JP5709876B2 - 多発性硬化症治療用組成物 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、オリゴペプチド及び融合タンパク質、並びに、多発性硬化症の進行過程におけるＭＢＰの結合及び触媒の低下に関与する、エピトープ特異的抗ＭＢＰ触媒自己抗体（ＥＳＡＭＢＰＣＡＡ）の不活性化におけるこれらの利用に関する。本発明は、また、上記オリゴペプチドを含む医薬組成物、上記オリゴペプチドの組み合わせ、上記オリゴペプチドから構成される融合タンパク質、及び、多発性硬化症治療のためのこれらの利用に関する。
〔背景技術〕
多発性硬化症（以下では、ＭＳと略する）は、異種な病理生理学的及び臨床的発現、並びに、非常に複雑な病因を伴う、ヒト中枢神経系の炎症性脱髄疾患である(Hafler et al., 2004. J. Clin. Invest. 113: 788−794; Kornek et al., 2003. Brain Res. Bull. 61: 321−326.)。ヒトにおけるこの病気の進行は、髄鞘の破壊を引き起こし、電気パルスを伝導するための神経の能力に、最終的に影響する(Schwartz, R. S., 1993, in Fundamental Immunology, ed. Paul, W. E. (Raven, New York), pp. 1033−1097)。
この病気の起源を説明するために、ウイルス模倣の仮説が立てられた(Merkler et al., 2006. J. Clin. Invest. 116: 1254−1263.)。しかしながら、現在のところは、この病気の本当の誘因メカニズムは、明確には同定されていない(Hohlfeld et al., 2004.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (Suppl. 2): 14599−14606)。
ＭＳ患者の増殖性Ｔ細胞のいくつかは、ＭＢＰを直接対象としていること(Allegretta et al., Science, 247, 718-721, 1990)、及び、ヒトＴ細胞はＭＢＰ分子における多数のエピトープを認識し得ること(Richert et al., J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989)が証明されている。ＭＢＰはまた、抗原提示細胞の関与なしに、いくつかのＴ細胞を活性化する可能性を示す(Altman et al., Eur. J. Immun. 17, 1635-1640, 1987)。
病気のヒト及び実験動物モデルのＭＳ発展及び進行に、免疫Ｔ細胞が関与しているという、有力な及び広く受け入れられた証拠にも関わらず、ミエリンシース破壊に特異的なＢ細胞反応の貢献はあまり調査されていない(Klawiter et al.,2007. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 7: 231−238.; Nikbin et al., 2007. Int. Rev. Neurobiol. 79: 13−42.).。
ＭＳ病状のかなりの部分は、ＭＢＰ構成要素を直接対象とする自己抗体が血液中に存在することによって、特徴付けられる(Reindl et al., 1999, Brain, 122, 2047−2056; Genainet al., 1999, Nat. Med. 5,170−175)。さらに、高解像度顕微鏡解析により、ヒトＭＳ及びマーモセットのＭＳ様疾患における脱髄プラークの領域にミエリン特異的自己抗体が検出され、これらがミエリン破壊に直接的に貢献することを示唆している(Genain et al., 1999, Nat. Med. 5,170−175)。ＭＳの病因における自己抗体の役割のメカニズムは不明であるが、ＭＢＰ及びミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）は、ＭＳの臨床予測のためのバイオマーカーとして提案されている(Berger et al., 2003, N. Engl. J. Med. 349, 139−145.10)。同様の免疫グロブリンもまた、実験的にアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を引き起こしたＭＳ動物モデルのマウスで見つかっている(Fritz et al., 1983, J. Immunol. 130, 191−194.)。ＭＳ活性の患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、ＭＢＰに対する自己抗体の力価の増加が観察された(Warren at al., Ann Neurol 209:20-25, 1986)。臨床的に、ＭＳは、急性再発又は慢性進行のような病状活性の段階、及び、臨床的な回復段階によって特徴付けられる。活性ＭＳは、ＭＢＰに対する自己抗体の髄腔内における発現レベルの増加に結びつく(Warren et al., Ann Neurol 209:20-25, 1986; Catz et al., Can J NeurolSci 13:21-24, 1986)。これらの抗体は、急性再発中は主に自由型（Ｆ）で見られ、病気が知らない間に進行しているときには、主に結合型（Ｂ）で見られる(Warren et al., Ann Neurol 209:20-25, 1986)。再発−回復期の多発性硬化症（ＲＲＭＳ）患者は、ＣＤ２０＋Ｂリンパ球を標的として選択的に減少させるリツキシマブモノクローナル抗体を有しており、このような患者の治療は、安全で、ある程度の範囲で効果的であることが示されている（Stuve, O. et al., Long-term B-lymphocyte depletion with rituximab in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis., Arch Neurol. 2009 Feb;66(2):259-61）。
科学的な背景の存在によって、全長ＭＢＰ分子及びフラグメントに相当する多数のペプチド、並びに、ＭＢＰタンパク質のホモログ及びそのフラグメントを用いたＭＳ治療へのアプローチが、この１０年間展開されている。同様に、ヒトＭＢＰが１７０アミノ酸残基からなることは、良く知られている。科学文献及び特許文献において、ＭＢＰのフラグメントは、全長ＭＢＰ配列（配列番号１）のＣ末端から数えて最初及び最後のアミノ酸残基の位置に従って標識される。
WO 9612737には、いくつかの「Ｔ細胞活性（例えば、免疫Ｔ細胞又はその小集団の活性及び機能に影響を与える能力）」を有するペプチド（ヒトＭＢＰフラグメント）が、ＭＳの阻害及び治療のために提供され、治療用途に適していることが記載されている。ＭＢＰにおけるＴ細胞認識エピトープを明らかにするために、１６個の短い（それぞれ約２０アミノ酸残基長）、３個のより長い（82-100, 83-105, 141-165)、互いに重複するペプチド配列について、ＭＳ患者の末梢血細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を刺激する能力が試験されている。発明者によって提供されたペプチドのアミノ酸構造は、以下のＭＢＰフラグメントに対応している：11-30; 11-29; 11-31; 83-105; 82-105; 82-104; 80-98; 82-102; 80-104; 80-102; 111-130; 111-129; 141-165; 101-125。また、この著者は、従来ＭＢＰのＴ細胞活性を有することが知られている他のペプチドと、発明に係るペプチドとの組み合わせを開示している：13 − 25; 31-50; 61-80; 82-92; 82-96; 82-97; 82-98; 82-100; 82-100; 83-100; 83-101; 84-97; 84-100; 85-100; 86-105; 87-99; 87-99 [91K>A]; 88-100; 88-99; 82-100; 111-135; 122-140; 139-170; 141-160; 142-166; 142-168; 146-160; 153-170。
Wraith D.C.とその共著者とは、他の抗原処理を必要とせずに、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合する可能性の有る免疫寛容原性ペプチドの選択方法、及び、これらのペプチドの多発性硬化症の治療及び／又は予防のための薬学組成物における使用方法を提供している。これらの著者は、ヒトＭＢＰの1-24; 15-39; 30-54; 45-69; 60-84; 75-99; 90-114; 105-129; 120-144; 135-159; 150 -170; 131-145; 132-146; 133-147; 134-148; 135-149; 136-150; 137-151; 138-152; 139-153; 140-154; 141-155; 142-156; 143-157; 144-158フラグメントに対応するいくつかのペプチドを合成し、ＭＳ患者の末梢血細胞により認識されるヒトＭＢＰエピトープの同定のため、及び、これらのペプチドがＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合する可能性を調査するために、合成したペプチドを用いている。短いペプチドのいくつかは、免疫Ｔ細胞機能の調節に関して活性であり、ＭＳ治療のために選択及び請求された：134-148; 135-149; 136-150; 137-151; 138-152; 139-153; 140-154; 30-44; 80-94; 83-99; 81-95; 82-96; 83-97; 84-98; 110-124; 130-144; 131-145; 132-146; 133-147 (以下の出願を参照のこと: EP1918298, US 11/979,224, WO 03/64464)。
