KR102585625B1 - 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다: (ⅰ) 아미노산 서열 KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호: 1과 적어도 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 서열; 및 (ⅱ) 아미노산 서열 GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호: 2와 60 % 이상의 서열 상동성을 지니는 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 그레이브스 병에서 자가 항체 형성을 활성화 또는 예방하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

조성물 {Composition}
본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR)로부터 유래된 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물 또는 펩타이드는 그레이브스 병(GD)의 치료 및/또는 예방에 유용한 TSHR 자가항체의 예방 및/또는 생성 억제에 유용한 것이다.
그레이브스 병은 갑상선에 영향을 미치는 자가 면역 질환이다. 그것은 갑상선 호르몬의 과도한 양의 생성과 이에 따른 갑상선의 확대증 (goitre)의 결과 갑상선의 기능이 항진됨을 특징으로 하고 있다. 갑상선 기능 항진증은 다양한 범위의 신경정신증 및 신체적 증상의 원인이 될 수 있다. 그레이브스 병(GD)은 모든 갑상선 기능 항진증의 60-90 %를 차지하는 가장 흔한 원인이며 일반적으로 중년 이후에 발병하나 어린이, 청소년 및 노인에게도 나타날 수 있다. 그레이브스 병은 여성 인구의 2% 정도까지 발병되고 있으며, 남성보다 5 내지 10배 이상 여성에게 흔하게 발병되는 질환이다. 소아 그레이브스 병은 미국에서 약 6,000명의 어린이와 유럽 연합(EU)에서 6,000명의 어린이가 각각 발병하고 있으며 이는 경미한 형태의 항진증과 비교하여 더욱 심한 임상 징후와 증상 및 실험적 비정상 증상을 동반한다.
그레이브스 병에 관련된 강력한 유전적 요소가 있다. 그레이브스 병에 관한 최근 인구 역학적 연구는 없으나, 갑상선 기능 항진증에 대한 일부의 유사 인구 역학적 연구는 존재하고 그레이브스 병의 발병과 유병률에 관한 모든 수치가 개략적으로 알려져 왔다. 갑상선 기능 항진증의 발생 빈도는 10만명 당 26명 내지 93명이고 전체적 유병률은 1.3% 정도이며 이 중 42% 정도는 명백한 질환이고 62% 정도는 경미한 질환으로 예측된다.
GD 질환의 환자 중 약 30 내지 50%는 그레이브스 안구병증(GO)인 하나 또는 양쪽 눈의 돌출을 나타내게 된다. 대개의 경우 GO는 경미하지만 20% 정도는 심각하거나 중증도의 질환을 경험하게 되어 이들 중 적어도 반 이상은 스테로이드를 요구하게 되고 GO 환자의 3 내지 5%는 갑상선 안구 질환(DON)의 증상으로 인해 고통과 시야 감소의 증상을 경험하게 된다. 눈의 움직임은 각막의 심한 건조를 야기시켜 한밤중에도 눈썹을 감기 어렵게 되며 시신경 내의 압력 증가는 시야 결손 및 시력 상실을 초래할 수 있다. GO는 전경골(pretibial) 점액수종과 관련되어 있다.
GD의 증상 및 징후는 GO, 갑상선종 및 전경골 점액수종을 제외하고는 갑상선 기능 항진증의 직 간접적 효과로부터 대부분 야기된다. 갑상선 기능 항진증의 증상은 불면증, 손 떨림, 과민반응, 탈모, 과도한 발한, 열 과민증 및 증가된 식욕에도 불구한 체중 감소를 포함할 수 있다. 또 다른 증상으로는 대개 대칭적으로 비대해진 딱딱한 갑상선, lid lag(안구돌출로 인해 눈꺼풀이 정상상태보다 위로 치켜 올려진 상태), GO로 인한 과도한 눈물 흘림, 심장의 부정맥 및 고혈압 등이 있다. 갑상선 항진 환자들은 정신 질환, 불안 및 우울증과 같은 행동 및 성격 변화를 경험하게 된다. 경미한 갑상선 기능 항진증의 경우 환자들은 예를 들어, 불안, 안절부절 못함, 과민성, 정서적 불안장애와 같은 예후를 경험할 수 있다.
현재 그레이브스 병의 치료법은 존재하지 않으며 따라서 현존하는 치료법은 증상 완화를 목표로 삼는다.그레이브스 병 증상에 대한 세 가지 치료방법으로 경구투여 항갑상선 약물(ATDs) 투여, 방사선 요오드(RAI) 치료법 및 갑상선 절제술이 있다. 후자의 두 가지 방법은 일생 동안 갑상선 호르몬의 보충이 필요하다. 미국에서 가장 일반적인 치료법은 방사선 요오드 치료법이며 이와 상이하게 유럽, 일본 및 세계 대부분의 다른 국가에서는 ATD를 첫 번째 치료법으로서 적용하고 있다.
ATD 치료법은 경미한 부작용과 50 내지 60%에 달하는 증상 완화를 나타낸다. 방사선 요오드 치료법이 GO 발병을 야기시키거나 악화시킬 수 있다는 인식이 늘어남에 따라 미국 내에서도 ATDs로 치료받는 환자의 수가 증가하고 있다.
각각의 치료 방법의 성공 가능성이 서로 다르기 때문에 환자들은 첫 번째 치료법이 완벽히 효과적이지 않다면 하나 이상의 다른 방법을 선택할 수도 있다. 재발 또는 연속적 갑상선 기능 저하증의 위험성이 존재하기 때문에 그레이브스 병에 적용 가능한 일반적인 치료법이 요망된다. 따라서 그레이브스 병을 더욱 효과적으로 치료하고 질병의 증상을 경감 또는 저하시킬 수 있는 그레이브스 병의 대체적 치료법이 요구된다.
그레이브스 병에 대한 대체 요법의 개발은 후보 치료법의 잠재적 효능을 평가하기 위한 관련 모델, 특히 동물 모델의 부족으로 인해 어려움이 있었다. 그레이브스 병에 대한 알려진 BALB/c 마우스 모델은 그레이브스 병에 대한 승인된 약물 예를 들면 메티마졸 및 메틸프레드니솔론의 유효성을 측정하는데 유용하지 않다.
따라서 그레이브스 병과 같은 TSHR 자가항체의 생산과 관련된 질병을 치료하고 예방하기 위한 대체 요법이 필요하며 이는 또한 그레이브스 병을 치료하고 질병의 증상을 경감시키거나 감소시키는 데 효과적인 대체 요법이 필요하다. 따라서 그레이브스 병 치료제의 잠재적 효능을 평가하기 위한 대체 모델 역시 요구되고 있다.
본 발명자들은 2개의 TSHR 펩타이드의 "칵테일"이 그레이브스 병의 치료에 필요한 TSHR 자가항체의 생체 내 생성의 억제 또는 예방에 특히 효과적이라는 것을 발견하였다.
따라서 첫번째 측면에서 본 발명은 하기 TSHR 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다:
(ⅰ) 아미노산 서열 KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 1의 서열과 60 % 이상의 상동성을 지니는 서열; 및
(ⅱ) 아미노산 서열 GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 2의 서열과 60 % 이상의 상동성을 지니는 서열을 포함한다.
서열 KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)은 또한 본 명세서 내에서 RNB-5D-K1이라 지칭된다. 서열 GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)은 또한 본 명세서 내에서 RNB-9B로 지칭된다.
본 발명에 따른 조성물은 본 명세서 내에 기재된 본 발명의 치료학적 측면에서 적용될 수 있다.
두번째 측면에서 본 발명은 생체 내 TSHR 자가항체의 생성을 억제 또는 예방하는데 유용한 본 명세서에 기재된 본 발명의 펩타이드를 제공한다.
세번째 측면에서 본 발명은 피험자에 그레이브스 병을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 펩타이드를 제공한다.
네번째 측면에서 본 발명은 생체 내 TSHR 자가항체의 생성을 억제 또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 본 발명의 펩타이드의 용도를 제공한다.
다섯번째 측면에서 본 발명은 그레이브스 병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 본 발명의 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
여섯번째 측면에서 본 발명은 피험자에 서열번호: 1의 펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 적어도 60%의 서열 상동성을 지니는 펩타이드, 및 서열번호: 2의 펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 적어도 60% 서열 상동성을 지니는 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 피험자에 TSHR 자가항체의 생성을 억제 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
일곱번째 측면에서 본 발명은 서열번호: 1의 펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 적어도 60%의 서열 상동성을 지니는 펩타이드, 및 서열번호: 2의 펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 적어도 60% 서열 상동성을 지니는 펩타이드를 피험자에 복용시키는 단계를 포함하는 그레이브스 병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
하나의 측면에서 조성물은 하기 펩타이드를 포함(comprise)하거나 함유(include)하지 않는다 :
RNB-4K-GKK: KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK
본 발명에 따른 펩타이드 조성물은 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서 펩타이드 조성물은 본 명세서에 기재된 본 발명의 아미노산 서열 만으로 이루어져 있다.
피험자는 HLA-DR3일 수 있다. 피험자는 HLA-DR4일 수 있다.
본 명세서에 정의된 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 용량 증가 프로토콜에 따라 투여될 수 있다.
여덟번째 측면에서 본 발명은 동시, 개별 또는 순차적인 투여를 위한 하기 TSHR 펩타이드를 포함하는 키트에 관한 것이다:
(ⅰ) 아미노산 서열 KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 1과 적어도 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 서열; 및
(ⅱ) 아미노산 서열 GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 2와 적어도 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 서열;
키트는 그레이브스 병과 같은 TSHR 자가항체 생성과 관련된 증상의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.
아홉번째 측면에서 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 그레이브스 병의 치료, 예방 또는 관리에 사용되는 추가의 치료제와 병용된다. 예를 들어 펩타이드 또는 조성물은 항-갑상선제 또는 β-차단제와 병용될 수 있다.
아홉번째 측면에서 본 발명은 TSHR 항체의 생성과 연관된 질병에 대한 동물 모델에 관한 것으로 상기 동물은 인간 HLA-DR3에 의해 형질 전환되고 TSHR 수준은 적합한 대조 동물 보다 생체 내에서 증가되어 있다. 하나의 측면에서 TSHR 수준은 TSHR 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터의 투여를 통해 증가된 것이다.
TSHR 항체 생성과 관련된 질병은 그레이브스 병일 수 있다.
TSHR은 인간 TSHR일 수 있다. 예를 들어 TSHR은 인간 TSHR A 서브 유니트 또는 세포 외 도메인(ECD)일 수 있다.
바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 컨스트럭트일 수 있다.
아데노바이러스 벡터 또는 컨스트럭트는 3주 간격으로 투여 될 수 있다. 아데노바이러스 벡터 또는 컨스트럭트는 2회 또는 3회 연속 투여로 투여될 수 있다.
아데노바이러스 벡터 또는 컨스트럭트는 109 내지 1011 바이러스 입자의 용량으로 투여된다. 아데노바이러스 벡터 또는 컨스트럭트는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
동물은 마우스일 수 있다. 마우스는 HLA-BRD1*0301로 형질전환된 마우스 일 수 있다.
도 1 - 5D-K1 처리는 DR3tg 마우스 내에서 TSHR-유도 증식을 저하시킨다.
DR3tg 마우스에 100㎍을 최대 용량으로 하여 용량 증가 프로토콜에 따라 시험군에는 5D-K1(GLS)로 전처리하였고 대조군에는 HLA-DR3 결합 펩타이드(GLS)(1군 당 개체 수 = 10)로 전처리 하였다. 동물들은 CFA로 50㎍ 5D(GLS) 면역화 시키고 10일 후에 TSHR-특이적 증식을 평가하기 위해 림프절과 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군-처리 마우스(적색 라인) 및 펩타이드-처리 마우스(청색 라인)에 대한 자극 지수(SI) 값의 평균±표준 오차(SEM)로 나타낸다. 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)은 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하는 데 사용되었으며 p 값은 그래프에 기록하였다. Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었고 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001). 펩타이드-처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 평균 백분율 감소를 그래프에 나타내었다. SI는 자극 지수를, LN은 림프절을 의미한다.
도 2 - 9B-N 처리는 DR3tg 마우스 내에서 TSHR-유도 증식을 저하시킨다.
DR3tg 마우스에 33㎍을 최대 용량으로 하여 용량 증가 프로토콜에 따라 9B-N (PPL) 또는 PBS(개체 수 = 10/군)로 전처리 하였다. 동물들은 CFA로 50㎍ 9B(GLS) 면역화 시키고 10일 후에 TSHR-특이적 증식을 평가하기 위해 림프절과 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군-처리 마우스(적색 라인) 및 펩타이드-처리 마우스(청색 라인)에 대한 자극 지수(SI) 값의 평균±표준 오차(SEM)로 나타낸다. 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)은 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하는 데 사용되었으며 p 값은 그래프에 기록하였다. Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었고 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001). 펩타이드-처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 평균 백분율의 감소를 그래프에 나타내었다. SI는 자극 지수를, LN은 림프절을 의미한다.
도 3 - ATX-GD-59 처리는 ADR3tg 마우스 내에서 TSHR-유도 증식을 감소시킨다.
DR3tg 마우스에 각 펩타이드 당 15 nmol를 최대 용량으로 하여 용량 증가 프로토콜에 따라 ATX-GD-59(PPL) 또는 HIP-15F-GKK 대조군 펩타이드(GLS)(군 당 개체 수 = 10)로 전처리 하였다. 동물들은 CFA로 부모 펩타이드 5D(Severn)와 9B(PPL) 30nmol를 면역화 시키고 10일 후에 TSHR-특이적 증식을 평가하기 위해 림프절과 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군 처리 마우스(적색 라인) 및 펩타이드 처리 마우스(청색 라인)에 대한 자극 지수(SI) 값의 평균±표준오차(SEM)로 나타낸다. 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)은 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하는 데 사용되었으며 p 값은 그래프에 기록하였다. Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었고 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001). 펩타이드-처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 평균 백분율 감소를 그래프에 나타내었다. SI는 자극 지수를, LN은 림프절을 의미한다. 데이터는 두 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다.
도 4 - ATX-GD-59 처리는 Ad-TSHR 면역화된 DR3tg 마우스 내에서 TSHR-특이적 비장 세포 증식을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 11)에 22.5 pmol, 225 pmol 및 2250 pmol의 ATX-GD-59로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-59 펩타이드를 22.5 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ를 3주 간격으로 2회(0일 및 21일) 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하고 TSHR 특이적 증식을 평가하기 위해 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군 마우스(적색 라인) 및 펩타이드 처리 마우스(청색 라인)에 대한 분당 절대 카운트(cpm; 왼쪽 그래프) 또는 자극 지수(SI; 우측 그래프)의 평균±표준오차(SEM)로 나타낸다. 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)은 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하는 데 사용되었으며 p 값은 그래프에 기록하였다. Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었고 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001). 펩타이드 처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 전반적인 평균 감소 백분율을 그래프에 나타내었다. 데이터는 두 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다.
도 5 - 예방적 ATX-GD-59 처리는 항-TSHR 항체 수치를 감소시킨다.
DR3tg 마우스에 22.5 pmol, 225 pmol 및 2250 pmol의 ATX-GD-59로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사(개체 수 = 11)하거나 대조군(개체 수 = 11) 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-59 펩타이드를 22.5 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ를 3주 간격으로 2회(0일 및 21일) 근육 주사하였다. 시험 전, 첫 번째 면역 직전, 2주 후 및 5주 후에 ELISA로 항-TSHR 총 IgG 수준을 측정하기 위해 혈액을 채취하였다. 각각의 점은 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항 TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001). 데이터는 두 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다.
도 6 - 예방적 ATX-GD-59 처리는 상이한 항-TSHR 항체 이소-타입 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스에 22.5 pmol, 225 pmol 및 2250 pmol의 ATX-GD-59로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사(개체 수 = 11)하거나 대조군(개체 수 = 11) 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-59 펩타이드를 22.5 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ(개체 수 = 7)를 3일 간격으로 2회(0일 및 3일) 근육 주사하였다. 시험 전, 첫 번째 면역 직전, 2주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 2주에 ELISA로 항-TSHR 이소-타입 IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항 TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001). 데이터는 두 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였다.
