HU217633B

HU217633B - Mielin hatású peptidek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, és alkalmazásuk gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU217633B
Application number: HU9701679A
Authority: HU
Inventors: Ingrid Catz; Kenneth G. Warren
Original assignee: The Governors Of The University Of Alberta
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 2000-03-28
Also published as: NO971829L; FI971662A; FI120308B; NO971829D0; US5817629A; DK0789709T3; NO321385B1; CA2203018A1; HUT76977A; AU713546B2; SK282463B6; RO117096B1; EP0789709B1; ATE201415T1; AU3647895A; WO1996012731A1; FI971662A0; NZ293910A; UA55375C2; EP0789709A1

Abstract

A találmány tárgyát az alábbi peptidek képezik: MBP84–93 H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH MBP85–94 H-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-OH MBP86–95 H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH MBP87–96 H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH. A 18,5 KDmolekulatömegű humán mielin alapprotein (h-MBP) 170 aminosavcsoportottartalmaz. Azt találták, hogy a h-MBP körülbelül 84 aminosavcsoportjaés körülbelül 97 aminosavcsoportja közötti szakasznak megfelelőszintetikus peptidek in vitro neutralizálják a h-MBP antitesteket. ŕ

Description

A találmány kiválasztott új polipeptidekre és a polipeptideknek a humán mielin alapprotein antitestek immunregulációjára ható gyógyszerkészítmények előállítására való alkalmazására vonatkozik. A találmány kiterjed a kiválasztott polipeptideket tartalmazó új, sclerosis multiplex kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekre is.

„Alapprotein” kifejezés alatt a leírásban a természetes humán mielin alapproteint, a természetben előforduló humán mielin peptideket értjük.

A sclerosis multiplex (SM) a humán központi idegrendszer (humán Central nervous system; CNS) gyulladással együtt járó multifokális demielinező betegsége. A sclerosis multiplexre rendkívül jellemző a vér-liquor gáton belüli [intra-blood-brain barrier (intra-BBB)] fokozott IgG-szintézis [Tourtelotte, W. W., J. Neurol. Sci., 10, 279-304 (1970); Link, H. and Tibbling, G., Scand. J. Clin. Láb. Invest., 37, 397-401 (1977); Tourtelotte, W. W. and Ma, B., Neurology, 28, 76-83 (1978); Walsh, J. M. and Tourtelotte, W. W., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds., Multiple sclerosis, Baltimore, Williams and Wilkins, 275-358 (1982); valamint Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 17, 475-480 (1985)].

Az aktív vagy inaktív betegségben szenvedő, klinikai értelemben vett SM-betegek vér-liquor gátjában zajló IgG-szintézis általában fokozott [Schumacher, G. A., Beebe, G., Kibler, R. E., et al., Ann. NY Acad Sci, 15, 266-272 (1965)]. A központi idegrendszeri IgG legnagyobb részének specifitása ismeretlen. Míg egy kisebb rész antivirális aktivitással rendelkezik vagy reakcióba lép az agyi antigénekkel, nukleinsavakkal, erythrocytákkal vagy simaizomsejt-antigénekkel, a nemspecifikus rész a B-sejtek poliklonális aktiválását végezheti [Tourtelotte, W. W. and Ma, B., Neurology, 28, 76-83 (1978)]. Az utóbbi évtized során megnövekedett az érdeklődés a specifikus mielin proteinek antitestjei iránt.

Az antigénkomponensükként mielin alapproteint (myelin basic protein, MBP) tartalmazó cirkuláló immunkomplexek nyomon követése során [Dasgupta, Μ. K., Catz, I., Warren, K. G. et al, Can. J. Neurol. Sci., 10, 239-243 (1983)] az MBP antitestek (anti-MBP) megnövekedett titerét figyelték meg az SM aktív formáiban szenvedő betegek cerebrospinalis folyadékában (CSF) [Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 209,

20- 25 (1986)]. Klinikailag az SM-et a betegség aktív, például akut relapsusos vagy a krónikus progressziós fázisai, valamint klinikai remissziós fázisai jellemzik. Az aktív SM az intrathecalisan termelődött anti-MBP megnövekedett mennyiségeivel jár együtt [Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 209, 20-25 (1986); és Catz, I. and Warren, K. G., Can. J. Neurol. Sci., 13,

21- 24 (1986)]. Azt találták, hogy ezek az antitestek az akut relapsus ideje alatt túlnyomórészt szabad (free, F) formában vannak, míg túlnyomórészt kötött (bound, B) formában vannak, amikor a betegség alattomosan progresszív [Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 209, 20-25 (1986)]. Az akut relapsus ideje alatt a cerebrospinalis folyadék (CSF) anti-MBP titerei összefüggésben állnak a betegség aktivitásával [Warren, K. G. and

Catz, I., Ann. Neurol., 21, 183-187 (1987)]. A neuritis optica első rohamaival szenvedő betegekben és az SM első rohamain áteső betegek legtöbbjében az anti-MBPmennyiségek ugyancsak megnövekedtek [Warren, K. G., Catz, I., and Bauer, C., Ann. Neurol., 23, 297-299 (1988); Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 91, 143-151 (1989)].

A CSF anti-MBP-szinteknek az olyan betegek esetén végzett longitudinális kinetikai vizsgálatai, akik egy akut relapsust követő gyógyulási fázisba kerültek, az F anti-MBP titereknek a B frakciók progresszív emelkedésével arányos fokozatos csökkenését mutatták [Warren, K. G. and Catz, I., Neurol. Sci., 91, 143-151 (1989); Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 88, 185-194 (1988)]. A remissziós fázisban a CSF anti-MBP detektálhatatlanná válhat, ami arra utal, hogy egy, az SM inaktív fázisaihoz kapcsolódó antiMBP-semlegesítés történik [Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 88, 185-194 (1988)]. Ezzel ellentétben a krónikus progresszív SM-et a fokozott anti-MBP-nek a hosszú időtartamokon keresztül fennálló, az antiMBP-neutralizáció gátlásával együtt járó állandósága jellemzi [Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 88, 185-194 (1988)]. Az utóbbi időben egy anti-MBP-t tartalmazó, SM-betegek CSF-jéből tisztított IgG-frakcióban egy olyan mielin alapprotein antitest kaszkádot azonosítottak, amelynek egyes antitestjei semlegesítik az anti-MBP-t, és más antitestjei gátolják az anti-MBP semlegesítését [Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 96, 19-27 (1990)].

