FI111050B - Keskushermoston pesäkekovettumatauti-aivo-selkäydinnesteestä peräisin olevan antimyeliiniemäsproteiinin valmistusmenetelmä - Google Patents

Description

111050

Keskushermoston pesäkekovettumatauti-aivo-selkäydinnesteestä peräisin olevan antimyeliiniemäsproteiinin valmistusmenetelmä - Förfarande for framställning av antimyelinbasprotein frän multipel skleros hjärn-ryggmärgsvätska t « 5 Tämä keksintö kohdistuu sellaisten polypeptidien valmistusmenetelmään, jotka neutraloivat ihmisen myeliiniproteiinin vasta-aineita. Hakemuksessa kuvataan myös uusia farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät näitä valittuja polypeptidejä ja menetelmää näiden peptidien käyttämiseksi hoidettaessa hermoston pesäkekovettumatautia.

Hermoston pesäkekovettumatauti (MS) on ihmisen keskushermostojärjestelmän 10 (CNS) monialkuinen myeliinikatotauti, johon liittyy tulehdus. Lisääntynyt veri-aivo-esteen sisäinen (intra-BBB) IgG-synteesi on MS:n tunnusmerkki (Tourtelotte, W. W., J Neurol Sei 10: 279-304, 1970, Link H. ja Tibbling, G., Scand J Clin Lab Invest 37: 397-401, 1977, Tourtelotte, W, W. ja Ma, B., Neurology 28: 76-83, 1978, toim. Walsh, J. M. ja Tourtelotte, W. W., Hallpike, J. F., Adams, C.W.M. ja Tourtelotte, W. 15 W., Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982,: 275-358, ja Warren, K.

G. ja Catz, I. Ann Neurol 17:475-480,1985).

IgG-synteesi BBB:ssä kohoaa tavallisesti kliinisesti määrätyissä potilaissa (Schumacher, G. A., Beebe, G., Kibler, R. E., et ai., Ann NY Acad Sei 15:266-272, 1965) aktiivisen tai inaktiivisen taudin yhdeydessä. CNS-IgG:n suurimman osan spesifisyys 20 on tuntematon. Kun pienessä osassa on viruksenvastaista aktiivisuutta tai se reagoi aivon antigeenejä, nukleiinihappoja, erytrosyyttejä tai sileiden lihasten antigeenejä vastaan, ei-spesifinen osa voi aktivoida polyklonaalisesti B-soluja (Tourtelotte, W. W. ja Ma, B., Neurology 28:76-83, 1978). Viime vuosikymmenen aikana on kiinnostuttu merkittävästi myeliinille spesifisten vasta-aineiden tutkimisesta.

25 Kierrossa olevien myeliiniemäsproteiinia (MBP) sekä niiden antigeenistä komponenttia sisältävien immuunikompleksien havaitsemisen jälkeen (Dasgupta, M. K., Catz, I, Warren, K. G. et ai., Can J Neurol Sei 10:239-243, 1983) havaittiin lisääntyneitä MBP.n vasta-aineiden (anti-MBP) tiittereitä aivo-selkäydinnesteessä (CSF) potilaissa, • joilla on MS:n aktiivisia muotoja (Warren, K. G. ja Catz, I., Ann Neurol 209:20-25, 30 1986). Kliinisesti MS:lle on tunnusomaista sairauden aktiivisuuden vaiheet, kuten ' akuutit uusiutumiset ja krooninen eteneminen sekä kliinisen kevenemisen vaiheet. Ak tiiviseen MS:ään liittyy intratekaalisesti tuotetun anti-MBP:n lisääntyneet tasot (Warren, K. G. ja Catz, L, Ann Neurol 209:20-25, 1986, ja Catz, I. ja Warren, K. G., Can J Neurol Sei 13:21-24, 1986). Näitä vasta-aineita löydetään vallitsevasti vapaassa (F) 35 muodossa akuuttien uusiutumisten aikana ja vallitsevasti sitoutuneessa (B) muodossa, 2 111050 kun sairaus on salakavalasti etenevä (Warren, K. G. ja Catz, I. Ann Neurol 209:20-25, 1986). Akuuttien uusitumisten aikana CSF-anti-MBP-tiitterit korreloivat taudin aktiivisuuden kanssa (Warren, K. G. ja Catz, L, Ann Neurol 21:183-187, 1987). Anti-MBP-tasoja löydettin myös lisääntyneinä potilaissa, joissa esiintyy näköhermotuleh-5 duksen ensimmäiset kohtaukset ja eniten potilaissa, joilla on ensimmäiset MS-koh-taukset (Warren, K. G., Catz, I., ja Bauer, C., Ann Neurol 23:297-299, 1988, Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 91:143-151,1989).

