JP7117847B2 - 組成物 - Google Patents
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Description
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列
を含む組成物を提供する。
RNB-4K-GKK: KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK
を含有しないか又は含まない。
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列
を含む、同時、別々又は逐次投与のためのキットに関する。
グレーブス病は主要自己抗原である甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)を標的にする自己反応性T及びBリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患である。
T細胞エピトープは、自己であれ外来であれ、あらゆる抗原への適応免疫応答において中心的役割を果たしている。過敏性疾患(アレルギー、自己免疫疾患及び移植拒絶反応を含む)においてT細胞エピトープが果たしている中心的役割は、実験モデルの使用を通じて実証されてきた。アジュバントと組み合わせた合成ペプチド(T細胞エピトープの構造に基づく)の注射により炎症性疾患又はアレルギー疾患を誘導することが可能である。
適応免疫応答では、Tリンパ球はタンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。APCはタンパク質抗原を取り込んでそれを短いペプチド断片に分解する。ペプチドは細胞内部の主要組織適合性分子に結合して細胞表面に運ばれ得る。MHC分子と共に細胞表面に提示されると、ペプチドはT細胞により認識される(T細胞受容体(TCR)を介して)ことができ、その場合にはそのペプチドはT細胞エピトープである。
用語「ペプチド」は通常の意味で使用され、典型的には隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合により互いに連結された典型的にはL-アミノ酸の一連の残基を意味する。この用語には改変ペプチド及び合成ペプチド類似体が含まれる。
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明に従ったペプチド及び/又は組成物をグレーブス病の治療又は管理に使用される他の療法と、本発明のペプチド/組成物ともう一方の治療薬の両方の治療効果を維持したままで、組み合わせて施すことが可能であることを見出した。
i)TSHR自己抗体
ii)TSHRに特異的なCD4+T細胞
iii)TSHR自己抗体を分泌するB細胞
のうちのいずれか又はすべてのレベルの減少を引き起こし得る。
本ペプチド又は組成物は、注射液として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射に先立つ液体中の溶液、又は液体中の懸濁液に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化することもできるし、又はペプチドをリポソームに封入することもできる。活性成分は、薬学的に許容可能であり活性成分と適合する賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水(例えば、リン酸緩衝食塩水)、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど及びその組合せである。
都合の良いことに、2つのTSHRペプチドは、混合した組成物又はカクテルの形態で一緒に投与することができる。しかし、同時、別々、逐次又は組合せ投与のために、ペプチドをキットの形態で別々に提供することが好ましい状況があり得る。
グレーブス病の現在の動物モデルは種々の欠点と関連している。例えば、現在使用されている動物モデルはグレーブス病と関係する症状又は特徴を発症しない。さらに、利用可能な動物モデル、例えば、BALB/cマウスで開発されたモデルは、グレーブス病の承認された治療法に対する応答について試験されていない。
[1] 以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む組成物。
[2] 治療に使用するための、上記[1]に記載のペプチド、並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/若しくはβ遮断薬、又は上記[1]に記載の組成物。
[3] TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための、上記[1]又は[2]に記載の組成物又は使用のためのペプチド。
[4] 対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防するための、上記[1]又は[2]に記載の組成物又は使用のためのペプチド。
[5] TSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための医薬の製造における、上記[1]又は[2]に記載のペプチド又は組成物の使用。
[6] グレーブス病を治療する及び/又は予防するための医薬の製造における、上記[1]は[2]に記載のペプチド又は組成物の使用。
