RU2121850C1

RU2121850C1 - Фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза

Info

Publication number: RU2121850C1
Application number: RU94027578A
Authority: RU
Inventors: Кеннет Г. Уоррен; Ингрид Кац
Original assignee: Дзе Гавернос оф дзе Юниверсити оф Алберта
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 1998-11-20
Also published as: DE69232987T2; ES2196007T3; DK0610446T3; EP0610446B1; NZ244807A; CA2053799C; NO310513B1; ATE236193T1; CA2053799A1; NO941415D0; AU2750092A; WO1993008212A1; DE69232987D1; FI941860A0; EP0610446A1; NO941415L; FI941860A; RU94027578A; FI111050B

Abstract

Изобретение относится к селективным полипептидам и их использованию для нейтрализации антител человеческого миелинового белка. Фармацевтическая композиция в качестве, активного ингредиента включает пептид с длиной аминокислот 8-25. Пептид способен нейтрализовать антимиелиновый основной белок. Способ лечения заключается во введении пептида длиной от 8 до 25 последовательных аминокислот внутри последовательности. Доза введения составляет 1- 10 мг/кг веса тела. Использование селективных синтетических пептидов для лечения рассеянного склероза поможет решить проблемы, связанные с применением природного протеина, 2 с. и 2 з.п.ф-лы, 1 табл., 4 ил.

Description

Данное изобретение относится к селективным полипептидам и их использованию для нейтрализации антител человеческого миелиного белка. Изобретение также относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные селективные полипептиды, и к способу использования этих пептидов для лечения рассеянного склероза.

Уровень техники.

Рассеянный склероз (РС) - это многоочаговая демиелинизирующая болезнь центральной нервной системы (ЦНС), связанная с воспалением. Повышенный внутригематоэнцефалический барьер (интра-ВВВ) синтеза IgG (иммуноглобулина G) является отличительным признаком РС (Tourtelotte, W.W., J.Neurol. Sci. 10: 279-304, 1970; Link, H. and Tibbling, G., Scand. J. Clin Lab. Jnvest. 37 : 397-401; Tourtelotte, W.W. and Ma, B, Neurology 28 : 76-83, 1978; Walsh, J. M. and Tourtlotte, W.W., Jn. Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. and Tourtelotte, W.W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore. Williams and Wilkins, 1982 : 275-358; and Warren K.G. and Catz, I. Ann.Neurol. 17 : 475-480, 1985).

Синтез IgG (иммуноглобулина G) с повышением ВВВ обычно наблюдается у больных с клинически выраженным РС (Schumacher, G.A., Bube, G., Kibler R.E., et al., Ann NJ Acad. Sci. 15 : 266 - 272, 1965) при активном и пассивном течении болезни. Специфичность большинства IgG ЦСЖ неизвестна. В то время, как небольшая часть обладает антивирусной активностью или реагирует на антигены мозга, нуклеиновые кислоты, эритроциты или антигены гладкой мускулатуры, неспецифическая часть может вызывать поликлональную активацию B-клеток (Tourelotte, W.W., and Ma, B., Neurology 28 : 76-83, 1978).

В последнее десятилетие наблюдался значительный интерес к изучению антител специфических миелиновых белков с использованием детектирования кровеносных иммунных комплексов, содержащих в качестве антигенного компонента миелиновый основной белок (МОБ), в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) пациентов с активными формами РС были обнаружены повышенные титры антител МОБ (анти-МОБ) (Warren, K.G., and Catz, I. Ann. Neurol. 209 : 20 - 25, 1986). Клинически РС характеризуется такими фазами развития болезни, как острые рецидивы или хроническое развитие и клиническая ремиссия. Активный РС связан с повышенным уровнем интратекально продуцированных анти-МОБ (Warren, K.G., and Catz, I, Ann. Neurol. 209 : 20-25, 1986; and Catz, I. and Warren K.G, Can. J. Neurol Sci. 13 : 21-24, 1986). Эти антитела находятся преимущественно в свободной (Своб.) форме во время острых рецидивов и преимущественно в связанной (Связ. ) форме, когда болезнь прогрессирует незаметно (Warren K.G. and Catz, I. Ann. Neurol. 209 : 20 - 25, 1986). Во время острых рецидивов титры анти-МОБ ЦСЖ коррелируются с активностью болезни (Warren K.G. and Catz, I., Ann. Neurol. 21 : 183-187, 1987).