A B-sejt autoimmunitására vonatkozó korábbi kutatásaink azt bizonyították, hogy az SM-nek legalább két, egymástól különböző formája van, ahol a betegek nagyobb része mielin alapprotein autoantitestekkel (antiMBP), míg a betegek kisebb számban proteolipid protein antitestekkel (anti-PLP) rendelkezik [Warren, K. G. et al., Ann. Neurol., 35, 280-289 (1994)]. Az antiMBP-hez kapcsolódó SM esetén az akut relapsusokhoz megnövekedett szabad (F)/kötött (B) anti-MBP-arányok társulnak, míg a krónikus progresszív fázist alacsonyabb F/B anti-MBP arányok jellemzik, és a remissziós fázisban lévő betegek enyhén megnövekedett anti-MBP titerekkel rendelkeznek [Warren, K. G. and Catz, I. J. Neurol. Sci., 88, 185-194 (1989)].

Azt is igazolták már, hogy egyrészt az SM-betegekben a proliferáló T-sejtek némelyike az MBP-re irányul [Allegretta et al., Science, 247, 718-721 (1990)], másrészt pedig a humán T-sejtek képesek felismerni a molekulán lévő többszörös epitópokat [Richert et al., J. Neuroimmun., 23, 55-66 (1989)]. Úgy tűnik, az MBP alkalmas arra, hogy bizonyos T-sejteket az antigént nyújtó sejtek bevonása nélkül aktiváljon [Altman et al., Eur. J. Immun., 17, 1635-1640 (1987)]. Másképpen ez azt jelenti, hogy a T-sejtek intracelluláris folyamat igénye nélkül képesek felismerni az MBP kis peptidjeit egyszerűen azon képességük alapján, hogy hozzákötődnek a sejtek felületén lévő II. osztályú fő hisztokompatibilitási antigénekhez.

Mivel az experimentális allergiás encephalomyelitis (EAE) az SM egyik elfogadott állatmodellje, kiváltható

HU 217 633 Β a fogékony rágcsálók MBP-vel vagy PLP-vel és Freund-féle teljes adjuvánssal végzett inokulálásával, feltételezhető, hogy az SM-folyamat autoimmun mechanizmussal rendelkezik [Fritz, R. B., et al., J. Immunoi., 130, 1024-1026 (1983); Trotter, J. L., et al., J. Neurol. Sci., 79, 173-188 (1987)]. A B-sejt autoantitest szempontjából a betegség folyamata által megcélzott MBP epitóp a 80 és 100 csoport közötti területen, a triProlil-szekvencia közepén (-99-100-101- csoport) helyezkedik el [Warren, K. G., et al., Ann. Neurol., 35, 280-289 (1994)]. Ez a B-sejt epitóp átfedésben áll az MBP-vel reaktív, az SM agyi sérülésében található Tsejtek számára szolgáló immundomináns epitóppal [Oksenberg, J. R., et al., Natúré, 326, 68-70 (1993)].

A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy az MBP semlegesíti az anti-MBP-t. Ugyanakkor azonban az SM-nek heterológ MBP intramuszkuláris vagy szubkután beadása útján történő kezelésére tett korábbi erőfeszítések sikertelenek maradtak [Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch. Neurol., 29, 10-15 (1973); Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J. Neurol., 216, 27-31 (1977); valamint Romíné, J. S. and Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds., Multiple sclerosis. Baltimore, Williams and Wilkins, 621-630 (1982)]. Natív MBP alkalmazásával a probléma kétszeres. A protein humán agymintákból kerül előállításra, így fennáll annak a veszélye, hogy a mintában latens neurovírusok lehetnek jelen. Másodszor, bár az MBP normális körülmények között nem immunogén, lehetséges, hogy ha megváltozott immunrendszerű alanyoknak adjuk be, az MBP antigénként viselkedik, és MBP-vel szembeni antitestek termelődését okozhatja.

A jelen találmány szerinti megoldás értelmében meghatározzuk, hogy az akut relapsus fázisában lévő SM-betegek CSF-jéből tisztított anti-MBP semlegesíthető-e a humán MBP (h-MBP) kiválasztott peptidjeivel. Ebből a célból a h-MBP teljes hosszát lefedő szintetikus peptideket alkalmaztunk annak érdekében, hogy meghatározzuk azt a h-MBP-n lévő lehetséges epitópot, amely semlegesíti az említett betegből nyert anti-MBP-t. Ily módon azokat a kiválasztott peptideket, amelyek bizonyítottan semlegesítik az anti-MBP-t, hatékonyabban használhatjuk fel az SM kezelésére, mint a teljes hosszúságú MBP-t. Ezek a peptidek nem természetes előfordulásúak, így a neurovírusok okozta veszély nem lép fel. Ezen túlmenően, kis méreteiknek köszönhetően ezek a peptidek nem működhetnek immunogénként. Ily módon a kiválasztott peptideknek az SM kezeléseként történő alkalmazása megoldja a natív protein alkalmazása során felmerülő problémákat.

A találmány szerinti peptideket további vizsgálatnak vetettük alá annak érdekében, hogy meghatározzuk a peptideknek a kötésben vagy az SM anti-MBP in vivő termelésében kifejtett hatékonyságát.

A találmány olyan peptidekre vonatkozik, amelyek szekvenciájukban lényegében homológok egy humán mielin alapprotein aminosavszekvenciájának egy részével. Ezek a peptidek alkalmasak az anti-MBP termelésének semlegesítésére vagy módosítására.

