EA024832B1 - Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина mbp, композиции и способ лечения рассеянного склероза - Google Patents

Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина mbp, композиции и способ лечения рассеянного склероза Download PDF

Info

Publication number
EA024832B1
EA024832B1 EA201290185A EA201290185A EA024832B1 EA 024832 B1 EA024832 B1 EA 024832B1 EA 201290185 A EA201290185 A EA 201290185A EA 201290185 A EA201290185 A EA 201290185A EA 024832 B1 EA024832 B1 EA 024832B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oligopeptide
mbp
multiple sclerosis
oligopeptides
amino acid
Prior art date
Application number
EA201290185A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290185A1 (ru
Inventor
Александр Габибович Габибов
Алексей Анатольевич БЕЛОГУРОВ
Наталья Александровна ПОНОМАРЕНКО
Original Assignee
ЛАЙФБИО ЛАБОРАТОРИС ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ЛАЙФБИО ЛАБОРАТОРИС ЭлЭлСи filed Critical ЛАЙФБИО ЛАБОРАТОРИС ЭлЭлСи
Publication of EA201290185A1 publication Critical patent/EA201290185A1/ru
Publication of EA024832B1 publication Critical patent/EA024832B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к лечению рассеянного склероза. Предложены олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина MBP (ESAMBPCAA), имеющий аминокислотную последовательность GGDRGAPKRGSGKDSHH (SEQ ID NO: 2), фармацевтические композиции и гибридные белки, содержащие указанный олигопептид, а также способ лечения или предотвращения рассеянного склероза у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции, содержащей олигопептид с последовательностью SEQ ID NO: 2.

Description

Изобретение относится к олигопептидам и гибридным белкам, а также к их применению для инактивации эпитоп-специфичных аутоантител к МВР (англ. Муе1ш Вайс Рго!ет, основной белок миелина) (Е8АМВРСАА), вовлеченных в связывание и каталитическое расщепление МВР в ходе прогрессирования рассеянного склероза. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные олигопептиды, комбинации указанных олигопептидов и гибридные белки, состоящие из вышеупомянутых олигопептидов, а также к их применению для лечения рассеянного склероза.
Уровень техники
Рассеянный склероз (далее сокращенно РС) представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы человека с неоднородными патофизиологическими и клиническими проявлениями и очень сложной этиологией (Найег е! а1., 2004. 1. СИи. 1пуе51. 113: 788-794; Котек е! а1., 2003. Вгат Кек. Ви11. 61: 321-326). Прогрессирование данного заболевания у людей приводит к разрушению миелиновой оболочки и, в конечном счете, влияет на способность нервов проводить электрические импульсы (8сЬ№агк, К. 8., 1993//Риибатеи!а1 1ттиио1оду, еб. Раи1, М. Е. (Кауеи, Νον Уогк), рр. 1033-1097).
Для объяснения возникновения такой патологии была предложена гипотеза вирусной мимикрии (Мегк1ег е! а1., 2006. 1. СЬи. 1иуек1. 116: 1254-1263). Однако истинные механизмы запуска развития заболевания до сих пор четко не определены (НоЬ11е1б е! а1., 2004.Ргос. Ыа11. Асаб. 8сЕ И8А 101 (8ирр1. 2): 14599-14606).
Было показано, что некоторые из пролиферирующих Т-клеток у пациентов с РС направлены против МВР (А11едге!!а и соавт., Наука, 247, 718-721, 1990), и что Т-клетки человека могут распознавать несколько эпитопов на молекуле МВР (КюЬей е! а1., 1. Ыештаттип 23, 55-66, 1989). Также оказалось, что МВР способен активировать некоторые Т-клетки без участия антигенпрезентирующих клеток (А1!тап е! а1., Еиг. 1. 1ттии. 17, 1635-1640, 1987).
Несмотря на убедительные и общепринятые доказательства участия иммунных Т-клеток в развитии и прогрессировании рассеянного склероза у людей и в экспериментальных моделях заболевания у животных вклад специфичного В-клеточного ответа в разрушение миелиновой оболочки изучен в гораздо меньшей степени (К1а\уйег е! а1., 2007. Сигг. №иго1. №иго5ск Кер. 7: 231-238.; ΝίΙΛίπ е! а1., 2007. 1и!. Кеу. №игоЪю1. 79: 13-42).
Целый ряд данных указывает на то, что значительная часть случаев РС характеризуется наличием в крови аутоантител, направленных против компонентов МВР (Кетб1 е! а1., 1999, Вгат, 122, 2047-2056; Оеиаш е! а1., 1999, ΝηΙ. Меб. 5, 170-175). Кроме того, микроскопический анализ с высоким разрешением выявил миелин-специфичные аутоантитела в областях бляшек демиелинизации при РС у человека, а также при РС-подобном заболевании у обезьян-игрунков, что позволяет предположить, что такие антитела вносят непосредственный вклад в разрушение миелина (Оеиаш е! а1., 1999, ΝηΙ. Меб. 5, 170-175). Хотя механизм участия аутоантител в патогенезе РС не известен, аутоантитела к МБР и гликопротеину миелина олигодендроцитов (англ. туейи ойдобеибгосу!е д1усорго!еш, МОО) были предложены в качестве биомаркеров для клинического прогнозирования РС (е! а1., 2003, Ν. Еид1. 1. Меб. 349, 139-145.10). Подобные иммуноглобулины были также обнаружены у мышей с индуцированным экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (ЭАЭ), представляющим собой модель рассеянного склероза у животных (Ρη!ζ е! а1., 1983, 1. 1ттиио1. 130, 191-194). Повышенный титр аутоантител к МВР был обнаружен в спинномозговой жидкости (ликворе) пациентов с активными формами рассеянного склероза (^Маггеи е! а1., Аии №иго1 209:20-25, 1986). Клинически РС характеризуется наличием фаз активности заболевания, таких как острые рецидивы или хроническое прогрессирование, и фаз клинической ремиссии. Активный РС связан с повышенным интратекальным уровнем аутоантител к МВР (Маггеи е! а1., Аии №иго1 209:20-25, 1986; Сак е! а1., Саи 1 №иго1 8с1 13:21-24, 1986). Такие антитела обнаруживаются преимущественно в свободной форме (Р) в ходе острых рецидивов и преимущественно в связанной (В) форме при прогрессировании заболевания без явных симптомов (Маггеи е! а1., Аии №иго1 209:20-25, 1986). Лечение пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом (РРРС) с помощью ритуксимаба моноклонального антитела, которое селективно воздействует и снижает уровень СЭ20+ В-лимфоцитов, по-видимому, является безопасным и эффективным до некоторой степени (8!ϋν О. е! а1., Ьоид-!егт В1утрЬосу!е бер1е!юи \νί11ι пШхппаЪ ш райеи!к \νί11ι геЦрктд-гетййид ти1бр1е кс1его515., АгсЬ №иго1. 2009 РеЬ; 66(2): 259-61).
В соответствии с данными существующими научными предпосылками в течение последнего десятилетия был разработан подход к лечению РС, основанный на иммуномодуляции с помощью целой молекулы МВР и многочисленных пептидов, представляющих собой фрагменты и гомологи белка МВР и их фрагменты. Как известно, МВР человека состоит из 170 аминокислотных остатков. В научной и патентной литературе фрагменты МВР обозначают в соответствии с положением их первого и последнего аминокислотного остатка, считая от С-конца полной последовательности МВР (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1).
В международной публикации МО 9612737 предложен ряд пептидов (фрагментов МВР человека), обладающих Т-клеточной активностью (т.е. способностью влиять на активность или функции иммун- 1 024832 ных Т-клеток или их субпопуляций), для предотвращения и лечения рассеянного склероза, которые охарактеризованы как пептиды, пригодные для терапевтического применения. Для выявления эпитопов в МВР, узнаваемых Т-клетками, 16 коротких (каждый длиной около 20 аминокислотных остатков) и три длинных (82-100, 83-105, 141-165) перекрывающихся друг с другом пептидных последовательности были протестированы на способность стимулировать ίη νίίτο пролиферацию клеток периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом. Аминокислотный состав пептидов, предложенных авторами упомянутого изобретения, соответствует следующим фрагментам МВР: 11-30, 11-29, 11-31, 83-105, 82105, 82-104, 80-98, 82-102, 80-104; 80-102; 111-130; 111-129; 141-165; 101-125. Кроме того, авторы упомянутого изобретения описывают комбинацию раскрытых в изобретении пептидов с другими пептидами, для которых из предшествующего уровня техники была известна Т-клеточная активность МВР: 1325; 31-50; 61-80; 82-92; 82-96; 82-97; 82-98; 82-100; 82-100; 83-100; 83-101; 84-97; 84-100; 85-100; 86-105; 87-99; 87-99 [91К>А]; 88-100; 88-99; 82-100; 111-135; 122-140; 139-170; 141-160; 142-166; 142-168; 146160;153-170.
