MXPA04007510A - Peptidos tolerogenicos de la proteina basica de mielina. - Google Patents

Abstract

Se provee un peptido que es capaz de fijarse a una molecula MHC de la clase I o II sin procesamiento adicional (esto es, un apitope) que consta de una porcion de la region 131-158, de proteina de mielina, en particular se provee un apitope que es seleccionado de los siguientes peptidos proteicos basicos de mielina:134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153, 140-154; se provee ademas el uso del tal peptido en un composicion farmaceutica y un metodo de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad utilizando tal peptido.

Description

PEPTIDOS TOLEROGENICOS DE LA PROTEINA BASICA DE MIELINA La presente invención se refiere a péptidos de la proteína básica de mielina. En particular, la invención se refiere a los péptidos que constan de una porción de la región 131-158 de la proteína básica de mielina y su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En una respuesta ¡nmunológica adaptable, los linfocitos T son susceptibles de reconocer epítopes internos de un antígeno proteico. Las células que presentan antígenos (APC) absorben antígenos proteicos y los degradan en fragmentos cortos de péptidos. Un péptido puede fijarse a una molécula clase I y II de mayor histocompatibilidad compleja (MHC) que se encuentra dentro de la célula y transportarla a la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular junto con una molécula MHC, se puede reconocer el péptido por medio de una célula T (por vía del receptor de células T (TC )), en cuyo caso el péptido es un epítope de célula T. Los epítopes de células T desempeñan una actividad central en la respuesta ¡nmunológica adaptable a cualquier antígeno, ya sea del mismo ó extraño. Se ha mostrado a través de modelos experimentales, la actividad central que desempeñan los epítopes de células T en las enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen la alergia, las enfermedades autoinmunes y el rechazo al trasplante). Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas inyectando péptidos sintéticos (basados en la estructura de epítopes de células T) en combinación con adyuvantes. En contraste, se ha demostrado que es posible inducir tolerancia inmunológica a epítopes péptidos especiales, administrando epitope péptidos en forma soluble. Se ha demostrado que la administración de antígenos de péptidos solubles es un medio efectivo para inhibir la enfermedad en encéfalomielitis autoinmune experimental (EAE - un modelo para esclerosis múltiple (MS) (Metzler y Wraith, (1993) Int Immunol. 5: 1159-1 165; Liu y Wraith (1995) Int Inmunol. 7: 1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Inmunol. 28: 1251-1261 ); y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveoretinitis (revisado en Anderton y Wraith, 1998 como se menciona anteriormente). Esto también se ha probado como un medio para tratar una enfermedad progresiva en EAE (Anderton y Wraith (1998) como se menciona anteriormente). Ha llamado mucho la atención, el uso de péptidos tolerogénicos para tratar o para prevenir la enfermedad. Una razón para esto es que se ha demostrado que ciertos epítopes tolerogénicos pueden regular por disminución las respuestas de las células T a diferentes antígenos dentro del mismo tejido. Este fenómeno conocido como "supresión circundante" significa que debería ser posible inducir tolerancia a más de un epitope (preferentemente a todos) dentro de un antígeno determinado y a más de un antígeno para una enfermedad dada, usando un péptido tolerogénico particular (Anderton y Wraith, (1998) como se menciona anteriormente). Esto evitaría la necesidad de identificar todos los antígenos patógenos dentro de una enfermedad determinada. Los péptidos también son una opción favorable para la terapia, debido a su costo relativamente bajo al hecho de que péptidos análogos se pueden producir con propiedades inmunológicas alteradas. De este modo los péptidos pueden modificarse, para alterar sus interacciones ya sea con MHC o con TCR. Un posible problema con este enfoque es que se ha demostrado que no todos los péptidos que actúan como epítopes de células T son capaces de inducir tolerancia. El péptido de proteína básica de mielina (MBP) 89-101 es un antígeno inmunodominante después de la inmunización y es también ¡nmunógeno muy efectivo tanto en términos de la preparación para la reactividad de células T como de la inducción de EAE. Sin embargo, se ha demostrado que este péptido no es efectivo para inducir tolerancia cuando se administra en solución (Anderton y Wraith, (1998), como se cita anteriormente). Se ha propuesto un número de explicaciones para la jerarquía observada en la capacidad de los epítopes de célula T para inducir tolerancia (revisado en Anderton y Wraith, (1998), como se menciona anteriormente). En particular, se ha propuesto la existencia de una correlación entre la afinidad del péptido para el MHC y la tolerogenicidad (Liu y Wraith, (1995), como se menciona anteriormente), pero esto no está de acuerdo con algunas de las observaciones. Por ejemplo, la MBP [89-101], que no es tolerogénica, se fija a l-As con una afinidad relativamente alta. Entonces, el predecir cuáles péptidos inducirán tolerancia no es algo inmediato. Los inventores de la presente han demostrado que si un epítope péptido es de un tamaño apropiado para ser introducido por un APC inmaduro sin procesamiento antígeno, puede producir tolerancia inmunológica (Solicitud de Patente Internacional Número PCT7GB01/03702). La observación de que algunos epítopes de células T son tolerogénicos y otros son incapaces de inducir tolerancia se puede explicar, por lo tanto, por el hecho de que algunos epítopes requieren un procesamiento adicional antes de poder ser introducidos por una molécula MHC. Estos epítopes que requieren un procesamiento adicional no inducen tolerancia cuando se administran en forma soluble, a pesar de su capacidad para producir enfermedad cuando se inyectan en combinación con un adyuvante. Los epítopes que no requieren procesamiento adicional son capaces de inducir tolerancia y los inventores de la presente los ha llamado "apítopes" (Epítopes Independientes del Procesamiento de Antígenos).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los inventores de la presente han examinado la región 131 -158 de MBP y han encontrado una serie de péptidos que pueden presentarse por medio de células fijas presentadoras de antígenos a las células T.