A találmány az alábbi peptidekre vonatkozik:

MBP84-93 (az 1. számú szekvencia 84-93 aminosavcsoportja)

H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH MBP85-94 (az 1. számú szekvencia 85-94 aminosavcsoportja)

H-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-OH MBP86-95 (az 1. számú szekvencia 86-95 aminosavcsoportja)

Η-V al-V al-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-V al-Thr-OH MBP87-96 (az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportja)

H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH.

A találmány magában foglalja azokat a gyógyszerkészítményeket is, amelyek egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval összekeverve hatóanyagként egy fenti peptidet tartalmaznak.

A találmány kiterjed a találmány szerinti peptideknek hatóanyagként sclerosis multiplex kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására történő alkalmazására is, amelynek során az anti-humán mielin alapprotein hatékony semlegesítése vagy módosítása érdekében alkalmazzuk egy találmány szerinti peptid hatásos mennyiségét.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábra 18 szintetikus pepiidnek (jobb oldali számok) az intakt humán MBP-molekulához viszonyított lokalizációját mutatja be. A peptideket az MBP-molekulán lévő megfelelő szakasz mellett elhelyezett függőleges vonalak jelzik. A bal oldali számok a humán MBP-n lévő aminosavcsoportokat jelölik.

A 2. ábra az SM anti-MBP esetén az MBP epitópok további finomítását mutatja be, amelynek során a 61 és 110 csoport közötti területet lefedő 41 dekapeptidet alkalmaztunk.

Jelmagyarázat:

- a fekete oszlopok a százalékos gátlást ( = 100-radioaktivitási egység) jelentik,

- pozitív kontrollként MBP-t és MBP75-95 peptidet alkalmaztunk, amelyek mindegyike mind az F, mind pedig a B antitestek teljes (100%-os) gátlását eredményezte,

- negatív kontrollként MBP51 -60 és MBP 111-120 peptidet alkalmaztunk, amelyek mindegyike csak jelentéktelen (0-10%-os) mértékben gátolta az F és a B anti-MBP-t,

- az F és B antitest maximális (90-100%-os) gátlását eredményező MBP84-93, MPB85-94, MBP86-95 és MBP87-96 peptid nagymértékű hasonlóságot mutat az MBP epitóppal,

- a szaggatott vonal az inhibíciós vizsgálat 95%-os konfidenciahatárát jelöli.

A találmány tehát peptidekre vonatkozik, amelyek szekvenciájukban homológok egy humán mielin alapprotein aminosavszekvenciájának egy részével.

A 41 dekapeptidből álló sorozat alkalmazásával végzett kompeptitív gátlási vizsgálat alapján az SM antiMBP esetén a 82 aminosav és a 98 aminosav közötti területen lokalizált MBP epitóp 40%-nál nagyobb mértékben gátolja a kötött anti-MBP-t, és 60%-nál nagyobb

HU 217 633 Β mértékben gátolja a szabad anti-MBP-t. Az SM antiMBP esetén a legnagyobb mértékű gátlást eredményező MBP epitóp feltehetően a 84 aminosav és a 96 aminosav között helyezkedik el. A hatásos dekapeptidek legkisebb közös szakasza a 87 aminosavtól a 93 aminosavig terjed. A találmány tehát az alábbi peptidekre vonatkozik :

MBP84-93 (az 1. számú szekvencia 84-93 aminosavcsoportja)

H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH MBP87-96 (az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportja)

H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH.

A találmány szerinti vegyületeket a peptidek hagyományos és jól ismert előállítási eljárásainak megfelelően szintetizálhatjuk. A találmány szerinti peptideket a Groome és munkatársai által ismertetett [Groome, N. P., Dawkes, A., Barry, R. et al., J. Neuroimmun, 19, 305-315 (1988)] Fmoc eljárás alkalmazásával állítottuk elő. A „peptid” kifejezés magában foglalja azokat a peptideket, amelyeket a természetes előfordulású mielin alapproteineknek a találmány szerinti kiválasztott peptidek előállítása érdekében végzett szabályozott hidrolíziséből nyerünk. Ismerve a kiválasztott peptidek szekvenciáját, a kiválasztott aminosavszekvenciát kódoló megfelelő DNS-szekvencia is meghatározható. A megfelelő DNS-szekvenciát a DNS-szekvenciák hagyományos és jól ismert előállítási eljárásai szerint szintetizálhatjuk. Az így előállított DNS-szekvenciákat ezt követően megfelelő klónozó vivőanyagokba klónozhatjuk, és a rekombináns peptid előállításához felhasználhatjuk egy megfelelő gazdasejt transzformálására. Az ezen a területen jártas szakember számára a fentiekben említett módszerek mindegyike jól ismert.

A találmány szerinti peptidek szekvenciájukat tekintve homológok egy humán mielin alapprotein aminosavszekvenciájának egy részével.

Megállapítottuk, hogy a h-MBP aminosavszekvenciájának megfelelő kiválasztott peptidek hatékonyan semlegesítik vagy módosítják az anti-MBP képződését. A peptideket 10 aminosavcsoport hosszúságban egy, az alábbiakban látható (az 1. számú szekvencia 84-96 aminosavcsoportjait tartalmazó) folytonos aminosavszekvenciából választjuk ki, azzal a feltétellel, hogy az adott szekvencia semlegesíti vagy módosítja az anti-mielin alapprotein képződését.

Az 1. számú szekvencia 60-106 aminosavcsoportjai

61 Hi s

Hi s

Pro

Al a

Arg

Thr

Al a

Hi s

Tyr

Gly

Ser

Leu

Pro

Gin

Ly s

Ser

Hi s

Gly

Arg

Thr

G1 n

As p

G1 u

Asn

Pro

Va 1

Hi s

Phe

Ly s

Asn

I 1 e

Val

Thr

Pro

Arg

Thr

Pro

Ser

Gin

Gly

Ly s

Gly

106

A találmány szerinti peptidek tehát a következők: MBP84-93 (az 1. számú szekvencia 84-93 aminosavcsoportja)

H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH (mért molekulatömeg: 961,98);

MBP85-94 (az 1. számú szekvencia 85-94 aminosavcsoportja)

Η-Pro-V al-V al-His-Phe-Phe-Ly s-Asn-Ile-V al-OH (mért molekulatömeg: 1036,31);

MBP86-95 (az 1. számú szekvencia 86-95 aminosavcsoportja)

H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH (mért molekulatömeg: 1023,99);

MBP87-96 (az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportja)

H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH. (mért molekulatömeg: 921,45).