Ακιίΐΐι Э.С. с соавторами предлагают способ выбора пептидов, вызывающих иммунологическую толерантность, способных связываться с молекулами МНС I или II класса без последующего процессинга антигена, и применение таких пептидов в фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рассеянного склероза. Авторами был синтезирован ряд пептидов, соответствующих фрагментам 1-24, 15-39, 30-54, 45-69, 60-84, 75-99, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159, 150-170, 131-145, 132-146, 133147, 134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153, 140-154, 141-155, 142-156, 143-157, 144-158 МВР человека, которые применялись авторами для идентификации эпитопов МВР человека, узнаваемых клетками периферической крови у пациентов с РС, а затем для изучения способности таких пептидов связываться с молекулами МНС I класса или II класса. Был выбран ряд коротких пептидов, активных в отношении модуляции функции иммунных Т-клеток и предложенных для лечения РС: 134-148, 135-149, 136-150, 137-151, 138-152, 139-153, 140-154, 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130144, 131-145, 132-146, 133-147 (см. заявки ЕР 1918298, И8 11/979224, АО 03/64464).
В И8 2005209156 для лечения рассеянного склероза предложен пептид, выбранный из фрагмента МВР (75-98), имеющий аминокислотную последовательность АСЛРУУНРРБМУТРЛТ. включающую замены, вставки или делеции.
В патенте США № 5858980 было установлено, что фрагменты МВР 84-102 и 143-168 содержат иммунодоминантные эпитопы МВР, узнаваемые Т-клетками, активные при развитии рассеянного склероза, и предложен пептид, содержащий аминокислотную последовательность ЕЫРУУНЕБКШУТРВТ (фрагмент МВР 83-98) и их аналоги и АОСТЕАКбЕКЕССВО (фрагмент МВР 146-160), а также фармацевтическая композиция, содержащая такие пептиды.
Ааггеп К.С. с соавторами предложены растворимые синтетические пептиды, подходящие для нейтрализации аутоантител к МВР, имеющие последовательность аминокислот, соответствующую следующим аминокислотным остаткам МВР человека: 61-75, 64-78, 69-83, 75-95, 69-83; 80-97, 91-106, 84-93, 8594, 86-95, 87-96, 82-98. Такие пептиды перекрываются с последовательностью МВР от аминокислотных остатков с 61 по 106 (см. АО 98/45327). Один из выбранных пептидов (а именно МВР 75-95) продемонстрировал способность связываться со свободными антителами к МВР как ίη νίίτο, так и ίη νίνο (в крови пациентов с РС). Напротив, не демонстрирующий связывания контрольный пептид 35-58 МВР не оказывал влияния на свободные и связанные антитела к МВР у пациентов с РС.
Некоторые пептиды на основе МВР и ДНК-вакцины были протестированы в клинических испытаниях: ДНК-вакцина ВНТ-3009 от ВауЫ11 ТЬетареибск, содержащая ген полноразмерного МВР, измененные пептидные лиганды ОР77116 и НБР-5788 от Ыеигосппе Вюкаепсек, композиция Му1ога1 для перорального применения, вызывающая иммунологическую толерантность, на основе полноразмерного МВР от Аи1о1ттипе(К). Однако при применении таких вариантов терапии какого-либо значительного успеха не наблюдалось из-за серьезных побочных эффектов или невозможности замедления прогрессирования РС (НоЫГе1б е! а1., Ргос Ыа! Асаб. 8с1 и 8 А. 2004, Ос1оЬет 5; 101 (8ирр1. 2): 14599-14606). В настоящее время вышеуказанный синтетический пептид, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 82-98 белка МВР (ОЕКРУУНЕЕКШУТРРТ) и обозначаемый как МВР8298 активно исследуется на II фазе клинических испытаний для лечения прогрессирующего рассеянного склероза. Пептид в дозе 500 мг вводили внутривенно каждые шесть месяцев. Было показано, что на лечение с помощью МВР8298 реагируют только пациенты, имеющие гаплотипы НЬА ΌΚ2 и/или ΌΚ4 (Ааггеп, К.О. е! а1, Еигореап 1оитпа1 оГ Iттиηο1οду, 2006, νο1. 13, Ыо 8, рр. 887-895).
Вышеупомянутый фрагмент МВР 84-102 (патент США № 5858980) применяли в качестве активного ингредиента для препарата для лечения вторично-прогрессирующего РС в I фазе клинических испытаний. Согласно измерению по Расширенной шкале оценки состояния инвалидности не было выявлено эффективности такого лечения в тесте с девятью отверстиями и стержнями (англ. №пе Но1е Ред Тек!), и были обнаружены новые повреждения, диагностированные с помощью магнитно-резонансной томографии (Оообкш, Ό. Е. е! а1. Ыеиго1оду 2000, νο1. 54, рр. 1414-1420).
Таким образом, поиск и отбор новых фрагментов МВР, олигопептидов, обладающих терапевтической активностью в отношении РС, представляет нетривиальную задачу, и лечебные свойства любого из
- 2 024832 таких олигопептидов в отношении лечения РС не могут быть предсказаны заранее специалистом в данной области техники даже на основании обширных доклинических испытаний ίη νίΐτο и/или ίη νίνο. Выявление и отбор таких новых эффективных пептидов могут быть осуществлены за счет открытия новых иммунопатологических механизмов, участвующих в развитии и прогрессировании рассеянного склероза.
Ранее нами были представлены доказательства того, что небольшая часть аутоантител к МВР, циркулирующих в крови пациентов с РС, демонстрирует сайт-специфическое протеолитическое расщепление молекулы МВР, что представляет собой новый иммунопатологический механизм разрушения миелина и прогрессирования РС (Ропотагепко е! а1. 1ттипо1о§у Ье11ег8 103, 2006, рр. 45-50).
Таким образом, задачей настоящего изобретения является нахождение новых олигопептидов, которые были бы способны нейтрализовать эпитоп-специфичные аутоантитела к МВР, вовлеченные в связывание и каталитическое расщепление МВР в ходе прогрессирования рассеянного склероза (Е8АМВРСАА-эпитоп-специфичные каталитические аутоантитела к МВР), а также обеспечение новых эффективных способов лечения РС с применением таких новых олигопептидов.
Указанная задача достигается путем обеспечения новых олигопептидных молекул (олигопептиды, гибридные белки, состоящие из таких олигопептидов, и фрагменты таких олигопептидов), фармацевтической композиции, содержащей указанные олигопептиды и гибридные белки, которые нейтрализуют Е8АМВРСАА. Неожиданным образом, несмотря на то, что Е8АМВРСАА представляет собой лишь незначительную долю циркулирующих аутоантител к МВР при РС, авторы настоящего изобретения обнаружили, что олигопептиды, имеющие последовательность, содержащую всего лишь 6 аминокислотных остатков из 8ЕС ГО N0: 2, которые нейтрализуют Е8АМВРСАА, демонстрируют неожиданно высокую эффективность при лечении рассеянного склероза.
Другие преимущества и аспекты настоящего изобретения станут очевидными после ознакомления с последующим подробным описанием изобретения.
Краткое описание изобретения
В одном варианте реализации, согласно настоящему изобретению предложен олигопептид (I), имеющий аминокислотную последовательность ССПКСАРККС8СКЭ§НН (8Е0 ГО N0: 2).
В другом варианте реализации, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество одного из следующих олигопептид I, имеющий аминокислотную последовательность ССЭВСАРΚΚ.Ο3ΟΚΌ3ΗΗ (8ЕС ΙΌ N0: 2);
В другом варианте реализации, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество олигопептида I, имеющего аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 2 и дополнительно содержащая по меньшей мере один олигопептид, выбранный из олигопептида II, имеющего последовательность 8ЕС ГО N0: 3, и олигопептида III, имеющего последовательность 8Е0 ГО N0: 4.
В другом варианте реализации, согласно настоящему изобретению предложен гибридный пептид, состоящий из олигопептида, имеющего последовательность 8ЕС ГО N0: 2, и одного или более олигопептидов 8ЕС ГО N0: 3 и 8Е0 ГО N0: 4 или их фрагментов, которые соединены последовательно друг с другом пептидным или непептидным линкером в любом порядке.
В другом варианте реализации изобретения предложен способ лечения рассеянного склероза, включающий введение эффективной дозы олигопептида или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
В другом варианте реализации предложено применение олигопептида или гибридного белка согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показана последовательность аминокислот интактной молекулы МВР человека. Печатными буквами показаны аминокислотные остатки МВР человека. Также представлены участки аминокислотной последовательности МВР, которые соответствуют аминокислотной последовательности олигопептида настоящего изобретения (8Е0 ГО N0: 2) и олигопептидов, имеющих аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 3 и 8Е0 ГО N0: 4 соответственно. Эти участки аминокислотной последовательности МВР обведены черной линией.
На фиг. 2 показано расщепление МВР в присутствии Е8АМВРСАА и ингибирование расщепления в присутствии различных пептидных фрагментов МВР (горизонтальный ряд чисел соответствует позиции первого и последнего аминокислотного остатка).