Повышенные уровни анти-МОБ были также обнаружены у пациентов при первых приступах оптического неврита и у большинства пациентов с первыми приступами РС (Warren K.G., Catz I, and Bauer C., Ann. Neurol. 23 : 297-299, 1988; Warren K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 91: 143-151, 1989).

Изучение кинетики уровней анти-МОБ ЦСЖ пациентов, переживающих стадию выздоровления вслед за острым рецидивом, показало постепенное падение титров анти-МОБ в Своб. , соответствующее прогрессивному росту Cвяз. (связанных) фракций (Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 91 : 143-151, 1989; Warren K.G. and Catz, I., J. Neurol. 88 : 185-194, 1988). В стадии ремиссии анти-МОБ ЦСЖ могут стать необнаруживаемыми, что, по-видимому, объясняется нейтрализацией анти-МОБ, связанной с неактивными фазами РС (Warren, K.G. and Catz, I., Neurol. Sci., 88. 185 - 194, 1988). В противоположность этому хронически прогрессирующий РС, характеризуемый постоянством возросших анти-МОБ, в течение длительного периода времени был связан с ингитированием нейтрализации анти-МОБ (Warren, K. G. and Catz, I., Neurol. Sci., 88 : 185-194, 1988). В последнее время сообщалось, что каскад антител миелинового основного белка, обнаруженных в JgG фракции, очищенный от ЦСЖ больных РС, содержал анти-МОБ, антитела, нейтрализующие анти-МОБ и антитела, которые ингибируют нейтрализацию анти-МОБ (Warren, K. G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 96 : 19-27, 1990).

Более ранние исследования показали, что анти-МОБ нейтрализуется МОБ. Однако прежние попытки осуществлять лечение РС внутримышечным или подкожным применением гетерологов МОБ не были успешными (Campbell B., Vogel., R. J. Fisher. , E. and Lorenz, R., Arch. Neurol. 29: 10-15, 1973; Gonselte, R.E., Delmotte, P. and Demonty, L., J. Neurol. 216: 27-31, 1977; и Romine, J. S. and Salk, Jn. Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. and Tourtelotte, W.W., eds. Multiple Screlosis. Baltimore. Willams and Wilkinds, 1982: 621-630). Проблема с использованием природного МОБ двухаспектна. Белок получен из образцов человеческого мозга и поэтому существует потенциальная опасность, что в образце могут быть латентные невровирусы. Во-первых, хотя МОБ обычно не является иммуногеном, возможно, что при применении его к людям с измененной иммунной системой, МОБ может действовать как антиген и вызывать продуцирование антител по отношению к МОБ.

Соответственно целью данного изобретения является определение, может ли анти-МОБ, очищенный от ЦСЖ больных РС с острыми рецидивами, быть нейтрализован селективными синтетическими пептидами человеческого МОБ (ч-МОБ). Для этой цели для определения возможного ареала эпитопа к ч-МОБ, который нейтрализует анти-МОБ, полученный от этих пациентов, были использованы синтетические пептиды, охватывающие всю длину ч-МОБ. Поэтому селективные синтетические пептиды, которые продемонстрировали способность нейтрализовать анти-МОБ, могут быть использованы для лечения РС более эффективно, чем МОБ полной длины. Эти синтетические пептиды - не природного происхождения и поэтому как таковая, потенциальная угроза невровирусов не будет существовать. Дополнительно благодаря своему маленькому размеру эти пептиды не могут действовать как иммуногены. Следовательно, использование селективных синтетических пептидов для лечения РС, поможет решить проблемы, связанные с применением природного протеина.

