SK15762003A3 - Kompozícia vakcíny HCV E1E2 - Google Patents

Description

KOMPOZÍCIA VAKCÍNY HCV E1E2

Oblasť techniky

Tento vynález sa všeobecne zaoberá kompozíciami vakcíny. Predložený vynález sa hlavne vzťahuje ku kompozíciám vakcíny HCV E1E2 obsahujúcim antigény E1E2, submikrónové emulzie olej vo vode a CpG oligonukleotidy.

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV) je základnou príčinou parenterálnej hepatitídy iného typu ako A, iného typu ako B (NANBH). Tento vírus sa vyskytuje u 0,4 až 2,0 % darcov krvi. Chronická hepatitída sa vyvíja u zhruba 50 % infekcií a z nich sa zhruba u 20 % infikovaných jedincov vyvíja cirhóza pečene, ktorá niekedy vedie k hepatocelulárnemu karcinómu. V súlade s tým má štúdia a kontrola tejto choroby význam v lekárstve.

HCV sa prvýkrát identifikoval a charakterizoval ako príčina NANBH Houghtonom a kol. Vírusová genómová sekvencia HCV je známa rovnako ako spôsoby získania tejto sekvencie. Pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 89/04669, WO 90/11089 a WO 90/14436. HCV má genóm jednovláknovej ribonukleovej kyseliny kladného zmyslu 9,5 kb a je členom čeľade vírusov Flaviridae. Na základe fylogenetických analýz sa identifikuje najmenej šesť rozdielnych, avšak príbuzných genotypov HCV (Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391 - 2399 (1993)). Vírus kóduje jednotlivý polyproteín majúci viac ako 3000 aminokyselinových zvyškov (Choo a koľ, Science, 244, 359 - 362 (1989), Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2451 - 2455 (1991), Han a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 1711 - 1715 (1991)). Tento polyproteín sa spracováva kontranslačne a posttranslačne do štruktúrnych a neštruktúrnych (NS) proteinov.

244/B

Niekoľko proteínov sa zrejme kóduje, ako ukazuje obrázok 1, genómom HCV. Poradie a nomenklatúra produktov štiepenia polyproteínu HCV je nasledujúca: NH₂ - C - E1 - E2 - p7 - NS2 - NS3 - NS4a - NS4b - NS5a NS5b - COOH. Počiatočné štiepenie polyproteínu sa charakterizuje hostiteľskými proteázami uvoľňujúcimi tri štruktúrne proteíny, N-terminálny nukleokapsidový proteín (nazvaný „jadro,,) a dva glykoproteíny obálky „E1„ (tiež známy ako E) a „E2„ (tiež známy ako E2/NS1) rovnako tak ako neštruktúrne (NS) proteíny obsahujúce vírusové enzýmy. Oblasti NS sa nazývajú NS2, NS3, NS4 a NS5. NS2 je integrálny membránový proteín s proteolytickou aktivitou a v kombinácii s NS3 štiepi jednoduchú väzbu NS2 - NS3, ktorá opäť vytvára koniec NS3 N a uvoľňuje veľký polyproteín, ktorý zahrňuje aktivity serín proteázy a RNA helikázy. Proteáza NS3 slúži na spracovanie zvyšného polyproteínu. V týchto reakciách uvoľňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteíny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentná RNA polymerázu (NS5b). Dokončenie zretia polyproteínu sa spúšťa autokatalytickým štiepením pri spojke NS3 - NS4a katalyzovaním serín proteázou NS3.

E1 sa detekuje ako zložka 32 a 35 kDa a prevádza sa na jednotlivý endo H-senzitívny pás o zhruba 18 kDa. Naproti tomu vykazuje E2 komplexný typ pri imunoprecipitácii konzistentne s tvorbou viacpočetných zložiek (Spaete a kol., Virol., 188, 819 - 830 (1992), Selby a kol., J. Virol., 70, 5177 - 5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385 - 1395 (1993), Tomei a koľ, J. Virol., 67, 4017 - 4026 (1993)). Glykoproteíny E1 a E2 obálky HCV tvoria stabilný komplex schopný koimunoprecipitácie (Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385 - 1395 (1993), Lanford a koľ, Virology, 197, 225 - 235 (1993), Ralston a koľ, J. Virol., 67,6753-6761 (1993)).

E1 a E2 sa udržiavajú vo vnútri buniek a nemajú komplexný glycid, pokiaľ sa exprimujú stabilne alebo v prechodnom vírusovom systéme Vaccinia (Spaete a kol., Virology, 188, 819 - 830 (1992), Ralston a kol., J. Virol., 67, 6753 - 6761 (1993)). Pretože sa proteíny E1 a E2 v týchto expresných systémoch normálne viažu na membrány, pripravujú sa vylučované formy kvôli uľahčeniu purifikácie proteínov. Pozri napríklad US patent č. 6 121 020. Navyše

244/B sa popisuje intracelulárna tvorba E1E2 v Hela bunkách. Pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 98/50556.

Glykoproteíny HCV E1 a E2 sú predmetom značného záujmu, lebo vykazujú ochranu proti vystaveniu vírusom v štúdiách na primátoch (Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 1294 - 1298 (1994)). Sú však stále potrebné vakcínové zmesi obsahujúce tieto antigény na prevenciu infekcie HCV.

Vakcínové kompozície často obsahujú imunologické adjuvantné látky na zvýšenie imunitnej odpovede. Napríklad úplné Freundovo adjuvans (CFA) je vysoko účinný imunostimulačný prostriedok, ktorý sa úspešne používa s mnohými antigénmi na experimentálnej báze. CFA zahrňuje tri zložky: minerálny olej, emulgačný prostriedok a usmrtené mykobaktérie, ako je Mycobacterium tuberculosis. Vodné roztoky antigénu sa zmiešajú s týmito zložkami s vytvorením emulzie vody v oleji. CFA, i keď je účinný ako adjuvantný prostriedok, spôsobuje závažné vedľajšie účinky vrátane bolesti, tvorby abscesov a horúčky, predovšetkým ako dôsledok prítomnosti mykobakteriálnej zložky. Preto sa CFA v ľudských a veterinárnych vakcínach nepoužíva.

Muramyldipeptid (MDP) je minimálnou jednotkou mykobakteriálneho komplexu bunkovej steny, ktorá generuje adjuvantnú aktivitu pozorovanú u CFA. Pozri napríklad Ellouz a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 59, 1317 (1974). Niekoľko vytvorených syntetických analógov MDP vykazuje široké rozmedzie adjuvantného pôsobenia a vedľajších účinkov. Ohľadom prehľadu týchto analógov pozri Chedid a kol., Prog. Aliergy, 25, 63 (1978). Reprezentatívne analógy MDP zahrňujú deriváty treonylu MDP (Byars a kol., Vaccine, 5, 223 (1987), n-butylderiváty MDP (Chedid a kol., Infect. Immun., 35, 417) a lipofilné deriváty muramyltripeptidu (Gisler a koľ, v Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, 1981, redakcia Y. Yamamura a S. Kotani, Excerpta Medica, Amsterdam, str. 167).

Jedným lipofilným derivátom MDP je N-acetylmuramyl-L-alanyl-Dizoglutaminyl-L-alanín-2-(1 ',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE). Tento muramyltripeptid zahrňuje

244/B fosfolipidové konce, ktoré umožňujú pripojenie hydrofóbnej časti molekuly k lipidovému prostrediu, zatiaľ čo muramylpeptidová časť sa spája s vodným prostredím. Preto je MTP-PE samotný schopný pôsobiť ako emulgačný prostriedok na tvorbu stabilných emulzií oleja vo vode. MTP-PE sa používa v emulzii 4 % skvalénu s 0,008 % Tween 80™ nazvaným MTP-PE-LO (nízky olej) na dodávku antigénu vírusu gD herpes simplex s účinnými výsledkami (Sanchez - Pescador a koľ, J. Immunol., 141, 1720 - 1727 (1988), í keď pri zlej fyzikálnej stabilite. Nedávno sa vyvinula MF59, bezpečná vysoko imunogénna submikrónová emulzia olej vo vode obsahujúca 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,5 % (hmotnosť/objem) Tween 80™, 0,5 % Span 85™ a prípadne rôzne množstvá MTP-PE na použitie vo vakcínových kompozíciách. Pozri napríklad Ott a kol., „MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines,, vo Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.), Plénum Press, New York, 1995, str. 277 až 296. Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 1294 - 1298 (1994) a Houghton a kol., vo Viral Hepatitis and Liver Disease (1997), str. 656, popisujú použitie komplexov HCV E1/E2 so submikrónovou emulziou olej vo vode obsahujúcou MTP-PE.

Bakteriálna deoxyribonukleová kyselina obsahuje nemetylované CpG dinukleotidy majúce imunostimulačné účinky na mononukleárne bunky v periférnej krvi in vitro. Krieg a kol., J. Clin. Immunol., 15, 284 - 292 (1995). CpG oligonukleotidy sa používajú na zvýšenie imunitných odpovedí. Pozri napríklad US patenty č. 6 207 646, 6 214 806, 6 218 371 a 6 406 705.

Napriek použitiu týchto adjuvantov konvenčné vakcíny často zlyhávajú pri zaisťovaní adekvátnej ochrany proti cieľovému patogénu. V súlade s tým existuje naďalej potreba efektívnych vakcínových kompozícií proti HCV obsahujúcich bezpečné a netoxické adjuvanty.

244/B

Podstata vynálezu

Tento vynález sa čiastočne zakladá na prekvapujúcom objave skutočnosti, že použitie antigénov HCV E1E2 v kombinácii so submikrónovými emulziami oleja vo vode a oligonukleotidmi obsahujúcimi imunostimulačné sekvencie nukleových kyselín (ISS), ako je CpY, CpR a nemetylované CpG motívy (cytozín nasledovaný guanozínom a pripojený fosfátovou väzbou) poskytujú významne vyššie titry protilátok ako tie, ktoré možno pozorovať bez týchto adjuvantov. Alternatívne možno tieto kompozície používať so samotnými ISS bez submikrónových emulzií olej vo vode alebo so samotnými emulziami olej vo vode bez MTP-PE, bez ISS. Použitie týchto kombinácií poskytuje bezpečný a účinný spôsob zvyšovania imunogénneho pôsobenia antigénov HCVE1E2.

V súlade stým sa v jednom vyhotovení tento vynález zameriava na kompozíciu obsahujúcu antigén HCV E1E2 a submikrónovú emulziu olej vo vode bez MTP-PE, kde je táto submikrónová emulzia olej vo vode schopná zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCV E1E2. Táto kompozícia môže ďalej obsahovať ISS ako oligonukleotid obsahujúci nemetylované CpG motívy („CpG oligonukleotid,,), ktorý v prípade prítomnosti pôsobí zvyšovaním imunitnej odpovede na antigén.

V ešte ďalšom vyhotovení sa tento vynález zameriava na spôsob stimulácie imunitnej odpovede u stavovca, ktorý zahrňuje podávanie subjektu terapeuticky účinného množstva HCV E1E2 antigénu a submikrónovej emulzie olej vo vode bez MTP-PE, kde je táto submikrónová emulzia olej vo vode schopná zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCV E1E2. Subjektu možno tiež podávať jeden či viacero ISS, ako je jeden či viacero oligonukleotidov obsahujúcich nemetylované CpG motívy, kde ISS môže zvyšovať imunitnú odpoveď antigénu HCV E1E2. Submikrónová emulzia olej vo vode môže byť prítomná v rovnakej kompozícii ako antigén alebo sa môže podávať v oddelenej kompozícii. Navyše, pokiaľ je prítomný ISS, môže byť v rovnakej kompozícii ako antigén a/alebo submikrónová emulzia olej vo vode alebo v inej kompozícii.

244/B

V ďalšom vyhotovení sa tento vynález zameriava na spôsob prípravy kompozície obsahujúcej kombináciu submikrónovej emulzie olej vo vode bez MTP-PE s antigénom HCV E1E2. V určitých vyhotoveniach tento spôsob ďalej obsahuje kombináciu ISS, ako je oligonukleotid obsahujúci nemetylované motívy CpG schopný zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCV E1E2 s antigénom E1E2 a submikrónovou emulziou olej vo vode.

V ďalších vyhotoveniach sa tento vynález zameriava na kompozíciu obsahujúcu antigén HCV E1E2 a ISS, ako je CpG oligonukleotid schopný zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCV E1E2.

V ešte ďalšom vyhotovení sa tento vynález zameriava na spôsob stimulácie imunitnej odpovede u stavovca zahrňujúceho podávanie subjektu terapeuticky účinného množstva antigénu HCV E1E2 a ISS, ako je CpG oligonukleotid, kde ISS môže zvyšovať imunitnú odpoveď antigénu HCV E1E2. ISS môže byť v rovnakých kompozíciách ako antigén alebo sa môže podávať v oddelenej kompozícii.

V ešte ďalších vyhotoveniach sa tento vynález zameriava na spôsob prípravy kompozícií obsahujúcich kombináciu ISS, ako je CpG oligonukleotid s antigénom HCV E1E2, kde ISS môže zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCVE1E2.

CpG molekula v ktoromkoľvek vyššie popísanom vyhotovení môže mať vzorec 5'-XiX2CGX3X₄, kde Xi a X₂ sú sekvencie zvolené zo skupiny zahrňujúcej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG, a X₃ a X₄ sa volia z prípadov TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde „p„ označuje fosfátovú väzbu. V určitých vyhotoveniach zahrňuje CpG oligonukleotid sekvenciu GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT s niekoľkými pripojenými prídavnými nukleotidmi.

244/B

V jednom ďalšom vyhotovení má CpG oligonukleotid na použitie v týchto kompozíciách sekvenciu 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1) alebo sekvenciu 5'TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).

V určitých vyhotoveniach obsahuje submikrónová emulzia olej vo vode:

(1) metabolizovateľný olej, ktorý je prítomný v množstve 0,5 % až 20 % celkového objemu a (2) emulgačný prostriedok, ktorý je prítomný v množstve 0,01 % až 2,5 % (hmotnosť/objem) a kde tento olej a emulgačný prostriedok sú prítomné vo forme emulzie olej vo vode s kvapôčkami, ktoré majú v podstate priemer okolo 100 nm do menej ako 1 mikrometer, kde submikrónová emulzia olej vo vode je schopná zvyšovať imunitnú odpoveď antigénu HCV E1E2.

V ďalších vyhotoveniach je submikrónová emulzia olej vo vode podľa popisu vyššie a nemá akékoľvek polyoxypropylén - polyoxyetylénové blokové kopolyméry rovnako tak ako akýkoľvek muramylpeptid.

V ďalších vyhotoveniach obsahuje emulgačný prostriedok mono-, dialebo triester polyoxyetylénsorbitanu a/alebo mono-, di- alebo triester sorbitanu.

V určitých vyhotoveniach je množstvo oleja 1 % až 12 %, ako je 1 % až 4 % celkového objemu a množstvo emulgačného prostriedku je 0,01 % až 1 % (hmotnosť/objem), ako je 0,01 % až 0,05 % (hmotnosť/objem).

V ďalších vyhotoveniach popisovaných tu obsahuje submikrónová emulzia olej vo vode 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) Tween 80™ (polyoxyetylénsorbitan - monooleát) a/alebo 0,25 až 1,0 % Span 85™ (sorbitan - trioleát) a pripadne N-acetylmuramyl-Lalanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE).

244/B

V ďalších vyhotoveniach obsahuje submikrónová emulzia olej vo vode v podstate:

(1) 5 objemových % skvalénu a (2) jeden či viacero emulgačných prostriedkov zvolených z prípadov Tween 80™ (polyoxyetylénsorbitan - monooieát) a Span 85™ (sorbitan - trioleát), kde celkové množstvo emulgačného prostriedku (prostriedkov) je 1 hmotnostné % (hmotnosť/ objem), kde skvalén a emulgačný prostriedok (prostriedky) sú vo forme emulzie olej vo vode majúcej olejové kvapôčky, z ktorých v podstate všetky sú veľkosti zhruba 100 nm až menej ako 1 pm v priemere a kde kompozícia neobsahuje žiaden polyoxypropylén - pofyoxyetylénový blokový kopolymér a ďalej, kde je submikrónová emulzia olej vo vode schopná zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén HCV.

V ďalšom vyhotovení predstavuje jeden či viacero emulgačných prostriedkov polyoxyetylénsorbitan - monooieát a sorbitan - trioleát a celkové množstvo polyoxyetylénsorbitan - monooleátu a sorbitan - trioleátu je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).

V určitých vyhotoveniach kompozícia nemá muramylpeptid.

Tieto a ďalšie aspekty tohto vynálezu sú zrejmé s odkazom na nasledujúci podrobný popis a pripojené výkresy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je diagram znázorňujúci HCV genóm zobrazujúci rôzne oblasti polyproteinu HCV.

Obrázky 2A až 2C (číslo identifikácie sekvencie 3 a 4) ukazujú nukleotid a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu oblasti HCV-1 E1/E2/p7. Čísla na obrázku sa vzťahujú k celkovej dĺžke polyproteinu HCV-1. Sú znázornené oblasti E1, E2 a p7.

244/B

Obrázok 3 je diagram plazmidu pMHE1E2-809 kódujúceho E1E2₈₀9, reprezentatívny E1E2 proteín na použitie podľa tohto vynálezu.

Obrázok 4 ukazuje titry protilátok E1E2₈og EIA z myší imunizovaných E1E2₃o9 plus CpG, Ε1Ε2₈₀₉ plus MF59, E1E2₈₀₉ plus CpG a MF59 a E1E2₈₀₉ plus 4XMF59, ako sa popisuje v príkladoch. Krúžky ukazujú titry jednotlivých protilátok myšieho séra. Štvorčeky ukazujú geometrický priemer titra protilátok (GMT) skupiny 10 myší. Úsečky chýb predstavujú porovnávacie intervaly pre štatisticky významné rozdiely stanovené jednostrannou analýzou rozptylu.

Nasleduje podrobný popis vynálezu.

V praxi tento vynález používa, pokiaľ sa neuvádza inak, konvenčné spôsoby chémie, biochémie, spôsoby rekombinantných deoxyribonukleových kyselín a imunológiu v rámci znalosti odboru. Tieto spôsoby sa plne vysvetľujú v literatúre. Pozri napríklad Fundamental Virology, 2. vydanie, diel I a II (B. N. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, diely I až IV (D. M. Weir a C. C. Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc.), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydanie, 1989), Methods in Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan, red. Academic Press, Inc).

Je potrebné poznamenať, že pri použití v tomto popise a pripojených nárokoch zahrňujú singulárne formy „a,„ „an„ a „the,, i odkazy na plurál, pokiaľ obsah zreteľne neurčuje inak. Preto napríklad pojem „antigén,, zahrňuje zmes 2 či viacerých antigénov a podobne.

244/B

V celom texte sa používajú nasledujúce skratky aminokyselín:

Alanín: Ala (A)	Arginín: Arg (R)
Asparagín: Asn (N)	Kyselina aspartová: Asp (D)
Cysteín: Cya (C)	Glutamín: Gin (Q)
Kyselina glutamová: Glu (E)	Glycín: Gly (G)
Histidín: His (H)	Izoleucín: lle (I)
Leucín: Leu (L)	Lyzín: Lys (K)
Metionín: Met (M)	Fenylalanín: Phe (F)
Prolín: Pro (P)	Serín: Ser (S)
Treonín: Thr (T)	Tryptofán: Trp (W)
Tyrozín: Tyr (Y)	Valín: Val (V)

I. Definície

Pri popise tohto vynálezu sa používajú nasledujúce termíny a ich definície sa uvažujú tak, ako sa popisuje nižšie.

Pojmy „polypeptid,, a „proteín,, sa týkajú polyméru aminokyselinových zvyškov a neobmedzujú sa na minimálnu dĺžku produktu. Preto sa do tejto definície zahrňujú peptidy, oligopeptidy, diméry, multiméry a podobne. Táto definícia zahrňuje proteíny plnej dĺžky aj fragmenty. Tieto termíny tiež zahrňujú postexpresné modifikácie polypeptidu, napríklad glykozyláciu, acetyláciu, fosforyláciu a podobne. Ďalej na účely tohto vynálezu sa „polypeptid,, týka proteínu, ktorý zahrnuje modifikácie, ako sú delécia, adícia a substitúcia (všeobecne povahou konzervatívne), natívne sekvencie, pokiaľ proteín zachováva požadovanú aktivitu. Modifikácie môžu byť úmyselné, ako je to v prípade mutagenézy zameranej na miesto alebo náhodné, ako je to pri mutáciách hostiteľa poskytujúcich proteíny či chyby následkom amplifikácie PCR.

244/B „E1 polypeptid,, znamená molekulu odvodenú od oblasti HCV E1. Zrelá oblasť E1 HCV-1 začína zhruba pri aminokyseline 192 polyproteínu a pokračuje zhruba k aminokyseline 383, číslované vzhľadom k HCV-1 polyproteínu plnej dĺžky. (Pozri obrázky 1 a 2A až 2C. Aminokyseliny 192 až 383 obrázkov 2A až 2C zodpovedajú polohám aminokyselín 20 až 211 sekvencie identifikačného čísla 4). Aminokyseliny okolo 173 až zhruba 191 (aminokyseliny 1 až 19 sekvencie identifikačného čísla 4) slúžia ako signálne sekvencie pre E1. Preto „E1 polypeptid,, znamená bud prekurzorový E1 proteín vrátane signálnej sekvencie alebo zrelý „E1 polypeptid,,, ktorý nemá túto sekvenciu alebo dokonca E1 polypeptid s heterológnou signálnou sekvenciou. Tento E1 polypeptid zahrňuje C-terminálnu membránovú kotviacu sekvenciu, ktorá sa vyskytuje zhruba pri polohách aminokyselín 360 až 383 (pozri medzinárodná publikácia č. WO 96/04301, vydaná 15. februára 1996). E1 polypeptid, ako sa tu definuje, môže alebo nemusí zahrňovať C-terminálnu kotviacu sekvenciu ani jej časti.

„E2 polypeptid,, znamená molekulu odvodenú od oblasti HCV E2. Zrelá oblasť E2 HCV-1 začína zhruba pri aminokyseline 383 až 385, číslované vzhľadom k polyproteínu HCV-1 plnej dĺžky. (Pozri obrázky 1 a 2A až 2C. Aminokyseliny 383 až 385 obrázkov 2A až 2C zodpovedajú polohám aminokyselín 211 až 213 sekvencie identifikačného čísla 4.) Signálny peptid začína zhruba pri aminokyseline 364 tohto polyproteínu. „E2 polypeptid,, teda znamená buď prekurzorový E2 proteín vrátane signálnej sekvencie alebo zrelý E2 polypeptid, ktorému chýba táto sekvencia alebo dokonca E2 polypeptid s heterológnou signálnou sekvenciou. E2 polypeptid zahrňuje C-terminálnu membránovú kotviacu sekvenciu vyskytujúcu sa zhruba pri polohách aminokyselín 715 až 730, ktorá môže pokračovať až zhruba k aminokyselinovému zvyšku 746 (pozri Lin a koľ, J. Virol., 68, 5063 - 5073 (1994)). Polypeptid E2, ako sa tu definuje, môže a nemusí zahrňovať Cterminálnu kotviacu sekvenciu ani jej časti. Navyše E2 polypeptid môže zahrňovať celú oblasť p7 alebo jej časť, ktorá sa vyskytuje bezprostredne pri konci C E2. Ako ukazujú obrázky 1 a 2A až 2C, oblasť p7 sa nachádza pri polohách 747 až 809, číslované vzhľadom k polyproteínu HCV-1 plnej dĺžky

244/B (aminokyselinové polohy 575 až 637 sekvencie identifikačného čísla 4.). Navyše existujú mnohé známe zložky HCV E2 (Spaete a kol., Virol., 188, 819 830 (1992), Selby a kol., J. Virol., 70, 5177 - 5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385 - 1395 (1993), Tomei a kol., J. Virol., 67, 4017 - 4026 (1993)). V súlade s tým na účely tohto vynálezu pojem „E2„ zahrňuje tie zložky E2 zahrňujúce bez obmedzenia zložky, ktoré majú deléciu 1 až 20 alebo viacerých aminokyselín z konca N E2, ako sú napríklad delécie 1, 2, 3, 4, 5, ... 10, ... 15, 16, 17, 18, 19, ... atd. aminokyselín. Takéto zložky zahrňujú tie, ktoré začínajú pri aminokyseline 387, aminokyseline 402, aminokyseline 403, atď.

Reprezentatívne oblasti E1 a E2 z HCV-1 ukazujú obrázky 2A až 2C a sekvencie identifikačného čísla 4. Na účely tohto vynálezu sa oblasti E1 a E2 definujú vzhľadom k číslu aminokyseliny polyproteínu kódovanej genómom HCV-1, kde iniciátor metionínu určuje polohu 1. Pozri napríklad Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2451 - 2455 (1991). Je potrebné poznamenať, že pojem „E1 polypeptid,, alebo „E2 polypeptid,,, ako sa tu používa, sa neobmedzuje na sekvenciu HCV-1. V tomto smere možno zodpovedajúce oblasti E1 alebo E2 v iných izolátoch HCV ľahko určiť priradením sekvencií z izolátov spôsobom, ktorý dosahuje maximálne priradenie sekvencií. To možno vykonať ktorýmkoľvek z radu súborov počítačového programového vybavenia, ako je ALIGN 1.0, ktorý možno získať od University of Virginia, Department of Biochemistry (Dr. Willam R. Pearson). Pozri Pearson a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 2444-2448 (1988).

Ďalej „E1 polypeptid,, alebo „E2 polypeptid,,, ako sa tu definuje, sa neobmedzuje na polypeptid majúci presnú sekvenciu znázornenú na obrázkoch. Genóm HCV je v skutočnosti v stave konštantného toku in vivo a obsahuje niekoľko premenných domén vykazujúcich relatívne vysoké stupne variability medzi izolátmi. Počet zachovaných a variabilných oblastí je medzi týmito kmeňmi známy a všeobecne budú mať aminokyselinové sekvencie epitopy odvodené od týchto oblastí vyšší stupeň sekvenčnej homológie, napríklad aminokyselinovú sekvenčnú homológiu viac ako 30 %, prednostne viac ako 40 %, viac ako 60 % a dokonca ešte viac ako 80 až 90 % pri priradení dvoch sekvencií. Je zrejmé, že tieto termíny zahrňujú E1 a E2 polypeptidy

244/B z ktoréhokoľvek z rôznych kmeňov HCV a izolátov vrátane izolátov majúcich ktorýkoľvek zo šiestich génov typu HCV popísaných Simmondsom a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391 - 2399 (1993) (napríklad kmene 1, 2, 3, 4, atd’.), rovnako tak ako novo identifikovaných izolátov a subtypov týchto izolátov, ako sú HCV1a, HCV1b, atď.

Pojmy „E1„ alebo „E2„ polypeptid sa teda vzťahujú k natívnym sekvenciám E1 alebo E2 z rôznych kmeňov HCV rovnako tak ako analógov muteínov a imunogénnych fragmentov, ako sa ďalej definujú nižšie. Sú známe úplné genotypy mnohých z týchto kmeňov. Pozri napríklad US patent č. 6 150 087 a Gen-Bank Accession č. AJ238800 a AJ238799.

Ďalej termíny „E1 polypeptid,, a „E2 polypeptid,, zahrňujú proteíny vrátane modifikácií natívnej sekvencie, ako sú vnútorná delécia, adícia a substitúcia (všeobecne povahou konzervatívne). Tieto modifikácie môžu byť úmyselné, ako je mutagenéza cielená na miesto alebo náhodné, ako sú prirodzené prípady mutácie. Všetky tieto modifikácie sa zahrňujú do tohto vynálezu, pokiaľ modifikované E1 a E2 polypeptidy slúžia na zamýšľaný účel. Tak napríklad ak sa polypeptidy E1 a/alebo E2 používajú v kompozíciách vakcín, musia byť modifikácie také, aby imunologická aktivita (t.j. schopnosť vyvolať humorálnu bunkovú imunitnú odpoveď na polypeptid) sa zachovala.

Komplex „E1E2„ znamená proteín obsahujúci aspoň jeden polypeptid E1 a aspoň jeden polypeptid E2, ako sa popisujú vyššie. Tento komplex môže tiež zahrňovať celú oblasť p7 alebo jej časť, ktorá bezprostredne prilieha ku koncu C E2. Ako ukazujú obrázky 1 a 2A až 2C, je oblasť p7 pri polohách 747 až 809 číslovaných vzhľadom k polyproteínu HCV-1 plnej dĺžky (polohy aminokyselín 576 až 637 sekvencie identifikačného čísla 4). Reprezentatívny komplex E1E2 obsahujúci proteín p7 sa tu nazýva „E1E2₈o9„.

Režim pripojenia E1 a E2 v komplexe E1E2 je nepodstatný. Polypeptidy E1 a E2 sa môžu spájať nekovalentnými interakciami, ako sú elektrostatické sily, alebo kovalentnými väzbami. Napríklad môžu byť E1E2 polypeptidy podľa tejto prihlášky vo forme hybridného proteínu, ktorý zahrňuje imunogénny E1 polypeptid a imunogénny E2 polypeptid, ako sa definujú vyššie. Fúzia sa môže

244/B exprimovať z polynukleotidu kódujúceho chiméru E1E2. Alternatívne sa môžu komplexy E1E2 vytvárať spontánne jednoduchým zmiešaním E1 a E2 proteínov, ktoré sa pripravili jednotlivo. Podobne pri súčasnej expresií a vylučovaní do média môžu proteíny E1 a E2 vytvárať komplex spontánne. Termín komplexy E1E2 (tzv. agregáty) teda zahrňuje spontánnu formu pri purifikácii E1 a/alebo E2. Takéto agregáty môžu zahrňovať jeden či viacero monomérov E1 v spojení s jedným či viacerými monomérmi E2. Počet prítomných monomérov E1 a E2 nemusí byť rovnaký, pokiaľ je prítomný aspoň jeden monomér E1 a jeden monomér E2. Detekcia prítomnosti komplexu E1E2 sa ľahko určí štandardnými spôsobmi detekcie proteínov, ako je elektroforéza na polyakrylamidovom géli a imunologických spôsobov, ako je imunoprecipitácia.

Pojmy „analóg,, a „muteín,, sa týkajú biologicky aktívnych derivátov referenčnej molekuly alebo fragmentov týchto derivátov, ktoré uchovávajú požadovanú aktivitu, ako je imunoreaktivita, v štúdiách, ktoré sa tu popisujú. Všeobecne termín „analóg,, znamená zlúčeniny majúce natívnu polypeptidovú sekvenciu a štruktúru s jednou či viacerými aminokyselinovou adíciou, substitúciou (povahou všeobecne prirodzenou) a/alebo deléciou vzhľadom k natívnej molekule, pokiaľ tieto modifikácie nenarušujú imunogénnu aktivitu. Pojem „muteín,, sa týka peptidov majúcich jedno či viacero peptidových mimetík („peptoidov), ako sú tie, ktoré popisuje medzinárodná publikácia č. WO 91/04282. Prednostne má analóg či muteín aspoň rovnakú imunoaktivitu ako natívna molekula. Spôsoby prípravy polypeptidových analógov a muteínov sú v odbore známe a popisujú sa nižšie.

Zvlášť preferované analógy zahrňujú substitúcie, ktoré sú svojou povahou konzervatívne, t.j. tie substitúcie, ktoré nastávajú v rámci jednej skupiny aminokyselín a týkajú sa ich bočných reťazcov. Konkrétne sa aminokyseliny všeobecne delia do štyroch skupín: (1) kyslé - aspartát a glutamát, (2) bázické - lyzín, arginín, histidín, (3) nepoláme - alanín, valin, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionin, tryptofán a (4) polárne bez náboja - glycín, asparagín, glutamín, cysteín, serín, treonín, tyrozín. Fenylalanín, tryptofán a tyrozín sa niekedy klasifikujú ako aromatické

244/B aminokyseliny. Napríklad možno rozumne predvídať, že izolovaná náhrada leucínu izoleucínom či valínom, aspartátu glutamátom a treonínu serínom alebo podobná konzervatívna náhrada aminokyseliny štruktúrne príbuznou aminokyselinou nebude mať značný vplyv na biologickú aktivitu. Napríklad daný polypeptid môže mať až zhruba 5 až 10 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo dokonca až zhruba 15 až 25 alebo 50 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo akýkoľvek počet medzi 5 až 50, pokiaľ sa zachováva požadovaná funkcia molekuly. Skúsený odborník môže ľahko určiť oblasti danej molekuly, ktoré môžu tolerovať zmenu s použitím vynesenia Hopp/Woods a Kyte - Doolittle dobre známych v odbore.

Pojem „fragment,, znamená polypeptid skladajúci sa len z časti intaktnej polypeptidovej sekvencie a štruktúry plnej dĺžky. Fragment môže zahrňovať Cterminálnu deléciu a N-terminálnu deléciu a/alebo vnútornú deléciu natívneho polypeptidu. „Imunogénny fragment,, daného proteínu HCV všeobecne zahrňuje aspoň zhruba 5 až 10 súvislých aminokyselinových zvyškov molekuly plnej dĺžky, prednostne aspoň zhruba 15 až 25 súvislých aminokyselinových zvyškov molekuly plnej dĺžky a najlepšie aspoň zhruba 20 až 50 či viac súvislých aminokyselinových zvyškov molekuly plnej dĺžky, ktoré definujú epitop alebo akýkoľvek počet medzi 5 aminokyselinami a sekvenciou plnej dĺžky s podmienkou, že tento fragment zachováva schopnosť vyvolávať imunologickú odpoveď, ako sa tu definuje. Ohľadne popisu imunogénnych fragmentov E1 a E2 HCV pozri napríklad Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365.

Pojem „epitop,,, ako sa tu používa, sa týka sekvencie aspoň zhruba 3 až 5, prednostne zhruba 5 až 10 alebo 15 a nie viac ako zhruba 500 aminokyselín (alebo akéhokoľvek počtu medzi týmito hodnotami), ktoré definujú sekvenciu, ktorá sama o sebe alebo ako časť väčšej sekvencie vyvoláva imunologickú odpoveď po podaní subjektu. Často sa epitop viaže na protilátku vytvorenú ako odpoveď na túto sekvenciu. Neexistuje žiadna kritická horná hranica pre dĺžku fragmentu, ktorá môže zahrňovať proteínovú sekvenciu takmer celej dĺžky alebo dokonca hybridný protein obsahujúci dva či viacero epitopov polyproteínu

244/B

HCV. Epitop na použitie v tomto vynáleze sa neobmedzuje na polypeptid majúci presnú sekvenciu časti materského proteínu, z ktorého sa odvodzuje. V skutočnosti sú vírusové genómy v stave konštantného toku a obsahujú niekoľko premenných domén, ktoré vykazujú relatívne vysoké stupne variability medzi izolátmi. Preto pojem „epitop,, zahrňuje sekvencie identické s natívnou sekvenciou rovnako tak ako modifikácie natívnych sekvencií, ako sú delécia, adícia a substitúcia (povahou všeobecne konzervatívne).

Oblasti daného polypeptidu obsahujúce epitop možno identifikovať s použitím akéhokoľvek počtu spôsobov mapovania epitopov dobre známych v odbore. Pozri napríklad Epitop Mapping Protocols v Methods in Molecular Biology, diel 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996), Human Press, Totowa, New Jersey. Lineárne epitopy možno určiť napríklad súčasnou prípravou veľkého počtu peptidov na pevných nosičoch, kde tieto peptidy zodpovedajú častiam molekuly proteínu a reakciou týchto peptidov s protilátkami, v priebehu ktorej sú peptidy doteraz pripojené na nosiče. Tieto spôsoby sú v odbore známe a popisujú sa napríklad v US patente č. 4 708 871, Geysen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 3998 -4002 (1984) Geysen a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 178 - 182 (1985), Geysen a kol., Molec. Immunol., 23, 709 - 715 (1986). Týmito spôsobmi možno identifikovať rad epitopov HCV. Pozri napríklad Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320 - 324 (1994) a ďalšie práce nižšie. Podobne sa konformačné epitopy ľahko identifikujú stanovením priestorovej konformácie aminokyselín, napríklad rentgenovou kryštalografiou a dvojrozmernou nukleárnou magnetickou rezonanciou. Pozri napríklad Epitope Mapping Protocols, vyššie. Antigénne oblasti proteínov možno tiež identifikovať štandardným vynesením antigénneho správania a hydropatie, ako je to napríklad v programe Omíga verše 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program používa metódu Hopp/Woods, Hoop a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3824 - 3828 (1981) na stanovenie profilov antigénneho správania a Kyte - Doolittlovu techniku, Kyte a kol., J. Mol. Biol., 157, 105 132 (1982) na vynesenie hydropatie.

Pojem „konformačný epitop,,, ako sa tu používa, sa týka časti proteínu alebo proteínu plnej dĺžky alebo jeho analógu či muteínu, ktorý má štruktúrne

244/B charakteristiky natívne vzhľadom k aminokyselinovej sekvencií kódujúcej epitop v rámci prirodzeného proteínu plnej dĺžky. Natívne štruktúrne vlastnosti zahrňujú, avšak bez obmedzenia, glykozyláciu a trojrozmernú štruktúru. Dĺžka sekvencie definujúcej epitop môže byť predmetom širokých variácií, lebo sa uvažuje, že sa tieto epitopy tvoria trojrozmerným tvarom antigénu (napríklad skladaním). Preto môže byť aminokyselín definujúcich epitop relatívne málo, avšak môžu sa široko rozkladať pozdĺž dĺžky molekuly (alebo dokonca na rôznych molekulách v prípade dimérov, atď.) a privedú sa do správnej konformácie epitopu skladaním. Podiely antigénu medzi zvyškami definujúcimi epitop nemusia byť pre konformačnú štruktúru epitopu kritické. Napríklad delécia alebo substitúcia týchto zasahujúcich sekvencií nemusí ovplyvňovať konformačný epitop, pokiaľ sa zachovajú sekvencie kritické na konformáciu epitopu (napríklad cysteíny, ktoré sa zúčastňujú disulfidických väzieb, glykozylačné miesta, atď.).

Konformačné epitopy sa ľahko identifikujú s použitím vyššie popísaných spôsobov. Ďalej, prítomnosť či neprítomnosť konformačného epitopu v danom polypeptide možno ľahko stanoviť sreeningom daného antigénu s protilátkou (polyklonálne sérum alebo monoklonálne pre konformačný epitop) a porovnaním jeho reaktivity s reaktivitou denaturovanej verzie antigénu, ktorá zachováva iba lineárne epitopy (pokiaľ vôbec niektoré zachováva). Pri takomto screeningu s použitím polyklonálnych protilátok môže byť výhodné absorbovať polyklonálne sérum najprv s denaturovaným antigénom a pozorovať, či zachováva protilátky proti danému antigénu. Konformačné epitopy odvodené od oblastí E1 a E2 sa popisujú napríklad v medzinárodnej publikácii č. WO 94/01778.

244/B „Imunologická odpoveď,, na antigén HCV alebo kompozíciu znamená vývoj humorálnej a/alebo bunkovej imunitnej odpovede subjektu na molekuly prítomné v danej kompozícii. Na účely tohto vynálezu sa humorálna imunitná odpoveď týka imunitnej odpovede sprostredkovanej molekulami protilátky, zatiaľ čo „bunková imunitná odpoveď,, je taká, ktorá je sprostredkovaná Tlymfocytmi a/alebo inými bielymi krvinkami. Jedným dôležitým aspektom bunkovej imunity je antigén-špecifická odpoveď sprostredkovaná cytolytickými T-bunkami (,,CTL„). CTL sú špecifické pre peptidové antigény, ktoré sú prítomné v spojení s proteínmi kódovanými hlavným histokompatibilným komplexom (MHC) a exprimovanými na povrchoch buniek. CTL pomáhajú vyvolávať a podporovať intracelulárnu deštrukciu intracelulárnych mikróbov alebo cytolýzu buniek infikovaných týmito mikróbmi. Ďalším aspektom celulárnej imunity je antigén - špecifická odpoveď T-bunkovými helpermi. Tbunkové helpery pomáhajú stimulovať funkciu a zameriavať aktivitu nešpecifických efektorových buniek proti bunkám vykazujúcim peptidové antigény v spojení s molekulami MHC na ich povrchu. „Celulárna imunitná odpoveď,, sa tiež týka tvorby cytokínov, chemokínov a ďalších takýchto molekúl produkovaných aktivovanými T-bunkami a/alebo inými bielymi krvinkami vrátane tých, ktoré sú odvodené od CD4+ a CD8+ T-buniek. Kompozícia vakcíny, ktorá vyvoláva bunkovú imunitnú odpoveď, môže slúžiť na senzibilizáciu stavovca prezentáciou antigénu v spojení s MHC molekulami pri bunkovom povrchu. Imunitná odpoveď sprostredkovaná bunkami sa zameriava do blízkosti buniek alebo na bunky prezentujúce na svojom povrchu antigén. Navyše možno vytvárať antigén - špecifické T-lymfocyty kvôli umožneniu budúcej ochrany imunizovaného hostiteľa. Schopnosť daného antigénu stimulovať bunkami sprostredkovanú imunologickú odpoveď možno určiť radom analýz, ako je lymfoproliferácia (aktivácia lymfocytov), CTL cytotoxické eseje alebo stanovením T-lymfocytov špecifických pre antigén u senzibilizovaného subjektu. Tieto spôsoby sú v odbore dobre známe. Pozri napríklad Erikson a kol., J. Immunol., 151, 4189 - 4199 (1993), Doe a kol., Eur. J. Immunol., 24, 2369-2376 (1994).

244/B

Preto imunologická odpoveď, ako sa tu používa, môže byť taká, ktorá stimuluje tvorbu CTL a produkciu či aktiváciu T-bunkových helperov. Daný antigén môže tiež vyvolať imunitnú odpoveď sprostredkovanú protilátkou vrátane napríklad neutralizácie väzby (NOB) protilátok. Prítomnosť odpovede protilátky NOB možno ľahko stanoviť spôsobmi popísanými napríklad autormi Rosa a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 1759 (1996). Preto môže imunologická odpoveď zahrňovať jeden či viacero z nasledujúcich účinkov: tvorba protilátok B-bunkami a/alebo aktivácia supresorových T-buniek a/alebo gama delta T-buniek zameraných špecificky na antigén či antigény prítomné v kompozícii danej vakcíny. Tieto odpovede môžu slúžiť na neutralizáciu neúčinnosti a/alebo sprostredkovanie protilátkového komplementu alebo protilátkovo - dependentnej bunkovej cytotoxicity (ADCC) kvôli poskytnutiu ochrany či úľavy od symptómov imunizovaného hostiteľa. Takéto odpovede možno stanoviť s použitím štandardných imunoesejí a neutralizačných esejí dobre známych v odbore.

Pojem „imunostimulačná nukleotidová sekvencia,, alebo „ISS,„ ako sa tu používa, znamená polynukleotid, ktorý obsahuje aspoň jeden imunostimulačný oligonukleotidový (ISS - ODN) zvyšok. Tento ISS zvyšok je jednoduchá alebo dvojitá skrutkovnica DNA alebo RNA oligonukleotidu majúceho aspoň šesť nukleotidových báz, ktoré môžu zahrňovať alebo ktoré môžu tvoriť modifikovaný oligonukleotid či sekvenciu modifikovaných nukleozidov. Zvyšky ISS zahrňujú alebo sa môžu pripájať k molekule CG obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu alebo p(lC) nukleotidovú sekvenciu, ktorá môže byť palindromná. Cysteín môže byť metylovaný alebo nemetylovaný. Príklady konkrétnych ISS molekúl na použitie v tomto vynáleze zahrňujú CpG molekuly, o ktorých sa diskutuje ďalej nižšie, rovnako tak ako CpY a CpR molekuly a podobne.

Zložka HCV E1E2, ako je submikrónová emulzia olej vo vode alebo CpG oligonukleotid, posilňuje imunitnú odpoveď na antigén HCV E1E2 prítomný v kompozícii, ak kompozícia má väčšiu schopnosť vyvolávať imunitnú odpoveď ako je imunitná odpoveď vyvolaná ekvivalentným množstvom antigénu dodaného bez prídavnej zložky. Takáto posilnená imunita sa môže stanoviť podaním antigénovej kompozície za prítomnosti alebo bez prítomnosti ďalších

244/B zložiek a porovnaním titrov protilátok proti dvom použitým štandardným esejam, ako je rádioimunoesej a ELISA, dobre známe v odbore.

„Rekombinantný,, proteín je proteín, ktorý zachováva požadovanú aktivitu a ktorý sa pripraví spôsobmi rekombinantných DNA, ako sa tu popisuje. Všeobecne sa daný gén klonuje a potom sa exprimuje v transformovanom organizme, ako sa popisuje ďalej nižšie. Hostiteľský organizmus exprimuje cudzí gén so získaním proteínu za podmienok expresie.

Pojem „izolovaný,, pri odkaze na niektorý polypeptid znamená, že daná molekula je oddelená a diskrétna voči celému organizmu, v ktorom sa molekula nachádza v prírode alebo že je prítomná v podstate v neprítomnosti ďalších biologických makromolekúl toho istého typu. Pojem „izolovaný,, vzhľadom k polynukleotidu je molekula nukleovej kyseliny jednoduchá ako celok alebo časť sekvencií normálne spojených s jeho povahou alebo sekvenciou, ktorá existuje v prírode, avšak majúcou heterológne sekvencie alebo molekulu disasociovanú od chromozómu.

Pojem „ekvivalentný antigénny determinant,, znamená antigénny determinant z rôznych poddruhov či kmeňov HCV, ako sú kmene 1, 2, 3, atď. HCV, ktorého antigénne determinanty nie sú nevyhnutne identické následkom variácie sekvencie, avšak ktoré sa vyskytujú v ekvivalentných polohách v danej sekvencií HCV. Všeobecne budú mať aminokyselinové sekvencie ekvivalentných antigénnych determinantov vysoký stupeň sekvenčnej homológie, t.j. homológiu sekvencie aminokyselín viac ako 30 %, zvyčajne viac ako 40 %, viac ako 60 % a dokonca ešte viac ako 80 až 90 % homológie pri priradení oboch sekvencií.

„Homológia,, sa týka percentuálnej identity medzi dvoma polynukleotidmi alebo dvoma polypeptidovými zvyškami. Dve DNA alebo dve polypeptidové sekvencie sú „v podstate homológne,,, ak vykazujú aspoň 50 %, prednostne aspoň 75 %, lepšie aspoň 80 až 85 %, ešte lepšie aspoň 90 % a najlepšie aspoň 95 % až 98 % sekvenčnej identity pozdĺž definovanej dĺžky týchto molekúl. Pojem v podstate homológny, ako sa tu používa, sa tiež týka sekvencií vykazujúcich úplnú identitu s danou DNA alebo polypeptidovou sekvenciou.

244/B „Identita,, všeobecne znamená presnú zhodu nukleotid po nukleotide alebo aminokyselina po aminokyseline pre príslušné dve polynukleotidové alebo polypeptidové sekvencie. Percento identity možno stanoviť priamym porovnaním sekvenčnej informácie medzi dvoma molekulami priradením sekvencií, počítaním presného počtu súhlasu medzi dvoma priradenými sekvenciami, delením dĺžkou kratšej sekvencie a vynásobením výsledku číslom 100. Pri tejto analýze možno použiť ľahko dostupné počítačové programy, ako je ALIGN, M. O. Dayhoff v Atlas of Proteín Sequence and Structure, M. O. Dayhoff red., 5. Suppl., 3, 353 - 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, ktorá prispôsobuje algoritmus lokálnej homológie Smitha a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482 - 489 (1981) analýze peptidov. Programy na stanovenie nukleotidovej sekvenčnej identity sú k dispozícii vo Verzii 8 súboru Wisconsin Sequence Analysis Package (od Genetics Computer Group, Madison, WI) napríklad programy BESTFIT, FASTA a GAP, ktoré sa rovnako zakladajú na algoritme Smitha a Watermana. Tieto programy sa ľahko používajú s parametrami štandardného nastavenia odporučeným výrobcom a popísanými vo Wisconsin Sequence Analysis Package citovanom vyššie. Napríklad percentuálna identita danej nukleotidovej sekvencie s referenčnou sekvenciou sa stanoví s použitím algoritmu homológie Smitha a Watermana s tabuľkou skóre štandardného nastavenia a gap penalty šiestich nukleotidových polôh.

Ďalší spôsob zistenia percentuálnej identity v súvislosti s týmto vynálezom je použitie súboru programov MPSRCH s autorským právom University of Edinburgh vyvinutých John F. Collinsom a Shane S. Sturrokom a distribuovaných Intelli-Genetics, Inc. (Mountain View, CA). Z týchto súborov možno použiť Smithov - Watermanov algoritmus, kde sa používajú parametre štandardného nastavenia pre tabuľku skóre (napríklad gap open penalty 12, gap extension penalty 1 a gap 6). Z generovaných údajov hodnota „Match,, (zhody) odráža „sekvenčnú identitu,,. Ďalšie vhodné programy pre výpočet percentuálnej identity či podobnosti medzi sekvenciami sú všeobecne známe v odbore, napríklad ďalší program na priradenie je BLAST používaný s parametrami štandardného nastavenia. Napríklad možno použiť BLASTN a

244/B

BLASTP s použitím parametrov štandardného nastavenia: genetický kód = štandardný, filter = žiaden, vlákna = obe, skrátenie = 60, očakávanie - 10, matrica = BLOSUM62, popisy = 50 sekvencii, triedenie = HIGH SCORE, databáza = neredundantná, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podrobnosti o týchto programoch možno nájsť na nasledujúcej internetovej adrese: http: //www. nebi. n 1m.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternatívne možno homológiu stanoviť hybridizáciou polynukleotidov za podmienok, ktoré vytvárajú stabilné duplexy medzi homológnymi oblasťami s nasledujúcou digesciou jednovláknovo špecifickej nukleázy (nukleas) a stanovením veľkosti fragmentu po digescii. DNA sekvencie, ktoré sú v podstate homológne, možno identifikovať v Southernovom hybridizačnom experimente napríklad za prísnych podmienok definovaných pre daný systém. Definícia príslušných hybridizačných podmienok patrí do rámca skúseností v odbore. Pozri napríklad Sambrook a kol., vyššie, DNA Cloning, vyššie, Nucleic Acid Hybridization, vyššie.

II. Spôsoby uskutočnenia vynálezu

Pred podrobným popisom tohto vynálezu je potrebné si uvedomiť, že sa tento vynález neobmedzuje na konkrétnu formuláciu či procesné parametre a ako taký môže vykazovať odchýlky. Rovnako je potrebné si uvedomiť, že terminológia, ktorá sa tu používa, slúži iba na účely popisov jednotlivých vyhotovení tohto vynálezu a nepokladá sa za obmedzujúcu.

I keď v praxi tohto vynálezu možno použiť rad kompozícií a spôsobov podobných či ekvivalentných tým, ktoré sa tu popisujú, predkladá sa tu popis preferovaných látok a spôsobov.

Ako sa popisuje vyššie, zakladá sa tento vynález na objave, že antigény HCV E1E2 v kombinácii so submikrónovými emulziami olej vo vode bez MTPPE rovnako tak ako so submikrónovými emulziami olej vo vode a imunostimulačnými molekulami nukleových kyselín, ako sú CpG

244/B oligonukleotidy, poskytujú kompozície, ktoré vyvolávajú významne vyššie titry protilátok ako sú hodnoty pozorované bez týchto adjuvantných prostriedkov. Vyvolanie HCV-špecifických protilátok polypeptidmi E1E2 poskytujú systémy modelov in vitro a in vivo na vývoj HCV vakcín, hlavne na identifikáciu HCV E1, E2 a HCV E1E2 polypeptidových epitopov súvisiacich s tvorbou silných titrov protilátok proti E1, proti E2 a/alebo proti E1E2 a/alebo s celulárnou imunitnou odpoveďou zameranou proti HCV. E1E2 polypeptidy možno tiež použiť na získanie imunitnej odpovede proti HCV u cicavca, hlavne odpovede protilátky proti E1 proti E2 a/alebo proti E1E2 a/alebo celulárnej bunkovej odpovede pre buď terapeutické alebo profylaktické účely.

Kvôli ďalšiemu pochopeniu tohto vynálezu je nižšie poskytnutá podrobná diskusia ohľadom E1E2 polypeptidov na použitie v daných kompozíciách rovnako tak ako na prípravu submikrónových emulzií olej vo vode, imunostimulačných molekúl nukleových kyselín a kompozícií uvedených vyššie.

Polypeptidy E1E2

Ako sa popisuje vyššie, komplexy E1E2 na použitie s kompozíciami podľa tohto vynálezu zahrňujú polypeptidy E1 a E2 spojené buď nekovalentnými alebo kovalentnými interakciami. Genóm vírusu hepatitídy C obsahuje jednoduchý otvorený čítací rámec zhruba 9 600 nukleotidov, ktorý sa transkribuje do polyproteínu. Polyproteín HCV sa štiepi získaním radu oddelených produktov v poradí NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5aNS5b-COOH (pozri obrázok 1). Polypeptid HCV E1 je glykoproteín a je zhruba od aminokyseliny 192 do aminokyseliny 383 (číslovanie vzhľadom k polyproteínu HCV-1). Pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2451 2455 (1991). Aminokyseliny pri zhruba 173 až zhruba 191 predstavujú signálnu sekvenciu pre E1. Polypeptid HCV E2 je rovnako glykoproteín a vyskytuje sa zhruba od aminokyseliny 383 alebo 384 k aminokyseline 746.

Signálny peptid pre E2 začína zhruba pri aminokyseline 364 polyproteínu. Termín E1 „plnej dĺžky,, alebo „neskrátený,, E1, ako sa tu používa, sa teda týka polypeptidov zahrňujúcich aspoň aminokyseliny 192 až 383

244/B polyproteínu HCV (číslovanie vzhľadom k HCV-1). Vzhľadom k E2 pojem plnej dĺžky alebo neskrátený, ako sa tu používa, sa tu týka polypeptidov, ktoré zahrňujú aspoň aminokyseliny 383 alebo 384 až 746 polyproteínu HCV (číslovanie vzhľadom k HCV-1). Ako bude zrejmé z tohto popisu, môžu polypeptidy E2 na použitie v tomto vynáleze zahrňovať ďalšie aminokyseliny z oblasti p7, ako sú aminokyseliny 747 až 809.

Ako sa popisuje vyššie, existuje E2 vo forme viacerých zložiek (Spaete a kol., Virol., 188, 819 - 830 (1992), Selby a kol., J. Virol., 70, 5177 - 5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385 - 1395 (1993), Tomei a kol., J. Virol., 67, 4017 - 4026 (1993)) a môže dochádzať k odstrihnutiu a proteolýze na koncoch N a C polypeptidov E1 a E2. Preto môže polypeptid E2 pre toto použitie obsahovať aspoň aminokyseliny 405 až 661, napríklad 400, 401, 402, ... až 661, ako je 383 alebo 384 až 661, 383 alebo 384 až 715, 383 alebo 384 až 746, 383 alebo 384 až 749 alebo 383 alebo 384 až 809 alebo 383 alebo 384 u akéhokoľvek konca C medzi 661 až 809 polyproteínu HCV s číslovaním vzhľadom k polyproteínu plnej dĺžky HCV-1. Podobne môžu preferovateľné E1 polypeptidy pre toto použitie obsahovať aminokyseliny 192 až 326, 192 až 330, 192 až 333, 192 až 360, 192 až 363, 192 až 383 alebo 192 u ktoréhokoľvek konca C medzi 326 a 383 polyproteínu HCV.

Komplexy E1E2 možno tiež pripraviť z imunogénnych fragmentov E1 a E2 obsahujúcich epitopy. Napríklad fragmenty polypeptidov E1 môžu obsahovať od zhruba 5 do takmer plnej dĺžky molekuly, ako je 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 185 alebo viac aminokyselín polypeptidu E1 alebo akékoľvek celé číslo medzi týmito vymenovanými číslami. Podobne fragmenty polypeptidov E2 môžu obsahovať 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 alebo 350 aminokyselín polypeptidu E2 alebo akékoľvek celé číslo medzi týmito vymenovanými číslami. Polypeptidy E1 a E2 môžu byť od rovnakých alebo rozdielnych kmeňov HCV.

Napríklad epitopy odvodené od hypervariabilnej oblasti E2, ako je oblasť rozmedzia aminokyselín 384 až 410 alebo 390 až 410, sa môžu zahrnúť do polypeptidu E2. Zvlášť efektívny epitop E2 na inkorporáciu do sekvencie E2 je

244/B taký, ktorý zahrňuje sekvenciu konzensu odvodenú z tejto oblasti, ako je sekvencia konzensu Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-LeuPhe-Ala-Pro-Giy-Ala-Lys-Gln-Asn, ktorá predstavuje sekvenciu konzensu pre aminokyseliny 390 až 410 genómu typu 1 HCV. Sú známe ďalšie epitopy E1 a E2 a popisujú sa napríklad v Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365.

Navyše komplexom polypeptidov E1 a E2 môže chýbať celá doména prekleňujúca membránu alebo jej časť. Sekvencie membránového ukotvenia slúžia na pripojenie polypeptidu k endoplazmatickému retikulu. Normálne sú tieto polypeptidy schopné sekrécie do rastového média, v ktorom sa pestuje organizmus exprimujúci proteín. Avšak, ako sa popisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 98/50556, možno tieto polypeptidy získavať intracelulárne. Sekrécia do rastového média sa ľahko stanoví s použitím radu detekčných spôsobov, vrátane napríklad polyakrylamidovej gélovej elektroforézy a podobne a imunologických spôsobov, ako sú imunoprecipitačné analýzy, ako popisuje napríklad medzinárodná publikácia č. WO 96/04301 vydaná 15. februára 1996. Pre E1 všeobecne polypeptidy končiace okolo aminokyselinovej polohy 370 a vyššie (podľa číslovania HCV-1 E1) sa zadržia ER, a preto sa nevylučujú do rastového média. Pre E2 polypeptidy končiace okolo aminokyselinovej polohy 731 a vyššie (rovnako podľa číslovania sekvencie HCV-1 E2) sa zadržia ER a nevylučujú sa. (Pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 96/04301, vydaná 16. februára 1996) Je potrebné poznamenať, že tieto aminokyselinové polohy nie sú absolútne a môžu sa do určitého stupňa meniť. Preto tento vynález predpokladá použitie polypeptidov E1 a E2 udržiavajúcich transmembránovú väzbovú doménu, rovnako tak ako polypeptidov, ktorým chýba časť alebo celá transmembránová väzbová doména vrátane E1 polypeptidov končiacich okolo aminokyselín 369 a nižšie a E2 polypeptidov končiacich okolo aminokyselín 730 a nižšie takým spôsobom, že spadajú do tohto vynálezu. Ďalej možno C-terminálne skrátenie rozšíriť mimo transmembránovú prekleňujúcu membránu smerom ku koncu N. Preto napríklad skrátenie E1 v polohách nižších ako napríklad 360 a skrátenie E2 v polohách nižších ako napríklad 715 rovnako patri do tohto vynálezu. Je iba

244/B nevyhnutné to, aby skrátené polypeptidy E1 a E2 zostali funkčnými pre zamýšľané úlohy. Avšak hlavne preferované skrátené E1 konštrukty sú tie, ktoré neprekračujú aminokyselinu 300. Väčšina preferovaných sú tie, ktoré končia v polohe 360. Preferované skrátené E2 konštrukty sú tie, ktorých Cterminálne skrátenie neprekračuje polohu aminokyseliny 715. Obzvlášť preferované skrátenie E2 predstavujú tie molekuly, ktoré sú skrátené po akejkoľvek aminokyseline 715 až 730, ako je 725. Pokiaľ sa použijú skrátené molekuly, preferuje sa použitie molekúl E1 a E2, ktoré sú obe skrátené.

Polypeptidy E1 a E2 a ich komplexy môžu byť tiež prítomné ako azialoglykoproteíny. Tieto azialoglykoproteíny sa tvoria spôsobmi známymi v odbore, ako je použitie buniek s blokovanou terminálnou glykozyláciou. Keď sa tieto proteíny exprimujú v týchto bunkách a izolujú GNA lektínovou afinitnou chromatografiou, agregujú proteíny E1 a E2 spontánne. Podrobné spôsoby prípravy týchto agregátov E1E2 sa popisujú napríklad v US patente č. 6 074 852.

Ďalej môžu byť komplexy E1E2 prítomné ako heterogénna zmes molekúl následkom odrezávania a proteolytického štiepenia, ako sa popisuje vyššie. Preto môžu komplexy vrátane E1E2 zahrňovať viacpočetné zložky E1E2, ako je E1E2 končiaca pri aminokyseline 746 (Ε1Ε2₇4θ), E1E28 končiaca pri aminokyseline 809 (E1E2₈og) a akékoľvek ďalšie molekuly E1 a E2 popísané vyššie, ako sú E2 molekuly s N-terminálnym skrátením od 1 do 20 aminokyselín, ako sú zložky E2 začínajúc aminokyselinou 387, aminokyselinou 402, aminokyselinou 403, atď.

244/B

Komplexy E1E2 sa ľahko získavajú rekombinantne, buď ako hybridné proteíny alebo napríklad kotransfekciou hostiteľských buniek s konštruktmi kódujúcimi dané E1 a E2 polypeptidy. Kotransfekciu možno uskutočniť buď v polohe trans alebo cis, t.j. použitím rôznych vektorov alebo použitím jedného vektoru, ktorý nesie oba gény E1 a E2. Pri použití jedného vektora možno oba gény riadiť jedným súborom kontrolných prvkov alebo alternatívne môžu byť gény prítomné na vektore v jednotlivých expresných kazetách riadených jednotlivými kontrolnými elementmi. Po expresii sa E1 a E2 proteíny spontánne spájajú. Alternatívne možno vytvárať komplexy miešaním jednotlivých proteínov navzájom, ktoré boli vytvorené oddelene, buď v purifikovanej alebo semipurifikovanej forme alebo dokonca zmiešaním médií, v ktorých sa pestovali hostiteľské bunky exprimujúce proteíny, pokiaľ sa proteíny vylučujú. Konečne možno komplexy E1E2 podľa tohto vynálezu exprimovať ako hybridný proteín, kde sa požadovaná časť E1 pripája na požadovanú časť E2.

Spôsoby tvorby komplexov E1E2 z plnej dĺžky, zo skrátených proteínov E1 a E2, ktoré sa vylučujú do média, rovnako tak ako z intracelulárne získaných skrátených proteínov sú známe v odbore. Takéto komplexy možno napríklad získať rekombinantne, ako popisuje US patent č. 6 121 020, Ralston a kol., J. Virol., 67, 6753 - 6761 (1993) Grakoui a kol., 67, 1385 - 1395 (1993) a Lanford a kol., Virology, 197, 225 až 235 (1993).

Polynukleotidy kódujúce polypeptidy E1 a E2 HCV na použitie v tomto vynáleze možno teda získavať štandardnými spôsobmi molekulárnej biológie. Napríklad polynukleotidové sekvencie kódujúce vyššie popisované molekuly možno získať rekombinantnými spôsobmi, ako je screening cDNA a genómovej knižnice z buniek exprimujúcich gén alebo odvodením génu od vektora, o ktorom je známe, že ich obsahuje. Ďalej možno požadovaný gén izolovať priamo z molekúl vírusových nukleových kyselín spôsobmi popisovanými v odbore napríklad v Hougthon a kol., US patent č. 5 350 671. Daný gén možno tiež získať synteticky skôr ako klonovať. Molekuly sa môžu konštruovať príslušnými kodónmi pre danú sekvenciu. Úplná sekvencia sa potom zostaví z presahujúcich oligonuklidov pripravených štandardnými spôsobmi a

244/B zostavených do úplnej kódovacej sekvencie. Pozri napríklad Edge, Náture, 292, 756 (1981). Nambair a kol., Science, 223, 1299 (1984) a Jay a koľ, J. Biol. Chem., 259, 6311 (1984).

Dané nukleotidové sekvencie možno teda získať z vektorov uchovávajúcich príslušné sekvencie alebo pripraviť synteticky úplne alebo čiastočne s použitím rôznych spôsobov syntézy oligonukleotidov známych v odbore, ako je mutagenéza zameraná na miesto a spôsobmi polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) tam, kde je to vhodné. Pozri napríklad Sambrook, vyššie. Konkrétne jedným spôsobom získania nukleotidovej sekvencie kódujúcej požadované sekvencie je spájanie komplementárnych súborov presahujúcich syntetických oligonukleotidov získaných v konvenčnom automatizovanom syntetizátore polynukleotidov s následnou ligáciou príslušnou DNA ligázou a amplifikáciou ligovanej nukleotidovej sekvencie prostredníctvom PCR. Pozri napríklad Jayaraman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 4084 4088 (1991). Navyše možno použiť syntézu smerovanú na oligonukleotid (Jones a koľ, Náture, 54, 75 - 82 (1986)), mutagenézu vopred existujúcich nukleotidových regiónov orientovanú na oligonukleotidy (Riechmann a koľ, Náture, 332, 323 - 327 (1988) a Verhoeyn a koľ, Science, 239, 1534 - 1536 (1988)) a enzymatické zapĺňanie oligonukleotidov s medzerami s použitím T₄DNA polymerázy (Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029 10033 (1989)) so získaním molekúl majúcich pozmenené či zvýšené schopnosti väzby antigénu a imunogénne vlastnosti.

Keď sa kódujúce sekvencie pripravia či izolujú, môžu sa klonovať do akéhokoľvek vhodného vektoru či replikónu. Mnohé klonovacie vektory sú známe tomu, kto je skúsený v odbore a výber príslušného klonovacieho vektoru je otázkou voľby. Vhodné vektory zahrňujú, avšak bez obmedzenia, plazmidy, fágy, transpozóny, kozmidy, chromozómy alebo vírusy, ktoré sú schopné replikácie pri spojení so správnymi kontrolnými elementmi.

Kódovacia sekvencia sa potom privedie pod kontrolu vhodných kontrolných elementov v závislosti od systému, ktorý sa má použiť na expresiu. Kódovacia sekvencia sa môže uviesť pod kontrolu promótoru, väzbového

2₄4/B miesta ribozómov (pre bakteriálnu expresiu) a prípadne operátora, takže sa daná sekvencia DNA transkribuje do RNA vhodným transformantom. Kódovacia sekvencia môže a nemusí obsahovať signálny peptid vedúcej sekvencie, ktorý sa môže potom odstrániť hostiteľom pri posttranslačnom spracovaní. Pozri napríklad US patent č. 4 431 739, 4 425 437, 4 338 397.

Navyše sa môžu požadovať kontrolné sekvencie na pridanie regulačných sekvencií, ktoré umožňujú reguláciu expresie sekvencií vzhľadom k rastu hostiteľskej bunky. Regulačné sekvencie sú známe tomu, kto je skúsený v odbore a príklady zahrňujú tie, ktoré spôsobujú zapnutie alebo vypnutie expresie génu ako odpoveď na chemický či fyzikálny podnet vrátane prítomnosti regulačnej zlúčeniny. Ďalšie typy regulačných elementov môžu byť rovnako prítomné vo vektore. Napríklad enhancerové elementy možno tu použiť na zvýšenie hladín expresie konštruktov. Príklady zahrňujú skorý génový enhancer SV40 (Dijkema a kol., EMBO J., 4, 761 (1985)), enhancer/promótor odvodený od dlhého terminálneho opakovania (LTR) vírusu Rousovho sarkómu (Gorman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6777 (1982)) a elementy odvodené od ľudského CMV (Boshart a kol., Celí, 41, 521 (1985)) ako elementy, ktoré sú súčasťou sekvencie CMV intrónu A (US patent č. 5 688 688). Expresná kazeta môže ďalej zahrňovať spôsob replikácie pre autonómnu replikáciu vo vhodnej hostiteľskej bunke, jeden či viacero voliteľných markérov, jedno či viacero reštrikčných miest, možnosť vysokého počtu kópií a silný promótor.

Expresný vektor sa konštruuje takým spôsobom, že sa vo vektore umiestni príslušná kódovacia sekvencia s príslušnými regulačnými sekvenciami, pričom umiestnenie a orientácia kódovacej sekvencie vzhľadom ku kontrolným sekvenciám je také, že sa kódovacia sekvencia transkribuje pod „kontrolou,, kontrolnej sekvencie (t.j. RNA polymeráza, ktorá sa viaže na molekulu DNA pri kontrolných sekvenciách, transkribuje kódovaciu sekvenciu). Modifikácia sekvencií kódujúcich danú molekulu môže byť žiaduca na tento účel. Napríklad v niektorých prípadoch môže nastať nutnosť modifikovať sekvenciu tak, aby ju bolo možné pripojiť ku kontrolným sekvenciám v príslušnej orientácii, t.j. udržiavať čítací rámec. Kontrolná sekvencia a ďalšie

244/B sekvencie možno ligovať s kódovacou sekvenciou pred vložením do vektoru. Alternatívne možno kódovaciu sekvenciu kódovať priamo do expresného vektoru, ktorý už obsahuje kontrolné sekvencie a príslušné reštrikčné miesto.

Ako sa vysvetľuje vyššie, môže byť tiež vhodné vytvárať mutanty či analógy daného polypeptidu. Mutanty alebo analógy HCV polypeptidu na použitie v týchto kompozíciách možno pripraviť deléciou časti sekvencie kódujúcej daný polypeptid, inzerciou sekvencie a/alebo substitúciou jedného či viacerých nukleotidov v rámci sekvencie. Spôsob modifikácie nukleotidových sekvencií, ako je mutagenéza zameraná na miesto a podobne, sú dobre známe skúsenému odborníkovi v odbore. Pozri napríklad Sambrook a koľ, vyššie, T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 448 (1985), Geisselsoder a kol., BioTechniques, 5, 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol., 100, 468 (1983), Dalbie - McFarland a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982).

Molekuly možno exprimovať širokým rozmedzím systémov vrátane hmyzích, cicavčích, bakteriálnych, vírusových a kvasinkových expresných systémov napospol dobre známych v odbore.

Napríklad expresné systémy hmyzích buniek, ako sú bakulovírusové systémy, sú dobre známe tomu, kto je skúsený v odbore a popisujú sa napríklad v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555 (1987). Materiály a spôsoby systémov expresie buniek bakulovírusov/hmyzu sú komerčne dostupné vo forme súprav okrem iného od Invitrogen, San Diego CA („MaxBac,, git). Podobne systémy expresie bakteriálnych a cicavčích buniek sú dobre známe v odbore a popisujú sa napríklad v Sambrook a kol., vyššie. Kvasinkové expresné systémy sú rovnako známe v odbore a popisujú sa napríklad v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., red., 1989) Butterworths, Londýn.

Rovnako je známy rad príslušných hostiteľských buniek na použitie so systémami vyššie. Napríklad cicavčie bunkové línie sú známe v odbore a zahrňujú imortalizované bunkové línie od American Type Culture Collection (ATCC), ako sú, avšak bez obmedzenia, bunky ovárií čínskeho škrečka (CHO), HeLa bunky, bunky ľadvín mláďat škrečka (BHK), bunky ľadvín opíc (COS),

244/B ľudské embryonálne bunky ľadvín, bunky ľudského hepatocelulárneho karcinómu (napríklad Hep G2), bunky bovínnej ľadviny Madin - Darby (,,MDBK„) a ďalšie. Podobne bakteriálni hostitelia, ako je E. coli, Bacillus subtilis a Streptococcus spp., sú použiteľní s týmito expresnými konštruktami. Kvasinkoví hostitelia použiteľní v tomto vynáleze zahrňujú okrem iného Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoria, Schizosaccaromyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzie bunky na použitie s bakulovirusovými expresnými vektormi zahrňujú okrem iného Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ni.

Molekuly nukleových kyselín obsahujúce dané nukleotidové sekvencie možno stabilne integrovať do genómu hostiteľskej bunky alebo udržiavať na stabilnom episomálnom elemente vo vhodnej hostiteľskej bunke s použitím rôznych spôsobov dodávky génu dobre známych v odbore, pozri napríklad US patent č. 5 399 346.

V závislosti od zvoleného expresného systému a hostiteľa sa molekuly tvoria rastúcimi hostiteľskými bunkami transformovanými expresným vektorom popísaným vyššie za podmienok, pri ktorých sa tento proteín exprimuje. Expresný proteín sa potom izoluje z hostiteľských buniek a purifíkuje. Pokiaľ expresný systém vylučuje proteín do rastového média, možno produkt purifikovať priamo z tohto média. Pokiaľ sa nevylučuje, môže sa izolovať z bunkových lyzátov. Voľba príslušných rastových podmienok a spôsobov získavania patrí do rámca skúseností v odbore.

Kompozície

Keď sa antigény E1E2 pripravia, v kompozíciách sa môžu použiť vakcíny napríklad v profylaktických (t.j. na zabránenie infekcie) alebo terapeutických (na liečenie HCV po infekcii) vakcínach. Tieto vakcíny môžu zahrňovať zmesi jedného či viacerých komplexov E1E2, ako sú komplexy E1E2 odvodené od viacerých ako jedného vírusového izolátu rovnako tak ako od ďalších antigénov HCV. Ďalej, ako sa popisuje vyššie, sa môžu komplexy E1E2 prezentovať ako

244/B heterogénna zmes molekúl odstrihovaním a proteolytickým štiepením. Kompozícia obsahujúca komplexy E1E2 môže teda obsahovať viacero zložiek E1E2, ako je E1E2 končiaca pri aminokyseline 746 (E1E2₇₄₆), E1E28 končiaca pri aminokyseline 809 (E1E2₈o9) alebo ktorákoľvek z rôznych molekúl E1 a E2 popisovaných vyššie, ako sú molekuly E2 s N-terminálnym skrátením o 1 až 20 aminokyselín, ako sú zložky E2 začínajúce pri aminokyseline 387, aminokyseline 402, aminokyseline 403, atď.

Tieto vakcíny možno podávať v spojení s inými antigénmi a imunoregulačnými prostriedkami, napríklad imunoglobulínmi, cytokínmi, lymfokínmi a chemokínmi vrátane, avšak bez obmedzenia, cytokínov ako je IL2, modifikovaný IL-2 (cys125 -> ser125), GM-CSF, IL-12, gama - interferón, IP10, MlPlbeta, FLP-3, ribavirín a RANTES.

Vakcíny všeobecne zahrňujú jeden či viacero „farmaceutických pomocných látok či vehikúi,,, ako je voda, fyziologický roztok, glycerol, etanol, atď. Navyše v týchto vehikulách môžu byť pomocné látky, ako sú zmáčacie a emulgačné prostriedky, látky pufrujúce pH a podobne.

Prípadne je prítomný nosič, čo je molekula, ktorá samotná neindukuje tvorbu protilátok škodlivých subjektu, ktorý dostane túto kompozíciu. Vhodnými nosičmi sú zvyčajne veľké, pomaly metabolizované makromolekuly, ako sú proteíny, polysacharidy, polymliečne kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerizačné aminokyseliny, aminokyselinové kopolyméry, lipidové agregáty (ako sú kvapôčky oleja či liposómy) a inaktívne vírusové častice. Tieto nosiče sú dobre známe bežne skúsenému v odbore. Ďalej sa môže HCV polypeptid pripájať na bakteriálny toxoid, ako je toxoid diftérie, tetanu, cholery, atď.

Ak sa tu popisuje, môžu byť v tej istej kompozícii na zvýšenie imunitnej odpovede submikrónové emulzie olej vo vode a/alebo ISS, ako sú CpG oligonukleotidy (popisované ďalej nižšie). Môžu byť tiež prítomné ďalšie adjuvantné látky ako sú, avšak bez obmedzenia (1) hlinité soli (alum), ako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitý, atď., (2) adjuvantný systém Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), obsahujúci 2 % skvalénu, 0,2 % Tween 80 a jednu či viacero komponentov bakteriálnej bunkovej steny zo

244/B skupiny zahrňujúcej monofosforyllipid A (MPL), trehalóza - dimykolát (TDM) a skelet bunkovej steny (CWS), prednostne MPL + CWS (Detox™), (3) saponínové adjuvantné látky, ako je QS21 alebo Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, M) použité ako častice vytvorené ako ISCOM (imunostimulačné komplexy), ktoré môžu byť bez prídavných detergentov (pozri napríklad medzinárodnú publikáciu č. WO 00/07621), (4) úplné Freundovo adjuvans (CFA) a neúplné Freundovo adjuvans (IFA), (5) cytokíny, ako sú interleukíny, ako je IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, atď. (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 99/44636), interferóny, ako je gama interferón, makrofágový faktor stimulujúci tvorbu kolónií (M-CSF), faktor nekrózy tumoru (TNF), atď., (6) detoxifikované mutanty a bakteriálny ADP-ribozylačný toxín, ako je toxín cholery (CT), toxín čierneho kašľa (PT) alebo tepelne labilný toxín E. coli (LT), hlavne LT-K36 (kde sa substituuje lyzín namiesto prirodzenej aminokyseliny v polohe 63), LT-R72 (kde sa substituuje arginín namiesto prirodzenej aminokyseliny v polohe 72), CT S109 (kde sa substituuje serín namiesto prirodzenej aminokyseliny v polohe 109) a PT-K9/G129 (kde sa substituuje lyzín namiesto prirodzenej aminokyseliny v polohe 9 a glycín v polohe 129) (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 93/13202 a WO 92/19265), (7) monofosforyllipid A (MPL) alebo 3-O-deacylovaný MPL (3dMPL) (pozri napríklad GB 2220221, EPA 0689454), prípadne v podstate v neprítomnosti alum (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. 00/56358), (8) kombinácia 3dMPL napríklad s QS21 a/alebo emulziami olej vo vode (pozri napríklad EPA 0835318, EPA 0735898, EPA 0761231), (9) polyoxyetylénéter alebo polyoxyetylénester (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 99/52549), (10) saponín a imunostimulačný oligonukleotid, ako je CpG oligonukleotid (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 00/62800), (11) niektorý imunostimulant a častice kovovej soli (pozri napríklad medzinárodnú publikáciu č. WO 00/23105), (12) saponín a emulzia olej vo vode (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 99/11241), (13) saponín (napríklad QS21) + 3dMPL + IL-12 (prípadne + sterol) (pozri napríklad medzinárodná publikácia č. WO 98/57659) a (14) ďalšie látky pôsobiace ako imunostimulačné prostriedky na zvyšovanie účinnosti kompozície.

244/B

Muramylové peptidy zahrňujú, avšak bez obmedzenia N-acetylmuramylL-treonyl-D-izoglutamín (thr-MDP), N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-izoglutam (nor-MDP), acetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(1' ,2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), atď.

Zvyčajne sa vakcínové kompozície pripravujú ako injekčné látky, buď ako kvapalné roztoky či suspenzie. Možno tiež pripravovať tuhé formy vhodné na rozpustenie či suspendovanie v kvapalných vehikulách pred injekčným podávaním.

Tieto vakcíny obsahujú terapeuticky účinné množstvo komplexov E1E2 a ktorúkoľvek z ďalších viacerých popisovaných komponentov podľa potreby. „Terapeuticky účinné množstvo,, znamená množstvo proteínu E1E2, ktoré vyvolá imunologickú odpoveď, prednostne protektívnu imunologickú odpoveď u subjektu, ktorému sa podá. Táto odpoveď všeobecne povedie k rozvoju u tohto subjektu sekrečno - bunkovej a/alebo protilátkou sprostredkovanej imunitnej odpovede na vakcínu. Zvyčajne táto odpoveď zahrňuje, avšak bez obmedzenia, jeden či viacero z nasledujúcich účinkov: tvorbu protilátok ktorejkoľvek imunologickej triedy, ako sú imunoglobulíny A, D, E, G alebo M, proliferáciu B a T lymfocytov, zaistenie aktivácie rastu a diferenciačných signálov pre imunologické bunky, expanzia helperových T-buniek, supresorových T-buniek a/alebo cytotoxických T-buniek a/alebo gama delta T bunkových populácií.

Pripravené vakcíny sa podávajú konvenčným spôsobom parenterálne, napríklad injekciou, buď subkutánne alebo intramuskulárne. Ďalšie formulácie pre iné spôsoby podávania zahrňujú perorálne a pľúcne formulácie, čapíky a transdermálne spôsoby aplikácií. Rozpis dávok môže byť jednodávkový či viacdávkový. Prednostne je účinné množstvo dostatočné na to, aby poskytlo liečenie či prevenciu symptómov ochorenia. Presné potrebné množstvo sa bude meniť v závislosti od liečeného subjektu, veku a všeobecného stavu jednotlivca, ktorý sa má liečiť, kapacity imunitného systému jednotlivca na tvorbu protilátok, stupňa požadovanej protekcie, závažnosti liečeného stavu, konkrétneho zvoleného polypeptidu E1E2 a spôsobu jeho podávania okrem iných faktorov. Príslušné účinné množstvo môže ľahko stanoviť skúsený

244/B odborník. „Terapeuticky účinné množstvo,, bude v relatívne širokom rozmedzí, ktoré možno stanoviť rutinnými skúškami na modeloch in vitro a in vivo známych v odbore. Množstvo polypeptidov E1E2 použitých v príkladoch nižšie poskytuje všeobecné vodidlo, ktoré možno použiť na optimalizáciu vyvolania protilátok proti E1, proti E2 a proti E1E2.

Hlavne možno komplex E1E2 prednostne podávať intramuskulárne väčšiemu cicavcovi, ako je primát, napríklad paviánovi, šimpanzovi alebo človeku v dávke zhruba 0,1 pg až 5,0 mg na jednu dávku alebo v množstve medzi hodnotami, ako je 0,5 pg až zhruba 1,0 mg, 1 pg až zhruba 500 pg, 2,5 pg až zhruba 250 pg, 4 pg až zhruba 200 pg, ako je 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ... 20, ... 30,. ... 40, ... 50, ... 60, ... 70, ... 80, ... 90, ... 100, atď. pg na jednu dávku. Polypeptidy E1E2 možno podávať buď cicavcovi, ktorý sa neinfikuje HCV alebo ich možno podávať cicavcovi infikovanému HCV.

Podávanie polypeptidov E1E2 môže vyvolať titer protilátok proti E1, proti E2 a/alebo proti E1E2 po dobu aspoň 1 týždeň, 2 týždne, 1 mesiac, 2 mesiace, 3 mesiace, 4 mesiace, 6 mesiacov, 1 rok alebo dlhšie. Polypeptidy E1E2 možno tiež podávať kvôli zaisteniu pamäťovej odpovede. Pokiaľ sa dosiahne takáto odpoveď, môže titer protilátok klesať v priebehu času, avšak expozícia vírusu HCV alebo imunogénu vedie k rýchlej indukcii protilátok, napríklad počas len niekoľkých dní. Prípadne možno titre protilátok uvažovať u cicavca zaistením jednej či viacerých posilňovacích injekcií polypeptidov E1E2 2 týždne, 1 mesiac, 2 mesiace, 3 mesiace, 4 mesiace, 5 mesiacov, 6 mesiacov, 1 rok alebo dlhšie po prvej injekcii.

Prednostne vyvoláva polypeptid E1E2 titer protilátok aspoň 10, 100, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 10 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000 (titer geometrického priemeru) alebo viac alebo akúkoľvek hodnotu medzi týmito titrami, ako sa stanoví s použitím štandardnej imunoeseje, ako je imunoesej popisovaná v príkladoch nižšie. Pozri napríklad Chien a kol., Lancet, 342, 933 (1993) a Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 10011 (1992).

244/B

Submikrónové emulzie olej vo vode

Ako sa popisuje vyššie, môžu sa submikrónové prostriedky vo forme emulzie olej vo vode podávať stavovcovi buď pred, súčasne s, a/alebo následne po dodávke antigénu E1E2. Submikrónové emulzie olej vo vode na toto použitie zahrňujú netoxické metabolizovateľné oleje a komerčné emulgátory. Príklady netoxických metabolizovateľných olejov zahrňujú bez obmedzenia rastlinné oleje, rybie oleje, živočíšne oleje alebo synteticky pripravené oleje. Preferujú sa rybie tuky, ako je olej ztresčej pečene, olej zo žraločej pečene a veľrybie tuky, hlavne sa preferuje skvalén, 2,6,10,15,19,23hexametyl-2,6,10,14,18,22-tetrakozahexán prítomný v tuku žraločej pečene. Táto tuková zložka bude prítomná v množstve od zhruba 0,5 do zhruba 20 objemových %, prednostne v množstve až 15 %, prednostnejšie v množstve od zhruba 1 % do zhruba 12 % a najlepšie od 1 % do 4 % tuku.

Vodný podiel adjuvantného prostriedku môže byť pufrovaný fyziologický roztok alebo čistá voda. Pretože sa kompozície predpokladajú na parenterálne podávanie, je lepšie pripraviť konečné roztoky tak, aby tonicita, t.j. osmolalita, bola v podstate rovnaká ako u normálnych fyziologických roztokov, aby sa zabránilo opuchom či rýchlej absorpcii po podaní kompozície následkom rôznych iónových koncentrácií medzi kompozíciou a fyziologickými kvapalinami. Pokiaľ sa používa skôr fyziologický roztok ako voda, je lepšie ju pufrovať kvôli udržaniu pH kompatibilného s normálnymi fyziologickými podmienkami. V niektorých prípadoch môže byť tiež nevyhnutné udržiavať pH na konkrétnej hladine kvôli zaisteniu stability určitých zložiek kompozície. Preto bude pH kompozície všeobecne 6 až 8 a bude sa udržiavať s použitím ktoréhokoľvek fyziologicky prijateľného pufra, ako je fosfátový, acetátový, tris, bikarbonátový, karbonátový či podobne. Množstvo vodného prostriedku bude všeobecne množstvo nevyhnutné na doplnenie kompozície do požadovaného konečného objemu.

Emulgačné prostriedky vhodné na použitie vo formuláciách olej vo vode zahrňujú bez obmedzenia neiónovo povrchovo aktívne látky na báze sorbitanu, ako je sorbitan mono-, di- alebo triester, napríklad tie, ktoré sú komerčne

244/B dostupné pod názvom Span™ alebo Arlacel™, ako je Span 85™ (sorbitan trioleát), polyoxyetylénsorbitan mono-, di- alebo triestery komerčne známe pod názvom Tween™, ako je Tween 80™ (polyoxyetylénsorbitan - monooleát), polyoxyetylénové mastné kyseliny dostupné pod názvom Myrj™, étery polyoxyetylénových mastných kyselín odvodené od lauryl-, acetyl-, stearyl- a oleylalkoholov, ako sú tie, ktoré sú známe pod názvom Brij™ a podobne. Tieto látky sú ľahko dostupné od radu komerčných zdrojov vrátane Sigma, St. Louis, MO a ICI America's Inc., Wilmington, DE. Tieto emulgačné prostriedky možno použiť samotné alebo v kombinácii. Emulgačný prostriedok bude zvyčajne prítomný v množstve 0,02 % až 2,5 % hmotnostných % (hmotnosť/objem), prednostne 0,05 % až zhruba 1 % a najlepšie 0,01 % až zhruba 0,5 %. Toto prítomné množstvo bude všeobecne okolo 20 až 30 hmotnostných % v použitom oleji.

Emulzie môžu tiež obsahovať ďalšie imunostimulačné prostriedky, ako sú muramylpeptidy vrátane, avšak bez obmedzenia, N-acetylmuramyl-Ltreonyl-D-izoglutamín (thr-MDP), N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-izoglutám (nor-MDP), acetyl-muramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), atď. Môžu tiež byť prítomné imunostimulačné zložky bakteriálnej bunkovej steny, ako je monofosforyllipid A (MPL), trehalóza - dimykolát (TDM) a skelet bunkovej steny (CWS). Alternatívne môžu byť emulzie bez týchto prostriedkov, ako sú emulzie bez MTP-PE. Submikrónové emulzie olej vo vode podľa tohto vynálezu môžu byť tiež bez polyoxypropylén - polyoxyetylénových (POP-POE) blokových kopolymérov. Na popis rôznych vhodných submikrónových formulácií olej vo vode na použitie podľa tohto vynálezu rovnako tak ako imunostimulačných prostriedkov pozri napríklad medzinárodnú publikáciu č. 90/14837, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. vydanie, 1995, Van Nest a kol., „Advanced adjuvant formulations for use with recombinant subunit vaccines,,, vo Vaccines 92, Modern Approaches to New Vaccines (Brown a kol., red.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, str. 57 - 62 (1992), Ott a kol., „MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines,, vo Vaccine

244/B

Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.), Plénum Press, New York (1995), str. 277 - 296 a US patent č. 6 299 884.

Na tvorbu submikrónových častíc, t.j. častíc menších ako 1 pm v priemere a častíc v nanometrovom rozmedzí rozmerov, možno použiť rad spôsobov. Napríklad možno použiť komerčné emulgátory pracujúce na princípe vysokých šmykových síl vyvinutých pretláčaním kvapalín malými otvormi za vysokého tlaku. Príklady komerčných emulgačných zariadení zahrňujú bez obmedzenia mikrofluidizačné zariadenie Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, MA), a Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, WI). Príslušný tlak na použitie s jednotlivým emulgačným zariadením ľahko stanoví skúsený odborník. Napríklad na použitie mikrofluidizačného zariadenia Model 110Y poskytuje prevádzku pri tlakoch 34,5 až 207 MPa olejové kvapôčky s priemermi 100 až 750 nm.

Veľkosť olejových kvapôčok sa môže meniť zmenou pomeru povrchovo aktívnej látky k oleju (rastúci pomer zmenšuje rozmer kvapôčok), prevádzkového tlaku (rastúci prevádzkový tlak znižuje rozmer kvapôčok), teploty (rastúca teplota znižuje rozmer kvapôčok) a prídavkom amfipatického imunostimulačného prostriedku (prídavok tohto prostriedku znižuje rozmer kvapôčok). Skutočný rozmer kvapôčok sa bude meniť s daným povrchovo aktívnym prostriedkom, olejom a imunostimulačným prostriedkom (pokiaľ je prítomný) a s danými zvolenými prevádzkovými podmienkami. Veľkosť kvapôčky možno overiť použitím triediacich prístrojov, ako je SubMicron Particle Analyzer (Model N4MD) od Coulter Corporation a tieto parametre sa môžu meniť s použitím vodidiel popísaných vyššie tak, aby všetky kvapôčky mali v priemere menší rozmer ako 1 pm, prednostne menší ako zhruba 0,8 pm v priemere a najlepšie menší ako 0,5 pm v priemere. „V podstate všetky,, znamená aspoň 80 % počtu kvapôčok, prednostne aspoň zhruba 90 %, prednostnejšie aspoň zhruba 95 % a najlepšie aspoň zhruba 98 %. Distribúcia veľkosti častíc je zvyčajne Gaussovská, takže stredný priemer je menší ako popisované medze.

244/B

Obzvlášť preferované submikrónové emulzie olej vo vode na toto použitie sú emulzie skvalén/voda obsahujúce rôzne množstvo MTP-PE, ako sú submikrónové emulzie olej vo vode obsahujúce 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) Tween 80™ (polyoxyetylénsorbitan - monooleát) a/alebo 0,25 až 1,0 % Span 85™ (sorbitan - trioleát) a prípadne N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'-dipalmitoyl-snglycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), napríklad submikrónové emulzia olej vo vode známa ako „MF59„ (medzinárodná publikácia č. WO 90/14837, US patent č. 6 299 884 a Ott a koľ, „MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines,, vo Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.), Plénum Press, New York, 1995, str. 277 - 296). MF59 obsahuje 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu (napríklad 4,3 %), 0,25 až 0,5 % (hmotnosť/objem) Tween 80™ a 0,5 % (hmotnosť/objem) Span 85™ a prípadne rôzne množstvá MTP-PE formulované do submikrónových častíc s použitím mikrofluidizačného zariadenia, ako je mikrofluidizačné zariadenie Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA) MTP-PE môže byť napríklad v množstve 0 až 500 pg/dávka, prednostne 0 až 250 pg/dávka a najlepšie 0 až 100 pg/dávka. Pojem „MF59-0,,, ako sa tu používa, sa vzťahuje k vyššie popísanej submikrónovej emulzii olej vo vode bez MTP-PE, zatiaľ čo pojem MF59-MTP označuje formuláciu obsahujúcu MTP-PE. Napríklad „MF59-100,, obsahuje 100 pg MTP-PE na dávku atď. MF69, ďalšia submikrónové emulzia olej vo vode pre toto použitie obsahuje 4,3 % skvalénu (hmotnosť/objem), 0,25 % Tween 80™ (hmotnosť/objem) a 0,75 % Span 85™ (hmotnosť/objem) a prípadne MTP-PE. Ďalšou submikrónovou emulziou olej vo vode je MF57, tiež známa ako SAF, obsahujúca 10 % skvalénu, 0,4 % Tween 80™, 5 % blokového polyméru pluronik L121 a thrMDP, rovnako mikrofluidizovanej do submikrónovej emulzie. MF75-MTP označuje formuláciu MF75 obsahujúcu MTP v množstve 100 až 400 pg MTPPE na dávku.

Submikrónové emulzie olej vo vode, spôsoby ich prípravy a imunostimulačné prostriedky, ako sú muramylpeptidy na použitie v týchto

244/B kompozíciách sa podrobne popisujú v medzinárodnej publikácii č. WO 90/14837.

Keď sa vytvorí submikrónová suspenzia olej vo vode, môže sa podávať stavovcovi buď pred podaním, súčasne s podaním alebo po podaní antigénu a ISS, pokiaľ sa používa. Ak sa používa pred imunizáciou antigénom, podáva sa adjuvantná formulácia už 5 až 10 dni pred imunizáciou, prednostne 3 až 5 dní pred imunizáciou a najlepšie 1 až 3 alebo 2 dni pred imunizáciou danými antigénmi. Ak sa podáva oddelene, možno dodávať submikrónovú formuláciu olej vo vode buď do rovnakého miesta dodávky ako kompozícia antigénu aiebo do iného miesta.

Pokiaľ sa požaduje súčasné podanie, môže sa submikrónová formulácia olej vo vode zahrnúť do antigénových kompozícií. Všeobecne možno antigény a submikrónovú emulziu olej - voda kombinovať jednoduchým miesením, miešaním či trepaním. Možno tiež použiť iné spôsoby, ako je rýchly prechod zmesi týchto dvoch zložiek malým otvorom (ako je podkožná ihla) kvôli získaniu vakcínových kompozícií.

V prípade kombinácie môžu byť rôzne zložky kompozície prítomné v širokých rozmedziach pomerov. Napríklad sa zložky antigénu a emulzie zvyčajne používajú v objemovom pomere 1 : 50 až 50 : 1, prednostne 1 : 10 až 10:1, prednostnejšie od zhruba 1 : 5 do 3 : 1 a najlepšie zhruba 1:1. Avšak pre konkrétne účely môžu byť vhodné iné pomery, napríklad keď daný antigén má nízku imunogenitu, kedy sa požaduje vyššie relatívne množstvo antigénovej zložky.

244/B

Imunostimulačné molekuly nukleových kyselín (ISS)

Popisuje sa, že bakteriálna DNA stimuluje cicavčie imunitné odpovede. Pozri napríklad Krieg a kol., Náture, 374, 546 - 549 (1995). Imunostimulačná schopnosť sa prisudzuje vysokej frekvencii imunostimulačných molekúl nukleových kyselín (ISS), ako sú nemetylované CpG dinukleotidy prítomné v bakteriálnej DNA. Oligonukleotidy obsahujúce nemetylované CpG motívy indukujú aktiváciu B buniek, NK buniek a buniek prezentujúcich antigén (APC), ako sú monocyty a makrofágy. Pozri napríklad US patent č. 6 207 646.

Tento vynález používa adjuvanty odvodené od ISS. ISS podľa tohto vynálezu zahrňuje oligonukleotid, ktorý môže byť časťou väčšieho nukleotidového konštruktu, ako je plazmid alebo bakteriálna DNA. Tento oligonukleotid môže byť usporiadaný lineárne či kruhovo alebo môže obsahovať lineárne í kruhové segmenty. Tento oligonukleotid môže zahrňovať modifikácie, ako sú, avšak bez obmedzenia, modifikácie YOH alebo 5ΌΗ skupiny, modifikácie nukleotidovej bázy, modifikácie zložky cukru a modifikácie fosfátovej skupiny. ISS môže obsahovať nukleotidy (obsahujúce ribózu ako jedinú principiálnu glycidovú zložku), deoxyribonukleotídy (obsahujúce deoxyribózu ako zásadnú glycidovú zložku). Modifikované cukry či analógy cukrov možno rovnako inkorporovať do oligonukleotidu. Príklady zvyškov cukru, ktoré možno použiť, zahrňujú ribózu, deoxyribózu, pentózu, deoxypentózu, hexózu, deoxyhexózu, glukózu, arabinózu, xylózu, lyxózu a cyklopentylovú skupinu analogickú cukru. Cukor môže byť v pyranozylovej alebo furanozylovej forme. Fosforečný derivát (alebo modifikovaná fosfátová skupina) sa môže použiť ako monofosfát, difosfát, trifosfát, alkylfosfát, alkánfosfát, fosforotioát, fosforoditioát alebo podobne. Báza nukleových kyselín, ktoré sa inkorporujú do oligonukleotidovej bázy ISS, môžu byť prirodzené purínové a pyrimidové bázy, najmä uracil alebo tymín, cytozín, adenín a guanín rovnako tak ako prirodzené a syntetické modifikácie týchto báz. Navyše je k dispozícii veľký počet neprirodzených nukleozidov obsahujúcich rôzne heterocyklické bázy a rôzne zvyšky cukru (a analógov cukru) známych skúsenému odborníkovi.

244/B

Štruktúrne základným oligonukleotidom ISS je nukleotidové sekvencia obsahujúca CG alebo p(1C) nukleotidové sekvencia, ktorá môže byť palindromná. Cytozín môže byť metylovaný alebo nemetylovaný. Príklady konkrétnych molekúl ISS na použitie podľa tohto vynálezu zahrňujú molekuly CpG, CpY a CpR a podobne známe v odbore.

Preferované ISS sú tie, ktoré sa odvodzujú od skupiny molekúl CpG, CpG dinukleotidy a syntetické oligonukleotidy obsahujúce motívy CpG (pozri napríklad Krieg a kol., Náture, 374, 546 (1995) a Davis a kol., J. Immunol., 160, 870 - 876 (1998), ako sú ktorékoľvek z rôznych imunostimulačných CpG oligonukleotidov popísané v US patente č. 6 207 646. Tieto CpG oligonukleotidy všeobecne obsahujú aspoň 8 až zhruba 100 nukleotidov, prednostne 8 až 40 nukleotidov, prednostnejšie 15 až 35 nukleotidov, prednostne 15 až 25 nukleotidov a akýkoľvek počet nukleotidov medzi týmito hodnotami. Napríklad oligonukleotidy obsahujúce motív konzensu CpG predstavované vzorcom 5'-XiCGX₂-3', kde Xi a X₂ sú nukleotidy a C je nemetylovaný, sa môžu používať ako imunostimulačné CpG molekuly. Všeobecne Xi je A, G alebo T a X₂ je C alebo T. Ďalšie použiteľné CpG molekuly zahrňujú molekuly vzorca 5'-XiX₂CGX₃X₄, kde Xi a X₂ sú sekvencie ako je GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT alebo TpG a X3 a X₄ sú TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA alebo TpG, kde „p„ označuje fosfátovú väzbu. Prednostne oligonukleotidy nezahrňujú GCG sekvenciu na konci alebo blízko konca 5' a/alebo 3'. Navyše sa k CpG prednostne pripájajú na jeho konci 5' dva puríny (prednostne GpA dinukleotid) alebo purín a pyrimidín (prednostne GpT) a na konci 3' sa pripájajú dva pyrimidíny, prednostne TpT alebo TpC dinukleotid. Preferované molekuly teda budú obsahovať sekvenciu GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT a k týmto sekvenciám sa bude pripájať niekoľko ďalších nukleotidov ako je 1 až 20 alebo viacero nukleotidov, prednostne 2 až 10 nukleotidov a prednostnejšie 3 až 5 nukleotidov alebo akýkoľvek počet medzi týmito hodnotami. Nukleotidy mimo centrálneho jadra sú obzvlášť náchylné k zmene.

Ďalej môžu byť CpG oligonukleotidy na toto použitie jednovláknové či dvojvláknové. Dvojvláknové molekuly sú stabilnejšie in vivo, zatiaľ čo

244/B jednovláknové molekuly vykazujú zvýšenú imunitnú aktivitu. Navyše môže byť základný fosfátový reťazec modifikovaný, ako je modifikovaný fosforoditioátom kvôli dosiahnutiu imunostimulačnej aktivity CpG molekuly. Ako sa popisuje v US patente č. 6 207 646, aktivujú CpG molekuly s fosforotioátovými základnými reťazcami preferenčne B-bunky, zatiaľ čo tie, ktoré majú fosfodiesterové základné reťazce, aktivujú preferenčne monocytárne (makrofágy, dendritické bunky a monocyty ) a NK bunky.

Príklady CpG oligonukleotidov na použitie v týchto kompozíciách zahrňujú molekuly so sekvenciou 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1) a 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).

Molekuly ISS možno ľahko testovať ohľadom ich schopnosť stimulovať imunitnú odpoveď štandardnými spôsobmi dobre známymi v odbore. Napríklad schopnosť molekuly stimulovať humorálnu a/alebo bunkovú imunitnú odpoveď sa ľahko stanoví vyššie popísanými imunoesejami. Navyše možno submikrónové kompozície olej vo vode podávať za prítomnosti i bez prítomnosti ISS kvôli stanoveniu, či sa imunitná odpoveď zvyšuje.

Ako sa popisuje vyššie, možno ISS podávať buď pred podaním, súčasne s podaním alebo po podaní antigénu a/alebo submikrónovej emulzie olej vo vode. Pokiaľ sa podávajú pred imunizáciou antigénom a/alebo submikrónovou emulziou olej vo vode, možno ju podávať už 5 až 10 dní pred imunizáciou, prednostne 3 až 5 dní pred imunizáciou a najlepšie 1 až 3 alebo 2 dni pred imunizáciou. Pokiaľ sa podávajú oddelene, možno ich dodávať buď do rovnakého miesta ako kompozície antigénu alebo do iného miesta. Pokiaľ sa požaduje súčasné podanie, možno ISS zahrnúť do kompozícií antigénu.

Všeobecne sa použije 0,5 pg až 5 000 pg ISS, bežnejšie 0,5 pg až zhruba 1000 pg, prednostne 0,5 pg až zhruba 500 pg alebo od 1 do 100 pg, prednostne od 5 do zhruba 50 pg, prednostnejšie 5 až zhruba 30 pg alebo ktorékoľvek množstvo v týchto rozmedziach ISS na dávku pri týchto spôsoboch.

244/B

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nižšie sa popisujú príklady špecifických vyhotovení vykonávania tohto vynálezu. Tieto príklady sa ponúkajú len ako ilustrácia a neobmedzujú žiadnym spôsobom rozsah tohto vynálezu.

Je snaha zaistiť správnosť pri uvádzaní použitých čísel (napríklad množstvo, teplota, atď.), avšak je potrebné pripustiť určité experimentálne chyby a odchýlky.

Príklad 1

Tvorba HCVE1E2

Komplex HCV E1E2 na použitie v týchto vakcínových kompozíciách sa pripraví nasledujúcim spôsobom ako hybridný proteín. Konkrétne cicavčí expresný plazmid pMH-E1E2-809 (obrázok 3) kóduje hybridný proteín E1E2, ktorý tiež zahrňuje aminokyseliny 192 až 809 HCV-1 (pozri Choo a koľ, Proc. Natl. Acad. Soc., USA, 88, 2451 - 2455 (1991)). Sekvenciu molekuly E1E2₈₀₉ tu ukazujú obrázky 2A až 2C.

Bunky ovárií čínskeho škrečka (CHO) sa používajú na expresiu sekvencie HCV E1E2 z pMH-E1E2-809. Hlavne sa používajú bunky DG44 CHO. Tieto bunky popisuje Uraub a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 4216 - 4220 (1980), odvodzujú sa od buniek K-1 CHO a vytvorí sa dihydrofoliát reduktáza deficientným (dhfr) pôsobením dvojitej delécie v géne dhfr.

Vykoná sa transfekcia buniek DG44 pMH-E1 E2-809. Bunky po transfekcii sa pestujú v selektívnom prostredí tak, aby mohli rásť len bunky exprimujúce gén dhfr (Sambrook a kol., vyššie). Izolované kolónie CHO sa umiestnia (zhruba 800 kolónií) do jednotlivých jamiek 96 - jamkovej doštičky. Z pôvodných 96 - jamkových doštičiek sa pripravia duplikáty na vykonanie experimentov expresie. Replikátne mištičky sa pestujú tak dlho, až bunky vytvoria splývajúcu monovrstvu. Bunky sa fixujú k jamkám doštičky a

244/B permeabilizujú chladným metanolom. Ako sonda pre fixované bunky sa použije 3D5C3, monoklonálna protilátka proti E1E2 a 3E5-1, monoklonálna protilátka proti E2. Po pridaní protimyšieho HRP konjugátu a následnom pridaní substrátu sa stanovia bunkové línie s najvyššou expresiou. Línie buniek s najvyššou expresiou sa potom expandujú v 24 - jamkových klusterových doštičkách. Stanovenie expresie sa opakuje a opäť sa expandujú bunkové línie s najvyššou expresiou do jamôk väčšieho objemu. To sa opakuje tak dlho, až sa bunkové línie s najvyššou expresiou expandujú zo 6-jamkových mištičiek do baniek pre tkanivové kultúry. V tomto okamihu je dostatočné množstvo buniek na presné počítanie a zber buniek a vykoná sa kvantitatívne vyhodnotenie expresie. ELISA (Spaete a kol., Virol., 188, 819 - 830 (1992)) sa vykoná na bunkovom extrakte kvôli stanoveniu vysokých expresorov.

Príklad 2

Purifikácia HCV E1E2

Po expresii sa bunky podrobia cytolýze a potom sa intracelulárne vytvorený E1E2so9 purifikuje GNA lektínovou afinitnou chromatografiou (krok GNA) s nasledujúcou stĺpcovou chromatografiou na hydroxyapatite (krok HAP), DV50 membránovou filtráciou (krok DV50), SP sefarózovou vysokovýkonnou stĺpcovou chromatografiou (krok SP), Q membránovou filtráciou (krok Q) a G25 sefadexovou stĺpcovou chromatografiou (krok G25). Pri dokončení každého z týchto krokov sa celkový produkt buď sfiltruje filtrom 0,2 μΓη a udržiava pri teplote 2 až 8 °C alebo sa hneď spracuje v ďalšom purifikačnom kroku. Pri skončení purifikačného procesu sa antigén sfiltruje filtrom 0,2 pm a udržiava sa v zmrazenom stave pri teplote -60 °C alebo nižšej do filtrácie na prípravu.

Konkrétne sa na cytolýzu použijú dva objemy vychladeného pufra na cytolýzu (1 % Triton X-100 v 100 mM Tris, pH 8 a 1 mM EDTA) pridané k bunkám CHO pri teplote 2 až 8 °C. Zmes sa centrifuguje pri frekvencii otáčania 5000 min'¹ po dobu 45 minút pri teplote 2 až 8 °C kvôli odstráneniu zvyškov rozpadnutých buniek. Supernatant sa odoberá a filtruje filtrom Sartorias 0,65 pm Sartopure (Sartorius) a potom filtrom Sartorias 0,65 mm

244/B

Sartofine, ďalej filtrom Sartorias 0,45 pm Sartobran a filtrom 0,2 pm Sartobran. Filtrovaný lyzát sa udržiava na ľade pred nanesením na stĺpec GNA.

GNA agarózový stĺpec (1885 nml, 200 x 600, Vector Labs, Burlingame, CA) sa vopred upraví šesťnásobkom objemu stĺpca ekvilibračného pufra (25 mM fosforečnanu sodného, 1,0 M chloridu sodného, 12 % Triton X-100, pH 6,8) pred nanesením. Lyzát sa aplikuje na stĺpec pri prietoku 31,4 ml/min. (6 cm/h) cez noc. Stĺpec sa premýva 4 objemami náplne ekvilibračného pufra, potom sa premyje opäť 5 objemami náplne toho istého pufra. Produkt sa eluuje 1 M metyl alfa-D-manopyranozidom (MMP), 10 mM fosforečnanom sodným, 80 mM chloridom sodným, 0,1 % Tritonom X-100, pH 6,8. Eluačný pík, zhruba 1 objem stĺpca, sa odoberie, sfiltruje filtrom 0,2 pm a ukladá pri teplote nižšej ako -60 °C na chromatografiu na stĺpci hydroxyapatitu.

Chromatografia na hydroxyapatite sa vykoná pri teplote miestnosti. Keramická hydroxyapatitová kolóna typu I (BioRad) 1200 ml (100 x 150 mm) sa upraví objemom jedného stĺpca 0,4 M fosforečnanu sodného pH 6,8, potom sa upraví aspoň desaťnásobkom objemu stĺpca roztoku 10 mM fosforečnanu sodného, 80 mM chloridu sodného, 0,1 % Tritonu X-100, pH 6,8. Štyri podiely celkového eluátu GNA sa nechajú roztaviť v cirkulujúcom vodnom kúpeli pri teplote neprevyšujúcej 30 °C, sfiltrujú filtrom 0,2 pm a nanesú na kolónu upravenú pri prietoku 131 ml/min. (100 cm/h.). Pufor na ekvilibráciu hydroxyapatitu sa aplikuje na stĺpec ako pufor sledujúci náplň. Pretekajúca kvapalina sa zbiera, keď UV narastie na východiskovú hladinu. Zber produktu sa zastaví, keď celkový objem produktu dosiahne objem náplne plus 75 % objemu stĺpca. Celkový prietok z HAP sa ďalej spracuje filtráciou DV50 kvôli redukcii vírusov.

Filtrácia DV50 sa vykoná pri teplote miestnosti. Náplň DV50 sa pripraví dvojnásobným zriedením HAP a úpravou roztokom 0,15 % Tritonu X-100, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, pH 5,3. Zriedenie a úprava sa dosiahne prídavkom zrieďovacieho pufra 1 (koncentrácia 3 mM kyseliny citrónovej, 2 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,2 % Tritonu X-100) kvôli úprave pH celkového produktu na 5,3 s nasledujúcim prídavkom zrieďovacieho pufra 2

244/B (koncentrácia 2 mM EDTA, 0,2 % Tritonu X-100, pH 5,3) tak, aby konečný objem bol dvojnásobok pôvodného celkového objemu HAP.

Zriedené a upravené celkové množstvo HAP (náplň DV50) sa sfiltruje membránovou kartridžou (Pall) Pall Ultipor VF DV50, 25,4 cm. Kryt filtra sa opatrí filtračnou kartridžou, predvlhčí vodou a sterilizuje autoklávovaním pri teplote 123 °C po dobu 60 minút s pomalým vyčerpaním pred použitím. Filter sa potom predvlhčí ekvilibračným pufrom SP (koncentrácia 10 mM citrátu sodného, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,15 % Tritonu X-100, pH

5.3) a vysuší pred aplikáciou náplne DV50 pri tlaku neprevyšujúcom 310 kPa. Náplň DV50 sa potom aplikuje pri prietoku zhruba 800 ml/min. a transmembránovom tlaku zhruba 207 kPa. Filtrát sa odoberá a ukladá pri teplotách 2 až 8 °C cez noc a použije sa v kroku SP.

SP (sefarózová) chromatografia sa vykoná pri teplote miestnosti. Stĺpec 88 ml (50 x 45 mm) SP Sepharose HP (Pharmacia, Peapack, NJ) sa ekvilibruje 15-násobkom objemu stĺpca ekvilibračného pufra (koncentrácia 10 mM citrátu sodného, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,15 % Tritonu X-100, pH

5.3) . Filtrát DV50 sa aplikuje na stĺpec. Tento stĺpec sa premyje najprv 5násobkom objemu kolóny ekvilibračného pufra a potom 20-násobkom objemu kolóny premývacieho pufra s koncentráciami 10 mM citrátu sodného, 15 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,1 % Tween 80™, pH 6,0. Produkt sa eluuje zo stĺpca roztokom s koncentráciami 10 mM citrátu sodného, 180 mM chloridu sodného, 1 M kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,1 % Tween 80™, pH 6,0. Celá oblasť absorpčného vrcholu pri 280 nm sa zbiera ako celkový produkt. Celkový produkt sa ukladá pri teplote 2 až 8 °C cez noc a použije sa v Q-membránovom filtračnom kroku.

Q-membránový filtračný krok sa vykonáva pri teplote miestnosti. Dve sterilizované diskové membrány Sartorius Q100X sa zapoja rádovo. Membrány sa ekvilibrujú aspoň 300 ml Q ekvilibračného pufra (koncentrácia 10 mM citrátu sodného, 180 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,1 % Tween 80™, pH 6,0). Celkový eluát SP sa filtruje ekvilibrovanými Q membránami pri prietoku 30 až 100 ml/min. s následným premytím 40 ml Q

244/B ekvilibračného pufra. Filtrát a premývací podiel sa zbierajú a spájajú ako celkový produkt a používajú v kroku G25.

Krok G25 sa vykoná pri teplote miestnosti. Stĺpec 1115 ml (100 x 142 mm) Pharmacia Sephadex G-25 (Pharmacia, Peapack, NJ) sa ekvilibruje aspoň päťnásobkom objemu formulačného pufra (koncentrácia 10 mM citrátu sodného, 270 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny etyléndiamíntetraoctovej, 0,1 % Tween 80™, pH 6,0). Celkový Q filtrát sa aplikuje na stĺpec a prietok zo stĺpca sa odoberá, sfiltruje filtrom 0,22 pm (Millipore) a uloží zmrazený pri teplote -60 °C alebo nižšie do doby použitia.

Príklad 3

Imunogenita vakcínových kompozícií HCV E1E2 u myší

Imunogenita HCV E1E2₈₀9 získaných a purifikovaných, ako sa popisuje vyššie, v kombinácii so submikrónovou emulziou olej vo vode a/alebo CpG oligonukleotidom sa stanoví nasledujúcim spôsobom.

Formulácie použité v tejto štúdii sú zhrnuté v tabuľke 1. MF59, submikrónová emulzia olej vo vode obsahujúca 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,5 % (hmotnosť/objem) Tween 80™, 0,5 % Span 85™ sa získa podľa popisu vyššie. Pozri medzinárodná publikácia č. WO 90/14837, US patent č. 6 299 884 a Ott a kol., „MF59 Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines,, vo Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.), Plénum Press, New York, 1995, str. 277 - 296. Pre skupiny 4 a 9 sa použije štvornásobné množstvo MF59. MF59 použité v tejto štúdii je MF59-0 a neobsahuje MTP-PE.

Formulácie použité pre skupiny 1, 3, 6 a 8 tiež zahrňujú 25 pg aktívnej CpG molekuly na dávku. Sekvencia aktívnej molekuly je 5'TCCATGACGTTCCTGA CGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1).

244/B

Formulácia použitá pre skupinu 5 zahrňuje 25 pg neaktívnej kontrolnej CpG molekuly na dávku. Sekvencia neaktívnej CpG molekuly je 5'TCGAGGACTTCTCT CAGGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 2).

Formulácie použité pre skupiny 1 až 4 zahrňujú 2,8 pg na dávku antigénu HCV E1E2₈o9 získaného podľa popisu vyššie.

Formulácie použité pre skupiny 5 až 9 zahrňujú 2,0 pg na dávku HCV E2₇₁₅, skráteného E2 proteínu získaného z CHO buniek, ako popisuje US patent č. 6 12 020.

Myši Balb /C vo veku 6 mesiacov sa rozdelia do 9 skupín (10 myší na skupinu) a dostávajú intramuskuláme 50 pl kompozície vakcíny so zložkami vymenovanými v tabuľke 1. Posilňovacia vakcína sa dodáva v dobe 30 a 90 dní po počiatočnej injekcii. Sérum sa odoberá 14 dní po poslednej injekcii a titre protilátok proti E1E2 a proti E2 sa stanovia enzymatickou imunoesejou. Pozri Chien a kol., Lancet, 342, 933 (1993).

Výsledky ukazuje tabuľka 1 a obrázok 4. Ako možno vidieť, myši imunizované HCV E1E2 s použitím CpG v kombinácii s MF59 ako adjuvantným prostriedkom poskytujú významne vyššie (p < 0,05) hladiny protilátok E1E2 ako myši imunizované E1E2 s použitím samotného MF59 alebo samotného 4 x MF59 ako adjuvantných prostriedkov. CpG samotný poskytuje hladiny protilátok vyššie ako sú hladiny protilátok so samotným MF59, i keď tento rozdiel nie je významný. Oproti tomu myši imunizované E2₇₁₅ s použitím MF59 a/alebo CpG poskytujú veľmi nízke hladiny protilátok s menej ako 50 % myší vykazujúcich odpoveď. To je prekvapujúce, lebo skoršie pokusy s E2₇i₅ poskytujú vysoké hladiny protilátok ku myší a odpoveď u všetkých zvierat.

244/B

Tabuľka 1

Imunogenita HCV E1E2₈o₉ a E2₇i₅ s použitím CPG a/alebo MF59 ako adjuvantných prostriedkov. Čísla v zátvorkách ukazujú počet zvierat tvoriacich protilátky vo vzťahu k počtu imunizovaných zvierat

Skupina	Vakcína, adjuvantný prostriedok	Dávka	Geometrický priemer titra protilátky E1E2 EIA	Geometrický priemer titra protilátky E2 EIA
1	E1E2809 CpG	2,8,2,8, 2,8	5,167 (10/10)	ND
2	E1E2809 MF59	2,8,2,8, 2,8	2,716 (10/10)	ND
3	E1 E28o9 CpG + MF59	2,8,2,8,2,8	19,1596 (10/10)	ND
4	E1E2809 4 x MF59	2,8,2,8,2,8	3,335 (10/10)	ND
5	E2715 kontrola CpG	2,0, 2,0, 2,0	ND	1,3 (1/10)
6	E2715 CpG	2,0,2,0,2,0	ND	3,1 (2/20)
7	E2715 MF59	2,0, 2,0,2,0	ND	6,1 (4/10)
8	E2715 CpG + MF59	2,0, 2,0,2,0	ND	26,8 (5/10)
9	E2715 4 x MF59	2,0,2,0, 2,0	ND	9,7 (4/10)

244/B

Príklad 4

Imunogenita vakcínových kompozícií HCV E1E2 u šimpanzov

Imunogenita HCV E1E2₈o9 vytvorených a purifikovaných, ako sa popisuje vyššie, v kombinácii so submikrónovou emulziou olej vo vode a/alebo CpG oligonukleotidom sa stanoví nasledujúcim spôsobom.

Formulácie použité v tejto štúdii sumarizuje tabuľka 2. MF59 a E1E2₈₀₉ sa popisujú vyššie. Sekvencia použitej molekuly CpG je 5'TCGTCGTTTTGTCGTTTT GTCGTT-3' (identifikačné číslo sekvencie 5).

Šimpanzy sa rozdelia do dvoch skupín (5 zvierat na skupinu) a dostávajú intramuskulárne kompozíciu vakcíny so zložkami špecifikovanými v tabuľke 1. Konkrétne sa jedna skupina zvierat imunizuje v dobe 0, 1 a 6 mesiacov 20 pg E1E2₈o9 a MF59. Druhá skupina zvierat sa rovnako imunizuje v dobách 0, 1 a 6 mesiacov 20 pg E1E2₈₀9 a MF59 rovnako tak ako 500 pg CpG.

Vzorky séra sa získajú 14 dní po poslednej imunizácii a titre protilátok proti E1E2 sa stanovia enzýmovými imunoesejami. Konkrétne sa antigénom E1E2 poťahujú polystyrénové mikrotitračné misky a naviazaná protilátka sa detekuje HRP konjugovanou protiľudskou protilátkou s nasledujúcim rozvojom tetrametylbenzidínového substrátu.

Ako tabuľka 2 ukazuje, šimpanzy imunizované HCV E1E2 s použitím CpG v kombinácii s adjuvantom MF59 poskytujú významne vyššie (p < 0,05) hladiny protilátok E1E2 ako zvieratá imunizované E1E2 s použitím samotného MF59.

244/B

Tabuľka 2

Imunogenita HCV E1E2₈₀g s použitím CpG a MF59 ako adjuvantných prostriedkov

Vakcína, adjuvant	Šimpanz č.	Titer protilátky E1E2 EIA	Geometrický priemer titra protilátky E1E2 EIA
Skupina 1: Ε1Ε28οθ CpG	1	84	261
	2	101
	3	131
	4	421
	5	2580
Skupina 2: E1E2809, CpG + MF59	1	8835	2713
	2	2713
	3	3201
	4	510
	5	1238

Podľa tohto vynálezu sa popisujú nové HCV vakcinačné kompozície a spôsoby ich použitia. Z vyššie poskytnutého popisu možno usúdiť, že i keď sa popisujú preferované vyhotovenia predmetu vynálezu do určitých podrobností, je potrebné si uvedomiť, že zrejme možno vykonať pozmenenia bez odchýlenia sa od ducha a obsahu tohto vynálezu, ako sa definuje v pripojených nárokoch.

Claims (42)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) a submikrónovú emulziu olej vo vode neobsahujúcu Nacetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(1 ',2'-dipalmitoyl-sn-glycero3-hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), kde táto submikrónová emulzia olej vo vode je schopná zvyšovať imunitnú odpoveď antigénu E1E2 HCV.
2. 2. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že antigén E1E2 HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín s aspoň 80 % sekvenčnou identitou so súvislou sekvenciou aminokyselín znázornených v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
3. 3. Kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že antigén E1E2 HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
4. 4. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje sekvenciu imunostimulačnej nukleovej kyseliny (ISS).
5. 5. Kompozícia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že ISS je CpG oligonukleotid.
6. 6. Kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-X₁X₂CGX₃X₄, kde Xi a X₂ sú zvolené zo sekvencie zo skupiny zahrňujúcej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG a X₃ a X₄ sa volia zo skupiny zahrňujúcej TpT, CpT,

   32 244/B

   ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde „p„ znamená fosfátovú väzbu.
7. 7. Kompozícia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že tento oligonukleotid obsahuje sekvenciu GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT.
8. 8. Kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1).
9. 9. Kompozícia podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).
10. 10. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje (1) metabolizovateľný olej, ktorý je prítomný v množstve 0,5 % až 20 % celkového objemu a (2) emulgačný prostriedok, ktorý je prítomný v množstve 0,01 až 2,5 hmotnostných % (hmotnosť/objem) a tento olej a emulgačný prostriedok sú prítomné vo forme emulzie olej vo vode majúcej kvapôčky oleja, ktoré sú v podstate všetky s priemerom zhruba 100 nm až menej ako 1 mikrometer.
11. 11. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že tento olej je prítomný v množstve 1 % až 12 % celkového objemu a emulgačný prostriedok je prítomný v množstve 0,01 až 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).

    32 244/B
12. 12. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že tento emulgačný prostriedok obsahuje mono-, di- alebo triester polyoxyetylénsorbitanu alebo mono-, di- alebo triester sorbitanu.
13. 13. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) polyoxyetylénsorbitan - monooleátu a/alebo 0,25 až 1,0 % sorbitan - trioleátu.
14. 14. Kompozícia podľa nároku 13, vyznačujúca sa tým, že submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje v podstate 5 objemových % skvalénu a jedno či viacero emulgačných prostriedkov zvolených zo skupiny zahrňujúcej polyoxyetylénsorbitan - monooleát a sorbitan - trioleát, kde celkový objem emulgačného prostriedku (emulgačných prostriedkov) predstavuje 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
15. 15. Kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že tento jeden či viacero emulgačných prostriedkov predstavuje (predstavujú) polyoxyetylénsorbitan - monooleát a sorbitan - trioleát a celkové množstvo prítomného polyoxyetylénsorbitan - monooleátu a sorbitan - trioleátu je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
16. 16. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) a sekvenciu imunostimulačnej nukleovej kyseliny (ISS), kde táto ISS je schopná zvyšovať imunitnú odpoveď antigénu Ε1E2 HCV.
17. 17. Kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že ISS je CpG oligonukleotid.

    32 244/B
18. 18. Kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že antigén E1E2

    HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín s aspoň 80 % sekvenčnou identitou so spojitou sekvenciou aminokyselín znázornenou v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
19. 19. Kompozícia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že tento antigén E1E2 HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
20. 20. Kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-XiX2CGX₃X₄, kde Xi a X₂ sa zvolia zo sekvencií skupiny zahrňujúcej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG, a X₃ a X₄ sa volia zo skupiny zahrňujúcej TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde „p„ znamená fosfátovú väzbu·.
21. 21. Kompozícia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že tento oligonukleotid obsahuje sekvenciu GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT.
22. 22. Kompozícia podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (čislo identifikácie sekvencie 1).
23. 23. Kompozícia podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).

    32 244/B
24. 24. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

    (a) antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) zahrňujúci sekvenciu aminokyselín s aspoň 80 % sekvenčnou identitou so spojitou sekvenciou aminokyselín znázornenou v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C, (b) submikrónovú emulziu olej vo vode schopnú zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén E1E2 HCV, kde táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje (i) metabolizovateľný olej, ktorý je prítomný v množstve 1 % až 12 % z celkového objemu a (ii) emulgačný prostriedok, kde tento emulgačný prostriedok je prítomný v množstve 0,01 až 1,0 hmotnostné % (hmotnosť/objem) a obsahuje mono-, di- alebo triester polyoxyetylénsorbitanu a/alebo mono-, di- alebo triester sorbitanu, kde tento olej a emulgačný prostriedok sú vo forme emulzie olej vo vode majúcej kvapôčky oleja, ktoré sú v podstate všetky s priemerom zhruba 10 nm až menej ako 1 pm a (c) CpG oligonukleotid, kde tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvencie GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT.
25. 25. Kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že tento antigén E1E2 HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
26. 26. Kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1).
27. 27. Kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenciu 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).

    32 244/B
28. 28. Kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a/alebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a N-acetylmuramyl-L-alanyl-Dizoglutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE).
29. 29. Kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje v podstate 5 objemových % skvalénu a aspoň jeden emulgačný prostriedok zvolený zo skupiny monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a trioleátu sorbitanu, kde celkové množstvo emulgačného prostriedku (emulgačných prostriedkov) je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
30. 30. Kompozícia podľa nároku 29, vyznačujúca sa tým, že tento aspoň jeden emulgačný prostriedok je monooleát polyoxyetylénsorbitanu a trioleát sorbitanu a celkové množstvo monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a trioleátu sorbitanu je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
31. 31. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

    (a) antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) zahrňujúci sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C, (b) submikrónovú emulziu olej vo vode schopnú zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén E1E2 HCV, kde táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a/alebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a prípadne N-acetylmuramyl-L-alanyl-Dizoglutaminyl-L-alanín-2-(1 ',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), kde tento olej a emulgačný
32. 32 244/B prostriedok sú prítomné vo forme emulzie olej vo vode majúcej kvapôčky oleja s priemerom v podstate spolu zhruba 100 nm až menej ako 1 prn a (c) CpG oligonukleotid, ktorý obsahuje sekvenciu 5'TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1) alebo sekvenciu 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTT GTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).

    32. Kompozícia podľa nároku 31, vyznačujúca sa tým, že tento antigén E1E2 HCV obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C.
33. 33. Kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje v podstate (i) 5 objemových % skvalénu a (ii) jeden či viacero emulgačných prostriedkov zvolených z prípadov monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a trioleátu sorbitanu, kde celkové množstvo emulgačného prostriedku (emulgačných prostriedkov) je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
34. 34. Kompozícia podľa nároku 33, vyznačujúca sa tým, že týmto aspoň jedným emulgačným prostriedkom je monooleát polyoxyetylénsorbitanu a trioleát sorbitanu a celkové množstvo monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a trioleátu sorbitanu je 1 hmotnostné % (hmotnosť/objem).
35. 35. Použitie kompozície podľa nárokov 1 až 34 v spôsobe stimulácie imunitnej odpovede niektorého stavovca.
36. 36. Spôsob stimulácie imunitnej odpovede u niektorého stavovca, vyznačujúci sa tým, že sa mu podáva terapeuticky účinné množstvo antigénu E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) a submikrónová emulzia olej vo vode bez N32 244/B acetylmuramyl-L-alanyl-D-izoglutaminyl-L-alanín-2-(1 ',2'-dipalmitoyl-sn-glycero3-hydroxyfosforyloxy)etylamínu (MTP-PE), kde táto submikrónové emulzia olej vo vode je schopná zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén Ε1E2 HCV.
37. 37. Spôsob stimulácie imunitnej odpovede u niektorého stavovca, vyznačujúci sa tým, že sa mu podáva terapeuticky účinné množstvo E1E2 antigénu vírusu hepatitídy C (HCV) a imunostimulačná molekula nukleovej kyseliny (ISS), kde táto ISS je schopná zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén E1E2 HCV.
38. 38. Spôsob stimulácie imunitnej odpovede u niektorého stavovca, vyznačujúci sa tým, že sa mu podáva terapeuticky účinné množstvo kompozície obsahujúcej:

    (a) antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) zahrňujúci sekvenciu aminokyselín s aspoň 80 % sekvenčnou identitou so spojitou sekvenciou aminokyselín znázornenou v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C, (b) submikrónovú emulziu olej vo vode schopnú zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén E1E2 HCV, kde táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje (i) metabolizovateľný olej, ktorý je prítomný v množstve 1 % až 12 % z celkového objemu a (ii) emulgačný prostriedok, kde tento emulgačný prostriedok je prítomný v množstve 0,01 až 1,0 hmotnostné % (hmotnosť/objem) a obsahuje mono-, di- alebo triester polyoxyetylénsorbitanu a/alebo mono-, di- alebo triester sorbitanu, kde tento olej a emulgačný prostriedok sú vo forme emulzie olej vo vode majúcej kvapôčky oleja, ktoré sú v podstate všetky s priemerom zhruba 10 nm až menej ako 1 pm a (c) CpG oligonukleotid, kde tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvencie GACGTT, GACGTC, GTCGTT alebo GTCGCT.

    32 244/B
39. 39. Spôsob stimulácie imunitnej odpovede u niektorého stavovca, vyznačujúci sa tým, že sa mu podáva terapeuticky účinné množstvo kompozície obsahujúcej:

    (a) antigén E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV) zahrňujúci sekvenciu aminokyselín znázornenú v polohách 192 až 809 obrázkov 2A až 2C, (b) submikrónovú emulziu olej vo vode schopnú zvyšovať imunitnú odpoveď na antigén E1E2 HCV, kde táto submikrónová emulzia olej vo vode obsahuje 4 až 5 % (hmotnosť/objem) skvalénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnosť/objem) monooleátu polyoxyetylénsorbitanu a/alebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a prípadne N-acetylmuramyl-L-alanyl-Dizoglutaminyl-L-alanín-2-(1 ',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamín (MTP-PE), kde tento olej a emulgačný prostriedok sú prítomné vo forme emulzie olej vo vode majúcej kvapôčky oleja s priemerom v podstate napospol zhruba 100 nm až menej ako 1 pm a (c) CpG oligonukleotid, ktorý obsahuje sekvenciu 5'TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 1) alebo sekvenciu 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTT GTCGTT-3' (číslo identifikácie sekvencie 5).
40. 40. Spôsob prípravy kompozície, vyznačujúci sa tým, že sa spojí submikrónová emulzia olej vo vode bez N-acetylmuramyl-L-alanyl-Dizoglutaminyl-L-alanín-2-(ľ,2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)etylamínu (MTP-PE) s antigénom E1E2 hepatitídy vírusu C (HCV).
41. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje kombináciu imunostimulačnej sekvencie nukleovej kyseliny (ISS) s antigénom E1E2 a submikrónovou emulziou olej vo vode.

    32 244/B
42. 42. Spôsob prípravy kompozície, vyznačujúci sa tým, že sa kombinuje sekvencia imunostimulačnej nukleovej kyseliny (ISS) s antigénom E1E2 vírusu hepatitídy C (HCV).