На фиг. 3 показано ингибирование активности Е8АМВРСАА различными синтетическими олигопептидами, содержащими аминокислотные последовательности фрагмента МВР 43-68. Горизонтальная ось - концентрация олигопептидов, используемых в анализе ингибирования; вертикальная ось - относительная активность Е8АМВРСАА (активность Е8АМВРСАА в контроле (ФСБ) принимали за 1). Обозначения олигопептидов указаны в примере 3.
На фиг. 4 показано подавление проявлений миелодиспластического синдрома (МДС) у крыс агути темных ЭЛ (Эатк ЛдоиО). имеющих экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), которых
- 3 024832 лечили с помощью олигопептидов согласно настоящему изобретению и гибридного белка. Подавление показателей МДС при протекании ЕАЕ у крыс ΌΆ на 24 день. Максимальный клинический результат в каждой группе крыс, среднее значение и доверительный интервал при доверительной вероятности 95%.
На фиг. 5 показано подавление проявлений МДС при протекании экспериментального РС (инфекция вирусом Тейлера) с помощью комбинаций олигопептидов.
Подробное описание изобретения Определения
Используемый в настоящей заявке термин олигопептид относится к любой молекуле, включающей вплоть до примерно 20 аминокислотных остатков, связанных пептидной связью (связями), то есть термин олигопептид обозначает полипептид длиной до 20 аминокислот. Термин олигопептид или олигопептиды охватывает олигопептиды, а также их соли. Подходящие соли включают соли натрия или калия или соли уксусной или фосфорной кислоты.
При использовании в настоящем описании термин олигопептид охватывает олигопептид, имеющих определенную последовательность аминокислот, и его функциональные варианты. Функциональные варианты включают любой фрагмент олигопептида определенной последовательности, при этом длина фрагмента составляет от 6 до 20 аминокислот при условии, что такой вариант сохраняет возможность связывания с ЕЗЛМВРСЛЛ.
Используемый в настоящем описании термин фрагмент олигопептида настоящего изобретения включает по меньшей мере примерно 6, предпочтительно по меньшей мере примерно 8, предпочтительно по меньшей мере примерно 12, более предпочтительно по меньшей мере примерно 14, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 16 или более последовательных аминокислотных остатков.
Кроме того, предусмотрены варианты олигопептидов настоящего изобретения, полученные путем изменения аминокислотной последовательности исходных олигопептидов. Такие изменения могут включать одну или более аминокислотных замен, делеций, вставок или добавлений, при том условии, что образующийся в результате вариант содержит по меньшей мере 6 последовательных аминокислот исходной последовательности и способен связываться с ЕЗЛМВРСЛЛ.
Используемый в настоящем описании термин гибридный белок относится к олигопептиду или его фрагменту, слитому с другим олигопептидом или его фрагментом, при этом каждая из таких частей, слитых в гибридной молекуле соединена с другой напрямую через пептидную связь (аминогруппа (ΝΗ2) из Ν-конца одного олигопептида, связанная с карбоксильной группой (СООН) С-конца другого олигопептида или его фрагмента) или посредством линкера. Линкер может быть выбран из пептидного линкера или непептидного линкера. Пептидный линкер может включать последовательность, содержащую примерно от 1 до 20 аминокислот, которые линейно связаны друг с другом пептидной связью и могут включать последовательность сайта расщепления протеазой. Термин непептидный линкер, используемый в настоящей заявке, относится к любой связывающей молекуле с двумя или более реакционноспособными группами, отличный от пептидного линкера. Предпочтительный линкер представляет собой непептидный полимер. Непептидный полимер, применяемый в качестве линкера в настоящем изобретении, представляет собой полимер, несущий реакционноспособные группы на обоих концах, которые способны независимо связываться с реакционноспособными группами олигопептида, при этом примеры реакционноспособной группы олигопептида включают концевую аминогруппу или концевую карбоксильную группу, остаток лизина, остаток гистидина или остаток цистеина. Реакционноспособные группы полимера включают альдегидную группу, группу пропионового альдегида, группу масляного альдегида, малеимидную группу, кетонную группу, винилсульфонную группу, тиоловую группу, гидразидную группу, карбонилдиимидазольную (КДИ) группу, нитрофенилкарбонатную (НФК) группу, тризилатную группу, изоцианатную группу и сукцинимидные производные. Примеры сукцинимидных производных включают сукцинимидил пропионат (СПК), сукцинимидил бутановую кислоту (СБК), сукцинимидил карбоксиметилат (СКМ), сукцинимидил сукцинамид (ССА), сукцинимидил сукцинат (СС), сукцинимидил карбонат и Ν-гидроксисукцинимид (Ν-ГС). Реакционноспособные группы на концах непептидного полимера могут быть одинаковыми или разными. Например, полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу на другом конце. Низкомолекулярные линкеры включают карбодиимид или глутаральдегид.
Используемый в данном описании термин ЕЗЛМВРСЛЛ относится к небольшой фракции аутологичных молекул иммуноглобулина, циркулирующих в крови пациента с РС, которые связываются с основным белком миелина (МВР) и катализируют сайт-специфическое протеолитическое расщепление молекулы МВР.
В настоящем описании термины лечить, лечение относятся к введению лекарственного средства, агента, соединения или композиции субъекту, страдающему заболеванием, для уменьшения, облегчения или устранения по меньшей мере одного симптома патологического состояния, подлежащего лечению по оценке лечащего врача или специалиста в данной области любым известным способом. В настоящем описании термин нейтрализация, инактивация, подавление обозначает снижение специфичной активности, измеренной с помощью подходящей тест-системы.
В настоящем описании эффективное количество представляет собой количество олигопептида,
- 4 024832 его фрагмента, или гибридного белка, описанных выше, которое при введении способно уменьшать, ослаблять или ликвидировать по меньшей мере один из симптомов рассеянного склероза. Кроме того, эффективное количество обозначает количество, способное уменьшить или предотвратить состояние рассеянного склероза.
На основании предыдущей работы авторов изобретения (Бе1одитоу а! а1., ТЬе 1оитпа1 оГ 1ттипо1оду, 2008, 180: 1258-1267) был обнаружен новый класс аутоантител, участвующих в распознавании и расщеплении основного белка миелина у пациентов с РС. Такие каталитически активные антитела представляют собой весьма незначительную долю антител к МВР, однако было установлено, что их каталитическая активность коррелирует с прогрессирующим состоянием РС. Таким образом, количественное определение протеолиза МВР, опосредованное аутоантителами к МВР, было предложено в качестве нового биомаркера РС. Несмотря на то, что ЕЗАМВРСАА представляет собой лишь незначительную долю циркулирующих аутоантител к МВР при РС, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые олигопептиды, обладающие сильной нейтрализующей активностью по отношению к ЕЗАМВРСАА, демонстрируют неожиданно высокую эффективность в лечении РС как у людей, так и в общепринятых моделях рассеянного склероза у животных. В соответствии с настоящим изобретением предложен олигопептид, имеющий аминокислотную последовательность ССЭРСАРКРСЗСКЭЗНН (ЗЕО ГО N0: 2). Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности 46-62 МВР человека и обозначена как МВР 46-62. Указанный олигопептид способен ингибировать ЕЗАМВРСАА.
Олигопептиды, имеющие последовательности ΟΡΟΥΟΟΚΑδΌΥΚδΑΗΚ (8ЕЦ ΙΌ N0: 3) и ОСТБ8К1РКЬССКП8К8С8РМАКК (ЗЕО ГО N0: 4) содержат хорошо известные в данной области эпитопы МВР, узнаваемые иммунными Т-клетками и/или обычными (не протеолитическими) аутоантителами к МВР пациентов с РС. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эти два олигопептида (ЗЕО ГО N0: 3 и §ЕЦ ГО N0: 4) синергически повышают эффективность олигопептида (ЗЕО ГО N0: 2) согласно настоящему изобретению в лечении рассеянного склероза у людей и в предотвращении (или уменьшении) развития принятой модели РС у животных - экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ). Несмотря на наличие низкой ингибирующей активности в отношении ЕЗАМВРСАА. по сравнению с олигопептидом (ЗЕО ГО N0: 2), эти два олигопептида усиливают терапевтический эффект олигопептида ССЭРСАРКРСЗСКЭЗНН при одновременном введении животным и у людям. Вне связи с какой-либо теорией, можно предположить, что это связано с тем, что одновременная модуляция нескольких иммунных механизмов - функции иммунных Т-клеток и гидролиза МВР, опосредованного аутоантителами, может обеспечить увеличение терапевтического эффекта. В соответствии с этим,предложена фармацевтическая композиция, содержащая олигопептид ЗЕО ГО N0: 2, его фрагменты или функциональные варианты и по меньшей мере один из двух олигопептидов последовательности ЗЕО ГО N0: 3 или 8БТ) ГО N0: 4.
В другом варианте реализации настоящего изобретения олигопептиды последовательности ЗЕО ГО N0: 2, их фрагменты или функциональные варианты соединены друг с другом с образованием гибридного пептида. Такой гибридный пептид состоит из нескольких копий фрагмента, инактивирующего Е8АМВРСАА.