도 7 - Ad-TSHR 면역화된 DR3tg 마우스에서의 자극적 항-TSHR 항체의 발현
DR3tg 마우스에 22.5 pmol, 225 pmol 및 2250 pmol의 ATX-GD-59로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사(개체 수 = 11)하거나 대조군(개체 수 = 11) 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-59 펩타이드를 22.5 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ(개체 수 = 7)를 3일 간격으로 2회(0일 및 3일) 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 혈청을 채취하여 CHO-세포 분석법으로 분석하였다. 각각의 점은 5주 경 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹 당 평균±SEM으로 나타내었다. Mann-Whitney 시험법을 사용하여 자극 TSHR-항체 수준의 차이를 측정하였으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001). 결과는 3번 이상의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. RLU는 상대 광 유니트(자극된 세포의 발광 / 비자극된 세포의 발광)를 나타낸다.
도 8 - MMI 및 ATX-GD-459 공동 투약 연구의 개요
마우스에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드 또는 대조군 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하였다. -15일부터 마우스에 피하 이식된 삼투 펌프를 통해 담체 또는 메티마졸 처리하였다. 그 후 마우스에 109 Ad-TSHR 입자를 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역 2주전 및 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 및 5주 후에 혈액을 채취하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하고 혈액, 갑상선 및 비장 샘플을 채취하였다.
도 9 - 프로프라놀롤과 ATX-GD-459 공동 투약 연구의 개요
마우스에 15 pmol, 150 pmol and 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드 또는 대조군 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하였다. -15일부터 마우스에 복강 내 주사를 통해 담체 또는 프로프라놀롤 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR 입자를 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역 2주전 및 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 및 5주 후에 혈액을 채취하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하고 혈액, 갑상선 및 비장 샘플을 채취하였다.
도 10 - Ad-TSHR 면역화 된 DR3tg 마우스에서의 TSHR-특이적 비장 세포 증식
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 7~10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 복강 내 주사를 통해 담체 또는 프로프라놀롤 처리하였다. -15일부터 마우스에 피하 이식된 삼투압 펌프를 통해 비히클(풀 심볼) 또는 MMI(오픈 심볼) 처리하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하고 TSHR 특이적 증식을 평가하기 위해 비장을 채취하였다. 양방향 분산 분석이 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하는 데 사용되었고 Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었다. 유의미한 차이를 본 명세서 내에 기재하였다.
도 11 - MMI 처리가 아닌 ATX-GD-459가 항-TSHR IgG 항체 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 7~10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 피하 이식된 삼투 펌프를 통해 비히클 또는 MMI로 처리하였다. 그 후 마우스에 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 12 - MMI 처리가 아닌 ATX-GD-459가 항-TSHR lgG2b 및 lgG2c 항체 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 7~10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 피하 이식된 삼투 펌프를 통해 비히클 또는 MMI로 처리하였다. 그 후 마우스에 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 2주에 측정된 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항-TSHR lgG1, lgG2b 및 lgG2c 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 13 - MMI 처리는 혈청 T4 농도를 유의미하게 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 7~10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 피하 이식된 삼투 펌프를 통해 비히클 또는 MMI로 처리하였다. 그 후 마우스에 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 T4 수준을 측정하였다. 각각의 점은 5주에 측정된 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 T4 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 14 - Ad-TSHR 면역화된 DR3tg 마우스에서의 TSHR-특이적 비장 세포 증식
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 매일 복강 내 주사를 통해 비히클(풀 심볼) 또는 프로프라놀롤(오픈 심볼) 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였으며 TSHR-특이 증식을 측정하기 위해 비장을 채취하였다. 데이터는 분당 절대 계수(cpm, 좌측 그래프), 자극 지수 값(SI, 중간 그래프) 또는 보정 계수(Δcpm, 우측 그래프)의 평균±표준 오차를 나타낸다. 양방향 분산 분석을 사용하여 T 세포 증식에 대한 전반적인 처리 효과를 측정하였으며 Bonferonni post-hoc 시험법이 사용되었다. 유의미한 차이를 본 명세서 내에 기재하였다.
도 15 - 프로프라놀롤 처리가 아닌 ATX-GD-459가 항-TSHR IgG 항체 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 매일 복강 내 주사를 통해 비히클(풀 심볼) 또는 프로프라놀롤(오픈 심볼) 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 16 - 프로프라놀롤 처리가 아닌 ATX-GD-459가 TSHR IgG2b 및 IgG2c 항체 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 매일 복강 내 주사를 통해 비히클(풀 심볼) 또는 프로프라놀롤(오픈 심볼) 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 항-TSHR lgG1 , lgG2b 및 lgG2c 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 17 - 총 T4 수준은 프로프라놀롤 또는 ATX-GD-459 처리의 영향을 받지 않는다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459 펩타이드를 15 nmol 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. -15일부터 마우스에 매일 복강 내 주사를 통해 비히클(풀 심볼) 또는 프로프라놀롤(오픈 심볼) 처리하였다. 그 후 마우스에 1010 Ad-TSHR을 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 첫 번째 면역화 5주 후에 실험을 중단하였다. 첫 번째 면역 직전, 2주, 4주 후 및 5주 후에 혈액을 채취하였으며 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각각의 점은 5주에 측정된 한 마우스의 데이터를 나타내고 그룹 평균±SEM으로 나타내었다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 T4 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001).
도 18 - 프로프라놀롤의 혈장 수준으로 약리학적 복용량을 확인한다.
펩타이드와 프로프라놀롤이 투여된 대조군 마우스 및 마우스에서 혈장 프로프라놀롤 수준을 측정하였다. 혈장을 0주 및 5주에 채취하였고 결과를 나타내었다.
도 19 - 개략적 T 세포 내성 프로토콜
마우스에 0.1 ㎍, 1 ㎍ 및 10 ㎍ 펩타이드로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 펩타이드(ATX-GD-459 단일 펩타이드 또는 칵테일)를 3회 주사하였다. 최대 용량 및 상응하는 용량 증가는 실험마다 상이할 수 있다. 마우스를 0일째에 꼬리의 기저부에서 Complete Freund's 애쥬번트(CFA)로 펩타이드를 에멀젼화시켜 피하 주입하여 면역화 시켰다. 면역화 10일 후에 실험을 종료하고 TSHR 또는 펩타이드 재자극에 의한 림프절(LN) 세포 및 비장 세포의 증식을 측정하였다.
도 20 - ATX-GD-459 처리는 HLA-DR3 마우스에서 TSHR로 유도된 증식을 유효하게 감소시킨다.
(A) 100㎍의 최대 용량으로 용량 증가 스케쥴에 따라 HLA-DR4 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 RNB-4K-GKK 또는 PBS로 전처리 하였다. (B) 100㎍의 최대 용량으로 용량 증가 스케쥴에 따라 HLA-DR3 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 RNB-5D-K1 또는 HIP-16E(HLA-DR3 결합 조절 펩타이드)로 전처리 하였다. (C) 33㎍의 최대 용량으로 용량 증가 스케쥴에 따라 HLA-DR3 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 RNB-9B 또는 PBS로 전처리 하였다. 동물들은 CFA로 부모 펩타이드를 면역시켰고 10일 후에 TSHR-특이적 증식을 평가하기 위해 림프절과 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군-처리 마우스 및 펩타이드-처리 마우스에 대한 자극 지수(SI) 값의 평균±표준 오차를 나타낸다. 양방향 분산 분석(Two-way ANOVA)을 사용하여 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하였으며 p값은 그래프에 나타내었다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001). 펩타이드-처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 평균 백분율 감소를 그래프에 나타내었다. SI는 자극 지수를, LN은 림프절을 나타낸다. (D) 각 펩타이드 당 75㎍의 최대 용량으로 용량 증가 스케쥴에 따라 HLA-DR3 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 ATX-GD-459 또는 PBS로 전처리 하였다. 동물에 CFA로 면역화시킨 에멀젼화 4K/5D/9B를 투여하였으며 10일 후에 TSHR 특이적 증식을 평가하기 위해 림프절과 비장을 채취하였다. 데이터는 대조군-처리 마우스 및 펩타이드-처리 마우스에 대한 자극 지수(SI) 값의 평균±표준 오차를 나타낸다. 양방향 분산 분석(Two-way ANOVA)을 사용하여 T 세포 증식에 대한 전반적인 치료 효과를 측정하였으며 p값은 그래프에 나타내었다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****, p <0.0001). 펩타이드-처리에 의해 유도된 T 세포 증식의 평균 백분율 감소를 그래프에 나타내었다. SI는 자극 지수를, LN은 림프절을 나타낸다.
도 21 - 아데노바이러스 그레이브스 병 모델 및 검증의 개요
(A) 마우스에 TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR) 또는 β-갈락토시다아제(Ad-LacZ)를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 근육주사를 통해 면역화시켰다. 1010 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 2회 주사하였다. 각각의 실험 당 프로토콜에 대한 편차를 표시하였다. 첫 번째 면역화 전, 2주 및 4주 후에 혈액을 채취하였다. 실험은 첫 번째 면역화 4주 후에 종료되었으며 그레이브스 병과 유사한 증상 조사를 위해 혈액, 비장 및 갑상선을 채취하였다. (B) 마우스에 Ad-TSHR을 3주 간격으로 2회(0주 및 3주) 면역화 시켰다. 처리는 첫 번째 면역 일자에 피하 펌프 삽입을 통해 시작되었고 실험이 끝날 때까지 4주 동안 계속되었다. 혈액을 시험 전에, 첫 번째 면역화 2주, 4주 후에 채취하였다. 마우스를 첫 번째 면역화 4주 후에 안락사시켜 혈액과 비장 샘플을 채취하였다. (C) 마우스에 0.1㎍, 1㎍, 10㎍ 펩타이드를 -15, -13, -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 100㎍ 펩타이드를 3회 주사하였다. 그 후 마우스에 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ를 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 혈액을 시험 전에, 그리고 첫 번째 면역화 전과 2주, 5주 후에 채취하였다. 마우스를 첫 번째 면역화 5주 후에 안락사시켜 혈액과 비장 샘플을 채취하였다.
도 22 - Ad-TSHR 면역화 시 BALB/c 마우스에서 T4와 TSHR IgG 수준의 시간 경과에 따른 변화
TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR) 또는 β-갈락토시다아제(Ad-LacZ)를 발현하는 1010 또는 1011 아데노바이러스 벡터를 사용하여 근육주사를 통해 BALB/c 마우스(군 당 개체 수 = 6~7)를 면역화시켰다. 1010 또는 1011 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 3회 주사하였다(0주, 3주 및 6주). (A) ELISA로 T4 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹 당 평균±SEM을 나타낸다. 갑상선 기능 항진 마우스의 숫자는 그래프에 나타내었다. 발표된 데이터와 일치하여 갑상선 기능 항진증의 억제는 Ad-LacZ 면역화된 대조군 마우스 내의 정상 마우스 T4 수준의 평균 ± 2 표준 편차로 나타내었다. (B) ELISA로 항 TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. 단방향 분산분석을 사용하여 항 TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001).
도 23 - Ad-TSHR 면역화시 DR3tg 마우스에서 T4, 자극 TSHR-항체 및 항-TSHR 항체 역가의 변화
(A) DR3tg 마우스(군 당 개체수 = 10)에 TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR) 또는 β- 갈락토시다아제(Ad-LacZ)(군 당 개체수 = 12)를 발현하는 109 아데노바이러스 벡터로 근육주사를 통해 면역화시켰다. 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 2회 주사하였다(0주 및 3주). 혈청을 시험 전에, 첫 번째 면역화 2주 및 4주 후에 채취하고 ELISA로 T4 수준을 측정하였다. 각 점은 4주에 측정된 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. Mann-Whitney 시험법을 사용하여 T4 수준의 차이를 측정하였으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001). 결과는 3번 이상의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. (B) DR3tg 마우스(군 당 개체수 = 10)에 TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR) 또는 β-갈락토시다아제(Ad-LacZ)를 발현하는 109 아데노바이러스 벡터로 근육주사를 통해 면역화시켰다. 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 2회 주사하였다(0주 및 3주). 혈청을 시험 전에, 첫 번째 면역화 2주 및 4주 후에 채취하고 T4 수준을 CHO 루시퍼라제 리포터 유전자 분석법을 통해 측정하였다. 각 점은 4주에 측정된 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. Mann-Whitney 시험법을 사용하여 자극 TSHR-항체 수준의 차이를 측정하였으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001). 결과는 3번 이상의 독립적인 실험을 통해 수득하였다. RLU는 상대 광 유니트(자극된 세포의 발광 / 비자극된 세포의 발광)를 나타낸다. (C) BALB/c 마우스(군 당 개체수 = 10, 좌측 패널) 및 DR3tg 마우스(군 당 개체수=7, 우측 패널)에 TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR)를 발현하는 1010 아데노바이러스 벡터로 근육주사를 통해 면역화시켰다. 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 3회 주사하였다(0주, 3주 및 6주). 혈청을 시험 전에, 첫 번째 면역화 4주, 7주 및 10주 후에 채취하고 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. 단방향 분산분석을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001). (D) DR3tg 마우스(군 당 개체수 = 10)에 TSHR-A 서브 유니트(Ad-TSHR)를 발현하는 1010 또는 1011 아데노바이러스 벡터 또는 β- 갈락토시다아제(Ad-LacZ)를 발현하는 1010 아데노바이러스 벡터로 근육주사를 통해 면역화시켰다. 아데노바이러스 입자를 3주 간격으로 3회 주사하였다(0주, 3주 및 6주). 10주 후에 비장을 채취하고 삼중체화 티미딘 도입으로 TSHR 유도된 비장 세포 증식을 측정하였다. 결과는 그룹당 평균±SEM으로 나타내었다. Cpm는 분 당 카운트를 나타내며 SI는 자극 지수를 나타낸다.
도 24 - Ad-TSHR 면역화 후 DR3tg 마우스의 T4 및 항-TSHR 수준 상의 메티마졸 처리 효과
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 7~8)에 0주 및 3주에 Ad-TSHR로 면역화시켰다. 첫 번째 면역화 당일부터 피하 펌프 삽입을 통해 메티마졸(50 또는 500 ㎍/마우스/일) 또는 비히클 처리를 시행하였으며 시험 종료시 까지 4주간 계속되었다.
(A) 혈청을 시험 전에, 첫 번째 면역화 4주, 7주 및 10주 후에 채취하고 ELISA로 T4 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. 단방향 분산분석을 사용하여 T4 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001). (B) ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹당 평균±SEM을 나타낸다. 단방향 분산분석을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001).
도 25 - 메틸프레드니솔론 처리로 항-TSHR IgG 수준이 감소한다.
DR3tg 마우스(군 당 개체수 = 10)에 1010 Ad-TSHR로 0주 및 3주에 면역화시켰다. 첫 번째 면역화 3일 전에 피하 펌프 삽입을 통해 메틸프레드니솔론(Mpred)(7 mg/kg/일) 또는 비히클 처리를 주입하였으며 시험 종료시 까지 4주간 계속되었다. 혈청을 시험 전에, 첫 번째 면역화 2주 및 4주 후에 채취하고 ELISA로 항-TSHR IgG 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹 당 평균±SEM을 나타낸다. Mann-Whitney 시험법을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 차이를 측정하였으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001).
도 26 - ATX-GD-459 처리는 항-TSHR 항체 수준을 감소시킨다.
DR3tg 마우스(군 당 개체 수 = 10)에 0.1 ㎍, 1 ㎍ 및 10 ㎍의 ATX-GD-459로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 ATX-GD-459를 100 ㎍ 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ를 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 근육 주사하였다. 혈액을 시험 전에, 그리고 첫 번째 면역화 전과 2주, 5주 후에 채취하여 ELISA로 항-TSHR total IgG 수준을 측정하였다. 각 점은 하나의 마우스의 데이터를 나타내며 그룹 당 평균±SEM을 나타낸다. 단방향 분산분석을 사용하여 항-TSHR IgG 수준의 전반적인 차이를 측정하였다. Bonferroni post-hoc 시험법이 사용되었으며 유의미한 차이를 그래프에 나타내었다(*p <0.05, **p <O.01; ***p <O.001, ****p <0.0001).