[7] 対象においてTSHR自己抗体の産生を抑制する又は予防するための方法であって、対象に上記[1]又は[2]に記載のペプチド又は組成物を投与するステップを含む方法。
[8] 対象においてグレーブス病を治療するための方法であって、対象に上記[1]又は[2]に記載のペプチド又は組成物を投与するステップを含む方法。
[9] 対象がHLA-DR3である、上記[3]~[8]のいずれかに記載の使用又は方法。
[10] 対象がHLA-DR4である、上記[3]~[8]のいずれかに記載の使用又は方法。
[11] 組成物が用量漸増プロトコルに従って投与される、上記[3]~[10]のいずれかに記載の使用又は方法。
[12] 以下のTSHRペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)の全体若しくは一部、又はその一部、又は配列番号2と少なくとも60%の配列同一性を有する配列、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、同時、別々又は逐次投与のためのキット。
[13] グレーブス病の予防又は治療における同時、別々又は逐次投与のための、上記[12]に記載のキット。
[14] TSHR抗体の産生と関連する疾患の動物モデルであって、動物がヒトHLA-DR3のトランスジェニックであり、前記動物においてTSHRのレベルが対照動物と比べて増加している、動物モデル。
[15] TSHR抗体の産生と関連する疾患がグレーブス病である、上記[14]に記載の動物モデル。
[16] TSHRがヒトTSHRである、上記[14]又は[15]に記載の動物モデル。
[17] TSHRがヒトTSHR Aサブユニットである、上記[14]~[16]のいずれかに記載の動物モデル。
[18] ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、上記[14]~[17]のいずれかに記載の動物モデル。
[19] アデノウイルスが筋肉内注射により投与される、上記[18]に記載の動物モデル。
[20] 動物がマウスである、上記[18]又は[19]に記載の動物モデル。
[21] マウスがHLA-BRD1 * 0301トランスジェニックマウスである、上記[20]に記載の動物モデル。
本発明はここで実施例によりさらに説明されるが、この実施例は当業者が本発明を実施するのを支援するために役立つことを意味しており、本発明の範囲を限定することを決して意図していない。
ATX-GD-59はTSHR特異的T細胞寛容を誘導しHLA-DR3トランスジェニックマウスの動物モデルにおいて抗TSHR抗体力価を減少させる
材料、方法及び手順
マウス
DR3tgマウスは外部のCharles River、UK又はInnoSer、NLにおいて特定病原体不含条件下で飼育された。DR3tg系統はもともとStrauβらにより作り出された。簡単に説明すると、使用されたゲノム構築物は、pUC13中のHLA-DRAゲノムクローンの6kb NdeI断片及びDRB1*0301のB遺伝子を含むコスミド(pTCF)であるcos4.1の24kb ClaI×SalI断片であった。それぞれの構築物を1~2μg/mL含有する溶液を、C57Bl/6雄と交配した(C57Bl/6×DBA/2)F1ドナー由来の受精卵への同時注入のために使用した。子孫は、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)へと育種した。これらのDR3tgマウスはヒトMHCクラスIIであるHLA-DR3分子を発現するが、マウスMHCクラスII分子は発現しない。トランスジェニックマウスは、DRA cDNAの1.35kb Bam HI断片及びDRB1*0301 cDNAの1.25kb Bam HI断片でプローブされた、Eco RIで消化された尾部DNAのサザンブロット分析により特定された。このMHCクラスII分子がグレーブス病に対する増加した感受性と関連があることが示唆されてきたことから、DR3tgマウスはこれらの実験のために使用された。
ペプチドはPolyPeptide Laboratories(PPL;ストラスブール、フランス)により合成され、-20℃でPBS中8mg/mlのストック溶液にて保存された。製造工程は、ペプチドの構築において構成要素(building block)としてN-α-Fmoc保護アミノ酸を利用する固相ペプチド合成に基づいている。C末端残基はFmoc-lys(Boc)-MPPAリンカーの一部としてMBHA樹脂に結合される。その他のアミノ酸は、Fmoc脱保護及びアミノ酸カップリングサイクルの連続により組み込まれる。図面の説明はPPLペプチドがいつ使用されたかを示している。
DR3tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μg(最高用量/ペプチド)の可溶性ペプチド(5D-K1又は9B-N)を3回注射した(用量漸増スケジュール)。ATX-GD-59はペプチド5D-K1(配列番号1)と9B-N(配列番号2)の等モル混合物であり、言及されている最高用量(nmol)はカクテル中のペプチド当たりである。100μgのペプチド用量は約45nmolに相当するがそれは両システムが異なる実験において使用されたからである。ペプチドはPBS中皮下に投与された。