US2005209156には、AGAPVVHPPLAIVTPATのアミノ酸配列を有するＭＢＰフラグメント（７５〜９８）から選択されたペプチド、およびその置換、付加、又は欠失を含むペプチドが、ＭＳ治療用として記載されている。
US特許5858980には、ＭＢＰフラグメント８４〜１０２及び１４３〜１６８が、ＭＳの進行中に、ＭＢＰ活性の免疫優性Ｔ細胞認識エピトープを含むことが同定されたと記載されており、ENPVVHFFKNIVTPRT（ＭＢＰフラグメント８３−９８）及びその類似物、並びに、QGTLSKIFKLGGRD（ＭＢＰフラグメント１４６−１６０）が提供されており、これらのペプチドを含む医薬も同様に提供されている。
Warren K.G.と共著者とは、以下のヒトＭＢＰアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列を有する、抗ＭＢＰ自己抗体を中和するのに有用な可溶性合成ペプチドを提供する：61-75; 64-78; 69-83; 75-95; 69-83; 80-97; 91-106; 84-93; 85-94; 86-95; 87-96; 82-98。これらのペプチドは、そのアミノ酸残基の６１〜１０６において、ＭＢＰ配列と重複する（ＷＯ９８／４５３２７を参照のこと）。選択されたペプチドの１つ（すなわちＭＢＰ７５〜９５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ（ＭＳ患者の血液中）の両方において、ＭＢＰに対する自由抗体への結合能を示した。これに対して、非結合制御ペプチドＭＢＰ３５〜５８は、ＭＳ患者において、ＭＢＰに対する自由抗体及び結合抗体に効果がなかった。
ＭＢＰを基にしたペプチド及びＤＮＡワクチンのいくつかが、臨床試験において評価されている：全長ＭＢＰからの遺伝子を含むBayhillTherapeutics社のＤＮＡワクチンＢＨＴ−３００９、Neurocrine Biosciences社の変性ペプチドリガンドＧＰ７７１１６及びＮＢＩ−５７８８、全長ＭＢＰ配列に基づくAutoimmune(R)からの経口樹上細胞（oral tolerogenic）組成物であるMyloral。しかしながら、深刻なマイナス事象がある又はＭＳ進行を遅らせる能力がないために、これらの治療による顕著な結果は観察されなかった。ここで、ＭＢＰのアミノ酸残基８２〜９８に対応する配列(DENPVVHFFKNIVTPRT)を有し、MBP8298とコード化された、上述した合成ペプチドは、進行性多発性硬化症の治療のための臨床試験の段階ＩＩにおいて、大々的に研究されている。ペプチドが、６ヶ月毎に５００ｍｇの投与量で静脈内投与された。ＭＢＰ８２９８による治療における応答システムは、ＨＬＡへリオタイプＤＲ２及び／又はＤＲ４を有する患者にのみ見られた(Warren, K.G. et al, European Journal of Immunology, 2006, vol. 13, No 8, pp. 887-895)。
上述したＭＢＰ８４〜１０２フラグメント（ＵＳ特許５８５８９８０）は、臨床試験の段階Ｉにおける二次進行性ＭＳ治療用製剤の有効成分として使用された。磁気共鳴映像法により診断される新規の病変において、総合障害度評価尺度（Expanded Disability Status Scale）、ナインホールペグテスト（Nine Hole Peg Test）の測定に基づく治療効果は検出されなかった(Goodkin, D. E. et al. Neurology 2000, vol. 54, pp. 1414-1420)。
それゆえに、ＭＳに対する治療活性を有するオリゴペプチドであるＭＢＰの新規なフラグメントを検索及び選択することは重要であり、かつ、そのようなオリゴペプチドの、ＭＳ治療に関連するいずれかの医療特性は、当業者がかなり多くの臨床前ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいたとしても、予測できない。このような新規の効果的なペプチドの同定及び選択は、ＭＳの成長及び進行に関与する、新規の免疫病理メカニズムの発見により達成されるかもしれない。
以前に、本発明者らは、ＭＳ患者の血液中を循環する抗ＭＢＰ自己抗体の小断片による、ＭＢＰ分子の部位特異的なタンパク質分解を証明し、かつ、ミエリン破壊及びＭＳ進行の新規な免疫病理メカニズムを説明した。
したがって、本発明の目的は、多発性硬化症の進行中のＭＢＰの結合及び触媒作用の減退に関与するエピトープ特異的抗ＭＢＰ自己抗体（ESAMBPCAAエピトープ特異的抗ＭＢＰ触媒自己抗体）を中和することが可能な、新規なオリゴペプチド、並びに、これらの新規なオリゴペプチドを用いてＭＳを治療する新規な効果的な方法を決定することである。
この目的は、ESAMBPCAAを中和する、新規なオリゴペプチド成分（オリゴペプチド、これらのオリゴペプチドから構成される融合タンパク質、及び、これらのオリゴペプチド断片）、並びに、上述したオリゴペプチド及び融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供することによって達成される。驚くべきことに、ESAMBPCAAが、ＭＳにおける抗ＭＢＰ自己循環抗体の唯一のより小さい断片に相当するにも関わらず、本発明の発明者らは、ESAMBPCAAを中和する配列番号２の６アミノ酸残基と同様に短い配列を有し、ＭＳの治療において予想以上に高い効果を示すオリゴペプチドを見出している。
本発明の他の利点及び特徴は、本発明の以下の詳細な説明を読むことによって明らかになるだろう。
〔発明の概要〕
一実施形態において、本発明は、GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有するオリゴペプチド（Ｉ）を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２の１以上のアミノ酸が変異した配列を含むオリゴペプチドを提供し、当該オリゴペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する６アミノ酸残基を少なくとも含み、ESAMBPCAAに結合することができる。
さらなる実施形態において、本発明は、オリゴペプチドＩの断片、又は、配列番号２の１以上のアミノ酸が変異した配列を含むオリゴペプチドＩの断片を提供し、当該断片は、少なくとも６アミノ酸残基長であり、且つ、ESAMBPCAAに結合することができる。
さらなる実施形態において、本発明は、以下のいずれか１つのオリゴペプチドを、有効成分として、治療に効果的な量で含み、かつ、薬学的に許容される担体若しくは希釈剤、又は薬物送達システムを含む薬学組成物を提供する：
−アミノ酸配列GGDRGAPKRGSGKDSHH(配列番号２)を有するオリゴペプチドＩ；
−配列番号２のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が変異した配列を含むオリゴペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列中の連続する６アミノ酸残基を少なくとも含み、ESAMBPCAAに結合することができるオリゴペプチド；
−配列番号２のアミノ酸を有するオリゴペプチドＩの断片、又は、配列番号２の１以上のアミノ酸が変異した配列を含むオリゴペプチドの断片であって、少なくとも６アミノ酸残基長であり、且つ、ESAMBPCAAに結合することができる断片。
別の実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドＩ若しくはその断片、又は、配列番号２の１以上のアミノ酸が変異した配列を含むオリゴペプチド若しくはその断片を、有効成分として、治療に効果的な量で含む薬学組成物を提供し、上記に加えて、配列番号３の配列を有するオリゴペプチドＩＩ及び配列番号４の配列を有するオリゴペプチドＩＩＩから選択されるオリゴペプチドを、少なくとも１つさらに含む薬学組成物を提供する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号２、３、及び４の配列を有するオリゴペプチドの群から選択される２以上のペプチドであって、同一又は異なる２以上のペプチドにより構成された融合ペプチド、又は、その断片を提供し、当該断片は、任意の順序で、ペプチドリンカー又は非ペプチドリンカーを介して互いに連続して連結されており、当該融合タンパク質は、配列番号２のオリゴペプチド又はその断片を少なくとも１つ含んでいる。
