CN1931365A - Hcv e1e2疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
描述了包含E1E2抗原、亚微米水包油乳剂和/或免疫刺激核酸序列的HCV E1E2组合物。所述组合物可用于在脊椎动物试验品中刺激免疫应答的方法。
Description
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US 02/20676,国际申请日为2002年6月28日,进入中国国家阶段的申请号为02812819.2,名称为“HCV E1E2疫苗组合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明一般涉及疫苗组合物。具体的,本发明涉及含有E1E2抗原、亚微米水包油乳剂和/或CpG寡核苷酸的HCV E1E2组合物。
本发明背景
丙肝病毒(HCV)是引起肠胃外非甲、非乙型肝炎(NANBH)的主要原因。病毒存在于0.4到2.0%的血液供体中。慢性肝炎在约50%感染中发展,其中约20%感染个体发生了肝硬化,肝硬化有时导致肝细胞癌。因此,研究和控制该病具有医学重要性。
HCV首先由Houghton等作为NANBH起因鉴定并确定特征。由于获得序列的方法已知,HCV的病毒基因序列已知。参见例如国际公开号WO 89/04669;WO 90/11089和WO 90/14436。HCV有9.5kb的正义、单链RNA基因组且是黄病毒家族的成员。在系统发生分析的基础上鉴定了至少六个不同但相关HCV基因型(Simmonds等,J.Gen.Virol.(1993)
74:2391-2399)。病毒编码具有超过3000个氨基酸残基的单个多蛋白(Choo等,Sciencel.(1989)
244:359-362;Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)
88:2451-2455;Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)
88:1711-1715)。多蛋白共翻译和翻译后加工成结构和非结构蛋白质。
特别地,如图1所示,一些蛋白质由HCV基因组编码。HCV多蛋白裂解产物的顺序和名称如下:NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。多蛋白最初的裂解由宿主蛋白酶催化,蛋白酶释放三种结构蛋白以及含病毒酶的非结构(NS)蛋白,结构蛋白是N-末端核壳蛋白(命名为“核心”)和两种包膜糖蛋白“E1”(也称为E)及“E2”(也称为E2/NS1)。NS区域命名为NS2、NS3、NS4和NS5。NS2是具蛋白水解活性的整合膜蛋白,它与NS3结合并裂解NS2-NS3 sissle键,从而产生NS3 N-末端并释放包括丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶的大多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。在这些反应中,NS3释放NS3辅因子(NS4a)、两种蛋白质(NS4b和NS5a)和RNA-依赖的RNA聚合酶(NS5b)。多蛋白成熟的完成通过NS3丝氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a连接处的自身催化裂解来起始。
E1检测为32-35kDa种类并转变成单个约18kDa的内H-敏感带。相反,E2在免疫沉淀中表现出复杂模式,这与产生多种类型一致(Spaete等,Virol.(1992)
188:819-830;Selby等,J.Virol.(1996)
70:5177-5182;Grakoui等,J.Virol.(1993)
67:1385-1395;Tomei等,J.Virol.(1993)
67:4017-4026)。HCV包膜糖蛋白E1和E2形成共免疫沉淀的稳定复合体(Grakoui等,J.Virol.(1993)
67:1385-1395;Lanford等,Virology.(1993)
197:225-235;Ralston等,J.Virol.(1993)
67:6753-6761)。
当E1和E2稳定表达或在短暂牛痘病毒系统中时,它们维持在细胞内且缺乏复杂碳水化合物(Spaete等,Virology.(1992)
188:819-830;Ralston等,J.Virol.(1993)
67:6753-6761)。由于E1和E2蛋白在这些表达系统中一般是膜结合,产生分泌形式以促进蛋白质纯化。参见例如美国专利号6,121,020。此外,描述了在海拉细胞中胞内生成E1E2。参见例如国际公开号WO 98/50556。
HCV E1和E2糖蛋白备受瞩目,因为在灵长类动物的研究中显示它们可抗病毒袭击。(Choo等,Proc.Natl.Acad Sci.USA.(1994)
91:1294-1298)。然而,需要有效的含有这些抗原的疫苗组合物以防止HCV感染。
疫苗组合物通常包括免疫佐剂以增强免疫应答。例如,完整弗氏佐剂(CFA)是有力的免疫刺激剂,它在实验基础上与许多抗原成功使用。CFA包括三种成分:矿物油、乳化剂和死分枝杆菌如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。水溶抗原溶液与这些成分混合以产生油中水乳剂。尽管作为佐剂有效,CFA引起严重副作用,包括疼痛、脓肿形成和发热,这主要是由于存在分枝杆菌成分。因此,CFA不用于人和牲畜疫苗。
胞壁酰二肽(MDP)是分枝杆菌细胞壁复合体的最小单位,复合体产生CFA观察到的佐剂活性。参见例如Ellouz等,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1974)
59:1317。产生的一些MDP合成类似物表现出宽广范围的佐剂潜力和副作用。这些类似物的综述参见Chedid等,Prog.Allergy(1978)
25:63。MDP的代表类似物包括MDP的苏氨酰衍生物(Byars等,Vaccine(1987)
5:223)、MDP的n-丁基衍生物(Chedid等,Infect.Immun.
35:417)和胞壁酰三肽的亲脂衍生物(Gisler等,微生物产物和相关合成化合物的免疫调节(Immunomodulations of Microbial Products and Related SyntheticCompounds)(1981)Y.Yamamura和S.Kotani编,Excerpta Medica,Amsterdam,第167页)。
一种MDP亲脂衍生物是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(1’-2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-huydroxyphosphoryloxy)-ethylamine)(MTP-PE)。此胞壁酰三肽包括磷脂尾部,可使分子疏水部分与脂类环境联合而胞壁酰肽部分与水环境相联。因此,MTP-PE本身能作为乳化剂来产生稳定的水包油乳剂。MTP-PE被用于名为MTP-PE-LO(低油)的乳剂,该乳剂含有4%鲨烯的0.008%土温80(Tween 80TM),以便以有效结果传递单纯疱疹病毒gD抗原(Sanchez-Pescador等,J.Immunol.(1988)
141:1720-1727),尽管其物理稳定性很差。近来,一种安全、高免疫原性的亚微米水包油乳剂MF59包含4-5%w/v鲨烯、0.5%w/v土温80TM、0.5%Span85TM和任选的不同量MTP-PE,它发展用于疫苗组合物。参见例如Ott等,“MF59-设计和评估用于人疫苗的安全和潜在佐剂”(MF59-Design and Evaluationof a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines),疫苗设计:亚基和佐剂方法(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell,M.F.和Newman,M.J.编)Plenum Press,New York,1995,277-296页,Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)
91:1294-1298和Houghton等,病毒性肝炎和肝脏疾病(Viral Hepatitis and Liver Disease)(1997),第656页,描述了使用HCVE1/E2复合体和包括MTP-PE的亚微米水包油乳剂。
细菌DNA包括在体外对外周血单核细胞有免疫刺激效果的未甲基化的CpG二核苷酸。Krieg等,J.Clin.Immunol.(1995)
15:284-292。CpG寡核苷酸用于增强免疫应答。参见例如美国专利号6,207,646;6,214,806;6,218,371和6,406,705。
尽管使用这些佐剂,常规疫苗通常不能提供抗靶病原体的适当保护。因此,对于有效抗HCV的疫苗组合物有持续需要,疫苗组合物包括安全和非毒性佐剂。
发明概述
本发明部分基础在一个令人惊讶的发现上,使用HCV E1E2抗原结合亚微米水包油乳剂和含免疫刺激核酸序列(ISS)的寡核苷酸如CpY、CpR和未甲基化CpG基序(后面有鸟苷并由磷酸键相连的胞嘧啶),提供的抗体滴度显著高于没有这些佐剂所观察到的。另外,本文佐剂可与ISS单独使用而没有亚微米水包油乳剂,或与缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂单独使用而没有ISS。使用这种组合提供安全和有效方法来提高HCV E1E2抗原的免疫原性。
因此,在一个实施方案中,本发明针对的组合物包括HCV E1E2抗原和缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂,其中亚微米水包油乳剂能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答。组合物可进一步包括ISS如含未甲基化CpG基序的寡核苷酸(“CpG寡核苷酸”),当ISS存在时增强对抗原的免疫应答。
在另一个实施方案中,本发明针对的方法在脊椎动物试验品中刺激免疫应答,包括给试验品施用治疗有效量HCV E1E2抗原和缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂,其中亚微米水包油乳剂能提高对HCV E1E2抗原的免疫应答。试验品也可施用一个或更多ISS如一种或多种含未甲基化CpG基序的寡核苷酸,其中ISS能增强对HCVE1E2抗原的免疫应答。亚微米水包油乳剂可作为抗原存在于相同组合物中或在单独组合物中施用。此外,如果存在ISS,它可存在于与抗原和/或亚微米水包油乳剂相同的组合物中,或在不同组合物中。
在更多的实施方案中,本发明针对的方法产生的组合物包括缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂与HCV E1E2抗原结合。在一些实施方案中,方法进一步包括ISS如含未甲基化CpG基序的寡核苷酸,寡核苷酸能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答,ISS与E1E2抗原和亚微米水包油乳剂结合。
在其它实施方案中,本发明针对的组合物包括HCV E1E2抗原和ISS如能增强对HCV E1E2抗原免疫应答的CpG寡核苷酸。
在另一个实施方案中,本发明针对的方法在脊椎动物试验品中刺激免疫应答,包括给试验品施用治疗有效量HCV E1E2抗原和ISS如CpG寡核苷酸,其中ISS能提高对HCV E1E2抗原的免疫应答。ISS可作为抗原存在于相同组合物中或在单独组合物中施用。
在进一步的实施方案中,本发明针对的方法产生的组合物包括ISS如CpG寡核苷酸与HCV E1E2抗原结合,其中ISS能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答。