Сущность изобретения.

Согласно данному изобретению получают синтетические пептиды, последовательность которых является в основном гомологической по отношению к последовательности части аминокислотной последовательности человеческого миелинового белка. Эти синтетические пептиды имеют разную длину - от 8 остатков аминокислот до примерно 25 остатков аминокислот. В предпочтительном варианте эти синтетические пептиды соответствуют аминокислотной последовательности человеческого миелинового основного белка (ч-МОБ) от 61 остатка аминокислот до примерно 106 остатков аминокислот.

Далее согласно настоящему изобретению получают фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента синтетические пептиды, описанные выше, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Далее, согласно данному изобретению предлагается способ лечения рассеянного склероза, заключающийся в применении эффективного количества синтетических пептидов, описанных выше, для эффективной нейтрализации анти-(ч-МОБ).

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 иллюстрирует локализацию восемнадцати синтетических пептидов (маленькие цифры) по отношению к целой молекуле человеческого МОБ. Пептиды представлены вертикальными линиями, помещенными рядом с соответствующим местом на молекуле МОБ. Большие цифры обозначают остатки амина кислот человеческого МОБ.

На фиг. 2 показана нейтрализация анти-МОБ, очищенного и извлеченного из 10 различных больных, при помощи МОБ и 18 синтетических МОБ-пептидов.

На фиг. 3 показана нейтрализация анти-МОБ, выделенного из организма индивидуального больного РС при помощи человеческого МОБ и пептидов #12 (остатки 80-97), #15 (остатки 91-106) и #56 (остатки 75-95).

На фиг. 4 изображена полная аминокислотная последовательность человеческого миелинового основного белка, показанного схематически на фиг. 1.

Детальное описание изобретения.

Настоящее изобретение направлено на создание селективных синтетических пептидов, которые в основном являются гомологами в последовательности части аминокислотной последовательности человеческого миелинового белка. Предпочтительным вариантом данного изобретения является создание селективных синтетических пептидов, которые в основном являются гомологами в последовательности части аминокислотной последовательности человеческого миелинового основного белка (ч-МОБ). Термином "в основном, гомологи" обозначают тот факт, что между аминокислотной последовательностью человеческого миелинового белка, особенно ч-МОБ, и синтетических пептидов может быть различие при условии, что синтетические пептиды, имеющие отличную аминокислотную последовательность, все еще действуют по требуемому назначению, то есть для нейтрализации антител к миелиновым протеинам человека или ч-МОБ (анти-МОБ). Руководствуясь настоящим изобретением, специалист в данной области техники легко определит эмпирически, какие могут быть различия в последовательности селективных пептидов без нарушения функции этих пептидов.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с обычными и хорошо известными методами синтеза полипептидов.

В объем термина "синтетические пептиды" входят пептиды, синтезируемые путем контролируемого гидролиза миелина природного происхождения, для получения селективных синтетических пептидов по настоящему изобретению. Сюда также относятся пептиды, полученные ДНК-рекомбинацией. Зная последовательность селективных синтетических пептидов, согласно данному изобретению определяют соответствующую ДНК-последовательность, которая будет служить кодом для селективной аминокислотной последовательности. Соответствующая ДНК-последовательность может быть продуцирована обычными и хорошо известными методами синтеза ДНК-последовательностей. Полученные таким образом ДНК-последовательности могут быть затем клонированы в соответствующие вещества и использованы для превращения соответствующей клетки-хозяина в рекомбинантный синтетический пептид. Все вышесказанное является обычными знаниями, хорошо известными специалисту в данной области.