Az anti-MBP-nek az SM patogenezisében betöltött tényleges szerepe még felderítendő. Az aktív SM-ben szenvedő betegek megnövekedett anti-MBP titereiről elsőként Panitch és munkatársai számoltak be [Panitch, H. S., Hooper, C. S. and Johnson, K. P., Arch., Neurol., 37, 206-209 (1980)], akik tengerimalac-MBP-vel végzett szilárd fázisú radioimmuno-assayt alkalmaztak. Az akut SM relapsus fázisában lévő betegekben általában a túlnyomórészt szabad formában lévő anti-MBP meny35 nyiségének növekedését tapasztalják, míg a klinikai remisszió fázisában lévő betegek esetén az anti-MBPszintek esetenként nem detektálhatok. Az akut relapsus fázisából a remisszió fázisába történő átmeneti szakasz ideje alatt a szabad anti-MBP heteken vagy hónapokon keresztül progresszíven csökken, ugyanakkor az antitest kötött frakciói a kezdeti értékeikhez képest növekednek. A remisszió fázisában lévő más betegek esetén a szabad és a kötött anti-MBP alacsony titerei figyelhetők meg, amelynél az F/B arány általában egységnyinél kisebb; ez arra utal, hogy anti-MBP semlegesítő antitest (antitestek) kötődik (kötődnek) az anti-MBPhez. Esetenként előfordulhat, hogy a klinikailag definiált SM kritériumainak megfelelő betegek vagy a neuropatológiailag igazoltan SM-ben szenvedő betegek a betegségük aktív fázisainak ideje alatt detektálhatatlan anti-MBP-vel rendelkeznek. Elképzelhető, hogy az ilyen betegeknek más mielinprotein antitestjeik vannak. Egy specifikus antitest hiánya nem csökkenti az antiMBP-nek a demielinezési mechanizmusban betöltött tényleges jelentőségét az SM-betegek nagyobb részében.

A közelmúltban egy MBP antitestkaszkádot figyeltek meg az SM CDF-ből tisztított IgG-frakcióban [Warren, K. G. and Catz, I, J. Neurol. Sci., 96, 19-27 (1990)]. Az aktív betegséghez kapcsolódóan mind sza4

HU 217 633 Β bad, mind pedig kötött formájú MBP primer antitestek előfordulnak: az akut relapsus fázisában lévő betegekben az F/B arány körülbelül egységnyi, míg a krónikus progresszív betegségben szenvedő betegek esetén ez az arány egységnyinél kisebb [Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 209, 20-25 (1986); Catz, I. and Warren, K. G., Can. J. Neurol. Sci., 13, 21-24 (1986); valamint Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 21, 183-187 (1987)]. Az anti-MBP-t neutralizáló szekunder antitestek akkor jelennek meg, amikor a betegség inaktívvá válik. Az anti-MBP semlegesítését gátló tercier antitestek akkor vannak jelen, amikor a betegség krónikusan progresszív, és nem válik inaktívvá. Az a tény, hogy az SM elkülönülő fázisaihoz egy MBP antitestkaszkád kapcsolódik, arra utal, hogy az antitestkaszkádnak potenciális jelentősége lehet a betegség természetes előrehaladásának leküzdésében.

Jóllehet az aktív SM-ben szenvedő betegek CSFjében anti-MBP detektálható, az anti-MBP-nek a demielineződés patogenezisében betöltött közvetlen szerepe még bizonyításra vár. Azt, hogy az anti-MBP részt vesz az SM mechanizmusában, legjobban az antiMBP in vivő semlegesítésével határozhatjuk meg, például oly módon, hogy a betegeknek beadjuk a kiválasztott peptideket, majd megfigyeljük a betegség klinikai lefolyását. Amennyiben az anti-MBP csak az SM során történő demielineződéshez kapcsolódó primer antitest, lehetőség nyílik a folyamatnak az olyan kiválasztott peptidek intrathecalis és/vagy intravénás és/vagy orális beadása útján történő blokkolására, amelyek az antiMBP-t semlegesítenék, és in situ elősegítenék az MBP iránti toleranciát. Az SM során történő demielineződésben más humán mielinproteinek is részt vehetnek. Ennek megfelelően a találmány oltalmi körébe tartozik az olyan peptideknek a megfelelő antitestek semlegesítésére történő felhasználása is, amely peptidek szekvenciájukat tekintve lényegében homológok ezen egyéb mielinproteinek aminosavszekvenciájának egy részével. Jóllehet már a korábbiakban is történtek próbálkozások arra, hogy az SM-et heterológ MBP intramuszkuláris vagy szubkután beadása útján kezeljük, ezek a kísérletek nem voltak igazán eredményesek [Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch. Neurol., 29, 10-15 (1973); Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J. Neurol., 216, 27-31 (1977); valamint Romine, J. S. and Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds., Multiple sclerosis, Baltimore, Williams and Wilkins, pp. 621-630 (1982)]. A találmány szerinti, az anti-MBP képződését semlegesítő vagy módosító MBP peptidek intrathecalis és/vagy intravénás beadása lényegesen jobb eredményeket biztosított.