도 27 - RNB-5D-K1 및 RNB-4K-GKK에 대한 하이브리도마 클론의 반응을 나타내는 APIPS 분석
RNB-5(클론 50+35) 또는 RNB-4(클론 164+455) 및 TSHR에 특이적인 5×104 T 세포 하이브리도마 클론을 TSHR 및 RNB-5D-K1 또는 RNB-4K-GKK의 존재하에 항원 제시 B 세포(VAVY)(클론 50)를 발현하는 5×104 인간 DR3 또는 B 세포(BM14)(클론 35, 164, 455)를 발현하는 5×104 인간 DR4를 사용하여 배양하였다. 항원 제시 세포(APC)는 배양 웰에 첨가하기 전에 생존시켰거나 0.5 % 파라포름알데히드로 미리 고정화시켰다. 공동 배양 48시간 후 상등액을 채취하고 ELISA로 분석하여 IL-2 분비 수준을 측정하였다. 대표 클론의 결과를 나타내었다.
본 발명은 그레이브스 병의 치료 및/또는 예방에 유용한 TSHR 자가항체의 생성을 예방 또는 억제하는 신규한 대체적 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 실시예 1에 나타난 바와 같이 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 펩타이드의 병용은 그레이브스 병 모델 내에서 TSHR의 내성을 야기시킨다.
따라서 본 발명의 첫 번째 측면은 바람직하게는 서열번호: 1 및 서열번호 2의 펩타이드인 본 명세서 내에서 정의하고 있는 본 발명의 펩타이드인 TSHR로부터 다수의 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
갑상선 자극 호르몬 수용체
그레이브스 병은 1차 자가 항원인 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR)를 목표로 하는 자가-반응 T 및 B 림프구에 의해 야기되는 자가면역 질환이다.
TSHR은 갑상선 내의 갑상선 난포 세포 위에 G-단백질 커플링된 수용체로서 리간드 결합을 위한 cAMP 신호 캐스케이드인 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 통해 티록신(T4) 및 트리요오도티로닌(T3)의 생성을 자극한다. APCs에 의한 TSHR의 내재화, 분해 및 제시에 따라 T세포는 활성화되고 자가-반응 B세포와 상호 반응하며 이에 대해 TSHR에 대한 반응성 자가-항체의 생성을 자극한다. 갑상선-자극 면역 글로불린은 TSH와 같이 동일한 수용체 포켓에서 결합하고 TSHR 매개 신호 변환을 활성화시키고 갑상선으로부터 과량의 갑상선 호르몬을 생성시켜 갑상선을 증식시킨다.
갑상선 자극 호르몬 수용체로 알려진 TSHR은 갑상선 상피 세포 상에서 일차적으로 발현된다.
TSHR 홀로수용체는 764개의 잔기를 지니고 TSH와 결합하는 N-말단 세포 외 도메인, 세르펜틴(또는 트랜스멤브레인 도메인) 및 C-말단 세포 내 도메인을 지닌다.
TSHR은 매우 잘 보존된 시스테인 잔기를 지닌 거대한 세포 외 도메인(418개 아미노산)을 포함하고 이는 리간드 결합 및 불활성화 수용체 입체형태 모두에 중요성을 지니는 세포 외 도메인 4차 구조의 형성을 용이하게 한다. 세포 외 도메인은 총 단백질 길이의 반 이상을 포함하며 고-친화성 리간드 결합에 충분하다. 세포 표면으로 수송된 이후에 수용체 분자는 내부-분자 절단을 유도하게 되고 이는 316 잔기 내지 366 잔기 사이의 50개 아미노산의 서열 이탈을 야기한다.
결과적으로 수용체는 두 개의 서브유니트를 포함하고 알파-서브유니트는 세포 외 리간드-결합 도메인을 포함하고 베타-서브유니트는 트랜스멤브레인 도메인과 짧은 C-말단 서열을 포함하며 서로 이황화 결합에 의해 결합되어 있다. 그 다음 단계는 알파-서브유니트를 제거하고 세포막 위에서 리간드-결합 도메인 고갈 베타-서브유니트의 과도한 생성을 야기한다.
TSH가 TSHR로 순환되어 결합된 이후에 G-단백질 신호화 캐스케이드는 아데니닐 시클라아제를 활성화시키고 cAMP의 세포 내 수준을 증가시킨다. cAMP는 요오드 펌프, 타이로글로블린 합성, 요오드화, 내포 작용(endocytosis)과 단백질 분해, 타이로이드 과산화효소 활성 및 호르몬 분비를 포함하는 갑상선 세포의 모든 기능을 활성화시킨다.
숙성된 TSHR의 아미노산 서열은 아래에 기재하였다(서열 번호: 3).

내성
T 세포 에피토프는 자가 또는 외부의 어떠한 항원에 대한 적응성 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 과민 질환(알레르기, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함)에 있어서 T 세포 에피토프에 의한 중추적 역할은 실험 모델을 이용하여 입증되었다. 애쥬번트와 함께 합성 펩타이드(T 세포 에피토프의 구조를 기반으로 한)의 주입에 의해 염증 또는 알레르기 질환의 유도가 가능하다.
이와 대조적으로 용해되는 형태의 펩타이드 에피토프의 투여에 의해 특정 항원에 대한 면역 내성을 유도하는 것이 가능한 것으로 나타났다. 용해 가능한 펩타이드 항원의 투여는 실험 자가면역 뇌척수염(EAE - 다발성 경화증 모델(MS)) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159- 1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); 및 관절염, 당뇨병 및 포도막 망막염(상기 Anderton and Wraith (1998)에서 관찰됨)의 실험 모델 내 질환을 억제하는 효과적인 방법으로 입증되었다. 또한 이는 EAE(상기 Anderton and Wraith (1998)) 내 진행성 질환의 치료 방법으로서 입증되었다.
내성은 항원에 대한 반응이 소실하는 것이다. 자가 항원에 대한 내성은 면역 체계의 필수적인 특징이고, 이것이 소실되면 자가면역 질환이 유발될 수 있다. 적응성 면역 체계는 다양하게 거대한 감염성 작용제에 반응할 수 있는 능력을 유지하면서 그 자신의 조직 내에 포함된 자가 항원의 자가면역 공격을 방지해야 한다. 이는 대부분 흉선(중추 내성) 내 아폽토시스성 세포사멸에 대한 미성숙 T 림프구의 민감성에 의해 제어된다. 그러나 모든 자가 항원이 흉선 내에서 탐지되지 않고, 따라서 자가-반응성 흉선세포의 사멸이 불완전하게 유지된다. 따라서 말초 조직(말초 내성) 내 숙성된 자가-반응성 T 림프구에 의해 내성이 수득되는 메커니즘이 존재한다. 중추 및 말초 내성의 메커니즘 고찰은 Anderton et al (1999)(Immunological Reviews 169:123-137)에 제공되어 있다.
그레이브스 병은 갑상선 호르몬 합성 및 분비와 갑상선 성장을 자극하는 TSHR에 결합하여 활성화시키는 TSHR 자극 자가항체에 의해 발생하는 것으로 현재 여겨지고 있다. 본 발명의 펩타이드는 TSHR의 내성을 유도할 수 있으며 이는 피험자에게 투여되었을 때 TSHR 자가-단백질에 대한 내성을 회복하고 병리적 면역 반응을 완화시킨다.
아피토프
적응성 면역 반응에 있어서 T 림프구는 단백질 항원의 내부 에피토프를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포(APC)는 단백질 항원을 포획하여 짧은 펩타이드 단편으로 분해시킨다. 펩타이드는 세포 내부에서 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 Ⅰ 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 세포 표면으로 운반된다. MHC 분자와 함께 세포 표면에 제시되었을 때 펩타이드가 T 세포 에피토프인 경우 T 세포(T 세포 수용체(TCR)를 통해)에 의해 펩타이드를 인식한다.
따라서 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈(groove)에 결합할 수 있는 항원으로부터 유래된 펩타이드이며 T 세포에 의해 인식되어지는 것이다.
최소 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자의 펩타이드-결합 홈에 결합 가능하고 T 세포에 의해 인식 가능한 에피토프에서 유래된 최소 단편이다. 주어진 면역 영역 내에서 에피토프로 작용하는 중복된 펩타이드의 ‘인접 세트’를 생성하는 것이 통상적으로 가능하고 이들 모두는 최소 에피토프를 포함하나 인접 영역이 상이한 것이다.
이와 동일한 방법으로 트렁크화된(truncated) 펩타이드에 대한 응답을 측정함으로서 특정 MHC 분자:T 세포 복합체에 대한 최소 에피토프를 확인하는 것이 가능하다. 예를 들어 오버랩핑된 라이브러리 내 1~15개 잔기를 포함한 펩타이드로부터 수득되는 경우 응답이 얻어지면 양 말단( 1~14, 1~13, 1~12 등 및 2~15, 3~15, 4~15 등)에서 트렁크화된 세트는 최소 에피토프를 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명자들은 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드의 특성과 생체 내 내성을 유도할 수 있는 펩타이드의 특성 사이에 연결점이 존재함을 이미 개시한 바 있다(WO 02/16410). 펩타이드가 너무 길어서 추가 처리(예를 들어 트리밍(trimming)) 없이 MHC 분자의 펩타이드 결합 홈에 결합할 수 없거나 부적당한 입체 형태로 결합되는 경우에는 생체 내에서 내성이 형성되지 않을 것이다. 한편 펩타이드가 MHC 펩타이드 결합 홈에 직접 결합하기에 적당한 크기 및 입체 형태를 지닌 경우 이러한 펩타이드는 내성 유도에 유용할 것으로 예측될 수 있다.
따라서 시험관 내에서 MHC 클래스 I 또는 Ⅱ 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 T 세포에 제시될 수 있는지 여부를 조사함으로서 펩타이드의 내성 생성 능력을 조사하는 것이 가능하다.
본 발명의 펩타이드는 MHC 분자에 결합되고 추가 항원 처리 없이 TSHR 특이적 T 세포로부터 반응을 자극시킬 수 있다는 점에서 아피토프(Antigen Processing-Independent epiTOPES)이다. 이러한 아피토프는 WO 02/16410에 기재된 규칙-기반 방법에 따라 TSHR에 대한 내성을 유발할 것으로 예측될 수 있다.
MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 7 내지 13개, 바람직하게는 8 내지 10개 아미노산 길이이다. 펩타이드의 결합은 펩타이드의 주요 사슬 내의 원자와 모든 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드-결합 홈 내 불변 사이트간에 접촉하는 두 개의 말단에서 안정화된다. 펩타이드의 아미노 및 카르복시 말단에 결합하는 홈의 양 말단에 불변 사이트가 존재한다. 펩타이드 길이의 변이는 주로 유연성을 허용하는 프롤린 및 글리신 잔기에서의 펩타이드 골격 내 비틀림에 의해 조절된다.
MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 펩타이드는 일반적으로 8 내지 20개 아미노산 길이, 바람직하게는 10 내지 17개 아미노산 길이이고 그보다 길 수 있다(예를 들어 40개 아미노산까지). 이들 펩타이드는 양 말단에서 개방된 MHC Ⅱ 펩타이드-결합 홈(MHC 클래스 I 펩타이드-결합 홈과 달리)을 따라 확장된 입체형태(conformation)를 지닐 수 있다. 펩타이드는 펩타이드-결합 홈을 연결하는 보존적 잔기와 접촉되는 주-사슬 원자에 의해 적절히 배치될 수 있다.
바람직한 실시형태에서 펩타이드는 더 이상의 처리과정 없이 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 것이다.
펩타이드
용어 "펩타이드"는 일반적으로 α-아미노와 인접 아미노산의 카르복실기 사이의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되는 일반적으로 L-아미노산인 잔기 시리즈를 의미하는 일반적인 의미로 사용된다. 상기 용어는 변형된 펩타이드 및 합성 펩타이드 유사체를 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 화학 방법(Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer- Verlag, Berlin)을 이용하여 제조된다. 예를 들어 펩타이드는 고형상 기술(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고 수지로부터 절단되고 고성능 액체 크로마토그래피(예를 들어 Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)에 의해 정제될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 제조사에 의해 제공되는 지침에 따라 ABI 43 1 A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다.
또한 펩타이드는 선택적으로 재조합 수단에 의해 생성되거나 긴 폴리펩타이드로 사슬로부터 절단될 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 갑상선 자극 호르몬 수용체 단백질로부터 절단에 의해 수득되고 그 후 한 쪽 또는 양쪽 말단의 변형에 의해 제조될 수 있다. 펩타이드 조성물은 아미노산 분석 또는 서열 분석(예를 들어 Edman 분해 절차)에 의해 확인된다.
본 발명에 사용되는 펩타이드는 다음과 같다.
(ⅰ) 아미노산 서열 KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 1의 서열과 60 % 이상의 상동성을 지니는 서열; 및
(ⅱ) 아미노산 서열 GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)의 전부 또는 일부, 또는 그의 일부, 또는 서열번호 2의 서열과 60 % 이상의 상동성을 지니는 서열.
본 발명의 펩타이드는 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드와 적어도 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 70%, 81 %, 82%, 83%, 84, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 포함하거나 아미노산 서열로 구성되어 있다.
바람직한 측면에서 펩타이드는 서열번호: 1 및 2의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 측면에서 펩타이드는 서열번호: 1 및 2의 아미노산 서열로 구성되어 있다.
서열 상동성은 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 서열 간의 서열 상동성의 정도를 결정하기 위해서는 다수의 서열 정렬을 위한 컴퓨터 프로그램이 유용하다. 예를 들면 Clustal W(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)가 유용하다. 서열의 쌍을 정렬하고 비교하기 위한 프로그램은 ALIGN(Myers ef a/., (1988) CABIOS, 4: 1-17), FASTA(Pearson er a/., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98) 및 gapped BLAST(Altschul er a/., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)가 이 목적에 유용하다. 더욱이 European Bioinformatics institute의 Dali 서버는 단백질 서열의 구조-기반 정렬법을 제공한다(Holm (1993) J. Mol. Biol., 233: 123-38; Holm (1995) Trends Biochem. Sci., 20: 478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res., 26: 316-9).
다수의 서열 정렬 및 상동성 백분율 계산은 표준 BLAST 파라미터를 사용하여 결정될 수 있으며 이때 모든 생물체에서 이용 가능한 서열 및 matrix Blosum 62, gap costs: existence 11 , extension 1을 사용한다.
선택적으로 다음과 같은 프로그램과 파라미터를 사용할 수 있다. 프로그램 : Align Plus 4, version 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite). DNA 비교 : Global 비교, 표준 선형 스코어 매트릭스, 불일치 패널티 = 2, 오픈 갭 패널티 = 4, 연장 갭 패널티 = 1. 아미노산 비교 : 글로벌 비교, BLOSUM 62 스코어 매트릭스.
따라서, 변이체가 모체의 기능적 활성을 보유하는 한 즉 변이체가 기능적으로 동등하다면 즉 본 명세서 내에 정의된 모체 펩타이드의 활성을 갖거나 나타내면 진술된 또는 주어진 서열의 변이체가 본 발명의 펩타이드 범위에 포함된다. 이러한 변이체는 모 서열의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실(한쪽 또는 양쪽 말단 절단 포함)을 포함할 수 있다. 예를 들면 1 내지 14개의 아미노산의 서열이다.
하나 이상의 아미노산이 예를 들면 화학적 그룹으로 치환되어 화학적으로 유도체화된 것을 하나 또는 그 이상 포함하는 기능적으로 균등한 유도체를 또한 포함한다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 펩타이드가 필요한 활성을 유지한다면 서열번호: 1 내지 3의 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 서열번호: 1 내지 3의 일부 또는 단편은 예를 들면 6 내지 14 길이의 잔기일 수 있다. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 길이의 잔기일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 8 내지 30 개의 아미노산, 예를 들어 8 내지 25개의 아미노산, 8 내지 20개의 아미노산, 8 내지 15개의 아미노산 또는 8 내지 12개의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 하나의 측면에서 본 발명의 펩타이드는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 길이를 지닌다.