Pitkittäiset CSF-Anti-MBP-tasojen kineettiset tutkimukset potilaissa, jotka tulevat el-pymisvaiheeseen, joka seuraa akuuttista uusiutumista, ovat osoittaneet vapaiden anti-10 MBP-tiitterien asteittaisen laskun, joka on sitoutuneiden fraktioiden progressiivisen nousun mukainen (Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 91:143-151, 1989, Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 88:185-194, 1988). Väliaikaisessa lievenemi s vaiheessa CSF-anti-MBF voi tulla havaitsemattomaksi, mikä osoittaa MS:n inaktiivisiin vaiheisiin liittyvää anti-MBP-neutraloitumista (Warren, K. G., ja Catz, I., J Neurol Sei 15 88:185-194, 1988). Sitä vastoin kroonisesti etenevään MS:ään, jolle on tunnusomaista lisääntyneen anti-MBP:n säilyvyys pitkiä ajanjaksoja, liittyy anti-MBP-neutraloitu-misen esto (Warren, K. G., ja Catz, I., J Neurol Sei 88:185-194,1988). Myeliiniemäs-proteiinivasta-ainekaskadi, joka identifioitiin äskettäin IgG-fraktiossa, joka puhdistettiin MS-potilaiden CSF:stä, sisälsi anti-MBP:tä, vasta-aineita, jotka neutraloivat an-20 ti-MBP:n ja vasta-aineita, jotka inhiboivat anti-MBP-neutraloinnin (Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 96:18-27,1990).

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MBP neutraloi anti-MBP:n. Kuitenkin aiemmat yritykset MS:n hoitamiseksi heterologisen MBP:n lihaksen sisäisellä tai 7 ihonalaisella antamisella eivät ole olleet menetestyksellisiä (Campbell, B., Vogel, R.

25 J., Fisher, E. ja Lorenz, R., Arch Neurol 29:10-15, 1973, Gonzette, R.E., Delmotte, P. ja Demonty, L, J Neurol 216:27-31, 1977) ja Romine, J. S. ja Salk, J., toim. Hallpike, J. F., Adams, C.W.M. jaTourtelotte, W.W., Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982:621-630). Ongelma on käytettäessä luontaista MBP:tä kaksinkertainen. Proteiini valmistetaan ihmisen aivonäytteistä ja niin ollen on potentiaalisena vaarana, 30 että näytteessä voi olla latentteja hermoviruksia. Toiseksi vaikka MBP ei ole normaalisti immunogeeni, on mahdollista, että kun sitä annetaan henkilöille, joiden immuunijärjestelmä on muuttunut, MBP saattaa toimia antigeeninä ja aiheuttaa MBP:n vastaisten vasta-aineiden tuotantoa.

Näin ollen esillä olevan keksinnön kohteena on määrittää, voidaanko MS-potilaiden, 35 joilla on akuutteja uusiutumisia, CSF.stä puhdistettu anti-MBP neutraloida ihmisen MBP:n (h-MBP) valituilla synteettisillä peptideillä. Tässä tarkoituksessa käytetään 3 111050 synteettisiä, hMBP:n kokopituuden kattavia peptideitä määrittämään mahdollinen epi-tooppialue h-MBP:ssä, joka neutraloi näistä potilaista saadun anti-MBP:n. Siten valit- * tuja synteettisiä peptidejä, joissa esiintyy anti-MBP:n neutralointia, voidaan käyttää MS:n hoitamiseen tehokkaammin kuin täyspituista MBP:tä. Nämä synteettiset peptidit ’ 5 eivät esiinny luonnollisesti ja siten mitään hermovirusten potentiaalista uhkaa ei esiin ny. Lisäksi pienen kokonsa takia nämä peptidit eivät voi toimia immunogeeninä. Siten valittujen synteettisten peptidien käytöllä MS:n hoitoon voitetaan ongelmat, joita on identifioitu käytettäessä luontaista proteiinia.

Esillä olevan keksinnön mukaan saadaan aikaan synteettisiä peptidejä, jotka ovat 10 oleellisesti homologisia sekvenssiltään ihmisen myeliiniproteiinin aminohapposekvenssin osan kanssa. Näiden synteettisten peptidien pituus on noin 8 aminohappotähteestä noin 25 aminohappotähteeseen. Edullisessa suoritusmuodossa nämä synteettiset peptidit vastaavat ihmisen myeliiniemäsproteiinin (h-MBP) aminohapposekvenssiä noin aminohappotähteestä 61 noin aminohappotähteeseen 106.