最高用量/ペプチドの変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは、完全フロイントアジュバント(CFA;不完全フロイントアジュバント(Difco)中2mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco Laboratories、ミシガン、US))中に乳化させた親ペプチド(非改変5D及び/又は9B)に相当する50μgを用いて尾の基部に皮下的に免疫した(100μl CFA(100μg H37RA)中50μgペプチド/注射)。免疫の10日後、所属リンパ節(LN)(draining LN)及び脾臓を収穫した。LN細胞及び脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいて2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza、Verviers、ベルギー)を補充したX-vivo15培地で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、濃度範囲0~25μg/mLのTSHR-ECDと一緒に、又は12.5μg/mLの精製タンパク質誘導体(PPD;免疫対照;Statens serum institut、コペンハーゲン、デンマーク)と一緒に72時間培養した(200μL/ウェル)。5% CO2の37℃インキュベーター中で72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃及び5% CO2でインキュベートし、16時間後プレートを凍らせた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)で読み取って細胞増殖を評価した。
DR3tgマウスに、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ22.5pmol、225pmol及び2250pmolのATX-GD-59又は対照処置を側腹領域に皮下的に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に22.5nmolのATX-GD-59(最高用量/ペプチド)又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。
精製組換えTSHR-ECD(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)はELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温(RT)で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tween20で洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1% BSA(w/v)でブロックし、被験血清(1対50又は1対500希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体のを検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジン(TMB)を用いて発色させた。光学密度(OC)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)で測定した。
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞は、M. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された9。細胞は、2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン、50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%チャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地を取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(relative light units(RLU); 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。
単一ペプチド処置はTSHR特異的T細胞寛容を誘導する
単一ペプチド5D-K1及び9B-Nの免疫寛容原性効果を判定するため、HLA-DRトランスジェニックマウスを、先ずペプチドのうちの1つを単独で用いて用量漸増スケジュールに従って処置した。第1の実験では、DR3tgマウスは、方法のセクションに記載される通りに5D-K1又は対照処置を受けた。この改変されたアピトープを用いた前処置により、TSHR誘導T細胞増殖は、対照処置動物と比べた場合、脾臓試料で43%、LN試料で60%減少した(図1及び2参照)。
個々のペプチド5D-K1又は9B-Nを用いたペプチド処置がマウスにおいてTSHR特異的リンパ球増殖を減少させるという知見は、組合せ処置が、すなわちペプチドをカクテルとして投与することにより、TSHR特異的応答を同様に減少させることが可能かどうかを調べることにつながった。DR3tgマウスを用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-59で処置し、CFA中の両方の親非改変ペプチドを含む乳濁液で免疫した。3種のATX-GD-59最高用量(15、22.5及び45nmol/ペプチド)をその潜在的に異なる寛容化能(tolerizing capacity)について試験したが、処置用量間では差を観察することはできなかった(データは示していない)。代表的な結果は図3に示されており、ATX-GD-59処置が有意なレベルのTSHR特異的寛容を誘導することが示された。TSHR誘導増殖は、脾細胞及びLN細胞においてそれぞれ58%及び54%減少した。