TSHR 펩타이드는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물의 형태일 수 있다.
TSHR 펩타이드는 중성 또는 염 형태로 조성물에 제제화 될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 산 부가 염(펩타이드의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 및 말레인산과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기질 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기로부터 형성될 수 있다.
병용
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 펩타이드 및/또는 조성물이 그레이브스 병의 치료 또는 관리에 사용되는 다른 치료법과 병행하여 투여가 가능함과 동시에 본 발명의 펩타이드/조성물 및 다른 치료제 모두의 치료 효과를 유지함을 발견하였다.
따라서 하나의 측면에서 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 그레이브스 병의 예방용 처리에 사용되는 추가적 치료제와 병용될 수 있다.
예를 들어 펩타이드 또는 조성물은 항-갑상선제 또는 β-차단제와 병용될 수 있다.
실시예 2에 나타난 바와 같이 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 펩타이드를 항-갑상선제와 병용 투여한 결과 TSHR 펩타이드에 의한 항-TSHR 항체 생성의 감소에 영향을 미치지 않았으며 항-갑상선 작용(T4 생성으로 측정됨)감소에도 영향을 미치지 않았다. 즉 두 치료 효과가 모두 유지되었다. β-차단제와 병용 투여된 본 발명에 따른 조성물의 병용에 대해서도 유사한 결과가 달성되었다. 이와 같이 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 그레이브스 병의 치료 및 관리를 위한 기존의 치료법과 병용하여 사용될 수 있음을 입증하였다.
본 발명에 따른 병용제제는 그레이브스 병 증상의 치료 또는 관리를 동시에 허용하는 그레이브스 병에서의 자가 면역 반응의 감소, 즉 기저의 메커니즘을 촉진시키는 점에서 유리하다.
'항 갑상선제'는 갑상선 호르몬에 대항하는 호르몬 길항제이다. 항 갑상선 제제는 그레이브스 병 치료에 사용된다. 그레이브스 병 환자에게 갑상선 호르몬 합성 억제 효과에 대한 항 갑상선제를 투여하여 티록신(T4) 수준을 직접적으로 감소시켰다.
하나의 실시형태에서 항 갑상선 제제는 카르비마졸, 메티마졸(MMI), 프로필티오우라실(PTU) 및 과염소산 칼륨으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서 항 갑상선 제제는 메티마졸(MMI)이다.
갑상선 기능 항진증의 β-아드레날린성 반응(질병의 면역 화합물 치료 없이)을 방지하기 위해 그레이브스 병 환자에게 β-차단제가 제공된다.
β-차단제는 심장 부정맥 관리에 사용되는 약물의 일종이다. β-차단제는 내인성 카테콜라민 에피네프린(아드레날린)과 노르에피네프린(노르아드레날린), 특히 아드레날린 베타 수용체에 대한 교감 신경계의 작용을 차단한다.
본 발명에 따른 β-차단제는 프로프라놀롤, 부신도롤, 카르테올롤, 카베딜롤, 라베탈롤, 나돌롤, 옥프레놀롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 소탈롤 및 티몰롤을 포함한다. 바람직한 실시형태에서 β-차단제는 프로프라놀롤(propranolol)이다.
β-차단제에 약학적으로 허용되는 염을 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 β-차단제는 프로프라놀롤 하이드로클로라이드이다.
항-갑상선 제제 및 β-차단제의 적절한 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 항-갑상선 제제는 10 내지 1000㎍의 용량으로 투여될 수 있으며 예를 들면 20 내지 900, 30 내지 800, 40 내지 700, 50 내지 600, 60 내지 500, 70 내지 400, 80 내지 300 또는 90 내지 200㎍의 용량으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 투여량은 300 내지 700㎍의 용량이며 예를 들면 약 500㎍, 더욱 바람직하게는 500㎍이다.
바람직한 실시형태에서 항 갑상선 제제는 매일 투여되고 예를 들면 20-28 시간마다 바람직하게는 24시간마다 투여된다.
항 갑상선 제제는 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있으며 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서 항 갑상선 제제는 피하 투여된다.
β-차단제는 1 내지 100 mg/kg 용량으로 투여될 수 있으며 예를 들어 5 내지 90, 10 내지 80, 15 내지 75, 20 내지 70, 25 내지 60, 30 내지 55, 35 내지 50 및 40 내지 45 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 β-차단제는 5-20 mg/kg 바람직하게는 약 10 mg/kg 보다 바람직하게는 10 mg/kg의 용량으로 투여된다.
바람직한 실시형태에서 β-차단제는 매일 투여되고 예를 들면 20-28 시간마다 바람직하게는 24시간마다 투여된다.
β- 차단제는 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있으며 이것은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서 β-차단제는 복강 내 투여된다.
하나의 실시형태에서 본 발명에 따른 펩타이드 또는 조성물은 항 갑상선 제제 및/또는 β-차단제와 동시에 투여된다. 또 다른 실시형태에서 본 발명에 따른 펩타이드 또는 조성물은 항 갑상선 제제 및/또는 β-차단제와 상이한 시간에 투여된다.
하나의 측면에서 본 발명의 펩타이드/조성물이 투여되는 피험자(또는 투여하고자 하는 피험자)는 이미 항 갑상선 제제 및/또는 β-차단제를 복용할 수 있다. 이와 같이 본 발명은 피험자가 항 갑상선 제제 및/또는 β-차단제를 현재 복용하고 있거나 이전에 복용한 경우도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 추가적 형태에서 피험자는 그레이브스 병을 위한 임의의 치료제를 현재 복용하지 않거나 이전에도 복용하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 논의된 본 발명의 한 측면에서 제1 단계는 그레이브스 병 환자이거나 발병 위험성이 큰 피험자로 확인된다.
본 발명에 따른 펩타이드 또는 조성물은 예방적 또는 치료적 용도로 사용될 수 있다.
예방 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 TSHR에 대한 면역 반응의 생성을 감소시키거나 방지한다. 면역 반응 수준은 본 발명의 조성물로 처치하지 않은 환자에게서 나타나는 것보다 더 작다. '감소된다'라는 용어는 상기 조성물로 처치되지 않은 환자에서 관찰되는 반응(또는 동일한 시간-프레임에 대한 처치하지 않은 환자에서 관찰되는 반응)의 50%, 70%, 80% 또는 90% 감소와 같은 면역 반응의 부분적 감소가 관찰됨을 나타낸다. '방지한다'라는 용어는 TSHR에 대한 감지 가능한 면역 반응에서 관찰되지 않음을 나타낸다.
치료 용도로 투여되는 경우 상기 조성물은 TSHR에 대한 이미 진행중인 면역 반응을 억제한다. '억제한다'라는 용어는 펩타이드 치료 전 수준과 비교 시 진행중인 면역 반응의 수준 또는 처치가 제공되지 않은 동일 시점에서 관찰되는 수준의 감소를 나타낸다.
본 발명의 조성물로의 치료는 하기의 어느 하나 또는 전부의 수준을 감소시킨다 : (ⅰ) TSHR 자가항체: (ⅱ) TSHR에 특이적인 CD4+ T 세포 (ⅲ) TSHR 자가항체를 분비하는 것이 가능한 B 세포.
이들 인자 모두의 검출은 ELISA, 유동 세포 계측법 등과 같은 당 분야에 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물 치료는 TSHR에 특이적인 CD4+ T 세포에서 아네르기를 선택적으로 유발한다. 아네르기는 예를 들면 시험관 내에서 TSHR와 함께 연속적 시도를 통해 검출될 수 있다.
제형
조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조될 수 있고; 용액 내에 적합한 고형 제제, 현탁액에 적합한 고형 제제 또는 주입 전 액체 형태로 제조될 수 있다. 또한 제제는 유화될 수도 있고 펩타이드를 리포솜 내에 캡슐화시킬 수 있다. 활성 성분은 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 상용화 가능한 부형제와 혼합할 수 있다. 적당한 부형제는 예를 들면 물, 식염수(예를 들어 인산 완충 생리식염수), 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물이다.
바람직하게는 조성물은 습윤제 또는 유화제 및/또는 pH 조절제와 같은 최소한의 보조제를 포함한다. 완충염은 인산염, 구연산염, 아세트산염을 포함한다. 염산 및/또는 수산화나트륨은 pH 조절제로 사용된다. 안정화를 위해 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 이당류가 사용될 수 있다.
상기 조성물이 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 펩타이드(RNB-5D-K1 및RNB-9B)의 상대 비율은 거의 동일하다. 선택적으로 각각의 펩타이드의 상대 비율은 변경될 수 있으며 예를 들면 자가반응 T-세포의 특정 서브-세트 상에 내성 유발 반응에 초점을 맞추어 하나의 펩타이드가 특정 HLA 형태의 다른 것 보다 더 우월하게 작동하는 경우이다.
제형화 후 조성물은 멸균 용기 내에 통합된 후 밀봉되고 저온 예를 들면 4℃에서 보관시키거나 동결-건조시킨다.
통상적으로 상기 조성물은 동결 건조된 분말로 제조된다. 동결 건조는 안정화된 형태로 장기간-보관이 가능하다. 동결 건조 절차는 당분야에 공지되어 있고 예를 들면 http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html 참조. 만니톨, 덱스트란 또는 글리세린, 트레할로스와 같은 당류와 같은 충전제는 일반적으로 동결-건조 전에 사용된다.
조성물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 설하, 비강내, 경피내, 좌제 또는 이식(예를 들면 서방성 분자를 이용)과 같은 통상적인 방식으로 투여된다.
조성물은 비강내, 피하 또는 경피내 경로를 통해 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩타이드 및 조성물은 인간 피험자를 치료하는데 사용된다. 일반적으로 의사는 개별적인 피험자에 가장 적당한 실질적인 용량을 결정할 것이고 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변동될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및 조성물은 인간 피험자를 치료하는데 사용된다. 상기 피험자는 그레이브스 병(GD) 질환자이다. 상기 피험자는 TSHR 자가항체를 지닌다.
피험자는 저해 TSHR 자가항체를 전개시키기 위한 유전적 소인과 관련된 HLA-일배체(halotype)이다. 피험자는 HLA-DR3 또는 HLA-DR4를 발현시킨다. 개체의 HLA 일배체를 측정하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시 형태에서 다수의 용량을 상승 농도로 환자에 제공하는 '용량 증가' 프로토콜이 수행된다. 이러한 방법은 예를 들면 봉독 알레르기에 대한 면역치료 적용시 포스포리파제 A2 펩타이드에 사용되었다(Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).
키트
편리하게는 조성물은 다수의 펩타이드를 포함하는 경우 혼합 조성물 또는 칵테일의 형태로 병용 투여된다. 그러나 동시 개별적 연속적 또는 병용 투여를 위한 펩타이드를 제공하기 위해 별도의 키트 형태로 제조하는 것도 바람직하다.
예를 들면 키트는 2개의 펩타이드를 별도의 용기에 포함시킬 수 있다. 용기의 내용물은 투여 전에 결합되거나 결합되지 않을 수 있다.
또한 키트는 혼합 및/또는 투여 수단(예를 들면 비강내 투여를 위한 분사기; 또는 피하/경피내 투약을 위한 주사기 및 바늘)을 포함한다. 또한 키트는 사용 지침서를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 키트는 질병을 치료 및/또는 예방하는데 사용된다.
특히 상기 조성물/키트는 생체 내 TSHR 자가항체의 생산을 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 상기 조성물/키트는 대상에서 그레이브스 병을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
동물 모델
그레이브스 병의 현재 동물 모델은 여러 가지 단점을 지니고 있다. 예를 들면 현재 사용되는 동물 모델은 그레이브스 병과 관련된 증상이나 특징을 나타내지 않는다. 또한 BALB/c 마우스에서 개발된 모델과 같은 이용 가능한 동물 모델은 그레이브스 병에 대한 승인된 치료법에 대한 반응을 테스트하지 않았다.
그러므로 그레이브스 병에 대한 현재의 동물 모델은 잠재적인 치료법을 연구하는데 최적이 아니다.
본 발명자들은 놀랍게도 인간 HLA-DR3에 대해 형질 전환된 동물이 잠재적인 치료법을 연구하기 위한 적절한 근거를 제공한다는 것을 확인하였다. 따라서 추가적인 실시형태에서 본 발명은 TSHR 항체의 생산과 관련된 질병에 대한 동물 모델을 제공하며 상기 동물은 인간 HLA-DR3에 대해 형질 전환되고 대조 동물과 비교하여 TSHR의 증가된 수준을 나타낸다.
용어 'TSHR의 증가된 수준'은 TSHR 펩타이드와 같은 전체 길이 TSHR 서열의 증가된 수준을 포함하는 것으로 의도된다.
TSHR의 수준은 적절한 대조 동물(예를 들면 인간 HLA-DR3에 대해 형질 전환되지만 TSHR의 증가를 나타내지 않는 동물) 이상으로 증가된다. TSHR의 수준은 적절한 방법으로 증가시킬 수 있다. 예를 들면 TSHR 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 투여함으로써 증가시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서 벡터는 바이러스 벡터이다.
추가적 실시형태에서 본 발명은 TSHR 항체의 생산과 관련된 질환의 동물 모델을 생산하는 방법을 제공하며 상기 방법은 인간 HLA-DR3에 대해 형질 전환된 동물에서 TSHR 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서 상기 방법은 TSHR 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 도입함으로써 TSHR 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 실시형태에서 벡터는 바이러스 벡터이다.
동물 모델은 TSHR 항체 생산에 관련된 질병의 특징을 지니고 있다. 예를 들면 동물 모델에서 TSHR 항체의 수준은 TSHR 수준이 증가하지 않는 동등한 대조 동물에 비해 증가한다. TSHR 항체의 수준은 TSHR 항체의 수치가 증가하지 않는 동등한 대조 동물에 비해 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 증가 될 수 있다.
TSHR 항체의 수준은 당 업계에 공지된 표준 방법 예를 들면 ELISA 분석을 사용하여 측정될 수 있다. TSHR 항체의 수준은 시험관 내 샘플에서 측정될 수 있다. 예를 들면 샘플은 혈청 샘플일 수 있다.
'인간 HLA-DR3 형질전환'은 동물이 인간 MHC 클래스 Ⅱ 세포 표면 분자 HLA-DR3을 발현한다는 것을 의미한다. 형질 전환 동물은 당 업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
'TSHR 항체 생성과 관련됨'은 TSHR 항체가 질병 병인에 기여한다는 것을 의미한다. 예를 들면 TSHR 항체의 수준은 질병이 없는 경우의 수준과 비교하여 질병에서 증가될 수 있다. TSHR 항체와 관련된 질병은 그레이브스 병일 수 있다.
TSHR은 인간 TSHR일 수 있다. 예를 들면 TSHR은 인간 TSHR A 서브 유니트 또는 그의 일부일 수 있다.
TSHR을 코딩하는 핵산은 예를 들면 본 명세서에 기술된 TSHR 서열에 기초하여 당 업계에 공지된 방법으로 제공될 수 있다.
핵산은 천연, 합성 또는 재조합일 수 있다. 그것은 이중 또는 단일 가닥일 수 있으며 DNA 또는 RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면 cDNA, PCR 생성물, 게놈 서열 또는 mRNA 일 수 있다.
뉴클레오타이드 서열은 선택되는 숙주/숙주세포에서 생성을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
TSHR을 코딩하는 염기 서열의 전달은 바이러스 감염에 의해 매개될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들면 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스일 수 있다.
특히 바이러스 벡터는 아데노바이러스일 수 있다.
동물 모델의 생성은 벡터의 다중 투여를 포함할 수 있다.
벡터 예를 들면 아데노바이러스는 3주 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들면 벡터는 18-25, 18-23, 19-23 또는 20-22일 간격으로 투여될 수 있다. 벡터는 20일, 21일 또는 22일 간격으로 투여될 수 있다.
동물 모델은 적어도 두 번 동안 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면 아데노바이러스 벡터는 2또는 3회 투여될 수 있다. 특히 동물 모델은 두 번에 걸쳐 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
동물 모델은 투여 사이에 3주 간격으로 벡터를 2회 투여하는 것을 포함할 수 있다.
