FI120308B - Peptidi, joka pystyy neutraloimaan tai muuntamaan myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen tuoton - Google Patents

Description

Peptidi, joka pystyy neutraloimaan tai muuntamaan myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen tuoton 5 Keksinnön piiri Tämä keksintö koskee valittuja polypeptidejä ja niiden käyttöä ihmisen emäksisen myeliiniproteiinin vasta-aineen immunologisessa säätelyssä. Tämä keksintö koskee myös uusia farmaseutti- 10 siä koostumuksia, joka sisältävät valittuja polypeptidejä sekä näiden peptidien käyttömenetelmää pesäkekovettumataudin hoi dossa .

Tausta ja aiempi tekniikan taso 15

Pesäkekovettumatauti eli multippeli skleroosi (MS) on ihmisen keskushermostojärjestelmän (CNS) sairaus, johon liittyy moni- pesäkkeinen myeliinikato sekä tulehdus. MS:n tuntomerkki on veri-aivoesteen sisäinen (intra-BBB), lisääntynyt IgG:n syn- 20 teesi (Tourtelotte, W.W., J. Neurol. Sei. 10: 279-304, 1970;

Link, H ja Tibbling, G., Scand. j. Clin. Invest. 37: 397-401, ·*·.· 1977; Tourtelotte, W. W. ja Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978; • · . Walsh, J. M. ja Tourtelotte, W. W., julkaisussa, Hallpike, J.

• · · . F., Adams, C. W. M. ja Tourtelotte, W. W. , julkaisijat, • · · 25 Mulpiple sclerosis, Baltimore. Williams & Williams, 1982: 275- .. 358; sekä Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 17: 475-480, : *’ 1985) .

·«« • · ♦ • » ·

IgG-synteesi BBB:n sisällä lisääntyy tavallisesti kliinisesti • · : 30 tarkalleen määrätyissä MS-potilaissa, joilla on aktiivinen tai • · · inaktiivinen sairaus (Schumacher, G. A., Beebee, G., Kibler, :·[·. R. E., et ai., Ann. NY Acad. Sei. 15:266-272, 1965). CNS-IgG:n • · *..I pääosan psesifisyys on tuntematon. Vaikka pienellä osalla on • · ’Γ viruksenvastaista aktiivisuutta tai reaktioita aivojen anti- • · *.*.· 35 geenejä, nukleiinihappoja, erytrosyyttejä tai pehmeän lihaksen antigeenejä kohtaan, epäspesifinen osa voi edustaa B-solujen polyklonaalista aktivoitumista Tourtelotte, W. W. ja Ma, B.,

Neurology 28:76-83, 1978). Viime vuosikymmenen aikana on ollut huomattavaa mielenkiintoa spesifisten myeliiniproteiinien vasta-aineiden tutkimusta kohtaan.

2 5 Sen jälkeen kun oli ilmaistu kiertäviä immuunikomplekseja, jotka sisälsivät myeliinin emäksistä proteiinia (MBP) antigeenisenä komponenttinaan (Dasgupta, M. K., Catz, I., Warren, K.

G. et ai., Can. J. Neurol. Sei. 10:239-243, 1983), havaittiin sellaisten potilaiden selkäydinnesteessä (CSF) MBP:n vasta-10 aineen (anti-MBP) lisääntyneitä tiittereitä, joilla oli MS:n aktiivisia muotoja (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 209:20-25, 1986). MS:lle ovat kliinisesti luonteenomaisia sairauden aktiivisuuden jaksot, kuten akuutit uudelleen sairastumiset tai taudin krooninen eteneminen sekä taudin tila-15 päisen hellittämisen kliiniset vaiheet. Aktiiviseen MS:ään liittyvät intratekaalisesti tuotetun anti-MBP:n lisääntyneet tasot (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol.209:20-25, 1986; sekä Catz, I. ja Warren, K. G., Can. J. Neurol. Sei. 13:21-24, 1986). Nämä vasta-aineet esiintyvät pääasiallisesti vapaassa 20 (F) muodossa akuuttien uudelleensairastumisten aikana ja val litsevasti sidotussa (B) muodossa, kun sairaus etenee sala-kavalasti (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 209:20-25, : 1986). Akuuttien uudelleensairastumisten aikana CSF:n anti- • · · . MBP-tiitterit korreloivat sairauden aktiivisuuden kanssa • · · 25 (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 21:183-187, 1987).

• ·

Anti-MBP:n tasot lisääntyivät myös potilailla, joilla oli • · · *... optisen neuriitin eli näköhermotulehduksen ensimmäisiä koh- • · · *·* tauksia, ja useimmilla potilailla, joilla sattuivat MS:n ensimmäiset kohtaukset (Warren, K. G., Catz, I. ja Bauer, C., • · : 30 Ann. Neurol. 23:297-299, 1988; Warren, K. G. ja Catz, I., J.

Neurol. Sei. 91:143-151, 1989).

• · · • · · • · [··’.' CSF:n anti-MBP-tasojen pitkittäiset, kineettiset tutkimukset Φ m ’1' potilaissa, jotka tulivat akuutin uudelleen sairastumisen • · • * · I— ·.·.* 35 • · 3 jälkeen toipumisvaiheeseen, havainnollistivat, että F:n anti-MBP-tiitterit vähenivät asteittain, mikä oli oikeassa suhteessa B-fraktioissa tapahtuvaan, etenevään lisääntymiseen (Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 91: 143-151, 1989; 5 Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 88:185-194, 1988). Taudin tilapäisessä hellittämisvaiheessa voi olla, että CSF:n anti-MBP ei ole ilmaistavissa, mikä viittaa siihen, että MS:n inaktiiviseen vaiheeseen liittyy anti-MBP:n neutraloituminen (Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 88:185-194, 1988). 10 Sitävastoin kroonisesti etenevälle MS:lie on ominaista, että lisääntynyt anti-MBP säilyy pitkiä aikoja, mikä liittyy anti-MBP:n neutraloitumisen estymiseen (Warren, K. G. ja Catz, I., Neurol. Sei. 88:185-194, 1988). Viime aikoina on havaittu, että myeliinin emäksisen proteiinin vasta-ainekaskadi, joka 15 tunnistettiin MS-potilaiden CSF:stä puhdistetussa IgG-jakeessa, sisälsi anti-MBP:tä, vasta-aineita, jotka neutraloivat anti-MBP:n, sekä vasta-aineita, jotka inhiboivat anti-MBP:n neutraloinnin (Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 96:19-27, 1990).

20 Tämän keksinnön tekijöiden aiempi tutkimus on havainnollista- :*·.· nut, että B-solun autoimmuniteettiin liittyvän katsantokannan • · . perusteella on olemassa ainakin kaksi MS:n erillistä muotoa, ··· . .·. siten että potilaiden pääosalla on autovasta-aineita myeliinin • « » 25 emäksistä proteiinia kohtaan (anti-MBP) ja potilaiden vähem- • · .. mistöllä on vasta-aineita proteolipidiproteiinia kohtaan • · *... (anti-PLP) (Warren, K. G. et ai., Ann. Neurol. 35, 280-289, **’ * 1994). Anti-MBP:n liittyvässä MS:ssä sairauden akuutit uusiu tumiset ovat yhteydessä kohonneisiin vapaan (F) ja sidotun • · : 30 (F/B) anti-MBP:n suhteisiin, kun taas pienemmät anti-MBP:n • · « ·...· F/B-suhteet ovat luonteenomaisia kroonisesti etenevälle vai- heelle, ja potilailla, joilla tauti hellittää tilapäisesti, on • · harvemmin vähän suurentuneita anti-MBP-tiittereitä (Warren, K.

*1* G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 88, 185-194, 1989).

• · • * * -> f ·.·.· 35 • · 4

On havainnollistettu, että MS-potilaiden jotkut lisääntyvät T-solut kohdistuvat MBP:hen (Allegretta et ai., Science, 247, 718-721, 1990) ja että ihmisen T-solut voivat tunnistaa moninaisia epitooppeja molekyylin pinnalla (Richert et ai., J. 5 Neuroimmun. 23, 55-66, 1989). MBP näyttää pystyvän myös aktivoimaan joitakin T-soluja sekaantumatta antigeeniä edustaviin soluihin (Altman et ai., Eur. J. Immun. 17, 1635-1640, 1987). On todennäköistä, että T-solut voivat tunnistaa MBP:n pienet peptidit vaatimatta solunsisäistä käsittelyä, yksinkertaisesti 10 kyvyllään sitoutua luokan II pääasiallisiin histokompatibili-teettiantigeeneihin eli kudossopeutumisantigeeneihin läsnä olevien solujen pinnalla.

Koska kokeellinen, allerginen aivo-selkäydintulehdus eli enke- 15 falomyeliitti (EAE), MS:n hyväksytty eläinmalli, voidaan saada aikaan rokottamalla jyrsijöitä joko MBPrllä tai PLP:llä, joka on yhdistetty Freundin täydelliseen adjuvanttiin, MS:n mye- liinikadolla voi olla autoimmuunimekanismi (Fritz, R. B. et ai., J. Immunol. 130, 1024-1026, 1983; Trotter, J. L. et ai., 20 J. Neurol. Sei. 79, 173-188, 1987). B-solun autovasta- ainenäkökulmasta käsin, MBP-epitooppi, jota sairausprosessi ;1·.· käyttää maalitauluna, on paikannettu proksimaalisesti tri- • · . Prolil-sekvenssiin (tähteet -99-100-101-), alueeseen, joka si- ··· . jaitsee tähteiden 80 ja 100 välissä (Warren, K. G. et ai., • · « 25 Ann. Neurol. 35, 280-289, 1994). Tämä B-soluepitooppi menee • · .. päällekkäin sellaiselle MBP:lie reaktiokyisten T-solujen • · • · · suhteen immunodominoivan epitoopin kanssa, jota esiintyy MS:n • · » *·’ 1 aivovaurioissa (Oksenberg, J. R. et ai.. Nature, 362, 68-70, 1993) .

IA: 30 • · · ’ ϊ Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MBP neutraloi anti- • · · MBP:n. Aiemmat yritykset hoitaa MS:ää heterologisen MBP: n • · *..! lihaksensisäisellä tai ihonalaisella annolla eivät ole kuiten- • · • · T1 kaan onnistuneet (Campell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. ja • · ·.·.· 35 Lorenz, R., Arc. Neurol. 29:10-15, 1973; Gonsette, R. E., ί**ί Delmotte, P. ja Demonty, L., J. Neurol. 216:27-31, 1977; sekä 5

Romine, J. S. ja Salk, J., julkaisussa Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. ja Tourtelotte, W. W., toimittajat) Multiple sclerosis., Baltimore, Williams & Williams, 1982:621-630). Natiivin MBP:n käytössä on kaksinkertainen ongelma. Proteiini 5 valmistetaan ihmisen aivonäytteistä, ja näin ollen on olemassa mahdollinen vaara, että näytteessä on läsnä piileviä neurovi-ruksia. Toiseksi, vaikka MBP ei ole normaalisti immunogeeni, on mahdollista, että kun sitä annetaan yksilöille, joiden immuunijärjestelmä on muuttunut, MBP voi toimia antigeeninä ja 10 aiheuttaa vasta-aineiden tuoton itseään vastaan.

Tämä keksintö ratkaisee näin ollen, voisivatko humaani MBP:n (h-MBP) valitut peptidit neutraloida anti-MBP:n, joka on puhdistettu sellaisten MS-potilaiden CSF:stä, jotka ovat 15 sairastuneet akuutisti uudelleen. Tähän tarkoitukseen käytettiin synteettisiä peptidejä, jotka kattavat h-MBP:n koko pituuden, h-MBP:n sellaisen mahdollisen epitooppialueen määrittämiseksi, joka neutraloi anti-MBP:n, joka on saatu näistä potilaista. Sellaisia valittuja peptidejä, jotka neutraloivat 20 anti-MBP:tä, voidaan käyttää MS:n hoitoon tehokkaammin kuin täysimittaista MBP:tä. Näitä peptidejä ei esiinny luonnossa, :1·.· ja mitään mahdollista neurovirusten uhkaa sellaisenaan ei voi • · . olla olemassa. Sitä paitsi nämä peptidit eivät voisi toimia • · · . immunogeeneinä pienen kokonsa vuoksi. Valittujen peptidien • · · 2 5 käyttö MS:n hoidossa voittaisi sen tähden ongelmat, joita on • · .. tunnistettu natiivin proteiinin käytössä.

• · • ·· • · · • · · ’·’ 1 Tämän keksinnön peptidejä tutkittiin vielä niiden tehokkuuden määrittämiseksi, kun sidotaan MS-anti-MBP:tä tai muunnetaan • · : 30 sen tuottoa in vivo.

··1 • · • · ··· :v. Keksinnön yhteenveto « · • · · · • · ♦ · Tämän keksinnön mukaan annetaan käyttöön peptidejä, joiden 6 tivaatimuksissa.

Tämän keksinnön mukaan peptidit ovat seuraavan kaavan mukaisia: 5 R1-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2 tai niiden suoloja, jossa kaavassa Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile- ovat SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 87-93 ja Rx valitaan 10 ryhmästä, jossa on:

Asn-Pro-Val-;

Pro-Val-;

Vai-;

Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; 15 Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; vety; ja hydroksi ja R, valitaan ryhmästä, jossa on: -Vai; 20 -Val-Thr; -Vai-Thr-Pro; :*·.♦ -Val-Thr-Pro-Arg-; • · . vety; ja ♦ ♦ · • # · . hydroksi; ♦ · · 25 edellyttäen, että Rx ja R2 eivät molemmat ole vety tai • · .. hydroksyyli samanaikaisesti. Peptidi voi sisältää substi- • · °mm[m tuutioita, deleetioita tai niiden lisäyksiä, edellyttäen, että • · · *·’ ’ peptidi säilyttää anti-MBP:n neutralointi- tai sen tuoton modulointifunktion.

f*·· 30 • · ·

Mainittujen peptidien esimerkit valitaan seuraavista pepti- .*··. deistä: • · j”. MBP75-95 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 75-95) . Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai Hi s Phe V.· 3 5 Phe Lys Asn Ile Vai Thr *:·*: MBP64-78 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 64-78)

Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly MBP61-75 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 61-75) 7

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys MBP69-83 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 69-83)

Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu MBP80-97 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 80-97) 5 Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg MBP91-106 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 91-106)

Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 10 MBP84-93 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 84-93)

Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile MBP85-94 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet) Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val MBP86-95 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 86-95) 15 Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr MBP87-96 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 87-96) Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro Tämän lisäksi tämän keksinnön mukaan saadaan aikaan farmaseut-20 tisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena ainesosana edellä kuvattua peptidiä joko yksinään tai yhdistettynä seok-sessa farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

• · • · · • · · • · · . .·. Tämän keksinnön mukaan saadaan vielä aikaan sellainen menetel- • · · 2 5 mä pesäkekovettumataudin hoitamiseksi, jossa annetaan tehokas • · määrä edellä kuvattua peptidiä, joko yksinään tai yhdistetty- • · · *... nä, jotta neutraloidaan tehokkaasti ihmisen myeliinin emäksi- • · · ’·* ’ sen proteiinin vasta-aineen tuotto tai muunnetaan sitä.

• · : ’·· 3 0 Piirrosten lyhyt kuvaus • · · • · • · • · · .···. Kuvio 1 esittää kahdeksantoista synteettisen peptidin paikal- • · listamista (pienet luvut) suhteessa intaktiin ihmisen MBP- • · . molekyyliin. Peptidejä edustavat pystysuorat sauvat, jotka on • · ·.·.· 35 sijoitettu MBP-molekyylin vastaavan alueen viereen. Suuret ’!**! luvut edustavat ihmisen MBP:n aminohappotähteitä.

Kuvio 2 esittää ihmisen MBP:llä ja MBP-peptideillä toteutuvan 8 sellaisen anti-MBP:n inhiboitumiskäyriä, joka on saatu kymmeneltä pesäkekovettumatautia potevalta potilaalta ja joka on puhdistettu sekä yhdistetty.

5 Kuvio 3 esittää ihmisen MBP:llä ja peptideillä MBP80-97; MBP91-106 sekä MBP75-95 toteutuvaa sellaisen anti-MBP:n neutralointia, joka on saatu yksittäiseltä pesäkekovettumatautipo-tilaalta.

10 Kuvio 4 esittää CSF:n anti-MBP-tiittereiden pitkäaikaista tarkkailua, joka on toteutettu potilaalla, jolla on krooninen, etenevä MS:

Anti-MBP.-n F- (vapaa) ja B- (sidottu) tasot lisääntyivät 15 jatkuvasti, kun näytteitä otettiin 26 kertaa 11 vuoden mittaisen jakson aikana vuodesta 1983 vuoteen 1993.

cpm: iskuja minuutissa 20 cpm (näyte) - cpm (tausta) radioaktiivisuusyksiköt = ------------------------------- cpm (totaalinen) - cpm (tausta) • * • · · • · · • * . ·'. avoimet ympyrät: sidottu (B) anti-MBP, joka on määritetty CSF- • · · . 2 5 immuunikompleksien happamen hydrolyysin jälkeen.

• · · • · · • ·

.. suljetut ympyrät: vapaa (F) anti-MBP

• ·· • · · • · ·

Kuvio 5 - Kontrollipotilaat: CSF:n anti-MBP-tasot kahdessa 30 "aikakontrollissa" (1F56, kuvio 5A sekä 3M66, kuviossa 5B) • · : *·· sekä kaksi aika-keittosuolakontrollia" (4M45, kuvio 5C ja • · ·

%..· 5M59, kuvio 5D) . Sekä vapaa (F) että sidottu (B) anti-MBP

.··♦. pysyi kaikilla neljällä potilaalla jatkuvasti lisääntyneenä • · perustasolla, kun CSF:n näytteet otettiin joka 30. minuutti • · . 35 ensimmäisten kahden tunnin ajan sekä 24 tuntia myöhemmin.

• ·

Symbolit ovat samat kuin kuviossa 4.

Kuvio 6 - Potilaiden väliset peptiditutkimukset: CSF:n anti-MBP-tasot neljän sellaisen potilaan ryhmässä (10F38, kuvio 6A; • · 9 13F43, kuvio 6C; 5M59, kuvio 6D; sekä 3M66, kuvio 6G) , jotka saivat lisääntyviä määriä (vastaavasti 1, 2,5, 5 ja 10 mg) sitoutumatonta synteettistä peptidikontrollia MBP35-58, sekä neljän muun MS-potilaan parillisessa ryhmässä (6F53, kuvio 6B; 5 8M41, kuvio 6D; 4M45, kuvio 6F; sekä 1F56, kuvio 6H) , jotka saivat lisääntyviä määriä (vastaavasti 1, 2,5, 5 ja 10 mg) anti-MBP:tä sitovaa synteettistä peptidiä MBP75-95. Peptidi MBP75-95 sitoi CSF:n anti-MBP:n vapaata muotoa (F) tavalla, joka ei ollut annoksen mukainen ja joka ei reagoinut peptidin 10 MBP35-58:n kanssa. Sidottu anti-MBP jäi käytännöllisesti katsoen koskemattomaksi.

Kuvio 7 - Potilaansisäiset peptiditutkimukset: Kun MS-potilaat olivat joko "aikakontrolleja" (5F56, kuvio 70 ja 3M66, kuvio 15 7D) tai "aika-keittosuolakontrolleja" (5M59, kuvio 7A ja 4M45, kuvio 7B) tai kun ne saivat sitoutumatonta kontrollipeptidiä MBP35-58 (5M59 ja 3M66), niiden CSF:n anti-MBP:n sekä F- että B-tasot säilyivät koskemattomina. Sitä vastoin kun samat potilaat 4M45, 1F56 ja 3M66 saivat myöhemmin 5-10 mg anti-MBP:tä 20 sitovaa peptidiä MBP75-95, niiden anti-MBP:n F-muoto tuli ha-vaitsemattomaksi aina seitsemän päivän mittaiseksi ajaksi, ja ;*.J se palasi perustasolle 10 - 21 päivän kuluessa.

• · • · · • · · . Kuvio 8 - Synteettisen peptidin anto toistettuina intrate- • · · 25 kaalisina ruiskeina: kroonisesti etenevää MS:ää poteva potilas .. sai 10 viikottaista sellaista ruisketta suoraan CSF:ään, • · • ** joissa kussakin oli 10 mg MBP75-95:ttä; anti-MBP:n F- ja B- • · · • · · ’·* * tiitterit mitattiin ennen (ympyrät) ja 3 0 minuutin kuluttua (neliöt) kustakin siirroksesta. F-anti-MBP (suljetut ympyrät ·· • *·· 30 ja neliöt) tehtiin ei-ilmaistaviksi 10 viikon mittaiseksi ajaksi, kun taas B-vasta-aine pysyi olennaisesti muuttumatto- ··· e.I. mana (avoimet ympyrät ja neliöt) .

• · ··· • \ Kuvio 9 - Synteettisen peptidin anto laskimoon: CSF:n anti- 35 MBP-tasot, sen jälkeen kun oli annettu laskimoon yksi ruiske, *:··· jossa oli 500 mg MBP75-95:ttä; sekä F- että B-anti-MBP-tasot vähenivät merkittävästi, kun ne tutkittiin 10, 16 ja 30 päivän kuluttua ruiskeesta. Symbolit ovat samat kuin kuviossa 4.

10

Kuvio 10 - MBP-epitoopin hieno lisäerittely MS:n anti-MBP:n suhteen, siten että käytetään sellaisten 41 dekapeptidin sarjaa, jotka peittävät alueen, joka on tähteiden 61 ja 110 5 välillä.

Selitys: - sauvat edustavat inhibitioprosenttia = 100 - radioaktii- visuusyksiköt - MBP:tä ja peptidiä MBP75-95 käytettiin positiivisina kontio rolleina, ja ne tuottivat MBP51-60:n ja MBPlll-120:n sekä F- ja B-vasta-aineiden täydellisen inhibition (100 prosenttisen) - peptidejä MBP51-60 ja MBP111-120 käytettiin negatiivisina kontrolleina, ja ne inhiboivat F- ja B-anti-MBP:tä niin vähän (0-10 prosenttia), ettei sillä ollut merkitystä 15 - dekapeptidit MBP84-93, MBP85-94, MBP86-95 ja MBP87-96, jotka tuottivat sekä F-ja B-vasta-aineen maksimi inhibition (90 -100 prosenttia), olivat suuressa määrin liittyneet MBP-epi-tooppiin - pisteviiva: inhibitiomäärityksen 95 prosentin luotettavuus- 20 rajat .·. : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · · • · • · · • · · Tämä keksintö koskee valittuja peptidejä, joiden sekvenssi on • · · *··) 25 olennaisesti homologinen ihmisen myeliinin emäksisen proteii nin aminohapposekvenssin osan kanssa. "Olennaisesti homologi- • · ί ** nen" tarkoittaa, että voi olla vähän vaihtelua ihmisen myelii- • · · V · nin emäksisen proteiinin ja peptidien aminohapposekvenssien välillä, edellyttäen että peptidit, joiden aminohapposekvens-30 sissä on vaihtelua, toimivat vielä niille tarkoitetussa käy-tössä, se on, ne neutraloivat ja muuntavat ihmisen myeliinin • · · .1. emäksisen proteiinin vasta-aineiden (anti-MBP) tuottoa. Tämän • · *···[ keksinnön perusteella olisi alan ammattimiehelle ilman muuta * selvää määrittää kokeellisesti, mikä variaatio voidaan tehdä 3 5 valittujen peptidien sekvenssiin vaikuttamatta peptidien φ · funktioon.

Tähän keksintöön perustuen, kompetitiivisten inhibitiomääri- • · 11 tysten perusteella, joissa käytettiin 41 dekapeptidin sarjaa, MS:n anti-MBP:lle MBP-epitooppi on paikannettu alueeseen, joka sijaitsee aminohapon 82 ja aminohapon 98 välissä ja joka inhiboi sidottua anti-MBP:tä enemmän kuin 40-prosenttisesti ja 5 vapaata anti-MBP:tä enemmän kuin 60 prosenttisesti. Inhibition suurimman tason perusteella MBP-epitooppi MS-anti-MBP:lie on luultavasti aminohapon 84 ja aminohapon 96 välissä. Tehokkaiden dekapeptidien pienin yhteinen alue on aminohaposta 87 aminohappoon 93. Tämän keksinnön mukaan peptidejä ja niiden 10 suoloja voidaan kuvata täten seuraavalla kaavalla:

Rj-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-^ jossa Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile- on SEQ ID NO:l:n aminohap-15 potähteet 87 - 93 ja jossa Rx valitaan ryhmästä, jossa on: Asn-Pro-Val-;

Pro-Val-;

Vai-;

Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; 20 Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; vety; ja ; hydroksi • · · * ja R, valitaan ryhmästä, jossa on: -vai ; *···’ 25 -Val-Thr; ’ * -Val-Thr-Pro; ·· : ’·· -Val-Thr-Pro-Arg-; ··« V ·’ vety; ja hydroksi ·*·.. 3 0 ; edellyttäen että Rx ja R2 eivät molemmat ole vety tai .***. hydroksyyli samanaikaisesti.

• · · • · · • · ’···[ Seitsemän aminohappoa, jotka ulottuvat aminohappoasemasta 87 * * asemaan 93, olisivat luultavasti riittävän suuria sitomaan 3 5 tehokkaasti anti-MBP:n. Rx ja R2 molemmat eivät voi olla täten • · vety tai hydroksi samanaikaisesti.

Kun Rx tai R2 on aminohappo, se voidaan valita luonnossa esiin- 12 tyvien aminohappojen joukosta. Rt tai R3 eivät rajoitu aminohappoihin, jotka ovat ylävirtaan tai alavirtaan Val87:stä ja Ile93:sta ihmisen myeliinin emäksisessä proteiinissa, kuten esitetään SEQ ID NO:l:ssä. Voidaan käyttää erilaisia muunnok-5 siä Rx:n ja R2:n ylävirta- ja alavirtasekvensseissä, substituutiot, lisäykset tai deleetiot mukaan luettuina. Tämän lisäksi voidaan sekvenssiin -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile tehdä modifikaatioita, substituutiot, lisäykset tai deleetiot mukaan luettuina, edellyttäen että näin tuotetut peptidit toimivat 10 vielä niille tarkoitetussa käytössä, se on, neutraloitaessa ja muunnettaessa myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineiden tuottoa.

Termi "polypeptidin tähde" tai "polypeptiditähde" on tarkoi-15 tettu sisältämään di-, tri- ja suurempia polypeptidejä, proteiinit tai niiden fragmentit mukaan luettuina. Kuten edellä, kun R3 tai R2 on polypeptiditähde, Rx tai R2 ei rajoitu pepti-deihin, jotka sijaitsevat ihmisen myeliinin emäksisessä proteiinissa ylävirtaan tai alavirtaan Val87:stä ja Ile93:sta. 20 Voidaan käyttää mitä tahansa peptiditähdettä.

.·. : R. ja (tai) R, voivat olla sekvenssin -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn- . '·[ Ile tai sen muunnosten toisto, substituutiot, lisäykset tai • · · **I deleetiot mukaan luettuina. Peptidi voisi täten sisältää anti- • · · • · · **·. 2 5 MBP:n sitoutumiskohdan (epitoopin) monia kopioita.

• · ·· • · ϊ ** Tämän keksinnön yhdisteitä voidaan valmistaa polypeptidien ··· *.* · tavanomaisten ja hyvin tunnettujen synteesimenetelmien mukaan.

Termin "peptidi" piiriin kuuluvat myös sellaiset peptidit, 3 0 jotka on saatu myeliinin luonnossa esiintyvien emäksisten proteiinien kontrolloidusta hydrolyysistä, joka on toteutettu • · · .I. tämän keksinnön mukaisten peptidien tuottamiseksi. Termin • · • · ·*·. "peptidi" piiriin kuuluvat myös peptidit, jotka on tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Kun tunnetaan valittujen peptidien 35 sekvenssi, kuten tässä keksinnössä julkaistaan, tämän keksin- • · ·:··· nön piiriin sisältyy myös sopivan sellaisen DNA-sekvenssin määrittäminen, joka koodittaa valittua aminohapposekvenssiä. Sopiva DNA-sekvenssi voidaan valmistaa tavanomaisilla ja hyvin 13 tunnetuilla DNA-sekvenssien syntetisointitekniikoilla. Näin tuotetut DNA-sekvenssit voidaan kloonata sitten sopiviin kloonausvehikkeleihin ja käyttää sopivan isäntäsolun transfor-mointiin yhdistelmäpeptidin tuottamiseksi. Kaikki metodiikka, 5 johon edellä viitattiin on alan ammattimiehelle tavanomaista, ja hän tuntee sen hyvin.

Tämän keksinnön peptidit ovat olennaisesti homologisia ihmisen myeliinin emäksisen proteiinin aminohapposekvenssin osan 10 kanssa. "Aminohapposekvenssin osalla" tarkoitetaan, että sekvenssi voi olla minkä pituinen hyvänsä, edellyttäen että aminohapposekcenssi on riittävän pitkä, jotta se toimii, niin että se neutraloi tai muuntaa ihmisen myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen eli anti-MBP:n tuoton mutta ei niin 15 pitkä, että se tuottaisi tekniikan tason ongelmia, kun peptidejä käytetään pesäkekovettumataudin hoitoon in vivo. Tämän keksinnön mukaan peptidit voivat olla ainakin kymmenen aminohapon mittaisia. Tämän keksinnön eräässä esimerkissä peptidit voivat olla pituudeltaan noin kymmenestä aminohappotähteestä 20 noin 25 aminohappotähteeseen. Peptidin kokonaiskoko voi olla paljon suurempi, jos tämän keksinnön peptidejä käytetään .·. : fuusioproteiinin osana.

• »t • · • · · • · · *’I Tämän keksinnön erään sovellusmuodon mukaan on ratkaistu, että • · · • · · *’. 25 sellaiset valitut peptidit, jotka vastaavat olennaisesti h- ] * MBP:n aminohapposekvenssiä, ovat tehokkaita anti-MBP:n tuoton • · • '* neutraloinnissa tai muuntamisessa. Nämä peptidit vastaavat h- • · · * MBP:n aminohapposekvenssiä noin aminohappotähteestä 61 noin tähteeseen 106. Eräässä esimerkissä nämä peptidit vastaavat h-3 0 MBP:n aminohapposekvenssiä noin aminohappotähteestä 75 noin tähteeseen 106, kun peptidejä käytetään vapaan anti-MBP:n ··· .1, neutralointiin. Lisäesimerkissä nämä peptidit vastaavat h- • · **·. MBP:n aminohapposekvenssiä noin aminohappotähteestä 82 noin aminohappotähteeseen 99, kun peptideitä käytetään sidotun 35 anti-MBP:n tuoton neutralointiin tai muuntamiseen. Sen tähden • · *:*·· peptidit valitaan 10 aminohappotähteestä 25 aminohappotähtee seen, jotka on otettu jatkuvasta aminohapposekvenssistä, joka sijaitsee myöhemmin esitetyn sekvenssin (SEQ ID NO:l:n amino- happotähteet 61 - 106) sisällä, edellyttäen, että mainittu sekvenssi voi neutraloida myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen tuoton tai muuntaa sitä.

14 5 SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 61 - 106 61

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe 10 Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 106

Peptidien esimerkit valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavis-15 ta peptideistä: MBP61-75 (SEQ ID N0:l:n aminohappotähteet 61 - 75)

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys MBP64-78 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 64 - 78) 20 Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly MBP69-83 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 69 - 83) : Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu . .·. MBP75 - 95 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 75 - 95) • · · ”1 Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe ***. 2 5 Phe Lys Asn Ile Vai Thr * MBP80 - 97 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 80 - 97) : ** Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr • · · ·.· · Pro Arg MBP91-106 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 91 - 106) 3 0 Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly • · · • · · • · ···. Tämän keksinnön eräässä sovellusmuodossa peptidit esitetään • · · · · kaavalla, joka on seuraava: 3 5 • · ·;··· Rj-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Rj sekä niiden suoloina, jolloin mainitussa kaavassa Rx ja R2 15 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, hydrok-sista, aminohappotähteestä ja polypeptidin tähteestä; edellyttäen että Rx ja R2 eivät ole vety tai hydroksyyli samanaikaisesti. Peptidi voi sisältää substituutioita, deleetioita ja 5 lisäyksiä, edellyttäen että se säilyttää anti-MBP:n tuoton neutralointi- tai modulointitoiminnan.

Valittujen peptidien esimerkit valitaan peptideistä, jotka ovat seuraavat: 10 MBP84-93 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 84 - 93)

Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile MBP85-94 (SEQ ID N0:l:n aminohappotähteet 85 - 94) Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val MBP86-95 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 86 - 95) 15 Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr MBP87-96 (SEQ ID NO:l:n aminohappotähteet 87 - 96) Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro

Anti-MBP:n mahdollisen roolin tutkimista MS:n taudin synnyssä 20 jatketaan. Aktiivista MS:ää potevien potilaiden lisääntyneistä anti-MBP-tiittereistä raporoivat ensiksi Panitch et ai. (Pa- : nitch, H. S., Hooper, C. S. sekä Johnson, K. P., Arch. Neurol.

• · · . 37:206 - 209, 1980) jotka käyttivät radioimmunologista kiin- • · · teäfaasimääritystä marsun MBP:n kanssa. Sellaisilla potilail- • · · ***. 25 la, jotka sairastuivat uudelleen akuuttiin MS:ään, oli taval- ’ lisesti lisääntynyttä anti-MBP:tä, joka vallitsevasti oli • · • ** vapaassa muodossa, kun taas joillakin potilailla, jotka olivat • · · ’.· * taudin kliinisessä hellittämisvaiheessa, ei ollut anti-MBP- tasoja, jotka olisi voitu ilmaista. Siirtymisvaiheessa akuu-30 tista uudelleen sairastumisesta taudin tilapäiseen hellittämi-seen anti-MBP:n tiitterit vähenivät jatkuvasti, viikkojen - • · · .1. kuukausien ajan, kun taas vasta-aineen sidotut fraktiot li- • · sääntyivät alkuarvoihinsa verrattuina. Muissa potilaissa, • · · · · jotka ovat vaiheessa, jossa tauti hellittää tilapäisesti, on 35 mahdollista havaita vapaan ja sidotun anti-MBP:n pieniä tiit- • · ·;··· tereitä, joissa suhde F/B on pienempi kuin yksi, mikä viittaa siihen, että anti-MBP:tä neutraloiva Vasta-aine (neutraloivat vasta-aineet) ovat sidotut anti-MBP:hen. Satunnaisesti sellai- 16 set potilaat, joihin sopivat kliinisesti määritellyn MS:n kriteerit, tai sellaiset potilaat, joilla on neuropatologises-ti varmistettu MS, on tautinsa aktiivisten faasien aikana anti-MBP:tä, joka ei ole ilmaistavissa. On mahdollista, että 5 tällaisilla potilailla on vasta-aineita muita myeliiniprote-iineja kohtaan. Spesifisen vasta-aineen skenaarion puuttuminen ei kiellä anti-MBP:n mahdollista tärkeyttä myeliinikadossa MS-potilaiden pääosalla.

10 MBP-vasta-ainekaskadi havaittiin äskettäin IgG-fraktiossa, joka puhdistettiin MS-CSF:stä (Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 96:19 - 27, 1990). Primaarisia vasta-aineita MBP:lle esiintyy sairauden yhteydessä sekä vapaina että sidotussa muodossa: F/B-suhteet ovat arvoltaan suurempia kuin yksi 15 potilailla, jotka sairastuvat akuutisti uudelleen, ja mainittu suhde on pienempi kuin yksi potilailla, jotka potevat kroonisesti etenevää tautia (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 209:20 - 25, 1986, Catz, I. ja Warren, K. G., Can. J. Neurol. Sei. 13:21 - 24, 1986; sekä Warren, K. G. ja Catz, I., Ann.

20 Neurol. 21:183 - 187, 1987). Kun tämä sairaus tulee inaktiiviseksi, tulee esiin sekundaarisia vasta-aineita, jotka neutra- : loivat anti-MBP:n. Tertiaarisia vasta-aineita, jotka inhiboi- • ♦ . .·. vat anti-MBP:n neutraloitumisen, on läsnä, kun sairaus etenee • · · kroonisesti eikä onnistu inaktivoitumaan. Se tosiasia, että • · · ***. 25 MBP-vasta-ainekaskadi liittyy MS:n erillisiin faaseihin, * viittaa sen mahdolliseen tärkeyteen verrattuna tämän sairauden • · ; ** luonnonmukaiseen historiaan.

··· • · « • ♦ ·

Vaikka anti-MBP:t voidaan ilmaista sellaisten potilaiden • · j *·. 3 0 CFS:ssä, jotka potevat aktiivista MS:ää, niiden suora rooli demyelinaatiotaudin eli myeliinikadon synnyssä jää varmista- ··» matta. Anti-MBP: iden liittyminen MS: n mekanismiin voitaisiin • · • · ***. parhaiten määrittää niiden neutraloitumisella in vivo, mahdol- • · · · · lisesti siten, että annetaan valittuja peptidejä ja tarkastel-:V: 35 laan sairauden kliinistä kulkua. Jos anti-MBP on ainoa primaa- ·:··· rinen vasta-aine, joka MS: ssä on liittynyt demyelinaatioon (jos anti-MBP:t ovat ainoat primaariset vasta-aineet, jotka MS:ssä ovat liittyneet demyelinaatioon), voi olla mahdollista 17 estää tämä tapahtuma sellaisten valittujen MBP-peptidien intratekaalisella ja (tai) suonensäisellä ja (tai) suun kautta toteutettavalla annolla, jotka neutraloisivat anti-MBP:n ja edistäisvät vastustuskykyä MBP:lle in situ. Ihmisen muut 5 myeliiniproteiinit voivat liittyä MS:ssä demyelinaatioon, ja sen mukaisesti tämän keksinnön piiriin kuuluu sellaisten peptidien käyttö vastaavien vasta-aineiden neutralointiin, joiden sekvenssi on olennaisesti homologinen näiden muiden myeliiniproteiinien aminohapposekvenssin osalle. Vaikka aiem-10 mat yritykset hoitaa MS:ää heterologisen MBP:n lihaksensisäisellä tai ihonalaisella annolla ei ole täysin onnistunut (Campbell, B., Vogel, R. J., Fisher, E. ja Lorenz, R., Arch. Neurol. 29:10 - 15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. ja

Demonty, L., J. Neurol. 216:27 - 31, 1977, sekä Romine, J. S. 15 ja Salk, J., julkaisussa Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. ja Tourtelotte, W. W., toimittajat, Multiple sclerosis, Baltimore. Williams & Williams, 1982:621 - 630), on havainnollistettu, että intratekaalinen ja (tai) laskimonsisäinen sellaisten MBP-peptidien anto, jotka neutraloivat tai muuntavat anti-20 MBP:n tuottoa keksinnön mukaan, antavat suotuisampia tuloksia.

: MS:n eläinmalli, kokeellinen allerginen enkefalomyeliitti eli • · · aivo-selkäydintulehdus on T-soluvälitteinen demyelinaa- • · · *** tiosairaus. EAE voidaan parantaa siten, että sairastuneisiin • · · *···] 25 hiiriin siirretään vatsaontelon sisään MBP:n synteettisiä * ' peptidejä (Gaur, A. et ai., Science 258, 1491 - 1494, 1992). • · :*** MBP:n suurten annosten anto poisti tämän lisäksi autoreaktio- • · · : kykyisiä T-soluja ja ehkäisi EAE:n kliinisiä ja patologisia enteitä hiirissä (Critchfield, J. M. et ai., Science 263, 1139 30 - 1143, 1994). Vieläpä MBP.-n anto suun kautta muunsi EAE.-ta, siten että se sai aikaan perifeerisen vastustuskyvyn (Chen, W. et ai., Science. 265, 1237 - 1240, 1994). Äskettäisessä kak- • · *···' soissokeakoetutkimuksessa on saatu viitteitä siitä, että MS- • · · · · * * potilaassa vastuustuskyky voidaan saada aikaan, siten että 35 annetaan suun kautta myeliinin antigeenejä (Weiner, H. L. et • · ....j ai., Science 259, 1321 - 1324, 1993). Voidaan tarvita mye- liiniantigeenien tai näiden antigeenien synteettisten peptidien yhdistelmää, joka annetaan suun kautta ja (tai) laskimon 18 sisäisesti ja (tai) intratekaalisesti, jotta muunnetaan T-soluja, B-soluja sekä makrofaageja, jotka liittyvät MS-poti-laiden myeliinin hajoamiseen.

5 Tämä keksintö koskee näin ollen farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena ainesosana edellä kuvattua peptidiä, joko yksinään tai yhdistelmänä, seoksena farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttävät kantajat tunnetaan tekniikan tason mukaan hyvin, ja esimerkik-10 si normaali keittosuolaliuos sisältyy niihin.

Tämän keksinnön mukaisia peptideitä voidaan antaa ihmisille pesäkekovettumataudin hoitoon tai muuntamiseen. Terapeuttinen annos laskimonsisäiseen ja (tai) suun kautta toteutettavaan 15 antoon MS:n hoitoa varten voi olla noin 1,0 mg - noin 10,0 mg kilogrammaa kohti kehon painoa. Jos anto on intratekaalista, annos on noin 1 - 10 mg. Tämän keksinnön eräässä esimerkissä peptidiä annetaan joko suonensisäisesti tai intratekaalisesti tai yhdistelmänä. Peptidejä voidaan antaa joko yksinkertaisena 20 tai peräkkäisenä annoksena, tarpeen mukaan .'.J Vaikka keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti viittaamalla • · . .·. erityisesti sen edullisiin sovellusmuotoihin, seuraavat esi- • · · **· merkit esitetään valaisemaan mutta ei rajoittamaan keksintöä.

• · · • · · .!!!: 25

Esimerkki 1 ·· • · • · · • · · • · · *.* * Ihmisen myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen neutra lointi in vitro 3 0

Kuvio 1 esittää tähän tutkimukseen käytettyjen 18 h-MBP-pepti- • · · .1.^ din paikantamista suhteessa intaktiin MBP-molekyyliin. Natiivi • · *'*. MBP eristettiin aivokudoksesta, jossa ei ollut MS:ää (Diebler, • t · · · G. E., Martenson, R. E., Kies, M. W., Prep. Biochem, 2:139 - • · 35 165, 1972) ja sitä puhdistettiin vielä geelisuodatuksen avul- ·:··; la. Lopullisista antigeeni valmisteista tarkistettiin puhtaus SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Ainoastaan valmisteet, jotka vaelsivat 18,5 KD: n suuruisen molekyylipainon 19 kohdalla, käytettiin lisätutkimuksiin. Puhdistettua MBP:tä käytettiin antigeenispesifisessä affiniteettikromatografiässä, neutralointitutkimuksissa ja radioimmunologisessa kiinteäfaa-s i-ant i-MPB-määrityks es sä.

5

Kahdeksantoista sellaista peptidiä, jotka kattoivat h-MBP:n pituuden ja sisälsivät 8-25 aminohappotähdettä, syntetisoitiin Fmoc-menetelmällä, aiemmin kuvatulla tavalla (Groome, N.

P., Dawkes, A., Barry, R. et ai., J. Neuroimmun 19:305 - 315, 10 1988). Peptidin puhtaus tarkistettiin käänteisfaasisuurpaine- nestekromatografiällä, jossa käytettiin Cl8-pylvästä ja vesi-asetoninitriiligradienttia (0,1 prosenttia TFA). Myös peptidien aminohapot analysoitiin standardimenetelmin. Monet tähän tutkimukseen käytetyistä peptideistä, kun ne valmistettiin 15 toimimaan immunogeeneinä, sisälsivät kysteiinitähteen, joka ei esiinny luonnossa. Se ei todennäköisesti vaikuta näihin havaintoihin.

Selkäydinneste (CSF) saatiin yhden viikon sisällä oireiden 20 alkamisesta 35 potilaalta, jotka olivat sairastuneet uudelleen akuuttiin MS:ään, ja IgG-tasot määritettiin nefelometrialla.

. . Tähän tutkimukseen käytetyt CSF-näytteet valittiin siten, että • · ♦ * niillä oli aluksi suuret absoluuttiset IgG-tasot (> 0,80 g/1) • · · *···* sekä anti-MBP:n lisääntyneet tiitterit (F/B-suhde > 1,0).

• · · *·ί·* 25 Kaikilla MS-potilailla oli kliinisesti selvä sairaus.

• · ·· • *·· IgG puhdistettiin sellaisten potilaiden konsentroidusta CSF:s- : tä, joilla oli akuutti MS, ja proteiinin puhdistukseen käytet tiin affiniteettikromatografiaa, joka toteutettiin A-Sepharo- 30 sella (Pharmacia™, kuten aiemmin kuvattiin (Warren, K. G. ja ,···. Catz, I., J. Neurol. Sei. 96:19 - 27, 1990). Kunkin IgG-val- • · ]·* misteen puhtaus varmistettiin polyakryyliamidigeelielektrofo- • · reesilla ja isoelektrisellä fokusoinnilla. Kun puhdistetusta IgG:stä absorboitiin suurentuneet anti-MBP-tasot nollaksi 35 MBP:n avulla, absorption jälkeiset supernatantit sisälsivät • · jäännös-IgG:n.

Puhdistettu MBP kytkettiin CNBr:llä aktivoituun Sepharose • · 20 4B:hen (Pharmacia™) valmistajan ohjeiden mukaan. MBP-Sepharo-se-affiniteettikromatografiaa käytettiin sitoutumattoman anti-MBP:n eristämiseen lähtönäytteistä, jotka olivat puhdistettua CSF-IgG:tä, joka sisälsi suurentuneita anti-MBP-tasoja ja joka 5 oli saatu 35 potilaalta, jotka olivat sairastuneet uudelleen akuuttiin MS:ään (Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 103:90 - 96, 1991). Puhdistettuja anti-MBP-näytteitä verrat tiin alkuperäiseen IgG-lähteeseen polyakryyliamidigeelielekt-roforeesin avulla. Kun puhdistettu anti-MBP absorboitui nol-10 läksi MBP:llä, absorptionjälkeiset supernatantit eivät sisältäneet enää IgG-jäännöstä.

