PT1474443E - Péptidos tolerogénicos da proteína básica da mielina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS TOLEROGÉNICOS DA PROTEÍNA BÁSICA DA MIELINA" A presente invenção refere-se a péptidos da proteína básica da mielina. Em particular, a invenção refere-se a péptidos que compreendem uma porção da região 131-158 da proteína básica da mielina e sua utilização no tratamento e/ou prevenção de uma doença.

ANTECEDENTES

Numa resposta imunitária adaptativa, os linfócitos T são capazes de reconhecer epitopos internos de um antigénio proteico. As células apresentadoras de antigénio (APC) capturam os antigénios proteicos e degradam-nos em fragmentos peptídicos curtos. Um péptido pode ligar-se a uma molécula da classe I ou II do complexo de histocompatibilidade major (MHC) dentro da célula e pode ser transportado para a superfície celular. Quando apresentado à superfície celular em conjunto com uma molécula MHC, o péptido pode ser reconhecido por uma célula T (via o receptor da célula T (TCR) ) , em cujo caso, o péptido é um epitopo da célula T.

Os epitopos da célula T têm uma função central na resposta imunitária adaptativa para qualquer antigénio, próprio ou estranho. A função central desempenhada pelos epitopos da célula T em doenças de hipersensibilidade (que incluem alergia, doenças 1 auto-imunes e rejeição de transplante) tem sido demonstrada através da utilização de modelos experimentais. É possível induzir doenças inflamatórias ou alérgicas por injecção de péptidos sintéticos (baseados na estrutura dos epitopos das células T) em combinação com adjuvante.

Em contraste, tem sido demonstrado ser possível induzir tolerância imunológica direccionada para epitopos peptídicos particulares por administração de epitopos peptídicos na forma solúvel. A administração dos antigénios peptídicos solúveis tem sido demonstrada como um meio eficaz de inibição de doença em encefalomielite auto-imune experimental (EAE - um modelo para esclerose múltipla (MS)) (Metzler e Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu e Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton e Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); e modelos experimentais de artrite, diabetes e uveorretinite (revisto em Anderton e Wraith (1998), como acima). Esta também foi demonstrada como um meio de tratar uma doença em desenvolvimento em EAE (Anderton e Wraith (1998), como acima). A utilização de péptidos tolerogénicos para tratar ou prevenir doenças tem atraído uma atenção considerável. Uma razão para isto é que tem sido demonstrado que certos epitopos tolerogénicos podem regular negativamente as respostas das células T para antigénios distintos dentro do mesmo tecido. Este fenómeno, conhecido por "supressão espectadora" significa que deverá ser possível induzir tolerância a mais do que um epitopo (de um modo preferido, todos os epitopos) dentro de um determinado antigénio e a mais do que um antigénio para uma determinada doença, utilizando um péptido tolerogénico particular (Anderton e Wraith (1998), como acima). Isto poderá 2 obviar a necessidade de identificar todos os antigénios patogénicos dentro de uma doença particular.

Os péptidos são também uma opção favorável para terapia devido ao seu custo relativamente baixo e ao facto dos análogos peptídicos poderem ser produzidos com propriedades imunológicas alteradas. Os péptidos podem, assim, ser modificados para alterar as suas interacções com MHC ou TCR.

Um problema possível com esta abordagem é que foi demonstrado que nem todos os péptidos que actuam como epitopos das células T são capazes de induzir tolerância. 0 péptido 89-101 da proteína básica da mielina (MBP) é um antigénio imunodominante após imunização e é também um imunogénio muito eficiente em termos de iniciação da reactividade da célula T e indução de EAE. No entanto, este péptido tem demonstrado ser ineficaz na indução de tolerância guando administrado em solução (Anderton e Wraith (1998), como acima). Têm sido propostas várias explicações para a hierarquia observada na capacidade dos epitopos das células T para induzirem tolerância (revisto em Anderton e Wraith (1998), como acima). Em particular, foi proposto que existe uma correlação entre a afinidade do péptido para a MHC e tolerogenicidade (Liu e Wraith (1995), como acima), mas isto não corresponde a algumas das observações. Por exemplo, o [89-101] da MBP, que não é tolerogénico, liga-se a I-As com uma afinidade relativamente elevada. Não é assim tão linear prever que péptidos irão induzir tolerância.