벡터 예를 들면 아데노바이러스는 투여 당 108 내지 1011 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 투여 당 109 내지 1011 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다. 아데노바이러스는 투여 당 109 바이러스 입자의 용량으로 투여될 수 있다.
벡터는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면 아데노바이러스 벡터의 경우 벡터는 근육 내 주사로 투여될 수 있다.
동물은 포유류일 수 있다. 예를 들면 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 또는 영장류일 수 있다. 바람직하게는 동물은 마우스이다.
하나의 실시형태에서 마우스는 혼합된 유전적 배경을 지닌 HLA-DRA1*01:01 및 HLA-DRB1*03:01 형질전환 마우스이다. 그러한 마우스를 생성하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다.
예를 들면 하기 실시예를 사용하여 마우스 모델을 조립하였다 : pUC에서의 HLA-DRA 게놈 클론의 6-kb NdeI 단편 및 B 유전자를 포함하는 cos 4.1의 24-kb C/alxSa/I 단편을 C57BL/6 수컷과 교배한(C57BL/6xDBA/2) F1 기증자로부터의 수정란에 공동 주입하였다. 이후에 자손은 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 분자 발현이 결여된 IA-beta 녹아웃 C57BL/6 유전적 배경(ABO 마우스)으로 성장한다. 이들 DR3tg 마우스는 HLA-DR3 분자를 발현하나 마우스 MHC-Ⅱ 분자는 발현하지 않는다. 이 방법은 포괄적인 것이 아니며 예를 들면 C57BL/10 배경상의 HLA-DR3 형질전환 마우스를 조립하기 위한 대안적인 방법은 당 업계에 공지되어있다.
본 발명은 이를 수행함에 있어 당업자의 이해를 돕기 위해 제공되는 실시예에 의해 추가로 기술된다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어떠한 경우에도 한정하는 것은 아니다.
실시예
(실시예 1) ATX-GD-59는 TSHR 특이적인 T 세포 내성을 유도하고 HLA-DR3 형질전환 마우스의 동물 모델에서 항-TSHR 항체 역가를 감소시킨다.
재료, 방법 및 절차
마우스
DR3tg 마우스는 영국 Charles River 또는 네덜란드 InnoSer 외부에서 특정 병원균이 없는 조건에서 사육된다. 최초 DR3tg 종은 Strauss 등에 의해 생성되었다. 요약하면 사용된 게놈 컨스트럭트는 pUC 13에서 HLA-DRA 게놈 클론의 6kb NdeⅠ 단편과 DRB1*0301의 B 유전자를 함유하는 cosmid(pTCF)인 cos4.1의 24kb CLaⅠ x SalⅠ 단편이다. 각각의 컨스트럭트 1-2 ㎍/mL를 함유하는 용액을 사용하여 C57BI/6 수컷과 교배한(C57BI/6 x DBA/2) F1 기증자로부터의 수정란으로 공동 주입하였다. 자손은 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 분자 발현이 결여된 IA-베타 녹아웃 C57BL/6 유전적 배경(AB0 마우스)으로 번식시켰다. 이들 DR3tg 마우스는 인간 MHC 클래스 Ⅱ, HLA-DR3 분자를 발현하지만 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 분자는 발현하지 않는다. 형질전환 마우스를 EcoR1로 절단된 말단 DNA의 서던 블롯 분석법으로 동정하였으며 DRA cDNA의 1.35kb Bam HI 단편과 DRB1*0301 cDNA의 1.25kb BamHI 단편으로 탐지하였다. 이러한 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 그레이브스 병에 대한 감수성 증가와 관련이 있다고 제안되어 DR3tg 마우스를 이 실험에 사용하였다. Hasselt 대학교의 동물 실험 윤리위원회(ECD)에 의해 동물 연구를 승인받았으며 병원성이 제거된 시설 내에서 관리 기준에 따라 수행하였다.
항원
펩타이드는 Polypeptide Laboratories(PPL, Strasbourg, 프랑스)에 의해 합성되었고 -20℃에서 PBS 내에 8mg/ml의 스톡 용액으로 보관되었다. 제조 공정은 N-a-Fmoc 보호된 아미노산을 펩타이드 어셈블리의 구성 요소로 사용하는 고체상 펩타이드 합성에 기초한다. C 말단 잔기는 Fmoc-lys(Boc)-MPPA-링커의 일부로서 MBHA 수지에 커플링된다. 다른 아미노산은 일련의 Fmoc 탈보호 및 아미노산 커플링 사이클에 의해 통합된다. 도면의 설명은 PPL 펩타이드가 사용된 시기를 나타낸다.
대안적으로 펩타이드를 GL Biochemistry Ltd(GLS; Shanghai, 중국) 또는 Severn Biotech Ltd(Severn, Kidderminster Worcs., 영국)에 의해 합성하고 DMSO(Sigma-Aldrich) 내의 20 mg/mL 저장용액에 -80℃에서 저장하였다. 펩타이드는 N-말단 유리 아민 및 C 말단 아미드를 지니는 F-moc 반응을 사용하여 합성되었다. 실험마다 상이한 펩타이드 공급 업체를 나타내었다.
펩타이드는 단일 펩타이드(9B-N, 5D-K1) 또는 펩타이드 칵테일 ATX-GD-59로 처리에 사용되었다. ATX-GD-59는 9B-N 및 5D-K1의 동일 몰수의 혼합물이고 ATX-GD-59의 제시된 용량은 개별 펩타이드 함량을 나타낸다. 즉 투여된 총 펩타이드 양은 제시된 처리 용량의 2배이다.
TSHR(TSHR-ECD, AA19-417)의 인간 재조합 세포 외 도메인은 Chesapeake PERL (Savage, 미국)에 의한 Chesapeake PERL 기술 PERLXpress를 사용하여 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 유생 발현 시스템으로 생산되었다. 각각의 로트 TSHR-ECD 단백질 품질은 SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다.
아데노바이러스 벡터는 Viraquest(North Liberty, IA, 미국)에서 구입하였다. TSHR 아미노산 잔기 1-289(Ad-TSHR)를 함유하는 아데노바이러스의 제조 및 정제는 이전에 개시하였다. 요약하면 β-갈락토시다아제를 발현하는 아데노바이러스 Ad-TSHR 및 대조군 컨스트럭트(Ad-LacZ)를 HEK293 세포에서 증식시키고 CsCL 밀도 구배 원심 분리로 정제하였다. 바이러스 입자 농도는 260 nm에서 흡광도를 측정하여 측정하였다.
생체 외 내성 시험
DR3tg 마우스에 0.1 ㎍, 1㎍ and 10 ㎍ 펩타이드를 각각 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에서 피하 주사하였다. 그 후 마우스에 -8, -6, -4일에(용량 증가 스케쥴) 100 ㎍(최대 용량/펩타이드) 용해성 펩타이드(5D-K1 또는 9B-N)를 3회 주입하였다. ATX-GD-59는 펩타이드 5D-K1(서열번호: 1)과 9B-N(서열번호: 2)의 동일 몰량 혼합물이고 언급된 최대 용량(㎚ol)은 칵테일 내의 각각 펩타이드에 대한 것이다. 두 시스템이 서로 다른 실험에서 사용되었으므로 100ug의 펩타이드 용량은 ~45nmol에 해당된다. 펩타이드는 PBS로 피하 투여하였다. 최대 용량/펩타이드의 변화 및 상응하는 용량 증가량을 실험 별로 나타내었다. 0일째에 Complete Freund 애쥬번트(CFA; Incomplete Freund 애쥬번트(Difco) 내의 2mg/ml 마이코박테리움 튜버큘로시스 H37RA(Difco Laboratories, Michigan, 미국))에 에멀젼화된 부모 펩타이드(비-변형 5D 및/또는 9B)에 상응하는 50 ㎍로 꼬리 기반을 통해 피하 면역화 시켰다(주사 당 100μL CFA(100㎍ H37RA) 내의 50㎍ 펩타이드). 면역화 10일 후에 림프절(LN)을 드레이닝시키고 비장을 채취하였다. LN 세포와 비장세포를 분리하고 96-웰 편평 플레이트 내에서 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza, Verviers, 벨기에)으로 보충한 X-vivo 15 배지에서 배양시켰다. 항원-유도 세포 증식을 조사하기 위해 0.5×106 세포/웰을 서로 다른 항원 농도의 TSHR-ECD와(0-25 ㎍/ml)와 함께 72시간동안 배양(200 μl/웰) 시키거나 12.5 ㎍/ml 정제 단백질 유도체(PPD; 면역화 대조군; Statens serum institut, 덴마크 코펜하겐)와 함께 배양시켰다. 37℃ 및 5% CO2로 72시간 인큐베이션시킨 후에 60 μl의 세포 상등액을 채취하고 동결시켰다. 20 μl/웰의 삼중화 티미딘(PerkinElmer, Zaventem, 벨기에)을 세포에 첨가하여 최종 농도가 1 μCi/웰이 되게 한다. 세포를 37℃ 및 5% CO2로 인큐베이션 시킨 후 16시간 후에 플레이트를 냉동시킨다. 해동된 플레이트를 채취하고 β-카운터(Wallac 1450 Microbeta Trilux 액상 Scintillation 카운터)로 판독하여 세포 증식을 평가한다.
그레이브스 병을 위한 아데노바이러스 동물 모델
DR3tg 마우스에 22.5 pmol, 225 pmol 및 2250 pmol의 ATX-GD-59로 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 연속하여 마우스에 -8, -6 및 -4일(용량 증가 스케쥴)에 22.5 nmol ATX-GD-59(최대 용량/펩타이드)를 3회 주사하거나 대조군 처리하였다. 최대 용량의 변화 및 그에 상응하는 용량 증가량을 실험마다 나타내었다.
0일째에 마우스의 허벅지 근육에 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ(1010 바이러스 입자)를 근육 주사하였다. 실험 당 동일한 배치의 아데노바이러스를 사용하여 모든 마우스를 동시에 면역화 시켰다. 마우스를 3주 간격(0주 및 3주)으로 2회 주사하고 도 2에 도시된 프로토콜에 따라 상이한 시점에서 혈액을 채취하였다.
첫 번째 면역화 5 주 후에 마우스를 안락사시켜 혈액, 비장세포 및 갑상선을 수득하였다. 비장세포를 분리하고 96-웰 편평 플레이트 내에서 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza, Verviers, 벨기에)으로 보충한 X-Vivo 15 배지에 배양시켰다. 항원-유도 세포 증식을 조사하기 위해 0.5×106 세포/웰을 서로 다른 항원 농도의 TSHR-ECD와(0-25 ㎍/ml) 함께 72시간동안 배양(200 μl/웰)시켰다.
37℃ 및 5% CO2로 72시간 인큐베이션 후에 60 μl의 세포 상등액을 채취하고 동결시켰다. 20 μl/웰의 삼중화 티미딘(PerkinElmer, Zaventem, 벨기에)을 세포에 첨가하여 최종 농도가 1 μCi/웰이 되게 하였다. 세포를 37℃로 인큐베이션 시킨 후 16시간 후에 플레이트를 냉동시킨다. 해동된 플레이트를 수집하고 β-카운터(Wallac 1450 Microbeta Trilux 액상 Scintillation 카운터)로 판독하여 세포 증식을 평가한다.
항-TSHR 항체의 측정
정제된 재조합 TSHR-ECD(Chesapeake-Perl)에 대한 항-TSHR 항체 (IgG 클래스)를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트(절반-면적 96-웰, Fisher Scientific)를 PBS(0.5Mg/ml) 내 50μl/웰의 TSHR-ECD 단백질로 실온에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. PBS-0.05% Tween20으로 세척한 후에 실온에서 1시간 동안 PBS 내의 1% BSA로 웰을 블로킹시키고 테스트 혈청(1 :50 또는 1 :500 희석)과 함께 인큐베이션 시켰다. 마우스 항-TSHR 항체(A9, Abeam, 영국 케임브리지)를 양성 대조군으로 사용하였다. 호스래디쉬 페록시다제(HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG (Abeam)로 항체 결합을 측정하였다. lgG1, lgG2a, lgG2b 및 lgG2c 이소-타입의 항 TSHR 항체를 검출하기 위해 HRP-컨쥬게이트 래트 항-마우스 lgG1(Southern Biotech, Alabama, 미국), 염소 항-마우스 lgG2a(Southern Biotech), 염소 항-마우스 lgG2b (Abeam) 및 염소 항-마우스 lgG2c(Abeam) 항체를 각각 사용하였다. 신호를 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 증폭시켰다. 450nm에서 플레이트 판독기(Tecan Benelux)로 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
자극성 항-TSHR 항체(TSAb)의 측정
acAMP 반응성 루시퍼라제 컨스트럭트인 pA3Luc 및 G418 내성을 지닌 인간 TSHR인 pcDNA3-TSHR로 안정하게 트랜스펙트시킨 중국 햄스터 난소-K1(CHO-K1) 세포인 Lulu* 세포를 M. Ludgate 교수(영국 카디프 대학교)에 의해 제공받았다. 세포를 5% CO2와 37℃에서 2mM L-글루타민, 50U/mL 페니실린, 50U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza), 10% 우 태아 혈청(FBS)(Fisher Scientific, Aalst, 벨기에) 및 0.2 mg/mL 제네티신(Fisher)이 보충된 Ham's 12 배지(Lonza) 내에 유지시켰다. TSAb를 측정하기 위해 세포를 96-웰 플레이트에서 2×104 세포/웰의 농도로 10% 차콜 스트립핑 혈청(Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에)을 함유한 Ham's 12 배지 내에 도말하였다. 다음날 배지를 제거하고 37℃에서 4시간 동안 5% PEG와 10% 시험 혈청을 함유한 신선한 Ham's 배지에서 배양하였다. 그 후 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 완충액(Promega, Leiden, 네덜란드)으로 용해시켰다. cAMP 반응성 루시퍼라제 생성은 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)에 의해 제조자 지침에 따라 측정하였고 발광은 FLUOstar 오메가 루미넌스(BMG labtech, Ortenberg, 독일)로 측정하였다. 결과는 상대 광 유니트(RLU, 자극 세포의 발광/비 자극 세포의 발광)로 나타내었다.
갑상선 기능 항진증의 측정
총 티록신(T4)을 제조자 지침에 의거 CBI 마우스/래트 티록신 ELISA 키트 (Calbiotech, Spring Valley, 미국 캘리포니아)를 사용하여 희석되지 않은 마우스 혈청(10μl) 내에서 측정하였다. 키트 내에서 T4 수치를 표준화하여 계산하였고 ㎍/dl로 표현되었다.
결과
단일 펩티드 처리는 TSHR- 특이성 T 세포 내성을 유도한다.
단일 펩타이드 5D-K1 및 9B-N의 내성 효과를 측정하기 위해 HLA-DR 형질 전환 마우스를 먼저 펩타이드 중 하나를 단독으로 용량 증가 스케쥴에 따라 처리하였다. 첫 번째 실험에서 DR3tg 마우스는 실험방법 섹션에서 설명한 바와 같이 5D-K1 또는 대조군으로 처리하였다. 이 변형된 아피토프로 전처리한 결과 TSHR로 유도된 T 세포의 증식이 대조군에 비해 비장 샘플에서 43 %, LN 샘플에서 60 % 감소하였다(도 1 및 2 참조).
펩타이드 9B-N의 내성유도 특성을 측정하기 위해 DR3tg 마우스를 9B-N 또는 PBS로 처리하였다. 이 연구는 9B-N의 전처리가 비장 및 LN 샘플에서 각각 41 및 33 %만큼 TSHR에 대한 T 세포 증식을 유의하게 감소시킨다는 것을 나타내었다.
결합된 펩타이드 처리는 TSHR-특이적 T 세포 내성을 유도한다.