В другом варианте реализации настоящего изобретения олигопептид (ЗЕО ГО N0: 2) или его фрагменты или функциональные аналоги и олигопептид (ЗЕО ГО N0: 3) или его фрагменты, и олигопептид (ЗЕО ГО N0: 4) или его фрагменты соединены друг с другом в любом порядке с образованием гибридного пептида. Таким образом, гибридный пептид согласно настоящему изобретению может содержать несколько повторяющихся копий инактивирующего ЕЗАМВРСАА фрагмента олигопептида (ЗЕО ГО N0: 2) и эпитопы олигопептидов (ЗЕО ГО N0: 3) и (ЗЕО ГО N0: 4).
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество олигопептида согласно настоящему изобретению (ЗЕО ГО N0: 2) или гибридного белка, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и/или систему доставки лекарственного средства. Примеры фармацевтически приемлемых носителей хорошо известны в данной области и включают, например, физиологический раствор. Примеры систем доставки лекарственного средства также хорошо известны в данной области и включают, например, липосомы или синтетические полимерные наночастицы. Олигопептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с существующими способами синтеза олигопептидов, имеющих формулу в соответствии с настоящим описанием. Гибридные белки могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Зная последовательность выбранных гибридных белков, как описано в настоящем изобретении, соответствующие последовательности ДНК могут быть получены в соответствии со стандартными известными способами синтеза ДНК. Последовательности ДНК, полученные таким образом, могут быть клонированы в соответствующих векторах для клонирования, и их можно применять для трансформации подходящей клетки-хозяина с получением рекомбинантного пептида. Все методики, упомянутые выше, являются стандартными и хорошо известными специалистам в данной области.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рассеянного склероза, включающий введение эффективной дозы олигопептида или гибридного пептида или содержащей их фармацевтической композиции нуждающемуся в этом субъекту. Терапевтическая доза олигопептидов
- 5 024832 или гибридного белка для лечения рассеянного склероза может составлять от примерно 0,01 мг на килограмм массы тела до примерно 10,0 мг на килограмм массы тела, при этом композицию можно вводить внутривенно, подкожно, интратекально. В одном из примеров реализации настоящего изобретения соединение вводят перорально, для направленного воздействия на так называемый путь доставки через слизитую оболочку. Композицию можно вводить в виде единой или последовательных доз, по необходимости.
Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно описано с особым акцентом на предпочтительные варианты его реализации, следующие примеры лишь иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.
Примеры
Пример I. Обнаружение ЕБАМВРСАА-аутологичных молекул иммуноглобулина, которые связываются с основным белком миелина и катализируют сайт-специфическое протеолитическое расщепление молекулы МВР в крови пациентов с рассеянным склерозом
Очистку и определение характеристик аутоантител к МВР проводили с помощью сыворотки крови 24 пациентов с рассеянным склерозом (в возрасте 17-54 лет, средний возраст 32 года), которым не оказывали лечение стероидами или нестероидными противовоспалительными препаратами. Диагноз РС проверяли и подтверждали, и рассчитывали баллы по Расширенной шкале оценки состояния инвалидности (англ. ЕЭББ. Ехрапйей О^аЬИПу Б1а1и8 Бса1е) в соответствии с классификацией прогрессирования заболевания по Позеру, с использованием клинических, иммунологических данных и данных МРТ (Рокег е! а1., СОп №ига1 Иеигокигд 2001; 103:1-11). Иммуноглобулины (1дО) были выделены из сыворотки путем трехкратного 50% осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок О-Сефарозе (АтегкЬат Вюкшепсек). 1дО-содержащие фракции затем подвергали диализу против ФСБ или ТСБ с 0,05% КаИ3 при 4°С. Проводили количественное определение 1дО и стандартизацию с помощью ИФА. Степень чистоты 1дО оценивали с помощью электрофореза с последующим окрашиванием серебром, иммуноблоттингом при невосстанавливающих условиях и масс-спектрометрии с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (БЕЬИ1). 1дО дополнительно разделяли путем антигенаффинной хроматографии на колонке с МВР, иммобилизованным на ИНБ-сефарозе (АтегкЬат), и степень их чистоты оценивали с помощью электрофореза с последующим окрашиванием серебром.
МВР получали из мозга быка согласно методике Миллера (МШег е! а1., 1996. ЕхрептепЫ аШоиптипе епсерМотуеййк ίη 1Пе тои8е.//Сиггеп1 РгоЮсок ίη 1ттипо1оду; 1. Е. Сойдап, ей. ХУПеу, Ие\у Уогк, р. Б19). Образующийся в результате белок очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке С4 10/250 (МакЬегу-Иадеб Оегтапу).
Гидролиз МВР с помощью аутоантител к МВР оценивали следующим образом: очищенные антитела (0,1-1 мкг) инкубировали при 37° С в течение 14 ч в конечном объеме 12,5 мкл ФСБ, 0,02% КаИ3, содержащем 1-2 мкг МВР. Образцы смешивали с буфером Ьаеттй. Степень расщепления МВР определяли с помощью ДСН-ПААГ в трис-глициновой и трициновой буферной системе. Для количественного определения расщепления МВР (10 мкМ) инкубировали при 37°С с антителами (60 нМ) в 0,1 мл ФСБ, 0,02% ИаИ3 в течение 12 ч. Реакцию останавливали добавлением 10% ТФУ до рН 2,5. Образцы далее разделяли с помощью хроматографии на колонке С4 4.0/150 (^а1егк). Количество нерасщепленного МВР рассчитывали на основании поглощения при 280 нм. Результаты представлены в табл. 1.
- 6 024832
Таблица 1. Клинический статус 24 пациентов с рассеянным склерозом и соответствующие скорости гидролиза МВР под действием Е8АМВРСАА
N пациента Тип заболевания Активность Е5АМВРСАА (пмоль/мин/нмоль) Баллы по ЕО55
М31 ВП 77,6+7,1 5,0
М32 ВП 84.3+6,9 4.5
М53 ВП 63,0+5,8 6,0
М54 ВР 45,6+6,0 2,0
М55 ВР 5,9+4,8 1,0
М36 ВР 2,1+4,5 1,0
М87 ВР 5,3+5,0 2,0
М3 8 ВР 3,0+3,9 1,5
М39 ВП 71,2+5.5 3,0
М310 ВП 4,5+4,1 2,5
М311 ВР 1,5+6,0 0
М812 ВП 79,0+8,9 4,0
М313 ВР 2.0+4,0 0
М314 пп 44,9+5,0 3,0
М315 пп 22,3+4,5 3,0
М316 ВР 29,3+5,3 2,5
М317 ВР 15,1+4.1 3,0
М318 ВР 4,3+3,9 1,5
М319 ВР 6,5+4,0 2,0
М520 ВП 15,0+5,9 3,0
М321 ВП 1,3+3,7 2,0
М322 ВР 39,2+7,2 3,0
М323 ВП 29,1+6,2 3,0
М524 ВР 4.3+3,5 1,5
ВП - вторично-прогрессирующий,
ПП - первично-прогрессирующий,
ВР-возвратно-ремиттирующий.
Необходимо отметить, что уровень Е8АМВРСАА-опосредованного расщепления МВР коррелирует с состоянием пациента по Расширенной шкале оценки состояния инвалидности (ЕЭ88) (г2 = 0,85, Р < 0,001 согласно ранговой корреляции Спирмена).
Наиболее высокий уровень антитело-посредованного катализа происходит в случаях с высоким баллом ЕЭ88 (от 3,0 до 6,0), в основном на стадии прогрессирования заболевания или обострения при возвратно-ремиттирующем (ВР) течении заболевания.
Пример 2. Скрининг Е8АМВРСАА-ингибирующих последовательностей
Двенадцать фрагментов ДНК, кодирующих пептиды МВР, человека, представляющие различные участки молекулы МВР (1-27, 17-41, 25-54, 43-68, 53-81, 81-103, 91-114, 107-132, 123-140, 130-156, 146170), были получены с помощью ПНР с четырьмя перекрываниями, соответствующими линкеру (80000)38. Конечные продукты ПНР клонировали в рамке в плазмиде рЕТ32СН при сайтах рестрикции Νοοί и ВатН1. Продукты экспрессии таких плазмид, включающие МВР пептиды, слитые с Тгх, применяли для анализа расщепления. В качестве контроля использовали плазмиду, кодирующую Тгх (тиоредоксин) вместе с линкером (800 00)38. Растворимый рекомбинантный Ηίδ-меченный белок получали в результате экспрессии в ЕхсНепсЫа сой и выделяли путем сорбции на колонке Та1оп 8иретР1о№ (ВО Είοδοίспсс5) с последующей катионообменной хроматографией на колонке Мопо 8 со1итп (Атешйат Рйаттас1а) при рН 5,0 и последующей эксклюзионной хроматографией на колонке 8ирегйех 75 0Ь 10_300 (Лтешйат Рйагтааа) в 150 мМ буфере ΝΗ.·Ηί'.’ϋ3,.