上面任何实施方案中的CpG分子可有公式5’-X1X2CG X3 X4,其中X1和X2是选自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的序列,X3和X4选自TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA和TpG,其中“p”表示磷酸键。在一些实施方案中,CpG寡核苷酸包括序列侧翼有一些其它核苷的GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
在另外的实施方案中,用于本组合物的CpG寡核苷酸有序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO:1)或序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中,亚微米水包油乳剂包括:
(1)可代谢的油,其中油的量为总体积的0.5%到20%
(2)乳化剂,其中乳化剂为0.01%到2.5%重量(w/v),其中油和乳化剂以水包油乳剂形式存在,几乎所有乳剂的油滴直径为约100nm到小于1微米,
其中亚微米水包油乳剂能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答。
在其它实施方案中,亚微米水包油乳剂如上所述且缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物以及任何胞壁酰肽。
在另外的实施方案中,乳化剂包括聚氧乙烯山梨聚糖单、二或三酯和/或山梨聚糖单、二或三酯。
在一些实施方案中,油的量为总体积的1%到12%,如1%到4%,乳化剂为0.01%到1%重量(w/v)如0.01%到0.05%重量(w/v)。
在其它本文所述的实施方案中,亚微米水包油乳剂包括4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v土温80TM(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)、和/或0.25-1.0%Span85TM(山梨聚糖三油酸酯),以及任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
在另外实施方案中,亚微米水包油乳剂实质上由:
(1)5%体积的鲨烯;
(2)一种或多种乳化剂组成,所述乳化剂选自土温80TM(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和Span85TM(山梨聚糖三油酸酯),其中乳化剂存在总量为1%重量(w/v);鲨烯和乳化剂以水包油乳剂形式存在,几乎所有乳剂的油滴直径为约100nm到小于1微米,其中组合物缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物以及任何胞壁酰肽,此外水包油乳剂能增强对HCV抗原的免疫应答。
在其它实施方案中,一种或多种乳化剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和山梨聚糖三油酸酯,且聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在总量为1%重量(w/v)。
在一些它实施方案中,组合物缺乏胞壁酰肽。
参考下列详细描述和附图,本发明的这些和其它方面是显然的。
附图详述
图1是HCV基因组的图示,描述了HCV多蛋白的不同区域。
图2A-C(SEQ ID NOS:3和4)显示了核苷和相应的HCV-1 E1/E2/p7区域的氨基酸序列。图中所示数字是相对于全长HCV-1多蛋白。显示了E1、E2和p7区域。
图3是质粒pMHE1E2-809的图,质粒编码用于本发明使用的代表E1E2蛋白E1E2809。
图4显示来自小鼠的E1E2809EIA抗体滴度,如实施例所述,小鼠用E1E2809加CpG;E1E2809加MF59;E1E2809加CpG和MF59;E1E2809加4XMF59免疫。圆圈表示各个小鼠的血清抗体滴度。方框显示一组十只小鼠的几何平均抗体滴度(GMT)。误差柱(error bar)是用于统计上显著差异的比较缺口,差异由单向方差分析确定。
发明详述
除非另有说明,本发明的实践使用本领域技术内的化学、生化、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中被充分说明。参见例如基础病毒学(Fundamental Virology),第二版,I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编);实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology),I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,Blackwell Scientific Publications);T.E.Creighton,蛋白质:结构和分子性质(Proteins:Structures and Molecular Properities)(W.H.Freeman和Company,1993);A.L.Lehninger,生物化学(Biochemistry)(WorthPublishers,Inc.,当添加入);Sambrook等,分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989);酶学中的方法(Methods InEnzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)。
必须指出,如本说明书和所附权利要求书中所用,除非另有明显说明单数形式包括复数指示物。因此,例如提及“一种抗原”包括两种或更多抗原的混合物等。
在文中使用下列氨基酸缩写:
丙氨酸:Ala(A) 精氨酸:Arg(R)
天冬酰胺:Asn(N) 天冬氨酸:Asp(D)
半胱氨酸:Cys(C) 谷氨酰胺:Gln(Q)
谷氨酸:Glu(E) 甘氨酸:Gly(G)
组氨酸:His(H) 异亮氨酸:Ile(I)
亮氨酸:Leu(L) 赖氨酸:Lys(K)
甲硫氨酸:Met(M) 苯丙氨酸:Phe(F)
脯氨酸:Pro(P) 丝氨酸:Ser(S)
苏氨酸:Thr(T) 色氨酸:Trp(W)
酪氨酸:Tyr(Y) 缬氨酸:Val(V)
I.定义
在本发明描述中,适用下列术语且定义如下所示。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物且不限于产物的最小长度。因此,肽、寡肽、二聚物、多聚物等包括在定义内。全长蛋白质和其片段包含在定义内。术语也包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外,为了本发明,“多肽”所指蛋白质包括对天然序列的修饰如缺失、添加和置换(一般是保守性质),只要蛋白质保持所需活性。这些修饰可以是设计的如通过定点突变,或者可以是偶然的如通过生成蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增的误差。
“E1多肽”指来自HCV E1区域的分子。成熟HCV-1的E1区域起始于多蛋白的约氨基酸192且持续到约氨基酸383,数字是相对于全长HCV-1多蛋白。(参见图1和2A-2C。图2A-2C的氨基酸192-383对应于SEQ ID NO:4的氨基酸位置20-211)。在约173到约191的氨基酸(SEQ ID NO:4的氨基酸1-19)作为E1的信号序列。因此,“E1多肽”指前体E1蛋白包括信号序列或缺乏此序列的成熟E1多肽,或者甚至指有异源信号序列的E1多肽。E1多肽包括出现在约氨基酸位置360-383的C-末端膜锚序列(参见出版于1996年2月15日的国际公开号WO96/04301)。一种本文定义的E1多肽可或可不包括C-末端膜锚序列或其部分。
“E2多肽”指来自HCV E2区域的分子。成熟HCV-1的E2区域起始于约氨基酸383-385,数字是相对于全长HCV-1多蛋白。(参见图1和2A-2C。图2A-2C的氨基酸383-385对应于SEQ ID NO:4的氨基酸位置211-213)。信号肽起始于多蛋白的约氨基酸364。因此,“E2多肽”指前体E2蛋白包括信号序列或缺乏此序列的成熟E2多肽,或者甚至指有异源信号序列的E2多肽。E2多肽包括出现在约氨基酸位置715-730的C-末端膜锚序列并可延伸直到约氨基酸残基746(参见lin等,J.Virol.(1994)
68:5063-5073)。一种本文定义的E2多肽可或可不包括C-末端膜锚序列或其部分。此外,E2多肽也可包括所有或部分直接毗邻E2C-末端的p7区域。如图1和图2A-2C所示,p7区域发现于位置747-809,数字相对于全长HCV-1多蛋白(SEQ ID NO:4的氨基酸位置575-637)。另外,已知存在多种HCV E2(Spaete等,Virol.(1992)
188:819-830;Selby等,J.Virol.(1996)
70:5177-5182;Grakoui等,J.Virol.(1993)
67:1385-1395;Tomei等,J.Virol.(1993)
67:4017-4026)。因此,为了本发明目的,术语“E2”包含任何这些种类E2,包括但不限于缺失1-20个或更多来自E2N-末端氨基酸的种类,如缺失1、2、3、4、5....10...15、16、17、18、19...等个氨基酸。这些E2种类包括起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的种类。
来自HCV-1的代表E1和E2区域显示于图2A-2C和SEQ ID NO:4。为了本发明目的,E1和E2区域关于多蛋白的氨基酸数字定义,多蛋白由HCV-1基因组编码,起始甲硫氨酸指定为位置1。参见例如Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)88:2451-245。然而,应该指出本文所用术语“E1多肽”或“E2多肽”不限于HCV-1序列。在此方面,其它HCV分离物中的对应E1或E2区域可通过排列来自分离物的序列来确定,排列形式使序列产生最大排列。这可由任何一些计算机软件包进行,如ALIGN 1.0,来自弗吉尼亚大学生化系(Attn:Dr.William R.Pearson)。参见Pearson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1988)
85:2444-2448。
此外,本文所定义“E1多肽”或“E2多肽”不限于有图中所述精确序列的多肽。确实,HCV基因组在体内处于恒定流出状态并包含一些在分离物间表现出相对高程度可变性的可变结构域。一些保守和可变区域在这些菌株中已知,一般来自这些区域抗原表位的氨基酸序列有高程度的序列同源性,如超过30%的氨基酸序列同源性,当排列两种序列时,超过40%、超过60%甚至超过80-90%的同源性优选。显然术语包含来自任何不同HCV菌株和分离物的E1和E2多肽,包括有任何6种HCV基因型的分离物,HCV基因型描述于Simmonds等,J.Gen.Virol.(1993)
74:2391-2399(如菌株1、2、3、4等)以及新鉴定的分离物和这些分离物亚类如HCV1a、HCV1b等。
因此,例如术语“E1”或“E2”多肽指来自任何不同HCV菌株的天然E1或E2序列以及下面进一步定义的类似物、突变蛋白和免疫原性片段。许多这些菌株的完整基因型已知。参见例如美国专利号6,150,087和GenBank编号AJ238800和AJ238799。
此外,术语“E1多肽”和“E2多肽”所包含蛋白质包括对天然序列的修饰如内部缺失、添加和置换(一般是保守性质)。这些修饰可以是设计的如通过定点突变,或者可以是偶然的如通过天然产生的突变事件。只要修饰的E1和E2多肽发挥功能用于它们想要的目的,所有这些修饰包括在本发明中。因此,例如如果E1和/或E2多肽待用于疫苗组合物,修饰必须不损失免疫活性(即引起体液或细胞免疫应答的能力)。