ATX-GD-59の治療効果を実証するため、ATX-GD-59を用いたペプチド処置がTSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体の誘発などのグレーブス病パラメータの存在を抑制することができるかどうかを調べた。DR3tgマウスは用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-59又は対照処置を受け、続いてAd-LacZ又はAd-TSHRウイルス粒子を用いて2回免疫された。先ず、TSHR特異的脾細胞増殖に対するATX-GD-59処置の効果を調べた。Ad-LacZ免疫マウスの脾細胞はin vitro TSHR再刺激しても増殖しない(データは示していない)。対照処置Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるTSHR特異的脾細胞の絶対増殖値は低いが用量依存的に増加する。図4に示されているように、22.5nmol最高用量/ペプチドを用いたATX-GD-59処置ではTSHR特異的脾細胞増殖を40%超、顕著に減少させることができた。15nmolのそれぞれのペプチドを用いたATX-GD-59処置では類似の結果を示した(データは示していない)。繰り返し実験ではATX-GD-59処置の類似する寛容化効果が観察され(データは示していない)、それによってこれらの結果の再現性が確かめられた。
ATX-GD-459と臨床的に使用されているグレーブス病薬の共薬物療法
材料及び方法
マウス
DR3tgマウスは外部のCharles River、UKにおいて特定病原体不含条件下で飼育された。DR3tg系統はもともとStraussらにより作り出された(Straussら、1994、Immunogenetics 3、104~108ページ)。簡単に説明すると、使用されたゲノム構築物は、pUC13中のHLA-DRAゲノムクローンの6kb NdeI断片及びDRB1*0301のB遺伝子を含むコスミド(pTCF)であるcos4.1の24kb ClaI×SalI断片であった。それぞれの構築物を1~2μg/mL含有する溶液を、C57BL/6の雄と交配した(C57BL/6×DBA/2)F1ドナー由来の受精卵への同時注入のために使用した。子孫は、マウスMHCクラスII分子発現を欠くlA-ベータノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)に後に育種された。これらのDR3tgマウスはHLA-DRB1*0301分子を発現するが、マウスMHC-II分子を発現しない。マウスはC57BL/6へ及びB10.Qへ戻し交配することにより維持した。トランスジェニックマウスは、DRA cDNAの1.35kb BamHI断片及びDRB1*0301 cDNAの1.25kb BamHI断片でプローブされた、Eco RIで消化された尾部DNAのサザンブロット分析により特定された。このMHCクラスII分子が個体がグレーブス病を発症するリスクの増加と関連があることが示唆されてきたことから、DR3tgマウスはこれらの実験のために使用された。
単一ペプチドはすべてGL Biochem Ltd(上海、中国)により合成され、-80℃でDMSO(Sigma-Aldrich)中20mg/mlのストック溶液で保存された。ペプチドは、N末端遊離アミンとC末端アミドを用いて合成された。
DR3tgマウス(n=9~10/群)は、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ15pmol、150pmol及び1500pmolのATX-GD-459ペプチド又は対照ペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に15nmolのATX-GD-459ペプチド(最高用量)又は対照ペプチドを3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応して用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。最初のペプチド処置の日に開始して実験の終了まで、マウスはMMI又はプロプラノロールで処置された。MMI(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)は所望の濃度で減菌水に溶解され、ALZET浸透圧ポンプ(model 1004、0.11μL/時;Charles River、フランス)により皮下投与により1日量500μgをマウスに与えた。新しい浸透圧ポンプは4週間後に植え込まれた。塩酸プロプラノロール(Sigma-Aldrich)は0.9%生理食塩水に新たに溶解され、10mg/kg/日の用量で毎日腹腔内(IP)注射を介して投与された。0日目、マウスは、109又は1010Ad-TSHRウイルス粒子を用いた筋肉内注射により免疫され、免疫は3週間後に繰り返された。体重は毎週ベースで記録されてマウスの健康状態を測定した。マウスは最初の免疫の5週間後に安楽死させ血液、甲状腺及び脾臓試料を得た。TSHR誘導脾細胞増殖、サイトカイン分泌及び抗TSHR抗体レベルは下記の通りに評価された。