Az SM állatmodell, az experimentális allergiás encephalomyelitis (EAE), egy T-sejt médiáit demielinező betegség. Az EAE a megbetegített egér-MBP szintetikus peptidekkel végzett intraperitonealis inokulációjával enyhíthető [Gaur, A., et al., Science, 258, 1491-1494 (1992)]. Ezen túlmenően egerekben az MBP nagy dózisainak beadása törli az autoreaktív T-sejteket, és enyhíti az EAE klinikai és patológiás tüneteit [Critchfíeld, J. M., et al., Science, 263, 1139-1143 (1994)]. Perifériális tolerancia kiváltásával még az MBP orális beadása is módosítja az EAE-t [Chen, W., et al., Science, 265, 1237-1240 (1994)]. Egy, a közelmúltban elvégzett kettős vak kísérlet azt valószínűsíti, hogy az SM-betegekben mielinantigének orális beadásával is kiváltható tolerancia [Weiner, H. L., et al., Science, 259, 1321-1324 (1993)]. Az SM-betegekben a mielin destrukciójában részt vevő T-sejtek, B-sejtek és makrofágok módosításához szükség lehet arra, hogy orális és/vagy intravénás és/vagy intrathecalis úton a mielinantigéneknek vagy a mielinantigének szintetikus peptidjeinek kombinációját adjuk be.

Ennek megfelelően a találmány kiterjed az olyan gyógyszerkészítményekre is, amelyek egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval összekeverve hatóanyagként egy fentiekben ismertetett peptidet tartalmaznak. A gyógyszerészetileg elfogadható hordozók példái az ezen a területen jártas szakember számára jól ismertek; magukban foglalják például a normál fiziológiás nátrium-klorid-oldatot (a továbbiakban fiziológiás sóoldat).

A találmány szerinti peptideket beadhatjuk humán betegeknek a sclerosis multiplex kezelésére vagy módosítására. Intravénás és/vagy orális beadás esetén az SM kezelésére szolgáló terápiás dózis testtömeg-kilogrammonként körülbelül 1,0 mg és körülbelül 10,0 mg közötti értékű. Amennyiben intrathecalis beadást alkalmazunk, a dózis körülbelül 1 mg és körülbelül 10 mg közötti értékű. Az egyik, találmány szerinti példában a peptidet intravénásán vagy intrathecalisan, illetve kombinációban adjuk be. Az adott eset igényeitől függően a peptideket beadhatjuk egyetlen vagy pedig egymást követő többszörös dózisban.

A találmány részleteit az előnyös megoldások ismertetésén keresztül adjuk meg. Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, amelyek a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

Az aníi-humán mielin alapprotein in vitro semlegesítése

Az 1. ábra az ebben a vizsgálatban alkalmazott 18 h-MBP peptidnek az intakt MBP-molekulához viszonyított lokalizációját mutatja be. A natív MBP-t nem-SM agyszövetből izoláltuk [Diebler, G. E., Martenson, R. E., Kies, M. W., Prep. Biochem., 2, 139-165 (1972)], majd gélszűréssel tovább tisztítottuk. A végső antigénpreparátumok tisztaságát SDS poliakrilamid gélelektroforézissel ellenőriztük. A további vizsgálatokban csak azokat a preparátumokat használtuk fel, amelyek 18,5 KD molekulatömegnek megfelelően migráltak. A semlegesítési kísérletekben tisztított MBP-t alkalmaztunk az antigénspecifikus affínitáskromatográfíás vizsgálatokban és a szilárd fázisú antiMBP radioimmuno-assay során.

A h-MBP teljes hosszát lefedő és 8-25 aminosavcsoportot tartalmazó 18 peptidet, köztük a találmány szerinti peptideket a korábbiakban ismertetett [Groome, N. P., Dawkes, A., Barry, R. et al., J. Neuroimmun, 19,

HU 217 633 Β

305-315 (1988)] Fmoc eljárásnak megfelelően szintetizáltuk. A peptidek tisztaságát reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával ellenőriztük, amelynek során egy Cl8 kolonnát és víz/acetonitril (0,1% trifluor-ecetsav) gradienst alkalmaztunk. A peptidek aminosavanalízisét ugyancsak standard elemzési módszerek alkalmazásával hajtottuk végre. A vizsgálatban alkalmazott peptidek közül több egy nem természetes ciszteincsoportot tartalmazott, mivel ezeket a peptideket azért állítottuk elő, hogy immunogénként funkcionáljanak. Nem valószínű, hogy ez befolyásolná az általunk nyert eredményeket.

A cerebrospinalis folyadékot (CSF) a tünetegyüttes megjelenésétől számított egy héten belül 35, az akut SM relapsus fázisában lévő betegtől nyertük, és az Iglszinteket nefelometriás úton határoztuk meg. A vizsgálatban alkalmazott CSF mintákat a kezdeti nagy abszolút IgG-szintek (> 0,80 g/1) és az anti-MBP megnövekedett ti terei (F/B arány > 1,0) alapján választottuk ki. Valamennyi SM-beteg megfelel a klinikailag definiált betegség kritériumainak.

Az IgG-t akut SM-ben szenvedő betegek koncentrált CSF-jéből protein A-Sepharose (Pharmacia™) affinitáskromatográfiával tisztítottuk, annak megfelelően, ahogyan az a korábbiakban ismertetésre került [Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 96, 19-27 (1990)]. Valamennyi IgG-preparátum tisztaságát poliakrilamid gélelektroforézissel és izoelektromos fokuszálással ellenőriztük. Ha a tisztított IgG-ből származó nagyobb anti-MBP-mennyiségeket MBP-vel nullára abszorbeáltuk, az abszorpció utáni felülúszók visszamaradt IgG-t tartalmaztak.

A tisztított MBP-t a gyártó utasításainak megfelelően CNBr-aktivált Sepharose 4B-hez (Pharmacia™) kapcsoltuk. A kötetlen MBP MBP-Sepharose affmitáskromatográfiával [Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 103, 90-96 (1991)] történő izolálásához kiindulási anyagként az akut SM relapsus fázisában lévő 35 betegtől nyert, megnövekedett anti-MBP-mennyiségeket tartalmazó tisztított CSF IgG-t alkalmaztunk. A tisztított anti-MBP-mintákat poliakrilamid gélelektroforézis útján összehasonlítottuk a kezdeti IgG-forrással. Amikor a tisztított anti-MBP-t MBP-vel nullára abszorbeáltuk, az abszorpció utáni felülúszók nem tartalmaztak visszamaradt IgG-t.