如上所述,“E1E2”复合体所指蛋白质包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。这种复合体也可包括所有或部分直接毗邻E2 C-末端的p7区域。如图1和图2A-2C所示,p7区域发现于位置747-809,数字相对于全长HCV-1多蛋白(SEQ IDNO:4的氨基酸位置575-637)。本文定义为“E1E2809”的代表E1E2复合体包括p7蛋白。
E1E2复合体中E1和E2相联模式是非实质的。E1和E2多肽可通过非共价相互作用如静电力或通过共价键来联合。例如,本应用的E1E2多肽可以融合蛋白形式,融合蛋白包括上面定义的免疫原性E1多肽和免疫原性E2多肽。融合可从编码E1E2嵌合体的多核苷酸中表达。另外,E1E2复合体可仅通过混合单独产生的E1和E2蛋白来自发形成。类似的,当共表达和分泌入介质时,E1和E2蛋白可自发形成复合体。因此,术语包括自发来自于纯化E1和/或E2的E1E2复合体(也称为聚集体)。这种聚集体可包括一个或更多E1单体,E1单体与一个或更多E2单体相联。E1和E2单体存在数量不需相同,只要存在至少一个E1单体和一个E2单体。检测E1E2复合体的存在可使用标准蛋白检测技术来确定,如聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫学技术如免疫沉淀。
术语“类似物”和“突变蛋白”指所涉及分子的生物学上活性衍生物或这些衍生物保持所需活性的片段,如本文所述试验中的免疫反应性。一般,术语“类似物”所指化合物有天然多肽序列和结构,相对天然分子具有一个或更多氨基酸添加、置换(通常是保守性质)和/或缺失,只要修饰不破坏免疫原活性。术语“突变蛋白”所指肽有一个或更多肽模拟物(“类肽”),如描述于国际公开号WO 91/04282。优选的是,类似物或突变蛋白有至少与天然分子相同的免疫活性。产生多肽类似物和突变蛋白的方法在本领域已知并在下面进一步描述。
尤其优选的类似物包括保守性质的置换,即置换发生在侧链相关的氨基酸家族中。具体是,氨基酸一般获得自四个家族:(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;(4)无电荷极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。例如,有理由预测用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、丝氨酸取代苏氨酸或者结构相关氨基酸相似保守取代氨基酸对于生物活性没有主要作用。例如,感兴趣的多肽可包括多至5-10个保守或非保守氨基酸置换,或甚至到约15-25或50个保守或非保守氨基酸置换,或任何5-50间的整数,只要分子所需功能保持完整。本领域技术人员通过参考本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图可确定能忍受变化的感兴趣区域。
“片段”所指多肽仅由部分完整全长多肽序列和结构组成。片段可包括C-末端缺失和N-末端缺失和/或天然多肽的内部缺失。具体HCV蛋白的“免疫原性片段”一般包括至少约5-10个全长分子的连续氨基酸残基,至少约15-25个全长分子的连续氨基酸残基优选,至少约20-50个或更多全长分子的连续氨基酸残基最优选,如果所讨论片段保持引起本文所述免疫应答的能力,免疫原性片段定义抗原表位或5个氨基酸和全长序列间的任何整数。为描述已知HCV E1和E2免疫片段,参见例如Chien等,国际公开号WO 93/00365。
本文所用术语“抗原表位”所指序列有至少约3-5个氨基酸,约5到10或15个优选,不超过约500个氨基酸(或任何其间的整数),抗原表位定义自身序列或部分更大的序列。在其施用的试验品中引起免疫应答。通常,抗原表位结合在对这种序列反应中产生的抗体。对于片段长度没有严格上限,可包括几乎蛋白序列全长或者甚至含两个或更多来自HCV多蛋白抗原表位的融合蛋白。用于试验本发明的抗原表位不限于有亲代蛋白质部分确切序列的多肽,多肽获得自亲代蛋白质。病毒基因组处于恒定流出状态且保持一些在分离物间表现出高程度可变性的可变结构域。因此,术语“抗原表位”包括与天然序列相同的序列以及对天然序列的修饰,如缺失、添加和置换(一般是保守性质)。
特定多肽区域包括的抗原表位可用本领域熟知的任何数量抗原表位作图技术鉴定。参见例如抗原表位作图操作(Epitope Mapping Protocols),分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology),第66卷(Glenn E.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如确定线性抗原表位可通过如在固体支持物上同时合成大数量肽和蛋白分子部分相应肽,且当肽仍附于支持物时使肽与抗体反应。这些技术在本领域已知并描述于如美国专利号4,708,871;Geysen等,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:3998-4002;Geysen等,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:178-182;Geysen等,(1986)Molec.Immunol.
23:709-715。使用这些技术,鉴定了一些HCV抗原表位。参见例如Chien等,病毒性肝炎和肝脏疾病(1994)320-324页和下面。类似的,构象抗原表位通过确定空间构象氨基酸来鉴定如通过x-射线结晶学和2维核磁共振。参见例如抗原表位作图操作,同上。蛋白的抗原区域也可用标准抗原性和亲水性图来鉴定,如用来自OxfordMolecular Group的Omiga 1.0版本软件程序计算。此计算机程序使用Hopp/Woods法,Hopp等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)
78:3824-3828确定抗原性分布和Kyte-Doolittle技术,Kyte等,J.Mpl.Biol.(1982)
157:105-132用于亲水性图。
如本文所用,术语“构象抗原表位”指全长蛋白部分或其类似物或突变蛋白,具有氨基酸序列天然的结构特征,氨基酸序列编码全长天然蛋白中的抗原表位。天然结构特征包括但不限于糖基化和三维结构。确定序列的抗原表位长度可进行多种变化,因为这些抗原表位被认为由抗原三维形状来形成(如折叠)。因此,确定抗原表位的氨基酸数量可以相对少但广泛分布在分子长度中(或在二聚物等的情况中甚至在不同分子上),通过折叠产生正确抗原表位构象。确定抗原表位的残基间抗原部分对于抗原表位的构象结构不关键。例如如果维持对抗原表位构象关键的序列(如参与二硫键、糖基化位点等的半胱氨酸),缺失或置换这些间插序列也许不影响构象抗原表位。
构象抗原位用上述方法鉴定。此外,在特定多肽中确定构象抗原表位的存在或缺失可通过用抗体(多克隆血清或单克隆构象抗原表位)筛选感兴趣抗原并比较其反应性和仅保持线性抗原表位的抗原变性形式(如果有)。在这种多克隆抗体筛选中,有利的是首先用变性抗原吸收多克隆血清并观察它受否保持感兴趣抗原的抗体。获得自E1和E2区域的构象抗原表位描述于如国际公开号WO 94/01778。
对HCV抗原或组合物的“免疫应答”是指试验品中对感兴趣组合物中存在分子的体液和/或细胞免疫应答发展。为了本发明目的,“体液免疫应答”指抗体分子调节的免疫应答,“细胞免疫应答”由T-淋巴细胞和/或其它白细胞调节。细胞免疫的一个重要方面包括细胞溶解T细胞(“CTLs”)的抗原-特异反应。CTLs对肽抗原有特异性,抗原与主要组织相容性复合体(MHC)编码的蛋白质相联并在细胞表面表达。CTLs有助于诱导和促进细胞内微生物的胞内破坏或感染这些微生物的细胞裂解。细胞免疫的另一方面包括辅助T细胞的抗原-特异反应。辅助T细胞作用于协助刺激功能和集中非特异效应细胞的活性,效应细胞抗的细胞表面展现出与MHC分子相关肽抗原。“细胞免疫应答”也指细胞因子、趋化因子和其它这种分子的产生,其它分子由活化的T细胞和/或其它白细胞生成,包括那些来自于CD4+和CD8+T细胞。引起细胞免疫应答的组合物或疫苗可用于通过在细胞表面与MHC分子相联的抗原呈递使脊椎动物试验品敏感。细胞-调节免疫应答针对表面呈递抗原的细胞或附近。此外,可产生抗原-特异T-淋巴细胞以在未来保护免疫宿主。具体抗原刺激细胞-调节免疫应答的能力可通过一些试验确定,如淋巴增生(淋巴细胞活化)试验、CTL细胞毒型细胞试验或分析敏化试验品中特异于抗原的T-淋巴细胞。这些试验在本领域熟知,参见例如Erickson等,J.Immunol.(1993)
151:4189-4199;Doe等Eur.J.Immunol.(1994)
24:2369-2376。
因此,本文所用免疫应答可刺激CTL产生和/或辅助T细胞产生或活化。感兴趣抗原也可引起抗体-调节免疫调节,包括例如中和结合(NOB)抗体。确定NOB抗体反应存在的技术描述于如Rosa等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)
93:1759。因此,免疫应答可包括一种或多种下列效果:B细胞产生抗体的生成;和/或抑制T细胞和/或γδT细胞的活化,这些细胞特异于感兴趣组合物或疫苗中存在的一种或几种抗原。这些反应可用于中和传染性和/或调解抗体-补体或抗体依赖细胞毒性(ADCC)以提供宿主症状的保护或缓和。这些反应可用本领域熟知的标准免疫测定和中和试验确定。
如本文所用,“免疫刺激核苷序列”或“ISS”是指包括至少一个免疫刺激寡核苷酸(ISS-ODN)部分的多核苷酸。ISS部分是单或双链DNA或RNA寡核苷酸,有至少六个核苷碱基,可包括修饰的寡核苷酸或修饰核苷的序列或由修饰的寡核苷酸或修饰核苷的序列组成。ISS部分包括或侧翼有CG-包含核苷序列或p(IC)核苷序列,序列可以是回文。半胱氨酸可以是甲基化或未甲基化的。用于本发明的具体的ISS分子的例子包括下面进一步讨论的CpG分子以及CpY和CpR分子等。
HCV E1E2组和物的成分,如亚微米水包油乳剂或CpG寡核苷酸,可增强对组合物中存在的HCV E1E2抗原的免疫应答,组合物引起免疫应答的能力大于相同量未传递其它成分的抗原。确定这种提高的免疫原性可通过施用有和没有其它成分的抗原组合物,用标准试验比较抗两者的抗体滴度,如本领域熟知的放射性免疫测定和ELISAs。
“重组”蛋白是保持所需活性并由本文所述重组DNA技术制备的蛋白质。通常,,感兴趣的基因被克隆并随后表达在转化生物体中。宿主生物体表达外源基因以在表达条件下生成蛋白质。
当提及多肽时,“分离”指所示分子与全生物体分开和分离,分子发现于自然中或在显著缺乏其它相同类型生物大分子情况中存在。关于多核苷酸的术语“分离”是指核酸分子,缺乏全部或部分天然与它正常相联的序列;或是天然存在的序列,但有与之相联的异源序列;或者是与染色体分离的分子。
“相同抗原决定簇”指来自不同HCV亚类或菌株的抗原决定簇,如HCV菌株1、2、3等,由于序列变化抗原决定簇不需相同但出现在所讨论HCV序列中的相同位置。一般,当比对两种序列时,相同抗原决定簇的氨基酸序列有高度的序列同源性,如超过30%的氨基酸序列同源性,通常超过40%,如超过60%,甚至超过80-90%的同源性。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分间的百分比同一性。两个DNA或两个多肽序列彼此“显著同源”,序列表现出至少约50%的确定长度分子的序列同一性,至少约75%优选,至少约80-85%更优选,至少约90%优选,至少约95-98%最优选。如本文所用,显著同源也指表现出与具体DNA或多肽序列完全同一性的序列。
一般,“同一性”分别指对应于两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷-核苷或氨基酸-氨基酸。百分比同一性可通过直接比较两个分子间序列信息来确定,通过比对序列、计算两个比对序列间配对的确切数字、除以较短序列长度并将结果乘以100。计算机程序可用于协助分析,如ALIGN,Dayhoff,M.O.,蛋白质序列和结构集(Atlas of Protein Sequence and Structure)M.O.Dayhoff编,5Suppl.
3:353-358,National biomedical Research Foundation,Washington,DC,它改变了Smith和Waterman的局部同源性算法,Advances inAppl.Math.
2:482-489,1981用于肽分析。确定核苷序列同一性的程序存在于Wisconsin序列分析包,第8版(来自Genetics Computer Group,Madison,WI)例如BESTFIT、FASTA、GAP程序,它们也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序使用厂商建议和上述Wisconsin序列分析包中所述缺省参数。例如涉及序列的具体核苷序列的百分比同一性可用Smith和Waterman同源性算法确定,采用六个核苷位置的缺省记录表和缺口罚分(gap penalty)。
另一种在本发明中确定百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包,其版权属于爱丁堡大学,由John F.Collins和Shane.S.Sturrok开发,InteliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)分销。Smith和Waterman算法可用于此程序包,其中在记录表中使用了缺省参数(例如,缺口罚分为12,缺口延伸罚分为1,缺口为6)。从数据中产生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其它计算序列间百分比同一性或类似性的适当程序一般在本领域中已知,例如其它对比程序有采用缺省参数的BLAST。例如,可用采用以下缺省参数的BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准;滤器(filter)=无;链=两者;截止=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述(dexcription)=50个序列;排序=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细描述可在以下因特网地址中找到:
http://www/ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外,同源性可通过在同源区域间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸来确定,接着用单链-特异核酸酶消化并确定消化片段大小。显著同源的DNA序列可在Southern杂交实验中鉴定,在例如此具体系统定义的严格条件下。定义适当杂交条件在本领域技术内。参见例如Sambrook等,同上;DNA克隆(DNA cloning),同上;核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization),同上。
II.完成本发明的模式
详细描述本发明前,要理解的是由于制剂或参数会变化,本发明不限于具体制剂或过程参数。也要理解的是本文所用术语仅用于描述本发明具体实施方案,并不想要限制。
尽管与本文所述类似或相同的一些组合物和方法可用于本发明实践,本文描述了优选材料和方法。
如上所指出,本发明基础在一个发现上,HCV E1E2抗原结合缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂以及亚微米水包油乳剂和免疫刺激核酸分子如CpG寡核苷酸,提供的组合物引起的抗体滴度显著高于没有这些佐剂所观察到的。E1E2多肽引起的HCV-特异抗体提供用于发展HCV疫苗的体外和体内模式系统,具体用于鉴定与强抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗体滴度产生相关的HCV E1、E2和HCV E1E2多肽抗原表位,和/或抗HCV的细胞免疫应答。E1E2多肽也可用于在哺乳动物中产生抗HCV的免疫应答,具体是用于治疗或预防目的的抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗体反应和/或细胞免疫应答。
为进一步理解本发明,下面提供关于E1E2多肽的更详细讨论用于试验组合物以及产生亚微米水包油乳剂、免疫刺激核酸分子和包括上述部分的组合物。
E1E2多肽
如上所说明,用于本发明的E1E2复合体包括E1和E2多肽,与非共价或共价相互作用相联。丙肝病毒基因组通常包含单个约9,600核苷的可读框,可读框转录成多蛋白。裂解HCV多蛋白以产生一些不同产物,顺序为NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH(见图1)。HCV E1多蛋白是糖蛋白且从约氨基酸192延伸到氨基酸383(数字相对于HCV-1多蛋白)。参见例如Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)
88:2451-2455。约173到约191的氨基酸代表E1的信号序列。HCV E2多蛋白也是糖蛋白且从约氨基酸383延伸到氨基酸746。E2的信号肽起始于约多蛋白的氨基酸364。因此,本文所用术语“全长”E1或“非平截”E1所指多蛋白包括至少HCV多蛋白的氨基酸192-383(数字相对于HCV-1)。关于E2,本文所用术语“全长”或“非平截”所指多蛋白包括至少HCV多蛋白的氨基酸383或384到氨基酸746(数字相对于HCV-1)。此揭示中显然的是用于本发明的E2多蛋白可包括来自p7区域的其它氨基酸如氨基酸747-809。
如上说明,E2作为多个种类存在(Spaete等,Virol.(1992)
188:819-830;Selby等,J.Virol.(1996)
70:5177-5182;Grakoui等,J.Virol.(1993)
67:1385-1395;Tomei等,J.Virol.(1993)
67:4017-4026)且剪短和蛋白水解可发生在E1和E2多肽的N-和C-末端。因此,本文所用E2多肽可包括至少HCV多蛋白氨基酸405-661,如400、401、402...到661,例如383或384-661、383或384-715、383或384-746、383或384到-749或者383或384-809、或者383或384到661-809间任意C-末端,数字相对于全长HCV-1。类似的,本文所用E1多肽优选可包括HCV多蛋白氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383、或192到326-383间任意C-末端。
E1E2复合体也可由含抗原表位的免疫原性片段E1和E2组成。例如,E1多肽片段可包括从E1多肽约5个氨基酸到近全长分子,如6、10、25、50、75、100、125、150、175、185个或更多氨基酸或所示数字间任何整数。E1和E2多肽可来自相同或不同HCV菌株。
例如,抗原表位获得自如E2的超变量区域例如跨越氨基酸384-410或390-410的区域,抗原表位可包括在E2多肽中。结合到E2序列中的具体有效E2抗原表位包括获得自此区域的契合序列,如契合序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn,代表HCV类型1基因组氨基酸390-410的契合序列。其它E1和E2抗原表位已知并描述于如Chien等,国际公开号WO 93/00365。
此外,复合体的E1和E2多肽可缺乏所有或部分跨膜蛋白结构域。膜锚序列功能是使多肽联到内质网。一般,这些多肽能分泌入培养基,其中表达蛋白质的生物体被培养。然而,如国际公开号WO 98/50556所述,这些多肽也可胞内回收。分泌到培养基用一些检测技术确定,如聚丙烯酰胺凝胶电泳等、免疫学技术如免疫沉淀试验,描述于如出版于1996年2月15日的国际公开号WO 96/04301。关于E1,一般终止于氨基酸位置370和更高(以HCV-1 E1数字为基础)的多肽由ER保持并因此不分泌入培养基。关于E2,终止于氨基酸位置731和更高(也以HCV-1 E2序列数字为基础)的多肽由ER保持并因此不分泌。(参见例如出版于1996年2月15日的国际公开号WO 96/04301)。应该指出这些氨基酸位置不是绝对的且可一定程度变化。因此,本发明预期使用保持跨膜结合结构域的E1和E2多肽以及缺乏所有或部分跨膜结合结构域的多肽,包括终止于约氨基酸369和更低的E1多肽和终止于约氨基酸730和更低的E1多肽,它们为本发明获得。此外,C-末端平截可延伸穿过跨膜结构域到N-末端。因此,例如发生在位置低于如360的E1平截和发生在位置低于如715的E2平截也可包括在本发明中。必要的是平截E1和E2多肽保持功能用于所需目的。然而,具体优选的平截E1构建不延伸超过氨基酸300。最优选的在位置360终止。优选的平截E2构建是不延伸超过氨基酸位置715的C-末端平截。具体优选的E2平截在任意氨基酸715-730后截短,如725。如果使用平截分子,优选使用都截短的E1和E2分子。
E1和E2多肽和它们的复合体也可存在作为脱唾液酸糖蛋白。这些脱唾液酸糖蛋白由本领域已知方法产生,如用阻断末端糖基化的细胞。当这些蛋白质在这类细胞中表达并由GNA凝集素亲和层析分离时,E1和E2蛋白自发聚集。产生这些E1E2聚集体的详细方法描述于如美国专利号6,074,852。
此外,E1E2复合体可存在作为分子的异源混合物,这是由于上述的剪短和蛋白水解。因此,含E1E2复合体的组合物可包括多种E1E2,如终止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、终止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)、或任意上述其它不同E1和E2分子如N-末端从1-20个氨基酸平截的E2分子,如起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2种类。
E1E2复合体可重组产生,作为融合蛋白或通过如用编码感兴趣E1和E2多肽的质粒共转染宿主细胞。共转染可反式或顺式完成,即使用不同载体或使用携带E1和E2基因的单个载体。如果用单个载体完成,两个基因可由一组控制元件推动,或者另外基因可存在于载体单独表达盒中,由单独制元件推动。表达后,E1和E2蛋白自发相联。另外,复合体可通过将分别产生的单独蛋白质混合一起来形成,以纯化或半纯化形式,或者甚至通过混合培养基,在其中表达蛋白质的宿主细胞被培养。最后,本发明E1E2复合体可表达作为融合蛋白,其中E1的所需部分融合到E2的所需部分。
从分泌到培养基的全长、平截的E1和E2蛋白以及胞内生成的平截蛋白中产生E1E2复合体的方法在本领域中已知。例如,这种复合体可重组产生,描述于美国专利号6,121,020;Ralston等,J.Virol.(1993)
67:6753-6761,Grakoui等,J.Virol.(1993)
67:1385-1395;Lanford等,Virology.(1993)
197:225-235。
因此,用于本发明的编码HCV E1和E2多肽的多核苷酸可用标准分子生物技术产生。例如,编码上述分子的多核苷酸序列可用重组方法获得,如通过从表达基因的细胞中筛选cDNA和基因组文库或通过从已知包括相同载体中获得基因。此外,所需基因可用本领域所述技术直接从病毒核酸分子中分离,如在Houghton等,美国专利号5,350,671中。感兴趣基因也可合成产生,而不是克隆。分子可用具体序列的适当密码子设计。完整序列随后从用标准方法制备的重叠寡核苷酸中集合并装配成完整编码序列。参见例如Edge(1981)Nature.
292:756;Nambair等,(1984)Science.
223:1299;Jay等,(1984)J.Biol.Chem.
259:6311。
因此,具体核苷序列可从含所需序列的载体获得或者用多种本领域已知寡核苷酸合成技术完全或部分合成,如在适当处用定点突变和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见例如Sambrook,同上。具体是,一种获得编码所需序列的核苷序列方法是通过退火常规产生的重叠合成寡核苷酸互补对、自动化多核苷酸合成仪、接着用适当DNA连接酶连接和通过PCR扩增连接核苷序列。参见例如Jayaraman等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
88:4084-4088。另外,寡核苷酸定向合成(Jones等(1986)Nature.
54:75-82)、寡核苷酸定向突变预存在核苷区域(Riechmann等(1988)Nature
332:323-327和Verhoeyen等(1988)Science
239:1534-1536)和用T4 DNA聚合酶酶填充缺口寡核苷酸(Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:10029-10033)可用于提供的分子改变或增强抗原-结合能力和免疫原性。
一旦制备或分离了编码序列,这种序列可克隆到任何适当载体或复制子中。许多克隆载体对于本领域技术人员已知,选择适当克隆载体是一种选择。适当载体包括但不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或病毒,当与合适控制元件相联时它们能复制。
编码序列随后置于适当控制元件的控制下,取决于用于表达的系统。因此,编码序列可置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子控制下,从而感兴趣DNA序列由合适转化株转录成RNA。编码序列可或可不包含信号肽或前导序列,它们后来在翻译后加工中被宿主去除。参见例如美国专利号4,431,739;4,425,437;4,338,397。
除了控制序列,需要加入调节序列来调控相对宿主细胞生长的序列表达。调节序列对本领域技术人员已知,例子包括那些引起基因表达响应化学或物理刺激来打开或关闭,包括存在调节化合物。其它种类调节元件也可存在于载体中。例如,本文可使用增强子元件以增加构建表达水平。例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBO J..
4:761)、获得自劳氏肉瘤病毒长末端重复(LTR)的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
79:6777)和获得自人CMV的元件(Boshart等(1985)Cell.
41:521),如包括在CMV内含子A序列中的元件(美国专利号5,688,688)。表达盒可进一步包括在适当宿主细胞中用于自主复制的复制起点、一个或更多选择标记、一个或更多限制性位点、高拷贝和强启动子的潜力。
构建表达载体,从而具体编码序列位于有合适调节序列的载体中,编码序列相对控制序列的位置和方向使编码序列在控制序列“控制”下转录(即在控制序列结合DNA分子的RNA聚合酶转录编码序列)。编码感兴趣分子的序列修饰对于获得此目标是需要的。例如,在一些情况中,必须修饰序列使它能以合适方向附于控制序列;即维持阅读框。控制序列和其它调节序列可在插入载体前连接到编码序列。另外,编码序列可直接克隆到含控制序列和适当限制性位点的表达载体中。
如上所说明,产生感兴趣多肽的突变体或类似物也是需要的。用于试验组合物的HCV多肽突变体或类似物可通过缺失部分编码感兴趣多肽的序列、插入序列和/或置换一个或更多序列内核苷来制备。修饰核苷序列的技术如定点突变等对本领域技术人员熟知。参见例如Sambrook等,同上;Kunkel T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1985)
82:448;Geisselsoder等(1987)BioTechniques
5:786;Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.
100:468;Dalbie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.
79:6409。
分子可在多种系统中表达,包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统,这些都在本领域中熟知。
例如,昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统,对本领域技术人员已知并描述于如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒和其它形式从Invitrogen,San Diego CA购买(“MaxBac”试剂盒)。类似的,细菌和哺乳动物细胞表达系统在本领领域熟知并描述于如Sambrook等,同上。酵母表达系统也在本领领域中已知并描述于如酵母遗传工程(Yeast Genetic Engineering)(Barr等编)Butterwoths,London。
一些用于上述系统的合适宿主细胞也已知。例如,哺乳动物细胞系在本领领域中已知并包括来自American Type Culture Collection(ATCC)的无限增殖细胞系,例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、仓鼠幼儿肾细胞、猴肾细胞(COS)、人胚胎肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞以及其它。类似的,发现细菌宿主如大肠杆菌(E.Coli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、链球菌属(Steptococcus spp.)可用于本表达构建。本发明中有用的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、麦芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形类汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆弱克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowialioplytica。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
包括感兴趣核苷序列的核酸分子可使用多种本领域熟知的基因传递技术来稳定整合到宿主细胞基因组中或维持在适当宿主细胞中的稳定游离元件上。参见例如美国专利号5,399,346。
取决于所选表达系统和宿主,分子通过转化上述表达载体的宿主细胞在表达蛋白的条件下生长来产生。表达蛋白随后从宿主细胞分离并纯化。如果表达系统分泌蛋白质到培养基中,产物可从培养基中直接纯化。如果不分泌,蛋白质可从细胞裂解物中分离。合适生长条件和回收方法的选择在本领域技术范围内。
组合物
一旦产生,E1E2抗原可在疫苗组合物中提供,如预防(即防止感染)或治疗(治疗感染后的HCV)疫苗。疫苗可包括一个或更多E1E2复合体的混合物如获得自超过一个病毒分离物的E1E2复合体,以及其它HCV抗原。此外如上所说明,由于剪短和蛋白水解E1E2复合体可作为分子的异源混合物存在。因此含E1E2复合体的组合物可包括多种E1E2,如终止于氨基酸746的E1E2(E1E2746)、终止于氨基酸809的E1E2(E1E2809)、或任意上述其它不同E1和E2分子如N-末端从1-20个氨基酸平截的E2分子,如起始于氨基酸387、氨基酸402、氨基酸403等的E2种类。
疫苗可与其它抗原和免疫调节剂结合施用,例如免疫球蛋白、细胞因子和趋化因子,包括但不限于细胞因子如IL-2、修饰的IL-2(cys125→ser125)、GM-CSF、IL-12、γ干扰素、IP-10、MIP1β、FLP-3、病毒唑和RANTEs。
疫苗一般包括一个或更多“药学上可接受赋形剂或载体”如水、盐水、甘油、乙醇等。此外,辅助物质如润湿或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这些载体中。
载体任选存在,它是一种分子,本身不诱导对接受组合物个体有害的抗体产生。适当载体一般是大、缓慢代谢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂类聚集体(如油滴或脂质体)和失活病毒颗粒。这种载体对本领域普通技术人员是熟知的。此外,HCV多肽可结合到细菌类毒素,如来自白喉、破伤风、霍乱等的类毒素。
如上所说明,亚微米水包油乳剂和/或ISS如CpG寡核苷酸(下面进一步描述)可存在于相同组合物中以提高免疫应答。可存在其它佐剂,例如但不限于:(1)铝盐类(明矾),如氢氧化铝、正磷酸铝、硫酸铝等;(2)RibiTM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT),含2%鲨烯、0.2%土温80和一种或多种细菌细胞壁成分,成分来自单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate)(TDM)和细胞壁骨架(CWS),MPL+CWS(DetoxTM)优选;(3)皂角苷佐剂如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)可使用或由此产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合体),ISCOMs可缺乏其它去垢剂(参见例如国际公开号WO00/07621);(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA);(5)细胞因子,如白介素,例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(参见例如国际公开号WO 99/44636),如γ干扰素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素的去毒突变体如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、具体是LT-K63(其中赖氨酸在位置63置换野生型氨基酸)、LT-R72(其中精氨酸在位置72置换野生型氨基酸)、CT-S109(其中丝氨酸在位置109置换野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其中赖氨酸在位置9置换野生型氨基酸且甘氨酸在位置129置换野生型氨基)(参见例如国际公开号WO 93/13202和WO 92/19265);(7)单磷酰脂A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)(参见例如GB2220221;EPA 0689454),任选地大量缺少明矾(参见例如国际公开号WO 00/56358);(8)3dMPL与如QS21和/或水包油乳剂的组合物(参见例如EPA 0835318;EPA0735898;EPA 0761231);(9)聚氧乙烯或聚氧乙烯酯(参见例如国际公开号WO99/52549);(10)皂角苷和免疫刺激寡核苷酸,如CpG寡核苷酸(参见例如国际公开号WO 00/62800);(11)免疫刺激物和金属盐类颗粒(参见例如国际公开号WO00/23105);(12)皂角苷和水包油乳剂(参见例如国际公开号WO 99/11241);(13)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选的+固醇)(参见例如国际公开号WO98/57659);(14)其它作为免疫刺激剂提高组合物有效性的物质。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰(nor-MDP)、-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
通常,疫苗组合物制备为可注射物,作为脂溶液或悬浮液;适于溶液或悬浮液中的固体形式,也可制备注射前的脂类载体。
疫苗包括治疗有效量的E1E2复合体和所需任何其它上述成分。“治疗有效量”指在施用个体中诱导免疫应答的E1E2蛋白量,保护性免疫应答优选。这种反应一般导致试验品对疫苗分泌、细胞和/或抗体-调节免疫应答的发展。通常,这种反应包括但不限于一种或多种下列效果;产生来自任意免疫种类的抗体,如免疫球蛋白A、D、E、G或M;B和T淋巴细胞增生;提供活化、生长和分化信号给免疫细胞;辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞群的扩展。
一旦制成,疫苗常规是肠胃外施用,如通过注射,皮下或肌肉内。适于其它施用模式的另外制剂包括口头和肺部制剂、栓剂和经皮肤应用。剂量治疗可以是单剂量安排或多剂量安排。优选的是,有效量足够治疗或防止疾病症状。必需精确量的不同取决于治疗试验品;待治疗个体的年龄和总体状况;个体免疫系统合成抗体的能力;所需保护的程度;治疗情况的严重性;具体选择的E1E2多肽和其施用模式。合适有效量可由本领域技术人员确定。相对宽范围的“治疗有效量”可用本领域已知体外和体内模式通过途径尝试确定。下面例子中所用E1E2多肽量提供总体指导,可用于最优化抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗体的诱发。
具体是,E1E2复合体优选肌肉内注射到大哺乳动物中,例如灵长类动物如狒狒、黑猩猩或人,剂量为约0.1μg到约5.0mg每剂量或所列范围内的任何量,如.5μg到约1.0mg、1μg到约500μg、2.5μg到约250μg、4μg到约200μg,如4、5、6、7、8、9、10...20...30...40...50...60...70...80...90...100等μg每剂量。E1E2多肽可施用给未感染HCV的哺乳动物或HCV-感染的哺乳动物。
施用E1E2多肽可引起哺乳动物中抗E1、抗E2和/或抗E1E2抗体滴度维持至少1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年或更长。也可施用E1E2多肽以提供记忆反应。如果获得这种反应,抗体滴度可随着时间下降,然而暴露于HCV病毒或免疫原导致抗体迅速诱导,如仅在几天内。任选的是,抗体滴度可在哺乳动物中维持,这是通过在初步注射后2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年或更多提供一个或更多E1E2多肽的强化注射。
优选的是,E1E2多肽引起的抗体滴度为至少10、100、150、175、200、300、400、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000(几何平均滴度)或更高,或所列滴度内的任何数字,这是用标准免疫测定来确定,如描述于下面例子中的免疫测定。参见例如Chien等,Lancet(1993)
342:933;和Chien等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)
89:10011。
亚微米水包油乳剂
如上所说明,亚微米水包油乳剂也可在传递E1E2抗原前、同时或之后施用给脊椎动物试验品。本文所用亚微米水包油乳剂包括非毒性、可代谢的油和商业乳化剂。非毒性、可代谢的油的例子包括但不限于植物油、鱼油、动物油或合成制备油。鱼油如鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油优选,发现于鲨鱼肝油的鲨烯2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷己烯(tetracosahexaene)尤其优选。油成分存在量从约0.5%到约20%体积,至约15%的量优选,从约1%到约12%的量更优选,从约1%到约4%的量最优选。
佐剂的水溶部分可以是缓冲盐水或无搀杂的水。由于组合物用于肠胃外施用,优选构成最终的溶液从而涨度即同渗重摩本质与正常生理流体相同以防止由于组合物和生理流体间不同离子浓度导致施用后膨胀或迅速吸收组合物。如果使用盐水而不是水,优选缓冲盐水以维持与正常生理条件相容的pH。同样在一些情况中,必须维持pH在具体水平以确保一些组合物成分的稳定性。因此,组合物的pH一般是pH6-8且pH可用任何生理上可接受缓冲液维持,如磷酸、醋酸、tris、重碳酸盐或碳酸盐缓冲液等。水溶剂的量一般是使组合物达到所需最终体积必需的量。
适用于水包油制剂的乳化剂没有限制包括以山梨聚糖为基础的非离子表面活性剂如山梨聚糖单、二或三酯,例如以SpanTM或ArlacelTM名字购买的如SpanTM85(山梨聚糖三油酸酯);商品名为土温TM的聚氧乙烯山梨聚糖单、二或三酯,如土温80TM(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯);名为MyrjTM的聚氧乙烯脂肪酸;获得自月桂醇、乙醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪酸酯;如名为BrijTM;等。这些物质可从一些商业源获得,包括Sigma,St.Lousis,MO和ICI America’s Inc.,Wilmington,DE。这些乳化剂可单独或组合使用。乳化剂通常存在量从0.02%到约2.5%重量(w/v),0.05%到约1%优选且0.01%到约0.5%更优选。存在量一般约为20-30%所用油重量。
乳剂可包含其它免疫刺激剂,如胞壁酰肽,包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰(nor-MDP)、-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。免疫刺激细菌细胞壁成分如单磷酰脂A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和细胞壁骨架(CWS)也可存在。另外,乳剂可以没有这些试剂,如没有MTP-PE。本发明的亚微米水包油乳剂也可没有任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。为描述本发明所用多种适当亚微米水包油乳剂制剂以及免疫刺激剂,蚕茧例如国际公开号WO 90/14837;Remington:制药科学和实践(The Science and Practice of Pharmacy),第19版(1995);Van Nest等“用于与重组亚基疫苗使用的高级佐剂制剂”(Advanced adjuvant formulations for usewith recombinat subunit vaccine),疫苗92,新疫苗的现代方法(Vaccines 92,Modern Approaches to New Vaccines)(Brown等编)Cold Spring HarborLaboratory Press,57-62页(1992);Ott等,“MF59-设计和评估用于人疫苗的安全和潜在佐剂”,疫苗设计:亚基和佐剂方法(Powell,M.F.和Newman,M.J.编)Plenum Press,New York(1995)277-296页,和美国专利号6,299,884。
为产生亚微米颗粒即直径小于1微米且在纳米大小范围中的颗粒,可使用一些技术。例如,可使用高剪切力原理操作的商业乳化器,在高压下使流体通过小孔。商业乳化器例子包括但不限于110Y型微流化器(Microfluidics,Newton,MA)、Gaulin 30CD型(Gaulin,Inc.,Everett,MA)和Rainnie Minilab 8.30H型(MicroAutomizer Food and Diary,Inc.,Hudson,WI)。单独乳化器使用的适当压力由本领域技术人员确定。例如,当使用110Y型微流化器时,在5000到30,000psi操作产生直径约100到750nm的油滴。
油滴大小改变可通过变化去垢剂和油的比例(比例增加使小滴尺寸减小)、操作压力(操作压力增加使小滴尺寸减小)、温度(温度增加使小滴尺寸减小)和加入两性免疫刺激剂(加入这些试剂使小滴尺寸减小)。实际小滴尺寸的改变随着具体去垢剂、油和免疫刺激剂(如果有)和所选具体操作条件。小滴尺寸可使用校准仪器检验,如Coulter公司生产的商业亚微米颗粒分析器(N4MD型),参数可用上述指南改变直到几乎所有小滴直径小于1微米,直径小于0.8微米优选,直径小于0.5微米最优选。几乎所有是指至少约80%(数量),至少约90%优选,至少约95%更优选,至少约98%最优选。颗粒大小分布是典型高斯分布,从而平均直径小于所列限制。
本文所用的具体优选亚微米水包油乳剂是鲨烯/水乳剂,任选包含不同量的MTP-PE,如亚微米水包油乳剂含4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v土温80TM(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0%Span85TM(山梨聚糖三油酸酯)和任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE),例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(国际公开号WO90/14837;美国专利号6,299,884;和Ott等,“MF59-设计和评估用于人疫苗的安全和潜在佐剂”,疫苗设计:亚基和佐剂方法(Powell,M.F.和Newman,M.J.编)Plenum Press,New York(1995)277-296页)。MF59包含4-5%w/v鲨烯、0.25-0.5%w/v土温80TM、0.5%w/vSpan85TM和任选的不同量MTP-PE,用微流化器如110Y型微流化器(Microfluidics,Newton,MA)制成亚微米颗粒。例如MTP-PE存在量可以是约0-500μg/剂量,0-250μg/剂量更优选,0-100μg/剂量最优选。如本文所用,术语“MF59-0”指上面缺乏MTP-PE的亚微米水包油乳剂,术语MF59-MTP指含MTP-PE的制剂。例如,“MF59-100”包含100μgMTP-PE每剂量等。另一种本文所用亚微米水包油乳剂MF69包含4.3%w/v鲨烯、0.25%w/v土温80TM、0.75%w/vSpan85TM和任选的MTP-PE。又一种亚微米水包油乳剂是MF75,也称为SAF,包含10%w/v鲨烯、0.4%土温80TM、5%多聚醇-阻断聚合物L121和thr-MDP,同样微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP指包括MTP的MF75制剂,如来自100-400μgMTP-PE每剂量。
亚微米水包油乳剂、制造组合物中有用的相同和免疫刺激剂如胞壁酰的方法详细描述于国际公开号WO 90/14837。
一旦制成亚微米水包油乳剂,如果使用ISS,它可在传送抗原和ISS之前、同时或之后施用给脊椎动物试验品。如果抗原免疫前施用,佐剂制剂可早在用感兴趣抗原免疫前5-10天施用,免疫前3-5天优选且免疫前1-3或2天最优选。如果分开施用,亚微米水包油制剂可传送到抗原组合物相同传递位置或不同传递位置。
如果需要同时传送,亚微米水包油制剂可用抗原组合物包括。一般,抗原和亚微米水包油乳剂可通过简单混合、搅拌或摇动来结合。其它技术如将两种成分混合物迅速穿过开口(如hydrodermic针)也可用于提供疫苗组合物。
如果结合,组合物的不同成分可以大范围比例存在。例如,抗原和乳剂成分一般使用1∶50到50∶1的体积比例,1∶10到10∶1优选,从约1∶5到3∶1更优选,约1∶1最优选。然而,其它比例对于特殊目的更合适,如当具体抗原具有低免疫原性时,需要相对更高量的抗原成分。
免疫刺激核酸分子(ISS)
以前报导细菌DNA刺激哺乳动物免疫应答。参见例如Krieg等,Nautre(1995)374:546-549。此免疫刺激能力来自高频率的免疫刺激核酸分子(ISS),如细菌DNA中存在的未甲基化CpG二核苷酸。含未甲基化CpG基序的寡核苷酸显示诱导B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞(APCs)的活化,如单核细胞和巨噬细胞。参见例如美国专利号6,207,646。
本发明使用来自ISS的佐剂。本发明的ISS包括的寡核苷酸可以是部分较大核苷构建如质粒或细菌DNA。寡核苷酸可以是线性或环状,或可包含线性和环状片段。寡核苷酸可包括修饰,例如但不限于YOH或5’OH基团修饰、核苷碱基修饰、糖成分修饰和磷酸基团修饰。ISS可包括核糖核苷酸(包含核糖作为唯一或主要糖成分)、脱氧核糖核苷酸(包含去氧核糖作为主要糖成分)。修饰的糖或糖类似物也可结合在寡核苷酸中。可使用的糖部分例子包括核糖、去氧核糖、戊糖、去氧戊糖、己糖、去氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖类似物环戊基。糖可以吡喃或呋喃形式。磷衍生物(或修饰的磷酸基团)可使用并可以是一磷酸、二磷酸、三磷酸、烷基磷酸、链烷磷酸、硫代磷酸等。结合到ISS寡核苷酸碱基的核酸碱基可以是天然产生的嘌呤和嘧啶碱基,即尿嘧啶或胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤以及这些碱基的天然发生或合成修饰。此外,存在大量非天然核苷,它们包括不同杂环碱基和不同糖部分(和糖类似物)并对本领域技术人员已知。
结构上,ISS的底部寡核苷酸是CG-包含核苷序列或p(IC)核苷序列,可以是回文序列。胞嘧啶可以是甲基化或未甲基化。用于本发明的具体ISS分子例子包括本领域已知的CpG、CpY和CpR分子等。
优选ISS获得自CpG分子家族、包括CpG基序的CpG二核苷酸和合成寡核苷酸(参见例如Krieg等,Nautre(1995)
374:546-549和Davis等J.Immunol(1998)
160:870-876),如揭示于美国专利号6,207,646的任何不同免疫刺激CpG寡核苷酸。这些CpG寡核苷酸一般包括至少8到约100个核苷,8到40个核苷优选,15-35个核苷更优选,15-25个核苷和这些值之间任意数量核苷优选。例如,包括共有CpG基序的寡核苷酸由公式5’-X1CG X2-3’表示,其中X1是A、G或T,X2是C或T。其它有用CpG分子包括由公式5’-X1 X2CG X3 X4表示的,其中X1和X2是序列如GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT、TpG,X3和X4是如TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA或TpG,其中“p”表示磷酸键。优选的是,寡核苷酸不包括在5’-和/或3’末端或附近的GCG序列。另外,CpG优选以两个嘌呤(优选GpA二核苷酸)或一个嘌呤和一个嘧啶(优选GpT)在其5’-末端侧翼,以两个嘧啶在其3’-末端,优选TpT或TpC二核苷酸。因此,优选分子包括序列包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT,这些序列侧翼有一些其它核苷,如1-20个或更多核苷酸,2到10个核苷优选且3到5个核苷或这些所列范围间任何整数更优选。中央核心区域外的核苷似乎非常可以变化。
此外,本文所用CpG寡核苷酸可以是双或单链。双链分子体内更稳定而单链分子表现出提高的免疫活性。另外,磷酸骨架可被修饰以提高CpG分子的免疫刺激活性,如硫代磷酸-修饰。如美国专利号6,207,646所述,有硫代磷酸骨架的CpG分子优选活化B细胞,有磷酸二酯骨架的CpG分子优选活化单核(巨噬细胞、树突细胞和单核细胞)和NK细胞。
用于本组合物的示范CpG寡核苷酸包括的分子有序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO:1)和5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:5)。
可用本领域熟知的标准技术试验ISS分子刺激免疫应答的能力。例如分子刺激体液和/或细胞免疫应答的能力用上述免疫测定确定。此外,抗原和亚微米水包油组合物可有或没有ISS施用以确定免疫应答是否增强。
如上所说明,ISS可在传送抗原和/或亚微米水包油乳剂之前、同时或之后施用。如果在抗原和/或亚微米水包油乳剂免疫前施用,ISS可早在免疫前5-10天施用,免疫前3-5天优选且免疫前1-3或2天最优选。如果分开施用,ISS可传送到抗原组合物相同传递位置或不同传递位置。如果需要同时传送,ISS可用抗原组合物包括。
一般,使用约5μg到5000μg ISS,更常用5μg到约1000的ISS每剂量,5μg到约500μg优选,或从1到约100μg,优选约5到约50μg,优选5到约30或这些范围内的任何量,它们可在本方法中使用。
III.实验
下面例子是完成本发明的具体实施方案。提供例子仅用于描述目的,不想在任何方面限制本发明范围。
努力保证所用数字的准确性(如量、温度等),但应允许一些实验误差和偏差。
实施例1
HCV E1E2的产生
用于本发明疫苗组合物的HCV E1E2复合体制备为下列融合蛋白。特别地,哺乳动物表达质粒pMH-E1E2-809(图3)编码E1E2融合蛋白,所述融合蛋白包括HCV-1的氨基酸192-809(参见Choo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)
88:2451-2455)。E1E2809分子的序列示于本文图2A-2C。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于表达来自pMH-E1E2-809的HCV E1E2序列。具体是,使用CHO DG44细胞。Uraub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1980)
77:4216-4220描述的这些细胞获得自CHO K-1细胞并通过dhfr基因中双重缺失而缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)。
DG44细胞用pMH-E1E2-809转化。转化细胞生长在选择性培养即中,从而仅表达dhfr基因的细胞可生长(Sambrook等,同上)。分离的CHO克隆挑入(约800个克隆)96孔板的各个孔中。从原始96孔板进行影印来完成表达实验。影印板生长至细胞形成汇合的单层。细胞固定到板壁并用冷甲醇渗透。抗E1E2的单克隆抗体3D5C3和抗E2的单克隆抗体3E51用于探测固定细胞。加入抗小鼠HRP缀合物后,接着加入底物,确定了最高表达的细胞系。然后将最高表达的细胞系扩大到24孔聚合板(24-well cluster plate)。重复表达试验并再次将最高表达细胞系扩张到最大体积的孔。这样重复直到最高表达细胞系从6孔板扩张到组织培养烧瓶。这时有足够量的细胞来精确计数和收集细胞,进行定量表达试验。在细胞裂解物上进行ELISA(Spaete等,Virol.(1992)
188:819-830)以确定高表达子。
实施例2
HCV E1E2的纯化
表达后,裂解CHO细胞并通过GNA-凝集素亲和层析(GNA步骤)纯化生成的E1E2809,接着进行羟磷灰石(HAP)柱层析(HAP步骤)、DV50膜过滤(DV50步骤)、SP琼脂糖HP柱层析(SP步骤)、Q膜过滤(Q步骤)和G25琼脂糖柱层析(G25步骤)。完成各加工步骤后,产物收集用0.2μ过滤并保存于2-8℃或通过下次纯化步骤直接加工。完成纯化过程后,抗原用0.2μ过滤并保存于-60℃或更低直到过滤用于制剂。
具体是,裂解细胞,两体积冷裂解缓冲液(1%Triton X-100于100mM Tris,pH8,和1mM EDTA)加入2-8℃的CHO细胞。混合物以5000rpm在2-8℃离心45分钟以去除碎片。收集上清并通过Sartorias 0.65μm Sartopure预滤器(Sartorius)和之后的Sartorias 0.65mm Sartofine预滤器来过滤,接着通过Sartorias 0.45μmSartobran过滤器和0.2μm Sartobran过滤器。过滤裂解物在装入GNA柱前保存在冰上。
GNA琼脂糖柱(1885ml,200×600,Vector Labs,Burlingame,CA)用八个柱体积的平衡缓冲液(25mM NaPO4,1.0M NaCl,12%Triton X-100,pH6.8)预平衡。裂解物以31.4ml/min(6cm/hr)加入柱过夜。柱用4床体积平衡缓冲液洗,随后再次用5床体积10mM NaPO4,80mM NaCl,0.1%Triton X-100,pH6.8洗。产物用1M甲基α-D-吡喃甘露糖苷(MMP),10mM NaPO4,80mM NaCl,0.1%Triton X-100,pH6.8洗提。收集约1体积的洗脱峰,0.2μm过滤并在或低于-60℃保存用于HAP层析。
HAP层析在室温进行。1200ml(100×150mm)I型陶瓷羟磷灰石柱(BioRad)用一个柱体积的0.4M NaPO4,pH6.8调节,随后用不小于10个柱体积的10mM NaPO4,80mM NaCl,0.1%Triton X-100,pH6.8平衡。四组GNA洗提收集在不超过30℃的循环水浴中融化,0.2μm过滤并以131ml/min(100cm/hr)装入平衡柱。装载后HAP平衡缓冲液加入柱作为追踪缓冲液(chase buffer)。当UV上升到基线上时收集通过流量。当产物收集体积到达一体积装载体积加75%柱体积时,停止产物收集。HAP通过流量收集进一步通过DV50病毒还原过滤来加工。
DV50过滤在室温进行。制备DV50装载是通过两倍稀释HAP收集和0.15%TritonX-100,1mM EDTA,pH5.3调节。稀释和调节通过加入稀释缓冲液-1(3mM柠檬酸,2mM EDTA,0.2%Triton X-100)完成以调整产物收集的pH到5.3,接着加入稀释缓冲液-2(2mM EDTA,0.2%Triton X-100,pH5.3)以使终体积达到2倍原始HAP收集体积。
稀释和调节的HAP聚集物(DV50装载)通过10英寸,Pall Ultipor VF DV50膜柱体(Pall)过滤。用过滤柱体收集过滤物(filter housing),用水预湿,123℃高压灭菌60分钟消毒,使用前缓慢排气。过滤器随后用SP平衡缓冲液(10mM柠檬酸钠,1mM EDTA,0.15%Triton X-100,pH5.3)预湿,在不超过45psi的压力加入DV50装载前排出。DV50装载接着用约800ml/min的流速在约30psi的转膜压力应用。收集滤液并过夜保存在2-8℃并用于SP步骤。
SP层析在室温进行。88ml(50×45mm)SP琼脂糖HP柱层析(Pharmacia,Peapack,NJ)用15个柱体积的平衡缓冲液(10mM柠檬酸,1mM EDTA,0.15%Triton X-100,pH5.3)平衡。DV50过滤物加入柱。柱首先用5个柱体积的平衡缓冲液洗,接着用20个柱体积的洗涤缓冲液,洗涤缓冲液含10mM柠檬酸,15mM NaCl,1mM EDTA,0.1%土温-80TM,pH6.0。产物用10mM柠檬酸,180mM NaCl,1mM EDTA,0.1%土温-80TM,pH6.0从柱洗提。收集完整的280nm吸收峰作为产物收集。产物收集过夜保存在2-8℃并用于Q-膜过滤步骤。
Q-膜过滤步骤在室温进行。两个消毒的Sartorious Q100X圆盘膜串联相连。膜用不少于300ml的Q平衡缓冲液(10mM柠檬酸,180mM NaCl,1mM EDTA,0.1%土温-80TM,pH6.0)平衡。完整SP洗提收集以30-100ml/min流速通过平衡的Q膜过滤,接着用40ml的Q平衡缓冲液冲洗。收集过滤物和冲洗物并结合作为产物收集且用于G25步骤。
G25步骤在室温进行。1115ml(100×142mm)Pharmacia交联葡聚糖G-25柱(Pharmacia,Peapack,NJ)用不少于5个柱体积的制剂缓冲液(10mM柠檬酸,270mMNaCl,1mM EDTA,0.1%土温-80TM,pH6.0)平衡。Q过滤收集加入柱并收集柱通过流量,0.22μm过滤(Millipore)并冻存于-60℃或更地直到使用。
实施例3
小鼠中HCV E1E2疫苗组合物的免疫原性
上述产生和纯化的HCV E1E2809的免疫原性如下确定,HCV E1E2809与亚微米水包油乳剂和/或CpG寡核苷酸结合。