각각의 펩타이드 5D-K1 또는 9B-N을 사용한 펩타이드 처리가 마우스에서 TSHR- 특이 림프구 증식을 감소시킨다는 것을 확인하고 펩타이드를 칵테일로서 투여하는 병용 요법이 TSHR- 특이적 반응을 또한 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하게 되었다 . DR3tg 마우스를 용량 증가 스케쥴에 따라 ATX-GD-59로 처리하고 CFA에서 비-변형 펩타이드를 모두 포함하는 에멀젼으로 면역화 시켰다. 3개의 ATX-GD-59 최대 용량으로 다른 내성 용량을 시험하였으나(데이터 없음) 치료 용량간에 차이는 관찰되지 않았다. 대표적인 결과는 ATX-GD-59 치료가 TSHR 특이적 내성을 상당 수준으로 유도한다는 것을 도 3에 나타내었다. TSHR에 의해 유도된 증식은 각각 비장 세포 및 LN 세포에서 58% 및 54% 감소되었다.
결합된 펩타이드 처리는 아데노바이러스 기반 그레이브스 병 동물 모델에서 항 TSHR 항체 생성을 감소시킨다.
ATX-GD-59의 치료 효능을 입증하기 위해 ATX-GD-59를 사용한 펩타이드 처리가 TSHR 특이적 비장 세포 증식 및 TSHR 항체 발달과 같은 그레이브스 병 매개 변수의 존재를 억제할 수 있는지의 여부를 조사하였다. AdX-GD-59 처리된 DR3tg 마우스 및 대조군 마우스를 Ad-LacZ 또는 Ad-TSHR 바이러스 입자에 의한 두 번의 면역화 이후의 용량 증가 스케쥴에 따라 처리하였다. 우선 TSHR 특이적 비장 세포 증식에 대한 ATX-GD-59 치료 효과를 측정하였다. Ad-LacZ 면역 마우스의 비장 세포는 체외 TSHR 재 자극시에 증식하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 대조군 처리된 Ad-TSHR 면역화 DR3tg 마우스의 TSHR-특이적 비장 세포 절대 증식 수준은 낮지만 용량 의존적으로 증가한다. 도 4에 나타난 바와 같이 22.5 nmol의 최대용량/펩타이드를 사용한 ATX-GD-59 처리는 TSHR 특이적 비장 세포 증식을 40% 이상 크게 감소시킬 수 있었다. 15 nmol의 각 펩타이드를 사용한 ATX-GD-59 처리에서도 비슷한 결과가 나타났다(데이터는 표시되지 않음). ATX-GD-59 처리의 유사한 내성 효과가 반복 실험에서 관찰되었으며(데이터는 나타내지 않음) 이를 통해 이러한 결과의 재현성을 확인하였다.
그 후 ATX-GD-59 처리가 항 TSHR 항체 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 혈청 샘플을 수집하여 ELISA를 통해 항-THSR IgG 수준을 측정하였다.
ATX-GD-59 펩타이드 전처리 전(W-2, 데이터 미제공) 및 후(WO)에는 항 TSHR IgG 항체가 존재하지 않았다(도 5). 증식 데이터에 대응하여 Ad-LacZ 대조 면역 마우스에서 항 TSHR 항체가 검출되지 않았다. 첫 번째 Ad-TSHR 면역 후 2주째에 펩타이드 대조군 마우스에서 높은 항 TSHR IgG 수치가 관찰되었다. ATX-GD-59 처리는 2주째에 Ad-TSHR 면역화 시 95%의 펩타이드 대조군에서 나타나는 항 TSHR 항체의 증가를 감소시켰다. 또한 5주째 항-TSHR IgG 수치는 여전히 93% 감소하였으며 이는 ATX-GD-59 펩타이드 처리에 의한 것이다.
항 TSHR 항체 수준의 감소를 더 조사하기 위해 상이한 항 TSHR 이소-타입 항체에 대한 ATX-GD-59 처리의 효과를 측정하였다. 1010 바이러스 입자에서의 Ad-TSHR 면역화는 이소-타입 IgG2b 및 IgG2c의 항-TSHR 항체를 높은 수준으로 유도하였다. 도 6은 Ad-TSHR 면역화 된 마우스에서 ATX-GD-59가 lgG1, IgG2b 및 IgG2c 이소-타입의 항-TSHR 항체를 유의미하게 감소시킴을 나타내며 도 5에 나타난 총 IgG 항체 수준의 패턴과 상관 관계가 있음을 나타낸다. ATX-GD-59 치료의 15 nmol과 22.5 nmol 용량 처리 방법은 두 번의 독립적인 실험에서 두 번 시험되었으며 항-TSHR 총 IgG와 IgG 이소-타입 수준(15 nmol 용량의 데이터는 표시되지 않음)을 현저히 감소시킨다. 이는 두 가지 용량 모두가 아데노바이러스 기반 GD 모델에서 효능을 나타냄을 의미한다.
종합하면 이러한 결과는 예방적 ATX-GD-59 처리가 생체 내 허용 모델에서 TSHR-특이 T세포 내성을 유도하고 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 항-TSHR 항체 수준을 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
(실시예 2) 그레이브스 병을 위한 ATX-GD-459와 임상 통용 약물과의 병용
재료 및 방법
마우스
DR3tg 마우스는 영국 Charles River 외부에서 특정 병원균이 없는 조건에서 사육된다. 최초 DR3tg 종은 Strauss 등에 의해 생성되었다(Strauss et al, 1994, Immunogenetics 3, 104-108). 요약하면 사용된 게놈 컨스트럭트는 pUC 13에서 HLA-DRA 게놈 클론의 6kb NdeⅠ 단편과 DRB1*0301의 B 유전자를 함유하는 cosmid(pTCF)인 cos4.1의 24kb CLaⅠ x SalⅠ 단편이다. 각각의 컨스트럭트 1-2 ㎍/mL를 함유하는 용액을 사용하여 C57BI/6 수컷과 교배한(C57BI/6 x DBA/2) F1 기증자로부터의 수정란으로 공동 주입하였다. 자손은 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 분자 발현이 결여된 IA-베타 녹아웃 C57BL/6 유전적 배경(AB0 마우스)으로 번식시켰다. 이들 DR3tg 마우스는 HLA-DRB1*0301 분자를 발현하나 마우스 MHC 클래스 Ⅱ 분자는 발현하지 않는다. 마우스는 C57BL/6 및 B10.Q로 역 교배에 의해 유지되었다. 형질전환 마우스를 EcoR1로 절단된 말단 DNA의 서던 블롯 분석법으로 동정하였으며 DRA cDNA의 1.35kb Bam HI 단편과 DRB1*0301 cDNA의 1.25kb BamHI 단편으로 탐지하였다. 이러한 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 그레이브스 병에 대한 감수성 증가와 관련이 있다고 제안되어 DR3tg 마우스를 이 실험에 사용하였다.
DR4 마우스 종은 Lars Fugger 등(PNAS 1994; volume 91 :6151-6155)이 최초로 창출한 것이었다. 이는 HLA-DRA*0101/ HLA-DRB1*0101 및 mCD3-huCD4c/g 컨스트럭트를 (DBA/lxA.CA)Fl 수정으로부터 배아 내에 동시에 마이크로 주입시키고 생존하는 배아를 일정 기간 성장시키기 위해 가-임신된 자성(Balb/c x 129) F1으로 이송시킨다. 그 후손을 후에 IA-b 넉아웃 C57BL/6 유전 배경(ABO 마우스)으로 양육시켜 마우스 MHC 클래스 Π 분자 발현을 결핍시킨다. 따라서 DR4 마우스 내에서 발현되는 MHC 클래스 Π 분자는 오직 인간 HLA DR4 분자였다.
BALB/cJOIaHsd 마우스는 Harlan 실험실(Venray, 네덜란드)로부터 구입하였다.
Hasselt 대학교의 동물 실험 윤리위원회(ECD)에 의해 동물 연구를 승인받았으며 병원성이 제거된 시설 내에서 수행하였다.
항원
모든 단일 펩타이드는 GL Biochem Ltd(Shanghai, 중국)에 의해 합성되었고 -80℃에서 DMSO(Sigma-Aldrich) 내 20 mg/ml의 저장 용액에 보관되었다. 펩타이드는 N-말단 유리 아민 및 C-말단 아미드로 합성되었다.
ATX-GD-459 펩타이드(이들 펩타이드에 대한 논의는 실시예 3 참조)는 Polypeptide Laboratories(Strasbourg, 프랑스)에 의해 합성되었고 -20℃에서 PBS 내에 8mg/ml의 스톡 용액으로 보관되었다. 제조 공정은 N-a-Fmoc 보호된 아미노산을 펩타이드 어셈블리의 구성 요소로 사용하는 고형상 펩타이드 합성에 기초한다. C 말단 잔기는 Fmoc-lys(Boc)-MPPA-링커의 일부로서 MBHA 수지에 커플링된다. 다른 아미노산은 일련의 Fmoc 탈보호 및 아미노산 커플링 사이클에 의해 통합된다.
TSHR(TSHR-ECD, AA19-417)의 인간 재조합 세포 외 도메인은 Chesapeake PERL (Savage, 미국)에 의한 Chesapeake PERL 기술 PERLXpress를 사용하여 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 유생 발현 시스템으로 생성되었다. 각각의 로트 TSHR-ECD 단백질 품질은 SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다.
아데노바이러스 벡터는 Viraquest(North Liberty, IA, 미국)에서 구입하였다. TSHR 아미노산 잔기 1-289(Ad-TSHR)를 함유하는 아데노바이러스의 제조 및 정제는 이전에 개시되었다(Chen et al. 1999 J Clin Endocrinol Metab 84:3182-3186). 요약하면 β-갈락토시다아제를 발현하는 아데노바이러스 Ad-TSHR 및 대조군 아데노바이러스(Ad-LacZ)를 HEK293 세포에서 증식시키고 CsCL 밀도 구배 원심 분리로 정제하였다. 바이러스 입자 농도는 260 nm에서 흡광도를 측정하여 측정하였다.
GD를 위한 아데노바이러스 기반 동물 모델 내에서 ATX-GD-459 및 임상적으로 통용되는 GD 약물 병용
DR3tg 마우스에 15 pmol, 150 pmol 및 1500 pmol의 ATX-GD-459 펩타이드를 각각 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에서 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 -8, -6, -4일에(용량 증가 스케쥴) 15nmol ATX-GD-459(최대 용량)를 3회 주입하였다. 고 용량의 변화 및 그에 상응하는 용량 증가량을 실험마다 나타내었다.
최초 펩타이드 처리 당일부터 시작하여 실험 종료시 까지 마우스를 MMI 또는 프로프라놀롤로 처리하였다. MMI(Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에)를 원하는 농도의 멸균 수에 용해시켜 ALZET 삼투압 펌프(모델 1004, 0.11μL/시간, Charles River, 프랑스)에 의한 피하 투여를 통해 마우스에게 500㎍의 1일 용량을 제공하였다. 새로운 삼투압 펌프를 4주 후에 이식하였다. 프로프라놀롤 하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich)를 0.9 % 식염수에 용해하여 10mg/kg/일의 용량으로 매일 복강 내(IP) 주사를 통해 투여하였다. 0일째에 109 또는 1010 Ad-TSHR 바이러스 입자를 근육 내 주사하여 마우스를 면역화시키고 3주 후에 면역화를 반복하였다. 마우스의 건강 상태를 측정하기 위해 주 단위로 체중을 기록하였다. 첫 번째 면역화 5 주 후에 마우스를 안락사시켜 혈액, 갑상선 및 비장 샘플을 수득하였다. TSHR-유도된 비장 세포 증식, 사이토카인 분비 및 항-TSHR 항체 수준을 하기 기재된 바와 같이 평가하였다.
항-TSHR 항체의 측정
ELISA를 사용하여 정제된 재조합 TSHR-ECD(Chesapeake-Perl)에 대한 항-TSHR 항체(IgG 클래스)를 측정하였다. 96-웰 플레이트(절반-면적 96-웰, Fisher Scientific)를 PBS(0.5㎍/ml) 내 50μl/웰의 TSHR-ECD 단백질로 실온에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. PBS-0.05% Tween20으로 세척한 후에 실온에서 1시간 동안 PBS 내의 1% BSA(w/v)로 웰을 블로킹시키고 테스트 혈청(1 :50 또는 1 :500 희석)과 함께 인큐베이션 시켰다. 마우스 항-TSHR 항체(A9, Abeam, Cambridge, 영국)를 양성 대조군으로 사용하였다. 호스래디쉬 페록시다제(HRP)-컨쥬게이트화 염소 항-마우스 IgG(Abeam)로 항체 결합을 측정하였다. lgG1, lgG2a, lgG2b 및 lgG2c 이소-타입의 항-TSHR 항체를 검출하기 위해 HRP-컨쥬게이트 래트 항-마우스 lgG1(Southern Biotech, Alabama, 미국), 염소 항-마우스 lgG2a(Southern Biotech), 염소 항-마우스 lgG2b(Abeam) 및 염소 항-마우스 lgG2c(Abeam) 항체를 각각 사용하였다. 신호를 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 증폭시켰다. 450nm에서 플레이트 판독기(Tecan Benelux)로 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
자극성 항-TSHR 항체(TSAb)의 측정
cAMP 반응성 루시퍼라제 컨스트럭트인 pA3Luc 및 G418 내성을 지닌 인간 TSHR인 pcDNA3-TSHR로 안정하게 트랜스펙트시킨 중국 햄스터 난소-K1(CHO-K1) 세포인 Lulu* 세포를 M. Ludgate 교수(영국 카디프 대학교)에 의해 제공받았다. 세포를 5% CO2와 37℃에서 2mM L-글루타민, 50U/mL 페니실린, 50U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza), 10% 우 태아 혈청(FBS)(Fisher Scientific, Aalst, 벨기에) 및 0.2 mg/mL 제네티신(Fisher)이 보충된 Ham's 12 배지(Lonza) 내에 유지시켰다. TSAb를 측정하기 위해 세포를 96-웰 플레이트에서 2×104 세포/웰의 농도로 10% 차콜 스트립핑 혈청(Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에)을 함유한 Ham's 12 배지 내에 도말하였다. 다음날 배지를 제거하고 37℃에서 4시간 동안 5% PEG와 10% 시험 혈청을 함유한 신선한 Ham's 배지에서 배양하였다. 그 후 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 완충액(Promega, Leiden, 네덜란드)으로 용해시켰다. cAMP 반응성 루시퍼라제 생성은 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)에 의해 제조자 지침에 따라 측정하였고 발광은 FLUOstar 오메가 루미넌스(BMG labtech, Ortenberg, 독일)로 측정하였다. 결과는 상대 광 유니트(RLU, 자극 세포의 발광/비 자극 세포의 발광)로 나타내었다.
갑상선 기능 항진증의 측정
총 티록신(T4)을 제조자 지침에 의거 CBI 마우스/래트 티록신 ELISA 키트 (Calbiotech, Spring Valley, 미국 캘리포니아)를 사용하여 희석되지 않은 마우스 혈청(10μl) 내에서 측정하였다. 키트 내에서 T4 수치를 표준화하여 계산하였고 ㎍/dl로 표현되었다.
비장세포 증식 분석
비장세포를 분리하고 96-웰 편평 플레이트 내에서 2 mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza, Verviers, 벨기에)으로 보충한 엑스 비보 15 배지에 배양시켰다. 항원-유도 세포 증식을 조사하기 위해 0.5×106 세포/웰을 72시간동안 서로 다른 TSHR-ECD 농도(0-25 ㎍/ml)로 배양하였다(200 μl/웰). 37℃ 및 5% CO2로 인큐베이션 72시간 후에 60 μl의 세포 상등액을 회수하고 동결시켰다. 20 μl/웰의 3중화 티미딘(PerkinElmer, Zaventem, 벨기에)을 세포에 첨가하여 최종 농도가 1 μCi/웰이 되게 한다. 세포를 37℃로 인큐베이션 시킨 후 16시간 후에 플레이트를 냉동시킨다. 해동된 플레이트를 수집하고 β-카운터(Wallac 1450 Microbeta Trilux 액상 Scintillation 카운터)로 판독하여 세포 증식을 평가한다.