Синтетические пептиды по данному изобретению в основном являются по последовательности гомологами части аминокислотной последовательности человеческого миелинового основного протеина или ч-МОБ. Термин "часть аминокислотной последовательности" означает, что синтетическая последовательность может быть любой длины при условии, что эта аминокислотная последовательность имеет достаточную длину для функционирования в качестве нейтрализатора анти-миелинового белка человека или анти-МОБ, но не такую длину, которая приведет к уже известным из уровня техники проблемам, когда синтетические пептиды используются для лечения in vivo рассеянного склероза. Согласно данному изобретению синтетические пептиды по длине могут колебаться от примерно 8 остатков аминокислот до примерно 25 остатков аминокислот. По предпочтительному варианту настоящего изобретения синтетические пептиды могут по длине меняться от 15 остатков аминокислот от 21 остатка аминокислот.

Согласно одному варианту настоящего изобретения было определено, что селективные синтетические пептиды, в основном соответствующие аминокислотной последовательности ч-МОБ, эффективны при нейтрализации анти-МОБ. Эти синтетические пептиды соответствуют аминокислотной последовательности ч-МОБ из примерно 61 остатков до примерно 106 аминокислотных остатков. Поэтому синтетические пептиды выбираются из имеющих от 8 аминокислотных остатков до 25 аминокислотных остатков, взятых из непрерывной аминокислотной последовательности среди последовательностей, показанных ниже.

SEQIDN.1
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser
His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn
Ile Val The Pro Arg Thr Pro Thr Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
Предпочтительные синтетические пептиды выбирают из группы, состоящей из
Пептид # 27 (SEQIDN. 2):
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys;
Пептид # 16 (SEQIDN. 3):
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly;
Пептид # 21 (SEQIDN. 4):
Tyr Gly Aer Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln;
Пептид # 56 (SEQIDN. 5):
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr;
Пептид # 12 (SEQIDN. 6):
Thr Gln Asp Gln Asp Rro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg; и
Пептид # 15 (SEQIDN. 7):
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly;
Потенциальную роль анти-МОБ в патогенезисе РС продолжают изучать. О повышенных титрах анти-МОБ у пациентов, болеющих активным РС, впервые сообщили Panitch et al (Panitch, H.S., Hooper, C.S., Johnson, K.P., Arch. Neurol. 37: 206 - 209, 1980), использовавшие метод твердофазного радиоммунологического анализа с применением МОБ морской свинки. У пациентов с острыми рецидивами РС обычно наблюдается повышенное количество анти-МОБ, преимущественно в свободной форме, в то время как у некоторых пациентов в стадии клинической ремиссии нельзя было обнаружить анти-МОБ. Во время стадии перехода от острого рецидива к ремиссии титры свободных анти-МОБ прогрессивно уменьшаются в течение нескольких недель или месяцев, в то время как количество связанных фракций антител растет по сравнению с их первоначальным количеством. У других пациентов в стадии ремиссии можно наблюдать низкие титры свободных или связанных анти-МОБ, обычно при отношении своб./связ. ниже 1 предполагается, что антитела, нейтрализующие анти-МОБ, связаны с анти-МОБ.

Иногда у пациентов, которые имеют клинически подтвержденный РС или невропатологически подтвержденный РС, во время активных фаз болезни анти-МОБ не определяются.

Возможно такие пациенты имеют антитела к другим миелиновым белкам. Отсутствие специфических антител не уменьшает потенциального значения анти-МОБ в механизме демиенилизации у большинства больных РС.

В последнее время каскад МОБ-антител наблюдался в JgG-фракции, очищенной от ЦСЖ больных РС (Warren. K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci., 96: 19-27, 1990). Первичные антитела к МОБ в свободной и связанной формах возникают в связи с активной формой болезни. Отношение своб./связ. выше 1 у пациентов с острыми рецидивами и ниже 1 у пациентов с хронической прогрессирующей болезнью (Warren, K.G. and Catz, I., and Warren, K.G., Can. J. Neurol. Sci. 209: 20-25, 1986; and Warren, K.G. and Catz. I. Ann. Neurol 13: 21-24, 1986; and Warren. K.G. and Catz. I., Ann. Neurol. 21: 183-187, 1987).