15 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Hakemuksessa saadaan aikaan farmaseuttisia koostumuksia, jotka käsittävät aktiivisena aineena edellä kuvatut synteettiset peptidit seoksina farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen kanssa.

Lisäksi hakemuksessa kuvataan menetelmä hermoston pesäkekovettumataudin hoita-20 miseksi, joka käsittää tehokkaan määrän edellä kuvattuja synteettisiä peptidejä antamisen anti-humaanimyeliiniproteiinien neutraloimiseksi tehokkaasti.

Kuvio 1 esittää kahdeksantoista synteettisen peptidin sijainnin (pienet luvut) suhteessa intaktiin ihmisen MBP-molekyyliin. Peptidit on esitetty pystytankoina, jotka on sijoitettu niiden MBP-molekyylissä olevan vastaavan alueen viereen. Suuret luvut esittävät 25 ihmisen MBP:ssä olevia aminohappotähteitä.

Kuvio 2 esittää puhdistetun ja 10:stä erilaisesta hermoston pesäkekovettumatautipoti-. · laasta yhdistetyn anti-MBP :n neutralointia ihmisen MBP.llä ja 18 synteettisellä pepti dillä.

• Kuvio 3 esittää yksittäisestä hermoston pesäkekovettumatautipotilaasta eristetyn anti-30 MBP:n neutralointia ihmisen MBP:llä ja peptidillä #12 (tähteet 80-97), #15 (tähteet 91-106) ja #56 (tähteet 75-95).

4 111050

Kuviossa 4 kuvataan ihmisen myeliiniemäsproteiinin kokonainen sekvenssi, joka on esitetty kaaviomaisesti kuviossa 1.

Esillä oleva keksintö kohdistuu valikoitujen synteettisten peptidien valmistusmenetelmään, jotka peptidit ovat oleellisesti homologisia sekvenssiltään ihmisen myeliini-5 proteiinin aminohapposekvenssin osan kanssa. Esillä olevan keksinnön edullinen suoritusmuoto kohdistuu valikoitujen synteettisten peptidien valmistusmenetelmään, jotka peptidit ovat oleellisesti homologisia sekvenssiltään ihmisen myeliiniemäsproteiinin (h-MBP) aminohapposekvenssin osan kanssa. Oleellisesti homologisella" tarkoitetaan, että ihmisen myeliiniproteiinin, erityisesti h-MBP:n, aminohapposekvenssin ja 10 synteettisten peptidien välillä voi esiintyä joitakin vaihteluita edellyttäen, että synteettiset peptidit, joissa on vaihtelu aminohapposekvenssissä, toimivat edelleen tarkoitetussa käytössään, so. neutraloivat ihmisen myeliiniproteiinin tai h-MBP:n (anti-MBP) vastaisia vasta-aineita. Kun keksinnön opetukset on annettu, alan ammatti-miehestä on ilmeistä määrittää empiirisesti, mikä vaihtelu valittujen peptidien sek-15 venssiin voidaan tehdä vaikuttamatta peptidien toimintaan. Termin piiriin myös sisällytetty "synteettinen peptidi" tarkoittaa peptideitä, jotka tuotetaan luonnollisesti esiintyvien myeliiniproteiinien säädetystä hydrolyysistä esillä olevan keksinnön mukaisten valikoitujen synteettisten peptidien valmistamiseksi. Kun tiedetään esillä olevassa keksinnössä selostettujen valikoitujen synteettisten peptidien sekvenssi, kuuluu esillä 20 olevan keksinnön piiriin sopivan DNA-sekvenssin määrittäminen, joka koodaa valikoitua aminohapposekvenssiä. Sopiva DNA-sekvenssi voidaan valmistaa konventionaalisilla ja hyvin tunnetuilla DNA-sekvenssien syntetointimenetelmillä. Näin valmistetut DNA-sekvenssit voidaan kloonata sitten sopiviin kloonausvälitysaineisiin ja käyttää sitten sopivan isäntäsolun transformoimiseen rekombinanttisen synteettisen ·. 25 peptidin valmistamiseksi. Kaikki edellä mainittu metodologia on konventionaalista ja alan ammattimiesten tuntema.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut synteettiset peptidit ovat oleellisesti homologisia sekvenssiltään ihmisen myeliiniemäsproteiinin tai h-MBP:n aminohapposekvenssin osan kanssa. "Aminohapposekvenssin osalla" tarkoitetaan, että **' 30 synteettinen sekvenssi voi olla minkä tahansa pituinen edellyttäen, että aminohappo- sekvenssi on riittävän pitkä toimiakseen siten, että se neutraloi anti-humaanimyeliini-proteiinin tai anti-MBP:n, mutta ei sen pituinen, että se aiheuttaisi tekniikan tason ongelmia, kun synteettisiä peptidejä käytetään hermoston pesäkekovettumataudin in vivo -hoitoon. Esillä olevan keksinnön mukaisesti synteettiset peptidit voivat olla pituudel-35 taan noin 8 aminohappotähdestä noin 25 aminohappotähteeseen. Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa synteettiset peptidit voivat olla pituudeltaan noin 15 aminohappotähteestä noin 21 aminohappotähteeseen.

5 111050

Esillä olevan keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti on määritetty, että valikoidut synteettiset peptidit, jotka vastaavat oleellisesti h-MBP:n aminohapposekvens-' siä, ovat tehokkaita neutraloitaessa anti-MBP. Nämä synteettiset peptidit vastaavat h- MBP:n aminohapposekvenssiä noin aminohappotähteestä 61 noin aminohappotähtee- • 5 seen 106. Siten synteettiset peptidit vahtaan noin 8 aminohappotähteestä noin 25 ami- nohapptähteeseen otettuna jatkuvasta aminohapposekvenssistä, joka on jäljempänä esitetyssä aminohapposekvenssissä: SEQID no 1

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr 10 Gin Asp Gin Asp Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly

Edulliset synteettiset peptidit valitaan tyhmästä, joka koostuu:

Peptidistä # 27 (SEQID nro 2):

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys, 15 Peptidistä # 16 (SEQID nro 3):

Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly,

Peptidistä #21 (SEQID nro 4):

Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Gin,

Peptidistä # 56 (SEQID nro 5): 20 Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Gin Asp Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai :·' Thr,

Peptidistä # 12 (SEQID nro 6):

Thr Gin Asp Gin Asp Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg, ja Peptidistä # 15 (SEQID nro 7): . 25 Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Lys Gly Gly.

» · * ♦

Anti-MBP:n potentiaalisen roolin tutkimusta MS:n patogeneesissä jatketaan. Lisääntyneistä anti-MBP-tiittereistä potilaissa, joilla on aktiivinen MS, raportoi alunperin Panitch et ai (Panitch, H. S., Hooper, C. S. ja Johnson, K. P., Arch Neurol 37:206-209, 1980), joka käytti kiintofaasiradioimmuunitestiä marsun MBP:ssä. Potilailla, joilla on 30 akuutteja uusiutumisia, on tavallisesti lisääntynyt anti-MBP vallitsevasti vapaassa muodossa, kun taas potilailla, joilla on kliininen lieventymistila, voi olla havaitsemat-tomia anti-MBP-tasoja. Siirtymätilan akuutista uusitumisesta lieventymistilaan aikana 6 111050 vapaan anti-MBP:n tiitterit laskevat viikkojen tai kuukausien aikana, kun taas vasta-aineen sitoutuneet fraktiot kohoavat verrattuna niiden alkuarvoon. Muissa lieventy-mistilassa olevissa potilaissa on mahdollista havaita vapaan ja sitoutuneen anti-MBP:n alhaisia tiittereitä, tavallisesti vapaan/sitoutuneen suhteen ollessa alle 1, mikä osoittaa, 5 että anti-MBP:tä neutraloiva(t) vasta-aine(eet) on (ovat) sitoutunut (sitoutuneet) anti-MBP:hen. Joskus potilailla, jotka täyttävät kliinisesti määritetyn MS:n kriteerit, tai potilailla, joilla on neuropatologisesti vahvistettu MS, on havaitsematon anti-MBP sairautensa aktiivisten vaiheiden aikana. On mahdollista, että tällaisilla potilailla on muiden myeliiniproteiinien vasta-aineita. Spesifisen vasta-aineskenaarin puuttuminen ei 10 kiellä anti-MBP:n potentiaalista tärkeyttä MS-potilaiden pääosan demyelinaatiomeka-nismissa.