A presente requerente demonstrou que se um epitopo de péptido é de um tamanho apropriado para ser apresentado por APC 3 imaturas sem processamento de antigénio, pode induzir tolerância imunológica (Pedido de Patente Internacional número PCT/GB01/03702) . A observação de gue alguns epitopos das células T são tolerogénicos e outros são incapazes de induzir tolerância pode, deste modo, ser explicada pelo facto que alguns epitopos necessitam de processamento posterior antes de serem capazes de serem apresentados por uma molécula do MHC. Estes epitopos que necessitam de processamento posterior não induzem tolerância quando administrados numa forma solúvel, apesar da sua capacidade para induzir doença quando injectados em combinação com adjuvante.

Os epitopos que não necessitam de processamento posterior são capazes de induzir tolerância e foram denominados "apitopos" (Epitopos Independentes de Processamento de Antigénio) pela requerente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente requerente examinou a região 131-158 da MBP, e encontrou vários péptidos que podem ser apresentados por células apresentadoras de antigénios fixas a células T.

Estes péptidos são definidos como apitopos, porque são capazes de se ligar a MHC classe I ou II sem processamento posterior. A presente requerente identificou, também, dois epitopos mínimos na região 131-158 da proteína básica da mielina que são reconhecidos pelos clones particulares de células T. 0 péptido 4 pode compreender um ou ambos os epitopos que são 142-152 e 140-148 da MBP.

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um péptido que é capaz de se ligar a uma molécula MHC classe I ou II sem processamento posterior e que é seleccionado dos seguintes péptidos de proteína básica da mielina: YKSAHKGFKGVDAQG (134-148), KSAHKGFKGVDAQGT (135-149), SAHKGFKGVDAQGTL (136-150), AHKGFKGVDAQGTLS (137-151), HKGFKGVDAQGTLSK (138-152), GFKGVDAQGTLSKIF (140-154).

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais péptidos de acordo com o primeiro aspecto do pedido. A presente invenção proporciona também a utilização de um péptido de acordo com o primeiro aspecto da invenção, na preparação de um medicamento para utilização no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla. 5

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a resposta do clone MS60:D2 de célula T na apresentação dos péptidos da MBP localizados na região 131-158 por APC.

Figura 2 mostra a resposta do clone N5 de célula T na apresentação do péptido 140-154 da MBP por APC.

Figura 3 mostra a resposta do clone N5 de célula T na apresentação dos péptidos localizados na região 136-157 da MBP por APC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um péptido. Péptidos 0 termo "péptido" é utilizado no sentido normal para significar uma série de residuos, tipicamente L-aminoácidos, ligados um ao outro, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos α-amino e carboxilo de aminoácidos adjacentes. O termo inclui péptidos modificados e análogos peptídicos sintéticos.

Um péptido da presente invenção pode ser de gualquer tamanho que seja capaz de se ligar a uma molécula de MHC classe I ou II sem processamento posterior. 6

Os péptidos que se ligam a moléculas MHC classe I têm tipicamente 7 a 13, mais normalmente, 8 a 10 aminoácidos em comprimento. A ligação do péptido é estabelecida nas duas extremidades por contacto entre átomos na cadeia principal do péptido e locais invariantes na cavidade de ligação do péptido de moléculas de MHC classe I. Existem locais invariantes em ambas as extremidades da cavidade que ligam o terminal amino e carboxilo do péptido. Variações no comprimento do péptido são proporcionadas por uma irregularidade no esqueleto do péptido, muitas vezes nos resíduos de prolina ou glicina que permitem a flexibilidade necessária.

Os péptidos que se ligam a moléculas do MHC classe II têm tipicamente entre 8 e 20 aminoácidos de comprimento, mais normalmente entre 10 e 17 aminoácidos de comprimento e podem ser muito maiores. Estes péptidos apresentam uma conformação alongada ao longo da cavidade de ligação do péptido do MHC II que (ao contrário da cavidade de ligação do péptido do MHC classe I) é aberta em ambas as extremidades. O péptido é mantido no local principalmente por contacto de átomos da cadeia principal com resíduos conservados que rodeiam a cavidade de ligação do péptido. O péptido da presente invenção pode ser preparado utilizando métodos químicos (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlim). Por exemplo, os péptidos podem ser sintetizados por técnicas de fase sólida (Roberge JY et ai. (1995) Science 269: 202-204), clivados a partir da resina e purificados por cromatografia líquida preparativa de elevado desempenho (e. g., Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co, Nova Iorque, NI). A síntese automatizada pode ser alcançada, por exemplo, utilizando 7 0 Sintetizador de Péptido ABI 43 1 A (Perkin Elmer), de acordo com as instruções proporcionadas pelo fabricante. 0 péptido pode, alternativamente, ser preparado por técnicas de recombinação ou por clivagem de um polipéptido mais comprido. Por exemplo, o péptido pode ser obtido por clivagem da proteína básica da mielina. A composição de um péptido pode ser confirmada por análise ou sequenciação de aminoácidos (e. g., o processo de degradação de Edman). 0 péptido da invenção é derivado da região 131-158 da MBP. De um modo preferido, o péptido é derivado de um fragmento do antigénio que surge por processamento natural do antigénio por uma APC.