精製組換えTSHR-ECD(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)はELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温(RT)で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tween20で洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1% BSA(w/v)でブロックし、被験血清(1対50又は1対500希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体を検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジンを用いて発色させた。光学密度(OC)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)で測定した。
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞はM. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された6。細胞は、2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン、50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%のチャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー)を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地は取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(RLU; 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。
脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいて2mMのグルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(すべてLonza、Verviers、ベルギー)を補充したX-vivo15培地で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる濃度のTSHR-ECD(0~25μg/ml)と一緒に72時間培養した(200μL/ウェル)。5% CO2の37℃インキュベーターにおいて72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
アデノウイルスベースGDモデルにおけるMMIとATX-GD-459の共薬物療法
ATX-GD-459処置をMMIと組み合わせてGD症状を治療することができるかどうかを検証するため、MMI及びATX-GD-459の共薬物療法の効果を、アデノウイルスベースのGD動物モデルにおいて調べた(モデルのさらなる考察につては実施例4及び5参照)。この実験では、DR3tgマウスはMMIとATX-GD-459の以下の組合せ:ビヒクル+対照ペプチド、MMI+対照ペプチド、ビヒクル+ATX-GD-459又はMMI+ATX-GD-459を用いて処置した。ATX-GD-459又は対照ペプチドを用いた処置は、用量漸増スケジュールに従って実験の最初の2週間に投与された(図8)。皮下ビヒクル又はMMI処置は同時に開始したが実験の終了まで続いた。この実験デザインは、GD様疾患パラメータに対するMMIとATX-GD-459処置の互恵的影響を調べることを可能にした。
GD患者は多くの場合β遮断薬を使用して甲状腺機能亢進のアドレナリン性症状と戦っている。したがって、アデノウイルスベースGDモデルにおけるATX-GD-459とβ遮断薬プロプラノロールを用いた共薬物療法の効果をこの実験では調べた。先ず、TSHR特異的脾細胞増殖を調べた。図14に示されるように、プロプラノロールもATX-GD-459処置もTSHR特異的脾細胞増殖に対して有意な効果を誘導しなかった。プロプラノロールとATX-GD-459の併用処置も増殖応答に何の効果もなかった。
ATX-GD-459を用いたEx vivo T細胞寛容化
RNB-4K-GKK及びRNB-5D-K1ペプチドがアピトープであるかどうかを判定するためにRNB-4K及びRNB-5Dに特異的なハイブリドーマクローンを選択した。「抗原プロセシング独立提示(antigen processing independent presentation)」(APIPS)アッセイを実施し、RNB-4K-GKK及びRNB-5D-K1ペプチドがアピトープであることが確かめられた(図27)。
アデノウイルスベースのグレーブス病モデルの確立
ATX-GD-459ペプチド処置の治療効果を検証するため、アデノウイルスベースの動物モデルを先ず野生型BALB/cマウスにおいて確立した。TSHR誘導脾細胞増殖、抗TSHR IgG抗体、T4の血清レベル及び甲状腺組織の病理変化を疾患症状のパラメータとして調べた。第1の実験では、BALB/cマウスを108個のAd-TSHRウイルス粒子を用いて免疫した。このウイルス用量は、甲状腺機能亢進及び抗TSHR抗体産生を誘導すると記載された(Chenら、2004、Endocrinology 145(11):4927~4933ページ)が、2/10のマウスのみが(ボーダーライン)甲状腺機能亢進と考えられ、抗TSHR IgG抗体を産生したマウスはいなかった(データは示していない)。