Estos péptidos se definen como apítopes, porque son capaces de fijarse al MHC clase I o II sin procesamiento adicional. Por lo tanto en un primer aspecto, la presente invención provee un apítope que consta de una porción de la región 131-158 de proteína básica de mielina. Los inventores de la presente, también han identificado dos epítopes mínimos en esta región que son reconocidos por clones de células T determinados. El péptido puede constar de uno o ambos de esos epítopes que son el MBP 142-152 y 140-148. En una modalidad preferida el péptido se selecciona de los siguientes péptidos proteicos básicos de mielina: 134-148, 135-149, 136-150, 137-151 , 138-152, 139-153, 140-154. En un segundo aspecto, la presente invención brinda una composición farmacéutica que consta de uno o más péptidos de acuerdo con el primer aspecto de la solicitud. En un tercer aspecto, la presente invención brinda un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, y que consta del paso de administrar al sujeto un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La presente invención brinda el uso de un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para ser usado en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

Los péptidos de la presente invención son útiles para la prevención y/o tratamiento de la esclerosis múltiple.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la respuesta del clon de células T MS60:D2 a la presentación de los péptidos MBP anidados en la región 131-158 por APC. La figura 2 muestra la respuesta del clon de células T N5 a la presentación del péptido MBP 140-154 por APC. La figura 3 muestra la respuesta del clon de células T N5 a la presentación de los péptidos MBP anidados en la región 136-157 por APC.

DECRIPCION DETALLA DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido.

Péptidos El término "péptido" se usa en el sentido normal para referirse a una serie de residuos, típicamente aminoácidos L, unidos entre sí como es típico por enlaces péptidos entre grupos a-amino y carboxilo de aminoácidos adyacentes. El término incluye péptidos modificados y péptidos sintéticos análogos.