Az anti-MBP konstans mennyiségeit (15 radioaktivitási kötési egység a 100-as skálán 0%-nak felel meg) folyadékfázisban h-MBP növekvő mennyiségeivel (0-1000 ng) vagy az MBP egyedi peptidjeinek növekvő mennyiségeivel (0-10 000 ng) inkubáltuk, majd 1,5 órás inkubálás után valamennyi keverékben meghatároztuk a szabad anti-MBP-mennyiséget. A neutralizációs kísérletekben 7 egyedi SM-betegtől nyert izolált anti-MBP-t, vagy 10 különböző SM-betegtől nyert és egyesített anti-MBP-t alkalmaztunk. Negatív antigénkontrollként (10-1000 ng mennyiségben) borjú thymus hisztont és humán szérumalbumint használtunk. Pozitív antitestkontrollként az MBP64-78 pepiidnek egy monoklonális antitestjét (26-os klón) és az MBP 1-8 peptidnek egy poliklonális nyúl antiszérumát (R155) alkalmaztuk [Groome, N., Harland, J. and Dawkes, A., Neurochem. Int., 7, 309-317 (1985); Barry, R., Payton, M. and Groome, N., Neurochem. Int., 2, 291-300 (1991)]. Negatív antitestkontrollként a 45-50 epitópnak egy másik, egér monoklonális antitestet (16os klón) használtunk.

Az anti-MBP-mennyiségeket szilárd fázisú radioimmuno-assay útján humán MBP-vel határoztuk meg [Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 209, 20-25 (1986); Warren, K. G. and Catz, I., Ann. Neurol., 21, 183 — 187 (1987); valamint Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 91, 143-151 (1989)]. A szabad anti-MBP-mennyiségeket megmértük az affinitáskromatográfíák során nyert összes frakcióban és valamennyi neutralizációs keverékben. A vizsgálatok közötti eltérések minimalizálása érdekében az összes mintát négy párhuzamos kísérletben alkalmaztuk, amelyek során ugyanazt a jódozószert alkalmaztuk.

Amint azt a korábbiakban már említettük, az antiMBP-t a körülbelül 61 aminosavcsoport és a körülbelül 106 aminosavcsoport között elhelyezkedő peptidek semlegesítik. A h-MBP-nek az amino-terminális szakaszát (körülbelül az 1-63 aminosavcsoportokat) és a karboxil-terminális szakaszát (körülbelül a 117-162 aminosavcsoportokat) lefedő peptidek nem semlegesítették az anti-MBP-t. Úgy tűnik, hogy az MBP különböző, nem átfedő szakaszaiból származó peptidek ugyanazt (ugyanazokat) az antitestet (antitesteket) neutralizálják. Ezt az magyarázhatja, hogy az antitestek egy olyan diszkontinuus (összegyűjtött) epitópot azonosítanak, amely különböző szakaszokból származó aminosavakat tartalmaz. Hasonló jelenséget figyeltek meg a korábbiakban Hruby és munkatársai [Hruby, S., Alvord, E. C., Groome, N. P., et al., Molec. Immun., 24, 1359-1364 (1987)], akik kimutatták, hogy egy patkány monoklonális antitest egy fő epitóppal rendelkezett a 112-121 MBP-szekvenciában, de erős keresztreakciót mutatott egy másik epitóppal a 39-91 pepiidben. Több mint valószínű, hogy az antitest két teljesen eltérő, olyan szekvenciával ad keresztreakciót, amelyek nem képeznek diszkontinuus epitópot [Hruby, S., Alvord, E. C., Martenson, R. E., et al., J. Neurochem., 44, 637-650 (1985)]. A neutralizációs adatokat az MBP különböző szakaszaiból származó peptidek azon képessége magyarázhatja, amelynek értelmében a peptidek kölcsönhatásba lépve különböző antitest aminosav-oldalláncokkal elfoglalják az antitest kötőhelyét. Ez a magyarázat összhangban áll azzal a megfigyeléssel, hogy a gátlás kiváltásában a teljes gátlást biztosító peptidek moláris alapon hozzávetőleg százszor kevésbé hatékonyak, mint az intakt MBP. A fentiekben kifejtett hipotézis szerint a peptidklónok nem képesek elérni az eredeti MBP epitóp kötési energiáját.

2. példa

Az anti-humán mielin alapprotein képződésének in vivő semlegesítése vagy módosítása

Betegkiválasztás és kontrollvizsgálatok

A kutatási programba bevont betegeket a következő helyen választottuk ki: Multiple Sclerosis Patient Care

HU 217 633 Β and Research Clinic of the University of Alberta, Edmonton, Kanada. A betegeket előzetesen a Schumacherféle kritériumok [Schumacher, G., A., Beebe, G., Kibler, R. E., et al., Ann. NY Acad Sci., 15, 266-272 (1965)] szerinti sclerosis multiplexszel diagnosztizálták, amelyet az agy mágneses rezonanciavizsgálatával és/vagy CSF immunokémiai profilokkal támasztottak alá. Annak igazolására, hogy a krónikus progresszív SM-ben az antiMBP hosszú időn, hónapokon, sőt éveken keresztül folyamatosan megemelt szinten van, a betegeket ismételt lumbálpunkciónak vetettük alá, majd megfigyeltük az F és B anti-MBP-t. Egy krónikus progresszív SM-ben szenvedő beteg esetén megfigyeltük, hogy az auto-antitest 11 éven keresztül állandóan emelt szinten maradt, miközben az anti-MBP-mennyiségben nem fordult elő spontán csökkenés.

A 24 órán keresztül viszonylag állandóan maradt kezdeti megemelkedett CSF anti-MBP-szintek meghatározása érdekében két betegtől (1F56 és 3M66) két órán keresztül minden 30. percben, majd 24 órával később ismételt CSF-mintát vettünk, és megfigyeltük az F és B anti-MBP-t. Az 1F56 és a 3M66 beteg „időkontroll”-ként szolgált. A két órán keresztül minden 30. percben, majd 24 órával később vett CSF-mintákban az F és B anti-MBP-mennyiségek folyamatosan emelt szinten maradtak.

Ezenkívül két másik betegben (4M45 és 5M59) meghatároztuk azt is, hogy milyen hatása van annak, ha a CSF-be 5 cm³ fiziológiás sóoldatot inokulálunk. Ezek a betegek „idő-fiziológiás sóoldatkontroll”-ként szolgáltak. Amikor intrathecalisan 5 cm³ fiziológiás sóoldatot injektáltunk, a fentiek szerinti mintavételt követően az F és B anti-MBP-szintek az alapvonalnak megfelelő emelt értéken maradtak, ami azt igazolja, hogy az anti-MBP titerekre gyakorolt „hígítási hatás” elhanyagolható.

Az anti-MBP-mennyiségeket humán MBP-vel bevont immulon mikrotitervájatok alkalmazásával végzett szilárd fázisú radioimmuno-assay útján határoztuk meg. Az immulon mikrotitervájatokat 100 μΐ/ml 10 μ g/ml koncentrációjú MBP-vel (1 μg/vájat) vontuk be, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakció bovin-szérumalbuminnal (BSA) történő leállítása, majd háromszori vizes mosás után a vájatokat szobahőmérsékleten tároltuk. A CSF vagy a szövetextraktumok 100 μΐ-es mintáit 0,05% Tween 20-at tartalmazó 0,01 M PBS-sel literenként 0,010 g IgGkoncentrációra hígítottuk, majd az MBP-vel bevont vájatokbán 1-2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ötszöri pufferes (0,05% Tween 20-at tartalmazó 0,01 M PBS) mosás után a vájatokat 0,05% Tween 20-at és 0,5% BSA-t tartalmazó 0,01 M PBS-ben kecske anti-nyúl IgG-FC-vel egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd megismételtük a fenti öblítést. Végül ¹²⁵I-protein A-t (vagy ¹²⁵I-protein G-t) adtunk hozzá, és egy órán át szobahőmérsékletű inkubációt végeztünk. Amikor ^l25I-protein G-t alkalmaztunk trészerként (nyomkövetőként), a vizsgálati pufferben és a reakció leállítása során a BSA helyett ovalbumint használtunk. Háromszori végső vizes mosást követően a vájatokat egyedileg számláltuk. Az eredményeket radioaktivitási egységek formájában fejeztük ki, amelyet a következő egyenlet alapján számítottuk ki: radioaktivitási egység=[(minta beütésszám)-(vak beütésszám)] / [(teljes radioaktivitás beütésszám)-(vak beütésszám)]. Valamennyi mintát tíz ismétléssel vizsgáltuk. Annak érdekében, hogy bármely pozitív mintánál 10 000-nél nagyobb beütésszámot detektáljunk, a számlálást 10 percen keresztül végeztük.

A vizsgálat előtt valamennyi CSF és/vagy szövetmintát literenként 0,010 g végső IgG-koncentrációra hígítottuk. Az F anti-MBP-t közvetlenül a CSF-ben vagy a szövetextraktumban detektáltuk, míg az antitest B mennyiségét az immunkomplexek savas hidrolízise után határoztuk meg. Bevonat nélküli vájatokbán minden egyes mintával nem specifikus kötést hajtottunk végre. Az epitóp lokalizálásához a szintetikus peptideket először egy folyadékfázisú kompetitív vizsgálatban tisztított antitesttel reagáltattuk, majd radioimmuno-assay alkalmazásával az így nyert keverékek mindegyikében meghatároztuk az anti-MBP-t. A kombinált kompetitív kötési vizsgálat és radioimmuno-assay eredményeit a szintetikus peptid százalékos gátlásaként, 100-radioaktivitási egység formájában fejeztük ki. A mintákat 10 ismétléssel vizsgáltuk. A számlálást egy LKB1275 Minigamma-számlálóban 10 percen keresztül végeztük. Pozitív kontrollként 5 előre meghatározott hígításban a szövettisztított anti-MBP közös oldatát alkalmaztuk. Negatív kontrollként nem neurológiai betegektől nyert egyesített CSF-et használtunk. A vizsgálat reprodukálhatósági értéke 3 és 5% közötti; a vizsgálati eltérések 7%-nál kisebbek voltak.

A kontrollkísérletek emelt és konstans CSF antiMBP-szintjeinek állandósága képezi a kutatás következő lépését.

Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott valamennyi peptidet a Procyon Inc. (London, Ontario, Kanada) Fmoc [9-(metoxi-karbonil)-fluorén] eljárásával, „good manufacturing product” (GMP) kód alatt szintetizáltuk. A peptidek tisztaságát reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfíával ellenőriztük, amelynek során egy Cl8 kolonnát, valamint 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz/acetonitril gradienst alkalmaztunk. A tömegspektroszkópiás vizsgálatokat és az aminosavanaliziseket standard módszerekkel végeztük. Az inokulációt megelőzően valamennyi peptidet leellenőriztettük a pirogenicitásra (Vancouver General Hospital, Vancouver, Kanada), a sterilitásra (Provinciái Laboratory fór Public Health fór Northern Alberta, Edmonton, Kanada) és az akut toxicitásra (Health Sciences Laboratory Animál Services, University of Alberta, Edmonton, Kanada) nézve. A peptidek „humán szervezetbe történő beadásra alkalmas” minősítést kaptak. A kódolt szintetikus peptidek megfelelő mennyiségeit feloldottuk 5 cm³ steril fiziológiás sóoldatban [0,9%-os injekciós, USA gyógyszerkönyvi, nempirogén vizes nátrium-klorid-oldat (Baxter Corp., Toronto, Ontario, Kanada)], az oldatot kétszer átszűrtük 0,22 pm-es sterilizáló szűrőegységeken (Miller-GX, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok),

HU 217 633 Β majd egy lumbálpunkciós eszköz segítségével beadtuk a CSF-be.

Az SM anti-MBP MBP epitópja

Az SM anti-MBP MBP epitopjának további lokalizálása érdekében CSF-ből és SM agyszövetből affinitáskromatográfiával tisztított F és B anti-MBP-t [Warren,

K. G., et al., Ann. Neurol., 35, 280-289 (1994)] a kompetitív gátlási vizsgálatokban 41 olyan MBP szintetikus peptiddel reagáltattunk, amelyek egyenlő hosszúságúak voltak (mindegyik peptid 10 aminosavcsoportból állt, és a szomszédos peptiddel 9 aminosavcsoporton keresztül átfedésben volt), és lefedték a humán MBP 61 és 110 aminosavcsoportja közötti területet. A maximális gátlást biztosító peptid(ek) volt(ak) az antitestkötő helyhez legnagyobb mértékben kapcsolódó peptid(ek). 15

Az SM agyszövetből tisztított F és B anti-MBP maximális (> 80%) gátlását négy peptid, nevezetesen az MBP84-93, az MBP85-94, az MBP86-95 és az MBP87-96 eredményezte, ami arra utal, hogy az SM anti-MBP MBP epitópja a 84 és 96 csoport között he- 20 lyezkedik el. A közös aminosavcsoportok legkisebb területe a 87 csoporttól a 93 csoportig teljed. A B anti-MBP szőkébb tartománnyal rendelkezik, mint az F antitest.

Az anti-MBP antitesteknek az SM demielineződés patogenezisében betöltött szerepe még nem tisztázott; 25 jelenleg csak az anti-MBP in vivő módosításával és ezt követően a klinikai és patológiás következmények megfigyelésével határozható meg. Például az SM akut relapsus fázisának ideje alatt, amikor az F/B antitestarányok egységnyinél nagyobbak, egy ismert F antiMBP-t kötő peptidet inokulálhatunk intrathecalisan annak érdekében, hogy megkössük a szabad keringő antitestet, és leállítsuk az akut relapsus klinikai hatásait; a remisszió előfordulásáig hetenkénti beadásra lehet szükség. A krónikus progresszív fázisban lévő SM-betegek esetén az anti-MBP-t termelő gyulladási mechanizmus alulszabályozásához intravénás és intrathecalis peptidbeadásra lehet szükség.

Szekvenciák jegyzéke

Az 1. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 170 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: protein (vi) Eredeti származás:

(A) Szervezet: homo sapiens (vii) Közvetlen származás:

(B) Klón: humán mielin alapprotein (ix) Az 1. számú szekvencia leírása:

Al a 1

Ser

G1 n

Ly s

Arg 5

Pro

Ser

Gin

Arg

Hi s 10

Gly

Ser

Ly s

Tyr

Leu 15

Al a

Thr

Al a

Ser

Thr

Me t

As p

Hi s

Al a

Arg

Hi s

Gly

Phe

Leu

Pro

Arg

Hi s

20

25

30

Arg

As p

Thr

Gly

I 1 e

Leu

As p

Ser

I le

Gly

Arg

Phe

Gly

As p

35

40

45

Arg

Gly

Al a

Pro

Ly s

Arg

Gly

Ser

Gly

Ly s

As p

Ser

Hi s

Pro

Al a

50

55

60

Arg

Thr

Al a

Hi s

Tyr

Gly

Ser

Leu

Pro

Gin

Ly s

Ser

Hi s

Gly

Arg

Thr

65

70

75

80

G1 n

As p

Glu

As n

Pro

Val

Hi s

Phe

Ly s

Asn

I le

Va 1

Thr

Pro

85

90

95

Arg

Thr

Pro

Ser

Gin

Gly

Ly s

Gly

Arg

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

100

105

110

Arg

Phe

Ser

Trp

Gly

Al a

Glu

Gly

Gin

Arg

Pro

Gly

Phe

Gly

Tyr

Gly

1 15

120

125

Gly

Arg

Al a

Ser

As p

Tyr

Ly s

Ser

Al a

Hi s

Ly s

Gly

Phe

Ly s

Gly

Va 1

130

135

140

As p

Al a

Gin

Gly

Thr

Leu

Ser

Ly s

I 1 e

Phe

Ly s

Leu

Gly

Arg

As p

145

150

155

160

Ser

Arg

Ser

Gly

Ser

Pro

Me t

Al a

Arg

165

170

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Az anti-mielin alapprotein képződését semlegesíteni vagy módosítani képes

MBP84-93 - az 1. számú szekvencia 84-93 ami- 55 nosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH MBP85-94 - az 1. számú szekvencia 85-94 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-OH 60

MBP86-95 - az 1. számú szekvencia 86-95 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH, vagy

MBP87-96 - az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH peptid.
2. Gyógyszerkészítmény, amely egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval összekeverve egy, az

HU 217 633 Β anti-mielin alapprotein képződését semlegesíteni vagy módosítani képes

MBP84-93 - az 1. számú szekvencia 84-93 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH MBP85-94 - az 1. számú szekvencia 85-94 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-OH MBP86-95 - az 1. számú szekvencia 86-95 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH, vagy

MBP87-96 - az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH pepiidet tartalmaz.
3. Egy, az anti-mielin alapprotein képződését semlegesíteni vagy módosítani képes

MBP84-93 - az 1. számú szekvencia 84-93 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-OH MBP85-94 - az 1. számú szekvencia 85-94 amino5 savcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-OH MBP86-95 - az 1. számú szekvencia 86-95 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-OH, vagy

MBP87-96 - az 1. számú szekvencia 87-96 aminosavcsoportjának megfelelő szekvenciájú H-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-OH peptid alkalmazása gyógyszerkészítmény előállítására.
4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a hatóanyagot intravénásán, intrathecalisan, orálisan vagy ezek kombinációinak formájában adagolható gyógyszerkészítmény előállítására alkalmazzuk.