Para objectivos práticos, existem várias outras características que o péptido deverá apresentar. Por exemplo, o péptido deverá ser solúvel a uma concentração que permita a sua utilização in vivo. De um modo preferido, o péptido deverá ser solúvel a concentrações até 0,5 mg/mL, de um modo mais preferido, o péptido deverá ser solúvel a concentrações até 1 mg/mL, de um modo muito preferido, o péptido deverá ser solúvel a concentrações até 5 mg/mL.

Para administração intranasal o volume máximo de dose que pode ser administrado utilizando processos actuais é de aproximadamente 200 pL por narina. Se o péptido for solúvel a 1 mg/mL, uma dose dupla para cada narina permite que sejam administradas 800 pg ao doente. Não é comum administrar mais do que 5 mg em qualquer dose individual. É também importante que o péptido seja suficientemente estável in vivo para ser terapeuticamente útil. A presente requerente demonstrou que, in vivo, 30 minutos após administração, a quantidade total de péptido de teste diminui para cerca de 50%, 4 horas após administração, a quantidade diminui para cerca de 30%, mas depois de 5 dias, o péptido continua a ser detectável (a cerca de 5%) . O tempo de meia vida do péptido in vivo deverá ser, pelo menos, de 10 minutos, de um modo preferido, pelo menos, 30 minutos, de um modo mais preferido, pelo menos, 4 horas, de um modo muito preferido, pelo menos, 24 horas. A presente requerente verificou que após administração intranasal, a quantidade de péptido no nódulo linfático de drenagem atinge um máximo a cerca de 4 h após administração, no entanto, o péptido continua a ser detectável (a níveis de cerca de 5%, no máximo) após 5 dias. De um modo preferido, o péptido é suficientemente estável para ser apresentado numa concentração terapeuticamente activa no nódulo linfático de drenagem, durante o tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico. 0 péptido deverá também demonstrar boa biodisponibilidade in vivo. O péptido deverá manter uma conformação in vivo que lhe permita ligar uma molécula de MHC na superfície celular sem qualquer impedimento.

Proteína Básica de Mielina (MBP) A MBP é um antigénio da mielina, que foi anteriormente caracterizada e sequenciada (Roth et al. (1987) J. Neurosci. Res. 17(4) 321-328; Número de Acesso M30516). 9

Os péptidos da presente invenção sao deriváveis da região 131-158 da MBP.

De um modo preferido, o péptido compreende um ou mais dos epitopos de células T mínimos na região, por exemplo, o epitopo 142-152 ou 140-148 da MBP mínimo. O péptido da presente invenção é seleccionado dos péptidos da proteína básica da mielina:

péptido da MBP Sequência 134-148 YKSAHKGFKGVDAQG 135-149 KSAHKGFKGVDAQGT 136-150 SAHKGFKGVDAQGTL 137-151 AHKGFKGVDAQGTLS 138-152 HKGFKGVDAQGTLSK 140-154 GFKGVDAQGTLSKIF

Epitopos Independentes de Processamento de Antigénio (AP I TOPES) 0 péptido da presente invenção é capaz de se ligar a uma molécula de MHC classe I ou II (na cavidade de ligação do péptido) sem processamento posterior. Tais péptidos são aqui conhecidos como "apitopos" (Epitopos Independentes de Processamento de Antigénio).

A apresentação de péptidos à superfície celular derivadas de um determinado antigénio não é aleatória e tende a ser dominada por um pequeno número de epitopos que ocorrem frequentemente. A 10 dominância de um péptido particular irá depender de muitos factores, tais como a afinidade relativa para ligação da molécula de MHC, ponto espacio-temporal de geração dentro da APC e resistência à degradação. A hierarquia de epitopos para um antigénio pode alterar-se com a progressão de uma resposta imunitária, que tem implicações importantes para auto-tolerância e auto-imunidade. As regiões determinantes imunodominantes são provavelmente bons tolerogénicos. Aqui, numa forma de realização preferida, o apitopo da presente invenção baseia-se num epitopo dominante.