アデノウイルス性グレーブス病モデルの検証
DR3tgアデノウイルス性グレーブス病モデルを検証するため、アデノウイルス性グレーブス病モデルにおける抗TSHR抗体産生に対する異なる免疫調節薬の効果を調べた。抗甲状腺薬メチマゾール(MMI)は、グレーブス病患者において甲状腺ホルモンレベルを直接減少させるために現在使用されている。したがって、Ad-TSHR免疫DR3tgマウスにおけるMMI処置の効果が判定された。マウスにおけるMMIの甲状腺機能亢進誘導効果を記載している文献(Jeongら、2012、Endocrinology 153:683~689ページ;Mozesら、1998、J. Clin Immunology 18(2):106~113ページ)に基づいて、2つの異なるMMI用量(50~500μg/マウス/日)を試験した。日用量500μgのMMIは最初の免疫後の2週間と4週間の両方でT4レベルを有意に減少させたが、一方で50μg用量はT4レベル減少傾向を示しただけであった(図24A)。Ad-TSHR免疫はこの実験(Ad-LacZ免疫マウスのデータは示していない)及び以前の実験において甲状腺機能亢進症を誘導しなかったが、MMI処置により誘導されるT4レベルの減少は、DR3tgマウスの甲状腺によるホルモン産生に影響を及ぼすことが可能であることを示している。
アデノウイルス性グレーブス病モデルにおけるATX-GD-459の治療効果の実証
RNB-4K-GKK、RNB-5D-K1及びRNB-9Bペプチドの組合せ(ATX-GD-459)が抗TSHR抗体の誘発を抑制することができるかどうかを判定するため、DR3tgマウスは用量漸増スケジュールに従ってATX-GD-459又は対照処置を受け、続いてAd-LacZ又はAd-TSHR免疫された。血清試料を採取してELISAにより抗THSR IgGレベルを測定した。ATX-GD-459ペプチド処置前(W-2、データは示していない)及び後(W0)に抗TSHR IgG抗体は存在しなかった(図25)。最初のAd-TSHR免疫後の2週間でPBS処置マウスにおいて高い抗TSHR IgGレベルが観察される。ATX-GD-459処置は、2週目及び5週目にAd-TSHR免疫の際に抗TSHR IgG抗体の増加をそれぞれ72%及び65%減少させた。これらの結果は、ATX-GD-459がこのアデノウイルス性グレーブス病モデルにおいて有効であることを示している。
マウス
マウスは実施例2に記載された通りであった。
抗原は実施例2に記載された通りであった。
抗原特異的T細胞ハイブリドーマを、固定又は非固定VAVY又はBM14細胞(= APC)により提示されるペプチドに対するその反応性について試験した。個々のクローン由来の5×104細胞を25μg/mlのペプチド及び5×104細胞の固定又は新鮮なAPCと一緒に培養した。APCを固定するため、細胞は室温(RT)で5分間0.5%のパラホルムアルデヒド(Merck、Darmstadt、ドイツ)(pH7)と一緒にインキュベートした。固定化反応は0.4Mのグリシン(Sigma-Aldrich)を添加し細胞をRPMI-10%FCS中で洗浄することにより停止させた。さらに、ヒトTSHR-ECDタンパク質(Chesapeake-PERL、Savage、Maryland、USA)に対する反応性を測定してエピトープを同定した。48時間後、抗原誘導IL-2産生をELISAにより測定した。
DR3tg又はDR4tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのペプチドを側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に33、75又は100μgのペプチド(最高用量に応じて、図面説明文参照)を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは、CFAに乳化させた50μgの抗原(非改変親15マーペプチド)(ペプチド/CFA)で尾の基部に皮下的に免疫した。免疫10日後、所属リンパ節(LN)及び脾臓を収穫した。LN細胞及び脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいてX-vivo15培地(2mMのL-グルタミン、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン;Lonza を補充した)で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる抗原濃度(0~25μg/ml)と一緒に、又は12.5μg/mlの精製タンパク質誘導体(PPD;プライミング対照;Statens serum institut、Copenhagen、デンマーク)と一緒に72時間培養した(200μl/ウェル)。72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