Характер гидролиза МВР под действием Е8АМВРСАА, выделенного из плазмы мышей 81Й с ЭАЭ, индуцированным введением МВР в полном адъюванте Фрейнда, оценивали с помощью ДСН-ПААГ, как указано в примере 1, в присутствии 0,5 мкМ различных пептидов МВР. Результаты представлены на фиг. 2. Фрагмент МВР 43-68, содержащий последовательность 000В0АРКР080К08НН. демонстрирует
- 7 024832 сильную ингибирующую активность по отношению к гидролизу МВР, индуцированному аутоантителами к МВР.
Пример 3. Подавление гидролиза, обусловленного МВР-специфичными аутоантителами, с помощью синтетических олигопептидов, содержащих аминокислотные последовательности фрагмента МВР 43-68
Для определения последовательности аминокислот, необходимых для эффективного ингибирования активности ЕЗАМВРСЛЛ, был синтезирован следующий ряд пептидов:
Таблица 2
Аминокислотная последовательность Число аминокислотных остатков Положение в последовательности МВР
А1 ΚΡΡΟΟϋΚΟΑΡΚΚΟδΟΚϋδΗΗΡΑΚΤΑΗ 26 43-68
А2 РОСЮКОАРКЕОЗОКОЗННРАК 21 45-65
АЗ ООЭКОАРККО5ОКО5НН 17 46-62
А4 ОАРКК.О5ОКО5НН 13 50-62
А5 ООЭКСАРККО5 11 46-56
А6 ΡΚΕΟδΟΚϋδΗΗ 11 52-62
А7 ООЭКОАРКК 9 46-54
А8 ΡΟδΟΚϋδΗΗ 9 54-62
А9 ССЭКСАР 7 46-52
А10 δΟΚϋδΗΗ 7 56-62
А11 ООЭКО 5 46-50
А12 κοδΗΗ 5 58-62
Была исследована эффективность олигопептидов в подавлении ЕЗАМВРСЛЛ-опосредованного гидролиза МВР с использованием Е8АМВРСЛЛ, собранного от пациентов с прогрессирующем РС, как указано в примере 1. Различные концентрации тестируемых пептидов смешивали с антителом (30 нМ) вместе с МВР (4 мкМ) в ТБС с 0,1% ΝαΝ3 и 10 мМ СаС12. Образцы инкубировали в течение 16 ч при температуре 37°С и анализировали в 15% ДСН-ПААГ. Гели окрашивали с помощью реактива Кумасси и анализировали денситометрически с использованием программного обеспечения ТОТЛЕЕЛВ 2,01 (ΝοηПпсаг Нупаш1С8, И6.. №\\еа511е ироп Тупе, и.К). Данные представлены на фиг. 3, показывают, что среди анализируемых олигопептидов олигопептид Л3, содержащий аминокислотную последовательность ΟΟ^Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ^§ΗΗ, демонстрирует наиболее эффективную ингибирующую активность, при этом включая меньшее количество аминокислотных остатков, чем олигопептиды А1 и А2. Укорочение длины олигопептида до менее 6 аминокислот приводит к полному отсутствию ЕБЛМВРСЛЛ-ингибирующей активности.
Пример 4. Подавление гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами, с помощью синтетических олигопептидов, содержащих аминокислотную последовательность ССОРСЛРΚΚΟδΟΚΌδΗΗ, их фрагментов и гибридных белков.
Образцы сыворотки от 5 пациентов, страдающих прогрессирующим РС, количественно оценивали с помощью Е§АМВРСЛЛ-опосредованного гидролиза МВР, как указано в примере 1, в присутствии следующих веществ: А1-отрицательный контроль: фосфатный буферный раствор (РВ§); А2-глатирамер ацетат (Сорахопе, Теуа РЬагтасеиИсаП), 100 нМ; А3-олигопептид ΟΟ^Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ^§ΗΗ, 100 нМ; А4олигопептидов ЛОККО^СКНЕМ (фрагмент олигопептида ΟΟ^Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ^§ΗΗ 100 нМ; А5олигопептид δΟΚΌδ (фрагмент олигопептида ΟΟ^Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ^§ΗΗ) -100 нм; А6-гибридный белок ΚΟАРΚΚΟδΟΚΚΟАРΚΚΟδΟΚΚΟАРΚΚΟδΟΚΚΟАРΚΚΟδΟΚΚΟАРΚΚΟδΟΚΚΟАРΚΚΟ 8ОК (содержащий повторяющуюся последовательность Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ, представляющую собой последовательность фрагмента олигопептида ΟΟ^Κ.ΟАРΚΚ.ΟδΟΚ^§ΗΗ) 100 нМм.
Продукты Л3, А4 и А5 были синтезировали с помощью лабораторного твердофазного органического синтеза (Институт биоорганической химии, им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Продукт А6 синтезировали с помощью бесклеточной системы трансляции АВNОVЛ (\у\у\у.аЬпоуа.1\у).
Результаты анализа представлены в табл. 3 ниже.
- 8 024832
Таблица 3. Влияние различных тестируемых препаратов на гидролиз, опосредованный МВРспецифичными аутоантителами (пмоль/мин/нмоль)
Пациент 1 Пациент 2 Пациент 3 Пациент 4 Пациент 5
Α1 (РВ5) 77,6 ±7,1 84,3 ± 6,9 63.0 ±5,8 45.616,0 79.018.9
А2 62,517,2 72,617,7 51,213,5 47,717,9 65,715,4
АЗ 11,213,5 17,314,1 14,412,2 14.514.4 16.917.3
А4 12,713,6 15,612,9 14,314,4 15.814.9 13.315.9
А5 5714,1 59,715,7 44,216,6 45,513,8 55,716,1
А6 7,7+3,3 22,314,2 20,113,9 21,516,6 5,011,8
Таким образом, все олигопептиды: олигопептид ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ, олигопептид ΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8Η (фрагмент олигопептида ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ длиной 11 аминокислот и гибридный белок, содержащий повторяющуюся последовательность ΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚ, представляющую собой последовательность фрагмента олигопептида ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ - обладают сильным подавляющим действием на гидролиз, опосредованный МВР-специфическими аутоантителами.
Пример 5. Лечение ЭАЭ с помощью олигопептидов и гибридных белков согласно настоящему изобретению
Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) у крыс ΌΑ представляет собой хорошо известную модель рассеянного склероза у животных. Работа с экспериментальными животными была проведена в филиале Института биоорганической химии, им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук в Пущино. Самкам крыс ΌΑ 10-14 недель проводили анестезию и вводили внутрикожно у основания хвоста 100 мл инокулум, содержащий 50 мг МОО крысы в солевом растворе, эмульгированном (1:1) Κί'Ά (81дта Сйеш1са1 Со., 81. Ьошк, МО), содержащий 200 мг МусоЬас1егшт 1иЬегси1о515 (штамм Η 37 ΡΑ; ИНео БаЬогаЮпек. Ое1го11.М1). На 8-й день после второй иммунизации крыс разделяли на 6 групп (по 6 крыс в группе) и проводили лечение в течение 5 дней (дни 8-12) в соответствии со следующей схемой:
Группа 1 - олигопептид ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ по 120 мкг ежедневно путем интраназального введения
Группа 1 - олигопептид ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ по 50 мкг ежедневно путем интраназального введения
Группа 3 - гибридный белок
ΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΡΟΑΡΚΡΟ 8ΟΚ по 120 мкг ежедневно путем интраназального введения
Группа 4 - олигопептид ΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8Η по 120 мкг ежедневно путем интраназального введения
Группа 5 - глатирамер ацетат (Сорахопе, Теуа) по 120 мкг ежедневно путем интраназального введения
Группа 6 - контроль (ФСБ)
Клинические симптомы заболевания (проявления МДС) оценивали ежедневно по следующей шкале оценки: степень 0 - нет клинических проявлений, степень 1 - легкое проявление ковыляющей походки или вялого хвоста, степень 2 - тяжелое проявление ковыляющей походки, степень 3 - умеренный парез задних конечностей и степень 4 - тяжелый парез задних конечностей. В образцах сыворотки, взятых от животных, оценивали количественно Ε8ΑМΒΡСΑΑ-опосредованный гидролиз ΜΒΡ, как указано в примере 1.
Результаты представлены на фиг. 4 и в табл. 4 ниже.
Таблица 4. Влияние лечения на скорость гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами (среднее значение для 6 животных, пмоль/мин/нмоль)
Экспериментальная группа День 8 День 16 День 24
Группа 1 42,8+5,5 17,3+5,4 15,1+3,9
Группа 2 43,1+6.4 35,6+4.9 46,3+2.9
Группа 3 45,7+6,5 48,1+7,4 39,4+4,6
Группа 4 49,3+4.9 45,9+7.1 45,1+6.3
Группа 5 51,4+8,2 55,4+5,7 62,2+5,7
Группа 6 47,6+6,1 61,3+7,35 75,2+8,3
Таким образом, гидролиз, опосредованный МВР-специфичными аутоантителами и проявления МДС, наиболее эффективно подавляется олигопептидом ΟΟΌΡΟΑΡΚΡΟ8ΟΚΌ8ΗΗ дозозависимым образом.
- 9 024832
Гибридный белок
Κ.ΟΑΡΚΚ.ΟδΟΚΚ.ΟΑΡΚΚ.ΟδΟΚΚ.ΟΑΡΚΚ.ΟδΟΚΚ.ΟΑΡΚΚ.ΟδΟΚΚ.ΟΑΡΚΚ.ΟδΟΚΚ.ΟΑΡΚΚ.0 δΟΚ и олигопептид ΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗ также активны в отношении подавления гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами и проявлений МДС.
Пример 6. Лечение экспериментального ΡΟ (инфицирование вирусом Тейлера) с помощью олигопептидов и их комбинаций олигопептидов согласно настоящему изобретению
Штамм ВсЛп мышиного вируса энцефаломиелита Тейлера (ТМЕУ), используемый в данном исследовании, получали и размножали в клетках ВНК-21, выращенных в среде Дульбекко, модифицированной Иглом, с добавлением 7,5% донорской телячьей сыворотки. Для в.ч. инфекции в правое полушарие головного мозга вводили 30 мкл вирусного раствора (от 0,2 х 106 до 6 х 106 БОЕ) 6-8-недельным мышам δΙΌ (8 животных в каждой группе) под наркозом с изофлураном. Клинические симптомы (проявления МДС) заболевания оценивали еженедельно по следующей шкале оценки: степень 0 - нет клинических проявлений, степень 1 - легкое проявление ковыляющей походки или вялого хвоста, степень 2 - тяжелое проявление ковыляющей походки, степень 3 - умеренный парез задних конечностей и степень 4 - тяжелый парез задних конечностей. В образцах сыворотки, взятых у животных, проводили количественную оценку ЕδΑМΒΡСΑЛ-опосредованного гидролиза МВР, как указано в примере 1.
Как известно, олигопептиды ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ (δΙΓ) ΙΌ N0: 3) и ΟΟΤΙ.δΚΙΙΊΚ.ΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ (δΕΟ ΙΌ N0: 4) способны модулировать иммунную активность Т-клеток при ΡΟ, что обуславливает их эффективность в лечении ΡΟ.
На день 14 после инфицирования мышей разделяли на 6 групп (30 мышей в каждой группе) и подвергали их лечению в течение 10 дней (14-24 дней) по следующей схеме:
Группа 1 - контроль - ФСБ ежедневно путем подкожной инъекции
Группа 2 - Копаксон ежедневно по 30 мкг ежедневно путем подкожной инъекции
Группа 3 - олигопептид ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Группа 4 - олигопептид ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Группа 5 - олигопептид ΟΟΤΕδΚΙΡΚΕΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Группа 6 - олигопептид ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ на 20 мкг и олигопептид ΟΡΟΥΟΟΚΑδΌΥΚδΑΗΚ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Группа 7 - олигопептид ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ по 20 мкг, олигопептид ΟΡΟΥΟΟΚΑδΌΥΚδΑΗΚ по 20 мкг и олигопептид ΟΟΤΕδΚΙΡΚΕΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Группа 8 - олигопептид ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ по 20 мкг и олигопептид ΟΟΤΡδΚΙΙΚΡΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ по 20 мкг в день путем подкожной инъекции
Результаты представлены на фиг. 5 и в табл. 5 ниже.
Таблица 5. Влияние проводимого лечения на проявления болезни и степень гидролиза ΜΒΡ, опосредованного аутоантителами
Группа % животных, пораженных заболеванием на 100 день Активность Е8АМВРСАА на день 100 (пмоль/мин/нмоль)
Группа 1 27 (30) 45.7+6,7
Группа 2 25(30) 39,8+4,1
Группа 3 19(30) 11,4+3,5
Группа 4 25(30) 40+3,1
Группа 5 27(30) 35,3+5,1
Группа 6 15(30) 16.5+3,2
Группа 7 17(30) 14,1+2,9
Группа 8 25(30) 37,7+4,9
Таким образом, гидролиз, опосредованный МВР-специфичными аутоантителами, и проявления МДС наиболее эффективно подавляются олигопептидом ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ в отдельности или в комбинации с олигопептидом ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ и/или олигопептидом ΟΟΤΕδΚΙΡΚΕΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ.
Олигопептиды ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ и олигопептид ΟΟΤΕδΚΙΡΚΕΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ в отдельности или в комбинации обладают умеренным терапевтическим эффектом и не оказывает влияние на гидролиз, опосредованный МВР-специфичными аутоантителами. Комбинация ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ с ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ и ΟΟΤΕδΚΙΡΚΕΟΟΚΌδΚδΟδΡΜΑΚΚ обладает слабым благоприятным терапевтическим эффектом. Важно отметить, что пептид ΟΟΌΚΟΑΡΚΚΟδΟΚΌδΗΗ и его комбинация с олигопептидом ΟΡΟΥΟΟΚЛδ^ΥΚδΑΗΚ и/или олигопептидом ΟΟΤΡδΚΙΙΚΡΟ- 10 024832
ΟΚΌδΚδΟδΡΜΆΚΚ также обладает предупреждающей развитие заболевания (профилактической) активностью.
Пример 7.
Подавление гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами, и лечение РС путем введение в кровь пациента гибридных белков согласно настоящему изобретению:
Три гибридных белка, имеющих следующие формулы, были синтезированы с применением бесклеточной системы трансляции ΑΒΝΟνΑ (\у\у\у.аЬпоуа.1\у):
1)
КОАРККО8ОККОАРККО8ОККОАРККО8ОККОАРККО8ОККОАРККО8ОККОАРККО8ОК
2)
САРККС8ОК¥СОКА8ПУК8ОТЬ8К1РКЬСОКП8ККСАРККС8ОК¥СОКА8ПУК8ОТЬ8К1РКЬСОКП8К.
3) ООПКОАРККО8ОКП8ННОРО¥ООКА8П¥К8АНКрОТР8К1РКРООРП8К8О8РМАКК
Таким образом, эти гибридные белки включают последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4, соединенные в различном порядке.
Все три олигопептида присоединяли к СКВг-активированным сефарозным гранулам (РЬагтас1а) по 0,1 мг каждого олигопептида на 1 мл гранул в асептических условиях. После это сефарозу с присоединенными олигопептидами тщательно промывали забуференным 0,01 М Трис раствором 1,14 М №С1, рН 8,0, содержащим 10 мМ ЭДТА, для удаления нековалентно связанных веществ и упаковывали в 400 мл колонки.
В случае аутоантител Е8АМВРСАА аферез проводили в Санкт-Петербургской Медицинской академии на кафедре неврологии. Авторами изобретения был проведен аферез Е8АМВРСАА у 18-летнего пациента с быстро прогрессирующей тяжелой формой вторичного прогрессирующего РС, признанного устойчивым к традиционной терапии (кортикостероиды и иммунодепрессанты). Пациент прошел 5 циклов афереза, по одному циклу в неделю. Плазму пациента отделяли с помощью сепаратора плазмы с непрерывным потоком, СоЬе 8рсс1га. США. Ток крови варьировал от 50 до 70 мл/мин. Также добавляли гепарин в виде первоначального болюса 5000 ед., далее на первом этапе 50 ед./мин с помощью насоса. Затем плазму промывали через сефарозную колонку и оставшуюся часть крови возвращали пациенту. Поток плазмы через сефарозную колонку контролировали с помощью автоматизированного устройства для адсорбции-десорбции АЭА-Мебюар. После прохождения через колонку плазму возвращали пациенту. В каждом цикле обрабатывали 3000 мл плазмы. Показатель по шкале ЕЭ88 снизился со значения 6 до первого афереза до 5,5 через две недели после последнего цикла. Контрольный анализ путем МРТ, проведенный через один месяц после последнего цикла, показал стабилизацию предыдущих поражений при сокращении двух поражений. Новых очагов не было обнаружено. Степень гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами, определяли, как указано в примере 1, до и через две недели после последнего цикла афереза. Данные представлены в табл. 6 ниже.
Таблица 6. Подавление гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами, после проведения лечения
Параметр Перед терапией 2 недели после последнего цикла
Е5АМВРСАА 87 пмоль/мин/нмоль 15 пмоль/мин/нмоль
1еО 410 мг/дл 395 мг/дл
1§А 53 мг/дл 57 мг/дл
1§М 24 мг/дл 22 мг/дл
Показатель по шкале ПП53 6 5,5
Таким образом, воздействие на кровь пациента с РС гибридных белков согласно настоящему изобретению подавляет активность Е8АМВРСАА и обеспечивает эффективное лечение РС.
Кроме того, были получены некоторые другие гибридные белки, содержащие 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4, соединенные в другом порядке (с помощью пептидных и непептидных линкеров), и успешно протестированы на способность подавлять активность Е8АМВРСАА и способность облегчать симптомы РС и снижать биомаркер РС.
