MX2014012135A

MX2014012135A - Liposomas que contienen fragmentos oligopeptidos de proteina basica de mielina, una composicion farmaceutica y un metodo para el tratamiento de la esclerosis multiple.

Info

Publication number: MX2014012135A
Application number: MX2014012135A
Authority: MX
Inventors: Alexander Gabinov; Alexey Belogurov; Natalia Ponomarenko; Ivan Smimov; Andrew Bacon; Gregory Gregoriadis
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2015-07-23
Also published as: WO2013153179A1; RU2639497C2; AU2013246870A1; RU2014145237A; JP2015514123A; IL235190A0; CN104334185B; CN104334185A; AU2016225843A1; AU2013246870B2; NZ700854A; KR20150003795A; JP6014241B2; EP2836229A1; CA2870036A1; EP2836229B1; KR101778169B1

Abstract

Una composición para el tratamiento de la esclerosis múltiple que comprende un primer péptido (MBP) de proteína básica de mielina enlazado a un primer vector, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido: (R1) a-P1-(R2) b en donde P1 es una secuencia de aminoácido que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 1-3; cada uno de R1 y R2 son secuencias de aminoácido que consisten independientemente de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de a y b son independientemente 0 a uno. Las composiciones peptídicas inmunodominantes de proteína básica de mielina se encapsulan en liposomas manosilados. En una modalidad específica, las composiciones comprenden péptidos (MBP) de proteína básica de mielina (46-62), MBP (124-139), y MBP (147-170).

Description

LIPOSOMAS QUE CONTIENEN FRAGMENTOS DE OLIGOPÉPTIDOS DE PROTEÍNA BÁSICA DE MIELINA, UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y UN MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE Referencias cruzadas para las solicitudes relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente estadounidense No. 13/444788, presentada el 11 de abril de 2012, titulada "LIPOSOMAS QUE CONTIENEN FRAGMENTOS DE OLIGOPÉPTIDOS DE PROTEÍNA BÁSICA DE MIELINA, UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Y UN MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE", la descripción de los cuales se incorpora aqui expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad neurodegenerativa en la que las vainas de mielina graso alrededor de los axones del cerebro y la médula espinal están dañadas, lo que lleva a la desmielinización y cicatrización. El daño causado al sistema nervioso central (SNC) da como resultado un amplio espectro de síntomas neurológicos. Aproximadamente un millón de personas en el mundo sufren de ésta enfermedad autoinmune, que tiene una etiología enigmática y una patogenia mal entendida. Las células T y B reaccionan contra los componentes de la membrana de mielina, median la desmielinización del cerebro y la médula espinal, y parecen ser responsables de una gran parte de la progresión de la enfermedad.

La lista de autoantigenos potenciales contra los cuales las células B y T reaccionan en pacientes con EM está creciendo progresivamente e incluye varias proteínas de oligodendrocitos-asociados, proteína básica de mielina de forma más notable (MBP) y glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG). La infiltración del sistema nervioso central por estos macrófagos y linfocitos, a través de la barrera hematoencefálica (BBB), resulta en la formación de lesiones desmielinizantes inflamatorias en el cerebro y en la médula espinal.

Mientras que las células T son responsables de una gran parte del efecto desmielinizante, las células B juegan un papel importante también. Esto es porque las células B funcionan como células presentadoras de antígeno y células productoras de citoquinas, además de su papel bien reconocido en la producción de anticuerpos (Hikada y Zouali, Nat Immunol 2010; 11: 1065-8). La evidencia adicional de la implicación de las células B en la desmielinización es la detección de anticuerpos catalíticos a la MBP en pacientes con esclerosis múltiple. Estos anticuerpos catalíticos son capaces de enlazarse no sólo a su antígeno, sino de cribarlo también (Ponomarenko NA et al, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 2006; 103:. 281-6). La evidencia sugiere que existe un fuerte componente ambiental para la progresión de la esclerosis múltiple, en la que los autoanticuerpos de reacción cruzada con antigenos neuronales y virales contribuyen a la etiología y patogénesis de la esclerosis múltiple (Gabibov AG et al, FASEB J 2011; 25:.4211-21).

Se han propuesto muchas terapias para la esclerosis múltiple, incluyendo: (i) la administración de acetato de glatirámero (GA); (ii) administración de "ligandos peptídicos alterados" (APL) que interactúan con receptores de células T (TCR); (iii) administración IFNh; (iv) administración de anti-CD20, anti-CD25, anticuerpos monoclonales anti-CD52; (v) varias terapias orales; (vi) vacunación con células T inactivadas o regiones hipervariables TCR; (vii) tolerancia del sistema inmunitario mediante la administración de autoantígenos, o vacunación de ADN; y (viii) terapia de depleción de células B-dirigida.

Sin embargo, a pesar de los datos clínicos prometedores, inmunológicos y bioquímicos, ninguna de las terapias existentes son capaces de curar o prevenir la progresión de la esclerosis múltiple. Por lo tanto, hay una gran necesidad en la téenica por enfoques terapéuticos eficaces de la esclerosis múltiple.

Breve resumen de la invención En un aspecto, la presente invención satisface una necesidad en el campo de la medicina para las composiciones eficaces y métodos de tratamiento de la esclerosis múltiple (EM), proporcionando una composición terapéutica de los péptidos MBP inmunodominantes enlazados a un vector para la administración a un sujeto en necesidad del mismo. En una modalidad especifica, la composición comprende péptidos MBP inmunodominantes encapsulados en un liposoma manosilado. Como se muestra en la presente, la administración de éstas composiciones mejora la encefalomielitis autoinmunitaria experimental en curso en un modelo de rata inducido-EAE de la esclerosis múltiple.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertos péptidos de la MBP son los principales epitopos de células B en pacientes que sufren de esclerosis múltiple. Se encontró que la administración de formulaciones liposomales de estos péptidos, pero no los péptidos libres, a modelos de roedores con esclerosis múltiple resultó en una reducción estadísticamente significativa en la parálisis. Sin estar limitado por la teoría, es posible que la formulación liposomal de estos péptidos resulte en la mejora de entrega de estos péptidos a las células inmunitarias (por ejemplo, células B y/o células presentadoras de antígeno) y/o mejora la ingesta de estos péptidos en las células inmunitarias (por ejemplo las células B y/o células presentadoras de antígeno).

Por consiguiente, la presente invención proporciona, entre otros aspectos, composiciones y métodos para tratar la esclerosis múltiple. Las composiciones comprenden uno o más de los péptidos MBP identificados enlazados a un vector (por ejemplo, un liposoma manosilada).

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la composición comprende un primer péptido (MBP) de proteina básica de mielina enlazado a un primer vector, el primer péptido MBP que consiste de la secuencia de aminoácidos: (R1)a-PD-(R2)b en la que: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ÍD NOS: 1-3; cada uno de RD y RD son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten de de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de a y b son independientemente cero o uno.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, a y b son cero. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, a es uno y b es cero. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, a es cero y b es uno. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, a y b son uno.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:l. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:l. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:l. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición comprende además un segundo péptido MBP enlazado a un segundo vector, el segundo péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácidos: (R3)c-PD-(RD)d en la que: PD es -una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOS:1-3; cada uno de R3 y RD son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten en de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de c y d son independientemente cero o uno, en el que PD y PD son diferentes secuencias de aminoácidos.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, los vectore primero y segundo son el mismo vector.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición comprende además un tercer péptido MBP enlazado a un tercer vector, el tercer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácidos: (Rü)e-PD-(RD)f en donde: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS:1-3; cada uno de RD y RD son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten en de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de e y f son independientemente cero o uno, en el que PD, PD y PD son diferentes secuencias de aminoácidos.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el primer, segundo y tercer vector son el mismo vector.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID N0:1 PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2; y PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el péptido MBP se enlaza covalentemente al vector. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el péptido MBP no se enlaza covalentemente al vector.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el vector comprende una nanopartícula. En una modalidad especifica de las composiciones proporcionadas anteriormente, la nanopartícula es un liposoma.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el vector comprende una porción diana. En una modalidad específica de las composiciones proporcionadas anteriormente, el vector es una porción diana.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la porción diana aumenta: (a) el suministro del péptido MBP a una célula inmunitaria; o (b) la ingesta del péptido MBP en una célula inmunitaria, en comparación con un péptido MBP enlaado a un vector en ausencia de una porción diana. __En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la porción diana comprende un residuo de mañosa. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la porción diana comprende un anticuerpo que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la porción diana comprende un aptámero que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la porción diana comprende un péptido que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la célula inmunitaria es una célula B. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígeno (APC).

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la composición comprende un primer péptido de la proteína (MBP)básica de mielina enlazado a un primer vector, el primer péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácidos: (R1)a-PG-(R2)b en la que: PQ es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOS:1-3; cada uno de R1 y R2 son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de a y b son independientemente cero o uno, en el que el vector es un liposoma comprende un lípido manosilado.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID N0:1.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, la composición comprende además: un segundo péptido MBP enlazado a un segundo vector, el segundo péptido MBP que consiste en la secuencia de aminoácidos: (R3)c-PD-(RD)d; y un tercer péptido MBP enlazado a un tercer vector, el tercer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácidos: (RD)e-PD-(RD)f en la que: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N0:1; PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2; PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:3; cada uno de R1, R2, R3, RD, RD y RD, son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de a, b, c, d, e y f son independientemente cero o uno.

En una modalidad de las composiciones t proporcionadas anteriormente, el(los) péptido(s) MBP no está(n) enlazado covalentemente al liposoma. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el(los) péptido(s) MBP está(n) encapsulados en el liposoma.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el liposoma tiene un diámetro medio de 100 nm a 200 nm.

En una modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el lipido manosilado es tetramanosil-3-L-lisina-dioleoil glicerol. En otra modalidad de las composiciones proporcionadas anteriormente, el lipido manosilado es manDOG.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente en necesidad del mismo, el método comprende administrar al paciente una composición que comprende un primer péptido (MBP) de proteina básica de mielina enlazado a un primer vector, el primer péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácidos: (R1)a-PD-(R2)b en la que: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS:1-3; cada uno de R1 y R2 son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten en de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de a y b son independientemente cero o uno.

En una modalidad de los métodos establecidos anteriormente, a y b son cero. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, a es uno y b es cero. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, a es cero y b es uno. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, a y b son uno.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:l. En otra forma de modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:l. En otra forma de modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:l. En otra forma de modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:2. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con SEC ID NO:3. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición comprende además un segundo péptido MBP enlazado a un segundo vector, el segundo péptido MBP que consiste en la secuencia de aminoácidos: (R3)c-PD-(RD)d en la que: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS:1-3; cada uno de R3 y R4 son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten en de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de c y d son independientemente cero o uno, y en el que PD y PD son diferentes secuencias de aminoácidos.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, los vectores primero y segundo son el mismo vector.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición comprende además un tercer péptido MBP enlazado a un tercer vector, el tercer péptido MBP que consiste en la secuencia de aminoácidos: (RD)e-PD- (RD)f en donde: PD es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NOS:1-3; cada uno de RD y RD son independientemente secuencias de aminoácidos que consisten de 1 a 10 aminoácidos; y cada uno de e y f son independientemente cero o uno, y en el que PD, PD, y PD son diferentes secuencias de aminoácidos.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el primer, segundo y tercer vector son el mismo vector.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l; PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2/ y PD es la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el péptido MBP está enlazado covalentemente al vector. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el péptido MBP no está enlazado covalentemente al vector.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el vector comprende una nanopartícula. En una modalidad especifica, la nanopartícula es un liposoma.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el vector comprende una porción diana.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la porción diana aumenta: (a) el suministro del péptido MBP a una célula inmunitaria; o (b) la ingesta del péptido MBP en una célula inmunitaria, en comparación con un péptido MBP ligado a un vector en ausencia de una porción diana.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el vector es una porción diana. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la porción diana comprende un residuo de mañosa. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la porción diana comprende un anticuerpo que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la porción diana comprende un aptámero que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la porción diana comprende un péptido que se enlaza específicamente a una célula inmunitaria. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la célula inmunitaria es una célula B. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígeno (APC).

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición comprende un péptido MBP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N0:1, el péptido MBP ligado a un vector comprende una porción diana, en el que el vector que comprende una porción diana es un liposoma que comprende un lipido manosilado.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición comprende: (i) un primer péptido MBP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l; (ii) un segundo péptido MBP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2; y (iii) un tercer péptido MBP que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el (los) péptido(s) MBP no está (n) covalentemente enlazado(s) al liposoma.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el(los) péptido(s) MBP está (n) encapsulado(s) en el liposoma.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el liposoma tiene un diámetro promedio de 100 nm a 200 nm.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, el lipido manosilado es tetramanosil-3-L-lisina-dioleoil glicerol. En otra modalidad de los métodos establecidos anteriormente, el lipido manosilado es manDOG.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición se administra al paciente al menos una vez a la semana. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición se administra al paciente por lo menos dos veces a la semana. En otra modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición se administra al paciente diariamente.

En una modalidad de los métodos proporcionados anteriormente, la composición se administra por administración tópica, administración entérica o parenteral.

Breve descripción de las figuras La figura 1. Ratas DA inducidas con EAE son los modelos de roedores más relevantes de la EM en términos de autoanticuerpos anti-MBP de patrón de enlace. (A) Los autoanticuerpos séricos de pacientes con EM y modelos de roedores que desarrollaron encefalomielitis autoinmunitaria experimental (ratas DA, SJL y C57BL/6 ratones) se unieron de forma reproducible a ELISA. El suero de ratones BALB/c se utilizó como control negativo. (B) Diseño de epitopo MBP de librería. Manchado de Coomassie representativa y hibridación-Western Blot de anti-c-myc y mAb anti-MBP con MBP epitopo de librería. Anti-c-myc Ab se enlaza a todos los miembros del epitopo MBP de librería debido a la presencia de epitopo diana en todas las proteínas de fusión (esquema en la parte superior), por lo tanto, sugiere la exposición y accesibilidad de todos los péptidos MBP, situados directamente contracorriente al epitopo c-myc. El anti-MBP Ab monoclonal (clon F4A3, epitopo MBP RHGFLPRHR (SEC ID NO:20)) reacciona con todo la MBP y sus péptidos MBP2 y MBP3 como se predijo. (C) El patrón de enlace de los autoanticuerpos séricos del epitopo MBP de librería está de acuerdo con ELISA. De acuerdo con nuestros datos de ratas DA que desarrollan EAE son los más relevantes para el modelo de roedores de EM. La secuencia MBP con péptidos presentados en su epitopo de librería se muestra en la parte inferior (SEC ID NO:17). Cada décimo de residuo de aminoácido está marcado en negrita. Los corchetes representan péptidos inmunodominantes MBP-1/-2/-3, seleccionados para la detección eficiencia del tratamiento.

Figura 2. Caracterización de la especificidad y afinidad de los anticuerpos policlonales de ratas DA inmunizadas con MBP, (63-8D . (A) El panel superior muestra que tres fragmentos de la MBP son reconocidos por el suero autoAc de las ratas DA con EAE inducida. Los péptidos inmunodominantes se determinaron de acuerdo con el ELISA de la vinculación autoAb con el epitopo de librería y el cálculo teórico posterior basado en la supuesto de sus secuencias superpuestas. Además, el epitopo MBP de librería se híbrido con anti-c-myc y anti-MBP F4A3 mAb para verificar el ensayo de enlace (panel inferior). (B) las características cuantitativas de reconocimiento de los epítopos determinados por autoAc, medido por la téenica SPR. Se muestran los péptidos respectivos y constantes de disociación eficaces. Los epítopos exactos se muestran en negrita, ND = no determinado.

Figura 3. Representación esquemática de la tecnica de liposomado usada para encapsular los péptidos MBP inmunodominantes en liposomas SUV manosilado . (Arriba a la izquierda) Mezcla de lipidos (EggPC con 1% de manosilado DOG) en cloroformo. (Arriba en medio) La formación de capas de lipidos irregulares durante la evaporación del disolvente orgánico. (Arriba a la derecha) Primera rehidratación que conduce a la multi-capa MLV de formación de liposomas. El diámetro promedio de partículas es entre 1-5 mieras. (Parte inferior izquierda) liofilización de liposomas SUV, obtenidos a partir de liposomas MLV por homogeneización a alta presión y mezcla de péptido con exceso de azúcar, (parte inferior central) Los péptidos se encuentran entre los liposomas SUV colapsados. (Inferior derecha) La encapsulación de péptidos durante la segunda rehidratación en los liposomas SUV con el tamaño de aproximadamente 60-80 nm y 1.0% de residuos de mañosa en la superficie. La representación fue ejecutada por Visual Science Company.

Figura 4. Péptidos MBP inmunodominantes atrapados en liposomas mejoran la encefalomielitis autoinmunítaria experimental en ratas DA. Todos los grupos en estudio (AG) se analizaron en función de la puntuación media de la enfermedad, tasa gliosis/desmielinización. El grupo de control (vehículo) no tratado se muestra por un línea negrita (A) y se repite en cada parcela para la comparación. Tres fragmentos MBP inmunodominantes encapsulados en liposomas SUV manosilada se utilizan para el tratamiento de EAE en ratas DA: MBP(46-62) fue el más eficaz en disminuir la puntuación máxima de la enfermedad durante el primer ataque. (B), MBP (124-139) (C), y MBP (147-170) (D) impidió el desarrollo de la fase de remisión. La administración de una mezcla de MBP(46-62), MBP(124-139) y MBP(147-170) de péptidos MBP inmunodominantes atrapados en liposomas mejoró significativamente la EAE prolongada (E), copaxona (F) y el péptido libre de MBP(46-62) (G) se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. La media de puntuación de la enfermedad se muestra para cada grupo. Diferencia estadísticamente significativa se muestra por la línea negrita. El perfil representativo de rata seleccionada individual se muestra por una línea delgada. La hematoxilina representativa y la manchado de eosina se muestra en el panel derecho.

Figura 5. Péptidos MBP inmunodominantes atrapados en liposomas, disminuyen el título del suero de autanticuerpos anti-MBP y regulan el perfil de citosnas Thl del SNC. (A) La concentración de suero anti-MBP autoAb en ratas DA EAE tratadas con MBP1 SUV, MBP1/2/3 SUV, y copaxona en comparación con las ratas no tratadas Y no inmunizados. Luxol Representativo de manchado azul rápida (B), la inmunomanchado para citosinas Thl IFNy (B) y IL2 (C) y la inmunomanchado de BDNF (D) en secciones de cerebro de ratas DA tratadas con MBP1 SUV (inferior derecha), MBP1/2/3 SUV (inferior izquierda), y copaxona (arriba a la derecha), en contraste con las ratas no tratadas (parte superior izquierda).

Figura 6. Puntuación media de la parálisis de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. Una puntuación de la parálisis se asignó diariamente para cada rata durante la duración de los periodos de estudio: aclimatación, inducción de EAE, tratamiento y post-tratamiento (total 35 dias). 54 ratas DA inducidas por EAE fueron separados por igual en 9 grupos. Los grupos I-VII se trataron con formulaciones 1-7, el grupo VIII fue tratado con Copaxona (grupo control positivo), el grupo IX se le administró una inyección de agua (grupo de control negativo). Las puntuaciones de parálisis se registraron diariamente y se muestran como valores medios para los grupos IV (A) y los grupos VI-IX (B). Una reducción estadísticamente significativa en la puntuación de parálisis, en comparación con los controles, se observó para el grupo IV (tratado con la formulación 4) en los días 3 y 4 después del tratamiento (n = 6, * p <0,05). La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 7. El pesos corporal promedios (g) de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. El peso corporal de los animales se registró durante todos los periodos de estudio: aclimatación, inducción EAE, tratamiento y después del tratamiento (un total de 35 dias). 54 ratas DA EAE inducidas fueron separadas en partes iguales en 9 grupos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el peso corporal de las ratas tratadas con las formulaciones de péptidos MBP y los grupos de control. La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 8. Manchado de hematoxilina y eosína (H&E) de la médula espinal de los modelos de rata inducidas por EAE de EM. La magnificación de Imágenes a lOx y 40x de la médula espinal aislada de las ratas inducidas por EAE tratadas con: (A) (rata 35, grupo II), (rata 53; grupo IV), (rata 69; grupo IX); (B) (rata 71; grupo VIII), (rata 77; grupo III), (rata 79; grupo V); y (C) (rata 81; grupo I), (rata 95; grupo VII), (rata 2003; grupo VI).

Figura 9. Diseño experimental. Montaje experimental, incluyendo las identidades de los péptidos, el contenido liposomal, y la dosis para todas las formulaciones experimentales probadas en los ejemplos 12, 13 y 14. MBP1 (SEC ID NO:l); MBP1FL (SEC ID NO:9); MBP1FR (SEC ID NO:10); MBP2 (SEC ID NO:2); MBP3 (SEC ID NO:3).

Figura 10. Puntuación media de la parálisis de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. Una puntuación de la parálisis fue asignada diariamente a cada rata durante la duración de los periodos de estudio: aclimatación, inducción de EAE, tratamiento y después del tratamiento (total de 36 dias).54 ratas DA inducidas con EAE fueron separados en 10 grupos. Los grupos I-VIII fueron tratados con formulaciones MBP F 1-8, el grupo IX fue tratado con Copaxone (grupo control positivo), el grupo C fue administrado con una inyección de agua (grupo control negativo). Una reducción estadísticamente significativa en la puntuación de parálisis, en comparación con los controles, se observó para los grupos III y IV (tratados con una dosis de 200 mg) los días 2 y 3 después del tratamiento (n = 5, *p <0.05). La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 11. Peso corporal promedio (g) de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. El peso corporal de los animales se registró durante todos los períodos de estudio: aclimatación, inducción EAE, tratamiento y después del tratamiento (un total de 36 días). 54 ratas DA inducidas con EAE fueron separados por igual en 10 grupos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el peso corporal de las ratas tratadas con las formulaciones de péptidos MBP y los grupos de control. La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 12. Puntuación media de la parálisis de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. Una puntuación de la parálisis fue asignado diariamente a cada rata durante la duración de los periodos de estudio: aclimatación, inducción de EAE, tratamiento y post tratamiento. 42 ratas DA inducidas con EAE se separaron en 7 grupos. Los grupos II-V fueron tratados con formulaciones MBP F I-IV, los grupos VI y VII fueron tratados con Copaxona (150 mg y 450 mg, respectivamente; grupos de control positivos) y al grupo I se le administró la inyección de agua (grupo de control negativo). Una reducción estadísticamente significativa en la puntuación de parálisis, en comparación con el control negativo, se observó para: grupo II (tratado con la formulación liposomal de péptido MBP1; 1:330 a lípido) en los dias 1 a 4 después del tratamiento (n = 6, *p<0,005); grupo III (tratado con la formulación liposomal de péptido MBPl/2/3; 1:330 a lípido) en el día 1 después del tratamiento (n = 6, *p<0,05); y el grupo V (tratado con la formulación liposomal de péptido MBPl/2/3; 1:110 a lípido) en los días 1 a 3 después del tratamiento (n = 6, *p<0,05). La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 13. Peso corporal promedio (g) de los modelos de rata inducidas con EAE de EM. El peso corporal de los animales se registró durante todos los periodos de estudio: aclimatación, inducción EAE, tratamiento y después del tratamiento. 42 ratas DA inducidas por EAE fueron separadas por igual en 7 grupos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el peso corporal de las ratas tratadas con las formulaciones de péptidos MBP y los grupos de control. La desviación estándar se indica con barras de error.

Figura 14 Secuencia de la alineación de 7 MBP isoformas de empalme. UniProt ID Nos .: P02686 (SEC ID NO:13); P02686-2 (SEC ID NO:14); P02686-3 (SEC ID NO:15); P02686-4 (SEC ID NO:16); P02686-5 (SEC ID NO:17); P02686-6 (SEC ID NO:18); y P02686-7 (SEC ID NO:19).

Descripción detallada de la invención I. Introducción La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurodegenerativa grave que tiene un historial autoinmunitario. Aunque se conocen varios tratamientos para el tratamiento de la esclerosis múltiple, no existe una cura para la enfermedad. Además, las terapias actuales tienen una eficacia limitada y pueden resultar en efectos secundarios no deseados. En consecuencia, el desarrollo de nuevos enfoques para el tratamiento de la EM es de gran importancia. Presentamos aquí composiciones y el uso de epitopos de células B de la proteina básica de mielina (MBP) encapsulada en pequeños liposomas (SUV) manosilado como un fármaco eficaz para el tratamiento de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratas DA, un modelo aceptado en el arte para EM de humanos.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas de péptidos MBP antigénicos enlazados a un vector, que son útiles para el tratamiento de la esclerosis múltiple. En una modalidad especifica, las composiciones terapéuticas comprenden uno, dos, o tres péptidos MBP antigénicos enlazados a un vector (por ejemplo, un liposoma) que comprende opcionalmente una porción diana (por ejemplo, un lipido manosilado). Cuando se administra a un paciente con esclerosis múltiple, las composiciones terapéuticas mejoran las capacidades cognitivas y aliviar los síntomas de parálisis. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para el tratamiento, la gestión, y la profilaxis de la esclerosis múltiple en un sujeto en necesidad del mismo.

El uso de una librería de epítopo de proteína básica de la mielina, se analizó el patrón de enlace de autoanticuerpos séricos (autoAb) de los pacientes con EM remitente-recurrente y en comparación con autoAb anti-MBP de ratones albinos James Lambert (SJL), 6 ratones negros C57 (C57BL/6) y ratas Dark Agouti (DA) con EAE. Se encontró que las ratas DA con EAE son los modelos de roedores más relevantes de EM basada en los espectros de ,autoAc a fragmentos MBP. Tres fragmentos MBP inmunodominantes encapsuladas en liposomas SUV manosiladas se utilizaron para el tratamiento de EAE en ratas DA. MBP(46-62) fue el más eficaz en la disminución de la puntuación máxima de la enfermedad durante el primer ataque, mientras que MBP(124-139) y MBP(147-170) evitó el desarrollo de una etapa de exacerbación. La administración de una mezcla de péptidos MBP inmunodominantes atrapados en liposomas mejora significativamente EAE prolongada por regulación a la baja de citosinas Thl y la inducción de la producción de BDNF en el SNC. Los efectos sinérgicos de péptidos MBP disminuyen el curso general de la enfermedad con el primer ataque moderado y el resultado rápido de la exacerbación, lo que sugiere una nueva modalidad terapéutica para el tratamiento de la EM.

II. Definiciones Tal como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una estructura molecular capaz de asociarse con una carga (por ejemplo, pequeñas moléculas terapéuticas o de diagnóstico, péptidos, ácidos nucleicos, proteínas y productos biológicos). En una modalidad, un vector es una estructura molecular que alberga o cuida de una carga terapéutica (por ejemplo, un péptido MBP) administrado a un sujeto en necesidad del mismo. Un vector puede, pero no necesariamente, mejorar un efecto terapéutico impartido por la carga, mejorar o dirigir la administración de la carga a una ubicación in vivo o tipo de célula, mejorar la absorción de la carga en células o células particulares in vitro o in vivo, aumentar la vida media in vivo de la carga, proteger la carga de las interacciones in vivo no deseadas, o reducir la velocidad de eliminación de la carga de la corriente sanguínea y/o el cuerpo de un sujeto. En una modalidad, el vector comprende una nanopartícula, como se define a continuación, capaz de encapsular, incrustar, inmovilización la carga. Opcionalmente, el vector, por ejemplo, el vehículo de nanopartículas, puede comprender además una porción diana. En otra modalidad, el vector es una porción diana que está enlazado directamente (covalentemente o no covalentemente) a la carga. Ejemplos de vectores no limitantes incluyen: nanopartículas, tales como liposomas, micelas, micelas de copolímeros de bloque, polímerosomas, niosomas, nanoburbujas de lípidos recubiertos y dendrímeros; vehículos sólidos, tales como partículas metálicas y partículas de sílice; residuos de azúcar, tales como mañosa, un derivado de mañosa, un análogo de mañosa o un hidrato de carbono que contiene uno o más residuos de mañosa, derivados de mañosa o un análogo de mañosa; péptidos, tales como un ligando de receptor de la célula; polipéptidos, tales como un anticuerpo o fragmento funcional de la misma; y ácidos nucleicos, tales como un aptámero o Spiegelmer®.

Tal como se utiliza aquí, el término "porción diana" se refiere a un agente que mejora la eficacia de una carga terapéutica o de diagnóstico cuando se asocia con la carga, en comparación con la eficacia de la carga sola. En una modalidad, una porción diana mejora la entrega de la carga asociada a una ubicación in vivo o tipo de célula y/o mejora la absorción de la carga en una célula o ubicación in vivo. La porción diana puede estar enlazado covalente o no covalentemente a la carga (por ejemplo, un péptido MBP), incluyendo pero no limitado, a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacción electrostática, de interacción hidrófoba o atrapamiento físico. En ciertas modalidades, la vinculación puede medirse a través de un enlazador u otra estructura del vector. Ejemplos de estructuras diana incluyen, sin limitación, un residuo de azúcar (por ejemplo, mañosa o un carbohidrato que contiene uno o más residuos de mañosa), un péptido (por ejemplo, un ligando de receptor celular), un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo) y un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®).

Tal como se utiliza aquí, el término "vector que comprende una porción diana" se refiere a una estructura molecular que mejora la entrega de una carga a una célula y/o mejora la ingesta de la carga en la célula. En una modalidad, el vector comprende una porción diana que se enlaza covalente o no covalentemente a un vehículo de nanopartículas capaz de transportar una carga (por ejemplo, un péptido MBP u otro agente terapéutico). Opcionalmente, el vector comprende una porción diana incluye un vehículo de nanopartículas capaz de albergar la carga. En otra modalidad, un vector que comprende una porción diana consiste en una porción diana que está directamente enlazado, covalente o no covalentemente, a una carga (por ejemplo, un péptido MBP u otro agente terapéutico). En una modalidad específica, un vector que comprende una porción diana es la porción diana.

Tal como se utiliza en la presente, el término "nanopartículas" se refiere a un vector con un diámetro medio de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, que está enlazado a la carga, por ejemplo, un péptido (por ejemplo, un péptido MBP), ácido nucleico, grupo terapéutico o grupo de diagnóstico. Las nanopartículas pueden ser huecas (por ejemplo, tienen una cubierta exterior y un núcleo hueco), sólido o de múltiples capas. La carga (por ejemplo, un péptido MBP) puede ser atado a, incrustado en, o encapsulada por la nanoparticula. Muchos nanoparticulas son conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Elizondo et al, Prog Mol Biol Transí Sci. 2011; 104:1-52, cuyo contenido se incorpora aquí expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos) e incluyen, sin limitación, un liposoma, una micela, una micela de copolímero de bloques (revisado en Kataoka et al, Adv Drug Deliv Rev. 2001 23 de marzo; 47(1):113-31, los contenidos de las cuales se incorporan expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), una polimersoma (revisado en Christian et al, Eur J Pharm Biopharm 2009 Mar; 71 (3):463-74, los contenidos de los cuales se incorporan expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), un niosoma (revisado en Kazi et al, J Pharm Adv Res Technol 2010 Oct; 1(4):374-80, los contenidos de los cuales se incorporan expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), una nanoburbuja de lipidos recubiertos (Unger et al, Adv Drug Deliv Rev.7 de mayo 2004; 56(9):1291-314, el contenido del cual incorpora expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), un dendrimero, una partícula metálica (por ejemplo, una partícula de óxido de hierro o partículas de oro) y una partícula de sílice.

En una modalidad, una nanoparticula tiene un diámetro promedio de aproximadamente de 1 a aproximadamente 1000 nm. En otra modalidad, una nanoparticula tiene un diámetro promedio de aproximadamente de 20 a aproximadamente 500 nm. En otra modalidad, una nanoparticula tiene un diámetro promedio de aproximadamente de 50 a aproximadamente 400 nm. En otra modalidad, una nanoparticula tiene un diámetro promedio de aproximadamente de 75 nm a aproximadamente 300 nm. En todavía otra modalidad, una nanoparticula tiene un diámetro promedio de aproximadamente de 100 nm a aproximadamente 200 nm. En ciertas modalidades, los liposomas pueden incluir lípidos catiónicos, lípidos aniónicos, lípidos bipolares, lípidos neutros o combinaciones de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente, el término "liposoma" se refiere a cualquier estructura cerrada por una bicapa lipídica (es decir, lamela). El término liposoma abarca liposomas de vesículas multilamelares (MLV) que varían en tamaño desde aproximadamente 0.1 mieras a aproximadamente 5 mieras, liposomas de vesícula unilamelar pequeños de (SUV) que varían en tamaño desde aproximadamente 0.02 mieras hasta aproximadamente 0.05 m, y liposomas de vesícula unilamelar grandes que varían en tamaño desde alrededor de 0.06 mieras en adelante. Tal como se utiliza en la presente, el término "multilamelar" se refiere a una estructura lipídica que contiene más de dos capas de lípidos. Por consiguiente, el término "unilamelar" se refiere a una estructura lipidica que contiene dos capas de lipidos, es decir, una sola bicapa lipidica. Generalmente, cuando están presentes en un ambiente acuoso, la porción hidrófila (por ejemplo, grupos de cabeza polares de lipidos) de la mayoría de los lipidos que comprenden una bicapa lipidica se encuentra en la superficie de la estructura (es decir, la cara externa o interna de la bicapa y el porciones hidrófobas (por ejemplo, grupos de hidrocarburos saturados o insaturados) de la mayoría de los lipidos que comprenden una bicapa lipidica se encuentran en el interior de la bicapa.

Tal como se utiliza en la presente, el término "micela" se refiere a cualquier estructura cerrada por una monocapa de lipidos. Generalmente, cuando están presentes en un ambiente acuoso, la porción hidrófila (por ejemplo, grupos de cabeza polares de lipidos) de la mayoría de los lipidos que comprenden una micela se encuentra en la superficie de la estructura y las porciones hidrófobas (por ejemplo, grupos hidrocarburos saturados o insaturados) de la mayoría de los lipidos que comprenden una micela se encuentran en el interior de la estructura. En ciertas modalidades, un liposoma puede estar encapsulado dentro de una micela más grande. Del mismo modo, en ciertas modalidades, una micela puede encapsularse dentro de un liposoma más grande.

Tal como se utiliza en la presente, el término "liposoma manosilado" se refiere a un liposoma que comprende uno o más residuos de mañosa, derivados de mañosa o analógicos de mañosa, asociada con el exterior de la bicapa lipidica. En una modalidad, un liposoma comprende un lipido manosilado conjugado con uno o más residuos de mañosa, derivados o análogos. En una modalidad especifica, el residuo de mañosa, derivado o análogo puede conjugarse a un grupo de cabeza polar u otra estructura de lipidos que generalmente se encuentra en el lado externo de una bicapa lipidica presente en un medio acuoso (por ejemplo, la superficie exterior y/o interna de un liposoma) . Preferiblemente, al menos un porcentaje de los residuos de mañosa, derivados o análogos de los conjugados con un liposoma manosilado estará expuesto al ambiente externo del liposoma y de este modo será accesible para interactuar, por ejemplo, con las células inmunitarias . En una modalidad, un liposoma comprende un lipido mono-manosilado. En una modalidad especifica, el lipido mono-manosilado es manDOG de lipidos (véase, Ponpipom, MM et al, J. Med Chem 1981, 24, 1388; Espuelas et al, B100rg Med Chem Lett 4 de agosto 2003;13(15):2557-60, los contenidos de los cuales se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos). La estructura de un lipido manDOG se proporciona en la Figura 3. En otra modalidad, un liposoma manosilado comprende un lípido de tetramanosil-3-L-lisina-dioleoil glicerol (Espuelas et al . , supra) . Ejemplos de derivados de mañosa no limitativos y análogos incluyen 1-desoximanojirimicina, metil-a-D-manopiranósido, 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), 2-desoxi-2-fluoro-manosa (2-FM), y 2 desoxi-2-cloro-manosa (2-CM), cualquiera de los cuales puede estar conjugado a un lípido.

En ciertas moralidades, al menos el 0.01% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjuga con al menos un residuo de mañosa. En otra modalidad, al menos 0.1% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjuga con al menos un residuo de mañosa. En otra modalidad, al menos 1% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjuga con al menos un residuo de mañosa. En todavía otras modalidades, al menos 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6 %, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjuga con al menos un residuo de mañosa.

Tal como se utiliza en la presente, el término "lípido" se refiere a moléculas hidrófobas o anfifílicas capaces de formar estructuras monocapa o bicapa en un entorno acuoso, por ejemplo, una micela o liposoma. Los lípidos incluyen, sin limitación, grasas, ceras, esteróles, vitaminas solubles en grasa, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y fosfolipidos. Los lipidos usados para formar nanoparticulas, tales como liposomas y micelas, pueden modificarse adicionalmente o conjugarse a una porción diana. Ejemplos de estructuras diana que pueden estar conjugados a lipidos no limitantes incluyen: residuo de azúcar (por ejemplo, mañosa o un carbohidrato que contiene uno o más residuos de mañosa), péptidos (por ejemplo, un ligando de receptor celular), polipéptidos (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo) y ácidos nucleicos (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®).

Tal como se utiliza en la presente, el término "colesterol" se refiere a un alcohol esferoide de origen natural (esterol) que tiene cuatro anillos fusionados, así como sus ésteres con ácidos grasos de cadena larga y análogos de los mismos que conservan la capacidad de modular la fluidez de la membrana. El colesterol y los ésteres de colesterol son componentes de lipoproteínas del plasma y la membrana celular externa de las células animales y tienen la capacidad de modular la fluidez de la membrana. Los análogos del colesterol que retienen la habilidad de modular la fluidez de la membrana son conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, Gimpl, G., et al (1997) Biochemistry 36:10959-10974) e incluyen, por ejemplo, 5-colesteno, 5 pregnen-3 -ol-20-ona, 4-colesten-3-ona y 5-colesten-3-ona. El colesterol y los análogos de colesterol son componentes liposomales comunes que pueden impartir fluidez adicional en una monocapa lipidica o bicapa formando una micela o liposoma.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "enlazado" y "conjugado" se utilizan indistintamente y se refieren a una asociación covalente o no covalente entre dos fracciones, por ejemplo, entre un agente terapéutico y un vector o porción diana. Las vinculaciones formadas entre los dos fracciones, aunque no necesariamente de naturaleza covalente, ayudan a mantener la asociación entre las fracciones. Ejemplos no limitados de vínculos que pueden utilizarse para asociar dos fracciones, por ejemplo, un péptido MBP y una porción diana, incluyen: interacciones covalentes (es decir, un enlace químico covalente formado ya sea directamente entre la primera fracción y la segunda fracción o a través de un molécula de vinculación); interacciones iónicas (por ejemplo, un enlace iónico formado ya sea directamente entre la primera fracción y la segunda fracción o a través de una molécula de vinculación); interacciones electrostáticas (por ejemplo, la atracción de dos cargas opuestas); interacciones hidrófobas; interacciones mantenidas juntas por medio de fuerzas de Van der Waals; y las interacciones mantenidas unidas a través de atrapamiento físico (por ejemplo, encapsulación o incrustación de una molécula de carga dentro de una nanoparticula). En una modalidad, una molécula de carga (por ejemplo, un péptido MBP) encapsulado dentro de un vector (por ejemplo, un liposoma) está enlazado a una porción diana (por ejemplo, un residuo de mañosa) que está atado al exterior del vector.

Tal como se utiliza en la presente, el término "integrado dentro" se refiere a la colocación de una molécula de carga con respecto a un vector, en el que la molécula de carga se encuentra dentro de la matriz de la estructura del vector. Por ejemplo, se dice que un péptido de carga para ser integrado dentro de un vector liposomal o micela cuando el péptido, o una porción del mismo, se encuentra dentro de una bicapa lipídica (liposomas) o monocapa (micela). Las moléculas de carga incrustadas dentro de un vector pueden ser covalente o no covalentemente asociadas con la matriz de vector (por ejemplo, una cubierta polimérica) o una sub-componente de la matriz de vector (por ejemplo, un lípido presente en una bicapa lipídica de un liposoma), por ejemplo, a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacción electrostática, de interacción hidrófoba o atrapamiento físico.

Tal como se utiliza en la presente, el término "encapsulado en" se refiere a la colocación de una molécula de carga con respecto a un vector, en la que la molécula de carga está encerrada o contenida dentro de la parte interior de una estructura de vector. Por ejemplo, se dice que un péptido de carga para ser encapsulado en un vector liposomal cuando el péptido se encuentra dentro de una bicapa lipidica del liposoma, de este modo protegido del ambiente externo al liposoma. Las moléculas de carga encapsuladas en un vector pueden ser covalente o no covalentemente asociadas con el vector (por ejemplo, una cubierta polimérica) o un sub-componente de la matriz de vector (por ejemplo, un lipido presente en una bicapa lipidica de un liposoma), por ejemplo , a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacción electrostática, de interacción hidrófoba o atrapamiento físico.

En ciertas modalidades, el interior de un vector liposomal o micela comprenderá un entorno acuoso. Por consiguiente, una carga hidrófila, tal como un péptido o ácido nucleico, puede estar solvatada parcial o completamente en el interior del vector. En otras modalidades, el interior de un vector liposomal o micela puede comprender un entorno no acuoso, por ejemplo, puede consistir en un disolvente polar. Por consiguiente, una carga hidrófobo, tal como una pequeña molécula no polar, puede estar solvatada parcial o completamente en el interior del vector.

Tal como se utiliza en la presente, el término "atados a" se refiere a la colocación de una molécula de carga con respecto a un vector, en la que la molécula de carga está vinculada a la estructura del vector en uno o más puntos. Atar una molécula de carga se puede hacer de forma covalente (por ejemplo, a través de un enlace químico) o no covalente (por ejemplo, a través de hibridación de ácido nucleico). Las moléculas de carga pueden ser atadas al exterior o interior de un vector (por ejemplo, una cubierta polimérica) o un sub-componente de la matriz de vector (por ejemplo, un lipido presente en una bicapa lipidica de un liposoma). Una molécula de carga amarrada a una estructura de vector en un punto de enlace puede, de lo contrario, ser libre para moverse por el espacio (por ejemplo, solvatada de otra manera por el ambiente externo o interno al vector). Las moléculas de carga atadas a un vector pueden ser covalente o no covalentemente asociadas con el vector (por ejemplo, una cubierta polimérica) o un sub-componente de la matriz de vector (por ejemplo, un lipido presente en una bicapa lipidica de un liposoma), por ejemplo, a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacción electrostática o interacción hidrófoba.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "aptámero", "SPIEGELMER®" y "ligando de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un oligonucleótido de origen no natural (típicamente de 15 a 250 nucleótidos de largo) que se enlaza específicamente a un determinado objetivo. Los aptámeros son ácidos nucleicos que comprenden una estructura secundaria específica que imparte especificidad para una molécula diana (por ejemplo, un marcador de superficie celular o receptor). Los aptámeros pueden comprender además una ternaria específica, y posiblemente cuaternaria, estructura que contribuye aún más a la afinidad entre el ácido nucleico y molécula diana. Cuando está presente en una estructura tridimensional adecuada, un aptámero se enlaza específicamente a un objetivo particular. Los aptámeros abarcan secuencias de ácidos nucleicos naturales (por ejemplo, ¿LA, dT, dC, dG, rA, rU, rC y rG), así como ácidos nucleicos no naturales (por ejemplo, dU, di, rT, rl) y ácidos nucleicos modificados. SPIEGELMERs® son aptámeros formados con ácidos L-nucleicos, en lugar de los ácidos de origen natural D-nucleicos. Los aptámeros y SPIEGELMERs® pueden incluir una mezcla ácidos nucleicos L y D.

Tal como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que es inmunológicamente reactivo con un antigeno particular. El término "inmunoglobulina", como se utiliza en la presente, abarca moléculas intactas de varios isotipos asi como fragmentos con capacidad de enlace al antigeno, por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv y rlgG. Véase, por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.);. Kuby, J., Im unology, 3rd Ed., WH Freeman & Co., Nueva York (1998), cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. El término también abarca fragmentos Fv de cadena única recombinante (scFv). El término abarca además moléculas bivalentes o biespecificas, diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos. Moléculas bivalentes y biespecificas se describen en, por ejemplo, Kostelny et al . (1992) J. Immunol 148:1547; Pack y Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579; Hollinger et al, 1993, Proc Nati Acad Sci EE.UU. A. 1993 15 de julio;90(14):6444-8; Gruber et al, (1994) J. Immunol 5368; Zhu et al, (1997) Protein Sci 6:781; Hu et al , (1996) Cáncer Res 56:3055, cuyo contenido se incorpora a la presente en por referencia en su totalidad para todos los propósitos. El término anticuerpo también abarca, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de inmunoglobulina en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o sustituye de modo que el sitio de enlace del antigeno (región variable) está enlazado a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especies, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco y similares; o (b) la región variable, o una porción del mismo, se ve alterada, sustituida o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad de antigeno diferente o alterada.

Un "anticuerpo humanizado" es una molécula de inmunoglobulina que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, residuos del marco de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en los CDR importados o secuencias de marco. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones del marco (FR) son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988) y Presta, Curr Op Struct Biol 2:593-596 (1992), cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-327 (1988) y Verhocyen et al . , Science 239:1534- 1536 (1988), cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), mediante la sustitución de CDR de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Enlazados. No. 4.816.567, cuyo contenido se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de unas especies no humanas.

Tal como se utiliza en la presente, el término "se enlaza específicamente" se refieren a una molécula (por ejemplo, una porción diana) que se enlaza a una objetivo particular (por ejemplo, un marcador de superficie celular o receptor) con al menos 2 veces mayor afinidad, en comparación con una molécula no diana. En ciertas modalidades, una molécula se enlaza específicamente con al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 5000 veces, 10,000 veces o mayor afinidad, en comparación con una molécula no diana.

Tal como se utiliza en la presente, el término "células inmunitarias" se refiere a células que son de origen hematopoyético y que juegan un papel en la respuesta inmune. Las células inmunitarias incluyen linfocitos, tales como células B y las células T; células asesinas naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos , eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.

Tal como se utiliza en la presente, el término "células B" se refiere a un linfocito producido en la médula ósea de la mayoría de los mamíferos, que funcionan en el sistema inmunitario humoral. Durante las diversas etapas de desarrollo, las células B se conocen como: células B (o pre-pro) progenitor; células B (o pre-pre) pro tempranas; células B (o pre-pre) pro tarde; células pre-B grandes; células pre-B pequeñas; células B inmaduras y células B maduras, cada una de las cuales están abarcadas por el término célula B. Los marcadores fenotípicos de la superficie celular que pueden ser utilizados para diferenciar las células B de otros linfocitos (por ejemplo, células T) incluyen: moléculas MHC de clase II, CD19 y CD21. El término "células B" comprende células plasmáticas B, células de memoria B, células B-l, células B-2, células de la zona marginal B y células B folicular.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "célula presentadora de antígeno" y "APC" se usan indistintamente y se refieren a células presentadoras de antigenos específicos (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans), así como otras células presentadoras de antigeno (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, y oligodendrocitos) Tal como se utiliza en la presente, los términos "marcador de superficie celular", "receptor de superficie celular" y "moléculas de superficie celular" se refieren a una estructura antigénica presente en la superficie de una célula. El antigeno de superficie celular puede ser, pero no está limitado a, un antigeno especifico de célula, un antigeno especifico de la célula inmunitaria, un antigeno especifico de células B, un antigeno especifico de las células presentadoras de antigeno, un antigeno especifico de linfocitos, un antigeno asociado con la esclerosis múltiple, un receptor (por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento), un epitopo de superficie, un antigeno que es reconocido por una célula efectora inmunológica especifica tal como una célula T y un antigeno que es reconocido por una célula efectora inmunológica no especifica tal como una célula macrófago o una célula asesina natural. Ejemplos de "antigenos de superficie celular" incluyen, pero no se limitan a, marcadores fenotipicos de: células NK (por ejemplo, CD16 y CD56); células T auxiliares (por ejemplo, TCRaP, CD3, CD4 y); células T citotóxicas (por ejemplo, TCRap, CD3, y CD8); células gdT (por ejemplo, TCRyS y CD3); y células B (MHC de clase II, CD19 y CD21). Las moléculas de superficie celular también pueden incluir carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas o cualquier otras moléculas presentes en la superficie de una célula de interés.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "proteína básica de la mielina" y "MBP" son indistintamente utilizados y se refieren a una proteína codificada por el gen humano de la proteína básica de la mielina (MBP; NCBI Gene ID: 4155). In vivo, múltiples isoformas de la proteína MBP surgen de corte y empalme alternativo (para revisión, véase, Harauz et al . Biochemistry, (2009) Sep. 1;48 (34):8094-104, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos), cada uno de los cuales está abarcado por el término "proteína básica de la mielina." Un alineamiento de secuencias de siete representativos de MBP se proporciona en la Figura 14. Tal como se usa en la presente, la numeración de aminoácidos de péptidos de MBP se refiere a la secuencia de aminoácido de la isoforma predominante de MBP encontrada en la mielina madura (isoforma de empalme 5; UniProt ID No .: P02686-5), una proteína de 18,5 kDa que consta de 171 aminoácidos (SEC ID NO: 17).

Tal como se utiliza en la presente, los términos "esclerosis múltiple" y "ES" son usados indistintamente y se refiere a una enfermedad inflamatoria en la que las vainas de mielina grasas alrededor de los axones del cerebro y la médula espinal están dañados y/o disminuidos, lo que lleva a la desmielinización y cicatrización, asi como un amplio espectro de signos y síntomas (para revisión, véase, Compston y Coles, Lancet 25 de octubre 2008,372 (9648): 1502-1517, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Varios subtipos de EM se han clasificado, incluyendo remitente recidivante (EMRR), secundaria progresiva (EMSP), primaria progresiva (PPMS) y progresiva con recaídas (EMPR), cada una de las cuales están englobadas en el término esclerosis múltiple.

Tal como se utiliza en el presente, el término "paciente" o "sujeto" se utilizan indistintamente y se refieren a un individuo que necesita o busca el tratamiento. Por ejemplo, un sujeto puede haber sido diagnosticado con o en riesgo de desarrollar la esclerosis múltiple (EM) o un subtipo de la misma. Un paciente con esclerosis múltiple puede referirse a un individuo que ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple y está recibiendo tratamiento para la EM, ha recibido previamente tratamiento para la EM o nunca ha recibido tratamiento para la EM, una persona que está en riesgo de una recaída de la EM o un individuo en riesgo de EM (por ejemplo, un individuo que está predispuesto genéticamente a EM).

Tal como se utiliza en la presente, los términos "terapia", "tratamiento" de la esclerosis múltiple son indistintamente utilizados y se refieren a cualquier paliación o mejora de una condición fisiológica o fisiológica indeseable resultante de EM. Por ejemplo, la reducción en la gravedad o frecuencia de: hipoestesia, parestesia, debilidad muscular, clonus, espasmos musculares, parálisis, ataxia, disartria, disfagia, nistagmo, neuritis óptica (por ejemplo, fosfenos o diplopía), fatiga, dolor agudo o crónico, dificultades de la vejiga e intestinales, deterioro cognitivo, depresión, fenómeno de Uhthoff y signo de Lhermitte. En una modalidad, la Escala Ampliada del Estado de Discapacidad (EDSS) puede utilizarse como una medida de la progresión de la enfermedad y la gravedad en los pacientes con EM (véase, Kurtzke JF, Neurología 1983;33:1444-1452, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente en su totalidad para todos los fines). Por consiguiente, en una modalidad, la terapia se refiere a un acto de mejora de la EDSS de un paciente.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "prevención" y "tratamiento profiláctico" de la esclerosis múltiple son indistintamente utilizados y se refieren a los tratamientos terapéuticos que reducen el riesgo, la gravedad o la aparición de los sintomas clínicos de la EM.

La profilaxis puede ser parcial o completa. Las profilaxis parciales pueden dar lugar a la aparición retardada o progresión demorada de un estado de enfermedad o síntoma en un paciente en riesgo de desarrollar EM o incurrir en recaída de EM. Aunque no se ha identificado un componente genético causante estricto de la EM, varios factores genéticos correlacionados con un aumento del riesgo de desarrollar la esclerosis múltiple se han identificado, incluyendo, sin limitación, los SNP identificados en Hafler DA et al . (N Engl J Med 30 de agosto 2007; 357(9):851-62, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad a todos los propósitos), como rs3135388 (A alelo, gen HLA-DRA), rsl2722489 (alelo C; gen IL2RA), rs2104286 (alelo T; gen IL2RA), rs6897932 (alelo C; gen IL7R), rs6498169 (alelo G; KIAA0350), rs6604026 (alelo C; RPL5), rsl0984447 (alelo A; gen DBC1) , rsl2044852 (alelo C; gen CD58), rs7577363 (alelo A; gen ALK), rs7536563 (alelo A; gen FAM69A), rslll64838 (alelo C; gen FAM69A), rsl0975200 (alelo G; gen ANKRD15), rsl0735781 (alelo G ; gen EVI5), rs6680578 (alelo T; gen EVI5), rs4763655 (alelo A; gen KLRB1), rsl2487066 (alelo T; gen CBLB) y rsl321172 (alelo C; gen PDE4B).

Tal como se utiliza en la presente, los términos "dosis" y "dosificación" son indistintamente utilizados y se refieren a la cantidad de un ingrediente activo administrado en un solo punto de tiempo. En el contexto de la presente invención, una dosis se puede referir a la cantidad de un péptido MBP administrada a un sujeto. Una dosis también puede referirse a la cantidad de una preparación de vector de un péptido MBP administrada a un sujeto, por ejemplo, una preparación liposomal de uno o una combinación de péptidos MBP. La dosificación administrada a un paciente variará dependiendo de un número de factores, incluyendo: la frecuencia de administración, gravedad de la afección (por ejemplo, esclerosis múltiple), subtipo de la enfermedad (por ejemplo, EM remitente-recidivante, EM progresiva secundaria, EM progresiva primaria y progresiva con recaídas), etapa de la enfermedad (por ejemplo, ataque inicial, recaída y remisión), tamaño y tolerancia del sujeto, vía de administración empleada, riesgo de efectos secundarios, riesgo de interacciones farmacológicas adversas, y la respuesta a los tratamientos anteriores, cada uno de los cuales puede ser determinados fácilmente por un médico experto. El término "forma de dosificación" se refiere al formato particular del agente farmacéutico, por ejemplo, una formulación líquida para administración subcutánea o formulación de gel para la liberación controlada a través de un depósito.

Tal como se utiliza en la presente, el término "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente eficaz" son indistintamente utilizados y se refieren a una dosis que produce efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y será comprobable por un experto en la téenica usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Augsburger y Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms (vols 1 a 3, 3a Ed 2008); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (3a Ed, 2008.); Pickar, Dosage Calculations (8a Ed, 2007.) y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Tal como se utiliza en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación adecuada para administración a un sujeto que contiene un agente terapéutico y, opcionalmente, uno o más de los siguientes: un vector, una porción diana, un agente tampón, una sal, un agente de conservación (por ejemplo, un agente antioxidante o anti-microbiano), un agente osmótico, un agente de carga y cualquier otro excipiente o vehículo adecuados para la administración del agente terapéutico a través de una ruta particular de administración.

Tal como se utiliza en la presente, el término "control" se refiere a una muestra, nivel, o el resultado fenotípico que sirve como una referencia para la comparación con un resultado de la prueba, por ejemplo, un beneficio terapéutico alcanzado por un tratamiento particular. El término control abarca ambos controles positivos (por ejemplo, un valor o resultados que se espera para una terapia dada) y controles negativos (por ejemplo, un valor o resultado que se esperarla en la ausencia de tratamiento).

Un control positivo puede referirse a un resultado obtenido por la administración de un agente terapéutico conocido para proporcionar un efecto beneficioso para un estado de enfermedad o síntoma. Por ejemplo, el resultado obtenido por la administración de Copaxona a un sujeto diagnosticado con EM o un modelo animal de EM, puede utilizarse como un control positivo para una terapia experimental de EM. En este sentido, una terapia experimental que da como resultado un resultado similar o mejor, en comparación con el resultado obtenido con la administración de Copaxone, seria considerado un buen candidato para el tratamiento de la EM.

Un control negativo se puede referir a un resultado obtenido en ausencia de tratamiento para una enfermedad o síntoma. Por ejemplo, la administración de agua o vector vacío a un sujeto diagnosticado con EM o un modelo animal de EM, puede utilizarse como un control negativo para una terapia experimental de EM. En este sentido, una terapia experimental que resulta en un resultado similar al obtenido con el control negativo no sería considerado un buen candidato para el tratamiento de la EM. Considerando que, una terapia experimental que da como resultado un mejor resultado, en comparación con el resultado obtenido con el control negativo, sería considerado un buen candidato para el tratamiento de la EM.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "molécula de ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" son indistintamente utilizados y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de cadena sencilla o de cadena doble, y, a menos que se indique específicamente de otro modo, abarcan polinucleótidos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. Se entenderá que cuando una molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de ADN, esto también incluye moléculas de ARN que tienen la secuencia de ARN correspondiente en que "U" (uridina) sustituye "T" (timidina).

Tal como se utiliza en la presente, los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a un polímero de cuatro o más residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. El término "péptido recombinante" se refiere a un péptido que se produce por expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido de una molécula de ADN recombinante.

Tal como se utiliza en la presente, el término "péptido sintético" se refiere a un péptido que se produce por medios químicos, por ejemplo, por la fase líquida o la síntesis de péptidos en fase sólida. Los péptidos sintéticos incluyen polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.

Tal como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren naturalmente y no naturales, incluyendo análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural incluyen los codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, O-fosfoserina, 5-hidroxitriptófano, lantionina. Los aminoácidos de origen natural pueden incluir, por ejemplo, animoácidos D- y L-. Los aminoácidos usados en la presente también pueden incluir aminoácidos no naturales. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, cualquier carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina o metilo sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptidicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por cualquiera de sus comúnmente conocidos símbolos de tres letras o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto con conocimiento ordinario en la téenica reconocerá que las sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones a un ácido nucleico o secuencia de péptido que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora", donde la alteración resulta de la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la téenica. Tales variantes modificadas conservadoramente son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) fenilalanina (F), Tirosina (Y), triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M). Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984).

Tal como se utiliza en la presente, los términos "idéntico" e "identidad" cuando se usa en referencia a dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos, se refieren a los residuos en las secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima. Cuando se utiliza en porcentaje de identidad de secuencia de referencia a un péptido, se reconoce que una o más posiciones de residuos que no son idénticas pueden diferir de lo contrario por una sustitución de aminoácido conservativa, en la que un primer residuo de aminoácido es sustituido por otro aminoácido residuo que tiene propiedades químicas similares, tales como una carga similar o carácter hidrófobo o hidrófilo y, por lo tanto, no cambia sustancialmente las propiedades funcionales del péptido. Donde las secuencias de péptidos difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de la identidad de secuencia puede ser ajustado al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Tal ajuste se puede realizar utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, marcando una sustitución conservativa como un parcial en lugar de una falta de coincidencia completa, aumentando así el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, donde se da un aminoácido idéntico una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora se le da una puntuación de cero, una sustitución conservadora se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras puede calcularse utilizando cualquier algoritmo conocido (véase, por ejemplo, cyers y Miller, Comp Appl . Biol . Sci . 4:11-17, 1988; Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch , J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Nati .

Acad. Sci . , EE.UU. 85:2444 (1988); Higgins y Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp , CABIOS 5:151-153; 1989; Corpet et al, Nucí . Acíds Res . 16:10881 a 10890, 1988; Huang, et al, Comp. Sci . Appl . Biol . 8:155-165, 1992; Pearson et al, Meth . Mol . Biol . , 24:307-331, 1994). La alineación también puede realizarse mediante una inspección visual simple y alineación manual de las secuencias.

Se reconocerá que sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (por ejemplo, menos del 15%, menos del 10%, o menos de 5%) en una secuencia peptidica pueden ser considerados variaciones modificadas de manera conservadora, proporcionado alteración que resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

Las sustituciones de aminoácidos conservativos que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la téenica. Dependiendo de la funcionalidad del aminoácido particular, es decir, catalíticamente importantes, estructuralmente importantes, estéricamente importantes, los diferentes grupos de aminoácidos pueden considerarse sustituciones conservadoras entre sí. La Tabla 1 proporciona agrupaciones de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras basadas en la carga y polaridad del aminoácido, hidrofobicidad del aminoácido, exposición de la superficie/estructura natural del aminoácido y la estructura secundaria de la propensión de aminoácidos .

Tabla 1. Agrupaciones de sustituciones de aminoácidos conservadoras basadas en la funcionalidad del residuo en la proteina.

Dos o más secuencias de aminoácidos o dos o más secuencias de nucleótidos se consideran "sustancialmente idénticas" si las secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos comparten al menos 60% de identidad de secuencia entre si o con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación dada. Por lo tanto, las secuencias sustancialmente idénticas incluyen los que tienen, por ejemplo, al menos 60% de identidad de secuencia, al menos 65% de identidad de secuencia, al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 75% de homología de secuencia, por lo menos 80% de homología de secuencia, por lo menos 85 % de identidad de secuencia, al menos 90% de identidad de secuencia, al menos 95% de identidad de secuencia, o al menos 99% de identidad de secuencia. En ciertas modalidades, las secuencias sustancialmente idénticas tendrán al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. En una modalidad, las secuencias comparten del 60% al 95% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las secuencias comparten del 65% al 90% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las secuencias comparten del 70% al 85% de identidad de secuencia. En aún otras modalidades, las secuencias comparten del 65% al 95% de identidad de secuencia, del 70% a 95% de identidad de secuencia, del 75% a 95% de identidad de secuencia, del 80% a 95% de identidad de secuencia, del 85% a 95% identidad de secuencia o del 90% a 95% de identidad de secuencia.

En ciertas modalidades, dos polipéptidos se considerarán sustancialmente idénticos si comparten secuencias de péptidos de núcleo idénticas o casi idénticas que son eficaces para proporcionar un beneficio terapéutico. Por ejemplo, cuando una primera secuencia de péptidos de núcleo proporciona un beneficio terapéutico, independientemente de la presencia de aminoácidos adicionales localizados corriente arriba (es decir, N-terminal de la secuencia de núcleo) o corriente abajo (es decir, C-terminal de la secuencia de núcleo), un polipéptido que comprende una segunda secuencia de péptido de núcleo que comparte al menos 80% de identidad con la primera secuencia peptidica del núcleo puede considerarse sustancialmente idéntica. Esto es cierto incluso cuando la secuencia polipeptídica completa no comparte identidad de al menos 80% con la secuencia de referencia. Por ejemplo, dos polipéptidos terapéuticos que tienen las secuencias de aminoácidos: (R1)a-PD-(R2)b y '(R3)c-PD-(RD)d, pueden considerarse sustancialmente idénticos si (i) PD y PD son al menos 80% idénticos y (ii) PD y PD son suficientes para proporcionar un beneficio terapéutico a un sujeto en necesidad del mismo, independientemente de las secuencias de aminoácidos de R1, R2, R3 y RD.

En ciertas modalidades, sustancialmente secuencias de péptidos de núcleo idénticas compartirán al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. En una modalidad especifica, las secuencias de péptidos de núcleo compartirán al menos 85% de identidad de secuencia (es decir, de 85% a 100% de identidad). En otra modalidad especifica, las secuencias de péptidos de núcleo compartirán al menos 90% de identidad de secuencia (es decir, de 90% a 100% de identidad). En otra modalidad especifica, las secuencias de péptidos de núcleo compartirán al menos 95% de identidad de secuencia (es decir, de 95% a 100% de identidad). En todavía otra modalidad especifica, las secuencias de péptidos de núcleo compartirán 100% de identidad de secuencia, independientemente de la identidad de secuencia global de dos polipéptidos que se comparan. En una modalidad, las secuencias de péptidos de núcleo comparten de 60% a 95% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las secuencias de péptidos de núcleo comparten de 65% a 90% de identidad de secuencia. En otra modalidad, las secuencias de péptidos de núcleo comparten de 70% a 85% de identidad de secuencia. En aún otras modalidades, las secuencias de péptidos de núcleo comparten de 65% a 95% de identidad de secuencia, de 70% a 95% de identidad de secuencia, de 75% a 95% de identidad de secuencia, de 80% a 95% de identidad de secuencia, de 85% a 95% de identidad de secuencia o de 90% a 95% de identidad de secuencia.

Tal como se utiliza en la presente, el término "ventana de comparación" se refiere a un tramo contiguo de aminoácidos o nucleótidos en la que la secuencia de dos polipéptidos o polinucleótidos son comparados para la identidad de secuencia o similitud. Con respecto a los péptidos terapéuticos, una ventana de comparación puede ser de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos de largo. En una modalidad, una ventana de comparación puede ser de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de largo. En aún otra modalidad, una ventana de comparación puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos de largo. Dependiendo de factores, tales como la longitud de los polipéptidos que se comparan, la ventana de comparación puede ser, por ejemplo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos de longitud. En una modalidad particular, la ventana de comparación es de toda la longitud de una secuencia de aminoácidos de referencia.

La alineación de secuencias puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48: 443, por la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección y la mejor alineación (es decir, que resulta en el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generada por los diversos métodos seleccionados. El algoritmo BLAST es muy adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia (Altschul et al, J Mol. 215:403-410, (1990), cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Varios programas de software que incorporan el algoritmo BLAST están disponibles al público a través del sitio web del Centro Nacional de Información Bioteenológica (NCBI). Estos programas incluyen blastp, blastn, blastx, tblastn, tblastx y programas de software de PSI-BLAST.

III. Péptidos MBP A. Introducción En un aspecto, la presente invención proporciona péptidos (MBP) de proteina básica de mielina útiles para tratar o prevenir la recaída de la esclerosis múltiple (EM). Como se muestra en la Figura 1C, se identificaron dos regiones inmunodominantes de MBP en un modelo de rata DA inducida por EAE de esclerosis múltiple, que se correlaciona con la respuesta inmunológica a MBP en pacientes humanos diagnosticados con esclerosis múltiple de recaída remisión (RRMS): MBP(43-64) y MBP(115-170). Se encontró que los autoanticuerpos IgG policlonales a estas regiones se han generado en el modelo de rata DA inducida por EAE (Figura 2), lo que sugiere que estas regiones contienen epítopos de células B importantes a la patología de la EM. En consecuencia, los péptidos que comprenden parte o la totalidad de estas regiones pueden ser útiles para el tratamiento o prevención de la EM. En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende un epitopo de células B.

En un aspecto de la invención, se proporcionan péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente idénticas a las regiones inmunodominantes identificados de MBP para el tratamiento de la EM. En una modalidad especifica, los péptidos MBP comprenden al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP(115-170) (SEC ID NO:12) se proporcionan para el tratamiento de la EM. Generalmente, un péptido MBP consistirá de 6 a 100 aminoácidos de longitud. En una modalidad, el péptido MBP consistirá de 6 a 50 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, el péptido MBP consistirá de 6 a 25 aminoácidos de longitud. En aún otras modalidades, el péptido MBP constará de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o más aminoácidos. En una modalidad especifica, un péptido MBP consiste de 6 a 40 aminoácidos de longitud.

En una modalidad, un péptido MBP comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En otra modalidad, un péptido MBP comprende al menos 15 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:ll) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En otras modalidades, un péptido MBP comprende al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 aminoácidos consecutivos de MBP(43-64) (SEC ID NO:11) o MBP(115-170) (SEC ID NO:12). En otras modalidades, un péptido MBP comprende al menos 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos de MBP consecutivos (115-170) (SEC ID NO:12). En una modalidad, el péptido MBP está enlazado a un vector, que puede o no incluir una porción diana. En una modalidad especifica, el vector es un liposoma. En una modalidad más especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En otro aspecto, un péptido MBP comprende de 6 a 25 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En otra modalidad, un péptido MBP comprende de 10 a 20 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:ll) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En otra modalidad, un péptido MBP comprende de 6 a 40, o de 6 a 35, o de 6 a 30, o de 6 a 20 aminoácidos consecutivos de MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En aún otras modalidades, un péptido MBP comprende de 6 a 20, o de 6 a 18, o de 6 a 16, o de 6 a 14, o de 6 a 12, o de 6 a 10, o de 6 a 8 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12). En una modalidad, el péptido MBP está ligado a un vector. En una modalidad especifica, el vector es un liposoma. En una modalidad más especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende la secuencia: GGDRGAPKRGSGKDSHH (MBP (46-62); SEC ID NO:l). En una modalidad, MBP (46-62) está ligado a un vector. En una modalidad especifica, el vector es un liposoma. En una modalidad más especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En otra modalidad específica, el péptido MBP comprende la secuencia: GFGYGGRASDYKSAHK (MBP (124-139); SEC ID NO:2). En una modalidad, MBP (124-139) está ligado a un vector. En una modalidad específica, el vector es un liposoma. En una modalidad más específica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En otra modalidad específica, el péptido MBP comprende la secuencia: QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (MBP (147-170); SEC ID N0:3). En una modalidad, MBP (147-170) está ligado a un vector. En una modalidad especifica, el vector es un liposoma. En una modalidad más especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

B. Sustituciones de aminoácidos Los péptidos MBP proporcionados en la presente pueden comprender además uno o más sustituciones de aminoácidos con relación a la secuencia MBP de tipo salvaje (SEC ID NO:17). En una modalidad, la sustitución de aminoácidos es una sustitución conservadora de aminoácidos. Por ejemplo, aminoácidos que tienen hidrofobicidades similares (por ejemplo, Leu e lie) pueden ser sustituidos fácilmente por otros. La Tabla 1 proporciona agrupaciones de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras basadas en la carga y polaridad del aminoácido, la hidrofobicidad del aminoácido, la exposición de la superficie/estructura natural del aminoácido, y la estructura secundaria de la propensión de aminoácidos. En otra modalidad, la sustitución de aminoácido no es una sustitución de aminoácido conservadora.

En una modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de péptido de al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP (115-170) (SEC ID NO: 12). En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de péptido de al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID N0:11) o MBP (115-170 ) (SEC ID NO: 12). En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de péptido de al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:11) o MBP (115-170 ) (SEC ID NO:12). En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con una secuencia de péptido de al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:ll) o MBP (115-170 ) (SEC ID NO:12). En aún otras modalidades, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de péptido de al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID NO:ll) o MBP (115-170) (SEC ID NO:12).

En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID N0:1. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:l. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:l. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:l. En aún otras modalidades, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:l.

En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2. En aún otras modalidades, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:2.

En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3. En otra modalidad, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3. En aún otras modalidades, el péptido MBP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:3.

C. Regiones flanqueantes de péptidos Las células presentadoras de antígeno (APCs), tales como los linfocitos de células B, células dendríticas y macrófagos estimulan una respuesta inmune mediante la internalización, el procesamiento y la presentación de antigenos extraños (por ejemplo, en respuesta a una infección patógena) o autoprocesados (por ejemplo, en una enfermedad autoinmune) para estimular varios tipos de células-T. Sin estar limitado por la teoría, porque los APC son capaces de internalización y el procesamiento de grandes antígenos en péptidos antigénicos más pequeños reconocidos por la maquinaria de las células T, un péptido MBP, que se describen en la presente que contiene al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) o MBP (115-170), puede tener aminoácidos adicionales en los extremos N y C-terminal o, es decir, residuos flanqueantes.

La residuos flanqueantes de MBP pueden incluir regiones flanqueantes naturales presentes en la proteína MBP de tipo salvaje (por ejemplo, aminoácidos N-terminal a residuos MBP 43 y 'll5 y/o aminoácidos C-terminal a residuos MBP 64 y 170) o alternativamente puede comprender una secuencia exógena o al azar. En una modalidad, los extremos N y/o C-terminal de residuos flanqueantes pueden impartir una propiedad beneficiosa para el péptido MBP. Por ejemplo, los residuos flaqueantes de aminoácidos pueden: estabilizar el péptido, dirigir el péptido a una localización intracelular específico o extracelular, mejorar las propiedades del vector de carga del péptido, o mejorar o dirigir el procesamiento del antígeno o presentación en una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula B o APC).

En una modalidad, un péptido MBP comprende además de 1 a 50 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, el péptido MBP comprende además de 1 a 25 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, el péptido MBP comprende además de 1 a 10 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En aún otras modalidades, el péptido MBP comprende además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido.

En una modalidad específica, un péptido MBP que contiene la secuencia: GGDRGAPKRGSGKDSHH (MBP (46-62); SEC ID N0:1) comprende además de 1 a 50 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (46-62) comprende además de 1 a 25 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (46-62) comprende además de 1 a 10 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En aún otras modalidades, una MBP (46-62) péptido comprende además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido.

En una modalidad especifica, un péptido MBP que contiene la secuencia: GFGYGGRASDYKSAHK (MBP (124-139); SEC ID NO:2) comprende además de 1 a 50 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal de el péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (124 a 139) comprende además de 1 a 25 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (124 a 139) comprende además de 1 a 10 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En aún otras modalidades, una (124-139) péptido MBP comprende además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido.

En una modalidad especifica, un péptido MBP que contiene la secuencia: QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (MBP (147— 170); SEC ID N0:3) comprende además de 1 a 50 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (147 a 170) comprende además de 1 a 25 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En otra modalidad, un péptido MBP (147 a 170) comprende además de 1 a 10 aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido. En aún otras modalidades, una (147-170) péptido MBP comprende además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos adicionales en el extremo N y/o C-terminal del péptido.

Un péptido MBP como se dispone en la presente puede ser descrito en términos de una secuencia de péptido del núcleo (Px), una secuencia N-terminal de flanqueo opcional (Rn), y una secuencia C-terminal opcional que flanquea (Re). En ciertas modalidades, el número total de aminoácidos en las porciones Px, RN, y Re de un péptido MBP es menor que 250. En otra modalidad, el número total de aminoácidos es menor que 100. En otra modalidad, el número total de aminoácidos es menor que 50. En aún otras modalidades, el número total de aminoácidos es menor que 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7.

En una modalidad, el número total de aminoácidos es de 6 a 250 En otra modalidad, el número total de aminoácidos es de 6 a 100. En otra modalidad, el número total de aminoácidos es de 6 a 50. En aún otras modalidades, el número total de aminoácidos es de 10 a 250, de 10 a 100, de 10 a 50, de 15 a 250, de 15 a 200, de 15 a 175, de 15 a 150, de 15 a 125, de 15 a 100, de 15 a 90, de 15 a 80, de 15 a 75, de 15 a 70, de 15 a 65, de 15 a 60, de 15 a 55, de 15 a 50, de 15 a 45, de 15 a 40, de 15 a 35, de 15 a 30, de 15 a 25 o de 15 a 20.

En una modalidad, la secuencia del péptido de núcleo (Px) tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o sustancialmente idéntica al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) o MBP (115-170), preferiblemente al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (46-62), MBP (124-139) o MBP (147-170). En modalidades especificas, Px tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 65, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica -a una de las SEC ID NO:1-3.

En una modalidad, Rn y Re son individualmente entre 1 y 250 aminoácidos. En una modalidad particular, la combinación de Rn y Re es entre 1 y 250 aminoácidos. En una modalidad, un péptido MBP tiene tanto una región flanqueante N-terminal (Rn) y una región flanqueante C-terminal (Re). En otra modalidad, el péptido MBP tiene una región de flanqueante N-terminal (Rn), pero no una región flanqueante C-terminal (Re). En otra modalidad, el péptido MBP tiene una región flanqueante C-terminal (Re) pero no una región flanqueante N-terminal (Rn).

D. Síntesis de péptidos Un péptido MBP según la invención puede sintetizarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida que incluye la síntesis de péptidos en fase sólida. Los métodos convencionales de fase sólida para la síntesis de péptidos puede comenzar con anhídridos de aminoácido protegido-N-alfa que se preparan en forma cristalizada o recién preparados en solución, y se utilizan para la adición sucesiva de aminoácidos en el extremo N-terminal. En cada adición de residuos, el péptido en crecimiento (sobre un soporte sólido) es tratado con ácido para eliminar el grupo N-alfa-protector, se lava varias veces para eliminar el ácido residual y para promover la accesibilidad de la estación terminal del péptido al medio de reacción. El péptido se hace reaccionar con un anhídrido simétrico de aminoácido N-protegido activado, y el soporte sólido se lava. En cada paso de adición de residuo, la reacción de adición de aminoácidos puede repetirse para un total de dos o tres reacciones de adición separados, para aumentar el porcentaje de crecimiento de moléculas de péptidos que se hacen reaccionar. Normalmente, de 1 a 2 ciclos de reacción se utilizan para las primeras doce adiciones de residuos, y de 2 a 3 ciclos de reacción para los residuos restantes.

Después de completar las cadenas de péptidos en crecimiento, la resina de péptido protegido se trata con un ácido fuerte tal como ácido fluorhídrico líquido o ácido trifluoroacético para desbloquear y liberar los péptidos del soporte. Para la preparación de un péptido amidado, se selecciona el soporte de resina usado en la síntesis de suministrar una amida C-terminal, después de la escisión del péptido de la resina. Después de la eliminación del ácido fuerte, el péptido puede extraerse en solución de ácido acético 1 M y liofilizarse. El péptido puede aislarse mediante una separación inicial por filtración en gel, para eliminar dímeros de péptidos y polímeros de mayor peso molecular, y también para eliminar las sales no deseadas. El péptido parcialmente purificado puede purificarse adicionalmente mediante cromatografía HPLC preparativa, y la pureza y la identidad del péptido confirmarse por análisis de composición de aminoácidos, espectrometría de masas y mediante HPLC analítico (por ejemplo, en dos sistemas de disolventes diferentes).

Asimismo, los péptidos MBP descritos en la presente pueden ser preparados mediante la expresión en una célula hospedera adecuada, seguido por purificación a partir del cultivo celular. Muchos sistemas son conocidos en la téenica para la expresión de péptidos. Los ejemplos de cepas hospedadoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a: especies fúngicas o por levaduras tales como Aspergíllus , Trichoderma , Saccharomyces , Pichia , Candida y Hansenula ; especies bacterianas tales como Salmonella , Bacillus , Acinetobacter , Rhodococcus , Streptomyces , Escherichia , Pseudomonas , Methylomonas , Methylobacter , Alcaligenes , Synechocystis , Anabaena , Thiobacíllus, Methanobacterium, Klebsiella , Burkholderia , Sphingomonas , Brevibacterium, Corynebacterium , Mycobacterium , Arthrobacter , Nocardía r Actinomyces y Comamonas; células de mamífero tales como líneas de células humanas, líneas de células de hámster, y líneas de células de roedor; y líneas de células de insecto, tales como sistemas de expresión basados en baculovirus.

IV. Vectores de péptido MBP A. Introducción Los péptidos MBP de la presente invención están enlazados a un vector para la administración a un sujeto en necesidad del mismo. La selección de un vector apropiado se basa en muchos factores, tales como: la ruta particular de administración empleada, la dosificación del péptido que se entregará, la frecuencia de dosificación, la eficacia de los tratamientos anteriores, la gravedad de la enfermedad o síntoma que se está tratando y la etapa actual de la enfermedad en el sujeto.

La carga del péptido MBP pueden relacionarse con el vector en un enlace covalente o de forma no covalente. Por ejemplo, el péptido MBP puede asociarse con el vector a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, fuerzas de Van der Waals, incrustado en, atado a, o atrapado físicamente por el vector.

En una modalidad, el vector enlazado al péptido MBP es una nanopartícula. Ejemplos de nanopartículas no limitantes incluyen: liposomas, micelas, micelas de copolímeros de bloque, polímerosomas, niosomas, nanoburbujas lípidos recubiertos, dendrímeros, partículas metálicas (por ejemplo, una partícula de óxido de hierro o partículas de oro), y partículas de sílice. La carga del péptido puede encapsularse dentro de, integrado en, llevado en la superficie de, o conectado al vector de nanoparticulas.

El uso de nanoparticulas para la administración de un agente terapéutico proporciona varias ventajas, en comparación con la administración del agente terapéutico solo. Por ejemplo, las nanoparticulas pueden utilizarse para proteger a los agentes terapéuticos de otro modo lábiles, tales como péptidos o polinucleótidos nativos, desde insulto intracelular y/o extracelular. Las nanoparticulas también pueden funcionar para reducir o eliminar los efectos tóxicos causados por el agente terapéutico. Por lo tanto, dosis más altas de un agente terapéutico potencialmente dañinos o tóxicos pueden ser entregados a través de la formulación de nanoparticulas.

Las nanoparticulas pueden vincularse con agua soluble o polímeros no inmunogénicos de alto peso molecular para aumentar la vida media en suero del liposoma (por ejemplo, véase, Patente de EE.UU. núms. 5.013.556, 5.676.971 y 6.132.763, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua adecuados incluyen: poli (alquilen glicoles) tales como polietilenglicol (PEG), poli (propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (poliol oxietilado ), poli (alcohol olefinico), poli (vinilpirrolidona), poli (hidroxialquilmetacrilamida), poli (metacrilato de hidroxialquilo), poli (sacáridos), poli (-hidroxi ácido), poli (alcohol vinilico), polyphosphasphazene, polioxazolina, poli (N acriloilmorfolina), poli (óxido de alquileno) polímeros, poli (ácido maleico), poli (DL-alanina), polisacáridos, tales como el ácido polisiálico o carboximetilcelulosa, dextrano, almidón o derivados de almidón tales como almidón de hidroxietilo (HES), ácido hialurónico y quitina , poli (met) acrilatos, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

En ciertas modalidades, el vector de péptido MBP está enlazado además a una porción diana. En otras modalidades, el vector ligado al péptido MBP es una porción diana. En una modalidad específica, la porción diana (i) aumenta el suministro de un péptido MBP a una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria), en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana; y/o (ii) aumenta la ingesta de un péptido MBP en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria), en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En una modalidad específica, la fracción se enlaza específicamente a una clase o tipo de células, por ejemplo a las células inmunitarias que comprenden un antígeno de la superficie celular particular.

B. Liposomas En una modalidad especifica, el vector de péptido MBP es un liposoma. El uso de liposomas para la administración de agentes terapéuticos es bien conocido en la téenica (para revisión, véase, Chrai, R. Murará, y Ahmad I. Liposomes (una revisión) Part Two: Drug delivery Systems. BioPharm.15 (1):40,42-43, 9 (2002), cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos). Ejemplos de composiciones de liposomas incluidos en la Patente de EE.UU. No.: 4.983.397, 6.476.068, 5.834.012, 5.756.069, 6.387.397, 5.534.241, 4.789.633, 4.925.661, 6.153.596, 6.057.299, 5.648.478, 6.723.338, y 6,627218; Patente de EE.UU. App. Publicación No.: 2003/0224037, 2004/0022842, 2001/0033860, 2003/0072794, 2003/0082228, 2003/0212031, 2003/0203865, 2004/0142025 y 2004/0071768; Publicaciones de Patente Internacional WO 00/74646, WO 96/13250, WO 98/33481 y; Papahadjopolulos D. et al . (Proc Nati Acad Sci EE.UU. (1991) 88: 11460 a 11464), Alien y Martin (Se in Oncol (2004) 31: 5-15 (supl 13)), y Weissig et al . (Pharm Res (1998) 15: 1552-1556), cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia en su totalidad a todos los efectos.

En algunas modalidades, el liposoma incluye un fosfolipido, por ejemplo, una fosfatidilcolina. El fosfolipido puede ser de origen natural, semisintético o sintético. En algunas modalidades, el fosfolipido es una fosfatidilcolina de origen no natural. En algunas modalidades, el fosfolipido es catiónico. En otras modalidades, el fosfolipido es aniónico. En aún otras modalidades, el fosfolipido es neutral. Fosfolipidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolinas (PC), ácido fosfatidico, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.

En algunas modalidades, el fosfolipido es una fosfatidilcolina. Ejemplos de fosfatidilcolina no limitantes incluyen: colina 2,3-dipalmitoil-sn-glicero-1-fosfatidil; diestearoil fosfatidil colina (DSPC); dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC); dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC); fosfatidilcolina palmitoil oleoil (POPC); fosfatidilcolina de huevo (EPC); y fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC).

En algunas modalidades, el liposoma comprende un lipido catiónico. Como se usa en la presente, los lípidos catiónicos se refieren a moléculas que comprenden al menos uno, y más típicamente dos, cadena de ácido graso y un grupo de cabeza polar cargado positivamente. Lípidos catiónicos típicos tienen ya sea dodecilo (C12) o hexadecilo (cetilo, C16) de cadenas de ácidos grasos, aunque el término " "lliippiiddoo ccaattiióónniiccoo"" también pretende abarcar los lípidos con cadenas de ácidos grasos de otras longitudes. Los ejemplos no limitantes de lipidos catiónicos incluyen: DOTAP (1,2-diacil-3-trimetilamonio propano), DOPE (dioleoil fosfatidiletanolamina), DOTMA ([2,3-bis (oleoil) propil] trimetil anunonium cloruro), DOGS (dioctadecil amido glicil espermina), DODAB (bromuro de dioctadecil diamonio), DODAC (cloruro de dioctadecil diamonio), DOSPA (2,3 dioleoiloxi-N-[esperminacarboxaminoetil]-NN-dimetil-1-propanaminio), DC-Chol (3b [N (N ', N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol, dioleoilo), DOIC (1—[2 (oleoiloxi) etil] -2-oleoil-3-(2-hidroxietil) cloruro de imidazolinio), DOPC (dioleoil fosfatidilcolina) , y DMRIE (dimiristooxipropil dimetil hidroxietil amonio bromuro).

En ciertas modalidades, el liposoma comprende además colesterol, un análogo de colesterol y/o un derivado de colesterol que imparte fluidez adicional a la bicapa lipidica del liposoma. Ejemplos de análogos y derivados de colesterol que se pueden utilizar en los liposomas proporcionados en la presente incluyen 5-oo1q3?bho-3b-o1-20-ona, 4-colesten-3-ona y no limitativos 5-colesten-3-ona. En ciertas modalidades, el colesterol estará presente en un liposoma a una concentración de aproximadamente de 0.01% en moles a aproximadamente 25% en moles. En ciertas modalidades, el colesterol está presente en una concentración de aproximadamente de 0.01% en moles a aproximadamente 10% en moles en el liposoma. En aún otras modalidades, la concentración de colesterol en un liposoma es de aproximadamente de 0.01%, 0.02% en moles, 0.03% en moles, 0.04% en moles, 0.05% en moles, 0.06% en moles, 0.07% en moles, 0.08% en moles, 0.09% en moles, 0.1% en moles, 0.2% en moles, 0.3% en moles, 0.4% en moles, 0.5% en moles, 0.6% en moles, 0.7% en moles, 0.8% en moles, 0.9% en moles, 1% en moles, 2% en moles, 3% en moles, 4% en moles, 5% en moles, 6% en moles, 7% en moles, 8% en moles, 9% en moles, 10% en moles, 11% en moles, 12% en moles, 13% en moles, 14% en moles, 15% en moles, 16% en moles, 17% en moles, 18% en moles, 19% en moles, 20% en moles, 21% en moles, 22% en moles, 23% en moles, 24% en moles, 25% en moles o superior.

En una modalidad particular, el liposoma incluye un lipido ligado a una porción diana. Ejemplos de estructuras dianas que pueden estar enlazados a un lipido utilizado para la formación de un liposoma no limitantes incluyen: residuos de azúcar (por ejemplo, mañosa o un hidrato de carbono que contiene uno o más residuos de mañosa, análogos, o derivados de los mismos); péptidos (por ejemplo, un ligando de receptor celular), polipéptidos (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional de la misma); y ácidos nucleicos (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®).

En una modalidad, el lípido ligado a una porción diana incluye una concentración final de al menos 0.01% del contenido total de lípidos del liposoma. En otra modalidad, la concentración del lípido enlazado a la porción diana en el liposoma es de al menos 0.1% del contenido total de lípidos. En otra modalidad, la concentración del lípido enlazado a la porción diana en el liposoma es de al menos 1% del contenido total de lípidos. En otra modalidad, la concentración del lípido enlazado a la porción diana es de al menos 5%, o al menos 10% del contenido total de lípidos del liposoma. En aún otras modalidades, la concentración del lípido enlazado a la porción diana es aproximadamente 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 25? 30? 35? 40? 45% , 50% , 55% , 60% , 65% , 70% , 75? 80% 85%, 90%, 95 o o. o 100% del contenido total de lípidos del liposoma.

En una modalidad específica, el liposo a comprende un lípido enlazado a uno o más residuos de mañosa (es decir, un liposoma manosilada). Los ejemplos no limitantes de lípidos manosilado incluyen: lípido ManDOG (Espuelas et al, B100rg Med Chem Lett 200304 de agosto; 13 (15):2557-60, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad para todos los fines); lípido de tetramanosil-3-L-lisina-dioleoil glicerol (Espuelas et al , supra . ) ; y fosfatidilinositoles manosilados (Barratt et al (1986) Biochim Biophy Acta, 862:153-164, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos).

En ciertas modalidades, los liposomas descritos en la presente tienen un diámetro medio de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nm. Por ejemplo, el diámetro promedio del liposoma puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 225 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nm, desde aproximadamente 50 a aproximadamente 175 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 225 nm, de aproximadamente 75 a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 nm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 225 nm, de aproximadamente 100 a alrededor de 200 nm. En una modalidad particular, el diámetro promedio del liposoma será de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 200 nm.

Los liposomas pueden realizarse por un número de téenicas bien conocidas en la técnica, incluyendo, extrusión, evaporación de fase inversa, sonicación, agitación, y auto-ensamblaje en solución acuosa (para revisión, véase, Torchilin VP, Weissig V (2003) Liposomes: a practical approach. Practical approach series, Vol 264, 2a edición, Universidad de Oxford, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad a todos los efectos). Además, es bien sabido que los métodos para preparar liposomas también pueden utilizarse para la fabricación de composiciones de cargas encapsuladas de manera liposomal.

Los ejemplos no limitantes de métodos para la preparación de composiciones liposomales se describen en las Publicaciones de Patente Internacional: WO 1999/65465 y WO 2010/052326; Patentes de EE .UU. No.: 7.381.421, 7.604.803, 8.075.896, 7.790.696, 7.384.923, 7.008.791 y publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Nos: 2009/0068254 y 2008/0317838 (los contenidos de los cuales están incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Un esquema ejemplar para formar una composición liposomal de péptido(s) consiste en un método de cinco pasos: paso 1) la formación de capas de lípidos irregulares secas por evaporación del disolvente orgánico (lípidos en cloroformo); paso 2) la rehidratación capas de lípidos secas e irregulares que conducen a la multi-capa de formación de liposomas MLV; paso 3) la generación de liposomas SUV de liposomas MLV, por homogeneización a alta presión; paso 4) la deshidratación, mediante secado por congelación, de una mezcla de liposomas SUV con una mezcla de péptido(s) con el exceso de azúcar; y paso 5) la rehidratación de la mezcla deshidratada de liposomas SUV con la mezcla de péptido(s) con el exceso de azúcar en los liposomas SUV con tamaño de aproximadamente de 100 a 200 nm.

V. Prciones diana A. Introducción Para aumentar su efecto terapéutico, composiciones de péptidos MBP descritas en la presente pueden enlazarse a una porción diana. La porción diana puede ser covalente o no covalentemente a un péptido MBP, por ejemplo, a través de un enlace covalente, enlace iónico, interacción electrostática, de interacción hidrófoba, o atrapamiento físico. En ciertas modalidades, la vinculación puede ser mediada a través de una estructura de enlazador o vector. Ejemplos de estructuras dianas incluyen, sin limitación, un residuo de azúcar (por ejemplo, mañosa o un hidrato de carbono que contiene uno o más residuos de mañosa, análogos, o derivados del mismo), un péptido (por ejemplo, un ligando de receptor celular), un polipéptido (por ejemplo, una anticuerpo o fragmento de la misma funcional), y un ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®).

Cuando se asocia, una porción diana mejora la eficacia de un péptido MBP, en comparación con la eficacia de la carga sola. En una modalidad, una porción diana mejora la entrega del péptido MBP asociada a una ubicación ín vivo o tipo de célula; y/o mejora la absorción del péptido MBP en una célula o localización in vivo. En una modalidad particular, la porción diana mejora la entrega del péptido MBP asociada a una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula B o APC); y/o mejora la absorción del péptido MBP en una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula B o APC).

Cuando se enlaza covalentemente o no covalentemente a uno o más péptido MBP, una porción diana puede: (i) aumentar el suministro de un péptido MBP a una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) por lo menos 10%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana; y/o (ii) aumentar la ingesta de un péptido MBP en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) por al menos 10%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En una modalidad especifica, la célula inmunitaria es una célula B o célula presentadora de antigeno (APC). En una modalidad, la porción diana (i) aumenta el suministro; y/o (ii) aumenta la ingesta de un péptido MBP en una célula en al menos un 25% en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En otra modalidad, la porción diana (i) aumenta el suministro; y/o (ii) aumenta la ingesta de un péptido MBP en una célula en al menos 50%, 75%, o 100%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En aún otra modalidad, la porción diana (i) aumenta el suministro; y/o (ii) aumenta la ingesta de un péptido MBP en una célula, por lo menos 2 veces en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En aún otras modalidades, la porción diana (i) aumenta la entrega; y/o (ii) aumenta la ingesta de un péptido MBP en una célula, por lo menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces o 1.000 veces en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana.

B. Residuos de azúcar En una modalidad, la porción diana comprende una porción de carbohidrato (por ejemplo, un residuo de azúcar). En ciertas modalidades, el residuo de azúcar puede ser un monosacárido, un disacárido, o un polisacárido. El residuo de azúcar puede ser de origen natural, un análogo de un azúcar de origen natural, o un derivado de un azúcar de origen natural. Ejemplos de residuos de azúcar que pueden usarse como porción diana no limitantes incluyen: mañosa, glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, ribosa, galactosamina, glucosamina, ácido siálico, N-acetilglucosamina, sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, celobiosa, trehalosa , kojibiosa, nigerosa, isomaltosa, b, b-trehalosa, OÍ, b-trehalosa, soforosa, laminaribiosa, gentiobiosa, turanosa, maltulosa, palatinosa, gentiobiulose, manobiosa, melibiosa, melibiulose, rutinosa, rutinulose, xilobiosa, análogos de los mismos o derivados de los mismos.