Anti-MBP:n vakiomääriä (15 radioaktiivisuutta sitovaa yksikköä, jotka vastasivat 100:aa, mitta-asteikon laajentamistar-15 koetuksessa, = 0 prosenttia) inkuboitiin h-MBP:n lisääntyvien määrien (0 - 1000 ng) tai MBP:n yksittäisten peptidien (0 - 10 000 ng) kanssa nestefaasimäärityksessä ja 1,5 tunnin mittaisen inkuboinnin jälkeen määritettiin kaikista seoksista vapaat anti-MBP-tasot. Anti-MBP:tä, joka oli eristetty seitsemältä 20 yksittäiseltä MS-potilaalta, tai kymmeneltä eri MS-potilaalta saatua, yhdistettyä anti-MBP:tä käytettiin neutralointikokei- ^ . siin. Negatiivisina antigeenikontrolleina käytettiin vasikan • ·· kateenkorvan histonia ja ihmisen seerumin albumiinia (alue: 10 • · · ·** - 1000 ng) . Positiivisina vasta-ainekontrolleina käytettiin • · · *·«1 2 25 peptidin MBP64-78 (klooni 26) yhtä monoklonaalista vasta- • 9 1 ainetta sekä peptidin MBPl-8 (R155) kaniinin polyklonaalista • · • 1·· vasta-ainetta (Groome, N., Harland, J. ja Dawkes, A., Neu- ί,ί ί rochem. Int. 7:309 - 317, 1985; Barry, R., Payton, M. ja

Groome, N., Neurochem. Int. 2:291 - 300, 1991). Negatiivisena ·1·.. 30 vasta-ainekontrollina käytettiin hiiren toista monoklonaalista .1·1. vasta-ainetta, joka oli muodostettu epitooppia 45 - 50 vastaan • (klooni 16).

··· ' • · • · • · · 2 1 Anti-MBP-tasot määritettiin radioimmunologisella kiinteäfaasi- j1;1· 3 5 määritysmenetelmällä, jossa käytettiin ihmisen MBP:tä (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 209:20 - 25, 1986; Warren, K.

G. ja Catz, I., Ann. Neurol. 21:183 - 187, 1987; sekä Warren, K. G. ja Catz, I., J. Neurol. Sei. 91:143 - 151, 1989). Vapaat 21 anti-MBP:n tasot mitattiin kaikista jakeista, jotka oli saatu affiiniteettikromatografioista, sekä kaikista neutraloin- tiseoksista. Kaikki yksittäiset näytteet ajettiin neljänä kappaleena, siten että käytettiin samaa jodeerattua materiaa-5 lia määritysten välisen vaihtelun saattamiseksi vähimmilleen.

Puhdistettu anti-MBP neutraloitui täydellisesti MBP:llä ja peptideillä MBP80 - 97, MBP91 - 106 sekä MBP75 - 95, ja peptidit MBP64-78, MBP69-83 ja MBP61-75 neutraloivat sen osittain 10 (taulukko 1 ja kuvio 2). Jäljelle jääneet kaksitoista peptidiä eivät neutraloineet puhdistettua anti-MBP:tä, ja niiden kineettiset käyrät jäivät kuviossa 2 esitetyn raudoitetun alueen sisälle. Vasikan kateenkorvan histoni ja ihmisen seerumin albumiini eivät reagoineet pudistetun anti-MBP:n kanssa edes 15 pitoisuuksina, jotka olivat jopa 1000 ng. Klooni 26 inhiboitui vain peptidillä MBP64-78. R155 inhiboitui vain peptidillä MBPl-8. Klooni 16 ei reagoinut MBP:n tai minkään peptidin kanssa (kuvion selkeyden vuoksi ei ole esitetty kontrollituloksia) . Kontrollinäytteet havainnollistavat neutralointilä-20 hestymistavan paikkansapitävyyden, koska kukin kontrollivasta-aine neutraloitui täydellisesti peptidillä, jolta neutraloitu- .·. : mistä odotettiin, mutta ei millään muulla peptideillä. Tämä • · · . .·. osoittaa, että tunnistuksen spesifisyys havaittiin vieläpä • · · **I suurilla peptidipitoisuuksilla (10 000 ng) .

• · · • · · • · ·· • · • · · • · · • · · • · ♦ • · • · • ·· • · • ♦ ««· ♦ ♦♦ • · • « ··· • · • · • · · • ♦ · • · • · 22 _Taulukko 1_

Peptidin numero Ihmisen MBP-sek- Reaktiokyky' anti- venssi MBP:n kanssa 7 1 - 8 Cy -___ 38 Cy 4-18__-_ 8 Cy 11 - 24__-____ 39 18 - 32__-_ 40 26 - 40__-_ 41 Cy 35 - 58__-_ 20 Cy 51 - 64 Cy__-___ 16 Cy 64 - 78__+ _ 27 Cy 61 - 75__+ _ _21__Cy 69 - 83__+___ 56 Cy 75 - 95__++_ 12 Cy 80 - 97 Gly__++_ _15__Cy 91 - 106__++_ 6 117 - 129 -__ 42 Cy 127 - 140__-_ 43 Cy 136 - 149 • · ·

• · · I I I I. I IMI·! ..." Hl.. .1.1. .,M|| ' ™ "I II

.*./ 2 141 - 155 • · · — I » 1 ' 1 - —-* ™—' 1' 111 44 Cy 149 - 162 • * * L———la——a——————... —8g=d • · · • · ;·. Taulukon 1 selitykset: • · · ++ täydellinen neutralointi • · · 5 + osittainen neutralointi .. - merkityksetön reaktiokyky • · • ·· • · · • · *·;·* Seitsemältä yksittäiseltä MS-potilaalta saatu, puhdistettu :***: anti-MBP neutraloitiin täydellisesti h-MBP:llä sekä peptideil- • · · 10 lä MBP80-97, MBP91-106:11a sekä MBP75-95:llä (katso kuviota 3 valaisevana esimerkkinä) . Yksittäisiltä MS-potilailta saadun • · · *·*·[ vasta-aineen rajoitetun määrän vuoksi anti-MBP ei reagoinut jäljelle jääneiden 15 peptidin kanssa.

23

Kuten aiemmin mainittiin, anti-MBP neutraloitiin peptideillä, jotka ulottuivat noin aminohappotähteestä 61 noin aminohappotähteeseen 106. Sellaiset peptidit, jotka eivät neutraloineet anti-MBP:tä, kattoivat h-MBP:n sekä aminopäät (noin tähteet 1 5 - 63) sekä karboksyylipäät (noin tähteet 117 - 162) . Näyttää siltä, että peptidit, jotka ovat peräisin MBP:n erilaisista alueista, jotka eivät mene päällekkäin, neutraloivat saman vasta-aineen (samoja vasta-aineita). Tämä voisi olla selitettävissä, jos vasta-aineet tunnistavat epäjatkuvan (kootun) 10 epitoopin, joka sisältää aminohappoja eri alueista. Samanlaisen ilmiön ovat havainneet Hruby et ai. (Hruby, S., Alvord, E.

C., Groome, N. P. et ai., Molec. Immun. 24: 1359 - 1364, 1987), jotka osoittivat, että rotan monoklonaalisella vasta-aineella oli epitooppi MBP-sekvenssissä 112 - 121, mutta sillä 15 oli voimakas ristireaktio toisen epitoopin kanssa peptidissä 39 - 91. Tämä on todennäköisempää kuin mahdollisuus, että vasta-aine reagoi ristiin kahden täydellisesti erilaisen sekvenssin kanssa, jotka normaalisti eivät muodosta epäjatkuvaa epitooppia (Hruby, S., Alvord, E. C., Martenson, R.E., et 20 ai. J. Neurochem. 44:637 - 650, 1985). Neutralointitulokset voitaisiin selittää sillä, että sellaiset peptidit, jotka .·. : kukin ovat peräisin MBP:n erilaisista lohkoista, kykenevät • · · miehittämään osittain vasta-ainetaskun, siten että niillä on • · · • · · **.' vuorovaikutusta vasta-aineen erilaisten aminohapposivuketjujen • · · *·**[ 25 kanssa. Tämä selitys sopii yhteen havainnon kanssa, jonka mukaan peptidit, jotka inhiboivat täydellisesti (MBP80-97, • · : ** MBP91-106 sekä MBP75-95), ovat noin 100 kertaa tehottomampia • · · ·.· 1 " molaarisella perusteella kuin intakti MBP aiheuttaessaan inhibition. Edellä kehitellyn hypoteesin perusteella tämä 3 0 voisi johtua kustakin peptidikloonista, joka ei pysty saavut- :***; tamaan alkuperäisen MBP-epitoopin sitoutumisenergiaa.

• · · • · · · • · • · • · · • · • · • · · • · · • · 24

Esimerkki 2

Ihmisen myeliinin emäksisen proteiinin tuoton neutralointi tai muuntaminen in vivo 5

Potilaiden valinta ja kontrollitututkimukset

Potilaat, jotka osallistuivat tähän tutkimusprojektiin, olivat Albertan yliopiston multippeliskleroosipotilaiden hoito- ja 10 tutkimusklinikasta Edmontonista, Kanadasta. Heillä oli pesäkekovettumatauti määritetty Schumacherin tunnusmerkkien (1965) mukaan ja varmistettu aivojen magneettiresonanssikuvauksella sekä (tai) CSF:n immunokemiallisilla tutkimuksilla. Sen valaisemiseksi, että kroonisesti koko ajan etenevässä MS:ssä 15 anti-MBP lisääntyi jatkuvasti pitkiä ajanjaksoja, kuukausista vuosiin, tehtiin potilaille toistettuja lannepistoja ja tarkkailtiin F- ja B-anti-MBP:tä. Havaittiin, että potilaassa, joka poti kroonisesti koko ajan etenevää MS:ää, autovasta-aine pysyi jatkuvasti lisääntyneenä niinkin pitkiä ajanjaksoja kuin 20 11 vuotta ja että anti-MBP-tasot eivät vähentyneet spontaanis ti (kuvio 4 on valaiseva esimerkki).

• · • · · • · ·

Sen määrittämiseksi, että aluksi lisääntyneet CSF:n anti-MBP- • · · *'! tasot pysyivät suhteellisen vakioina 24 tunnin ajan, kahdella • · · ***. 25 potilaalla (1 F56 ja 3M66) CSF-näytteen otto toistettiin joka * 1 kolmaskymmenes minuutti kahden tunnin ajan sekä 24 tuntia myö- • · • 2 hemmin, samalla kun tarkkailtiin F- ja B-anti-MBP:tä (vastaa- • · · *.· · vasti kuvio 5A ja 5B) . Potilaat 1F56 ja 3M66 toimivat "aika- kontrolleina". F- ja B-anti-MBP-tasot pysyivät jatkuvasti : 30 lisääntyneinä, kun otettiin CSF-näytteet joka kolmaskymmenes minuutti kahden tunnin ajan sekä 24 tuntia myöhemmin.

• · · · · • · 2 *'1. Tämän lisäksi määritettiin samoin normaalin keittosuolan vaikutus kahdella muulla potilaalla (4M45 ja 5M59; vastaavasti 35 kuvio 5C ja 5D) , joiden CSF:ään sitä siirrettiin 5 ml. Nämä • · ·:··· potilaat toimivat "aika-keittosuolakontrolleina" . Kun normaa lia keittosuolaa ruiskutettiin 5 millilitraa aivo-selkäydinalueelle, F- ja B-anti-MBP-tasot pysyivät 25 lisääntyneinä peruslinja tasolla, kun CSF:stä otettiin näytteitä edellä esitetyllä tavalla, mikä havainnollisti täten, että "laimennusvaikutus" anti-MBP-tiittereihin oli kielteinen.