No entanto, após uma resposta imunitária primária aos péptidos imunodominantes, pode ocorrer a "propagação" do epitopo para determinantes sub-dominantes (Lehmann et al., (1992) Nature 358:155-157). A apresentação de epitopos sub-dominantes pode ser importante na indução da auto-imunidade. 0 apitopo da presente invenção pode, deste modo, basear-se num epitopo sub-dominante.

Para qualquer determinado antigénio, podem existir, também, epitopos crípticos. Os epitopos crípticos são aqueles que podem estimular uma resposta das células T quando administrados como um péptido mas que falham na produção de tal resposta quando administrados como um antigénio completo. Pode ser que durante o processamento do antigénio em péptidos na APC, o epitopo críptico seja destruído.

Um epitopo críptico pode actuar como um apitopo in vitro, pelo facto de ser capaz de se ligar a uma molécula de MHC sem processamento posterior e induzir anergia numa célula T que reconhece o epitopo como críptico. No entanto, tal apitopo deverá, provavelmente, ser útil terapeuticamente porque deverá 11 ser incapaz de tolerar as células T que reconhecem um epitopo naturalmente processado do antigénio.

Os epitopos para um antigénio podem ser identificados por determinação da resposta das células T para péptidos sobrepostos ao longo do antigénio inteiro (ver acima) quando apresentados por APC. Tais estudos resultam normalmente em "locais de abrigo" de péptidos e o epitopo mínimo para uma linha/clone de células T particular pode ser avaliado por determinação da resposta a péptidos truncados. Não pode ser assumido que um epitopo mínimo de um antigénio se irá comportar como um apitopo. Pode muito bem ser que os aminoácidos que flanqueiam o epitopo mínimo sejam necessários para ligação óptima ao MHC. 0 apitopo deverá ser concebido para abranger a possibilidade de que possam ocorrer diferenças subtis entre os epitopos mínimos de clones de células T diferentes.

Deverá ser salientado que poderá não ser possível identificar um apitopo para todos os epitopos. Existem evidências claras que alguns epitopos ligam MHC de um modo que é dependente da carga de MHC em endossomas e, deste modo, requer processamento (Viner et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. 92:2214-2218). Esta é outra razão porque não se pode assumir que cada epitopo mínimo irá comportar-se inevitavelmente como um apitopo.

Identificação de péptidos contendo epitopos das células T 12

Existem vários métodos conhecidos na técnica para identificar os epitopos das células T dentro de um dado antigénio.

Os epitopos naturalmente processados podem ser identificados por análise espectrofotometrica de massa de péptidos eluídos a partir de APC carregada de antigénio. Estas são APC que foram encorajadas a capturar o antigénio ou foram forçadas a produzir a proteína intracelularmente por transformação com o gene apropriado. Tipicamente, as APC são incubadas com a proteína em solução ou adequadamente direccionada para a superfície das células APC. Após incubação a 37 °C as células são lisadas em detergente e a proteína de classe II purificada por, por exemplo, cromatografia de afinidade. 0 tratamento de MHC purificada com um meio químico adequado (por exemplo, condições ácidas) resulta na eluição de péptidos de MHC. Este conjunto de péptidos é separado, e o perfil comparado com o péptido de APC de controlo tratados do mesmo modo. Os picos únicos para as células que expressão/alimentam a proteína são analisados (por exemplo, por espectrometria de massa) e os fragmentos de péptido identificados. Este processo gera, normalmente, informação acerca da gama de péptidos (normalmente encontrados em "conjuntos encaixados") gerados a partir de um antigénio particular por processamento de antigénio.

Outro método para identificar epitopos é avaliar uma biblioteca de péptidos sintéticos que se sobrepõem e aumentam o comprimento do antigénio num ensaio in vitro. Por exemplo, podem ser utilizados péptidos que têm 15 aminoácidos de comprimento e que se sobrepõem em 5 ou 10 aminoácidos. Os péptidos são testados num sistema de apresentação de antigénio que compreende células apresentadoras de antigénio e células T. Por exemplo, o 13 sistema de apresentação de antigénio pode ser uma preparação de esplenócitos de murino, uma preparação de células humanas a partir de amígdalas ou PBMC. Alternativamente, o sistema de apresentação de antigénio pode compreender uma linha/clone de células T particular e/ou um tipo de células apresentadoras de antigénio particulares. A activação das células T pode ser determinada via proliferação das células T (por exemplo, utilizando incorporação de 3H-timidina) ou produção de citocina. A activação de células T CD4+ do tipo TH1 pode, por exemplo, ser detectada via produção de IFNy que pode ser detectada por técnicas convencionais, tal como um ensaio de ELISPOT.

Os estudos de sobreposição de péptido indicam, normalmente, a área do antigénio na qual um epitopo está localizado. 0 epitopo mínimo para uma célula T em particular pode depois ser avaliado por determinação da resposta a péptidos truncados. Por exemplo, se é obtida uma resposta para o péptido compreendendo os resíduos 1-15 na biblioteca de sobreposição, podem ser utilizados conjuntos que são truncados em ambas as extremidades (i. e., 1-14, 1-13, 1-12 etc. e 2-15, 3-15, 4-15 etc.) podem ser utilizados para identificar o epitopo mínimo.

Sistemas de Apresentação Independente de Processamento de Antigénio (APIPS)

Uma vez identificado o epitopo, o próximo passo é investigar se este se comporta também como um apitopo. 14

Um apitopo deverá ser apresentado às células T sem a necessidade de processamento de antigénio. Tendo identificado os péptidos contendo os epitopos das células T, os apitopos podem ser identificados utilizando um sistema livre de processamento. Os péptidos truncados e análogos do péptido podem ser testados para activação utilizando um sistema de apresentação independente de processamento de antigénio (APIPS).

Exemplos de APIPS incluem: a) APC fixas (com ou sem anticorpos para CD28); b) membranas lipídicas contendo moléculas MHC de Classe I ou II (com ou sem anticorpos para CD28); e c) MHC natural ou recombinante, purificada na forma ligada a placa (com ou sem anticorpos para CD28). É conhecido a utilização de APC fixas para investigar as respostas das células T, por exemplo, em estudos para investigar o epitopo mínimo dentro de um polipéptido, medindo a resposta a péptidos truncados (Fairchild et al., (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). A APC pode ser fixa utilizando, por exemplo, formaldeído (normalmente, paraformaldeído) ou glutaraldeído.

As membranas lipídicas (que podem ser membranas planas ou lipossomas), podem ser preparadas utilizando lípidos artificiais ou podem ser fracções da membrana plasmática/microssomal de APC.

Em utilização, os APIPS podem ser aplicados a poços de uma placa de cultura de tecidos. Os antigénios peptídicos são depois adicionados e a ligação do péptido à porção de MHC dos APIPS é 15 detectada por adição de linhas ou clones das células T seleccionados. A activação da linha ou clone de células T pode ser medida por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, via secreção da citocina ou incorporação de 3H-timidina.

Tolerância

Os péptidos da presente invenção deverão ser capazes de induzir tolerância a MBP uma vez que são apitopos para este antigénio.

Como aqui utilizado, o termo "tolerogénico" significa capaz de induzir tolerância. A tolerância é o insucesso em responder a um antigénio. A tolerância a antigénios próprios é uma caracteristica essencial do sistema imunitário, quando este é perdido, pode resultar numa doença auto-imunitária. 0 sistema imunitário adaptativo deverá manter a capacidade para responder a uma enorme variedade de agentes infecciosos evitando simultaneamente o ataque auto-imune dos próprios antigénios contidos nos próprios tecidos. Isto é controlado numa maior extensão pela sensibilidade dos linfócitos T imaturos para a morte de células apoptóticas no timo (tolerância central). No entanto, nem todos os antigénios próprios são detectados no timo, por isso a morte dos timócitos auto-reactivos permanece incompleta. Existem assim também mecanismos através dos quais a tolerância pode ser adquirida através dos linfócitos T auto-reactivos maduros nos tecidos periféricos (tolerância periférica). É apresentada uma revisão 16 dos mecanismos de tolerância central e periférica em Anderton et ai., (1999) (Immunological Reviews 169:123-137). A tolerância pode resultar de ou ser caracterizada pela indução de anergia em, pelo menos, uma porção das células T CD4+. De modo a activar uma célula T, um péptido deve ser associado com uma APC "Professional" capaz de distribuir dois sinais às células T. 0 primeiro sinal (sinal 1) é distribuído por um complexo MHC-péptido na superfície celular da APC e é recebido pelas células T via o TCR. 0 segundo sinal (sinal 2) é distribuído por moléculas costimulatórias na superfície da APC, tal como CD80 e CD86, e recebido por CD28 na superfície da célula T. Pensa-se que quando uma célula T recebe o sinal 1 na ausência do sinal 2, não é activada e, de facto, torna-se anérgica. as células T anérgicas são refractárias para o estimulo do antigénio subsequente e podem ser capazes de suprimir outras respostas imunes. Pensa-se que as células T anérgicas estão envolvidas na mediação da tolerância das células T.