Ejemplos no limitativos de derivados de mañosa y análogos incluyen 1-desoximanojirimicina, metil-aD-manopiranósido, 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), 2-desoxi-2-fluoro-manosa (2-FM) y 2-desoxi-2-cloro-manosa (2-CM), cualquiera de los cuales puede estar conjugado a un lipido.

C. Anticuerpos En otra modalidad, la porción diana comprende un anticuerpo, o fragmento funcional del mismo, como se define en la presente. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza específicamente a un antígeno de superficie celular. En una modalidad específica, el anticuerpo se enlaza específicamente a un antígeno de superficie celular en una célula inmunitaria. En más modalidades específicas, el anticuerpo se enlaza a un antígeno de superficie celular presente en una célula B o célula presentadora de antígeno (APC). En una modalidad particular, el anticuerpo se enlaza específicamente a un receptor de mañosa presente en la superficie de una célula.

Los ejemplos no limitantes de los antígenos de superficie celular que pueden objetivarse mediante un anticuerpo enlazado a un péptido MBP o vector enlazado al mismo incluyen: los marcadores fenotípicos de: Células NK (por ejemplo, CD 16 y CD 56); las células T adyuvantes (por ejemplo, TCRa , CD3, y CD4); las células T citotóxicas (por ejemplo, TCRc<, CD3, y CD8); células T gd (por ejemplo., TCRyó y CD3); y células B (clase II MHC, CD 19, y CD21). Las moléculas de superficie celular pueden también incluir carbohidratos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, o cualquier otra molécula presente en la superficie de una célula de interés.

D. Aptámeros En otra modalidad, la porción diana comprende un aptá ero. En una modalidad, el aptámero específicamente se enlaza a un antigeno de superficie celular. En una modalidad especifica, el aptámero específicamente se enlaza a un antígeno de superficie celular presente en una célula inmunitaria. En una modalidad mas específica, el aptámero se enlaza a un antígeno de superficie celular presente en una célula B o antígeno presente en célula (APC). En una modalidad particular, el aptámero se enlaza específicamente a un receptor de mañosa presente en la superficie de una célula.

Los e-jemplos no limitantes de los antígenos de superficie celular que pueden objetivarse mediante un aptámero enlazado a un péptido MBP o vector enlazado al mismo incluyen: los marcadores fenotípicos de: las células NK (por ejemplo; CD16 y CD 56); las células T adyuvantes (por ejemplo, TCRap, CD3, y CD4); las células T citotóxicas (por ejemplo, TCRap, CD3, y CD8); las células Tgd (por ejemplo., TCRyó y CD3); y las células B (clase II MHC, CD 19, y CD21). Las moléculas de superficie celular también pueden incluir carbohidratos, proteínas, lipoproteínas , glicoproteínas, o cualquier otra molécula presente en la superficie de una célula de interés.

VI. Composiciones terapéuticas.

A. Introducción En un aspecto, la presente invención proporciona una composición terapéutica para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM) que comprende un péptido (MBP) de proteína básica de ielina, como se define en la presente, enlazado a un vector. En una modalidad, el péptido MBP comprende al menos seis aminoácidos consecutivos de MBP (43 a 64)(SEC ID NO:ll) o MBP (115-170)(SEC ID NO:12). Por lo general, el péptido MBP consistirá en 6 a 100 aminoácidos en longitud. En una modalidad el péptido MBP consistirá en 6 a 50 aminoácidos en longitud. En otra modalidad el péptido MBP consistirá en 6 a 25 aminoácidos en longitud. Incluso en otras modalidad el péptido MBP consistirá en aproximadamente en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 , 63 , 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o más aminoácidos. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el vector comprende una porción diana y es un liposoma manosilado.

B. Composiciones de vector En una modalidad, la composición comprende al menos dos péptidos MBP, cada uno de los cuales se enlaza a un vector. En una modalidad, ambos péptidos MBP se enlazan a un solo vector (por ejemplo, encapsulado dentro de un sólo liposoma). En otra modalidad, cada péptido MBP se enlaza a un vector separado(por ejemplo, encapsulados en liposomas separados)y los complejos de vector MBP se mezclan antes de la administración.

En una modalidad, la composición comprende un primer péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:l enlazados a un primer vector y un segundo péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:2 enlazados a un segundo vector. En una modalidad especifica, el primer péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID N0:1 y el segundo péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido SEC ID NO:2. En una modalidad mas especifica, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:l. Y el segundo péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido SEC ID NO:2.

En una modalidad, la composición comprende un primer péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID N0:1 enlazados a un primer vector y un segundo péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:3 enlazados a un segundo vector. En una modalidad especifica, el primer péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID N0:1 y el segundo péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3. En una modalidad mas especifica, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID N0:1 y el segundo péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3.

En una modalidad, la composición comprende un primer péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:2 enlazados a un primer vector y un segundo péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:3 enlazados a un segundo vector. En una modalidad especifica, el primer péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2 y el segundo péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3. En una modalidad mas especifica, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2. Y el segundo péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3.

En una modalidad, la composición comprende al menos 3 péptidos MBP, cada uno esta enlazado a un vector. En una modalidad, todos los 3 péptidos MBP se enlazan a un solo vector (por ejemplo, encapsulados dentro de un solo liposoma). En otra modalidad cada péptido MBP se enlaza a un vector separado (por ejemplo, encapsulados dentro de un solo liposoma separado) y los complejos de vector MBP se mezclan antes de la administración.

En otra modalidad, la composición comprende un primer péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:l. Enlazados a un primer vector, un segundo péptido MBP comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:2. Enlazados a un segundo vector, y un tercer péptido MBP comprende 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID NO:3. Enlazados a un tercer vector. En una modalidad especifica, el primer péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:l, el segundo péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, el tercer péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3. En una modalidad más especifica el primer péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:l. El segundo péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2,y el tercer péptido MBP consiste de la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la composición comprende un péptido MBP como se define en la presente, el péptido enlazado a un vector comprende una porción diana. En una modalidad especifica, el vector comprende una porción diana en incremento: (i) suministro del péptido a una célula inmunitaria; o (ii) ingesta del péptido en una célula inmunitaria, en comparación con un péptido enlazado a un vector en ausencia de una porción diana. En una modalidad especifica, el vector comprende un liposoma. En otra modalidad especifica, la porción diana comprende un lipido manosilado.

En ciertas modalidades de las composiciones escritas en la presente, el vector se enlaza covalentemente o no covalentemente a una porción objetiva. En una modalidad, la porción diana (i) incrementa el suministro de un péptido MBP a una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria), en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP a una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria), en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En una modalidad especifica, la célula es una célula inmunitaria. En una modalidad mas especifica, la célula inmunitaria es una célula de o un célula presentadora de antigeno (APC).

C. Composiciones de vector liposomal.

En modalidades especificas de la invención, las composiciones terapéuticas descritas en la presente comprenden vectores liposomales. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de esclerosis múltiple que comprende un péptido MBP encapsulado liposomalmente. En una modalidad especifica, el liposoma se enlaza a una porción de diana. En una modalidad mas especifica, la porción de diana es un lipido manosilado presente en la bicapa liposomal.

En una modalidad especifica, el liposoma se enlaza a una porción de diana de mañosa, es decir, es un liposoma manosilado. En ciertas modalidades, al menos 0.01% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se 5 conjugaran con al menos un residuo de mañosa. En otra modalidad, al menos 0.1% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjugaran con al menos un residuo de mañosa. En otra modalidad, al menos 1% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjugarán con al 10 menos un residuo de mañosa. Incluso en otras modalidades, al menos 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, t 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 15 80%, 85%, 90%, 95%, ó 100% de los lipidos que comprenden un liposoma manosilado se conjugaran con al menos un residuo de mañosa.

Las composiciones liposomales pueden formularse de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Las formulaciones liposomales pueden comprender uno o mas de: un agente regulador de pH (por ejemplo, regulador de pH de acetato, regulador de pH de fosfato, regulador de pH de citrato, regulador de pH de borato, o regulador de pH de tartrato); un azúcar (por ejemplo, trealosa, maltosa, sacarosa, lactosa, mañosa, dextrosa, o fructosa); un alcohol de azúcar (por ejemplo, sorvitol, maltitol lactitol, manitol, o gliserol); un alcohol (etanol o t-butanol); una sal (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, citrato de sodio, fosfato de sodio, o fosfato de potasio); un antioxidante (por ejemplo, glutatión).

D. Porción diana.

En ciertas modalidades, la porción diana es una porción de azúcar (por ejemplo, mañosa o un carbohidrato que contiene uno o mas residuos de mañosa); un péptido (por ejemplo, un ligando receptor de célula), polipéptido(por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo); o acido nucleico (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®). En una modalidad especifica la porción diana es un residuo de mañosa.

En una modalidad, la porción de diana: (i) incrementa el suministro de un péptido MBP a una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) mediante al menos 10%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria) mediante al menos 10%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En una modalidad especifica, la célula inmunitaria es una célula B o célula presentadora de antigeno (APC). En una modalidad, la porción diana (i) incrementa el suministro; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP en una célula mediante al menos 25% en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. En otra modalidad, la porción diana (i) incrementa el suministro; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP en una célula mediante al menos 50%, 75%, o 100%, en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. Incluso en otra modalidad la-porción diana (i) incrementa el suministro; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP en una célula, mediante al menos 2 veces en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana. Incluso en otras modalidades, la porción diana (i) incrementa el suministro; y/o (ii) incrementa la ingesta de un péptido MBP en una célula, mediante al menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, ó 1000 veces en comparación con un péptido MBP no enlazado a la porción diana.

En un aspecto, la invención proporciona una composición para el tratamiento de esclerosis múltiple que comprende un péptido MBP, como se define en la presente, enlazado de manera covalente a una porción diana (por ejemplo, en donde el vector es una porción diana). En ciertas modalidades, la porción diana se enlaza de manera covalente y directa al péptido MBP. La porción diana puede enlazarse, por ejemplo, en el extremo N- o C-terminal de la proteina MBP en un grupo primario de una lisina, glutamina, o asparagina de cadena lateral, en un grupo hidroxilo de una cadena lateral de serina o trionina, o en un tio libre de una cadena lateral de cisteina. En ciertas modalidades, la porción diana enlazada directamente al péptido MBP en una porción de azúcar (por ejemplo, un residuo de mañosa o un carbohidrato que contiene uno o mas residuos de mañosa, un análogo del mismo o un derivado del mismo), un péptido (por ejemplo, un ligando receptor de células), un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo), un acido nucleico (por ejemplo, un aptámero o Spiegelmer®). En una modalidad especifica, la porción diana en un residuo de mañosa.

E. Terapias de combinación No existe ninguna cura actual para la esclerosis múltiple. Sin embargo, se han aprobado varias modalidades terapéuticas para la administración de los síntomas asociados con la esclerosis múltiple. Estas terapias incluyen: fingolimodo, un modulador receptor 1-fosfato de esfingosina que secuestra los linfocitos en nodos linfáticos, evitando que contribuya a una reacción autoinmunitaria; el interferón b-la y b -Ib, que funciona de manera similar para la reducción en el indice de los relapsos de la esclerosis múltiple, y ralentiza la progresión de discapacidad en pacientes con esclerosis múltiple a través de sus propiedades antiinflamatorias; el acetato de latirámero (copaxona), un inmunomodulador no esteroidal, sin interferón, que es un polímero aleatorio de cuatro aminoácidos predominantes encontrados en MBP glutamina (Glu), lisina (Lys), alanina (Ala), y tirosina (Tyr); mitoxantrona, un inhibidor de topoisomerasa de tipo 2 utilizado para el tratamiento de esclerosis múltipla progresiva secundaria; y natalisoma un anticuerpo monoclonal inmunizado contra la molécula a4-integrina de adhesión celular.

Adicionalmente, el uso de los siguientes tratamientos puede proporcionar algunos beneficios terapéuticos para pacientes diagnosticados con, o que están en riesgo de desarrollar la esclerosis múltiple: (i) administración de acetato glatirámero (GA) que está aprobado para el tratamiento de la remisión o recaída de la esclerosis múltiple (RRMS). El GA es un copolímero aleatorio sintético de Glu, Lys, Ala, Tyr, que induce una población de células T regulatorias Th2 con la capacidad de cruzar los BBB y producir citosinas antiinflamatorias IL-4, IL-6, IL-10, un factor de crecimiento nervioso derivado del cerebro (Aharoni R. et al . , Proc Nati Acad Sci EUA 2003;100:14157-62); (ii) administración de los tan llamados "ligandos de péptidos alterados" (APL) que interactúan con los receptores de célula T (TCR). Los APL transportan porciones enlazantes TCR modificadas (Lúea ME et al . , J Neuroimmunol 2005;160:178-87), mutadas (Katsara M. et al . , J Med Chem 2009;52:214-8), o restringidas (Warren KG et al . , Eur J Neurol 2006;13:887-95) y son capaces de activar parcialmente las células T, intercambiar el fenotipo Thl a Th2, y en algunos casos inducir la anergia de células T. El péptido MBP (82-98), un APL derivado del fragmento encefalitogénico de MBP, muestra una inhibición prometedora de la progresión de la esclerosis múltiple en pacientes con aplotipo HLA-DR2-DR4. Sin embargo, una composición farmacéutica, con base en este péptido fallo en un ensayo químico de fase 3 (Fontoura and Garren, Results Probl Cell Differ 2010;51:259-85). Una mutación doble del péptido MBP (83-99) induce respuestas de IL-4 y antagoniza las respuestas de IFN-gamma (Katsara M. et al . , J Neuroimmunol 2008;200:77-89); (iii) administración de IFNp; (iv) ABC monoclonales como rituximab (anti-CD20) objetivado hacia la células B (Hauser SL et al . , N Engl J Med 2008;358:676-88), daclizumab (anti-CD25, subunidad alpha de receptor IL-2) depleción activada de células T (Rose JW et al . , Ann Neurol 2004;56:864-7) y alemtuzumab (anti-CD52, glicoproteína de función desconocida presentada en linfocitos y monocitos maduros) (Coles A. et al . , Clin Neurol Neurosurg 2004;106:270-4); (v) terapias orales tales como FTY720 en forma fosforilada (inhibidor de receptores acoplados a proteina G asociados con SP1), teriflunomida (inhibidor de proliferación de células T), BG-12 (inductor de citosinas Th2), laquinimod (inhibidor de células T y de tráfico de macrófagos en el sistema nervioso central, disparador de intercambio de Th2/Th3), cladribine (sustrato para cinasa de oxitirina, que interfiere con la reparación del ADN y la muerte de linfocito) (todos revisados en Fontoura y Garren,Results Probl Cell Differ 2010;51:259-85); (vi) inyección de células T inactivadas o vacunación mediante regiones hipervariables de TCR para estimular la contrarregulación especifica de TCR CD8+ células, (vii) tolerancia del sistema inmunitario: inducción de "Tolerancia nasal u oral" mediante el autoantigeno, o vacunación de ADN mediante el plásmido BHT-3009 que codifica las moléculas completas de MBP y dispara la tolerancia significativa de ambas células T y anticuerpos hacia los antigenos de mielina. (viii) la nueva y recientemente propuesta terapia de depleción objetivada de células B especificas (Stepanov AV et al., PLoS One; 6:e20991).

En un aspecto, la presente invención proporciona terapia de combinación para pacientes diagnosticados con o en riesgo de tener esclerosis múltiple. En una modalidad, la terapia comprende la coadministración de una composición peptidica de MBP descrita en la presente y un agente terapéutico identificado previamente, por ejemplo, fingolimod, interferon b-la, interferon b-lb, acetato glitarámero, mitoxantrona, un inhibidor de topoisomerasa tipo II utilizado para el tratamiento de esclerosis múltiple progresiva secundaria, y un antigeno anti-a4-integrina.

En una modalidad, la coadministración comprende la administración simultanea o secuencial de un péptido MBP antigénico enlazado a un vector y el segundo agente terapéutico. En otra modalidad, la coadministración comprende la administración de un primer ciclo terapéutico completo con un primer fármaco, ya sea la composición peptidica MBP o la terapia alternativa, seguido de la administración de un régimen terapéutico completo con otro tratamiento. En esta modalidad, la administración de los dos fármacos no se traslapa por el contrario, las terapias se ciclisan de manera opuesta entre si.

VII. Tratamiento de esclerosis múltiple A. Introducción En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la esclerosis múltiple en un sujeto en necesidad de los mismo mediante la administración de un péptido MBP de epitopo de célula B enlazado a un vector, como se escribe en la presente, al sujeto. En una modalidad especifica, el método comprende administrar un péptido MBP encapsulado liposomalmente que comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica a una de las SEC ID N0S:1 a 3 a un sujeto en necesidad del mismo.

En una modalidad, el método comprende administrar un péptido (MBP) de proteina básica de mielina terapéutico que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de MBP (43-64) (SEC ID N0:11) o MBP (115-170) (SEC ID N0:12) enlazados a un vector (por ejemplo, un liposoma). Por lo general, el péptido MBP consistirá en 6 a 10 aminoácidos en longitud. En una modalidad, el péptido MBP consistirá en 6 a 50 aminoácidos en longitud. En otra modalidad, el péptido MBP consistirá en 6 a 25 aminoácidos en longitud. Incluso en otras modalidades, el péptido MBP consistirá en aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, o más aminoácidos. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica el vector es un liposoma manosilado.

En una modalidad mas especifica, el método comprende administrar un péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la secuencia: GGDRGAPKRGSGKDSHH (MBP(46-62); SEC ID NO:l), enlazada a un vector para un sujeto en necesidad del mismo. En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:l. En una modalidad mas especifica, el péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID N0:1. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En otra modalidad especifica, el método comprende administrar un péptido MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la secuencia: GFGYGGRASDYKSAHK (MBP(124-139); SEC ID NO:2), enlazado a un vector para un sujeto en necesidad del mismo. En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2. En una modalidad mas especifica, el péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2.

En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el liposoma es un liposoma monosilado.

En otra modalidad especifica, el método comprende administrar un MBP que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de la secuencia : QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (MBP(147-170); SEC ID NO:3), enlazado a un vector para un sujeto en necesidad del mismo. En una modalidad especifica, el péptido MBP comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3. En una modalidad especifica, el péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En otra modalidad especifica, el método comprende administrar al menos dos péptidos MBP, cada péptido MBP respectivo comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID N0:1, SEC ID NO:2, o SEC ID NO:3, los péptidos enlazados MBP a un vector. En una modalidad mas especifica, los péptidos MBP cada uno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NOS:1-3. En una modalidad mas especifica, los péptidos MBP cada uno consiste una secuencia de aminoácido seleccionado de SEC ID NOS:1-3. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

Incluso en otra modalidad especifica, el método comprende administrar tres péptidos MBP, cada péptido MBP respectivo comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de SEC ID N0:1, SEC ID NO:2, o SEC ID NO:3, los péptidos enlazados MBP a un vector. En una modalidad mas especifica, los péptidos MBP cada uno comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NOS:1-3. En una modalidad mas especifica, Los péptidos MBP cada uno consiste en una secuencia de aminoácido seleccionado de SEC ID NOS:1-3. En una modalidad, el vector es un liposoma. En una modalidad mas especifica, el liposoma es un liposoma manosilado.

En ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple. En una modalidad, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple de recaída remisión (RRMS). En otra modalidad, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS). En otra modalidad, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS). En otra modalidad, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple de recaída progresiva (PRMS).

En una modalidad, el tratamiento comprende la administración de una composición de péptido MBP durante o inmediatamente después de un ataque sintomático agudo. En una modalidad, el ataque sintomático agudo es un ataque inicial. En otra modalidad, el ataque sintomático es un ataque de relapso. En ciertas modalidades, el sujeto puede coadministrarse con corticoesteroides intravenosos (por ejemplo, metilprednisolona) durante el ataque sintomático agudo. En ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple progresiva primaria, secundaria progresiva o de recaída remisión. En una modalidad, el tratamiento aminorara la severidad del ataque agudo o mejorará uno o más de los síntomas físicos o psicológicos en el sujeto.

En otra modalidad, el tratamiento comprende la administración de una composición de péptido MBP durante un periodo de remisión de la esclerosis múltiple en el sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple secundaria progresiva o de remisión recaída. En una modalidad, el tratamiento evitará el inicio de un ataque agudo, retrasa el inicio de un ataque agudo, aminoramiento de la seguridad de un ataque agudo subsecuente, o mejorará uno o más de los síntomas físicos o psicológicos en el sujeto.

En otra modalidad, el tratamiento comprende la administración de una composición de péptido MBP durante un periodo de declinación progresiva en el sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto ha sido diagnosticado con esclerosis múltiple secundaria progresiva, primaria progresiva, o recaída progresiva. En una modalidad, el tratamiento evitará el inicio de un ataque agudo, el retraso del inicio de un ataque agudo, el aminoramiento de la seguridad de un ataque agudo subsecuente, la reducción de la progresión de la enfermedad, la detención de la progresión de la enfermedad, o la mejora de uno o más de los síntomas físicos o psicológicos en el sujeto.

Incluso en otra modalidad, el tratamiento comprende la administración de una composición peptidica MBP a un sujeto diagnosticado con un riesgo incrementado de desarrollar esclerosis múltiple. En ciertas modalidades, el sujeto tendrá uno o más factores de riesgo de esclerosis múltiple, incluyendo sin limitación: un historial familiar con esclerosis múltiple, la presencia, sobrerregulación, o subrregulación de un biomarcador de enfermedad (por ejemplo, interleucina-6, oxido nítrico y sintasa de oxido nítrico, osteopontina, fetuin-A, y anticuerpos anti-MBP), y un marcador genético de la esclerosis múltiple. En ciertas modalidades, la administración profiláctica de una composición peptidica MBP a un sujeto en necesidad de la misma evitara la enfermedad, el retraso del inicio de la enfermedad, evitará un ataque agudo inicial, el retraso del inicio de un ataque agudo inicial, la aminoración de la severidad de la enfermedad, o la aminoración de la severidad de un ataque agudo inicial.

En ciertas modalidades, el sujeto habrá sido tratado previamente para la esclerosis múltiple. En otras modalidades, el sujeto no habrá recibido tratamiento previo para la esclerosis múltiple.

B. Administración Las composiciones peptídicas MBP de la presente invención pueden administrarse de conformidad con cualquier via de administración conocida, por ejemplo, tópica, entérica, parenteral, intravenosa, subcutánea, subdermal, intramuscular, intraperitoneal, por inhalación, epidural, por cánula (por ejemplo, intravenosa, nasal, oral, o cánula intercraneal), la administración directamente al sistema nervioso central, o cualquier otra via similar de administración. La via de administración elegida, para un tratamiento terapéutico particular dependerá, por ejemplo, de la composición farmacéutica, la dosificación del agente terapéutico que se va a administrar, el estado de la enfermedad que se va a tratar; los resultados proporcionados por ensayos clínicos tales como la eficacia de una formulación particular y el perfil de seguridad para una formulación particular, y el cumplimiento esperado del paciente. En una modalidad especifica, la composición peptídica MBP se administra subcutáneamente.

En ciertas modalidades, una composición peptídica de MBP se administra de tal manera que la composición se suministra o acumula en el sistema nervio central. En una modalidad, la composición se administra directamente al sistema nervioso central (SNC), por ejemplo, mediante epidural espinal, administración intranasal (para revisión ver, Liu X., Expert Opin Drug Deliv.2011 Dec; 8(12):1681-90 y Wen MM., Discov Med. 2011 Jun; 11(61):497-503, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos), o el implemento de un sistema de suministro de fármaco (para revisión ver, Tresco y Winslow, Crit Rev Biomed Eng.2011;39 (1):29-44, cuyo contenido se incorpora a la presente mediante referencia en su totalidad, para todos los propósitos).

Debido a que la administración directa de la terapia para el sistema nervioso central presenta muchos desafios, incluyendo en riesgo de infecciones potencialmente letales la composición también puede administrarse de manera externa al sistema nervioso central. Las terapias suministradas de esta manera deben pasar a través de una barrera sanguínea del cerebro (BBB) para entrar al sistema nervioso central. Muchas estrategias han sido propuestas para mejorar el pasaje de las terapias a través de la barrera sanguínea cerebral (ver, Hossain S et al . Curr Drug Deliv. 2010 Dec; 7(5):389-97, cuyo contenido se incorpora mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos). Por ejemplo, el uso de sistemas de vector que despliegan ligandos de receptor BBB, péptidos, o anticuerpos específicos para la BBB en su superficie (para revisión ver, Costantino L., Future Med Chem. 2010 Nov; 2(11):1681-701 y Craparo et al., CNS Neurosci Ther. 2011 Dec; 17(6):670-7, cuyos contenidos se incorporan en la parte presente mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos) un péptido quimérico que comprende un péptido MBP fusionado a un vector de transporte de BBB tal como un péptido endógeno, proteina modificada, o anticuerpo monoclonal péptido mimético (MAb) que se somete a RMT a través de la BBB en sistemas de receptor endocraneal endógeno (ver, Pardridge, W.M., Mol. Interv., 2003, 3(2), 90-105, cuyos contenidos se incorporan mediante referencia en su totalidad para todos los propósitos). En una modalidad, el tratamiento comprende administración peptidica por ejemplo, una vez al mes, dos veces al mes, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cualquier otro dia, todos los dias, o dos veces al dia, durante un periodo de tiempo dado. Dependiendo del régimen terapéutico y estado de la enfermedad del paciente, un ciclo del tratamiento puede continuar durante al menos un mes, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Cuando sea adecuado, el ciclo de tratamiento puede continuar al menos un año, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más años. El efecto del tratamiento en el paciente puede monitorearse y ajustarse como sea necesario, por ejemplo, para mejorar la eficacia o reducir los efectos laterales, mediante un médico experto.

La dosis administrada a un paciente variará dependiendo del número de factores, incluyendo: la frecuencia de administración, la severidad de la condición (por ejemplo, esclerosis múltiple); el subtipo de la condición (por ejemplo, esclerosis múltiple de recaída remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria, y esclerosis múltiple de recaída progresiva); la etapa de la condición (por ejemplo, ataque inicial, remisión y recaída); el tamaño y la tolerancia del sujeto; la vía de administración empleada; el riesgo de los efectos laterales; el riesgo de interacciones de fármaco adversas; y la respuesta a tratamientos anteriores, cada uno de los cuales puede ser determinada fácilmente por un medico experto.

Como se discute arriba, muchos factores contribuirán a lo que constituye una dosificación adecuada, incluyendo la frecuencia de administración. En una modalidad, una composición peptídica de MBP que se proporciona en la presente puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg. En otras modalidades, la dosis puede ser de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg. En otra modalidad, la dosis puede ser de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. En otra modalidad, la dosis puede ser de aproximadamente 0.25 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En otra modalidad, la dosis puede ser de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Incluso en otra modalidad, la dosis puede ser de aproximadamente, 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg. Incluso en otras modalidades, la dosis puede ser de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg, 0 desde aproximadamente 200 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg. En una modalidad, la dosis se administra diariamente. En otra modalidad, la dosis se administra cualquier otro dia, cada tercer día, cada cuatro dias, cada cinco dias, cada seis dias, o cada siete dias. En una modalidad, la dosis se administra una vez a la semana. En otra modalidad, la dosis se administra una vez cada dos semanas. En otras modalidades, la dosis se administra tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, onceaba, o doceava semana.

VIII. Ejemplos Ejemplo 1- Preparación de liposomas que contienen péptidos MBP mediante sonicacion . 45 g de una mezcla de fosfolipidos que contiene una parte en peso de lipido DOG manosilado (ManDOG) y 99 partes en peso de 2,3-dipalmitoil-sn-glicero-1-fosfatidil colina se disolvió en 450 i de cloroformo se coloco en un frasco evaporador de vacio de 1 L. El cloroformo se evaporó bajo vacío para formar una película de lípido en las paredes del frasco. Después de la evaporación, el frasco se llenó con gas nitrógeno, y 800 mL de agua para inyecciones (WFI) se introdujo lentamente en el mismo. El frasco se colocó en un baño ultrasónico durante 30 minutos para afectar los liposomas preformados. Los liposomas reformados después de sonicación, que resultaron en una emulsión acuosa de liposomas. 0.75 g de una mezcla peptídica de MBP que contiene GGDRGAPKRGSGKDSHH (SEC ID NO:l; MBP1), GFGYGGRASDYKSAHK (SEC ID NO:2; MBP2), y QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (SEC ID NO:3; MBP3) y exceso de lactosa (la lactosa a una proporción lipídica de 3:1) en cantidades iguales luego se disolvió en 40 i de agua para inyecciones. La emulsión de liposoma se añadió a la solución peptídica de MBP, y la mezcla se agitó durante 30 minutos, resultando en una emulsión de liposomas con tamaños de entre 100 nm y 200 nm y en péptidos MBP no encapsulados. La emulsión resultante de los liposomas monolamelares luego se liofilizó.

El siguiente paso fue la rehidratación bajo condiciones controladas seguido de el lavado de los liposomas SUV resultante mediante centrifugación para remover materiales no incorporados. Las perlas lavadas se volvieron a suspender en PBS al volumen de dosis requerido.

La incorporación de péptido se estimo en la base de HPLC de fase inversa utilizando la gradiente lineal de acetonitrilo aplicada en una columna C18. El diámetro de promedio zeta y el potencial zeta de liposoma se midió en un zetasizer ZetaPlus Brookhaven a 25°C mediante dilución de 20 ml de dispersión al volumen requerido con PBC o medios apropiados. Los liposomas de control sin péptidos (vehículo) y los liposomas que carecen de lípidos monosilados se obtuvieron de manera idéntica aecepcion de la adipcion de los péptidos MBP y ManDOG respectivamente.

Ejemplo 2- Preparación de liposomas que contienen péptidos MBP mediante desintegración. 45 g de una mezcla de fosfolípidos que contiene una parte en peso de lípido DOG manosilado (ManDOG) y 99 partes en peso de 2,3-dipalmitoil-sn-glicero-1-fosfatidil colina se disolvió en 450 mi de cloroformo se colocaron en un frasco evaporador de vacío de 1 L. El cloroformo se evaporó bajo vacío para formar una película de lípido en las paredes del frasco. Después de la evaporación, el frasco se llenó con gas nitrógeno, y 800 mi de agua para inyecciones se introdujo lentamente en el mismo. La mezcla resultante se transfirió a un receptor desintegrador de fluidos y la presión de volumen de golpe del desintegrador se estableció a 150 MPa. 100 mi. de la mezcla se añadieron al siguiente desintegrador por carga, y la emulsión liposomal resultante se recolectó del receptor desintegrador. 0.75 g de una mezcla peptidica de MBP que contiene GGDRGAPKRGSGKDSHH (SEC ID NO:l; MBP1) , GFGYGGRASDYKSAHK (SEC ID NO:2; MBP2), y QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR (SEC ID NO:3; MBP3) y exceso de lactosa (lactosa a lipido en una proporción de 3:1) en cantidades iguales luego se disolvió en 40 l de agua para inyecciones. La emulsión de liposoma se añadió a la solución peptidica MBP, y la mezcla se agitó durante 30 minutos, resultando en una emulsión de liposomas con tamaños de entre 100 nm y 200 nm y péptidos MBP no encapsulados. La emulsión resultante de liposomas monolamelares luego se liofilizó.

El siguiente paso fue la rehidratación bajo condiciones controladas seguido de el lavado de los liposomas SUV resultante mediante centrifugación para remover materiales no incorporados. Las perlas lavadas se volvieron a suspender en PBS al volumen de dosis requerido. La incorporación peptidica se estimó en la base de HPLC de fase inversa utilizando una gradiente lineal de acetonitrilo aplicada en una columna C18. El diámetro de promedio zeta y el potencial zeta de liposoma se midió en un zetasizer Brookhaven ZetaPlus a 25°C mediante dilución de 20 icrolitros de la dispersión al volumen requerido con PBC o medios apropiados. Los liposomas de control sin péptidos (vehículo) y los liposomas que carecen de lípidos manosilados se obtuvieron de manera idéntica a excepción de la adición de los péptidos MBP y ManDOG respectivamente.

Ejemplo 3- Formulación acuosa de liposomas que contienen péptidos MBP 100 mi de solución salina de fosfato regulada en pH (FBR), se añadieron a 1000 mg de liposomas de péptido MBP liofilizados, preparados como se describe en el ejemplo 1, bajo condiciones estériles y de agitación. El Beta caroteno se añadió luego a la composición a una concentración final de 0.01%, como un antioxidante. La composición de liposoma luego se suministró en contenedores de vidrio clase 1 hidrolítico bajo condiciones estériles y a una atmosfera de nitrógeno. Los contenedores luego se sellaron con tapas de goma y se cubrieron con tapas de aluminio.

Ejemplo 4- Formulación liofilizada de liposomas que contienen péptidos MBP A 1000 mi de liposomas de péptido MBP liofilizados, preparados como se describe en el ejemplo 1, 2 mi de alfa tocoferol se añadieron bajo condiciones estériles. 100 mi de las mezcla seca resultante se suministraron en contenedores de vidrio clase 1 hidrolíticos bajo condiciones estériles y a una atmosfera de nitrógeno. Los contenedores luego se sellaron con tapones de goma y se cubrieron con tapas de aluminio. Antes del uso, la mezcla liposomal de MBP seca se reconstituyó con 1-2 mi de WFI por contenedor y se agitaron durante 1 a 2 minutos para formar una emulsión de liposoma homogénea.

Ejemplo 5- Tratamiento de EAE en Ratas con péptidos MBP encapsulados Upo soma lmente Para inducir la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en ratas DA que tienen una masa de 220- 250 g (12-14 meses de edad), 10 mg de fragmento de péptido encefalogénico de proteina básica de mielina ARTTHYGSLPQKSQRSQ (SEC ID NO:4; Anaspec, EUA) emulsificado en adyuvante completo de Freund's (Difeo, EUA) a una concentración de 10% (m/v) se inyectaron subdermalmente en las uñas. La ratas luego se pesaron y monitorearon para ver los síntomas neurológicos de EAE diariamente. El perfil sintomático del EAE de cada rata se clasificó de acuerdo con la escala siguiente: (0) - ausencia de sintomas de EAE; (1) - reducción en la tonicidad de la cola; (2) disminución en los reflejos derechos; (3) - paresis; (4) -parálisis completa; (5) - agonía o muerte. Los síntomas intermediarios luego se clasificaron mediante el incremento o disminución del valor a 0.5 unidades. Seis días después de la inducción del EAE, los animales se distribuyeron de manera aleatoria en varios grupos (12 animales en cada uno) .

Entre los días 6 y 11 después de la inducción, las ratas en cada grupo respectivo fueron inyectadas subdermalmente con la preparación liposomal descrita en el ejemplo 2 (emulsificada en solución salina de fosfato, ph 7.4), una preparación de control positiva de acetato de glatirámero (GA; copaxona, Teva Pharmaceutical Industries Ltd, Israel), un péptido prototipo; DENPVVIIFFKNIVTPRT (SEC ID NO:5), o una solución salina de fosfato regulada con ph (pH 7.4) placebo. El péptido, acetato de glatirámero, y las presiones liposomales se formularon inmediatamente antes de la administración utilizando solución salina de fosfato regulada por pH (pH 7.4). 0.1 mL de cada composición se administraron diariamente a una concentración de 150 mg por animal. Los resultados de la prueba se presentan en la Tabla 2: Tabla 2. El efecto de prototipo, los liposomas descritos, el placebo y el acetato de glatirámero en la enfermedad EAE en curso en ratas de línea DA.

Como se muestra en la Tabla 2, la administración de la composición liposomal peptidica MBP proporcionó gran beneficio terapéutico significativo al reducir la intensidad y el indice de progresión de EAE en las ratas DA, en comparación con la administración ya sea del péptido prototipo o de las composiciones de acetato de glatirámero (comparar el promedio de los puntajes de EAE en el día 20).

Ejemplo 6 - Tratamiento de un sujeto femenino humano diagnosticado con esclerosis múltiple , con péptidos MBP encapsulados Upo soma lmente .

Una paciente femenina (30 años de edad) diagnosticada con esclerosis múltiple (forma cerebro espinal, curso progresivo, fue tratada previamente con corticoesteroides, beta interferón y acetato de glatirámero, cada uno de los cuales probo ser inefectivo, debido que su déficit neurológico y su incapacidad cognitiva continuó en progreso. Los niveles de suero de los anticuerpos MBP en el sujeto fueron determinados como de 107 unidades por mi y el indice de simulación de linfocitos T del paciente (SI) se midió a 6.5.

Con consentimiento adecuado, la composición tripeptidica MBP liposomal preparada como se describe en el ejemplo 3, se administró subdermalmente a una dosis de 200 mi por semana durante seis meses. Durante el curso del tratamiento, la regresión del déficit neurológico del paciente a 1.5 unidades (escala EDSS) se observó. Los niveles de suero de los anticuerpos lgG anti MBP se redujeron a niveles no detectadles. Y el SI de los linfocitos T se midió después de 6 meses a 2.

Estos resultados demostraron que la esclerosis múltiple puede ser tratada efectivamente en humanos mediante la administración de composiciones peptidicas MBP liposomales descritas en la presente.

Ejemplo 7 - Tratamiento de un sujeto humano masculino diagnosticado con esclerosis múl tiple con peptidos MBP encapsulados liposomalmente Un paciente masculino (37 años de edad) diagnosticado con esclerosis múltiple (forma cerebro espinal, cursos de recaídas), en la etapa de recaída, se sometió previamente a tratamiento corticoesteroide repetido. El paciente presento síntomas de esclerosis múltiple durante tres años. Desde el momento del tratamiento, el paciente presentó: nistagmus lateral cuando volteaba a la derecha, reflejo de tendón activo, S < D en las piernas, reflejo abdominal superior activo, reflejo abdominal inferior y medio ausente, síntoma de Babinski's bilateral, clonus de los pies (mas presente en el pie derecho), no tenia paresis en las extremidades, no cambió la tonicidad muscular, marcha atáxica, pérdida de balance en la estancia Romberg, ataxia cuando realizó la prueba talón-rodilla, y retención de orina. El valor del déficit neurológico del paciente en la escala EDSS fue de seis.

El paciente también presentó palidecimiento oftálmico de los medios temporales de las cabezas del nervio optimo. Después de estudiar el PBMC, del paciente, la actividad de los linfocitos T con respecto a MBP se determinó a un índice de estimulación (SI) de 7.45. Los niveles T anticuerpos LGG de suero fueron de 75 unidades por mi.

Con el consentimiento del paciente, la composición peptídica prototipo se administró una vez cada dos semanas a una dosis de 500 mi. Siete dias después da cada inyección, la sangre (venosa) periférica del paciente se mostró con el fin de determinar los cambios en la actividad de linfocitos T con respecto a MBP, asi como los niveles de autoanticuerpo. Durante el curso de las siete semanas, la presentación clínica del paciente de la esclerosis múltiple progresó ligeramente. En la semana cuatro, el nivel de autoanticuerpos de lgG incremento a 112 unidades por mi, y se duplicó el SI de células T.

Después del curso inicial del tratamiento con el péptido prototipo, el paciente autorizó el tratamiento con la composición tripeptídica MBP liposomal descrita arriba. Al paciente se le administraron 100 mi de la composición una vez cada dos semanas durante doce semanas (seis inyecciones totales).

A las tres semanas en el régimen de tratamiento tripeptídico MBP liposomal, empezaron a aparecer las señales de remisión. En la semana ocho, el nivel de autoanticuerpos, lgG del paciente había caído a 25 unidades por mililitros y el SI de células T era de tres veces menor que el nivel medido antes del tratamiento. Clínicamente, la uresis del paciente y la marcha se normalizaron, podía mantener el balance en la estancia Romberg, paso fácilmente la prueba de talón-rodilla, y su valor de déficit neurológico, en la escala de EDSS cayó a 5.

Estos resultados demostraron que la esclerosis múltiple puede ser tratada efectivamente en humanos mediante la administración de composiciones peptídicas MBP de liposomales descritas en la presente.

Ejemplo 8 - Identificación de un modelo de roedores relevante para la esclerosis múltiple La EAE puede inducirse en muchas especies, mediante inmunización por antigenos de mielina, ya que sirve como modelo para la esclerosis múltiple. Estos modelos de esclerosis múltiple, aunque se usan en muchos estudios, no son completamente relevantes para la enfermedad de esclerosis múltiple. Por ejemplo, una cantidad de estudios que muestran eficacia de una terapia para la esclerosis múltiple propuesta en un modelo de animal EAE falló al traducirse en un efecto benéfico, e incluso causar exacerbación, después del tratamiento, de un paciente con esclerosis múltiple humano (Hohlfeld y Wekerle, Proc Nati Acad Sci EUA 2004;101:14599-606). Por lo tanto, una examinación cuidadosa de los modelos de roedor EAE se realizo para identificar un sistema que coincidiera mas cercanamente con los espectros de los autoanticuerpos MBP (autoAb) presentes en los pacientes con esclerosis múltiple.

Una librería de epítopo de MBP que representa fragmentos de su neuroantígeno fusionado con la proteina portadora de tiorredoxina se preparó previamente (Belogurov AA et al . , J Immunol 2008;180:1258-67, cuyo contenido se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Se reporto que el patrón de enlace autoAb a la librería de epítopo MBP puede ser visto como una firma molecular, o una toma de la célula B patogénica como respuesta de esclerosis múltiple. Para identificar el modelo de roedor más relevante para la esclerosis múltiple, el EAE se indujo tres sepas de roedores: ratones SJL y C57BL/6 y ratas DA (Figura IB). La librería de epítopo MBP se probó mediante hibridación, con anti MBP y anti-c-myc mAb (Figura 1A) para determinar el patrón de enlace autoanticuerpo anti-MBP de los modelos de roedor inducidos EAE. Este patrón de enlace luego se comparó con el patrón de enlace autoarticuerpo anti-MBP determinado para doce pacientes humanos con esclerosis múltiple.

Todos los estudios de animales se llevaron acabo en instalaciones para animales del Centro Médico de Assaf Harofeh (Zerifin, Israel) que usan practicas aprobadas estándar para el cuidado animal. La inducción de EAE se realizó en 8 a 9 semanas en ratas hembra (DA) Dark Agouti. En resumen, las ratas se inyectaron intradermalmente en la base de la cola con un volumen total de 200 ml de inoculo, que contiene 50 ml de MBP de (63 -81) (ANASPEC), en solución salina mezclada (1:1) con CFA, (adyuvante de Freund's incompleto (IFA), sigma), y un miligramo MT (zeta H37 RA; Difeo Laboratories, Detroit, MI). Los animales desarrollaron síntomas de esclerosis múltiple y se incluyeron en el estudio. Las ratas fueron tratadas con formulaciones de liposomas de diferentes (tabla 3), copaxona, o placebo (vehículo) bajo condiciones similares durante 6 días. Todas las formulaciones se administraron mediante una inyección subcutánea por día. Se hizo un seguimiento a los animales hasta el día 28 después de la inducción de EAE. La clasificación de los signos clínicos se desarrolló diariamente durante todos los periodos de estudio. La grabación de la clasificación fue la siguiente: 0 - Normal 1 - debilidad en cola, 2 - debilidad en pierna trasera o parálisis, 3 - parálisis de pierna trasera, arrastre de las piernas traseras, 4 - parálisis completa, incapaz de moverse, 5 - muerte.

Los ratones SJL hembra SPF, de seis a ocho semanas de edad, se inmunizaron de acuerdo con el protocolo establecido (Coligan JE, Current protocols in immunology. [New York]: Wilcy, 1996, p. Suppl.19, Unidad 5.1 & Suppl. 21, Unidad 2.8) con MBP bovinos inyectados con 50 mg en adyuvante de Freund's completo que contiene 2 mg/ml de M. tuberculosis. Los ratones C57BL/6 hembra SPF, de 6 a 8 semanas de edad se inmunizaron de acuerdo con el protocolo establecido (Oliver AR et al . , J Immunol 2003;171:462-8) con dominio extracelular recombinante de MOG inyectado a 100 mi por ratón en adyuvante de Freund's completo que contiene 0.5 mg/ml de M. tuberculosis. Entre 14 y 28 dias después de una segunda inmunización, los ratones con síntomas clínicos pronunciados se les hizo la eutanasia y se recolecto sus sueros para análisis. 100 mi de muestras de sangre de 12 pacientes, con esclerosis múltiple de recaída remisión se obtuvieron del Centro de Esclerosis Múltiple de Moscú en el Hospital de la Ciudad #11. Los pacientes con esclerosis múltiple fueron de entre 23 y 61 años de edad (32.2 años en promedio). Su escala de discapacidad expandida (EDSS) se clasificaron de 0 a 4 (2.0 en promedio). El EDSS se clasificó en una escala de 0 a 10, con puntajes mayores que indicaban mayor discapacidad. Ninguno de los pacientes había recibido tratamiento con corticoesteroides durante al menos un mes antes de que las muestras sanguíneas fueran tomadas (JF, Neurology 1983;33:1444-52). Todos los pacientes firmaron el consentimiento de información de acuerdo con las regulaciones del Ministerio de Salud de la Federación Rusa, aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Ciudad #11.

Para determinar los patrones de enlace de autoanticuerpo anti-MBP en los sueros de roedores inducidos con EAE y los pacientes con esclerosis múltiple humanos, los experimentos con ELISA se realizaron de la manera siguiente. Se revistieron placas de microtitulación (MaxiSorp-Nunc) con 50 ml de una solución 10 mg/ml o péptidos MBP recombinantes en 100 mM de carbonato/bicarbonato regulado a pH de 9.0, en pocilios de columna ^.mpar. Las placas se sellaron con el sellador de placas ELISA (Costar) se encubaron a 4°C durante la noche y luego se lavaron (300 ml/pocillo) tres veces con solución salina regulada en pH de fosfato (PBS) gue contiene 0.15% de Tween-20. Todos los posillos luego se bloquearon con 250 m? de 2% de alúmina de suero bovino (BSA) (Sigma) en regulador de ph de carbonato, bicarbonato de 9.0 y se encubaron durante una hora a 37°C. Luego se lavaron las placas con PBS que contiene 0.15% de Tween-20. Los anticuerpos del suero se diluyeron en PBS que contiene 0.15% de Tween-20 y 0.5% de BSA al final de la dilución de 1:1000-1:50000, y 50 m? de la muestra diluida se añadieron a cada posillo de la placa. El anticuerpo monoclonal MBP de ratas (ab7349, Abcam) se uso como control. Las placas se encubaron durante una hora a 37°C, se lavaron tres veces con PBS de 0.15% de Tween-20. A cada posillo, 50 m? de conjugado de anti-rata lgG, anti-orificio de cabra a peroxidasa de rábano picante (A9037, Sigma) se diluyeron 1:4000, se añadieron en regulador de pH se incubaron durante una 1 hr a 37°C. Después de cinco lavados con PBS 0.15% de Tween-20, 50 ml de tetrametil bencidina se añadieran a cada posillo y se almacenaron en la obscuridad de 5 a 15 minutos. La reacción se detuvo con 50 ml/posillo de 10% acido fosfórico. Los valores de OD450 se midieron usando un vario escáner de lectura de micro placas (Thermo, EUA).

En términos de respuesta autoAB: una región inmunodominante MBP (124-147), se identificó en ratones C57BL/6; dos en ratones SJL, MBP(24-44) y MBP(72-139); y dos en ratas DA; MBP(40-60) y MBP(107-170). Los últimos dos se correlacionaron con patrones de esclerosis múltiple en humanos, incluyendo dos fragmentos MBP (43-64) y MBP(115-170), sugiriendo gue la respuesta inmunológica vista en las ratas DA inducida con EAE es significativamente relevante como un modelo para la esclerosis múltiple en humanos. Se seleccionaron tres péptidos para análisis posterior: MBP(46-62) ("MBP1"); MBP(124-139) ( "MBP2 "); y MBP(147-170) ("MBP3"), que fueron los más inmunodominantes tanto en pacientes con esclerosis múltiple como en ratas DA. De manera significativa, las células T+CD4 especificas de mielina con alta vives descritas por Bielekova et al . (Bielekova B et al . , J Immunol 2004; 172:3893-904, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos) posee reactividad hacia los péptidos MBP 111-129 y 146-170, que se traslapan con los fragmentos MBP identificados en el presente estudio, demostrando la reactividad cruzada entre estos epitopos de célula B y T.

Ejemplo 9 - Ratas DA EAE inmunizadas con anticuerpos anti-MBP de liberación de MBP63-81 que reconocen péptidos encefalitogénicos y MBP C-terminal Previamente, sólo GPBP(62-84), y a un menor grado GPBP(68-88), han sido mostrados por ser capaces de inducir EAE en ratas DA (Miyakoshi A. et al . , J Immunol 2003;170:6371-8). Sin embargo, dado que el péptido encefalitogénico MBP(81-104) juega un papel significativo en la evaluación de la esclerosis múltiple (Aharoni R. et al . J Neuroimmunol 1998;91:135-46), un protocolo de inmunización resultante en la reproducibilidad a alto nivel de los anticuerpos para el fragmento MBP C-terminal y la región encefalitogénica MBP fue deseada. Para asegurarse de que el esparcimiento del epitopo, un a marca de esclerosis múltiple, se incluiría en la patogénesis EAE del modelo de roedor, el homogenizado de la médula espinal fue excluido del homogenizado usado en el presente estudio.

En resumen, las ratas DA se inmunizaron con el péptido MBP(63-81), con el fin de lograr las patologías EAE deseadas. El análisis de los anticuerpos del suero de las ratas DA después de la inmunización revelaron una respuesta de autoanticuerpo mejorada para tres fragmentos MBP: MDHARHGFLPRH (SEC ID NO:6); QDENPVVHFFKNIV (SEC ID NO:7) y IFKLGGRDSRSGSPMARR (SEC ID NO:8). La especificidad de los autoanticuerpos anti-MBP lgG policlonales fue determinada de acuerdo con el enlace con la librería de epítopo MBP y adicionalmente el cálculo teorético con base en la asunción de los péptidos que se traslapan (Figura 2A). Ninguna actividad significativa de suero autoAb en las ratas DA EAE contra MBP(63-81) fue identificada. Debido a que el péptido MBP (63-81) fue usado como el antígeno, ésto sugirió el involucramiento del esparcimiento de epítopo durante el desarrollo de EAE en las ratas DA. Esta observación también está de acuerdo con los descubrimientos previos de que MBP(62-75), un péptido encefalitogénico mayor en ratas DA, no es inmunodominante como se define en Sercarz et al . (Sercarz EE et al., Annu Rev Immunol 1993;11:729-66, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos).

Para cuantificar el reconocimiento autoAb de los epítopos MBP identificados, y para confirmar su secuencia in vitro, la afinidad de los anticuerpos anti-MBP de suero policlonal aislados de las ratas DA para péptidos MBP biotinilados se determinó mediante la resonancia de plasmón de superficie (figura 2B). La disociación efectiva constante de la proteína MBP de longitud completa (1.5xlCT8) se determinó como nanomolar, asi como las constantes de disociación para MBP encefalitogénico (9.6xl09) y fragmentos (8.4xl0~9) C-terminal, verificando su identidad como epitopos de célula B mayores. El enlace al péptido MDHARHGFLPRH (SEC ID NO:6) no fue detectable, y por lo tanto, se excluyó de la evaluación adicional en este estudio como un biomarcador para la progresión de EAE.

Todas las medidas de resonancia por plasmón de superficie se realizaron en aparato BiaCore T-200 (GE Healthcare, EUA). Los péptidos MBP biotinilados (50 mg/ml) (enlistados en la Figura 2) y MBP se inmobilizaron en chips SA y CM-5 respectivamente. Todos los procesos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El indice de flujo del regulador de pH HBS-EP se mantuvo como 10 ml/min durante todas las mediciones. Los anticuerpos (50 g/ml) fueron probados en ambos chips con tiempo de disociación/asociación estándar de 300/300 s. Las constantes de disociación se calcularon utilizando BiaCore T-200 Evaluation Software 1.0.

Ejemplo 10 - Administración de epitopos de célula B derivados de MBP encapsulados en liposomas SUV manosilados mejora significativamente EAE en un modelo de rata con EM El tratamiento de EAE en ratas Lewis se realizó previamente con autoantigenos de mielina encapsulados diferentes de aquellos proporcionados en la presente (ver, St Louis J. et al . , J Neuroimmunol 1997;73:90-100; y Avrilionis y Boggs, J Neuroimmunol 1991;35:201-10, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Al mismo tiempo, el grupo de Nagelkerken mostró que la administración de APL M-PLP139-151 manosilado induce la tolerancia especifica de péptido a EAE en ratones SJL (Lúea ME et al . , J Neuroimmunol 2005;160:178-87, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos).

Los antigenos peptidicos MBP de célula B recientemente identificados se encapsularon en liposomas (SUV) de vesículas unilamelares, pequeñas que transportan residuos de mañosa en su superficie. El beneficio mayor de su alcance es que los péptidos no modificados inmunodominantes están presentes en forma nativa desde adentro del liposoma, mientras que el suministro de células que presentan antígeno (APC) se mejora mediante la mañosa expuesta a superficie. Los APC tienen altos niveles de receptores de mañosa en su superficie, mejorando la endocitosis de las partículas de liposoma manosiladas en el citosol (Keler T. et al., Expert Opin Biol Ther 2004;4:1953-62, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Por otro lado, la administración de los liposomas catiónicos que carecen de mañosa puede incrementar significativamente la respuesta de anticuerpo, como es descrito por Durova et al . para una "vacuna anti-V1H" (Durova OM et al . , Mol Immunol 2009;47:87-95, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos), y debe ser evitada para la inducción por autotolerancia.

Los liposomas se ensamblaron de una mezcla de fosfatidilcolina de huevo (PC) y un DOG manosilado en porcentaje molar (ManDOG) (Durova OM, supra) . El ensamble de los liposomas SUV se realizó como se ilustra en la Figura 3: (i) formación de capas de lipidos irregulares durante la evaporación de solvente orgánico, seguido por rehidratación que resulta en la formación (MLV) de vesícula multilamelar multicapa; (ii) homogenización de alta presión que resulta en formación de SUV vació; (iii) secado en frío de liposomas SUV con páptidos - en esta etapa los péptidos se ubican entre los liposomas SUV colapsados; y (iv) la encapsulación de los péptidos durante la segunda rehidratación en los liposomas SUV con un diámetro promedio de aproximadamente 60-100 nm, con 1.0 % de residuos de mañosa en su superficie. Cuatro formulaciones fueron usadas para este estudio: cada epítopo de célula B (MBP1, MBP2, and MBP3) individualmente y una mezcla 1:1:1 (en masa) de todos los tres péptidos.

Pequeñas vesículas unilamelares (SUV) fueron preparadas de fosfatidilcolina de huevo (PC) y DOG manosilado (Espuelas S. et al., Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyl conjúgate and incorporation into liposome carriers, 2003 B100rg Med Chem Lett., Aug 4; 13(15):2557-60, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos) (1:100 proporción molar) mediante homogenización de alta presión (Durova OM, supra) . En resumen, la mezcla de lípidos (100 mg/ml) en CHCI3 se secó bajo vacío, luego se volvió a suspender en agua Milli-Q a una concentración de lípido final de 50 mg/ml, seguido de homogenización de alta presión (20,000 psi). Los SUV resultantes se mezclaron con péptidos (proporción de lípido a péptido 330:1) junto con exceso de azúcar (proporción de lactosa a péptido 3:1) con secado en frío subsecuente. Después de la rehidratación bajo condiciones controladas, los liposomas SUV resultantes se lavaron mediante centrifugación para remover los materiales no incorporados. Las perlas lavadas se volvieron a suspender en PBS al volumen de dosis requerido. La incorporación de péptido se estimó en la base de HPL de fase inversa que usa una gradiente lineal de acetonitrilo aplicada en columna C18. El diámetro z promedio y zeta potencial de liposomas se midió en un zetasizer Brookhaven ZetaPlus a 25°C mediante la dilución de 20 ml de la dispersión al volumen requerido con 1 mM PBS o medio apropiado.

Para probar el potencial terapéutico de las cuatro formulaciones, las rata DA que presentan EAE inducido se inyectaron subcutáneamente con una de cuatro formulaciones liposomales manosiladas, copaxona (control positivo), péptido MBP1 (no encapsulado) libre (control negativo), y liposomas manosilados vacíos (control de vehículo; Tabla 3).

Tabla 3. Características liposomales y los grupos experimentales de ratas DA involucrados en el estudio.

El tratamiento de cada rata se inició al primer signo de manifestación clínica con EAE. Como se muestra en la Tabla 4, el tratamiento con formulaciones de péptido MBP1 liposomales y MBP1/2/3 redujo significativamente el puntaje de enfermedad máximo y acumulativo en ratas DA inducidas con EAE. Asimismo, la mortalidad se redujo en todos los grupos tratados con péptidos MBP liposomales (MBP2 SUV- 1/11; todos MBP SUV - 1/54), en comparación con el grupo tratado con vehículo liposomal vacío (3/17). Solamente hubo una muerte en el grupo tratado con MBP1 (1/15) libre.

Table 4. Efecto de los páptidos MBP atrapados en liposomas SUv manosilados en el desarrollo de EAE en ratas DA. 1p<0.05 diferencias estadísticamente significativas observadas del grupo de control; Anova de una vía para estadísticas no paramétricas: Wilcoxon 2p>0.05 diferencias estadísticamente significativas no observadas del grupo de control; Anova de una vía para estadísticas no paramétricas: Wilcoxon 3Intervalo intercuartílico, valor en paréntesis, ( )· El puntaje promedio de la enfermedad y el índice de gliosis/demielinización se determinó para cada grupo de tratamiento, como se muestra en la Figura 4. Como se puede ver, el tratamiento con formulaciones liposomales de MBP1 proporcionó la mayor reducción en el puntaje de enfermedad máximo durante el ataque inicial (panel 4A). El tratamiento con formulaciones liposomales de MBP2 y MBP3 limitó el progreso de la enfermedad en la etapa de recaída (paneles 4C y 4D). La administración de una formulación liposomal de una mezcla de todos lor tres péptidos MBP mejoró significativamente el EAE desencadenado, redujo el perfil total de la enfermedad (panel 4E).

El tratamiento con péptido MBP1 libre no proporcionó ningún efecto benéfico (panel 4G), mientras que el tratamiento con copaxona resultó en un índice de mejora en EAE con el tratamiento con la formulación MBP1/2/3 SUV (panel 4F). Sin embargo, las tratadas con copaxona no se recuperaron por completo de EAE después del ataque inicial, como las ratas tratadas con la formulación MBP1/2/3 SUV liposomales. Estos datos son de acuerdo con las etapas de hematoxilina y eosina y se calculó el puntaje de gliosis/desmielinación (Figura 4, paneles derechos). Adicionalmente, MBP1 y MBP1/2/3 SUV disminuyeron significativamente tanto en puntajes de enfermedad máximos promedio como en puntajes de enfermedad acumulativos promedio, los cuales sugieren su potencial terapéutico alto (Tabla 4).

Ejemplo 11 - Desarrollo de EAE inhibido con péptidos MBP liposomales mediante la subrregulación de las citosinas Thl y la inducción de producción BDNF en el sistema nervioso central Para investigar el estado inmunológico de las ratas DA inducidas con EAE después del tratamiento con péptidos MBP encapsulados liposomalmente, el suero aislado de las ratas tratadas como se describe en el Ejemplo 10 fue analizado para ver los anticuerpos anti-MBP y el manchado de cistosina del sistema nervioso central (Figura 5). Una disminución significativa en la concentración eutoAb anti-MBP se observó en el suero de las ratas tratads con péptidos MBP encapsulados liposomalmente, en comparación con el suero de las ratas tratadas con el control negativo de vehículo (Figura 5A). Los niveles de los anticuerpos específicos para ambos de los epítopos de célula B mayores, del mismo modo los autoanticuerpos reactivos contra MBP de longitud completa. De manera notable, los epítopos MBP (81— 103) no estuvieron presentes en ninguna formulación liposomal, sin embargo la concentración de autoanticuerpos que reconocieron este epitopo se redujo al mismo grado que para los autoanticuepros que reconocieron la proteina MBP de longitud completa. Por lo tanto, se concluye que el efecto observado no podía ser explicado mediante la neutralización primitiva de anticuerpos patogénicos en la corriente sanguínea.

Las composiciones peptídicas MBP descritas en la presente pueden en parte actuar a través de un mecanismo que involucra células T autorreactivas, debido al traslape de los epítopos de célula T y B (Belogurov A. et al., Bioessays 2009;31:1161-71, cuyo contenido se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Para investigar esta posibilidad, el manchado para las citosinas Thl se realizó en muestras de ratas DA inducidas con EAE tratadas como se describe en el Ejemplo 10 (Figura 5B). Se encontró que los niveles de IL-2 y IFNy fueron significativamente subrregulados en ratas tratadas con formulaciones peptídicas MBP liposo ales (Tabla 5), sugiriendo que las formulaciones designadas funcionan como fármacos antiinflamatorios. Se observó también la disminución de la desmielinización en ratas DA inducidas con EAE tratadas con las composiciones peptídicas MBP liposomales. Esta observación se correlacionó con la producción de BDNF mejorada (Figura 5B), sugiriendo que los péptidos MBP atrapados liposomalmente funcionan a través de un mecanismo que es similar al de la copaxona, que es conocido como expresión de BDNF sobrerregulada (Aharoni R et ai., Proc Nati Acad Sci U SA 2003;100:14157-62).

Tabla 5. Titulación de autoanticuerpo anti-MBP de suero y perfil de citosinas de SNC en ratas que desarrollan EAE en respuesta a la administración de péptidos MBP atrapados liposomamente.

El análisis histológico y el manchado de citosinas se realizaron como sigue. Las médulas espinales de los animales se recolectaron, y se embebieron en parafina, se diseccionaron en rebanadas y se mancharon con H&E y azul rápido de luxol (LFB). Los parámetros histológicos fueron los siguientes: el grado de gliosis (grado de puntajes) de 0 a 3; 0 corresponde a la ausencia de gliosis, 1 a gliosis media (hasta 5 a 10 células), 2 a gliosis moderada (entre 10 a 50 células por foco) y 3 a gliosis severa más de 50 células por foco). El grado de puntajes de desmielinación se nivela de 0 a 3; 0 corresponde a la ausencia de desmielinación, 1 a la demielinación media, 2 a la desmielinación moderada y 3 a la despielinación severa. El manchado para las citosinas IL-2, IFNg y BDNF se realizó de acuerdo con el protocolo de manufactura.

Los estudios presentes identificaron dos regiones inmunodominates de MBP en ratas Da inducidas con EAE, que también son identificadas en pacientes con esclerosis múltiple humanos. Cuando se encapsularon en liposomas manosilados, la administración de los péptidos que correspondió a estas regiones inmunodominantes disminuyó significativamente el EAE en ratas DA, reduciendo el primer ataque y mejorando la recuperación de la exacerbación. Se encontró que estas composiciones subrregularion las citosinas Thl, indujeron la expresión BDNF, e inhibieron la producción Ab anti-MBP (Tabla 5). Sin limitarse por la teoría, un mecanismo posible de acción para este efecto terapéutico es que los residuos de mañosa presentes en la superficie de los liposomas cargados con péptidos MBP incrementaron la ingesta de péptidos MBP encapsulados liposomalmente en las células APC, que a su vez resultaron en una inducción de tolerancia hacia la proteína básica de mielina y hacia la mejora subsecuente de la enfermedad.

Este efecto observado y benéfico que los fragmentos MBP encapsulados liposomalmente tienen en la progresión de la enfermedad EAE en las ratas DA, junto con las similitudes inmunológicas entre las ratas Da inducidas con EAE y los pacientes humanos con esclerosis múltiple, sugiere una modalidad terapéutica novedosa para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

Ejemplo 12 - Eficacia terapéutica de péptidos MBP encapsulados liposomalmente en un modelo de rata con esclerosis múltiple (EM) (DA-EAE-28-0D Para evaluar el uso de los péptidos de epitopo de célula B MBP para el tratamiento de EM, se condujo un estudio en ratas DA inducidas con EAE. Los dianas del estudio incluyeron: 1) confirmar la eficacia terapéutica del péptido MBP1; 2) determinar si la encapsulación SUV proporciona beneficios terapéuticos adicionales; 3) determinar si la formulación SUV a base de MSL proporciona beneficios terapéuticos adicionales; 4) determinar si la adición de regiones de flanqueamiento de MBPl proporcionan beneficios adicionales en el modo de mezclado en SUV; 5) determinar si la adición de las regiones de flanqueamiento de MBPl proporcionan beneficios adicionales en el modo de mezclado en SUV a base de MSL; 6) comparar la actividad de MBP1/MBP1FL/MBP1FR en formulaciones MSL SUV mediante el uso del modelo de EAE agudo en ratas (DA) hembra Dark Agouti.

Cada una de las siete formulaciones que se evaluaron se proporcionaron como polvo liofilizado a 4°C. La rehidratación de cada dosis grupal diaria se hizo con agua para inyección de acuerdo con la Tabla 6. Las formulaciones peptidicas MBP se volvieron a suspender en agua para inyección (Cure Medical) y la copaxona (Teva LTD) se diluyó con solución salina a una concentración final de 150 mg/mL. Cada animal sujeto se administró con la formulación de prueba durante los 6 dias consecutivos mediante inyección subcutánea.

Tabla 6. Protocolos de resuspensión para las formulaciones peptidicas MBP bajo investigación.

Ratas hembra Dark Agouti (DA) de 9 semanas de edad (Harían Laboratories, Inc.), que pesaban entre 125 y 145 gramos se usaron como los sujetes probados. El estado de salud de los animales usado en el estudio se examinó al llegar. Solamente los animales en buen estado de salud se aclimataron a las condiciones de laboratorio y se usaron en el estudio. Los animales fueron alimentados con Dieta de Proteina para Roedores (Teklad) ad um y se les dio libre acceso al agua. Se mantuvo a los animales bajo un ambiente a 20°C y 24°C con una humedad relativa de 30-70% y a un ciclo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los animales fueron asignados a sus respectivos grupos de manera aleatoria. Este estudio se realizó siguiendo la revisión del Comité para la conducción Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Médico Assaf Harofeh, Beer Yaakov, Número de Comité Ético: 68/2009.

Para inducción de EAE, las ratas se inyectaron intradermalmente en la base de la cola con un volumen total de 200 ml de incócuylo que contiene 50 mg de MBP(63-81) (ANASPEC), en solución salina mezclada (1:1) con CFA, (IFA, Sigma) y 1 mg t (cepa H37 RA; Difeo Laboratories, Detroit, MI).

Las ratas fueron evaluadas diariamente empezando desde las 24 horas después de la inmunización. En el dia 8 post inmunización, más del 50% de las ratas desarrollaron signos de parálisis. Los animales que presentaron síntomas de esclerosis múltiple se separaron en 9 grupos para empezar el tratamiento. Antes del tratamiento, se recolectó la sangre de dos ratas de cada grupo. En el día 9 y 10 de la postinmunización, 55 a 60 ratas desarrollaron signos de parálisis 7-10 dias de la postinducción con EAE, 54 animales se dividieron en 9 grupos (6 ratas en cada uno), y la sangre se recolectó de 2 ratas de cada grupo antes de la iniciación del tratamiento. Cada grupo de ratas se trató una vez al dia con la formulación de acuerdo con la Tabla 7 durante los 6 dias consecutivos. Las formulaciones se administraron mediante inyección subcutánea en el área menor del lado abdominal. La sangre se recolectó de todas las ratas 24 horas después de la última inyección. Los animales se mantuvieron diariamente durante el periodo de estudio. Los animales se sacrificaron 28 dias de la postinducción con EAE, el suero y el plasma se recolectaron de los corazones de las ratas. Los animales se perfusionaron con 4% de PFA, se recolectaron el cerbero y la médula espinal y se mantuvieron en 4% de formaldehido.

Tabla 7. Estudio de los grupos de tratamiento y los protocolos de tratamiento.

Los animales fueron observados de manera individual y los signos clínicos se registraron una vez diariamente durante todos los periodos de estudio. Las observaciones incluyeron cambios en el pelaje, los ojos, el indice respiratorio, la vocalización, parálisis, el patrón de actividad y comportamiento. La clasificación de los signos de parálisis relacionados con la esclerosis múltiple para cada animal se realizó diariamente de acuerdo con los criterios en la Tabla 8. El peso corporal de cada animal se determinó diariamente durante todos los periodos de estudio. Todos los animales con un puntaje de parálisis de más de 1 recibieron 2 mi de agua y 2 mi de Dieta de Proteínas para Roedor (Teklad) diariamente mediante aguja de alimentación por sonda.

Tabla 8. Grupos de prueba de estudio y protocolos de tratamiento.

Recolección de sangre durante la fase de vida: Se recolectó la sangre del seno orbital de las ratas vivas. La sangre se recolectó en 2 tipos de pipetas: pipetas EDTA y 2 mL de pipetas Eppendorf. El suero y el plasma separado de cada animal se evaluó posteriormente para citosina IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, TNF-alfa, IFN-gamma, y concentraciones TGF-beta mediante ELISA. Recolección de sangre durante la fase de terminación: Inmediatamente después del sacrificio, la sangre se recolectó de los corazones de las ratas en dos tipos de pipetas: pipetas EDTA y 2 mL en pipetas Eppendorf. El suero y el plasma se separaron y se almacenaron a -20°C.

Después del sacrificio, se realizó la perfusión con 0.5 L de 4% de PFA. Inmediatamente después de la recolección de sangre, el sistema vascular se lavó con 20 mL de solución salina y 0.5 L de PFA se perfusionaron utilizando 180-200 mmHg por medio de un canal derecho del corazón. El cerebro y la médula espinal de cada animal fueron recolectados y se mantuvieron en 4% de formaldehido. Los tejidos se recortaron, embebieron en parafina, seccionaron a aproximadamente 5 micrones de espesor y se mancharon con Hematoxilina y Eosina (H&E) y manchado PAS.

Resultados Como se resume en la Tabla 9, la mortalidad ocurrió en grupos tratados con MBP1 libre (Grupo 1; 1/6), (Grupo 2; 1/6), y Grupo 3; 2/6), copaxona (Grupo VIII; 2/6), y WFI (Grupo IX; 2/6). De manera conversa, ninguna rata murió en los grupos tratados con (Grupos IV-VII, respectivamente).

Tabla 9. índice de mortalidad en ratas en 54 ratas DA inducidas con EAE.

Una reducción estadísticamente significativa en el puntaje de la parálisis, en comparación con otros grupos, se observó en ratas tratadas con la formulación de péptidos de epítopo de células B MBP1/MBP1FL/MBP1FR en liposomas manosilados (Figura 6A; (x)).

La ganancia de pesos corporal de todos los animales se encontró que estuvo dentro del intervalo de valores normales esperados durante el periodo de aclimatación. La pérdida de masa corporal se observó durante el pico de enfermedad en animales de todos los grupos. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tratamiento y los grupos de control para cualquiera de las medidas de peso corporal (Figura 7).

No hubo diferencias estadísticamente significativas detectadas en los niveles de IL-2, IL-4, IL- 10, IL-17, TNF-alfa, IFN-gamma, y TGF-beta antes del tratamiento y entre los grupos tratados con formulaciones probadas. La comparación de las diferencias en los niveles de citosina entre los grupos tratados con formulaciones peptídicas MBP y los controles no fue estadísticamente significativa.

Para evaluar la mielinación en las rata inducidas con EAE tratadas con formulaciones I-IX, la histología fue realizada en ciego, es decir, sin saber qué animal fue tratado con qué sustancia por un patólogo. Los resultados se compararon con la histología de un animal no tratado.

En breve, todas las rebanadas se mancharon con HE, Ácido periódico de Schiff (PAS), y manchas de Luxol Fast Blue (LFB). Los parámetros histológicos se escogieron para caracterizar la naturaleza de las lesiones. La gliosis clasificó de 0 a 3, de acuerdo con la siguiente escala: 0=sin gliosis, l=gliosis media (hasta 5-10 células), 2=gliosis moderada (entre 10-50 células por foco), y 3=gliosis severa (más de 50 células por foco). La desmielinación se clasificó de 0 a 3, de acuerdo con la siguiente escala: 0=no desmielinización, l=desmielinización media, 2=desmielinización moderada y 3=desmielinización severa. Las lesiones adicionales también fueron observadas, si se presentan.

El análisis histopatológico de la columna vertebral de 2 animales seleccionados aleatoriamente de cada grupo reveló la apariencia de la gliosis en todas las ratas analizadas. Sin embargo, una mejora significativa en mielinación se vio en ambos animales del grupo IV (MBP1/MBP1FL/MBP1FR encapsulados en liposomas no modificados) y en una de las ratas del grupo V (MBP1/MBP1FL/MBP1FR encapsulados en liposomas no modificados), en comparación con los animales de los otros grupos. Los patrones de manchado H&E ejemplares se muestran en las Figuras 8A-8C.

Este estudio demuestra que la administración de los péptidos de epitopo de células B MBPl, MBP1FL, y MBP1FR coencapsulados en un liposoma manosilado en una reducción estadisticmanete significativa de parálisis en modelos de roedor con esclerosis múltiple: MBPl, MBP1FL y MBP1FR en una formulación liposomal (1% de composición lipidica manosilada molar a una proporción de péptido a lipidico 1:330). La formulación liposomal de todos los tres péptidos tiene respuesta significativamente eficaz (Grupo 4), en comparación con los péptidos solos (Grupos 2, 3, 6, y 7), y el control negativo (Grupo 9). Mediante comparación, los tres péptidos juntos en una composición liposomal sin el 1 % molar de lipido de mañosa (Grupo 5 vs. Grupo 4) no muestra eficacia significativa, indicando una respuesta mejorada mediante la inclusión del lipido manosilado. El puntaje de la enfermedad en si fue comparable para el péptido MBPl solo (Grupo 1) o liposomalmente formulado (Grupo 2); sin embargo el análisis histopatológico para la gliosis y la mielinación de columnas vertebrales cultivadas de 2 ratas seleccionadas aleatoriamente de cada grupo demuestra un puntaje de desmielinación bajo, lo cual indica un resultado patológico mejorado para la formulación liposomal del péptido MBP1 solo (Grupo 2). El mejor puntaje ( es decir, más bajo) de desmielinación se obtuvo mediante la administración de la formulación liposomal de todos los tres péptidos MBP (Grupo 4), que también resultaron en una 5 mejora significativa en el puntaje total de la enfermedad.

Ejemplo 13 - Eficacia terapéutica de los péptidos MBP encapsulados liposomalmente en un modelo de rata con esclerosis múltiple (DA-EAE-28-02) Para evaluar adicionalmente el uso de los 10 péptidos de epítopo de células B MBP para el tratamiento de la esclerosis múltiple, se condujo un estudio en ratas inducidas con EAE. Las formulaciones liposomales manosiladas de varias combinaciones de péptidos MBP, MBP1, MBP1FL, MBP1FR, MBP2, y MBP3 se probaron para su potencial 15 terapéutico en el modelo de rata DA inducido con EAE, descrito arriba.

Cada una de las formulaciones peptídicas MBP se proporcionaron como un polvo liofilizado y almacenado a 4°C. La rehidratación para cada formulación con agua para 20 inyección se hizo diariamente de acuerdo con la Tabla 10. F Las formulaciones peptídicas MBP se volvieron a suspender en agua para inyección (Medical Cure) y la copaxona (Teva LTD) se diluyó con solución salina a una concentración final de 450 mg/mL. A cada animal sujeto se le administró 25 la formulación de prueba durante 6 días consecutivos mediante inyección subcutánea.

Tabla 4. Protocolos de resuspensión para las formulaciones peptídicas MBP bajo investigación.

Ratas hembra (DA) Dark Agouti de 8 a 9 semanas de edad (Harían Laboratories, Inc.), que pesaban entre 110 y 145 gramos se usaron como los sujetes probados. El estado de salud de los animales usado en el estudio se examinó al llegar. Solamente los animales en buen estado de salud se aclimataron a las condiciones de laboratorio y se usaron en el estudio. Los animales fueron alimentados ad libitum y se les dio libre acceso al agua. Se mantuvo a los animales bajo un ambiente a 20°C y 24°C con una humedad relativa de 30-70% y a un ciclo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los animales fueron asignados a sus respectivos grupos de manera aleatoria. Este estudio se realizó siguiendo la revisión del Comité para la conducción Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Médico Assaf Harofeh, Beer Yaakov, Número de Comité Ético: 830_b2451_6.

Para inducción de EAE, las ratas se inyectaron intradermalmente en la base de la cola con un volumen total de 200 ml de inoculo gue contiene 50 mg de MBP(63-81) (ANASPEC), en solución salina mezclada (1:1) con CFA, (IFA, Sigma) y 1 mg Mt (cepa H37 RA; Difeo Laboratories, Detroit, MI).

Las ratas fueron evaluadas diariamente empezando desde las 24 horas después de la inmunización. En el día 9 post inmunización, más del 50% de las ratas desarrollaron signos de parálisis. Los animales que presentaron síntomas de esclerosis múltiple se separaron en 10 grupos para empezar el tratamiento. Antes del tratamiento, se recolectó la sangre de dos ratas de cada grupo. En el día 9 y 11 de la postinmunización, 54 a 60 ratas desarrollaron signos de parálisis. 9-11 dias de la postinducción con EAE, 54 animales se dividieron en 10 grupos (5-6 ratas en cada uno), y la sangre se recolectó de 2 ratas de cada grupo antes de la iniciación del tratamiento. Cada grupo de ratas se trató una vez al día con la formulación de acuerdo con la Tabla 11 durante los 6 dias consecutivos. Los animales se mantuvieron y evaluaron hasta el día 28 postinducción. Los puntajes clínicos se asignaron diariamente durante el periodo de estudio. Los animales se sacrificaron 28 días postinducción con EAE utilizando isoflurano. Inmediatamente después de que se sacrificaron, se recolectó la sangre de los corazones de las ratas. El suero y el plasma se separaron y almacenaron a -20°C. Los animales se perfusionaron con 4% de PFA, se recolectaron el cerbero y la médula espinal y se mantuvieron en 4% de formaldehído.

Tabla 11. Grupos de prueba de estudio y protocolos de tratamiento.

Los animales fueron observados de manera individual y se registraron los signos clínicos una vez diariamente durante todos los periodos de estudio. Las observaciones incluyeron cambios en el pelaje, ojos, índice respiratorio, vocalización, parálisis, patrón de comportamiento y actividad. El puntaje de los signos de parálisis relacionados con la esclerosis múltiple para cada animal se realizó diariamente de acuerdo con los criterios en la Tabla 8. El peso corporal de cada animal se determinó diariamente durante todos los periodos de estudio. Todos los animales con un puntaje de parálisis de más de 1 recibieron 2 mi de agua y 2 mi de Dieta de Proteínas para roedores remojada (Tekolad) diariamente mediante aguja de alimentación por sonda.

Resul tados Como se resumió en la Tabla 12, 1 ieta por rata de cada grupo tratado con MBP2 encapsulado liposomalmente libre (Grupo V; 1/6), copaxona (Grupo IX; 1/5), y WFI (Grupo X; 1/5).

Tabla 12. índice de mortalidad en 54 ratas DA inducidos con EAE.

Una reducción estadísticamente significativa en el puntaje de parálisis, en comparación con el control de agua (Grupo X), se observó en ratas tratadas con una dosis alta de péptido MBPl encapsulado liposomalmente (Figura 10 (D)).

La ganancia en peso de los animales se encontró que estuvo dentro del intervalo de valores esperado durante el periodo de aclimatación. La pérdida de peso se observó durante el pico de enfermedad en animales de todos los grupos. La ganancia en peso durante el periodo de pico de postenfermedad en todos los animales de los grupos. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos administrados con pétidos MBP encapsulados liposomalmente y los grupos de control (Figura 11).

Con la excepción del Grupo 2, este estudió probó una sola formulación liposomal (1% molar de composición lipidica de mañosa y una proporción de péptido a lipido 1:330) y con éste se examinó la eficacia terapéutica de varios péptidos MBP de epitopo de células B, y combinaciones de los mismos. De manera notable, una reducción estadísticamente significativa en la parálisis de las ratas tratadas con 200 mg (nominales) de MBP encapsulado liposomalmente (46-62) (Grupo 4) se observó, en comparación con el control negativo. Adicionalmente, se observó una diferencia no estadísticamente significativa (tendencia) en la parálisis de las ratas tratadas con 200 mg de MBP encapsulado liposomalmente (46-62) (Grupo 4), en comparación con las ratas tratadas con copaxona (Grupo 9), en los días 4 y 5 de postratamiento.

El perfil de severidad de enfermedad en este estudio tuvo fases de recaída y primarias distintas. Cuando se compararon los resultados en las ratas tratadas con la misma dosis (50 mg/día) de péptidos MBP solos encapsulados liposomalmente, se descubrió que la administración de MBP (46-62) (Grupo III) proporcionó el beneficio terapéutico mayor en la fase primaria de la enfermedad, mientras que la administración de MBP encapsulado liposomalmente (124-139) (Grupo V) o MBP (147-170) (Grupo VI) proporcionó también un beneficio tarapéutico durante la fase de racida de la enfermedad. Esta desviación no se observó como absoluta y puede ser denegada mediante la dosis peptídica, como administración de dosis alta de MBP encapsulado liposomalmente (46-62) (Grupo 4) es el más eficaz de todas las fases. El beneficio terapéutico de formulaciones liposomales que contienen múltiples péptidos MBP es más difícil de interpretar, posiblemente debido a la dosis baja de cada péptido respectivo. Con respecto al uso del mismo péptido formulado en diferentes proporciones de péptido a lípido (comparar Grupos I y II) ninguna diferencia en el puntaje total de la enfermedad fue observada.

Ejemplo 14 - Eficacia terapéutica de péptidos MBP encapsulados liposomalmente en un modelo de rata con esclerosis múltiple (DA-EAE-28-05 ) Para evaluar adicionalmente el uso de péptidos de epítopo de células B para el tratamiento de la esclerosis múltiple, se condujo un estudio en ratas DA inducidas con EAE. Los objetivos de estudio incluyeron: 1) confirmación adicional de que las formulaciones liposomales de MBP1 solas y MBP1/2/3 proporcionan un beneficio terapéutico en un modelo de rata con esclerosis múltiple; y 2) examinación del efecto terapéutico de diferentes proporciones de péptido a lípido para las formulaciones MBP liposomales.

Cada una de las formulaciones peptidicas MBP evaluadas se proporcionaron como polvos liofilizados y se almacenaron a 4°C. Cada formulación se rehidrató en agua para inyección de acuerdo con la Tabla 13. Se diluyó la copaxona (Teva LTD) con solución salina a una concentración final de 720 mg/mL. Cada animal sujeto se administró con la formulación de prueba durante 6 dias consecutivos mediante inyección subcutánea.

Tabla 13. Protocolos de resuspensión para las formulaciones peptidicas MBP bajo investigación.

Ratas hembra (DA) Dark Agouti de 8 a 9 semanas de edad (Harían Laboratories, Inc.), que pesaban entre 110 y 145 gramos se usaron como los sujetes probados. El estado de salud de los animales usado en el estudio se examinó al llegar. Solamente los animales en buen estado de salud se aclimataron a las condiciones de laboratorio y se usaron en el estudio. Los animales fueron alimentados ad libitum y se les dio libre acceso al agua. Se mantuvo a los animales bajo un ambiente a 20°C y 24°C con una humedad relativa de 30-70% y a un ciclo de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los animales fueron asignados a sus respectivos grupos de manera aleatoria. Este estudio se realizó siguiendo la revisión del Comité para la conducción Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Science in action LTD, Rehovot. Número de Comité Ético: IL-10-11-109.

Para inducción de EAE, las ratas se inyectaron intradermalmente en la base de la cola con un volumen total de 200 ml de inoculo que contiene 50 mg de MBP(63-81) (ANASPEC), en solución salina mezclada (1:1) con CFA, (IFA, Sigma) y 1 mg Mt (cepa H37 RA; Difeo Laboratories, Detroit, MI).

Las ratas fueron evaluadas diariamente empezando desde las 24 horas después de la inmunización. Los animales que presentaron síntomas de esclerosis múltiple se separaron en 7 grupos (6 ratas en cada uno) para el inicio del tratamiento. Cada grupo de ratas se trató una vez diariamente con la formulación de acuerdo con la Tabla 14 durante 6 dias consecutivos. Las formulaciones se administraron mediante inyección subcutánea en el área menor del lado abdominal. La sangre se recolectó de todas las ratas 24 horas después de la última inyección. Los animales se mantuvieron y evaluaron hasta el día 28 después de inducción con EAE. Los puntajes clínicos se asignaron diariamente durante el periodo de estudio. Los animales fueron sacrificados 28 días después de la inducción con EAE, el plasma sanguíneo y el suero fueron recolectados de los corazones de las ratas. Los animales se perfusionaron con 4% de PFA, el cerebro y la médula espinal se recolectaron y mantuvieron en 4% de formaldehído.

Tabla 14. Grupos de prueba de estudio y protocolos de tratamiento.

Los animales fueron observados individualmente y los signos clínicos se registraron una vez al día durante todos los periodos de estudio. Las observaciones incluyeron cambios en el pelaje, ojos, índice respiratorio, vocalización, parálisis, patrón de comportamiento y actividad. El puntaje de los signos de parálisis relacionado con la esclerosis múltiple para cada animal se realizó diariamente de acuerdo con los criterios en la Tabla 8. El peso corporal de cada animal fue determinado diariamente durante todos los periodos de estudio.

Resul tados Ninguna rata murió antes del día 28 postinducción, en este estudio.

Las reducciones estadísticamente significativas en el puntaje de parálisis, en comparación con el control de agua (Grupo 1), se observaron en las ratas tratadas con: péptido MBPl formulado a 1:330 (péptido:lípido; Grupo 2), y péptidos MBPl/2/3 formulados a 1:330 (péptido:lípido; Grupo 3) y 1:110 (péptido:lípido; Grupo 5, en los días 1-4 postratamiento (Figura 12). Una diferencia significativa no estadística (tendencia) en la parálisis de las ratas tratadas con copaxona (Grupos 6 y 7) fue observada, en comparación con el control de agua (Grupo 1).

La ganancia en peso de todos los animales se encontró que estaba dentro del intervalo de valores esperado durante el periodo de aclimatación. La pérdida en peso se observó durante el pico de enfermedad en animales de todos los grupos. La ganancia en peso ocurrió durante el periodo de pico de enfermedad en todos los animales de los grupos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos administrados con péptidos MBP encapsulados liposomalmente y los grupos de control (Figura 13).

Este estudio muestra que el tratamiento con péptido MBP1 de epítopo de células B formulado liposomalmente y péptidos MBP1/2/3 de epítopo de células B formulado coliposomalmente proporcionan un beneficio terapéutico estadísticamente significativo en un modelo de rata con esclerosis múltiple. En proporciones mayores de péptido a lipido, las coformulaciones de MBP1/2/3 parecen proporcionar un mayor terapéutico que los péptidos MBP1 solos. De manera conversa, a proporciones menores de péptido a lipido, las formulaciones de MBP1 solas parecen proporcionar un mayor terapéutico que las coformulacíones MBP1/2/3. En ambos casos, sin embargo, los péptidos MBP1 formulados liposomalmente proporcionan mayores terapéuticos que la copaxona, un terapéutico aprobado para el tratamiento de esclerosis múltiple de recaída remisión.

Se entiende que los ejemplos y las modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrados solamente y que varias modificaciones o cambios en luz de los mismos se sugerirán a las personas expertas en el arte y se van a incluir dentro del espíritu y previsión de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para el tratamiento de esclerosis múltiple, caracterizada porque comprende tres péptidos (MBP) de proteina básica de mielina enlazados a un primer vector, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:l, el segundo péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, y el tercer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:3, y el primer vector comprende un liposoma que tiene una porción diana expuesta a superficie que comprende un residuo de mañosa o derivado de mañosa. (El respaldo puede ser encontrado en WO 2013/153179 en [0165], [0196], [0241]).

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más péptidos se enlazan covalentemente al vector. (WO 2013/153179, [0162])

3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque uno o más péptidos MBP no están enlazados covalentemente con el vector. (WO 2013/153179, [0162])

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción diana incrementa: (a) el suministro del péptido MBP a una célula inmunitaria; o (b) la ingesta del péptido MBP en una célula inmunitaria; en comparación con un péptido MBP enlazado a un vector en la ausencia de una porción diana. (WO 2013/153179, [0163])

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque los péptidos MBP son encapsulados por el liposoma. (WO 2013/153179, [180])

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el liposoma tiene un diámetro promedio de 100 nm a 200 nm. (WO 2013/153179, [159])

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el liposoma y la porción diana comprenden un lipido manosilado. (WO 2013/153179, [158])

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el lipido manosilado es tetramanosil-3-L-lisin-dilil glicerol. (WO 2013/153179, [158])

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el lipido manosilado es manDOG. (WO 2013/153179, [158])

10. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple. (WO 2013/153179, [198])

11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde la composición está en una forma de dosificación semanal. (WO 2013/153179, [0206])

12. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde la composición se manufactura en una forma de dosificación diaria. (WO 2013/153179, [0206])

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la composición está en una forma que se puede adecuar para la administración tópica, la administración entérica, o la administración parenteral. (WO 2013/153179, [0203])

14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple de recaída remisión (RRMS). (WO 2013/153179, [0197])

15. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fármaco es para el tratamiento de la esclerosis múltiple secundaria progresiva (SPMS). (WO 2013/153179, [0197])

16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple primaria progresiva (PPMS). (WO 2013/153179, [0197])

17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple de recaída progresiva (PRMS). (WO 2013/153179, [0197])

18. Un método para hacer la composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (i) mezclar mañosa o un derivado de mañosa con un lípido en la presencia de un solvente orgánico; (ii) evaporar el solvente orgánico, formando capas de lípido irregulares; (iii) rehidratar las capas de lípido irregulares para obtener una vesícula multilamelar, multicapa (MLV); (iv) homogenizar la vesícula multilamelar para obtener una vesícula unilamelar pequeña; (v) mezclar las vesículas unilamelares con los tres péptidos MBP y secar con congelamiento la mezcla; (vi) rehidratar las vesículas unilamelares pequeñas para obtener liposomas de vesícula unilamelar pequeños que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 60 a 100 nm. (WO 2013/153179, [0242])

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los tres péptidos MBP se añaden en una proporción de 1:1:1 en masa. (WO 2013/153179, [0197])

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado porque el derivado de mañosa es DOG manosilado y el lipido es fosfatidilcolina de huevo, y se mezclan en una proporción de 100:1. (WO 2013/153179, [0242])

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque los liposomas de vesícula unilamelar pequeños tienen 1.0% de residuos de mañosa en su superficie. (WO 2013/153179, [0242])

22. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende tres péptidos (MBP) de proteína básica de mielina enlazados a un primer vector, el primer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, el segundo péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, y el tercer péptido MBP consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, el primer vector comprende un liposoma que tiene una porción diana expuesta a superficie que comprende un residuo de mañosa o un derivado de mañosa, y un portador farmacéuticamente aceptable. (El respaldo puede ser encontrado en WO 2013/153179 en [0103], [0165], [0196], [0241]).

23. Una composición para el tratamiento de esclerosis múltiple, caracterizada porque comprende un péptido (MBP) de proteina básica de mielina enlazado a un primer vector, el péptido MBP consiste en secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, y un vector que comprende un liposoma que tiene una porción diana expuesta a superficie que comprende un residuo de mañosa o derivado de mañosa. (El respaldo puede ser encontrado en WO 2013/153179 en [065], [0196], [0241], [0235], [0237]).

24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque los péptidos MBP se enlazan covalentemente con el vector. (WO 2013/153179, [0162])

25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, caracterizada porque los péptidos MBP no se enlazan covalentemente al vector. (WO 2013/153179, [0162])

26. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la porción diana incrementa: (a) el suministro del péptido MBP a una célula inmunitaria; o (b) la ingesta del péptido MBP en una célula inmunitaria; en comparación con un péptido MBP enlazado a un vector en la ausencia de una porción diana. (WO 2013/153179, [0163])

27. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el péptido MBP es encapsulado por el liposoma. (WO 2013/153179, [0180])

28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque el liposoma tiene un diámetro promedio de 100 nm a 200 n . (WO 2013/153179, [0159])

29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque el liposoma y la porción diana comprenden un lipido manosilado. (WO 2013/153179, [0158])

30. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizada porque el lipido manosilado es tetramanosil-3-L-lisina-dioleoil glicerol. (WO 2013/153179, [0158])

31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizada porque el lipido manosilado es manDOG. (WO 2013/153179, [0158])

32. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple. (WO 2013/153179, [0198])

33. El uso de conformidad con la reivindicación 32, en donde la composición está una forma de dosis semanal. (WO 2013/153179, [0206])

34. El uso de conformidad con la reivindicación 32, en donde la composición se manufactura en una forma de dosis diaria. (WO 2013/153179, [0206])

35. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en donde la composición está en una forma que se puede adecuar para la administración tópica, administración entérica, o administración parenteral. (WO 2013/153179, [0203])

36. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple de recaída remisión (RRMS). (WO 2013/153179, [0197])

37. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple secundaria progresiva (SPMS). (WO 2013/153179, [0197])

38. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple primaria progresiva (PPMS). (WO 2013/153179, [0197])

39. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en donde el fármaco es para el tratamiento de esclerosis múltiple progresiva de recaída (PRMS). (WO 2013/153179, [0197])

40. Una composición farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple, caracterizada porque comprende un péptido (MBP) de proteina básica de mielina enlazado a un vector, el primer péptido MBP consiste en secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11 o la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, y el vector que comprende un liposoma que tiene una porción diana expuesta a superficie que comprende un residuo de mañosa o derivado de mañosa, y un portador farmacéuticamente aceptable. (WO 2013/153179 en [0165], [0196], [0241], [0235], [0237]).

41. Un método para tratar la esclerosis múltiple en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende: administrar la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, 22 a 31, o 40 al paciente. (WO 2013/153179, [0190])

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la composición se administra al paciente al menos una vez a la semana. (WO 2013/153179, [0206])

43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la composición se administra al paciente al menos dos veces a la semana. (WO 2013/153179, [0206])

44. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la composición se administra al paciente diariamente. (WO 2013/153179, [0206])

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, caracterizado porque la composición se administra mediante administración tópica, administración entérica, o administración parenteral. (WO 2013/153179, [0203])