5

Anti-MBP-tasot määritettiin kiinteässä faasissa toteutetulla radioimmunologisella määrityksellä, jossa käytettiin MBP:tä, joka pantiin Immulon-mikrotiitterikammioihin. Ne peitettiin 100 plitralla MBP:tä, jonka pitoisuus oli 10 pg millilitrassa 10 (1 pg kammiota kohti), ja niitä inkuboitiin yön ajan 37 °C:ssa. Sen jälkeen kun reaktioseokset oli tukahdutettu häränseerumin albumiinilla (BSA) ja pesty kolme kertaa vedellä, kammioita säilytettiin huoneenlämpötilassa. CSF:n tai kudosuutteiden näytteet, joiden tilavuus oli 100 plitraa, 15 laimennettiin, siten että niissä oli IgG:tä 0,010 grammaa litrassa (0,01-molaarisella PBS:llä, jossa oli 0,05 prosenttia

Tween 20:ntä), ja niitä inkuboitiin MBP:llä päällystetyissä kammioissa 1-2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Viiden pesun jälkeen, jotka toteutettiin puskurilla (0,01-molaarinen PBS, 20 0,05-prosenttinen Tween 20:n suhteen), kammioita inkuboitiin vuohen anti-kaniini-IgG-Fc:llä (0,01-molaarinen PBS, joka on : 0,05-prosenttinen Tween 20:n ja 0,5-prosenttinen BSA:n • · · • · . .·, suhteen) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten ne • * · /’Γ huuhdottiin edellä esitetyllä tavalla. Lopuksi lisättiin 125I- • * * '**. 25 proteiini A: ta (tai 125-I-proteiini-G: tä) ja inkuboitiin yhden * · « · · tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun 125I-proteiini G:tä • · • *’ käytettiin merkkiaineena, BSA korvattiin ovalbumiinilla · · · *.*· määrityspuskurissa ja reaktion tukahduttamispuskurissa. Kolmen lopullisen vesipesun jälkeen kammiot laskettiin yksittäin.

• · | 30 Tulokset ilmaistaan radioaktiivisuusyksiköinä seuraavasti: (näytteen iskut - taustaiskut)/kokonaisradioaktiivisuuden *·« y.. antamat iskut - taustan iskut) . Kaikki näytteet ajetaan • · *’*. kymmenenä kaksoiskappaleena ja niitä lasketaan 10 minuutin ♦ *·*· ajan, jotta kootaan > 10 000 iskua kutakin positiivista 35 näytettä kohti.

Ennen määritystä kaikki CSF- ja (tai) kudosnäytteet laimennettiin lopulliseen lgG:n pitoisuuteen, joka oli 0,010 g 26 litrassa. F-anti-MBP ilmaistiin suoraan CSF:ssä tai kudosuut-teessa, samalla kun vasta-aineen B-tasot määritettiin immuuni-kompleksien happohydrolyysin jälkeen. Epäspesifinen sitoutuminen tapahtui kutakin näytettä vastaavissa päällystämättömissä 5 kammioissa. Epitoopin paikantamista varten annettiin synteettisten peptidien ensin reagoida puhdistetun vasta-aineen kanssa kompetetiivisessa määritysmenetelmässä, joka toteutettiin nestefaasissa, ja sitten anti-MBP määritettiin kaikista reaktioseoksista radioimmunologisella määritysmenetelmällä.

10 Tulokset yhdistetystä kompetitiivisestä sitoutumismääritys-menetelmästä sekä radioimmunologisesta määritysmenetelmästä ilmaistiin synteettisen peptidin inhibitioprosenttina, joka määritettiin 100 - radioaktiivisuusyksiköinä. Näytteet määritettiin 10 kaksoiskappaleena ja niitä laskettiin 10 minuutin 15 ajan LKB1275 Minigamma-laskijassa. Kudoksesta puhdistettu, yhdistetty anti-MBP käytettiin viitenä ennalta määrättynä laimennuksena positiivisina kontrolleina. Negatiivisina kontrolleina käytettiin sellaisista potilaista saatua, yhdistettyä CSF:ää, joilla ei ollut neurologista sairautta. Toistettavuus 20 määrityksen sisällä oli kolmesta viiteen prosenttiin, ja määritysten välinen vaihtelu oli vähemmän kuin seitsemän prosent- . . tia.

• · · • · · • · • · · *··;* CSF:n anti-MBP:n pysyminen lisääntyneenä ja kontrollikokeiden • · · 2 5 vakiotaso sallivat tämän tutkimuksen seuraavan vaiheen.

• · • · • *·· Kaksoisokkopeptidillä kontrolloitu vaiheen 1 koe - Ruiske : aivoselkäydinnesteen alueelle 30 Toteutettiin vaiheen 1 koe synteettisen peptidin MBP75-95:n .···. vaikutuksen määrittämiseksi CSF-anti-MBP:n F- ja B-tiittereitä • · • kohtaan. Jotta saatiin lupa Albertan yliopiston tutkimuseetti- • · *·..* seltä neuvostolta, tämä suunnitelma toteutettiin myöhemmin **“· potilailla, joilla oli kliinisesti määritelty MS (Schumacher 35 et ai., N. Y. Acad. Sei., 122, 552 - 568, 1965), vakavasti • · · • · invalidisoinut ja pitkälle edennyt, jatkuva sairaus. Sen jäi- keen kun oli saatu asioihin perehtynyt suostumus, 14 potilasta tarjoutui vapaaehtoisesti tähän tutkimukseen; kahdeksan poti- • · 27 lasta valittiin heidän F-CSF-anti-MBP:n alkutiitterinsä perusteella (enemmän kuin kahdeksan radioaktiivisuusyksikköä (taulukko 2), jotta nämä saivat aivo-selkäydinnesteen alueelle yhden ruiskeen joko peptidiä MBP75-95, joka sitoi anti-MBP:tä in 5 vitro. tai sitoutumatonta kontrollipeptidiä MBP35-58 (Warren ja Catz, 1993b). Koe toteutettiin kaksoissokkokokeena, niin että kumpikaan tutkijoista, eivätkä potilaat, olleet perillä ruiskeen laadusta. Kaikki peptidit saivat koodin, joka oli seitsennumeroinen, satunnaisesti valittu luku ja jonka antoi 10 lääkäri, jolla ei ollut osuutta kokeeseen. Parilliset peptidit liuotettiin viiteen millilitraan normaalia keittosuolaliuosta ja ruiskutettiin lannepiston avulla CSFrään ja ne annettiin lisääntyvinä annoksina, jotka olivat 1, 2,5, 5 ja 10 mg. Ennen ruisketta otettiin CSF-näyte (perustaso), 30 minuutin välein 15 kahden tunnin ajan ruiskeen jälkeen, 24 tuntia myöhemmin sekä sitten viikon välein 3-4 viikon ajan, kunnes anti-MBP:n pitoisuudet palasivat perustasolle. Solun lukumäärät, koko-naisproteiini-, glukoosi-, IgG- ja albumiinitasot määritettiin kaikissa CSF-näytteissä, jotka saatiin. F- ja B-anti-MBP-tasot 20 määritettiin radioimmunologisella määritysmenetelmällä, kuten edellä kuvattiin.

• · • · · • ·· • · • · · • · · ··· • · · • · · ··· • · ·· • · • ·♦ • · · • · · • « • · • ·· • · • · • * · ··· • · • · ··· • · • · • · · « · · • · « « 28 * p a •u £ 4-) Ή :fd :fd :fd :fd :fd :fd :fd :fd

-H G rH rH rH rH rH iH γ—I i—I

I—I 4-) (D I—I c—I I—1 t—I I—I r-1 I—I rH

fd P CD -H >1 S >1 S 1H S Ή >ι Ή Ή >i -H

> 4-> W WW

Λ! — fd m ^ O ^ oo rgrsjOcnrocNiOo^^o^

H rH rH j-^^—jrH rH rH rH rH rH rH

Π3 —1 P

fd :fO -U M 4-) 4->

~ Ή 0 :0 Td CU X -H CD -H CO S W

» rV Ή >ι 4-) W ^ G G Ph ffl 5 ^ u) cr» oj .HocCoincriLn^vDo^oo

0 1H id rH rH rH rH

·· > fd pH Ή a CO -H fd O 4J >

•H

4-)

G

I -H W

Id OP

d M fd in fd >

fd Qj rH

1—/ <d fd

fd Λ rG

fd rn G Ή ’Ή ^ W φ rH fd £3 G -M (1) fd H fd a w m w id

w > E W («3 <C 3 -H

rH $ 3 -H (O r-nnJU! fO

S m Ή tö m > ιβ > Λ! -h •5 Λ o > ,¾ γη rHnjin

™ ErHwinwranJtO -h td -P

ti Ö rd 3 3 3 3 ρ ,ΰ h Λ id id ·· 3 id -Η,ΰ td id td td td <u p : ·.: 3 τι rH > > > > e 0 « «j • · ^ fd 0) G rH rH rH rH » fd fd fd Ή fd Φ id fd fd fd Ή 1n -H 1H 1n w

... y-Hö^jci^iitnnJMDiidaiiö-H

··· 0}-H<ÖIÖ<e<Ö<D<d<D<D<e<D-HW

··· G Q) fd T-» 1n ό 1n Φ M <D<H G M b) C) • a>a)4->fdfdfd<d^ Ma a <u φ

*·· £M4->fdfdfdfdfdGfdfdGfdiHM

• · · rHa1HMMMMao;aM(UMaa 0 id w h h h »h rd £ fd fd £ fd fd fd

e - - 1 · MMOrHrHrHrHMrHMarHaMM

I I fd <uo)(ua)fdOfd o fdid 1 cup&ZE&iu&cu 1 x 1 cu cu ·· o ·· iniT-iiiiiiiimiinii : ·· - o -

CO^>T-iCn<TvC^CriCDCOr^OOOOU?COCD

• · · • · · "" " 111 1 ' ——— " ' ' '''' I .....' "" 1 ....... " "" — " 1 ——— —— • · ·

G

0) —

Td fd P 2 3 1H OOO OcHOOO^rH^^^OCNU")"^

·· fdOWrHrHCNCNCNHrH 04 H rH

: · m 4-> o l ·· -H W p fd Q) > ,···. CO 1 ~ • · ^_____________ • · · ———————— ——— —— — — —— — — —— — —— — · —— — — .:. <n ^ : : _ n -

• · · O Ml 1H

·;·1: S $ § voo ^OLncnnrOrHCT.oot^^^^ « -hg 2 .. rH 04 ro^io^r-co^Sil^p;^ 3

5 n M y/ rH rH rH H rH

·.1.· «J fc ω -h ^11 I I - • · 29

Taulukko 2: 14 sellaisella potilaalla toteutetut kliiniset tulokset ja CSF:n anti-MBP-tasot, joilla on krooninen, etenevä MS ja jotka vapaaehtoisesti osallistuivat vaiheen 1 tutkimukseen, jossa potilaalle annettiin synteettisiä MBP-peptidejä 5 yhtenä ruiskeena aivo-selkäydinnesteen alueelle. Koska oli välttämätöntä, että F-anti-MBP-pitoisuus oli aluksi suuri (> 8 radioaktiivisuusyksikköä), jotta saavutettiin merkittävä ruiskeenjälkeinen muutos, tutkimukseen valittiin vain 8-14 potilasta.

