JP2005298523A - Ｈｃｖｅ１ｅ２ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】 安全かつ非毒性のアジュバントを含む、ＨＣＶに対して効果的なワクチン組成物を提供すること。
【解決手段】 Ｅ１Ｅ２抗原、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび／または免疫刺激性核酸配列を含むＨＣＶ Ｅ１Ｅ２組成物が、開示される。本組成物は、脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法において使用され得る。本発明は、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）（例えば、ＣｐＹモチーフ、ＣｐＲモチーフ、および非メチル化ＣｐＧモチーフ（シトシンの後に、グアノシンが続き、リン酸結合によって連結される）を含むオリゴヌクレオチドと併用して、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原を使用することによって、このようなアジュバントが存在しないときに観察される免疫力価よりも有意に高い免疫力価を提供するという驚くべき発見に部分的に依存する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、一般にワクチン組成物に関する。特に、本発明は、Ｅ１Ｅ２抗原、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび／またはＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ワクチン組成物に関する。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非経口非Ａ型非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主な原因である。このウイルスは、血液ドナーの０．４〜２．０％に存在する。慢性肝炎は、感染の約５０％において発症し、そして感染個体の約２０％は、時折肝細胞癌に至る肝硬変を発症する。よって、この疾患の研究および制御は、医学的に重要である。

ＨＣＶは、ＨｏｕｇｈｔｏｎらによってＮＡＮＢＨの原因として最初に同定および特徴付けられた。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法と同様に公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ属のウイルスのメンバーである。系統発生学分析に基いて少なくとも６つの異なるが関連する遺伝子型のＨＣＶが同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９）。このウイルスは、３０００個より多いアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５；Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１−１７１５）。このポリタンパク質は、翻訳と同時に、および翻訳後に、構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質にプロセシングされる。

特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質が、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断産物の順番および名称は、以下である：ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。このポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質（Ｎ末端核カプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）ならびに２つのエンべロープ糖タンパク質「Ｅ１」（Ｅとも呼ばれる）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１とも呼ばれる）、そしてウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質）を遊離させる宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と呼ばれる。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する不可欠な膜タンパク質であり、ＮＳ３と組合わせて、ＮＳ２−ＮＳ３シシル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、順々にＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングするために働く。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）およびＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒されるＮＳ３−ＮＳ４ａ連結での自己切断によって開始される。

Ｅ１は、３２〜３５ｋＤａ種として検出され、そして約１８ｋＤａのエンドＨ（ｅｎｄｏ Ｈ）感受性の単一バンドに変換される。対照的に、Ｅ２は、複数種の生成と一致して免疫沈降の際に複合体パターンを示す（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）。ＨＣＶエンべロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２は、同時に免疫沈降し得る安定な複合体を形成する（Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７：２２５−２３５；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３−６７６１）。

Ｅ１およびＥ２は、安定に発現されるか一過性ワクシニアウイルス系において発現される場合、細胞内に残存し、そして錯体炭化水素を欠く（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３−６７６１）。Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質はこれらの発現系では通常膜結合型であるので、このタンパク質の精製を容易にするために分泌形態が産生された。例えば、米国特許第６，１２１，０２０号を参照のこと。さらに、Ｈｅｌａ細胞でのＥ１Ｅ２の細胞内産生が記載された。例えば、国際公開番号ＷＯ９８／５０５５６を参照のこと。

ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質およびＥ２糖タンパク質は、十分関心がある。なぜなら、これらは、霊長類の研究におけるウイルスチャレンジに対して防護的であることが示されているからである（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１２９４−１２９８）。しかし、これらの抗原を含む、ＨＣＶ感染の予防のために効果的なワクチン組成物の必要性が存在する。

ワクチン組成物は、しばしば免疫応答を増強するための免疫学的アジュバントを含む。例えば、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）は、実験基礎において多くの免疫原とともに首尾よく使用された強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、以下の３つの成分を含む：鉱油、乳化剤および死滅ミクバクテリウム（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。抗原水溶液は、油中水エマルジョンを作製するためにこれらの成分と混合される。アジュバントとして効果的であるが、ＣＦＡは、主に、ミコバクテリア成分の存在に起因して重篤な副作用（疼痛、膿瘍形成および発熱を含む）を引き起こす。よって、ＣＦＡは、ヒトワクチンおよび獣医用ワクチンにおいて使用されていない。

ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、最小単位のミコバクテリア細胞壁複合体であり、これは、ＣＦＡで観察されるアジュバント活性を生成する。例えば、Ｅｌｌｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７４）５９：１３１７を参照のこと。広範なアジュバント能および副作用を示すＭＤＰのいくつかの合成アナログが生成された。これらのアナログの総説については、Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ（１９７８）２５：６３を参照のこと。ＭＤＰの例示的アナログとしては、ＭＤＰのトレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８７）５：２２３）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：４１７）およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９８１）Ｙ．ＹａｍａｍｕｒａおよびＳ．Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．１６７）が挙げられる。

ＭＤＰの親油性誘導体の１つは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）である。このムラミルトリペプチドは、この分子の疎水性部分と脂質環境との結合を可能にするリン脂質テールを含むが、ムラミルペプチド部分は水性環境と結合する。よって、ＭＴＰ−ＰＥ自体は、安定な水中油エマルジョンを生成する乳化剤として働き得る。ＭＴＰ−ＰＥは、０．００８％ Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ８０を有する４％スクアレンのエマルジョン（ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低油）と呼ばれる）において使用され、物理学的安定性に乏しいにもかかわらず効果的な結果を有する単純ヘルペスウイルスｇＤ抗原を送達する（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１７２０−１７２７）。最近、安全で高い免疫原性のサブミクロンの水中油エマルジョンであるＭＦ５９（これは、４〜５重量％スクアレン、０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０^ＴＭ、０．５％ Ｓｐａｎ８５^ＴＭ、および必要に応じて、変動量のＭＴＰ−ＰＥを含む）が、ワクチン組成物における用途に開発された。例えば、Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６を参照のこと。Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１２９４−１２９８、およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９７）ｐ．６５６は、ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２複合体をＭＴＰ−ＰＥを含むサブミクロンの水中油エマルジョンとともに使用することを記載する。

細菌性ＤＮＡは、末梢血単核細胞に対するインビトロでの免疫刺激効果を有する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。Ｋｒｉｅｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５：２８４−２９２。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫応答を増強するために使用された。例えば、米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；および同第６，４０６，７０５号を参照のこと。

このようなアジュバントの使用の代わりに、慣用的ワクチンは、しばしば、標的化された病原体に対する適切な保護を提供し損なう。よって、安全かつ非毒性のアジュバントを含む、ＨＣＶに対して効果的なワクチン組成物について引き続き必要性が存在する。

項目１．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を欠くサブミクロンの水中油エマルジョンを含む組成物であって、ここで、該サブミクロンの水中油エマルジョンが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を刺激し得る、組成物；
項目２．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組成物；
項目３．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、組成物；
項目４．免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）をさらに含む、組成物；
項目５．上記ＩＳＳがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、組成物；
項目６．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが配列５’−Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４を含む組成物であって、ここで、Ｘ_１およびＸ_２が、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴおよびＴｐＧからなる群より選択され；そしてＸ_３およびＸ_４が、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡおよびＴｐＧからなる群より選択され、ここで、ｐがリン酸結合を表す、組成物；
項目７．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む、組成物；
項目８．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）を含む、組成物；
項目９．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を含む、組成物；
項目１０．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、以下：
（１）総容量の０．５％〜２０％の量で存在する、代謝可能な油；および
（２）０．０１重量％〜２．５重量％（ｗ／ｖ）の量で存在する乳化剤
を含む組成物であって、ここで、この油およびこの乳化剤が、実質的に全てが直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である油滴を有する水中油の形態で存在する、組成物；
項目１１．上記油が総容量の１％〜１２％の量で存在し、そして上記乳化剤が０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｖ）の量で存在する、組成物；
項目１２．上記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、および／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む、組成物；
項目１３．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、４〜５重量％のスクアレン、０．２５〜１．０重量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％のソルビタントリオレアートを含む、組成物；
項目１４．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、５重量％のスクアレン；ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートからなる群より選択される１つ以上の乳化剤、から本質的になる組成物であって、ここで、存在する乳化剤の総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、組成物；
項目１５．上記１つ以上の乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートであり、そして存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートの総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、組成物；
項目１６．Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原および免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）を含む組成物であって、ここで、このＩＳＳが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得る、組成物；
項目１７．上記ＩＳＳがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、組成物；
項目１８．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組成物；
項目１９．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、組成物；
項目２０．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが配列５’−Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４を含む組成物であって、ここで、Ｘ_１およびＸ_２が、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴおよびＴｐＧからなる群より選択され；そしてＸ_３およびＸ_４が、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡおよびＴｐＧからなる群より選択され、ここで、ｐがリン酸結合を表す、組成物；
項目２１．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む、組成物；
項目２２．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）を含む、組成物；
項目２３．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を含む、組成物；
項目２４．以下：
（ａ）図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原；
（ｂ）ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得るサブミクロンの水中油エマルジョンであって、ここで、該サブミクロンの水中油エマルジョンが、以下：
（ｉ）総容量の１％〜１２％の量で存在する、代謝可能な油、および
（ｉｉ）０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｖ）の量で存在し、かつポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、および／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む、乳化剤
を含み、ここで、この油およびこの乳化剤が、実質的に全てが直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である油滴を有する水中油の形態で存在する、水中油エマルジョン；ならびに
（ｃ）配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
を含む、組成物；
項目２５．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、組成物；
項目２６．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）を含む、組成物；
項目２７．上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を含む、組成物；
項目２８．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、４〜５重量％のスクアレン、０．２５〜１．０重量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％のソルビタントリオレアート、ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、組成物；
項目２９．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、５重量％のスクアレン；ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートからなる群より選択される１つ以上の乳化剤、から本質的になる組成物であって、ここで、存在する乳化剤の総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、組成物；
項目３０．上記１つ以上の乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートであり、そして存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートの総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、組成物；
項目３１．以下：
（ａ）図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原；
（ｂ）４〜５重量％のスクアレン、０．２５〜１．０重量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％のソルビタントリオレアート、ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得るサブミクロンの水中油エマルジョンであって、ここで、この油およびこの乳化剤が、実質的に全てが直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である油滴を有する水中油の形態で存在する、水中油エマルジョン；ならびに
（ｃ）配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）、または配列５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を含む、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
を含む、組成物；
項目３２．上記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、組成物；
項目３３．上記サブミクロンの水中油エマルジョンが、以下：
（ｉ）５容量％のスクアレン；および
（ｉｉ）ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートからなる群より選択される１つ以上の乳化剤であって、ここで、存在する乳化剤の総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、乳化剤
を含む、組成物；
項目３４．上記１以上の乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートであり、そして存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートおよびソルビタントリオレアートの総量が１重量％（ｗ／ｖ）である、組成物；
項目３５．脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法における、上記の組成物の使用；
項目３６．脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、治療有効量のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を欠くサブミクロンの水中油エマルジョンを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該サブミクロンの水中油エマルジョンが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を刺激し得る、方法；
項目３７．脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、治療有効量のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原、および免疫刺激性核酸分子（ＩＳＳ）を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ＩＳＳが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得る、方法；
項目３８．脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、以下：
（ａ）図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原；
（ｂ）ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得るサブミクロンの水中油エマルジョンであって、ここで、このサブミクロンの水中油エマルジョンが、以下：
（ｉ）総容量の１％〜１２％の量で存在する、代謝可能な油、および
（ｉｉ）０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｖ）の量で存在し、かつポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、および／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む、乳化剤
を含み、ここで、この油およびこの乳化剤が、実質的に全てが直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である油滴を有する水中油の形態で存在する、水中油エマルジョン；ならびに
（ｃ）配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
を含む治療有効量の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法；
項目３９．脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法であって、以下：
（ａ）図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原；
（ｂ）４〜５重量％のスクアレン、０．２５〜１．０重量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％のソルビタントリオレアート、ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得るサブミクロンの水中油エマルジョンであって、ここで、この油およびこの乳化剤が、実質的に全てが直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である油滴を有する水中油の形態で存在する、水中油エマルジョン；そして
（ｃ）配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）、または配列５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を含む、ＣｐＧオリゴヌクレオチド
を含む治療有効量の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法；
項目４０．Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を欠くサブミクロンの水中油エマルジョンをＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原と合わせる工程を包含する、組成物を作製する方法；
項目４１．免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）を上記Ｅ１Ｅ２抗原および上記サブミクロンの水中油エマルジョンと合わせる工程をさらに包含する、方法；
項目４２．免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原と合わせる工程を包含する、組成物の作製方法。

（発明の要旨）
本発明は、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび免疫刺激性核酸配列（ＩＳＳ）（例えば、ＣｐＹモチーフ、ＣｐＲモチーフ、および非メチル化ＣｐＧモチーフ（シトシンの後に、グアノシンが続き、リン酸結合によって連結される）を含むオリゴヌクレオチドと併用して、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原を使用することによって、このようなアジュバントが存在しないときに観察される免疫力価よりも有意に高い免疫力価を提供するという驚くべき発見に部分的に依存する。あるいは、本明細書中の組成物は、ＩＳＳ単独で、サブミクロンの水中油エマルジョンを伴うことなく使用されるか、またはＭＴＰ−ＰＥを欠くエマルジョンのみのサブミクロンの水中油エマルジョンと共に、ＩＳＳを伴わずに使用される。このような組成物の使用は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原の免疫原性を増強するための安全でかつ効果的なアプローチを提供する。

従って、１つの実施形態において、本発明は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原およびＭＴＰ−ＰＥを欠くサブミクロンの水中油エマルジョンを含む組成物に関し、ここで、このサブミクロン水中油エマルジョンはＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大し得る。この組成物は、存在する場合に、この抗原に対する免疫応答を増強するように作用する、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのようなＩＳＳ（「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」）をさらに含み得る。

なお別の実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、治療有効量のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原およびＭＴＰ−ＰＥを欠くサブミクロンの水中油エマルジョンを被験体に投与する工程を包含し、ここで、サブミクロン水中油エマルジョンは、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大し得る。被験体はまた、１個以上のＩＳＳ（例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む１つ以上のオリゴヌクレオチド）が投与され得、ここで、このＩＳＳは、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強し得る。このサブミクロン水中油エマルジョンは、抗原と同じ組成物中に存在し得るかまたは別個の組成物中で投与され得る。さらに、ＩＳＳが存在すると、抗原および／またはサブミクロン水中油エマルジョンと同じ組成物中に存在し得るかまたは異なる組成物として存在し得る。

なおさらなる実施形態において、本発明は、ＭＴＰ−ＰＥを欠きＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原を伴うサブミクロン水中油エマルジョンあわせたものを含む組成物を作製するための方法に関する。特定の実施形態において、この方法は、ＩＳＳ（例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）とＥ１Ｅ２抗原およびサブミクロン水中油エマルジョンとをあわせる工程をさらに包含する。

さらなる実施形態において、本発明は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原およびこのＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大することが出来るＩＳＳ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）を含む組成物に関する。

さらに別の実施形態において、本発明は、脊椎動物における免疫応答を刺激する方法に関し、この被験体に対して治療有効量のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原およびＩＳＳ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）を投与する工程を包含し、ここで、ＩＳＳはＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大する工程を包含する。このＩＳＳは、抗原と同じ組成物中に存在し得るかまたは別個の組成物中で投与され得る。

なおさらなる実施形態において、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのようなＩＳＳと、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原とを組み合わせる工程を包含する、組成物を精製する方法に関する。ここでこのＩＳＳは、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大させ得る。

上記の任意の実施形態におけるＣｐＧ分子は、式５’−Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４を有し得、ここでＸ_１およびＸ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴおよびＴｐＧからなる群より選択され、Ｘ_３およびＸ_４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡ、およびＴｐＧからなる群より選択される。ここで「ｐ」は、リン酸結合を表す。特定の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、いくつかのさらなるヌクレオチドが隣接した、配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む。

さらなる実施形態において、本発明の組成物において使用するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）または配列５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を有する。

特定の実施形態において、サブミクロンの水中油型エマルジョンは、以下を含有する：（１）代謝可能な油（ここでこの油は、総容積の０．５％〜２０％の量にて存在する）および（２）乳化剤（ここでこの乳化剤は、０．０１重量％〜２．５重量％（ｗ／ｖ）である）。ここでこの油 および乳化剤は、水中油型エマルジョンの形態で存在し、この水中油型エマルジョンは油滴を有し、この油滴の実質的に全てが、直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満であり、ここでこのサブミクロンの水中油型エマルジョンは、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増大し得る。

他の実施形態において、このサブミクロンの水中油型エマルジョンは、上記に記載されるとおりであり、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーもムラミルペプチドも欠いている。

さらなる実施形態において、上記乳化剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノ−エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、もしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステルおよび／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステルを含む。

特定の実施形態において、上記油は、総容積の１重量％〜１２重量％（例えば、１重量％〜４重量％）の量にて存在し、上記乳化剤は、０．０１重量％〜１重量％（ｗ／ｖ）（例えば、０．０１重量％〜０．０５重量％（ｗ／ｖ））である。

本明細書中に記載の他の実施形態において、上記サブミクロンの水中油型エマルジョンは、４〜５％ ｗ／ｖ スクアレン、０．２５〜１．０％ ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレンエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））および／または０．２５〜１．０％ Ｓｐａｎ ８５^ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、ならびに必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙ）ホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有する。

他の実施形態において、上記ミクロン未満の水中油型エマルジョンは、本質的に以下からなる：（１）５容量％のスクアレン；および（２）Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレン（ｅｌｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノオレエート）およびＳｐａｎ ８５^ＴＭ（ソルビタントリオレエート）からなる群より選択される１つ以上の乳化剤（ここで存在する乳化剤の総量は、１重量％（ｗ／ｖ）である）；ここでスクアレンおよび乳化剤は、水中油型エマルジョンの形態で存在し、この水中油型エマルジョンは油滴を有し、この油滴の実質的に全てが、直径約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である。ここで上記組成物は、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーを欠き、さらに、上記ミクロン未満の水中油型エマルジョンは、ＨＣＶ抗原に対する免疫応答を増大し得る。

他の実施形態において、上記１以上の乳化剤は、ポリオキシエチレン（ｅｌｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートであり、存在するポリオキシエチレン（ｅｌｔｈｙｌｅｎｅ）ソルビタンモノオレエートおよび存在するソルビタントリオレエートの総量は、１重量％（ｗ／ｖ）である。

特定の実施形態において、上記組成物は、ムラミルペプチドを欠く。

本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。

（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別段規定されなければ、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の当該分野の技術範囲内の方法を使用する。このような技術は、文献中に詳細に例示される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。

本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明らかに内容がそうでないと示されない限り、複数形態を含むことが注意されなければならない。従って、例えば、「抗原」との言及は、２以上の抗原の混合物などを含む。

以下のアミノ酸の略語は、本明細書中全体を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。

（Ｉ．定義）
本発明を記載するにあたり、以下の用語が使用され、以下に示すように定義すること外とされる。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントがともに、この定義内に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」とは、改変（例えば、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（一般に、性質が保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通じてのように意図的であってもよいし、タンパク質を精製する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーを通じてのような、偶然であってもよい。

「Ｅ１ポリペプチド」によって、ＨＣＶ Ｅ１領域に由来する分子を意味する。ＨＣＶ−１の成熟Ｅ１領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられたポリタンパク質のほぼアミノ酸１９２で始まり、ほぼアミノ酸３８３へと続く（図１および２Ａ〜２Ｃを参照のこと。図２Ａ〜２Ｃのアミノ酸１９２〜３８３は、配列番号４のアミノ酸２０位〜２１１位に対応する）。約１７３〜約１９１のアミノ酸（配列番号４のアミノ酸１〜１９）は、Ｅ１のシグナル配列として働く。従って、「Ｅ１ポリペプチド」とは、前駆体Ｅ１タンパク質（シグナル配列を含む）、または成熟Ｅ１ポリペプチド（この配列を欠く）のいずれか、または異種シグナル配列を有するＥ１ポリペプチドですらも意味する。このＥ１ポリペプチドは、ほぼアミノ酸３６０位〜３８３位に存在するＣ末端膜アンカー配列を含む（国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１（１９９６年２月１５日公開）を参照のこと）。本明細書中に規定される場合、Ｅ１ポリペプチドは、Ｃ末端アンカー配列またはその一部を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。

「Ｅ２ポリペプチド」によって、ＨＣＶ Ｅ２領域に由来する分子を意味する。ＨＣＶ−１の成熟Ｅ２領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられる、ほぼアミノ酸３８３〜３８５で始まる（図１および２Ａ〜２Ｃを参照のこと。図２Ａ〜２Ｃのアミノ酸３８３〜３８５は、配列番号４のアミノ酸２１１位〜２１３位に対応する）。シグナルペプチドは、ポリタンパク質のほぼアミノ酸３６４で始まる。従って、「Ｅ２ポリペプチド」によって、前駆体Ｅ２タンパク質（シグナル配列を含む）または成熟Ｅ２ポリペプチド（この配列を欠く）のいずれか、またはまたは異種シグナル配列を有するＥ２ポリペプチドですらも意味する。このＥ２ポリペプチドは、ほぼアミノ酸７１５位〜７３０位に存在するＣ末端膜アンカー配列を含み、ほぼアミノ酸残基７４６程度の範囲まで及び得る（Ｌｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：５０６３−５０７３を参照のこと）。本明細書中で記載される場合、Ｅ２ポリペプチドは、Ｃ末端アンカー配列またはその一部を含んでいても、含んでいなくてもよい。さらに、Ｅ２ポリペプチドはまた、Ｅ２のＣ末端にすぐ隣接して存在するｐ７領域の全てまたは一部を含み得る。図１および２Ａ〜２Ｃに示されるように、このｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた７４７〜８０９位（配列番号４のアミノ酸５７５位〜６３７位）に見いだされる。さらに、ＨＣＶ Ｅ２の複数の種が存在することが既知である（Ｓｐａｅｔｅら，Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）。従って、本発明の目的に関して、用語「Ｅ２」は、これらの種のＥ２のいずれかを含む。これらの種としては、Ｅ２のＮ末端から１〜２０またはそれ以上のアミノ酸の欠失（例えば、１、２、３、４、５．．．１０．．．１５、１６、１７、１８、１９．．．などのアミノ酸の欠失）を有する種が挙げられるが、これらに限定されない。このようなＥ２種は、アミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３などで始まる種を含む。

ＨＣＶ−１由来の代表的なＥ１およびＥ２領域は、図２Ａ〜２Ｃおよび配列番号４に示される。本発明の目的に関して、Ｅ１領域およびＥ２領域は、ＨＣＶ−１のゲノムによりコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号付けに関して規定され、開始メチオニンが、１位で示される。例えば、Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照のこと。しかし、用語「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、ＨＣＶ−１配列に限定されないことが注意されるべきである。この点に関して、他のＨＣＶ分離株の対応するＥ１領域またはＥ２領域は、その分離株に由来する配列を、最大限整列させる様式にて、整列させることにより容易に決定され得る。このことは、多くのコンピューターソフトウェアパッケージのいずれか（例えば、ＡＬＩＧＮ １．０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（宛先：Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）から入手可能）を用いて行われ得る。Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：２４４４−２４４８を参照のこと。

さらに、「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」は、本明細書中で規定される場合、示される図面に記載される正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、このＨＣＶゲノムは、インビボでの一定の流出の状態にあり、分離株間で比較的高い程度の可変性を示すいくつかの可変ドメインを含む。多くの保存された可変領域は、一般にこれらの株の間で既知であり、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合に、高い程度の配列相同性（例えば、３０％を超えるアミノ酸配列相同性、好ましくは、４０％を超える、６０％を超える、および８０−９０％相同性を超えさえする）を有する。この用語が、種々のＨＣＶ株およびＨＣＶ分離株のいずれか（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９（例えば、株１、２、３、４など）に記載のＨＣＶの６つのゲノムのうちのいずれかを有する分離株、ならびに新たに同定された分離株、およびこれらの分離株のサブタイプ（例えば、ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂなど）を含む）に由来するＥ１およびＥ２ポリペプチドを含むことは容易に明らかである。

従って、例えば、用語「Ｅ１」ポリペプチドまたは「Ｅ２」ポリペプチドとは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来するネイティブなＥ１配列またはＥ２配列、ならびに以下にさらに詳細に規定されるアナログ、変異体および免疫原性フラグメントをいう。これらの株のうちの多くの完全遺伝子型は、既知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＪ２３８８００およびＡＪ２３８７９９を参照のこと。

さらに、用語「Ｅ１ポリペプチド」および「Ｅ２ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する改変（例えば、内部欠失、付加、および置換（概して性質が保存的）を含むタンパク質を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように意図的であってもよいし、天然に存在する変異事象を介してのように、偶発的であってもよい。これらの改変の全ては、改変Ｅ１ポリペプチドおよび改変Ｅ２ポリペプチドがその意図した目的について機能する限り、本発明に含まれる。従って、例えば、このＥ１および／またはＥ２ポリペプチドは、ワクチン組成物において使用されるべきである場合、上記改変は、免疫学的活性（すなわち、このポリペプチドに対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起する能力）が失われないようにされなければならない。

「Ｅ１Ｅ２」複合体によって、上記のような少なくとも１つのＥ１ポリペプチドおよび少なくとも１つのＥ２ポリペプチドを含むタンパク質を意味する。このような複合体はまた、Ｅ２のＣ末端にすぐ隣接して存在するｐ７領域の全てまたは一部を含み得る。図１および２Ａ〜２Ｃに示されるように、このｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた７４７位〜８０９位（配列番号４のアミノ酸５７５位〜６３７位）に見いだされる。このｐ７タンパク質を含む代表的なＥ１Ｅ２複合体は、本明細書中で「Ｅ１Ｅ２_８０９」といわれる。

Ｅ１Ｅ２複合体におけるＥ１とＥ２の会合の様式は、重要ではない。Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、非共有結合（例えば、静電力を介する）、または共有結合により会合され得る。例えば、本出願のＥ１Ｅ２ポリペプチドは、上記で規定された免疫原性Ｅ１ポリペプチドおよび免疫原性Ｅ２ポリペプチドを含む、融合タンパク質の形態であり得る。この融合物は、Ｅ１Ｅ２キメラをコードするポリヌクレオチドから発現され得る。あるいは、Ｅ１Ｅ２複合体は、個々に生成されたＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を単に混合することにより自発的に形成され得る。同様に、同時発現され、培地に分泌される場合、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に複合体を形成し得る。従って、この用語は、Ｅ１および／またはＥ２の精製の際に自発的に形成するＥ１Ｅ２複合体（凝集体ともよばれる）を含む。このような凝集体は、１以上のＥ２モノマーと会合した１以上のＥ１モノマーを含み得る。存在するＥ１モノマーおよびＥ２モノマーの数は、少なくとも１つのＥ１モノマーおよび１つのＥ２モノマーが存在する限り、等しくなくてもよい。Ｅ１Ｅ２複合体の存在の検出は、標準的なタンパク質検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）および免疫学的技術（例えば、免疫沈降）を使用して、容易に決定され得る。

用語「アナログ」および「ムテイン」とは、参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはそのような誘導体のフラグメントをいい、この誘導体または誘導体のフラグメントは、所望の活性（例えば、本明細書中に記載されるアッセイにおける免疫反応性）を保持する。一般に、用語「アナログ」とは、ネイティブ分子に対して１以上のアミノ酸付加、置換（一般に性質が保存的）および／または欠失が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブポリペプチド配列を有する化合物、ならびにネイティブ分子に対して上記の改変を有する構造物をいう。用語「ムテイン」とは、１以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチド（例えば、国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２に記載されるもの）をいう。好ましくは、このアナログまたはムテインは、ネイティブ分子と少なくとも同じ免疫反応性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、以下にさらに記載される。

特に好ましいアナログは、性質が保存的である置換（すなわち、アミノ酸側鎖に関連したアミノ酸のファミリー内で生じる置換）を含む。具体的には、アミノ酸は、概して、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非電荷極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、チロシン、およびチロシンは、ときおり、芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単離された置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似の保存的置換は、生物学的活性に対する大きな影響を有さないことが合理的に類推される。例えば、目的のポリペプチドは、約５〜１０個までの保存的置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは約１５〜２５個もしくは５０個までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換すら、あるいは、分子の所望の機能がインタクトである限り、５〜５０個の間の任意の整数の保存的置換または非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓプロットおよびＫｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、変化を許容する目的の分子の領域を容易に決定し得る。

「フラグメント」によって、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図する。このフラグメントは、ネイティブポリペプチドのＣ末端欠失およびＮ末端欠失、ならびに／または内部欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、概して、エピトープを規定する、全長分子のうちの少なくとも約５〜１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは、全長分子のうちの少なくとも約１５〜２５個の連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは、全長分子のうちの少なくとも約２０〜５０個またはそれ以上の個数の連続するアミノ酸残基、あるいは問題のフラグメントが、本明細書中に規定される免疫学的応答を誘発する能力を維持するのであれば、５アミノ酸と全長配列の間の任意の整数を含む。ＨＣＶ Ｅ１およびＨＣＶ Ｅ２の既知の免疫原性フラグメントの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５を参照のこと。

用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも約３〜５個、好ましくは、約５〜１０個または１５個の配列であって、約５００個以下のアミノ酸（またはそれらの間の任意の整数）をいい、このエピトープは、より大きな配列自体またはその一部として配列を規定し、これが投与される被験体における免疫学的応答を誘発する。しばしば、エピトープは、このような配列に応じて生成された抗体に結合する。フラグメントの長さに対する臨界的上限はなく、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長、またはＨＣＶポリタンパク質に由来する２以上のエピトープを含む融合タンパク質すら含み得る。本発明において使用するためのエピトープは、親タンパク質から由来するその一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、一定の流出の状態にあり、単離株間で比較的高い程度の可変性を示すいくつかの可変性ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブ配列と同一である配列、ならびにネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に性質が保存的）を含む。

エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の任意の多くのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（このペプチドは、タンパク質分子の一部に対応する）を同時に合成し、このペプチドを、ペプチドが支持体に結合したまま抗体と反応させることにより決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載される。このような技術を用いて、多くのＨＣＶエピトープが同定された。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０−３２４、およびさらに以下を参照のこと。同様に、立体エピトープは、例えば、ｘ線結晶構造学および二次元核磁気共鳴により、アミノ酸の空間的配置を決定することにより、容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的抗原性およびハイドロパシープロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して起算されるもの）を使用して同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）およびハイドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。

本明細書中で使用される場合、用語「立体エピトープ」とは、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対してネイティブな構造特徴を有する、全長タンパク質の一部、またはそのアナログもしくはムテインをいう。ネイティブ構造特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、これらのエピトープが抗原の三次元形状（例えば、折りたたみ）により形成されると考えられるので、広いバリエーションに供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、数が比較的少数であり得るが、分子の長さに沿って（またはダイマーの場合に異なる分子上にすら）広く分散し得、折りたたみを介して正確なエピトープコンホメーションにされる。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、エピトープの立体構造に重要でない可能性がある。例えば、これらの介在配列の欠失または置換は、エピトープコンホメーションに重要な配列（例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化部位に関与するシステインなど）が維持されるのであれば、立体エピトープに影響を及ぼさない可能性がある。

立体エピトープは、上記で議論される方法を使用して容易に同定される。さらに、所定のポリペプチド中の立体エピトープの存在および非存在は、目的の抗原を抗体（立体エピトープに対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体）でスクリーニングし、その反応性を、直鎖状エピトープのみを有する抗原（あるならば）の変性バージョンの反応性と比較することにより容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を最初に変性抗原に吸着させ、ポリクローナル血清が目的の抗原に対する抗体を保持するか否かを見ることが、有利であり得る。Ｅ１領域およびＥ２領域に由来する立体エピトープは、例えば、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８に記載される。

ＨＣＶ抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体において目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が発生することである。本発明の目的に関して、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいうのに対し、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と結合して示され、細胞表面に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞表面上のＭＨＣ分子と結合してペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクタ細胞の機能の刺激を補助する様に働き、このエフェクタ細胞の活性を集中させる。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）により生成される他のこのような分子の生成をいう。細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、脊椎動物被験体を、細胞表面でＭＨＣ分子と結合して抗原を提示することにより感作するように作用し得る。この細胞媒介性免疫応答は、細胞表面にて抗原を提示する細胞に、またはこのような細胞付近に方向付けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫した宿主の将来的な防御を可能にするように生成され得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイにより（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイにより）、または感作した被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることにより決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。

従って、本明細書中に記載される免疫学的応答は、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答（例えば、結合中和（ＮＯＢ）抗体を含む）を惹起し得る。ＮＯＢ抗体応答の存在は、例えば、Ｒｏｓａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３；１７５９に記載される技術により容易に決定される。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１つ以上を包含し得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原に特異的に対する、サプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体−補体または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対して防御または症状の軽減を提供するように作用し得る。そのような応答は、当該分野で周知の標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して、測定され得る。

本明細書中で使用される場合、「免疫刺激ヌクレオチド配列」または「ＩＳＳ」は、少なくとも１つの免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ−ＯＤＮ）部分を含むポリヌクレオチドを意味する。このＩＳＳ部分は、少なくとも６ヌクレオチド塩基を有する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、改変オリゴヌクレオチドもしくは改変オリゴヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれらからなり得る。このＩＳＳ部分は、パリンドロームであり得るＣＧ含有ヌクレオチド配列またはｐ（１Ｃ）ヌクレオチド配列を、含むかまたはそれらの配列が隣接し得る。そのシステインは、メチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。本発明における使用のための特定のＩＳＳ分子の例としては、ＣｐＧ分子（下記にさらに考察される）、ならびにＣｐＹ分子およびＣｐＲ分子などが挙げられる。

ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２組成物の成分（例えば、ミクロン未満の水中油エマルジョンまたはＣｐＧオリゴヌクレオチド）は、この組成物が、さらなる成分を伴わずに送達された場合に等量のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原により惹起される免疫応答よりも大きい免疫応答惹起能力を保有する場合に、この組成物中に存在するＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を増強する。そのような増強された免疫原性は、さらなる成分を伴うこの抗原組成物およびさらなる成分を伴わないこの抗原組成物を投与すること、そして当該分野で周知の標準的アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ）を使用して、その２つに対する抗体力価を比較することによって、決定され得る。

「組換え」タンパク質とは、所望の活性を保持し、かつ本明細書中に記載されるような組換えＤＮＡ技術により調製された、タンパク質である。一般に、目的の遺伝子が、クローニングされ、その後、下記にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現される。その宿主生物は、発現条件下でそのタンパク質を産生するように外来遺伝子を発現する。

「単離された」によって、ポリペプチドを言及する場合、示された分子がその分子が天然で見出される生物全体から分離され別個であること、または示された分子が同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しない状態で存在することが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」とは、天然で通常付随する配列すべてまたは一部を欠く、核酸分子であるか；または天然で存在する通りであるが、それに付随する異種配列を有する配列であるか；または染色体から解離している分子である。

「等価な抗原決定基」によって、異なるＨＣＶ亜種または異なるＨＣＶ株由来する（例えば、ＨＣＶの株１、２、３などに由来する）抗原決定基が意味され、その抗原決定基は、配列の変化に起因して必ずしも同一ではないが、問題のＨＣＶ配列中の等価な位置に存在する。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列を整列した場合に、高い程度の配列相同性（例えば、３０％を超えるアミノ酸配列相同性、通常は、４０％を超える相同性（例えば、６０％を超える相同性、そして８０〜９０％さえも超える相同性））を有する。

「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分間または２つのポリペプチド部分間の同一性パーセントを指す。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、その分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の、配列同一性を示す場合に、それらは互いに対して「実質的に相同である」。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列を指す。

一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド−ヌクレオチド対応またはアミノ酸−アミノ酸対応を指す。同一性パーセントは、２つの分子間の配列情報を、その配列を整列し、整列した２つの配列間の正確な一致数を計数し、短い方の配列の長さで除算し、その結果に１００を乗算することによって直接比較することによって、決定され得る。容易に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ 補遺３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；これは、ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））が、この分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラム（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＧＡＰプログラム）が、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において利用可能である。これらのプログラムは、製造業者により推奨されそして上記に言及されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載される、デフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを、デフォルトのスコアリング表および６ヌクレオチド位のギャップペナルティとともに使用して、決定され得る。

本発明の状況において同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権を保有される、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発されＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配給される、ＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用され得、そのアルゴリズムにおいて、デフォルトパラメータ（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１、およびギャップ６）が、スコアリング表のために使用される。作成されたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムが、当該分野で一般的に公知であり、例えば、別のアライメントプログラムＢＬＡＳＴが、デフォルトパラメータとともに使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが、以下のデフォルトパラメータ：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０個の配列；分類（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝非リダンダント（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ），ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用して使用され得る。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにて見出され得る。

あるいは、相同性は、相同な領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼにより消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって、決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列が、例えば、特定の系について規定されるような、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。

（ＩＩ．発明を実施する様式）
本発明を詳細に記載する前に、特定の処方物またはプロセスパラメータは当然変動し得るので、本発明は、そのような特定の処方物またはプロセスパラメータに限定されないことが、理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定するものであることは意図されないこともまた、理解されるべきである。

本明細書中に記載される組成物および方法に類似するかまたは等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。

上記のように、本発明は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原は、ＭＴＰ−ＰＥを欠くミクロン未満の水中油エマルジョン、ならびにミクロン未満の水中油エマルジョンおよび免疫刺激核酸（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）と組み合わせて、そのようなアジュバントを用いずに観察される抗体力価よりも有意に高い抗体力価を惹起する、組成物を提供する。ＥＩＥ２ポリペプチドによるＨＣＶ特異的抗体の惹起は、ＨＣＶワクチンの開発のための（特に、強力な抗Ｅ１抗体力価、抗Ｅ２抗体力価、および／または抗Ｅ１Ｅ２抗体力価の生成ならびに／あるいはＨＣＶに対する細胞免疫応答に関連する、ＨＣＶ Ｅ１ポリペプチドエピトープ、Ｅ２ポリペプチドエピトープ、およびＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ポリペプチドエピトープを同定するための）インビトロモデル系およびインビボモデル系の両方を提供する。Ｅ１Ｅ２ポリペプチドはまた、哺乳動物においてＨＣＶに対する免疫応答（特に、抗Ｅ１抗体応答、抗Ｅ２抗体応答、および／もしくは抗Ｅ１Ｅ２抗体応答ならびに／または細胞免疫応答）を、治療目的または予防目的のいずれかのために生成するために使用され得る。

本発明のさらなる理解のために、より詳細な考察が、本組成物、ミクロン未満の水中油エマルジョン、免疫刺激核酸分子、および上記を含む組成物の生成における使用のためのＥ１Ｅ２ポリペプチドに関して以下に提供される。

（Ｅ１Ｅ２ポリペプチド）
上記に説明したように、本組成物とともに使用するためのＥ１Ｅ２複合体は、非共有結合相互作用または共有結合相互作用のいずれかを介して結合している、Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドを含む。Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムは、代表的には、約９，６００ヌクレオチドの１つのオープンリーディングフレームを含み、このオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質へと転写される。ＨＣＶポリタンパク質は、ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、多数の別個の産物を生成するように切断される（図１を参照のこと）。このＨＣＶ Ｅ１ポリペプチドは、糖タンパク質であり、およそアミノ酸１９２からアミノ酸３８３（ＨＣＶ−１のポリタンパク質に対する番号付け）までに広がる。Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５を参照のこと。１７３付近〜およそ１９１のアミノ酸は、Ｅ１についてのシグナル配列をしめす。ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドもまた、糖タンパク質であり、およそアミノ酸３８３またはアミノ酸３８４からアミノ酸７４６までに広がる。Ｅ２についてのシグナル配列は、そのポリタンパク質のおよそアミノ酸３６４で始まる。従って、用語「全長」Ｅ１または「短縮されていない」Ｅ１とは、本明細書中で使用される場合、（ＨＣＶ−１に対して番号付けして）ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸１９２〜３８３を含むポリペプチドを指す。Ｅ２に関して、「全長」または「短縮されていない」とは、本明細書中で使用される場合、（ＨＣＶ−１に対して番号付けして）ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸３８３または３８４〜アミノ酸７４６を含むポリペプチドを指す。本開示から明白であるように、本発明とともに使用するためのＥ２ポリペプチドは、ｐ７領域由来のさらなるアミノ酸（例えば、アミノ酸７４７〜８０９）を含み得る。

上記で説明したように、Ｅ２は、複数の種として存在し（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９〜８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７〜５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５〜１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７〜４０２６）、そして切り取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）およびタンパク質分解が、Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端で生じ得る。従って、本明細書中での使用のためのＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けして、ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸４０５〜６６１（例えば、４００、４０１、４０２〜６６１）、例えば、３８３もしくは３８４〜６６１、３８３もしくは３８４〜７１５、３８３もしくは３８４〜７４６、３８３もしくは３８４〜７４９または３８３もしくは３８４〜８０９、または３８３もしくは３８４から６６１〜８０９間の任意のＣ末端まで、を含み得る。同様に、本明細書中で使用するために好ましいＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、１９２〜３３０、１９２〜３３３、１９２〜３６０，１９２〜３８３、または１９２から３２６〜３８３間の任意のＣ末端までを含み得る。

Ｅ１Ｅ２複合体はまた、エピトープを含むＥ１の免疫原性フラグメントおよびＥ２の免疫原性フラグメントから構成され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドフラグメントは、約５〜Ｅ１分子のほぼ全長（例えば、Ｅ１ポリペプチドの６アミノ酸、１０アミノ酸、２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、１８５アミノ酸もしくはそれ以上、または記載された数の間の任意の整数を含み得る。同様に、Ｅ２ポリペプチドフラグメントは、Ｅ２ポリペプチドの６アミノ酸、１０アミノ酸、２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸もしくは３５０アミノ酸、または記載された数の間の任意の整数を含み得る。このＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、同じＨＣＶ株に由来しても、異なるＨＣＶ株に由来してもよい。

例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０に広がる領域）に由来するエピトープが、Ｅ２ポリペプチドに含まれ得る。そのＥ２配列中に組み込むための特に有効なＥ２エピトープは、この領域由来のコンセンサス配列（例えば、コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（これは、ＨＣＶ １型ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０についてのコンセンサス配列を示す）を含むエピトープである。Ｅ１およびＥ２のさらなるエピトープが、公知であり、そして例えば、Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５に記載される。

さらに、その複合体のＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインのすべてまたは一部を欠き得る。その膜アンカー配列は、小胞体にそのポリペプチドを会合するように機能する。通常、そのようなポリペプチドは、そのタンパク質を発現する生物が培養される増殖培地中に分泌可能である。しかし、国際公開番号ＷＯ９８／５０５５６に記載されるように、そのようなポリペプチドはまた、細胞内でも回収され得る。増殖培地中への分泌は、多数の検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む）および免疫学的技術（例えば、１９９６年２月１５日公開の国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１）に記載されるような免疫沈降アッセイ）を使用して、容易に決定され得る。Ｅ１に関して、一般的に、およそアミノ酸３７０位以上（ＨＣＶ−Ｅ１の番号付けに基く）で終結するポリペプチドは、ＥＲにより保持され、従って、増殖培地中に分泌されない。Ｅ２に関して、およそアミノ酸７３１位以上（これもまた、ＨＣＶ−Ｅ２の番号付けに基く）で終結するポリペプチドは、ＥＲにより保持され、増殖培地中に分泌されない。（例えば、１９９６年２月１５日公開の国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１を参照のこと。）これらのアミノ酸位置は絶対ではなく、ある程度まで変動し得ることが、留意されるべきである。従って、本発明は、膜貫通結合ドメインを保持するＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドの使用を企図し、膜貫通結合ドメインのすべてまたは一部（およそアミノ酸３６９以下で終結するＥ１ポリペプチドと、およそアミノ酸７３０以下で終結するＥ２ポリペプチドとを含む）を欠くポリペプチドが、本発明により捕捉されることが意図される。さらに、Ｃ末端短縮は、この膜貫通ドメインを超えてＮ末端方向へと広がり得る。従って、例えば、３６０以下の位置で生じるＥ１短縮および例えば、７１５以下の位置で生じるＥ２短縮もまた、本発明により包含される。必要なすべてのことは、短縮型Ｅ１ポリペプチドおよび短縮型Ｅ２ポリペプチドが、その意図される目的のために機能性を保持することである。しかし、特定の好ましい短縮型Ｅ１構築物は、およそアミノ酸３００を超えては広がらない構築物である。最も好ましいのは、３６０位で終結する構築物である。好ましい短縮型Ｅ２構築物は、およそアミノ酸７１５位を超えて広がらないＣ末端短縮を含む構築物である。特に好ましいＥ２短縮物は、アミノ酸７１５〜７３０のいずれか（例えば、７２５）の後で短縮された分子である。短縮型分子が使用される場合、両方ともが短縮型のＥ１分子およびＥ２分子を使用することが、好ましい。

Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドならびにその複合体はまた、アシアロ糖タンパク質として存在し得る。そのようなアシアロ糖タンパク質は、当該分野で公知の方法によって、例えば、末端グリコシル化がブロックされた細胞を使用することによって、産生される。これらのタンパク質がそのような細胞中で発現されそしてＧＮＡレクチンアフィニティクロマトグラフィによって単離される場合、そのＥ１タンパク質とＥ２タンパク質とは、自発的に凝集する。これらのＥ１Ｅ２凝集物を産生するための詳細な方法は、例えば、米国特許第６，０７４，８５２号に記載されている。

さらに、Ｅ１Ｅ２複合体は、上記のように、切り取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）およびタンパク質分解性切断に起因して、分子の不均質混合物として存在し得る。従って、Ｅ１Ｅ２複合体を含む組成物は、複数のＥ１Ｅ２種（例えば、アミノ酸７４６で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２_７４６）、アミノ酸８０９で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２_８０９））、または上記の他の種々のＥ１分子およびＥ２分子のいずれか（例えば、１〜２０アミノ酸のＮ末端短縮を含むＥ２分子（例えば、アミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３などで始まるＥ２種））を含み得る。

Ｅ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質としてか、または例えば、目的のＥ１ポリペプチドをコードする構築物とＥ２ポリペプチドをコードする構築物とで宿主細胞を同時トランスフェクトすることによってのいずれかで、容易に組換え産生される。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかで、すなわち、別個のベクターを使用することによってか、またはＥ１遺伝子およびＥ２遺伝子の両方を保有する単一のベクターを使用することによって、達成され得る。単一のベクターを使用して行われる場合、両方の遺伝子が単一の制御エレメントセットにより駆動され得るか、あるいは、それらの遺伝子は、個々の制御エレメントにより駆動される個々の発現カセット中にて、ベクター上に存在し得る。発現後、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に会合する。あるいは、その複合体は、精製形態または半精製形態のいずれかで別個に産生された個々のタンパク質を一緒に混合することによってか、またはそれらのタンパク質が分泌される場合は、それらのタンパク質を発現する宿主細胞が培養された培養培地を混合することによってさえ、形成され得る。最後に、本発明のＥ１Ｅ２複合体は、Ｅ１の所望の部分がＥ２の所望の部分に融合された融合タンパク質として、発現され得る。

Ｅ１Ｅ２複合体を、培地中に分泌される全長Ｅ１タンパク質および全長Ｅ２タンパク質ならびに短縮型Ｅ１タンパク質および短縮型Ｅ２タンパク質、ならびに細胞内産生された短縮型タンパク質から生成するための方法は、当該分野で公知である。例えば、そのような複合体は、米国特許第６，１２１，０２０号；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３〜６７６１；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５〜１３９５；およびＬａｎｆｏｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７：２２５〜２３５に記載されるように、組換え産生され得る。

従って、本発明とともに使用するためのＨＣＶ Ｅ１ポリペプチドよびＥ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準的分子生物学技術を使用して、生成され得る。例えば、上記分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して、例えば、その遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってか、またはその遺伝子を含むことが既知のベクターからその遺伝子を誘導することによって、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、ウイルス核酸分子から、当該分野で記載されている技術（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号）を使用して、直接単離され得る。目的の遺伝子は、クローニングされるよりも、むしろ合成により生成され得る。その分子は、特定の配列についての適切なコドンを用いて設計され得る。その後、その完全な配列が、標準的方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから集合され、そして完全なコード配列へと集合される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。

従って、特定のヌクレオチド配列が、所望の配列を保有するベクターから得られ得るか、または当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合は、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を使用して、完全合成または部分合成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るための１方法は、従来の自動ポリヌクレオチド合成機において生成された重複合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングし、その後、適切なＤＮＡリガーゼを用いて連結し、そして連結したヌクレオチド配列をＰＣＲを介して増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４０８４〜４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向的合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ５４：７５〜８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜１５３６）およびギャップがあるオリゴヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して酵素的に充填すること（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜１００３０）が、変化または増強した、抗原結合能および免疫原性を有する分子を提供するために使用され得る。

一旦コード配列が調製または単離されると、そのような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコン中にクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが、当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、選択事項である。適切なベクターとしては、適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能である、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

その後、そのコード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切な制御エレメントの制御下に配置される。従って、そのコード配列は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）、そして必要に応じてオペレーターの制御下に、目的のＤＮＡ配列が適切な形質転換体によりＲＮＡへと転写されるように、配置され得る。そのコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列（その後、翻訳後プロセシングにおいて宿主により除去され得る）を含んでも含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。

制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に対して配列の発現の調節を可能にする、調節配列を付加することが望ましくあり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、化学的刺激または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする、配列が挙げられる。他の型の調節エレメントもまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントが、その構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７）、ならびにヒトＣＭＶ由来のエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列中に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号））が、挙げられる。その発現カセットは、適切な宿主細胞中での自律複製のための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高コピー数の能力、および強力なプロモーターをさらに含み得る。

発現ベクターは、特定のコード配列が適切な調節配列とともにそのベクター中に位置し、制御配列に対するコード配列の位置および方向が、そのコード配列が制御配列の「制御」下で転写される（すなわち、その制御配列にてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが、そのコード配列を転写する）ように、構築される。目的の分子をコードする配列の改変が、この目的を達成するために望ましいかもしれない。例えば、いくつかの場合において、適切な方向で制御配列に結合され得る（すなわち、リーディングフレームを維持する）ように、その配列を改変することが必要であり得る。その制御配列および他の調節配列が、ベクター中に挿入される前に、コード配列に連結され得る。あるいは、そのコード配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含む発現ベクター中に、直接クローニングされ得る。

上記で説明したように、目的のポリペプチドの変異体またはアナログを生成することが、望ましくあり得る。本組成物における使用のためのＨＣＶポリペプチドの変異体またはアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部の欠失によって、配列の挿入によって、および／または１つ以上のヌクレオチドをその配列で置換することによって、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９を参照のこと。

この分子は、広範な種類の系（昆虫発現系、哺乳動物発現系、細菌発現系、ウイルス発現系、および酵母発現系（すべて当該分野で周知である）を含む）において発現され得る。

例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから（「ＭａｘＢａｃ」キット）、市販されている。同様に、細菌細胞発現系および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。酵母発現系もまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９），Ｂｕｔｔｅｒｗｏｔｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載される。

上記の系とともに使用するための多数の適切な宿主細胞もまた、公知である。例えば、哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような哺乳動物細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、胎仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｓｏｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞など）が、挙げられるがこれらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、本発現構築物とともに使用することが見出される。本発明において有用な酵母宿主としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターとともに使用するために昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。

目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を使用して、宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中において安定なエピソームエレメント上で維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。

選択される発現系および宿主に依存して、この分子は、上記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、タンパク質が発現される条件下で増殖させることにより生成される。次いで、発現されたタンパク質が宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系がタンパク質を増殖培地に分泌する場合、この産物は、培地から直接精製され得る。タンパク質が分泌されない場合、タンパク質は細胞溶解産物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の範囲内である。

（組成物）
一旦生成されれば、Ｅ１Ｅ２抗原は、ワクチン組成物（例えば、予防ワクチン（感染の予防のため）または治療ワクチン（感染後のＨＣＶの治療のため））中に提供され得る。ワクチンは、１つ以上のＥ１Ｅ２複合体の混合物（例えば、１つより多くのウイルス分離株に由来するＥ１Ｅ２複合体）ならびにさらなるＨＣＶ抗原を含み得る。さらに、上述のように、Ｅ１Ｅ２複合体は、クリッピングおよびタンパク質分解切断に起因する、分子の異種混合物として存在し得る。従って、Ｅ１Ｅ２複合体を含む組成物は、複数種のＥ１Ｅ２（例えば、アミノ酸７４６で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２_７４６）、アミノ酸８０９で終結するＥ１Ｅ２８（Ｅ１Ｅ２_８０９））または上記の他の種々のＥ１分子およびＥ２分子のいずれか（例えば、１〜２０アミノ酸のＮ末端短縮を有するＥ２分子（例えば、アミノ酸３８７で始まるＥ２種、アミノ酸４０２で始まるＥ２種、アミノ酸４０３で始まるＥ２種など））を含み得る。

ワクチンは、他の抗原および免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（これらとしては、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、ＦＬＰ−３、リバビリン、およびＲＡＮＴＥＳのようなサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない））と共に投与され得る。

一般に、ワクチンは、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。

必要に応じて、キャリアが存在し、これは、それ自体は組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない分子である。適切なキャリアは、代表的には、大きく、緩慢に代謝する高分子である。このような分子としては、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子が挙げられる。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、ＨＣＶポリペプチドは、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来するトキソイド）に結合体化され得る。

本明細書中で説明するように、サブミクロン水中油エマルジョンおよび／またはＩＳＳ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（以下にさらに説明する）が、免疫応答を増強するために、同じ組成物中に存在し得る。さらなるアジュバントもまた存在し得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン（ａｌｕｍ））（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（これは、２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ））を含む）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が用いられ得るか、それから粒子が生成され得る（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ここでＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を含まないものであり得る）（例えば、国際公開公報ＷＯ００／０７６２１を参照のこと）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など（例えば、国際公開公報ＷＯ９９／４４６３６を参照のこと）、インターフェロン（例えば、γ−インターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の解毒変異体（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）の解毒変異体、百日咳毒素（ＰＴ）の解毒変異体、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）の解毒変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（６３位において野生型アミノ酸の代わりにリジンに置換されている）ＬＴ−Ｒ７２（７２位において野生型アミノ酸の代わりにアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９位において野生型アミノ酸の代わりにセリンに置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９位において野生型アミノ酸の代わりにリジンに、かつ１２９位においてグリシンに置換されている）（国際公開公報Ｗ０９３／１３２０２およびＷ０９２／１９２６５を参照のこと）；（７）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ２２２０２２１；ＥＰＡ０６８９４５４を参照のこと）、必要であれば、ミョウバン（ａｌｕｍ）が実質的に存在しない（例えば、国際公開公報ＷＯ００／５６３５８を参照のこと）；（８）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョン（ｅｍｕｌａｔｉｏｎ）との組み合わせ（例えば、ＥＰＡ０８３５３１８；ＥＰＡ０７３５８９８；ＥＰＡ０７６１２３１を参照のこと）；（９）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開公報ＷＯ９９／５２５４９を参照のこと）；（１０）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、国際公開公報ＷＯ００／６２８００を参照のこと）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、国際公開公報ＷＯ００／２３１０５を参照のこと）；（１２）サポニンおよび水中油エマルジョン（例えば、国際公開公報ＷＯ９９／１１２４１を参照のこと）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（例えば、国際公開公報ＷＯ９８／５７６５９を参照のこと）；および（１４）組成物の有効性を増強する免疫刺激剤として作用する他の物質。

ムラミルペプチドとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホルホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。

代表的には、ワクチン組成物は、注入可能物として（例えば、液体溶液または懸濁液のいずれかとして）調製される；注入の前に液体ビヒクル中に溶液または懸濁液とするのに適した固体形態もまた調製され得る。

ワクチンは、治療有効量のＥ１Ｅ２複合体および必要に応じて上記成分の他のいずれかを含む。「治療有効量」とは、それが投与される個体において、免疫応答（好ましくは、防御免疫応答）を誘導するＥ１Ｅ２タンパク質の量を意味する。このような応答は、一般に、ワクチンに対する分泌性の細胞媒介免疫応答および／または抗体媒介免疫応答の被験体における発生を生じる。通常、このような応答としては、１つ以上の以下の効果が挙げられるが、これらに限定されない：免疫クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）のいずれかからの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増殖、および分化シグナルの提示；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγδＴ細胞集団の拡大。

一旦処方されれば、ワクチンは、従来どおりに非経口に（例えば、皮下、または筋肉内のいずれかの注射により）投与される。他の投与形態に適したさらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用が挙げられる。投薬処置は、単一投薬スケジュールまたは多投薬スケジュールであり得る。好ましくは、有効量は、疾患症状の処置または予防をもたらすのに十分である。必要な正確量は、とりわけ、処置される被験体；処置される個体の年齢および全体の状態；個体の免疫系が抗体を合成する能力；所望の防御の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定のＥ１Ｅ２ポリペプチド；およびその投与形態に依存して変動する。適切な有効量は、当業者によって容易に投与され得る。「治療有効量」は、当該分野で公知のインビトロでのモデルおよびインビボでのモデルを用いて慣用の試験を通じて決定され得る比較的広範な範囲である。以下の実施例で使用されるＥ１Ｅ２ポリペプチドの量は、抗Ｅ１抗体、抗Ｅ２抗体および／または抗Ｅ１Ｅ２抗体の惹起を最適化するために使用され得る一般的な指針を提供する。

特に、Ｅ１Ｅ２複合体は、好ましくは、大きな哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に、１回の投薬量当たりおよそ０．１μｇ〜約５．０ｍｇの投薬量で、または述べられた範囲（例えば、０．５μｇ〜約１．０ｍｇ、１μｇ〜約５００μｇ、２．５μｇ〜約２５０μｇ、４μｇ〜約２００μｇ）の間の任意の量、例えば、１投薬量当たり４、５、６、７、８、９、１０．．．２０．．．３０．．．４０．．．５０．．．６０．．．７０．．．８０．．．９０．．．１００などのμｇで注入される。Ｅ１Ｅ２ポリペプチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳動物に投与され得るか、またはＨＣＶ感染哺乳動物に投与され得る。

Ｅ１Ｅ２ポリペプチドの投与は、哺乳動物において、抗Ｅ１抗体価、抗Ｅ２抗体価、および／または抗Ｅ１Ｅ２抗体価を惹起し得、これは、少なくとも１週、２週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年またはより長く続く。Ｅ１Ｅ２ポリペプチドはまた投与されて、記憶応答を提供し得る。このような応答が達成される場合、抗体価は、経時的に減少し得るが、しかしＨＣＶウイルスまたは免疫原への曝露は、例えば、たった２、３日以内での抗体の迅速な誘導を生じる。必要に応じて、抗体価は、初回注射の２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以上後にＥ１Ｅ２ポリペプチドの１回以上のブースター注射を提供することにより、哺乳動物において維持され得る。

好ましくは、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドは、標準的な免疫アッセイ（例えば、以下の実施例に記載の免疫アッセイ）を用いて決定されるような、少なくとも１０、１００、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００、３，０００、５，０００、ｌ０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００，５０，０００（幾何平均力価）、またはそれ以上、あるいは述べられた力価の間の任意の数の抗体価を惹起する。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９３）３４２：９３３；ならびにＣｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１を参照のこと。

（サブミクロン水中油エマルジョン）
上述で説明したように、サブミクロン水中油エマルジョン処方物はまた、脊椎動物被験体に、Ｅ１Ｅ２抗原の送達前、同時に、またはその後のいずれかで投与され得る。本明細書中で使用するためのサブミクロン水中油エマルジョンは、無毒で代謝可能な油および市販の乳化剤を含む。無毒で代謝可能な油の例としては、植物油、魚油、動物油、または合成油が挙げられるが、これらに限定されない。魚油（例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油）が好ましく、スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）（サメ肝油において見出される）が特に好ましい。油成分は、約０．５容量％〜約２０容量％の量、好ましくは、約１５％までの量、より好ましくは、約１％〜約１２％まで、そして最も好ましくは１％〜約４％油で存在する。

アジュバントの水性部分は、緩衝化生理食塩水または純水であり得る。組成物は、非経口投与について意図されるが、組成物と生理流体と間のイオン濃度差に起因する組成物の投与後膨潤または迅速な吸収を防ぐために、張度（すなわち、浸透圧）が通常生理食塩流体と本質的に同じであるように最終濃度を構成することが好ましい。水よりも生理食塩水が使用される場合、通常生理状態と適合可能なｐＨを維持するために、生理食塩水を緩衝化することが好ましい。また、特定の場合、特定の組成物成分の安定性を確実にするために、特定のレベルにｐＨを維持することが必要であり得る。従って、組成物のｐＨは、一般に、ｐＨ６〜８であり、そしてｐＨは、任意の生理学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液、重炭酸緩衝液、炭酸緩衝液など）を用いて維持され得る。存在する水性剤の量は、一般に、組成物を所望の最終容量にするのに必要な量である。

水中油処方物において使用するために適した乳化剤は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、ソルビタントリエステル（例えばＳｐａｎ^ＴＭまたはＡｒｌａｃｅｌ^ＴＭの名称で市販されているもの（例えば、Ｓｐａｎ^ＴＭ ８５（ソルビタントリオレエート）））；ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、またはポリオキシエチレンソルビタントリエステル（これらは、Ｔｗｅｅｎ^ＴＭの名称で商業的に公知である（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）；ポリオキシエチレン脂肪酸（Ｍｙｒｊ^ＴＭの名称で入手可能である）；ポリオキシエチレン脂肪酸エーテル（ラウリルアルコール、アセチルステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来する（例えば、Ｂｒｉｊ^ＴＭの名称で公知のもの）など）。これらの物質は、多数の商業的供給源から容易に入手可能である。このような供給源としては、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯおよびＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥが挙げられる。これらの乳化剤は、単独または組み合わせて使用され得る。乳化剤は、通常、０．０２重量％〜約２．５重量％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５％〜約１％、および最も好ましくは、０．０１％〜約０．５％の量で存在する。存在する量は、一般に、用いられる油の約２０〜３０重量％である。

エマルジョンはまた、他の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（これらとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。免疫刺激細菌細胞壁成分（例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ））もまた存在し得る。あるいは、エマルジョンは、これらの因子を含まないものであり得る（例えば、ＭＴＰ−ＰＥを含まない）。本発明のサブミクロン水中油エマルジョンはまた、いかなるポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックコポリマーも含まないものであり得る。本発明と共に使用するための種々の適切なサブミクロン水中油エマルジョン処方物、ならびに免疫刺激剤の説明については、例えば、国際公開公報ＷＯ９０／１４８３７；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５；Ｖａｎ Ｎｅｓｔら、「Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら、編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５７−６２（１９９２）；Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）ｐｐ．２７７−２９６；ならびに米国特許第６，２９９，８８４号を参照のこと。

サブミクロン粒子（すなわち、直径１ミクロン未満の粒子およびナノメーターサイズ範囲の粒子）を生成するために、多数の技術が使用され得る。例えば、高圧下で液体を小穿孔から押し出すことによって生じる高い剪断力の原理によって作動する市販の乳化機が、使用され得る。市販の乳化機の例としては、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）、およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。個々の乳化機と共に使用するための適当な適切な圧力は、当業者によって容易に決定される。例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザーが使用される場合、５０００〜３０，０００ｐｓｉでの操作が、約１００〜７５０ｎｍの直径を有する油滴を生じる。

油滴の大きさは、界面活性剤と油との比（比を増大することは滴サイズを減少させる）、操作圧（操作圧の増大は、滴サイズを減少させる）、温度（温度の増大は、滴サイズを減少させる）を変更することにより、および両親媒性免疫刺激剤の添加により（このような剤の添加は滴サイズを減少させる）変動され得る。実際の滴サイズは、特定の界面活性剤、油、免疫刺激剤（ある場合）と共に、および選択される特定の操作条件と共に変動する。滴サイズは、サイジング機器（例えば、市販のＳｕｂＭｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造される）の使用により確証され得、そしてパラメーターは、実質的に全ての滴が直径１ミクロン未満、好ましくは約０．８ミクロン未満、そして最も好ましくは約０．５ミクロン未満になるまで、上記の指針を用いて変動し得る。実質的に全てとは、少なくとも約８０％（数において）、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％であることを意味する。粒径分布は、代表的には、ガウス分布であり、従って、平均直径は、述べられた限界より小さい。

本明細書中で使用するための特に好ましいサブミクロン水中油エマルジョンは、必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン（例えば、４−５％ ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０^ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、および／または０．２５〜１．０％ Ｓｐａｎ ８５^ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、および必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油エマルジョン（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油エマルジョン（国際公開公報ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）である。ＭＦ５９は、４〜５％ ｗ／ｖ スクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０^ＴＭ、および０．５％ ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５^ＴＭを含み、ならびに必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、これは、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））を用いてサブミクロン粒子に処方されている。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／投薬量、より好ましくは０〜２５０μｇ／投薬量、および最も好ましくは、０〜１００μｇ／投薬量の量で存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」は、上記のＭＴＰ−ＰＥを欠くサブミクロン水中油エマルジョンをいい、用語ＭＦ５９−ＭＴＰは、ＭＴＰ−ＰＥを含有する処方物を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、一投薬量当たり１００μｇ ＭＴＰ−ＰＥを含有するなど。ＭＦ６９（本明細書中で使用するための別のサブミクロン水中油エマルジョン）は、４．３％ ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、および０．７５％ ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５^ＴＭ、ならびに必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する。なお別のサブミクロン水中油エマルジョンは、ＭＦ７５であり、これはまたＳＡＦとしても知られ、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、５％ プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、そしてこれもまた、サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされている。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰ（例えば、１投薬量当たり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥ）を含むＭＦ７５処方物を示す。

サブミクロン水中油エマルジョン、これを生成する方法、および組成物において使用するための免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド）は、国際公開公報ＷＯ９０／１４８３７に詳細に記載されている。

一旦サブミクロン水中油エマルジョンが処方されれば、それは、抗原およびＩＳＳ（用いられる場合）の送達の前、それと同時、またはそれに続いてのいずれかで脊椎動物被験体に投与され得る。抗原での免疫化の前に投与される場合、アジュバント処方物は、目的の抗原での免疫化の５〜１０日前、好ましくは免疫化の３〜５日前、および最も好ましくは、免疫化の１〜３日前、または２日前の程度の時期に投与され得る。別個の投与される場合、サブミクロン水中油処方物は、抗原組成物と同じ送達部位または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。

同時送達が所望される場合、サブミクロン水中油処方物は、抗原組成物と共に含まれ得る。一般に、抗原およびサブミクロン水中油エマルジョンは、簡便に混合、攪拌、または振盪させることよって組み合わされ得る。他の技術（例えば、小さな開口部（例えば、皮下針）に迅速に２つの成分の混合物を通過させること）もまたワクチン組成物を提供するために使用され得る。

組み合わせた場合、組成物の種々の成分は、広範な比で存在し得る。例えば、抗原およびエマルジョン成分は、代表的には、１：５０から５０：１、好ましくは１：１０から１０：１、より好ましくは約１：５から３：１、および最も好ましくは、約１：１の容量比で使用される。しかし、他の比は、特定の目的（例えば、特定の抗原が低い免疫原性を有する場合、この場合、より高い相対量の抗原成分が必要とされる）のためにより適切であり得る。

（免疫刺激核酸分子（ＩＳＳ））
細菌ＤＮＡは、哺乳動物免疫応答を刺激することが以前に報告されている。例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５４６−５４９を参照のこと。この免疫刺激能は、高い頻度の免疫刺激核酸分子（ＩＳＳ）（例えば、細菌ＤＮＡ中に存在する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド）に起因している。非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、単球およびマクロファージ）の活性化を誘導することが示されている。例えば、米国特許第６，２０７，６４６号を参照のこと。

本発明は、ＩＳＳに由来するアジュバントを利用する。本発明のＩＳＳは、より大きなヌクレオチド構築物（例えば、プラスミドＤＮＡまたは細菌ＤＮＡ）の一部であり得るオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、線形または環状の構成であり得るか、または線形セグメントおよび環状セグメントの両方を含み得る。オリゴヌクレオチドは、改変を含み得る。このような改変としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＯＨもしくは５’ＯＨ基の改変、ヌクレオチド塩基の改変、糖成分の改変、およびリン酸基の改変。ＩＳＳは、リボヌクレオチド（唯一のまたは主な糖成分としてリボースを含む）、デオキシリボヌクレオチド（主な糖成分としてデオキシリボースを含む）を含み得る。改変された糖または糖アナログもまた、オリゴヌクレオチドに取り込まれ得る。用いられ得る糖部分の例としては、リボース、デオキシリボース、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、および糖アナログシクロペンチル基が挙げられる。糖は、ピラノシル形態またはフラノシル形態であり得る。リン誘導体（または改変リン酸基）が使用され得、そして一リン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルリン酸、アルカンリン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどであり得る。ＩＳＳのオリゴヌクレオチド塩基に取り込まれる核酸塩基は、天然に存在するプリン塩基およびピリミジン塩基、すなわち、ウラシルまたはチミン、シトシン、アデニン、およびグアニン、ならびにこれらの塩基の天然に存在する改変物および合成改変物であり得る。さらに、種々の複素環式塩基および種々の糖部分（および糖アナログ）を含む多数の非天然ヌクレオシドが入手可能であり、そして当業者に公知である。

構造的に、ＩＳＳのルートのオリゴヌクレオチドは、ＣＧ含有ヌクレオチドまたはｐ（ＩＣ）ヌクレオチド配列（これは、パリンドロームであり得る）である。シトシンは、メチル化されているか、またはメチル化されていないものであり得る。本発明において使用するための特定のＩＳＳ分子の例としては、当該分野で公知のＣｐＧ分子、ＣｐＹ分子、およびＣｐＲ分子などが挙げられる。

好ましいＩＳＳは、ＣｐＧファミリーの分子、ＣｐＧジヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５４６およびＤａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：８７０−８７６を参照のこと）、例えば、米国特許第６，２０７，６４６号に開示される種々の免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれか、に由来するものである。このようなＣｐＧオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも８から約１００個までのヌクレオチド、好ましくは、８〜４０個のヌクレオチド、より好ましくは、１５〜３５個のヌクレオチド、好ましくは、１５〜２５個のヌクレオチド、およびこれらの値の間の任意の数のヌクレオチドを含む。例えば、５’−Ｘ_１ＣＧＸ_２−３’（ここで、Ｘ_１およびＸ_２はヌクレオチドであり、そしてＣは非メチル化である）で表される、コンセンサスＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、免疫刺激ＣｐＧ分子としての使用を見出す。一般的に、Ｘ_１はＡ、Ｇ、またはＴであり、Ｘ_２はＣまたはＴである。他の有用なＣｐＧ分子としては、式５’−Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４により獲得されるもの（ここで、Ｘ_１およびＸ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、またはＴｐＧのような配列であり、そしてＸ_３およびＸ_４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡ、またはＴｐＧである（ここで、「ｐ」は、リン酸結合を示す））が挙げられる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、５’末端および／または３’末端に、またはその付近に、ＧＣＧ配列を含まない。さらに、ＣｐＧは、好ましくは、その５’末端で、２つのプリン（好ましくは、ＧｐＡジヌクレオチド）を有するか、またはプリンとピリミジン（好ましくは、ＧｐＴ）と隣接し、そしてその３’末端で、２つのピリミジン（好ましくは、ＴｐＴまたはＴｐＣジヌクレオチド）と隣接する。従って、好ましい分子は、配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含み、そしてこれらの配列は、数個のさらなるヌクレオチド（例えば、１〜２０個以上のヌクレオチド、好ましくは、２〜１０個のヌクレオチド、および、より好ましくは、３〜５個のヌクレオチド、または上記の範囲の間の任意の整数）に隣接する。中央の中心領域の外側のヌクレオチドは、変化に対して非常に影響を受けやすいと考えられる。

さらに、本明細書中で用いるためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得る。二本鎖分子は、インビボでより安定であり、一方、一本鎖分子は、増強された免疫活性を示す。さらに、リン酸骨格は、ＣｐＧ分子の免疫刺激活性を増強するために、ホスホロジチオエート修飾のような修飾をされ得る。米国特許第６，２０７，６４６号に開示されるように、ホスホロチオエート骨格を有するＣｐＧ分子は、Ｂ細胞を優先的に活性化し、一方、ホスホジエステル骨格を有するものは、単球細胞（マクロファージ、樹状細胞および単球）およびＮＫ細胞を優先的に活性化する。

本発明の組成物に用いるための例示的ＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）および５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）を有する分子が挙げられる。

ＩＳＳ分子は、当該分野で周知の、標準的な技術を用いて、免疫応答を刺激する能力について容易に試験され得る。例えば、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を刺激する分子の能力は、上記の免疫アッセイを用いて容易に決定される。さらに、抗原およびサブミクロンの水中油組成物は、ＩＳＳありまたはなしで、投与されて、免疫応答が増大されるか否かを決定し得る。

上で説明したように、ＩＳＳは、抗原および／またはサブミクロンの水中油エマルジョンの送達の前、同時、または後のいずれかで投与され得る。抗原および／またはサブミクロンの水中油エマルジョンでの免疫の前に投与される場合、ＩＳＳは、免疫の５〜１０日前、好ましくは、免疫の３〜５日前、そして最も好ましくは、免疫の１〜３または２日前に投与され得る。別々に投与される場合、ＩＳＳは、抗原組成物と同じ送達部位、または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。同時送達が望ましい場合、ＩＳＳは、抗原組成物と共に含まれ得る。

一般的に、約０．５μｇ〜５０００μｇのＩＳＳが用いられ、より一般的には、０．５μｇ〜約１０００、好ましくは、０．５μｇ〜約５００μｇ、または１〜約１００μｇ、好ましくは、約５〜約５０μｇ、好ましくは、５〜約３０、またはこれらの範囲内の任意の量のＩＳＳ／用量が、本方法での用途を見出している。

（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示のみを目的として提供され、そして、いかなる場合においても、本発明の範囲を限定することは意図されない。

用いられる数字（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差は、もちろん、許容されるべきである。

（実施例１）
（ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２の製造）
本ワクチン組成物における使用のためのＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を、以下のとおり、融合タンパク質として調製した。詳細には、哺乳動物発現プラスミドｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９（図３）は、ＨＣＶ−１のアミノ酸１９２〜８０９を含むＥ１Ｅ２融合タンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照）。Ｅ１Ｅ２_８０９分子の配列は、本明細書中図２Ａ〜２Ｃに示される。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９からのＨＣＶ Ｅ１Ｅ２配列の発現に使用した。詳細には、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を使用した。これらの細胞（Ｕｒａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４２１６−４２２０により記載）を、ＣＨＯ Ｋ−１細胞から誘導し、そしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子における二重欠失により、ｄｈｆｒ欠損にした。

ＤＧ４４細胞をｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９でトランスフェクトした。ｄｈｆｒ遺伝子を発現する細胞のみが増殖し得るように、トランスフェクト細胞を選択培地で増殖させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。単離したＣＨＯコロニーを、９６ウェルプレートの個々のウェル中に選び取った（約８００コロニー）。元の９６ウェルプレートから、発現実験を実施するために複製を作製した。細胞がコンフルーエントな単層になるまで、複製プレートを増殖させた。細胞をプレートのウェルに固定し、冷メタノールを使用して透過性にした。３Ｄ５Ｃ３（Ｅ１Ｅ２に対するモノクローナル抗体）および３Ｅ５−１（Ｅ２に対するモノクローナル抗体）を使用して、固定した細胞をプローブした。抗マウスＨＲＰ結合体、続いて基質を添加後、最高に発現する細胞株を決定した。次いで、最高に発現する細胞株を、２４ウェルクラスタープレートに拡大した。発現のアッセイを繰り返し、そして再び最高に発現する細胞株をより大きな容量のウェルに拡大した。最高に発現する細胞株を、６ウェルプレートから組織培養フラスコに拡大するまで、これを繰り返した。この時点で、細胞の正確な計数および採集を可能にするに充分な量の細胞が存在し、そして定量的な発現アッセイを行った。ＥＬＩＳＡ（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０）を、細胞抽出物に対して行い、高く発現するものを決定した。

（実施例２）
（ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２の精製）
発現後、ＣＨＯ細胞を溶解し、そして細胞内で生成されたＥ１Ｅ２_８０９を、ＧＮＡ−レクチンアフィニティークロマトグラフィー（ＧＮＡ工程）、続くハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラムクロマトグラフィー（ＨＡＰ工程）、ＤＶ５０膜濾過（ＤＶ５０工程）、ＳＰセファロースＨＰカラムクロマトグラフィー（ＳＰ工程）、Ｑメンブレン濾過（Ｑ工程）およびＧ２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィー（Ｇ２５工程）により精製した。プロセシング工程のそれぞれの終了後、生成物のプールを０．２μ濾過しそして２〜８℃で保持するか、または直ぐに次の精製工程により処理するかのいずれかをした。精製プロセスの終了後、抗原を０．２μ濾過し、そして処方のために濾過されるまで−６０℃以下にて凍結保持した。

具体的には、細胞を溶解するため、２容量のチルド溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）および１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を２〜８℃にてＣＨＯ細胞に加えた。混合物を５０００ｒｐｍにて４５分間２〜８℃で遠心分離し、残渣を除去した。上清を回収し、そしてＳａｒｔｏｒｉａｓ ０．６５μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、次いでＳａｒｔｏｒｉａｓ ０．６５ｍｍ Ｓａｒｔｏｆｉｎｅ ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ、続いてＳａｒｔｏｒｉｏｕｓ ０．４５μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ｆｉｌｔｅｒ、および０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ
ｆｉｌｔｅｒを通じて濾過した。濾過した溶解物を、ＧＮＡカラムにロードする前に、氷上に維持した。

ＧＮＡアガロースカラム（１８８５ｍｌ、２００×６００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、ロードの前に、８カラム容量の平衡緩衝液（２５ｍＭ ＮａＰＯ_４、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．８）で予め平衡化した。溶解物をカラムに３１．４ｍｌ／分（６ｃｍ／時）にて一晩適用した。カラムを、４総容積の平衡緩衝液で洗浄し、次いで５総容積の１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ６．８）で再度洗浄した。生成物を、１Ｍメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（ＭＭＰ）、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ６．８）で溶出させた。溶出ピーク（約１カラム容量）を回収し、０．２μｍ濾過し、そしてＨＡＰクロマトグラフィーのために−６０℃以下で保存した。

ＨＡＰクロマトグラフィーを室温にて実施した。１２００ｍｌ（１００×１５０ｍｍ）タイプＩセラミックハイドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ）を、１カラム容量の０．４Ｍ ＮａＰＯ_４（ｐＨ６．８）で条件付け、次いで１０カラム容量以上の１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ６．８）で平衡化した。４つのロットのＧＮＡ溶出物プールを、３０℃以下の循環水浴中で解凍し、０．２μｍ濾過し、そして平衡化したカラムに１３１ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）でロードした。ロード後、チェース緩衝液としてＨＡＰ平衡緩衝液をカラムに適用した。ＵＶがベースラインを超えて上昇したら、フロースルーを回収した。生成物プール容量がロード容量＋カラム容量の７５％の容量に達したら、生成物回収を停止した。ＨＡＰフロースループールを、ＤＶ５０ウイルス削減濾過によりさらに処理した。

ＤＶ５０濾過を室温にて実施した。ＤＶ５０ロードを、ＨＡＰプールを２倍に希釈し、そして０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ５．３）に調整することにより調製した。希釈緩衝液１（３ｍＭ クエン酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を加えて生成物プールのｐＨを５．３に調整し、続いて希釈緩衝液２（２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ５．３））を加えて、最終容量を元のＨＡＰプール容量の２倍まで上げることによって、希釈および調整を達成した。

希釈し調整したＨＡＰプール（ＤＶ５０ロード）を、１０インチのＰａｌｌ Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ ＤＶ５０メンブレンカートリッジ（Ｐａｌｌ）を通して濾過した。フィルターハウジングを、フィルターカートリッジを用いて組み立て、水で予め湿らせ、そして使用前に、ゆっくりとした排気で、１２３℃にて６０分間オートクレーブすることによって滅菌した。次いで、フィルターをＳＰ平衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ５．３））で予め湿らせ、そして４５ｐｓｉ以下の圧力でＤＶ５０ロードの適用前に排水した。続いて、ＤＶ５０ロードを、約８００ｍｌ／分の流速で約３０ｐｓｉの膜貫通圧にて適用した。濾過物を回収し、そして２〜８℃にて一晩保存し、そしてＳＰ工程において使用した。

ＳＰクロマトグラフィーを室内において室温にて実施した。８８ｍｌ（５０×４５ｍｍ）ＳＰセファロースＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を１５カラム容量の平衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｐＨ５．３））で平衡化した。ＤＶ５０濾過物をカラムに適用した。カラムを、最初に５カラム容量の平衡緩衝液、続いて１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（ｐＨ６．０）を含む２０カラム容量の洗浄緩衝液で洗浄した。生成物を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（ｐＨ６．０）でカラムから溶出した。全２８０ｎｍ吸光ピークを生成物プールとして回収した。生成物プールを２〜８℃にて一晩保存し、Ｑメンブレン濾過工程において使用した。

Ｑメンブレン濾過工程を室温にて実施した。２つの滅菌Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｑ１００Ｘディスクメンブレンを直列に接続した。メンブレンを、３００ｍｌ以上のＱ平衡緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（ｐＨ６．０））で平衡化した。全ＳＰ溶出物プールを、３０〜１００ｍｌ／分の流速にて平衡化Ｑメンブレンを通して濾過し、続いて４０ｍｌのＱ平衡緩衝液でフラッシングした。濾過物およびフラッシュ液を回収し、合わせて生成物プールとし、そしてＧ２５工程において使用した。

Ｇ２５工程を室温にて実施した。１１１５ｍｌ（１００×１４２ｍｍ）Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ、ＮＪ）を、５カラム容量以上の処方緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２７０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ、ｐＨ６．０）を用いて平衡化した。Ｑろ過プールを、カラムにアプライし、そしてカラムの貫流液を収集し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、そして使用するまで−６０°以下で凍結して保存した。

（実施例３）
（マウスにおけるＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ワクチン組成物の免疫原性）
上記のように産生および精製した、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２_８０９の免疫原性を、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび／またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと組合わせて、以下のように決定した。

本研究において用いた処方物を表１にまとめる。４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０^ＴＭ、０．５％ Ｓｐａｎ ８５^ＴＭを含む、ＭＦ５９、サブミクロンの水中油エマルジョンを、以前に記載されるように生成した。国際公開ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，２７７〜２９６頁を参照のこと。群４および群９について、４倍量のＭＦ５９を用いた。この研究に用いたＭＦ５９は、ＭＦ５９−０であり、そしてＭＴＰ−ＰＥを含まなかった。

群１、群３、群６および群８に用いられる処方物は、１用量あたり２５μｇの活性なＣｐＧ分子を含んだ。用いた活性なＣｐＧ分子の配列は：
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）
であった。

群５に用いた処方物は、１用量あたり２５μｇの不活性なコントロールＣｐＧ分子を含んだ。用いた不活性なＣｐＧ分子の配列は：
５’−ＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＴＴ−３’（配列番号２）
であった。

群１〜４に用いた処方物は、上記のように産生された、１用量あたり２．８μｇのＨＣＶ Ｅ１Ｅ２_８０９抗原を含んだ。

群５〜９に用いた処方物は、米国特許第６，１２，０２０号に記載されるように、ＣＨＯ細胞において産生される、１用量あたり２．０μｇのＨＣＶ Ｅ２_７１５（短縮型Ｅ２タンパク質）を含んだ。

６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを、９つの群（１群あたり１０匹のマウス）に分け、そして表１に特定される成分を有する５０μｌのワクチン組成物を筋肉内投与した。動物を、最初の注射の３０日後および９０日後に追加免疫した。血清を、最後の注射の１４日後に収集し、そして抗Ｅ１Ｅ２抗体力価および抗Ｅ２抗体力価を、酵素免疫アッセイにより決定した。Ｃｈｉｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９３）３４２：９３３を参照のこと。

結果を表１および図４に示す。見られ得るように、アジュバントとしてＭＦ５９と組合わせたＣｐＧを用いてＨＣＶ Ｅ１Ｅ２を免疫したマウスは、アジュバントとして、ＭＦ５９単独または４ｘＭＦ５９単独を用いてＥ１Ｅ２を免疫したマウスよりも、有意により高い（Ｐ＜０．０５）レベルのＥ１Ｅ２抗体を生じた。ＣｐＧ単独は、ＭＦ５９単独を用いた抗体レベルよりも、有意により高くはないが、より高い抗体レベルを生じた。対照的に、ＭＦ５９および／またはＣｐＧを用いてＥ２_７１５を免疫したマウスは非常に低いレベルの抗体を生じ、応答するマウスは５０％未満であった。このことは、Ｅ２_７１５を用いた以前の実験は、マウスにおいて高い抗体レベルを生じ、試験した全てのマウスで応答したので、驚くべきことである。

（表１．アジュバントとしてＣＰＧおよび／またはＭＦ５９を用いるＨＣＶ Ｅ１Ｅ２_８０９およびＥ２_７１５の免疫原性。括弧の中の数は、免疫した動物の数に対する抗体を産生する動物の数を示す）

（実施例４）
（チンパンジーにおけるＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ワクチン組成物の免疫原性）
上記のように産生および精製した、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２_８０９の免疫原性を、サブミクロンの水中油エマルジョンおよび／またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと組合わせて、以下のように決定した。

本研究に用いた処方物を表２にまとめる。ＭＦ５９およびＥ１Ｅ２_８０９は、上に記載される。用いたＣｐＧ分子の配列は：
５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号５）
であった。

チンパンジーを、２つの群（１群あたり５匹の動物）に分け、そして表１で特定した成分を有するワクチン組成物を筋肉内投与した。詳細には、動物の１つの群を、２０μｇのＥ１Ｅ２_８０９およびＭＦ５９を用いて、０ヶ月目、１ヶ月目および６ヶ月目に免疫した。第２の群の動物もまた、２０μｇのＥ１Ｅ２_８０９およびＭＦ５９、ならびに５００μｇ ＣｐＧを用いて、０ヶ月目、１ヶ月目および６ヶ月目に免疫した。

血清サンプルを、最後の免疫の１４日後に獲得し、そして抗Ｅ１Ｅ２抗体力価を、酵素免疫アッセイにより決定した。詳細には、Ｅ１Ｅ２抗原を、ポリスチレンのマイクロタイタープレート上にコーティングし、そして結合した抗体を、ＨＲＰ−結合体化抗ヒト抗体、次いで、テトラメチルベンジジン基質発色によって検出した。

表２に見られ得るように、アジュバントとしてＭＦ５９と組合わせたＣｐＧを用いてＨＣＶ Ｅ１Ｅ２を免疫したチンパンジーは、ＭＦ５９単独を用いてＥ１Ｅ２を免疫した動物よりも、有意により高い（Ｐ＜０．０５）レベルのＥ１Ｅ２抗体を生じた。

（表２．アジュバントとして、ＣＰＧおよびＭＦ５９を用いるＨＣＶ Ｅ１Ｅ２_８０９の免疫原性）

従って、新規のＨＣＶワクチン組成物および方法、ならびにこれらを使用する方法が開示される。上述から、本発明の好ましい実施形態が、いくらか詳細に記載されているが、明白なバリエーションは、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されることが理解される。

図１は、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域を示す、ＨＣＶゲノムの模式図である。 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号３および４）は、ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図面に示される数は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対する。このＥ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域が示される。 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号３および４）は、ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図面に示される数は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対する。このＥ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域が示される。 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号３および４）は、ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図面に示される数は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対する。このＥ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域が示される。 図３は、本発明で使用するための代表的Ｅ１Ｅ２タンパク質であるＥ１Ｅ２_８０９をコードするプラスミドｐＭＨＥｌＥ２−８０９の模式図である。 図４は、実施例に記載されるＥ１Ｅ２_８０９およびＣｐＧ；Ｅ１Ｅ２_８０９およびＭＦ５９；Ｅ１Ｅ２_８０９およびＣｐＧおよびＭＦ５９；ならびにＥ１Ｅ２_８０９および４ＸＭＦ５９で免疫したマウスからのＥ１Ｅ２_８０９ ＥＩＡ抗体力価を示す。丸印は、個々のマウス血清抗体力価を示す。四角は、１０匹のマウスの群の相乗平均抗体力価（ＧＭＴ）を示す。エラーバーは、一元配置分散分析により決定された統計学的有意差についての個体の比較である。

Claims (1)

1. Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を欠くサブミクロンの水中油エマルジョンを含む組成物であって、ここで、該サブミクロンの水中油エマルジョンが、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を刺激し得、かつ、該ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２抗原が、
   

   

   

   

   の位置１９２〜８０９で示されるアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組成物。

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