Вторичные антитела, нейтрализующие анти-МОБ, появляются, когда болезнь становится пассивной. Третичные антитела, которые ингибируют нейтрализацию анти-МОБ, присутствуют, когда болезнь хронически прогрессирует и не становится пассивной. Тот факт, что каскад антител к МОБ связан с различными фазами РС, приводит к предположению, что он имеет значение для естественного течения болезни. Хотя анти-МОБ можно обнаружить в ЦСЖ больных активным РС, их прямую роль в патогенезисе демиенилизации еще следует подтвердить. Вовлечение анти-МОБ в механизм РС можно лучше всего определить путем их нейтрализации in vivo возможно применением селективных синтетических пептидов и мониторингом клинического течения болезни. Если анти-МОБ является (являются) единственным(и) первичным(и) антителом(-ами), связанными с демиелинизацией при РС, можно заблокировать этот процесс путем интратекального применения селективных синтетических МОБ-пептидов, которые будут нейтрализовывать анти-МОБ и будут способствовать терпимости к МОБ in situ. Другие человеческие миелиновые белки также могут быть вовлечены в процесс демиелнизации при РС и соответственно использование синтетических пептидов, последовательность которых в основном гомологическая по отношению к последовательности части аминокислотной последовательности этих других миелиновых белков, для нейтрализации соответствующих антител, находится в рамках данного изобретения. Хотя предыдущие попытки осуществлять лечение РС внутримышечным или подкожным применением гетерологического МОБ не были полностью успешными (Cambell, B., Vogel, R. J. Fisher, E. and Lorenz R., Arch. Neurol. 29: 10-15, 1973; Gousette, R. E. , Delmotte P. and Demonty, L.J. Weurol. 216: 27-31, 1977; and Romine, J.S. and Salk, J., Jn. Hallpike, J.F. Adams, C.W.M. and Toustelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore. Williams and Wilkins. 1982: 621-630), более вероятно, что интратекальное применение синтетических МОБ-пептидов, нейтрализующих анти-МОБ, даст положительные результаты.

Соответственно, данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента синтетические пептиды, описанные выше, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Примеры таких носителей широко известны в данной области и включают, например, обычный физиологический раствор.

Синтетические пептиды согласно данному изобретению можно применять для лечения рассеянного склероза у людей. Терапевтическая доза для лечения РС может быть равна от примерно 1,0 мг на кг веса тела до примерно 10,0 мг/кг веса тела. Синтетические пептиды можно применять внутривенно, внутритекально или орально. Предпочтительно применять пептиды внутривенно или внутритекально (тека - капсула, оболочка).

Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации данного изобретения, но они не ограничивают его объем.

Пример. На фиг.1 показано расположение 18 синтетических пептидов ч-МОБ, использованных в данном исследовании, по отношению к целой молекуле МОБ. На фиг.4 показана полная аминокислотная последовательность в человеческом миелиновом основном белке, изображенном схематически на фиг.1.

Природный МОБ был выделен из мозговой ткани, не пораженной РС (Diebler, G. E. , Martenson, R.E., Kies M.U. Prep. Biochem. 1: 139-165, 1972) и затем очищен гель-фильтрацией.

Конечные препараты антигена проверяют на чистоту при помощи гель-электрофореза с использованием сульфодецилсульфата - полиакриламидного геля. Для дальнейших исследований применяют только такие препараты, которые мигрируют при молекулярном весе 18,5 кДа. Очищенный МОБ используют в антигенно-специфической аффиной хроматографии, при изучении нейтрализации и в твердофазном радиоиммунологическом исследовании анти-МОБ.

Восемнадцать синтетических пептидов, охватывающих длину ч-МОБ и содержащих 8-25 остатков аминокислот, были синтезированы способом, ранее описанным в Groome, N. P., Dawkes, A., Barry R. et.J.Neuroimmun. 19: 305-315, 1988). Чистота пептидов проверялась методом жидкостной хроматографии высокого давления с обратимой фазой с использованием колонки C₁₈ и градиента вода/ацетонитрил (0,1% ТФК). Анализ аминокислот пептида также проводят стандартным методом. Многие пептиды, использованные в указанной работе, содержали остатки неприродного цистеина, так как им предназначалась роль иммуногенов. Это вряд ли влияет на исследования по данному изобретению.