결과
아데노바이러스 기반 GD 모델에서 MMI와 ATX-GD-459의 병용투여
GD 증상을 치료하기 위해 ATX-GD-459 처리가 MMI와 병용될 수 있는지를 확인하기 위해 MEM 및 ATX-GD-459 병용투여의 효과를 아데노바이러스 기반 GD 동물 모델에서 조사하였다(추가 논의는 실시예 4 및 5 참조). 이 실험에서, DR3tg 마우스를 MMI와 ATX-GD-459의 조합으로 처리하였다 : 비히클+대조펩타이드, MMI+대조펩타이드, 비히클+ATX-GD-459 또는 MMI+ATXGD-459. ATX-GD-459 또는 대조 펩타이드는 용량 증가 스케쥴(도 8)에 따라 실험 첫 2주 동안 투여되었다. 피하 투여 비히클 또는 MMI 처리는 동시에 시작되었지만 실험이 종료될 때까지 지속되었다. 이 실험 디자인은 GD와 유사한 질병 매개 변수에 대한 MMI 및 ATX-GD-459 처리의 상호 영향에 대한 조사를 허용하였다.
첫번째로 TSHR 특이적 비장 세포 증식에 대한 MMI 및 ATX-GD-459 처리의 효과를 조사하였다. 절대 TSHR-특이적 비장 세포 증식 수준은 대조군 마우스에서 상대적으로 낮았다(도 10). 그러나 이 수준은 이전에 수행한 실험의 다른 모든 대조군(데이터는 나타내지 않음) 또는 프로프라놀롤 실험에서보다 훨씬 높은 수준이었다. 따라서 도 10에 나타난 바와 같이 MMI 또는 ATX-GD-459 처리로 인한 TSHR 특이적 비장 세포 증식의 유의미한 감소를 의미있게 판단하여야 한다.
TSHR에 의해 유도된 비장 세포 증식 이후에 항-TSHR IgG 혈청 수준을 모든 마우스에서 측정하였다. 실험 시작 전에 모든 마우스에서 항 TSHR IgG 항체가 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). ATX-GD-459의 용량 증가 처리는 0주에 측정된 바와 같이 항-TSHR 항체의 생성을 유도하지 않았다(도 11). Ad-TSHR 면역화는 대조 펩타이드 처리 마우스에서 항 TSHR 항체 생성을 유도 하였으나 ATX-GD-459 처리 마우스에서는 유도하지 않았다. 대조군 마우스 사이에서 잠재적인 변이로 인한 큰 차이는 나타나지 않았으나 ATX-GD-459 전처리는 평균 항-TSHR 항체 생성을 90% 이상 감소시켰다. 또한 MMI 처리는 항-TSHR 항체 수준에 영향을 미치지 않았다. 또한 MMI 처리는 ATX-GD-459 펩타이드 처리의 항체 감소 능력에 영향을 미치지 않았다.
항-TSHR 항체 프로파일을 특정 IgG 이소-타입을 측정하여 추가로 조사하였다. 도 12에 나타난 바와 같이 Ad-TSHR 면역화된 마우스는 모두 IgG-1 이소 타입의 항-TSHR 항체를 생성하지 않았다. Ad-TSHR 면역화는 대조 펩타이드 처리 마우스에서 항-TSHR IgG2b 및 IgG2c 항체의 생성을 유도하였으나 ATX-GD-459 처리 마우스에서는 생성되지 않았다. ATX-GD-459 전처리는 항 TSHR IgG2b 및 IgG2c 항체 생성을 90% 이상 감소시켰다. 대조적으로 MMI 처리는 항-TSHR IgG 이소-타입에 영향을 미치지 않으며 ATX-GD-459 처리의 항체 감소 능력에는 영향을 미치지 않았다. 이 데이터는 항-TSHR 총 IgG 항체에서 관찰된 프로파일과 완전히 일치한다.
이소 타입 측정 이외에 항-TSHR 항체의 생물학적 활성 및 MMI 또는 ATX-GD-459의 잠재적 효과를 조사하였다. Ad-TSHR 면역화 마우스 자극 항체의 역가가 초과되지 않았기 때문에(데이터는 나타내지 않음) 자극 항체의 발생에 대한 MMI 또는 ATX-GD-459 처리의 효과에 대해서는 판단할 수 없었다. 자극 항체의 낮은 빈도는 이전에 기재된 실험(ATX-GD-15-003 보고서)에 따른다.
마지막으로 T4 수준에 대한 MMI 및 ATX-GD-459 처리의 효과를 조사하였다. 이 실험에서 Ad-LacZ 면역화가 면역 대조군으로 사용되지 않았기 때문에 갑상선 기능 항진증의 발병률을 결정할 수 없었다. 갑상선 기능 항진증에 대한 정보는 없지만 MMI 처리가 T4 수치를 유의미하게 감소시킨 것으로 나타났다(도 13). 그러나 ATX-GD-459 전처리는 혈청 T4 수준에 영향을 미치지 않았다. 또한 ATX-GD-459 전처리는 MMI의 T4-감소 능력에 영향을 미치지 않았다.
종합적으로 판단하면 이 데이터는 MMI와 ATX-GD-459 처리가 서로의 기능을 저해하지 않으며 아데노바이러스 기반 GD 모델에서 안전하게 병용될 수 있음을 나타낸다.
아데노바이러스 기반 GD 모델에서 프로프라놀롤과 ATX-GD-459의 병용 투여
GD 환자는 종종 갑상선 기능 항진증의 아드레날린성 증상에 대응하기 위해 β-차단제를 사용한다. 따라서 이 실험에서 아데노바이러스 기반 GD 모델에서 ATX-GD-459 및 β-차단제 프로프라놀롤과의 병용 투여 효과를 조사하였다. 첫 번째로 TSHR 특이적 비장 세포 증식을 측정하였다. 도 14에 나타난 바와 같이 프로프라놀롤 또는 ATX-GD-459 처리는 TSHR-특이적 비장 세포 증식에 유의미한 효과를 유도하지 않았다. 또한 프로프라놀롤과 ATX-GD-459의 병용 처리는 증식 반응에 영향을 미치지 않았다.
그 후 프로프라놀롤 및 ATX-GD-459 처리가 항 TSHR 항체 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 혈청 샘플을 수집하여 ELISA를 통해 항-THSR IgG 수준을 측정하였다. ATX-GD-459 펩타이드 전처리 전(W-2) 및 후(WO)에는 항 TSHR IgG 항체가 존재하지 않았다(도 15). Ad-TSHR 면역화는 대조군 펩타이드 처리 마우스에서 항-TSHR 항체의 강력한 생성을 유도하였으나 ATX-GD-459 처리 마우스에서보다 적게 나타났다. 놀랍게도 이 실험에 사용된 1010 바이러스 입자를 사용하는 Ad-TSHR 면역화는 이전 실험에서 사용된 109 Ad-TSHR 면역화보다 더 높은 항-TSHR 항체 역가를 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). ATX-GD-459 처리는 면역화 후 W2와 W5에서 측정했을 때 항-TSHR 항체 생성을 90% 이상 감소시켰다. 대조적으로 프로프라놀롤 치료는 항-TSHR 항체 수준에 영향을 미치지 않았다. 또한 프로프라놀롤 치료는 ATX-GD-459 펩타이드 처리의 항체 감소 능력에 영향을 미치지 않았다.
항체 프로파일을 더 조사하기 위해 항-TSHR IgG 이소 타입 프로파일을 측정하였다. lgG2b 및 lgG2c 수준보다는 낮으나 항-TSHR 면역화에 의해 항-TSHR IgG1 항체가 명확하게 유도되었다. 이러한 데이터는 이전 실험에서의 항-TSHR IgG1의 부재와 대조적이나(데이터 표시되지 않음) 면역화에 사용된 아데노바이러스 입자 용량이 109에서 1010으로 증가한 것으로 설명할 수 있다. 도 16에 나타난 바와 같이 ATX-GD-459 처리는 항-TSHR IgG2b 및 IgG2c 항체 수준을 유의미하게 감소시켰다. 또한 항-TSHR IgG 항체가 펩타이드 처리에 의해 감소되었으나 유의미한 수준으로는 감소하지 않았다. 펩타이드 처리와 달리 프로프라놀롤 처리는 항-TSHR IgG 이소 타입의 어떤 것에도 영향을 미치지 않았다. 또한 프로프라놀롤 처리는 ATX-GD-459 처리의 항체 감소 능력에 영향을 미치지 않으므로 항-TSHR 총 IgG 항체에 대해 관찰된 프로파일과 완전히 일치한다
종합하면, ATX-GD-459 처리는 이 동물 모델에서 항-TSHR 항체 역가를 현저하게 감소시켰다. 그러나 프로프라놀롤 처리가 GD와 유사한 질병 파라미터에 미치는 영향은 관찰되지 않았다. 매일 IP 투여가 마우스 혈액에서 프로프라놀롤의 약리학 적 수준을 유도하는지를 확인하기 위해 마우스 혈장의 프로프라놀롤 수준을 LC-MSMS(Anacura)로 측정하였다. 혈액 샘플을 투여 후 60~90분 사이에 채취하고 개별 혈장 수준을 W0과 W5 사이에서 비교하였다. 결과는 도 18에 나타내었다.
(실시예 3) ATX-GD-459를 사용한 생체 외 T 세포 내성
RNB-4K 및 RNB-5D에 특이적인 하이브리도마 클론을 선택하여 RNB-4K-GKK 및 RNB-5D-K1 펩타이드가 아피토프인지 여부를 측정하였다. '항원 처리 독립 제시(APIPS)' 분석이 수행되었고 RNB-4K-GKK 및 RNB-5D-K1 펩타이드가 아피토프인 것으로 확인되었다(도 27).
TSHR에 대한 내성을 유도하기 위해 표 1에 나타낸 펩타이드(ATX-GD-459로 명명 됨) 또는 단독 투여된 개별 펩타이드를 포함하는 조성물의 능력을 측정하였다. 생체 외 내성 프로토콜은 도 19에 나타내었다.
HLA-DR3 마우스를 용량 증가 스케쥴에 따라 ATX-GD-459로 처리하고 CFA에서 부모 펩타이드 4K/5D/9B를 함께 면역화 시켰다. 결과는 ATX-GD-459 처리가 비장 세포와 LN 세포 모두에서 유의미한 수준의 TSHR 특이적 내성을 유도함을 나타내었다(도 20). ATX-GD-459 처리에 의해 유도된 내성은 개별 펩타이드의 투여에 의해 유도된 내성보다 증가하였다(도 20).
(실시예 4) 아데노바이러스 기반 그레이브스 병 모델의 확립
ATX-GD-459 펩타이드 처리의 치료 효과를 확인하기 위해 야생형 BALB/c 마우스에서 아데노바이러스 기반 동물 모델을 처음 수립하였다. TSHR에 의해 유도된 비장 세포 증식, 항-TSHR IgG 항체, T4의 혈청 수준 및 갑상선 조직의 병리학적 변화를 질병 증상의 매개 변수로서 조사하였다. 첫 번째 실험에서 BALB/c 마우스를 108 개의 Ad-TSHR 바이러스 입자로 면역화 시켰다. 이 바이러스 용량이 갑상선 항진증과 항-TSHR 항체 생성을 유도한다고 기술되었으나(Chen et al., 2004, Endocrinology_145 (49) : 4927-33) 2/10의 마우스만이 갑상선 기능 항진증으로 간주되었으며(경계선) 항-TSHR IgG 항체는 어느 마우스에서도 생성되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
증가된 바이러스 입자 용량을 사용하는 두 번째 실험에서 Ad-TSHR 면역화 마우스의 약 30%가 첫 번째 면역화 4주 후에 측정된 혈청 T4 수치가 증가하였다(도 22).
그러나 10주째에는 15%의 증가가 관찰되었다. 초기의 증가 이후에 면역화 이후 몇 주가 지나 야생형 BALB/c 마우스의 증가된 T4 수준의 감소는 이전에 개시된 바 있다(McLachlan et al, 2012, Thyroid 8:1-7). 그럼에도 불구하고 개별 마우스에서 갑상선 상피 세포의 비대 또는 림프구 침윤과 같은 갑상선 조직의 조직 병리학적 소견과 뚜렷한 갑상선 기능 항진이 정확히 일치하였다(데이터는 표시되지 않음).
문헌은 C57BL/6 유전적 배경 또는 DR3tg 마우스가 그레이브스 병 유사 증상의 발달에 내성을 지닌다는 증거를 나타내나 본 발명자들은 Ad-TSHR 면역화가 혼합된 C57BL/10, DBA/2, C57BL/6 비-MAC 클래스 Ⅱ의 DR3tg 마우스에서 그레이브스 병 유사 증상을 유도하는 능력을 시험하였다.
도 23a는 Ad-LacZ 및 Ad-TSHR 면역화된 DR3tg 마우스의 혈청 T4 수준을 나타낸다. Ad-TSHR 면역화 마우스 4마리에서 Ad-LacZ 면역화 마우스의 평균 + 2SD보다 높은 T4 수치를 나타내었으나 단지 경계성 갑상선 기능 항진을 나타내었으며 T4 수준의 증가가 펩타이드 처리 효능의 효과를 연구하는 질병 파라미터로 사용하기에는 너무 낮다고 간주되었다.
Ad-TSHR 면역화는 DR3tg 마우스의 혈청에서 높은 항-TSHR IgG 역가를 유도하였다(도 11, 우측 패널). 가장 높은 항-TSHR IgG 수준은 4주에 도달하였고 이어서 7주 및 10주에 ALB/c 마우스에서 관찰된 안정한 항 TSHR IgG 수준과 대조되는 항체 수치의 감소가 나타났다(도 23c, 좌측 패널). DR3tg 마우스의 항-TSHR IgG 수준이 첫 번째 면역화 후 2주째에 4주째 보다 더 높았다는 결과는(데이터는 표시되지 않음) 10주 대신에 4주에 아데노바이러스 그레이브스 모델을 종료시키는 결론을 이끌어 냈다.
(실시예 5) 아데노바이러스 그레이브스 병 모델의 검증
DR3tg 아데노바이러스 그레이브스 병 모델을 검증하기 위해 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 항-TSHR 항체 생성에 대한 상이한 면역 조절 약물의 영향을 측정하였다. 항-갑상선 약물인 메티마졸(MMI)은 현재 그레이브스 병 환자의 갑상선 호르몬 수치를 직접적으로 감소시키는 데 사용된다. 따라서 Ad-TSHR 면역화 된 DR3tg 마우스에서 MMI 처리의 효과를 측정하였다. 마우스에서의 MMI의 갑상선 기능 항진 유도 효과를 개시한 문헌(Jeong et al, 2012, Endocrinology 153: 683-9; Mozes et al, 1998, J. Clin Immunology 18 (2): 106-13)에 기초하여 두 가지 상이한 MMI 용량(50~500㎍/마우스/일)을 시험하였다. 500㎍ MMI의 1일 용량은 첫 번째 면역화 후 2주 및 4주 모두에서 T4 수준을 유의미하게 감소시키는 반면에 50㎍ 용량은 감소된 T4 수준으로의 추세를 나타내었다(도 24a). Ad-TSHR 면역화가 이번 연구와 이전의 실험에서 갑상선 기능 항진증을 유도하지는 않았지만(데이터는 나타내지 않음) MMI 처리에 의해 유도된 T4 수준의 감소는 DR3tg 마우스의 갑상선에 의한 호르몬 생성이 영향받을 수 있음을 나타낸다.
MMI는 항 갑상선 기능 외에도 면역 조절 효과를 나타낸다(Mozes et al, 1998, Wang 등, 2003, J. Leukoc. Biol. 73 : 57-64). 따라서 MMI 처리가 Ad-TSHR 면역화된 마우스에서 항-TSHR IgG 생성을 감소시킬 수 있는지 여부를 측정하였다. MMI 처리가 T4 수준을 유의미하게 감소시켰으나 항 TSHR IgG 수준의 변화는 관찰되지 않았다(도 24b).
그레이브스 병 환자 특히 GO 환자는 종종 글루코코르티코이드로 면역 억제 치료를 필요로 한다. Ad-TSHR 면역화 마우스에서 항-TSHR 항체 생성에 대한 합성 글루코 코르티코이드 약물인 메틸프레드니솔론의 효과를 시험하였다. Ad-TSHR 면역화 DR4tg 마우스에서 7 mg/kg/일의 메틸프레드니솔론 처리는 항 TSHR IgG 수준을 유의미하게 감소시켰으나 1 mg/kg/일의 용량은 항체 역가를 낮추는데 충분하지 못했다(데이터는 나타내지 않음).