Äskettäin havaittiin MBP-vasta-ainekaskadi IgG-fraktiossa, joka puhdistettiin MS CFS:stä (Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 96:19-27, 1990). MBP:n primaariset vasta-aineet sekä vapaissa että sitoutuneissa muodoissa ilmenevät liittyneenä aktiivi-15 seen tautiin: vapaat/sitoutuneet suhteet yli 1 potilaisssa, joilla on akuutit uusiutumiset ja alle l:n potilaissa, joilla on krooninen progressiivinen sairaus (Warrem K. G. ja Catz, 1., Ann Neurol 209:20-25, 1986, Catz, I. ja Warren, K. G., Can J Neurol Sei 13:21-24, 1986, ja Warren, K. G. ja Catz, I., Ann Neurol 21:183-187, 1987). Sekundaariset vasta-aineet, jotka neutraloivat anti-MBP:tä ilmestyvät, kun tauti tulee inaktii-20 viseksi. Tertiaariset vasta-aineet, jotka inhiboivat anti-MBP-neutralisaatiota, ovat läsnä, kun sairaus on kroonisesti progressiivinen eikä tule inaktiiviseksi. Se seikka, että MBP-vasta-ainekaskadi liittyy erilaisiin MS:n vaiheisiin osoittaa sen mahdollista tärkeyttä tämän sairauden luonnollista historiaa vasten tarkasteltuna.

Vaikka anti-MBP voidaan havaita aktiivista MS:ää sairastavien potilaiden CSF:ssä, 25 sen erilainen rooli demyelinaation patogeneesissä jää vahvistamatta. Anti-MBP :n osallistuminen MS:n mekanismiin voidaan määrittää parhaiten sen neutraloitumisesta in vivo ehkä antamalla valikoituja synteettisiä peptidejä ja tarkkailemalla taudin kliinistä kulkua. Jos anti-MBP (MBP:t) on (ovat) ainoa(t) primaarinen (-set) vasta-aineet (-aineet), jotka liittyvät demyelinaatioon MS:ssä, on mahdollista estäää tämä prosessi 30 antamalla intratekaalisesti valikoituja synteettisiä MBP-peptidejä, jotka neutraloivat anti-MBP:n ja edistävät MBP-siedettävyyttä in situ. Muita ihmisen myeliiniproteiineja voi osallistua demyelinaatioon MS:ssa ja näin ollen esillä olevan keksinnön piiriin kuuluu synteettisten peptidien, jotka ovat sekvenssiltään oleellisesti homologisia näiden muiden myeliiniproteiinien aminosekvenssien kanssa, käyttö vastaavien vasta-ain-35 eiden neutraloimiseen. Vaikka aiemmat yritykset MS:n hoitamiseksi lihaksen sisäisellä tai ihonalaisella heterologisen MBP:n antamisella eivät ole olleet kokonaan menes- 7 111050 tyksellisiä (Campbell. B., Voge., R. I, Fischer, E. ja Lorenz, R., Arch Neurol 29:10-15, 1973, Gonsette, R. E., Delmotte, P. ja Demonty, L. J Neurol 216:27-31, 1977, ja Romine, J. S. ja Salk, I, toimin. Hallpike, J. F., Adams, C.W.M. ja Tourtelotte, W.W., Multiple sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 182:621-630), synteettisten MBP-, 5 peptidien, jotka neutraloivat anti-MBP:tä, intratekaalinen antaminen on lupaavaa edul listen tulosten saavuttamiseksi.

Näin ollen saadaan farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät aktiivisena aineena edellä kuvattuja synteettisiä peptidejä sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään kantoaineeseen. Esimerkit farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantoaineista ovat alalla 10 hyvin tunnettuja ja ne käsittävät esimerkiksi normaalin suolaliuoksen.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatuja synteettisiä peptidejä voidaan antaa ihmisille hermostopesäkekovettumataudin hoitamiseksi. Terapeuttinen annos MS:n hoitamisessa voi olla noin 1,0 mg:sta ruumiin painokiloa kohti noin 10,0 mg:aan ruumiin-painokiloa kohti. Synteettisiä peptidejä voidaan antaa suonensisäisesti, intratekaalisesti 15 ja oraalisesti. Olisi edullista antaa peptidit joko suonensisäisesti tai intratekaalisesti.

Samalla kun keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti viitaten erityisesti edullisiin suoritusmuotoihin, seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi muttei sen rajoittamiseksi.

Esimerkki 20 Kuvio 1 esittää h-MBP:n tässä tutkimuksessa käytetyn 18 synteettisen peptidin sijainnin suhteessa intaktiin MBP-molekyyliin. Kuvio 4 osoittaa kuviossa 1 kaaviomaisesti • * • ·: esitetyn ihmisen myeliiniemäsproteiinin täydellisen aminohapposekvenssin.