Un péptido de la presente invención puede tener cualquier longitud que le permita unirse a una molécula MHC clase I o II sin procesamiento adicional. Los péptidos que se unen a moléculas MHC clase I tienen típicamente de 7 a 13, más usualmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud. La unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos por los contactos entre los átomos que están en la cadena principal del péptido y los sitios invariantes de la unión-peptídica enlazante de todas las moléculas MHC clase I. Hay sitios invariantes a ambos extremos del vínculo que unen las terminales amino y carboxi del péptido. Las variaciones en la longitud del péptido se acomodan por medio de un enrollamiento en la cadena principal del péptido, a menudo en residuos de prolina o de glicina que permiten la flexibilidad requerida. Los péptidos que se unen a moléculas MHC clase II tienen típicamente de 8 a 20 aminoácidos de longitud, más usualmente entre 10 y 17 aminoácidos de longitud y pueden ser mucho más largos. Estos péptidos yacen en una estructura extendida a lo largo de la unión-peptídica enlazante MHC clase II la cual (a diferencia de la unión-peptídica enlazante MHC clase I) está abierta en ambos extremos. El péptido se mantiene en el lugar principalmente por medio de los contactos de los átomos que están en la cadena principal con residuos conservados que alinean la unión-peptídica enlazante. El péptido de la presente invención, se puede obtener utilizando métodos químicos (Peptide Chemistry, A Practical TextBook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlín). Por ejemplo, los péptídos se pueden sintetizar por medio de técnicas de fase sólida (Roberge JY et al., (1995), Science 269: 202-204), segmentados de la resina, y purificados por medio de cromatografía preparativa líquida de alta resolución (por ejemplo, Creighton, (1983) Proteins Structures and Molecular Principies, WH Freeman y Co, New York NY). Se puede lograr la síntesis automatizada, por ejemplo utilizando un sintetizador de péptidos ABI 431 (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones que brinda el fabricante. Alternativamente, el péptido puede obtenerse por medios recombinantes, o por segmentación de un polipéptido más largo. Por ejemplo, el péptido se puede obtener por segmentación de la proteína básica de mielina. Se puede confirmar la composición del péptido por medio del análisis de los aminoácidos o por secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman). El péptidó de la invención es derivable de la región 131 -158 de MBP. El péptido puede, preferentemente, derivar de un fragmento del antígeno que surge del procesamiento natural del antígeno por un APC. Con fines prácticos hay otras varias características que debería mostrar el péptido. Por ejemplo, el péptido debería ser soluble en una concentración que permitiera su uso "in vivo". El péptido debería ser, preferiblemente, soluble en concentraciones de hasta 0.5 mg/ml; más preferentemente, el péptido debería ser soluble en concentraciones de hasta 1 mg/ml; más preferentemente aún, el péptido debería ser soluble en concentraciones de hasta 5 mg/ml. Para la administración intranasal, el volumen máximo de dosis que puede admitirse usando los procedimientos corrientes es de aproximadamente 200 µ? por fosa nasal. Si el péptido es soluble en 1 mg/ml, se le puede administrar al paciente una dosis doble de 800 µg en cada fosa nasal. Es inusual administrar más de 5 mg en cualquier dosis individual. Es también importante que el péptido sea lo suficientemente estable "in vivo" para que sea útil terapéuticamente. Los inventores de la presente invención han encontrado que in vivo, 30 minutos después de la administración de la cantidad total de un péptido de prueba, cae aproximadamente a 50%, 4 horas después de la administración, la cantidad cae aproximadamente a 30%, pero después de cinco días el péptido es aún detectable (a aproximadamente 5%). El período de vida medio del péptido in vivo debería ser por lo menos de 10 minutos, preferentemente por lo menos de 30 minutos, más preferiblemente por lo menos de 4 horas, más preferiblemente aún de por lo menos 24 horas. Los inventores de la presente han encontrado que después de la administración intranasal la cantidad de péptido en el ganglio linfático drenante, alcanza su pico máximo aproximadamente 4 horas después de la administración, sin embargo el péptido aún se puede detectar (a nivel de aproximadamente 5% como máximo) después de 5 días. El péptido es, preferentemente, lo suficientemente estable como para estar presente en una concentración terapéuticamente activa en el ganglio linfático drenante, durante el tiempo suficiente como para producir un efecto terapéutico. El péptido debería también demostrar buena biodisponibilidad ¡n vivo. También debería mantener una conformación in vivo que le permitiera fijarse a una molécula de MHC en la superficie celular sin obstáculos.

Proteína básica de mielina (MBP) La MBP es un antígeno de la mielina, que previamente se ha caracterizado y secuenciado ( oth et al., (1987) J Neurosci. Res 17 (4) 321 -328; Número de acceso M30516). Los péptidos de la presente invención derivan de la región MBP 131-158. Preferiblemente, el péptido tiene o consta de uno o más de los epítopes de células T mínimos en la región, por ejemplo el epítope mínimo MBP 142-152 ó 140-148. Preferiblemente el péptido se selecciona de los siguientes péptidos proteicos básicos de mielina.

Péptido MBP Secuencia 134-148 YKSAHKGFKGVDAQG 135-149 KSAHKGFKGVDAQGT 136-150 SAHKGFKGVDAQGTL 137-151 AHKGFKGVDAQGTLS 138-152 HKGFKGVDAQGTLSK 139-153 KGFKGVDAQGTLSKI 140-254 GFKGVDAQGTLSKIF Epítopes independientes del procesamiento de antíqenos (APITOPES) El péptido de la presente invención es capaz de unirse a una molécula MHC clase I ó II (en la unión-peptídica enlazantes) sin procesamiento adicional. Dichos péptidos se conocen en la presente como "apítopes" (Epítopes Independientes del Procesamiento de Antígenos). La presentación de la superficie celular de los péptidos que derivan de un antígeno dado no es casual y tiende a ser dominada por un pequeño número de epítopes que se presentan frecuentemente. El predominio de un péptido determinado, dependerá de muchos factores tales como la afinidad relativa para fijar la molécula de MHC, punto de generación espacio-temporal dentro de las APC y resistencia a la degradación. La jerarquía del epítope por un antígeno puede cambiar con la progresión de una respuesta inmunológica, que tiene implicancias importantes para la autotoleracnia y la autoinmunidad. Las regiones determinantes de inmunodominio son probablemente buenos tolerógenos. En consecuencia en una modalidad preferida, el epítope de la presente invención se basa en un epítope dominante. Sin embargo, después de una respuesta ¡nmunológica primaria a los péptidos inmunodominantes, puede ocurrir el "despliegue" del epítope a determinantes sub-dominantes (Lehmann et al., (1992) Nature 358:155-157). La presentación de los epítopes sub-dominantes puede ser importante para disparar la auto-inmunidad. El apítope de la presente invención puede, por lo tanto basarse en un epítope sub-dominante. También pueden existir los epítopes crípticos, para cualquier antígeno dado. Los epítopes crípticos son aquellos que pueden estimular una respuesta celular T, cuando se administran como un péptido, pero que no logran producir tal respuesta, cuando se administran como un antígeno completo. Puede ocurrir que durante el procesamiento del antígeno a péptidos en las APC se destruya el epítope críptico. Un epítope críptico puede actuar como un apítope "in vitro" al ser capaz de fijar una molécula de MHC sin procesamiento adicional e inducir energía en una célula T que reconoce al epítope críptico. Sin embargo, sería improbable que tal epítope fuera terapéuticamente útil, porque no sería capaz de tolerar células T que diferenciaran un epítope naturalmente procesado del antígeno. Los epítopes para un antígeno se pueden identificar midiendo la respuesta de las células T a los péptidos solapados que cubren el antígeno completo (ver abajo) cuando son presentados por medio de APC. Dichos estudios generalmente resultan en "conjuntos anidados" de péptidos, y el epítope mínimo para una línea/clon de células T determinadas puede evaluarse midiendo la respuesta a los péptidos truncados. No se puede suponer que un epítope mínimo de un antígeno, se comportará como un apítope. Puede suceder que se necesiten los aminoácidos que bordean al epítope mínimo para la fijación óptima al MHC. El apítope debería diseñarse para cubrir la posibilidad de que hubiera diferencias sutiles entre los epítopes mínimos de los diferentes clones celulares T. Se debería destacar que tal vez no sea posible identificar un apítope para todos los epítopes. Hay una clara evidencia de que algunos epítopes fijan el MHC en una forma que depende de la carga de MHC en los endosomas y por tanto requieren procesamiento (Viner et al., (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. 92:2214-2218). Esta es otra razón por la cual no se puede suponer que cada epítope mínimo se comportará inevitablemente como un apítope.

Identificación de los péptidos que contienen epítopes de células T Hay un número de métodos conocidos en la técnica para identificar los epítopes de células T dentro de un antígeno dado. Los epítopes procesados naturalmente pueden identificarse por medio de un análisis espectrofotométrico de masa de péptidos eluidos de las APC cargadas de antígenos. Estas son APC que han sido estimuladas para absorber antígeno, o que han sido forzadas a producir la proteína intracelularmente por transformación con el gen apropiado. Típicamente las APC se incuban con proteína, ya sea en solución o adecuadamente dirigida a la superficie celular de las APC. Después de la incubación a 37°C, las células se disuelven en detergente y la proteína clase II se purifica, por ejemplo, por cromatografía afín. El tratamiento del MHC purificado en un medio químico adecuado (por ejemplo, condiciones ácidas) da por resultado la elusión de péptidos del MHC. Esta agrupación de péptidos se separa y el perfil se compara con el péptido del APC control, tratado en la misma forma. Los puntos máximos exclusivos de las células proteicas explícitas/alimentadas se analizan (por ejemplo, por medio de espectrometría de masa) y se identifican los fragmentos de péptidos. Este procedimiento usualmente da información sobre la escala de los péptidos (generalmente se encuentran en los "conjuntos anidados") generados de un antígeno particular por medio del procesamiento del antígeno. Otro método para identificar epítopes es enmascarar un conjunto de péptidos sintético que se solapa y extiende la longitud del antígeno en un ensayo "in vitro". Por ejemplo, pueden usarse péptidos que tengan 15 aminoácidos de longitud y 5 ó 10 aminoácidos solapados. Los péptidos se prueban en un sistema de presentación de antígenos que consta de células que presentan antígenos y células T. Por ejemplo, el sistema de presentación de antígenos puede ser una preparación de esplenocito de murino, una preparación de células humanas de amígdala o de PBMC. Alternativamente, el sistema de presentación del antígeno puede constar de una línea/clon de células T determinada y/o un antígeno determinado que presente el tipo de célula. Se puede medir la activación de células T vía la proliferación de células T (usando, por ejemplo, la absorción de 3H-timidina) o la producción de citosina. La activación de las células T del tipo TH1 CD4+ puede, por ejemplo, detectarse por medio de la producción de IFN^que puede detectarse por técnicas estándar tales como un ensayo ELISPOT. Los estudios de péptidos solapados generalmente indican el área del antígeno en que se ubica un epítope. Se puede luego determinar el epítope mínimo para una célula T especial, midiendo la respuesta de los péptidos truncados. Por ejemplo, si se obtiene una respuesta a los residuos 1-15 que contienen péptidos en el conjunto solapado, se pueden usar conjuntos que estén truncados en ambos extremos para identificar el epítope mínimo, (por ejemplo, 1-14, 1 -13, 1-12, etc. y 2-15, 3-15, 4-15, etc.).