Ad-면역화된 DR3tg 마우스의 7 mg/kg/일 메틸프레드니솔론 처리는 첫 번째 면역화 후 2주에 측정된 항-TSHR 항체 수준을 유의미하게 감소시켰으나 4주 후에는 그렇지 않았으며 비-처리된 마우스에서 시간에 따라 항-TSHR 항체 수준은 자연적으로 감소하였다. 메틸프레드니솔론 처리는 또한 흉선 및 비장 세포 수를 감소시켰으며 이는 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 충분한 약리학적 용량 수준을 나타낸다(도 25).
이러한 데이터는 질병을 지닌 DR3tg 마우스에서의 아피토프의 효과가 항-TSHR IgG 항체의 감소를 측정함으로써 결정될 수 있음을 나타낸다.
(실시예 6) 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 ATX-GD-459의 치료적 효능 입증
RNB-4K-GKK, RNB-5D-K1 및 RNB-9B 펩타이드 조합(ATX-GD-459)이 항-TSHR 항체의 발달을 억제할 수 있는지를 측정하기 위해 DR3tg 마우스는 용량 증가 스케쥴에 따라 ATX-GD-459 또는 대조군 처리를 받고 Ad-LacZ 또는 Ad-TSHR 면역화하였다. 혈청 샘플을 채취하여 ELISA를 통해 항-THSR IgG 수준을 측정하였다. ATX-GD-459 펩타이드 처리 전(W-2, 데이터는 나타내지 않음)과 ATX-GD-459 펩타이드 처리 후(WO)에 항-TSHR IgG 항체가 존재하지 않았다(도 25). 첫 번째 Ad-TSHR 면역화 2주 후에 PBS로 처리한 마우스에서 높은 항 TSHR IgG 수준이 관찰되었다. ATX-GD-459 처리는 Ad-TSHR 면역화시 항-TSHR IgG 항체의 증가를 2주 및 5주에 각각 72% 및 65% 감소시켰다. 이러한 결과는 ATX-GD-459가 이 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 효과적임을 나타낸다.
Ad-TSHR 면역화 시 높은 항 TSHR IgG 수준이 관찰되었다. 따라서 이 질병 파라미터를 사용하여 아데노바이러스 그레이브스 병 모델에서 면역-조절 약물 또는 ATX-GD-459 펩타이드 처리의 효과를 조사하였다. 메틸프레드니솔론 처리가 Ad-TSHR 면역화된 DR3tg 마우스에서 항-TSHR IgG 수준을 성공적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 용량 증가 스케쥴에 따른 ATX-GD-459 펩타이드 처리는 항-TSHR IgG 항체 형성의 증가를 70% 감소시켰다.
재료 및 방법
마우스
마우스는 실시예 2에 나타난 바와 같다.
항원
항원은 실시예 2에 나타난 바와 같다.
항원 처리 독립 제시 시스템(APIPS) 분석
항원-특이적 T세포 하이브리도마를 고정된 또는 비-고정된 VAVY 또는 BM14 세포(=APC)에 의해 제시되는 펩타이드에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 각 클론의 5×x104 세포를 25㎍/ml 펩타이드와 5×x104 고정화 또는 신선한 APC와 함께 배양하였다. APC를 고정화시키기 위해 세포를 0.5 % 파라포름알데히드(Merck, Darmstadt, 독일)(pH7)와 함께 실온에서 5분 동안 배양하였다. 0.4M 글리신(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 세포를 RPMI-10 % FCS로 세척하여 고정 반응을 중단시켰다. 또한 에피토프를 동정하기 위해 인간 TSHR-ECD 단백질(Chesapeake-PERL, Savage, Maryland, 미국)에 대한 반응성을 측정하였다. 48시간 후 항원에 의한 IL-2 생성을 ELISA로 측정하였다.
생체 외 내성 시험
DR3tg 또는 DR4tg 마우스에 0.1㎍, 1㎍ 및 10㎍의 펩타이드를 각각 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에서 피하 주사하였다. 그 후 마우스에 -8, -6 및 -4일에(용량 증가 스케쥴) 33, 75 또는 100㎍ 펩타이드를 3회 주사하였다(최대 용량에 따라 상이함, 도면의 설명 참조). 최대 용량의 변화 및 그에 상응하는 용량 증가량을 실험마다 나타내었다. 0일째에 쥐의 꼬리 부분에 CFA(펩타이드/CFA)에 유화된 50㎍ 항원(변형되지 않은 모체 15-머 펩타이드)을 피하 면역화 시켰다.
면역화 10일 후에 림프절(LN)을 드레이닝시키고 비장을 채취하였다. LN 세포와 비장세포를 분리하고 96-웰 편평 플레이트 내에서 엑스 비보 15 배지(2mM L-글루타민, 50 U/mL 페니실린 및 50 U/mL 스트렙토마이신으로 보충함; Lonza)에 배양시켰다. 항원-유도 세포 증식을 조사하기 위해 0.5×l06 세포/웰을 서로 다른 항원 농도(0-25 ㎍/ml)로 72시간동안 배양(200 μl/웰)시키거나 12.5 ㎍/ml 정제 단백질 유도체(PPD; 프라이밍 대조군; Statens serum institut, 덴마크 코펜하겐)와 함께 배양시켰다. 72시간 후에 60 μl의 세포 상등액을 회수하고 동결시켰다. 20 μl/웰의 3중화 티미딘(PerkinElmer, Zaventem, 벨기에)을 세포에 첨가하여 최종 농도가 1 μCi/웰이 되게 한다. 세포를 37℃로 인큐베이션 시킨 후 16시간 후에 플레이트를 냉동시킨다. 해동된 플레이트를 수집하고 β-카운터(Wallac 1450 Microbeta Trilux 액상 Scintillation 카운터)로 판독하여 세포 증식을 평가한다.
그레이브스 병에 대한 아데노바이러스 동물 모델
인간 TSHR A-서브유니트(아미노산 잔기 1-289, Ad-TSHR)를 발현하는 아데노바이러스와 β-갈락토시다아제를 발현하는 대조군 아데노바이러스(Ad-LacZ)를 Viraquest(North Liberty, IA, 미국)에서 구입하였다. 6주령 자성 BALB/cJOIaHsd 마우스(Harlan Laboratories, Venray, 네덜란드) 또는 DR3tg 마우스의 뒷다리 근육 내에 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ(109, 1010 또는 1011 바이러스 입자)를 근육 주사하였다. 각 실험마다 모든 마우스를 동일한 아데노바이러스 배치를 사용하여 동시에 면역화시켰다. 마우스는 3주 간격(0일, 3주 및 6주)으로 2회 또는 3회 주입시키고 첫 번째 면역화 전과 2번째 면역화 후 1주일 후에 혈액을 채취하였다. 모든 마우스를 첫 번째 면역화 후 4, 5 또는 10주 후에 안락사시켜 혈액, 비장 세포 및 갑상선을 채취하였다. 비장세포를 분리하고 96-웰 편평 플레이트 내에서 엑스-비보 15 배지(글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충함; Lonza)에 배양시켰다. 항원-유도 세포 증식을 조사하기 위해 0.5×l06 세포/웰을 서로 다른 항원 농도로 (0-25 ㎍/ml) 72시간동안 배양(200 μl/웰)시켰다. 72시간 후에 60 μl의 세포 상등액을 회수하고 동결시켰다. 20 μl/웰의 3중화 티미딘(PerkinElmer, Zaventem, 벨기에)을 세포에 첨가하여 최종 농도가 1 μCi/웰이 되게 한다. 세포를 37℃로 인큐베이션 시킨 후 16시간 후에 플레이트를 냉동시킨다. 해동된 플레이트를 수집하고 β-카운터(Wallac 1450 Microbeta Trilux 액상 Scintillation 카운터)로 판독하여 세포 증식을 평가한다.
항-TSHR 항체의 검출
정제 TSHR-ECD 단백질(Chesapeake-Perl)에 대한 항-TSHR 항체(IgG 클래스)를 ELISA를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트(절반-면적 96-웰, Fisher Scientific)를 PBS(0.5㎍/ml) 내 50 μl/웰의 TSHR-ECD 단백질로 실온에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. PBS-0.05% Tween으로 세척한 후에 실온에서 1시간 동안 PBS 내의 1%(w/v) 우혈청알부민(BSA)으로 웰을 블로킹시키고 테스트 혈청(복제된 알리코트, 1 : 50 희석) 과 함께 인큐베이션 시켰다. 마우스 항-TSHR 항체 (A9, Abeam, Cambridge, 영국)를 양성 대조군으로 사용하였다. 호스래디쉬 페록시다제(HRP)-컨쥬게이트화 염소 항-마우스 IgG(Abcam)로 항체 결합을 측정하였다. 신호를 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 증폭시켰다. 450nm에서 플레이트 판독기(Tecan Benelux)로 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
자극성 항 TSHR-항체(TSAb) 측정
cAMP 반응성 루시퍼라제 컨스트럭트인 pA3Luc 및 G418 내성을 지닌 인간 TSHR인 pcDNA3-TSHR로 안정하게 트랜스펙트시킨 중국 햄스터 난소-K1(CHO-K1) 세포인 Lulu* 세포를 M. Ludgate 교수(영국 카디프 대학교)에 의해 제공받았다. 세포를 5% CO2와 37℃에서 2mM L-글루타민, 50U/mL 페니실린 및 50U/mL 스트렙토마이신(모두 Lonza), 10% 우 태아 혈청(FBS)(Fisher Scientific, Aalst, 벨기에) 및 0.2 mg/mL 제네티신(Fisher)이 보충된 Ham's 12 배지(Lonza) 내에 유지시켰다. TSAb를 측정하기 위해 세포를 96-웰 플레이트에서 2×104 세포/웰의 농도로 10% 차콜 스트립핑 혈청(Sigma-Aldrich, Bornem, 벨기에)을 함유한 Ham's F12 배지 내에 도말하였다. 다음날 배지를 제거하고 37℃에서 4시간 동안 5% PEG와 10% 시험 혈청을 함유한 신선한 Ham's 배지에서 배양하였다. 그 후 세포를 루시퍼라제 세포 배양 용해 완충액(Promega, Leiden, 네덜란드)으로 용해시켰다. cAMP 반응성 루시퍼라제 생성은 루시퍼라제 리포터 분석(Promega)에 의해 제조자 지침에 따라 측정하였고 발광은 FLUOstar 오메가 루미넌스(BMG labtech, Ortenberg, 독일)로 측정하였다. 결과는 상대 광 유니트(RLU, 자극 세포의 발광/비 자극 세포의 발광)로 나타내었다.
갑상선 기능 항진증의 검출
총 티록신(T4)를 제조자 지침에 의거 CBI 마우스/래트 티록신 ELISA 키트 (Calbiotech, Spring Valley, 미국 캘리포니아)를 사용하여 희석되지 않은 마우스 혈청(10μl) 내에서 측정하였다. 키트 내에서 T4 수치를 표준화하여 계산하였고 ㎍/dl로 표현되었다. 갑상선을 10% 중성 완충 포르말린(pH 7.5) 내에서 고정화시키고 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 조직을 처리하고 염색시켰다. 조직을 병리학적 변화(비대, 상피 세포 과발현 및 림프구의 침윤)를 위해 관찰하고 점수화하였다(KWS Biotest, 영국 브리스톨).
그레이브스 병 동물 모델 검증
DR3tg 마우스를 Ad-TSHR로 2회 근육 주사하여 3주 간격으로(0일 및 21일) 면역화 시켰다. 첫 번째 면역화 시작일로부터 실험 종료시 까지 마우스를 MMⅠ 또는 6a-메틸프레드니솔론 21 헤미숙네이트 나트륨 염(메틸프레드니솔론)으로 처리하였다. 모든 화합물은 ALZET 삼투 펌프(모델 1004, 0.11㎕/시간, Charles River, 프랑스)로 피하 투여하였다. MMI(Sigma)를 원하는 농도의 멸균 수에 용해시켜 마우스에게 1일 50 또는 500㎍을 투여하였다. 메틸프레드니솔론(Sigma)을 멸균 수에 용해시키고 1 mg/kg/일 또는 7 mg/kg/일의 용량으로 마우스에 투여하였다. 마우스의 건강 상태를 측정하기 위해 주 단위로 체중을 기록하였다. 마우스를 첫 번째 면역화 4 주 후에 안락사시켜 혈액 및 비장 샘플을 채취하였다. TSHR- 특이적 비장 세포 증식 및 항-TSHR 항체 수준을 상기한 바와 같이 평가하였다.
예방적 그레이브스 병 동물 모델
DR3tg 또는 DR4tg 마우스에 0.1㎍, 1㎍ 및 10㎍의 ATX-GD-459를 각각 -15, -13 및 -11일에 옆구리 부위에서 피하 주사하거나 대조군 처리하였다. 그 후 마우스에 100㎍ ATX-GD-459(최대 용량)를 -8, -6 및 -4일에 3회 주입하거나(용량 증가 스케쥴) 대조군 처리하였다. 최대 용량의 변화 및 그에 상응하는 용량 증가량을 실험마다 나타내었다. 0일째에 마우스에 109 Ad-TSHR 또는 Ad-LacZ 바이러스 입자를 근육 내 주사하여 면역화 시키고 3주 후에 면역화를 반복하였다. 첫 번째 면역화 후 5주 후에 혈액과 비장을 채취하였다. TSHR-특이적 비장 세포 증식 및 항-TSHR 항체 수준을 상기한 바와 같이 평가하였다.
상기한 본 발명의 다양한 수정 및 변이가 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었으나 청구된 본 발명의 보호범위는 이러한 특정 실시예에 의해 부당하게 제한되지 않는다는 것으로 이해되어야 한다. 실제로 화학 또는 생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 상기한 모드의 다양한 변이가 본 발명에 포함되는 것으로 판단된다. 상기 명세서에 언급된 모든 공보는 본 발명에 참고 문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Apitope International NV <120> Composition <130> P106152PCT <150> GB 1423171.6 <151> 2014-12-24 <150> GB 1520190.8 <151> 2015-11-16 <150> GB 1520196.5 <151> 2015-11-16 <150> GB 1520199.9 <151> 2015-11-16 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thyroid Stimulating Hormone Receptor (TSHR) peptide RNB-5D-K1 <400> 1 Lys Lys Lys Lys Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Lys Lys 20 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHR peptide RNB-9B <400> 2 Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 764 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro 1 5 10 15 Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser 85 90 95 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu 130 135 140 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu 260 265 270 Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn 275 280 285 Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser 290 295 300 Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser 305 310 315 320 Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly 325 330 335 Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr 340 345 350 Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln 355 360 365 Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His 370 375 380 Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro 385 390 395 400 Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe 405 410 415 Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val 435 440 445 Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly 450 455 460 Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu 465 470 475 480 Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr 485 490 495 Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg 515 520 525 Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly 530 535 540 Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile 545 550 555 560 Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr 565 570 575 Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val 580 585 590 Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val 595 600 605 Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys 610 615 620 Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile 625 630 635 640 Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val 645 650 655 Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys 660 665 670 Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp 675 680 685 Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln 690 695 700 Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln 705 710 715 720 Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu 725 730 735 Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln 740 745 750 Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu 755 760 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHR peptide RNB-4K-GKK <400> 4 Lys Lys Gly Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile Asp 1 5 10 15 Val Thr Gly Lys Lys 20

Claims (22)

  1. 하기 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) 펩타이드인
    (ⅰ) KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드; 및
    (ⅱ) GLKMFPDLTKVYSTD(서열번호: 2)의 아미노산 서열을 지닌 펩타이드;
    를 포함하는, 피험자에 그레이브스 병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 항-갑상선제, β-차단제 또는 이들의 조합을 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생체 내에서 TSHR 자가항체의 생성을 억제 또는 예방하기 위해 사용되는 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생체 내 TSHR 자가항체의 생성을 억제 또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 사용되는 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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