10

Kaikki peptidit, joita käytettiin näissä tutkimuksissa, syntetisoitiin "hyvän tehdasmaisen tuotteen" (GMP) koodin mukaan, siten että käytettiin Procyon Inc.:n (Lontoo, Ontario, Kanada) Fmoc-menetelmää (9 — fluorenyylimetoksikarbonyylimenetelmää). 15 Peptidin puhtaus tarkistettiin käänteisfaasisuurpainenestekro-matografiällä, jota varten käytettiin Cl8-pylvästä ja vesi-asetonitriiligradienttia, joka sisälsi 0,1 prosenttia TFA:ta. Massaspektrometria ja aminohappoanalyysi toteutettiin standardimenetelmin. Ennen ruiskutusta tutkittiin kaikista peptideis-20 tä pyrogeenisyys (Vancouver General Hospital, Vancouver, Kanada) , steriiliys (Provincial Laboratory for Public Health for : Northern Alberta, Edmonton, Kanada) sekä akuutti myrkyllisyys • ·· , ,·] (Health Sciences Laboratory Animal Services, University of • · · ’** Alberta, Edmonton, Kanada) ja ne ilmoitettiin "sopiviksi • · · • · · ***, 2 5 ihmiselle toteutettavaan antoon". Liuotettiin sopivat määrät ] * koodattuja, synteettisiä peptidejä viiteen millilitraan • · • *’ steriiliä, normaalia keittosuolaliuosta (ruiske 0,9- • · · ·.* * prosenttista natriumkloridia, USP, pyrogeenitöntä, Baxter

Corp. Toronto, Kanada), ne suodatettiin kaksi kertaa steri-30 loivien suodatinyksiköiden läpi, joiden huokoskoko oli 0,22 pm (Millex-GX. Millipore Corp., Bedford, MA, USA), ja niitä ··· annettiin CSF:ään lantiopunktion avulla.

• · • · ···

Potilaidenväliset peptiditutkimukset 35 • · ·:··· Potilaat 6F53, 8M41, 4M45 ja 1F56 saivat synteettistä peptidiä MBP75-95, joka pystyy sitomaan anti-MBP:tä in vitro, ja potilaat 10F36, 13F43, 5M59 ja 3M66 saivat "kontrollia", synteet- 30 tistä, sidontaan kykenemätöntä peptidiä MBP35-58, lisääntyviä määriä, jotka olivat vastaavasti 1, 2,5, 5 ja 10 mg (kuvio 6). Potilaassa 6F53 (kuvio 6B) , jolle annettiin yksi milligramma MBP75-95:ttä havaittiin F-anti-MBP:n 75 prosentin suuruinen 5 väheneminen, jonka jälkeen se palasi välittömästi perustasolle; potilaassa 8M41 (kuvio 6D), joka sai 2,5 mg MBP75-95:ttä, ilmeni F-anti-MBP:n täydellinen neutraloituminen, joka tapahtui sitoutumalla ja palautui normaalille tasolle 24 tunnin sisällä; potilaassa 4M45 (kuvio 6F), joka sai viisi milligram-10 maa MBP75-95:ttä, tapahtui saostuminen ja täydellinen F-anti-MBP:tä sitova neutraloituminen, ja se kesti seitsemän päivää ja palasi alkuarvoonsa, kun näyte otettiin 21 päivää myöhemmin; potilas 1F56 (kuvio 6H) sai 10 mg MBP75-95: ttä, mikä tuotti myös F-anti-MBP:n täydellisen neutraloitumisen, joka 15 tapahtui sitomisen avulla ja kesti seitsemän päivän ajan ja palasi perusarvoon, kun otettiin näytteitä 14 ja 28 päivää myöhemmin. Aivoselkäydinnesteen alueelle toteutettu eli intra-tekaalinen MBP75-95:n anto ei muuttanut merkittävästi anti-MBP:n sidottuja tasoja. Potilaissa 10F38, 13F43, 5M59 ja 3M66, 20 jotka saivat vastaavasti 1, 2,5, 5 ja 10 mg "kontrollia", ei-sitovaa peptidiä MPB35-58, CSF-anti-MBP:n F- ja B-tasot eivät . . muuttuneet alussa vallinneista korkeista tasoista 24 tunnin • · · • ·· * .* mittaisen kokeen aikana (vastaavasti kuvio 6A, 6C, 6E ja 6G) .

• · · *·*;* Perinteiset MS-potilaan tulehduksen CSF-parametrit, kuten • · ·

*·!·* 25 solujen lukumäärä, kokonaisproteiinin absoluuttiset tasot, igG

***** ja albumiini, oligoklonaalinen sitoutuminen, IgG-indeksi ja ·♦ • *·· CNS:n IgG-synteesi pysyi vät muuttumattomina ennen peptidin :*:*: antoa ja sen jälkeen.

:*.(< 3 0 Potilaansisäiset peptidi tutkimukset ··· • · • · *·* Potilaansisäiset kokeet toteutettiin potilaansisäisen vaihte- ··· *...* lun vähentämiseksi pienimmilleen. Potilaassa 5M59, joka oli ’·**· joko "aika-keittosuolakontrolli" tai joka sai viisi mg ei- .*.*. 35 sitovaa peptidiä MBP-35-58, F-anti-MBP-tasot pysyivät lisään- • · tyneinä perustasolla molempien kokeiden aikana (kuvio 7A) .

Potilas 4M45 oli aluksi "aika-keittosuolakontrolli", ja kaksi kuukautta myöhemmin hän sai viisi milligrammaa MBP75-95:ttä.

• · 31 Hänen F-anti-MBP:nsä pysyi jatkuvasti lisääntyneenä kaikissa näytteissä, jotka koottiin "aika-keittosuolakokeen" aikana, ja MBP75-95:n annon jälkeen sitä ei voitu ilmaista (kuvio 7B) . Samanlaisia tuloksia saatiin potilaalla 1F56, jolla F-vasta-5 aineen määrät olivat jatkuvasti lisääntyneinä "aikakontrolli-kokeen" aikana, ja hänen F-anti-MBP:nsä muuttuivat MBP75-95:n annon (10 mg) jälkeen sellaisiksi, ettei niitä voitu ilmaista (kuvio 7C) . Täydellinen tutkimus toteutettiin potilaassa 3M66. Hänen F-anti-MBP-tasonsa olivat "aika-kontrollikokeen" aikana 10 jatkuvasti lisääntyneinä tai kun annettiin 10 mg MBP35-58:aa; kuitenkin kun ruiskutettiin 10 milligrammaa MBP75-95:ttä, F-anti-MBP neutraloitui täydellisesti ja jäi seitsemän päivän ajaksi sellaiseksi, ettei sitä voitu ilmaista (kuvio 7D).

15 Synteettisen peptidin MBP75-95:n toistettu anto

Sen jälkeen kun oli määritetty in vivo, että peptidi MBP75-95 neutraloi F-anti-MBP:tä ajanjaksoja, jotka olivat pitempiä kuin seitsemän päivää, mainittu peptidi valittiin toistettuun 20 antoon, jossa sitä siirrettiin selkäydinnesteeseen 10 mg viikoittain 10 viikon ajan. Tämä koe toteutettiin kolmella eri .·. : potilaalla, joilla oli krooninen, etenevä MS ja jotka eivät • ·· • · . .·. osallistuneet projektiin, jossa ruiskutettiin yhtä ainoaa • · · peptidiä, ja jotka osallistuivat vapaaehtoisesti tähän tutki- • · · ’*·. 25 mukseen. F- ja B-anti-MBP määritettiin yhdestä kahteen viikkoa [ * ennen ensimmäistä antoa, ennen kutakin kymmenestä ruiskeesta • · • ** sekä 30 minuutin kuluttua kunkin ruiskeen jälkeen sekä jälleen • · · *.* * yhden - kahden viikon kuluttua viimeisestä ruiskeesta. Kaikis ta CSF:istä, jotka oli saatu ennen kutakin kymmentä ruisketta ·· : 30 ja niiden jälkeen, määritettiin solujen lukumäärä, kokonais- proteiini, glukoosi, igG- ja albumiinitasot. Ennen ensimmäistä ··· ja viimeistä ruisketta otettiin verta ja siitä analysoitiin • · • · **·. elektrolyytit, kreatiniini, sydän- ja maksaperäiset entsyymit ja toteutettiin hematologiset määritykset.

35 • · *:··· Kun sellaiset MS-potilaat, joilla oli krooninen, etenevä sairaus, saivat 10 mg MBP75-95:ttä intratekaalisena ruiskeena toistetusti viikon välein 10 viikon mittaisen ajan, niiden F- 32 anti-MBP, jonka määrä oli aluksi suuri, saattoi tulla sellaiseksi, ettei sitä voitu ilmaista, niin kauan kuin peptidiä annettiin; kun peptidiä ei enää annettu, F-anti-MBP palasi perustasolle yhden - kahden kuukauden kuluessa (kuvio 8). B-5 vasta-aineen tiitterit säilyivät pysyvästi lisääntyneinä koko kokeen ajan.

Sellaisilla potilailla, jotka osallistuivat näihin tutkimuksiin ja saivat joko yksikertaisen ruiskeen synteettistä pepti-10 diä tai toistettuja, viikottaisia ruiskeita, oli krooninen, etenevä pesäkekovettumatauti ja asteeltaan pitkälle kehittynyttä, neurologista heikkoutta. Kukaan näistä potilaista ei raportoinut neurologisten oireidensa huonontumisesta tai MS-taudin kiihtymisestä intratekaalisen peptidiannon jälkeen, 15 eikä CSF:ssä kehittynyt sellulaarista vastetta. MBP75-95:ttä toistetusti saaneilta MS-potilailta tarkkailtiin systeemisiä komplikaatioita, elektrolyyttimuutokset sekä sydämen, maksan ja munuaisen toimintahäiriöt sekä hematologiset muutokset mukaan luettuina, ja mitään haitallisia lisätauteja ei esiin- 2 0 tynyt.

.·. ; MBP75-95:n anto laskimoon • ·· • · • · · • · ·

Sen jälkeen kun oli määritetty, että peptidin MBP75-95:n • · · • · · ***# 2 5 mtratekaalinen anto tuotti F-anti-MBP:n täydellisen neutra loitumisen sitomalla sen mutta ei mitään muutoksia B-vasta- ·· ♦ · i ** aineen tasoissa, päätettiin määrittää saman peptidin laskimon- ··· V · sisäisen annon vaikutus F- ja B-anti-MBP:n CSF-tiittereihin; 500 milligrammaa MBP75-95:ttä liuotettiin 100 millilitraan 3 0 normaalia keittosuolaliuosta ja se ruiskutettiin potilaan 8M41 ;***; laskimoon 30 minuutin kuluessa ja CSF:n anti-MBP: tä tarkkail- ··· tiin joka 30. minuutti, ensimmäisten kahden tunnin ajan, 18 • · **·] tuntia myöhemmin sekä 10, 16 ja 30 päivää myöhemmin. Otettiin verta ennen ruisketta sekä 16 ja 30 päivää myöhemmin ja siitä 3 5 analysoitiin elektrolyytit, kreatiniini, sydän- ja maksaent- • · ·:··· syymit ja toteutettiin hematologiset määritykset. Selkäydin nesteestä tarkkailtiin solujen lukumäärää, kokonaisproteiinia, glukoosia, IgG:tä sekä albumiinitasoja.

33

Kuten esitetään kuviossa 8, 500 mg MBP75-95:ttä, joka annettiin laskimoon, ei tuottanut mitään muutosta CSF:n anti-MBP:n F- ja B-tasojen tiittereissä ensimmäisten kahden tunnin aikana. CSF:n F-anti-MBP:n määrässä havaittiin 30 prosentin lasku 5 18 tuntia myöhemmin. Kun CSF:stä otettiin näytteet 10, 16 ja 30 päivää myöhemmin, sekä F- että B-anti-MBP olivat vähentyneet niiden alkuperäisestä tasostaan, joka oli 11 radioaktiivi suusyksikköä, vastaavasti neljään, kahteen ja yhteen radio-akti ivisuusyksikköön.

10

Kaikissa potilaissa, joita oli käsitelty intratekaalisesti, toistettu havainto oli, että sidotun vasta-aineen lisääntyneet tasot säilyivät hellittämättä, kun taas F-anti-MBP:tä ei voitu ilmaista MBP75-95:n intratekaalisen annon jälkeen. Tämä viit- 15 taa siihen, että tulehdustapahtuma, joka tuotti autovasta- aineita MBP:lie, jäi aktiiviseksi MBP75-95:n intratekaalisen annon aikana ja sen jälkeen. Seurauksena tästä havainnosta MBP75-95:ttä annettiin laskimoon potilaalle, joka oli saanut aiemmin yksinkertaisen intratekaalisen ruiskeen peptidiä.

20 Laskimoon toteutetun annon jälkeen CSF:n anti-MBP:n sekä F- että B-tasot osoittautuivat vähenevän merkittävästi, kun niitä .·. : tarkkailtiin yhden kuukauden mittaisten jaksojen ajan. CSF:n • ·· #*#/ anti-MBP:n sekä F- että B-tasojen väheneminen MBP75-95:n • · · **! suonensisäisen annon jälkeen viittaa siihen, että autoimmuuni- I · i 25 tulehdusprosessissa, joka vastaa anti-MBP:n synteesistä, on tapahtunut mainittua prosessia vähentävää säätelyä.

• · • ·· • · · V · MBP-epitooppi MS-anti-MBP:lle 30 Jotta voitiin paikantaa MBP:n epitooppi MS-anti-MBP: lie, ·***· annettiin sellaisen F- ja B-anti-MBP:n, joka oli puhdistettu • · · af f initeettikromatograf iän avulla CSFrstä ja MS-potilaan • · *···| aivokudoksesta (Warren, K. G. et ai., Ann. Neurol. 35, 280 - * 289, 1994), reagoida kompetitiivisissä inhibitiomäärityksissä 35 41 peräkkäisen, synteettisen MBP-peptidin kanssa, jotka olivat • ♦ •j··· yhtä pitkiä (kukin 10 tähdettä ja siten, että yhdeksän peitti viereisen tähteen) ja kattoivat alueen, joka sijaitsi ihmisen MBP:n tähteiden 61 ja 110 välissä. Sellaisen peptidin (sei- 34 laisten peptidien), joka (jotka) tuotti (tuottivat) suurimman mahdollisen inhibition, katsottiin mitä suurimmassa määrin liittyvän vasta-ainetta sitovaan kohtaan.

5 MS-potilaan aivokudoksesta puhdistetun F- ja B-anti-MBP:n maksimi-inhibitio (kuvio 10) saatiin aikaan neljällä dekapep-tidillä, nimittäin MBP84-93:11a, MBP85-94:llä, MBP86-95:llä sekä MBP87-96:11a, mikä viittaa siihen, että MBP:n epitooppi MS:n anti-MBP:lle paikannetaan tähteiden 84 ja 96 väliin. 10 Yhteisten aminohappojen vähimmäisalue on tähteestä 87 tähteeseen 93. B-anti-MBP:llä on paljon rajoitetumpi alue kuin F-vasta-aineella.

Anti-MBP-vasta-aineiden roolia MS-taudin myeliinikadon synnys-15 sä ei ole selvennetty ja se voidaan määrittää vain muuntamalla anti-MBP:tä in vivo sekä tarkkailemalla kliinisiä ja patologisia seurauksia tämän jälkeen. Esimerkiksi MS:n akuutin uudelleen puhkeamisen jälkeen, kun F- ja B-vasta-aineiden suhteet (F/B) ovat suuremmat kuin yksi, sellaista peptidiä, jonka 20 tiedetään sitovan F-anti-MBP:tä, voitaisiin antaa aivo-selkäydinnesteen alueelle (intratekaalisesti) vapaana kiertävän .·. ; vasta-aineen sitomiseksi ja akuutin, uudelleen puhjenneen • ·· ’ taudin kliinisten vaikutusten päättämiseksi; voidaan tarvita • · · *·· viikoittaista antoa, ennen kuin tauti hellittää tilapäisesti.

• · · *···] 25 Voi olla, että sellaisille MS-potilaille, jotka potevat kroo- * * nista, etenevää sairautta, on annettava peptidiä sekä laski- ·· i *·· moon että intratekaalisesti, jotta hillitään anti-MBP:tä • · · V · tuottavat tulehdusmekanismit.

3 0 Edullisiin sovellusmuotoihin voidaan tehdä erilaisia muunnok- ·***· siä poikkeamatta keksinnön piiristä ja hengestä, joka määri- • · · .·. tellään liitteinä seuraavissa vaatimuksissa.

• · • · ··· • · • · • · · • · · • · • · 35

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT

(i) HAKIJA: The Governors of the University of Al- 5 berta

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: MYELIININ EMÄKSISEN PROTEIININ PEPTIDISPESIFISYYS JA MYELIININ EMÄKSISEN PROTEIININ PEPTIDIEN ANTO PESÄKEKOVETTUMATAUTIA POTEVILLE

10 POTILAILLE

(iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 1 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: 15 (A) VASTAANOTTAJA: Gowling, Strathy & Hen derson (B) KATU: 160 Elgin Street (C) KAUPUNKI: Ottawa (D) VALTIO: Ontario .**.20 (E) MAA: Kanada : (F) POSTINUMERO: KIP 1C3 • · · • · · • · · (V) KONEKOODIMUOTO: • · (A) VÄLINETYYPPI: Levyke I · · '...25 (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

‘ (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patenln julkaisulupa #1.20, • **· versio # 1.20 • · · • · · • · · : .*«30 (vi) TIEDOT NYKYISESTÄ HAKEMUKSESTA: ,···. (A) HAKEMUSNUMERO: • ♦ (B) HAKEMISPÄIVÄ: • "** (C) LUOKITUS: • · 35 (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/327 351 (B) HAKEMISPÄIVÄ: 21. päivä lokakuuta, 1994 36 (Vili) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: (A) NIMI: Judy A. Erratt (B) REKISTERINUMERO: 4 068 (C) VIITE-/LUETTELONUMERO: 08-859459WO1 5 (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: (613) 233-1781 (B) TELEFAX: (613) 563-9869 (C) TELEX TAI SÄHKÖPOSTI: 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 170 aminohappoa 15 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini .**.20 (vi) ALKUPERÄ: • · ; (A) ORGANISMI: homo sapiens • · · • · 1 • · · .1.1: (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: ihmisen myeliinin emäksinen **..25 proteiini * · · « (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:l: • · • ·« • · · • · · • · · . .'.30 • · · • · · • · · · • · • · • · · 37

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala 15 10 15

Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His 20 25 30

Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp 35 40 45

Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala 50 55 60

Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr 65 70 75 80

Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro 85 90 95

Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser 100 105 110

Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly 115 120 125 • · t • « · • · « • « · ***\ Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai *:··: 130 135 140 • ·

Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp 145 150 155 160 • " Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg 165 170 • · · • · · • · · • · · > : • · · 1 • · · • · • ··

Claims (8)

38

1. Peptidi tai sen suolat, joka peptidi pystyy neutraloimaan tai muuntamaan myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen 5 tuoton, tunnettu siitä, että peptidillä on kaava: R^Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Rj, jossa Rx valitaan ryhmästä, jossa on: Asn-Pro-Val-; Pro-Val-;

10 Vai-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; vety; ja hydroksi 15 ja R2 valitaan ryhmästä, jossa on: -Vai; -Val-Thr; -Val-Thr-Pro; -Val-Thr-Pro-Arg-; 2. vety; ja hydroksi ^ . edellyttäen, että Rx ja R2 molemmat eivät ole vetyjä tai hyd- • · · * .* roksyylejä samanaikaisesti. • · · • · · ··· • · · *·:.* 25

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, *·”· että • · • *·· kun Rx on Asn-Pro-Val-, R2 on vety tai hydroksi; kun Rx on Pro-Val-, R2 on -Vai; kun R1 on Vai-, R2 on -Val-Thr; j*. 30 kun Rt on vety tai hydroksi, R2 on -Val-Thr-Pro; .···. kun Rj on Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, * · *·’ R, on -Val-Thr; ja kun Rj on Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R2 on -Val-Thr-Pro-Arg. • ·

3. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aines- • · φ • · osana peptidiä tai sen suoloja, joka peptidi pystyy neutraloi- maan tai muuntamaan myeliinin emäksisen proteiinin vasta-aineen tuoton ja on yksinään tai seoksessa yhdistettynä farma- • · 39 seuttisesti hyväksyttävään kantajaan, tunnettu siitä, että peptidillä on kaava: Rj-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2, jossa Rx valitaan ryhmästä, jossa on:

5 Asn-Pro-Val-; Pro-Val-; Vai-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; 10 vety; ja hydroksi ja R2 valitaan ryhmästä, jossa on: -Vai; -Val-Thr;

15 -Val-Thr-Pro; -Val-Thr-Pro-Arg-; vety; ja hydroksi edellyttäen, että Rj ja R2 molemmat eivät ole vetyjä tai hyd-20 roksyylejä samanaikaisesti. . . 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen koostumus, tunnettu siitä, :-‘;= • · ♦ ***** kun Rj on Asn-Pro-Val-, R2 on vety tai hydroksi; ’·:♦* 25 kun Rj on Pro-Val-, R2 on -Vai; ***** kun Rt on Vai-, R2 on -Val-Thr; ·· • *·· kun Rj on vety tai hydroksi, R2 on -Val-Thr-Pro; :T: kun Rj on Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R2 on -Val-Thr; ja i*.># 3 0 kun Rj on Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val, R2 on -Val-Thr-Pro-Arg. ··· • · • · [·] 5. Peptidin tai sen suolojen käyttö, joka peptidi tai jotka • · *.·.* suolat pystyy (vät) neutraloimaan tai muuntamaan myeliinin ***** emäksisen proteiinin vasta-aineen tuoton, lääkkeen valmistami- .*.*. 3 5 seksi, tunnettu siitä, että peptidillä on kaava: • · · R1-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R2, jossa Rj valitaan ryhmästä, jossa on: Asn-Pro-Val-; • · 40 Pro-Val-; Vai-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; 5 vety; ja hydroksi ja Rj valitaan ryhmästä, jossa on: -Vai; -Val-Thr;

10 -Val-Thr-Pro; -Val-Thr-Pro-Arg-; vety; ja hydroksi edellyttäen, että Rt ja R2 molemmat eivät ole vetyjä tai hyd-15 roksyylejä samanaikaisesti.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että kun Rt on Asn-Pro-Val-, R2 on vety tai hydroksi; kun Rx on Pro-Val-, R2 on -Vai; 2. kun R2 on Vai-, R2 on -Val-Thr; kun Rx on vety tai hydroksi, R2 on -Val-Thr-Pro; .·.; kun R2 on Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, • · · R, on -Val-Thr; ja • · · ^ *·; kun R2 on Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R2 on -Val-Thr-Pro-Arg. • · · *·»* 25 ’ ' 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että • · : ’*· lääkettä annetaan laskimonsisäisesti, intratekaalisesti, suun • · · V · kautta tai niiden yhdistelmänä.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että .***. lääkettä annetaan laskimonsisäisesti annoksena, joka on • · · alueella 1-10 mg kehonpainon kilogrammaa kohti, kerta- tai • · *··*! perättäisinä annoksina, tarpeen mukaan. • · 9

3. Patentkrav • ·