Luontainen MBP eristettiin ei-MS-aivokudoksesta (Diebler, G. E., Martenson, R. E., Kies, m.W., Prep Biochem 2:139-165, 1972) ja se puhdistettiin edelleen geelisuoda-25 tuksella. Lopulliset antigeenivalmisteet tarkistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielekt-roforeesilla. Pelkästään valmisteita, jotka migratoituivat 18,5 KD:n molekyylipainos-.. sa, käytettiin lisätutkimuksissa. Puhdistettua MBP:tä käytettiin antigeeni-spesifisessä affmiteettikromatografiassa, neutralointitutkimuksissa ja kiintofaasi-anti-MBP-radio-immuunitestissä.

k 3 0 Kahdeksantoista synteettistä peptidiä, jotka kattoivat h-MBP:n pituuden ja sisälsivät 8-25 aminohappotähdettä, syntetoitiin aiemmin kuvatulla Fmoc-menetelmällä (Groome, N.P., Dawkes, A., Barry, R. et ai. J Neuroimmun 19:305-315, 1988). Peptidin puhtaus tarkastettiin käänteisfaasikorkeapainenestekromatografialla C18-pylväässä ja vesi/ase- δ 111050 tonitriili gradienttina (0,1 % TFA). Peptidien analysointi suoritettiin myös käyttäen standardianalyysejä. Monet tässä tutkimuksessa käytetyistä peptideistä sisälsivät ei-luonnollisen kysteiinitähteen, kun ne tehtiin immunogeeneinä toimiviksi. Tämä ei vaikuta todennäköisesti esillä oleviin tuloksiin.

5 Saatu aivo-selkäydinneste (CSF) saatiin viikon sisällä oireiden alkaessa 35 potilaasta, joilla on akuutteja MS-uusiutumisia ja IgG-tasot määritettiin sameuden mittaamisella. Tässä tutkimuksessa käytetyt CSF-näytteet valittiin siten, että niissä oli alunperin suuret absoluuttiset IgG-tasot (> 0,80 g/1) ja anti-MBP:n kohonneet tiitterit (Vapaiden/si-toutuneiden suhde > 1,0). Kaikilla MS-potilailla oli kliinisesti määrätty tauti.

10 IgG puhdistettiin akuuttia MS:ää sairastavien potilaiden konsentroidusta CSF:stä proteiini A-Sepharose- (Pharmacia™) afiEiniteettikromatografialla aiemmin kuvatusti (Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 96:19-27, 1990). Jokaisen IgG-valmisteen puhtaus tarkastettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja isoelektrisellä fokusoinnilla. Kun puhdistetusta IgG:stä peräisin olevat korotetut anti-MBP-tasot absorboitiin 15 nollaan MBP illä, absorption jälkeiset supematantit sisälsivät jäännös-IgG:tä.

Puhdistettu MBP kytkettiin CNBr:llä aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia™) valmistajan ohjeiden mukaan. Puhdistettua CSF IgG:tä, joka sisälsi kohonneita anti-MBP-tasoja, jotka olivat peräisin 35 potilaasta, joilla on akuutit uusiutumiset, käytettiin lähtömateriaaleina sitoutumattoman anti-MBP.n eristämiseksi MBP-Sepharose-20 affmiteettikromatografialla (Warren, K. G. ja Catz, I., J Neurol Sei 103:90-96, 1991). Puhdistettuja anti-MBP-näytteitä verrattiin aloitus-IgG-lähteeseen polyakiyyliamidi-geelielektroforeesilla. Kun puhdistetttu anti-MBP absorboitiin nollaan MBPdlä, ab-.1 sorption jälkeiset supematantit eivät sisältäneet mitään jäännös-IgG:ta.

Vakiomäärät anti-MBP:tä (15 radiaktiivisuussitomisyksikköä jotka vastaavat 100 25 skaalanlaajennussyistä =%0) inkuboitiin lisääntyvinä h-MBP-määrinä (0-1000 ng) tai yksittäisiä MBP:n synteettisä peptidejä (0-10000 ng) nestefaasitestissä ja 1,5 tunnin inkuboinnin jälkeen vapaat anti-MBP-tasot määritettiin kaikissa seoksissa. Neutraloin-tikokeissa käytettiin anti-MBP:tä, joka oli eristetty 7 henkilöstä, tai yhdistettyä anti-MBP:tä, joka oli peräisin 10 erilaisesta MS-potilaasta. Vasikan kateenkorvan histonia 30 ja ihmisen seerumin albumiinia käytettiin negatiivisina antigeeniverrokkeina (alue: 1 ΟΙ 00 ng). Yhtä monoklonaalista peptidin #16 (klooni 26) vasta-ainetta ja peptidin #7 (Rl55) yhtä polyklonaalista kanin antiseerumia käytettiin positiivisina vasta-ainever-rokkeina (Groome, N., Harland, J., ja Dawkes, A., Neurochem Int 7:309-317, 1985, Barry, R., Payton, M., ja Groome, N., Neurochem Int 2:291-300, 1991). Epitoopin 45- 9 111050 50 (klooni 16) toista hiiren monoklonaalista vasta-ainetta käytettiin negatiivisena vas-ta-aineverrokkina.

Anti-MBP-tasot määritettiin kiintoaineradioimmuunitestillä ihmisen MBP:n avulla (Warren, K. G. ja Catz, L, Ann Neurol 209:20-25, 1986, Warren, K. G. ja Catz, I., 5 Ann Neurol 21:183-187, 1987, ja Warren, K. G. ja Catz, L, J Neurol Sei 91:143-151, 1989). Vapaat anti-MBP-tasot mitattiin kaikista fraktioista affiniteettikromatografiois-ta ja kaikista neutralointiseoksista. Kaikki yksittäiset näytteet ajettiin neljänä kappaleena käyttäen samaa jodattua materiaalia testin välisen vaihtuvuuden minimoimiseksi.

10 MBP ja peptidit #12 (tähteet 80-97, #15 (tähteet 91-106) ja #56 (tähteet 75-95) neutraloivat puhdistetun anti-MBP:n ja peptidit #16 (tähteet 64-78), #21 (tähteet 69-83) ja #27 (tähteet 61-75) neutraloivat osittain puhdistetun anti-MBP:n (taulukko 1 ja kuvio 2). Jäljelle jääneet kaksitoista synteettistä peptidiä eivät neutraloineet puhdistettua an-ti-MBP:tä ja niiden kineettiset käyrät putosivat kuviossa 2 esitetylle harmaalle alueel-15 le. Vasikan kateenkorvän histoni ja ihmisen seerumin albumiini eivät reagoineet puhdistetun anti-MBP:n kanssa edes niinkään suurissa konsentraatioissa kuin 1000 ng. Pelkästään peptidi #16 inhiboi kloonin 26. Pelkästään peptidi #7 inhiboi R155:n. Klooni 16 ei reagoinut MBP:n tai minkään peptideistä kanssa (kuvion selvyyden vuoksi verrokkitietoja ei ole esitetty). Verrokkinäytteet osoittavat neutralointiyrityksen 20 kelpoisuuden kun odotettu peptidi neutraloi jokaisen verrokkivasta-aineen täydellisesti tai mikään muista peptideistä ei. Tämä osoittaa, ettei edes suurissa peptidikonsentraa-tioissa (10000 ng) havaittu tunnistuksen spesifisyyttä.

» b 1 » * 10 111050

Taulukko 1

Peptidiluku Ihmisen MBP-sekvenssi Reaktiivisuus anti-MBP;n kanssa 7 __1-8 Cy__:_ 38 __Cy 4-18__-_ 8 __Cy 11-24__-_ 39 __18-32__-_ 40 __26-40__-_ 41 __Cy 35-58__-_ 20 __Cy 51-64 Gly__-_ 16__Cy 64-78 __+_ 27__Cy 61-75__+_ 21 __Cy 69-83__+_ 56__Cy 75-95__++_ 12__Cy 80-97 Gly__++_ 15__Cy 91-106__++_ 6__117-129__-_ 42 __Cy 127-140__-_ 43 __Cy 136-149__-_ 2__141-155__-_ 44 Cy 149-162 ++ täydellinen neutralointi + osittainen neutralointi 5 - merkityksetön reaktiivisuus h-MBP-peptidit #12, #15 ja # 56 neutraloivat täydellisesti 7 yksittäisestä MS-poti- •.

·♦ laasta puhdistetun anti-MBP:n (katso kuvio 3 valaisevana esimerkkinä). Yksittäisistä MS-potilaista saadun vasta-aineen rajoittuneen määrän johdosta anti-MBP ei reagoinut jäljelle jääneiden 15 synteettisen peptidin kanssa.

10 Kuten aiemmin huomautettiin, synteettiset peptidit, jotka ulottuvat noin aminohappotähteestä 61 noin aminohappotähteeseen 106, neutraloivat anti-MBP :n. Synteettiset peptidit, jotka eivät neutraloineet anti-MBP:tä, kattavat h-MBP:n aminoterminaalit (noin tähteet 1-63) ja karboksyyliterminaalit (noin tähteet 177-162). Ilmenee, että peptidit, jotka ovat peräisin erilaisilta MBP.n limittymättömiltä alueilta, neutraloivat sa-15 man vasta-aineen (samat vasta-aineet). Tämä voidaan selittää, jos vasta-aineet tunnistavat katkonaisen (kootun) epitoopin, joka sisältää aminohappoja, jotka ovat peräisin erilaisilta alueilta. Samanlaisen ilmiön ovat havainneet aiemmin Hruby et ai (Hruby, ' * S., Alvord, E. C., Groome, N.P. et ai, Molec Immun 24:1359-1364, 1987), jotka osoit tivat, että rotan monoklonaalisessa vasta-aineessa oli suurin epitooppi MBP-sekvens- 11 111050 sissä 112-121 mutta voimakas ristireaktio toisen epitoopin kanssa peptidissä 39-91. Tämä on todennäköisempää kuin mahdollisuus, että vasta-aine on risti-reaktiivinen * kahden täydellisesti erilaisen sekvenssin kanssa, jotka eivät muodosta katkonaista epi-tooppia (Hruby, S., Alvord, E. C, Martenson, R. E., et ai, J. Neurochem 44:637-650, * 5 1985). Neutralointitiedot voidaan selittää MBP:n erilaisista sektioista peräisin olevien peptidien kyvyllä vallata osittain vasta-ainetta sitova tasku vuorovaikuttamalla erilaisten vasta-aine-aminohapposivuketjujen kanssa. Tämä selitys sopii havaintoon, että peptidit, joilla saadaan täydellinen inhibointi (#12, #15 ja # 56), ovat suunnilleen 100 kertaa tehottomampia mooliperustalla kuin intakti MBP aiheuttaessa inhibointia. Edel-10 lä esitetyllä hypoteesillä tämä voi johtua jokaisesta peptidikloonista, joka on kykenemätön saavuttamaan alkuperäisen MBP-epitoopin sitoutumisenergian.

Edullisiin suoritusmuotoihin voidaan tehdä erilaisia muunnelmia poikkeamatta oheisissa patenttivaatimuksissa määritetyn keksinnön piiristä.

» • · • » « k

Claims (4)

12 111050

1. Menetelmä peptidin valmistamiseksi, joka peptidi on oleellisesti homologinen sekvenssiltään ihmisen myeliiniemäsproteiinin aminohapposekvenssin osan kanssa, joka sekvenssi ulottuu noin aminohappotähteestä 61 noin aminohappotähteeseen 5 106 (SEQ ID nro 1), mainittu peptidi on pituudeltaan noin 8 aminohaposta noin 25 aminohappoon ja joka peptidi ei ole peptidi, jonka muodostavat sekvenssin aminohappotähteet 61-82, 71-92, 84-102, 82-91, Cys 80-97 Gly, Cys 64-78, Cys 91-106, Cys 82-99 Gly, Tyr 85-98, 90-100 tai 88-100, tunnettu siitä, että peptidi valmistetaan Fmoc-menetelmällä käytettäväksi ihmisen hermoston pesäkekovettumataudin 10 hoitoon.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda peptid har en 35 längd ffän ca 15 aminosyror tili ca 21 aminosyror. 13 111050

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peptidi on pituudeltaan noin 15 aminohaposta noin 21 aminohappoon.

3. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att nänrnda peptid väljs ur en grupp som bestär av SEQ ID no 2, SEQ ID no 3, SEQ ID no 4, * SEQ ID no 5, SEQ ID no 6 och SEQ ID no 7.

3. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peptidi valitaan ryhmästä, joka koostuu SEQ ID nro 2:sta, SEQ ID nro 3:sta, SEQ ID nro 4:stä, SEQ ID nro 5:stä, SEQ ID nro 6:sta ja SEQ ID nro 7:stä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mai-20 nittu peptidi lisäksi sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen kanssa farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi ja että mainittu peptidi kykenee neutraloimaan antimyeliiniemäsproteiinin. 25 1. Förfarande för ffamställning av en peptid, varvid peptidens sekvens är väsent-ligt homolog med en del av aminosyrasekvensen av mänskligt myelinbasprotein, varvid sekvensen sträcker sig ungefär ffän aminosyrarest 61 ungefär tili aminosyra-rest 106 (SEQ ID m 1), nämnda peptid har en längd ffän ca 8 aminosyror tili ca 25 .. aminosyror och vilken peptid är inte en peptid, som bildas av sekvensens aminosy- 30 rorarester 61-82, 71-92, 84-102, 82-91, Cys 80-97 Gly, Cys 64-78, Cys 91-106, Cys 82-99 Gly, Tyr 85-98, 90-100 eller 88-100, kännetecknat av attpeptiden tillverkas med Fmoc-metoden för att användas vid behandling av multipel skleros i männi-skans nervsystem.

4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknat av att nämnda * 5 peptid dessutom blandas med en farmaceutiskt godtagbar bärare för att framställa en farmaceutisk sammansättning och att nämnda peptid förmär neutralisera antimye-linbasprotein. * 1 • · < > > · « 4