Цереброспинальную жидкость (ЦСЖ) получали в течение недели от 35 пациентов с острыми рецидивами PC, а уровни IgG определяли методом нефелометрии. Используемые в этой работе образцы ЦСЖ были выбраны так, чтобы они имели первоначально высокие абсолютные уровни IgG (≥ 0,80 г/л); повышенные титры анти-МОБ (отношение своб/связ. > 1,0). Все пациенты болели клинически выраженным PC.

IgG из концентрированной ЦСЖ пациентов с острыми рецидивами РС был очищен методом аффинной хроматографии (белок - A-сефароза (Pharmacia TM)), как это было описано в Warre K.G. and Catz, I. J.Neurol. Sci. 96: 19-27, 1990. Чистоту каждого препарата IgG проверяли методом гель-электрофореза (полиакриламидный гель) и изоэлектрическим фокусированием.

Когда повышенные уровни анти-МОБ из очищенного IgG абсорбировали при помощи МОБ до нулевого значения, супернатанты пост-абсорбции содержали остаточный IgG.

Очищенный МОБ сочетают с CNBr - активированной Sepharose 4B (Pharmacia TM) в соответствии с инструкцией производителя. Содержание IgG повышенные уровни анти-МОБ из очищенной ЦСЖ 35 пациентов с острыми рецидивами РС использованы в качестве исходных образцов для выделения несвязанного анти-МОБ методом аффинной хроматографии (МОБ-Sepharose) (см.Warre K.G. and Catz I., J. Neurol. Sci. 103: 90-96, 1991). Очищенные образцы анти-МОБ сравнивали с первоначальным источником IgG методом гель-электрофореза (полиакриламидный гель). Когла весь очищенный анти-МОБ был абсорбирован МОБ (до 0), супернатанты пост-абсорбции не содержали остаточного IgG.

Постоянные количества анти-МОБ (15 единиц, связывающих радиоактивность, соответствующих 100 на шкале расширения = % 0) инкубируют с возрастающими количествами ч-МОБ (0-1000 нг) или индивидуальных синтетических пептидов МОБ (0-10000 нг) в жидкофазном анализе и через 1,5 час. инкубации во всех смесях были определены свободные уровни анти-МОБ. В опытах по нейтрализации использовали анти-МОБ, выделенный у 7 индивидуальных больных РС или анти-МОБ, собранный у 10 различных больных РС. В качестве негативных антигенных контрольных образцов использовали гистон тимуса теленка и альбумин сыворотки человека. В качестве позитивных контрольных образцов антител использовали одно моноклональное антитело к пептиду # 16 (клон 26) и одно поликлональное антисывороточное тело кролика к пептиду # 7 (R 155) (см.Groome, N., Harland J., and Dawkes, A. , Neurochem. Jnt. 7: 309-317, 1985; Barry, R., Payton., and Groome, N. , Neurochem Jut. 2: 291-300, 1991). В качестве негативного контрольного антитела использовали моноклональное антитело мыши к эпитопу 45-50 (клон 16). Уровни анти-МОБ определяли твердофазным радиоиммунологическим анализом при помощи человеческого МОБ (Warren K.G., and Catz, I., Ann. Neurol. 209: 20-25, 1986; Warren. K.G., and Catr I., Ann Neurol. 21: 183-187, 1987; and Warren.K.G. and Catr.I., J.Neurol Sci., 91: 143-151, 1989). Свободные уровни анти-МОБ были измерены во всех фракциях, полученных методом аффинной хроматографии, и во всех нейтрализационных смесях. Все индивидуальные образцы получали в 4-х экземплярах с использованием одного и того же иодинированного материала для того, чтобы свести к минимуму погрешности испытаний.

Очищенный анти-МОБ был полностью нейтрализован МОБ и пептидами: # 12 (остатки 80-97), # 15 (остатки 91-106) и # 56 (остатки 75-95) и частично нейтрализован пептидами # 16 (остатки 64-78), # 21 (остатки 69-83) и # 27 (остатки 61-75) (таблица и фиг.2). Оставшиеся 12 синтетических пептидов не нейтрализуют очищенный анти-МОБ и их кинетические кривые попадают в заштрихованную область, показанную на фиг.2. Гистон тимуса теленка и альбумин сыворотки человека не реагируют с очищенным анти-МОБ даже при таких высоких концентрациях, как 1000 нг. Клон 26 ингибируется только пептидом # 16. R I 155 ингибируется только пептидом # 7. Клон 16 не реагирует с МОБ или другими пептидами (для четкости чертежей контрольные результаты не показаны). Контрольные образцы показывают действенность подхода к нейтрализации, так как каждое контрольное антитело было полностью нейтрализовано ожидаемым пептидом и никаким другим. Это свидетельствует о том, что наблюдается распознавание специфичности даже при высоких концентрациях пептида (10000 нг).

Очищенный анти-МОБ, полученный у 7 индивидуальных больных РС, полностью нейтрализовался ч-МОБ и пептидами # 12, # 15 и # 56 (см.фиг.3 как иллюстративный пример).

Благодаря ограниченному количеству антитела, полученного от индивидуальных больных, анти-МОБ не реагировал с оставшимися 15 синтетическими пептидами.

Как было отмечено ранее, анти-МОБ нейтрализовался синтетическими пептидами, имеющими от 61 до 106 остатков аминокислот. Синтетические пептиды, не нейтрализующие анти-МОБ, покрывают как амино- (остатки 1-63), так и карбоксильные (остатки 117-162) группы ч-МОБ. Оказывается пептиды из различных, не перекрывающихся частей МОБ нейтрализуют одни и те же антитела. Это можно объяснить, если антитела распознают непрерывный эпитоп, содержащий аминокислоты на различных участках. Подобное явление ранее наблюдалось Hruly et al (Hruly, S., Alvord, E.C. Groome, N.P.et.al., Molec. Immun. 24: 1359-1364, 1987), которые показали, что моноклональное антитело крысы имеет эпитоп в последовательности 112-121 у МОБ и образует сшивку с другим эпитопом в пептиде 39-91. Более, чем вероятно, что антитело образует сшивку с двумя совершенно различными последовательностями, которые не образуют непрерывный эпитот (Hruhy. , S. Alvord, E.C., Martenson, R.E., et al. J.Neurochem. 44: 637-650, 1985). Данные по нейтрализации можно объяснить способностью пептидов из различных частей МОБ занимать каждый частично антителосвязывающий "карман" путем взаимодействия с различными боковыми цепями аминокислот антитела. Это объяснение согласуется с наблюдением, что пептиды, проявляющие полное ингибирование (# 12, # 15 и # 56), приблизительно в 100 раз менее эффективны на молярной основе, чем целый МОБ при протекании ингибирования.

Следуя вышеуказанной гипотезе, это может быть вызвано тем, что каждый пептидный клон не способен достичь энергии связывания первоначального эпитопа МОБ.

Не выходя за рамки и объем изобретения, определенный формулой изобретения, предпочтительные варианты данного изобретения могут быть изменены.

Claims

1. Фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента пептид, взятый в количестве 1 - 10 мг/кг веса тела, длиной от 8 до 25 последовательных аминокислот, внутри последовательности
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный пептид способен нейтрализовать антимиелиновый основной белок.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид выбран из группы, состоящей из
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys; Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly; Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln; Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr; Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg; и Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly.

3. Способ лечения рассеянного склероза человека, заключающийся во введении 1 - 10 мг/кг веса тела пептида длиной от 8 до 25 последовательных аминокислот внутри последовательности
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный пептид способен нейтрализовать антимиелиновый основной белок.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что названный пептид выбран из группы, состоящей из
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys; Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly; Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln; Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr; Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg; и Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly.