CZ301488B6 - Použití imunostimulacních nukleových kyselin - Google Patents

Použití imunostimulacních nukleových kyselin Download PDF

Info

Publication number
CZ301488B6
CZ301488B6 CZ20021050A CZ20021050A CZ301488B6 CZ 301488 B6 CZ301488 B6 CZ 301488B6 CZ 20021050 A CZ20021050 A CZ 20021050A CZ 20021050 A CZ20021050 A CZ 20021050A CZ 301488 B6 CZ301488 B6 CZ 301488B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
rich
seq
immunostimulatory
nucleic acids
Prior art date
Application number
CZ20021050A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20021050A3 (cs
Inventor
M. Krieg@Arthur
Schetter@Christian
Vollmer@Jörg
Original Assignee
University Of Iowa Research Foundation
Coley Pharmaceutical Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27387805&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ301488(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University Of Iowa Research Foundation, Coley Pharmaceutical Gmbh filed Critical University Of Iowa Research Foundation
Publication of CZ20021050A3 publication Critical patent/CZ20021050A3/cs
Publication of CZ301488B6 publication Critical patent/CZ301488B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Rešení se týká použití imunostimulacní nukleové kyseliny bohaté na Py, kde nukleovou kyselinou je nukleová kyselina bohatá na T, která je z více než 60 % tvorená T a obsahuje dinukleotid CpG, pro výrobu léciva pro stimulaci imunitní reakce u jedince jiného než hlodavce.

Description

Použití imunostimuiačních nu Ideových kyselin
Oblast techniky
Vynález se týká použití imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py, kde nukleovou kyselinou je nukleová kyselina bohatá na T, kteráje z více než 60 % tvořená T a obsahuje dinukleotid CpG, pro výrobu léčiva pro stimulaci imunitní reakce u jedince jiného než hlodavce.
io
Dosavadní stav techniky
Bakteriální DNA má imunostimulační účinky na aktivaci B-lymfocytů a NK buněk, aie DNA z obratlovců nikoliv (Tokunaga, T, et al., 1988, Jpn, J. Cancer Res. 79: 682-686: Tokunaga, T. et is al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P. et al, 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; a přehled uvedený v Krieg, 1998, v Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein a A.M. Krieg (ed.),
John Wiley a Sons, lne., New York, NY, str. 431-448). Nyní je známo, že tyto imunomodulační účinky bakteriální DNA jsou důsledkem přítomnosti nemethylovaných CpG dinukleotidů v určitém kontextu bází (CpG motivů), které jsou běžné v bakteriální DNA, nebo které jsou methylova20 né nebo málo přítomné v DNA obratlovců (Krieg et al., 1995, Nátuře 374: 546-549; Krieg, 1999, Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10), Imunostimulační účinky bakteriální DNA mohou být napodobeny syntetickými oligonukleotidy (ODN) obsahujícími tyto CpG motivy. Takové CpG ODN mají vysoce stimulační účinky na lidské a myší leukocyty, indukují proliferaci B-lymfocytů; sekreci cytokinů a imunoglobulinů; lytickou aktivitu NK buněk (přirozených zabíječů) a sek25 reci IFN-γ; a aktivací dendritických buněk (DC) a jiných buněk prezentujících antigen k expresi kostímulačních molekul a sekreci cytokinů, zejména Thl-cytokinů, které jsou významné pro navození Thl-imunitní reakce. Tyto imunostimulační efekty přirozeného fosfodiesterového skeletu CpG ODN jsou vysoce CpG specifické v tom, že tyto účinky v podstatě zrušeny tehdy, když je CpG motiv methylován, změněn na GpC nebo jinak eliminován nebo pozměněn (Krieg et al., 1995, Nátuře 374: 546-549; Hartmann et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 9305-10). Fosfodiesterové CpG ODN mohou být připraveny v lipidech, kamenci nebo jiném vehikulu s depotními vlastnostmi nebo se zlepšeným vychytáváním do buněk, za účelem zlepšení imunostimulačního účinku (Yamamoto et ai., 1994, Microbiol. Immunol. 38: 831-836; Gramzinski et ak, 1998, Mok Med. 4: 104-118).
V dřívějších pokusech se předpokládalo, že imunostimulační CpG motiv má vzorec purin-urinCpG-pyrimidin-pyrimidin (Krieg et ak, 1995, Nátuře 374: 546-549; Pisetsky, 1996, J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et ak, 1998, EMBO J., 17: 6230-6240; Lipford et ak, 1998, Trends in Microbiol. 6: 496-500). Nicméně, nyní je jasné, že myší íymfocyty odpovídají dosti dobře na fosfodiesterové CpG motivy, které nemají tento vzorec (Yi et ak, 1998, J. Immunol, 160: 58985906) a totéž platí pro lidské B-lymfocyty a dendritické buňky (Hartmann et ak, 1999, Proč. Nati, Acad. Sci. USA 96: 9305-10; Liang, 1996, J. Clin. Invest. 98; 1119-1129).
Několik výzkumníků zkoumalo, zda může mít obsah nukleotidů efekty nezávislé na sekvenci
ODN, Bylo zjištěno, že ODN jsou obecně bohaté na GG, CCC, CAC a CG sekvence, zatímco mají nižší obsah TT nebo TTC nukleotidových sekvencí ve srovnání s předpokládaným náhodným využitím kodonů (Smetsers et al., 1996, Antísense Nucleic Acid Drug Develop. 6: 63-67), Toto nabízí možnost, že nadměrně exprimované sekvence mohou obsahovat výhodné cílové elementy pro protismyslné oligonukleotidy a naopak. Jedním důvodem pro vyloučení použití
ODN bohatých na thymidin z pokusů s protismyslnými oligonukleotidy je to, že degradace ODN nukleasami přítomnými v buňkách uvolňuje volný thymidin, který soutěží s 3H-thymidinem, který se často používá v pokusech pro hodnocení buněčné proliferace (Metson et ak, 1992, Antisense Research a Development, 2: 325-330).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká i munosti mutačních nukleových kyselin bohatých na pyrimid i n (bohatých na Py) a v některých provedeních bohatých na thymidin (T), které nevyžadují přítom5 nost CpG motivu. Předkládaný vynález se také částečně týká objevu, že nukleové kyseliny, které obsahuji TG dinukleotidový motiv, jsou také imunostimulační. Vynález je založen částečně na neočekávaném objevu, že sekvence nukleové kyseliny, které obsahují CpG motivy, jsou imunostimulační. Pomocí analýzy imunostimulačních vlastností mnoha sekvencí nukleových kyselin bylo zjištěno, že tyto sekvence mohou být bohaté na Py, bohaté na T nebo že mohou obsahovat io TG motivy. Také bylo zjištěno, že tyto sekvence přednostně aktivují imunitní buňky nepocházející z hlodavců. Sekvence bohaté na Py a TG jsou pouze minimálně imunostimulační pro hlodavci imunitní buňky, ve srovnání s non-hlodavčími imunitními buňkami. Proto je možné pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu indukovat imunitní reakci u non-hlodavců podáním imunostimulačních nukleových kyselin bohatých na Py a nebo TG. Imunostimulační nukleové i? kyseliny bohaté na Py a TG podle předkládaného vynálezu mohou volitelně obsahovat CpG motivy. Tyto objevy mají značný význam pro klinický vývoj imunostimulačních nukleových kyselin obsahujících a neobsahujících CpG.
V jednom aspektu se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího účinné množství izolované imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG a farmaceuticky přijatelný nosič. V jiných aspektech se vynález týká prostředku obsahujícího imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py nebo TG. V jiných provedení může být imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Γ. V ještě jiném provedení může být imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T a také může obsahovat alespoň jeden TG motiv.
Výhodně je nukleová kyselina bohatá na Py nukleová kyselina bohatá na T. V některých provedení je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T poly-T nukleová kyselina obsahující 5' TTTT 3'. V jiném provedení póly T nukleová kyselina obsahuje 5'X|X2TTTTX1X43', kde X], X2, X3 a X.t jsou nukleotidy. V některých provedení je X|X2 TT a/nebo X3X4 je TT. V jiných ;o provedení je X|X2 vybrán ze skupiny skládající se z. TA, TG, TC, AT, ΑΛ, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG a GC; a/nebo je X3X4 vybrán ze skupiny skládající se z TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA, a GC.
Imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T může obsahovat pouze jeden póly T motiv nebo
3? může obsahovat více póly T motivů. V některých provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6, alespoň 7 nebo alespoň 8 T motivů. V jiných provedení obsahuje alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6, alespoň 7 nebo alespoň 8 CpG motivů. Ve výhodném provedení se střídá více póly CpG motivů a póly T motivů.
V ještě jiném provedení obsahuje alespoň jeden zvíce póly T motivů alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6. alespoň 7. alespoň 8 nebo alespoň 9 sousedních T nukleotidovýeh zbytků.
V jiných provedení jsou póly T motivy alespoň 3 a alespoň 3 motivy obsahují alespoň 3 sousední I nukleotidové zbytky nebo jsou póly T motivy alespoň 4 a alespoň 4 motivy obsahují alespoň 3 is sousední T nukleotidové zbytky.
V některých případech imunostimulačních nukleová kyselina bohatá na T neobsahuje póly T motivy, ale místo toho obsahuje více než 25 % T zbytků. V jiných provedení imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T obsahují póly T motivy a také obsahují více než 25 % T zbytků.
Ve výhodném provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T více než 35 % T zbytků, více než 40 % T zbytků, více než 50 % T zbytků, více než 60 % T zbytků, více než 80 % T zbytků nebo více než 90 % T nukleotidovýeh zbytků. V důležitém provedení obsahuje nukleová kyselina alespoň 50 % T zbytků.
Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a TG mohou mít jakoukoliv délku větší než nukleotidů, ale v některých provedeních mohou mít délku mezi 8 a 100 nukleotidovými zbytky.
Ve výhodném provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T alespoň nukleotidů, alespoň 24 nukleotidů, alespoň 27 nukleotidů nebo alespoň 30 nukleotidů.
Ve výhodném provedení obsahuje TG imunostimulační nukleová kyselina 15 až 25 nukleotidů. Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a TG mohou být jednořetězeové nebo dvouřetězeové.
Vjednom výhodném provedení má imunostimulační nukleová kyselina region bohatý na T i (ϊ uimsíčiiy vc středu syč uč Iky (tj. pribiíZuč stejný počet nukleotidu sousedí s regionem bohatým na T na 5' a 3' koncích).
Nukleová kyselina bohatá na T je v některých provedeních vybrána ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241,267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370- 372, !5 393, 433, 471. 479. 486, 491.497. 503, 556-558. 567, 6Q4, 707, 7Q4, 833. 852, 861, 867, 868,
882. 886, 905, 907, 908 a 910-913. V jiných provedení jsou nukleové kyseliny bohaté na T sekvence vybrané ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224. 233, 244, 246, 247, 258~ 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354. 374, 376, 392, 407, 411, 413, 429-432, 434, 435, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692. 693. 804,
862, 883,884, 888, 890 a 891.
V jiných provedení je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nukleová kyselina bohatá na C. Imunostimulační nukleová kyselina bohatá na C je nukleová kyselina obsahující alespoň jeden a výhodně alespoň 2 poly-C regiony, nebo nukleová kyselina obsahující 50 % nebo více C
2? nukleotidů.
Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG mohou obsahovat jeden nebo více CpG motivů. Motivy mohou být methylované nebo nemethylované. V jiných provedení neobsahují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG CpG dinukleotidy.
V jiných provedení obsahují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG také poly-A. póly G a/nebo póly C motivy. V ještě jiném provedení neobsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG dvě póly C sekvence alespoň 3 sousedních C nukleotidových zbytků nebo neobsahuje póly A sekvence s alespoň 3 sousedními A nukleotidovými zbytky.
V jiných provedení imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG obsahuje více než 25 % C nukleotidů nebo více než 25 % A nukleotidů. V ještě jiném provedení imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG neobsahuje poly-C sekvence, póly- G sekvence nebo poly-A sekvence.
tu Póly G nukleová kyselina je v některých provedení vybrána ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476. 531, 557 559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936, a 938. V jiných provedení obsahuje póly G nukleová kyselina sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315. 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527,
535, 554, 565, 609, 628, 660, 661,662, 725, 825. 856. 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 a 937.
V jiném aspektu vynálezu mohou být imunostimulační nukleové kyseliny definovány jako kyseliny obsahující IG motiv a takové kyseliny jsou zde označovány jako TG imunostimulační nukleové kyseliny. TG nukleová kyselina vjednom provedení obsahuje alespoň jeden TG dinuk50 leotid mající sekvenci následujícího vzorce: 5’NiXiTGX2N23'. V podobném provedení je N( nukleová kyselina sekvence složené z mnoha nukleotidů v rozmezí od (11-N>) do (21-N>) aN> je nukleová kyselina sekvence složené z mnoha nukleotidů v rozmezí od (11-Ni) do (21—Nj).
V příbuzném provedení je X? thymidin.
-3CZ 3014X8 B6
V jiných provedení má TG nukleová kyselina alespoň následující vzorec: 5' X|X2TGX2 3'. V ještě jiném provedení TG nukleová kyselina obsahuje následující sekvenci: 5'N|XiXfTGX4N23'.
V příbuzném provedení je Ni sekvence nukleové kyseliny složená z mnoha nukleotidů v rozmezí od (9-Nj) do (19-Ni) a N2 je sekvence nukleové kyseliny složená z mnoha nukleotidů v rozmezí od (9-NJ do (19—Ni). V jednom výhodném provedení je X3 thymidin. X|X2jsou nukleotidy, které mohou být vybrány ze skupiny skládající se z GT, GG, GA, A A, AT, AG, CT, CA, CG. I A a TT, a X2X4 jsou nukleotidy, které mohou být vybrány ze skupiny skládající se z TT, CT, AT, AG, CG. TC, AC, CC, TA, AA a CA. V některých výhodných provedeních je X3 thymidin.
V důležitém provedení jsou XiX4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující TT, TC, TA a TG. id V jiných provedeních jsou X|X2 GA nebo GT a X2X4 jsou TT. V ještě jiných provedeních jsou
X, nebo X2 nebo oba puriny a X. nebo X4 jsou pyrimidiny nebojsou X]X2 GpA a Xi nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny. V jednom provedení je X2 T a X2 je pyrimidin.
V jednom provedení je 5'X|X2TGX2X43f sekvence TG nukleové kyseliny nebo celá délka nebo is nějaký fragment TG nukleové kyseliny nepalindromická sekvence, a v jiných provedeních se jedná o palindromickou sekvenci.
V některých výhodných provedeních je TG nukleová kyselina také bohatá na T.
Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na TG a Py mají v některých provedeních nukleotidový skelet, který obsahuje alespoň jednu modifikaci, jako je fosforothioátová modifikace. Nukleotidový skelet může být chimérický neboje výhodně nukleotidový skelet zcela modifikovaný. Ve výhodném provedení má imunostimulační nukleová kyselina póly T motiv a fosforothioátový skelet.
Jiným aspektem vynálezu je přípravek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu, ve formě nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG, a antigen. kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy,
Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek obsahující imunostimulační nukleové kyselinu bohatou na Py nebo TG a antimikrobiální činidlo, kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy. Výhodně je antimikrobiální činidlo vybráno ze skupiny zahrnující antivirová činidla, ant i parazitární činidla, antibakteriáln i činidla a antimykotická činidla.
Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek s prodlouženým uvolňováním obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py a/nebo TG, kde nukleová kyselina bohatá na Py a/nebo TG neobsahuje nemethylované CpG motivy.
Vynález také poskytuje nutriční doplňky obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py a/nebo TG a přepravní vehikulum vybrané ze skupiny zahrnující kapsle, pilulky a sublinguální tablety, kde nukleová kyselina bohatá na Py a/nebo TG neobsahuje nemethylované CpG motivy.
Je třeba si uvědomit, že když je žádoucí podat oligonukleotid bohatý na Py, například poly-F oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na T, C nebo TG oligonukleotid, tak může být také žádoucí podat oligonukleotid bohatý na Py nebo TG oligonukleotid současně s fyzikálně separovaným CpG oligonukleotidem, TG oligonukleotidem nebo oligonukleotidem bohatým na Py. Alternativně může být CpG, TG motiv nebo motiv bohatý na Py přítomen ve stejné kontinuální
5o nukleové kyselině jako TG oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na Py. V ještě dalších provedeních mohou být všechny nebo některé kombinace TG a CpG nukleových kyselin a nukleových kyselin bohatých na Py podány současně buď na jednotlivých nukleových kyselinách, něho na stejné molekule nukleové kyseliny. Současným podáním je míněno podání v dostatečně krátkém časovém odstupu pro dosažení kombinovaného účinku obou oligonukleotidů, kde tento úči.4nek je výhodně větší než účinek dosažený při podání každého oligonukleotidu samostatně ve stejné dávce.
CpG oligonukleotidy mají obecně vzorec 5'X|X2CGtX43', kde X), X2, X; a X4 jsou nukleotidy a kde alespoň C z CpG je nemethylovaný. Výhodně mají CpG oligonukleotidy délku 8-100 nukleotidů a mají modifikované skelety konkrétně struktury jsou uvedeny v publikovaných PCT přihláškách, US přihláškách a citovaných odkazech, jejichž objevy jsou zde uvedeny ve své úplnosti, V jednom provedení neobsahuje CpG oligonukleotid póly T a TG motivy a není bohatý’ na T.
II)
V jiných provedeních má CpG oligonukleotid sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze STQ ID NO: 1,3,4, 14 -16. 18-24,28,29,33-46,49.50,52-56,58,64^67, 69,71,72,76-87,90,91, 93, 94, 96, 98, 102-124. 126-128, 131-133. 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224. 227-240, 242-256, 258, 260-265, 27015 273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-3(2, 314-317, 320-327,
329. 335, 337-341. 343-352, 354, 357. 361-365. 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 401-404, 406-426, 429, 429 433. 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-156, 460^164, 466-469, 472-175, 477, 478, 480, 483^185. 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615. 617, 619-622, 625 646, 648-650. 653-664, 6662ϋ 697, 699-706, 708, 709, 711-716. 718-732. 736, 737, 739-744, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790, 792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 81X, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877. 879-881, 883-885, 888-904 a 909-913.
V jiném provedení neobsahuje oligonukleotid bohatý na Py nebo TG CpG motivy. Toto provede25 ní také zahrnuje farmaceutické prostředky a kity, které obsahují jako CpG oligonukleotid (který’ nemusí obsahovat póly T a TG motivy a nemusí být bohatý na T) a oligonukleotid bohatý na Py a/nebo TG oligonukleotid fyzikálně separovaný od CpG oligonukleotidu. Farmaceutické přípravky jsou v účinném množství a obvykle obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče, jak jsou uvedeny dále pro oligonukleotidy bohaté na Py a pro TG oligonukleotidy. Kity obsahují alespoň jeden zásobník obsahující oligonukleotid, kterým je bohatý na Py nebo TG oligonukleotid (nebo některé jejich kombinace). Stejný zásobník, nebo v jiném provedení druhý zásobník, může obsahovat oligonukleotid s CpG motivem, který nemusí obsahovat motivy bohaté na Py a/nebo TG motivy. Kit také obsahuje návod pro podání oligonukleotidu jedinci. Kity mohou také obsahovat zásobník obsahující rozpouštědlo nebo ředidlo.
Nakonec, jak je zde uvedeno, CpG oligonukleotid fyzikálně separovaný od oligonukleotidu bohatého na Py nebo od TG oligonukleotidu muže být použit společně s oligonukleotidy bohatými na Py nebo TG oligonukleotidy ve způsobech, prostředcích a produktech popsaných výše.
V jiných aspektech muže být, že imunostimulační oligonukleotidu majících chimérické skelety ve kterých nemusí být přítomen CpG motiv. Vynález je částečné založen na objevu, že sekvence nukleové kyseliny, které neobsahují CpG motivy, jsou i munosti mu lační, a dále na objevu, že sekvence s chimérickými skelety měly neočekávaně zlepšené imunostimulační vlastnosti. Proto se v jednom aspektu vynález týká oligonukleotidu majícího vzorec: 5' Y|NiZN2Y23', kde Y| a Y2 jsou, nezávisle, molekuly nukleové kyseliny tvořené I až 10 nukleotidy, kde Yi obsahuje alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu a Y2 obsahuje alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu a kde Ni a Nejsou molekuly nukleové kyseliny, které jsou - nezávisle - tvořeny o až 5 nukleotidy, ale kde N|ZN2 má celkem alespoň 6 nukleotidů a kde nukleotidy, aie kde N]ZN2 má celkem alespoň 6 nukleotidů a kde nukleotidy N|ZN2 mají fosfod i esterový skelet, a kde Z je motiv imunostimulační nukleové kyseliny neobsahující CG. V jednom provedení je Z sekvence nukleové kyseliny vybraná ze skupiny zahrnující TTTT, TG a sekvence, kde alespoň 50 % bází sekvence jsou T.
V některých provedeních mají Y] a/nebo Y2 délku mezi 3 a 8 nukleotidy. V jiných provedeních jsou Yi a/nebo Y2 složeny z alespoň 3 G, alespoň 4 G, alespoň 7 G nebo pouze z G. V jiných pro- 5 CZ5U14S8 B6 vedeních jsou Y] a/nebo Y2 vybrány ze skupiny zahrnující TCGTCG, TCGTCGT a TCGTCGTT (SEW ID NO: 1145). Vještě jiných provedeních Y] a/nebo Y2 obsahují alespoň jednu, dvě, tři. čtyři nebo pět poly-A, poty T nebo poly-C sekvencí.
Centrální nukleotidy (N|ZN2) vzorce Y|N]ZN2Y2 mají fosfodiesterové internukleotidové vazby a V, a Yi mají alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu. V některých provedeních mají Y, a/nebo Y2 mají alespoň dvě modifikované internukleotidové vazby. V jiných provedení mají Y| a Y2 mezi dvěma a pěti modifikovanými internukleotidovými vazbami. Vještě jiných provedeních obsahuje Y| dvě modifikované internukleotidové vazby a Y2 obsahuje pět módi lito kovaných intemukleotidových vazeb nebo obsahuje Y| pět modifikovaných intemukleotidových vazeb a Y2 obsahuje dvě modifikované internukleotidové vazby. Modifikovanou internukleotidovou vazbou je v některých provedeních ťosforothioátová modifikovaná vazba, ťosforodithioátová modifikovaná vazba nebo p-ethoxy modifikovaná vazba.
Části vzorce YtN|ZN2Y2 mohou volitelně tvořit palindrom. Tak tvoří v některých provedeních nukleotidy N|ZN2 palindrom. V některých provedeních není palindrom přímá repetitivní sekvence. V jiných provedeních nukleotidy NiZN2 netvoří palindrom.
V jiných provedeních má N|ZN2 sekvenci nukleotidů vybranou ze skupiny zahrnují:
2o GAífn ATCGIC (SEQ ID NG: 1098), TCGATTTTCGA (SEQ ID NO: 1099); TCATTTTATGA (SEQ ID NO: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101): TCATTTTATGA (SEQ ID NO: 1102); ACGTTTTTTCGT (SEQ ID NO: 1103); TCGTTTTTCGA (SEQ ID NO: 1104); TCGATTTTTACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTCGTT (SEQ ID NO: 1106); rCGTTTTn AACGA (SEQ ID NO: 1107); ACGTTTTTTTCGT (SEQ ID NO: 1108); GATTT25 TTATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACGATTTTTCGTC (SEQ ID NO: 1010); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GATTTTTACGTC (SEQ ID NO: 1112); A ϊ I 1ATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGATTTTTCGTT(SEQ IDNO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115) TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119); GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID NO: 1121); TCATGTATGA (SEQ ID NO: 1122); GTGTTCGAC (SEQ ID NO: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID NO: 1124); ACGTGTACGT (SEQ ID NO: 1125); TCGTGTACGA (SEQ ID NO: 1126); TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO: 1128); TCGTGTTAACGA (SEQ ID NO: 1129); ACGTGTTAGT (SEQ ID NO: 1130); GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 1131);
GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134); ATGATCGT (SEQ ID NO: 1135); AACGATGTCG1T (SEQ ID NO: 1136); TCACTGGTGA (SEQ IDNO: 1137); TCGTATGA (SEQ ID NO: 1138); ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1140); a ACGATGTCGT (SEQ ID NO: 1141).
41)
Prostředek může volitelně obsahovat farmaceutický nosič a/nebo může být připraven v přepravním prostředku. V některých provedeních je přepravní prostředek vybrán ze skupiny zahrnující kationtové lipidy, proteiny pronikající do buněk a prostředky se zpomaleným uvolňováním,
V jednom výhodném provedení je prostředkem biodegradovatelný polymer. V jiném provedení je prostředkem s prodlouženým uvolňováním mikročástice.
Jiným aspektem vynálezu je prostředek obsahující imunostimulační oligonukleotid vzorce Y]N|ZN2Y2 a antigen.
Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek obsahující oligonukleotid vzorce Y|N|Z/N2Y? a antimikrobiální činidlo, kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy. Výhodně je antimikrobiální činidlo vybráno ze skupiny zahrnující antivirová činidla, antiparazitární činidla, antibakteriální činidla a antimykotická činidla.
Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek s prodlouženým uvolňováním obsahující oligonukleotid vzorce YtNiZN2Y2.
Vynález také poskytuje nutriční doplňky obsahující oligonukleotid vzorce YiN]ZN2Y2 v přeprav5 ním vehikulu vybraném ze skupiny zahrnující kapsle, pilulky a sublínguální tablety.
V některých provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny obsahující nemethylovaný CG dinukleotid, TG dinukleotid nebo sekvenci bohatou na Py zcela fosfodiesterový skelet a v jiných provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny obsahující nemethylovaný CG dinukleotid.
T/’ j _..l......1., n,, ,
VI UIIIUMWLIU tivuv OVř<VV1IVI uvmauju na i j 11IUU11 ιηυ v íiiij, mvivi, rtLvij inuzs, v vmilvuiv uvjuiivvat vazby vybrané ze skupiny zahrnující fosforothioátové, fosforodithioátové a p-ethoxy vazby.
V jednom provedení má imunostimulační nukleová kyselina obsahující nemethylovaný CG dinukleotid vzorec obsahující: 5'X]X2CGX3X43', kde Xi, X2, X3 a X4 jsou nukleotidy. V jiných provedeních obsahuje imunostimulační sekvence nukleové kyseliny alespoň jednu sekvenci následujícího vzorce: 5' TCNT XiX2CGX3Xt3', kde N je sekvence nukleové kyseliny složená z od přibližně 0 do 25 nukleotidů, kde alespoň jeden nukleotid má modifikovanou intemukleotidovou vazbu, a kde nukleová kyselina má 100 nebo méně nukleotidů. V některých provedeních jsou X[X2 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: GT, GT, GA a A A, a X3X4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TT, CT nebo GT. Ve výhodném provedení jsou X|X? GA a X3X4 jsou TT.
V jiném provedení obsahuje sekvence imunostimulační nukleové kyseliny obsahující CG dinukleotid alespoň jednu z následujících sekvencí: ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No. 15); 1CCAIG fCGGTCCTGCTCAT (SEQ ÍD No. 32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT ?5 (SEQ ID No.31); ATGGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID No. 18); TCCATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.28); GGGGGG (SEQ ID No. 12); TCCAl GACGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); 1CCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No. 41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID No. 37);
TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID No. 36); TCCATGCCGGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 3); TCCATGACGTTCCTAATGC f (SEQ ID No. 7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID No. 39); TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No. 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID No. 12);
TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 73): TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No, 74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 76); TCCTGTCGTTCCIG FCGTT (SEQ ÍD No. 77); I CC TGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID No. 52); TCCTTGTCGTTCCTGICGTT (SEQ ID No. 121); TCCTGTCGTrnTTGTCGTT (SEQ ID No. 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID No. 120); TCCAIGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No. 81);
to TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID No. 82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 47); TCGTCG ITT TGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 46); TCGTCGTTGTCCTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 49); GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No. 48); TGTCGTTG TCOTIGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No. 51);
a TGTCGTTCjTCGTT (SEQ ÍD No, 85). V jiném provedení je imunostimulační nukleovou kyšelínou obsahující TG sekvenci nebo sekvenci bohatou na Py nukleová kyselina popsaná výše.
Následným řešením mohou byt i farmaceutické prostředky a kity, které obsahují jak oligonuklcotid mající vzorec YiNiZN2Y2, tak CpG oligonukleotid (který může volitelně neobsahovat póly Γ a TG motivy a nemusí být bohatý na Py), kde oligonukleotid bohatý na Py a TG oligonukleotíd jsou fyzikálně separované od oligonukleotidu vzorce Y[NtZN2Y2, Farmaceutické prostředky obsahují účinná množství a obvykle obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou podrobně popsány dále. Kity obsahují alespoň jeden zásobník obsahující oligonukleotid vzorce YiNiZY2N2. Stejný zásobník, nebo v jiných provedeních druhý zásobník, může obsahovat oligo55 nukleotid s CPG motivem, který nemusí obsahovat motivy bohaté na Py a/nebo TG motivy
- 7 ( / 3111488 B6 a/ncbo TG oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na Py (nebo některé jejich kombinace). Kit také obsahuje návod pro podání oligonukleotidů jedinci. Kity mohou také obsahovat zásobník obsahující rozpouštědlo nebo ředidlo.
Jak bylo uvedeno, že být oligonukleotid vzorce Y1N1ZY7N?, který je fyzikálně separovaný od CpG, TG oligonukleotid nebo oligonukleotidu bohatého na Py, může být použit společně s CpG, TG oligonukleotidy nebo oligonukleotidy bohatými na Py ve způsobech, prostředcích a produktech.
io V jiném aspektu se předkládané řešení týká farmaceutického prostředku obsahujícího alespoň dva oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu, kde alespoň dva oligonukleotidy mají různé sekvence, a farmaceuticky přijatelný nosič.
V jiném aspektu řešení poskytuje vakcinační přípravek. Vakcína obsahuje kompozici podle před15 kládaného vynálezu spolu s antigenem.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro stimulaci imunitní reakce. Způsob zahrnuje podání imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG jedinci (ne hlodavci) v množství účinném pro indukci imunitní reakce u jedince. Výhodně je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG podána orálně, lokálně, v prostředku s prodlouženým uvolňováním, slizničně. systémově, parenterálně nebo intramuskulámě. Když je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG podána na povrch sliznice, tak může být podána v množství účinném pro indukci slizniční imunitní reakce nebo systémové imunitní reakce. Ve výhodných provedeních je slizniční povrch vybrán ze skupiny zahrnující orální, nasální. rektální, vaginální a oční sliznici.
V některých provedeních způsob zahrnuje imunizaci jedince antigenem. kde imunitní reakce je specifická pro antigen. Antigen může být kódovaný nukleokyselinovým vektorem, který může být podán jedinci. V některých provedeních je antigen vybrán ze skupiny zahrnující nádorové
3i) antigeny, virové antigeny, bakteriální antigeny, parazitární antigeny a peptidové antigeny.
Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG jsou schopné vyvolat široké spektrum imunitních reakcí, například mohou být tyto imunostimulační nukleové kyseliny použity pro přesměrování Th2 na Thl imunitní odpověď. Nukleové kyseliny bohaté na py a TG mohou být také použity pro aktivaci imunitních buněk, jako jsou leukocyty, dendritické buňky a NK buňky. Aktivace může být provedena in vivo, in vitro nebo ex vivo, tj. pomocí izolace imunitních buněk od jedince, kontaktování imunitních buněk s imunostimulační nukleovou kyselinou bohatou na Py a TG v množství účinném pro aktivaci imunitních buněk a podání aktivovaných imunitních buněk zpět jedinci. V některých provedeních dendritické buňky exprimují nádorový antigen.
to Uendritické buňky mohou být vystaveny působení nádorového antigenů ex vivo.
Imunitní reakce produkovaná nukleovými kyselinami bohatými na Py nebo TG nukleovými kyselinami může také vést k indukci produkce cytokinů, například produkce IL-6, IL-12, IL-18, I NF, IFN-ot a IFN-γ.
V ještě jiném provedení jsou nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG nukleové kyseliny použitelné pro léčbu nádorů. Nukleové kyseliny bohaté na Py a TG jsou také použitelné podle jiných aspektů vynálezu pro prevenci nádorů (například pro redukci rizika vzniku nádorů) u jedince s rizikem vzniku nádor. Nádor může být vybrán ze skupiny zahrnující nádory žlučových cest.
5o prsu, čípku děložního, choriokarcinom, karcinom tlustého střeva, karcinom endometria, žaludku, intraepitelové neoplasie, lymfomy, nádory jater (například malobunččné a nemalobuněčné). melanom, neuroblastomy, nádory dutiny ústní, nádory' vaječníkú, nádory slinivky břišní, nádory prostaty, nádory rekta, sarkomy, nádory štítné žlázy a nádory ledvin, stejně jako jiné karcinomy a sarkomy. V některých významných provedeních je nádor vybrán ze skupiny zahrnující nádory
-řív z. juiíoo no kostí, mozku nebo CNS, nádory pojivové tkáně, nádory jícnu, oka, Hodgkinův lymfom, karcinom hrtanu, karcinomy dutiny ústní, karcinom kůže a karcinom varlat.
Nukieové kyseliny bohaté na Py a TG nukieové kyseliny mohou byt také použity pro zlepšení reaktivity nádorových buněk na protinádorovou terapii, a v tomto případě jsou Py-bohaté nebo TG imunostimulační nukieové kyseliny podány společně s proti nádorovým činidlem. Protinádorovou terapií může být chemoterapie, vakcína (například in vitro aktivované dendritické buňky nebo vakcína obsahující nádorový antigen) nebo terapie na bázi protilátek. Tento poslední uvedený způsob terapie zahrnuje podání protilátky specifické pro buněčný povrchový antigen io nádorové buňky, kdy vzniká imunitní reakce vede k buněčné cytotoxieité zavisie na antigenu (ADCC). V jednom provedení může být protilátka vybrána ze skupiny zahrnující Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2. C225, Oncolym, SMART Ml 95, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior tó, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OVI023, 3622W94, anti -VEGE, Zenapax, MDX-220, MDX-Í47, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-I. CEACIDE,
Pretarget, NovoMAb-G2. TNT, Gliomab-H, GNI-250, EM D 72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egť.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2. MDX-260, ΑΝΛ Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab a ImmuRAIT-CEA.
Tak je v jednom aspektu vynálezu jedinci s nádorem nebo s rizikem vzniku nádoru podána imunostimulační nukleová kyselina a protinádorový lék. V některých provedeních je proti nádorový lék vybrán ze skupiny zahrnující chemoterapeutická činidla, imunoterapeutieká činidla a nádorové vakcíny. Chemoterapeutické činidlo může být vybráno ze skupiny zahrnující methotrexat, vineristin, adriamyein, eisplatinu, chlorethylnitrosomočoviny neobsahující cukr, 5-fluoruraeil, mitomycin C. bleomycin, doxorubicin, dacarbazin, taxol, fragylin, Megiamin GLA, valru25 bicin, carmustain a poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor RAS famesyl transferasy. inhibitor ťarnesyl transferasy, MMP, NTNLY2315I4, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, INP-470, Hyeamtin, Topotecan, PKC412, Valspodar/P8C833, Novantron/Mitroxantron, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BC1M556, C8-682, 9-AC, AG3340, AG3433. Incel/VX-710, VX-853, ZD010Í, 181641, ODN 698, TA 251 ó/Marmistat, BB2516/Marmistat. CDP 845,
42163, PD 183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, F 317, Picibanil/OK-J32, AD 32/Valrubicin,
Metastron/deriváty stroneia, Temodal/Temozolomid, Evacet/liposomální doxorubicin, Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paelitaxel, Xeload/Capecitabin, Furtulon/Doxitluridin, Cyclopax/orální paclitaxel, orální Taxoid, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibitor RAS onkogenu, BMS-182751/orální platinu, UFT (Tegafur/Uraeil),
Ergamisol/Levamisol, Eniluracil/776C85/5FU enhancer, Campto/Levamisol, Camptosar/lrinotecan, Tomudex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribin, Paxex/Paclitaxel, Doxil/liposomální doxorubicin, Caelyx/liposomální doxorubicin, Eludara/Fludarabin, Pbarmorubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZDI839, LU 79553/Bis-Naphtalimid, LU 103793/Dolastain, Caelyx/liposomální doxorubicin, Gemzar/Gemcitabin, ZD 0473/Anormed, YM 116, jódová zrna. CDK4 a CDK2 inhibitory, PARP inhibitory. D4809/Dexifosamid, Ifes/Mesnex/Ifosamid, Vumon/Teniposide. Parapiatin/karboplatina, Platinol/eisplatina, Vepeside/Etoposid, ZD 9331, Taxotere/Doxetaxel, proléčivo guaninarabinosidu, Taxanové analogy, nitrosomočoviny, alky lační činidla, jako je mel fe lan a eyklofosfamid, aminoglutethimid, Asparaginasa, Busulfan, karboplatina, Chlorombieil, Cytarabin HCl. Dactinomycin, Daunorubiein HCl, Estramustin fosfát sodný, Etoposid (VP16-213), Floxuridin,
Fluoruraeil (5-EU), Elutamid, Hydroxymočovina (hydroxykarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolid acetát (analog faktoru uvolňujícího LHRH), Lomustin (CCNU), Mechlorethamin HCl (dusíkatý yperit), Mercaptopurin, Mesna, Mitotan (o.p-DDD), Mitoxantrone HCl, Oktreotid, Plicamycin, Procarbazin HCl, Streptozocin, Tamoxifen-citrát, Thioguanin, Thiotepa, Vinblastin sulfát, Amsacrin (m-AMSA), Azacitidin, Erythropoietin, Hexamethyl50 melamin (HMM), Interleukin 2, Mitoguazon (methyl-GAG; methyl glyoxal bisguanylhydrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoxyeoformycin), Semustin (methyl-CCNU), Teníposid (VM-26) a Vindesinsulfát, ale tento výčet není omezující.
Imunoterapeutieké činidlo může být vybráno ze skupiny zahrnující Ributaxin, Herceptin,
Quadramet, Panorex, IDEC Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART Ml95, ATRAGEN, Ovarex,
-9< / 301488 B6
Bexxar. LDP-03, iortó, MDX-210, MDX11. MDX-22. OV103, 3622W94, anti-GEGF. Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMIJNE-2, MELIMMUNE-1, CEAC1DE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab- H, GN1-25O, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676. Monopharm-C, 4B5, ior egf. r3, ior C5, BABS, anti-FEK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART ID10 Ab, s Smart ABL 364 Ab a ImmuRAIT-CEA. ale tento výčet není vyčerpávající.
Nádorová vakcína může být vybrána ze skupiny zahrnující EGF, Anti-idiotypové nádorové vakcíny, Gp75 antigen, GMK melanomovou vakcínu, MGV-gangliosidovou konjugátovou vakcínu, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, EVax. Stn-KHL theratop, BLP25 (MUC-1), id líposomální idiotypovou vakcínu. Melacine, peptidové antigenní vakcíny, toxin/antigenové vakcíny, vakcíny na bázi MVA, PACIS, BCG vakcíny, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus a ImmuCyst/TheraCys, ale tento výčet není vyčerpávající.
V ještě jiném provedení se způsoby týkají prevence nebo léčby nádorů, a v takových způsobech is jejedincům dále podáván interťeron-ot.
Vynález se v jiných aspektech týká způsobů pro prevenci onemocnění u jedince. Způsob zahrnuje pravidelné podávání imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG jedinci pro navození reaktivity imunitního systému pro prevenci onemocnění u jedince. Příklady onemocnění,
2o které by mohly být preventivně řešeny za použití profylaktické metody podle předkládaného vynálezu, jsou mikrobiální infekce (například sexuálně přenosné nemoci) a anafylaktický šok při potravinových alergiích.
V jiných aspektech se vynález týká způsobu pro indukci vlastní imunitní reakce tak, že se jedinci podá imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG v množství účinném pro aktivaci vlastní imunitní reakce.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci virové nebo retrovirové infekce. V tomto způsobu je jedinci s virovou nebo retrovirovou infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci virové nebo retrovirové infekce. V některých provedeních je virem virus hepatitidy, HIV, hepatitidy B, hepatitidy C, herpes virus nebo papilloma virus.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci bakteriální infekce. V tomto způsobu je jedinci s bakteriální infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci bakteriální infekce.
V některých provedeních je bakteriální infekce způsobena intracelulámími bakteriemi.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci parazitární infekce. V tomto způsobu je jedinci s parazitární infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci parazitární infekce.
V některých provedeních je parazitární infekce způsobena intraeelulámím parazitem, V jiných provedeních je parazitární infekce způsobena non-hclmintickým parazitem.
V některých provedeních je jedincem člověk a v jiných provedeních je jedincem obratlovec jiný než člověk vybraný ze skupiny zahrnující psi, kočky, konč, krávy, prasata, kozy, ryby, opice, kuřata a ovce.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci astmatu, ve kterém jcjcdin50 ei s astmatem nebo s rizikem nebo vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci astmatu. V některých provedeních jc astmatem alergické astma.
- 10V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci alergie, ve kterém je jedinci s alergií nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci alergie.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci imunodeficitu, ve kterém je jedinci s imunodeficitem nebo s rizikem jeho vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci imunodeficitu.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro indukci Thl imunitní reakce, ve kterém je jedinci io podán jakýkoliv z prostředků podie předkládaného vynálezu v umužsíví účinném ρω indukci
Thl imunitní reakce.
V jednom provedení způsobu podle předkládaného vynálezu zahrnují podání oligonukleotidu vzorce 5Ύ|Ν|ΖΝ>Υ23' a imunostimulační nukleové kyseliny obsahující ncmethylovaný CG dinukleotid, TG dinukleotid nebo sekvenci bohatou na T. V tomto provedení je oligonukleotid obsahující 5'YtN|ZN2Y23' podán separované od imunostimulační nukleové kyseliny. V některých provedeních jsou oligonukleotid obsahující 5'Y|NjZN2Y23' a imunostimulační nukleová kyselina podávány v střídavém týdenním protokolu a v jiném provedení jsou oligonukleotid obsahující 5'Y|N|ZN2Y23' a imunostimulační nukleová kyselina podávány v střídavém dvoutý20 denním protokolu.
Vynález poskytuje v jiném aspektu prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a protinádorové činidlo, které jsou zapracovány ve farmaceuticky přijatelném nosiči a které jsou v množství účinném pro léčbu nádoru nebo pro redukci rizika vzniku nádoru. Ve významných provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleovou kyselinu bohatou na T, TG nukleovou kyselinu a nukleovou kyselinu bohatou na C.
Vynález dále poskytuje kit obsahující první zásobník obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a alespoň jeden další zásobník (například druhý zásobník) obsahující protinádorové .w činidlo, a návod k použití. V jednom provedení kit dále obsahuje interferon-ct. který může být samostatně uložen v ještě dalším zásobníku (například třetím zásobníku). V důležitém provedení kit obsahuje vehikulum pro zpomalené uvolňování obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu, a alespoň jeden zásobním pro protinádorové činidlo, a návod k použití uvádějící dobu podání proti nádorového činidla, imunostimulační nukleová kyselina může být vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na Py, TG nukleové kyseliny a CpG nukleové kyseliny, kde CpG nukleová kyselina má nukleotidovou sekvenci obsahující SEQ ID NO: 246.
Vynález dále poskytuje způsob pro prevenci nebo léčbu astmatu nebo alergie, který zahrnuje podání imunostimulační nukleové kyseliny a léku pro astma/alergii v množství účinném pro léčbu nebo prevenci astmatu nebo alergie. V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C.
V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina nukleová kyselina bohatá na T.
V příbuzném provedení má nukleová kyselina bohatá na T nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226. 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 905, 907, 908 a 910-913. V jiném provedení má nukleová kyselina bohatá na T nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 64, 98, 112,
146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244. 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305. 316.
317, 343, 344, 350, 352, 354. 374, 376, 392, 407, 411-413, 429, 432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804. 862, 883, 884, 888, 890 a 891.
V ještě dalším provedení není nukleová kyselina bohatá na T TG nukleová kyselina. V ještě dalším provedení není nukleová kyselina bohatá na T CpG nukleová kyselina.
CZ 301488 Bó
V jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina TG nukleová kyselina. V ještě dalším provedením není TG nukleová kyselina bohatá na T. V ještě dalším provedení není TG nukleová kyselina CpG nukleová kyselina.
V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina CpG nukleová kyselina, kde CpG nukleová kyselina má nukleotidovou sekvenci obsahující SEQ ID NO: 246.
V jiném provedení je lék proti astmatu/alergii vybrán ze skupiny zahrnující inhibitor PDE-4, io bronehodilatátor/β—2 agonista, činidlo otevírající K+ kanál, antagonista VLA4, antagonista neurokinu. inhibitor syntézy ΓΧΑ2, xanthanin, antagonista kyseliny arachidonové, inhibitor 5lipooxygenasy, antagonista thromboxinového A2 recepturu, antagonista tromboxanu Λ2, inhibitor 5-lipox aktivačního proteinu a inhibitor proteasy, například. V některých důležitých provedeních je lékem proti astmatu/alergii bronehodilatátor/[3-2 agonista vybraný ze skupiny is zahrnující salmeterol, salbutamol, terbutalin, D2522/formoterol, fenoterol a orciprenalin.
V jiných provedeních je lék proti astmatu/alergii vybraný ze skupiny zahrnující antihistaminika a. induktory prostaglandinů. Vjednom provedení je antihistaminikum vybrané ze skupiny zahrnující loratidin, cetirizin. buclizin, analogy ceterizinu, fexofenadin, terfenadin, desloratidin, norastemizol, epinastin ebastin, astemizol, levocabastin, azelastin, tranilast, terfenadin. mizolastin, betatastin, CS560 a HSR 609. V jiném provedení je induktorem prostaglandinů S-5751.
V jiných provedeních je lék proti astmatu/alergii vybraný ze skupiny zahrnující steroidy a imunomodulátory. Imunomodulátory mohou být vybrány ze skupiny zahrnující protizánětlivá činidla, antagonisty leukotrienů, 1L4 muteiny, solubilní 1L4 receptory, imunosupresiva a anti—1L4 protilátky, antagonisty IL4, anti—IL—5 protilátky, solubilní 1L-13 receptor-Fc fúzni proteiny, anti-IL9 protilátky, CCR3 antagonisté, CCR5 antagonisté, inhibitory VLA4 a činidla inhibující IgE.
V jednom provedení je činidlem inhibuj ícím IgE anti—IgE.
V jiném provedení je steroid vybrán ze skupiny zahrnující beelomethason, fluticason, triamcinolon a budesonid. V ještě jiném provedení je imunosupresivem tolerizující peptidová vakcína.
Vjednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina podána současně s lekem proti alergii/astmatu. V jiném provedení je jedincem imunokompromitovaný jedinec.
.15
Imunostimulační nukleové kyseliny jsou podány jedinci ve způsobech týkajících se prevence a léčby astmatu/alergie způsobem popsaným pro jiné aspekty vynálezu.
V jiném aspektu vynález poskytuje kit obsahující první zásobník pro imunostimulační nukleovou to kyselinu a alespoň jeden další zásobník (například druhý zásobník) pro lék proti astmatu/alergii, a návod k použití. Imunostimulační nukleové kyseliny použitelné v kitu jsou zde popsané.
V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. V jiném významném provedení kit obsahuje vehikulum se zpomaleným uvolňováním obsahující ímuno45 stimulační nukleovou kyselinu, a alespoň jeden zásobník pro lék proti astmatu/alergii a návod popisující dobu podání léku proti astmatu/alergii. Lék proti astmatu/alergii může být ze skupiny léků proti astmatu/alergii popsaných ve výše uvedených metodách určených pro prevencí nebo léčbu astmatu/alergie.
V ještě jiném aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a lék proti astmatu/alergii, které jsou připraveny ve farmaceuticky přijatelném nosiči a které jsou v množství účinném proti prevenci nebo léčbu imunitní reakce asociované s expozicí mediátoru astmatu nebo alergie. Imunostimulační nukleová kyselina může být vybrána ze skupiny imunostimulačníeh nukleových kyselin popsaných pro výše uvedené metody a prostředky.
V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. Lék proti astmatu/alergii může být ze skupiny léků proti astmatu/alergii popsaných ve výše uvedených metodách určených pro prevenci nebo léčbu astmatu/alergie.
Vješte jiném aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 95-136, SEQ ID NO: 138-152, SEQ ID NO: 154-222, SEQ ID NO: 224-245, SEQ ID NO: 247-261, SEQ ID NO: 263-299, SEQ ID NO; 301, SEQ ID NO: 303—409, SEQ ID NO: 414-420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO; 426947, SEQ ÍD NO: 959-1022, SEQ ID NO: 1024-1093, a farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodní lič jc niiuiiusíiiiiulačiií nuklcuvíi Kyscima ρϊιίΟιιιιιά v piOSířCuKu v uCiiiiičiil íhíiOZmVí. v jčunúin provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro indukci imunitní reakce. V jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro prevenci nebo léčbu nádorů. V ještě jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro prevenci nebo léčbu astmatu/alergie. Vynález také poskytuje kity obsahující jakýkoliv zvýše uvedených přípravků imunostimulačních nukleových kyselin a návod k použití.
V ještě jiném aspektu vynález obsahuje přípravek imunostimulační nukleové kyseliny skládající se v podstatě z: 5'M]TCGTCGTTM?3', kde alespoň jeden zC je nemethylovaný, kde M| je nukleová kyselina obsahující alespoň jeden nukleotid, kde M2 je nukleová kyselina obsahující 0 až 50 nukleotidů a kde imunostimulační nukleová kyselina je tvořena méně než 100 nukleotidy.
V ještě dalších aspektech se vynález týká farmaceutického přípravku imunostimulační nukleové kyseliny obsahující: 5'TCGTCGTT3', kde alespoň jeden z C je nemethylovaný, kde imunostimu25 lační nukleová kyselina obsahuje méně než 100 nukleotidů a ťosťodiesterový skelet, a prostředek s prodlouženým uvolňováním. V některých provedeních je prostředkem s prodlouženým uvolňováním mikročástice, V jiných provedeních prostředek obsahuje antigen.
Každé provedení předkládaného vynálezu může zahrnovat různá další provedení. Proto se predjo pokládá, že každý aspekt vynálezu zahrnuje jakýkoliv element nebo kombinaci elementů,
Přehled obrázků na výkresech
Obr, IA je histogram exprese CD86 (osa y) CD 19+ buňkami po expresi těchto buněk oligonukleotidům uvedeným na ose x v koncentraci 0,15 pml.
Obr. 1B je tabulka s daty z obr. IA.
Obr. IC je histogram exprese CD86 (osa y) CD19+ buňkami po expozici tčehto buněk oligonukleotidům uvedeným na ose x v koncentraci 0,30 pg/ml.
Obr. ID je tabulka s daty z obr. 1C.
Obr. 2 je graf srovnávající schopnosti ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 a ODN 2202 stimulovat proliferací B-lymfocytú v koncentraci z rozmezí od 0,2 gg/ml do 20 Ligml.
Obr. 3 je graf srovnávající schopnosti ODN 218$, ODN 2189, ODN 2190 a ODN 2182 stimulovat proliferací B-lymfocytů v koncentraci v rozmezí od 0.2 gg/rnl do 20 gg/ml.
Obr. 4 je sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů závislou na dávce indukovanou nonCpG ODN. PBMC dárce krve se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 {SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5162
-13ί-λ jU1488 Bb (SEQ [D NO: 1094) a barvily se mAb pro CD 19 (markér B lymfocytů) a CD86 (markér pro aktivaci B lymfocvtú, B7-2). Exprese byly měřeny průtokovou eytometrií.
Obr, 5 je sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů jinou sadou non- CpG ODN. PBMC od 5 jednoho representativního dárce se stimulovaly 0,4 pm/ml, 1,0 pg/ml nebo 10,0 pg/ml následujících ODN, 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO: 913), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5162 (SEQ ID NO: 1094), 5163 (SEQ ID NO: 1095), 5168 (SEQ ID NO: 1096) a 5169 (SEQ ID NO:
1097) a exprese markéru aktivace CD86 (B7-2) na CD19-pozitivnícb B-lymfocytech se měřila průtokovou eytometrií.
Obr. 6 sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů non-CpG ODN 1982 a 2041. PBMC se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO: 225) a 2041 (SEQ ID NO: 282) a aktivace B-lymfocytů (exprese markéru aktivace CD86) se měřila průtokovou eytometrií.
Obr. 7 je sloupcový graf ukazující aktivaci NK buněk indukovanou non-CpG ODN: PBMC dárce krve se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) a barvily se mAb pro CD3 (markér T lymfocytů), C'D56 (markér NK buněk)
2i) a CD69 (časný markér pro aktivaci). Exprese CD69 na CD56-pozitivních NK buňkách byla měřena průtokovou eytometrií.
Obr. 8 je sloupcový graf ukazující zesílení cytotoxicity zprostředkované NK buňkami indukované non-CpG ODN. I.ýza K-562 cílových buněk zprostředkovaná NK buňkami se měřila pomocí inkubace PBMC pres noc s6 pg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058).
Obr. 9 je sloupcový graf ukazující aktivaci NK T-lymfocytů indukovanou non-CpG ODN:
PBMC jednoho representativního dárce krve sc inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN: 2006 w (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433),
2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) po dobu 24 hodin a aktivace NKT buněk se měřila průtokovou eytometrií po barvení buněk mAb pro CD3 (markér T lymfocytů), CD56 (markér NK buněk) a CD69 (časný markér pro aktivaci).
Obr. 10 je sloupcový graf ukazující stimulaci mytocytů indukovanou různými CpG a non-CpG
ODN. PBMC se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ
ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2178 (SEQ ID NO: 428), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911),5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5163 (SEQ ID NO: 1095) a barvily se mAb pro
CD 14 (markér monocytů) a CD80 (B7-1, aktivační markér. Exprese byla měřena průtokovou eytometrií.
Obr. 11 je sloupcový graf ukazující uvolňování TNF<x po kultivaci lidských buněk s non-CpG
ODN. PBMC se kultivovaly po dobu 24 hodin s nebo bez 6 pg/ml uvedených ODN nebo s I pg/ml LPSjako pozitivní kontrolou alNfa se měřil pomocí EL1SA.
Obr. 12 je sloupcový graf ukazující uvolňování IL-ó po kultivaci lidských buněk s non-CpG
ODN, který ukazuje stejný průběh uvolňování jako TNFa. PBMC se kultivovaly s uvedenými
ODN (1 pg/ml) a Ik—6 se měřil v supernatantech pomocí ELIS A.
5l)
Podrobný popis vynálezu
V jednom aspektu se vynález týká objevu, že nukleové kyseliny bohaté na pyrimidiny (Py), zejména thymidin (T), stejně jako nukleové kyseliny obsahující TG dinukleotidové motivy, jsou
- 14účinné ve zprostředkování imunostimulačních účinků. Je známo, že nukleové kyseliny obsahují CpG jsou terapeutické a profylaktícké přípravky, které stimulují imunitní systém k léčbě nádorů, infekčních onemocnění, alergií, astmatu a jiných onemocnění a napomáhají při obraně proti oportunním infekcím po protinádorových chemoterapiích. Silná, ale vyvážená buněčná a humorální imunitní reakce vznikající po stimulaci CpG odráží vlastní obranný systém organismu proti invadujícím patogenům a nádorovým buňkám. CpG sekvence, které jsou relativně vzácné v lidské DNA, jsou často nacházeny v DNA infekčních organismů, jako jsou bakterie. Lidský imunitní systém se vyvinul pro rozpoznávání CpG sekvencí jako velmi časného signálu infekce, a tyto sekvence iniciují okamžitou a účinnou imunitní reakci proti invadujícím patogenům beztoho, že by dochaz-člu k iiCz.advuCíiu rcakcim často pozorovaným a jiných a
Proto mohou nukleové kyseliny obsahující CpG, jejíž účinek spočívá ve vlastních imunitních obraných mechanismech, využívat jedinečnou a přirozenou dráhu pro imunoterapii. Efekty CpG nukleových kyselin na imunomodulaci byly objeveny přcdkladately vynálezu a byly důkladné popsány v souvisejících patentových dokumentech, jako jsou dokumenty: LIS 6 194 388 (patentová přihláška pořadové č.: 08/386063, podaná 2.7. 1995 a související PCT US 95/01570); US 6 207 646 (patentová přihláška pořadové Č.: 08/738652, podaná 30.10.1996); US 6 239 116 (patentová přihláška pořadové č.: 08/960774. podaná 30.10.1997 a související PCT/US97/19791, WO 98/18810); US 6429 199 (patentová přihláška pořadové c.: 09/191170, podaná 13.11. 1998); US 6 214 806 (patentová přihláška pořadové č.: 09/03701, podaná 25.2. 1998 a související PCT/US98/903678); US 6 339 068 (patentová přihláška pořadové č.: 09/082649 podaná 20.5. 1998 a související PCT/US98/10408): US 6 406 705 (patentová přihláška pořadové č.: 09/315193, podaná 03.6. 1999 a související PC 1/US98/04703);
US 6 218 371 (patentová přihláška pořadové ě.: 09/286098. podaná 2.4. 1999 a související 25 PCT/US99/07335); WO 99/56755 (patentová přihláška pořadové ě.; 09/306281, podaná 6. 5.
1999 a související PCT/US99/09863).
Objevy předkládaného vynálezu jsou použitelné na všechny výše popsané použití nukleových kyselin obsahujících CpG, stejnějako na jakékoliv jiné známé použití CpG nukleových kyselin.
Vynález zahrnuje, v jednom aspektu, objev, že nukleové kyseliny bohaté na Py, zejména T, a TG nukleové kyseliny mají imunostimulační vlastnosti podobné jako mají CpG oligonukleotidy bez ohledu na to, zda je přítomen CpG motiv. Proto je vynález použitelný pro jakýkoliv způsob stimulace imunitního systému za použití nukleových kyselin bohatých na Py nebo TG nukleových kyselin. Překvapivě bylo zjištěno, že chimérické oligonukleotidy neobsahující CpG motiv jsou imunostimulační a mají mnohé pro fy faktické a terapeutické aktivity vlastní CpG oligonukleotidům.
Nukleová kyselina bohatá na Py je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T nebo C. V některých provedeních jsou výhodné nukleové kyseliny bohaté na T. Nukleová kyselina bohatá oligonukleotid č. 2006 (SEQ ID NO: 246). Jedním z nejvíce imunostimulačních oligonukleotidů bohatých na T podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina složená zcela z T nukleotidů, jako je oligonukleotid č. 2183 (SEQ ID NO: 433). Jiné nukleové kyseliny bohaté na T podle předkládaného vynálezu obsahují více než 25 % T nukleotidů, ale kyselinách bohatých na T mohou být T nukleotidy separovány od sebe jinými typy nukleotidových zbytků, tj. G, C a A.
V některých provedeních obsahuje nukleová kyselina bohatá na T více než 35, 40, 50, 60, 70. 80, 90 a 99 % T nukleotidů nebo jakékoliv procento mezi uvedenými hodnotami. Výhodně obsahují nukleové kyseliny bohaté na T alespoň jednu póly T sekvenci a více než 25 % T nukleotidů.
Podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že obsah T v ODN má dramatický vliv na imuno50 stimulační účiny ODN a že ODN bohaté na T mohou aktivovat více typů lidských imunitních buněk za absence jakýchkoliv CpG motivů. Oligonukleotid mající 3' poly-T region a 2 5' CG, například ODN 2181 (SEQ ID NO: 431) jc vysoce imunostimulační. Oligonukleotid podobné délky, ODN 2116 (SEQ ID NO: 357), který obsahuje dva CG dinukleotidy na 5' konci a poly-C region na 3' konci, byl také imunogenní, ale méně než oligonukleotid bohatý na T, když bylo provedeno srovnání za standardních podmínek. Ačkoliv mají Caf téměř stejnou strukturu, jsou
- 15CZ 301488 B6 jejich efekty na imunostimulační vlastnosti ODN různé. Oba mohou indukovat imunitní reakci, ale různě silnou. Tak jsou oligonukleotidy bohaté na T i oligonukleotidy bohaté na C použitelné podle předkládaného vynálezu, ale výhodnější jsou oligonukleotidy bohaté na T. Dále, jako je O, A nebo C, tak jsou redukovány imunostimulační účinky (ODN č. 2188 (STQ ID NO: 905), 2190 (SEQ ID NO: 907),2191 (SEQ ID NO: 908) a 2193 (SEQ ID NO: 910)).
Nukleová kyselina bohatá na C je nukleová kyselina, která obsahuje alespoň jeden nebo lépe alespoň dva póly C regiony nebo která obsahuje alespoň 50 % C nukleotidů. Poly-C region je region tvořený alespoň čtyřmi T zbytky v řadě. Poly-C regionem je například 5'CCCC3'. io V některých provedeních je výhodné, aby měl například 5'CCCC3'. V některých provedeních je výhodné, aby měl poly-C podle předkládaného vynálezu obsahující více než 50 % C nukleotidů, ale neobsahují nutně póly C sekvence. V těchto nukleových kyselinách bohatých na C mohou být
C nukleotidy separovány od sebe jinými typy nukleotidových zbytků, tj. G, T a A. V některých provedeních obsahuje nukleová kyselina bohatá na C více než 60, 70, 80, 90 a 99 % C nukleotidů nebo jakékoliv procento mezi uvedenými hodnotami. Výhodně obsahují nukleové kyseliny bohaté na C alespoň jednu póly C sekvenci a více než 50 % C nukleotidů, a v některých provedeních jsou také bohaté na T.
Jak je uvedeno v příkladech, v několika ODN, o kterých se dříve soudilo, že nejsou imunostimu20 lační, včetně dvou ODN SEQ ID NO: 225 a SEQ ID NO: 282, o kterých bylo dříve uváděno, že nejsou imunostimulační a které se používaly jako kontrolní ODN (Takahashi, T. ct al., 2000, J. Immunol. 164: 4458), bylo zjištěno, že jsou imunostimulační. Naše pokusy prokázaly, že tyto ODN mohou stimulovat B lymfocyty, ačkoliv při vyšších koncentracích ve srovnání s CpG ODN (obr. 6). Dlouhý polvl ODN (30 mer) indukoval, alespoň v některých pokusech, srovna25 tělně silnou aktivaci B-lymfocytů ve srovnání s jedním z nejsilnějšíeh CpG ODN aktivátorů Blymťocytů. Tyto pokusy také ukázaly překvapivé zjištění, že i poly-C ODN mohou stimulovat B-lymfocyty.
Nicméně, imunostimulační těmito ODN nebyla omezena na B-lymfocyty. Různé pokusy jasně prokázaly, že takovými non-CpG ODN mohou být aktivovány monocyty, NK buňky a i NKTlymfocyty (obr. 7-10). Oproti poly-T a poly-C sekvencím nebylo při použití póly-.A sekvencí dosaženo imunostimulace (alespoň pro monocyty, B-lymfocyty a NK buňky). Je zajímavé, že bylo zjištěno, že vložení CpG motivu do SEQ ID NO: 225 zesiluje imunostimulační aktivitu, zatímco prodloužení poly-T řetězcem nikoliv. l oto naznačuje, že CpG ODN a ODN bohaté na T mohou účinkovat různými způsoby nebo dráhami. Je také možné, že inserce poly-T motivů do různých pozic SEQ ID NO: 225 může způsobit změnu imunostimulačních vlastností.
Termíny „TG nukleová kyselina“ nebo „TG imunostimulační nukleová kyselina, jak jsou zde použity, označují nuklcovou kyselinu obsahující alespoň jeden TpG dinukleotid (thymidinguanin dinukleotidovou sekvenci, tj. „TG DNA nebo DNA obsahující 5' thymidin a potom 3' guanosin. které jsou vázané fosfátovou vazbou), která aktivuje složku imunitního systému.
V jednom provedení vynález poskytuje TG nukleovou kyselinu vzorce:
5'NiX|TGX2N23' kde Xi a X2 jsou nukleotidy a N je jakýkoliv nukleotid a Ni a N? jsou sekvence nukleové kyseliny složené /jakéhokoliv počtu N, s podmínkou, že celkový součet N, a N-> je v rozmezí od 11 do 21. Například, pokud je Ni 5, tak může být N2 6 (celková délka oligonukleotidu je potom 15 nukleotidů). TG mohou být umístěny kdekoliv v oligonukleotidovém řetězci, včetně 5' konce, centra a 3' konce. Tak může být N, 0-21, včetně s podmínkou, že N? je vybrán tak. aby součet Ni a N> byl 11 až 21, včetně. Obdobně může být N2 0- 21. včetně, s podmínkou, že N] je vybrán tak, aby součet N| a N2 byl 11 až 21. včetně. V některých provedeních je X, adenin, guanin nebo thymidin a X2 je cytosin. adenin nebo thymin. V jiných provedeních je X2 thymidin. V jiných
- 16 ΐ-'ν provedeních je X| cytosin a/nebo X? thymidin. V jiných provedeních je X| cytosin a/nebo X2 guanin. V jiných provedeních, která jsou popsána dále, může nukleová kyselina obsahovat jiné motivy, pokud je tak dlouhá, aby to bylo možné.
V jiném provedení vynález poskytuje TG nukleovou kyselinu vzorce:
5'N,XiX2TGX3X4N23' kde X], X2, X3 a X4 jsou nukleotidy. V některých provedeních jsou XiX2 nukleotidy vybrané ze ío skupiny zahrnující: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, TpA a TpT, a X3X4 jsou nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA a CpA; N je jakýkoliv nukleotid a Ni a N2 jsou sekvence nukleové kyseliny složené z jakéhokoliv počtu nukleotidů, s podmínkou, že celkový součet Ni a N2 je v rozmezí od 9 do 19. V některých provedeních jsou X]X2 GpA a ΧΛΧ4 jsou TpT. V jiných provedeních jsou Xt nebo X2 nebo oba puriny a X5 nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny, nebojsou XjX2 GpA a X2, nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny, nebojsou X,X2 GpA a X2 nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny. V jednom výhodném provedení jsou X3X4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TpT, TpC a TpA.
Imunostimulaění nukleová kyselina může mít jakoukoliv velikost (tj. délku), pokud je tvořena alespoň 4 nukleotidy. V důležitých provedeních mají imunostimulaění nukleové kyseliny délku 6 až 100 nukleotidů. V ještě jiných provedeních je délka v rozmezí od 8 do 35 nukleotidů. Výhodně mají TG oligonukleotidy velikost od 15 do 25 nukleotidů.
Velikost (tj. počet nukleotidových zbytků v nukleové kyselině) imunostimulaění nukleové kyseli>5 ny může také přispívat k stimulační aktivitě nukleové kyseliny. Bylo zjištěno, že i pro vysoce imunostimulaění nukleové kyseliny ovlivňuje délku nukleové kyseliny rozsah imunostimulaee, který může být dosažen. Bylo prokázáno, že se zvyšováním délky nukleové kyseliny bohaté na T až na 24 nukleotidů se zvyšuje imunostimulaee. Pokusy prezentované v příkladech demonstrují, že když se délka nukleové kyseliny bohaté na T zvyšuje od 18 do 27 nukleotidů, tak se významně zvyšuje schopnost nukleové kyseliny stimulovat imunitní reakci (srovnej ODN 2194, 2183. 2195 a 2196), které mají zmenšující se velikost od 27 do 18 nukleotidů). Zvyšují se délka nukleové kyseliny až do 30 nukleotidů má dramatický vliv na biologické vlastnosti nukleové kyseliny, ale zdá se, že zvyšování délky nad 30 nukleotidů nemá další vliv na imunostimulaění účinek (srovnej ODN 2179 a 2006).
Bylo prokázáno, že TG nukleové kyseliny délky od 15 do 25 nukleotidů mohou mít lepší imunostimulační vlastnosti. Proto v jednom aspektu vynález poskytuje oligonukleotid délky 15-27 nukleotidů (tj. oligonukleotid délky 15, 16, 17. 18. 19. 20,21.22.23, 24, 25, 26, 27 nukleotidů), kterým může být nukleová kyselina bohatá na T nebo TG nukleová kyselina, nebo jím může být
-ío TG nukleová kyselina bohatá na T. V jednom provedení není oligonukleotid nukleová kyselina bohatá na T ani TG nukleová kyselina. V jiných provedeních neobsahuje oligonukleotid CG motiv. Vynález také poskytuje oligonukleotidy délky 15 až 27 nukleotidů, oligonukleotidy délky 18 až 25 nukleotidů, oligonukleotidy délky 20 až 23 nukleotidů a oligonukleotidy délky 23 až 25 nukleotidů. Jakákoliv výše uvedené provedení týkající se oligonukleotidů délky 15 až 27 nukleo45 tidů a také tkají oligonukleotidů jiných délek. Vynález také zahrnuje použití jakéhokoliv z výše uvedených oligonukleotidů v uvedených způsobech.
Ačkoliv je maximální imunostimulaee dosaženo při použiti některých nukleovych kysel in délky 24 až 30 nukleotidů, stejně jako při použití některých TG nukleovýeh kyselin délky 15 až
25 nukleotidů, mohou být ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity kratší nebo delší imunostimulaění nukleové kyseliny. Pro usnadnění vychytávání v buňkách mají imunostimulaění nukleové kyseliny výhodně minimální délku 6 nukleotidů. Nukleové kyseliny jakékoliv délky větší než 6 nukleotidů (i délky mnoho kb) mohou indukovat imunitní reakci podle předkládaného vynálezu, pokud obsahují dostatečné imunostimulaění motivy, protože větší nukleové kyseliny jsou degradovány v buňkách. Výhodně mají imunostimulační nukleové kyseliny délku 8 až
- 17CZ 301488 B6
100 nukleotidů a v některých provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T délku 24 až 40 nukleotidů a imunostimulační TG nukleové kyseliny mají délku 15 až 25 nukleotidů.
V jednom provedení vynález poskytuje nukleovou kyselinu bohatou na T vzorce:
5rN1X,X2TGX1X4N23' kde X|, X2, X3 a X4 jsou nukleotidy. V jednom provedeních jsou X]X2 TT a/nebo X3X4 jsou TT. ίο V jiném provedení jsou X|X2 vybrány ze skupiny zahrnující následující nukleotidy: TA, TG, TC,
AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC; a X3X4 jsou vybrány ze skupiny zahrnující následující nukleotidy: FA, TG, TC, AT, ΛΑ, AG, AC, CT, CC, CA. GT, GG, GA a GC.
V některých provedeních je výhodné, aby imunostimulační nukleové kyseliny neobsahovaly poly-C (CCCC) nebo poly-A (AAAA). V jiných provedeních je výhodné, aby imunostimulační nukleové kyseliny obsahovaly poly-C, poly-A, poly-G (GGGG) nebo více GG. Zejména poly-G nebo rnnohotné GG motivy mají dramatické vlivy na některé imunostimulační nukleové kyseliny. Vliv těchto non-T sekvencí závisí částečně na stavu skeletu nukleové kyseliny. Například, pokud má nukleová kyselina fosfodiesterový skelet nebo chimérický skelet, tak má zahrnutí těchto sek20 věnci v nukleové kyselině pouze minimální, pokud nějaký, vliv na biologickou aktivitu nukleové kyseliny. Když je skelet zcela fosforothioátový (nebo obsahuje jinou fosfátovou modifikaci) nebo je významně fosforothioátový, tak může použití těchto sekvencí mít větší vliv na biologickou aktivitu nebo kinetiku biologické aktivity, za snížení účinnosti TG imunostimulačních nukleových kyselin nebo nukleových kyselin bohatých na T.
Ačkoliv bylo prokázáno, že nukleové kyseliny bohaté na C mají imunostimulační vlastnosti, může mít inserce poly-C sekvenci do nukleové kyseliny bohaté na T, která redukuje relativní zastoupení T nukleotidů v nukleové kyselině, negativní vliv na nukleovou kyselinu. Ačkoliv se předkladatelé vynálezu nevážou na konkrétní mechanismus, předpokládá se, že si imunitní systém vyvinul mechanismy pro odlišení nukleových kyselin majících jiné nukleotidové vlastnosti, snad vznikající v důsledku jiných sad vazebných proteinů, které rozpoznávají jiné sekvence, nebo specifických vazebných proteinů, které rozpoznávají všechny imunostimulační sekvence, ale sjinými afinitami. Obecně, nejvíce imunostimulační jsou nukleové kyseliny obsahující nemethylované CpG motivy, po nich nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. Nicméně, tato generalizace má mnoho výjimek. Například nukleová kyselina velmi bohatá na T (SEQ ID NO: 886) je v některých testech více imunostimulační než některé nukleové kyseliny obsahující CpG (například fosforothioátová CpG nukleová kyselina obsahující jediný CpG motiv).
•io Také bylo zjištěno, že přidání poly-A koncovky k ůnunostiinulační nukleové kyselině může zesílit aktivitu nukleové kyseliny. Bylo zjištěno, že když se vysoce imunostimulační CpG nukleová kyselina (SEQ ID NO: 246) modifikuje přidáním poly-A koncovky (AAAAAA) nebo poly-T koncovky (TTTTTT), tak má vzniklý oligonukleotid zvýšenou imunostimulační aktivitu. Schopnost poly-A nebo poly-T koncovky zvyšovat imunostimulační vlastnosti oligonukleotidu byla is podobná. SEQ ID NO: 246 je oligonukleotid bohatý na T, Je pravděpodobné, že když se poly-A a poly-T koncovky přidají k nukleové kyselině, která není bohatá na T. budou mít vetší vliv na imunostimulační schopnost nukleové kyseliny, protože když se poly-T koncovka přidá k nukleové kyselině, která je již bohatá na T, tak se imunostimulační vlastnosti adice poly-T koncovky jistým způsobem naředí, i když ne zcela. Toto zjištění má významné důsledky pro použití poly-A
5ii regionů. Proto v některých provedeních obsahují imunostimulační nukleové kyseliny poly-A region a v jiných nikoliv.
Některé imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahují jeden nebo více CG motivů. Přítomnost CG motivů b imunostimulačních nukleových kyselinách také ovliv55 ňuje biologickou aktivitu nukleových kyselin. Pokud je celková délka imunostimulační nukleové
- IS kyseliny 20 nukleotidů nebo méně, tak jsou CpG motivy významné pro určování imunostimulačního účinku nukleové kyseliny, a methylace těchto motivů snižuje imunostimulační účinky nukleové kyseliny. Pokud je délka imunostimulační nukleové kyseliny zvýšena na 24, tak je imunostimulační účinek nukleové kyseliny méně závislý na CpG motivech a není nadále vyrušen methylací CpG motivů nebo jejich inverzí na GC dinukleotidy, s podmínkou, že jsou přítomné jiné zde popsané imunostimulační vlastnosti.
Například, ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) je vysoce imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T délky 24 nukleotidů s čtyřmi CpG dinukleotidy. Nicméně, ODN 2117 (SEQ ID NO: 358), io ve které jsuu CpG motivy iiicuiylovany, jč íakč vysoce iiiiuiiústíriiuíaCiii. ODN 2137 (SEQ ID
NO: 886), ve které jsou CpG motivy ODN2006 invertovány na GpC, a která v důsledku tohoto obsahuje šest TG dinukleotidů, je také imunostimulační, Imunostimulační účinky nukteových kyselin, jako je ODN 2117 a 2137, jsou regulovány jejich obsahem T a TG. Každá z těchto tří nukleových kyselin je bohatá na T a ODN 2137 je také bohatá na TG. Pokud je jejich obsah T snížen insercí jiných bází, jako je A (ODN 2117 SEQ ID NO: 358)) nebo když je jejich obsah TG snížen substitucí TG AG, tak jsou jejich imunostimulační účinky mírně oslabeny. V jiném příkladu má nukleová kyselina délky 24 nukleotidů, ve které jsou všechny pozice náhodné, pouze mírný imunostimulační účinek (ODN 2182 (SEQ ID NO; 432)). Podobně, nukleová kyselina délky 24 nukleotidů s jiným složením nukleotidů má jiné imunostimulační účinky, které závisejí na obsahu T (ODN 2188 (SEQ ID NO: 905)), 2189 (SEQ ID NO: 906), 2190 (SEQ ID NO: 907)), 2191 (SEQ ID NO: 908)), 2193 (SEQ ID NO: 910). 2183 (SEQ ID NO: 433) a 2178 (SEQ ID NO: 428)). ODN 2190, který obsahuje TGT motivy, je více imunostimulační než ODN 2202, který obsahuje TGG motivy. Proto jsou v některých provedeních výhodně TGT motivy. V ještě jiných provedeních je počet TG motivů důležitý v tom, že zvýšený počet TG motivů vede k vyšší imunostimulaci. Některé výhodné IG nuklcovc kyseliny obsahují alespoň 3 TG motivy.
Příklady CpG nukleových kyselin jsou sekvence uvedené v tabulce A, jako je SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14 16. 18-24, 28, 29, 33 46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186,
188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275,
277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335,
337-341, 343-352, 354. 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399,
401 404, 406-426, 429, 433, 434 4.37, 439, 441-145. 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464,
466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483- 485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504 -505, 507-509,
511, 513 -5 29, 5 3 2-541, 5 43-5 5 5 , 564-5 66, 5 68-5 76, 5 7 8, 5 80, 599, 601-605 , 60 7-611, 613615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711 -716, 718732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790, 792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 a 909-913.
V některých provedeních vynálezu imunostimulační nukleové kyseliny obsahují CpG dinukleotidy a vjiných provedeních imunostimulační nukleové kyseliny neobsahují CpG dinukleotidy. CpG dinukleotidy mohou být methylované nebo nemethylované. Nukleová kyselina obsahující alespoň jeden nemethylovaný CpG dinukleotid je nukleová kyselina, která obsahuje nemethylo45 vanou dinukleotidovou sekvenci cytosin-guanin (tj. „CpG DNA“ nebo DNA obsahující nemethylovaný 5' cytosin následovaný 3' guanosinem, kde tyto dva zbytky jsou vázány fosfátovou vazbou) a aktivuje imunitní systém. Nukleová kyselina obsahující alespoň jeden methylovaný CpG dinukleotid je nukleová kyselina, která obsahuje methyiovanou dinukleotidovou sekvenci cytosin-guanin (tj. methylovaný 5' cytosin následovaný 3' guanosinem, kde tyto dva zbyt50 kyjsou vázány fosfátovou vazbou).
Příklad nukleových kyselin bohatých na T, které neobsahují CpG nukleové kyseliny, jsou nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, jako jsou SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267— 269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558.
567, 694, 793, 794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 86, 905, 907, 908 a 910-913. Příklad
- 19CZ 301488 B6 nukleových kyselin bohatých na I, které obsahují CpG nukleové kyseliny, jsou nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, jako jsou SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233,
244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374,
376, 392, 407, 411, 413, 429-432, 434, 435. 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804,
S 862, 883, 884, 888. 890 a 891.
Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být dvouřetězcové nebo jednořetězcové. Obecně, dvouřetězcové molekuly jsou stabilnější Ín vivo, zatímco jednořetězcové nukleové kyseliny mají vyšší imunostimulační aktivitu. Proto je v některých aspektech vynálezu výhodnější, aby byla io nukleová kyselina jednořetězcové, a v jiných aspektech je výhodnější, aby bylaG nukleová kyselina dvou řetězcová.
Termíny nukleová kyselina bohatá na T a TG nukleová kyselina, jak jsou zde použity, označují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a imunostimulační TG nukleové kyseliny, v pří15 slušném pořadí, pokud není uvedeno jinak, Nukleové kyseliny bohaté na T podle předkládaného vynálezu jsou sekvence popsané výše, stejně jako nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, které obsahují alespoň jeden póly T motiv a/nebo obsahují více než 25 %, lépe více než 35 %,
I nukleotidů. Nukleové kyseliny bohaté na C jsou nukleové kyseliny, které obsahují alespoň jeden, výhodně alespoň dva, poly-C regiony. TG nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu zu jsou nukleové kyseliny uvedené výše, stejně jako specifické nukleové kyseliny uvedené v tabulce A. které obsahují alespoň jeden TG motiv.
Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou - ale nemusí - také obsahovat poly-G motiv. Nukleové kyseliny obsahující poly-G jsou také imunostimulační. Různé práce, včetně
2? Pisetsky a Reich, 1993, Mol. Biol. Reports 18:217-221; Krieger a Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem. 63: 601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90: 3745 -3749; Wyatt et al., 1994, PNAS. 91: 1356-1360: Rando a Hogan, 1998, v Applied Antisense Oligonucleotide Technology, vyd. Krieg a Stein. str. 335-352; a Kimura et al., 1994, J. Biochem. 116: 991-994; také popisují imunostimulační vlastnosti póly (i nukleových kyselin.
Poly-G nukleové kyseliny jsou výhodně nukleové kyseliny následujícího vzorce:
5'X,X2GGGX3X43' kde X|, X2, X% X4 jsou nukleotidy. Ve výhodném provedení jsou alespoň jeden z X3 a X4 G. V jiném výhodném provedení je výhodný vzorec 5' GGGNGGG3' nebo 5' GGGNGGGNGGG 3', kde N znamená 0 až 20 nukleotidů. V jiných provedeních neobsahuje póly G nukleová kyselina nemethylované CG dinukleotidy. jako jsou například nukleové kyseliny uvedené dále jako SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288. 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531,
4o 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 a 938. V jiných provedeních obsahuje póly G nukleová kyselina alespoň jeden nemethylovaný CG dinukleotid, jako jsou například nukleové kyseliny uvedené dále jako SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 a 937.
Termíny „nukleová kyselina a „oligonukleotid“ jsou zaměnitelné a označují více nukleotidů (tj. molekul) obsahujících sacharid (například ribosu nebo deoxyribosu) navázaný na fosfátovou skupinu a na nějakou organickou bázi, kterou je buď substituovaný pyrimidin (například cytosin (C), thymidin (T) nebo uráčil (U)), nebo substituovaný purin (například adenin (A) nebo guanin
5(i (G)), Tyto termíny označují jak oligoribonukleotidy, tak oligodeoxyribonukleotidy. Termíny také zahrnují polynukleosidy, (tj. polynukleotid minus fosfát) a jakékoliv jiné organické báze obsahující polymer. Molekuly nukleové kyseliny mohou být získány z existujících zdrojů nukleových kyselin (například genomové nebo cDNA), ale výhodné jsou syntetické (například produkované syntézou nukleových kyselin).
SS
- 20 Termíny nukleová kyselina a oligonukleotid také zahrnují nukleové kyseliny nebo oligonukleotídy se substitucemi nebo modifikacemi, jako jsou substituce nebo modifikace bází a/nebo sacharidů. Například tyto termíny zahrnují nukleové kyseliny se sacharidy skeletu, které jsou kovalentně navázané na organické skupiny s nízkou molekulovou hmotností jiné než hydroxylové skupi5 ny v 3' pozici a jiné než fosfátové skupiny v 5' pozici. Takto modifikované nukleové kyseliny mohou obsahovat 2'-0-alkylované ribosové skupiny. Dále mohou modifikované nukleové kyseliny obsahovat sacharidy, jako je arabinosa, místo ribosy. Tak mohou mít nukleové kyseliny heterogenní složení skeletu a mohou obsahovat jakoukoliv možnou kombinaci polymerových jednotek navázaných na sebe, jak je tomu u peptidových-nukleových kyselin (které mají aminokyseliio nový skeiet s nukieotidovými bázemi). V některých provedeních jsou nukieové kyseliny homogenní ve složení skeletu. Nukleové kyseliny také obsahují substituované puriny apyrimidiny, jakojsou C-5 propinové modifikované báze (Wagneret al., Nátuře Biotechnology 14: 840-844. 1996). Mezi puriny a pyrimidiny patří, například, adenin, cytosin, guanin, thymidin, 5-methylcytosin, 2 aminopurin, 2-amino—6-chlorpurin, 2,6-diaminopurin, hypoxanthin a nesubstituova15 né aromatické skupiny. Jiné takové modifikace jsou dobře známé odborníkům v oboru.
Pro použití v předkládaném vynálezu mohou být nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu syntetizovány de novo za použití jakéhokoliv z mnoha v oboru známých způsobů. Například mohou být použity b-kyanethyl-fosforoamiditová metoda (Beucage, S. L. a Caruthers, Μ. H.
2o Tet. Let. 22: 1859. 1981); nukleosid-H-fosfonátová metoda (garreg et al.. Tet. Let. 27: 4051 — 1054, 1986; Froehleret al., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986; Geregg et al., Tet. Let. 27: 4055 4058, 1986; Gaffney et al., tet. Let. 29: 2619-2622, 1988). Tyto chemické reakce mohou být provedeny za použití různých automatizovaných syntezátorů nukleových kyselin dostupných na trhu. Tyto nukleové kyseliny jsou označovány jako syntetické nukleové kyseliny. Alternativně mohou být dinukleotidy bohaté na T a/nebo TG dinukleotidy produkovány ve velkém rozsahu v píasmidcch (viz Sambrook T. ct al., „Molecular Cloning. A Laboratory Manual·, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 a mohou být separovány do menších částí nebo mohou být aplikovány dohromady. Nukleové kyseliny mohou být připraveny z existujících sekvencí nukleové kyseliny (například genomové nebo cDNA) za použití známých technik, jako jsou techniky využívající restrikčních enzymů, exonukleas nebo endonukleas. Nukleové kyseliny připravené tímto způsobem jsou označovány jako izolované nukleové kyseliny. Izolovaná nukleová kyselina je obecně nukleová kyselina, která je separovaná od složek, se kterými je za normálních okolností asociována. Příkladem izolované nukleové kyseliny je nukleová kyselina, která je separována od buněk, od jádra, od mitochondrií nebo od chromatinu. Termíny nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny označují jak syntetické, tak izolované nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny.
Pro použití in vivo mohou být nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny relativně resistentní na degradaci (např. mohou být stabilizované). „Stabilizovaná molekula nukleové kyse40 1 iny“ označuje molekulu nukleové kyseliny, která je relativně resistentní na degradaci i π vivo (například prostřednictvím exo- nebo endonukleas). Stabilizace může být funkcí délky nebo sekundární struktury. Nukleové kyseliny délky stovek kb jsou relativně resistentní na degradaci in vivo. Pro kratší nukleové kyseliny může jejich sekundární struktura stabilizovat a zvyšovat jejich efekt. Například, pokud je 3' konec nukleové kyseliny komplementární k předešlému regionu, tak se může otočit a vytvořit určitou smyčku, ve které jsou nukleové kyseliny stabilizované a proto aktivnější.
Alternativně může být stabilizace nukleové kyseliny provedena pomocí modifikací fosfátového skeletu. Výhodné stabilizované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mají modifiko50 váný skelet. Bylo prokázáno, že modifikace skeletu nukleové kyseliny zvyšuje aktivitu nukleových kyselin bohatých na Py nebo TG nukleových kyselin, když jsou podány in vivo. Tyto stabilizované struktury jsou výhodné, protože molekuly bohaté na Py a TG molekuly podle předkládaného vynálezu mají alespoň částečně modifikovaný skelet. Konstrukty bohaté na Py a TG konstrukty obsahující fosforothioátové vazby mají maximální aktivitu a chrání nukleové kyseliny před degradací intracelulárními exo- a endo- nukleasami. Mezi další modifikované nukleové
CZ 3(11488 B6 kyseliny patří fcsfodiesterově modifikované nukleové kyseliny, kombinace fosfodiesterových a fosforothioátových nukleových kyselin, methyIfosfonát, methylfosforothioát, fosforodithioát, p-ethoxy a jejich kombinace. Každá z těchto kombinací a jejich konkrétní efekty na buňky imunitního systému jsou popsány konkrétněji pro CpG nukleové kyseliny v PCT publikovaných patentových přihláškách PCT/l JS95/01570 (WO 96/02555) a PCT/US97/197971 (WO 98/18810), které uplatňují prioritu z US pořadové č. 08/386063 a 08/960774, podaných 7. 2. 1995 a 30. 10. 1997, v příslušném pořadí, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy. Předpokládá se, že tyto modifikované nukleové kyseliny mohou vykazovat vyšší stimulační aktivitu v důsledku vyšší resistence na nukleasy, vyššího vychytávání do buněk, vyšší vazby proteinů ío a/nebo pozměněné intracelulární lokalizace.
Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou volitelně být chimérické oligonukleotidy. Chimérické oligonukleotidy jsou oligonukleotid vzorce: 5'YjN|TN2Y23'. Y| a Y> jsou molekuly nukleové kyseliny obsahující mezi 1 a 10 nukleotidy. Y, a Y2 každý obsahují alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu. Protože alespoň dva nukleotidy chimérických oligonukleotidů obsahují modifikace skeletu, jsou tyto nukleové kyseliny příkladem jednoho typu „stabilizovaných imunostimulačních nukleových kyselin.
V souvislosti s chimérickými oligonukleotidy jsou Yi a Y2 nezávislé jeden na druhém. To zname20 ná, že Y, a Yi mohou nebo nemusí mít různé sekvence a různé vazby ve skeletu ve srovnání s ostatními ve stejné molekule. Sekvence jsou různé, ale v některých případech jsou Yi a Y2 poly-G sekvence. Poly-G sekvence obsahují alespoň 3 G v řadě. V jiných provedeních jsou poly-G sekvencemi sekvence obsahující alespoň 4, 5, 6, 7 nebo 8 G v řadě. V jiných provedeních mohou být Y, a Y2 TCGTCG, TCGTCGT nebo TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). Y, a Y2 mohou také obsahovat poly-C, poly-T nebo póly-A sekvence. V jiných provedeních mohou obsahovat Y, a Y2 mezi 3 a 8 nukleotidy.
Ni a Ni jsou molekuly nukleové kyseliny obsahující mezi 0 a 5 nukleotidy tak, aby N|ZN2 obsahoval celkem 6 nukleotidů. Nukleotidy N)ZN2 mají fosfodiesterový skelet a nezahrnují to nukleové kyseliny mající modifikovaný skelet.
Z je imunostimulační nukfeokyselinový motiv, ale nezahrnuje CG. Například může být Z nukleová kyselina bohatá na T, například obsahující TTTT motiv, nebo sekvence, kde alespoň 50 % bází sekvence jsou T, nebo může být z TG sekvence.
Centrální nukleotidy (N|ZN2) vzorce Y| NtZN2Y2 obsahují fosfodiesterové intcmuklcotidové vazby a Yj a Y2 obsahují alespoň jednu, ale i více než jednu nebo i všechny, modifikované internukleotidové vazby. Ve výhodných provedeních obsahují Y, a/nebo Y alespoň dvé nebo dvě až pět modifikovaných intemukleotidových vazeb, nebo obsahuje Y, dvě modifikované intemukleoio tidové vazby a Y2 pět modifikovaných intemukleotidových vazeb, nebo obsahuje Y| pět modifikovaných intemukleotidových vazeb a Y2 dvě modifikované internukleotidové vazby. Modifikovanou internukleotidovou vazbou je v některých provedeních fosforothioátová modifikovaná vazba nebo p-ethoxy modifikovaná vazba.
Modifikované skelety, jako jsou fosforothioáty, mohou být syntetizovány za použití automatizovaných technik využívajících buď fosťoroamidátové, nebo H-fosfonátové chemie. Ary I - a alkyl— fosfonáty mohou být vyrobeny například způsobem popsaným v patentu US 4 469 863; a alky 1fosfotriestery (ve kterých je nabitá kyslíková skupina alkylované způsobem popsaným v patentu US 5 023 243 a v Evropském patentu EP 092 574) mohou být připraveny automatizovanou >0 syntézou na pevné fázi za použití komerčně dostupných činidel. Byly popsány způsoby pro jiné modifikace a substituce DNA skeletu (Uhlmann E. a Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544. 1990; Goodchild, J„ Bioconjugate Chem. I: 165. 1990).
Mezi další stabilizované nukleové kyseliny patří: ncionické DNA analogy, jako jsou alkyl a aryl-fosťáty (ve kterých je nabity' fosfonátova kyslík nahrazen alkylovou nebo ary lovou skupi- t? .
nou), fcsfodiestery a alkylfcsfotriestery, ve kterých je nabitá kyslíková skupina alkylována.
Nukleové kyseliny, které obsahují diol, jak je tetraethylenglykol nebo hexaethylenglykol, na jednom nebo obou koncích, jsou také významně resistentní na degradaci nukleasami.
V případě, že je nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG nukleová kyselina podána současně s antigenem, který je kódovaný nukleokyselinovým vektorem, tak je výhodné, aby byl skelet nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG nukleové kyseliny chimérickou kombinací fcsfodiesteru a fosforothioátu (nebo jiných fosfátových modifikací). Buňka může mít potíže s vychytáváním plasmidového vektoru za přítomnosti zcela fosforothioátové nukleové kyseliny. Proto, když jsou vtXiui λ íiuKičůva Kyselinu puuiiny jCuíuCí, tak jc vyhodíte, aby ítukícovu kyselínu
Λΐο fTnmárí 1 v iu vniinvii ký skelet nebo fosforothioátový skelet, ale aby byl plasmid asociovaný s vehikulem, které jej přepraví přímo do buněk, což eliminuje potřebu vychytávání buňkami. Taková vehikula jsou známá v oboru a patří mezi ně například liposomy a genová děla.
Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, stejně jako různé kontrolní nukleové kyseliny, jsou uvedeny v následující tabulce A.
Tabulka A
| SEQ ID NO: 0DN sekvence skelet í
i ' tctcccagcgtgcgccat a
2 ataatccagcttgaaccaag a
3 ataatcgacgttcaagcaag s
4 taccgcgtgcgaccctct s
5 ggggagggt s
6 ggggagggg s
7 ggtgaggtg s
6 tccatgt zgttcctgatgct 0
9 gctaccttagigtga ů
10 tccatgazgttcctgatgct 0
11 tccatgacgttcztgatgct 0
12 gctagazgttagtgt 0
13 agctccatggtgctcactg 5
14 c ca egt cgaccct caggcga s
15 gcacatcgtcccgcagccga 5
16 gteactcgtggtacctcga S
17 gttggatacaggccagactttgttg O
18 gattcaacttgcgctcatcttaggc O
19 accatggacgaactgtttcccctc s
20 accatggacgagctgtttcccctc $
21 accatggacgacctgtttcccctc s
22 accatggacgtactgtttcccctc s
23 accatggacggtctgtttcccctc s
24 accatggacgttctgtttcccctc s
25 ccactcacatctgctgctccacaag 0
26 acttctcatagtccctttggtccag 0
-23CZ JU14S8 Bó
27 tccatgagctccctgagtct 0
28 gaggaaggigiggaigacgt 0
29 gtgaaticgttcicgggict o
30 aaaaaa s
31 crgccc s
32 ctgtca 3
33 tcgtag s
34 tcgtgg s
35 cgtcgt s
36 tccůtgtcggtcctgagtct sos
37 tccatgccggtcctgagttct sos
38 tccatgacggtcctgagtct 305
39 tccatgacggtcctgagtct SOS
40 tccatgtcgatcctgagtct SOS
4 i tccatgtcgctcctgagtct sos
42 tccatgtcgttcctgagtCt SOS
43 tccatgacgttcctgagtct sos
44 tccataacgttcctgagtct sos
45 tccatgacgtccctgagtct sos
46 tccatcacgtgcctgagtct sos
47 tccatgctggtcctgagtct sos
48 tccatgtzggtcctgagtct sos
49 ccgcttcctccagatgagctcatgggtttctccaccaag o
50 cttggtggagaaacccatgagctcatctggaggaagcgg o
51 ccccaaagggatgagaagtt o
52 agatagcaaatcggctgacg o
53 ggttcacgtgctcatggctg o
54 tctcccagcgtgegceat Ξ
55 tctcccaqcgtgcgccat s
56 taccgcgtgcgaccctct 5
57 ataatccagcttgaaccaag s
58 ataatcgacgttcaagcaag s
59 tccatgattttcctgatttt o
60 ttgtttttttgtttttttgttttt s
61 ttttttttgtttttttgttttt o
62 tgctgcttttgtgcttttgtgctt s
63 tgctgcttgtgcttctgtgctt o
64 gcattcatcaggcgggcaagaat o
65 taccgagcttcgacgagatttca o
66 gcatgacgttgagr.t s
67 cacgttgaggggcat s
68 ctgctgagactggag s
69 tccatgacgttcctgacgtt Ξ
70 qcatgagcttgagctga o
71 t.cagcgtgcgcc 5
72 atqacgttcctgacgtt S
73 ctttggggttttggggtttt s
74 tctaggctttttaggcttcc s
7 5 tgcattttttaggccaccat 2
76 tet cccagcgtgcgtgcgccat S
77 tctcccagcgggcgcat s
78 tctcccagcgagcgccat s
79 tctcccagcgcgcgccat 5
80 ggggtgacgttcagggggg SOS
81 ggggtccagcgtgcgccatggggg sos
82 ggggtgtcgttcagggggg sos
83 tccatgtcgttectgtcgtt s
84 tccatagcgttcctagcgtt s
85 tcgtcgctgtctccgcttctt s
86 gcatgacgttgagct sos
O i cos
88 tccatgazgttcctgazgtt s
89 gcatgatgttgagct o
90 tccagcgtgcgccata sos
91 tctcccagcgtgcgccat 0
92 tccatgagcttcctgagtct o
93 gcatgtcgttgagct sos
94 tcctgacgttcctgacgtt s
95 gcatgatgttgagct o
95 gcatttcgaggagct o
97 g catgt agct ga gct o
98 tccaggacgttcctagttct o
99 tccaggagcttcctagttet o
100 tccaggacgttcctagttct o
101 tccagtctaggcctagttct o
102 tccagttcgagcctagttct 0
103 gcatggcgttgagct sos
104 g c a t agcgt ťg a gct sos
105 gcattgcgttgagct sos
106 gcttgcgttgcgttt sos
107 tctcccagcgttgcgccatat sos
108 tctcccagcgtgcgttatat sos
109 t ct ccctgc g t g cgccatat sos
110 tctgcgtgcgtgcgccatat sos
Ϊ1Ϊ tctcctagcgtgcgccatat sos
112 t ctcccagcgtgcgcctttt sos
113 g ct andcghhagc 0
114 tcctgacgttccc o
115 ggaagacgttaga o
116 tcctgacgttaga o
117 tcagaccagctggtcgggtgttcctga o
118 tcaggaacacccgaccagctggtctga o
119 gctagtcgatagc o
120 gctagtcgctagc 0
121 gcttgacgtctagc o
122 gcttgacgtttage o
123 gcttgacgtcaagc o
124 gctagacgtttagc o
125 tccatgacattcctgatgct o
126 gctagacgtctagtí 0
127 ggctatgtcgttcctagcc o
i 128 ggctatgtcgatcctagcc o
-25l /. JU1488 B6
1 129 ctcatgggttcctccaccaag o !
130 cttggtggagaaacecatgag -—.—--------J 0
131 tccatgacgttcctagttct 0
132 ccocttcctccagatgagctcatg o
133 catgagctcatctggaggaagcgg 0
134 ccagatgagctcatgggtttctcc 0
135 ggagaaacccatgagctcatctgg o
136 agcatcaggaacgacatgga 0
137 tccatgacgttcctgacgtt rna
138 gcgcgcgcgcgcgcgcgcg o
139 ccggccggccggccggccgg o
140 ttccaatcagccccacccgctctggccccaccctcaccctcca o
141 tggagggtgagggtggggccagagcgggtggggctgattggaa o
142 tcaaatgfcgggattttcccatgagtct o
ι 143 agactcatgggaaaatcccacatttga o
1 144 tgccaagtgctgagtcactaataaaga 0
145 tctttattagtgactcagcacttggca o
ί 146 tgcaggaagtccgggttttecccaacccccc Q
ί 147 ggggggttggggaaaacccggacttcctgca O
ϊ 4 8 ggggaetttccgctggggactttccagggggactttcc 505
149 tccatgacgttcctctccatgacgttcctctccatgacgttcctc O
150 gaggaacgtcatggagaggaacqtcatggagaggaacgtqatgga O
151 ataatsgagcttcaagcaag S
152 tccatgacgttcctgacgtt Ξ
153 tcc3tgacgttcctgacgtt SOS
154 tccaggactttcctcaggtt s
155 tcttgcgatgctaaaggacgtcacattgcacaatcttaataaggt 0
156 accttattaagattgtgcaatgtgacgtcctttagcatcgcaaga o
157 tcctgacgttcctggcggtcctgtcact o
158 tcctgtcgctcctgtcgct o
159 tcctgacgttgaagt 0
160 tcctgtcgttgaagt o
161 tcctggcgttgaagt o
16? tcctgccgttgaagt o
163 tccttacgttgaagt o
164 tcctaacgttgaagt o
7 65 tcctcacgttgaagt o
166 tcctgacgatgaagt o
167 tcctgacgctgaagt 0
168 tcctgacagtgaagt o
1 169 tccíaacgtagaagt o
.1 70 tcctgacgtcgaagt o
171 tcctgacgtggaagt o
172 tcctgagcttgaaat o
173 gggggacgtlggggg o
174 tcctgacgttccttc o
175 tctcccaacqagcgagcgccat s
176 tcct.qacgtLcccctggcggtcccctqtccct o
i 177 tcctqtcgctcctgtcgctcctqtcgct o
ί /8 tcctggcqggqaagt 0
179 tcctca zgt tgaagt ° . i
190 tcztgacgttgaagt 0
lál tcctagcgttgaagt 0
182 tccagacgttgaagt 0
183 tcctgacggggaagt 0
184 tcctggcggtgaagť 0
185 ggctccggggagggaatttttgtctat 0
186 atagaeaaaaattccctccccggagcc 0
187 tccatgagqttccttgagtct rna
188 tcgtcgctgtetccgcttctt so
189 řrrtrrorrotctccgcttctt s20
190 tcgagacattgcacaatcatctg 0
191 cagattgtgcaatgtctcga 0
192 tceatgtcgttcctgatgcg 0
193 gcgatgtcgttcctgatgct 0
194 gcgatgtcgttectgatgcg 0
19S tccatgtcgttccgcgegcg 0
196 tccatgtcgttcctgccgct 0
197“ tccatgtcgttcctgtagct 0
198 gcggcgggcggcgcgcgccc 0
199 atcaggaacgtcatgggaagc 0
200 tccatgagcttcctgagtct p-ethoxy
201 tcaacgtt p-ethoxy
202 tcaagett p-ethoxy
203 tcctgtcgttcctgtcgtt s
204 tccatgtcgtttttgtcgtt s
205 tcctgtcgttecttgtegtt s
206 tccttgtcgttcctgtcgtt s
207 btccattccatgacgttcctgatgcttcca os
208 tcctgtcgttttttgtegtt s
209 tcgtcgctgtetccgcttctt 5
210 tcgtcgctgtctgcccttctt s
2Ϊ1 tcgtcgctgttgtcgtttctt s
212 tcctgtcgttcctgtcgttggaacgacagg 0
213 tcctgtcgttcctgtcgťttcaacgtcaggaacgacagga 0
214 ggggtctgtcgttttgggggg 50S
215 ggggtctgtgcttttgggggg SOS
216 tccggccgttgaagt O
217 t ccggacggtgaagt O
218 tcccgccgttgaagt 0
219 tccagacggtgaagt 0
220 tcccgacggtgaagt 0
221 tccagagcttgaagt 0
222 tccatgtzgttcctgtzgtt s
223 tccatgacgttcctgacgtt sos
224 ggggttgacgttttgggggg sos
225 tccaggacttctctcaggtt s
226 tttttttťtttttttttttt s
227 tccatgccgttcctgccgtt s
228 tccatggcgggcctggcggg s
229 tccatgacgttcctgccgtt s
230 tccatgacgttcctggcggg s
-27L Z 301488 B6
231 tccatgacgttcctgcgttt s 1
232 tccatgacggtcctgacggt 5
? Ί ~ rccatgcgtgcgtgcgtttt 5
23, tccatacgttgcgttacgtt 5
235 ntccattccatt ctaggcctgagtcttccat 05
23b tccatagcqttcctagcgtt 0
2 37 tccatgtcgttcctgtcgtt 0
23 ε tccatagcgatcctagcgat o
239 tccattgcgttccttgcgtt o
24 C tccatagcggtcctagcggt 0
241 tccatgattttcctgcagttcctgatttt ;
242 tccatgacgttcctgcagttcctgaegtt s
242 ggcggcggcggcggcggcgg 0
244 tccacgacgttttcgacgtt Ξ
24 2 tcgtcgttgtcgttgtcgtt s
24b tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt s
2C tcgteqttgtcgttttgtcgtt s
2 4 í gcgtgcgttgtcgttgtcgtt Ξ
249 czggczggczgggczccgg a
25G gcggcqggcggcgcgcqccc 3
25 i agiccegigaacgiattcac o
252 tgtcgtttgtcgtttgtcgtt 5
252 tgtcgttgtcgttgtcgttgtcgtt S
254 tgtcgttgtcgttgtcgttgtcgtt s
í 235 tcgtcgtcgtcgtt s
i 256 tgtcgttgtcgtt 5
| 257 ccccccccccccccccecce ň
256 tctagcgtttttagcattcc 5 0 5
259 tgcatcccccaggccaccat s
26C tcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtt sos
2ál tcgtcgtt gtcgtt gtcgtt. sos
j 262 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt sos
: 263 tcgtcgttgtcgttttgtcgtt sos
I 264 ggggagggaggaacttcttaaaatťcccccagaatgttt o
1 265 aaacattctgggggaattttaagaagttcctccctcccc o
; 266 afcgtttacttcttaaaattcccccagaatgttt o
2 67 aaacattctgggggsattttaagaagtaaacat o
268 atgtttactagacaaaattcccccagaatgttt o
26? aaacattctgggggaattttgtctagtaaacat a
[ 27C aaaattqacgttttaaaaaa sos
1 27: ecccttgacgtttteccccc sos
i 27 2 ttttcgttgtttttgtcgtt
L 273 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt sos
1 214 ctgcaqcctgqgac o
1 275 acccgtcgtaattatagtaaaaccc ° j
27- ggcaccrgtgqggacattgtg ° j
277 aacaccgaacgtgagagg o
272 H-...........ΓΊ-- tccatgccgttcctgccgtt o
1 tccatgacggccctqacggt 0
>_ 28C tccatgccgqtcctaccggt o
1 281 tccatgcgcgtcctgcgcgt o '
282 ctggtctttctggtttttttctgg s
' 2B3 tcaggggtggggggaacctt sos
2B4 tccatgazgttcctagttct 0
285 tccatgatgttcctagttct 0
286 cccgaagtcatttcctcttaacctgg 0
287 ccaggttaagaggaaatgacttcggg 0
288 tcctggzggggaagt 0
289 gzggzgggzggzgzgzgccc X
290 tccatgtgcttcctgatgct 0
oni i UVUa U WWSr MVV V
292 tccatgtcgttcctagttct
293 tccaagtagttcctagttct o
294 tccatgtagttcctagttct 0
295 tcccgcgcgttccgcgcgtt s
296 tcctggcggtcctggcggtt s
297 tcctggaggggaegt 0
298 tcctgggggggaagt o
299 t cctggtggggaagt o
300 tcgtcgttttgtcgttttgtegtt o
301 ct ggtctttctggtttttttCtgg o
3Ó2 tccatgacgttcctgacgtt o
303 tccaggacttctctcaggtt sos
304 tzgtzgttttgtzgttttgtzgtt 0
305 btcgtcgttttgtcgttttgtcgrtttttt 03
306 gctatgacgttccaaggg s
' ' 307 tcaacgtt 3
308 tccaggactttcctcaggtt o
309 ctctctgtaggccegcttgg 5
310 ctttccgttggacccctggg s
311 gtccgggccaggccaaagtc s
312 gtgcgcgcgagcccgaaatc s
313 tccatgaigttcctgaigtt s
314 aatagtcgccataacaaaac 0
315 aatagtcgcca tggcggggc 0
316 btttttccatgtcgttcctgatgcttttt os
317 tcctgtcgttgaagtttttt o
318 gctagctttagagctttagagctt o
319 tgetgettcccccccccccc o
320 tcgacgttcccccecccccc o
321 tcgtcgttcccccccccccc o
322 tcgtcgt tccccccccccoc o
323 tcgccgttcccccccccccc o
324 t cgt cgatcccccccccccc 0
325 tcctgacgttgaagt s
326 tcctgccgttgaagt s
327 t cctgacggtgaagt 3
328 tcctgagcttgaagt 3
329 tcctggcggggaagt s
330 aaaatctgtgcttttaaaaaa sos
331 gatccagtcacagtgacctggcagaatctggat 0
332 gatccagattctgccaggtcactgtgactggat o
-29ί Λ JUI433 130
Γ 333 gatccagtcacaqtgactcagcagaatctggdt O !
334 gatccagattctgctgagtcactgtgactggat --f O !
335 tcgtcgttccccccczcccc O
336 tzgtqgttcccccccccccc o
337 t2gtcgttcccccccccccc o
335 tcgtzg ttcccccccccccc o
335 tcgtcgctcccccccccccc o
34 C tcgtcggtcccccccccccc
341 tcggcgttcccccccccccc o
342 ggcct 11tcccccccccccc o
343 tcgtcgttttqacgtttIgtcgtt s
344 tcgtcgttttgacgttttgacgtt 5
345 ccgtcgttcccccccccccc O
346 gcgtcgttcccccccccccc 0
347 tcgtcattcccccccccccc o
348 acgtcgttcccccccccccc o
349 ctgtcgttcccccccccccc o
350 btttttcgtcgttcccccccccecc ΟΞ
351 tcgtcgttccccccccccccb O
352 tcgtcgttttgtcgttttgtcgttb o
353 tccagttccttcctcagtct o
354 tzqtcgttttatcgttttgtcgtt 0
355 tcctggaggggaagt 5 ί
356 tcctgaaaaggaagt s
357 tcgtcgttccccccccc r
355 tzgtzgttttqtzgLtttgtzgtt 5
359 ggggtcaagcttqagggggg SOS
360 tgctgcttcccccccccccc s
361 tcgtcgtcgtcgtt
362 tcgtcgtcgtcgtt 520
363 tcgtcgtcgtcgtt os2
364 tcaacgttga s
365 tcaacgtt s
! 366 atagttttccatttttttac
3 67 aatagtcgccatcgcgcgac o
368 aatagtcgccatcccgggac o
369 aataqtcgccatcccccccc o
370 tgctgcttttgtgcttttgtgett o
371 ctgtgctttetgtgtttttetgtg s
372 ctaatctttctaatttttťtctaa s
i 37 3 tcgtcgttggtgtcqttggtgtcgtt 5
I 374 tcgtcgttggttgtcgttttggtt 5
ί 375 accatgqacgagctgtttCCCCtc
ί 376 tcgtcqttttgcgtgcgttt 3
377 ctgtaagtgagcttggagag
77 8 gagaacgctggaccttcc
379 cgqgcgactcagtctatcgg i Ί 1
38 0 gttctcagataaagcggaaccagcaacagacacagaa
381 ttctgtgtctgttgccggttccgctttatctgagaac
382 cagacacagaagcccgataqacq
38 3 agacagacacgaaacqaccq i
Γ 384 gtctgtcccatgatctcgaa
i 385 gctggccagcttacctcccg
386 ggggcctctatacagcctggg
307 ggggtccctgagactgcc
388 gagaacgctggaccttccat
389 tecatgtcggtcctgatgct
390 ctcttgcgacctggaaggta
391 aggtacagccaggactacgů
392 accatggacgacctgtttcccctc
ί' inu i . D^^at-nnsťťBrrťttťtrrrrtr
394 atggaaggtccagcgttctc o
395 agcatcaggaccgacatgga o
396 ctctccaagctcacttacag
397 tccetgagaetgccccacctt
399 gccaccaaaacttgtccatg
399 gtccatggcgtgcgggatga
400 cctctatacaacctgggac
401 cgggcgactcagtctatcgg
402 gcgctaccggtagcctgagt
403 cgactgccgaacaqgatatcggtgatcagcactgg
404 ccagtgctgateaccgatatcctgttcggcagtcg
405 ccaggttgtatagaggc
406 tctcccagcgtacgccat s
4 07 tctcccagcgtgcgtttt 5
40B tctcccgacgtgcgccat 5
409 tctcccgtcgtgcgccat 5
410 ataatcgtcgttcaagcaag 3
411 tcgtcgttttgtcgttttgtcgt s2
412 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt s2
413 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt s2
414 tcntcgtnttntcgtnttntcgtn s
415 tctcccagcgtcgccat s
416 tctcccatcgtcgccat s
417 ataatcgtgcgttcaagáaag s
418 ataatcgacgttcccecccc s
419 tctatcgacgttcaagcaag Ξ
420 tcc tga cgg gg agt s
421 tccatgacgttcctgatcc
422 tccatgacgttcctgatcc
423 tccatgacgttcctgatcc
424 tcc tgg cgt gga agt s
425 tccatgacgttcctgatcc
426 tcgtcgctgttgtcgtttctt 5
427 agcagctttagagctttagagctt S
428 cccccccccccccccccccccccc Ξ
429 tcgtcgttttgtcgttttgtcgttttgtcgtt S
4 30 tcgtcgttttttgtcgttttttgtcgtt s
431 tcgtcgtttttttttttttt 5
432 tttttcaacgttgatttttt SOS
433 tttttttttxtttttttttttttt s
434 ggggtcgtcgttttgggggg
-31 cz 301488 B6
4?: tcgtcgttttgtcgttttgggggg j
4 35 tcgtcgetgtctccgcttcttcttgcc i i
43 r.cgtcgctgtctccg s i
43: ctgtaagtgagcttggagag ř
433 gagaacgctggacct tccat
44 ; ccaggttgtatagaggc
443 gctagacgttagcgtga
442 ggagctcttcgaacgccata
443 tctccatgatggttttatcg t
444 aaggtggggcagtctcaggga
443 accggaggactggcgcgccg
446 ttaggacaaggtctagggtg
44' accacaaegagaggaacgca
143 gqcagtgcaggctcaccggg
443 gaaccttccatgctgtt
4 5' gctagacgttagcgtga
453 gcttggagggcctgtaagtg
45' gtagccttccta
453 cggtagccttccta
454 cacqgtagccttccta
45; agcacggtagccttccta
453 gaacgctggaccttccat
453 gaccttccat
45: tggaccttccat
455 gctggaccttccat
4 CC acgctggaccttccat
463 taagctctgteaacgccagg 1
4 62 gagaacgctggaccttccatgt
4 63 tccatgtcggtcctgatgct
4 63 ttcatgccttgcaaaatggcg
4 63 tgctagctgtgcctgtacet
4 6: aqcatcaggaccgacatgga
4 6' gaccttccatgtcggtcctgat
463 acaaccacgagaacgggaac
ή 6? I- . - gaaccttccatgctgttccg
: ι π caatcaatctgagqagacec
I tcaactctggtactttttca
i 433 μ_ -- | tggttacggtctgtcccatg
| 47? 1 j gtctatcggaggactqqcgc
cat Lttacgggcgggcgggc
Ρ Ή; ι_ yaggggaccattttacgggc
I 475 tgtccagccgaggggaccat
47' cgggcttacggcggatgctg
47: tggaccttctatgtcggtcc
4 73 rgtcccatgtttttagaagc
4 25 ” ” gtggttacgqtcgtgcccat
4 6; cc5 ccaaatgaaagacccec
! *55 ttgtactctccatgatggtt 1
ř ι λ u : ttccatgctgttccggctqg
Η ί - gaccttctatgtcggtcctq 1
4S3 : qagaccgccegaeettcqar
<3 86 ttgccccatattttagaaac
487 ttgaaactgaggtgggac
488 ctatcggaggactggcgcgcc
489 cttggagggcctcccggcgg
4 90 qctgaaccttccatgctgtt
491 tagaaacagcattcttcttttagggcagcaca
492 agatggttetcagataaagcggaa
493 ttccgctttatctgagaaccatct
494 gtcccaggttgtatagaggctgc
4nč w nor, η/·, tj nr rrtrrnat Λ na ť* - -j---3 - ·-----* - -
496 atcggaggactggcgcgccg
497 ggtctgtcccatatttttag
498 tCtttcaacgttgagggggg sos
499 tttttcaagcgttgatttttt SOS
500 ggggtcaacgttgatttttt sos
501 ggggttttcaacgttttgagggggg sos
502 ggttacggtctgtcccatat
503 ctgtcccatatttttagaca
504 accatcctgaggccattcgg
505 cgtctatcgggcttctgtgtctg
506 ggccatcccacattgaaagtt
507 ccaaatatcggtggtcaagcac i
508 gtgcttgaccaccgatatttgg
509 gtgctgatcaccgatatcotgttcgg
510 ggccaactttcaatgtgggatggcqtc
511 ttccgccgaatggcctcaggatggtac
512 tatagtccctgagactgccccaccttctcaacaacc
513 gcagcctctatacaacctgggacggga
514 ctatcggaggactggcgcgccg
515 tatcggaggactggcgcgccg
516 gaťcggaggactggcgcgccg
517 ccgaacaggatatcggtgatcagcae
518 t tttggggtcaacgttgagggggg
519 ggggt caacgt tgagggggg sos
520 cgcgcgcgcgcgcgcgcgcg s
521 ggggcatgacgttcgggggg ss
522 ggggcatgacgttcaaaaaa s
523 ggggcatgagcttcgggggg s
524 ggggcatgacgttcgggggg sos 1
525 aaaacatgacgttcaaaaaa sos
526 aaaacatgacgttcgggggg sos
527 ggggcatgacgttcaaaaaa sos
528 accatggacgatctgtttcccctc s
529 gccatggacgaactgttccccctc s
530 cccccccccccccccccccc sos
531 gggggggggggggggggggg sos
532 gctgtaaaatgaatcggccg sos
533 ttcgggcggactcctccatt sos
534 tatgccgcgcccggacttat SOS
535 ggggtaatcgatcagggggg sos
536 L tttgagaacgctggaccttc sos ]
L/..)(11488 B6
537 gatcgctgatctaatgctcg 505
5.38 gtrggtcctgatgctgttcc 505
539 tcgtcgLcágttcgctgtcg SOS
540 ctqqaccttccatgtcgg | sos
541 gctcgttcagcgrgtct sos 1
542 ctggaccttccatgtc 5Q5
543 cactgtccttcgtcga 505
544 cgctggaccttccatgtcgg SOS
54 5 gctgagctcatgccgtctgc SOS
54 6 aacgctggaccttccatgtc sos
54? tgcatgccgtacacagctct SOS
348 ccttccatgtcggtcctgat sos
54 9 tactcttcggatccctt.gcg 505
550 ttccatgtcggtcctgat 5OS
551 ctgattgctctctcgtga SOS
552 ggcgttattcctgactcgcc o
553 cctacgttgtatgcqcccagct o
55Z ggggtaatcgatgagggggg o
555 1tcqggcggactcctccatt o
556 tttttttttttttttttttt o
55? gggggttttttttttgggqg o
558 tttttcgggggggggttttt o
559 gggggqggggggggggggt o
5 60 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa o
561 cccccaaaaaaaaaaccccc o
Γ 562 aaaaaccccccccccaaaaa o
563 tttgaattcaggactggtgaggttgag o
564 tttgaatcctcagcqgtctccagtggc o
565 aa t tctctatcggqqctt ctgtgtctqttgctqgt Lccgctttat o
566 ctagataaagcggaaccdgcaacaqacacagaagccccgatagag 0
56? ttttctagagaggtgcacaatgctctgg 0
568 tttaaattccgtgtacagaaqcgagaagc o
569 tttgcgqccgctagacttaacctgagagata o
570 tttgggeccacgagagacagagacacttc o
571 tttgggcccgcttctcgcttctgtacacg o
5 72 gagaacgctggaccttccat 5
573 tccatgtcggtcctgatgct Ξ
574 ctgtcg 5
575 tcgtga Ξ
57 6 cgtcga s
577 a Gr gct 3
578 ctgtcg o
579 ! ^gtgct o
580 i Pcgtcga o
581 1 tcqtga o
582 ; gagaacgctc.caqcttcgat o
583 nctacacgcaagcgtga 0
58 4 gagaacgctcgaccttccat 0
585 gagaacgctggacctatccat o
j 59 6 ! [ gctogaggtragcqtga ° !
| 58? 1 qaqaacgctggacttccat r ~ I
588 tcacgctaacgtctagc o
589 bgctagacgttagcgtga 0
590 atggaaggtcgagcgttctc 0
591 gagaacgctggaccttcgat o
592 gagaacgatggaccttccat o
593 gagaacgct ggatccat o
594 gagaacgctccagcactgat 0
595 tccatgtcggtcctgctgat 0
596 atgtcctcggtcctgatgct o
597 aagaacqctccaccttccat 0
598 gagaacgctggaccttcgta o
599 batggaaggtccagcgttctc o
600 tcctga o
601 ťcaacgtt 0
602 aacgtt 0
603 aacgttga o
604 tcacgctaacctctagc o
605 gagaacgctggaccttgcat 0
606 gctggaccttccať o
607 gagaacgctggacctcatccst o
608 gagaacgctggacgctcatccat o
609 aacgttgaggggcat 0
610 atgcccctcaacgtt o
611 tcaacgttga o
612 gctggaccttccat 0
613 caacgtt o
614 acaacgttga o
615 tcacgt o
616 tcaagett o
617 tcgtca o
618 aggatatc o
619 tagacgtc o
620 gacgtcat o
621 ccatcgat o
622 atcgatgt o
623 atgcatgt o
624 ccatgcat o
625 agcgctga o
626 tcagcgct 0
627 ccttcgat o
628 gtgccggggtctccgggc 5
629 gc t gt ggggcggct cct g s
630 btcaacgtt o
631 ftcaacgtt o
632 faacgttga o
633 tcaacgt s
634 aacgttg s
635 cgacga 0
636 teaacgtt o
637 tcgga o
638 agaacgtt 1_r
-35 CZ J0148X B6
63£ tcatcgat j 0 í
64 0 taaacgtt j s 1
641 ccaacgtt -—.-—--1 5 1
64 2 gctcga 5 1
64 3 cgacgt S i
64 4 cgtcgt 5 ' i
64 5 acgtgt 5 !
646 cgttcg s !
647 gagcaagctqgaccttccac 3 í
64 9 cgcgta s i
64 9 cgtacg Ξ
650 tcaccggt 3
651 caagagatgctaacaatgca S
652 acccatcaatagctctgtgc 5 j
653 ccatcgat O
654 tcgacgtc O
655 ctagcgct 0
65 6 taagcgct o
657 tcgcgaattcgcg o
658 atggaaggtccagcgttct o
659 actggacgttagcgtga o
660 cgcctggggctggtntgg 0
661 gtgtcggggtctccgggc o
662 gtgccggggtctccgggc o
663 cgccgtcgcggcggttgg 0
664 gaagtteacgttgaqgggcat o
665 atctggtgagggcaagctatg 3
666 gttgaaacccgagaacatcat 5
667 gcaacgtt 0
668 gtaacgtt O
669 cgaacgtt o
670 gaaacgtt o
671 caaacgtt o
672 ctaacgtt o
673 ggaacgtt 0
674 tgaacgtt o
675 acaacgtt 0
676 ttaacgtt o
677 aaaacgtt o
678 ataacgtt σ
679 aacgtt.ct o
68C tccgatcg o
681 tccgtacg o
682 gctagacgctagcgtga o
683 gagaacgctggacctcatcatccat o
684 gagaacgctagaccttctat 0
685 actagacgttagtgtga o
686 cacaccttggtcaatgtcacgt o i
tctccatcctatggttttatcg o
_, J 68 8 cqctggaccttcr.at 0
í 639 | caccaccttggtcaatgtcacgt o
- 36 V<
690 gctagacgttagctgga 0
691 agtgcgattgcagatcg o
692 ttttcgttttgtggttttgtggtt
693 ttttcgtttgtcgttttgtcgtt
694 tttttgttttgtggttttgtggtt
695 accgcatggattctaggcca 5
696 gctagacgttagcgt O
697 aacgctggaccttccat O
698 tcaazgtt o
699 c-rt· ťí?nať 0
700 aqtagacgttagtgtga s
701 gctagaggttagcgtga 3
702 a tgga ct ct ccagcgtt ct c O
703 atcgactctcgagcgttctc O
704 gctagacgttagc o
705 getagaegt o
706 agtgcgattcgagatcg o
707 tcagzgct o
708 ctgattgctctctcgtga o
709 tzaacgtt o
710 gagaazgctggaccttccat 0
711 gctagacgttaggctga o
712 gctacttagcgtga 0
713 gctaccttagcgtga o
714 atcgacttcgagcgttctc o
715 atgcactctgcagcgttctc o
716 agtgactctccagcgttctc o
717 gccagatgttagctgga 0
718 atcgactcgagcgttcte o
719 atcgatcgagcgttctc 0
720 bga gaacgct cgacc11 egat o
721 getagaegt taget gga 303
722 atcgactctcgagcgttctc SOS
723 tagacgttagcgtga o
724 cgactctcgagcgttctc 0
725 ggggtcgaccttggagggggg sos
726 gctaacgtt agcgtga 0
727 egtegtegt 0
720 gagaacgctggaczttccat 0
729 atcgacctacgtgcgttztc 0
730 atzgacctacgtgcgttctc a
731 gctagazgttagcgt o
732 atcgactctcgagzgttctc o
733 ggggtaatgcatcagggggg 503
734 ggctgtattccťgactgccc s
735 ccatgctaacctctagc 0
736 gctagatgttagcgtga o
737 cgtaccttacggtga 0
738 tccatgctggtcctgatgct o
739 atcgactctctcgagcgttctc o
740 getagagettagcgtga o
-37CZ JU1488 B6
7 ζ 1 atcgactctcgagtqttctc Cl
7 42 aacgctcgaccttcgat O
ί & ' ctcaacgctggaccttccst o
744 atcgacctacgtgcgttctc o
74? gagaatgctggaccttccat j o
74 6 tcacgctaacctctgac | o
74' bgagaacgctccagcactgat | o
74: bgagcaagctggsccttccat Q
74? cgctagaggttagcgtqa O
75C gctagatgttaacgt O
752 atqgaaggtccacgttctc o
752 ' gctagatgttagegt o
752 gctagacgttagtgt
754 tccatgacggtcctgatgct o
?£: tccatggcggtcctgatgct c
7 5Ě gctagacgatagcgt o
757 gctagtcgataqcgt o
758 tccatgacgttcctgatqct 0
75? tccatgtcgttcctgatgct o
7 60 gctagacgttagzgt o
7 62 gctaggcgttagcgt o
762 tccatgtzggtcctgatgct o
762 tccatgtcggtzctgatgct o
764 atzgactetzgagzgttccc o
! 765 atggaaggtccagtgttctc 0
i 756 gcatgacgttgagct o
767 ggggtcaacgttgagggggg s
7 66 gqggtcaagtctgagggggg SOS
769 cgcgcgcgcgcgcgcgcgcg o
77C cccccccccccccccccccccccccccc s
/71 ccccccccccccccccccccccccccccccccccc s
7 7/ rccatgtcgctcctgatcct o
7 73 gctaaacgttagcgt o
77 4 t ciCat gtcgatcctgatgct o
77 5 tccatgccggtcctgatgct 0
776 aaaatcaacgttgaaaaaaa sos
7 77 tccataacgttcctgatgct o
? 76 tggaggtcccaccgagaLcggag o
775 egtcgtcgtcgtcgtcgtcgt s
78C ctgetgctgctgor.gctgctg S
“ ~ ?Ίΰ gagaacgctccgaccttcgat s
732 i gctagatgttagegt s 1
79? ' gcatgacqttqagct 3
784 j tcaatgctgaf o
785 tCaacgttgaf o
736 tcaacgttgab o ί
787 qcaatattgcb . . _____ o í
73: gcaatattgcf O í
‘ 8 ? Ϊ agttgcaact ! o
~7™9e ' i tcítcgaa ; 0
7 9: i tcaacgtc í o l·
7 92 ccatgtcggtcctgatgct 0
793 gtttťtatataatttggg o
794 tttttgtttgtcgttttgtcgtt o
795 ttggggggggtt 3
796 ggggttgggggtt s
797 ggtggtgtaggttttgg 0
7 98 bgagaazgctcgaccttcgat 0
799 tcaacgttaacgttaacgtt 0
800 bgagcaagztggaccttccat ΰ
sni hganaasgctccaacactgat rt
802 tcaazgttgax O
803 gzaatattgcx O
804 tgctgcttttgtcgttttgtgctt 0
805 ctgcgttagcaatttáactgtg 0
806 tccatgaegttcctgatgct S
807 tgcatgccgtgcatecgtacacagctct s
808 tgcatgccgtacacagctct 5
809 tgcatcagctct S
810 tgcgctct s
811 cccccccccccqcccccccc s
812 ccccccccccCc 3
813 cccccccc 3
814 tgcatcagctct SOS
815 tgcatgccgtacacagctct o
816 gagcaagctggaccttccat s
817 tcaacgttaacgttaacgttaacgttaacgtt 5
818 gagaacgctcgacettegat 3
819 gtccccatttcccagaggaggaaat O
820 ctagcggctgacgtcatcaagctag O
821 ctagettgatgacgteageegctag O
822 cggctgacgtcatcaa 3
823 ctgacgtg O
824 ctgacgtcat O
825 attcgatcggggcggggcgag o
826 ctcgccccgccccgatcgaat o
827 gactgacgtcagcgt o
828 ctagcggctgacgtcataaagctagc 3
829 ctagctttatgacgtqagccgctagc 3
830 ctagcggctgagctcataaagctagc S
831 ctagtggctgacgtcatcaagctag 3
832 tccaccacgtggtctatgct S
833 gggaatgaaagattttattaťaag O
834 tctaaaaaccatctattcttaaccct O
835 agctcaacgtcatgc 0
836 ttaacggtggtagcggtattggtc ΰ
837 t taagaccaataccgctaccaccg o
838 gatctagtgatgagtcagccggate °
839 gatccggctgactcatcactagatc 0
840 tccaagacgttcctgatgct 0
841 tccatgacgtccctgatgct 0
842 tccaccacgtggctgatgct 0
-39tZ JUI488 B6
8 43 ccacqtggacctctagc o
844 tcagaccaegtggtcgggtgttcctga | o
845 tcaggaacacccgaccacgtggtctga j o
846 catttccacgatttcCca , o
34? ttectctctgcaagagact j o
848 tgtatctctctgaagqact o
849 ataaagcgaaactagcagcagtttc o
850 gaaactgctgctagtttcgctttat o
851 tgcccaaaqagqaaaatttgtttcatacag o
552 ctgtatgaaacaaattttcctctttgggca o
853 ttagggttagggttaggqtt ss
854 tccatgagcttcctgatgct 55
855 aaaacatgacqttcaaaaaa 55
856 aaaacatgacgttcgggggg SS
857 ggggcatgaqcttcgggggg SOS
858 ctagactgacgtcatcaagctagt o
959 tctgacgtcatctgacgttggctgacgtct o
860 ggaattagtaatagatatagaagtt o
861 tttaccttttataaacataactaaaacaaa o
S62 gcgtttttttttgcg 5
863 atatctaatcasaacartaacaaa O
854 Lctatcccagqtggttcctgttag O
865 btccatgacgttcctgatgct o
866 btccatgagcttcctgatgct o
867 tttttttttttttř o
86Θ tttttttttttttř so
869 ctagcttgatgagctcagccgctag o
870 ttcagttgtcttgctgcttagctaa o
871 tccatgagcttcctgagtct 5
872 ctagcggctgacgtcatcaatctag O
873 tgctagccgtgcetgtacet s
374 atgetaaaggaogteacattgea n
875 tgcaatgtgacgtcctttagcat o
876 l ..... gtaggqgactttccgagctcgagatcctatg o
i 877 cataggatctcgagcteggaaagteccctac o
í 8 78 ctgtcaggaactgCSggtaagg o
1 879 cataacataggaatatttactcctcgc o
880 ctccagctccaagaaaqgacg o
881 gaagtttctggtaagtcttcg o
882 tgctgcttttgtgcttttgtgctt Ξ
893 rcgtcqttttytggttttgtggí t s
884 tcgtcgtttgtegttttgtcgtt 5
985 tcctgacqttcqgcgcgcgccc 5
886 tgetget tttgtgettt tqtgctt
i a 87 tccatqaqcttcctgagctt S
: 988 ! tcgtcqtttcgtcgttttgacgtt
i 889 í tcgtcgtttqcgtgcgtttcgtcgtt 5
í 9 90 tcgcgtgcqttccgtcgttttgacgtt s
3 91 ttcgtcgttttgtcgttttgtcgtt i
! 392 tcctgacggggaagt 1 -
' e 93 i Lcctggcgtgyaagt 1
894 tcctggcggtgaagt s
895 t cctggcgttgaagt 3
Q96 tcctgacgtggaagt s
897 gcgacgttcggcgcgcgccc 5
898 gcgacgggcggcgcgcgccc S
899 gcggcgtgcggcgcgcgccc s
900 gcggcggtcggcgcgegccc s
901 g cg acggt cggcgcgcgccc s
902 gcggcgttcggcgcgcgccc s
903 πί-ΓΓΛ rnt gcggegcgcgccc s
904 tcgtcgctgtctccg s
905 tgtgggggttttggttttgg s
906 aggggaggggaggggagggg 3
907 t gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt 5
908 c t c t ct ct ct e t ct ct c t ct ct chiraeric
909 ggggtcgacgtcgagggggg 3
910 atatatatatatatátatatat s
911 ttttttttttttttttttttttttttt 3
912 tttttttttttttttttťtťt s
913 tttttttttttttttttt s
914 gctagaggggagggt
915 gctagatgttagggg
916 gcatgagggggagct
917 atggaaggtccagggggctc
918 atggactctggagggggctc
919 atggaaggtccaaggggctc
920 gagaaggggggaccttggat
921 gagaaggggggaccttccat
922 gagaaggggccagcactgat
923 tccatgtggggcctgatgct
924 tccatgaggggcctgatgct
925 tccatgtggggcctgctgať
926 atggactctccggggťtctc
927 atggaaggtccggggttctč
928 atggactctggaggggtctc
929 atggaggctccatggggctc
930 atggactctggggggttctc
931 tccatgtgggtggggatgct
932 tccatgcgggtggggatgct
933 tccatgggggtcctgatgct
934 tccatggggtccctgatgct
935 tccatggggtgcctgatgct
936' tccatggggttcctgatgct
937 tccatcgggggcctgatgct
938 gctagagggagtgt
939 tttttttttttttttttt 3
940 gmggtcaacgttgagggmggg S
941 ggggagttcgttgaggggggg S
94 2 tcgtcgtttcccccccccec S
943 ttggggggttttttttttttttttt 3
944 tttaaattttaaaatttaaaata S
-41 <- /301488 B6
945 ttggtttttttggtttttttttgg 5
Γ 346 tttcccttttcčccttrtcccctc s
347 ggggtcatcgatgaggqggg s SOS
548 tccatgacgttcctgacgtt
349 tccatgacgttcctgacgtt
950 tccatgacgttcctgacgtt
351 tccatgacgttcctgacgtt
, 352 tccatgacgttcctgacgtt
953 tccatgacgttcctgacgtt
954 tccatgacgttcctgacgtt
955 tccatgacgttcctgacgtt
956 tccatgacgttcctgacgtt
957 tccatgacgttcctgacgtt
35Θ tccatgacgttcctgacgtt
359 yygggacgatcgtcggggg SOS
360 gggggtcgtacqacgggggg SOS )
961 ttttttcttttttttttctttttt po j
962 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa po ;
963 cccccccccccccccccccccccc po 5
964 tcgtcgttt tgtcgttttgtcgtt i
965 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
366 tcgtcgttttgtcgttttqtcgtt
367 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
3 68 ggggtcaacgttgagggggg
969 ggggtcaacgttgagggggg
970 ggggtcaagcttgagggggg
971 tgctgctt cccccccccccc
972 ggggacgtcgacgtgggggg sos
973 ggggtčgtcgacgagggggg sos
i 974 ggggtcgacgtacgtcgagggggg sos
97 5 ggggaccggtaccggtgggggg sos
í 976 gggtcgacqtcgagggggg sos
977 ggqytcgacgt cgaggggg sos
978 ggggaacgttaacgttgggggg sos
379 ggggtcaccggtgagggggg SOS
980 ggggtcgttcgaacgagggggg sos
981 ggggacgttcgaacgtgggggg sos
982 tcaactttga s
983 tcaagcttga Ξ
i 984 tcacgatcglga s
1 555 tcagcatgctga s
í 586 gggggagcatgctggggggg sos
987 gggggggggqgggggggggg sos
988 gggggacgatatcgtcgggggg sos
= 89 gggggacgargtcgtcgggggg sos
; 5 90 gggggacgagctcgtcgggggg SOS
1 =91 ! qgggcacgtacgtcgggggg sos
9 92 tcaacgtt
= 93 tccataccgytcctgatgct
= 94 tccataccggtectaccggt
995 gggggacgatcgttgggggg sos
996 ggggaacgatcgtcgggggg sos
997 ggg ggg acg atc gtc ggg ggg SOS
998 ggg gga ega tcg tcg ggg ggg sos
999 aaa gac gtt aaa po
1000 aaagagcttaaa po
1001 aaagazgttaaa po
1002 aaattcggaaaa po
1003 gggggtcatcgatgagggggg 5OS
't λλ a m ««. w rw ιψΑ cnc
—
1005 atgtagcttaataacaaagc po
1006 ggatcccttgagttacttct po
1007 ccattccacttctgattacc po
1008 tatgtattatcatgtagata po
1009 agcctacgtattcaccctcc po
1010 ttcctgcaactactattgta po
1011 atagaaggccctacaccagt po
1012 ttacaccggtctatggaggt po
1013 ctasccagatcaagtctagg po
1014 cctagacttgatctggttag po
1015 tataagcctcgtccgacatg po
1016 catgtcggacgaggcttata po
1017 tggtggtggggagtaagctc po
1018 gagetactcccccaccacca po
1019 gccttcgatcttcgttggga PO
1020 tggacttctctttgccgtct po
1021 atgctgtagcccagcgataa po
1022 accgaatcagcggaaagtga po
1023 tccatgacgtťcctgacgtt
1024 ggagaaaeccatgagctcatctgg
1025 accacagaecagcaggcaga
1026 gagcgtgaactgcgcgaaga
1027 tcggtacccttgcagcggtt
1028 ctggagccctagccaaggat
1029 gcgactccatcaccagcgat
1030 cctgaagtaagaaccagatgt
1031 ctgtgttatctgacataeacc
1032 aattagccttaggtgattggg
1033 acatctggttcttacttcagg
1034 ataagtcatattttgggaactac
1035 cccaatcacctaaggctaatt
1036 ggggtcgtcgacgagggggg sos
1037 ggggtcgttcgaacgagggggg sos
1038 ggggacgttcgaacgtgggggg sos
1039 tcetggcgqggaagt s
1040 ggggaacgacgtcgttgggggg sos
1041 ggggaacgtacgtcgggggg sos
1042 ggggaacgtacgtacgttgggggg sos
1043 ggggtcaccggtgagggggg sos
-43cz 301488 B6
-344 gcqgtcgacgtacgtcgagggggg Sos
1345 ggqgaccggtaccggtgggggg sos
1346 gggtcgacgtcqagggggg sos
1047 ggggtcgacgtcgagggg sos
-34 8 ggggaacgttaacqttgggggg sos
104 9 ggggacgtcgacgtggggg SOS
1050 qcactcttcgaagctacagccggcagcctctgat
1051 cggctcttceatgaggtctttgctaatcttgg
1052 cggctcttccatgaaagtctttggacgatgtgagc
1353 tcctgcaggttaagt s
1054 gggggtcgttcgttgggggg sos
1055 gggggatgattgttgggggg sos
1956 gggggaígatzgttgggggg sos
105? gggggaggtagcttgggggg sos
1058 ggttcttttggtccťtgtct 5
1059 ggttcttttggtcctcgtct s
1060 gqttcttttggtccttatet 5
1061 ggttcttggtttccttgtct s
1062 tggtcttttggtccttgtct s
10 63 ggLtcaaatggtccttgtct s
1064 gggtcttttgggccttgtct s
1065 tccaggacttctctcaggtttttt s
1066 tccaaaacttctctcaaatt 5
1067 tactacttttatacttttatactt s
i06S tgtqtgťgtgtgtgtgtgtgtgtg s
1069 ttgttgttgttgtťťgttgttgttg s
1070 ggctccggggagggaatttttgtctat 5
1071 gggacgatcgtcggggggg sos
1072 gggtcgtcgacgaggggggg sos
1073 ggtcgtcgacgaggggggg sos
107 4 gggtcgtcgtcgtggggggg sos
1075 ggggacgatcgtcggggggg 505
1076 ggggacgtcgtcgtgggggg SO5
1Ó 77 ggggf.cgacgtcgacgtcgaggggggg sos
1078 gggqaaccgcggttggggggg SoS
1079 ggggacgacgtcgtggygggq 505
1080 tcgtcgtcgtcgtcgtggggggy sos
1081 tcctgceggggaagt 5
1082 tcctgcaggggaagt s
1C83 tcctgaagqggaagt s
1084 tcctggcgggcaagt s
1085 tcctggcgggtaagt 5
1086 tcctggcgggaaayt 5
1087 tccqggcggqgaayt S
1088 tcggggcggggaagt 5
1389 tcccggcggggaagt 3
1390 gggggacgttggggg 5
13 91 ggggttttttttttqqgggg £05
1092 ggggccccccccccgggggg sos
-44x- νυ * tvfvf uw
1093 ggggttgťtgttgttgggggg šos
1094 tttttttttttttttttttttttttfctttt
1095 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa&aaa
1096 cccccccccccccccccccccccccccccc
1097 cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg , - .......i
Ačkoliv jsou efekty CpG u myší dobře charakterizovány, informace týkající se člověka jsou omezené. CpG fosforothioátové oligonukleotidy se silnou imunostimulační aktivitou v myším systému vykazují nižší aktivitu u lidských a jiných než hlodavcích imunitních buněk. V přikla5 dech vynálezu je popsán vývoj účinného lidského CpG motivu a charakterizace jeho účinků a mechanismů účinku na lidské primární B-lymťocyty. DNA obsahující tento CpG motiv silně stimuluje primární lidské B-lymfocyty k proliferaci, produkci IL—6 a expresi zvýšených množství CD86, CD40, CD54 a MHCII. Zvyšuje DNA vazebnou aktivitu transkripěních faktorů NFkB a AP-1, stejně jako fosforylaci stresem aktivovaných protein-kinas JNK a p38, a transkripčního io faktoru ATE-2. B-lymfocytámí signalizační dráhy aktivované CpG DNA byly odlišné od drah aktivovaných receptorem B-lymfocytů, které aktivuje ERK a různé izoformy JNK, ale který neaktivuje p38 a ATF-2. Obecně jsou data týkající se přenosu signálu iniciovaného CpG DNA v souladu s daty získanými u myší (Hacker, H. et al., 1998, EMBO J., 17: 6230, Vi A. K. a Krieg
A. M., 1998, J. lmmunol. 161:4493).
Výhodným nehlodavčím motivem je 5 TCGTCGTT-3'. Výměny bází v nejúčinnějším 8 měrovém CpG motivu (5-TCGTCGTT-3') snižovaly aktivitu oligonukleotidu. Thymidiny v 5' a 3' pozicích tohoto motivu byly důležitější než thymídin ve střední pozici. Adenin aguanosin ve střední pozici snižovaly aktivitu.
Naše pokusy prokázaly, Že jeden lidský CpG motiv ve fosfodiesterovém oligonukleotidu (2080) je dostatečný pro produkci maximálního účinku, a že další CpG motivy (2059) nezvyšují dále tuto aktivitu. Oligonukleotid s 8-merovým motivem 5-TCGTCGTT-3' (2080) obsahujícím dva CpG dinukleotidy měl v pokusech nejvyšší aktivitu. Substituce bází sousedících s dvěma CpG dinukleotidy (5' pozice, střední pozice, 3' pozice) snižovala aktivitu této sekvence. Oba CpG dinukleotidy v 8-merovém CpG motivu byly nutné pro optimální aktivitu (2108, 2106). Methylace cytidinů CpG dinukleotidů (2095) rušila aktivitu 2080, zatímco methylace nepříbuz.ného cytidinu (2094) nikoliv. Přidání dvou CpG motivů do sekvence 2080 nevedlo v sekvenci 2059 k dalšímu zvýšení aktivity fosfodiesterového oligonukleotidu. Sekvence 2080 s fosforothioátoio vým skeletem (2116) měla menší aktivitu, což naznačuje, že další CpG motivy jsou výhodné pro účinný fosforothioátový oligonukleotid.
V předkládaném vynálezu bylo zjištěno, že imunostimulační nukleové kyseliny mají dramatický imunostimulační účinek na lidské buňky, jako jsou NK buňky, B-lymfoeyty a DC, in vitro. Rylo prokázáno, že použité testy in vitro určují in vivo účinnost jako vakcinačního adjuvans u obratlovců jiných než hlodavců (příklad 12), což naznačuje, že imunostimulační nukleové kyseliny jsou účinným terapeutickým činidlem pro vakcinaci u člověka, v nádorové imunoterapii, imunoterapii astmatu, celkovém posílení imunitní reakce, regeneraci hematopoesy po radiaci nebo chemoterapii a vjiných imunomodulačních aplikacích.
Tak jsou imunostimulační nukleové kyseliny použitelné v některých aspektech vynálezu jako profylaktická vakcína pro léčbu jedinců s rizikem vzniku infekce infekčním organismem nebo s rizikem vzniku nádoru, u kterého byl identifikován specifický nádorový antigen, nebo alergie nebo astmatu, u kterých je znám alergen nebo predispozice k astmatu. Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být také podávány bez antigenu nebo alergenu pro krátkodobější ochranu před infekcí, alergií nebo nádory, a v tomto případě umožní opakované dávky dlouhodobější ochranu. Jako rizikový jedinci jsou zde označováni jedinci s jakýmkoliv rizikem vzniku infekce patogenem nebo nádoru nebo expozice alergenu. Například může být rizikovým jedincem ten, který plánuje cestu do oblastí, kde se vyskytuje infekční agens, nebo jedinec, který je díky svému
-45CZ 301488 B6 životnímu stylu nebo lékařským zákrokům vystaven působení kapalin, které mohou obsahovat infekční organismy, nebo přímo organismům, nebo také jedinec, který žije v oblasti, ve které se vyskytují infekční organismy nebo alergeny. Mezi jedince s rizikem infekce také patří obecná populace, které zdravotnické organizace doporučují vakcinaci antigenem konkrétního infekčního organismu. Pokud je antigenem alergen a u jedince se vyvíjí alergická reakce na tento konkrétní antigen a jedinec může být vystaven působeni antigenů, například během pyiové sezóny, tak je tento jedinec rizikový z hlediska expozice antigenů. Mezí jedince rizikové z hlediska vzniku alergie nebo astmatu patří jedinci, u kterých byla identifikována alergie nebo astma, ale kteří nemají aktivní onemocnění během léčby imunostimulaěními nukleovými kyselinami, stejně jako jedinci, io kteří jsou považováni za rizikové z hlediska vzniku těchto onemocnění z důvodů genetických faktorů nebo faktorů prostředí.
Jedinci rizikoví z hlediska vzniku nádorů jsou ti, kteří mají vysokou pravděpodobnost vzniku nádorů. Mezi takové jedince patří například jedinci s genetickou abnormalitou, u které bylo pro15 kázáno, že koreluje s vyšší pravděpodobností vzniku nádorů, a jedinci vystavení působení látek způsobujících nádory, jako je tabák, azbest nebo jiné chemické toxiny, nebo jedinci, kteří byly dříve léčení pro nádory a jsou v remisi. Když je jedinec rizikový z hlediska vzniku nádoru léčen antigenem specifickým pro určitý typ nádoru, pro který má jedinec vyšší riziko, a imunostimulační nukleovou kyselinou, tak může být schopen zabíjet nádorové buňky hned po jejich vzniku.
Když se u jedince začíná tvořit nádor, tak se u jedince vyvíjí specifická imunitní reakce proti nádorovému antigenů.
Kromě použití imunostimulačních nukleových kyselin pro profylaktickou léčbu zahrnuje předkládaný vynález také použití imunostimulačních nukleových kyselin pro léčbu jedince s infekcí, alergií, astmatem nebo nádorem.
Jedincem s infekcí je jedinec, který byl vystaven působení infekčního patogenu a který má akutně nebo chronicky detekovatelné hladiny patogenu v těle. Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být použity s antigenem pro vyvolání systémové nebo slizniční imunitní reakce specifické ío pro antigen, která je schopna redukovat množství nebo eradikovat infekční patogen. Infekční onemocnění je onemocnění vznikající v důsledku přítomnosti cizorodého mikroorganismu v těle.
Jc důležité vyvinout účinné vakcinační strategie a léčby pro ochranu sliznic těla, které jsou primárním místem průniku patogenu.
J5 Jedincem s alergií je takový jedinec, u kterého je riziko alergické reakce v odpovědi na alergen. Alergie je získaná hypersensitivita na substanci (alergen). Alergickými onemocněními jsou, například, ekzém, alergická rhinitis nebo koryza, senná rýma, konjunktivitida, bronchiální astma, urtikarie a potravinové alergie, a jiná atopická onemocnění.
V současné době jsou alergické nemoci obvykle léčeny injekcí malých dávek antigenů, po kterých následuje postupné zvyšování dávek antigenů. Předpokládá se, že tento postup indukuje vznik tolerance na antigen a brání dalším alergickým reakcím. IJ těchto metod může však trvat několik let, než začnou být účinné a jsou asociované s vedlejšími účinky, jako je anafýlaktický šok. Způsoby podle předkládaného vynálezu eliminují tyto problémy.
Alergie jsou obvykle způsobeny tvorbu IgE protilátek proti škodlivým alergenům. Cytokiny, které jsou indukovány systémovým nebo slizničním podáním imunostimulační nukleové kyseliny, jsou především třídy fhl (příklady jsou IL 12 a 1FN—γ) a tyto cytokiny indukují jak protilátkovou, tak buněčnou imunitní reakci. Typy protilátek asociovaných s Th 1 reakcí jsou obvykle .sn více protektivní, protože mají vysoké neutralizační a opsonizacní schopnosti. Dalším hlavním typem imunitní reakce, která je asociovaná s produkcí 1L -I. IL—5 a 11.10 cytokinů, je Th-2 imunitní reakce. Th2 reakce je především protilátková reakce a tyto protilátky mají méně protektivní účinky proti infekci a některé Th2 izotypy (například IgE) jsou asociované s alergií. Obecně se zdá, že alergická onemocnění jsou asociovaná s Th2 imunitní reakcí, zatímco Th 1 imunitní reakce poskytuje nejlepší ochranu proti infekci, ačkoliv je nadměrná Thl odpověď asociovaná
-46 s auto imunitním onemocněním. Z důvodu schopnosti imunostimulační nukleové kyseliny posunout imunitní odpověď u jedince z Th2 (která je asociovaná s produkcí IgE protilátek a alergií) k Thl reakci (která je protektivní před alergickými reakcemi), může být dávka imunostimulační nukleové kyseliny účinná pro indukci imunitní reakce podána jedinci pro léčbu nebo prevenci alergie.
iu
Tak mohou mít imunostimulační nukleové kyseliny významné terapeutické použití při léčbě alergických a nealergických onemocnění, jako je astma. Th2 cytokiny, zejména 11—4 a iL-5, jsou elevovány v dýchacích cestách astmatiků. Tyto cytokiny způsobují významné příznaky astmatické /xmičuívč reakce.
- X - 2Í 1. . x, Λ l-_l' A l, A,' I M I II
V VVtllV pi Vdlllj M4 UU 1 gL IZ.Wlj p. VI ι VI11 ví LUriv wJiuui 1 iu žímýeh buněk. Thl cytokiny, zejména lFN-γ a IL—12, mohou potlačovat tvorbu Th2 klonů a produkci I h2 cytokinů. Astma označuje onemocnění respiračního systému charakterizované zánětem, zúžením dýchacích cest a zvýšenou reaktivitou dýchacích cest na inhalované látky. Astma je často, ačkoliv ne vždy, asociované s atopickými nebo alergickými příznaky.
Jedinci s nádorem jsou jedinci s detekovatelnými nádorovými buňkami. Nádorem může být maligní nebo nemaligní nádor. Mezi nádory patří, například, nádory žlučových cest; nádory mozku; nádory prsu; nádory čípku děložního; choriokarcinom; nádory tlustého střeva; nádory endometria; nádory jícnu; nádory žaludku; intraepitelové neoplasie; lymťomy; nádory jater; nádory plic (například malobuněčný a nemalobuněčný karcinom); melanom; neuroblastom; nádory dutiny ústní; nádory ovaria; nádory slinivky břišní; nádory prostaty; nádory rekta; sarkomy; nádory kůže; testikulámí nádory; nádory štítné žlázy; a nádory ledvin; stejně jako jiné karcinomy a sarkomy. V jednom provedení je nádorem vlasatobuněčná leukemie, chronická myeloidní leukemie. kožní T-Iymfccytámí leukemie, folikulámí lymfom, maligní melanom, spinocelulámí karcinom, karcinom ledvin, karcinom prostaty; karcinom močového měchýře nebo karcinom tlustého střeva.
Jedinci podle předkládaného vynálezu jsou jedinci jiní než hlodavci. Jedinec jiný než hlodavec je člověk nebo obratlovec, jako například pes, kočka, kůň, kráva, prase, ovce, koza, kuře, primát, například opice, a ryba (užitkové druhy), například losos, ale ne hlodavec, jako je myši nebo krysa.
Tak může být předkládaný vynález také použit pro léčbu nádorů u živočichů jiných než člověk. Nádory jsou jednou z hlavních příčin úmrtí domácích zvířat (tj. koček a psů). Nádory' obvykle postihují starší zvířata, která se, v případě domácích mazlíčků, integrovala do rodiny. 45 % psů starších 10 let pravděpodobně podlehne tomuto onemocnění. Nejčastější léčbou je chirurgická léčba, chemoterapie a radioterapie. Mezi další léčebné modality, které jsou používané s určitými úspěchy, patří laserová terapie, kryoterapie, hypertermie a imunoterapie. Volba léčby závisí na ty pu nádorů a na stupni disseminace. Pokud není maligní nádor omezen na jedinou oblast v těle,
4ů jc obtížné odstranit pouze maligní tkáň bez postižení normálních buněk.
Maligními onemocněními běžně diagnostikovanými u psů a koček jsou lymfosarkom, osteosarkom, nádory mléčné žlázy, mastocytom, nádory mozku, melanom, adenoskvamozní karcinom, karcinoid plic, karcinom bronchiálních žlázek, bronchiolární karcinom, fibrom, myxochondrom, plicní sarkom, neurosarkom, osteom, papilom, retinoblastom, Ewingův sarkom, Wilmsův tumor, Burkittův lymfom, mikrogliom, neuroblastom, osteoklastom, orální neoplasie, fibrosarkom, osteosarkom a rhabdomyosarkom. Mezi další neoplasie u psů patří genitální spinocelulámí karcinom, přenosné venerální nádory, testikulámí nádory, seminom, nádor ze Sertoiiho buněk, hemangiopericytom. histiocytom, chlorom (granulocytární sarkom), komeální papilom, korneální spino50 celulámí karcinom, hemangiosarkom, pleuralní mesoteliom, bazocelulámí karcinom, thymom, nádory žaludku, karcinom nadledvin, orální papilomatosa, hemangioendoteliom akystadenom. Mezi další malignity diagnostikované u koček patří folikulámí lynifom. střevní Ivmfosarkom. fibrosarkom a plicní spinocelulámí karcinom. U fretek, populárních domácích zvířat, často vzniká insulinom, lymfom, sarkom, neurinom, nádor z buněk pankreatických ostrůvků, žaludeční
MALT lymfom a adenokarcinom žaludku.
-47CZ 301488 B6 ι
I
I
Mezi malignity postihující zemědělská zvířata patří leukemie, hemangioperieytom a hovězí oční neoplasie (u dobytka); prepuciální fibrosarkorn, ulcerosní spinocelulámí karcinom, prepuciální karcinom, neoplasie pojivové tkáně a mastocytom (u koní); hepatoeelulární karcinom (u prasat); ;
? lymfom a plicní adenomatosa (u ovcí); plicní sarkom, lymfom, Rousův sarkom, retikuloendoteli- !
osa, fibrosarkorn, nefroblastom, B-lymfocytární lymfom a lymfoidní leukosa (u ptáků); retinoblastom, jaterní neoplasie, lymfosarkom (lymfoblastický lymfom), plasmatocytoidní leukemie a sarkom vzduchového měchýře (u ryb), kaseozní lymfadenitida (CLA): chronická, infekční, přenosná nemoc ovcí a koz způsobená bakterií Corynebacterium pseudotubereulosis, a nakažlivý io plicní nádor ovcí způsobený Jaagsiekte“
Jedinec je vystavený působení antigenu. Termín vystavený působení antigenu, jako je zde použit, označuje buď aktivní krok kontaktování jedince s antigenem, nebo pasivní expozici jedince antigenu in vivo. Způsoby pro aktivní expozici jedince antigenu jsou dobře známé v oboru. Obecně, i? antigen je podán přímo jedinci prostřednictvím intravenosního, intramuskulámího, orálního, transdermálního, slizničního, intranasálního, intratracheálního nebo podkožního podání. Antigen může být podán systémově nebo lokálně. Způsoby pro podání antigenu a imunostimulační nukleové kyseliny jsou podrobněji popsány dále. Jedinec je pasivně exponován antigenu tehdy, když se antigen stane dostupným pro imunitní buňky v těle. Jedinec může být pasivně exponován antigenu například průnikem cizorodého antigenu do těla nebo vznikem nádorových buněk exprimujících cizorodé antigeny na svém povrchu.
Způsoby, ve kterých je jedinec pasivně exponován antigenu, mohou být závislé na načasování podání imunostimulační nukleové kyseliny. Například, u jedince, u kterého je riziko vzniku nádoru nebo infekčního onemocnění nebo alergické nebo astmatické reakce, může být imunostimulační nukleová kyselina podávána pravidelně v době, kdy je riziko nejvyšší, tj. během alergické sezóny nebo po expozici látce způsobující nádory. Další imunostimulační nukleová kyselina může být podána turistům před cestou do cizích zemí. kde je riziko infekce infekčním agens.
Obdobně může být imunostimulační nukleová kyselina podána vojákům nebo civilistům při rizi3» ku použití biologických zbraní za účelem indukce systémové nebo slizniční imunitní reakce na antigen a při a když je jedince exponován antigenu.
Antigen je molekula schopná vyvolat imunitní reakci. Antigeny jsou například buňky, buněčné extrakty, proteiny, polypeptidy, peptidy, polysacharidy, polysacharidové konjugáty, peptidy .35 a nepeptidové sloučeniny napodobující polysacharidy a jiné molekuly, malé molekuly, lipidy, glykolipidy, karbohydráty, viry a virové extrakty a mnohobuněčné organismy jako jsou parazity, a alergeny. Termín antigen zahrnuje jakoukoliv molekulu, která je rozpoznávána imunitním systémem hostitele jako cizorodá. Mezi antigeny patří nádorové antigeny, mikrobiální antigeny a alergeny.
II)
Nádorový antigen je sloučenina, jako je peptid nebo protein, asociovaná s nádory nebo povrchem nádorů, která může vyvolat imunitní reakcí, když je exprimována na povrchu buněk prezentujících antigen v asociaci s MHC molekulou. Nádorové antigeny mohou být připraveny z nádorových buněk buď přípravou surových extraktů nádorových buněk, jak je popsáno například v Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54; 1055, nebo částečným přečištěním antigenů, rekombinantní syntézou nebo de novo syntézou známých antigenů. Mezi nádorové antigeny patří, například, antigeny, které jsou exprimovány rekombinantnč, jejich imunogenní části nebo celé nádory, lakové antigeny mohou být isolovány nebo připraveny rekombinantnč nebo jinými způsoby známými v oboru.
Mikrobiální antigen je antigen mikroorganismu jako je virus, bakterie, parazit nebo houba. Mezi takové antigeny patří intaktní mikroorganismy, stejně jako jejich přirozené izoláty a fragmenty a deriváty, a také syntetické sloučeniny, které jsou identické nebo podobné přirozeným mikrobiálním antigenům a indukují imunitní reakci specifickou pro tento mikroorganismu. Sloučenina ^5 je podobná přirozenému mikrobiálnímu antigenu, pokud indukuje imunitní reakci (humorální
-48v*-* a Τ' a/nebo buněčnou) k přirozenému mikrobiálnímu antigenu. Takové antigeny jsou v oboru běžně používány a jsou známé odborníkům v oboru.
Příklady virů, které byly zjištěny u člověka, jsou: Retroviridae (například viry lidské imuno5 deficience, jako je HIV-1 (též označovaný jako HTLV III, LAV nebo HTLV-II/LAV, nebo 1 UV-ΠΙ; a jiné izoláty, jako je HIV-LP; Picomaviridae (například polio viry, virus hepatitidy A; enteroviry, lidské Coxsackie viry, rhinoviry, echoviry); Calciviridae (například kmeny způsobující gastroenteritidu); Togaviridae (například viry koňské encefalitidy, viry zarděnek); Flaviridae (například viry horečky dengue, viry encefalitidy, viry žluté zimnice); Coronoviridae (například io coronaviry); Knabdoviridae (například vity vesikuíámí sůjmauuuy, vuy vztekliny); TiíoviriuaC (například virus ebola); Paramyxoviridae (například parainfluenzové viry, virus spalniček, virus příušnic, respiračně syncytiální virus); (Jrthomyxoviridae (například chřipkové viry); Bungaviridae (například Hantaan viry, bunga viry, phleboviry a Nairo viry); Arenaviridae (viry hemorhagické horečky); Reoviridae (například reoviry, orbiviry a rotaviry); Birnaviridae; Hepadnaviridae i? (virus hepatitidy B); Parvoviridae (parvoviry); Papovaviridae (papilloma viry, polyoma viry): Adenoviridae (většinou adenoviry); Herpesviridae (herpes simplex virus (HSV) 1 a 2, virus varicella zoster, cytomegalovirus (CMV), herpes virus; Poxviridae (variola viry, viry vakcinie, pox viry); a Iridoviridae (například virus africké prasečí horečky); a neklasifikované viry (například etiologické agens spongiformních encefalopatií, agens hepatitidy delta (předpokládá se, že se jedná o defektní satelit viru hepatitidy B), agens non-A, non-E hepatitidy (třídy 1 = přenosné vnitřně; třídy 2 = přenosné parenterálně (tj. Hepatitida C); Nnrwalk a příbuzné viry a astrovirv).
Jak gram negativní, tak gram pozitivní bakterie působí jako antigeny u obratlovců. Mezi takové gram-pozitivní bakterie patří například Pasteurella species, Staphylococci species, a Strepto25 coccus species. Mezi gram-negativní bakterie patří, například, Escherichia coli, Pseudomonas species a Salmonella species. Příklady infekčních bakterií jsou, například, Helicobacter pylori. Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sp. (například M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningtidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus skupiny A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus skupiny B), Streptococcus (viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobní sp,), Streptococcus pneumoniae, patogenní Campylobacter sp., Enterococeus sp„ Haemophilus influenzae, Bacillus antracis. Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia a Actinomyces israelli.
Příklady hub jsou Cryptocoecus neoformans, Histoplasma capsulaum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candída albicans.
Mezi další infekční organismy (tj. prvoky) patří Plasmodium spp., jako je Plasrnodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasrnodium ovále a Plasmodium vivax a Toxoplasma gondii. Mezi krevní a/nebo tkáňové parazity patří Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leisbmania braziliensis, Leishmanta donovani, Trypanoso45 ma gambiense a Trypanosoma rhodesiense (Africká spává nemoc), Trypanosoma cruzi (Chagasova nemoc) a Toxoplasma gondii.
Další relevantní mikroorganismy jsou popsány v literatuře, viz například C. G. A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, jejíž celý obsah je zde uveden jako odkaz. Ačkoliv se výše popsané mikrobiální antigeny týkají lidských onemocnění, je vynález také použitelný pro léčbu jiných obratlovců, U obratlovců jiných než je člověk se také mohou vyvinout infekce, které mohou být preventivně nebo kuráti vně léčeny imunostimulačními nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu. Například, kromě léčby infekčních onemocnění u člověka jsou způsoby podle předkládaného vynálezu také použitelné pro léčbu infekcí u zvířat.
-49C7.301488 Bó
Termíny léčba, léčený, léčení, jak jsou zde použity s ohledem na infekční onemocnění, označují proťylaktickou léčbu, která zvyšuje resistenei jedince (jedince rizikového / hlediska infekce) na infekci patogenem, nebo jinými slovy, které snižují pravděpodobnost, žc se jedinec stane infiko? váný patogenem, stejně jako léčbu jedince {infikovaného jedince), který byl infikován, za účelem redukce nebo eliminace infekce nebo za účelem její prevence.
Mnoho vakcín pro léčbu obratlovců jiných než je člověk je popsáno v Bennet, K. Compendium of Veterinary Products, 3. vydání, North American Compediums, lne., 1995. Jak bylo uvedeno to výše, mezi antigeny patří infekční mikroby, jako jsou viry, paraziti, bakterie a houby a jejich fragmenty, které jsou odvozené od přirozených zdrojů nebo synteticky. Mezi infekční viry pro obratlovce včetně člověka patří retroviry, RNA viry a DNA viry. Tato skupina retrovirů zahrnuje jak jednoduché retroviry, tak komplexní retroviry. Mezi jednoduché retroviry patří podskupina B retrovirů, podskupina C retrovirů a podskupina D retrovirů. Příkladem retrovirů podskupiny B je virus myšího mamámího tumoru (MMTV). Mezi retroviry typu C patří skupina A podskupiny C (jako je virus Rousova sarkomu (RSV), virus ptačí leukemie (ALV) a virus ptačí myeloblastosy (AMV)) a skupina B podskupiny C (jako je virus kočičí leukemie (FeLV), virus giboni leukemie (GALV), virus nekrosy sleziny (SNV), virus retikuloendoteliosy (RV) a virus opičího sarkomu (SSV)). Mezi retroviry typu D patří virus Mason Pfizerovy opice (MPMV) a opičí retrovirus io typu 1 (SRV- 1). Mezi komplexní retroviry patří podskupiny lentivirů, viry T-Iymťocytámí leukemie a „foamy“ viry. Mezi lentiviry patří HIV-l, ale též HIV-2, SIV, Visna virus, virus kočičí imunodeficience (FTV), a virus koňské infekční anemie (El A V). Mezi viry T-lymfocytární leukemie patří HTLV-1. HTLV-II, virus opičí T-lymfocytámí leukemie (STLV) a virus hovězí leukemie (BLV). Mezi „foamy“ viry patří lidský „foamy“ virus (HFV), opičí „foamy“ virus (SFV) a hovězí „foamy“ virus (BFV).
Příklady jiných RNA virů, které jsou antigeny u obratlovců, jsou například členové rodiny Reoviridae, včetně rodu Orthoreo virus (různé serotypy savčích a ptačích retrovirů), rod Orb i virus (Bluetongue virus, Eugenangee virus, Kemerovo virus, virus africké koňské nemoci a virus so coloradské klíšťové horečky), kmen Rotavirus (lidský rotavirus, nebraský virus průjmu telat, opičí rotavirus, hovězí nebo ovčí rotavirus, ptačí rotavirus); rod Picomaviridae, včetně kmenu
Enterovirus (poliovirus, Coxsackie virus A a B, enterocytopatický lidský organ (ECHO) virus, virus hepatitidy A, opičí enteroviry, virus myší encefalomyelitidy (ME), poliovirus muris, hovězí enteroviry, prasečí enteroviry, kmen Cardiovirus (virus eneefalomyokarditidy (EMC), Mengo55 virus), kmen Rhinovirus (lidské rhinoviry, včetně alespoň 113 subtypů; další rhinoviry), rod Apthovirus (slintavka a kulhavka (FMDV); čeleď Calciviridae, včetně viru vesikulámího exanthemu prasat, viru San Miguel lvounů, kočičího pieornaviru a viru Norwalk; čeleď Togaviridae, včetně rodu Alphavirus (virus východní koňské encefalitidy, Semliki foreset virus, Sindbis virus, Chikungunya virus, O'Nyong-Nyong virus, Ross river virus, virus venezuelské koňské encefalitiK) dy, virus západní koňské encefalitidy), rodu Flavirius (virus žluté zimnice přenášený moskyty, virus horečky Dengue, virus japonské encefalitidy, virus saintlouiské encefalitidy, virus Murray Val lev encefalitidy, západonilský virus, Kunjin virus, virus středoevropské klíšťové encefalitidy, virus dálněvýchodní klíšťové encefalitidy, Kyasanur forest virus, Louping 111 virus, Powassan virus, virus Omské hemorrhagieké horečky), rodu Rubivirus (Rubella virus), rodu Pestivirus •15 (virus onemocnění sliznic, virus prasečí cholery, virus hraniční nemoci); čeleď Bunyaviridae, včetně rodu Bunyvirus (Bunyamwera a příbuzné viry, viry kalifornské encefalitidy), rodu Ph!ebovirus (virus sicilské horečky, virus Rift Valley horečky), rodu Nairovirus (virus krymskékonžské hemorhagické horečky, virus nairobské nemoci ovcí) a rodu Uukuvirus (Uukuniemi a příbuzné viry); čeleď Orthomyxoviridae, včetně rodu Influenza viru (influenza virus typu A, mnoho lidských subtypů); virus prasečí chřipky, a viry ptačí a koňské chřipky; influenza typu B (mnoho lidských subtypů), a influenza typu C (možná samostatný rod); čeleď Paramyxoviridae, včetně rodu Pararnyxovirus (parainfluenza virus typu 1, Sendai virus, hemadsorpční virus, Parainfluenza viry typu 2 až 5, virus Newcastelské nemoci, virus příušnic), rodu Morbillivirus (spalničkový virus, virus subakutní sklerozujíeí panencefalitidy, virus psinky, Rinderpest virus), rodu Pneumovirus (respíračně syncytiální virus (RSV), hovězí respiračnč syncytiální virus
- 50a Pneumonia virus); čeleď Rhabdoviridae, včetně rodu Vesiculovirus (VSV), Chandipura virus,
Flanders-I lart Park virus), rodu Lyssavirus (virus vztekliny), rybí Rhabdoviry a dva pravděpodobné Rhabdoviry (Marburg virus a Ebola virus); čeleď Arenaviridae, včetně viru lymfocytární ehoriomeningitidy (LCM), komplexu Tacaribe viru a viru Lassa; čeleď Coronoavtridae, včetně viru infekční bronchitidy (IBV), viru hepatitidy, lidského enterálního koronaviru a viru kočičí infekční peritonitidy (kočičí koronavirus).
Příklady jiných DNA virů, které jsou antigeny u obratlovců, jsou například členové čeledi Poxviridae, včetně rodu Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, virus opičích neštovic, ιϋ MavsKycn, uizuuíuli, kialiěiuli a EcííOiiičlia iičsíúvic), rodu LeporipoxVirtis (Myxom, Fibrc™), rodu Avipoxvirus (drůbeží neštovice, jiné ptačí poxviry), rodu Capripoxvirus (ovčí, kozí neštovice), rodu Suipoxvirus (prasečí neštovice), rodu Parapoxvirus (virus kontaktní dermatitidy, pseudoxowpox virus, virus hovězí papulámí stomatitidy); čeleď Iridoviridae (virus africké prasecí horečky, Frog viry 2 a 3, virus rybí lymfocystosy); čeleď Herpesviridae, včetně alfa15 Herpesvirú (Herpes Simplex Typy 1 a 2, Varicella-Zoster, virus koňských potratů, koňský herpes virus 2 a 3, pseudorabies virus, virus infekční hovězí kefatokonjunktivitidy. virus infekční hovězí rhinotracheitidy, virus kočičí rhinotracheitidy, virus infekční laryngotracheitidy), Beta-herpesviry (Lidský eytomegalovirus a cytomegaloviry prasat a opic); gamma-herpesviry (virus Epstein-Barrové (EBV). virus Marekovy nemoci, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpes20 virus sylvilagus, morěeeí herpes virus, virus Lucké nádoru); čeleď Adenoviridae, včetně rodu Mastadenovirus (lidské podskupiny A, R, C, D, L a nezařazené kmeny; opičí adenoviry (alespoň 23 sérotypů), virus infekční psí hepatitidy a adenoviry dobytka, prasat, ovcí, žab a mnoha dalších druhů, rodu Aviadenovirus (ptačí adenoviry); a nekultivované adenoviry; čeleď Papoviridae, včetně rodu Papillomavirus (lidské papilloma viry, hovězí papilloma viry jiných druhů), rodu
Polyomavirus (polyomavirus, opičí vakuolizační virus (SV-40), králičí vakuolizační virus (RKV), K virus, BK virus, JC virus, a jiné primáti polyoma viry, jako je lymfotropní papilloma virus); čeleď Parvoviridae, včetně rodu adeno-asoeiovaných virů, rodu Parvovirus (virus kočičí panleukopenie, hovězí parvovirus, psí parvovirus, Aleutský virus nemoci norků, atd.). Konečně, mezi DNA viry mohou patřit viry, které neodpovídají výše uvedeným čeledím, jako je virus Kuru a Creutzfekl- Jakobovy nemoci a agens chronické infekční neuropatie (CHINA virus).
Každý z výše uvedených seznamů je pouze ilustrativní a není omezující.
Kromě použití imunostimulačníeh nukleovýeh kyselin pro indukci imunitní reakce specifické pro antigen u člověka jsou způsoby podle předkládaného vynálezu vhodné pro léčbu ptáků, jako jsou slepice, kuřata, krocani, kachny, husy, křepelky a bažanti. Ptáci jsou cílem pro různé infekce.
Líhnoucí se ptačí mláďata jsou vystavena působení patogenních mikroorganismů krátce po vylíhnutí. Ačkoliv jsou tito ptáci nejprve chráněny před patogeny materskými protilátkami, je tato ochrana pouze dočasná a vlastní nezralý imunitní systém ptáčete musí začít chránit jedince před infekcí. Často je žádoucí zabránit infekci u ptáčat, když jsou nejvíce vnímavá k infekci. Také je žádoucí bránit infekci u starších ptáků, zejména jsou-1 i chováni v uzavřených boxech, kde dochází k rychlému šíření onemocnění. Proto je žádoucí podat imunostimulaění nukleové kyseliny a non-nukleokyselinová adjuvans podle předkládaného vynálezu ptákům pro zesílení imunitní reakce specifické pro antigen, když je antigen přítomen.
Příkladem časné infekce kuřat je infekce virem kuřecí infekční anemie (CIAV). CIA V byl poprvé izolován v Japonsku v roce 1979 během výzkumu týkajícího se vakcinaee proti Marekovč nemoci (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23: 366-385). Od této doby byl CIAV detekován u komerčně chované drůbeže ve všech zemích produkujících drůbež (van Bulow et al., 1991, str. 690-699), v Diseases of Poultry, 9. vydání, Iowa State University Press).
Infekce CIAV vede k rozvoji klinického onemocnění, které je charakterizované anemií. krvácením a imunosupresí a které se rozvíjí u vnímavých mladých kuřat. Atrofie thymu a kostní dřeně a konzistentní leze u kuřat infikovaných CIAV jsou také charakteristikami CIAV infekce. Deple-51 CZ 301488 B6 ce lymfocytů v thymu a občas ve Fabrieiově burse vede k imunosupresi a zvýšení citlivosti na sekundární virové, bakteriální nebo mykotické infekce, které potom komplikují průběh onemocnění. lmunosuprese může způsobovat zhoršení onemocnění po infekci virem Marekovy nemoci (MDV), virem infekční bursitidy, virem retikuloendoteliosy, adenovirem nebo reovirem. Bylo s popsáno, že patogenese MDV je zesílena CIAV (DeBoer et al., 1989, st. 28. v Proceedings of the
38íh Western Poultry Diseasc (konference, Tempe, Ariz.). Dále bylo popsáno, že CIAV zhoršuje příznaky infekční bursitidy (Rosenberg et al.. 1989, Avian Dis. 33:707-713). IJ kuřat se s věkem vyvíjí resistence na experimentálně indukované onemocnění způsobené CAA. Tato resistence je v podstatě dokončená ve věku 2 týdnů, ale starší ptáci jsou stále ještě citliví na infekci (Yuasa, N. ío et al., 1979, výše; Yuasa, N. et al., Arian Diseases, 24: 202-209, 1980). Nicméně, pokud jsou kuřata duálně infikována CAA a imunosupresivním agens (IBDV, MDV atd,), je resistence vznikající s věkem oddálena (Yuasa et al., 1979 a 1980, výše; Bulow von V. et al., J. Veterinary
Medicine 33: 93-116, 1986). Charakteristikou CIAV je to, že může potencovat přenos onemocnění včetně vysoké resistence na inaktivaci v prostředí a některá běžná dezinfekční činidla,
Ekonomický vliv CIAV infekce na drůbežářství je jasný ze skutečnosti, že 10 až 30 % infikovaných ptáků hyne.
Vakeinace ptáků může být, podobně jako vakcinace jiných obratlovců, provedena v jakémkoliv věku. Obvykle je vakcinace prováděna do 12 týdne věku pro živé mikroorganismy a mezi 14 až jo 18 týdnem pro inaktivované mikroorganismy nebo vakcíny jiného typu. Při vakcinaci ve vajíčku může být vakeinace provedena v poslední čtvrtině vývoje embrya. Vakcína může být aplikována podkožně, sprejem, orálně, nitroočně, intratraeheálně, nasálně nebo jinou metodou aplikace pres sliznici. Tak mohou být imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu podány ptákům nebo nonlidskym obratlovcům za použití běžných vakcinačních protokolů a antigen může být podáván po vhodné době, která je zde popsána.
Dobytek a užitková zvířata jsou také citlivá na infekci. Onemocnění, která postihují tato zvířata, mohou způsobovat závažné ekonomické ztráty, zejména mezi dobytkem. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro prevenci infekce u užitkových zvířat, jako jsou krávy, jo koně, prasata, ovce a kozy.
Krávy mohou být infikovány dobytčími viry. Virus průjmu dobytka (BVDV) je malý obalený
RNA virus a náleží, společně s virem cholery ježků (HOCV) a virem hraniční nemoci ovcí (BDV) do rodu pestivirus. Ačkoliv byly pestiviry dříve řazeny do čeledi Togaviridae, některé 35 studie je reklasifikují do čeledi Flaviridíae společně s virem hepatitidy C (HCV) (Francki etal., 1991).
BVDV, který je významným patogenem dobytka, může být rozdělen, podle analýz buněčné kultury, na cytopatogcnní (CP) a necytopatogenní (NCP) biotyp. NCP biotyp je rozšířenější, ačkoliv se u dobytka vyskytují oba biotypy. Když je březí kráva infikována kmenem NCP, tak může vrhnout tele trvale infikované a specificky imunotolerantní, které šíří virus po celý svůj život. Trvale infikované tele se může nakazit slizničním onemocněním a od zvířete mohou být potom izolovány oba biotypy. Klinickými příznaky jsou potraty, teratogenese a respirační potíže, postižení sliznic a mírný průjem. Dále muže vzniknout těžká trombocytopenie, asociovaná s epidemií ve stádě, a která může vést k úhynu, a kmeny asociované s touto manifestací se zdají být virulentnější než klasické BVDV.
Koňské herpes viry (EHV) jsou skupinou antigenné odlišných biologických činidel, které způsobují různé infekce u koní, od subklinických až do fatálních. Patří sem koňský herpesvirus-1 sn (EHV 1), ubikvitní patogen u koní. EHV-1 je spojen s epidemiemi potratů, onemocnění respiračniho traktu a onemocněními centrálního nervového systému. Primární infekce horního respiračního traktu u mladých koní vede k febrilnímu onemocnění, které trvá 8 až 10 dnů. Imunologicky zkušené klisny mohou být reinfikovány cestou respiraěního traktu bez manifestace onemocnění, takže k potratu obvykle dojde bez varovných příznaků. Neurologický syndrom jc spojený s respiračním onemocněním nebo potratem a může postihovat zvířata jakéhokoliv pohlaV 4 u ví v jakémkoliv věku a projevuje se ztrátou koordinace, slabostí a paralýzou zadních končetin (Telford, E. A. R. et al„ Virology 189: 304-316, 1992). Mezi další EHV patří EHV-2 nebo koňský cytomegalovirus, EHV-3, virus koňského koitálního exantému a EHV—I. který byl dříve označován jako podtyp 2 EHV-1,
Ovce a kozy mohou být infikovány různými mikroorganismy, včetně visna-maedi.
io
Primáti, jako jsou lidoopi a makakové, mohou být infikováni virem opičí imunodeficience. Bylo popsáno, že vakcíny obsahující inaktivovaný virus a bezbuněčné vakcíny obsahující virus opičí imunodeficience, jsou účinné v dosažení oeliiauy u inakaků (Stotí et al., 1990, Lanccí 36: 1538-1541; Desrosiers et al., PNAS USA (1989) 86: 6353-6357; Murphey Corb et al., (1989) Science 246: 1293-1297; a Carlson et al., (1990), AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239— 1246). Rekombinantní HIV gpl20 vakcína byla účinná v prevenci infekce u šimpanzů (Berman et al., 1990, Nátuře 345: 622-625).
Kočky, jak domácí, tak divoké, jsou citlivé na infekci různými mikroorganismy. Například kočičí infekční peritonitida je onemocnění, které se vyskytuje u domácích i u divokých koček, jako jsou lvi, levhartů, gepard a jaguárů. Když je žádoucí zabránění této a jiných typů infekcí u koček, tak může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro vakcinaci koček za účelem jejich ochrany před infekcí.
Domácí kočky mohou být infikovány několika retroviry, včetně viru kočičí leukemie (EeLV), viru kočičího sarkomu (FeSV), endogenního Cancomaviru (RD-114) a kočičího viru vyvolávajícího syncytie (EeSEV). Z těchto virů je FeLV nej významnějším patogenem způsobujícím různé příznaky, včetně lymforetikulárních a myeloidních neoplasií, anemií, autoimunitních onemocnění a imunodeficitu, který se podobá lidskému syndromu získané imunodeficience (AIDS). Nedávno byl konkrétní replikace deficitní EeLV mutant, označený jako FeLV-AIDS, spojen s imunosupresivními účinky.
Objev kočičího T-lymfotropního tentiviru (též. označovaného jako viru kočičí imunodeficience) by prvně popsán v Pedersen et af, (1987) v Science, 235: 790-793. Charakteristiky FIV byly popsány v Yamamoto et al., 1988, Leukemia, Deeember Supplement 2: 204S-215S; Yamamoto et al., 1988, Am, J. Vet. Res. 49: 146-1258; a Aekley et af, 1990, J. Virol. 64: 5652-5655. Klonování a analýza sekvence FIV jsou popsány v Qlmsted et al., 1989, Proč, Nati. Acad. Sci.
USA 86: 2448-2452 a 86: 4355^1360.
Kočičí infekční peritonitida (E1P) je sporadické onemocnění vyskytující se nepředvídatelně u domácích a divokých koček. Ačkoliv je EíP primárně onemocněním domácích koček, bylo diagnostikováno též u lvů, pum, levhartů, gepardů a jaguárů. Mezi menší divoké kočky, které byly postiženy FIP, patří rys a karakal, pouštní kočka a manul. U domácích koček sc onemoenční vyskytuje převážně u mladých zvířat, ačkoliv citlivé k infekci jsou kočky jakéhokoliv věku. Pík incidence se objevuje mezi 6. a 12. měsíci věku. Pokles incidence se pozoruje mezí 5. a 13. rokem věku a potom se mezi 14. a 15. rokem incidence opět zvyšuje.
Virová, bakteriální a parazitární onemocnění u ryb, měkkýšů nebo jiných vodních živočichů, jsou významným problémem pro rybářský průmysl. V důsledku vysoké hustoty zvířat v chovných nádržích nebo uzavřených mořských farmách mohou infekční nemoci eradikovat velkou část zvířat, například ryb, měkkýšů nebo jiných vodních živočichů. Prevence onemocnění je výhodnější léčbou u ry b než intervence při rozvinutém onemoenční. Vakcinace ryb je jedinou preven50 tivní metodou, kterou je možno dosáhnout dlouhodobé ochrany v důsledku imunity. Vakcinace na bázi nukleových kyselin jsou popsány v patentu US 5 780 448 (Davis).
Imunitní systém ryb má mnoho rysů společných s imunitním systémem savců, jako je přítomnost B-lymfocytů, T-lymfocytů, lymfokínů, komplementu a imunoglobulinů. Ryby mají podtřídy
-53CZ 301488 B6 lymfocytů s úlohami patrně stejnými, jako mají B a TMymfocyty savců, Vakcíny mohou byt aplikovány ve formě imerze nebo orálně.
Mezi vodní živočichy patří, avšak neomezují se na ně, ryby, měkkýši a jiní vodní živočichové.
Mezi ryby patří všechny ryby s obratly, které mohou mít kostěný nebo chrupavčitý skelet, jako jsou například lososovití, kapr, sumec, platýs, pražma a kaníc. Lososovití jsou čeledí ryb. do které patří pstruh (včetně pstruha duhového), losos a sivěn alpský. Neomezující příklady měkkýšů jsou mlži, humři, gamáti, krabi a ústřice. Mezi další chované vodní živočichy patří bez omezení úhoři, olihně a chobotnice.
io
Mezi polypeptidy virových vodních patogenů patří, však neomezují se na ně, glykoprotein (G) nebo nukleoprotein (N) viru hemorhagické septikemie (VHSV); G nebo N proteiny viru infekční hematopoetické nekrosy (IHNV); VP1, VP2, VP3 nebo N strukturální proteiny viru infekční nekrosy pankreatu (1PNV); G protein jarní viremie kaprů (SVC); a protein asociovaný s mem15 bránou, tegumin nebo kapsidový protein nebo glykoprotein viru sumečka skvrnitého (channel catfish virus, CCV).
Mezi typické parazity' koní patří Gasterophilus spp.; Eimerta leuckarti; Giardia spp; Tritrichomonas equi; Babesia spp, (RBC); Theilcria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; Sarcocystis spp.
Mezi typické parazity prasat patří Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii a Sarcocystis spp. a Trichinella spiralis.
Mezi typické parazity dobytka patří Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC), Babesia bigemina (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC); Theileria parva (lymfccyty), Tritrichomonas foetus a Sarcocystis spp.
5o Mezi hlavní parazity dravců patří Trichomonas gallinae; Coccidia (Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (sovy), Elaemoproteus spp., Trypanosoma spp.; Histomonas, Cryptosporidium meleagridis. Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria, Toxoplasma.
Mezi typické parazity infikující kozy a ovce patří Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp.,
Toxoplasma gondii, Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC) a Sarcocystis spp.
Mezi typické parazitární infekce drůbeže patří kokcidiosa způsobená Eimeria acervulina, E. necatrix, E. tenella, Isospora spp. a Eimeria truncata; histomoniasa, způsobená Histomonas io maleagridis a Histomonas gallinarum; trichomoniasa způsobená Trichomonas gallinae; a hexamitiasa způsobená Hexamita meleagridis. Drůbež může být také infikována Eimeria maxima,
Eimeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium, Eimeria brunetti, Eimeria adenoeides. Leucocytozoon spp., Plasmodium spp., Haemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii a Sarcocystis. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také použi4s ty pro léčbu a/nebo prevenci parasitámích infekcí u psů. koček, ptáků, ryb a fretek. Mezi typické ptačí parazity patří Trichomonas gallinae; Eimeria spp., Isospora spp., Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Haernoproteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leueoeytozoon/Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Mezi typické parazity infikující psi patří Trichinella spiralis: Isospora spp., Sarcocystis spp., Cryptosporidium spp., Hammondia spp.,
Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.
-54jvnuu υυ
Mezi typické parazity infikující kočky patří Isospora spp., Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., Hammondia hammondí, Besnoitia spp., Giardia spp., Entamoeba hístolytica; Hepatozoon canis, Cvtauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (erytrocyty, RE buňky).
Mezi typické parazity infikující ryby patří Hexamita spp., Eimeria spp., Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp., Plístophora spp., Myxosoma Henneguya; Costia spp., Ichthyophithirius spp. a Oodinium spp.
Mezi typické parazity infikující divoká zvířata patří Giardia spp. (masožravci, bvložravci), Isoio spora spp. (masožravci), Eimeria spp. (masužiavci, býiožiavci), ílicikna spp. (bvložravci),
Babesia spp. (masožravci, býložravci), Trypanosoma spp. (masožravci, býložravci), Schistosoma spp. (býložravci), Fasciola hepatica (býložravci), Fascioloides magna (bvložravci), Fasciola gigantica (býložravci), Trichinella spiralis (masožravci, býložravci).
i? Parazitární infekce v zoo mohou být také vážným problémem. Mezi typické parazity čeledi bovidae (buvolec, antilopa, banteng, oryx, gaur, impala, klipspringer, kudu, gazela) patří Eimeria spp. Mezi typické parazity čeledi ploutvonožců (tuleň, lachtan) patří Eimeria phocae. Mezi typické parazity čeledi eamelidae (velbloudi, lamy) patří Eimeria spp. Mezi typické parazity čeledi elephantidae (slon africký a indický) patří Fasciola spp. Mezi typické parazity nižších primátů (šimpanzi, orangutani, lidoopi, paviáni, makakové, opice) patří Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeba hístolytica, Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii; Plasmodium spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Leishmania spp. makrofágy).
Polypeptidy bakteriálních patogenu jsou například Fe-regulovaný zevní membránový protein, (IROMP), zevní membránový protein (OMP) a Λ-protein Aeromonis salmonicida, který’ způsobuje furunkulosu, p57 protein Renibacterium salmoninarum, který způsobuje bakteriální onemocnění ledvin (BK.D), hlavní povrchový antigen (rosa), povrchový eytotoxin (mpr), povrchový hemolysin (ish), flagelámí antigen Yersiniosy; extracelulámí protein (ECP), Ee-regulovaný zevní membránový protein (IROMP), strukturální protein Pasteurellosy; OMP a flagelámí protein
Vibrosis anguillarum a V. ordalii; a flagelámí protein, OMP protein, aroA, purA Edwardsiellosis ietaluri a E. tarda; a povrchový antigen Ichthyophthirius; a strukturální a regulační protein Cytophaga columnari a strukturální a regulační protein Rickettsia.
Polypeptidy parazitárních patogenů jsou například povrchové antigeny Ichthyophthirius.
Alergen je substance (antigen), která může indukovat alergickou nebo astmatickou reakci u vnímavého jedince. Seznam alergenů je mimořádně rozsáhlý a zahrnuje pyly, hmyzí jedy, zvířecí srst, spory hub a léky (např. penicilín). Příklady přirozených, zvířecích a rostlinných alergenů jsou, například, proteiny specifické pro následující druhy rody: Canine (Canis familiaris); Derma40 tophagoides (například Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (například Lolium perenne nebo Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeriajaponica); Alternaria(Altemaria altemata); Alder; Alnus(Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisía (Artemisia vulgaris); Plantago (například Plantago lanceolata); Parietaria (například Parietaria officinalis nebo
Parietaria judaica); Blatella (například Blattella gcnnanica); Apis (například Apis multiflorum); Cupressus (například Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica a Cupressus macroearpa); Juniperus (například Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis a Juniperus asheí); 1 buya (například Thuya orientalis); Chamaecyparis (například Chamaeeyparis obtusa); Periplaneta (například Periplaneta americana); Agropyron (například Agropyron repens); Secale (například Secale ccrcale); Triticum (například Triticum aestivum); Dactylis (například Dactylis glomerata); Eestuea (například Festuca elatior); Poa (například Poa pratensis nebo Poa compressa); Avena (například Avena sativa); Holcus (například Holeus lanatus); Anthoxanthum (například Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (například Arrhenatherum elatius); Agrostis (například Agrostis alba); Phleum (například Phleum pratense); Phalaris (například
-55CZ 301488 B6
Phalaris arundinacea); Paspalum (například Paspalum notatum); Sorghum (například Sorghum halepensis); a Bromus (například Bromus inermis).
Antigenem může být antigen, který'je kódovaný nukleovou kyselinou nebo vektorem nebo který může být kódovaný nukleokyselinovým vektorem. V případě nukleokyselinového vektoru je vektor podán jedinci a antigen je exprimován in vivo. V druhém případu může být antigen podán přímo jedinci. Antigen nekódovaný v nukleokyselinovém vektoru může být jakýkoliv ty p antigenu, který není nukleovou kyselinou. Například, v některých aspektech vynálezu je antigenem nekódovaným v nukleokyselinovém vektoru polypeptid. Drobné modifikace primární aminoio kyselinové sekvence polypeptidových antigenů mohou také vést k zisku polypeptidu, který má v podstatě stejnou antigenní aktivitu ve srovnání s nemodifikovaným polypeptidem. Takové modifikace mohou být cílené, vytvořené například místně cílenou mutagenesí, nebo mohou být spontánní. Všechny polypeptidy produkované těmito modifikacemi jsou zahrnuty; pokud je zachována mutagenicita. Polypeptidem může být například virový polypeptid.
Termín „v podstatě přečištěný“, jak je zde použit, označuje polypeptid, který v podstatě neobsahuje jiné proteiny, lipidy, karbohydráty nebojiné materiály, se kterými je za přirozených okolnosti asociován. Odborník v oboru může přečistit bakteriální nebo virové polypeptidy za použití standardních technik pro přečištění proteinů. V podstatě přečištěný protein obvykle vytváří jeden hlavní proužek na neredukujícím polyakrylamidovém gelu. V případě částečně glykosylovaných polypeptidů nebo polypeptidu obsahujících několik start kodonů může být na neredukujícím polyakrylamidovém gelu přítomno několik proužků, ale tyto proužky mají jednoznačný charakter pro daný polypeptid. Čistota virového nebo bakteriálního polypeptidu může být také určena analýzou amino-terminální aminokyselinové sekvence. Další typy antigenů, které nejsou kódované nukleokyselinovým vektorem, jako jsou polysacharídy, malé molekuly, mimetika atd., jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu.
Vynález také využívá póly nukleotidy kódující antigenní polypeptidy. Předpokládá se, že antigen může být podán subjektu ve formě molekuly nukleové kyseliny, která kóduje antigen, takže je .io antigen exprimován in vivo. Takové antigeny podané jedinci v nukleokyselinovém vektoru jsou označovány jako antigeny kódované nukleokyselinovým vektorem. Nukleová kyselina kódující antigen je operativně navázaná na genovou expresní sekvenci, která řídí expresi nukleové kyseliny pro antigen v eukaryotícké buňce. Genová expresní sekvence je jakákoliv regulační nukleotidová sekvence, jako je promotorova sekvence nebo kombinace promotor-zesilovač exprese, která usnadňuje účinnou transkripci a translaci antigenní nukleové kyseliny, na kterou je operativně navázaná. Genová expresní sekvence může být například savci nebo virový promotor, jako je konstitutivní nebo indukovatetný promotor. Mezi konstitutivní savčí promotory patří, například, promotory následujících genů: genu pro hypoxantin-fosťoribosyl transferasu (HPTR), adenosin-deaminasu, pyruvát kinasu, b-aktin a jiné konstitutivní promotory. Příklady virových io promotorů, které fungují konstitutivně v eukaryotických buňkách, zahrnují, například, promotory z cytomegaloviru (CMV), opičího viru (SV40), papilloma viru, adenoviru, viru lidské imunodeftcience (HIV), viru Rousova sarkomu, cytomegaloviru, dlouhé terminální repetice (LTR) viru Moloney leukemie, a thymidin -kinasový promotor viru herpes simplex. Další konstitutivní promotory jsou známé odborníkům v oboru. Promotory použitelné jako genové expresní sekvence v předkládaném vynálezu jsou také indukovatelné promotory, indukovatelné promotory jsou exprimovány za přítomnosti indukčního činidla. Například metallothioneinový promotor je indukován k podpoře transkripce a translace za přítomnosti některých iontů kovů. Další indukovatelné promotory jsou známé odborníkům v oboru.
so Obecně, genové expresní sekvence by měly zahrnovat, podle potřeby, 5''non-transkribující se a 5netranslatující se sekvence podílející se na iniciaci transkripce a translace, v příslušném pořadí, jako je TA TA box, čepiěkové sekvence, CAAT sekvence a podobně. Konkrétně budou takové 5netranskribující se sekvence zahrnovat promotorovy region, který obsahuje promotorovou sekvenci pro transkripční kontrolu operativně navázanou na antigenní nukleovou kyselinu. Geno- 56 rw vé expresní sekvence volitelně zahrnují sekvence zesilovače transkripce nebo předcházející aktivátorové sekvence, podle potřeby.
Antigenní nukleová kyselina je operativně navázaná na genovou expresní sekvenci. Termíny sekvence nukleové kyseliny pro antigen a genová expresní sekvence operativně navázané označují sekvence kovalentně vázané tak, že dochází k expresi nebo transkripci a/nebo translaci sekvence kódující antigen pod vlivem nebo kontrolou genové expresní sekvence. Dvě DNA sekvence jsou operativně navázané na sebe tehdy, když indukce promotoru v 5genové expresní sekvenci vede k transkripci sekvence pro antigen a když charakter vazby mezi dvěma DNA jo sekvencemi (I) nezpůsobuje mutaci posunující čtecí lámcc, (2) ncinteríeruje se schopností promotorového regionu řídit transkripci sekvence pro antigen, nebo (3) neinterferuje se schopností příslušného RNA transkriptu být translatován na protein. Tak je genová expresní sekvence operativně navázaná na sekvenci nukleové kyseliny pro antigen tehdy, když jsou genové expresní sekvence schopné dosáhnout transkripci nukleové kyseliny pro antigen, po které je transkript translatován do požadovaného proteinu nebo polypeptidu.
Nukleová kyselina pro antigen podle předkládaného vynálezu může být předložena imunitnímu systému samostatně, nebo v asociaci s vektorem. V nejširším smyslu je vektorem jakékoliv vehikulum schopné usnadnit přenos nukleové kyseliny pro antigen k buňkám imunitního systému tak, že antigen může být exprimován a prezentován na povrchu buněk imunitního systému. Vektor obvykle transportuje nukleové kyseliny k imunitním buňkám s redukovanou degradací ve srovnání s degradací, ke které by docházelo za nepřítomnosti vektoru. Vektor volitelně obsahuje výše uvedené genové expresní sekvence pro zesílení exprese nukleové kyseliny pro antigen v buňkách imunitního systému. Obecně, mezi vektory použitelné v předkládaném vynálezu patří například plasmidv. fágemidy. viry. jiná vehikula odvozená od virů nebo bakterií, kde tyto vektory' byly upraveny insercí nebo inkorporací sekvence nukleové kyseliny pro antigen. Virové vektory'jsou výhodným typem vektorů a patří mezi ně například sekvence nukleové kyseliny z následujících virů: retrovirů, viru Moloney myší leukemie, viru Harveova myšího sarkomu, viru myších nádorů mléčné žlázy a viru Rousova sarkomu; adenoviru, adenoasociovaného viru, virů typu SV -10: jo polyoma virů; viru Epsteina-BarTové; herpes viru; viru vakcinie; polio viru; a RNA vírů, jako je retrovirus. Je také možno využít dalších v oboru známých vektorů.
Výhodné virové vektory jsou získány z necytopatíckých eukarvotiekých virů, ve kterých byly neeseneiální geny nahrazeny požadovaným genem. Mezi necytopatieké viry patří retroviry, jejichž životní cyklus zahrnuje reverzní transkripci virové RNA do DNA s následnou integrací províru do buněčné DNA hostitele. Retroviry byly schváleny pro klinické studie genové terapie na lidech. Nej vhodnější jsou ty retroviry, které jsou neschopné replikace (tj. mohou řídit syntézu požadovaných proteinů, ale nemohou vyrábět infekční částice). Takové geneticky upravené retrovirové expresní vektory jsou použitelné pro vysoce účinnou transdukci genů in vivo. Standardní protokoly pro produkci replikace-defektních retrovirů (včetně kroků inkorporace exogenního genetického materiálu do plasmidů, transfekce přenosových buněk obsahujících plasmidy, produkce rekombinantních retrovirů přenosovou buněčnou linií, odběru virových částic z tkáňového kultivačního média, a infekce cílových buněk virovými částicemi), jsou uvedeny v Kríegler, M. Gene Transfer a Expresion, A Laboratory Manual, W. H. Freeman c.o., New York (1990), a Murry, E-J- Methods in Molecular Biology, svazek 7, Humana Press, lne., Cliffton, New Jersey (1991).
Výhodným virem pro některé aplikace je adeno-asociovaný virus, což je dvoj řetězcový DNA virus. Adeno-asociovaný virus může být upraven tak, aby byl neschopen replikace a může infl50 kovat různé typy a druhy buněk. Další jeho výhodou je: stabilita vůči teplu a lipidovým rozpouštědlům; vysoká frekvence přenosu v buňkách různých linií, včetně hematopoetických buněk; a chybění inhibice superinfekce, což umožňuje provedení více sérií transdukce. Významné je to. že adeno-asociovaný virus se může integrovat do lidské buněčné DNA místně cíleným způsobem, což minimalizuje možnost inserční mutagenese a variabilitu exprese insertovaného genu.
Dále. infekce přirozeným adenovirem byla sledována v tkáňové kultuře po více než 100 pasáží za
-576/ 0(1148» Bó nepřítomnosti selekčního tlaku, což naznačuje, že genomová integrace adeno-asociovaného viru je relativně stabilní událostí. Adeno -asociovaný virus může také působit extrachromosomálné.
Mezi další vektory patří plasmidové vektory. Plasmidové vektory byly důkladně popsány v oboru a jsou dobře známé odborníkům v oboru. Viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Barbor Laboratory Press, 1989. V několika posledních letech byly plasmidové vektory ověřeny jako zejména výhodné pro transport genů do buněk in vivo, protože se nemohou integrovat do genomu a replikovat v genomu hostitele. Nicméně, tyto plasmidy obsahující promotor kompatibilní s hostitelskou buňkou, mohou exprimovat peptid z genu io operativně kódovaného plasmidem. Mezi některé běžně používané plasmidy patří pBR322, pUC 18, pUCI 9, pRC/CMV, SV40 a pBlueSeript. Další plasmidy jsou dobře známé odborníkům v oboru. Dále, plasmidy mohou být vhodně upraveny za použití restrikčních enzymů a ligačních reakcí pro odstranění a přidání specifických fragmentů DNA.
Nedávno bylo zjištěno, že plasmidy nesoucí geny mohou být dopraveny do imunitního systému za použití bakterie. Modifikované formy bakterií, jako je Salmonella, mohou být transfektovány plasmidem a mohou být použity jako transportní vehikula. Bakteriální transportní vehikula mohou být podána hostiteli orálně nebo jiným způsobem. Bakterie přenášejí plasmid k buňkám imunitního systému, například k B-lymfoeytům, dendritiekým buňkám, pravděpodobně průnl kem přes střevní bariéru. Vysoké hladiny imunitní ochrany byly dosaženy za použití této techniky. Takové metody přenosu jsou použitelné pro aspekty předkládaného vynálezu využívající systémové podání antigenu, imunostimulační nukleové kyseliny a/nebo jiná terapeutická činidla.
Tak jsou imunostimulační nukleové kyseliny použitelné jako vakcinační adjuvans. Již dříve bylo zjištěno, že CpG oligonukleotidy jsou výbornými vakcinačními adjuvans. Bylo však také prokázáno, že CpG ODN, které jsou vynikajícími vakcinačními adjuvans u myší, nejsou výhodnými adjuvans u zvířat jiných nežjsou hlodavci. Pro identifikaci nejlepších imunostimulačních nukleovýeh kyselin pro použití jako vakcinační adjuvans u člověka nebo jiných živočichů jiných než hlodavců by! proveden in vivo skríning různých nukleových kyselin. Několik testů in vitro bylo ao hodnoceno u myší na jejich prediktivní hodnotu pro adjuvantní aktivitu u myší in vivo. Během tohoto pokusu byl identifikován test in vitro. který určuje účinnost in vivo. Bylo zjištěno, spíše překvapivě, že aktivace jak B-lymfoeytů, tak NK buněk koreluje se schopností imunomodulačních nukleových kyselin zesilovat imunitní reakci in vivo proti antigenu.
Dobrá prediktivní hodnota aktivace B-lymfoeytů pro adjuvantní aktivitu vakcíny in vivo je s největší pravděpodobností spojena s centrální úlohou B-lymfoeytů ve vzniku specifické imunitní reakce. Polyklonální proliferace B-lymfocytů (indukovaná ímunostimulačními nukleovými kyselinami) zvyšuje pravděpodobnost vzniku B-lymfocytů/T-pomocných lymfocytů specifických pro antigen. Dále, zesílená exprese kostimulační molekuly CD86 na polyklonálně expandovaných Βίο lymfocytech aktivuje T-po moc né lymfocyty specifické pro antigen. B-lymfocyty také zvyšují svou expresi CD40 v reakci na imunostimulační nukleové kyseliny, což zlepšuje schopnost CD40L exprimujících T-pomocných lymfocytů stimulovat B-lymfocyty. Zvýšená syntéza ICAM-1 na B-lymfoeytech usnadňuje mezibuněčný kontakt. Proto má aktivační status polyklonálních B-lymfocytů zásadní význam pro iniciaci specifické proti látkové reakce.
Příspěvek aktivity NK buněk k indukci specifických protilátek byl nicméně překvapivý. NK buňky jsou součástí imunitního systému a jako takové se podílejí na první linii obrany proti patogenúm. S největší pravděpodobností souvisejí cytokiny produkované NK buňkami po aktivaci s iniciací specifické imunitní reakce. Proto se v jednom aspektu vynález týká způsobu pro identí50 fikaci adjuvans pomocí detekce aktivace K buněk. Test aktivity NK buněk může být proveden způsobem popsaným v následujících příkladech nebo za použití jiných známých testů aktivity NK buněk. Je však výhodné, aby byla použita smíšená populace buněk. Je však výhodné, aby byla použita smíšená populace buněk, jako jsou PBMC, z důvodu možnosti, že aktivace NK buněk je nepřímý účinek. Test je výhodně použit pro identifikaci imunostimulačních nukleových kyselin, které jsou použitelné jako adjuvans u člověka a jiných zvířat kromě hlodavců.
-58Indukce cytokinů byla také identifikována jako významný prediktor adjuvantní aktivity in vivo.
Protože je sensitivita lidských primárních monocytů na endotoxin o 2 řády vyšší než myších, je nutno zabránit endotoxinové kontaminaci imunostimulačních nukleových kyselin použitých pro testování v lidském systému (Hartmann G., a Krieg, A. M. 1999, Gene Therapy 6: 893). Protože jsou TNF-<x, IL-6 a IL—12 produkovány lidskými monoeyty v reakci na i malá množství endotoxinu, je jejich hodnota pro vysoce účinný skríningový test omezená, Na druhé straně, lidské NK buňky a B-lymfocyty vykazují pouze mírnou aktivaci endotoxinem a proto jsou vhodné pro testování imunostimulační aktivity.
i o
Stimulace buněčných funkcí v NK buňkách nebo B-lymfocytecb (tj. lytické aktivity, proliterace) vyžaduje silněji imunostimulační nukleové kyseliny než indukce markérů aktivace na jejich povrchu (CD69. CD86). Pro oba typy buněk vykazuje použití povrchových markérů aktivace buněk vyšší nespecifické pozadí, které lze přisoudit fosforothioátovému skeletu, ve srovnání s funkčními testy. Tato vysoká sensitivita povrchových markérů vyžaduje použití nízkých koncentrací imunostimulační nukleové kyseliny pro optimální rozlišení mezi imunostimulačnímí nukleovými kyselinami podobné aktivity. Proto umožňuje použití povrchových markérů srovnání imunostimulačních nukleových kyselin se slabou aktivitou, zatímco funkční testy jsou výhodné pro srovnání imunostimulačních nukleových kyselin s vysokou aktivitou. Je jasné, že optimální koncentrace imunostimulační nukleové kyseliny pro stimulaci B-lymfocytů a NK buněk se liší. Zatímco 0,6 ,ugml ODN je již maximum pro stimulaci B-lymfocytů, může optimální aktivace NK buněk vyžadovat 6 pg/ml ODN. Jak aktivace B-lymfocytů, tak funkční aktivita NK buněk byly měřeny pomocí čerstvě izolovaných PBMC. Již dříve bylo zjištěno, že vysoce přečištěné lidské primární B-lymfocyty jsou aktivovány CpG DNA. Existence přímého účinku CpG DNA na NK buňky je méně jasná, a sekundární mechanismus zprostředkovaný jiným typem PBMC buněk může přispívat k CpG-indukované funkční aktivitě NK buněk.
Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány jedincí společně s antimikrobiálním činidlem. Termín „antimikrobiální činidlo“, jak je zde použit, označuje přirozenou nebo syntetickou sloučeninu, která může usmreovat nebo inhibovat infekční mikroorganismy. Typ antimikrobíálního činidla použitelného ve způsobu podle předkládaného vynálezu bude záviset na typu mikroorganismu, kterým je jedinec infikován, nebo který by mohl být infikován. Mezi antimikrobiální činidla patří, avšak nejsou na ně omezeny, antibakteriální činidla, antivirová činidla, anti-mykotická činidla a anti-parasitámí činidla. Výrazy jako „anti-infekční činidlo“, „anti-bakteriální činidlo“, ,,anti-virové činidlo“ a „anti-mykotické činidlo“, „anti-parasitámí činidlo“ a „parasiticid“ jsou dobře známé v oboru a jsou definovány ve standardních lékařských učebnicích. Stručně, anti-bakteriální činidla usmrcují nebo inhibují bakterie a patří mezi ně antibiotika, stejně jako jiné syntetické nebo přirozené sloučeniny mající podobnou funkci. Antibiotika jsou molekuly s nízkou molekulovou hmotností, které jsou produkovány jako sekundární metabolity buňkami, jako jsou mikroorganismy. Obecně, antibiotika interferují sjednou nebo více bakteriální funkcí nebo strukturou, které jsou specifické pro mikroorganismus a které nejsou přítomné v hostitelských buňkách. Anti-virová činidla mohou být izolována z přirozených zdrojů nebo mohou syntetizována a jsou použitelná pro zabíjení nebo inhibici virů. Anti-mykotická činidla jsou používána pro léčbu superficiálních mykotických infekcí, stejně jako oportunních a primárních systémových mykotických infekcí. Anti-parazitární činidla zabíjejí nebo inhibují parazity.
Příklady anti-parazitámích činidel, též označovaných jako parasiticidy, použitelných pro aplikaci u člověka, jsou albendazol, amfotericin B, benzidazol, bithionol, chlorochin HCI, chlorochin fosfát, clindamycin, dehydroemetin, diethylkarbamazin, diloxanid furoát, eflornithin, furazolidaon, glukokortikoidy, halofantrin, jodochinol, ivermectin, mebendazol, mefloquin, megluminantimoniát, melarsoprol, metriťonat, metronidazol, niklosamid, nifurtimox, oxamnichin, paromomycin, pentamidin-isethionát, piperazin, praziquantel, primaquinfosťát, proguanil, pyrantel pamoát, pyrimethanminsulfonamidy, pyrimethamin-sulfadoxin, chínacrin HCI, chinin sulfát, chinidin glukonát, spiramycin, natrium-stiboglukonát (natrium-antimonium-glukonát), suramin.
- 59 CZ 301488 B6 tetracyklin. doxycyklin, thiabendazol, tinidazol, trimethroprim-sulfamethoxazol a tryparsamid, kde tato činidla jsou použita samostatně nebo v kombinaci.
Mezi parasiticidy používané u non-lidských jedinců patří například piperazin. diethylkarbama? zin, thiabendazol, fenbendazol, albendazol, oxfendazol, oxíbendazol, febantel. levamisol, pyrantel-tartrát, pyrantel pamoát, dichlorvos, ivermectin, doramectic, milbemyein-oxim, iprinomectin, moxidectin, N-butylchlorid, toluen, hygromycin B thiacetarsemid sodný, melarsomin, praziquantel, epsiprantel, benzimidazoly, jako je fenbendazol, albendazol, oxfendazol, clorsulon, albendazol, amprolium; decochinat, lasalocíd, monensin sulfadimethoxim; sulfamethazin, lí) sulfachinoxalin, metronidazol.
Mezi antiparazitámí činidla používaná u koní patří například mebendazol, oxfendazol, febantel, pyrantel, dichlorvos, trichlorfon, ivermectin, piperazin; pro S. westeri: ivermectin. benzimidazoly, jako je thiabendazol, cambendazol, oxíbendazol a fenbendazol. Mezi antiparazitámí činidla používaná u psů patří milbemyeín oxin, ivermectin, pyrantel pamoát a kombinace ivermectinu a pyrantelu. Mezi antiparazitámí činidla používaná u prasat patří levamisol, piperazin, pyrantel. thiabendazol, dichlorvos a fenbendazol. Mezi antíhelmintíka používaná u ovcí koz patří levamisol a ivermectin, Caparsolat je účinný při léčbě D. immitis (heartworm) u koček.
Antibakteriální činidla zabíjejí bakterie nebo inhibují jejich růst. Antibiotika, která jsou účinná v zabíjení nebo inhibici široké škály bakterií, jsou označována jako širokospektrá antibiotika. Další typy antibiotik jsou účinné především proti gram-pozitivním nebo gram-negativním bakteriím. Tyto typy antibiotik jsou označované jako antibiotika s úzkým spektrem. Další antibiotika, která jsou účinná proti jedinému organismu nebo nemoci a ne proti jiným bakteriím, jsou označo25 vána jako antibiotika s omezeným spektrem. Antibakteriální činidla jsou někdy dělena podle primárního způsobu účinku. Obecne jsou antibakteriální činidla inhibitory syntézy buněčné stěny, inhibitory buněčné membrány, inhibitory syntézy proteinů, inhibitory syntézy nebo funkce nukleových kyselin a kompetitivní inhibitory.
Mezi antibakteriální činidla použitelná v předkládaném vynálezu patří, přirozené peniciliny, semi-syntetieké peniciliny, kyselina klavulanová, cefalosporiny, bacitracin, ampicilin, karbenicilin, oxacilin, azlocilin, mezlocilin, piperacilin, methicilin. dicloxacilin, nafcilin, cefalotin, ccfapirin, cefalexín, ceťamandol, cefaclor, cefazolin, cefuroxin, cefoxitin, cefotaxim, cefsulodin, cefetamet, cefixin, ceftriaxon, cefoperazon, ceftazidin, moxalaktam, karbapenemy, imipenemy, monobaktamy, aztreonam, vankomycin, polymyxin, amfotericin B, nystatin, imidazoly, elotrimazol, miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, rifampiny, ethambutol, tetraeykliny, ehloramfenicol. makro lidy, aminoglykosidv, streptomycin, kanamycin, tobramycin, amikacin, gentamicin, tetracyklin, minocyklin, doxycklin, chlortetracyklin, erythromycin, roxithromycin. klarithromyein, oleandomycin, azithromycin, chloramťenicol, chinolony, kotrimoxazol, nor4o floxacin. ciprotloxacin, enoxacin, kyselina nalidixová, temafloxacin, sulfonamidy, gantrisin a trimethoprim; acedapson; acetosulfon sodný; amieyklin; amifloxacin; amifloxacin mesylát; amikacin; amikacin sulfát; kyselina aminosalicylová; aminosalicylát sodný; amoxicilin; amfoinyein; ampicilin; ampicilin sodný; apalcilin sodný; apramycin; aspartocin; astromicin sulfát; avilamycin; avoparcin; azithromycin: a/locilin; azlocilin sodný; becampicilin hydrochlorid;
bacitracin; bacitracin methylendisalicylát; bacitracin zinečnatý; bambermyeiny; ealeiumbenzoylpas; berythromyein; betamicin sulfát; biapenem; biniramycin; butirosin sulfát; kapreomycin sulfát; karbadox; karbenicilin sodný; karbenicilin indanyl sodný; karbenicilin fenyl-sodný; karbenicilin draselný; carumonam sodný; cefaclor; eefadroxil; ceťamandol; cefamandol ňafat; cefamandol sodný; cefaparol; ccfatrizin; cefazaflur sodný; cefazolin; cefazolin sodný; cefbu50 prcazon; cefdinir; cefepim; cefepim hydrochlorid; cefetecol; cefixim; cefmenoxim hydrochlorid; eefmetazol; cefmetazol sodný; cefonicid sodný; cefonicid sodný; cefoperazon sodný; ceforanid; cefotaxim sodný; cefotetan; cefotetan dvoj sodný; cefctiam hydrochlorid; cefoxitin; cefoxitin sodný; eefpimizol; cefpimizol sodný; cefpiramid; cefpiramid sodný; eefpirom sulfát; cefpodoxim proxetil; cefprožil; cefroxadin; cefsulodin sodný; eeftazidim; ceftibuten; ceftizoxim sodný;
ceftriaxon sodný; ccfuroxim; ccluroxim axetil; cefuroxim pivoxetil; ceťuroxirn sodný; cefacetril
- 60 sodný; cefalexin; cefalexin hydrochiorid; cefaloglycin; cefaloridin; cefalothin sodný; cefapirin sodný; cefradin; cctocyklin hydrochiorid; cetofenicol; chloramfenikol; chloramfenikol palmitat; komplex chloramfenikol-pantothenat; chloramfenikol natrium-sukcinát; chlorhexidin fosfanilat; chloroxylenol; chlortetracyklin bisulfát; chlortetracyklin hydrochiorid; cinoxacin; ciprofloxacin; s ciprofloxacin hydrochloride; cirolemycin; clarithromycin; clinafloxacin hydrochiorid; clindamvcin; clindamycin hydrochiorid; clindamycin palmitat hydrochiorid; clindamycin fosfát; clofazimin; cloxacilin benzathin; cloxacilin sodný; cloxyquin; colistimethat sodný; colistin sulfát; coumermycin; coumermycÍn sodný; cyclacilin; cykloserin; dalfopristin; dapson; daptomycin; demeclocyklin; demeclocyklin hydrochiorid; demecyklin; denofungin; diaveridin; dicloxacilin; jú dicloxacil ni >oduy, diny uiostičpíoffiyc ui sulíai; dipyíiuiiún; dir iiiiforíiyčín; doxycyklin; uoxycyklin vápenatý; doxycyklin fosfatex; doxycyklin hyclat; droxacin sodný; enoxacin; epicilin; epitetracyklin hydrochiorid; erythromycin; erythromycin acistrat; erythromycin estolat; erythromycin ethylsukcinát; erythromycin gluceptat; erythromycin laktobionat; erythromycin propionát; erythromycin stearát; ethambutol hydrochiorid; ethionamid; fleroxacin; floxacilin;
fludalanin; flumequin; fosfomycin; fosfomycin tromethamin: fumoxicilin: furazolium chlorid; furazolium tartrát; fusidát sodný; kyselina fusidová; gentamicin sulfát; gloximonalp: gramicidin; haloprogin; hetacilin; hetacilin draselný; hexedin; ibafloxacin; imipenem; isokonazol; isepamicin: isoniazid; josamycin; kanamycin sulfát; kitasamycin; levofuraltadon; levopropylcillin draselný; lexithromycin; lincomycin; lincomycin hydrochiorid; lomefloxacin; lomcfloxacin hydrochiorid; ao lomefloxacin mesylat; loracarbeť; maťenide; meclocyklin; meclocyklin sulfosalicylát; megalomíein kalium-fosfát; mequidox; meropenem; methacyklin; methacvklin hydrochiorid: melhenamin; methenamin hippurát; methenamin mandelat; methicilin sodný; metioprim; metronidazol hydrochiorid; metronidazol fosfát; mezlocilin; mezlocilin sodný; minocyklin; minocyklin hydrochiorid; mirincamycin hydrochiorid; monensin; monensin sodný; nafcilin sodný; nalidixat sodný;
kyselina nalidixová; natamycin; nebramycin; neomycin palmitat; neomycin sulfát; neomycin undecylenat; netilmicin sulfát; neutramycin; nifuraden; nifuraldezon; nifuratel; nifuratrone; nifurdazil; nifurimid; nifurpirinol; nifurquinazol; nifurthiazol; nitrocyklin; nitrofurantoin; nitromid; norfloxacin; novobiocin sodný: ofloxacin; ormetoprim; oxacilin sodný; oximonam; oximonam sodný; kyselina oxolinová; oxytetracyklin; oxytetracyklin vápenatý; oxytetracyklin hydro30 chloride; paldimycin; parachlorofenol; paulomycin; pefloxacin; pefloxacin mesylat; penamecilin; penicilinG benzathin; penicilín G, draselná sůl; penicilín G prokain; penicilín G, sodná sůl; penicilín V; penicillin V benzathin; penicilín V hydrabamin; penicilín V, draselná sůl; pentizidon sodný; ťenylaminosalicylát; piperaciíin sodný; pirbenicilin sodný; piridicilin sodný; pirlimycin hydrochiorid; pivampicilin hydrochiorid; pivampicilin pamoat; pi vampicilin probenat;
polymyxin B sulfát; porfyromycin; propikacin; pyrazinamid; pyrithione zinečnatý: chindekamin acetat; chinupristin; racefenikol; ramoplanin; ranimycin; relomycin: repromicin; rifabutin; rifametan; rifamexíl; rifamid; rifampin; rifapentin; rifaximin; rolitetracyklin; rolitetracyklin nitrát; rosaramicin; rosaramicin butyrát: rosaramicin propionát; rosaramicin natrium-fosfát; rosaramicin stearat; rosoxacin; roxarson; roxithromycin; sancyklin; sanfetrinem sodný; sannoxicilin; sarpici40 lín; scopafungin; sisomicin; sisomiein sulfát; sparfloxacin; spectinomycin hydrochiorid; spiramycin; stalirnycin hydrochiorid; steffimycin; streptomycin sulfát; streptonicozid; sulfabenz; sulfabenzamid; sulfacetamid; sulfacetamid sodný; sulfacytin; sulfadiazin; sulfadiazin sodný; sulfadoxin; sulfalen; sulfamerazin; sulfameter; sulfamethazin; sulťamethizol; sulfamethoxazol; sulfamonomethoxin; sulfamoxol; sulfanilat zinku; sulfanitran; sulfasalazin; sulfasomizol;
sulfathiazol; sulfazamet; sulfisoxazol; sulfisoxazol acetyl; sulfisoxazol diolamin; sulfomyxin; sulopenem; sultamicilin; suncilin sodný; talampicilin hydrochiorid; teicoplanin; temaťloxacín hydrochiorid; temocilin; tetracyklin; tetracyklin hydrochiorid; tetracyklin v komplexu s fosfátem; tetroxoprim; thiamfenikol; thifencilin draselný; ticarcilin kresyl sodný; ticarcilin disodný; ticarcilin monosodný; ticlaton; tiodonium chlorid; tobramycin; tobramycin sulfát; tosuťloxacin; tri50 methoprim; trimethoprim sulfát; trisulfapyrimidiny; troleandomycin; trospectomycin sulfát; tyrothrícin; vancomycin; vancomycin hydrochiorid; virginiamycin; a zobramycin.
Antivirová činidla jsou sloučeniny, které braní infekci buněk viry nebo replikaci virů v buňkách. Existuje mnohem méně antivirových léků než antibakteriálních léků, protože proces virové repli55 káceje velmi podobný replikaci DNA v hostitelské buňce, takže by nespecifická antivirová
-61 C.7.301488 B6 činidla mohla být toxická pro hostitele. Existuje několik stadií v procesu virové infekce, která mohou být blokována nebo inhibována antivirovými činidly. Mezi tato stadia patří navázání viru na hostitelskou buňku (imunoglobuliny nebo vazebné peptidy), rozbalení viru (například amantadin). syntéza nebo translace virové DNA nebo RNA (například analogy nukleosidů), zrání ? nových virových proteinů (například inhibitory proteas) a množení a uvolnění viru.
Analogy nukleotidů jsou syntetické sloučeniny, které jsou podobné nukleotidům, ale které mají nekompletní nebo abnormální deoxyribosu nebo ribosovou skupinu. Po průniku nukleotidového analogu do buňky je tento analog fosforylován, za vzniku trifosfátu, který kompetuje s normálio nimi nukleotidy o inkorporaci do virové DNA nebo RNA. Po inkorporaci tri fosfátové formy nukleotidového analogu do rostoucího nukleokyselinového řetězce způsobuje tento analog ireversibilní asociaci s virovou polymerasou a tak k ukončení řetězce. Mezi nukleotidové analogy patří, například, acyklovir (používaný pro léčbu infekce virem herpes simplex a vařícella-zoster), gancyklovir (používaný pro léčbu cytomegalovirové infekce), idoxuridin, ribavirin (používaný is pro léčbu infekce respiračně syncítiálním virem), dideoxyinosin, dideoxycytidin a zidovudin (azidothymidin).
Interfcrony jsou cytokiny, které jsou secernovány buňkami infikovanými virem, stejně jako buňkami imunitního systému. Interferony se váží na specifické receptory na buňkách v sou20 sedství infikovaných buněk, kde způsobují změny, které chrání buňky před infekcí virem. Alfa a beta interferon také indukují expresi MHC molekul třídy I a II na povrchu infikovaných buněk, což vede ke zvýšené prezentaci antigenu pro rozpoznávání imunitním systémem hostitele. Alfa a beta-interferony jsou dostupné jako rekombinantní formy a jsou používané pro léčbu chronické hepatitidy B a C. V dávkách, při kterých jsou účinné pro antivirovou terapii, mají interferony závažné nežádoucí účinky, jako je horečka, úbytek hmotnosti a chátrání.
Terapie imunoglobuliny se používá pro prevenci virových infekcí. Terapie virových infekcí imunoglobuliny je jiná než terapie bakteriálních infekcí, protože místo toho, aby byla tato terapie specifická pro antigen se imunoglobuliny váží na extracelulámí viriony a brání jejich navázání a vstupu do buněk, které jsou vnímavé na virovou infekci. Terapie je použitelná pro prevenci virových infekcí po dobu, po kterou jsou protilátky přítomné v hostiteli. Obecně existují dva typy imunoglobulinové terapie: normální imunoglobulinová terapie a hyperimunoglobulinová terapie. Normální imunoglobulinová terapie využívá protilátek, které jsou připraveny ze séra normálních dárců krve. Tento produkt obsahuje nízké titry protilátek k různým lidským virům, jako je virus hepatitidy A, parvovirus, enterovirus (zejména u novorozenců). Hyperimunoglobulinová terapie využívá protilátek, které jsou připraveny ze séra jedinců, kteří mají vysoké titry protilátky k určitému viru. Tyto protilátky jsou potom znovu použity k určitému viru. Příklady hyperimunoglobulinů jsou zoster imunoglobulin (použitelný pro prevenci variceliy u imunokompromitováných dětí a novorozenců), lidský imunoglobulin proti vzteklině (použitelný pro ex-post proto fylaxi u jedinců pokousaných zvířetem nakaženým vzteklinou), imunoglobulin proti hepatitidč B (použitelný pro prevenci infekce virem hepatitidy B, zejména u jedinců vystavených viru) a RSV imunoglobulin (použitelný pro léčbu infekcí respiračně syneytiálním virem).
Jiným typem imunoglobulinové terapie je aktivní imunizace. Aktivní imunizace zahrnuje podá45 vání protilátek nebo fragmentů protilátek k virovým povrchovým proteinům. Dva typy vakcín, které jsou dostupné pro aktivní imunizaci proti hepatitidč B, obsahují protilátky proti hepatitidč B získané ze séra a rekombinantní protilátky proti hepatitidč B. Obě vakcíny jsou připraveny z HBsAg, Protilátky jsou podávány ve třech dávkách jedincům s vysokým rizikem infekce virem hepatitidy B, jako jsou zdravotníci, sexuální partneři chronických nosičů a děti.
Mezi anti-virová činidla použitelná v předkládaném vynálezu tedy patří například imunoglobuliny, amantadin, interferon, analogy nukleosidů a inhibitory proteasy. Konkrétními příklady antivirových činidel jsou acemannan; acyklovir; acyklovir sodný; adefovir, alovudin; alvircept sudotox; amantadin hydrochlorid; aranotín; arildon; atevirdin mesylat; avridin; cidofovir; cipamfylin;
cytarabin hydrochlorid; delavirdin mesylat; desciclovir; didanosin; disoxaril; edoxudin; envira- 62 den; envíroxím; famciclovír; famotin hydrochlorid; fiacitabin: flaluridin; fosarilat; foscarnet sodný; fosfonet sodný; ganciclovir; ganciclovir sodný; idoxuridin; kethoxal; lamivudin; lobucavir; memotin hydrochlorid; methisazon; nevirapin; pencielovir; pirodavir; ribavirin; rirnantadin hydrochlorid; saquinavir mesylat; somantadin hydrochlorid; sorivudin; statolon; stavudin; tiloron hydrochlorid; trifluiridn; valacyclovir hydrochlorid; vidarabin; vidarabin fosfát; vidarabin natři um-ťosfát; viroxim; zalcitabin; zidovudin; a zinviroxim.
Anti-mykotická činidla jsou vhodná pro léčbu a prevenci infekce houbami. Anti-mykotická činidla jsou někdy klasifikována podle mechanismu účinku. Některá anti-mykotická činidla účinkuji jako ml ubitory syntézy bunecne steny tírn, ze inhibuj i glukosu—synth asu. Mezi tuková činidla patří, například, basiungin/ECB. Další anti-mykotická činidla destabilizují integritu membrány. Mezi tato činidla patří, například, imidazoly, jako je clotrimazol, sertakonazol, flukonazoi, itrakonazof ketokonazol, mikonazol a vorikonazob stejně jako FK 463, amfotericin Β, BAY 38- 9502. MK 991, pradimicin, UK 292, butenafln a terbinafin. Jiná anti-mykotická činidla způsobují rozpad chitinu (například chitinasy) nebo imunosupresi (501 krém). Některé příklady komerčně dostupných činidel jsou uvedeny v tabulce B.
Tabulka B
Společnost Obchodní název Generický název Indikace Mechanismus účinku
Pharmacia a Upjohn PNU 196443 PNU 196433 anti-tnyk otíkum n/k
Lilly LY 303366 Basiungin/ECB Mykotické infekce anti- myk otikum/inhibitor syntézy buněčné stěny/inhibitor glukosa synlhasy
Bayer Canesten Klotrimazol Mykotické infekce destab. integrity membrány
Fujisawa FK 463 FK 463 Mykotické infekce Destabilizátor integrity membrány
Mylan Sertaconazol Sertaconazol Mykotické infekce Destabilizátor
- 63 CZJU1488 B6 integrity membrány
Genzyme Chitinasa Chitinasa Mykotické infekce, systémová rozpad chitinu
Liposome Abelcet Amfotericin B, liposomální Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Sequus Amphotec Amfotericin B, liposomální Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Bayer BAY 38-9502 BAY 38-9502 Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Pfizer Diflucan Fluconazol Mykotické infekce, SyS lLLiI ov a Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson Sporanox Itraconazol Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Sepracor Itraconazol (2R,4S) Itraconazol (2K,4S) Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson Niyoral Ketoconayol Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson Monistat Miconayol Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Merck MK991 MK 991 Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Bristol Mzers Squib Pradimicin Pradimicin Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Pfizer UK/292.663 UK-292.ÓÓ3 Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Pfizer Voriconazol Voriconayol Mykotické infekce, systémová Destabilizátor integrity membrány
Mylan 501 Cream 501 Cream zanetliva onemocněni mykoticka imunosuprese
Mylan Mcntax butenafin nehtove mykozy Destabilizátor integrity membrány
Schering Plough antimykotikum antimykotikum oprotunni infekce Destabilizátor integrity membrány
Alza Mycelex Troche C lotři mazol orální soor stabilizátor integrity membrány
Novartis Tamisil Terbinafin Onychomykosa Destabilizátor
integrity membrány
Tak patří mezi anlimykotika použitelná v předkládaném vynálezu například imidazoly, FK 463, amfctericin Β, BAY 38-9502, MK991, pradimicin, UK 292, butenafm; chitinasa; 501 krém; acrisorcin; ambruticin; amorolfin; amťotcricin B; azaconazol; azaserin; basifungin; bifonazol: bifenarnin hydrochlorid; bisphyrithion megsulfex; butokonazol nitrát; kalcium-undecylenat: candicidin; carbol-fuchsin; chlordantoin; coclopirox; ciclopirox olamine; cilofungin; cisconazole; clotrimazol; euprimyxin; denofungin; dipyrithion; doconazol; econazol; econazol nitrát; enileonazol; ethonam nitrát; fcntieonazol nitrát; tilípin; fluconazol; fiucytosin; fungimycin;
-64 griseofulvin; hamycin; isoconazol; itraconazol; kalafungin; ketoconazol; lomofungin; lydimycin;
mepartricin; miconazole; miconazole nitrát; monensin; monensin sodný; niftiftn hydrochlorid;
ncomycin undecylenat; nifuratel; nifunneron; nitralamin hydrochlorid; nystatin; kyselina oktanová; orconazol nitrát; oxiconazol nitrát; oxifungin hydrochlorid; parconazol hydrochlorid;
partricin; jodid draselný; proclonol; pyrithion zinečnatý; pyrrolnitrin; rutamycin; sanguinarium chlorid; saperconazol; scopafungin; selenium sulfid; sinefungin sulconazol; nitrát; terbinafin; terconazol; thiram; ticlaton; tioconazol; tolciclat; tolindat; tolnaftat; triacetín; tríafungín; kyselina undecylenová; viridofulvin; undecylenat zinku; a zinoconazol hydrochlorid.
HuitOSuinulaciií iťuklcovc kyseliny mohcu byl kombinovaný ícrap;
.1,.% ,i\.y * **« V’ jako jsou adjuvans pro zesílení imunitní reakce. ImunostimulaČní nukleové kyseliny a jiné terapeutické činidlo mohou být podány simultánně nebo sekvenčně. Když jsou jiná terapeutická činidla podána simultánně, tak mohou být podána ve stejné nebo jiném prostředku, ale vždy jsou podána současně. Další terapeutická činidla jsou podána sekvenčně s jinými činidly a imunostimulační nukleovou kyselinou, když je podání jiných terapeutických činidel a nukleových kyselin samostatné. Doba mezi podání sloučenin je v řádu minut nebo déle. Dalšími terapeutickými činidly jsou adjuvans, cytokiny, protilátky nebo antigeny atd.
ImunostimulaČní nukleové kyseliny jsou použitelné jako adjuvans pro indukci systémové imunit20 ní reakce. Tyto přípravy mohou být podány jedincům vystaveným působení antigenu za účelem zesílení imunitní reakce na antigen.
Kromě imunostimulačních nukleových kyselin mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu podány také s non-nukleokyselinovým adjuvans. Non-nukleokyselinové adjuvans je jakákoliv molekula nebo sloučenina kromě imunostimulační nukleové kyseliny, která může stimulovat protilátkovou a/nebo buněčnou imunitní reakci. Mezi taková adjuvans patří, například, adjuvans pro dosažení depo-efektu, imunostimulační adjuvans a adjuvans pro dosažení depo efektu a stimulaci imunitního systému.
Adjuvans. které vytváří depo efekt, jc adjuvans, které způsobuje pomalé uvolňování antigenu do těla, což prodlužuje expozici imunitních buněk antigenu. Do této třídy adjuvans patří, například, kamenec (například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý); nebo emulzní prostředky obsahující minerální olej, neminerální olej nebo emulze olej ve vodě nebo voda v oleji, jako je Seppic ISA serie Montanide adjuvans {například, Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris. France); MF-59 (emulze skvalen-ve-vodě stabilizovaná Spán 85 a Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; a PRO VAX (emulze olej ve vodě obsahující stabilizační detergens a činidlo vytvářející micely; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego. CA).
Imunostimulační adjuvans je adjuvans, které způsobuje aktivaci buněk imunitního systému,
Může například indukovat produkci a sekreci cytokinů buňkami imunitního systému. Tato třída adjuvans zahrnuje, například, saponiny přečištěné z kůry stromu Q. saponaria, jako je QS21 (glycolipid, který eluuje ve 21. píku při HPLC frakcionaci; Aquila Biofarmaceuticals, lne., Worcester, MA); poly[di(karboxyatfenoxy)fasfazen (pCPP polymer; Virus Research Institute, USA); deriváty lipopolysacharidů, jako je monofosforyllipid A (MpL; Ribi ImmunoChem
Research. lne., Halmiton, Ml), muramyl-dipeptid (MDP; Ribi) a threonyl-muramyl dipeptid (t-MDP; Ribi); OM-174 (glueosamin d i sacharid příbuzný lipidu A; OM Farma SA, Meyrin, Switzerland); a Leishmaniový elongačnt faktor (přečištěný Leishmaniový protein; Corixa Corporation, Seattle, WA).
Adjuvans, která vytvářejí depo--efekt a stimulují imunitní systém, jsou ty sloučeniny, které mají obě výše uvedené funkce. Tato třída adjuvans zahrnuje, například, ISCOMS (imunostimulační komplexy, které obsahují smíšené saponiny, lipidy a tvoří částice velikostí virů s póry, které mohou udržovat antigen; CSL, Melboume, Australia); SB-AS2 (SmithKline Beeeham adjuvantní systém #2, což je emulze olej-ve-vodě obsahující MPL a QS21: SmithKline Beeeham Biolo55 gieals [SBB], Rixensart, Belgium); SB- ASI (SmithKline Beeeham adjuvantní systém #4, který
-65 <./. JU1438 (30 obsahuje kamenec a MPL; SBB, Belgium); non -iontové blokové kopolymery, které tvoří micely, jako je CRL 1005 (tyto obsahují lineární řetězec hydroťobních polyoxypropylenů obklopený řetězcem polyoxyethylenu; Vaxcel. lne., Norcross, GA); a Syntex Adjuvant Formulation (SAF, emulze olej ve vodě obsahující Tween 80 a neiontový blokový kopolymer; Syntex Chemicals, lne., Boulder, CO).
Imunostimulační nukleoví kyseliny jsou také použitelné jako slizniění adjuvans. Dříve bylo popsáno, že jak slizniění, tak systémová imunita je indukována slizniění aplikací CpG nukleové kyseliny. Systémová imunita indukovaná v reakci na CpG nukleové kyseliny zahrnuje jak protiio látkovou, tak buněčnou reakci na specifické antigeny, které nejsou schopny indukovat systémovou imunitní reakci, když jsou podány pouze na sliznici. Dále, jak CpG nukleové kyseliny, tak cholera toxin (CT, slizniění adjuvans, které indukuje Th2-reakci), indukují Cti. Toto je překvapivé, protože při systémové imunizaci je přítomnost Th2-protilátek spojena s chyběním CTL (Schirmbeck et al., 1995). Podle zde prezentovaných výsledků se předpokládá, že imunostimut5 lační nukleové kyseliny budou účinkovat podobným způsobem,
Dále, imunostimulační nukleové kyseliny indukují slizníční reakci jak lokálně (například v plících), tak na vzdálených sličnících (například v dolním trávicím traktu). Imunostimulační nukleové kyseliny indukují významné koncentrace lgA protilátek na vzdálených sličnících. CT se obecně považuje za vysoce účinné slizniění adjuvans. Jak bylo popsáno dříve (Snider, 1995), CT indikuje především protilátky IgGl izotypu, které jsou charakteristické pro reakci Th2-typu. Naopak, imunostimulační nukleové kyseliny indukují spíše Thl reakci s IgG2a protilátkami, zejména po dosycovací imunizaci nebo při kombinaci dvou adjuvans. Protilátky Thl typu mají obecně lepší neutralizační schopnost a kromě toho je Th2 reakce v plících značně nežádoucí, protože je spojena s astmatem (Kay, 1996, Hogg, 1997). Použití imunostimulačních nukleových kyselin jako slizniěních adjuvant má výhody, které chybějí ostatním slizničním adjuvans, Imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné jako slizniění adjuvans pro indukci jak systémové, tak slizniění imunitní reakce.
Slizniění adjuvans označované jako non-nukleokyselinové slizniění adjuvans může být také podáno s imunostimulačnimi nukleovými kyselinami. Non-nukleokyselinové slizniění adjuvans je adjuvans jiné než imunostimulační nukleová kyselina, které může indukovat slizníční imunitní reakci u jedinci po podání na povrch slizniee v kombinaci s antigenem. Mezi slizniění adjuvans patří, například, bakteriální toxiny, jako je např. Cholera toxin (CT), deriváty CT, jako je CT B podjednotka (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val na Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val na Lys) (Fontana et al., 1995); CTK.104 (Tyr na Lys) (Fontana ct al., 1995); Cm53/K63 (Val na Asp, Ser na Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg na His) (Fontana et al., 1995); C1N107 (His na Asn) (Fontana et al., 1995); C TE114 (Ser na Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu na Lvs) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser na Phe) (Yamamotoet al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro na Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); aCTK63 (Ser na Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), Zonula oceludens toxin, zot, Escherichia coli termolabilní enterotoxin, labilní Toxin (LI ), LT deriváty, jako je LT B podjednotka (LTB) (Veerweij et al.. 1998); LT7K (Arg na Lys) (Koniáše et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser na Phe) (Komase et al.. 1998); LT 112 K (Glu na Lys) (Komase et aL, 1998); LT118E (Gly na Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg na Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg na Gly) (Komase et al., 1998); L I K63 (Ser na Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce etal,, 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); a LTR 72 (Ala na Arg) (Giuliani et al., 1998), Pcrtussis toxin, PT, (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag aCIemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995) včetně PT9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); deriváty toxinů (viz
5Ω dále) (Holmgren et al., 1093, Verwcij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag a Clements, 1999); deriváty lipidu A (např. monofcsforyl lipid A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998); deriváty muramyldipeptidu (MDP) (Fukushinia et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); proteiny zevní bakteriální membrány (například zevní membránový protein A (OspA), lipoprotein Borrelia burgdorferi. zevní membránový protein Neisseria meningitidis) (Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); emulze olej ve vodě (např. MF59)
- 66 (Barchfield et af, 1999, Verschoor et al., 1999, O'Hagen, 1998); soli hliníku (Isaka et al., 1998,
1999); a Saponiny (např. QS21) Aquila Biopharmaceutieals, lne., Worster, MA) (Sasaki et al.,
1998, MaeNealet al., 1998), ISCOMS, MF-59 (emulze skvalen-ve-vodě stabilizovaná Spán 85 a Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); Seppíc ISA 720; AirLiquide, Paris, France);
PRO V A--X (emulze olej-ve-vodě obsahující detergens a činidlo vytvářející micely; IDEC Pharmaceutical Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvant Formulation (SAF, Syntex Chemicals, lne. Boulder, CO); poly(di(karboxylátfenoxy)ťosfazen (PCPP polymer, Virus Research institute; USA) a Leishmaniový elongační faktor (Corixa Corporation, Scattle, WA).
lifiuiiitin icakcu mohou byt takc í nuiiko Vany nebo zes ilcny současným podáním nebo ko lineami expresí cytokinů (Bueler a Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al, 1997; Kim et al., 1997) nebo B-7 kostimulačních molekul (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al„ 1997) s imunostimulačními nukleovými kyselinami. Cytokiny mohou být podány přímo s imunostimulačními nukleovými kyselinami nebo mohou být podány ve formě nukleokyselinového vektoru, který' kóduje cytokin, takže je cytokin exprimován in vivo. V jednom provedení je eytokin podán ve formě plasmidového expresního vektoru. Termín „cytokin“ označuje různorodou skupinu solubilních proteinů a peptidů, které působí jako humorální regulátory v nano- až pikomolámích koncentracích a které, za normálních nebo patologických podmínek, modulují funkční aktivity jednotlivých buněk a tkání. Tyto proteiny také přímo zprostředkují interakce mezi buňkami a regulují procesy, které probíhají v extracelulamím prostředí. Příklady cytokinů jsou, například, 11,-2, IL^t, IL-5, IL-6, IL-7. IL-10. IL-12. IL-15, IL-18. faktor stimulující kolonie granulocytů-makroťágu (GM-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytu (G-CSh), interferon-gamma (IFN-gamma), IFN-alfa, faktor nekrosy nádorů (TNF), TGF-beta, FL I 3 ligand a CD40 ligand.
Cytokiny mají úlohu v řízení reakce T-lymfocytů. Pomocné (CD4+) T lymfocyty koordinují imunitní reakci u savců prostřednictvím produkce solubilních faktorů, které působí na jiné buňky imunitního systému, včetně jiných T-lymfocytů. Většina zralých CD4+ T pomocných buněk exprimuje jeden ze dvou cytokinových profilů: Thl nebo Th2. Thl podskupina indukuje oddálenou hypersensitivitu, buněčnou imunitu a přesmyk imunoglobulinů na třídy IgCi2n. Th2 podskupina indukuje humorální imunitu aktivací B-lymfocytů, podporou produkce protilátek a indukcí přesmyku protilátek na IgGf a IgE. V některých provedeních je výhodné, aby byl cytokinem Thl cytokin.
Nukleové kyseliny jsou také užitečné pro přesměrování imunitní reakce z Fh2 imunitní reakce na Thl imunitní reakci. Přesměrování Th2 na Thl imunitní reakci může být hodnoceno měřením koncentrací cytokinů produkovaných v odpovědi na nukleovou kyselinu (například indukcí monoeytů a jiných buněk k produkci Thl cytokinů, včetně IL-12, IFN-gamma a GM-CSF). Přesměrování nebo vyvážení imunitní reakce z Th2 na Thl odpověď je zejména vhodné při léčbě nebo prevenci astmatu. Například, účinné množství pro léčbu astmatu může být množství použitelné pro přesměrování imunitní reakce Th2 typu, která je asociovaná s astmatem, na reakci Thl typu. Th2 cytokiny, zejména 1L~4 a IL—5, jsou zvýšené v dýchacích cestách astmatiků. Tyto cytokiny podporují významné aspekty' astmatické zánětlivé reakce, včetně přesmyku na IgE izotyp, chemotaxe eosinofilů a aktivace a růstu žímých buněk. Thl cytokiny, zejména IFN45 gamma a IL-12, mohou potlačovat tvorbu Th2 klonů a produkci Th2 cytokinů. lmunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu způsobují zvýšení Thl cytokinů, které napomáhají vyvážení imunitního systému a brání nebo snižují nežádoucí účinky spojené s převládající imunitní reakcí Th2 typu.
Nukleové kyseliny jsou také použitelné pro zlepšení přežívání, diferenciace, aktivace a zrání dendritických buněk. lmunostimulační nukleové kyseliny mají jedinečnou schopnost podporovat přežívání buněk, diferenciaci, aktivaci a zrání dendritických buněk. Dendritieké prekurzorové buňky izolované z krve pomocí imunomagnetického třídění buněk získávají morfologické a funkční charakteristiky dendritických buněk během dvoudenní inkubace s GM-CSF. Bez GM55 CSF tyto buňky podléhají apoptose. lmunostimulační nukleové kyseliny jsou lepší než GM-CSF
-67CZ 31)1488 B6 v podpoře přežíváni a diferenciace dendritických buněk (exprese MHC II, velikosti buněk, granularity). Imunostimulační nukleové kyseliny také indukují zrání dendritických buněk. Protože dendritické buňky tvoří vazbu mezi nespecifickou a specifickou imunitou, tím, že prezentují antigen a exprimují rozpoznávací receptory, které detekují mikrobiální molekuly, jako je LPS, v jejich lokálním prostředí, podporuje možnost aktivace dendritických buněk imunostimulačními nukleovými kyselinami jejich použití pro in vivo a ex vivo imunoterapií onemocnění, jako jsou nádory a alergická nebo infekční onemocnění. Imunostimulační nukleové kyseliny jsou také použitelné pro aktivaci a indukci zrání dendritických buněk.
io Imunostimulační nukleové kyseliny také zvyšují lytickou aktivitu přirozených zabíječů a buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC). ADCC může být provedena za použití imunostimulačních nukleových kyselin v kombinaci s protilátkami specifickými pro buněčné cíle, jako jsou nádorové buňky. Když je imunostimulační nukleová kyselina podána jedinci současně s protilátkou, tak je imunitní systém příjemce indukován k zabíjení nádorových buněk. Mezi protilátky použitelné v ADCC patří protilátky, které interagují s buňkami v těle. V oboru bylo popsáno mnoho protilátek specifických pro buněčné cíle a mnohé takové protilátky jsou komerčně dostupné. Příklady takových protilátek jsou uvedeny dále v seznamu protinádorové imunoterapie.
Iinunoslimulační nukleové kyseliny mohou být také podány s protinádorovou terapií. Protinádo20 rová terapie zahrnuje protinádorové léky, ozařování a chirurgické výkony. Termín „protinádorový lék označuje činidla, která jsou podávána jedincům za účelem léčby nádorů. Termín „léčba nádorů“ označuje prevenci vzniku nádorů, redukci příznaků nádorů a/nebo inhibici růstu nádoru. V jiných aspektech je protinádorový lék podán jedinci s rizikem vzniku nádoru za účelem redukce rizika vzniku nádoru. Jsou zde popsány různé typy léků pro léčbu nádorů. Pro účely této přihlášky jsou protinádorové léky klasifikovány jako chemoterapeutická činidla, imunoterapeutická činidla, protinádorové vakcíny, hormonální léky a modifikátory biologické odpovědi.
Termín „protinádorový lek“ označuje činidla, která jsou podávána jedincům za účelem léčby nádorů. Termín „léčba nádorů“ označuje prevenci vzniku nádoru, redukci příznaků nádorů
3o a/nebo inhibici růstu nádoru. V jiných aspektech je protinádorový lék podán jedinci s rizikem vzniku nádoru za účelem redukce rizika vzniku nádoru. Jsou zde popsány různé typy léků pro léčbu nádorů. Pro účely této přihlášky jsou protinádorové léky klasifikovány jako chemoterapeutická činidla, imunoterapeutická činidla, protinádorové vakcíny, hormonální léky a modifikátory biologické odpovědi. Způsoby podle předkládaného vynálezu zahrnují použití jednoho nebo více protinádorových léků společně s imunostimulačními nukleovými kyselinami. Například může být imunostimulační nukleová kyselina podána s chemoterapeutickým a imunoterapeutickým činidlem. Alternativně může být protinádorovým lékem kombinace imunoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny, nebo chemoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny nebo chemoterapeutického činidla, imunoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny. která je
4i) podávána jedinci za účelem léčby nebo prevence nádorů.
Protinádorové léky působí různými způsoby. Některé protinádorové léky působí tak, že ovlivňují fyziologické mechanismy, které jsou specifické pro nádorové buňky. Příkladem je cílené ovlivnění specifických genů a jejich genových produktů (tj. proteinů), které jsou mutované u nádorů.
Mezi takové geny patří onkogeny (například Ras, Her2, bcl-2), tumor-supresorové geny (například LGF. p53, Rb) a geny buněčného cyklu (například CDK4, p21, telomerasa). Protinádorové léky mohou ovlivňovat dráhy přenosu signálu a molekulární mechanismy, které změněny v nádorových buňkách. Cílené ovlivnění nádorových buněk prostřednictvím epitopu exprimovaných na jejich povrchu lze provést pomocí monoklonalních protilátek. Tento typ protinádorové léčby se
5o obecně označuje jako imunoterapie.
Jiné protinádorové léky ovlivňují jiné než nádorové buňky. Například některé léky indukují imunitní systém k napadání nádorových buněk (tj. protinádorové vakcíny). Ještě jiné léky, označované jako inhibitory angiogenese, ovlivňují tok krve v solidních nádorech. Protože většina maligních nádorů může metastazovat (tj. šíří se z primárního místa dále, kde vytvářejí sekundární
-68 nádory), jsou léky působící proti metastazování také použitelné pro léčbu nádorů. Mezi angiogenní mediátory patří bazický FGF, VEGF, angiopoetiny, angiostatin, endostatin, TNFa, Ί ΝP—470, tromhospondin-1. trombocytámí faktor 4, CAI a některé členy integrinové rodiny proteinů.
Jednou kategorií tohoto typuje lék označovaný jako inhibitor metaloproteinasy, který inhibuje enzymy používané nádorovými buňkami v primárním miste nádoru k extravazaei do jiných tkaní.
Některé nádorové buňky jsou antigenní a mohou být proto rozpoznány imunitním systémem. V jednom aspektu je kombinované podání imunostimulační nukleové kyseliny a protinádorových léků, zejména imunoterapeutických léků, použitelné pro stimulaci specifické imunitní reakce io proti nádorovému antigenu. „Nádorový aniigeiC, jak je zde puužitu, jc sloučenina, jako je peptiu, asociovaná s nádorem nebo povrchem nádorových buněk, která může vyvolat imunitní reakci, když je exprimována na povrchu buněk prezentujících antigen společně s MHC molekulou.
Nádorové antigeny, jako jsou antigeny přítomné v protinádorových vakcínách nebo antigeny používané v případě protinádorově imunoterapie, mohou být připraveny ze surových extraktů nádorových buněk, jak je popsáno v Cohen et aL, 1994, Nádory Research, 54: 1055, nebo částečným přečištěním antigenů, za použití rekombinantní technologie, nebo de novo syntézou známých antigenů. Nádorové antigeny mohou být použity ve formě imunogenních částí konkrétního antigenu, nebo může být v některých případech použito celých buněk nebo nádorové hmoty. Takové antigeny mohou být izolovány nebo připraveny rekombinantně nebo jakýmikoliv jinými prostředky známými v oboru.
Teorie imunologického dohledu spočívá v tom, že primární funkcí imunitního systému je detekce a eliminace neoplastických buněk před vznikem nádoru. Základním principem této teorie je to. že nádorové buňky jsou antigenně odlišné od normálních buněk a tak vyvolávají imunitní reakce, které jsou podobné rejekcí imunologicky inkompatibilních allotransplantátů. Studie potvrdily, že se nádorové buňky liší, kvalitativně nebo kvantitativně, v expresi antigenů. Například, nádorově specifické antigeny jsou antigeny, které jsou specificky asociované s nádorovými buňkami, ale ne s normálními buňkami. Příklady nádorově specifických antigenů jsou virové antigeny v nádorech indukovaných DNA nebo RNA viry. Antigeny „asociované s nádory'1 jsou přítomné jak v nádo30 rových buňkách, tak v normálních buňkách, ale v nádorových buňkách jsou přítomné v jiném množství nebo formě. Příklady takových antigenů jsou inkofetální antigeny (například karcinoembryonální antigen), difereneiační antigeny (například T a Tn antigeny) a produkty onkogenů (například HER/neu).
Byly identifikovány různé typy buněk, které mohou zabíjet nádorové buňky in vitro a in vivo: přirození zabíječi (NK buňky), cytolytické T-lymfocyty (CTL), žabí ječí aktivovaní lymfokiny (LAK) a aktivované makrofágy. NK buňky mohou zabíjet nádorové buňky bez předchozí senzibilizaee specifickými antigeny ajejich aktivita nevyžaduje přítomnost antigenů třídy l kódovaných hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) na cílových buňkách. Předpokládá se, že
NK buňky se podílejí na kontrole rostoucích nádorů a na kontrole růstu metastáz. Oproti NK buňkám mohou CTL zabíjet nádorové buňky pouze potom, co byly senzibilizované k nádorovým antigenům a poté, co je nádorový antigen exprimován na nádorových buňkách, které také exprimují MHC třídy I. CTL se považují za efektorové buňky při rejekci transplantovaných nádorů a nádorů způsobených DNA viry. LAK buňky jsou podskupinou nulových lymťocytů odlišnou od
NK a CTL populací. Aktivované makrofágy mohou zabíjet nádorové buňky způsobem, který není po aktivaci ani závislý na antigenu, ani MHC restrihovaný. Předpokládá se, že aktivované makrofágy snižují růst nádorů, do kterých infiltrovaly. Testy in vitro identifikovaly jiné imunitní mechanismy, jako je buněčná cytotoxické reakce závislá na protilátkách a lýza protilátkami a komplementem. Nicméně se předpokládá, že ty to imunitní efektorové mechanismy jsou méně významné in vivo než funkce NK, C Í L, LAK a makrofágů in vivo (pro přehled viz Piessens, W. F. a David, J. „Tumor Immunology. v Scientifics American Medicine, svazek 2, Scientific American Books, N. Y. str. 1-13, 1996).
-69CZ 301488 B6
Cílem ímunoterapie je zesílení imunitní reakce pacienta na existující nádor. Jedna metoda irnunoterapie zahrnuje použití adjuvans. Adjuvant ní substance odvozené od mikroorganismů, jako je bači Hus CalmetteAjuerinové, zesilují imunitní reakci a zvyšují resistenci na nádory u zvířat.
s Imunoterapeutická činidla jsou léky, které jsou odvozeny od protilátek nebo fragmentů protilátek, které se specificky váží na antigen a rozpoznávají antigen. Termín „nádorový antigen'1 je obecně definován jako antigen exprimovaný na nádorových buňkách. Ještě lépe je antigen takový, který není exprimován na normálních buňkách, nebo alespoň není exprimován v takovém množství jako na nádorových buňkách. Protilátkové Ímunoterapie účinkují tak, že se váží na povrch nádoo rových buněk a tak stimulují endogenní imunitní systém k útoku na nádorové buňky. Jindy může protilátka působit jako přepravní vehikulum pro specifické zacílení toxických substancí do nádorových buněk. Protilátky jsou obvykle konjugovány na toxiny, jako je ricin (například z ricinových semen), calicheamycin a maytansinoidy, na radioaktivní izotopy, jako je kód—131 ayttrium-90, na chemoterapeutická činidla (jak jsou zde popsána) nebo na modifikátory biolo5 gické odpovědi. Tímto způsobem mohou být toxické substance koncentrovány v regionu nádoru nebo může být minimalizována nespecifická toxicita pro normální buňky. Kromě použití protilátek, které jsou specifické pro nádorové antigeny jsou ve způsobech podle předkládaného vynálezu použitelné protilátky, které se váží na cévy, například na endotelové buňky. Tyto protilátky jsou použitelné proto, že solidní nádory jsou závislé na nově vytvořených cévách a většina o nádorů může indukovat a stimulovat růst nových krevních cév. Proto je jednou strategií protinádorové léčby napadání krevních cév nádoru a/nebo pojivové tkáně (nebo stromatu) podporující takové cévy.
- 70 Tabulka C
Protinádorová munoterapeutíeká činidla ve vývoji nebo na trhu
Prodetce obchodní název (generický název) Indikace
IDEGOcncntech, IncJHoffinannLuRochc (první monoklonální protilátka licencovaná pro léčbu nádorů v USA RitnxanTM (rituximab, Mabthera) (mECC2B8, chimérická myštlidská anti-CD20 MAb)
Genentech/Hoilmann-La Koche Herceptin. ami-Hcrz íimad pra/vaj ceníky
Cytogen Corp. Quadramet (CYT-424) radioterapeutické Činidlo kostní metaatasy
C entocar/Glaxo/ Ajinomoto Panorex(Q (17-1 A) ímyAf monoklonální protilátka) Adjuvant terapie kolorcktálního karcinomu (Dukes-C)
Contoc oř/Ajinomoto Paiwrestg (17-IA) (chimérická myái monoklonální protilátka) Panoroas, plíce, prs, vaječmky
IDEC IDEC- Y2BS (myjí, aoij-CW MAb značená Yttriem-90) non-Hodgkinský lymfom
ImClone Systems BEC2 (anti-idiotypová MAb, napodobuje GD3 epitop) (s BCG) m&loliunččný karcinom plic
ImClone Systems C225 (chimérická monoklonální protilátka rócčptoíU pro epídermálnl růstový faktor (EGF) karcinom ledvin
T echnielone International· Alpha Therapeutics Oncolym (Lym-l monoklonální protilátka vázaná oajód-Ul) non-Hodgkinský lymfom
Protein Design Labs SM AR TMI 95 Ab, humanizovaná Akutní myl eo i dní leukemie
Tochniclone Corporauon/Cambridge Protilátka Technology 131-1 LYM-1 (OnoolymTW) non-Hodgkinský lymfom
Aroncx Phonnaceuticnla, Inc. ATRAGEN® .Akutní promyelocytámi leukemie
ImClone Systems C225 (chimérická anti-EGFr monoklonální proti látka + + císplatina nebo radiace nádory hlavy a krku nemalobunéčné nádory plic
-71 CZ3U1488 B6
AJtarcx, Canaja Ovarex (1343.13, anti-idiotypová C2I2S, my lí MAb) Ovaria
Coulter Phanna (Klinické výsledky Vyly pozitivní, ale lék byl spojen s významnou toxicitou pro kostní dřeň Bexxar (anti-CD20 Mab značená J3I-1) noú-Hodgkinský lymfom
Aronex Phannaceuticals, lne. ATRAGEN® Kaposiho sarkom
IDEC Ph&nnaceuticah CorpJGenentech RjtbXanTM (MAb proti CD20) pan-B Ab při kombinací s chemoterapií B lymfocytámí lymfom
LeukoSite/Hex O ti co logy LDP-03, huMAbk leukocytámímu antigenu CAMP ΑΓΗ ιογ tt (anh CD6, myši MAb) CTCL Chronická lymfocytámí leukemie (CLE)
Center ůf M oletplat ImmurtOlogy Nádory
Medarex Ll N ovartis MDX-210 (humanizováni anti-HER-2 bispecifickáká protilátka) prso, vaječuíky
MedarexJNovartis MDX-210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifickáfca protilátka) Prostata, nemalobunéčné pilce pynkieas, prs
Medarex MDX-1I (komplemcnt aktivující receptor (CAR) roonoxlcnalm protilátka) Akutní myelogenni leukémie (AML)
Medarex Novartis MDX210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifícká protilátka) ledviny a střevo
Medarex MDX-11 (koni plemeni aktivující receptor (CAR) monoklonální protilátka) Ěx vivo zpracování kostní dřené při akutni roycloidni leukémii (AML)
Medarex MDX-22 (humanizovaná bispociácká protilátka, MAb-konjugáty) (aktivátory komplementové kaskády) Akutní myleoidní leukemie
Cytogen OV1O3 (Yttnem-90 značená protilátka) vaječnflty
Cytogen OV1O3 (Yttriem-90 znaečná protilátka) ATfcAGEN® 3622W94 Mab, která se váže na EGP40 (17-1 A) pankarcicornový antigen na adenokarcinomech Prostata
Aronex Pharmateulicals, lne. Don-Hodgkiniký lymfom
Glaxo 'Wellcome plc nemalobun&ný karcinom plic prostata (adjuvantně)
Genentecb Aftti-VEGF. RhuMAb (inhibuje angiogenesi) plíce, prs, prosou kolorektálni karcinom
Protein Design Labí Zenapax (SMART Anti- Tac (1L-2 receptor) Ab, bumanizovaDá) Leukemie, lymfom
Piotein Design Labs SMART M19S Ab, humanizovaná Akutní promyelocytánií leukem ia
ímClone Systems C22S (chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka) * laxol prs
ImClone Systems (licensed fhnn RPR) C22S (chimérická anti-EGFr monokl onáhii protilátka) + doxonibicin prostata
ImClone Systems C22S(chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka) + udriamyCm prostata
ImClone Systems BEC2 (anti-idiotypová MAb, napodobuje GD3 epitop) Mélxoom
Medarex MDX-210 (humanizovaná anii-HER-2 bispecifícká Nádory
protilátka) 1
Medarex MDX-220 (bispecifická pro nádory exprirnující TAG-72) plíce, střevo, prostata ovarium, endometrium, penereasa žaludek
Medarex/Novartis MDX-210 (humanizovaná anri-HER-2 bispecifická protilátka) Prostata
Med nrei/Merck KgaA MDX-447 (humanizovaná anti-EGF receptor bispecifická protilátka) EGť receptor obsahující nádory (hlava a krk, prostata, plíce, močový mčchýť, cervix, ovaria)
MedarwINovartis * komb. terapie s GCSF pro různě nádory, hlavné prsu
IDbC MELIMMUNE-2 (mvší monoklonální protilátka - terapeutická vakcína) McJanom
ImEC MEUMMUŇE-t (myti monoklonální protilátka - terapeutická vakcína ) Nlclarom
[mnumOrtiedics. lne. CfcACíOT?“ (1-131) kolorektálni nádory a jme
ŇeoRx Pretarget^ radioaktivní protilátky iroft-Hodgkirwký B lymfocytánií lymfonj
Novophann Biotcch, Lne. NovoMAb-G2 (pankardaomová specifická Ab ) Nádory
Tec trn Klone Corporation/ Cambridge Protilátka Technology TNT (chimérická MAb k bistonovým antigenům) mozek
Techniclone International/ Cambridge Protilátka Technology TNT (chinteric MAb to histooe anttgensl Brain
Novophann Gliomab-H (Monoclonals - Humanizovaná Abs) Brain, melanomas, neuroWaflomas
Genetici Institute/ AHP GNI-2S0 Meh Colorecul
Merck KgaA EMD-72000 (diimérická-EGF antagonist) Nádory
Imtminoinediči LymphnCide (humanizovaná LL? protilátka) non-HcdgkjďsB-ccU lymforn
Immunex/ A HP CMA 676 (monoklonální protilátka conjugate) Akutní mydogenoui leukemia
Novophann Bidlech, ínc. Monopharm-C Colon, lung. pancreatic
Novopharm Bioteth, Inc. 4BS anti-idiotype Ab Melanoma, smáli-cell limg
Center of Molecular Immunology lor egflr3 (anti EGF-R humanizovaná Ab) Radtoimunoterapie
Center of Molecular Immunology tor cS (myti MAb kolorekt.) pro radioimunoterapii kolorektálni nádory
Creative HioMoleculcsl Chíron BABS (bÍQsyntetická protilátka proti vazebnému místu) Proteiny nádory prsu
ImCIone ŠysiemMChugai FLK-2 (monoklonální protilátka k fetálnf jatenrí kmase-2 (FLK-2» angiogenese spojená s nádory
ImmunoGcn, lne. konjugát humaoizovaná MAlťirurié molekuly malobun&ný karicnom plic
Medarex. Inc. MDX-260 bispecifická, zaměřená na GD-2 Melanonj. glknn, neuroblaslom
Procyon Biopharma ANA Ab nádory
Protein Designs Labs SMARTID10 AB B-lymfocytámí lymforn
Protein Desigrls Cabs/Novartís SMART ABL 364 Ah pra. pilce, kolon
Immunomedics, ínc. JmmuRAIT-CEA kolorektálni nádory
-73CZ 301488 B6
Ještě dalšími typy chemoterapeutickýeh činidel, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, jsou aminoglutetimid, asparagimisa. busulfan, karboplatina, ehlorambucil. cytarabin
HCl, daktinomycin, daunorubiein HCl, estramustin fosfát sodný, etoposid (VP-16-213). floxuridin, tluoruracil (5-FIJ), ílutamid, hydroxymočovina (hydroxykarbamid), ifosťamid. interferon a-2 A, a-2B, leuprolid acetát {analog LHRH), lomustin (CCNU), mechloretamin HCl (dusíkatý yperit), merkaptopurin, mesna, mitotan (o.p. DDD), mitoxantron 11C1, oktreotid, plieamycin, prokarbazin HCl, streptozotoein, tamoxifen citrát, thioguanin, thiotepa, vinblastin sulfát, amsacrin (m-AMSA), azacitidin, erythropoetin, hexamethylmelamin (HMM), interleukin-2, mitoguazon (methyl-GAG); methyl-glyoxal bis-guanylbydrazon (MGBG); pentostatin (2|[) deoxykoformycin), semustin (methyl-CCNU), teniposid (VM-26) a vindesin-sulfát,
Protinádorové vakcíny jsou léky, které jsou určeny pro stimulaci endogenní imunitní reakce na nádorové buňky. Současné vakcíny přednostně aktivují humorální imunitní systém (tj. imunitní reakci závislou na protilátkách). Jiné, v současnosti vyvíjené vakcíny, jsou zaměřeny na aktivaci buněčného imunitního systému včetně cytotoxiekýeh T-lymfocytů, které mohou zabíjet nádorové buňky. Nádorové vakcíny obvykle zesilují prezentaci nádorových antigenů jak na buňkách prezentujících antigen (například makrofágách nebo dendritíckých buňkách) a/nebo na jiných buňkách imunitního systému, jako jsou T-lymfocyty, B-lymfocyty a NK buňky.
Ačkoliv mohou mít protinádorové vakcíny různé formy, jak je popsáno dále, je jejich cílem přenos nádorových antigenů a/nebo antigenů asociovaných s nádorem k buňkám prezentujícím antigen (APC) za účelem usnadnění endogenního zpracování takových antigenů APC ajejich prezentace na povrchu buněk v kontextu s MHC molekulami třídy I. Jedna forma vakcíny je eelobuněčná vakcína, která je přípravkem nádorových buněk, které byly odebrány od jedince, které byly zpracovány ex vivo a které byly vráceny jako celé buňky jedinci. Lyzáty nádorových buněk mohou být také použity jako protinádorové vakcíny pro vyvolání imunitní reakce. Jinou formou nádorové vakcíny je peptidová vakcína, která používá nádorově specifické nebo s nádorem asociované malé proteiny pro aktivaci T-lymfocytů. Proteiny asociované s nádorem jsou proteiny, které nejsou asociované výlučně s nádorovými buňkami (tj, normální buňky mohou také exprimovat tyto antigeny. Nicméně, exprese antigenů asociovaných s nádorem je obvykle zvýšená v nádorech určitého typu. Ještě jinou formou protinádorových vakcín je vakcína dendritíckých buněk, která obsahuje celé dendritické buňky, které byly vystaveny in vitro působení nádorového antigenu nebo antigenu asociovaného s nádorem. Lyzáty nebo membránové frakce dendritíckých buněk mohou být také použity jako nádorové vakcíny. Vakcíny dendritíckých buněk jsou schop55 ny přímo aktivovat buňky prezentující antigen. Mezi další nádorové vakcíny patří gangliosidové vakcíny, vakcíny proteinů tepelného šoku, virové a bakteriální vakcíny a nukleokyselinové vakcíny.
Použití imunostimulačníeh nukleovýeh kyselin společně s protinádorovými vakeínami poskytuje
-to lepší humorální a buněčnou imunitní reakci specifickou pro antigen, kromě aktivace NK buněk a endogenních dendritíckých buněk, a dosahuje vyšších koncentrací IFNa, Toto zlepšení umožňuje použití vakcíny s nižší dávkou antigenu pro dosažení stejného účinku. V některých případech mohou být protinádorové vakcíny použity s adjuvans, jak jsou popsána výše.
Termín „nádorový antigen*4 označuje antigeny. kterc jsou jinak exprímovány na nádorových buňkách a které mohou být využity pro cílené zaměření nádorových buněk. Nádorové antigeny jsou antigeny, které mohou potenciálně stimulovat imunitní reakce specifické pro nádory. Některé z těchto antigenů jsou kódované, ale ne nutně exprimované. normálními buňkami. Tyto antigeny mohou být charakterizované jako normálně silentní (tj. neexprimované) v normálních buňkách, ale exprimované pouze v některých stadiích diferenciace a dočasně exprimované jako embryonální a fetální antigeny. Jiné nádorové antigeny jsou kódované mutantními buněčnými geny, jako jsou onkogeny (například aktivovaný ras onkogen), supresorovými geny (například mutantní p53), fúzními proteiny vzniklými v důsledku delecí nebo chromosomálníeh translokací. Ještě jiné nádorové antigeny mohou být kódované virovými geny, jako jsou geny RNA a DNA nádorových virů.
- 74Jiné vakcíny mohou mít formu dcndritických buněk, které byly vystaveny působení nádorových antigenu in vitro, zpracovaly antigen a mohou exprímovat nádorové antigeny na svém povrchu v kontextu s MHC molekulami pro účinnou prezentaci antigenu jiným buňkám imunitního systé5 mu.
Imunostimulační nukleové kyseliny jsou použity v jednom aspektu vynálezu společně s nádorovými vakcínami na bázi dendritických buněk. Dendritická buňka je profesionální buňka prezentující antigen. Dendritické buňky tvoří spojení mezi vlastním a získaným imunitním systémem i í) !5 íim, ze prczCiiiuji antigeny a diky svým rcccptcnim detekuji íuikrobiaiti! molekuly, jako j£ LPS, ve svém okolí. Dendritické buňky účinné intemalizují, zpracovávají a prezentují solubilní antigeny, se kterými se setkají. Proces internalizace a prezentace antigenu způsobuje rychlé zvýšení exprese hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) a jiných kostimulačních molekul, produkci cytokinů a migraci do lymťatických orgánů, kde se předpokládané podílejí na aktivaci Tlymfocytů.
- 75 CZ J01488 B6
Tabulka D uvádí seznam proti nádorových vakcín, které se vyvíjejí nebojsou na trhu.
Vyvíjené nebo prodávané prótináďorové vakcíny
Výrobce Obchodní název (generický název) Indikace
Center of Molecular immunology EGF nádory
Center of Molecular Immunology ganglíosidová nádorová vakcína
Center of Molecular Immunology anti-idíotypová nádory
ImCIaie Systems/memoríal Sloan- Ketterin Canccr Center Gp75 antigen melanom
JmCIone Systems/raemorial Sloan- Ketterin Canccr Center anti-idiotypovc Ab nádory
(Vogenic Pharmaceuticals, lne. GMK melanomová vakcína melanom
Progenic Pharmaceuticals, lne. MGV ganglíosidová konjugátová vakcína lymfom, kolorekt
Čorixa Hcr2/neu prs, ovarium
AVAX Technologies, lne. Ovarex ovarium
AVAX Technologies, lne. M-Vax, autologní celé buňky melanom
AVAX Technologies, lne. 0-Vax, autologní celé buňky ovarium
Biomira IncZChiron L-Vax, autologní celé buňky leukemie*AML
Biomira IncJChiron theratope, Stn-KLH prs, kolorekt.
Biomira lne. BLP25, MLJC-l peptidové vakcína enkapsulovaná v liposomálním systému plíce
Biomira lne. BLP25, MUC-1 peptidová vakcína enkapsulovaná v liposomálním systému + liposomální IL-2 plíce
Biomira lne.. liposomální idiotypová vakcína B-lymfocytární lymfom
Ribi Irrimunochem melacin, buněčný lyzát melanom
Corixa peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a I xIF adjuvans prs
Corixa peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans prostata
Corixa peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans ovarium
Corixa peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans lyrafcm
Corixa peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans plíce
Virus research Institute Toxin/antigen rekombinantní přepravni systém nádory
Appolan lne. Genevax-TCR T-lymfocytAmí lymfom
Bavarian Nordic Research Institute A/S MVA vakcína (virus vakcinie rnelanotn
BioChem Fharma/Bie/Cheni Vaccine PACIS, BCG vakcina močový měchýř
Cantab Pharmaceuticals TA-HPV cervix
Cantab Pharmaceuticals TA-CIN cervix
Cantab Pharmaceuticals DISC-virus, imunoterapie nádory
Pasteur Merieux Connaught IflimuCyst®ZTheraČys® - BCG Imunoterapeutikum (bacillus Calmette-Guerinové/Con naught), pro intravesikální léčbu povrchového karcinomu močového měchýře močový měchýř
Termín chemoterapeutické činidlo, jak je zde použit, zahrnuje všechny další formy protinádorových léků, které nespadají do kategorie imunoterapeutických činidel a protinádorových vakcín. Mezi chemoterapeutická činidla patří jak chemická, tak biologická činidla. Tato činidla ínhibují buněčnou aktivitu, kterou nádorové buňky potřebují pro trvalé přežívání. Do kategorie chemotcrapeutických činidel patří alkylační činidla/alkaloidy, antimetabolity, hormony a analogy hormonů, a různá antineoplastická činidla. Většina z těchto činidel je přímo toxická pro nádorové buňky a nevyžadují imunostimulaci. Kombinace chemoterapie a podávání imunostimuiačních nukleových kyselin zvyšuje maximální tolerovatelné dávky chemoterapie.
o
Chemoterapeutická činidla, která se v současnosti vyvíjejí nebo používají, jsou uvedeny v tabulce E.
- 77 CZ 301488 B6
Tabulka E
Vyvíjené nebo prodávané protinádorově lékvt
Prodejce Obchodní název TNP 470/AGM 1470 Generický název Name Indikace
Abbott Fragylin Anti-angiogenese u nádorů
Takeda TNP 470/AGM 1470 Fragylin Anti-angiogenese u nádoru
Scotia Meglaraine GLA Meglaminc GLA Vainibicin Vatrubicin Nádory močového měchýře
Medeva Valstar Medeva Valstar Nádory močového měchýře, rcTraktemí karcinom in šitu Nádory močového měchýře, papilámí
Rhone Poulenc Glíadel Wafer Cannustaine + Polifepr Osan Nádory mozku
Warner Lambert nepopsané nádory (b) nepopsané nádory (b) Nádory
Bristol Myers Squib Inhibitor RAS Famesyl Transferasy Inhibitor RAS Famesyl Transferasy Nádory
Novartis MM1 270 MM1270 Nádory
Bayer BAY 12-9566 BAY 12-9566 Nádory
Merck Inhibitor Famesyl Transferasy Inhibitor famesyl transferasy Nádory (Solidní nádorypankreas,, kolon, plíce, prs)
Pfizer PFE MMP Nádory, angiogenese
Pfizer PFE Tyrosin Kinasa Nádory, angiogenese
Lilly MTAZLY23I5I4 MTA/LY23I514 Solidní nádory
Lilly L y 264618/Lometexol Lom et exot Solidní nádory
Scotia Glamolec LiGLA (lithium-gamma linolenat) Nádory pankreasu, prsu, steřva
Warner Lambert Cl-994 CI-994 Nádory, Solidní nádory Leukemie
Schering AG inhibitor angiogenese inhibitor angiogenese Nádory / kardío
Takeda INP-470 nzk Maligní nárdory
Smithklíne Beecham ITycamtin Topotecan Metastatícké nádory ovaria
Novartis PKC412 PKC412 Nádory s mnohotnou lékovou resistencí
Novartis Valspodar PSC 833 Myeloidní
-78VZj JVI1Í1O DO
leukemie/ovariální nádory
ímmunex Novan trone Mitoxantron Bolest při hormonálně refraktemích nádorech prostaty
Warner Lambert Metaret Suramin Prostata
Genentech Anti-VEGF Anti- VEGF Prostata /Prs /kolorektum / NSCL nádorv
British Biotech Batimastat Batúnastat (BB94) Pterygium
Eisai E 7070 E 7070 Solidní nádory
Biochem Phamia BCH-4556 BCH-4556 Solidní nádory
Sankyo CŠ-682 CS-682 , Solidní nádory
Agouron AG2037 AG2037 Solidní nádory
IDEČ Pham a 9-AC Solidní nádory
9-AC
-- Agouron | VEGF/b-FGF Inhibitore VEGF/b-FGF Inhibitore Solidní nádory
Agouron AG3340 AG3340 Solidní nádory l Makulámí degenerace
Vertex Incel VX-710 Solidní nádory - IV
Vertex VX-853 VX-853 Solidní nádory - Orální
Zeneca ZD0101 (inj) ZD0101 Solidní nádory
Novartis ISI 641 ÍSL641 Solidní nádory
Novartis ODN 698 OON 698 Solidní nádory
Tanube Seiyaku TA 2516 Mariin istat Solidní nádory
British Biotech Marimastat Marimastat (BB 2516) Solidní nádory
Cell těch COP 845 Aggrecanase Inhibitor Solidní nádory /Prs
Chiroscience D2163 D21Ó3 Solidní nádory / Metastasy
Warner Lambert PD 183805 PO 183805
Oaiíchi 0X895 lf 0X895 lf Nádory
Daiichí Lemonal OP 2202 Lemonal OP 2202 Nádory
Fujisawa FK317 FK317 Protinádorové antibiotikum
Chugaí Picibanil OK-432 maligní nádory
Nycomed Amersham AD 32/valrubicin Vaírubicin Nádory močového měchýře - refraktemí karcinom in šitu
Nycomed Amcrsham Metastron Derivát stroncia Nádory kostí (adjuvantni terapie)
Schering Plough Temodal Temozolomide Nádory mozku
Schering Plough Temodal Temozolonide Nádory mozku
Liposome Evacet Doxorubicin, Liposomal Nádory prsu
Nycomed Amcrsham Yewtaxan Paclitaxel Nádory prsu - pokročilé Nádory ovaria - pokročilé
Bristol Myers Squib Taxol Paclitaxel Nádory prsu - pokročilé Nádory ovaria - pokročilé NSCLC
Roche Xeloda Capecitabine Nádory prsu, kolorektální nádory
-79CZ 301488 B6
Roche Furtulon Doxifluridine Nádory prsu, kolorektální nádory, nádory žaludku
Pharmacia & Upjohn Adriamycin Doxorubicin Nádory prsu, Eeukemíe
Ivax Cyclopax Paclitaxel, Orální Nádory prsu/ovaria
Rhone Poulenc Orální taxoid Orální taxoid různé nádory
AHP Novantronc Mitoxantrone Nádory
Sequus SPJ-O77 Cisplatína, Stealth Nádory
Hoechst HMR1275 Flavopiridol Nádory
Pfizer CP-358, 774 EGFR Nádory
Pfizer CP-609,754 Inhibitor RAS onkogenu Nádory
Bristol Myers Squib BMS-182751 orální platina Nádory (plíce, ovaria)
Bristol Myers Squib ÚFŘ (Tegafur/Uracil) UFR (Tegaťur/Uracil) Nádory orální
Johnson & Johnson Ergamisol Levamisol Nádory
,Glaxo Wellcome Eniluracil/776C85 5FU Enhancer Nádory, Refraktenií solidní & kolorektální
Johnson & Johnson Ergamisol Levamisole Nádory střeva
Rhone Poulenc Campto Irinotecan Kolorektální nádory, cervix
Pharmacia & Upjohn C.amptosar Irinotecan Kolorektální nádory, cervix
Zeneca Tomudex Ralítrexed Kolorektální nádory, plíce
| Nádory, nádory prsu
Johnson & Johnson Leustain Cladribirte Vlasatobuněčná leukemie
ívax Paxene Paclitaxel Kaposiho sarkom
Sequus Doxil Doxorubicin, Liposoraální KS/Nádoty
Sequus Caelyx Doxorubicin, Liposomální KS/Nádory
Schering AG Fludara Fludarabin Leukemie
Pharmacia & Upjohn Pharm orubicin Epiruhicin Nádory prsu/plic
Chiron DepoCyt DepoCyt Neoplastická meningitis
Zeneca ZDI839 ZD 1839 NSCLC, pankreas
BASF LU 79553 Bis-naftalimid onkologie
BASF LU Ϊ 03793 Dolastain onkologie
Shering Plough Caelyx Doxorubicin- Liposomální Nádory prsu/ovaria
Lilly Gem zař Gemcitabine Pankreas, NSCLC, prs, močový měchýř a ovarium
Zeneca ZD 0473/Anormed ZD 0473/Anormed NSCL na bázi platiny, ovarium atd.
Yamanouchi YM 116 YM 116 Nádory prostaty
Nycomed Seedsll-125 Rapid St Jodová zrna Nádory prostaty
Amersham
Agouron Cdk41cdk2 inhibitory cdk41cdk2 inhibitory solidní nádory
Agouron PARP inhibitory PARP lnhibitcxy solidní nádory
Chiroscience D4809 Dexifosamid solidní nádory
Bristol Myers Squib UFT (Tegaťur/Uracil) UFT (Tegafur/Uracil) solidní nádory
Sankyo Kreslin Kreslin solidní nádory
Asta Medica Ifex/Mesnex Ifosamide solidní nádory
Bristol Meyers Squib Ifex/Mesnex lfosamide solidní nádory
BriStol Myers Squib Vumon Teniposide solidní nádory
Bristol Myers Squib Paraplatin kar bop latina solidní nádory
Bristol Squib Myers Plantinol | Cisplatina, Stealth
Bristol Myers Squib Plantinol Cisplatina
Bristol Myers Squib Vepesid Etoposid solidní nádory, melanom
Zeneca ZD9331 ZD 9331 solidní nádory, pokročilé kolorektální nádory
Chugai Taxotere Docetaxel solidní nádory, nádory prsu
Rhone Poulenc Taxotere Docetaxel solidní nádory, nádory prsu
Glaxo Wellcome Prodrug guanin- arabmosidu Prodrug arabinosidu T - Leukemie/Lymfom & B-lymfocyt Neoplasm
Bristol Myers Squib Taxanový analog Taxanový analog po taxolu
V jednom provedení využívají způsoby podle předkládaného vynálezu imunostimulační nukleové kyseliny jako náhradu místo terapie IFN-α při léčbě nádorů. V současnosti některé léčebné protokoly indikují IFNa. Protože je IFNa produkován po podání některých imunostimulačních nukleových kyselin, mohou být tyto nukleové kyseliny použity pro vyvolání endogenní tvorby IFNa.
Vynález také zahrnuje způsob pro indukci pro antigen nespecifické imunoaktivace a resistence na různé infekční noxy za použití imunostimulačních nukleových kyselin. Termín „imunoaktivace io nespecifická pro antigen'’ označuje aktivaci imunitních buněk jiných než jsou B-lymfocyty, jako jsou například NK buňky, T-lymfocyty nebo jiné buňky imunitního systému, které mohou odpovídat na antigen nezávislým způsobem. Široké spektrum resistence na infekční agens je indukováno proto, že buňky imunitního systému jsou v aktivní formě a jsou indukovány k reakci na jakékoliv vniklé sloučeniny nebo mikroorganismy. Buňky nejsou specificky aktivovány k určité15 mu antigenu. Toto je zejména užitečně v obraně proti biologickým zbraním a za některých okolností popsaných výše, jako například u cestovatelů.
Stimulační index konkrétní imunostimulační nukleové kyseliny může být testován v různých imunotestech. Výhodně je stimulační index imunostimulační nukleové kyseliny pro proliferací
B-lymfocytů alespoň přibližně 5, lépe alespoň přibližně 10, ještě lépe alespoň přibližně 15 a nejlépe alespoň přibližně 20, jak je určeno inkorporací uridinu v kultuře myších B lymfocytů, která byla kontaktována s 20 μΜ nukleové kyseliny na dobu 20 hodin při 37 °C a která byla pulsovaná 1 pCi 3H uridinu; kde tyto buňky byly odebrány a hodnoceny o 4 hodiny později, jako je podobně popsáno v PCT publikovaných patentových přihláškách PCT/lJS95/01570 (WO 96/02555) a PCT/US97/19791 (WO 98/18810), které uplatňují prioritu z US pořadové číslo 08/386063 a 08/960774, podaných 7. 2. 1995 a 30. 10. 1997, v příslušném pořadí. Pro použití
-81 CZ 301488 B6 in vivo je důležité, aby byly imunostimulační nukleové kyseliny schopné účinné indukovat imunitní reakci, jako je například produkce protilátek,
Imunostimulační nukleové kyseliny jsou účinné u obratlovců jiných než jsou hlodavci. Různé imunostimulační nukleové kyseliny mohou způsobovat optimální imunostímulaci, podle typu jedince a sekvence imunostimulační nukleové kyseliny. U mnoha obratlovců bylo podle předkládaného vynálezu zjištěno, že jsou reaktivní na stejné imunostimulační nukleové kyseliny, které se někdy označují jako imunostimulační nukleové kyseliny specifické pro člověka. Hlodavci, nicméně, reagují na jiné nukleové kyseliny. Jakje zde uvedeno, imunostimulační nukleová io kyselina způsobující optimální stimulaci u člověka nemusí obvykle způsobovat optimální stimulaci u myší a naopak. Imunostimulační nukleová kyselina způsobující optimální stimulaci u člověka často způsobuje optimální stimulaci u jiných zvířat, jako jsou krávy, koně, ovce, atd. Odborník v oboru může identifikovat optimální sekvence nukleové kyseliny použitelné pro konkrétní druh za použití rutinních testů a/nebo znalostí v oboru.
Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být přímo podány jedinci nebo mohou být podány společně s transportním komplexem pro nukleové kyseliny. Transportní komplex pro nukleové kyseliny označuje molekulu nukleové kyseliny asociovanou s (například iontově nebo kovalentně vázanou; nebo enkapsulovanou v) prostředku pro cílený transport (jako je například molekula, která se váže s vysokou afinitou na cílové buňky (například na povrchy B-lymfocytů a/nebo je ve zvýšené míře vychytávány cílovými buňkami). Příklady komplexů pro transport nukleových kyselin jsou nukleové kyseliny asociované se sterolem (například cholesterolem), lipidem (například kationtovým lipidem, virosomem nebo liposomem), nebo činidlem cíleně se vážícím na cílové buňky (jako je například ligand rozpoznávaný specifickým reeeptorem cílových buněk).
Výhodné komplexy mohou být dostatečně stabilní in vivo pro zabránění významného nenavázání před intemalizaeí do cílových buněk. Nicméně, komplex může být štěpitelný za vhodných podmínek uvnitř buňky, takže je nukleová kyselina uvolněna ve funkční formě.
Transportní vehikula nebo prostředky pro transport antigenu a nukleové kyseliny na povrchy jsou w popsané. Imunostimulační nukleová kyselina a/nebo antigen a/nebo terapeutické činidlo mohou být podány samostatně (například v salinickém roztoku nebo pufru) nebo za použití jakýchkoliv vehikul známých v oboru. Například byla popsána následující transportní vehikula; kochleáty (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); emulsomy (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); 1SCOM (Mowat et al., 1993, Carsson etal., 1991, Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); liposomy (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); živé bakteriální vektory (například Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerinové, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfleld et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al,, 1998); živé virové vektory (například virus vakcinie, adenovirus, virus herpes simplex) (Gallichan et af, 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al„ 1998, Flexner et al., 1988,
4o Morrow et al., 1999); mikrosféry' (Gupta et al., 1998; Jones et al., 1996; Maloy et al., 1994; Moore et al., 1995; O'Hagan et al., 1994; Eldridge et al., 1989); nukleokyselinové vakcíny (Fynan etal., 1993; Kuklin et af, 1997; Sasaki et al., 1998; Okada et al., 1997; lshiietal., 1997); Polymery (například karboxymethyleelulosa, ehitosan) (Ilamajima et al., 1998, Jabbal Gill et a!., 1998); polymerové kruhy (Wyatt et af, 1998); proteosomy (Vancott et al., 1998; Lowell et al.,
1998, 1996, 1997); fluorid sodný (hashi et al., 1998); transgenní rostliny (Tacekt et al., 1998;
Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virosomy (Gluck et al.. 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); virům podobné částice (Jiang et al„ 1999, Leíbl et af, 1998). Jiné transportní prostředky jsou známé v oboru a některé jejich další příklady jsou uvedeny dále v popisu vektorů.
Termín „účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny“ označuje množství nezbytné nebo dostatečné pro realizaci požadovaného biologického účinku. Například, účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny pro indukci slizniční imunity je množství, které je nutné pro indukci vzniku IgA reakce na antigen po expozici antigenu, zatímco množství nutné pro indukci systémové imunity je množství, které způsobí vznik IgG reakce na antigen po expozici antigenu.
V kombinaci se zde uvedenými fakty je možno pomocí výběru různých aktivních sloučenin
-82 a faktorů jako je účinnost, relativní biologická dostupnost, tělesná hmotnost pacienta, závažnost nežádoucích účinků a preferovaný způsob podání možno naplánovat účinný proťylaktieký nebo terapeutický režim, který nemá významnější toxicitu a který je účinný pro léčbu konkrétního jedince. Účinné množství pro konkrétní aplikaci se může lišit v závislosti na faktorech jako je léčené onemocnění, konkrétní podaná imunostimulační nukleová kyselina, antigen, velikost jedince nebo závažnost onemocnění nebo stavu. Odborník v oboru může empiricky určit účinné množství konkrétní imunostimulační nukleové kyseliny a/nebo antigenu a/nebo jiného terapeutického činidla bez nutnosti zbytečných pokusů.
Konkrctni dávky sloučenin μιυ ^íiniieni íičbu lukalín púááfti jsúli Ouvykle v luzmczí UU pFiuližllě 0,1 pg do přibližně 10 mg na aplikaci, podle toho, zda se aplikace provádí denně, jednou týdně nebo měsíčně nebo v jakémkoliv jiném intervalu. Častěji jsou slizníční nebo lokální dávky v rozmezí od přibližně 10 pg do 5 mg na podání, nejčastěji jsou v rozmezí od přibližně 100 pg do 1 mg, s 2 až 4 aplikacemi oddělenými dny nebo týdny. Ještě častěji jsou imunostimulační dávky v rozmezí ud 1 pg do 10 mg na aplikaci, nejčastěji od 10 pg do 1 mg, s denním nebo týdenním podáním. Dávky sloučenin pro parenterální podání za účelem indukce imunitní reakce specifické pro antigen, kdy jsou sloučeniny podány s antigenem, ale ne s jiným terapeutickým činidlem, jsou obvykle 5- až 1000 krát vyšší než účinné slizniění dávky pro imunostimulační aplikaci nebo pro použití jako adjuvans ve vakcíně, častěji jsou 10- až 1000-krát vyšší a nejčastěji jsou 20- až 100—krát vyšší. Dávky sloučenin uvedené pro parenterální podání za účelem indukce nespecifické imunitní reakce nebo pro zesílení ADCC nebo indukce imunitní reakce specifické pro antigen, když jsou imunostimulační nukleové kyseliny podány v kombinaci s jiným terapeutickým činidlem nebo ve specializovaných transportních prostředcích, jsou obvykle v rozmezí od přibližně 0,1 pg do 10 mg na aplikaci, podle toho, zdaje aplikace prováděna denně, týdně nebo měsíčně nebo v jiných intervalech. Častěji jsou parenterální dávky pro tyto účely v rozmezí od přibližně 10 pg do 5 mg na aplikací a lépe od přibližně 100 pg do 1 mg, s 2 až 4 aplikacemi v rozmezí dnů až týdnů. V některých provedeních mohou být použity parenterální dávky 5- až 1 OOOO-krát vyšší než typické zde popsané dávky.
Pro jakoukoliv zde popsanou sloučeninu může být terapeuticky účinné množství určeno nejprve na zvířecích modelech. Terapeuticky účinná dávka může být také určena zdát pro CpG oligonukleotidy získaných na člověku (byly zahájeny klinické pokusy na lidech) a získaných pro sloučeniny, které mají podobné farmakologické aktivity, jako jsou jiná slizniění adjuvans, například LT a jiné antigeny pro vakcinaci, pro slizniění nebo lokální podání. Vyšší dávky jsou nutné pro parenterální aplikaci. Aplikovaná dávka může být upravena podle relativní biologické dostupnosti a účinnosti podané sloučeniny. Úprava dávek pro dosažení maximální účinnosti podle způsobů popsaných výše a jiných způsobů dobře známých v oboru je v rozsahu schopnosti odborníků v oboru.
Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou podány ve farmaceuticky přijatelných roztocích, které mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné koncentrace solí, puťrovacích činidel, konzervačních činidel, kompatibilních nosičů, adjuvans a volitelně jiných terapeutických činidel.
Pro použití v terapii může být účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny podáno jedin45 ci jakýmkoliv způsobem, který připraví nukleovou kyselinu na požadovaný povrch, například sliznici, nebo do systému. Podání farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu může být provedeno jakýmkoliv způsobem známým odborníkům v oboru. Výhodnými způsoby podání jsou orální, parenterální, intramuskulámí, intranasální, intratracheální, inhalační, oční, vaginální a rektální podání.
Pro orální podání mohou být sloučeniny (tj. imunostimulační nukleové kyseliny, antigeny nebo jiná terapeutická činidla) připraveny smísením aktivní sloučeniny s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými v oboru. Takové nosiče umožňují formulování sloučenin podle předkládaného vynálezu ve formě tablet, pilulek, dražé, kapslí, kapalin, gelů, sirupů, kaší, suspenzí a podobně, pro orální aplikaci léčenému jedinci. Farmaceutické prostředky pro orální použití
-83CZ 301488 B6 mohou být získány jako pevné přísady, případně pomocí rozemletí získané směsi, a zpracováním směsi granulí, po přidání vhodných pomocných činidel, za zisku tablet nebo dražé. Vhodnými přísadami jsou, například, plniva jako jsou sacharidy, jako je laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol; celulosové prostředky, jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rý žový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, karboxymethylcelulosa sodná, a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je to vhodné, mohou být přidána činidla podporující rozpadavost, jako je zesítený polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová, nebo její soli, jako je alginát sodný. Volitelně mohou být orální prostředky připraveny v solných roztocích nebo pufreeh pro neutralizaci vnitrních kyselých podmínek, nebo mohou být id podány bez nosičů.
Jádra dražé mohou být potažena vhodným potahem. Pro tento účel mohou být použity koncentrované roztoky sacharidů, které mohou volitelně obsahovat klovatiny, jako je arabská klovatina, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopol gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků, is a vhodná organická rozpouštědla a nebo směsi rozpouštědel. Do potahů pro tablety nebo dražé mohou být přidány barviva nebo pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci různých kombinací dávek aktivních sloučenin.
Mezi farmaceutické prostředky, které mohou být použity orálně, patří vytlačitelné kapsle vyrobe20 né z želatiny, stejně jako měkké, uzavřené kapsle vyrobené ze želatiny a změkčovacího činidla, jako je glycerol nebo sorbitol. Vytlačitelné kapsle mohou obsahovat aktivní činidla ve směsi s plnivy jako je laktosa, pojivý jako jsou škroby, a/nebo kluznými činidly jako je talek nebo magnesium-stearát, a volitelně se stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Dále mohou být přidána stabilizační činidla. Také mohou být použity mikrosféry připravené pro orální podání. Takové mikrosféry jsou dobře známé v oboru. Všechny prostředky pro orální podání by měly být v dávkách vhodných pro takové podání.
Pro bukal ní podání mohou být prostředky ve formě tablet nebo pastilek připravených běžným způsobem.
Pří inhalačním podání mohou být sloučeniny pro použití v předkládaném vynálezu výhodně podány ve formě aerosolového spreje z tlakovaného zásobníku nebo nebulizéru, s použitím vhod35 ného hnacího plynu, například dichlordifiuormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého a nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakovaného aerosolu může být dávková jednotka určena chlopní pro podání odměřitelného množství. Kapsle a patrony vyrobené například ze želatiny pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru mohou být připraveny takové, které obsahují směs sloučeniny a vhodné práškové báze, jako je laktosa nebo škrob.
Sloučeniny mohou být, když je žádoucí jejich systémové podání, připraveny ve formě vhodné pro parenterální podání injekcí, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infusí. Prostředky pro injekce mohou být prezentovány vc formě dávkové jednotky, například jako ampule nebo v multí-dávkovýeh zásobnících, s přidaným konzervačním činidlem. Prostředky mohou být ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v oleji nebo ve vodném vehikulu, a mohou obsahovat další pomocná činidla, jako jsou suspendaění, stabilizační a/nebo disperzní činidla.
Mezi farmaceutické prostředky pro parenterální podání patří vodné roztoky aktivních sloučenin vc formě rozpustné ve vodě. Dále mohou být připraveny suspenze aktivních sloučenin jako vhod50 né olejové injekční suspenze. Mezi vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula patří mastné oleje, jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát nebo triglyceridy, nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat substance, kterc zvyšují viskozitu suspenze, jako je karboxy methylcelulosa sodná, sorbitol nebo dextran. Volitelné může suspenze také obsahovat vhodná stabilizační činidla nebo činidla zvyšující rozpustnost sloučenin, což umožní přípravu vysoce koncentrovaných roztoků,
-84Alternativně mohou být aktivní sloučeniny ve formě prášku pro rekonstituci vhodným veh i kulem, například sterilní apyrogenní vodou, před použitím.
Sloučeniny mohou být také ve formě rektálních nebo vaginálních prostředků, jako jsou čípky nebo retenční nálevy, například obsahujících vhodné čípkové báze, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy,
Kromě prostředků popsaných výše mohou být sloučeniny připraveny také ve formě depotních
Λ T..I.ji___i___i,.Lx _ _L.'„________i____u.'.i „r:____________ -- . i. _ j___' μι υ.ΊΙΙ <UI\U. IclMJVV UlUUllUUUUt pusvuivi (JiUSllCUlVy II1U1IUU UVL pilplttvcnv /.a puu/Jii viiuuiiyvn polymemích nebo hydrofobních materiálů (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo vhodných iontoměničových pryskyřic, nebo jako špatně rozpustné deriváty, například jako špatně rozpustné soli.
Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat vhodné pevné nebo gelové nosiče nebo přísady, Příklady takových nosičů nebo přísad jsou uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé sacharidy, škroby, deriváty celulosy, želatina a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.
Vhodné kapalné nebo pevné farmaceutické prostředky jsou například vodné nebo salinické rozto20 ky pro inhalaci, mikroenkapsulované, cnkochleované, potažené na mikroskopické částice zlata, obsažené v liposomech, nebulizované, aerosoly, pelety pro implantaci do kůže, nebo prostředky sušené na drsném objektu, ze kterého jsou seškrábnuty na kůži. Mezi farmaceutická prostředky patří také granule, prášky, tablety, potahované tablety, (míkro)kapsle, čípky, sirupy, emulze, suspenze, krémy, kapky nebo prostředky s prodlouženým uvolňováním aktivních sloučenin, ve kterých jsou přísady a aditiva a/nebo pomocná činidla, jako jsou činidla podporující rozpadavost, pojivá, potahovací činidla, bobtnavá činidla, kluzná činidla, chuťová korigens, sladidla nebo solubilizační činidla použita způsobem popsaným výše. Farmaceutické prostředky jsou vhodné pro použití v různých systémech pro aplikaci léků. Pro stručný přehled metod aplikace léků viz Langer, Science, 249; 1527-1533, 1990, což je zde uvedeno jako odkaz.
lmunostimulační nukleové kyseliny a volitelně jiná terapeutická činidla a/nebo antigeny mohou být aplikovány sami o sobě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Pri použití v medicíně by soli měly být farmaceuticky přijatelné, ale farmaceuticky nepřijatelné soli mohou být použity při přípravě farmaceuticky přijatelných solí. Mezi takové soli patří, například, soli připravené z následujících kyselin: kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, sírové, dusičné, fosforečné, maleinové, octové, salicylové, p-toluensulfonové, vinné, citrónové, methansulfonové, mravenčí, malonové, jantarové, naftalen-2- sulfonové a benzensulfonové. Také mohou být takové soli připraveny z alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako jsou sodné, draselné nebo vápenaté soli karboxylové skupiny.
Mezi vhodná pufrovací činidla patří: kyselina octová a její sůl (1 až 2 % hmotn./obj.); kyselina boritá a její sůí (0,5 až 2,5 % hmotn./obj.): kyselina citrónová a její sůl (1 až 3 % hmotn./obj.); a kyselina fosforečná a její sůl (0,8 až 2 % hmotn./obj.). Mezi vhodná konzervační činidla patří benzalkoniumchlorid (0,003 až 0.03 % hmotn./obj.); chlorbutanol (0,3 až 0,9 % hmotn./obj.);
parabeny (0,01 až 0,25 % hmotn./obj.) a thimerosal 0,004 až 0,02 % hmotn./obj.).
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny a volitelně antigeny a/nebo jiná terapeutická činidla volitelně obsažená ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Termín ..farmaceuticky přijatelný nosič“ označuje jeden nebo více kompatibilních pevných nebo kapalných plniv, ředidel nebo enkapsulačních substancí, které jsou vhodné pro podání člověku nebo jinému obratlovci. Termín „nosič“ označuje organickou nebo anorganickou přísadu, přirozenou nebo syntetickou, se kterou je aktivní složka smíšena za účelem usnadnění aplikace. Složky farmaceutického prostředku mohou být také smíšeny se sloučeninami podle předkládaného vynálezu a se sebou navzájem tak, že nedochází k interakci, která by nežádoucím způsobem narušila požadovanou farmaceutickou účinnost.
- 85 CZ 301488 B6
Imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány ve směsi s dalšími adjuvans, jinými terapeutickými činidly nebo antigeny. Směs se může skládat z několika dalších imunostimuiačních nukleových kyselin nebo několika antigenů nebo terapeutických s činidel.
Jsou možné různé způsoby podání. Konkrétní způsob podání bude záviset na vybraném adjuvans a antigenu, léčeném onemocnění a dávce nutné pro dosažení terapeutické účinnosti. Způsoby podle předkládaného vynálezu, obecně řečeno, mohou být prováděny za použití jakéhokoliv io způsobu podání, který je lékařsky přijatelný, což znamená za použití jakéhokoliv způsobu, kterým je možno dosáhnout účinné úrovně imunitní reakce bez toho, že by byly způsobeny klinicky nepřijatelné nežádoucí účinky. Výhodné způsoby podání jsou způsoby popsané výše.
Prostředky jsou výhodně ve formě dávkových jednotek a mohou být připraveny jakýmkoliv i? způsobem známým ve farmacii. Všechny způsoby zahrnují krok smísení sloučenin s nosičem, který je tvořen jednou nebo více pomocnými přísadami. Obecně jsou prostředky připraveny uniformním a důkladným promísenírn sloučenin s kapalným nosičem, jemně děleným pevným nosičem nebo oběmi, a potom, pokud je to nutné, formováním produktu. Kapalnými dávkovými jednotkami jsou fioly nebo ampule. Pevné dávkové jednotky jsou tablety, kapsle a čípky. Při léě20 bě pacientů je dávka v závislosti na aktivitě sloučeniny, způsobu podání, cíly imunizace (tj. profylaxi nebo terapii), charakteru a závažnosti onemocnění, věku a tělesné hmotnosti pacienta různá. Podání danc dávky může být provedeno jako jediné podání ve formě dávkové jednotky, nebo jako aplikace několika menších dávkových jednotek. Opakované podání dávek v určených intervalech týdnů nebo měsíců je obvyklé při dosycení reakcí specifických pro antigen.
Mezi další systémy pro aplikaci patří systémy s načasovaným uvolňováním, oddáleným uvolňováním nebo zpomaleným uvolňováním. Takové systémy umožňují redukci opakovaného podávání sloučenin, což zvyšuje snadnost aplikace pro lékaře i pacienta. V oboru je známo mnoho systémů pro takové podání sloučenin. Mezi takové systémy patří systémy na bázi polymeru, jako jc .to poly(laktidglykolid), kopolyoxaláty, polykaprolaktony, polyesteramidy, polyortoestery, kyselina polyhydroxymáselná a polyanhydridy. Mikrokapsle / uvedených polymerů obsahujících léky jsou popsány například v patentu US 5 075 109. Mezi transportní systémy patří také nepolymerové systémy, jako jsou: lipidy včetně sterolů, jako je cholesterol, estery cholesterolu a mastné kyseliny nebo neutrální tuky, jako jsou mono-, di- a triglyceridy; hydrogelové systémy; sylastic35 ké systémy; peptidové systémy; voskové potahy; lisované tablety využívající běžná pojivá a přísady; částečně fúzované implantáty a podobně. Mezi specifické příklady patří: (a) erozní systémy, ve kterých je činidlo podle předkládaného vynálezu obsaženo v matrici, jako je matrice popsané v patentech US 4 452 775, US 4 675 189 a US 5 736 152; a (b) difusní systémy, ve kterých je aktivní složka vymývána řízenou rychlostí z polymeru, jak je popsáno v patentech US o 3 854 480, US 5 133 974 a US 5 407 686. Také mohou být použity pumpy, které jsou určeny pro implantaci.
Předkládaný vynález je dále ilustrován v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Celý obsah všech citací (včetně literárních citací, udělených patentů,
4? publikovaných patentových přihlášek a projednávaných patentových přihlášek) je zde uveden jako odkaz.
Příklady provedeni vynálezu
Materiály a metody:
Oligonukleotidy (ODN); Přirozené fosfodiesterové a fosforothioatem-modifikované ODN byly zakoupeny od Operon Technologies (Alameda, CA) a Hybridon Specialty Products (Milford,
MA). ODN byly testovány na endotoxin za použití LAL testu (UAL-assay BioWhittaker,
-86'-C. «/V-nW UV
Walkersville, MD; dolní limit detekce 0,1 EU/ml). Pro testy in vitro se ODN naředily v TE-pufni (10 mM Tris, pH 7, 0,1 mM EDTA) a skladovaly se při -20 °C. Pro použití in vivo se ODN naředily ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (0,1 M PBS, pH 7,3) uskladnily se při 4 °C. Všechna ředění byla provedena za použití apyrogenníeh činidel.
Izolace lidských PBMC a buněčná kultura: Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků pomocí Ficoll-Paque odstředění s gradientem hustoty (Histopaque-1077. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) způsobem popsaným drive (Hartmann et al., 1999 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96:9305-10). Buňky se suspendovaly
.. n m 41 i z 4 a i .. i j.’ . . * . r i *. j . i . * ' i on / z i * t » * \ , i - t,* < z r < am ii\
V IxriVIJ IU4U KUlUVaCNIUl iUCUJU uupilicucili 1U70 (UUJ./UUJJ LCpJCIIl UiaRLIVUVaiiym (JO t, i Jl)
FCS (HyClone, Logan, U F), 1,5 mM L-glutaminu, lOOU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (všechny od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletní médium). Buňky (konečná koncentrace 1 x 10ó buněk/ml) se kultivovaly v kompletním médiu v 5% CO2 humidifikovaném inkubátoru při teplotě 37 °C. ODN a LPS (ze Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis. MO) nebo anti-IgM se použily jako stimuly. Pro měření lyrické aktivity lidských NK se PBMC inkubovaly při 5 x I06/jamku ve 24-jamkovýeh plotnách. Kultury se odebíraly po 24 hodinách a buňky se použily jako standardy v 4 hodinovém testu uvolňování ?1Cr proti K562 buňkám, jak bylo popsáno dříve (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Pro test proliferace B-lymfocytů se 1 pCÍ 3II thymidinu přidal na dobu 18 hodin před odběrem a množství inkorporovaného 3H thymidinu se určilo scintilaci v den 5. Standardních odchylky ve 3 jamkách bvlv < 5%.
Průtoková cytometrie na lidských PBMC: Povrchové antigeny na primátích PBMC se barvily způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920928), Mono25 klonální protilátky k CD3 (UCHT1), CDI4 (MSE2), CD19 (B43). CD56 (Rl 59), CD69 (FNSO) a CD86 (2331 [FIJN-1 ]) se zakoupily od Pharminogen, San Diego, CA, IgGtx a IgG2bl< (Hartrnann et af., 1999 Proč. Nati. Acad. Sci USA 96:9305-10) se použily jako kontroly pro nespecifické barvení. NK buňky se identifikovaly podle exprese CD56 na CD3, CD14 a CD19 negativních buňkách, zatímco B-lymfocyty se identifikovaly podle exprese CD 19. Data z průtokové cytometrie pro 10000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Životaschopnost buněk v FSC/SSC vstupu použitém pro analýzu se stanovila pomoct barvení propidium jodidem (2 pg/ml) a zjistilo se, že je vyšší než 98 %. Data byla analyzována za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, lne., Stanford, CA).
Výsledky:
Příklad I: CpG dependentní stimulace lidských B-lymfocytů závisí na methylaci a délce ODN.
Lidské PBMC se získaly od normálních dárců a kultivovaly se po dobu 5 dnů při koncentraci 2xl05 buněk/jamku s uvedenými koncentracemi uvedených ODN sekvencí. Jak je uvedeno v tabulce F, lidské PBMC proliferují více než je základní proliferace, když jsou kultivovány s různými CpG ODN, ale také vykazují určitou proliferaci, když jsou kultivovány s ODN, které neobsahují jakýkoliv CpG motiv. Význam nemethyíovaných CpG motivů pro dosažení optimální imunostimulaee s těmito ODN je demonstrován skutečností, že ODN 1840 (SEQ ID NO: 83) indukuje 56603 pulsů inkorporace 3H-thymidinu, zatímco stejný ODN bohatý' na T s methylovanými CpG motivy (non-CpG), 1979 (SEQ ID NO; 222) indukuje nižší, ale stále ještě zvýšenou, aktivitu (pouze 18618 pulsů) při stejné koncentraci 0,6gg/ml. Snížená proliferace při vyš50 ších koncentracích ODN může byl artefaktem toho, že buňky jsou za těchto pokusných podmínek vyčerpány, nebo může odrážet určitou toxicitu vyšších koncentrací ODN, Zajímavé je, že kratší ODN obsahující CpG motivy, jako jsou 13-14-merové 2015 a 2016, jsou méně stimulační i přes skutečnost, že jejich molámí koncentrace může být ve skutečnosti vyšší, protože jsou ODN přidávány spíše podle hmotnosti než podle molarity. Toto prokazuje, že délka ODN může být
-87CZ 301488 H6 také významnou determinantou imunitních účinků ODN. Non-CpG ODN, ale slabě bohatý na T (přibližně 30%), 1982 {SEQ ÍD NO: 25), způsobuje pouze slabé zvýšení bazální proliferace.
Tabulka F
Koncentrace oligonukleotidu
ODN 0,15 Mg/ml 0,6 Bg/ml 2 pg/ml
Pouze základ 648 837 799
1840 (SEQ ID NO: 83) 5744 56603 31787
2016 (SEQ ID NO: 256) 768 4607 20497
1979 (SEQ ID NO: 222) 971 18618 29246
1892 (SEQ ID NO: 135) 787 10078 22850
2010 (SEQ ID NO: 250) 849 20741 8054
2012 (SEQ ID NO: 252) 2586 62955 52462
2013 (SEQ ID NO: 253) 1043 47960 47231
2014 (SEQ ID NO: 254) 2700 50708 46625
2015 (SEQ ID NO: 255) 105 9 23239 36119
Čísla udávají cpm inkorporace Ή thymidinu pro kultury lidských PBMC získané způsobem uvedeným výše.
Příklad 2: Aktivace aktivity lidských NK buněk závislá na koncentraci ODN bohatých na thymidin
Lidské PBMC se kultivovaly po dobu 24 hodin s panelem různých CpG nebo non-CpG ODN ve dvou různých koncentracích a potom se testovaly na jejich schopnost zabíjet NK cílové buňky, jak bylo popsáno výše (Ballas et al., 1996, J. Immunol. 157: 1840-1845). Zabíjení se měří v lytických jednotkách neboli v L.IJ. Lidský dárce použitý v tomto pokusu měl základní pozadí 3,69 LIJ, které se zvýšilo na 180,36 LU při použití pozitivní kontroly, IL -2. CpG oligonukleotid 2006 (SEQ ID NO: 246) indukoval vysokou úroveň NK lytické funkce při nízké koncentraci 0,6, a nižší úroveň při koncentraci 6,0. Překvapivě si ODN bohaté na T. ve kterých byly CpG motivy 2006 methvlované (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) nebo invertované na GpC (ODN 2137 (SEQ ID NO: 886)) zachovávaly silné imunostimulační účinky pří vysokých koncentracích ODN, jak je uvedeno v tabulce G. Tyto imunostimulační účinky závislé na koncentraci nejsou
-88«JV1-TW uu obecnou vlastností fosforothioátové ho skeletu, protože pokusy popsané dále ukazují, že póly-A
ODN je nestimulační. Určitá stimulace se pozoruje pro 24 bází dlouhý ODN, ve kterém jsou pozice všech bází náhodné tak, že A, C, G a T se vyskytují s frekvencí 25 % pro každou pozici (ODN 2182 (SEQ ID NO: 42)). Nicméně, stimulační účinek takových 24-bazových ODN je značně zesílen tehdy, když se jednou o čistý' poly-T, protože v tomto případe je stimulace pozorována i při nejnižší koncentraci 0,6 gg/ml (ODN 2183 (SEQ ID NO: 433)). Skutečnost, že stimulační aktivita ODN SEQ ID NO: 433 při této nejnižší koncentraci je vyšší než u jakéhokoliv ODN testovaného v této nízké koncentraci, mimo optimální lidské imunostimulační ODN SEQ ID NO: 246. Skutečně, vyšší koncentrace ODN SEQ ID NO: 433 stimulují více NK aktivity než iu jakýkoliv fosforothioátový ODN s výjimkou siiného CpG ODN 2142 (SEQiDNO: 890), který má o něco vyšší imunostimulační účinek. Pokud se obsah G v ODN SEQ ID NO: 246 zvýší vzhledem k obsahu T přidáním více G, tak dojde úměrně ke snížení poměru T nukleotidů k snížení imunostimulačního účinku ODN (viz ODN 2132 (SEQ ÍD NO: 373)). Proto je obsah T v ODN významnou determinantou jeho imunostimulační aktivity. Ačkoliv je poly-T ODN nejvíce i5 imunostimulační z non-CpG ODN, jsou jiné báze také významné pro určení imunostimulačního účinku non-GpG ODN. ODN 2131 (SEQ ID NO: 372), ve kterém je o něco více než polovina bází T a který neobsahuje G, je imunostimulační v koncentraci 6 gg/ml, ale má menší aktivitu než jiné ODN bohaté na T. Když je 6 A v ODN 2131 (SEQ ID NO: 372) nahrazeno 6 G, tak může být zvýšen imunostimulační efekt ODN (viz ODN 2130 (SEQ ID NO: 371)).
-89CZ 301488 B6
Tabulka G
Lidské PBL kultivované přes noc s oligonukleotidy
MR 3605
SR 256
%SR 7.11
efekt or 0.63 1.25 2.50 5.00 10.00 20.00
> kontrola [RM] L.U.
• samotná 2.65 5.45 10.15 17.65 29.92 39.98 3.69
*- lL2(Í00U/ml) 35.95 57.66 86.26 100.39 99.71 93.64 180.36
+ 1585 (0.6 3.75 6.10 12.14 23.70 36.06 43.98 5.48
ug/ml) - 1585 (6.0 ii g/m 1) 15.42 31.09 47.07 73.34 94.29 97.73 35.85
+ 2006 (0.6 ug/ml) 6.71 15.99 26.92 44.75 64.12 68.83 16.96
+ 2006 (6.0 ug/ml) 6.19 8.18 16.13 24.35 39.35 56,07 8.04
+ 2117(0.6 4.54 4.73 9.56 18.04 28.57 39.85 3.49
ug/ml) + 2117(6.0 ug/ml) 7.03 10.76 16.90 30.59 52.14 59.46 10.96
+ 2137(0.6 4.61 5.35 10.04 15.16 23.79 37.86 2.57
ug/ml) + 2137(6.0 ug/ml) 7.99 10.37 16.55 32.32 49.78 60.30 11.01
- 2178(0.6 ug/ml) 2.38 4.52 11.47 16,05 24.85 34.27 2.37
ΐ 2178(6.0 ug/ml) 4.21 5.03 11.16 16.39 28.22 36.45 2.94
+ 2182(0.6 ug/ml) 2.42 6.57 10.49 19.73 26.55 35.30 2.89
+ 2182(6.0 4.11 7.98 14.60 26.56 40.40 51.98 7.59
ugúnl)
+ 2183(0.6 ug/ml) 3.73 8.46 15.52 24.48 37.78 56.77 7.80
+ 2183(0,6 ug/ml) 8.86 12.89 23.08 41.49 66.26 75.85 1637
+ 2140(0,6 ug/ml) 3.78 5.27 12.30 20.79 35.75 45.62 5.40
+ 2140(6.0 “ty 6.56 13.24 2126 37.96 60.80 73.05 14.82
+ 2141 (0.6 ug/ml) 2,63 6.34 10.21 17.73 30.93 43.57 439
+ 2141 (6.0 ug/ml) 4.98 15.30 25.22 37.88 58.47 69.12 14.83
+ 2142(0.6 ug/ml) 3.18 3.66 6.99 14.62 19.68 32.52 1.56
+ 2142(6.0 ug/ml) 7.08 15.80 25.65 41.72 68.09 73-14 17.Π
+ 2143 (0.6 ug/ml) 4.12 6,90 10.77 22.96 35.78 42.94 5.19
+ 2143 (6.0 ug/ml) 3.16 8.40 12.38 21.69 34.80 54.21 6.64
+ 2159(6.0 ug/ml) 5.05 11.76 21.67 41.12 51.68 65.47 13.19
+ 2132 (6.0 ug/ml) 4.23 6.06 10.50 18.74 32.68 44.06 4.61
+ 2179 (6.0 ug/ml) 6.14 9.49 21.06 42.48 60.12 71.87 14.54
+ 2180(6.0 ug/ml) 2.37 8.57 15.44 29.66 4435 6131 9.47
+ 2133(6.0 ug/ml) 6.53 12.58 23.10 38.03 61.16 6836 14.62
+ 2134(6.0 ug/ml) 7,51 12.14 21.14 32.46 54.47 67.12 12.98
+ 2184(6.0 ug/ml) 5.22 9.19 17.54 30.76 45.35 63.55 10.42
+ 2185(6.0 ug/ml) 8.11 14.77 26.27 40.31 55.61 70.65 15.60
+ 2116(6.0 ug/ml) 5.58 10.54 16.77 37.82 59.80 6633 13.07
+ 2181 (6.0 ug/ml) 4.43 9.85 17.55 27.05 53.16 69.16 11.43
+ 2130(6.0 3.81 8.07 17.11 27.17 42.04 53.73 837
ug/ml)
-91 CZ 301488 B6
+ 2131 (6.0 ug/ml) 2.29 6.73 730 18.02 32.73 49.06 5.08
+ 2156(0.3 ug/ml) 2.50 5.26 8.20 15,95 26.64 33.07 231
+ 2156(1.0 ug/ml) 5.91 10.99 1731 26,97 50.64 63.78 10.84
+ 2157(0.3 ug/ml) 2.36 4.00 6.65 12.94 24.13 38.86 2.58
+ 2157(1.0 ug/ml) 3.72 9.55 17.15 34.55 52.27 6533 11.58
+ 2158(03 ug/ml) 1.25 2.36 6.90 1639 15.63 29.82 1.17
+ 2158(1.0 ug/ml) 4.73 7.26 11.07 15.55 30.80 43.71 4.16
+ 2118(0.6 ug/ml) 1.55 3.38 6.85 13.36 20.15 27.71 1.13
+ 2118(6.0 2.65 3.88 9.29 12.19 22.47 28.99 134
ug/ml)
Příklad 3: Indukce proliferace B-lymfocytů non-CpG ODN bohatými na T
Pro hodnocení schopnosti ODN bohatých na T aktivovat proliferaci B-lymfocytů se lidské PBMC barvily cytoplasmatickým barvivém CSFE, inkubovaly se po dobu 5 dnů s uvedenými ODN v koncentraci 0,15 nebo 0,3 gg/ml a potom se analyzovaly průtokovou cytometrií. Blymfocyty se identifikovaly podle markéru CD 19. CpG ODN 2006 byl silným induktorem proliferace B-lymfocytů a tento efekt byl redukován, když byly CpG motivy methy lo vány nebo inverio továny na GpC, jak je vidět na obr. 1 A, B, C, D v koncentraci ODN 0,3 gg/mL Složení bází ODN se zdá být významné pro imunostimulační efekty. Snížení obsahu T v ODN významně snižuje imunostimulační účinky, jak je tomu u ODN 2177 (SEQ ID NO: 427), kde je 6 zT přítomných v ODN 2137 (SEQ ID NO: 886) nahrazeno A, což vede ke značné redukci imunostimulačního účinku. Význam T pro imunostimulační účinky ODN je také vidět ve srovnání ODN 2116 (SEQ
ID NO: 357) a 2181 (SEQ ID NO; 431), ktcrc se liší na 3f konci ODN. ODN 2181, jehož 3' konec je poly-T, je více stimulační než ODN 2116, jehož 3' konec je poly-C, i přes skutečnost, že oba ODN mají 1 CG 1CG na 5' konci.
Příklad 4: Proliferace B-lymfocytů indukovaná TG oligonukleotidy
Stimulační účinky TG motivů jsou uvedeny na obr. 2. ODN 2137 má identické složení bází jako ODN 2006, ale CG motivy byly všechny invertovány na GC, za vzniku nukleové kyseliny neobsahující CG. ODN nicméně obsahuje 6 TG dinukleotidů. V ODN 2177 byly všechny TG dinukleotidy ODN 2137 změněny na AG. Ačkoliv obsahuje ODN 2177 pouze 6 adeninů, je v podstatě ncstimulační v koncentraci 0,2 pg/ml. Pro srovnání, ODN délky 24 bází, ve kterém je každá pozice náhodná (ODN 2182) indukuje >12% B-lymfocytů k proliferaci v koncentraci 0,2 gg/mk Tyto výsledky ukazují, že stimulační efekty ODN 237 jsou nejen efekty fosforothioátového skeletu, ale souvisejí s přítomností TG dinukleotidů.
Pro stanovení efektu různého počtu TG dinukleotidových motivů se srovnávaly ODN 2200 a ODN 2202. jak je uvedeno na obr. 2. Oba ODN obsahují 18 T a 6 G, ale v ODN 2200 jsou všechny G za sebou, takže obsahuje pouze jeden TG dinukleotid, zatímco v ODN 2202 jsou G rozděleny do GG dinukleotidů v celém ODN, takže ODN obsahuje tři TG. ODN 2202 je více imunostimulační než ODN 2200, což je v souladu s modelem, že alespoň tři TG motivy v ODN jsou nutné pro optimální stimulační aktivitu. Je pravděpodobné, že mohou být dosaženy ještě vyšší úrovně stimulace, když budou TG motivy optimalizovány způsobem podle předkládaného vynálezu.
i o
Příklad 5: Efekty TTG versus TTG motivů
Obr. 3 ukazuje výsledky pokusů provedených pro testování obsahu TG ve smyslu relativního množství T versus G a souvislosti se stimulačním účinkem na ODN. Obr. ukazuje, že ODN, ve kterém jsou všechny báze randomizované jako T nebo G (ODN 2188 (SEQ ID NO: 905)) není imunostimulační v koncentraci 0.2 pg/ml, podobně jako ODN, ve kterém byly všechny báze randomizované jako A nebo G (ODN 2189 (SEQ ID NO: 906)). Nicméně, při vyšší koncentraci 2 pg/ml byl randomizovaný T/G ODN 2188 významně více stimulační. Tato úroveň stimulace je stále nižší než úroveň dosažená sc zcela randomizovaným ODN (ODN 2182 (SEQ ID NO: 432)).
Nejvyšší stimulace při nízkých koncentracích se pozoruje u ODN, ve kterém je polovina bází T a druhá polovina je T nebo G (ODN 2190 SEQ ID NO: 907)). Protože je každá druhá báze jistě T, nemohou zde být žádné TG motivy. Data na obr. 3 ukazují, že zvyšující se obsah TG v ODN zvyšuje jejich imunostimulační aktivitu.
V jiných pokusech, jejichž výsledky zde nejsou zobrazeny, vykazoval ODN 2190 (SEQ ID NO. 907) stimulaci NK aktivity srovnatelnou s ODN 2188 (SEQ ID NO. 905) nebo ODN 2189 (SEQ ID NO. 906).
Příklady 6-8
Úvod:
Výše jsme prokázali, že póly T sekvence mohou zesilovat stimulaci B a NK buněk. Dále jsme zkoumali schopnost různých non-CpG ODN bohatých na T, stejně jako póly C ODN stimulovat lidské B-lymfocyty, NK buňky a monocyty.
Materiály a metody;
Oligonukleotídy: Fosforothioatem-mod i ft kované ODN se zakoupily od ARK Seientific GmbH (Darmstadt, Germany). Použité sekvence byly: 1982: 5'tccaggacttctctcaggtt-3' (SEQ ÍD NO: 225), 2006: 5-tcgtcgttttgtcgttttgtcgttb' (SEQ ID NO: 246), 2041: 5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3' (SEQ IDNO: 282), 2117: 5'-tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3' (SEQ IDNO: 358), 2137: 5'-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3' (SEQ IDNO: 886), 2183: 5'-ttttttttttttttttttttt'-3' (SEQ IDNO: 433),
2 1 94 : 5'-ttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ IDNO: 911), 2196: 5'-tttttttttttttttttt-3'(SEQ IDNO: 913),
5126: 5'-ggttcttttggtcettgtet-3' (SEQ IDNO: 1058), 5162: 5'-tttttttttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO: 1094), 5163: 5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3' (SEQ ID NO: 1095), 5168: 5'ceccceeeeceeceeeeecceeeeeeeeee-3' (SEQ IDNO: 1096) a 5169: 5'cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3' (SEQ ID NO: 1097). Většina ODN byla testována na obsah LPS za použití LAL testu (BioWhittaker, Belgium) (dolní limit detekce 0,1 EU/ml). Pro všechny testy byly ODN ředěny v TE pufru a skladovány při -20 °C. Všechna ředění byla provedena za použití apyrogenních činidel.
-93 CZ 301488 B6
Buněčné přípravky a buněčné kultury: Lidské PBMC byly izolovány z periferní krve zdravých dobrovolníků získaných v German Red Cross (Ratingen, Gennany), jak je popsáno v příkladu 1, ale veškerý materiál byl zakoupen od Life Technologies, Germany a byl testován na endotoxin.
Pro testy aktivace B lymfocytů, NK buněk a monocytů byly PBMC kultivovány v kompletním médiu v koncentraci 2x106 buněk/ml v 200 μΙ v 96-jamkových plotnách s oblým dnem, v zvlhčovaném inkubátoru při teplotě 37 °C. Různé ODN, LPS (Sigma) nebo IL—2 (R&D Systems, USA) byly použity jako stimuly. V uvedených časech byly buňky sklízeny pro průtokovou cytometrii.
Průtoková eytometrie: MAb použité pro barvení povrchových antigenů byly: CD3, CD 14, CD 19, io CD56, CD69, CD80 a CD86 (všechny od Pharmingen/Becton Dickinson, Germany). Pro monocyty byly Fc receptory blokovány za použití lidského IgG (Myltenyi, Germany), jak bylo popsáno dříve (Bauer, M et al., 1999 Immunology 97:699). Data z průtokové eytometrie pro alespoň
1000 buněk specifikované subpopulace (8 buněk, monocyty, NK buňky, NKT buňky nebo Tlymfocyty) byly získány na FACSalibur (Becton Dickinson). Data byla analyzována za použití programu CellQuest (Becton Dickinson).
Cytotoxicita zprostředkovaná NK buňkami: PBMC se kultivovaly přes noc s nebo bez 6 pg/ml ODN nebo 100 U/ml (L 2 při teplotě 37 °C, 5% CO2. Další ráno se K-562 cílové buňky značily fluorescentním barvivém, CFSE, jak bylo popsáno výše pro lidské B lymfocyty (Hartmann, G., a A. M. Krieg, 2000, J. Immunol. 164:944). PBMC se přidaly v různých poměrech (50:1, 25:1 a 12,5.1) k 2xlO5 cílových buněk a provedla se inkubace po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Buňky se odebraly a inkubovaly se s DNA-specifickým barvivém 7-AAD (Pharmingen) za účelem detekce apoptotických buněk. Výsledky byly měřeny průtokovou cytometrii.
EL1SA: PBMC (3x10ύ buněk/ml) se kultivovalo s uvedenými koncentracemi ODN nebo LPS po dobu 24 hodin (11.6. ΙΓ'Νγ a TNFa) nebo 8 hodin (ll-l β) ve 48-jamkových plotnách ve zvlhčované atmosféře při teplotě .37 °C. Supernatanty se odebraly a cytokiny se měřily za použití OPTeia ELIS A Kitů (Pharmingen) pro IL-6, IFNy a FNFtx, nebo za použití Eli-pair ELIS A testu (Hoelzel, Germany) pro ΙΕ—1 β, podle návodu výrobce.
to
Příklad 6: Aktivace B-lymfoeytů indukovaná ODN neobsahujícími CpG motivy
V pokusech popsaných výše v příkladu 3 jsme prokázaly, že ODN bohaté na T mohou aktivovat
T-lymfocyty. Rozšířily jsme tyto pokusy na použití dalších ODN a jiných buněk a činidel.
V první sadě pokusů jsme srovnávaly aktivační potenciál non-CpG ODN bohatých na T s velmi účinným CpG ODN 2006 (SEQ ID NO: 246). PBMC (2x10° buněk/ml) dárce krve (n=2) se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5162 (SEQ ID NO: 1094). Buňky se
4o inkubovaly po dobu 48 hodin při 37 °C způsobem popsaným výše a barvily se mAb pro CD 19 (markér B lymfocytů) a CD86 (markér aktivace B-lymfocytů, B7-2). Exprese byla měřena průtokovou cytometrii.
Za použití různých koncentrací ODN jsme ukázaly (obr. 4), že ODN bohaté na T bez CpG motivu mohou indukovat stimulaci lidských B-lymfocytů. ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058), který obsahuje pouze jednu poly-T sekvenci, ale více než 50% T. způsobuje vyšší aktivaci lidských B-lymfocytů. Ačkoliv má určitou podobnost se SEQ ID NO: 246 (například více než 80% obsah F/G), neobsahuje tento ODN žádný známý imunostimulační CpG motiv. Překvapivě, pro všechny testované ODN bohaté na T byl nejvyšší stimulační index získán pro koncentrace mezi 3 a 10 ml. Nejvyšší stimulační index z testovaných ODN měl CpG/T-bohatý ODN SEQJD NO: 246 v koncentraci 0,4 pg/ml. Zajímavé jc, že se aktivita při vyšších koncentracích snižovala.
Póly A, póly C a póly T sekvence se syntetizovaly a testovaly se na biologickou aktivitu, PBMC (2x10° buněk/ml) od jednoho reprezentativního dárce (n3) se stimulovaly způsobem popsaným
-94A-TtJVJ L4U výše za použití 0,4 pg/ml, l,0pg/ml nebo 10,0pg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID
NO: 246),2196 (SEQ ID NO: 913) (póly T, 18 bází), 2194 (SEQ ID NO: 911) (póly T, 27 bází),
5162 (SEQ ID NO: 1094) (polvT, 30 bází). 5163 (SEQ ID NO: 1095) (póly A. 30 bází), 5168 (SEQ ID NO: 1096) (póly C, 30 bází) a 5169 (SEQ ID NO: 1097) (póly CG, 30 bází). Exprese aktivačního markéru CD86 (B7-2) na CD 19-pozitivních B-Iymfbcytech byla měřena průtokovou eytometrií.
Obr. 5 demonstruje to, Že délka sekvence, alespoň pro póly T ODN, má významný vliv na její aktivitu. Póly T sekvence obsahující pouze 18 bází (SEQ ID NO; 913) byla méně stimulační než iii sekvence obsahující 27 bází (SEQ ID NO: 911) nebo sekvence obsahující 30 bází (SEQ iD
NO: 1094), s jasnou změnou stimulace; SEQ ID NO: 1094 > SEQ ID NO: 911 > SEQ ID
NO: 913. Póly A (SEQ ID NO: 1095) nebo póly CG (SEQ ID NO: 1097) sekvence, naopak, neindukovaly aktivaci lidských B-lymfocytů. Překvapivě bylo také zjištěno, že póly C sekvence (SEQ ID NO: 1096) mohou aktivovat lidské B-lymfoeyty, alespoň ve vyšších koncentracích (10 μ&'ηιΐ (Obr. 5).
Dva další ODN bohaté na T, konkrétně 1982 (SEQ ID NO: 225) a 2041 (SEQ ID NO: 282) neobsahující CpG motivy, byly testovány na jejich efekty na lidské B-lymfocyty. PBMC (n=2) byly inkubovány s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID
NO: 225) a 2041 (SEQ ID NO: 282), jak je popsáno výše. Aktivace B-lymfocytů (exprese aktivačního markéru CD86) se měřila průtokovou eytometrií.
Obr. 6 ukazuje, že non-CpG ODN bohaté na í jsou imunostimulační v koncentracích vyšších než 1 pg/ml. Inkorporace CpG motivu do 1982 zesiluje jeho imunostimulační aktivitu. Prodlou25 žení pomocí póly T sekvence nezesiluje imunostimulační aktivitu tohoto ODN, již bohatého na
T, ale místo toho mírně snižuje aktivační potenciál.
Přiklad 7: Imunostimulace non-CpG ODN se odráží v zesílení aktivace NK, eytotoxicity NK 30 a aktivace monocytů
NK buňky, stejně jako monocyty, se testovaly na jejich reakci na non-CpG ODN. PBMC (2x106 buněk/ml) se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN l'n-4): 2006 (SEQ ID NO: 246),
2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID 35 NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058). Po 24 hodinách kultivace při 37 °C se buňky sklízely a barvily se mAb na CD3 (markér pro T-lymfoeyty), CD56 (markér pro NK buňky) a CD69 (markér časné aktivace), jak je popsáno výše. Exprese CD69 na CD56-pozitivníeh NK buňkách se měřila průtokovou eytometrií.
Obr. 7 ukazuje, že pro póly Γ ODN mohou být pozorovány podobné efekty jako na obr. 5. Stimulace NK buněk, stejně jako B-lymfocytů, může být ovlivněna délkou ODN, ODN 2183 (SEQ ID NO: 433) (21 bází) indukoval aktivaci NK buněk, ale v menším rozsahu než delší ODN 2194 (SEQ ID NO: 911 (27 bází), jak se měřilo zesílenou expresí časného aktivačního markéru CD69 ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058) také aktivoval lidské NK buňky (obr. 7).
Předpokládá se, že protinádorová aktivita CpG ODN může být hodnocena podle schopnosti ODN zesilovat cytotoxicitu zprostředkovanou NK buňkami in vitro. ODN obsahující na 3 a 5 konci řetězce póly G měly nejvyšší indukci eytotoxicity (Ballas, Z, K., et al„ 1996, J, Immunol. 157: 1840). Pro testování vlivu non-CpG ODN bohatých na T na cytotoxicitu NK buněk jsme analy50 zovaly efekt ODN 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) na lýzu zprostředkovanou NK buňkami (obr. 8). Lýza K-562 cílových buněk zprostředkovaná NK buňkami se měřila po inkubaci PBMC přes noc s 6 gg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), SEQ ID NO: 911 (SEQ ID NO: 911) (póly T, 27 bází) a 5126 (SEQ ID NO; 1058), způsobem popsaným výše. SEQ ID NO: 1058 vykazovala malé zvýšení lýzy lidskými NK buňkami ve srovnání se stavem bez ODN.
-95 CZ 301488 Bó
SEQ ID NO: 911 a SEQ ID NO: 246 zesilovaly cytotoxicitu lidských NK buněk v ještě větší míře.
Dřívější práce prokázaly, že nejen NK buňky, ale také NKT buňky jsou mediátory cylotoxické ? reakce na nádorové buňky (14). Proto jsme se zaměřily na potenciální aktivaci lidských NKT buněk non-CpG ODN bohatými na T. PBMC od jednoho reprezentativního dárce (n 2) se inkubovaly s 6 μ^/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 913) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) po dobu 24 hodin způsobem popsaným výše. Aktivace NKT buněk byla měřena průtokovou cytoii) metrií po barvení buněk mAb pro CD3 (markér T-lymfocytů), CD56 (markér NK buněk) a CD69 (markér časné aktivace). Ukázaná je exprese CD69 na CD3 a CD56 dvojitě pozitivních buňkách (NKT buňkách).
Na obr. 9 je popsáno, že jak SEQ ID NO: 911, tak SEQ ID NO: 1058, stimulují NKT buňky.
Podobně jako pro NK buňky byla SEQ ID NO: 911 (póly T) aktivnější než sekvence SEQ ID NO: 1058. Dále, jak je popsáno pro B-lymfocyty a NK buňky, délka ODN měla určitý význam pro imunostimulační potenciál, kdy delší ODN měly větší účinky na NKT buňky. Podobné výsledky byly získány pro lidské T-lymfocyty.
Jiným typem buněk podílejících se na obraně proti infekcím jsou monoeyty. Tyto buňky uvolňují po aktivaci různé eytokiny a mohou vyzrávat na dendritické buňky (DC), což jsou profesionální buňky prezentující antigen (Roitt, I., J. Brostoff, and D. Male, 1998, Imunology, Mosby, London). Obr. 10 ukazuje aktivaci lidských monocytů po kultivaci PBMC s různými ODN. PBMC (2x106 buněk/ml) se inkubovaly s 6 pg/ml 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358),
2137 (SEQ ID NO: 886), 2178 (SEQ (D NO: 1096, 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID
NO; 911), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5163 (SEQ ID NO: 1095) přes noc při 37 °C, jak bylo popsáno výše. Buňky se odebraly a barvily se na CD14 (markér pro monoeyty) a CD87 (B7-1, markér aktivace). Exprese se měřila průtokovou cytometrií,
Jak bylo demonstrováno výše pro NK buňky a B-lymfocyty, sekvence bohaté na T (například SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 911) různé délky indukovaly stimulaci monocytů, ale měly různé úrovně aktivity, například SEQ ID NO: 433 > SEQ ID NO: 911. Póly A (SEQ ID NO: 1095), stejně jako póly C (SEQ ID NO: 1096 (2178)) sekvence, naopak, nezpůsobovaly aktivaci monocytů (jak je měřena podle zvýšení CD80 při koncentraci ODN 6 pg/ml).
Příklad 8: Indukce uvolňování cytokinů pomocí non-CpG ODN
Potom byla hodnocena schopnost různých ODN bohatých na T ovlivňovat uvolňování cytokinů.
PBMC (3x106 buněk/ml) se kultivovaly po dobu 24 hodin s nebo bez 6 pg/ml uvedených ODN nebo 1 pg/ml EPS jako pozitivní kontroly (n=2). Po inkubaci se supematanty odebraly a TNFa se měřil pomocí ELISA způsobem popsaným výše a výsledky jsou uvedeny na obr. 11. PBMC se kultivovaly s uvedenými ODN (1,0 μ^πιΙ). jakje uvedeno na obr. 11, a IL-6 se měřil v supematantech ELISA a výsledky jsou uvedeny na obr. 12.
Obr. 11 a 12 demonstrují, že non CpG ODN bohaté na T a CpG ODN bohaté na T mohou indukovat sekreci prozánčtlivých cytokinů TNFa a IL—6. Pro oba eytokiny bylo zjištěno, že ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058) byl ve většině testů stejně účinný jako ODN 2194 (SEQ ID NO: 911). Je známo, že CpG ODN ovlivňuje Thl/Th2 rovnováhu přednostně tím, že indukuje l h I eytokiny (Krieg, A. M. 1999, Biochemica et Biophysica Acta 93321:1). Pro testování toho, zda způsobuje ODN bohatý na T stejný posun k Th I cytokinům se měřila produkce iFNy v PBMC. V první sadě pokusů se prokázalo, že - jak je popsáno pro 1L6 a TNFa, ODN SEQ ID NO: 1058 a SEQ ID NO: 911 indukují uvolňování srovnatelných množství tohoto Thl cytokinů IFNy. Dále se zjistilo, že jiný prozánětlivý cytokin, ΙΕΝβ, se uvolňuje po kultivaci PBMC
-96VZ JUHM ESO s těmito dvěma ODN. Ačkoliv bylo množství těchto cytokinů indukované ODN bohatými na T bez CpG motivů menší než množství indukované CpG ODN SEQ ID NO: 246, byla tato množství výrazně vyšší než kontrola.
Příklady 9 až 11
Úvod io Vvnáiez popisuje optimální CpG motiv pro aktivaci imunitního systému u obratlovců jiných než jsou hlodavci. Bylo zjištěno, že fosfodiesterový oligonukleotid obsahující tento motiv silně stimuluje expresi CD86, CD40, CD54 a MHC1I, syntézu IL—6 a proliferaci primárních lidských B-!ymfocytů. Tyto efekty vyžadují intemalizaci oligonukleotidu a zrání v endosomu. Tento CpG motiv byl asociovaný s prodlouženou indukcí NFkB p50/p65 heterodimeru a proteinu 1 aktivuj íiš čího komplex transkripčního faktoru (AP-1), Aktivace transkrípčního faktoru CpG UDN předcházela kinasy (JNS) a p38, a aktivačního transkripčního faktoru 2 (ATF-2). Oproti CpG vedla signalizace přes receptor B-lymfocytů k aktivaci extracelulámí receptorové kinasy (ERK) a k fosforyíaei různých izoforem JNK.
Materiály a metody
Oligonukleotidy: Nemodifikované (fosfodiesterové. PE) a modifikované ODN rezistentní na nukleasu (fosforothioátové, PS) ODN byiy zakoupeny od Operon Technologies (Alameda, CA) a Hybridom Specialty Products (Milford, MA). Použité sekvence jsou uvedeny v tabulce
Η. E. coli DNA a DNA z telecího brzlíku byly zakoupeny od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Vzorky genomové DNA byly přečištěny extrakcí ťenoí-chloroform-isoamyl alkoholem (25/24/1) a srážením ethanolem. DNA byla přečištěna zendotoxinu opakovanou extrakcí tritonem x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a byla testována na endotoxin za použití LALtestu (LAL-test BioWhittaker, Walkerscille, MD; dolní limit detekce je 0,1 EU/ml) atestem na endotoxin s vysokou sensitivitou, který byl popsán dříve (dolní limit detekce 0,0014 EU/ml) (Hartmann G., and Krieg, A. M., 1999. CpG DNA and LPS induee distinct patterns of activation in human monocytes. Gene therapy 6: 893), Obsah endotoxinu ve vzorcích DNA byl menší než 0,0014 U/ml. E. coli a DNA z telecího thymu se zpracovaly na jednořetězcovou DNA před použitím pomocí varu po dobu 10 minut a potom ochlazením na ledu po dobu 5 minut. Vzorky
DNA se ředily v TE pufru za použití apyrogenních činidel.
Tabulka f I: Panel použitých oligonukleotidů1
Název (SEQ ID NO: )
Sekvence 5 -> 3
Start sekvence
PE 2079 (320) TCg A£G TTC CCC CCC CCC CC
Střední baze PE2I00(341)
PE 2082 (323)
Lidský CpG motiv PE2080(321)
TCG GCG TTC CCC CCC CCC CC TCG CCG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTC CCC CCC CCC CC
5 sousedící báze
tt i 3 sousedící baze PE 2105 (346) PE 2107 (348) PE 2104 (345) PE 2098 (339) PE 2099 (340) PE2083 (324)
První CpG deletovaný PE 2108 (349)
Druhý CpG deletovaný PE 2106 (347)
Metftylace PE 2095 (336) PE 2094 (335)
Non CpG kontrola
2080 PE 2078 (319)
PE 2101 (342)
PS forma 2080 Další CpG motivy Nejlepší PS Methylovaný 2006 PS 2116 (357) PE 2059 (300) PS 2006 (246) PS 2117 (358)
GCG TCG TTC CCC CCC CCC CC ACG TCG TTC CCC CCC CCC CC CCG TCG TTC CCC CCC CCC CC
TCG TCG CTC CCC CCC CCC CC TCG TCG GTC CCC CCC CCC CC TCG TCG ATC CCC CCC CCC CC
CTG TCG TTC CCC CCC CCC cc TCG TCA TTC CCC CCC CCC CC
TZG TZG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTC CCC CCC ZCC CC
TGC TGC TTC CCC CCC CCC CC
GGC CTT TTC CCC CCC CCC CC
TCG TCG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TZG TZG TTT TGT ZGT TTT GTZ GTT
PE, fosfodiester; PS, fosforothioát; tučně, změna bází; tučně Z, methylovaný cytidin; podtržené, CpG dinukleotidy.
s Příprava buněk a buněčná kultura: Lidské rnononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků pomocí Ficoll-Paque odstředění s gradientem hustoty (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St, Louis, MO) způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 291). Buňky se suspendovaly v RPMÍ 1640 kultivačním médiu doplněném 10% (obj./obj.) teplem inaktivovaným (56 °C, 1 h) FCS to (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM L-glutaminu, lOOU/ml penicilinu a 100pg/ml streptomycinu (všechny od Gibeo BRL, Grand Island, NY) (kompletní médium). Všechny sloučeniny byly testované na endotoxin. Životaschopnost se určovala před a po inkubaci s ODN pomocí hodnocení vylučování trypanové modři (běžná mikroskopie) nebo propidium jodidu (analýza průtokovou cytometrií). Ve všech pokusech bylo 96 až 99 % PBMC životaschopných. Buňky konečná koncentrace 1x10° buněk/ml) se kultivovaly v kompletním médiu v 5% CO2 v humidifíkovaném inkubátoru při teplotě 37 °C. Různé oligonukleotidy (viz tabulku L koncentrace uvedené v legendě k obrázku), LPS (ze Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co,, St. Louis, MO) nebo anti-IgM se použily jako stimuly. Chloroehin (5 pg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se použil pro blokování endosomální maturace/acidifikacc. V uvedených časech se buňky odebíraly
2u pro průtokovou cytometrií, jak je popsána dále.
-98LíU
Pro testy přenosu signálu se lidské primární B-lymfccyty izolovaly imunomagnetickým tříděním buněk za použití VAR10MACS techniky (Multenyi, Biotec, lne., Aubum, CA) podle návodu výrobce. Stručně, PBMC získané z ..buťťv coats zdravých dárců krve (Elmer L., DeGowin
Blood Center, University of lowa) se inkubovaly s protilátkou k CD 19 konjugovanou na mikro5 kořalky a nechaly se projít přes pozitivní selekční kolonu. Čistota B-lymfocytů byla vyšší než 95 %. Po stimulaci se připravily buněčně extrakty (westernové hybridizace) a jaderné extrakty EMSA) pro testování přenosu signálu.
Pro testy vazby CPG na proteiny se Ramos buňky (lidská B-lymfocytámí linie Burkittova lymfoίΰ mu, ATCC-CRL 1923 nebo CRL-1596; niierviroiogy 5: 319-334, i 975) kultivovaly v kompletním médiu. Nezpracované buňky se odebraly a připravil se extrakt cytosolových proteinů, který se analyzoval na přítomnost vazebných proteinů pro CpG oligonukleotidy pomocí EMSA a UVzesítění, jak jsou popsány dále.
is Průtoková cytomctric: Barvení povrchových antigenů se provedlo způsobem popsaným dříve (Hartmann et af, 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920). Monoklonální protilátky k HLA-DR se zakoupily od Immunotech, Marseille, France. Všechny ostatní protilátky se zakoupily od Pharmingen, San Diego, CA: mAb kCD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 [FUNlj). IgG i , (MOPC-21) a lgG2^K se použily jako kontroly pro specifické barvení. Intracelulámí cytokinové barvení pro IL-6 se provedlo způsobem popsaným dříve (Hartman G„ and Krieg, A. M., 1999. CpG DNA and LPS induee distinct patterns of activation in human monocytes. Gene therapy 6: 893). Stručně, PBMC (konečná koncentrace 1 x 10h buněk/ml) se inkubovaly za přítomnosti brefeldinu A (konečná koncentrace 1 pg/ml, Sigma Chemical Co.. St. Louis. MO). Po inkubaci se buňky odebraly a barvily se za použití EITC-značené mAb k CD19 (B43), PE25 značené krysí mAb proti lidskému IL-6 (MQ2-6A3, Pharmingen) a Fix a Perm Kitu (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Data z průtokové cytometrie pro 5000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beekton Dickinson lmmunocytometry Systems, San Jose, CA). Neživotaschopné buňky se vyloučily z analýzy barvením propidium jodidem (2 pg/ml). Data se analyzovala za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, lne., Stanford, CA).
Proliferační test: CSFE (5- a 6-karboxyfluorescein diacetátsukcinimidyl ester, M o leču 1 ar Probes, USA) je intracelulámí fluorescenční barvivo odvozené od fluoresceínu, které se dělí rovnoměrně mezi dceřiné buňky po dělení buněk. Barvení buněk CSFE umožňuje jak kvantifikaci, tak imunofenotypizaci (fykoerythrinem značené protilátky) proliferujících buněk ve směsi buněk. Stručně,
PBMC se promyly dvakrát v PBS, resuspendovalv se v PBS obsahujícím CFSE v konečné koncentrací 5 pM a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 10 minut. Buňky se promyly třikrát PBS a inkubovaly se po dobu 5 dnů jak je uvedeno v legendě k obrázku. Proliferující CD19pozitivní B-lymfocyty se identifikovaly podle snížení obsahu CFSE za použití průtokové cytometrie.
Příprava extraktů celých buněk, jaderných extraktů a extraktů cytosolových proteinů: Pro westernovou hybridizaci se připravily extrakty' celých buněk. Primární B-lymfocyty se ošetřily médiem, fosťodiesterovými oligonukleotidy 2080 (SEQ ID NO: 321) nebo 2078 (SEQ ID NO: 319) v koncentraci 30 pg/ml, nebo anti-IgM (10 pg/ml). Buňky se odebraly, promyly se dvakrát ledově chladným PBS obsahujícím 1 mM Na3VO4, resuspendovaly se v lyzačním pufru (150 mM NaCl, 10 mM TRIS, pH 7,4, 1% NP40, 50 mM NaF, 30 mg/ml leupeptinu, 50 mg/ml aprotininu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu, 50 pgml fenylmethylsulfonylehloridu (PMSF), inkubovaly se po dobu 15 minut na ledu a odstředily se při 14 000 rpm během 10 minut. Supematant se zmrazil při -80 °C. Pro přípravu jaderných extraktů se primární B-lymfocyty resuspendovaly v hypotonickém pufru (10 mM HEPES/KOH (pH 7.9), 10 mM KC1, 0.05% NP40, 1,5 mM MgCL, 0.5 mM dithiothreitolu (DTT), 0,5 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptidu, 50 mg/ml aprotininu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu). Po 15 minutách inkubace na ledu se suspenze odstředila při 1000 x g během 5 minut. Peletovaná jádra se resuspendovala v extrakčním pufru (20 mM HEPES (pH 7,9), 450 mM NaCl, 50 mM NaF, 20% glycerolu, 1 mM EDTA,
-99CZ 301488 B6 mM EGTA, 1 mM D IT, 1 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptinu, 50 mg/ml aprotoninu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu) a provedla se 1 hodinová inkubace na ledu. Jaderná suspenze se odstředila po dobu 10 minut při 16 000 g při teplete 4 °C. Supernatant se ochladil a uskladnil se při -80 °C. Cytosolové extrakty pro testy vazby CpG na proteiny se připravily z nestimulovaných š Ramos buněk, které se lyžovaly v hypotonickém pufru způsobem popsaným pro přípravu jaderného extraktu. Po odstředění se supematant odebral jako cytoplasmatieká frakce a uskladnil se při
-80 CC. Koncentrace proteinů se měřila za použití Bradťordova proteinového testu (Βίο-Rad, Hercules, CA) podle návodu výrobce.
io Westernová hybridizaee: Stejné koncentrace extraktů celých buněk (25 pg/dráhu) se zahřívaly v SDS vzorkovém pufru (50 mM Tris-HCl, pH 6,8; 1% β-merkaptoethanolu; 2% SDS; 0,1% bromfenolové modři; 10% glycerolu) po dobu 4 minut před zpracováním elektroforesou na 10% polyakrylamidovém gelu obsahujícím 0,1% SDS (SDS-PAGE). Po elektroťorese se proteiny přenesly na lmmobilion-P přenosové membrány (Millipore Corp., Bedford, MA). Bloty se bloko15 vály 5% odtučněným sušeným mlékem. Použily se specifické protilátky proti fosforylované formě extracelulámí reeeptorové kinasy (ERK), c -jun NH2tennmální kinasy (JNK), p38 a aktivačnímu transkripěnímu faktoru 2 (ATF-2) (New England Biotabs, Beverly, MA). Bloty se vyvíjely v činidle se zesílenou chemiluminiscencí (ECL; Amersham International, Aylesbury, UK) podle návodu výrobce.
Test elektroforetické mobility (EMSA); Prod etekei DNA-vazebné aktivity aktivátorového proteinu 1 pro transkripční faktor (AP-1) a NFkB se jaderné extrakty (1 pg/dráhu) analyzovaly EMSA za použití dsODN 5GATCTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3(SEQ1D NO: 838) obsahujícího AP-1 vazebnou sekvenci, a NFkB URE z c-myc promotorového regionu
5TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3(SEQ ID NO: 1142) jak sond. DN se značily na konci T4-polynukleotid kinasou (New England Biolabs) a (γ-υΡ)ΑΤΡ (Amersham, Arlington, Heights, IL). Vazebné reakce se provedly s 1 pg extraktu jaderného proteinu v DNA-vazebném pufru (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40 mM MgCh, 20 mM EDTA, 1 mM dithiothreitolu, 8% glycerolu a 100—400 ng póly (dl-dC) s 20000 až 40000 cpm značeného ODN v 10 pl celkovém objemu. Specificita NFkB proužků se potvrdila kompetitivní testy s chladnými oligonukleotidy z nepříbuzných vazebných míst transkripčního faktoru (10 až 100 ng). Pro test superposunu se 2 pg specifických protilátek k c-rel, p50 a p65 (Santa Cruz Biotechnology, lne., Santa Cruz, CA) přidaly do reakční směsi na dobu 30 minut před přidáním radioaktivně značené sondy. Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se přidal zaváděcí pufr a sondy se elektroforezovaly na 6% polyakrylamidovém gelu v Tris-boritan-EDTA pracovním pufru (90 mM Tris, 90 mM kyselina boritá, 2 mM EDTA, pH 8,0), Gely se sušily a potom se zpracovaly autoradiografií.
UV-zesítění a denaturační proteinová elektroforesa
Jaderné extrakty se inkubovaly se značeným fosfodiesterovýin oligonukleotidem způsobem popsaným pro EMSA. Komplexy DNA- protein se zesítily UV světlem v Startalinker (Stratagene) během 10 minut. Sondy se smísily s SDS-vzorkovým pufrem, vařily se po dobu 10 minut a vnesly se na 7,5% SDS-PAGE. Gel se sušil na Whatmanově papíru a zpracoval se autoradio45 grafií. Graf vzdálenosti v závislosti na molekulové hmotnosti se použil jako standardní křivka, která se použila pro výpočet přibližně molekulové hmotnosti zesítěných komplexů protein-ODN. Molekulová hmotnost oligonukleotidu byla odečtena od této hodnoty za zisku velikosti.
Příklad 9: Identifikace optimálního CpG motivu pro použití samostatné nebo v kombinaci s ODN bohatým na Γ
Fosforothioátové oligonukleotidy obsahující myší CpG motiv GACGTT (SEQ ID NO; 1143) (například 1862 (SEQ ID NO; 69)) a použité v koncentracích, které jsou aktivní v myších B-100CZ 301488 B6 lymfocytech (Yi A. K., Chang M„ Peckham, D. W„ Krieg A. M., a Ashman R. F. 1998, CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosís and promote cell cycle entry., J. Immunol. 160: 5898), mají slabou nebo žádnou imunostimulační aktivitu na lidské imunitní buňky. Pri vyšších koncentracích měl tento ODN určitý stimulační vliv na lidské
B-lymfocyty.
V dřívějších pokusech s aktivací B-lymfocytů u myší se zjistilo, že CpG-dinukleotid obklopený dvěma 5puriny a dvěma .'/'pyrimidiny a výhodně ó-merovým motivem 5ACGTT3(SEQ ID NO: 1143) byl optimální pro aktivitu fosfodiesteroveho oligonukleotidu (Krieg. A. M., et aL ío 1995, Nature’374: 546, Ya A. K., Chang, M. et al., 1998, J. Immunol. 160: 5898)7
Pro identifikaci optimálního motivu pro stimulaci imunitní reakce u člověka a obratlovců jiných než hlodavců jsme navrhli sérii ODN a testovali jsme jejich aktivitu. Nejprve jsme navrhli 20 měrový fosfodiesterový oligonukleotid s TC dinukleotidem na 5konci před optimálním CpG motivem 5GACGTT3(SEQ ID NO: 1143) a potom následovala póly C koncovka (2079: 5”TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3(SEQ ID NO: 320)). Bylo zjištěno, že tento oligonukleotid, když je přidán k primárním B-lymfocytům za stejných podmínek jako jsou podmínky optimální pro E. coli DNA (opakované přidávání v 0 hodině, 4 hodině a 18 hodině; 30 pg/ml pro každý čas) stimuluje vyšší úroveň exprese CD86 na lidských primárních B-lymfocytech po dvou dnech. Pro stanovení vztahu struktura-funkce pro CpG motivy jsme nahradili báze sousedící s CpG dinukleotidy za zachování dvou CpG dinuklcotidů v sekvenci. Změna adeninu umístěného mezi dvěma CpG dinukleotidy na thymidin (2080 (SEQ ID NO: 321)) vedla k dosažení o něco vyšší aktivity. Nahrazení guanosinem (2100 (SEQ ID NO: 341)) nebo cytidinem (2082 (SEQ ID NO: 323)) v této pozici nemělo vliv ve srovnání s 2079 (SEQ ID NO: 320). Naopak, nahrazení thymidinu 3 k druhému CpG dinukleotidu puriny guanosinem (2099 (SEQ ID ΝΌ: 340)) nebo adeninem (2083 (SEQ ID NO: 324)) vedlo k významnému poklesu aktivity oligonukleotidu, zatímco nahrazení pyrimidinem cytidinem vedlo k pouze slabému snížení aktivity. Thymidin bezprostředně 5k prvnímu CpG dinukleotidu byl také významný. Nahrazení thymidinu jakoukoliv jinou bází (2105 SEQ ID NO: 346), guanosin; (2107 (SEQ ID NO: 348), adenin; 2104 (SEQ ID NO: 345). cytidin, vedlo k významnému snížení aktivity oligonukleotidu. Eliminace prvního (2108 (SEQ ID NO: 349)) nebo druhého (2106 (SEQ ID NO: 347)) CpG dinukleotidu také částečně redukovalo aktivitu.
Přidání více 5GTCGTT3(SEQ ID NO: 1144) CpG motivů k fosfodiesterovému oligonukleo35 tidu obsahujícímu 8-merový duplexní CpG motiv (5CGTCGTT3(SEQ ID NO: 1145), 2080 (SEQ ID NO: 321)) nezesilovalo dále expresi CD86 na B-lymfoeyteeh (2059 (SEQ ID NO: 300)). Oligonukleotid se stejnou sekvencí jako 2080 (SEQ ID NO: 321), ale s fosforothioátovým skeletem, nevykazoval vyšší než bazální aktivitu (2116 (SEQ ID NO: 357)). Toto bylo překvapivé, protože bylo popsáno, že fosforothioátový skelet značně stabilizuje oligonukleotidy a zesiluje ío stimulaci indukovanou CpG (Krieg, A. M., Yi, A. K., Matson, S., Waldsehmidt T, J., Bishop, G. A., Teasdale, R.., Koretzky, G. A., a Klinman, D. M., 1995, CpG motifs in baeterial DNA trigger direct B-cell activation. Nátuře 374: 546). Proto jsme provedly další strukturálně-funkční analýzu fosforothioátových oligonukleotidu obsahujících 5CTCGTT3 (SEQ ID NO: 1144) a 5TCGTCGTT3(SEQ ID NO; 1145) motivy, která ukázala, že další CpG motivy (2006 (SEQ
ID NO: 246)) zvyšují aktivitu fosforothioátových oligonukleotidu.
Přečištěné B-lymfocyty izolované z periferní krve imunomagnetickým tříděním buněk byly aktivovány CpG DNA ve stejném rozsahu jako nepřccištěné B-lymfocyty v PBMC. Proto je aktivace B-lymfocytů pri mámí reakcí a ne sekundárním efektem způsobeným eytokiny secemo50 vánými jinými buňkami.
Kromě kostimulační molekuly CD86 je funkční stav B-lymfocytů charakterizován dalšími povrchovými markéry. Například, aktivované T-helper lymfocyty stimulují B-lymfocyty lígací na CD40, vazba na jiné imunitní buňky je zprostředkována prostřednictvím intercelulámí adhesní
- 101 CZ 301488 B6 molekuly 1 (1CAM-1, CD54) a hlavní histokompatibilní komplex II (MHC 11) je odpovědný za prezentaci antigenu. Zjistili jsme, že exprese CD40, CD54 a MHC II na B-lymfocyteeh byla zesílena CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321). Non-CpG kontrolní oligonukleotid
2078 (SEQ ID NO: 319) nevykazoval žádnou aktivitu ve srovnání $ mediem samotným.
Když se PBMC inkubovaly po dobu 5 dnů za přítomnosti 2080 (SEQ ID NO: 321) (přidaného v 0 hodině, 4 hodinách a 18 hodinách a každé další ráno), tak bylo zjištěno, že v subpopulaci lymfocytů se zvyšuje velikost buněk (ECS) a že jsou tyto buňky jsou více granulami (SSC), Pro zjištění, zda reprezentuje tato subpopulace proliferující B-Iymfocyty, jsme barvily čerstvě izoloio vane PBMC CFSE (5- (a 6-) karboxyfluoreseeindiacetátsukeinimidylester) v den 0 a inkubovaly jsme je po dobu 5 dnů s 2080 (SEQ ID NO: 321) způsobem popsaným výše. CFSE je fluorescentní molekula, která se ireverzibilně váže na buněčné proteiny. Každé buněčné dělení snižuje barvení CFSE o 50%. Buňky barvené slabě CFSE (proliferující buňky) byly hlavně CD19 pozitivní B-lymťocyty. Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321) indukovat 60 až 70%CD19 pozitivních B-lymfocytů k proliferaci během 5 dnů. Kontrolní oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) indukoval méně než 5% B-lymfocytů k proliferaci, Proliferující B-lymfocyty (nízký CFSE) vykazovaly větší velikost buněk (ECS) a vyšší granularitu.
Proliferující B-lymfocyty exprimovaly vyšší koncentrace CD86 než neproliteruj ící buňky (není
2o uvedeno). V souladu s tímto zjištěním vedl oligonukleotidový panel testovaný výše pro indukci exprese CD86 k téměř identickému charakteru proliferace B-lymfocytů. Nahrazení 3 thyrnidínu snižovalo aktivitu více než změna thymidinu ve střední pozici.
2? Příklad 10: Aktivace B-lymfocytů vyžaduje endosomální maturaci/acidifíkaci
Již dříve bylo popsáno, že chlorochin, inhibitor endosomální acidiťíkace, blokuje CpG -zprostředkovanou stimulaci myších buněk prezentujících antigen a B-lymfocytů, bez ovlivnění efektů vyvolaných EPS (Hacker, H. et al., 1998, EMBG J. 17: 6230, Yi, A. K. et al., 1998, J. Immunol.
160: 4755, MacEarlane, D. E, and Manžel, L., 1998, J. Immunol. 160: 1122). Zjistili jsme, že adice 5 pg/ml chlorochinu zcela blokuje CpG DNA zprostředkovanou indukci exprese CD86 na primárních B-lymfocytech (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO: 246), 4,7 vs. 1,4; E. coli DNA, 3,4 vs. 1,4; pouze médium, 0,9; n- 4). Dále, chlorochin zcela inhiboval indukci proliferace Blymfocytů fosforothioátovým oligonukleotidem 2006 (SEQ ID NO: 246) měřenou testem CFSE (5 proliferace, stejně jako standardním testem. I yto výsledky naznačují, že stejně jako u myších buněk vyžaduje aktivace lidských B-lymfocytů CpG DNA vychytávání DNA v endosomech a následnou endosomální acidifikaei.
-40 Příklad 11: Analýza subcelulárních dějů probíhajících po stimulaci lidských B-lymfocytů optimálním lidským ODN
Protože je CpG motiv nutný pro maximální aktivaci B lymfocytů významně odlišný u myší (GACGTT) (SEQ ID NO: 1143) a člověka (TCGTCGTT) (SEQ ID NO: 1145), zajímalo nás, zda jsou základní signální děje srovnatelné. Rychlá indukce vazebné aktivity NFkB byla zjištěna u myších B-lymfocytů a makrofágů (Stacey, K. J. et al., 1996, J. immunol. 157: 2116, Yi A. K. et al., 1998, J. Immunol. 160: 4755). Pro testování toho, zda reaguje NEkB u člověka na CpG DNA, se lidské primární B-lymfocyty izolovaly z periferní krve pomocí imunomagnetického třídění buněk a inkubovaly se s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321), non-CpG kontrolko ním oligonukleotidem 2078 (SEQ ID NO: 319) nebo s médiem. V uvedených časech se buňky odebraly a připravily se jaderné extrakty. Za přítomnosti CpG oligonukleotidu se vazebná aktivita NFkB zvýšila během jedné hodiny a udržovala se po dobu 18 hodin (poslední testovaný ěas). Non CpG kontrolní oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 31) nevykazoval vyšší aktivitu NFkB ve
- 102 QZ 301488 B6 srovnání s buňkami inkubovanými pouze s médiem. NFkB proužek byl identifikován chladnou kompeticí a v testu superposunu se prokázalo, že se skládal z p50 a p65 podjednotek.
Transkripční faktor aktivační protein—1 (AP—1) se podílí na regulaci časných genů a exprese cytokinů (Karin M., 1995, The regulation of AP-t activity by mitogcn-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270: 16483). V myších B-lymfocytech je vazebná aktivita AP-1 indukována v reakci na CpG DNA (Yi, A. K., and Krieg, A. M., 1998, Rapid induction of mítogen activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J. Immunol. 161: 4493). Pro stanovení toho. zda může být tento transkripční faktor indukován také CpG DNA u člověka jsme testovaly io vazebnou aktivitu AP-1 na DNA v primárních lidských B-lymfocytech. Buňky se inkubovaly s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321) nebo s kontrolním oligonukleotidem 2078 (SEQ ID NO: 319). Připravily se jaderné extrakty a vazebná aktivita AP-1 se analyzovala EMSA. Vazebná aktivita AP-l se zesílila během jedné hodiny a byla zvýšená do 18 hodin (poslední testovaná doba), což ukazuje na dlouhotrvající reakci.
Protože je aktivita AP-1 indukována mnoha stimuly (Angel P., and Karin, M., 1991, The role ofJun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim. Biophys Acta 1072: 129), zajímaly jsme se o dráhy přenosu signálu před AP-1. Komplex AP-1 transkripčního faktoru integruje různé dráhy mitogenem aktivované protein kinasy (MAPK) (Karin, M., 1995. The regulation of AP-1 activity by mítogen activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270: 16483). Westernové hybridizace se provedly za použití extraktu celých buněk z primárních B-lymfocytů inkubovaných s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321), kontrolním 2078 (SEQ ID NO: 319) nebo pouze s médiem. Použily se specifické protilátky k fosforvlované formě JNK, p-38, ATF-2 a ERK. Silná indukce fosforylace JNK byla zjištěna 30 minut a 60 minut po expozici CpG-DNA, zatímco non-CpG oligonukleotid neměl žádnou aktivitu vyšší než základní. Protein kinasa p38, jiná stresem aktivovaná protein kinasa (SAPK), byla také fosforylovaná v reakci na CpG DNA během 60 minut. ATF-2, substrát jak p38, tak JNK (Gupta, Campbel, D., Derijadr, B., and Davis R. J., 1995, Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signa! transduction pathway. Science 267: 389) a složka AP-1 komplexu, jo vykazoval slabou fosforylaci po 30 minutách, která se zvýšila po 60 minutách. CpG DNA neindukovala žádnou významnou fosforylaci ERK. Naopak, anti IgM. stimulující receptor Blymfocytů, spouštěl fosforylaci ERK. Anti IgM aktivoval jiné izoformy JNK než CpG DNA.
Příklad 12: Test na adjuvantní aktivitu in vivo
Byl vyvinut in vitro skríningový test pro identifikaci ODN použitelného jako adjuvans invivo u člověka a jiných zvířat (ne hlodavců). Protože jsme pozorovali nejen kvantitativní, ale také kvalitativní odlišnosti v aktivitách různých CpG u myší, testovaly jsme nejprve panel CpG io a non-CpG kontrolních ODN na myších buňkách za účelem identifikace testů in vitro se spolehlivou a silnou korelací s adjuvantní aktivitou s povrchovým antigenem hepatitidy B (HBsAg).
Systematicky jsme testovaly panel více než 250 ODN v odpovídajících lidských testech za účelem identifikace sekvencí s imunostimulační aktivitou in vitro. Potom jsme testovaly, zda ODN s nejvyšší aktivitou v těchto testech na člověku také aktivuje pro li ferac i B-lymfocytů u šimpanzů a opic, a nakonec jsme testovaly, zdajsou aktivní jako adjuvans s HBsAg na šimpanzech a makakách in vivo. Tyto pokusy ukázaly, že sekvence, počet a mezery mezi jednotlivými CpG motivy přispívají k imunostimulační aktivitě CpG fosforothioátových ODN. ODN s TC dinukleotidem na 5”konci následovaným třemi 6-merovými CpG motivy (5GTCGTT3) separovanými TT dinukleotidy konsistentně vykazoval nejvyšší aktivitu pro lidské, šimpanzí a makaěí leukocyty.
U šimpanzů nebo opic vakcinovaných proti hepatitidč B s tímto CpG ODN adjuvans se vyvinul 15—krát vyšší titr anti-HBs protilátky než u jedinců vakcinovaných bez adjuvans.
- 103CZ 301488 B6
Materiály a metody
Oligodeoxynukleotidy: Fosforothioatem-mod i Ukované ODN se zakoupily od Operon Technolo> gies (Alameda, CA) a Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ODN se testovaly na endotoxin za použití LAL-testu (LAL-assay Bio Whittaker, Walkersville, MD; dolní limit detekce OJ EU/ml). Pro testy Ín vitro se ODN naředíly v TE-pufru (lOmM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA) a uskladnily se při -20 °C. Pro použití in vivo se ODN naředily ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (OJ M PBS, pH 7,3) a uskladnily se při 4 °C. Všechna ředění se provedla za io použití apyrogenních činidel.
Kultury buněk myší sleziny; Sleziny se odebraly od 6 až 12 týdnu starých samic BAEB/c (The Jackson Laboratory), 2 x IO6 splenocytů se kultivovalo s 0.2 μΜ ODN po dobu 4 hodin (rNFa) nebo 24 hodin (IL 6, lFN-γ, II-12), a cytokiny se detekovaly ELISA, jak bylo popsáno dříve i? (Yi A. K., Klinman D. M., Martin T. L., Matson S.. a Krieg A. M. 1996. Rapid immune activation by CpG motiťs in bacterial DNA. Systemic induction oťlL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J. Immunol 157:5394), Pro hodnoceni proliferace B-lymfocytů indukované CpG se od buněk sleziny odstranily T-lymfocyty pomocí anti-Thv-1.2 a komplementu a odstředěním přes lympholyte MR (Cedarlane Laboratories, Homby, ON, Canada), buňky io sc kultivovaly po dobu 44 hodin s uvedenými ODN a potom se pulsovaly po dobu 4 hodin 1 pCi 1 El thymidínu, jak bylo popsáno dříve (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. 1.,
Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A., a Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nátuře 374:546). Pro testování lytické aktivity NK buněk se z myších buněk sleziny depletovaly B-lymfocyty za použití magnetických korálků potažených kozím anti-myším Ig, jak bylo popsáno dříve (Ballas Z. K., a Rasmussen W., Í993, Lymphokine aetivated killer cells, VII. IL 4 induces an NK 1J CD8ap'TCR-αβ B2204 lymphokineactivated killer subset. J Immunol 150:17). Buňky se kultivovaly v koncentraci 5 x 106/jamku ve 24-jamkových plotnách a odebíraly se v 18 hodině pro použití jako eťektorové buňky ve standardním 4 hodinovém testu uvolňování ;1Cr proti YAC-1 cílovým buňkám. Jedna jednotka (LU) so byla definována jako počet buněk potřebných k dosažení 30% specifické lýzy.
Imunizace myší proti EIBsAg a hodnocení humorální reakce: Skupiny 6 až 8 týdnů starých samic BAEB/c myší (n = 5 nebo 10, Charles Rivcr, Montreal, QC) se imunizovaly proti IIBsAg způsobem popsaným dříve (Davis II. L., et ak, 1998, J. Immunol. 160:870). Stručně, každé myši se podala jediná i.m. injekce 50 μΙ PBS obsahujícího 1 μg rekombinantního HBsAg (Medix Biotech. Poster City, CA) a 10 μg CpG ODN nebo non-CpG ODN jako jediné adjuvans nebo v kombinaci s kamencem (Alhydrogel „85“, Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark; 25 ing ΑΙ' /mg HBsAg). Kontrolní myši se imunizovaly HBsAg bez adjuvans nebo s kamencem. Plasma se odebírala od myší v různé časy po imunizaci á Abs specifické k HBsAg (antí-HBs) se
4i) kvantifikovaly ELISA testem s konečným ředěním (v trojím provedení), jak bylo popsáno dříve (Davis Η. E et ak, 1998 J. Immunol 160:870). Konečné litry se definovaly jako nejvyšší ředění plasmy, které vedlo k hodnotě absorbance (OD450) dvakrát vyšší než ne imunní plasma s hraniční hodnotou 0,05.
Izolace primátích PBMC a kultivace buněk: Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků, šimpanzů nebo makaků pomocí odstředění s Ficoll-hypaque gradientem hustoty (Hístopaquc-1077, Sigma Chemical Co„ St. Louis, MO), jak bylo popsáno dříve (HartmannG., et ak, 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:291). Buňky se suspendovaly s RPMI 1640 kultivačním médiem doplněným 10% (obj./obj.) teplem so inaktivovaným (56 °C, I hodina) FCS (HyCIonc, Eogan, U I), 1,5 mM L-glutaminem, 100 U/ml penicilinem a 100 μ^/τηΐ streptomycinem (všechny od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletní médium). Buňky (konečná koncentrace 1 x IO6 buněk/ml) se kultivovaly v kompletním médiu a 5 % CO2 ve zvlhčovaném inkubátoru při teplotě 37 °C. ODN a LPS (ze Salmonella tvphimurium, Sigma Chemical Co„ St. Louis, MO) nebo anti- IgM se použily jako stimuly. Pro měření
- 104 CZ 301488 B6 lytícké aktivity lidských NK buněk se PBMC inkubovaly v koncentraci 5 x l06/jamku ve 24jamkových plotnách. Kultury se odebíraly po 24 hodinách a buňky se použily jako eťektorv ve standardním 4-hodinovém testu uvolňování S!Cr proti K562 cílovým buňkám, jak je popsáno dříve (Ballas Z. K.. Rasmussen W. L., a Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine a human celíš by CpG motifs in oligodeoxynucleotides a bacterial DNA. J. Immunol. 157:1840; Ballas Z. K., a Rasmussen W., 1993, Lymphokine-activated killer cells. VII. IL. -4 induces an NK 1. I CDSa p rCR αβΒ220 lymphokine-activated killer subset. J Immunol. 150:17). Pro proliferaci B-lymfocytů se 1 pCi *H thymidinu přidal 18 hodin před odběrem buněk a množství i n komorovaného Ή thymidinu se určilo sc int i lačním odečtem v den 5. Standardní odchylky pro io tři jamky byly < 5 %.
Průtoková cytometrie na primátích PBMC; Povrchové antigeny na primátích PBMC se barvily způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920928). Monoklonální protilátky k CD3 (UCHT1), CD14 (MSE2), CD19 (B43), CD56 (B159. CD69 (FNSO) is aCD86 (2331 [EUN-1]) se zakoupily od Pharmingen. San Diego. CA. IgGhK (MOPC-21) a lgG2b,K (Hartmann et al., 1999 Proč. Nati. Acad. Sci USA 96:9305-10) se použily jako kontroly pro nespecifické barvení. NK buňky se identifikovaly podle exprese CD56 na CD3, CD14 a CD 19 negativních buňkách, zatímco B-lymfocyty se identifikovaly podle exprese CD19. Data z průtokové cytometrie pro 10000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Životaschopnost buněk v FSC/SSC vstupu použitém pro analýzu se stanovila pomocí barvení propidium jodidem (2 pg/ml) a zjistilo se, že je vyšší než 98 %. Data byla analyzována za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, lne., Stan ford, CA).
Imunizace Šimpanzů a makaků proti HBsAg a hodnocení protilátkové odpovědi; 14 makaků (2,0 až 3,5 kg) se imunizovalo pediatrickou dávkou Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, BE) obsahující 10 pg HBsAg adsorbovaného na kamenec (25 mg Al /mg HBsAg). Tato dávka byla podána samostatně (n=5) nebo v kombinaci s CpG ODN 1968 (n=5, 500 pg) nebo CpG ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) (n=4, 150 pg). 4 šimpanzi (10 až 20 kg) byly imunizovaní stejným způsobem, kdy dvěma byla podána kontrolní vakcína (pouze Engerix B) a dvěma experimentální vakcína (Engerix-B plus 1 mg CpG ODN 2006). Všechny vakcíny byly podány i.m. do pravé paže v celkovém objemu 1 ml. pice se chovaly v boxech v Primáte Research Center (Bogor, Indonesia) a šimpanzi se chovali v Bioqual (Rockville, MD). Zvířata se denně sledovala specialistou. Nebyly zaznamenány žádné příznaky nemoci nebo lokální nežá35 doučí reakce v místě injekce. Plasma se získala IV punkcí před a v různou dobu po imunizaci a uskladnila se zmrazená ( 20 °C) do testování na protilátky. Anti-HBs protilátky se detekovaly za použití komerčního ELIS A kitu (Monolisa Anti-HBs; Sanofi Pasteur, Montreal, QC) a titry se vyjádřily v mlU/ml podle srovnání se standardy definovanými WHO (Monolisa anti-HBs Standards; Sanofi-Pasteur).
Výsledky
Identifikace CpG ODN s jinými profily imunomodulačních aktivit in vitro: Naše pokusy ukázaly, že konkrétní báze na 5 a 3 koncích CpG dinukleotidů v CpG motivu mohou mít vliv na úroveň imunostimulace syntetickým ODN, ale není jasné, zda mohou mít různé CpG motivy různý vliv na imunomodulační účinky. Pro hodnocení této možnosti jsme testovaly panel CpG ODN na jejich schopnost indukovat lytickou aktivitu NK buněk, proliferaci B-lymfocytů a stimulaci syntézy TNFa, IL-6, IFN-γ a IL—12 v myších buňkách sleziny. Imunostimulační aktivity ODN bez CpG motivů (ODN 1982 (SEQ ID NO: 225), ODN 1983 (SEQ ÍD NO: 226)) byly negativní nebo slabé ve srovnání s CpG ODN. ODN s neoptimálními CpG motivy (ODN 1628 (SEQ ID NO: 767), ODN 1758 (SEQ ID NO; 1)) byly méně aktivní než ODN obsahující CpG motivy obklopené dvěma 5' puriny a dvěma 3' pyrimidiny (ODN 1760 (SEQ ID NO: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO: 69), ODN 1841 (SEQ ID NO: 84)). ODN 1826 obsahující dva optimální myší CpG motivy (5f GACGTT 3') (SEQ ID NO: 1143) měl nejvyšší aktivitu v 5 ze 6 provedených měření.
- 105CZ 301488 B6
S výjimkou ODN 1628 vykazovaly všechny ODN podobný charakter aktivity (lýzy zprostředkované NK buňkami, proliferace B-lymfocytů, produkce 1L-12, II-6, TNFa a IFNy). Dále, ODN 1628. který byl v tomto panelu jedinečný v tom, že obsahoval dva regiony bohaté na G, vykazoval přednostní indukci syntézy IFN-γ, ale relativně slabou stimulaci jiných aktivit.
Identifikace in vitro testů, které korelují s adjuvantní aktivitou in vivo: Protože je adjuvantní aktivita in vivo konečným cílem, pokusili jsme se identifikovat testy in vitro, které by predikovaly adjuvantní aktivitu CpG ODN in vivo. Stejné ODN použité pro testy in vitro se proto testovaly na jejich adjuvantní aktivitu při imunizaci myší proti HBsAg. Toto bylo provedeno jak s ODN io samotný, tak s ODN v kombinaci s kamencem, protože dřívější pokusy ukázaly silnou synergii pro CpG ODN a kamencová adjuvans (PCT publikovaná patentová přihláška WO 98/40100).
BALB/c myši imunizované HBsAg bez adjuvans dosahovaly pouze nízkých titrů anti-HBs ve týdnu a toto nebylo ovlivněno přidáním kontrolního ODN. Naopak, adice CpG ODN zvýšila 15 titry anti-HBs 5 až 40 násobně, podle použité sekvence. Když se přidal kamenec, tak byly titry anti-HBs přibližně 6-krát vyšší než při použití HBsAg samotného. Konkrétně, kontrolní ODN neměl žádný vliv a různé CpG ODN zvyšovaly tyto titry 2- až 36-násobně. Výsledky získané s různými ODN samotnými korelují velmi silně (r 0.96) s výsledky získanými při použití ODN plus kamenec. Když se provedla lineární regresní analýza, tak bylo dosaženo velmi vysokého stupně korelace mezi některými testy in vitro a in vivo zvýšením titrů anti-HBs. Ze všech testovaných parametrů in vitro měla indukce lytické aktivity NK buněk nejlepší korelaci s adjuvantní aktivitou in vivo (bez kamence, r—0.98; s kamencem, r = 0,95; p <0,0001). Dobrá korelace s adjuvantní aktivitou byla také získána pro stimulaci B-lymfocytů (r—0.84 a 0,7), stejně jako pro sekreci TNF-α (r-0,9 a 0,88), II -12 (r~0.88 a 0,86) a IL-6 (r-0.85 a 0,91), Jediný test in vitro, který nekoreloval s adjuvantní aktivitou, byla sekrece IFN-γ (r=0,57 a 0,68). Tato data ukazují, že in vitro testy na lytickou aktivitu NK buněk, aktivaci B-lymfocytů a produkci TNFa, IL—6 a 11-12, poskytují hodnotnou informaci in vitro pro predikci adjuvantní aktivity daného ODN in vivo.
io Skríning panelu fosforothioátových ODN na aktivaci lidských NK buněk: V předchozích pokusech jsme zjistily, že syntéza zánětlivých cytokinů lidskými PBMC je indukována extrémně nízkými koncentracemi endotoxinu (indukovaná sekrece TNFa je detekovatelná již při 6 pg/ml endotoxinu, což je o 2 řády vyšší sensitivita než u myších imunitních buněk). Naopak, aktivace lidských B-lymfocytů a indukce lytické aktivity lidských NK buněk endotoxinem je vzácnou událostí i při vysoké koncentraci endotoxinu. Na základě těchto výsledků jsme vybrali aktivaci NK buněk (lytickou aktivitu a expresi CD69) a B-buněk (proliferaci a expresi CD86) jako nejvíce specifické a reprodukovatelné testy s nízkou variabilitou mezi subjekty a použili jsme tyto testy pro in vitro skríning souboru ODN.
4ii Nejprve jsme testovali vliv fosforolhioátovýeh ODN obsahujících různé kombinace a permutace CpG motivů na lýzu cílových buněk NK buňkami. Pro jednoznačnost a srozumitelnost prezentace jsou uvedena pouze data pro vybrané reprezentativní CpG a kontrolní ODN. Lidské PBMC se inkubovaly s různými fosforothioátovýmí ODN (6 gg/ml) po dobu 24 hodin a testovaly se na svou schopnost lyžovat MC - značené K562 buňky. ODN s dvěma 6-merovými CpG motivy •15 (buď 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 1143), nebo 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144) v kombinaci s FpC na 5' konci ODN (ODN 1840 5' TCCAFGTCGTTCCTGTCGTT 3'(SEQ ID NO: 83), ODN 1851 5' TCC TGA CGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 94) nebo s alespoň třemi 6merovými motivy bez TpC na 5' konci (ODN 2013 (SEQ ID NO: 253)) vykazovaly střední aktivitu. Vysoká aktivita byla zjištěna, když 5' TpC přímo předcházel 6- měrovému lidskému ςο CpG motivu (5' rCGTCGTT 3' (SEQ ID NO; 1145)) a následovaly dva 6-merové motivy (ODN 2005 (SEQ ID NO: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) a ODN 2007 (SEQ ID NO: 247)). Nej lepší výsledky byly získány tehdy, když byly 6-merové CpG motivy separovány od sebe navzájem a od 5' 8 -měrového TpT motivu (ODN 2006 (SEQ ID NO: 246)).
- 106 CZ 301488 B6
Exprese aktivačního markéru CD69 se rychle zvyšuje na povrchu NK buněk po stimulaci. Pro potvrzení výsledků z testu lýzy NK buňkami se PBMC inkubovaly po dobu 18 hodin s ODN (2 pg/ml). Exprese CD69 se hodnotila na CD56 pozitivních NK buňkách (CD3, CDU a CD19 negativní). Ačkoliv byla indukce CD69 méně omezená sekvencí než stimulace funkční aktivity
NK buněk, vykazovaly kontrolní ODN (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117, ODN 2010) pouze slabou aktivitu srovnatelnou se základní aktivitou. ODN s dvěma lidskými CpG motivy separovanými 5'TTTT 3' (DN 1965 (SEQ ID NO: 208)) nebo čtyřmi lidskými CpG motivy bez vmezeřené sekvence (ODN 2013 (SEQ ID NO: 253)) byly relativně více aktivní v indukci exprese CD69 než ve stimulaci lytické aktivity NK buněk. Optimální funkční aktivita NK buněk, stejně io jako exprese CD69, byla získána s ODN obsahujícím TpC dinukleotid předcházející lidskému CpG motivu, a další lidský motiv v sekvenci (ODN 2006, (SEQ ID NO: 246), ODN 2007 (SEQ
ID NO: 247)).
Aktivita fosforothioátových ODN ve stimulaci B-lymfocytů: V předchozích pokusech jsme is zjistili, že procento proliferujících B-Iymfoeytů (CFSE test, viz oddíl metody) koreluje s povrchovou expresí ko-stimulační CD86 na B-lymfocytech, jak je měřena průtokovou cytometrií.
Proto jsme použily expresi CD86 na B-lymťocytech pro skríning panelu ODN na jejich imunostimulační aktivity. PBMC se inkubovaly s 0,6 pg/ml ODN. Exprese CD86 (průměrná intenzita fluorescence, MFI) se hodnotila na CD19 pozitivních B-lymfocytech. Póly C ODN (ODN 2017 {SEQ ID NO: 257)) nebo ODN bez CpG dinukleotidů (ODN 1982 (SEQ ÍD NO: 225)) selhaly ve stimulaci lidských B-lymfocytů za těchto experimentálních podmínek. Fosforothioátový ODN (ODN 2116 (SEQ ID NO: 256)) sjedním optimálním lidským CpG motivem předcházejícím TpC (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145)) měl slabou aktivitu. Přítomnost jednoho lidského ó-merového CpG motivu (5'GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144)) neměla žádný aktivační efekt.
Dva z těchto CpG motivů uvnitř sekvence nevykazovaly žádnou (ODN 1960 (SEQ ID NO: 203), ODN 2016 (SEQ ID NO: 256)) nebo slabou (ODN 1965 (SEQ ID NO: 208)) aktivitu závislou na sekvenci. Když byl ODN složen z tri nebo čtyř kopií tohoto motivu (ODN 2012 (SEQ ID NO: 252), ODN 2013 (SEQ ID NO: 253), ODN 2014 (SEQ ID NO: 254)), tak mohla být detekována střední aktivita vzhledem k B-lymfocytům. Kombinace lidského 8-měrového CpG motivu na 5' konci ODN s dvěma 6-merovými CpG motivy (ODN 2005 (SEQ ID NO: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO: 247), ODN 2102 (SEQ ID NO: 343), ODN 2103 (SEQ ID NO: 344)) vedla k významnému zvýšení schopnosti ODN stimulovat B-lymfocyty, Vzdálenost mezi jednotlivými motivy byla zásadní. Separace CpG motivů TpT byla výhodná (ODN 2006 (SEQ ID NO: 246)) ve srovnání s neseparovanými CpG motivy (ODN 2005 (SEQ ID
NO:); též viz srovnání ODN 1965 (SEQ ID NO: 208) s ODN 1960 (SEQ ID NO; 203)). Lidský 6-merový CpG motiv (5' GTCGTT 3') byl lepší než optimální myší ó-merový CpG motiv (5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 246)), když byl kombinován s lidským 8-merovým CpG motivem na 5' konci (ODN 2006 vs. ODN 2102 (SEQ ID NO: 343) a ODN 2103 (SEQ ID NO: 344)). (TCG)pou ODN byl inaktivní nebo pouze slabě aktivní, stejně jako ODN obsahující CpG dinukleotidy obklopené guaniny nebo jinými CpG dinukleotidy (ODN 2010 (SEQ ID NO: 250)). Dohromady data pro NK buňky a B-lymfoeyty ukazují, že z testovaných ODN má ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) nejvyšší imunostimulační aktivitu pro lidské imunitní buňky.
Srovnávací analýza účinnosti CpG fosforothioátových ODN u různých primátů: Různé CpG motivy jsou optimální pro aktivaci myších a lidských imunitních buněk. Dále, počet a lokalizace CpG motivů v aktivním ťosforothioátovém ODN je odlišný u myší a u člověka. Chtěli jsme vědět, zda mají CpG fosforothioátové ODN podobnou aktivitu u různých druhů primátu. Srovnávali jsme panel CpG ODN na jejich schopnost indukovat proliferaci B-lymfocytů u člověka, šimpanzů a makaků rhesus a cynomolgus. Schopnost ODN stimulovat proliferaci lidských Βίο lymfocytů (tabulka J) dobře koreluje s jejich schopností indukovat expresi CD86 na B-lymfocytech. ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), který vykazoval nejvyšší aktivitu v lidských B-lymfocytech a NK buňkách, byl také nej aktivnější ve stimulaci prol iterace B-lymfocytů od šimpanzů a makaků rhesus (tabulka J). ODN 1968 (SEQ ID NO: 211) a ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) měly nejvyšší aktivaci B-lymfocytů cynomolgus opic in vitro (SI 25 a 29, v příslušném pořadí.
- 107 CZ 301488 B6 při 6 pg ODN/ml). Překvapivě, CpG ODN 2007 (SEQ ID NO: 247), který vykazoval podobně vysokou aktivitu jako optimální ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) na lidských buňkách, nestimuloval proliferaci B-lymfocytů šimpanzů a makaků rhesus, a ODN 1968 (SEQ ID NO: 211) vykazoval slabou aktivitu. CpG ODN původně identifikované podle vysoké aktivity u myší (ODN 1760 (SEQ ID NO; 3), ODN 1826 (SEQ ID NO: 69)), měly slabou aktivitu u opic (tabulka J).
Tabulka J; Proliferaění reakce PBMC na fosforothioátové CpG ODN u primátů.
člověk šimpanz makak rhesus
bez adice 0.5+-0.1 0.5+-0.1 0.5+-0.0
ODN 1760 (SEQ JD NO,: 3) 23+-7 0.3+-0.1 0.5+-0.3
ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69) 0.8+-0.1 0.4+-0.1 0.6+-0. í
ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) 35+-9 20.0+-3,8 1.9+-0.7
ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225) 9.7+-1.1 2.5+-1T 0.7+-0.1
ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) S8+-8 27.4+-8.9 6.3+-3.3
ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247) 47+-11 05+-0.1 0.4+-0.2
PBMC se připravily z periferní krve a inkubovaly sc s ODN (0,6 pg/ml), uvedeným způsobem, po dobu 5 dnů. Proliferaee se měřila podle vychytávání TI tliymidinu (epm/1000) během posledních 18 hodin. Více než 95 % proliferujících buněk byly B-lymfocyty, jak bylo určeno za použití CESE testu. Byly testováni čtyři lidští probandi, šest šimpanzů a dva makakové rhesus.
ln vivo adjuvantni aktivita CpG ODN u šimpanzu a opic cynomolgus. Pro hodnocení toho, zda mají CpG ODN se silnou stimulační aktivitou na primáti buňky in vitro detekovatelnou adjuvantní aktivitu in vivo se opice cynomolgus a šimpanzi imunizovaly Engerix B, která obsahuje HBsAg adsorbovaný na kamenec, samostatně nebo s přidáním ODN 1968 (500 pg) nebo ODN
2o 2006 (SEQ ID NO: 246) (1 mg), v příslušném pořadí. Ve srovnání s kontrolami, kterým nebyly podány CpG ODN byly anti-EÍBs titry ve 4-týdnu po první imunizaci a 2 týdny po dosycovací imunizaci 66- a 16-násobně vyšší, v příslušném pořadí, u opic, a 15- a 3—krát vyšší u šimpanzů (tabulka K). Tak byl pozorován jasný adjuvantni efekt CpG ODN a toto bylo výrazné hlavně po první imunizaci.
- 108 CZ 301488 B6
Tabulka K: Anti-HBs reakce u primátů imunizovaných proti HBsAg CpG ODN3
Druh primáta Anti-Hbs (mlU/ml) J
n CpG ODN 4 týdny po 1 imunizaci 2 týdny po dosyc. imunizaci
opice cynomolgus 5 žádný 15 ± 44 4880 ± 13113
5 ODN 1968 (500 pg) (SEQ ID NO: 211) 995 ± 1309 76449 ± 42094
Šimpanzi 2 žádný 6, 11 3712, 4706
2 ODN 2006 (1 mg) (SEQ ID NO: 246) 125, 135 9640, 16800
Zvířata byla imunizovaná i.m. injekcí Engerix B obsahující 10 pg HBsAg adsorbovaného na 5 kamenec, samostatně nebo s přidaným CpG ODN. Opice cynomolgus byly imunizovány dosycovací dávkou 10 týdnů po první dávce a šimpanzi byli imunizováni dosycovací dávkou 4 týdny po první dávce. Anti-HBs byly stanoveny ELISA testem; hodnoty pro opice jsou GMT ± SEM (n=5), zatímco pro šimpanze jsou uvedeny jednotlivé hodnoty pro dva jedince v každé skupině.

Claims (19)

1. Použití imunostimulaění nukleové kyseliny bohaté na Py, kde nukleovou kyselinou je nukleová kyselina bohatá na T, která je z více než 60 % tvořená T a obsahuje dinukleotid CpG, pro výrobu léčiva pro stimulaci imunitní reakce u jedince jiného než hlodavce.
20
2. Použití podle nároku 1. kde imunostimulaění nukleovou kyselinou bohatou na T je póly T nukleová kyselina zahrnující
5'TTTT35
25
3. Použití podle nároku 2, kde póly T nukleová kyselina zahrnuje
5'Χ,ΧιΤΤΤΤΧιΧ, 3ř, kde Xi, X2, Xi a X4 jsou nukleotidy.
4. Použití podle nároku 3, kde X]X2 je TT.
- 109CZ 301488 B6
5, Použití podle nároku 3, kde X,X.i je TT.
6, Použití podle nároku 3, kde X,X7 je vybrán ze skupiny zahrnující TA, TG, IC. AT, Λ A, S AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC.
7, Použití podle nároku 3, kde X-X, je vybrán ze skupiny zahrnující TA, TG, I C, AT, AA. AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG. GA a GC.
io
8. Použití podle nároku 1, kde imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T má nukleotidové složení takové, že více než 80 % nukleotidů je T.
9. Použití podle nároku 1, kde imunitní reakce je imunitní reakce specifická pro antigen.
15
10. Použití podle nároku 1, kde uvedené léčivo je pro léčbu nebo prevenci astmatu u jedince, trpícího nebo ohroženého astmatem,
11. Použití podle nároku 1, kde uvedené léčivo je pro léčbu nebo prevenci alergie u jedince, trpícího nebo ohroženého alergií.
12. Použití podle nároku 1, kde uvedené léčivo je pro léčbu nebo prevenci nádoru u jedince, trpícího nebo ohroženého nádorem.
13. Použití podle nároku 1, kde imunostimulační nukleová kyselina dále zahrnuje motiv TG.
14. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje imunostimulační oligonukleotid zahrnující sekvenci nukleové kyseliny TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO; 343).
so
15. Použití prostředku podle nároku 14 pro výrobu léčiva pro podávání jedinci jinému než hlodavci pro léčbu nebo prevenci alergie nebo astmatu.
16. Prostředek podle nároku 34, vyznačující se tím, že délka oligonukleotidu je ekvivalentní nebo menší než 100 nukleotidů,
17. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že oligonukleotid má nukleotidový skelet, který zahrnuje alespoň jednu fosforothioátovou modifikaci.
18. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím. že oligonukleotid má nukleo40 lidový skelet, který' zahrnuje fosforothioátové a fdsfodiesterové internukleotidové vazby.
19. Prostředek podle nároku 14, vyznačující sc tím, že oligonukleotid sestává ze sekvence nukleové kyseliny 1 CG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GΤT (SEQ ID NO: 343).
CZ20021050A 1999-09-25 2000-09-25 Použití imunostimulacních nukleových kyselin CZ301488B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15611399P 1999-09-25 1999-09-25
US15613599P 1999-09-27 1999-09-27
US22743600P 2000-08-23 2000-08-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20021050A3 CZ20021050A3 (cs) 2003-01-15
CZ301488B6 true CZ301488B6 (cs) 2010-03-24

Family

ID=27387805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021050A CZ301488B6 (cs) 1999-09-25 2000-09-25 Použití imunostimulacních nukleových kyselin

Country Status (32)

Country Link
US (3) US7271156B2 (cs)
EP (2) EP1221955B9 (cs)
JP (1) JP2003510282A (cs)
KR (1) KR100863630B1 (cs)
CN (3) CN1939541A (cs)
AP (2) AP1775A (cs)
AT (1) ATE304361T1 (cs)
AU (2) AU780979B2 (cs)
BG (1) BG65736B1 (cs)
BR (1) BR0014236A (cs)
CA (1) CA2388055A1 (cs)
CZ (1) CZ301488B6 (cs)
DE (1) DE60022665T2 (cs)
DK (1) DK1221955T3 (cs)
EE (1) EE200200158A (cs)
ES (1) ES2248126T3 (cs)
HK (1) HK1047697B (cs)
HR (1) HRP20020249A2 (cs)
HU (1) HUP0202639A2 (cs)
IL (1) IL148843A0 (cs)
MX (1) MXPA02003108A (cs)
NO (1) NO20021453L (cs)
NZ (1) NZ517929A (cs)
OA (1) OA12028A (cs)
PL (1) PL354997A1 (cs)
RS (1) RS50325B (cs)
RU (1) RU2245149C2 (cs)
SK (1) SK287400B6 (cs)
TR (2) TR200200797T2 (cs)
UA (1) UA77152C2 (cs)
WO (1) WO2001022972A2 (cs)
ZA (1) ZA200201963B (cs)

Families Citing this family (249)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7189834B2 (en) * 1993-05-11 2007-03-13 Marshall William E Oligoribonucleotides alert the immune system of animals to the imminence of microbial infection
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US7422902B1 (en) * 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1027033B1 (en) * 1997-05-14 2009-07-22 The University Of British Columbia High efficiency encapsulation of nucleic acids in lipid vesicles
NZ508650A (en) * 1998-05-14 2003-05-30 Coley Pharm Gmbh Regulating hematopoiesis using unmethylated C and G CpG-oligonucleotides with a phosphorothioate modification
PT1077722E (pt) * 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
EP2204186B1 (en) 1999-02-17 2016-04-06 CSL Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20050002958A1 (en) * 1999-06-29 2005-01-06 Smithkline Beecham Biologicals Sa Vaccines
DE60041335D1 (de) 1999-08-19 2009-02-26 Dynavax Tech Corp Methode zur modulierung eines immunantwortes mit immunstimulierenden sequencen und zusammensetzungen dafür
OA12028A (en) * 1999-09-25 2006-04-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ES2288883T3 (es) * 1999-12-13 2008-02-01 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotidos sinteticos utiles terapeuticamente.
AU2001227889A1 (en) * 2000-01-14 2001-07-24 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AU2001231245A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
WO2001062207A2 (en) 2000-02-23 2001-08-30 The Regents Of The University Of California Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
KR100863632B1 (ko) 2000-03-31 2008-10-15 퍼듀 리서치 파운데이션 리간드-면역원 접합체를 사용한 치료 방법
SK287689B6 (sk) 2000-06-08 2011-06-06 Intercell Ag Použitie molekuly oligodeoxynukleovej kyseliny na výrobu imunostimulačnej farmaceutickej kompozície a farmaceutický prípravok
US7767197B2 (en) 2000-06-22 2010-08-03 Endo Pharmaceuticals Colorado LLC Delivery vehicle composition and methods for delivering antigens and other drugs
ATE440618T1 (de) * 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
DK1366077T3 (da) 2000-09-15 2011-09-12 Coley Pharm Gmbh Fremgangsmåde til screening i store mængder af CpG-baserede immunoagonister/-antagonister
ATE398175T1 (de) * 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
KR100881923B1 (ko) 2000-12-27 2009-02-04 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용 방법
US20040132677A1 (en) * 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
JP4598389B2 (ja) * 2001-06-21 2010-12-15 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション キメラ免疫調節化合物とその使用方法
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
CA2451739A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Chiron Corporation Hcv e1e2 vaccine compositions
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
CA2456328C (en) 2001-08-07 2015-05-26 Dynavax Technologies Corporation Complexes of a short cpg-containing oligonucleotide bound to the surface of a solid phase microcarrier and methods for use thereof
AU2002361468A1 (en) * 2001-08-14 2003-03-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human S Method for rapid generation of mature dendritic cells
JP4383534B2 (ja) 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
AU2008200021A1 (en) * 2001-08-17 2008-01-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
JP2005501917A (ja) * 2001-09-07 2005-01-20 ザ トラスティーズ オブ ボストン ユニバーシティ 免疫複合体関連疾患を処置するための方法および組成物
ATE447967T1 (de) * 2001-09-14 2009-11-15 Cytos Biotechnology Ag Verpackung von immunstimulierendem cpg in virusähnlichen partikeln: herstellungsverfahren und verwendung
EP1434603B1 (en) * 2001-09-28 2009-12-16 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
WO2003030656A2 (en) 2001-10-06 2003-04-17 Merial Limited Methods and compositions for promoting growth and innate immunity in young animals
EP1478371A4 (en) * 2001-10-12 2007-11-07 Univ Iowa Res Found METHODS AND PRODUCTS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES USING IMIDAZOQUINOLINE COMPOUND
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
EP1441763A2 (en) * 2001-11-07 2004-08-04 Inex Pharmaceuticals Corp. Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
EP1467755A1 (en) 2001-12-21 2004-10-20 Antigenics Inc. Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
NZ573064A (en) 2002-04-04 2011-02-25 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
CN101160399A (zh) * 2002-04-22 2008-04-09 拜奥尼茨生命科学公司 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用
US20040009943A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Pathogen vaccines and methods for using the same
US20040013649A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Cancer vaccines and methods of using the same
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
KR100456681B1 (ko) * 2002-05-22 2004-11-10 주식회사 대웅 박테리아의 염색체 ｄｎａ 파쇄물과 비독성리포폴리사카라이드를 포함하는 면역강화 및 조절 조성물
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
JP4598519B2 (ja) * 2002-06-20 2010-12-15 サイトス バイオテクノロジー アーゲー アジュバントとして使用するためのパッケージ化されたウィルス様粒子：調製法及び使用法
CA2490449A1 (en) * 2002-06-25 2003-12-31 City Of Hope Adjuvant-free peptide vaccine
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
CN1678188B (zh) * 2002-07-03 2012-10-10 科勒制药集团有限公司 调节免疫反应的核酸成份
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
SG166673A1 (en) * 2002-08-19 2010-12-29 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory nucleic acids
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
EP2330194A3 (en) * 2002-09-13 2011-10-12 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US8263091B2 (en) 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
ZA200503511B (en) 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
CA2504493C (en) 2002-11-01 2015-12-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory cpg oligonucleotides
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
US7317142B2 (en) 2002-12-13 2008-01-08 Prodi Gene, Inc. Immunization of fish with plant-expressed recombinant proteins
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
WO2004058159A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
KR20120128729A (ko) 2002-12-23 2012-11-27 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역자극성 서열 올리고뉴클레오타이드 및 이의 이용방법
WO2004074454A2 (en) 2003-02-20 2004-09-02 University Of Connecticut Health Center Methods and compositions for the treatment of cancer and infectious disease using alpha (2) macroglobulin-antigenic molecule complexes
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
NZ542323A (en) * 2003-03-26 2008-07-31 Cytos Biotechnology Ag Melan-A peptide analogue-virus-like-particle conjugates
WO2004087203A2 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
PL1610850T3 (pl) * 2003-04-09 2012-11-30 Novartis Ag Urządzenie rozpylające z osłoną wlotu powietrza
US7790189B2 (en) * 2003-05-15 2010-09-07 Mitsui Sugar Co., Ltd. Immunostimulating agents
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
WO2005004907A1 (en) 2003-07-10 2005-01-20 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles
CN103446582A (zh) * 2003-08-11 2013-12-18 财团法人阪大微生物病研究会 包含诱导粘膜免疫的佐剂的新型疫苗
US20070104809A1 (en) 2003-08-22 2007-05-10 Danisco A/S Composition comprising a bacteriocin and an extract from a plant of the labiatae family
GB2388581A (en) 2003-08-22 2003-11-19 Danisco Coated aqueous beads
US8541002B2 (en) 2003-09-12 2013-09-24 Agenus Inc. Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection
US7615539B2 (en) * 2003-09-25 2009-11-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
JP2007509040A (ja) * 2003-10-11 2007-04-12 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 先天性免疫及び抗体依存性細胞傷害を強化するための方法及び組成物
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
US7713535B2 (en) * 2003-12-08 2010-05-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
DE10361502A1 (de) * 2003-12-23 2005-07-28 Phenion Gmbh & Co. Kg Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen enthaltend Superstruktur-bildende Nukleinsäure-Sequenzen
KR100558851B1 (ko) * 2004-01-08 2006-03-10 학교법인연세대학교 면역조절능력이 증가된 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드변형체
US7973016B2 (en) * 2004-01-23 2011-07-05 Joslin Diebetes Center Methods of treating, reducing, or preventing autoimmune conditions
CA2555390C (en) * 2004-02-19 2014-08-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
JP2007531746A (ja) * 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
EP1753453A2 (en) * 2004-06-08 2007-02-21 Coley Pharmaceutical GmbH Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7674456B2 (en) * 2004-06-14 2010-03-09 Charles Wiseman Breast cancer cell lines and uses thereof
NZ553244A (en) * 2004-07-18 2009-10-30 Csl Ltd Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
EP1776460B8 (de) * 2004-08-03 2014-02-26 Geneart Ag Verfahren zur modulation der genexpression durch änderung des cpg gehalts
PL1794174T3 (pl) 2004-09-01 2012-11-30 Dynavax Tech Corp Sposoby i kompozycje do hamowania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i autoodporności
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
EP1657307A1 (en) * 2004-11-16 2006-05-17 Immunotech S.A. Oligonucleotides that induce the secretion of GM-CSF
AU2006216493A1 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligonucleotides
JP5403457B2 (ja) * 2005-02-28 2014-01-29 株式会社明治 Ａｔオリゴヌクレオチドを有効成分とする免疫応答増強性薬剤及び食品組成物
US7718622B2 (en) * 2005-03-04 2010-05-18 Dynavax Technologies Corporation Compositions comprising structurally stable conjugate molecules
CA2599218C (en) 2005-03-18 2015-08-11 Cytos Biotechnology Ag Cat allergen conjugates and uses thereof
MX2007012488A (es) * 2005-04-08 2008-03-11 Coley Pharm Group Inc Metodos para el tratamiento de asma exacerbado por enfermedad infecciosa.
US8642577B2 (en) 2005-04-08 2014-02-04 Chimerix, Inc. Compounds, compositions and methods for the treatment of poxvirus infections
KR101364003B1 (ko) 2005-04-28 2014-02-21 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 활성화된 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐용기와 이의 제조방법 및, 키트와 키트의 사용방법
DE102005022290A1 (de) * 2005-05-13 2006-11-16 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Hexanukleotid-Wirkstoffe
CN1865275B (zh) * 2005-05-17 2011-06-15 长春华普生物技术有限公司 对人b细胞肿瘤有治疗作用的人工合成的单链脱氧核苷酸
US8148341B2 (en) 2005-07-01 2012-04-03 Index Pharmaceuticals Ab Method for modulating responsiveness to steroids
PL2380584T3 (pl) 2005-07-01 2014-03-31 Index Pharmaceuticals Ab Sposób do immunostymulacji
AU2006269555A1 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
EP1945766A2 (en) * 2005-09-16 2008-07-23 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
BRPI0616069A2 (pt) * 2005-09-16 2011-06-07 Coley Pharm Gmbh modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferente pequeno (sirna) através de modificação de nucleotìdeo
AU2006306805A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Index Pharmaceuticals Ab Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease
KR101399591B1 (ko) * 2005-11-02 2014-06-18 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 동시 화학요법 및 면역요법
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
JP2009514850A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル アジュバントとして減少した量の水中油型エマルションを有するインフルエンザワクチン
EP2368572B1 (en) 2005-11-04 2020-03-04 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ592713A (en) 2005-11-04 2012-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Adjuvanted influenza vaccines including a cytokine-inducing agents other than an agonist of Toll-Like Receptor 9
CN102864152B (zh) * 2005-11-07 2015-11-18 艾德拉药物股份有限公司 包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性
PT1957647E (pt) 2005-11-25 2015-06-01 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos imunoestimulantes
EP1973608A1 (en) 2005-12-14 2008-10-01 Cytos Biotechnology AG Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
KR20110110853A (ko) 2006-01-27 2011-10-07 노파르티스 파르마 아게 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신
CA2641026A1 (en) * 2006-02-01 2007-08-09 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
US8168164B2 (en) 2006-02-03 2012-05-01 Purdue Research Foundation Targeted conjugates and radiation
PT2405002E (pt) * 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composições e métodos para formulações de oligonucleotídeos
CN100418583C (zh) * 2006-02-21 2008-09-17 朱鸿飞 预防和治疗乳腺炎的药物组合物
US20100068223A1 (en) 2006-03-24 2010-03-18 Hanno Scheffczik Storage of Influenza Vaccines Without Refrigeration
US9107863B2 (en) 2006-03-27 2015-08-18 The Buck Institute For Age Reasearch Reagents and methods for cancer treatment and prevention
CA2647942A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Novartis Ag Combined mucosal and parenteral immunization against hiv
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
RU2464030C2 (ru) * 2006-05-26 2012-10-20 Регадо Байосайенсиз, Инк. Введение противосвертывающей системы reg1
EP2054431B1 (en) 2006-06-09 2011-08-31 Novartis AG Conformers of bacterial adhesins
DK2032592T3 (da) 2006-06-12 2013-09-02 Cytos Biotechnology Ag Fremgangsmåder til pakning af oligonukleotider til virus-lignende partikler af rna-bakteriofager
US20100129403A1 (en) 2006-06-20 2010-05-27 Transgene S.A. Recombinant viral vaccine
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
CA3016948A1 (en) 2006-09-11 2008-03-20 Seqirus UK Limited Making influenza virus vaccines without using eggs
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
PL2121011T3 (pl) 2006-12-06 2014-10-31 Novartis Ag Szczepionki zawierające antygeny czterech szczepów wirusa grypy
UA100370C2 (uk) 2006-12-11 2012-12-25 Мериал Лимитед Спосіб вакцинації птахів проти salmonella
EP2125854B1 (en) 2006-12-12 2016-10-26 Kuros Biosciences AG Oligonucleotides containing high concentrations of guanine monomers
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
EA201070066A1 (ru) 2007-06-27 2010-06-30 Новартис Аг Вакцины против гриппа с низким содержанием добавок
AU2008283802A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
AU2008317261B2 (en) 2007-10-26 2015-04-09 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
US8993542B2 (en) 2008-01-25 2015-03-31 Chimerix Inc. Methods of treating viral infections
EP2268309B1 (en) 2008-03-18 2015-01-21 Novartis AG Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens
MX2010012069A (es) 2008-05-08 2010-12-14 Merial Ltd Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena.
TWI351288B (en) * 2008-07-04 2011-11-01 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Cpg dna adjuvant in avian vaccines
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
CN102361985B (zh) * 2008-12-04 2017-06-20 库尔纳公司 通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
MX2011006088A (es) 2008-12-09 2011-06-21 Coley Pharm Group Inc Oligonucleotidos inmunoestimuladores.
EP2396408B1 (en) * 2009-02-12 2017-09-20 CuRNA, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
PT2396038E (pt) * 2009-02-12 2016-02-19 Curna Inc Tratamento das doenças associadas com o factor neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) por inibição do produto antisenso natural da transcrição para bdnf
JP2012519482A (ja) 2009-03-06 2012-08-30 ノバルティス アーゲー クラミジア抗原
CN103800906B (zh) 2009-03-25 2017-09-22 德克萨斯大学系统董事会 用于刺激哺乳动物对病原体的先天免疫抵抗力的组合物
AU2010232490B2 (en) 2009-04-03 2016-08-11 Agenus Inc. Methods for preparing and using multichaperone-antigen complexes
US8679505B2 (en) 2009-04-14 2014-03-25 Novartis Ag Compositions for immunising against Staphylococcus aureus
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
CN102596204B (zh) 2009-07-06 2016-11-23 波涛生命科学有限公司 新的核酸前药及其使用方法
MX2012000395A (es) 2009-07-07 2012-02-28 Novartis Ag Inmunogenos conservados de escherichia coli.
ES2918381T3 (es) 2009-07-15 2022-07-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de proteína F de VRS y métodos para producir las mismas
JP2012532626A (ja) 2009-07-16 2012-12-20 ノバルティス アーゲー 無毒化されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ免疫原
KR101801407B1 (ko) * 2009-07-24 2017-11-24 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (ｓｉｒｔ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 시르투인 관련된 질환의 치료
DK2480669T3 (en) 2009-09-25 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF FILAGGRIN- (FLG) RELATED DISEASES BY MODULATING FLG EXPRESSION AND ACTIVITY
GB0918392D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Novartis Ag Diagnostic and therapeutic methods
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
US9260517B2 (en) 2009-11-17 2016-02-16 Musc Foundation For Research Development Human monoclonal antibodies to human nucleolin
AU2010321586C1 (en) 2009-11-23 2016-07-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same
CA2781557C (en) 2009-11-23 2018-01-09 Bayer Cropscience N.V. Elite event ee-gm3 and methods and kits for identifying such event in biological samples
ES2707778T3 (es) 2009-12-30 2019-04-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Inmunógenos polisacáridos conjugados con proteínas portadoras de E. coli
US9006218B2 (en) 2010-02-12 2015-04-14 Chimerix Inc. Nucleoside phosphonate salts
AU2011248620B2 (en) 2010-04-26 2015-11-26 Chimerix, Inc. Methods of treating retroviral infections and related dosage regimes
EP2575773A4 (en) 2010-05-26 2014-06-25 Selecta Biosciences Inc SYNTHETIC NANOTRÄGERKOMBINATIONSIMPFSTOFFE
GB201009861D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Novartis Ag OMV vaccines
US8940310B2 (en) 2010-06-16 2015-01-27 Dynavax Technologies Corporation Methods of treatment using TLR7 and/or TLR9 inhibitors
US9771579B2 (en) * 2010-06-23 2017-09-26 Curna, Inc. Treatment of sodium channel, voltage-gated, alpha subunit (SCNA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SCNA
WO2012006378A1 (en) * 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Liposomes with lipids having an advantageous pka- value for rna delivery
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
EA201390660A1 (ru) 2010-11-05 2013-11-29 Селекта Байосайенсиз, Инк. Модифицированные никотиновые соединения и связанные способы
PT2667892T (pt) 2011-01-26 2019-06-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regime de imunização contra o vsr
WO2012142480A1 (en) * 2011-04-14 2012-10-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric rna oligonucleotides and uses thereof
JP2014519819A (ja) 2011-05-13 2014-08-21 ノバルティス アーゲー 融合前ｒｓｖｆ抗原
LT2710039T (lt) 2011-05-20 2019-04-25 Alderbio Holdings Llc Anti-cgrp kompozicijos ir jų panaudojimas
CA2836800A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Alderbio Holdings Llc Use of anti-cgrp antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
EP2709662B1 (en) 2011-05-20 2019-07-31 AlderBio Holdings LLC Use of anti-cgrp or anti-cgrp-r antibodies or antibody fragments to treat or prevent chronic and acute forms of diarrhea
CA2840965C (en) * 2011-07-06 2021-03-02 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
EP3494974B1 (en) 2011-07-08 2023-10-18 The University of North Carolina at Chapel Hill Metal bisphosphonate nanoparticles for anti-cancer therapy and imaging and for treating bone disorders
JP6088507B2 (ja) 2011-07-08 2017-03-01 ノバルティス アーゲー チロシンライゲーションの方法
ES2626488T3 (es) 2011-07-19 2017-07-25 Wave Life Sciences Pte. Ltd. Procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos funcionalizados
AU2012284558B2 (en) 2011-07-20 2017-06-29 Centre National De La Recherche Scientifique Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
CN103702687A (zh) 2011-07-29 2014-04-02 西莱克塔生物科技公司 产生体液和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）免疫应答的合成纳米载体
US9493517B2 (en) 2011-11-07 2016-11-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugates comprising an antigen and a carrier molecule
CN104520439A (zh) * 2012-02-28 2015-04-15 国立大学法人东京农工大学 Tdp-43细胞内存在量关联疾患的认定方法
SG11201405847SA (en) 2012-03-20 2014-10-30 Merial Inc Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof
JP2014012650A (ja) * 2012-07-05 2014-01-23 Nihon Univ 上皮バリア機能の増強方法及び増強剤
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
AU2013288048A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
EP2873674B1 (en) * 2012-07-13 2020-05-06 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
RU2647568C2 (ru) 2012-08-30 2018-03-16 Мериал, Инк. Экспрессия химерного белка ksac и способ получения растворимых белков с помощью высокого давления
MX2015004171A (es) 2012-10-02 2015-10-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugados de sacaridos no lineales.
US9987344B2 (en) 2012-11-30 2018-06-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pseudomonas antigens and antigen combinations
ES2878749T3 (es) 2013-02-20 2021-11-19 Innate Pharma Un compuesto que se une específicamente a KIR3DL2 para el uso en el tratamiento de linfoma de células T periférico
US9427647B2 (en) * 2013-04-26 2016-08-30 Russell I. Moy Climbing hold assembly having load dissipative effect
JP6865582B2 (ja) * 2013-05-29 2021-04-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｋｉｒ３ｄｌ２は皮膚及び非皮膚末梢ｔ細胞リンパ腫のサブセットをそれぞれ予防及び治療するために有用なバイオマーカー及び治療標的である
WO2014201245A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tlr-9 agonist with tlr-7 and/or tlr-8 agonist for treating tumors
EP3024936B1 (en) 2013-07-25 2019-09-04 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
EP2870974A1 (en) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella conjugate vaccines
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
CN106068325B (zh) 2014-01-16 2021-07-09 波涛生命科学有限公司 手性设计
CA2953216C (en) 2014-06-04 2020-12-22 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
MA42420A (fr) 2015-05-13 2018-05-23 Agenus Inc Vaccins pour le traitement et la prévention du cancer
JP2018524323A (ja) 2015-06-26 2018-08-30 セキラス ユーケー リミテッド 抗原がマッチしたインフルエンザワクチン
AU2017277647B2 (en) 2016-06-08 2023-07-27 President And Fellows Of Harvard College Engineered viral vector reduces induction of inflammatory and immune responses
CA3031778A1 (en) * 2016-07-26 2018-02-01 Bayer Animal Health Gmbh Increased fertility in bovine species
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
CN111194232B (zh) 2017-08-02 2023-01-31 芝加哥大学 纳米级金属有机层和金属有机纳米片
JP2021502381A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ウイルスベクター誘発性炎症反応を阻害するための組成物および方法
JP7458977B2 (ja) * 2017-12-15 2024-04-01 エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー 免疫刺激性組成物
AU2020206241A1 (en) 2019-01-08 2021-08-26 H. Lundbeck A/S Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-CGRP antibodies
EP4074334A4 (en) * 2019-12-13 2024-09-04 Grand Theravac Life Science Nanjing Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND ITS USE
US20230241196A1 (en) 2020-01-27 2023-08-03 Oregon State University Gonorrhea subunit vaccine
CN114181888B (zh) * 2021-11-24 2023-12-08 汕头大学 一种浅色黄姑鱼鱼鳔细胞系的建立方法及应用
CN115252603A (zh) * 2022-07-08 2022-11-01 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) indisulam在制备治疗膀胱癌的药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998040100A1 (en) * 1997-03-10 1998-09-17 Ottawa Civic Loeb Research Institute USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE AS AN ADJUVANT

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0368594A (ja) * 1989-08-09 1991-03-25 Shiratori Seiyaku Kk ポリヌクレオチドの製造法
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DK0772619T4 (da) 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6214806B1 (en) * 1997-02-28 2001-04-10 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CPC dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6339068B1 (en) * 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
WO1999001154A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
CA2323929C (en) * 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
WO1999056755A1 (en) 1998-05-06 1999-11-11 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
NZ508650A (en) 1998-05-14 2003-05-30 Coley Pharm Gmbh Regulating hematopoiesis using unmethylated C and G CpG-oligonucleotides with a phosphorothioate modification
PT1077722E (pt) * 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
CA2333854A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation Stereoisomers of cpg oligonucleotides and related methods
AU2977500A (en) * 1999-02-02 2000-08-25 Biocache Pharmaceuticals, Llc Advanced antigen presentation platform
WO2000054803A2 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
TR200103018T2 (tr) * 1999-04-19 2002-02-21 Beecham Biologicals S.A. Smithkline İmmünostimülatör oligonükleotid ve saponin içeren katkı bileşikleri.
EP1177439B1 (en) * 1999-04-29 2004-09-08 Coley Pharmaceutical GmbH Screening for immunostimulatory dna functional modifiers
EP1196558A1 (fr) 1999-06-08 2002-04-17 Aventis Pasteur Oligonucleotide immunostimulant
AU6051800A (en) 1999-06-16 2001-01-02 University Of Iowa Research Foundation, The Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
OA12028A (en) * 1999-09-25 2006-04-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US20010044416A1 (en) 2000-01-20 2001-11-22 Mccluskie Michael J. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a Th2 immune response
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
FR2805265B1 (fr) 2000-02-18 2002-04-12 Aventis Pasteur Oligonucleotides immunostimulants
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US6339630B1 (en) * 2000-05-18 2002-01-15 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Sealed drive screw operator
ATE440618T1 (de) 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
DK1366077T3 (da) 2000-09-15 2011-09-12 Coley Pharm Gmbh Fremgangsmåde til screening i store mængder af CpG-baserede immunoagonister/-antagonister
ATE398175T1 (de) * 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
WO2002053141A2 (en) 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
GB0105360D0 (en) * 2001-03-03 2001-04-18 Glaxo Group Ltd Chimaeric immunogens
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
JP4383534B2 (ja) * 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
CN1633598A (zh) 2001-10-05 2005-06-29 科勒制药股份公司 Toll样受体3信号传导的激动剂和拮抗剂
EP1478371A4 (en) 2001-10-12 2007-11-07 Univ Iowa Res Found METHODS AND PRODUCTS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES USING IMIDAZOQUINOLINE COMPOUND
CN1691979A (zh) * 2001-11-30 2005-11-02 埃克森美孚化学专利公司 具有高活性的双金属催化剂
WO2003047602A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-12 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
NZ573064A (en) 2002-04-04 2011-02-25 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
WO2003103586A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
WO2004024095A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Idenix (Cayman) Limited ß-L-2'-DEOXYNUCLEOSIDES FOR THE TREATMENT OF RESISTANT HBV STRAINS AND COMBINATION THERAPIES
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
CA2502015A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
WO2004087203A2 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
US7615539B2 (en) 2003-09-25 2009-11-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
US20050181035A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-18 Dow Steven W. Systemic immune activation method using non CpG nucleic acids
US20050244410A1 (en) * 2004-04-29 2005-11-03 Ashlyn Bassiri Toll-like receptor 9 effector agents and uses thereof
MX2007012488A (es) * 2005-04-08 2008-03-11 Coley Pharm Group Inc Metodos para el tratamiento de asma exacerbado por enfermedad infecciosa.
WO2006116458A2 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998040100A1 (en) * 1997-03-10 1998-09-17 Ottawa Civic Loeb Research Institute USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE AS AN ADJUVANT

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lipford G.B. et al.: "CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants". European Journal of Immunology, vol. 27, no. 9, 2340-2344, 1997 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL354997A1 (en) 2004-03-22
AU7615300A (en) 2001-04-30
NO20021453D0 (no) 2002-03-22
HRP20020249A2 (en) 2005-06-30
AU2005203408A1 (en) 2005-08-25
HK1047697A1 (en) 2003-03-07
AP2006003503A0 (en) 2006-02-28
CN101543507A (zh) 2009-09-30
DE60022665T2 (de) 2006-06-22
US20030212026A1 (en) 2003-11-13
IL148843A0 (en) 2002-09-12
CA2388055A1 (en) 2001-04-05
BG65736B1 (bg) 2009-09-30
SK3962002A3 (en) 2003-04-01
HUP0202639A2 (en) 2002-12-28
YU27102A (sh) 2005-11-28
US20070066554A1 (en) 2007-03-22
BR0014236A (pt) 2002-10-15
TR200200797T2 (tr) 2002-10-21
OA12028A (en) 2006-04-28
EP1221955A2 (en) 2002-07-17
ATE304361T1 (de) 2005-09-15
AU780979B2 (en) 2005-04-28
DE60022665D1 (de) 2005-10-20
ES2248126T3 (es) 2006-03-16
HK1047697B (zh) 2005-12-02
UA77152C2 (en) 2006-11-15
WO2001022972A9 (en) 2006-12-14
DK1221955T3 (da) 2006-01-30
US7271156B2 (en) 2007-09-18
WO2001022972A3 (en) 2002-01-17
RU2002111006A (ru) 2004-01-10
EP1700603A2 (en) 2006-09-13
EP1221955B9 (en) 2005-11-30
CN1454091A (zh) 2003-11-05
KR20020068509A (ko) 2002-08-27
CZ20021050A3 (cs) 2003-01-15
KR100863630B1 (ko) 2008-10-15
SK287400B6 (sk) 2010-08-09
MXPA02003108A (es) 2003-10-14
EE200200158A (et) 2003-06-16
ZA200201963B (en) 2003-03-10
EP1221955B1 (en) 2005-09-14
AP1775A (en) 2007-08-28
NO20021453L (no) 2002-05-27
BG106538A (en) 2002-12-29
AU2005203408B2 (en) 2008-10-23
CN1939541A (zh) 2007-04-04
WO2001022972A2 (en) 2001-04-05
JP2003510282A (ja) 2003-03-18
NZ517929A (en) 2004-02-27
EP1700603A3 (en) 2007-06-13
TR200503031T2 (tr) 2005-09-21
US20090191188A1 (en) 2009-07-30
RS50325B (sr) 2009-09-08
AP2002002484A0 (en) 2002-06-30
RU2245149C2 (ru) 2005-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2245149C2 (ru) Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты
US7576066B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US8114419B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
EP1350262B1 (en) Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
AU2003247880B2 (en) Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
CA2396871A1 (en) Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20110925