DE102005022290A1 - Hexanukleotid-Wirkstoffe - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichtetes Hexanukleotid als pharmazeutisch aktiven Bestandteil, ein Verfahren zur Herstellung eines gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichteten Hexanukleotids, die Verwendung eines Hexanukleotids zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, beispielsweise viraler Infektionen bei Säugern, sowie einen Kit, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichtetes Hexanukleotid.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichtetes Hexanukleotid als pharmazeutisch aktiven Bestandteil, ein Verfahren zur Herstellung eines gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichteten Hexanukleotids, die Verwendung eines Hexanukleotids zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, beispielsweise viraler Infektionen bei Säugern, sowie einen Kit, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichtetes Hexanukleotid.
  • Oligomere Nukleinsäuren (Oligonukleotide) nehmen Kettenlängen ein, die zwischen Mononukleotiden (ein Nukleotid [nt]) und Dinukleotiden (2 nt) einerseits und Polynukleotiden (> 50 bis 100 nt) andererseits liegen, also zwischen 3 nt und etwa bis 7 nt. Zahlreiche biologische und biotechnologisch relevante Klassen von Oligonukleotiden wie beispielsweise Antisense-Oligonukleotide, siRNA oder immunstimulatorische CpG-Oligonukleotide haben Kettenlängen von mindestens 12 bis 16 nt, vorzugsweise 18 bis 24 nt, wobei einige oligomere Nukleinsäurewirkstoffe, wie z.B. Ribozyme und Aptamere, auch deutlich längerkettig sind. Dagegen sind Oligonukleotide im Längenbereich von 3 bis etwa 8 nt bisher kaum untersucht.
  • Beim Einsatz als Wirkstoff bieten kürzere Oligonukleotide gegenüber längerkettigen Nukleinsäuren eine Reihe technischer Vorteile. Die Herstellung, d.h. die Synthese und die Reinigung, kurzer Oligonukleotide verursacht bedeutend niedrigere Kosten. Ein niedrigeres Molekulargewicht bedeutet einen technischen Vorteil hinsichtlich der Verabreichung der Oligonukleotide. Die rationale Verbesserung von „Lead- Compounds" ist bei kürzeren Oligonukleotiden deutlich aussichtsreicher.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neue Oligonukleotide als eine neue pharmazeutische Wirkstoffklasse, insbesondere zur Regulierung der Aktivität proteinartiger Biopolymere, beispielsweise zur Hemmung der Aktivität endogener oder exogener Proteine und/oder der Vermehrung von Krankheitserregern in einem Individuum, bereitzustellen.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände gelöst.
  • Insbesondere wird erfindungsgemäß eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein Hexanukleotid als biologisch bzw. pharmazeutisch wirksamen Bestandteil und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel, wobei das Hexanukleotid zielspezifisch gegen ein proteinartiges Biopolymer gerichtet ist, bereitgestellt.
  • Unter einem Hexanukleotid, welches zielspezifisch gegen ein proteinartiges Biopolymer gerichtet ist, wird in der vorliegenden Erfindung jedes Hexanukleotid, das spezifisch und meßbar fest an ein proteinartiges Biopolymer unter im wesentlichen physiologischen Bedingungen bindet, verstanden.
  • Der Begriff „Hexanukleotid" bedeutet jede Nukleinsäure (oder Nukleinsäure-analoge Verbindung), die aus sechs monomeren Einheiten (Nukleotiden oder modifizierten Nukleotiden) aufgebaut ist. Der Begriff „Nukleinsäure" bedeutet natürliche, halbsynthetische oder vollständig synthetische sowie modifizierte Nukleinsäuremoleküle bestehend aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden, und/oder modifizierten Nukleotiden wie beispielsweise „Peptide nucleic acids" (PNA), „locked nucleic acids" (LNA) oder „Phosphorothioaten". Auch andere Modifikationen der Internukleotid-Phosphate und der Ribose bzw. Zucker-Komponenten können enthalten sein. Die Basen des Hexanukleotids umfassen sämtliche bekannten Nukleobasen, wie beispielsweise die natürlich vorkommenden Basen Adenin, Guanin, Cytidin, Thymidin und Uracil wie auch chemisch modifizierte Basen und künstlich hergestellte Basen.
  • Erfindungsgemäß können die Basen des Hexanukleotids auf jede im Stand der Technik bekannte Art, die nicht zu einem Verlust der Bindung des proteinartigen Biopolymers führen, modifiziert sein. Dies schließt auch Modifizierungen, die zu einer stärkeren oder schwächeren Bindung des Hexanukleotids führen, mit ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Hexanukleotid, welches zielspezifisch gegen ein proteinartiges Biopolymer gerichtet ist, die Nukleotidsequenz 5'-UCGUGU-3', 5'-TCGTGT-3', 5'-ACGUGU-3' oder 5'-UAGUGU-3' auf.
  • Der Begriff „proteinartiges Biopolymer" bedeutet erfindungsgemäß jedes proteinartige Biopolymer, einschließlich glykosilierter Modifikationen, dessen Aktivität durch das Binden an ein vorstehend definiertes Hexanukleotid mindestens reduziert und vorzugsweise im wesentlichen gehemmt werden kann. Die Reduzierung bzw. Hemmung kann reversibel oder irreversibel sein. Das proteinartige Biopolymer kann von endogenem oder exogenem Ursprung sein. Beispielsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Biopolymeren um Arzneistoff-spezifische Zielmoleküle („drugspecific targets"). Ein erfindungsgemäßes proteinartiges Biopolymer kann ein intrazelluläres Protein, ein extrazelluläres Protein oder ein Transmembranprotein sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das proteinartige Biopolymer von viralem Urprung. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt das proteinartige Biopolymer eine katalytische bzw. enzymatische Aktivität. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das proteinartige Biopolymer die Reverse Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das proteinartige Biopolymer zelloberflächenständig.
  • Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines vorstehend definiertes Hexanukleotids bereit, umfassend die Schritte
    • (a) des Bereitstellens eines ersten Systems, welches n unterschiedliche Sätze von Hexanukleotiden umfaßt, wobei (i) jeder Satz ein oder mehrere Hexanukleotide mit gleicher Nukleotidsequenz enthält, (ii) sich jeder Satz vom anderen durch die unterschiedliche Nukleotidsequenz der Hexanukleotide unterscheidet und (iii) n eine ganze Zahl von 2 bis 4096 ist,
    • (b) des Bereitstellens eines zweiten Systems, welches mindestens ein vorstehend definiertes Biopolymer umfaßt, und
    • (c) des Inkontaktbringens des ersten Systems mit dem zweiten System unter Bedingungen, welche eine zielspezifische Bindung eines Hexanukleotids an das proteinartige Biopolymer unter Bildung eines Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Hexanukleotide an mindestens eine detektierbare Markierung gekoppelt. Der in dieser Ausführungsform verwendete Begriff „Markierung" bedeutet geeignete, direkt oder indirekt nachweisbare Atome, Moleküle oder Gruppen, die in die Hexanukleotide eingebaut und/oder damit verbunden sind, beispielsweise Fluoreszenzmarkierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Hexanukleotide mit 32P markiert oder Fluoreszenz-markiert.
  • Das Inkontaktbringen des ersten Systems mit dem zweiten System unter Bedingungen, welche eine zielspezifische Bindung eines Hexanukleotids an das proteinartige Biopolymer unter Bildung eines Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes ermöglichen, umfaßt das Bereitstellen sämtlicher physikalischer Bedingungen wie beispielsweise Temperatur, Druck usw. als auch die chemischen Bedingungen wie beispielsweise Ionenkonzentration, Ionenstärke und Ionenzusammensetzung, pH-Wert usw. der jeweiligen Reaktionsgemische. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Inkontaktbringen des ersten Systems mit dem zweiten System unter im wesentlichen physiologischen Bedingungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Hexanukleotide in Schritt (a) und das proteinartige Biopolymer in Schritt (b) jeweils in einer wässrigen Lösung bereitgestellt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren nach Schritt (c) weiter den Schritt
    • (d) des Identifizierens des zielspezifisch gebundenen Hexanukleotids durch Isolieren des Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes von nicht gebundenen Hexanukleotiden und nach der Abtrennung von dem Biopolymer durch Bestimmen der Nukleotidsequenz dieses Hexanukleotids.
  • Das Isolieren des Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes von nicht gebundenen Hexanukleotiden kann beispielsweise durch das Abtrennen der nicht an die proteinartigen Biopolymere gebundenen Hexanukleotide, beispielsweise mittels Gelfiltration, erfolgen. Die in dem Hexanukleotid/Biopolymer-Komplex an die proteinartigen Biopolymere gebundenen Hexanukleotide können beispielsweise nach jedem bekannten Verfahren zum Klonieren von Nukleinsäuresequenzen in einen geeigneten Vektor kloniert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die in dem Hexanukleotid/Biopolymer-Komplex an das proteinartige Biopolymer gebundenen Hexanukleotide durch Hitzedenaturierung freigesetzt. Nach der Übertragung der Hexanukleotidsequenzen in einen geeigneten Vektor kann dieser beispielsweise in einen prokaryontischen Organismus eingebracht werden und auf diese Weise kann der die gewünschte Hexanukleotidsequenz enthaltende Vektor amplifiziert und anschließend isoliert werden. Daraufhin können die mit Hilfe der Klonierung gewonnenen Hexanukleotide durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren sequenziert werden. Dies schließt sowohl eine manuelle Sequenzierung mit Hilfe radioaktiv markierter Didesoxynukleotide als auch eine automatische Sequenzierung mit Hilfe entsprechender Sequenzierautomaten ein.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste System ein Träger für eine systematische Anordnung potentieller Wirkstoffe mit 4096 unterschiedlichen Sätzen und das proteinartige Biopolymer ist mindestens an eine detektierbare Markierung gekoppelt.
  • Unter einem „Träger für eine systematische Anordnung potentieller Wirkstoffe" wird eine zweidimensionale Anordnung von Gruppen von immobilisierten einzelsträngigen Biomolekülen, insbesondere Nukleinsäuren, mit bekannter Basenabfolge (Sequenz) verstanden, so daß jedem Biomolekül bestimmte räumliche Positionskoordinaten zugeordnet werden können. Um die Vorraussetzung einzelsträngiger immobilisierter Nukleinsäuremoleküle zu erfüllen, müssen diese bereits vor Beginn der Bindungsreaktion mit dem proteinartigen Biopolymer entweder durch das bei der Herstellung des Trägers angewandte Verfahren bereits einzelsträngig sein oder gegebenenfalls vor Beginn der eigentlichen Bindungsreaktion einer denaturierenden Behandlung unterzogen werden. Erfindungsgemäß befinden sich auf dem Träger 4096 verschiedene Gruppen von mindestens einem Hexanukleotid, die sich in der Basensequenz des Hexanukleotids unterscheiden. Auf diese Weise wird der gesamte Sequenzraum aller möglichen natürlich vorkommenden Hexanukleotide (vier natürlich vorkommende Basen (entweder A, T, C, G bei Desoxyribonukleinsäuren, oder A, U, C, G bei Ribonukleinsäuren), also 46 = 4096 Hexanukleotide) auf dem Träger dargestellt.
  • Das Material des Trägers unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann jedes im Stand der Technik bekannte Material sein, welches die erfindungsgemäß verwendeten Hexanukleotide im Oberflächenbereich des Trägers immobilisiert. Beispiele für derartige Materialien sind Kunststoffe, Halbleitermaterialien, Gläser, etc.
  • Der in dieser Ausführungsform verwendete Begriff „detektierbare Markierung" umfaßt jede Markierung, die für den Nachweis eines proteinartigen Biopolymers geeignet ist. Eine solche Markierung kann beispielsweise eine radioaktive Markierung durch den Einbau von Radioisotopen in das proteinartige Biopolymer, ein fluoreszierender Farbstoff, beispielsweise durch das Koppeln des proteinartigen Biopolymers an Cy5 oder FAM, eine Verbindung mit enzymatischer Aktivität, beispielsweise durch das Koppeln des proteinartigen Biopolymers an das Enzym Luciferase, welches ein Lichtsignal nach Umsetzen des entsprechenden Substrats herstellt, eine magnetische Markierung, ein Antigen, das einen Nachweis über entsprechende Antikörper ermöglicht, oder eine Verbindung mit einer hohen Affinität für eine detektierbare Markierung, beispielsweise durch das Koppeln des proteinartigen Biopolymers an Biotin, welches dann über Streptavidin, das an eine detektierbare Markierung gekoppelt ist, nachgewiesen werden kann, sein. Verfahren zum Nachweis dieser detektierbaren Markierungen sind in dem Fachgebiet bekannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Träger für eine systematische Anordnung potentieller Wirkstoffe für einen bestimmten Zeitraum, beispielsweise etwa 30 Minuten bis mehrere Tage, mit dem proteinartigen Biopolymer inkubiert, anschließend werden unspezifische Wechselwirkungen zwischen nicht-zielspezifisch gerichteten Hexanukleotiden und dem proteinartigen Biopolymer, beispielsweise durch das Verändern der Reaktionsbedingungen, aufgelöst. Beim Nachweisen der gebundenen proteinartigen Biopolymere mit Hilfe der detektierbaren Markierung werden verbleibende Signale auf den Feldern des Trägers detektiert und quantifiziert. Aus der Position der markierten Felder auf dem Träger und den Inkubationsbedingungen werden spezifisch bindende Hexanukleotidsequenzen sowie deren Spezifität abgeleitet. Je stringenter die Inkubationsbedingungen, unter denen eine Bindung des proteinartigen Biopolymers an ein Hexanukleotid stattfindet, desto höher ist die Spezifität dieser Bindung, d.h. desto spezifischer ist sie.
  • Zudem stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines vorstehend definierten Hexanukleotids für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung bereit. Erfindungsgemäß steht die Reduzierung oder im wesentlichen vollständige Hemmung der Aktivität eines proteinartigen Biopolymers durch die Verwendung des zielspezifisch gerichteten Hexanukleotids direkt oder indirekt mit der Erkrankung im Zusammenhang. Ein derartiges proteinartiges Biopolymer kann beispielsweise ein exogenes oder ein endogenes proteinartiges Biopolymer eines Wirbeltieres, bevorzugt eines Säugers, besonders bevorzugt eines Menschen, sein. Ferner kann ein derartiges proteinartiges Biopolymer von einem Krankheitserreger stammen. Ein Krankheitserreger kann gemäß der vorliegenden Erfindung jeder Organismus sein, der ursächlich für die Entstehung oder die Entwicklung einer Erkrankung verantwortlich sein kann, wie beispielsweise Bakterien, Viren, Pilze oder Protozoen.
  • Erfindungsgemäß ist das vorstehend definierte Hexanukleotid in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in einer pharmazeutisch wirksamen Menge vorhanden. Eine pharmazeutisch wirksame Menge ist eine für die Regulierung der Aktivität proteinartiger Biopolymere, beispielsweise zur Reduzierung oder im wesentlichen vollständigen Hemmung der Aktivität endogener oder exogener Protei ne und/oder der Vermehrung von Krankheitserregern in einem Individuum, wirksame Menge. Eine übliche Menge ist beispielsweise bis etwa 1 bis 10 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierung des Hexanukleotids ist für einen auf dem Gebiet der Pharmazie und/oder Medizin tätigen Fachmann mit Hilfe der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren problemlos zu ermitteln. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf jede im Stand der Technik bekannte Weise verabreicht werden. Dies schließt eine orale, rektale, systemische, (lokal) topische, nasale oder parenterale Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation (z.B. in Form eines Aerosols) ein. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in gelöster Form vorliegen und subkutan, intramuskulär oder intravenös injiziert werden. Zudem kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung neben dem vorstehend definierten Hexanukleotid weitere, für die jeweilige Verabreichungsform erforderliche Hilfsmittel, beispielsweise Verdünnungsmittel, pharmazeutische Träger, Salze und/oder Konservierungsmittel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines vorstehend definierten Hexanukleotids zur Behandlung oder Vorbeugung viraler Infektionen bei Säugern, beispielsweise Menschen, bereitgestellt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die virale Infektion eine Infektion mit einem humanen Immundefizienzvirus Typ 1.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reduzieren, vorzugsweise Hemmen der Aktivität von mindestens einem proteinartigen Biopolymer bereit, umfassend die Schritte
    • (a) des Bereitstellens eines ersten Systems, welches mindestens das proteinartige Biopolymer enthält,
    • (b) des Bereitstellens eines zweiten Systems, welches mindestens ein vorstehend definiertes Hexanukleotid enthält, und
    • (c) des Inkontaktbringens des ersten Systems mit dem zweiten System unter Bedingungen, welche eine zielspezifische Bindung mindestens eines Hexanukleotids an das proteinartige Biopolymer unter Bildung eines Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes ermöglichen.
  • Zudem stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von mindestens einem vorstehend definierten Hexanukleotid zum Hemmen der Aktivität von mindestens einem proteinartigen Biopolymer bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Hexanukleotid zum Hemmen der Aktivität eines Enzyms bereitgestellt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym die Reverse Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Hexanukleotid, das zur Hemmung der Aktivität der Reversen Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 verwendet wird, die Nukleotidsequenz 5'-UCGUGU-3' auf.
  • Außerdem wird ein Kit, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer vorstehend definiertes Hexanukleotid zur Reduzierung oder im wesentlichen vollständigen Hemmung der biologischen Aktivität des proteinartigen Biopolymers bereitgestellt.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1: Bindung des Hexanukleotids HXR-3 (5'-UCGUGU-3') (1a) bzw. eines Kontroll-Hexanukleotids (5'-UCAAAA-3') (1b) an die Reverse Transkripase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1 RT) sowie an die Kontrollproteine Bovines Serumalbumin (BSA) und T7-RNA-Polymerase (T7 pol), angegeben in Prozent [%]. Die Reverse Transkriptase des verwandten humanen Immundefizienzvirus Typ 2 wird nicht meßbar gebunden (nicht gezeigt).
  • 2: Biologische Wirksamkeit von HXR-3: Hemmung der Produktion rekombinanter Luciferase tragender infektiöser Viruspartikel von humanem Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1). HXR-1 ist ein inaktives Hexamer, „Kontrolle" bedeutet Virusproduktion in Abwesenheit eines Hexamers. Angegeben wird die Produktion rekombinanter infektiöse HIV-Partikel in relativen Einheiten.
  • 3: Übersicht über das erfindungsgemäße kombinatorische Verfahren in Lösung zur Herstellung zielspezifisch gerichteter Hexanukleotide
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher ohne sie einzuschränken.
    •
  • Beispiel 1: Bindung von radioaktiv markiertem HXR-3 an HIV-1 reverse Transkriptase (RT), BSA oder T7-RNA Polymerase
  • 5'-32P-markiertes Hexanukleotid HXR-3 (5'-UCGUGU-3') (1 nM) wurde mit je 50 μM Protein für 2 Minuten bei einer Temperatur von 25°C inkubiert. Mit Hilfe eines Filterbindungstests wurde freies Hexanukleotid von Protein-gebundenem Hexanukleotid getrennt und über die Bestimmung der Radioaktivität quantifiziert.
  • Beispiel 2: Biologische Wirksamkeit von zielspezifisch gerichteten Hexanukleotiden
  • „293T-Zellen" wurden mit den beiden Plasmiden „VSV-G+" und pGJ3-Luci zusammen mit den Hexanukleotiden HXR-1, HXR-3 oder ohne Hexanukleotid (Kontrolle) transfiziert. Dabei werden von beiden Plasmiden allen notwendigen Komponenten für die Bildung infektiöser Viruspartikel zur Verfügung gestellt, insbesondere die reverse Transkriptase von HIV-1 wird exprimiert, die als Target für HXR-3 anzusehen ist. Nach 48 Stunden wurden die von transfizierten Zellen freigesetzten Virionen dazu benutzt, Zellkulturen zu infizieren. Dabei schreibt die in Virionen befindliche reverse Transkriptase das Virusgenom in cDNA um, von der dann das Indikatorgen „Luciferase" exprimiert wird. Diese Lucifease-Aktivität wird in einem Standard-Test quantitativ bestimmt und zeigt das Maß der Hemmung der HIV-1 RT an.
  • Beispiel 3: Kombinatorisches Verfahren in Lösung zur Herstellung zielspezifisch gerichteter Hexanukleotide
  • Zunächst wird ein 32P-Random-Hexanukleotid-Pool hergestellt, der aus radioaktiv markierten Hexanukleotiden unterschiedlicher Basenzusammensetzung besteht. Anschließend erfolgt die Bindung dieser Hexanukleotide an die Reverse Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1 RT) unter geeigneten Bindungsbedingungen. Nach der Abtrennung nicht-gebundener Hexanukleotide mittels Gelfiltration erfolgt die Freisetzung der HIV-1 RT-gebundenen, zielspezifisch gerichteten Hexanukleotide durch Hitzedenaturierung. Anschließend erfolgt die Synthese eines 3'-Poly-dCTP-Anhangs an die selektionierten, zielspezifisch gerichteten Hexanukleotide mit Hilfe der Terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT). Nach einer Gel-Reinigung der Hexanukleotid-Poly-dC erfolgt eine 5'-Ligation des Primer PA mit Hilfe einer T4-RNA-Ligase. Es erfolgt eine Amplifikation mit dem anchor-Primer PB und den spezifischen Primern PA und PB (PA: 5'-TGCAGGCTCGAGTTAATTAACTGA-3', PB: 5'-TGTATTGCGGCCGCTGATCTAGA-3'). Das so erhaltene Amplifikationsprodukt wird in einen pGEM-T-Vektor kloniert und in JM 109 Zellen transformiert. Durch eine anschließende Sequenzierung der klonierten Hexanukleotide kann die Sequenz der bindungsaktiven, zielspezifisch gerichteten Hexanukleotide festgestellt werden.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (12)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein Hexanukleotid als biologisch wirksamen Bestandteil und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Hexanukleotid zielspezifisch gegen ein proteinartiges Biopolymer gerichtet ist.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Hexanukleotid die Nukleotidsequenz 5'-UCGUGU-3' aufweist.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das proteinartige Biopolymer von endogenem oder exogenem Ursprung ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das proteinartige Biopolymer zelloberflächenständig ist.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das proteinartige Biopolymer von viralem Ursprung ist.
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das proteinartige Biopolymer die Reverse Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 ist.
  7. Verfahren zur Herstellung eines gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichteten Hexanukleotids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, umfassend die Schritte (a) des Bereitstellens eines ersten Systems, welches n unterschiedliche Sätze von Hexanukleotiden umfaßt, wobei (i) jeder Satz ein oder mehrere Hexanukleotide mit gleicher Nukleotidsequenz enthält, (ii) sich jeder Satz vom anderen durch die unterschiedliche Nukleotidsequenz der Hexanukleotide unterscheidet und (iii) n eine ganze Zahl von 2 bis 4096 ist, (b) des Bereitstellens eines zweiten Systems, welches mindestens das proteinartige Biopolymer umfaßt, und (c) des Inkontaktbringens des ersten Systems mit dem zweiten System unter Bedingungen, welche eine zielspezifische Bindung eines Hexanukleotids an das proteinartige Biopolymer unter Bildung eines Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes ermöglichen.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, welches nach Schritt (c) weiter den Schritt (d) des Identifizierens des zielspezifisch gebundenen Hexanukleotids durch Isolieren des Hexanukleotid/Biopolymer-Komplexes von nicht gebundenen Hexanukleotiden und nach der Abtrennung von dem Biopolymer durch Bestimmen der Nukleotidsequenz des gegen das proteinartige Biopolymer zielspezifisch gerichteten Hexanukleotids umfaßt.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das erste System ein Träger für eine systematische Anordnung potentieller Wirkstoffe mit 4096 unterschiedlichen Sätzen ist und das proteinartige Biopolymer mindestens an eine detektierbare Markierung gekoppelt ist.
  10. Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierten Hexanukleotids zur Behandlung oder Vorbeugung viraler Infektionen bei Säugern.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die virale Infektion eine Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 ist.
  12. Kit, enthaltend mindestens ein gegen ein proteinartiges Biopolymer zielspezifisch gerichtetes Hexanukleotid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, zur Reduzierung oder im wesentlichen vollständigen Hemmung der biologischen Aktivität des proteinartigen Biopolymers.
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