ヒトTSHR Aサブユニットを発現しているアデノウイルス(アミノ酸残基1~289;Ad-TSHR)及びβガラクトシダーゼを発現している対照アデノウイルス(Ad-LacZ)はViraquest (North Liberty、IA、USA)から購入した。6週齢の雌BALB/cJOlaHsdマウス(Harlan Laboratories、Venray、オランダ)又はDR3tgマウスにAd-TSHR又はAd-LacZ(109、1010又は1011個のウイルス粒子)を大腿筋の筋肉内に注射した。すべてのマウスは実験ごとに同じバッチのアデノウイルスを使用して同時に免疫した。マウスには3週間間隔(0週目、3週目及び6週目)で2又は3回注射し、最初の免疫の前及び2回目の免疫の1週間後に採血した。マウスは最初の免疫の4、5又は10週間後に安楽死させ、血液、脾細胞及び甲状腺を得た。脾細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいてX-vivo15培地(グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン;Lonza を補充した)で培養した。抗原誘導細胞増殖を調べるため、0.5×106細胞/ウェルを、異なる抗原濃度(0~25μg/ml)と一緒に72時間培養した(200μl/ウェル)。72時間後、60μLの細胞上清を集めて凍結した。次に、20μL/ウェルのトリチウム標識チミジン(PerkinElmer、Zaventem、ベルギー)を細胞に添加して最終濃度1μCi/ウェルを得た。細胞は37℃でインキュベートし、16時間後プレートを凍結させた。解凍したプレートを収集しβカウンター(Wallac 1450 Microbeta Trilux液体シンチレーションカウンター)を用いて読み取って細胞増殖を評価した。
精製TSHR-ECDタンパク質(Chesapeake-Perl)に対する抗TSHR抗体(IgGクラス)をELISAを使用して測定した。96ウェルプレート(ハーフエリア96ウェル、Fisher Scientific)を室温で一晩、PBS中50μl/ウェルのTSHR-ECDタンパク質(0.5μg/ml)を用いて被覆した。PBS-0.05% Tweenで洗浄後、ウェルは室温で1時間PBS中1%ウシ血清アルブミン(BSA)(w/v)でブロックし、被験血清(2つのアリコート、1対50希釈)と一緒にインキュベートした。マウス抗TSHR抗体(A9、Abcam、Cambridge、UK)は陽性対照として使用した。次に、抗体結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Abcam)を用いて検出した。IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG2cアイソタイプの抗TSHR抗体を検出するため、それぞれHRPコンジュゲートラット抗マウスIgG1(Southern Biotech、Alabama、USA)、ヤギ抗マウスIgG2a(Southern Biotech)、ヤギ抗マウスIgG2b(Abcam)及びヤギ抗マウスIgG2c(Abcam)抗体を使用した。シグナルはテトラメチルベンジジン(TMB)を用いて発色させた。光学密度(OD)は450nmでプレート読み取り装置(Tecan Benelux)において測定した。
Lulu*細胞、すなわち、pA3Luc、cAMP応答性ルシフェラーゼ構築物、及びpcDNA3-TSHR(ヒトTSHRをG418耐性と組み合わせた)を安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣-K1(CHO-K1)細胞はM. Ludgate教授(Cardiff University、UK)よりご好意により提供された。細胞は、2mMのL-グルタミン(Lonza)、50U/mLのペニシリン及び50U/mLのストレプトマイシン(Lonza)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Fisher Scientific、Aalst、ベルギー)及び0.2mg/mLのジェネティシン(Fisher)を補充されたHam's 12培地(Lonza、Verviers、ベルギー)において5% CO2中37℃で維持された。TSAbを測定するため、細胞は、96ウェルプレート中、10%のチャコール処理済み血清(Sigma-Aldrich、Bornem、ベルギー) を加えたHam's F12培地に2×104細胞/ウェルで播いた。次の日、培養培地を取り除き、細胞は5%のPEG及び10%の被験血清を含有する新鮮なHam's培地と一緒に37℃で4時間インキュベートした。次に、細胞はルシフェラーゼ細胞培養溶解緩衝液(Promega、Leiden、オランダ)で溶解させた。cAMP応答性ルシフェラーゼ産生はルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega)により製造業者の説明書に従って測定し、光放出はFLUOstarオメガルミノメーター(BMG labtech、Ortenberg、ドイツ)を用いて測定した。結果は相対発光量(RLU; 刺激を受けた細胞の光放出/刺激を受けていない細胞の光放出)として表されている。
総チロキシン(T4)はCBIマウス/ラットチロキシンELISAキット(Calbiotech、Spring Valley、CA、USA)を製造業者の説明書に従って使用して無希釈マウス血清(10μl)において測定した。T4値はキット中の標準から計算しμg/dlとして表した。血清T4測定に加えて、甲状腺組織像を甲状腺機能亢進についてのパラメータとして使用した。甲状腺は10%中性緩衝ホルマリン(pH7.5)に固定し、薄片に加工し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。薄片は病理変化(肥大化、上皮細胞の過形成及びリンパ球の浸潤)について観察し、スコア化した(KWS Biotest、Bristol、UK)。