Sem desejar estar ligado pela teoria, a presente requerente previu que os péptidos que necessitam de processamento antes de poderem ser apresentados em conjunto com moléculas MHC não induzem tolerância porque foram manuseados pelas células apresentadoras de antigénio maduras. As células apresentadoras de antigénio maduras (tal como macrófagos, células B e células dendríticas) são capazes de processamento de antigénio, mas também de distribuição de ambos os sinais 1 e 2 a uma célula T, conduzindo à activação das células T. Os apitopos, por outro lado, serão capazes de ligar MHC de classe II em APC imaturas. Assim, serão apresentados às células T sem co-estimulação, conduzindo a anergia e tolerância das células T. 17

Com certeza, os apitopos são também capazes de se ligar a moléculas MHC na superfície celular de APC maduras. No entanto, o sistema imunitário contém uma maior abundância de APC imaturas relativamente a APC maduras (tem sido sugerido que menos de 10% das células dendríticas são activadas, Summers et al., (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295) . A posição por defeito para um epitopo será, deste modo, anergia/tolerância, em vez de activação.

Foi demonstrado que, quando a tolerância é induzida por inalação do péptido, a capacidade das células T CD4+ específicas para antigénio para proliferar é reduzida. Também, a produção de IL-2, IFN-y e IL-4 por estas células é regulada negativamente, mas a produção de IL-10 é aumentada. A neutralização de IL-10 em murganhos num estado de tolerância induzida por péptido tem demonstrado restaurar completamente a susceptibilidade à doença. Foi proposto que uma população de células regulatórias persiste no estado de tolerância que produz IL-10 e medeia a regulação imunitária (Burkhart et al., (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634). A indução da tolerância pode, deste modo, ser monitorizada por várias técnicas incluindo: (a) susceptibilidade reduzida para contrair a doença para a qual o péptido é um epitopo alvo in vivo; (b) a indução de anergia em células T CD4+ (que pode ser detectada por estimulo subsequente com antigénio in vitro); (c) alterações na população de células T CD4+, incluindo (i) redução na proliferação; 18 (ii) regulação negativa na produção de IL-2, IFN-γ e IL-4; e (iii) aumento na produção de IL-10.

Doença alvo 0 péptido da invenção pode ser utilizado no tratamento e/ou prevenção de uma doença.

Os péptidos da presente invenção são particularmente úteis no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS). A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crónica caracterizada por lesões de desmielinação múltipla disseminada por toda a matéria branca do SNC e ocorrendo em vários locais e tempos (McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 e 1246-1251). Pensa-se que a MS é mediada pelas células T autorreactivas. A MBP é imunogénica e os linfócitos T específicos de MBP têm actividade encefalitogénica em animais (Segai et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317:355-8).

Composição Farmacêutica

Num segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais péptido(s) do primeiro aspecto da invenção. A composição pode compreender 19 também um ou mais apitopos de outra região de MBP ou de um antigénio diferente. A presente requerente previu que, apesar da "supressão espectadora" pode ser necessário direccionar vários clones de células T diferentes de modo a induzir tolerância de um modo eficaz. Deste modo, podem ser administrados vários péptidos a um indivíduo de modo a prevenir ou tratar uma doença. A composição farmacêutica pode, por exemplo, compreender entre 1 e 50 apitopos, de um modo preferido, entre 1 e 15 apitopos. Se existir mais do que um apitopo, de um modo preferido, os apitopos são todos capazes de se ligar a MHC classe I ou todos capazes de se ligar a MHC de classe II, sem processamento posterior.

Quando existirem dois ou mais apitopos, a composição farmacêutica pode estar na forma de um kit, no qual alguns ou cada um dos apitopos são proporcionados em separado para administração simultânea, separada ou sequencial.

Alternativamente (ou em adição), se a composição farmacêutica (ou qualquer parte dela) é para ser administrada em doses múltiplas, cada dose pode ser embalada em separado. A composição farmacêutica pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do ou de cada apitopo e, opcionalmente, um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Também, nas composições farmacêuticas da presente invenção, o ou cada apitopo pode ser misturado com qualquer ligando(s), 20 lubrificante (s), agente(s) de suspensão, agente (s) de revestimento ou agente(s) de solubilização adequadas.

Administração 0 péptido pode ser administrado na forma solúvel na ausência de adjuvante.

De um modo preferido, o péptido é administrado através de uma via mucosal.

Os estudos demonstraram que o péptido, quando administrado na forma solúvel intraperitonealmente (i.p.), intravenosamente (i.v.), intranasalmente (i.n.) ou oralmente pode induzir a tolerância das células T (Anderton e Wraith (1998) como acima; Liu e Wraith (1995), como acima; Metzler e Wraith (1999) Immunology 97:257-263).