Sistemas presentadores independientes del procesamiento de antíqenos (APIPS) Una vez que se ha identificado un epítope, el paso siguiente es investigar si también se comporta como un apítope. Un apítope debe presentarse a las células T sin necesidad del procesamiento de los antígenos. Habiendo identificado a los péptidos que contienen epítopes de células T, los apítopes pueden identificarse usando un sistema libre de procesamiento. Los péptidos truncados y los péptidos análogos se pueden evaluar por medio de la activación usando un sistema presentador independiente del procesamiento de antígenos (APIPS). Los ejemplos de APIPS, incluyen: a) APC fijo (con o sin anticuerpos a CD 28); b) Membranas de lípidos que contienen moléculas MHC clase I o II (con o sin anticuerpos a CD 28), y c) MHC natural o recombinante purificado en forma de placas unidas (con o sin anticuerpos a CD 28) Se conoce el uso de APC fijo para investigar las respuestas de las células T, por ejemplo en estudios para investigar el epítope mínimo dentro de un polipéptido, midiendo la respuesta a los péptidos truncados (Fairchild et al., (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043). Se puede fijar el APC usando, por ejemplo formaldehído (en general paraformaldehído) ó glutaraldehído. Las membranas de lípidos (que pueden ser membranas planas o liposomas) pueden prepararse usando lípidos artificiales o pueden ser fracciones de membranas plasmáticas/microsomales de APC. En la utilización, los APIPS se pueden aplicar a los pozos de una placa de cultivo de tejidos. Luego, se agregan antígenos peptídicos y se detecta la unión del péptido a la porción de MHC de los APIPS, agregando líneas o clones de células T seleccionadas. Se puede medir la activación de la línea o del clon de células T por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de la absorción de 3H-timidina o de la secreción de citosina.

Tolerancia Los péptidos de la presente invención deberían ser capaces de inducir la tolerancia al MBP pues son apítopes para este antígeno. Como se usa aquí, el término "tolerogénico" significa capaz de inducir tolerancia. La tolerancia es la falta de respuesta a un antígeno. La tolerancia a los auto antígenos es un rasgo esencial del sistema inmunológico, cuando éste se pierde puede sobrevenir la enfermedad auto inmunológica. El sistema inmunológico adaptable debe mantener la capacidad de respuesta a una enorme variedad de agentes infecciosos, mientras se evita el ataque auto inmune de los auto antígenos contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran medida por medio de la sensibilidad de los linfocitos T inmaduros, a la muerte celular apoptótica en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no se detectan todos los auto antígenos en el timo, entonces la muerte de los timocitos auto reactivos permanece incompleta. De ese modo, hay también mecanismos por medio de los cuales se pueden adquirir tolerancia por medio de los linfocitos T auto reactivos maduros, en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). En Anderton et al., (1999) (Immunologícal Reviews 169: 123-137) aparece una revisión de los mecanismos de tolerancia central y periférica.

La tolerancia puede ser la causa de anergia, o caracterizarse por la inducción de la misma en por lo menos una porción de las células T CD 4+. Para activar unas células T, un péptido puede asociarse con una APC "profesional" capaz de transmitir dos señales a las células T. La primera señal (señal 1 ) es transmitida por el complejo de péptidos MHC sobre la superficie celular de las APC y es recibida por la célula T vía los TCR. La segunda señal (señal 2) es transmitida por las moléculas coestimuladoras sobre la superficie de las APC, tales como las CD 80 y las CD 86 y recibida por la CD 28 sobre la superficie de la célula T. Se piensa que cuando una célula T recibe la señal 1 en ausencia de la señal 2, no se activa, y, en realidad, se vuelve anergética. Las células T anergéticas son refractarias a la prueba antígena subsiguiente y pueden ser capaces de suprimir otras respuestas inmunológicas. Se piensa que las células anergéticas T, están involucradas con la tolerancia atenuante de las células T. Sin desear ceñirse a la teoría, los inventores de la presente predicen que los péptidos que requieren procesamiento antes de poder presentarse junto con las moléculas MHC, no inducen tolerancia, porque tienen que ser tratados por medio de células maduras presentadoras de antígenos. Las células maduras presentadoras de antígenos (tales como los macrófagos, las células B y las células dendríticas son susceptibles del procesamiento antígeno, pero también de transmitir la señal 1 y la señal 2 a una célula T, que conduce a la activación de la célula T. Los apítopes, por otra parte, podrán fijarse a las MHC clase II sobre las APC inmaduras. Así se introducirán a las células T sin coestimulación, conduciendo a la anergia celular T, y a la tolerancia. Por supuesto, los apítopes también son capaces de fijarse a las moléculas MHC en la superficie celular de las APC maduras. Sin embargo, el sistema inmunológico contiene un caudal mayor de APC inmaduras que de APC maduras (se ha sugerido que se activan menos del 10% de las células dendríticas, Summers et al. (2001 ) Am J. Pathol. 159:285-295). La posición errónea a un apítope será, por lo tanto, de anergía/tolerancia, más que de activación. Se ha demostrado que, cuando la tolerancia es inducida por medio de la inhalación de los péptidos, la capacidad para proliferar de las células T CD4+ antígeno-específicas, se reduce. También la producción de los IL 2, la producción de los IFN-? y de los IL-4, por medio de estas células se regula por disminución, pero la producción de los IL-10 aumenta. La neutralización de los IL-10 en ratones en estado de tolerancia inducida por los péptidos, ha demostrado que restituye completamente la susceptibilidad a la enfermedad. Se ha planteado que una población de células reguladoras persiste en el estado de tolerancia que producen IL-10 y la regulación inmunológica atenuante (Burkhart et al. (1999) Int Immunol 11 : 1625-1634). La inducción de tolerancia puede, por lo tanto, monitorearse por medio de varias técnicas, incluyendo: a) Susceptibilidad reducida a contraer la enfermedad para la cual el péptido es un epítope objetivo in vivo. b) La inducción de energía en las células T CD4+ (que pueden detectarse por medio de la prueba subsiguiente con antígeno in vitro); c) Cambios en la población de células T CD4+, incluyendo (i) reducción de la proliferación (ii) regulación por disminución en la producción de IL2, IFN-? e IL 4; y (iii) aumento en la producción de IL 10.

Enfermedades objetivo El péptido de la invención puede usarse en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. Los péptidos de la presente invención son particularmente útiles en el tratamiento y/o la prevención de la esclerosis múltiple (MS). La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por lesiones desmielinizantes múltiples diseminadas en toda la materia blanca de CNS y que tiene lugar en diversos lugares y tiempos (McFarlin y McFarland, 1982. New England J. Medicine 307: 1 183-1 188 y 1246-1251 ). Se piensa que la MS puede atenuarse por medio de células T auto-reactivas. El MBP es inmunogénico y los linfocitos T MBP-específicos tienen actividad encefalitogénica en animales (Segal et al., 1994. J. Neuroimmunol. 51 : 7-19.Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol. 42: 187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 31 7:355-8).

Composición farmacéutica En el segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que consta de uno o más péptidos del primer aspecto de la invención. La composición también puede constar de uno o más apítopes de otra región de MBP o de un antígeno diferente. Los inventores de la presente predicen que, a pesar de la "supresión circundante" puede ser necesario tener como objetivo un número de clones de células T diferentes, para inducir tolerancia de manera efectiva. De ahí que se le puedan administrar a un individuo una diversidad de péptidos para prevenir o tratar una enfermedad. La composición farmacéutica, por ejemplo, puede comprender entre 1 y 50 apítopes, preferentemente entre 1 y 15 apítopes. Si hay más de un apítope, los apítopes preferentemente, son todos capaces de fijarse ya sea a la MHC clase I o a la MHC clase II, sin procesamiento adicional. Donde haya dos o más apítopes, la composición farmacéutica puede estar en forma de conjunto, en el cual algunos o cada uno de los apítopes se provee en forma separada para la administración simultánea, separada o secuencial. Alternativamente (o además) si la composición farmacéutica (o cualquier parte de la misma) debe administrarse en dosis múltiples, cada dosis puede envasarse en forma separada. La composición farmacéutica puede constar de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de apítopes o de cada uno de ellos, y opcionalmente constar de un portador, un diluyente o un excipiente farmacéuticamente aceptables. En las composiciones farmacéuticas de la presente invención, también los epítopes a cada uno de ellos pueden mezclarse con cualquier aglutinante(s), lubricante(es), agente(s) de suspensión, agente (s) de revestimiento, o agente(s) de solubilización adecuados.

Administración. El péptido puede administrarse en forma soluble en ausencia del adyuvante. El péptido se administra preferentemente por vía mucosa. Los estudios han demostrado que el péptido puede inducir tolerancia de las células T, cuando se administra en forma soluble intraperitonealmente (i.p), en forma intravenosa (i.v) o intranasal (i.n) u oralmente (Anderton y Wraith, (1998) como se cita anteriormente, Liu y Wraith (1995) como se cita anteriormente; Metzier y Wraith, (1999) Immunology 97:257-263). El péptido se administra preferentemente en forma intranasal. Los estudios en ratones han demostrado que la duración de la administración de péptidos requerida para inducir tolerancia depende de la frecuencia precursora de las células T en el receptor (Burkhart et al., (1999) como se cita anteriormente). En muchos estudios experimentales se ha demostrado que se requieren repetidas dosis de péptidos para inducir tolerancia (Burkhart et al., (1999) como se cita anteriormente). Por lo tanto, la dosis exacta y el número de dosis de péptidos dependerá del individuo; sin embargo, en una modalidad preferida se administra una pluralidad de dosis. Si se administran simultáneamente una pluralidad de péptidos, puede hacerse en forma de "cocktail", lo que resulta adecuado para administrarse en dosis simples o múltiples. Alternativamente sería preferible administrar dosis múltiples, aunque variando las concentraciones relativas de los péptidos entre las dosis. En una modalidad preferida se puede seguir un protocolo de "intensificación de dosis", donde se da al paciente una pluralidad de dosis en concentraciones crecientes. Dicho enfoque se ha usado, por ejemplo, para péptidos de fosfolipasa A2 en aplicaciones de inmunoterapia contra la alergia al veneno de la abeja (Müller et al., (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101 :747-754 y Akdis et al., (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención, pero no debería interpretarse como limitativos de la misma. La invención se refiere particularmente a las modalidades específicas descritas en estos ejemplos: EJEMPLO 1 Identificación de los apítopes dentro de la región 134-154 de MBP Materiales y métodos Antígenos El MBP humano se prepara a partir de materia cerebral blanca, como lo describen Deibler et al. (Deibler et al. 1972, Preparative Biochemistry 2:139), y su pureza se determina por SDS-PAGE. Se usa MBP y derivados de proteínas purificada de tuberculosis mycobacterium (PPD) (Reino Unido, Laboratorio Veterinario Central, Surrey) en ensayos proliferativos a concentraciones óptimas previamente determinadas; la concentración óptima para cada antígeno es de 20ng/ml. Se sintetiza un panel de péptidos solapados de 15-mer. que abarca la región 131 -158 de MBP, utilizando química estándar F-moc, sobre un sintetizador múltiple de péptidos Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemania). Cada péptido es desplazado por 1 aa y solapado por 14 aa.

Medio de cultivo del tejido El medio RPMI 1640 se usa como medio de cultivo del tejido, complementado con 20mM HEPES (Sigma, Poole, UK), penicilina (100 U/ml), sulfato de estreptomicina (100 mg/ml) y 4 mM L-glutamina (todos de Life Technology, Paisley, Escocia). Se utiliza un medio sin suero para lavar las células linfoide y el TCL. Para todas las condiciones de cultivo y ensayos, el medio se complementa con 10% de plasma autoderivado inactivo al calor.

Generación de clones de células T Las líneas de células T (TLC) MBP-específicas se generan a partir de 8 pacientes con MS y dos donantes saludables controlados. Se separan los PBMC de cada sujeto como se describe anteriormente y 1x106 células/ml se colocan en placas de 6 pozos en presencia de MBP (50 µg ml); se congela regularmente una porción de PBMC de cada sujeto y se almacena para reestimulaciones subsiguientes. Siete días más tarde, las células se alimentan con un medio nuevo que contenga 2% de IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK), y en el día 12 del cultivo se restimulan todas las células con antígeno, IL-2 y PBMC irradiado (2500 Rad) autoderivado como una fuente de antígeno que introduce células (APC) a una razón celular de una célula T:5APC. Las células se expanden en IL-2 cada 3-4 días, y en el día 14 se reestimulan con antígeno, IL-2 y PBMC, como se describe anteriormente. En el día de la primera reestimulación, las células se examinan para proliferación específica a MBP. En resumen, se cultivan por triplicado 2 x 104 células T y 1 x 105 PBMC irradiado autoderivado, en placas de fondo redondo de 96 pozos, en presencia de MBP. Las células se cultivan durante 2 días y se les agrega en forma de pulsos (3H) Tímidína a 0.4 µ??/???? durante las últimas 18 horas del cultivo. Las células se cosechan luego como se describe anteriormente y un TCL se considera como MBP-específico con un 5cpm>1000 y un SI >3. A continuación se clonan los TCL siguiendo 3 ciclos de reestimulación/expansión utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK) en presencia de PBMC irradiado autoderivado como APC. Las células T se colocan en una placa bajo condiciones de dilución limitantes a 0.1 célula/pozo y a 0.3 célula/pozo y a 1 célula/pozo y se cultivan en placas Terasaki (Nunc Internacional, Costar) con 1X 104 de PBMC irradiado, 5 µg/ml de PHA y 2% de IL-2. Después de 10-12 días, los pozos con crecimiento positivo se expanden en placas con fondo redondo de 96 pozos usando 1 x 105 de PBMC irradiado, 5µg/ml de PHA y de IL-2. Tres días más tarde los pozos se alimentan con medio nuevo que contenga IL-2 y en el día 7, los clones se expanden a las placas cóncavas 48 usando 5 x 105 de PBMC irradiado, PHA e IL-2; en este punto los clones se prueban en ensayos de proliferación para respuestas específicas al MBP. Los clones de MBP específico se expanden una semana más tarde a las placas de 24 pozos, usando 1 x 106 de PBMC irradiado con PHA o Dynabeads (Dynal, UK.) e IL-2. Los clones se mantienen en las placas de 24 pozos, usando un ciclo de reestimulación/expansión de 7 a 10 días.

Ensayo de Proliferación Se incubaron células vivas o Mgar fijas de p-formaldehído (HLA-DRR+va) con péptidos en suero o en suero solamente, junto con células T. La respuesta proliferativa de célula T se midió por absorción de 3H-timidina de la siguiente manera. Se hicieron crecer durante 48 horas alícuotas triplicadas de 100 µ? de cada cultivo en una placa cóncava microtítulo de fondo redondo con 96 pozos, luego se le agregan en forma de pulsos 0.4 µ?? [3H] timidina (Amersham Internacional, Amersham UK). Después de 20 horas las células se cosechan en moldes de fibra de vidrio (LKB-Wallac, Turku, Finlandia) utilizando un cosechador Mach 1 1 96 (Tomtec, Orange, New Jersey, USA). La incorporación de [3H] timidina se determina usando un contador de centelleo líquido Microbeta (LKB Wallac). Los pozos de prueba que contienen antígeno se consideran positivas cuando el 5cpm> 1000 y el índice de estimulación (Sl)>3, donde SI = antígeno de CPM que contiene cultivo/cultivo CPM sin antígeno.

Resultados En la figura se muestra la respuesta del clon de células T MS 60: D2 a la introducción de los péptidos MBP anidados en la región 131-158. Los péptidos 134-148, 135-149, 136-150, 137-151 , 138-152, 139-153, y 140-154 se definen como apítopes ya que podrían introducirse a las células T por APC fijos sin procedimiento adicional. En la figura 2 se muestra la respuesta del clon de células T N5 a la introducción de péptidos 140-154. Esto confirma además que el péptido 140-154, puede introducirse por APC fijo sin procedimiento adicional.

EJEMPLO 2 Identificación del epítope mínimo reconocido por los clones de células T N5 y MS 60.D2 Se incubaron células Mgar vivas con péptidos solapados de la región 136-157 de MBP en suero o suero solo, junto con células T N5. La proliferación de células T se midió por absorción de 3H de timidación. Los resultados se muestran en la figura 3. El epítope mínimo reconocido por el clon de células T N5 es MPB 142-152. Se realizó un experimento similar para el clon de células T MS 60:D2 (figura 1 , Mgar no fijo). El epítope mínimo reconocido por el clon de células T es MBP 140-148. Para aquellos entendidos en la técnica se pondrán de manifiesto varias modificaciones y variaciones de los métodos y el sistema de la invención descritos, sin apartarse del alcance y el espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito junto con las modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica, no debe limitarse indebidamente a dichas modalidades especificas. Por cierto, se intenta que la presente invención abarque varias modificaciones a los modos descritos para llevar a cabo la invención, que resultan obvios para aquellos expertos en química o biología o campos relacionados. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación descrita anteriormente se incorpora como referencias.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Apitope Technology (Bristol) Limited <120> Péptido <130> P013368WO LCH <140> PCT/GB2003/000399 <141> 2003-01-30 <150> GB 0202399.2 <151> 2002-02-01 <160> 7 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala GIn Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala GIn Gly Thr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala GIn Gly Thr Leu 1 5 10 15 <210> 4 <21 1 > 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Tyr Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211 > 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Les Ser Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211 > 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys lie 1 5 10 15 <210> 7 <211 > 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys lie Phe 1 5 10 15

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Un péptido que sea capaz de unirse a una molécula clase I o

II de MHC sin procesamiento adicional y que consta de una porción de la región 131 -158 de la proteína básica de mielina. 2 - El péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque consta del epítope mínimo de 142-152 y/o del epítope mínimo 140-148.

3.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque seleccionado de los siguientes péptidos de proteína básica de la mielina; 134-148, 135-149, 136-150, 137-151 , 138-152, 139-153, 140-154.

4.- El péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque se usa en el tratamiento y/o en la prevención de una enfermedad.

5.- El péptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la enfermedad es esclerosis múltiple.

6.- Una composición farmacéutica que consta de uno o más péptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5.

7.- El uso de un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 en la fabricación de un medicamento para utilizarlo en la prevención y/o tratamiento de la enfermedad.