Пример 7. Фармацевтическая композиция, содержащая фрагменты олигопептида
Три олигопептида, имеющие следующие формулы: ОСПКСАРККО8СКП8НН, СЕС¥ССРА8П¥К8АНК и 0ОТР8К1РКРООКП8К.8О8РМАКК, были синтезированы в лаборатории твердофазного органического синтеза (Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН), фосфолипиды были приобретены в 81дта-А1бг1сй и Ауаий Ро1аг Ρίρίάδ. 50 г смеси яичного фосфатидилхолина (ФХ), диолеоил-фосфатидилхолина (ДОФХ) и 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропана (ДОТАП) (в молярном соотношении 4:2:1) растворяли в хлороформе, затем хлороформ удаляли путем испарения. Олигопептиды 1, 2 и 3 растворяли в фосфатно-солевом буфере (РВ8), рН 7,4 при концентрации каждого отдельного олигопептида 5 г/л (15 г/л суммарного белка). Липидную пленку в сосуде для
- 11 024832 выпаривания регидратировали путем смешивания с 10 л раствора ФСБ-пептиды и перемешивания в течение 30 минут при 40°С. Полученную эмульсию липид/белок переносили в 10 мл ампулы и лиофилизировали. Сухой порошок солюбилизировали ех-1етроге с 5 мл воды для инъекций (ВДИ) с образованием больших мультиламеллярных липосом (МЛЛ), содержащих указанные олигопептиды.
Пример 8
Лечение пациентов с возвратно-ремиттирующим РС с помощью перорального введения липосомных составов олигопептидов
Исследование проводили в период с апреля 2003 года по июнь 2005 года в Санкт-Петербургской Медицинской академии на кафедре неврологии. При одобрении местного комитета по этике в общей сложности в испытание были включены 15 пациентов (5 мужчин и 10 женщин со средним возрастом 32 года) с ремиттирующим РС (диагностированным в соответствии с критериями Постера и Макдональда), имеющих по меньшей мере два зафиксированных документально рецидива в течение двух последних лет и имеющих показатель по шкале ΕΌδδ (Расширенная шкала инвалидизации) Куртцке от 0 до 5,5 .
Пациентам вводили ежедневно путем перорального приема липосомы (МЛЛ), изготовленные, как описано в примере 8 по 0,5 мг белка на кг массы тела. Лечение проводили в качестве непрерывной монотерапии ежедневно в течение 2 лет.
Показатели по шкале ΕΌδδ проверяли раз в два месяца. Проверку с помощью МРТ мозга в отношении активных очагов демиелинизации (АОД) проводили один раз в два месяца. Анализ частоты и продолжительности рецидивов проводили в конце 2-летнего периода наблюдения. Подсчет клеток крови, активность Е8АМВРСАА, биохимические показатели крови и иммунологические показатели проверяли в начале и в конце исследования.
Все 15 пациентов имели стабильные показатели по шкале ΕΌδδ в течение первых 6 месяцев лечения. Средняя частота рецидивов снизилась с 2,7 в год с момента начала лечения до 1,5 в год в конце периода лечения. В течение 2-летнего последующего врачебного наблюдения у 11 пациентов не были рецидивов. У 6 пациентов (40%) число АОД было снижено к концу периода лечения. У 7 пациентов (47%) наблюдалась стабилизация имеющегося числа АОД. У 2 пациентов (13%) число АОД возросло. Никаких неблагоприятных эффектов, связанных с препаратами настоящего изобретения, не было выявлено. Иммунологические показатели крови и биохимические показатели клеток крови существенно не изменились к концу периода лечения. Данные представлены в табл. 7.
Таблица 7. Иммунологические, клеточные и биохимические показатели крови в начале и в конце лечения (данные усреднены для 15 пациентов)
Параметр До лечения После лечения
СОЗ 48,75+9,68 52,37+7,37
СО4 29,75+6,43 30,25+4,06
СО8 22,87+5,34 25,5+6,2
СО4/СО8 1,37+0,29 1.29+0,35
1§А 2,88+1,53 2,77+1,46
1§М 1,59+0,71 1,68+0,41
1§с 19,67+6,45 16,00+5,10
НЬАЭК 23.13+5.38 21,25+5.88
Е8АМВРСАА 45,1+6,2 12,5+4,5
гемоглобин 128,86+14,73 126,57+20,08
лейкоциты 5,69+1,38 5,04+0,98
лимфоциты % 28,29+8,94 25,36+5,12
АЛТ 0,29+0,20 0,21+0,07
АСТ 0,25+0,12 0,19+0,06
Билирубин 12,36+4,17 10,39+2,67
Мочевина 3,62+1,67 4,11+1,16
Креатинин 0,07+0,02 0,08+0,01
Было отмечено снижение степени гидролиза, опосредованного МВР-специфичными аутоантителами, и это соответствовало значительному достигнутому лечебному эффекту. Таким образом, пероральный прием олигопептидов в соответствии с настоящим изобретением производит благоприятный терапевтический эффект, связанный со снижением активности Е8АМВРСАА. В сравнении с доступными ретроспективными данными для существующих способов лечения, результаты лечения согласно настоящему изобретению показывают лучшие результаты, чем для бета-интерферона, представляющего собой существующий стандарт терапии РС. Сравнительная табл. 8 приведена ниже.
- 12 024832
Таблица 8. Сравнительные данные по клинической эффективности доступных в настоящее время стандартных режимов лечения рассеянного склероза и результаты лечения согласно настоящему изобретению в соответствии с примером 8
Лечение Клинические наблюдения Данные МРТ: снижение активных повреждений Побочные эффекты Ссылки
Сополимер 1 Снижение частоты рецидивов -29%; замедление прогрессирования показателей Εϋ$3 Отсутствует статистически значимое снижение Низкие .ГоЬпзоп КР, Вгоокз ВК, СоЬеп ΙΑ. Рогб СС, ОоккЫп .1, Εί за к РР е( аЬ Соро1утег-1 геёисез ге1арье га(е ала ίπιρτονε1; <И$аЬШ(у ίη ге1ар51П§геплКтс ти1йр1е зс1его51з: КезиКз οί а рЬазе III тиккспНе. аоиЫе-ЬНпа, р1асеЬо согкгоИеа (па1. Тке соро1утег-1 ти1йр1е зскточч 5(иёу §гоир. Кешг>1о<зу 1995; 45:1268.
Бета- интеферон Снижение частоты рецидивов -83%; нет замедления прогрессирования показателей ЕО53 83% снижение Высокие Ра(у ШУ, Π к)КВ. (Ье иве М5/МЫ 5(иау Сгоир апа (Ье 1п(егГегоп Ве(а Ми1(1р1е Зсктояз 5(и4у Сгоир. 1п(ег1егоп Ье(а-1Ь 15 еД'ссЬтс ίη ге1ар81П§-гепй((1П§ тиК(р1е 5с1егоз(8. II. ММ гекиКз о! а тиШ-сеп(геа, аоиЫе-ЬЬпа, р1асеЬосоп(го11еа (па1. Кешп1г,еу 1993;43:662-7
Олигопептиды согласно настоящему Снижение частоты рецидивов -87%; 75% снижение Нет Пример 8
изобретению замедление прогрессирования показателей ЕО55
Вышеизложенное описание приведено для иллюстрации и описания настоящего изобретения, но не является исчерпывающим или ограничивающим изобретение до конкретных описанных характеристик. Возможны различные модификации и изменения, которые могут быть осуществлены на основании вышеприведенного описания или при реализации изобретения на практике. Таким образом, необходимо отметить, что объем изобретения определяется пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.
- 13 ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ И/ИЛИ АМИНОКИСЛОТ (К ЗАЯВКЕ № 201290185) <110> ЛАЙфБИО Лабораторис ЭлЭлСи <120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА <130> 001-001 <160> 4 <170> РаОепНп νβΓ3ίοη 3.4 <210> 1 <211> 170 <212> РРТ <213> Ното зарлепз <400> 1
А1а 1 Зег С1п Ьуз Агд 5 Рго Зег С1п
ТНг А1а Зег ТНг 20 Меб Азр ΗΪ3 А1а
Агд Азр ТНг 35 С1у 11е Ьеи Азр Зег 40
Агд С1у 50 А1а Рго Ьуз Агд С1у 55 Зег
Агд 65 ТНг А1а ΗΪ3 Туг С1у 70 Зег Ьеи
С1п Азр С1и Азп Рго 85 Уа1 Уа1 ΗΪ3
Агд ТНг Рго Рго 100 Рго Зег С1п С1у
Агд РНе Зег 115 Тгр С1у А1а С1и С1у 120
С1у Агд 130 А1а Зег Азр Туг Ьуз 135 Зег
Азр 145 А1а С1п С1у ТНг Ьеи 150 Зег Ьуз
Агд Н1з 10 С1у Зег Ьуз Туг Ьеи 15 А1а
Агд 25 Н1з С1у РНе Ьеи Рго 30 Агд Н1з
11е С1у Агд РНе РНе 45 С1у С1у Азр
С1у Ьуз Азр Зег 60 Н1з Н1з Рго А1а
Рго С1п Ьуз 75 Зег Н1з С1у Агд ТНг 80
РНе РНе 90 Ьуз Азп 11е Уа1 ТНг 95 Рго
Ьуз 105 С1у Агд С1у Ьеи Зег 110 Ьеи Зег
С1п Агд Рго С1у РНе 125 С1у Туг С1у
А1а Н1з Ьуз С1у 140 РНе Ьуз С1у Уа1
11е РНе Ьуз 155 Ьеи С1у С1у Агд Азр 160
Зег Агд Зег С1у Зег Рго Меб А1а Агд Агд 165 170 <210> 2 <211> 17 <212> РР.Т <213> Ното зартепз <400> 2
С1у С1у Азр Агд С1у А1а Рго Ьуз Агд С1у Зег С1у Ьуз Азр Зег НЬз
1 5 10 15
НЬз
<210> 3
<211> 16
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 3
С1у РНе С1у Туг С1у С1у Агд А1а Зег Азр Туг Ьуз Зег А1а НЬз Ьуз
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 4 24 РКТ Ното зарьепз
<400> 4
С1п С1у ТНг Ьеи Зег Ьуз 11е РНе Ьуз Ьеи С1у С1у Агд Азр Зег Агд
1 5 10 15
Зег С1у Зег Рго МеЕ А1а Агд Агд

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина МВР (Е8АМВРСАА), имеющий аминокислотную последовательность ССИКСАРККС8СКИ8НН (8ЕЦ ГО N0: 2).
  2. 2. Фармацевтическая композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая терапевтически эффективное количество олигопептида по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или систему доставки активного ингредиента.
  3. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, дополнительно содержащая по меньшей мере один олигопептид, выбранный из олигопептидов с последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что она содержит олигопептид по п.1 и олигопептиды с последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 4.
  5. 5. Фармацевтическая композиция по п.3 или 4, в которой олигопептиды имеют форму солей.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой соли представляют собой ацетаты.
  7. 7. Гибридный пептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина МВР (Е8АМВРСАА), состоящий из олигопептида по п.1 (8ЕЦ ГО N0: 2), соединенного в любом порядке пептидным или непептидным линкером с олигопептидом с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3 и/или с олигопептидом с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4.
  8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения рассеянного склероза, содержащая терапевтически эффективное количество гибридного пептида по п.7 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или систему доставки активного ингредиента.
  9. 9. Способ лечения или предотвращения рассеянного склероза у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции по любому из пп.2-6 или 8.
  10. 10. Применение композиции по любому из пп.2-6 или 8 для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.
    Первичная структура (аминокислотная последовательность) основного белка миелина человека (МВР) (8Е<3 ГО N0 1)
EA201290185A 2009-10-12 2009-10-12 Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина mbp, композиции и способ лечения рассеянного склероза EA024832B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2009/000533 WO2011046462A1 (en) 2009-10-12 2009-10-12 Composition for treatment of multiple sclerosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290185A1 EA201290185A1 (ru) 2012-11-30
EA024832B1 true EA024832B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=42651912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290185A EA024832B1 (ru) 2009-10-12 2009-10-12 Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина mbp, композиции и способ лечения рассеянного склероза

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9896491B2 (ru)
EP (1) EP2488196B1 (ru)
JP (1) JP5709876B2 (ru)
KR (1) KR20120103591A (ru)
CN (1) CN102781465A (ru)
AU (1) AU2009354040A1 (ru)
CA (1) CA2780961C (ru)
DK (1) DK2488196T3 (ru)
EA (1) EA024832B1 (ru)
ES (1) ES2566230T3 (ru)
MX (1) MX2012004295A (ru)
WO (1) WO2011046462A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2448685C2 (ru) * 2009-11-30 2012-04-27 Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации Липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза
EP2530088A1 (en) 2011-05-30 2012-12-05 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis
MX2014012135A (es) * 2012-04-11 2015-07-23 Lipoxen Technologies Ltd Liposomas que contienen fragmentos oligopeptidos de proteina basica de mielina, una composicion farmaceutica y un metodo para el tratamiento de la esclerosis multiple.
WO2014152831A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Health Research, Inc. Targeting peptides and uses thereof
WO2015023132A1 (ko) * 2013-08-14 2015-02-19 주식회사 카엘젬백스 다발성 경화증 치료 및 예방용 조성물
CN105541992A (zh) * 2015-11-04 2016-05-04 武汉云克隆诊断试剂研究所有限公司 人MBP18.5kD变体抗原表位肽及特异性检测试剂盒
CN110317254A (zh) * 2018-03-28 2019-10-11 深圳市安群生物工程有限公司 人mbp抗原表位肽、抗原、抗体、应用及化学发光试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993008212A1 (en) * 1991-10-22 1993-04-29 Warren Kenneth G Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid
WO2008151847A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-18 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Autoantibody binding peptides and their use for the treatment of vascular diseases
WO2009056833A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Apitope Technology (Bristol) Limited Composition

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858980A (en) 1990-03-30 1999-01-12 Autoimmune, Inc. Peptide fragments of myelin basic protein
US6252040B1 (en) 1991-10-22 2001-06-26 The Governors Of The University Of Alberta Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients
WO1996012737A2 (en) 1994-10-25 1996-05-02 Immulogic Pharmaceutical Corporation Compositions and treatment for multiple sclerosis
CA2494338C (en) 1997-04-04 2007-07-17 The Governors Of The University Of Alberta Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients
US20030191063A1 (en) 2000-08-21 2003-10-09 Wraith David Cameron Peptide selection method
GB0202399D0 (en) 2002-02-01 2002-03-20 Univ Bristol Peptide
EP2197906A1 (en) * 2007-10-11 2010-06-23 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Fusion polypeptide comprising s-antigen repeat units

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993008212A1 (en) * 1991-10-22 1993-04-29 Warren Kenneth G Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid
WO2008151847A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-18 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Autoantibody binding peptides and their use for the treatment of vascular diseases
WO2009056833A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Apitope Technology (Bristol) Limited Composition

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELOGUROV A A JR; ZARGAROVA T A; TUROBOV V I; NOVIKOVA N I; FAVOROVA O O; PONOMARENKO N A; GABIBOV A G: "Suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats by novel peptide drug, structural part of human myelin basic protein 46-62", AUTOIMMUNITY, INFORMA HEALTHCARE, GB, vol. 42, no. 4, 1 January 2009 (2009-01-01), GB, pages 362 - 364, XP009138235, ISSN: 0891-6934, DOI: 10.1080/08916930902832090 *
BELOGUROV ALEXEY A , ET AL: "Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies: novel biomarker for multiple sclerosis.", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol. 180, no. 2, 15 January 2008 (2008-01-15), US, pages 1258 - 1267, XP002599272, ISSN: 0022-1767 *
VALLI A., ET AL.: "BINDING OF MYELIN BASIC PROTEIN PEPTIDES TO HUMAN HISTOCOMPATIBILITY LEUKOCYTE ANTIGEN CLASS II MOLECULES AND THEIR RECOGNITION BY T CELLS FROM MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS.", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION, US, vol. 91., no. 02., 1 February 1993 (1993-02-01), US, pages 616 - 628., XP000567819, ISSN: 0021-9738, DOI: 10.1172/JCI116242 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2488196A1 (en) 2012-08-22
EP2488196B1 (en) 2015-12-16
EA201290185A1 (ru) 2012-11-30
JP5709876B2 (ja) 2015-04-30
CN102781465A (zh) 2012-11-14
JP2013507437A (ja) 2013-03-04
DK2488196T3 (en) 2016-03-14
US9896491B2 (en) 2018-02-20
KR20120103591A (ko) 2012-09-19
CA2780961C (en) 2018-10-02
AU2009354040A1 (en) 2012-05-31
ES2566230T3 (es) 2016-04-11
CA2780961A1 (en) 2011-04-21
WO2011046462A1 (en) 2011-04-21
MX2012004295A (es) 2012-08-15
US20120207820A1 (en) 2012-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024832B1 (ru) Олигопептид, связывающий гидролизующие аутоантитела к основному белку миелина mbp, композиции и способ лечения рассеянного склероза
EP1196450B1 (fr) Derives citrullines de la fibrine et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement de la polyarthrite rhumato de
AU713546B2 (en) Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients
CN112125975A (zh) Pd-l1和cd47双特异性融合蛋白及其医药用途
EP0610446B1 (en) Synthetic peptide specificity of anti-myelin basic protein from multiple sclerosis cerebrospinal fluid
US20060247175A1 (en) Methods of predicting therapeutic efficacy of treatment of a multiple sclerosis patient
CA2201841C (en) Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients
US7090982B2 (en) Methods of predicting therapeutic efficacy of treatment of a multiple sclerosis patient
CA2634589A1 (en) Irreversibly-inactivated pepsinogen fragment and pharmaceutical compositions comprising this fragment for detecting, preventing, and treating hiv
WO2017211843A1 (en) Antiviral polyclonal antibodies against ebola virus and the uses thereof
WO2007107597A2 (en) Immunogenic construct and a method for the prophylactic or therapeutic treatment of aids
US20020111312A1 (en) Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM