CN100582085C

CN100582085C - 脂肪醇的碱性酯及它们作为抗炎药或免疫调节剂的用途

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Publication number: CN100582085C
Application number: CN200380101149A
Authority: CN
Inventors: M·欣茨基; I·R·科肯; R·马加里特; Y·赫滋格; J·斯特林; G·托斯; I·米斯科滋; F·兰塔; T·塔马斯
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: AU2003269466A1; US8987263B2; NZ539106A; NO20052229D0; RU2337093C2; KR20050071565A; CA2501318A1; NO20052229L; BR0314554A; IS7781A; EP1551495A2; US20060173053A1; WO2004032824A2; JP2006502213A; RU2005114374A; MXPA05003870A; AU2003269466B2; EP1551495A4; WO2004032824A3; ZA200502613B

Abstract

下面通式的脂肪醇的碱性酯：R1-O-CO-A，或其药学上可接受的盐，其中R1是C₁₂-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基，A是是含至少一个环状氨基和/或至少一个含叔或季氮原子的杂芳香族环，是抗炎和免疫调节剂，在免疫性炎症的治疗中有用，以及作为涉及细胞和体液反应的抗原的佐剂。

Description

脂肪醇的碱性酯及它们作为抗炎药或免疫调节剂的用途

发明领域

本发明涉及脂肪醇的碱性酯(BASIC ESTERS)及它们作为抗炎药和免疫调节剂的用途，特别是用于治疗免疫性炎症，以及作为抗原佐剂的用途，其中所述抗原包括细胞反应和体液反应。简写：AA：佐剂关节炎；CFA：完全弗氏佐剂；DTH：迟发型超敏反应；EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎；GA：格拉默乙酸盐(glatiramer acetate)；IFA：不完全弗氏佐剂；IV：静脉内；MBP：髓鞘碱性蛋白；MS：多发性硬化；MSCH：小鼠脊髓匀浆；OA：油醇；PBS：磷酸缓冲盐溶液；SC：皮下。

发明背景

1.炎症

炎症通常分为三个阶段：急性炎症、免疫应答和慢性炎症。急性炎症是对组织损伤的最初反应，通过释放组胺、血清素、缓激肽、前列腺素和白细胞三烯介导。当免疫活性细胞在外来生物或急性或慢性炎症反应期间释放的抗原物质作用下激活时，出现免疫反应，其通常在急性炎症阶段之后。宿主免疫反应的结果可能是有益的，因为它使入侵生物被吞噬或中和。但是，如果免疫反应导致慢性炎症而没有消除潜在的损伤过程，如同类风湿性关节炎中出现的情况，那么结果可能是有害的。

炎症患者的治疗使组织损伤进程减缓或终止以及疼痛减轻，疼痛是炎症患者的症状和持续主诉。

抗炎药通常分为甾体类或糖皮质激素抗炎药和非甾体类抗炎药(NSAID)。糖皮质激素是强抗炎药物，但是与慢性皮质类甾醇治疗有关的高毒性抑制了它的应用，只是用于某些急性炎症性病症。因此，非甾体类抗炎药在慢性病例如类风湿性关节炎的治疗中起主要的作用。

非甾体类抗炎药包括氨基芳基羧酸、芳基乙酸、芳基丁酸、芳基羧酸、芳基丙酸、吡唑、吡唑酮、水杨酸的衍生物和一些不同化学结构的其它衍生物，包括抗关节炎/抗风湿特效药。

非常希望能够提供新的非甾体类抗炎药，其能够作为目前抗炎药的代用品。

2.疫苗和佐剂

淋巴细胞是免疫系统的中央细胞，负责获得性免疫以及多样性、特异性、记忆和自我/非自我识别的免疫性质。成熟B细胞与其它淋巴细胞的区别在于：它们的合成以及用作抗原受体的膜结合免疫球蛋白(抗体)分子的展示。抗原和成熟原始B细胞上的膜结合抗体之间的相互作用导致相应特异性的B细胞克隆激活和分化，由此生成缺乏膜结合抗体但是分泌具有相同抗原结合特异性抗体分子的B细胞克隆。

如同B淋巴细胞，T淋巴细胞也具有抗原膜受体。但是，与B细胞上的膜结合抗体不同的是，T细胞受体(TCR)不识别游离抗原。相反，TCR仅识别与主要组织相容性复合体(MHC)内的基因编码的自体分子结合的抗原。为了使大部分T细胞能够被识别，抗原必须与MHC分子一起展示在抗原递呈细胞(APC)或病毒感染细胞、癌细胞的表面上及移植。

如B细胞一样，T细胞表达不同的膜分子。所有的T细胞亚群都表达TCR，一种包括CD3的多肽复合物，大多数T细胞都可以通过两种膜分子(CD4和CD8)中的一种或另一种的存在进行区分。表达膜糖蛋白分子CD4的T细胞局限于识别与结合II类MHC分子的抗原，而表达CD8(一种二聚体膜糖蛋白)的T细胞局限于识别与I类MHC分子结合的抗原。

通常，CD4和CD8的表达同样定义了T淋巴细胞的两个主要亚群。CD4⁺T细胞通常起T辅助(T_H)细胞的作用并且是II类限制性的；CD8⁺T细胞通常起T细胞毒性(Tc)细胞的作用并且是I类限制性的。

T_H细胞通过抗原递呈细胞上的抗原II类MHC复合体的识别进行激活。激活后，T_H细胞开始分裂并产生效应细胞的克隆，每个对相同的抗原II类MHC复合体来说都是特异性的。这些T_H细胞分泌各种细胞因子，其在B细胞、T细胞、以及其它参与免疫反应的细胞的激活中起关键作用。

T_H细胞产生的细胞因子模式的改变可以改变与其它白细胞发育的免疫反应的类型。依据T_H细胞激活时分泌的特征细胞因子，可以将T_H细胞分为两组：T_H1反应生成一种细胞因子分布，其支持炎症并主要激活某些T细胞和巨噬细胞，而T_H2反应主要激活B细胞和依赖于抗体的免疫反应。因此，T_H1细胞分泌诱导T细胞增殖的IL-2和介导组织炎症的细胞因子例如IFN-r。相反，T_H2细胞分泌IL-4和IL-10，其中IL-4激活B细胞以分泌某些IgG同种型的抗体并抑制T_H1炎性细胞因子的产生，而IL-10抑制由巨噬细胞产生的炎性细胞因子，并因此间接地减少T_H1细胞产生的细胞因子，并通过下调II类MHC表达对抗原递呈细胞起作用。

自体免疫源于免疫系统对自体组分的不适宜反应，导致T细胞或B细胞的自体反应性克隆激活，生成针对内源性抗原的体液或细胞介导反应，随后对细胞、组织和器官造成损伤。有时，损伤是由抗体引起的，例如自身免疫性疾病艾迪生氏病、自身免疫性贫血(例如自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血)、桥本氏甲状腺炎和硬皮病。

许多自身免疫性疾病例如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM或I型糖尿病)、多发性硬化、类风湿性关节炎和自身免疫性甲状腺炎的特点在于：通过由内源性抗原激活的T细胞介导的组织破坏。这些自身抗原的免疫反应通过自身反应性T淋巴细胞的持续激活得以维持。

自身免疫疾病可以分为器官特异性自身免疫疾病和全身性自身免疫疾病，在器官特异性自身免疫疾病中，免疫反应针对单一器官或腺体独有的靶抗原，这样表现基本上局限于该器官，而在全身性自身免疫疾病中，免疫反应针对广泛范围的靶抗原并涉及许多器官和组织。器官特异性自身免疫疾病的例子包括胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、甲状腺炎和重症肌无力，全身性自身免疫疾病的例子包括系统性红斑狼疮和硬皮病。

T_H1细胞促进了器官特异性自身免疫疾病的发病。例如，强有力的证据表明：在小鼠中，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是由免疫抗原例如髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)特异性的CD4⁺T_H1细胞引起的。该病可通过高MBP或PLP免疫动物的T细胞或这些动物的克隆T细胞系由一只动物传给另一只动物。T_H1型反应似乎还涉及其它的T细胞介导的疾病或病症，例如接触性皮炎。

大多数器官特异性自身免疫疾病是由自身反应性CD4⁺T细胞引起的。这些T细胞的分析表明：T_H1/T_H2平衡可能对是否发生自体免疫产生作用。T_H1细胞涉及自体免疫的形成，而在一些情况中，T_H2细胞不仅预防该疾病的诱导，而且防止既有疾病的进一步发展，并在异体移植耐受性的诱导和维持中起保护作用。

现已发开了几种治疗自身免疫疾病的方法。各种自身抗原的鉴定和测序引起了调节自身免疫T细胞活性的新方法的产生。现已提出，涉及自身免疫性疾病发病的全抗原或源自其序列的肽用于治疗自身免疫疾病。

适合对自身免疫性疾病进行免疫特异性治疗的合成肽由涉及自身免疫性疾病发病的T细胞识别。这些肽的序列由涉及该疾病的抗原序列内的病原性序列组成，或者可以是其类似物，在序列中，一个或多个天然氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，特别是所谓的″变异肽″，其在病原性天然副本(即，接触TCR的部位)的抗原表位中含有单个的氨基酸取代，但是在抗原限制位(即，接触MHC的部位)中没有变异。

每种自身免疫性疾病将会有完美的肽供其治疗，这些肽从与该疾病有关的抗原的序列中直接获得，或者是一种变异肽或其另一种类似物。因此，一种疾病如多发性硬化(MS)，其包括与自身抗原例如髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)和蛋白脂质蛋白(PLP)反应的T细胞，需要MBP、MOG或PLP的肽或其类似物来对它进行治疗；重症肌无力可以用一种来自乙酰胆碱受体的肽进行治疗；甲状腺炎可以用一种来自甲状腺球蛋白的肽进行治疗；1型糖尿病可以用一种谷氨酸脱羧酶(GAD)的肽或一种来自胰岛素序列的肽进行治疗；系统性红斑狼疮可以用一种来自蛋白质P53的肽进行治疗；以及传染性神经元炎可以用一种来自髓鞘抗原P2的肽进行治疗。

最近几年，已经提出用来源于与自身免疫性疾病有关的病原性自身抗原的肽或其类似物用于治疗该疾病。例如，已经描述了来源于人MBP序列(US 5,817,629；US 6,252,040)及其类似物(US 5948764；US6,329,499)的肽用于治疗多发性硬化；现已提出人GAD和胰岛素的65kD同工型的肽类似物用于治疗糖尿病(分别为US 5,945,401和US6,197,926)；以及现已描述了一种自身抗原或其片段用于治疗眼色素层视网膜炎(US 5,961,977)。上面所引用的全部专利在此引入作为参考，就象完成公开一样。

对于各种自身免疫疾病的每一种，希望给予相关肽的助剂，其将激活抗炎T_H2表型的T细胞。预期这样可以阻碍自身免疫过程。还有不涉及自身免疫性疾病治疗的情况，其中激活具有T_H2表型的特异性T细胞是有用的。但是，涉及自身抗原的治疗必须用不诱导T_H1型免疫的佐剂进行，T_H1型免疫可能激活所治疗患者的危险的T_H1自体免疫。因此，需要鉴别能够诱导非炎性T_H2型T细胞的特异性抗原组合的佐剂。

佐剂，依据它们的性质，是非特异性的免疫调节剂。适合于该目的的佐剂是一种非特异性的免疫调节剂，其能够与抗原或其它分子组合成治疗性接种疫苗，以便诱导所需的抗炎性表型的特异性T细胞的激活。

当皮下(SC)给予小鼠时，适合对T细胞介导疾病或病症例如自身免疫疾病进行治疗的几种肽被证明是有效的，在一种油赋形剂中，例如被称为不完全弗氏佐剂(IFA)的矿物油乳剂。但是，IFA和完全弗氏佐剂(CFA；含各种数量的分枝杆菌灭活生物的矿物油制剂)不允许用于人类，因为矿物油在体内不能降解。

非常希望发现用于肽治疗的有效赋形剂，该赋形剂是可降解的并且作为一种起载体作用的佐剂，或者用于储存或免疫增效剂/增强剂。3.本领域相关的参考文献

已经描述了一些脂肪醇和脂肪酸酯作为溶剂或乳化剂用于药物组合物。例如，鲸蜡醇可作为乳化剂和硬化剂用于药物组合物(The MerckIndex，2001，13th edition，pp.347-8，#2037)，油醇可以用作药物载体(The Merck Index，2001，13th ed ition，p.1222，#6900)，以及油酸的烷基酯可以用作药物溶剂(The Merck Index，2001，13th edition，p.6899，#6898)。

高级脂肪族伯醇的混合物，主要从蜂蜡中分离得到，据称具有中等抗炎活性。这种混合物的组成还没有公开(Rodriguez等人，1998)。

已经研究了长链醇烟酸酯例如十八烷基和(Z)-9-十八烯-1-基烟酸酯的质谱，以解释长链醇的结构(Vetter和Meister，1981)。但是没有生物学活性被赋予所述的化合物。

已经测试了具有C₆-C₁₆饱和醇(例如癸基、十一烷基、十四烷基和十六烷基醇)的4-氨甲基-苯甲酸的(PAMBA)的酯的抗纤维蛋白溶解活性，发现所述的酯没有活性(Markwardt等人，1966)。短链醇的PAMBA酯发现能够降低体外培养内皮细胞的增殖，其中己基酯是更有效的(Beyer and Pilgrim，1991)。

已经描述了烷基N，N-二取代的氨基酸，例如烷基N，N-二甲氨基乙酸酯其中所述烷基是辛基、癸基、十二烷基或十四烷基，以及癸基(4-甲基-1-哌嗪基)乙酸酯用作吲哚美辛以及其它可能药物的经皮渗透增强剂(Wong等人，1989；US 4,980,378)。

US 6,291,423描述了在基因治疗中使用的络合物，其包含一种治疗活性物质和一种阳离子型脂质(例如1位和4位被甲基和油氧基羰基甲基取代的季哌嗪鎓化合物)。

JP 2000-302650描述了供毛发用品使用的N，N-二甲基-氨基乙酸长链链烷醇酯，例如十四烷基、十六烷基和十八烷醇和链烯醇的酯。但是没有具体公开油烯基酯。

已经制备了具有长链醇例如癸基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂酰基和油烯基醇的甜菜碱[(羧甲基)三甲基氢氧化铵内盐]酯，并研究了它们的药效性质(Metayer和Jacob，1952)，或者测试了它们作为杀生剂在冷却水处理中的活性(Rucka等人，1983)。

N-羧甲基-哌啶、-哌嗪和-吗啉化合物的月桂基、肉豆蔻基和鲸蜡基酯的季铵盐被描述成杀菌剂(Smith等人，1951)。

已经提出将氨基酸(例如甘氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的硬脂酰酯和肽的硬脂酰酯用作细菌性和病毒性人体疫苗的佐剂(Penney等人，1985，1993；Nixon-George等人，1990)。

已经描述了将DL-ω-苯基-氨基酸的C₄-C₁₀链烷醇酯，例如DL-2-苯基甘氨酸辛酯或DL-2-苯基甘氨酸癸酯或DL-2-(4-二甲氨基苯基)甘氨酸辛酯用作抗炎药、抗组胺药、解痉药、抗氧化剂和抗炎药(Schulz等人，1982；Schewe等人，1991；Kontogiorgis等人，2001)。

US 3,821,403描述了氨基酸的高级烷基酯，例如甘氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的月桂基、肉豆蔻基、鲸蜡基和硬脂酰基酯，以及它们的N-低级烷基衍生物用作植物病害管理(Misato等人，1974)。

发明概述

现已发现，根据本发明，某些用作抗炎免疫调节剂的长链脂肪醇与含至少一个碱基的羧酸的酯，以及与涉及细胞和体液反应的特异性抗原结合的佐剂可以用于治疗炎症，特别是免疫性炎症，其中所述的佐剂用作载体、储存或免疫增效剂/增强剂。

一方面，本发明涉及通式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R1是C₁₂-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基，A是含至少一个非环状或环状氨基的残基和/或至少一个含叔或季氮原子的杂芳香族环，在制备用于治疗炎症的药物组合物中的用途。

另一方面，本发明涉及通式Ia的佐剂：

或其药学上可接受的盐，其中R1是C₁₀-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基，A是含至少一个非环状或环状氨基的残基和/或至少一个含叔或季氮原子的杂芳香族环，但是其中R1是C₁₈烷基以及A是含至少一个非环状氨基的残基或-CO-A是脯氨酸残基的化合物除外，在制备一种进一步包含抗原的治疗剂中的用途。

在各种类型的癌症例如黑色素瘤中，以及在感染性疾病例如细菌和病毒感染中，与通式Ia的佐剂一起使用的抗原可以是一种涉及自身免疫疾病的抗原。含这样一种抗原和本发明佐剂的治疗剂可以特别用于激活T细胞，以便治疗自身免疫疾病和优选需要T_H2型免疫反应的T细胞介导的免疫作用。

上式中的一些化合物，其将在下文中定义，是新的并构成本发明的另一方面。

附图的简要说明

图1表示N，N-二甲基-氨基乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)对佐剂关节炎(AA)的影响。在免疫的当天(第0天，三角形)或在第14天，AA起病后(第+14天，圆)，通过静脉注射(IV)给予路易鼠化合物1。

图2表明化合物1对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的作用。在免疫的当天(第0天，圆)通过静脉注射给予DA大鼠化合物1。

3表明化合物1对皮肤同种移植存活率的影响。在移植的当天(第0天，圆)通过静脉注射给予小鼠化合物1。

图4表明在BALB/c小鼠中，用各种浓度(1、2或4mg)的(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸盐(化合物3)治疗后迟发型超敏(DTH)反应的抑制。

图5表明各种浓度(0.5、1、2或4mg)的化合物5、9和11对小鼠中DTH的影响。地塞米松(2mg)用作阳性对照，(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸乙酯HCl(0.5、1、2或4mg)作为阴性对照。

图6表明皮下(SC)给予各种浓度(10、50、100、200mg)的化合物3对大鼠中AA的影响。用油醇(OA，100mg)作比较。

图7表明皮下(SC)给予各种浓度(10、50、100、200mg)的化合物3对大鼠中EAE的影响。用油醇(OA，100mg)作比较。

图8表明经口给予各种浓度(0.2、1、2、10、20mg)的化合物3对大鼠中EAE的影响。用油醇(OA，10mg)作比较。

图9表明经口给予哌嗪-1-基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸氢盐(化合物9，100mg/kg)对大鼠中EAE的影响。

图10表明化合物3在EAE诱导的小鼠中促进格拉默乙酸盐(GA)的免疫作用。

发明的详细说明

按照一方面，本发明提供通式I的化合物：

在本发明此方面的一种实施方案中，在所述的式I的抗炎化合物中，残基A选自由下面组成的基团：

其中R2是H、C₁-C₆烷基、芳基、或芳烷基，其中任何芳基部分可以未取代的或被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；

(ii)被NR6R7或CR8R8NR6R7取代的苯基，其中R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；以及

其中R9是H、低级烷基或吲哚基(C₁-C₄)烷基，以及X-是一种抗衡离子，或者R9是一对电子并且X不存在。

另一方面，本发明提供通式Ia的佐剂：

在本发明此方面的一种实施方案中，在所述式Ia的佐剂中，残基A选自由下面组成的基团：

其中R2是H、C₁-C₆烷基、芳基、或芳烷基，其中任何芳基部分可以未取代的或被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；条件是当R1是十八烷基时R4和R5不是H或C₁-C₆烷基，以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；

其中R9是H、C₁-C₆烷基或吲哚基(C₁-C₄)烷基，以及X^-是一种抗衡离子，或者R9是一对电子并且X不存在。

另一方面，本发明涉及下面通式的新化合物：

R1-O-CO-A

其中

(i)R1是C₂₀-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基，以及A是下式的残基：

其中R2是H、C₁-C₆烷基、芳基、或芳烷基，其中任何芳基部分可以未取代的或被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；或者

(ii)R1是C₁₈烷基以及A是下式的残基：

其中R2是H；R3是一对电子；以及R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；或者

(iii)R1是C₁₂-C₁₆烷基以及A是下式的残基：

其中R2是未取代的芳基，或芳基或芳烷基其中芳基部分被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；或者

(iv)R1是C₁₀烷基以及A是下式的残基：

其中R2是C₁-C₆烷基；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基；或者

(v)R1是C₁₀-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基以及A是被NR6R7或CR8R8NR6R7取代的苯基，其中R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基，但是其中R1是C₁₀-C₁₆烷基并且A是被-CH₂-NH₂取代的苯基的化合物除外；或者

(vi)R1是C₁₀-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基，以及A是下式的基团：

其中R9是C₁-C₆烷基或吲哚基(C₁-C₆)烷基以及X^-是抗衡离子；及其药学上可接受的盐。

为了清楚起见，在本文说明书和权利要求中的所有式中的记号＊表示与R1-O-CO-基团的-CO-连接的位置。

根据本发明，对于式Ia的佐剂，R1是C₁₀-C₂₄烷基或链烯基，对于用于治疗炎症的式Ia的化合物，R1是C₁₂-C₂₄烷基或C₁₀-C₂₄链烯基。在两种情况中，R1优选是C₁₂-C₂₀，更优选C₁₆-C₁₈，最优选C₁₈烷基或链烯基。烷基可以是直链或分枝的并且优选选自十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基，这样基团R1-O-分别源自于饱和脂肪醇十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇(亦称棕榈醇)和十八烷醇。链烯基可以具有一个或多个双键并优选选自十六烯基、十八烯基、十八二烯基和十八三烯基，这样基团R1-O-源自于不饱和的脂肪醇棕榈烯醇，或者优选源自于C₁₈-具有一个或多个以反式优选以顺式双键的不饱和脂肪醇，例如，但不局限于，油醇(顺-9-十八烯醇)、亚油烯醇(顺-9，12-十八烯二醇)、γ-亚麻醇(顺-6，9，12-十八烯三醇)和亚麻醇(顺-9，12，15-十八烯三醇)。在一种最优选的实施方案中，R1是顺-9-十八烯基或反-9-十八烯基，也称为十八碳-(Z)-9-烯基或油基。

残基A可以包括非环状或环状的伯、仲或叔氨基或季铵基。当所述氨基是非环状时，所得化合物是氨基酸的酯。

因此，在一种实施方案中，在包含在本发明的药物组合物或治疗组合物中的化合物中或者在本发明的一些新化合物中，A是下式的基团：

其中R2是H、C₁-C₆烷基、芳基、或芳烷基，其中任何芳基部分可以未取代的或被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；R4和R5每个独立地是C₁-C₆烷基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成一个任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间断的5-7元饱和环；以及R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基，具有如上文和权利要求中所定义的限制条件。例如，对于式Ia的佐剂和新的化合物，当R1是十八烷基(硬脂酰)时，R4和R5不能是H或C₁-C₆烷基；对于该新的化合物，其中R1是C₁₂-C₁₆烷基，R2不能是H、C₁-C₆烷基或未取代的芳烷基，或者其中R1是C₁₀烷基，R2不能是H、芳基或芳烷基。

在一种优选实施方案中，R2是H。如在此所使用的，C₁-C₆烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如但不局限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基和己基。在此使用的″芳基″单独地或作为″芳烷基″的一个部分是指C₆-C₁₀芳族碳环基团例如苯基和萘基。在一种优选实施方案中，芳基是苯基。术语″芳烷基″中的烷基同样是指C₁-C₆烷基。在一种优选实施方案中，芳烷基是苄基。在优选实施方案中，苯基和苄基是未取代的或被羟基取代，例如p-羟基苄基。

上述式中的某些化合物其中R3是一对电子以及R4和R5是H是氨基酸的酯，例如甘氨酸(R2是H)、丙氨酸(R2是甲基)、缬氨酸(R2是异丙基)、亮氨酸(R2是异丁基)、异亮氨酸(R2是仲丁基)、苯基甘氨酸(R2是苯基)、苯丙氨酸(R2是苄基)、酪氨酸(R2是p-羟基苄基)的酯。

根据本发明的某些实施方案，R4和R5与它们相连的氮原子一起形成任选被氧原子或氮原子间断的5-7元饱和环，例如吡咯烷、氮

，并且优选是6-元环，更优选是哌啶、哌嗪或吗啉。哌嗪环可以在4位被C₁-C₆烷基取代，优选被甲基取代。

在一种优选实施方案中，R2是H或苯基，R3是H、一对电子或甲基，R4和R5每个是H或甲基，或者R4和R5与它们相连的氮原子一起形成在4-位氮原子上任选被甲基取代的吗啉或哌嗪环。依据这种实施方案，用作抗炎化合物和佐剂的化合物的例子是在此称为化合物1、3、4、7、9、11的新酯：

1.N，N-二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯

3.(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸盐

4.(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八烷基酯酒石酸盐

7.4-甲基-4-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基甲基-吗啉-4-鎓氯化物

9.哌嗪-1-基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸氢盐

11.α-氨基-α-苯基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl盐。

在本发明的另一种实施方案中，A是被NR6R7或CR8R8NR6R7取代的苯基，其中R6、R7和R8每个独立地是H或C₁-C₆烷基。在一种优选实施方案中，A是被CR8R8NR6R7取代的苯基，其中R8是H以及R6和R7每个是H或C₁-C₆烷基，优选甲基。依据这种实施方案的化合物的例子是4-二甲氨基甲基苯甲酸的新的酯，在此称为化合物5和10，这两种化合物都是作为抗炎药和佐剂。

5.4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl

10.4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(E)-9-烯基酯HCl。

在本发明的还有另一种实施方案中，A是吡啶基：

其中R9是一对电子以及X^-不存在，或者R9是甲基或吲哚乙基以及X^-是选自氯化物、溴化物、碘化物和甲苯磺酸盐的抗衡离子。这些化合物是烟酸的酯。依据这种实施方案的化合物的例子是在此称为化合物2、6a、6b、6c和8，两个都作为抗炎药和佐剂，其中化合物6a、6b、6c和8是新的化合物：

2.烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯；

6a.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓碘化物；

6b.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓氯化物；

6c.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓甲苯磺酸盐；和

8.1-[(2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓溴化物；

本发明的酯通常是晶状的、不吸湿的和水溶性的，并且比起始的饱和或顺-不饱和醇更容易提纯和配制成口服和肠胃外制剂。

本发明还考虑式I和Ia化合物的药学上可接受的盐，酸加成盐和非环状或环状季铵盐，或与抗衡离子形成的吡啶鎓盐。所述化合物的药学上可接受的酸加成盐包括碱与无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等等形成的盐，以及碱与有机酸例如脂肪族单-和二羧酸、苯基-取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等等形成的盐。因此，这些盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等等。

所述碱性化合物的酸加成盐通过如下制备：游离碱与足量的所需酸接触，以常规方式生成盐。游离碱形式通过如下进行再生：所述盐与碱进行接触，然后以常规方式分离游离碱。游离碱形式与它们的各种盐在某些物理性质上有些不同，例如在极性溶剂中的溶解度，但是对本发明来说，所述盐在其它方面与它们的游离碱是相同的。

在本发明的一种实施方案中，通式I的化合物可以通过长链脂肪醇例如油醇与合适的氨基酸反应进行制备。因此，油醇与N，N-二甲基甘氨酸反应，得到在此称为化合物1的化合物。在另一种实施方案中，长链脂肪醇与烟酸的卤化物反应，例如油醇与烟酰氯反应得到在此称为化合物2的化合物。

在另一种实施方案中，长链脂肪醇与卤甲基乙酸氯化物反应，然后所得酯与合适的胺反应。例如，油醇与氯乙酰氯反应，所得氯乙酸油酯与哌嗪或与N-甲基-吗啉反应，得到游离碱，然后将游离碱转化为盐，例如化合物3或化合物7。类似地，十八烷醇与氯乙酰氯反应，所得硬脂酰氯乙酸酯与4-甲基-哌嗪反应，得到游离碱，然后将游离碱转化为盐，例如化合物4。

本发明的其它方法在下面的实施例中进行描述，并且可以用于制备式I的类似化合物。油醇和活化氨基酸间的反应可以在很宽范围的有机溶剂中进行，包括极性溶剂例如乙腈和氯仿，以及非极性溶剂例如己烷，在宽的温度范围内，例如从环境温度到回流温度，以及在1-2小时到1-2天的反应时间内。

季吡啶鎓盐可以如上所述进行制备，或者使用本领域熟练技术人员已知的烷基化试剂例如卤代烷、磺酸烷基酯和卤代烷基吲哚，对油基烟酸盐进行烷基化。卤代乙酸油酯与胺的反应可以在宽范围的有机溶剂中，包括极性溶剂例如乙腈和非极性溶剂例如己烷，在宽范围的温度下例如从环境温度到回流温度，以及在1-2小时到1-2天的时间内进行。将获得的油状或低熔点游离碱经合适的后处理和提纯后，转变为药学上可接受的盐。后者通常是高熔点的和水溶性固体。

应该注意，对于本发明酯的制备其中R1是顺-链烯基，起始顺-不饱和醇例如油醇可以以一种基本上纯的顺-不饱和形式使用，也就是说，反应物含有至少约80％的顺式。例如，商业油醇约为85％的纯度，大部分杂质由反式类似物组成(elaidyl alcohol)

先天和获得性免疫系统都参与调节每种类型的炎症，炎症是在过程例如伤口愈合、结缔组织重建、血管生成、器官再生、神经保护中以及在自身免疫、变应性、移植排斥和感染中观察到的获得性免疫反应中的一个关键因素。因此，调节炎性反应的抗炎药(例如在此所述的那些)将对各种病症有用。

可以用本发明的免疫调节剂进行治疗的炎性疾病、障碍或病症包括，但不局限于，免疫性慢性或急性炎性疾病、障碍或病症(选自自身免疫性疾病)，严重变态反应，哮喘，或与疾病、障碍或病症有关的炎症(选自移植排斥)，慢性退行性疾病例如阿尔茨海默氏病，以及可以用于神经保护、器官再生、以及用于皮肤慢性溃疡或精神分裂症的治疗。

可以根据本发明进行治疗的自身免疫疾病的例子是多发性硬化或人关节炎病症，例如类风湿性关节炎、带有瑞特氏综合征的反应性关节炎、强直性脊柱炎以及其它由免疫系统介导的关节炎症。还考虑了其它自身免疫疾病，并按照所涉及的器官和组织列于下文中。

因此，本发明涉及免疫性介导炎性疾病、障碍或病症的治疗，所述疾病、障碍或病症选自重症肌无力、格-巴二氏综合症或神经系统的其它炎性疾病；牛皮癣、寻常性天疱疮或其它皮肤疾病；系统性红斑狼疮、肾小球肾炎或其它肾脏疾病；动脉粥样硬化或其它血管炎症；自身免疫性肝炎、炎性肠病例如克罗恩氏病、胰腺炎或其它胃肠系统疾病；I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)、自身免疫性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或其它内分泌系统疾病。在一种优选实施方案中，所述的免疫介导炎性疾病、障碍或病症是牛皮癣。

一种用于测试本发明药物抗炎活性的模型是佐剂关节炎(AA)，它是一种用在完全弗氏佐剂(CFA)中的结核分枝杆菌免疫某些品系的大鼠的实验性关节病。这些大鼠出现一种特征与人类风湿性关节炎相似的关节炎，因此用作人关节炎病症(例如类风湿性关节炎、瑞特氏综合征的反应性关节炎、强直性脊柱炎以及其它似乎由免疫系统介导的关节炎症)的动物模型。佐剂关节炎还作为免疫介导炎症(一般包括细胞介导的自身免疫反应、移植排斥和变态反应)的模型。例如，可以抑制类风湿性关节炎的治疗包括免疫抑制剂(例如皮质类甾醇、环孢菌素A、咪唑硫嘌呤)以及其它广泛用于治疗自身免疫疾病的免疫抑制剂。因此，由一种治疗剂抑制佐剂关节炎表明：该药物是潜在有效的广谱抗炎药。

本发明进一步涉及一种治疗炎症的药物组合物，包含药学上可接受的载体和上文所述的通式I的化合物。

本发明提供的药物组合物可以是固体、半固体或液体形式，并且可以进一步包括药学上可接受的填充剂、载体或稀释剂以及其它惰性成份和赋形剂。所述的组合物可以通过任何合适的途径给予，例如，但不局限于，口服、局部或肠胃外(例如通过皮下、静脉内、肌内注射)，或任何其它合适的途径。由于许多化合物是油性的，他们优选通过胃肠外给药，更优选通过皮下给药。如果连续给药，那么本发明的化合物通常分别每天注射1-4次，或者例如使用微型泵连续皮下输注给药。剂量将取决于患者的状况和疾病的严重程度，并且由主治医师视情况而确定。

对于肠胃外给药，通过化合物以纯度、单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)与药学上可接受的载体进行混合，可以对化合物进行配制，所述的药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的并且与制剂中的其它组分相容。通常，通过将化合物均匀地和紧密地与液体载体或精细粉碎固体载体或两者接触，制备所述制剂。然后，如有必要，将产品制成所需的制剂。优选地，载体是肠胃外载体，更优选是一种与接受者血液等渗的溶液。这样的载体溶媒的例子包括水、盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。还可以使用非水赋形剂例如不挥发油以及脂质体。这些制剂可以通过本领域熟练技术人员已知的常规方法进行制备，例如描述在Remington′s Pharmaceutical Science″，A.R.Gennaro，ed.，17th edition，1985，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA。

另一方面，本发明涉及一种治疗炎症特别是免疫性介导炎症的方法，其包括给予需要的患者有效量的如上文所定义的式I的化合物。

另一方面，本发明涉及治疗组合物，包括上文式Ia的佐剂和抗原。抗原可以是提高体液反应的抗原例如毒素、细菌或病毒抗原，或者优选是提高细胞反应的抗原例如肽。

所述治疗剂可以包含一种可用于治疗自身免疫性疾病、神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病或帕金森病、癌症例如黑色素瘤、或传染病包括细菌和病毒感染的抗原。

在一种优选实施方案中，所述的治疗组合物用于治疗T细胞介导的疾病、障碍或病症，并且包含一种被炎性T细胞识别的抗原，所述的炎性T细胞与T细胞介导的疾病、障碍或病症的发病有关。

在一种更优选的实施方案中，所述的治疗剂包含一种被炎性T细胞识别的抗原，所述的炎性T细胞与T细胞介导的疾病、障碍或病症有关的发病有关，并且所述的制剂造成个体的T细胞细胞因子反应从T_H1转移到T_H2。

本发明的抗炎免疫调节剂形成脂质乳液，当作为疫苗佐剂与被治疗疾病、障碍或病症所涉及的T细胞能与之反应的抗原物质一起使用时，用来介导治疗前T_H1T细胞反应向治疗后T_H2T细胞反应的转移。此发现表明，这样的脂质乳液是致耐受性的生物活性载体，其可以用于治疗任何T_H1介导疾病或病症的疫苗中。在这样的疫苗中，抗原提供疗效的免疫特异性，而本发明的生物活性载体提供生物学结果，即T_H1→T_H2转移。由于本发明的所述生物活性载体介导的转移，一系列自身反应性疾病、障碍和病症可以通过使用一种可诱导T细胞细胞因子转移的抗原/载体组合加以治疗。

在本发明的一种优选实施方案中，该治疗剂包含抗原和治疗由T_H1细胞介导的器官特异性自身免疫疾病的式Ia的抗炎免疫调节剂佐剂。此类疾病的例子包括，但不局限于，自身免疫疾病例如多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎和自身免疫性甲状腺炎。

用于这种制剂的抗原是一种与所述自身免疫疾病发病有关的炎性T细胞识别的抗原，并可以是参与所述疾病进程的完整蛋白、所述蛋白序列衍生的肽、在病源性自身抗原肽表位中具有单个氨基酸取代的变异肽或与所述疾病相关的炎性T细胞识别的任何其它肽。

因此，对于多发性硬化(MS)的治疗，所述可以是MBP、MOG或PLP，或US 5,817,629中所述的人MBP序列衍生的肽，例如肽MBP(75-95)、MBP(86-95)和MBP(82-98)，或US 5,948,764和6,239,499中所述的其类似物，或MOG肽或PLP肽及其类似物，所有这些专利在此引入作为参考，似乎如在此完全公开的那样。所述抗原还可以是格拉默乙酸盐，共聚物1或Cop 1的乙酸盐的通用名称，一种由四种氨基酸组成的无规共聚物：酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸，其与MBP在功能上可交叉反应并能够在抗原呈递中与MHCII类上的MBP竞争。一些国家已经批准将格拉默乙酸盐用于治疗MS，其商标名为

(Teva Pharmaceuticals Ltd.，Petah Tikva，Israel的商标)。

对于I型糖尿病(IDDM)的治疗，所述肽可以来源于谷氨酸脱羧酶(GAD)或如US 5,945,401中所述的GAD肽类似物，或胰岛素肽类似物例如包含天然胰岛素B链序列残基9-23的肽，其在12、13、15和/或16位变异，并且如US 6,197,926中所述的进一步变异，所有这些专利在此引入作为参考，似乎如在此完全公开的那样。

对于其它自身免疫疾病的治疗，所述肽来源于与疾病有关的抗原序列或其肽类似物。因此，对于自身免疫性甲状腺炎的治疗，所述肽来源于甲状腺球蛋白序列；对于类风湿性关节炎，所述自身抗原可以源自于胶原蛋白II或分枝杆菌例如结核分枝杆菌，例如称为hsp60的60kDa热激蛋白，其构成在佐剂关节炎中由T淋巴细胞识别的分枝杆菌抗原表位或相应的人HSP60或其肽；对于重症肌无力的治疗，所述肽源自于乙酰胆碱受体序列或如US 6,066,621中所述的其类似物，在此引入作为参考，好象在此完全公开一样；对于系统性红斑狼疮的治疗，所述肽可以来源于蛋白质P53序列；以及对于格-巴二氏综合症的治疗，所述肽可以来源于髓鞘抗原P2的序列。

所述抗原还可以是一种非肽抗原。可根据本发明使用的非肽抗原的例子包括，但不局限于，治疗磷脂综合症的磷脂、治疗动脉粥样硬化的胆固醇、以及治疗系统性红斑狼疮的DNA分子。

所述抗原是否为肽并不重要。因此，例如，引起皮肤过敏及炎症例如接触性皮炎的T_H1介导的变态反应，可以通过含刺激性抗原和本发明的引起细胞因子反应从T_H1型转移到T_H2型的生物活性载体/佐剂的疫苗进行治疗。因此，虽然患者继续维持针对抗原的高水平抗体，但造成皮肤发炎的炎症性T细胞反应受到抑制。

因此，本发明的致耐受性生物活性载体/佐剂可以在需要对T细胞攻击的抗原产生耐受性的任何时候使用，即当疫苗被用于限制T细胞介导的病症，特别是T_H1-细胞介导的病症的任何时候。如果可以确定在移植排斥或移植物抗宿主疾病中是何种抗原激活该反应，那么给予这样的抗原和本发明的载体就可以指望促使从不希望的炎症性T_H1反应向更为希望的T_H2反应转移，不管在这种情况下能与T细胞反应的抗原数目总体上的复杂性。

在本发明的一种优选实施方案中，所述治疗剂引起IL-2或IFN-γT细胞细胞因子反应的减少和IL-4或IL-10T细胞细胞因子反应的增加。

为了测定肽激活后T细胞分泌的细胞因子，在一种体外激活测定法中检测患者外周血中的淋巴细胞。通过标准方法从肝素化全血中分离外周血淋巴细胞，与浓度为5-50μg/ml的测试肽一起进行培养。在不同时间点收集培养T细胞的上清液，按照ELISA或生物测定法测试各种细胞因子的活性。

根据本发明的完全意想不到的发现，某些长链脂肪醇与含一种碱基的羧酸所形成的酯可以有效地用作T细胞激活佐剂。类似地，同样意想不到地发现，这些制剂是致耐受性的生物有效抗炎免疫调节剂。

本发明的治疗剂(含有抗原和在此所述的式Ia的免疫调节剂)的优点在于：治疗可以限于诱导保护性T_H2免疫反应所需的相对较短的接触，这样诱导的特异性T_H2免疫自身将积极抑制疾病。如果没有所述抗原，那么不得不长期给予所述免疫调节剂以便持续抑制炎症，并且一旦停止治疗，预计疾病将会复发。在一些疾病中，持续给予单独的抗炎药的长期作用可能是不希望的。因此，通过将本发明的免疫调节剂和特异性抗原组合在一起诱导对炎症过程的积极和特异性调节是有利的。

本发明进一步涉及一种治疗T细胞介导的疾病、障碍或病症的方法，其包括给予需要的个体有效量的一种治疗剂，所述的治疗剂包含被与所述T细胞介导疾病、障碍或病症的发病有关的炎性T细胞识别的抗原，以及上文的通式Ia的佐剂。

现在通过下列非限制性实施例对本发明进行阐述。

实施例

在实施例中，下列化合物通过它们的粗体数字标明：

1.N，N-二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯；

2.烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯；

3.(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸盐；

4.(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八烷基酯酒石酸盐；

5.4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl

6a.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓碘化物；

6b.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓氯化物；

6c.1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓甲苯磺酸盐酯；以及

7.4-甲基-4-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基甲基-吗啉-4-鎓氯化物；

9.哌嗪-1-基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸氢盐；

10.4-N，N-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(E)-9-烯基酯HCl

11.α-氨基-α-苯基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl盐。

实施例1

N，N-二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)的合成

将N，N-二甲基甘氨酸(1.60g，15.4mmol)悬浮在干燥并不含酒精的氯仿(20ml)中，接着加入PCl₅(3.80g，17.3mmol)。将所述的黄色悬浮液在55-60℃下搅拌1小时，冷却到30℃，加入油醇(5.70ml，4.85g，18.0mmol)。将所述的黄色溶液加热到63-65℃，并在此温度下搅拌3-4小时。将该溶液冷却到室温，滤掉少量不溶性物质。向滤液中加入水，然后将混合物的pH值调节到8。分离有机相，用5％NaHCO₃和盐水洗涤，干燥并蒸发。黄色油状残余物(5.07g)与乙醚一起研磨，然后过滤所得悬浮物。将滤液蒸发至干，得到3.18g粗产物，其用柱层析(正己烷接着乙酸乙酯)提纯，得到标题化合物，在此是指化合物1，是一浅黄色液体(2.6g，7.36mmol，41％)。

计算值：C，74.73；H，12.26；N，3.96.实测值：C，67.88；H，11.69；N，3.13。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)(ppm)δ：0.88(t，3H，Me)，1.27-1.29(m，22H，11CH₂)，1.57-1.67(m，2H，CH₂，)，2.00(bd，4H，2CH₂)，2.37(s，6H，NMe₂)，3.18(s，2H，CH₂)，4.13(t，2H COOCH ₂)，5.31-5.39(m，2H，CH＝CH).

IR：1755cm^-1(CO).

实施例2

烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物2)的合成

将烟酰氯盐酸盐(17.8g，0.1mol)和油醇(26.85g，0.1mol)加入到己烷(250ml)中。在10分钟内，将吡啶(15.8g，0.2mol)加入到搅拌下的混合物中，然后反应混合物在室温下搅拌24小时。过滤除去盐酸吡啶并用己烷洗涤。用水萃取合并的滤液，在MgSO₄干燥，接着蒸发至干。残余物用乙腈蒸煮两次，干燥粘性残余物，得到澄清的水样液体，其冷却时转变为肥皂样(21.1g，56.5mmol，56.5％)。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)(ppm)δ：0.90(t，3H，Me)，130-1.50(m，22H，11CH₂)，1.75-1.85(m，2H，CH₂，)，2.00(bd，4H，2CH₂)，4.35(t，2H，COOCH ₂)，5.31-5.39(m，2H，CH＝CH)，7.41(dd，1H)，8.30(dt，1H)，8.77(dd，1H)，9.25(d，1H).

实施例3

(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯L-酒石酸盐(化合物3)的合成

3a)氯乙酸十八碳-9-(Z)-烯基酯

将油醇(147.9g，0.55mol)溶于正己烷(300ml)中，接着在10分钟内，向其中滴加氯乙酰氯(56.5g，0.50mol)。在室温下，将该澄清的反应混合物搅拌24小时。通过向反应混合物中鼓入氮气，除去其中的痕量HCl气体。无需进一步提纯，将此粗标题产物的己烷溶液直接用于下一步反应。

3b)4-甲基-哌嗪-1-基-乙酸十八碳-9-(Z)-烯基酯(游离碱)

将正己烷加入到上面实施例3a中获得的己烷溶液中(使最终容积为500ml)，接着加入1-甲基-哌嗪(103.6g，1.03mol)。将该反应混合物在室温下搅拌36小时。通过过滤除去1-甲基-哌嗪HCl，然后用正己烷洗涤。用水和盐水萃取合并的有机滤液，干燥并在减压下蒸发，得到一种浅黄色油。当冷却到-20℃时，后者转变为一种白色固体。

3c)4-甲基-哌嗪-1-基-乙酸十八碳-9-(Z)-烯基酯L-酒石酸盐

将上面实施例3b的游离碱溶于甲醇(150ml)中，然后加入(L)-(+)-酒石酸(75g，0.5mol)在甲醇(400ml)中的溶液。在室温下搅拌60分钟后，溶液通过一个20μ过滤器进行过滤，然后蒸发至干。首先用乙腈蒸煮粘性残余物，然后用丙酮处理24小时。滗析除去溶剂，固体用丙酮处理两次。所得悬浮液在真空下干燥(由于湿的酒石酸盐的吸湿性，取消过滤)。将干燥产物搅匀并过筛(500μ)，得到197.3g标题化合物3，是浅黄色粉末(35mmol，64％)，mp 69-72℃。

计算值：C，62.34；H，9.74；N，5.01.实测值：C，60.33；H，9.71；N，4.91。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)ppm δ：0.85(t，3H，Me)，1.18-1.24(bs，22H，11CH₂，)，1.54(bs，2H，CH₂)，1.96(bs，4H，2CH₂)，2.56(s，3H，N-Me)，2.69(s，4H，2CH₂)，2.90(s，4H，2CH₂)，3.26(s，2H，N-CH₂COO)，4.0(t，2H，CH₂OCO)，4.18，(s，1.5H，酒石酸盐CH)，5.29(t，2H，CH＝CH).

IR(cm^-1)：1616，1739(C＝O).

实施例4

(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八烷基酯L-酒石酸盐(化合物4)的合成

将硬脂醇(27.2g，100mmol)溶于苯(150ml)中，接着在10分钟内，向其中滴加氯乙酰氯(8.0ml，100mmol)。在室温下，将该澄清的反应混合物搅拌48小时。通过鼓入氮气除去痕量的HCl。加入1-甲基-哌嗪(28.0ml，250mmol)，然后反应混合物在室温下搅拌36小时。通过过滤除去1-甲基-哌嗪HCl，然后用正己烷洗涤。合并滤液和洗液，接着依次用水和盐水萃取，干燥并蒸发至干，得到游离碱(38.8g)。将后者溶于乙醇中并与(L)-(+)-酒石酸(14.18g)在乙醇(150ml)中的溶液混和，搅拌60分钟，然后在室温下保持3天。过滤收集所得固体，干燥，得到46.5g(83mmol，83％)标题化合物4，是一种白色固体，mp：88-89℃。

计算值：C，62.11；H，10.07；N，5.00.实测值：C，61.02；H，10.39；N，5.01。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)ppm δ：0.85(t，3H，Me)，1.18-1.30(bs，30H，15CH₂，)，1.54(m，2H，CH₂)，1.96(bs，4H，2CH₂)，2.56(s，3H，N-Me)，2.69(s，4H，2CH₂)，2.90(s，4H，2CH₂)，3.26(s，2H，N-CH₂COO)，4.02(t，2H，CH₂OCO)，4.18，(s，1.5H，酒石酸盐CH)，IR：1742cm^-1(C＝O).

实施例5

4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl(化合物5)的合成

5a)4-二甲氨基甲基-苯甲酸HCl

在搅拌下，加热4-氨甲基-苯甲酸(92.5g，0.61mol)在98％甲酸(127ml，3.36mol)中的悬浮液至完全溶解，然后加入37％的甲醛(114ml，1.53mol)。加热所述的溶液，并在回流温度下保持10小时。冷却后，加入20％的HCl(130ml)，然后将溶液蒸发至干。无需进一步提纯，将由此获得的白色粉末(131.5g，0.61mol，～100％)直接用于下一步反应中。

5b)4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl

将亚硫酰氯(28.6ml，0.39mol)加入到搅拌下的4-二甲氨基甲基-苯甲酸HCl(65.0g，0.3mol)在乙腈(300ml)中的悬浮液中，回流1h，然后蒸发至干。将该浅黄色固体残渣悬浮在乙腈(300ml)中，加入油醇(99.5ml，0.31mol)，然后将混合物回流2h。将混合物冷却，过滤收集粗盐，依次用乙腈(500ml)和丙酮(300ml)洗涤，干燥，得到105g(0.225mol，75％)标题化合物5，是一种稍微浅黄色固体，mp：191-3℃。

计算值：C，72.15；H，10.38；N，3.00.实测值：C，71.32；H，10.68；N，3.15。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)ppmδ：0.88(t，3H，Me)，1.25-1.33(bs，22H，11CH₂，)，1.75(m，2H，CH₂)，2.01(m，4H，2CH₂)，2.83(s，6H，NMe₂)，4.30(t，2H，CH₂OCO)，4.39，(s，2H，PhCH₂)，5.32-5.37(t，2H，CH＝CH)，7.83(d，2H)，8.10(d，2H).

实施例6

化合物6a、6b和6c的合成

6a)1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓碘化物(化合物6a)的合成

将烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯，通过实施例2中所述的方法制备，(3.74g，10mmol)和碘甲烷(3.12g；22mmol)溶于硝基甲烷(5ml)和甲醇(2.5ml)的混合物中。反应混合物在室温下保持3天，然后在真空中蒸发至干。残余物在己烷(20ml)中蒸煮，滗析除去己烷，干燥残余物，得到标题化合物，是一种黄色-橙色粘性固体(4.95g，9.6mmol，96％)。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)(ppm)δ：0.85(t，3H，Me)，1.20-1.50(m，22H，11CH₂)，1.70-1.80(m，2H，CH₂，)，1.96(bd，4H，2CH₂)，4.36(t，2H，COOCH ₂)，4.42(s，3H，N-Me)，5.27-5.39(m，2H，CH＝CH)，8.25(dd，1H)，8.95(dt，1H)，9.20(dd，1H)，9.55(d，1H).

6b)1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓氯化物(化合物6b)的合成

将1-甲基-吡啶鎓-3-羧酸酯盐酸盐(1.74g，10mmol)加入到亚硫酰氯(7ml)中。反应混合物在68-70℃下搅拌1.5小时，然后在真空中蒸发至干。向残余物中加入己烷(25ml)和油醇(2.69g，10mmol)，混合物在43℃下搅拌3天，然后在减压下蒸发至干，得到4.1g(9.66mmol，96％)粘性固体。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)(ppm)δ：0.85(t，3H，Me)，1.20-1.50(m，22H，11CH₂)，1.70-1.80(m，2H，CH₂，)，1.95(bd，4H，2CH₂)，4.38(t，2H，COOCH ₂)，4.42(s，3H，N-Me)，5.27-5.40(m，2H，CH＝CH)，8.25(dd，1H)，8.95(dt，1H)，9.20(dd，1H)，9.55(d，1H).

6c)1-甲基-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓甲苯磺酸盐(化合物6c)的合成

将烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯，通过实施例2中所述的方法制备，(3.74g，10mmol)溶于硝基甲烷(5ml)和甲醇(2.5ml)的混合物中。加入4-苯磺酸甲酯(1.86g，10mmol)在硝基甲烷(2ml)和甲醇(1ml)的混合物中的溶液，反应混合物在室温下搅拌4天。将所述的澄清溶液在减压下蒸发至干，得到5.2g(9.3mmol，93％)澄清粘性固体。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)(ppm)δ：0.85(t，3H，Me)，1.20-1.50(m，22H，11CH₂)，1.70-1.80(m，2H，CH₂，)，1.96(bd，4H，2CH₂)，2.25(s，3H，tolyl Me)，4.36(t，2H，COOCH ₂)，4.42(s，3H，N-Me)，5.27-5.39(m，2H，CH＝CH)，7.10(d，2H，Ph)，7.45(d，2H，Ph)，8.25(dd，1H)，8.95(dt，1H)，9.20(dd，1H)，9.55(d，1H).

实施例7

4-甲基-4-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基甲基-吗啉-4-鎓氯化物(化合物7)的合成

将氯乙酸十八碳-9-(Z)-烯基酯(17.2g，50mmol)和N-甲基吗啉(6.6ml，60mmol)在乙腈(100ml)中回流18小时。将反应混合物冷却到室温，然后蒸发至干。加入丙酮，过滤收集析出的粘性残余物，用丙酮洗涤并干燥，得到标题化合物7，是一种稍微粘性的和吸湿性的浅黄色固体，mp 129-131℃(4.11g，9.2mmol，18％)。

计算值：C，67.31；H，10.84；N，3.14.实测值：C，65.58；H，11.35；N，3.48。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)(ppm)δ：0.88(t，3H，Me)，1.15-1.50(m，22H，11CH₂)，1.65-1.80(m，2H，CH₂，)，2.0(bd，4H，2CH₂)，3.78(s，3H，N-Me)，4.08-4.36(m，10H，COOCH ₂，4CH₂吗啉)，5.28(s，2H，COCH₂N)，5.27-5.39(m，2H，CH＝CH).

实施例8

1-[(2-(1H-吲哚-3-基)-乙基]-3-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基-吡啶鎓溴化物(化合物8)的合成

将3-(2-溴乙基)吲哚(1.12g，5mmol)在甲醇(10ml)中的溶液加入到烟酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(1.87g，5mmol)在甲醇(5ml)中的溶液中。反应混合物在室温下搅拌24小时，然后在减压下蒸发至干，得到标题化合物8，是一种粘性固体(2.7g，4.5mmol，90.3％)。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)(ppm)δ：0.85(t，3H，Me)，1.20-1.50(m，22H，11CH₂)，1.70-1.80(m，2H，CH₂，)，1.90-2.05(bd，4H，2CH₂)，3.4(2H，CH₂)，4.31(t，2H，CH₂OCO)，4.95(t，2H，CH₂)，5.30-5.39(m，2H，CH＝CH)，6.30-7.60(m，5H，吲哚芳基)，8.10-9.50(4H，pyr)，11.0(br s，1H，NH).

实施例9

哌嗪-1-基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸氢盐(化合物9)的合成

向哌嗪(10.77g，125mmol)在乙腈(200ml)中的溶液中加入粗氯乙酸油酯(从25mmol氯乙酰氯制备)在乙腈(30ml)中的溶液。混合物回流1.5小时，冷却到室温并蒸发至干。向残余物中加入水和乙酸乙酯，分离相。有机相用等体积的水洗涤，在硫酸钠中干燥，接着蒸发至干。将油状残余物溶于少量甲醇中，加入在MeOH中的L-酒石酸(7.50g，2当量)。将所述粗盐的溶液蒸发至干，固体残渣用乙腈处理，过滤，用乙腈洗涤，然后用丙酮洗涤。将所述固体溶于MeOH(400ml)中，过滤并蒸发至干。残余物用EtOAc处理，过滤，用EtOAc洗涤，然后用丙酮洗涤，干燥，得到标题化合物9，是一种白色、非吸湿性粉末，mp 130-132℃(10.45g，15mmol，60％)。

计算值：C，55.32；H，8.42；N，4.03.实测值：C，53.67；H，8.66；N，4.14。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)ppmδ：0.85(t，3H，Me)，1.18-1.34(bs，22H，11CH₂，)，1.54(bs，2H，CH₂)，1.97(bs，4H，2CH₂)，2.73(s，4H，2CH₂)，3.06(s，4H，2CH₂)，3.30(s，2H，N-CH₂COO)，4.03(t，2H，CH₂OCO)，4.22，(s，0.5H，酒石酸盐CH)，5.33(t，2H，CH＝CH).

实施例10

4-二甲氨基甲基-苯甲酸十八碳-(E)-9-烯基酯HCl(化合物10)的合成

除用elaidyl醇代替油醇外，由4-二甲氨基甲基-苯甲酸HCl(1.0g，4.6mmol)，通过实施例5b中所述的方法制备标题化合物10(1.0g，2.1mmol，46％)，mp：194-6℃。

计算值：C，72.14；H，10.37；N，3.00.实测值：C，71.36；H，11.01；N，3.19。

¹H-NMR(200MHz，CDCl₃)ppm δ：0.88(t，3H，Me)，1.25-1.33(bs，22H，11CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.96(m，4H，2CH₂)，2.83(s，6H，NMe₂)，4.30(t，2H，CH₂OCO)，4.39，(s，2H，PhCH₂)，5.38(t，2H，CH＝CH)，7.83(d，2H)，8.10(d，2H).

实施例11

氨基苯乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl(化合物11)的合成

向N-叔丁氧羰基苯基甘氨酸(2.51g，10mmol)在乙腈(50ml)中的溶液中分批加入1，1′-羰二咪唑(3.24g，20mmol)。所述溶液在室温下搅拌1小时，加入油醇(3.15ml，2.68g，10mmol)，然后将反应混合物在室温下再搅拌2小时。蒸发溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯(150ml)中，依次用5％NaHCO₃、5％柠檬酸和水洗涤，在MgSO₄中干燥并蒸发至干。将残余物溶于在乙酸乙酯(100ml)中的1％HCl中，所述溶液在室温下保留6小时，然后蒸发至干。由此获得的残余物用乙醚/正己烷结晶，得到灰白色固体(1.6g，3.65mmol，36.5％)，mp 101-103℃。

计算值：C，71.28；H，10.12；N，3.10.实测值：C，70.87；H，10.33；N，3.47。

¹H-NMR(200MHz，DMSO-d₆)(ppm)δ：0.85(t，3H，Me)，1.20-1.50(m，22H，11CH₂)，1.70-1.80(m，2H，CH₂，)，1.96(bd，4H，2CH₂)，4.15(m，2H，COOCH ₂)，5.25(s，1H，PhCHNH₂)，5.27-5.39(m，2H，CH＝CH)，7.40-7.60(m，5H，Ph)，9.20(br s，3H，N⁺H₃).

实施例12

二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)对佐剂关节炎(AA)的影响

通过用0.1ml含1mg灭活结核分枝杆菌(Difco)的不完全弗氏佐剂(IFA，含乳化剂的矿物油；Sigma)在近交8-9周龄莱维品系雌性大鼠(每组8只大鼠，从Harlan-Olac处获得)的尾根处进行接种，诱导AA。观察到12-14天后肢体出现关节炎，如文献(Holoshitz等人，1983)所述，对四肢的炎症严重程度以0-4进行评分，求和得到0-16的评分。通常在接种后约26天观察到关节炎的发病高峰。

一组大鼠在接种的当天用0.5ml盐水中的40mg化合物1进行静脉注射(IV)治疗(三角形)；另一组大鼠在AA起病后的第14天用相同数量的化合物1进行静脉注射(IV)治疗(圆)；以及第三组大鼠用盐水治疗(正方形)。通过红色程度和每一肢体的肿胀程度，以0-4进行评分，求和得到0-16的AA评分。图1所示的结果是平均结果+标准偏差。如图1中所示，化合物1可以防止大鼠由AA引起的炎症。

实施例13

二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)的抗炎作用-抗EAE保护

EAE是通过用在完全弗氏佐剂(CFA)中的髓鞘碱性蛋白(MBP)(在路易鼠中)或用在不完全弗氏佐剂(IFA)中的大鼠脊髓的乳浊液(在DA大鼠中)接种某些品系的大鼠诱发的一种实验性自身免疫性疾病。动物实验性疾病作为人自身免疫性疾病多发性硬化的模型。接种后约12天大鼠出现EAE，其特征在于由于中枢神经系统的炎症引起的不同程度的麻痹。在某些品系如路易鼠中，麻痹可以持续高达6-7天，除非大鼠在急性麻痹的高峰期死亡，它们通常痊愈。在其他品系的大鼠如DA大鼠中，麻痹可以是慢性的和忽重忽轻的。

为了诱导和临床评估EAE，将从DA大鼠获得的脊髓冷冻，融化，在免疫接种前用刮刀彻底切碎。以一次皮下注射(刚好在皮肤下)将200μl乳液免疫接种到尾部背侧，所述乳液由1∶1的IFA(Difco，Detroit，MI，USA)和抗原(体积/体重，即100μl IFA/100mg全脊髓)制备。IFA用20mg/ml的结核分枝杆菌株37RA(Difco)(＝完全弗氏佐剂，CFA)补足。所述乳液通过用气密封玻璃注射器和1.2mm直径针头研磨制备。对大鼠定期称重，并检查其临床EAE症状。使用4级评分评价临床严重程度：0，无麻痹；1，尾无力(悬垂)；2，后肢麻痹；3，后肢和前肢麻痹；4，严重的全身麻痹(Lorentzen等人，1995)。

用0.1mlIFA(含100mg全均质DA脊髓)免疫接种大鼠(每组5或7只DA品系的雌性大鼠，8-9周龄)的每个后足垫，每只大鼠总共200mg。在免疫接种的当天，通过静脉注射(IV)用0.5ml盐水中的40mg化合物1或0.5ml盐水(对照)给大鼠进行处理。如上所述按照0-4的严重性评分对所述大鼠的EAE进行评分。结果以平均分+标准误差的形式表示在图2中。图2中的结果表明，与未经治疗的对照组(正方形)大鼠相比，化合物1(圆)可以在很大程度上阻止麻痹。

实施例14

二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)对皮肤同种异体移植存活率的作用

基本上如(Birk等人，1999)所述那样进行皮肤移植。因此，给小鼠剃毛，由处死供体背侧切下1cm²皮肤切片，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗。由麻醉受体(戊巴比妥6mg/ml，0.25ml/小鼠)切下2片各1cm²的背部皮肤，准备用于异体移植。以每个受体两块供体的异体移植移植到受体的背部移植区域。将氰丙烯酸丁酯(B.Braun Melsungen AG，Melsungen，Germany)敷在移植部位周围。将Nobecutan(ASTR，AstraTech，Glos G15，UK)喷在移植部位上。

在该实验中，用1cm²完整厚度的来自C57BL/6的8周龄的雌性小鼠的皮肤移植物移植8周龄BALB/c雌性小鼠的组。在移植的当天，用盐水或用含10mg化合物1的100μl盐水静脉注射治疗一组受体小鼠。记录排斥发生日。如图3中所示，小鼠用化合物1(圆)治疗的移植皮肤要比未经治疗的对照组(正方形)小鼠的移植皮肤存活更长时间。

实施例15

二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)作为MBP肽的佐剂在治疗EAE中的用途

已经表明化合物1是一种有效的抗炎免疫调节剂，现在感兴趣的是它作为佐剂与一种抗原一起用于治疗所述的T细胞介导的疾病，其中该抗原被与T细胞介导的疾病例如自身免疫性疾病的发病有关的炎性T细胞所识别。选择EAE作为MS的模型，选择MBP肽作为抗原。

通过用CFA(Sigma)中的25μg几内MBP(总计50μg)注射每只脚垫，在7-9周龄雌性路易鼠中诱发EAE。免疫接种后约12天出现EAE，其特征在于由于中枢神经系统的炎症引起的不同程度的麻痹。如上面实施例13所述，使用4级评分对大鼠麻痹进行评分。

EAE由识别MBP分子限定的决定簇的T细胞引起。路易鼠中的主MBP决定簇由包含MBP序列71-90的肽组成(在下文中称为p71-90肽)。

为了测试给予致脑炎的MBPp71-90肽和作为佐剂的化合物1是否也可以抑制EAE的形成，在MBP免疫接种的当天(第0天)和5天后(第5天)或MBP免疫接种前第14天和第7天，皮下注射在5mg化合物1中或在盐水中乳化的p71-90肽对每组5-8只的路易鼠进行治疗，或者用仅仅在盐水中(没有肽)的化合物1对每组5-8只的路易鼠进行治疗。通过测定发病率和疾病的严重程度，用p71-90/化合物1治疗对EAE的作用进行评价。与对照治疗相比，用盐水中的p71-90肽进行治疗或用化合物1和盐水没有肽进行治疗，引起了最大程度的麻痹降低，这表明：相关的肽例如与化合物1在一种乳浊液中的p71-90MBP肽能够调节大鼠中的EAE。

实施例16

二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯(化合物1)作为重组hsp60的佐剂在治疗AA中的用途

通过在7-9周龄的雌性路易鼠的尾根部免疫接种如上面实施例12所述的含1mg灭活结核分枝杆菌的IFA(Sigma；0.1ml的10mg/ml)，在该路易鼠中诱发AA。关节炎症的程度按0-16进行评分。

为了治疗AA，将7-9周龄的每组5-8只雌性路易鼠，诱导AA后，在AA诱导的当天(第0天)和7天后(第+7天)或在第-14天和-7天，用100μg重组hsp60(由佐剂关节炎中的T淋巴细胞识别的分枝杆菌抗原表位，在PBS中或在化合物1(5mg)中乳化的)进行治疗，或者用单独在盐水中的化合物1进行治疗。如实施例12所述测定对关节炎症的治疗作用。

实施例17

(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸盐(化合物3)抑制DTH皮肤反应

迟发型超敏反应(DTH)，一种由被某些T_H细胞当它们遇到某些类型的抗原时分泌的细胞因子诱导的局部炎性反应，是一种确定的皮肤炎症的实验模型。

作为第一步，在8周龄雌性BALB/c小鼠的皮肤中诱导DTH反应。通过向小鼠剃毛后的腹部局部施用200μl 2％的噁唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮；Sigma，St.Louis，MO)在丙酮/橄榄油(4∶1，体积/体积)中的溶液，对小鼠进行致敏。致敏后第6天，通过局部施用20μ10.5％的噁唑酮溶液，对每只小鼠的一只耳朵进行激发。激发后30分钟，向每只小鼠的已激发耳朵施加20μl各种剂量(1、2和4mg)的化合物3(对照组：未治疗的耳朵或用PBS治疗的耳朵)，进行治疗。24小时后，使用小鼠耳朵-肿胀试验测定炎症的程度，测定用化合物3进行诱导治疗的抑制百分数。结果表示在图4中。用1mg和2mg化合物3进行的治疗抑制了DTH反应(分别是12.5％和8％)。

实施例18

化合物5、9和11抑制DTH皮肤反应

如实施例17一样对小鼠进行DTH诱导。激发后30分钟，以0.5、1、2和4mg在40μl中的剂量施加化合物5、9和11，对小鼠进行治疗。此外，给予地塞米松(2mg/40μl)作为阳性对照。一组DTH诱导的小鼠还用(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸乙酯HCl进行治疗(阴性对照)。

测试化合物和地塞米松的结果表明：在DTH模型中，在降低炎症方面能起到积极的效果。阴性对照，一种乙酯，没有显示任何积极效果。结果表示在图5中。

实施例19

化合物3对佐剂关节炎(AA)的作用

如上面实施例12所述，在8周龄雌性路易鼠中诱发AA。在诱导疾病前第-7天，大鼠组用各种数量的化合物3(10、50、100或200mg)通过SC进行治疗。如图6中所示，化合物3可以防止大鼠抗AA。

实施例20

SC和经口给予化合物3对EAE的作用

如上面实施例15所述用在CFA中的豚鼠MBP对8周龄雌性路易鼠诱发EAE。

在一种实验中，在诱导疾病前的第7天，大鼠组(每组7只动物)用各种数量的化合物3(10、50、100或200mg)通过SC在背部进行治疗。如上所述按照0-4的严重性评分对所述大鼠的EAE进行评分。结果表示在图7中。

在另一种实验中，从EAE诱导当天开始，大鼠组(每组7只动物)用各种数量的化合物3(0.2、1、2、10或20mg)经口天天进行治疗。如上所述按照0-4的严重性评分对所述大鼠的EAE进行评分。结果表示在表1和图8中。

在另一个实验中，从EAE诱导的当天开始，化合物3经口隔日给予，发现同样有效(没有表示出)。

上面实验的结果表明：当皮下或口服给药时，化合物3可以防止大鼠抗EAE。

表1

化合物3的剂量(mg)	平均临床得分	抑制％
化合物3的剂量(mg)	平均临床得分	抑制％	0	2.9	0
0.2	2.1	28	0	2.9	0
0.2	2.1	28	1	2.1	28
2	2.5	14	1	2.1	28
2	2.5	14	10	2.1	28
20	1.7	41	10	2.1	28

实施例21

经口给予化合物9对EAE的作用

大鼠用化合物9(100mg/Kg)经口治疗。如上所述按照0-4的严重性评分对所述大鼠的EAE进行评分。表2和图9中的结果表明：当口服给药时，化合物9可以防止大鼠抗EAE。

表2

剂量	Mg/Kg	平均临床得分	抑制％	发病大鼠％	平均发病日
剂量	Mg/Kg	平均临床得分	抑制％	发病大鼠％	平均发病日	PBS	0	2.81±0.46	0	100	12.3
化合物9	100	1.93±0.45	31.4	100	11.5	PBS	0	2.81±0.46	0	100	12.3

实施例22

化合物3促进格拉默乙酸盐(GA)的免疫作用

格拉默乙酸盐(GA)是一种用于治疗多发性硬化的免疫调节剂(

Teva Pharmaceuticals Ltd.，Israel的商标)。GA具有某些明确的免疫作用，这些免疫作用可以在体外和体内证明：形成GA特异性T细胞以及降低EAE的临床症状严重度。虽然这些作用被认为是GA给予的，但是与某些添加剂一起给药可以促进它的作用。在本实施例中，测试用GA和作为佐剂的化合物3一起免疫接种对EAE结果和对特异性细胞免疫反应的作用。

材料：格拉默乙酸盐(GA)由Teva Pharmaceuticals Ltd.，Israel提供；冷冻干燥的小鼠脊髓匀浆(MSCH)从ICR小鼠中由Biological Lab，Netanya，Israel制备；IFA，结核分枝杆菌从Difco处购买；CFA，百日咳毒素(PTX)，PBS，2-巯基乙醇，concavalin A(Con A)来自Sigma；苔酚蓝来自BDH；来自Beit-Haemek，Israel的DCCM1(确定的细胞培养介质)和RPMI 1640介质；L-谷氨酰胺2mMx100，MEM(最低基础培养基)-非必要的氨基酸x100，以及丙酮酸钠1mMx100，所有都是无菌的，来自Bio-Lab，Israel。

实验动物：在CSJL/F1小鼠中测试EAE，在C57BL/J6小鼠中测试免疫反应。从Harlan Animal Breeding Center，Jerusalem，Israel处获得健康的无特异病原体的、雌性CSJLF/1小鼠和雄性C57BL/J6小鼠。开始研究时的小鼠为9周龄，体重为20g±15％。

A.EAE的测试方案：

(i)如下所示，将小鼠分成4个测试组：

组	免疫源(mg/小鼠)	添加剂/佐剂	小鼠的数目
组	免疫源(mg/小鼠)	添加剂/佐剂	小鼠的数目	1	GA(5.0)	IFA	10
2	GA(5.0)	化合物3(0.5mg/小鼠)	10	1	GA(5.0)	IFA	10
2	GA(5.0)	化合物3(0.5mg/小鼠)	10	3		化合物3(0.5mg/小鼠)+PBS(赋形剂-0.1mL/小鼠)	10
4		PBS(赋形剂-0.1mL/小鼠)	10	3		化合物3(0.5mg/小鼠)+PBS(赋形剂-0.1mL/小鼠)	10

(ii)免疫接种：在EAE诱导前第11天，通过SC在侧腹以100μL/小鼠的体积剂量给药(在右和左侧腹，50μL/侧腹)，用GA在IFA中的乳液对小鼠进行免疫接种(组1)，用GA在化合物3中的溶液对小鼠进行免疫接种(组2)，用在PBS中的化合物3对小鼠进行免疫接种(组3)，或单独用PBS对小鼠进行免疫接种(组4)。

(iii)在IFA中制备GA乳液：为了给组1进行免疫接种，将在PBS中的GA溶液(100mg/mL)与IFA按照1∶2进行稀释，得到最终浓度为50mg/mL，并按5.0mg/小鼠GA进行注射(0.1ml)。将GA+IFA混合物转移到一个与第二注射器通过路厄氏锁连接的注射器(2.5mL)中，通过将材料在约10分钟的时间从一个注射器转移到另一注射器，进行充分混合直到所述材料被充分乳化为止。

(iv)用化合物3制备GA溶液：为了对组2进行免疫接种，将在PBS中的GA溶液(100mg/mL)用化合物3在PBS中的溶液(10mg/mL)中进行稀释，得到最终GA浓度为50mg/mL的溶液，然后以5.0mg/小鼠GA的剂量给药。为了给对照组3进行免疫接种，将等体积的化合物3(10mg/mL)和PBS(赋形剂)进行混合。在化合物3+GA免疫接种组2和化合物3免疫接种对照组3中的化合物3的最终浓度是5mg/mL(0.5mg/小鼠的剂量水平，相当于25mg/kg)。

(v)EAE诱导：向小鼠的足垫注射由MSCH和商业上含结核分枝杆菌H37Ra的CFA组成的致脑炎剂以及通过静脉注射百日咳毒素IV，诱导EAE。

(vi)临床观察和评分：免疫接种后，每天观察小鼠的异常临床症状和行为。在免疫接种前对小鼠进行称重，免疫接种后，每周一次称量体重直到研究结束为止。EAE诱导后十天，检查小鼠的EAE临床症状并进行评分。观察EAE的临床症状，并在EAE诱导后第9天，根据下列五个评分等级开始评分直到实验结束为止，以评价临床严重程度：0，行为正常；1，体重减轻；2，尾无力；3，后腿张力减退并且无力；4，后腿麻痹；4，严重的全身麻痹；5，呼吸受损和/或惊厥和/或全身麻痹或死亡。所有评分在1以上的大鼠都被认为是有病的。

(vii)结果分析：

死亡率的计算：测定每组中有病的和死亡的动物的数目，如下计算发病率和死亡率：

有效性百分比的计算：根据死亡率如下计算有效性百分比：

计算平均病程和发病时间：计算以天数表示的平均病程和发病时间。

计算平均最高评分和抑制百分比：总结了在测试组中10只小鼠中每一只的最高评分。

如下计算该组的平均最高评分(MMS)：

∑每只小鼠的最高得分/每组中小鼠的数目。

如下计算抑制百分比：

抑制百分比＝1-(治疗组的MMS/对照组的MMS)x100

计算平均组得分和抑制百分比：总结了在测试组中10只小鼠中每一只的得分。

如下计算该组的平均组得分(GMS)：

∑每只小鼠的得分/每组中小鼠的数目。

如下计算抑制百分比：

抑制百分比＝1-(治疗组的GMS/对照组的GMS)x 100

B.免疫追踪的测试方案：

(i)如下所示，将小鼠分成6个测试组：

组	免疫源(μg/小鼠)	添加剂/佐剂	小鼠的数目
组	免疫源(μg/小鼠)	添加剂/佐剂	小鼠的数目	A	GA(75)	CFA+5mg/ml MT	10
B	GA(75)		10	A	GA(75)	CFA+5mg/ml MT	10
B	GA(75)		10	C		化合物3(50μg/小鼠)	10
D	GA(75)	化合物3(50μg/小鼠)	10	C		化合物3(50μg/小鼠)	10
D	GA(75)	化合物3(50μg/小鼠)	10	E		化合物3(500μg/小鼠)	10
F	GA(75)	化合物3(500μg/小鼠)	10	E		化合物3(500μg/小鼠)	10

(ii)免疫接种：在收集脾脏前10天，对小鼠进行免疫接种。GA在CFA中的乳液以及PBS和GA与化合物3的溶液以100μL/小鼠的体积剂量通过SC给予小鼠的侧腹。

(iii)在CFA中制备GA乳液：将在PBS中的GA溶液(最终GA浓度为1.5mg/mL，剂量为75μg/小鼠)在CFA中进行稀释，得到最终浓度为0.75mg/mL的溶液，以75μg/小鼠GA的剂量给药。将GA+CFA混合物转移到一个与第二注射器通过路厄氏锁连接的注射器(2.5mL)中，通过将材料在约10分钟的时间从一个注射器转移到另一注射器，进行充分混合直到所述材料被充分乳化为止。

(iv)用化合物3制备GA溶液：将化合物3溶于PBS中，得到10m g/mL，以500μg/小鼠给药，然后以1∶10稀释至1mg/mL，以50μg/小鼠给药。将GA(20mg管形瓶)溶于PBS中，得到20mg/mL溶液，然后在PBS中进一步稀释，得到最终GA浓度为1.5mg/mL的溶液，以75μg/小鼠的剂量给药。对于对照组，将相等体积的化合物3和GA或PBS混合。

(v)安全性评估：为了测试新制剂的安全性，免疫接种后每天，对观察到异常临床症状和行为的小鼠进行追踪研究。小鼠根据下列等级进行评分：0-行为正常；1-轻微中毒迹象(竖毛)；2-中等中毒迹象(部分眼睑闭合、弓起背部、活动减退、表情淡漠)；3-严重中毒迹象(运动失调、惊厥、喘息式呼吸、麻痹、不省人事)；4-死亡。在免疫接种前对小鼠进行称重，以及研究结束的当天对小鼠称重。出于人道原因，该研究在观察5天后结束，由于在所有组中都100％发生严重的疾病。称量脾脏的重量，并计算脾脏/体重的比值。

(vi)细胞培养：收集脾脏，并将其按每组放到无菌RPMI介质中。提取细胞，将其再悬浮到富含DCCM1的介质中，并进行计数。然后用介质作为基准，两种浓度的GA作为活化剂，25μg/ml和5μg/ml，以及Con A作为阳性对照，在37℃、5％CO₂下培养细胞。收集上清液，测试细胞因子分泌的水平。

(vii)使用ELISA对脾脏原代培养中的细胞因子分泌进行检测。细胞在体外被激活，并使用商业试剂盒根据供应商的指示，检测IL-2分泌水平。

C.结果

(i)EAE结果

死亡率、平均最高得分、组平均得分、平均发病时间和平均病程表示在表3中。在用GA(5mg/小鼠)+化合物3免疫接种的组中，显示EAE病征得到抑制。发现死亡率减少60％，MMS减少16％，GMS减少23.7％。对于抑制EAE症状，用GA+化合物3治疗的组要比用化合物3没有GA治疗的组或用GA+IFA(另一种添加剂)治疗的组更优。

(ii)免疫追踪结果

从免疫接种小鼠的脾脏细胞中分泌的IL-2表示在表4和图10中。在用化合物3(没有GA)以50和500μg/小鼠的剂量免疫接种的组中，脾脏细胞的IL-2分泌没有随GA提高。Con A(一种非特异性活化剂)在所有组中增加了IL-2的水平。化合物3对非特异性Con-A激活没有影响。

在用GA(75μg/小鼠)+化合物3(50μg/小鼠的剂量)免疫接种的组中，脾脏细胞的IL-2分泌随GA提高。在那些小鼠的脾脏细胞中发现的IL-2水平要比单独用GA免疫接种的小鼠高。

用GA(75μg/小鼠)+化合物3(500g/小鼠)同样引起脾脏细胞的IL-2分泌随GA增加(虽然在程度商要比在脾脏细胞(从单独用GA免疫接种的小鼠中采集的)中发现的IL-2少)。

安全性追踪表明没有异常行为或临床症状。所有得分是0。

化合物3和GA 75μg/小鼠+化合物3两种剂量都对小鼠体重没有副作用。所有小鼠显示类似的正常的重量增加，10天内每只小鼠的体重约增加1.5g。

脾脏重量与小鼠总体重的比值在所有组中都类似。

D.结论

在此给出的数据表明：在EAE模型中，向GA中加入化合物3促进了它的有益作用(特别是在存活率方面)以及促进了它的免疫作用(脾脏细胞对GA的细胞反应)。

用化合物3在有或者没有GA存在下的治疗表明：没有毒理学异常迹象。因此，SC注射化合物3没有可检测的急性炎性作用或毒性作用。此外，用化合物3在有或者没有GA存在下的治疗表明：没有免疫抑制迹象。

表3

inh.＊＝抑制

表4

参考文献

Beyer S.and Pilgrim H.1991，Die Hemmung der Endothelzellproliferationdurch Ester der 4-Aminomethylbenzoesaure(PAMBA)，Pharmazie 46：597-599.

Birk et al.，1999.The 60kDa heat shock protein modulates allograft rejection.Proc.Nat.Acad.Science USA.96：5159-63.

Holoshitz，Y.et al.，1983.Lines of T lymphocytes mediate or vaccinateagainst autoimmune arthritis，Science 219：56.

Kontogiorgis C.A.，Hadjip avlou-Litinia D.J.，and Schulz E.，2001，Antioxidant activity of DLω-phenyl-amino acid octyl esterswith anti-inflammatoryactivity.Arzneim-Forsch./Drug Res.51(I)：485-488.

Lorentzen J，C.et al.，1995.Protracted，relapsing and demyelinatingexperimental autoimmune eneephalomyelitis in DA rats immunized with syngeneicspinal cord and incomplete Freund′s adjuvant，J.Neuroimmunology.63：193-205.

Markwardt F.，Neuland P.，and Klocking H.-P.1966，Uber dieantifibrinolytische Wirkung von Estern der4-Aminomethylbenzoesaure(PAMBA)Pharmazie 21(6)：345-348.

Metayer MM.M.et Jacob J.，1952，Preparation et propriétéspharmacodynamiques de quelques esters de la bétaine，Ann.Pharm.Francaise，10：435-440.

Nixon-George A.，Moran T.，Dionne G.，Penney C.L.，et al.1990，Theadjuvant effect of stearyl tyrosine on a recombinant subunit hepatitis B surfaceantigen.The Journal of Immunology，144(12)：4798-4802.

Penney C.L.，Shah P.，and Landi S.，1985，A simple method for thesynthesis of long-chain alkyl esters of amino acids，J.Org.Chem.50：1457-1459.

Penney C.L.，Ethier D.，Dionne G.，Nixon-George A.，Zaghouani H.，et al.，1993，Further studies on the adjuvanticity of stearyl tyrosine and ester analogues，Vaccine 11(11)：1129-1134.

Rodriguez，M.D.，Gomez，R.，Sanchez，M and H.Garcia.1998，J.Appl.Toxicol.18：313-6.

Rucka M.，Oswiecimska M.，Witek S.1983，New biocides for cooling watertreatment：Quatemary ammonium salts derivatives of glycine esters.EnvironmentProtection Engineering，9(3)：25-31.

Schewe Ch.，Schulz E.，Vietinghoff G.，Sprung W.D.，Kobow M.，Loose S.，and Schewe T.，1991，On the mode of action of antiphlogistically active DL-ω-phenyl amino acid esters，Biomed.Biochim.Acta，50(2)：189-198.

Schulz E.，Sprung WD，Kroning G.and Lauge，P.1982，Pharmacologicalproperties of D，L-2-phenylglycine alkyl esters with special consideration of theiranti-inflammatory activity，Agents ActionsSuppl.，AAS 10：119-128.

Smith D.R.，Maienthal M.and Eifert R.L.，1951，Quaternary ammoniumsalts of heterocyclic bases，JA CS，73：2964-2965.

The Merck Index，13th Edition，2001，Merck&Co.Inc.，Rahway，N.J.，U.S.A.

Vetter W.and Meister W.，1981，Nicotinates as derivatives for the massspectrometric investigation of long chain alcohols，Organic Mass Spectrometry，16(3)：118-122.

Wong O.，Huntington J.，Nishihata T.，and Rytting J.H.，1989，New alkylN，N-dialkyl-substituted amino acetates as transdermal penetration enhancers，Pharmaceuticak Research，6(4)：286-295.

Claims

1.一种下面通式的化合物及其药学上可接受的盐：

R1-O-CO-A

其中

R1是C₂₀-C₂₄烷基或C₁₂-C₁₈链烯基，但R1不为法呢基，A是下式的残基：

其中R2是H、C₁-C₆烷基、芳基或芳烷基，其中任何芳基部分可以是未取代的或被硝基、氰基、卤素、羟基、NR6R7或CR8R8NR6R7取代；

R3是H、一对电子或C₁-C₆烷基；

R4和R5各自独立地是H或C₁-C₆烷基，或者R4和R5同与其相连的氮原子一起形成5-7元饱和环，该环任选被氧原子或任选被C₁-C₆烷基取代的氮原子间隔；并且

R6、R7和R8各自独立地是H或C₁-C₆烷基。

2.权利要求1的化合物及其药学上可接受的盐，其中R1是C₁₆-C₁₈链烯基。

3.权利要求2的化合物及其药学上可接受的盐，其中R1是顺-9-十八烯基或反-9-十八烯基。

4.权利要求3的化合物及其药学上可接受的盐，其中R2是H或苯基，R3是H或一对电子，R4和R5是甲基或与它们相连的氮原子一起形成在4位氮原子上任选被甲基取代的吗啉环或哌嗪环。

5.权利要求4的化合物及其药学上可接受的盐，选自：

N，N-二甲氨基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯；

(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸盐；

4-甲基-4-十八碳-(Z)-9-烯氧羰基甲基-吗啉-4-鎓氯化物；

哌嗪-1-基-乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯酒石酸氢盐。

6.权利要求1的化合物及其药学上可接受的盐，其中R1是顺-9-十八烯基，R2是苯基，R3是一对电子，R4和R5分别是H。

7.权利要求6的化合物及其药学上可接受的盐，其是α-氨基-α-苯基乙酸十八碳-(Z)-9-烯基酯HCl盐。

8.一种药物组合物，包含权利要求1-7任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

9.一种治疗组合物，包含一种抗原和权利要求1-7任一项的化合物或其药学上可接受的盐。