好ましい実施形態において、本発明に係る融合ペプチドは、配列番号２の配列の断片から構成され、当該断片は、６アミノ酸残基長を有し、ペプチドリンカー又は非ペプチドリンカーを介して互いに連続して連結されている。
本発明のさらなる実施形態において、多発性硬化症の治療方法が提供される。当該方法は、効果的な量のオリゴペプチド若しくはその断片、融合タンパク質、又は本発明に係る医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む。
本発明の特定の実施形態において、多発性硬化症の治療方法は、多発性硬化症を患う患者の血液を、効果的な量の本発明に係るオリゴペプチド若しくはその断片、融合タンパク質、又は医薬組成物に暴露する工程を含む。
他の実施形態において、本発明に係るオリゴペプチド又は融合タンパク質の、多発性硬化症を治療するための医薬の製造のための使用方法を提供する。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ヒトＭＢＰの完全な分子のアミノ酸配列を示す図である。太字は、ヒトＭＢＰのアミノ酸残基を表す。また、配列番号３及び４のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドと同様に、本発明のオリゴペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列に対応するＭＢＰアミノ酸配列部分を、対応させて表している。ＭＢＰアミノ酸配列のこれらの部分は、黒線により示す。
図２は、ESAMBPCAAの存在下におけるＭＢＰの減少、及び、種々のＭＢＰペプチド断片の存在下における減少の抑制を示す図である（図の横の列は、全長ＭＢＰ配列のＣ末端から数えて最初のアミノ酸残基及び最後のアミノ酸残基の位置に対応）。
図３は、ＭＢＰ断片４３〜６８のアミノ酸配列を含む、種々の合成オリゴペプチドによる、ESAMBPCAA活性の抑制を説明する図である。横軸−抑制分析に用いたオリゴペプチド濃度、縦軸−ESAMBPCAA相対活性（対照分析（ＰＢＳ）におけるESAMBPCAA活性を１とする）。オリゴペプチどのコードを実施例３に示す。
図４は、実験的にアレルギー性脳脊髄炎に罹患させ、本発明のオリゴペプチド及び融合タンパク質により治療した、ＤＡラットのＭＤＳ値の抑制を説明する図である。２４日目のＥＡＥ進行中のＤＡラットにおけるＭＤＳ値の抑制。各グループのラットにおける最大臨床値は、平均及び９５％信頼区間。
図５は、オリゴペプチドの組み合わせを用いた実験的ＭＳ（タイラー（Theiler's）ウイルス感染）の進行中におけるＭＤＳ値の抑制を説明する図である。
〔本発明の詳細な説明〕
（定義）
本明細書で使用する場合、用語「オリゴペプチド」は、約２０以下のアミノ酸残基を含み、ペプチド結合によって連結した任意の分子に関する。例えば、用語「オリゴペプチド」は、２０アミノ酸長以下のポリペプチドを意味する。用語「オリゴペプチド」又は「複数のオリゴペプチド」は、オリゴペプチドと同様にその塩をも範囲に含む。最適な塩は、ナトリウム若しくはカリウム塩、又は酢酸若しくはリン酸塩を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴペプチド」は、特定のアミノ酸配列を有する「オリゴペプチド」及びその機能変異体を包含する。機能変異体は、特定の配列のオリゴペプチド断片のいずれかを含み、当該断片は、ESAMBPCAAに対する結合能を保持するように提供され、６〜２０アミノ酸長である。
本明細書中で使用する場合、本発明のオリゴペプチド「断片」という用語は、少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、好ましくは少なくとも約１２、より好ましくは少なくとも約１４、最も好ましくは少なくとも約１６又はそれ以上の隣接するアミノ酸残基を含む。
さらに考慮されるのは、発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列を変更することによって得られた本発明のオリゴペプチドの変異体である。このような変更には、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加であって、結果として得られる変異体が、本発明の配列の少なくとも６の隣接するアミノ酸を含み、ESAMBPCAA結合能を提供するものを含むことができる。
本明細書中で使用する場合、用語「融合ペプチド」又は「融合タンパク質」は、他のオリゴペプチド若しくはその断片に融合したオリゴペプチド若しくはその断片に関する。各融合部位は、ペプチド結合（１つのオリゴペプチドのＮ末端のアミノ基（ＮＨ２）が、他方のオリゴペプチド又はそのフラグメントのＣ末端のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）に連結される）又は代替としてリンカーを介して、他方に直接的に結合する。「リンカー」は、「ペプチドリンカー」又は「非ペプチドリンカー」から選択してもよい。「ペプチドリンカー」は、約１から約２０までのアミノ酸を含む配列からなってもよく、これらはペプチド結合によって互いに直線状に連結されており、タンパク質分解酵素切断部位の配列を任意で含んでいれもよい。ここで使用される用語「非ペプチドリンカー」は、ペプチドリンカー以外に、２以上の反応基を有するいずれかの連結成分に関する。好ましいリンカーは、非ペプチドポリマーである。本発明のリンカーとして用いる非ペプチドポリマーは、両端に反応基を有するポリマーであって、オリゴペプチドの反応基に独立して結合可能であり、オリゴペプチドの反応基の例には、末端アミノ基若しくは末端カルボキシル基、リジン残基、ヒスチジン残基、又はシステインが含まれる。ポリマーの反応基には、アルデヒド基、プロピオン酸アルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）基、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）基、トリシレート基、イソシアネート基、及び、スクシニミド誘導体が含まれる。スクシニミド誘導体の例には、スクシニミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシニミジルブタン酸（ＳＢＡ）、スクシニミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシニミジルスクシナミド（ＳＳＡ）、スクシニミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシニミジルカルボネート、及び、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドが含まれる。この反応基は、非ペプチドポリマーの端部において、同じでも異なっていてもよい。例えば、ポリマーは、一端にマレイミド基を有し、他端にアルデヒド基を有していてもよい。分子量が低いリンカーには、カルボジイミド又はグルタルアルデヒドが含まれる。
本明細書中で使用される、用語「ESAMBPCAA」は、ＭＳ患者の血液中を循環する自家免疫グロブリン分子の小断片であって、ミエリン塩基性タンパク質に結合し、ＭＢＰ分子の部位特異的タンパク質分解による切断を触媒する小断片に関する。
本明細書中で使用される用語「治療のため」、「治療する」、及び「治療」は、いずれかの都合のよい方法により医者又はいずれかの当業者の診断による判断で治療される病状の少なくとも一つの症状を低減する、改善する、又は取り除くために、療法、因子、化合物、又は、組成物を、病気に罹った対象に施すことに関する。本明細書で使用される用語「中和、不活性化、抑制」は、特定の適切な試験システムにより測定した特定の活性の減少を意味する。
本明細書中で使用する「効果的な量」は、上述したオリゴペプチド、その断片、又は融合タンパク質の投与量であり、多発性硬化症の少なくとも１つの症状を低減する、改善する、又は取り除くことが可能な量である。さらに、効果的な量は、多数の硬化症症状を低減する又は予防することが可能な量を意味する。
本発明者らの以前の研究(Belogurovat al., The Journal of Immunology,2008, 180: 1258−1267)に基づいて、ＭＳ患者のミエリン塩基性タンパク質の認識及び分解に関与する、自己抗体の新規なクラスが見出された。これらの触媒活性抗体は、抗ＭＢＰ抗体の非常に小さな断片に相当するが、その触媒活性がＭＳの進行状態に関連することが見出された。それゆえに、ＭＢＰタンパク質分解を仲介する抗ＭＢＰ自己抗体の量が、ＭＳの新規なバイオマーカーとして提案された。驚くべきことに、ESAMBPCAAがＭＳにおいて循環する抗ＭＢＰ自己抗体のほんの小さな断片に相当するにも関わらず、本発明者らは、ESAMBPCAAにおいて強力な中和活性を有する、あるオリゴペプチドが、多発性硬化症のヒト及び十分に確立された動物モデルの両方におけるＭＳの治療に対して、予想以上に高い効果を示すことを見出した。本発明によれば、ここで、GGDRGAPKRGSGKDSHH(配列番号２)のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを提供する。この配列は、ヒトＭＢＰの４６〜６２のアミノ酸配列に対応し、これより先「ＭＢＰ４６〜６２」として引用する。このオリゴペプチドは、ESAMBPCAAを抑制し得る。
オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの断片及び機能的変異体は、本発明の好ましい実施形態の一つである。オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの一連の切断型を用いたESAMBPCAA抑制分析に基づいて、その生物学的活性を維持するためにオリゴペプチド断片に要求される最小のアミノ酸数が確立された。それゆえに、本発明によれば、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの断片及び機能的変異体は、配列番号２に示す、少なくとも６の隣接するアミノ酸残基を保持する必要がある。与えられた開示に基づけば、ペプチドのESAMBPCAA抑制活性に影響することなくオリゴペプチド配列GGDRGAPKRGSGKDSHHをどのように変異させることができるかを、経験的に決定することは、当業者にとって明白である。
他の局面において、本発明は、GFGYGGRASDYKSAHK(配列番号３)及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(配列番号４)のそれぞれの配列を有する２つのペプチドを提供する。これらのペプチドは、当該技術分野において公知の、ＭＳ患者の免疫Ｔ細胞及び／又は「従来型」（非タンパク質分解）抗ＭＢＰ自己抗体により認識されるＭＢＰエピトープを含む。本発明者らは、これらの２つのオリゴペプチド（配列番号３及び４）が、ヒトの多発性硬化症の治療、及び、ＭＳ実験的アレルギー性脳脊髄炎の確立された動物モデルの病気の進行の予防（又は低減）に対する、「本発明のオリゴペプチド（配列番号２）の効果を相互作用により向上させることを、予期せず見出した。オリゴペプチド（配列番号２）と比較して、ESAMBPCAA に対する抑制活性が低いにも関わらず、これらの２つのオリゴペプチドは、動物及びヒトに共に投与したとき、GGDRGAPKRGSGKDSHHオリゴペプチドの治療効果を強める。したがって、配列番号２のオリゴペプチド、その断片又は機能性変異体、及び、配列番号３又は４の配列を有する２つのオリゴペプチドの少なくとも１つを含む薬学組成物が提供される。
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２のオリゴペプチド、その断片又は機能性変異体は、融合タンパク質を形成するために、互いに連結されている。このような融合タンパク質は、ESAMBPCAAの不活性成分の複数のコピーを含む。
本発明のさらなる実施形態において、オリゴペプチド（配列番号２）又はその断片若しくは機能性類似物、並びに、オリゴペプチド（配列番号３）若しくはその断片及びオリゴペプチド（配列番号４）若しくはその断片は、融合タンパク質を形成するために、任意の順序で、互いに連結されている。それゆえに、本発明の融合タンパク質は、オリゴペプチド（配列番号２）、並びに、オリゴペプチド（配列番号３）及びオリゴペプチド（配列番号４）のエピトープのSAMBPCAA不活性成分の複数の反復性コピーを含んでいてもよい。
本発明はさらに、本発明のオリゴペプチド（配列番号２）、その断片若しくは機能性変異体、又は、融合タンパク質、並びに、薬学的に許容される担体又は希釈剤及び／又は薬物送達システムを、治療に効果的な量含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体の例は、当該技術分野において公知であり、例として正塩を含む。薬物送達システムの例は、当該技術分野において公知であり、例として、リポソーム又は合成ポリマーナノ粒子を含む。本発明のオリゴペプチドは、提供された開示に従った化学式を有するオリゴペプチドを合成する既存の方法により準備することができる。融合タンパク質は、組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。本発明に開示された、選択された融合タンパク質の配列が分かれば、適切なＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列を合成する既存の公知の方法によって製造することができる。それから、このようにして製造されたＤＮＡ配列は、組み換えペプチドを生成するために、適切なクローニング担体にクローニングして、適切な宿主細胞を形質転換するために用いることができる。上述した方法論の全ては、既存のものであり、当業者に公知のものである。
本発明はさらに、多発性硬化症の治療方法を提供する。この方法は、オリゴペプチド、又は断片、又は融合タンパク質、又はこれらを含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に、効果的な量で投与する工程を包含する。ＭＳの治療のためのオリゴペプチド又は融合タンパク質の治療量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから約１０．０ｍｇまでの範囲であってもよく、組成物は、静脈内、皮下、髄腔内に投与することができる。本発明の一例において、組成物は、いわゆる「粘液運搬経路」を目的として、経口投与する。組成物は、要求に応じて単一又は連続投与することができる。
この発明を、その好ましい実施形態を特に参照して詳細に説明する一方で、以下の実施例を説明のために提供するが、本発明はこれに限定されない。
〔実施例〕
実施例１.ESAMBPCAAの検出−多発性硬化症患者の血液中において、ミエリン塩基性タンパク質に結合し、ＭＢＰ分子の部位特異的タンパク質分解による切断を触媒する自己免疫グロブリン分子
抗ＭＢＰ自己抗体精製及び特定を、ステロイド又は非ステロイド抗炎症剤による治療を受けていないＭＳ患者２４人（１７〜５４歳、平均年齢３２歳）の血清を用いて行った。ＭＳ診断を証明及び確証し、ＥＤＳＳ（総合障害度評価尺度）値を、臨床データ、免疫データ及びＭＲＩデータを用いた、Poserの病状進行分類（Poser’s classification of disease progression）により算出した(Poser et al., Clin Neurol Neurosurg2001; 103:1−11.)。免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、５０％硫酸アンモニウムにより沈殿させた後、Ｇタンパク質セファロース(Amersham Biosciences)におけるアフィニティクロマトグラフィにかける処理を３回繰り返すことによって、血清から単離した。その後、ＩｇＧ含有分画を、４℃で、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ又はＴＢＳに対して透析した。ＩｇＧ量を、ＥＬＩＳＡにより定量し、標準化した。ＩｇＧの純度を、電気泳動後に、非還元状態下において銀染色による免疫ブロッティングを行い、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法によって評価した。ＩｇＧをさらに、ＭＢＰを固定したカラムにおいて、ＮＨＳ−セファロース(Amersham)について抗原アフィニティクロマトグラフィにかけることによって、分離し、その純度を、電気泳動及びその後の銀染色法により評価した。
ＭＢＰをＭｉｌｌｅｒ(Miller et al., 1996. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. In: Current Protocols in Immunology; J. E. Coligan, ed. Wiley, New York, p. S19.)に従って、ウシの脳から準備した。得られたタンパク質を、C4 10/250カラム(Mashery-Nagel, Germany)を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。
抗ＭＢＰ自己抗体によるＭＢＰ加水分解を、以下のとおり評価した：精製した抗体（０．１〜１μｇ）を、３７℃で１４時間インキュベートし、１２．５μｌ ＰＢＳ、１〜２μｇのＭＢＰを含む０．０２％ＮａＮ３の終量にした。サンプルにLaemmli’s バッファを混合した。ＭＢＰの減少量を、トリス−グリシン及びトリシンバッファシステムにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化した。ＭＢＰ減少の定量分析ために、ＭＢＰ（１０μＭ）を、０．１ｍｌのＰＢＳ、０．０２％ ＮａＮ３中において、１２時間、抗体（６０ｎＭ）と共に、３７℃でインキュベートした。ｐＨ２．５以下の１０％ ＴＦＡを添加することによって、反応を停止した。サンプルをさらに、C4 4.0/150カラム(Waters)において黒的グラフした。非分解ＭＢＰの量を、２８０ｎｍにおける吸収を観察することによって算出した。
結果を表１に示す。