DR3tgマウスは3週間間隔(0日目及び21日目)で2回、Ad-TSHRで筋肉内に免疫した。最初の免疫の日に開始して実験の終了まで、マウスはMMI又は6α-メチルプレドニゾロン21ヘミコハク酸ナトリウム塩(メチルプレドニゾロン)のいずれかで処置した。すべての化合物はALZET浸透圧ポンプ(model 1004、0.11μL/時;Charles River、フランス)により皮下に投与した。MMI(Sigma)は所望の濃度で減菌水に溶解し、マウスには日用量50又は500μgを与えた。メチルプレドニゾロン(Sigma)は減菌水に溶解し1mg/kg/日又は7mg/kg/日の用量でマウスに投与した。体重は毎週ベースで記録されてマウスの健康状態を測定した。マウスは最初の免疫の4週間後に安楽死させ血液及び脾臓試料を得た。TSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体レベルは上記の通りに評価された。
DR3tgマウスは、-15日目、-13日目及び-11日目にそれぞれ0.1μg、1μg及び10μgのATX-GD-459又は対照処置を側腹領域の皮下に注射し、続いて-8、-6及び-4日目に100μgのATX-GD-459(最高用量)又は対照処置を3回注射した(用量漸増スケジュール)。最高用量の変化、及びそれに対応した用量漸増用量の変化は実験ごとに示されている。0日目に、マウスは109個のAd-TSHR又はAd-LacZウイルス粒子を用いて筋肉内注射により免疫し、免疫は3週間後に繰り返された。最初の免疫の5週間後、血液及び脾臓を採取した。TSHR特異的脾細胞増殖及び抗TSHR抗体レベルは上記の通りに評価された。
Claims (13)
- 以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)を含むペプチド、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)を含むペプチド、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む組成物。 - 対象においてTSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための組成物であって、以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)を含むペプチド、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)を含むペプチド、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、組成物。 - 対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防するための組成物であって、以下の甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)ペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)を含むペプチド、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)を含むペプチド、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、組成物。 - 対象においてTSHR自己抗体の産生をin vivoで抑制する又は予防するための医薬の製造における、請求項1に記載の組成物の使用。
- 対象においてグレーブス病を治療する及び/又は予防するための医薬の製造における、請求項1に記載の組成物の使用。
- 対象がHLA-DR3を発現する、請求項2又は3に記載の組成物。
- 対象がHLA-DR4を発現する、請求項2又は3に記載の組成物。
- 組成物が用量漸増プロトコルに従って投与される、請求項2、3、6及び7のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象がHLA-DR3を発現する、請求項4又は5に記載の使用。
- 対象がHLA-DR4を発現する、請求項4又は5に記載の使用。
- 組成物が用量漸増プロトコルに従って投与される、請求項4、5、9及び10のいずれか一項に記載の使用。
- 以下のTSHRペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)を含むペプチド、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)を含むペプチド、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、同時、別々又は逐次投与のためのキット。 - グレーブス病の予防又は治療における同時、別々又は逐次投与のためのキットであって、以下のTSHRペプチド:
(i)アミノ酸配列KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK(配列番号1)を含むペプチド、及び
(ii)アミノ酸配列GLKMFPDLTKVYSTD(配列番号2)を含むペプチド、
並びに任意選択で抗甲状腺薬及び/又はβ遮断薬
を含む、キット。
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