De um modo preferido, o péptido é administrado intranasalmente.

Estudos em murganhos demonstraram que a duração da administração do péptido necessária para induzir tolerância depende da frequência do precursor das células T no recipiente (Burkhart et al., (1999), como acima). Em muitos estudos experimentais, foi demonstrado que são necessárias as doses repetidas de péptido para induzir tolerância (Burkhart et al., (1999), como acima) . A dose exacta e número de doses de péptido irão, deste modo, depender do indivíduo, no entanto, numa forma de realização preferida, são administradas várias doses. 21

Se forem administrados vários péptidos simultaneamente, estes podem estar na forma de um "cocktail" que é adequado para administração em doses simples ou múltiplas. Alternativamente pode ser preferido administrar doses múltiplas mas variar as concentrações relativas dos péptidos entre doses.

Numa forma de realização preferida, pode ser seguido um protocolo de "aumento de dose em escala", em que são administradas várias doses ao doente em concentrações crescentes. Tem sido utilizada tal abordagem para, por exemplo, péptidos de fosfolipase A2 em aplicações imunoterapêuticas contra a alergia a veneno de abelha (Muller et al., (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 e Akdis et al., (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invenção, mas não deverão ser construídos como uma sua limitação. A invenção refere-se particularmente a formas de realização específicas descritas nestes exemplos. 22

EXEMPLO 1- Identificação de apitopos dentro da região 134-154 de MBP

Materiais e Métodos

Antigénios A MBP humana é preparada a partir da matéria branca do cérebro como descrito por Deibler et al., (Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2:139) e a sua pureza avaliada por SDS-PAGE. A MBP e o derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis (PPD) (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) são utilizados em ensaios proliferativos às concentrações óptimas previamente determinadas; a concentração óptima para cada antigénio é de 20 pg/mL. É sintetizado um painel de péptidos com 15-mero em sobreposição abrangendo toda a região 131-158 da MBP são sintetizados utilizando a guimica F-moc convencional num sintetizador de péptidos múltiplos Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemanha). Cada péptido é apresentado por um 1 aa e sobreposto por 14 aa.

Meio de cultura de tecidos 0 meio RPMI-1640 suplementado com HEPES 20 mM (Sigma, Poole, RU), penicilina (100 U/mL), sulfato de estreptomicina (100 mg/mL) e L-glutamina 4 mM (todos da Life Technologies, Paisley, Escócia), é utilizado como o meio de cultura de tecidos. É utilizado meio sem soro para lavar as células linfóides e TCL. Para todas as condições de cultura e ensaios, o meio é suplementado com plasma autólogo inactivado por calor a 10%. 23

Geração de clones das células T

As linhas de células T específicas para MBP (TCL) são geradas a partir de 8 doentes com MS e 2 dadores controlo saudáveis. As PBMC de cada indivíduo são separadas como descrito acima e colocadas a lxlO6 células/mL em placas de 6 poços na presença de MBP (50 pg/mL); uma porção de PBMC de cada indivíduo é regularmente congelada e armazenada para reestimulação subsequente. Sete dias mais tarde, as células são espalhadas com meio fresco contendo IL-2 a 2% (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, RU) e no dia 12 de cultura todas as células são reestimuladas com antigénio, IL-2 e irradiadas (2500 Rad) com PBMC autólogo como uma fonte de células apresentadoras de antigénio (APC), a uma proporção celular de células T 1: APC 5. As células são expandidas em IL-2 a cada 3-4 dias e no dia 14 são reestimuladas com antigénio, IL-2 e PBMC, como descrito acima. No dia da primeira reestimulação, as células são examinadas para proliferação específica a MBP. Resumidamente, 2xl04 de células T e lxlO5 de PBMC autólogas irradiadas são cultivadas em triplicado em placas de fundo redondo de 96 poços, na presença de MBP. As células são cultivadas durante 2 dias e pulsadas com (3H)-Timidina a 0,4 pCi/poço durante, pelo menos, 18 horas de cultura. As células são depois recolhidas como descrito acima e uma TCL é considerada como sendo específica de MBP com um õcpm >1000 e um SI>3.

Após 3 ciclos de reestimulação/expansão são clonadas TCL utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, RU)) na presença de PBMC autólogas irradiadas como APC. As células T são plaqueadas sob condições de diluição limitadas 0,1 célula/poço, 0,3 célula/poço e 1 célula/poço e cultivadas em placas Terasaki (Nunc International, Costar) com lxlO4 de PBMC irradiado, 5 pg/mL de 24 PHA e IL-2 a 2%. Após 10-12 dias, os poços de crescimento positivo são expandidos em placas de fundo redondo de 96 poços, utilizando lxlO5 de PBMC irradiadas, PHA a 5 pg/mL e IL-2. Três dias mais tarde os poços são alimentados com meio fresco contendo IL-2 e no dia 7 os clones são expandidos em placas de 48 poços utilizando 5xl05 de PBMC irradiado, PHA e IL-2; neste ponto, os clones são testados em ensaios de proliferação para respostas especificas a MBP. Os clones específicos de MBP são expandidos uma semana mais tarde em placas de 2 4 poços utilizando lxlO6 de PBMC irradiadas com PHA ou Dynabeads (Dynal, RU) e IL-2. Os clones são mantidos em placas de 24 poços utilizando um ciclo de 7-10 dias de reestimulação/expansão.

Ensaio de Proliferação

As células Mgar vivas ou fixas com p-formaldeído (HLA-DR2 +ve) foram incubadas com péptidos no soro ou só no soro, em conjunto com células T. A resposta proliferativa das células T foi medida por captura de 3H-timidina como se segue. As aliquotas em triplicado de 100 pL de cada cultura foram crescidas numa placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços durante 48 horas, depois pulsadas com 0,4 pCi [3H]-Timidina (Amersham International, Amersham, RU) . Após 20 horas, as células foram recolhidas em pratos de fibra de vidro (LKB-Wallac, Turku, Finlândia), utilizando um colector 96 Mach 111 (Tomtec, Orange, Nova Jersey, EUA). A incorporação da [3H]-Timidina é determinada utilizando um contador de cintilação líquida Microbeta (LKB-Wallac) . Os poços de teste contendo antigénio são considerados positivos quando o õcpm >1000 e o índice de Estimulação (SI) >3, em que SI = CPM da cultura com antigénio/CPM da cultura sem antigénio. 25

Resultados A resposta do clone MS60:D2 das células T à apresentação dos péptidos MBP inseridos na região 131-158 é apresentada na Figura 1. Os péptidos 134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153 e 140-154 são definidos como apitopos porque podem ser apresentados por APC fixas a células T sem processamento posterior. A resposta do clone N5 das células T à apresentação do péptido 140-154 é apresentada na Figura 2. Isto confirma também que o péptido 140-154 pode ser apresentado por APC fixas sem processamento posterior. EXEMPLO 2 - Identificação do epitopo mínimo reconhecido

pelos clones N5 e MS60:D2 das células T

As células Mgar vivas foram incubadas com péptidos sobrepostos da região 136-157 de MBP no soro ou só no soro, em conjunto com células T N5. A proliferação das células T foi medida por captura da 3H-timidina.

Os resultados são apresentados na Figura 3. O epitopo mínimo reconhecido pelo clone N5 das células T é MBP 142-152.

Foi efectuada uma experiência semelhante para o clone MS60:D2 das células T (Fig. 1, Mgar não fixo) . O epitopo mínimo reconhecido por este clone das células T é MBP 140-148.

Serão evidentes várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção para os especialistas na 26 técnica. Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com formas de realização preferidas especificas, deverá ser entendido que a invenção, como reivindicada, não deverá ser, de um modo desnecessário, limitada a tais formas de realização especificas.

Lisboa, 19 de Outubro de 2010 27

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido que é capaz de se ligar a uma molécula de MHC classe I ou II sem processamento posterior e que é seleccionado dos seguintes péptidos proteicos básicos da mielina: YKSAHKGFKGVDAQG (134-148), KSAHKGFKGVDAQGT (135-149), SAHKGFKGVDAQGTL (136-150), AHKGFKGVDAQGTLS (137-151), HKGFKGVDAQGTLSK (138-152), GFKGVDAQGTLSKIF (140-154).
2. 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que é o péptido da proteina básica da mielina GFKGVDAQGTLSKIF (140-154).
3. 3. Composição farmacêutica compreendendo um ou mais péptidos de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, compreendendo entre 1 e 15 péptidos da proteína básica da mielina tolerogénica.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 ou 4 na forma de um kit, em que alguns ou cada um dos péptidos 1 sao proporcionados separadamente para administraçao simultânea, separada ou sequencial.
6. 6. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para administração intranasal.
7. 7. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 na preparação de um medicamento para utilização na prevenção e/ou tratamento de esclerose múltipla. Lisboa, 19 de Outubro de 2010 2