Figure 0005709876
重要なことに、ＭＢＰ分解を媒介するESAMBPCAAのレベルは、患者の総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）値と相関関係があった（ｒ２＝０．８５，Ｐ＜０．００１ スピアマンの順位相関関係数)。ＥＤＳＳが高い場合（３．０〜６．０）、多くは、進行段階、又は再発−回復（ＲＲ）病状の進行の悪化において、高レベルの抗体媒介触媒が起こった。
実施例２. ESAMBPCAA抑制配列のスクリーニング
ＭＢＰ分子の種々の部分に相当するヒトＭＢＰペプチドをコードする１２のＤＮＡフラグメント（１〜２７、１７〜４１、２５〜５４、４３〜６８、５３〜８１、８１〜１０３、９１〜１１４、１０７〜１３２、１２３〜１４０、１３０〜１５６、及び、１４６〜１７０）を、(SGGGG)3Sリンカーに対応する４つの重複部分と共に、ＰＣＲにより準備した。ＰＣＲの最終産物を、pET32CHプラスミドに、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を利用して、フレーム単位でクローニングした。ＭＢＰペプチドに融合されたＴｒｘを含むこれらのプラスミドの発現産物を、分裂分析のために使用した。リンカー(SGGGG) 3Sを有するＴｒｘ（チオレドキシン）をコードするプラスミドを、比較対照として設計した。可溶性組み換えＨｉｓタグタンパク質を、大腸菌（Escherichia coli）発現により得て、Talon SuperFlow (BD Biosciences)カラムに吸着させて単離し、ｐＨ５．０において、Mono S カラム(AmershamPharmacia)におけるカチオン交換クロマトグラフィにかけた。続けて、１５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＧＬ １０＿３００カラム(Amersham Pharmacia)において、サイズ排除クロマトグラフィにかけた。
ＥＡＥを患ったＳＪＬマウスの血漿から精製したESAMBPCAAによる、完全フロインドアジュバント中のＭＢＰの注入により誘引されるＭＢＰ加水分解のパターンを、０，５μＭの種々のＭＢＰペプチドの存在下において、実施例１において特定したＳＤＳ−ＰＡＤＥにより評価した。結果を図２に示す。GGDRGAPKRGSGKDSHH配列を含むＭＢＰの４３〜６８断片の、ＭＢＰ加水分解を媒介するＭＢＰ自己抗体における有力な抑制活性を証明する。
実施例３．ＭＢＰの４３〜６８フラグメントのアミノ酸配列を含む合成オリゴペプチドにより加水分解を媒介することによる、ＭＢＰ特異的自己抗体の抑制
ESAMBPCAA活性の抑制効果に要求されるアミノ酸配列を同定するために、以下の一連のペプチドを合成した。
Figure 0005709876
実施例１において特定した進行ＭＳ患者から収集したESAMBPCAAを用いて、ＭＢＰ加水分解を媒介するESAMBPCAAを抑制するオリゴペプチドの能力について評価した。試験ペプチドを、０，１％ ＮａＮ３及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中において、抗体（３０ｎＭ）及びＭＢＰ（４μＭ）と共に、種々の濃度に混合した。サンプルを３７℃で１６時間インキュベートし、１５％ ＳＤＳ＿ＰＡＧＥにより分析した。ゲルをクマシーにより染色し、ＴＯＴＡＬＬＡＢ ２．０１ ソフトウェア(Nonlinear Dynamics, Ltd., Newcastle upon Tyne, U.K.)を用いたデンシトメトリーにより分析した。図３に示すデータは、試験オリゴペプチドのうち、GGDRGAPKRGSGKDSHHのアミノ酸配列を含み、オリゴペプチドＡ１及びＡ１よりもアミノ酸残基の少ないオリゴペプチドＡ３が、最も有力な抑制活性を表すことを示す。オリゴペプチド長が６アミノ酸よりも少なくなるように短くすることは、ESAMBPCAA抑制活性の完全な欠落を引き起こす。
実施例４．GGDRGAPKRGSGKDSHHのアミノ酸配列を含む合成オリゴペプチド、その断片、及び、融合タンパク質による、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解の抑制
進行性ＭＳを患う５人の患者から収集した血清サンプルについて、以下の物質の存在下において、実施例１において特定されたESAMBPCAA媒介ＭＢＰ加水分解量を測定した。
Ａ１−反対の比較対照：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；
Ａ２−酢酸グラチラマー(Copaxone, TevaPharmaceuticals)、１００ｎＭ；
Ａ３−オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH １００ｎｍ；
Ａ４−オリゴペプチドAPKRGSGKDSH（オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの断片）−１００ｎＭ；
Ａ５−オリゴペプチドSGKDS（オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの断片）−１００ｎＭ
Ａ６−融合タンパク質RGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGK（GGDRGAPKRGSGKDSHHオリゴペプチドの断片を表す配列である繰り返し配列RGAPKRGSGKを含む）−１００ｎＭ。
生成物Ａ３、Ａ４及びＡ５は、固相有機合成の実験によって合成する（Shemyakin Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS）。生成物Ａ６は、ABNOVAカスタム無細胞翻訳システム（ABNOVA custom cell-free translation system）を用いて合成する(www.abnova.tw)。
分析の結果を下記の表３に示す。
Figure 0005709876
このように、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH、オリゴペプチドAPKRGSGKDSH（オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの１１アミノ酸長の断片）、及び、GGDRGAPKRGSGKDSHHオリゴペプチドの断片を表すRGAPKRGSGKの繰り返し配列を含む融合タンパク質の全ては、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解に対する有力な抑制効果を有する。
実施例５．本発明のオリゴペプチド及び融合タンパク質によるＥＡＥの治療
ＤＡラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、十分に確立されたＭＳの動物モデルである。動物実験を、Ｐｕｓｈｃｈｉｎｏ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｈｅｍｙａｋｉｎ ａｎｄ Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｒｕｓｓｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて行った。メスの１０〜１４週齢ＤＡラットを麻酔して、２００ｍｇのヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis、H 37 RA株; Difco Laboratories, Detroit,MI）を含むＣＦＡ(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)で乳化した生理食塩水中のラットＭＯＧを５０ｍｇ含む、１００ｍｌの接種材料を、尾の根元に皮内注射した。２回目の接種の８日後に、ラットを６つのグループ（グループ毎にラット６匹）に分け、以下のスケジュールで５日間（８〜１２日目）治療した：
グループ１−毎日１２０μｇのオリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHを鼻腔内投与
グループ１−毎日５０μｇのオリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHを鼻腔内投与
グループ３−毎日１２０μｇの融合タンパク質RGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKを鼻腔内投与
グループ４：毎日１２０μｇのオリゴペプチドAPKRGSGKDSHを鼻腔内投与
グループ５：毎日１２０μｇの酢酸グラチラマー(コパキソン（Copaxone）, Teva)を鼻腔内塗布
グループ６：比較対照（ＰＢＳ）。
病気の臨床症状（ＭＤＳ値）を、以下の評価度数で毎日評価した：グレード０、臨床兆候なし；グレード１、軽度のアヒル歩行；グレード２、重度のアヒル歩行；グレード３、中程度の後肢不全麻痺；グレード４、重度の後肢不全麻痺。動物から収集した血清サンプルを、実施例１で特定したESAMBPCAA媒介ＭＢＰ加水分解について定量した。
結果を、図４及び以下の表４に示す。
Figure 0005709876
このように、ＭＤＳ特異的自己抗体媒介加水分解及びＭＤＳ値の両方が、投与量に依存して、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHによって最も効果的に抑制された。融合タンパク質RGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGK、及び、オリゴペプチドAPKRGSGKDSHもまた、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解及びＭＤＳ値の抑制において活性である。
実施例６．本発明のオリゴペプチド及びオリゴペプチドの組み合わせによる、実験的ＭＳ（タイラーウイルス感染）の治療
本実験において用いるＴＭＥＶのＢｅＡｎ株を、７．５％ ドナーウシ血清を添加したダルベッコ修正イーグル培地（Dulbecco'smodified Eagle's medium）において生育したＢＨＫ−２１細胞において生成及び増殖させた。ｉ．ｃ．感染のために、３０μｌのウイルス溶液（0.2 ×106〜6×106 PFU）を、イソフルレンにより麻酔した６〜８週齢のＳＪＬマウス（グループ毎に８匹）の右の大脳半球に注入した。病気の臨床症状（ＭＤＳ値）を以下の評価度数により毎週評価した：グレード０、臨床兆候なし；グレード１、軽度のアヒル歩行；グレード２、重度のアヒル歩行；グレード３、中程度の後肢不全麻痺；グレード４、重度の後肢不全麻痺。動物から収集した血清サンプルについて、実施例１で特定したESAMBPCAA媒介ＭＢＰ加水分解を定量した。オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK（配列番号３）及びオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号４）は、ＭＳの治療におけるいくつかの効果につながる、ＭＳにおける免疫Ｔ細胞活性の調節が可能なことは、当業者に公知である。注入１４日後のマウスを、６つのグループ（グループ毎にマウス３０匹）に分け、以下のスケジュールに従って、１０日間（１４〜２４日）治療した：
グループ１−比較対照として、ＰＢＳを毎日皮下注入
グループ２−毎日３０μｇのコパキソン（Copaxone）を皮下注入
グループ３−毎日２０μｇのオリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHを皮下注入
グループ４−毎日２０μｇのオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKを皮下注入
グループ５−毎日２０μｇのオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRを皮下注入
グループ６−毎日、２０μｇのオリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、２０μｇのオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKとを、皮下注入
グループ７−毎日、２０μｇのオリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、２０μｇのオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKと、２０μｇのオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとを、皮下注入
グループ８−毎日、２０μｇのオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKと、２０μｇのオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとを、皮下注入。
結果を図５及び以下の表５に示す。
Figure 0005709876
このように、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解及びＭＤＳ値は、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH単独、又は、オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK及び／又はオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRの組み合わせによって、最も効果的に抑制される。オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK、及び、オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR単独又は組み合わせは、中程度の治療効果を有しており、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解には影響を与えない。GFGYGGRASDYKSAHKを伴うGGDRGAPKRGSGKDSHHと、QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの組み合わせは、最も有益な治療効果を有する。重要なことに、ペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH、並びに、そのオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK及び／又はオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの組み合わせは、また、病気の回避（予防）活性を有する。
実施例７．患者の血液を本発明に係る融合タンパク質に暴露する方法による、ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解の抑制及びＭＳの治療
以下の配列の融合タンパク質を、ＡＢＮＯＶＡカスタム無細胞翻訳システム(www.abnova.tw)を用いて合成した：
1) RGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGKRGAPKRGSGK
2) GAPKRGSGKYGGRASDYKSGTLSKIFKLGGRDSRRGAPKRGSGKYGGRASDYKSGTLSKIFKLGGRDSR
3) GGDRGAPKRGSGKDSHHGFGYGGRASDYKSAHKQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
このように、これらの融合タンパク質は、種々の順に連結した配列番号２、３、４の配列を含む。
３つの全てのオリゴペプチドを、無菌状態下において、臭化シアン活性化セファロース（CNBr-activated Sepharose）ビーズ(Pharmacia)に、ビーズ１ｍｌあたり各ペプチド０．１ｍｇを結合させた。結合させた後、オリゴペプチド−セファロースを、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ８．０の０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−１．１４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で大規模に洗浄して、非共有結合した材料を取り除き、４００ｍｌカラムに充填した。
ESAMBPCAA血漿交換のケースを、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｃａｄｅｍｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙにおいて行った。本発明者らは、従来の治療（コルチコステロイド及び免疫抑制剤）に抵抗性があると判断した、急性進行性重症二次進行ＭＳの１８歳の患者について、ESAMBPCAA血漿交換を行った。患者は、１週間毎に１サイクルの血漿交換を５サイクル行った。患者の血漿交換を、ｔｈｅ Ｃｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ，ＵＳＡの連続フロー血漿分離器により分離した。血流を５０〜７０ｍｌ／分の間で変化させた。ヘパリンも、５０００Ｕを初期投与した後、第１段階では、ポンプにより５０Ｕ／分で加えた。その後、血漿をセファロースカラムに通して洗浄し、残りの血液を患者に戻した。セファロースカラムを通る血漿流を、電子化吸着（脱離装置ＡＤＡ−Ｍｅｄｉｃａｐ）により制御した。カラムを通過させた後、血漿を患者に戻した。各サイクルにおいて、３０００ｍｌの血漿を処理した。ＥＤＳＳ値を、最初の血漿交換前の６から、最終の血漿交換サイクルの２週間後の５．５まで落とした。最終の血漿交換サイクルの１ヶ月後に行った比較対照のＭＲＩは、以前の病変の２つを低下させ、病変が安定したことを示した。新たな病変は検出されなかった。ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解の値を、最終の血漿交換サイクルの前及び２週間後に、実施例１において特定したのと同様に分析した。データを以下の表６に示す。
Figure 0005709876
このように、ＭＳ患者の血液を、本発明に係る融合タンパク質に暴露することによって、ESAMBPCAA活性が抑制され、ＭＳの効果的な治療が提供される。
また、配列番号２、３、４の配列を（ペプチドリンカー及び非ペプチドリンカーを介して）他の順に連結した列を含む、他の特定の融合タンパク質を生成し、ESAMBPCAA抑制活性、並びに、ＭＳ症状の改善能及びＭＳバイオマーカーの減少能を首尾よく試験した。
実施例８．オリゴペプチド断片を含む医薬組成物
GGDRGAPKRGSGKDSHH、GFGYGGRASDYKSAHK、及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRの３つの配列のオリゴペプチドを、固相有機合成の方法により合成している(ShemyakinOvchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS)。リン脂質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。卵のホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、及び、1, 2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（ＤＯＴＡＰ）を、４：２：１のモル比で混合した混合物５０ｇを、クロロホルム中に溶解させた後、クロロホルムを揮発させることによって取り除いた。オリゴペプチド１、２及び３を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、個々のオリゴペプチドの濃度がそれぞれ５ｇ／Ｌになるように溶解させた。蒸発管中の脂質フィルムを、ＰＢＳ−ペプチド溶液１０Ｌを混合し、４０℃で３０分間振動させることによって再水和した。得られた脂質／タンパク質乳濁液を、１０ｍＬバイアルに移し、凍結乾燥した。乾燥粉末を、注入（ＷＦＩ）用に水５ｍｌに対して「一時的に」可溶性にし、オリゴペプチドを含む大型の多層リポソーム形成させた。
実施例９．オリゴペプチドの経口リポソーム構築物を用いた再発回復ＭＳ患者の治療
実験を、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｃａｄｅｍｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙにおいて、２００３年の４月から２００５年の６月の間に行った。現地の倫理委員会の認可の下、直近２年以内に少なくとも２回の再発が証明され、ＥＤＳＳ（Ｋｕｒｔｚｋｅ総合障害度評価尺度）値が０以上５．５以下である、再発−回復ＭＳ（Poster及びMacDonald基準により診断）の全１５患者（男性５人及び女性１０人、年齢の中央値３２歳）を、試験のために募集した。
患者に、実施例８の記載にしたがって生成したリポソーム（ＬＭＶ）を、体重１ｋｇあたりタンパク質０．５ｍｇで、毎日経口投与する処置を施した。この処置を、２年間、毎日連続して単一治療として行った。
ＥＤＳＳ値を、２ヶ月に１回調べた。活性脱髄部位（ＡＤＬ）のための能のＭＲＴ検査を、２ヶ月毎に行った。再発の頻度及び持続の分析を、２年間の観察期間の最後に行った。血液細胞数、ESAMBPCAA活性、血液生化学及び免疫学的パラメーターを、試験の最初及び最後調べた。
１５人の全ての患者は、処置の最初の６ヶ月間は、安定したＥＤＳＳ値を有する。再発の平均頻度は、処置期間の最後には、年間２．７回以上から年間１．５回に減少した。２年間の追跡期間に、患者の１１人は再発しなかった。患者の６人（４０％）は、処置期間の最後にはほとんどＡＤＬがなくなった。患者の７人（４７％）は、進行が安定しており、ＡＤＬは同じ数である。患者の２人（１３％）は、ＡＤＬ数が増加した。治験薬剤につながる有害事象は記録されなかった。免疫学的パラメーター、血液生化学、及び血液細胞数は、処置期間の最後にも顕著な変化はなかった。データを表７に示す。
Figure 0005709876
ＭＢＰ特異的自己抗体媒介加水分解の値がより低いことが注目され、このことは顕著な治癒効果に達することに一致する。したがって、本発明に係るオリゴペプチドの経口摂取は、ESAMBPCAA活性の減少につながる好ましい治療能力を有する。利用可能な回顧的なデータとの比較において、本発明に係る治療結果は、既存の標準的なＭＳ治療であるベータ−インターフェロンの治療結果よりもよい結果を示す。比較した表８を以下に示す。
Figure 0005709876
実施例１０．
体重約１１０〜１４５ｇ、８〜９週齢のメスのDark Agoutiラットを、動物実験に用いた。
実験的にアレルギー性脳脊髄炎を引き起こすために、完全フロインドアジュバント（IFA, Sigma）と１：１で混合した生理食塩水中のＭＢＰ６３−８１（ANASPEC） ５０μｇと、結核（M. tuberculosis）死菌株(株H37 RA; Difco Laboratories, Detroit, MI) １ｍｇとを含む接種材料を、投与総量２００μＬで、尾の付け根に皮内注射した。ＥＡＥ誘導の後最初の２４時間は、ラットを毎日追跡した。ＥＡＥ誘導の後９日後に、５０％以上のラットに、麻痺の兆候が生じた。多発性硬化症の兆候が見られる動物を、治療の始めに１０のグループに分けた。治療の前に、各グループにつき２匹のラットから血液を収集した。ＥＡＥ誘導の９日後及び１１日後には、９０％のラットに、ＥＡＥの兆候が生じた。
ＥＡＥ誘導の９〜１１日後に、動物を９のグループ（各グループにラット５〜６匹）に分けた。各グループのラットに、以下に示すように、クレームした、異なるオリゴペプチド若しくはこれらの組み合わせ（等分子量混合）（１５０μｇ）、又は、正の比較対照（酢酸グラチラマー、コパキソン、Teva）若しくは負の比較対照（０．９％ 塩化ナトリウム溶液）を、毎日１回６日間、注射処置をした：
グループ１−負の比較対照（０．９％ 塩化ナトリウム溶液）
グループ２−正の比較対照（コパキソン）
グループ３−オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH
グループ４−オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK
グループ５−オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
グループ６−オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKとを同等に含む等分子量混合液（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）
グループ７−オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの等分子量混合液（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）
グループ８−オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKと、オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの等分子量混合液（１：１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）
グループ９−オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKと、オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの等分子量混合液（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）。
コパキソン、オリゴペプチド、及びその組み合わせ（機械混合）を、０．９％塩化ナトリウムで、濃度４５０μｇ／ｍｌに希釈した。投与量０．３３ｍｌ（１５０μｇ／ラット／日）で、６日間ＳＣ注射した。
注射周期の６日後に動物を維持し、ＥＡＥ誘導後２８日目まで追跡した。臨床兆候の記録を、実験期間中毎日行った。動物を、全ての実験期間中、個々に観察した。観察が長期間の場合には、臨床兆候を一日１回記録した。観察には、毛並み、眼、呼吸数、発声、麻痺、活動、及び行動パターンの変化を含めた。各動物におけるＭＳに関連した麻痺兆候の記録を、毎日行った（全ての実験期間）。
記録の等級を、以下の通りとした：０−正常；１−尾部衰弱；２−後肢衰弱又は麻痺；３−後肢麻痺、後肢を引きずる；４−完全麻痺、動くことができない；５−死亡。
ＥＡＥ誘導後２８日目に、動物を犠牲にし、ラットの心臓から血液を収集した。動物を４％ ＰＦＡで灌流し、脳及び脊髄を収集し、４％ホルムアルデヒドで固定した。
結果を以下の表９に示す。
Figure 0005709876
このように、ＥＡＥ臨床兆候は、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHH単独、又は、オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK及び／若しくはオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRの組み合わせにより、最も効果的に抑制される。
オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK及びオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR単独、又は組み合わせは、適度な治療効果を有する。オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHと、オリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHK及びオリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRとの組み合わせは、最も有益な治療効果を有する。例えば、オリゴペプチドQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR及び／又はオリゴペプチドGFGYGGRASDYKSAHKは、オリゴペプチドGGDRGAPKRGSGKDSHHの正の治療効果を、予想以上に増大させる。
本発明の上述した実施形態は、実例及び概要を提供するが、ただ１つの開示に本発明を網羅させる又は限定することを意図しない。上記の教示に矛盾しない又は本発明を実行させるための修正及び変更は可能である。したがって、本発明の範囲は請求項で定義した範囲及びその均等物に及ぶことを意味する。
図１は、ヒトＭＢＰの完全な分子のアミノ酸配列を示す図である。太字は、ヒトＭＢＰのアミノ酸残基を表す。また、配列番号３及び４のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドと同様に、本発明のオリゴペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列に対応するＭＢＰアミノ酸配列部分を、対応させて表している。ＭＢＰアミノ酸配列のこれらの部分は、黒線により示す。 図２は、ESAMBPCAAの存在下におけるＭＢＰの減少、及び、種々のＭＢＰペプチド断片の存在下における減少の抑制を示す図である（図の横の列は、全長ＭＢＰ配列のＣ末端から数えて最初のアミノ酸残基及び最後のアミノ酸残基の位置に対応）。 図３は、ＭＢＰ断片４３〜６８のアミノ酸配列を含む、種々の合成オリゴペプチドによる、ESAMBPCAA活性の抑制を説明する図である。横軸−抑制分析に用いたオリゴペプチド濃度、縦軸−ESAMBPCAA相対活性（対照分析（ＰＢＳ）におけるESAMBPCAA活性を１とする）。オリゴペプチどのコードを実施例３に示す。 図４は、実験的にアレルギー性脳脊髄炎に罹患させ、本発明のオリゴペプチド及び融合タンパク質により治療した、ＤＡラットのＭＤＳ値の抑制を説明する図である。２４日目のＥＡＥ進行中のＤＡラットにおけるＭＤＳ値の抑制。各グループのラットにおける最大臨床値は、平均及び９５％信頼区間。 図５は、オリゴペプチドの組み合わせを用いた実験的ＭＳ（タイラー（Theiler's）ウイルス感染）の進行中におけるＭＤＳ値の抑制を説明する図である。

Claims (12)

  1. （ａ）GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、オリゴペプチド又はその断片であって、
    前記断片は、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６の連続するアミノ酸残基を含み、かつ、抗ミエリン塩基性タンパク質触媒自己抗体(ESAMBPCAA)に結合可能である、GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、オリゴペプチド又はその断片と、
    （ｂ）GFGYGGRASDYKSAHK（配列番号３）の配列を有するオリゴペプチド、及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号４）の配列を有するオリゴペプチドからなる群から選択される、少なくとも１つのオリゴペプチドと
    を含んでいる組み合わせ。
  2. （ａ）GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、オリゴペプチドと、
    （ｂ）GFGYGGRASDYKSAHK（配列番号３）の配列を有するオリゴペプチド、及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号４）の配列を有するオリゴペプチドからなる群から選択される、少なくとも１つのオリゴペプチドと
    を含んでいる、請求項１に記載の組み合わせ。
  3. 配列番号２のアミノ酸配列を有する、オリゴペプチド又はその断片であって、
    前記断片は、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６の連続するアミノ酸残基を含み、かつ、抗ミエリン塩基性タンパク質触媒自己抗体(ESAMBPCAA)に結合可能である、配列番号２のアミノ酸配列を有する、オリゴペプチド又はその断片と、
    配列番号３の配列を有するオリゴペプチド、及び配列番号４の配列を有するオリゴペプチドの両方のオリゴペプチドと
    を含んでいる、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み合わせを、有効成分として、治療に効果的な量で含み、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は、薬剤運搬システムを含む、医薬組成物。
  5. 請求項２に記載の組み合わせを、有効成分として、治療に効果的な量で含み、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は、薬剤運搬システムを含む、医薬組成物。
  6. 請求項３に記載の組み合わせを、有効成分として、治療に効果的な量で含み、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は、薬剤運搬システムを含む、医薬組成物。
  7. 上記薬剤運搬システムはリポソームである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. （ａ）GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのオリゴペプチド又はその断片であって、
    前記断片は、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６の連続するアミノ酸残基を含み、かつ、抗ミエリン塩基性タンパク質触媒自己抗体(ESAMBPCAA)に結合可能である、GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのオリゴペプチド又はその断片と、
    （ｂ）GFGYGGRASDYKSAHK（配列番号３）の配列を有するオリゴペプチド、及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号４）の配列を有するオリゴペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのオリゴペプチドであって、
    前記オリゴペプチドは、非ペプチドリンカーを介して、互いに連続して連結されている少なくとも１つのオリゴペプチドと、
    からなる、融合ペプチド。
  9. （ａ）GGDRGAPKRGSGKDSHH（配列番号２）のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つのオリゴペプチドと、
    （ｂ）GFGYGGRASDYKSAHK（配列番号３）の配列を有するオリゴペプチド、及びQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号４）の配列を有するオリゴペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのオリゴペプチドであって、
    前記オリゴペプチドは、非ペプチドリンカーを介して、任意の順序で、互いに連続して連結されている少なくとも１つのオリゴペプチドと、
    からなる、融合ペプチド。
  10. 請求項８又は９に記載の融合ペプチドを、有効成分として、治療に効果的な量で含み、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は、薬剤運搬システムを含む、医薬組成物。
  11. 多発性硬化症治療のための薬剤を製造するための、請求項１又は２に記載の組み合わせ、請求項４〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物、請求項８又は９に記載の融合ペプチドの、使用。
  12. 多発性硬化症治療のための薬剤を製造するための、請求項４〜７及び１０のいずれか１項に記載の組成物の、使用。
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