此研究中所用制剂概括于表1。一种亚微米水包油乳剂MF59如前所述生成,它包含4-5%w/v鲨烯、0.5%w/v土温80TM、0.5%Span85TM。参见国际公开号WO90/14837;美国专利号6,299,884;和Ott等,“MF59-设计和评估用于人疫苗的安全和潜在佐剂”,疫苗设计:亚基和佐剂方法(Powell,M.F.和Newman,M.J.编)Plenum Press,New York(1995)277-296页。对于组4和9,使用4倍量的MF59。此研究中所用MF59是MF59-0,不含任何MTP-PE。
组1、3、6和8所用制剂也包括25μg的活性CpG分子每剂量。所用活性CpG分子序列是:5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO:1)。
组5所用制剂包括25μg的失活CpG分子每剂量。所用失活CpG分子序列是:5’-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3’(SEQ ID NO:2)。
组1-4所用制剂包括2.8μg每剂量的HCV E1E2809抗原,如上所述生成。
组5-9所用制剂包括2.0μg每剂量的HCV E2715,如美国专利号6,12,020所述,HCV E2715是CHO细胞中产生的一种平截E2蛋白。
6周年龄的Balb/C小鼠分成9组(每组10只小鼠)并肌肉内施用50μl的疫苗组合物和表1所列成分。动物在初次注射后30和90天强化。最后一次注射后14天收集血清且通过酶免疫测定确定抗E1E2和抗E2抗体滴度。参见Chien等,Lancet(1993)
342:933。
结果示于表1和图4。可见HCV E1E2免疫小鼠用CpG结合MF59作为佐剂,产生的E1E2抗体水平显著高于(P<0.05)单独使用MF59或单独使用4x MF59作为佐剂的E1E2免疫小鼠。单独CpG产生的抗体水平高于单独用MF59的抗体水平,尽管不显著高于。相反,使用MF59和/或CpG的E2715免疫小鼠产生非常低的抗体水平,少于50%的小鼠响应。这令人惊讶,因为前面用E2715的实验在小鼠中产生高抗体水平,所有试验小鼠响应。
表1.HCV E1E2809和E2715的免疫原性,它们使用CpG和/或MF59作为佐剂。括号中的数字表示产生抗体的动物数量相对免疫动物的数量。
组 | 疫苗佐剂 | 剂量 | 几何平均E1E2ELA抗体滴度 | 几何平均E2 ELA抗体滴度 |
1 | E1E2809;CpG | 2.8,2.8,2.8 | 5,167(10/10) | ND |
2 | E1E2809;MF59 | 2.8,2.8,2.8 | 2,716(10/10) | ND |
3 | E1E2809;CpG+MF59 | 2.8,2.8,2.8 | 19,159B(10/10)P<0.05 | ND |
4 | E1E2809;4X MF59 | 2.8,2.8,2.8 | 3,335(10/10) | ND |
5 | E2715;对照CpG | 2.0,2.0,2.0 | ND | 1.3(1/10) |
6 | E2715;CpG | 2.0,2.0,2.0 | ND | 3.1(2/20) |
7 | E2715;MF59 | 2.0,2.0,2.0 | ND | 6.1(4/10) |
8 | E2715;CpG+MF59 | 2.0,2.0,2.0 | ND | 26.8(5/10) |
9 | E2715;4X MF59 | 2.0,2.0,2.0 | ND | 9.7(4/10) |
实施例4
黑猩猩中HCV E1E2疫苗组合物的免疫原性
上述产生和纯化的HCV E1E2809的免疫原性如下确定,HCV E1E2809与亚微米水包油乳剂和/或CpG寡核苷酸结合。
此研究中所用制剂概括于表2。MF59和E1E2809描述如上。所用CpG分子的序列是:5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:5)。
黑猩猩分成2组(每组5只动物)并肌肉内施用疫苗组合物和表1所列成分。具体是,一组动物用20μg E1E2809和MF59在0、1和6个月免疫。第二组动物也用20μg E1E2809和MF59以及500μgCpG在0、1和6个月免疫。
最后一次免疫后14天获得血清样品且通过酶免疫测定确定抗E2抗体滴度。具体是E1E2抗原覆盖在聚苯乙烯微量滴定板上且结合抗体用HRP-缀合抗人抗体来检测,接着用四甲基对二氨基联苯底物发展。
如表2可见,HCV E1E2免疫黑猩猩用CpG结合MF59作为佐剂,产生的E1E2抗体水平显著高于(P<0.05)单独使用MF59的E1E2免疫小鼠。
表2.使用CpG和MF59作为佐剂的HCV E1E2809的免疫原性。
疫苗佐剂 | 黑猩猩 | E1E2 ELA抗体滴度 | 几何平均E2 ELA抗体滴度 |
组1:E1E2809:CpG | 12345 | 841011314212580 | 261 |
组2:E1E2809:CpG+MF59 | 12345 | 8835271332015101238 | 2713 |
因此,描述了新HCV疫苗组合物和使用相同的方法。根据前述,尽管一定程度描述了试验本发明的优选实施方案,要理解可不离开本发明精神和范围作出不同变化,范围由所附权利要求书定义。
序列表
<110>希龙公司(CHIRON CORPORATION)
<120>HCV E1E2疫苗组合物
<130>2302-17206.40
<140>
<141>
<160>5
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:CpG寡核苷酸
<400>1
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:失活CpG分子
<400>2
tccaggactt ctctcaggtt 20
<210>3
<211>1914
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:HCV-1 E1/E2/p7区域
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1914)
<400>3
tct ttc tct atc ttc ctt ctg gcc ctg ctc tct tgc ttg act gtg ccc 48
Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro
1 5 10 15
gct tcg gcc tac caa gtg cgc aac tcc acg ggg ctc tac cac gtc acc 96
Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr
20 25 30
aat gat tgc cct aac tcg agt att gtg tac gag gcg gcc gat gcc atc 144
Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile
35 40 45
ctg cac act ccg ggg tgc gtc cct tgc gtt cgc gag ggc aac gcc tcg 192
Leu His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser
50 55 60
agg tgt tgg gtg gcg atg acc cct acg gtg gcc acc agg gat ggc aaa 240
Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys
65 70 75 80
ctc ccc gcg acg cag ctt cga cgt cac atc gat ctg ctt gtc ggg agc 288
Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser
85 90 95
gcc acc ctc tgt tcg gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tct gtc 336
Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val
100 105 110
ttt ctt gtc ggc caa ctg ttt acc ttc tct cce agg cgc cac tgg acg 384
Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr
115 120 125
acg caa ggt tgc aat tgc tct atc tat ccc ggc cat ata acg ggt cac 432
Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His
130 135 140
cgc atg gca tgg gat atg atg atg aac tgg tcc cct acg acg gcg ttg 480
Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu
145 150 155 160
gta atg gct cag ctg ctc cgg atc cca caa gcc atc ttg gac atg atc 528
Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile
165 170 175
gct ggt gct cac tgg gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg 576
Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met
180 185 190
gtg ggg aac tgg gcg aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc 624
Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly
195 200 205
gtc gac gcg gaa acc cac gtc acc ggg gga agt gcc ggc cac act gtg 672
Val Asp Ala Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val
210 215 220
tct gga ttt gtt agc ctc ctc gca cca ggc gcc aag cag aac gtc cag 720
Ser Gly Phe Val Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln
225 230 235 240
ctg atc aac acc aac ggc agt tgg cac ctc aat agc acg gcc ctg aac 768
Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn
245 250 255
tgc aat gat agc ctc aac acc ggc tgg ttg gca ggg ctt ttc tat cac 816
Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His
260 265 270
cac aag ttc aac tct tca ggc tgt cct gag agg cta gcc agc tgc cga 864
His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg
275 280 285
ccc ctt acc gat ttt gac cag ggc tgg ggc cct atc agt tat gcc aac 912
Pro Leu Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn
290 295 300
gga agc ggc ccc gac cag cgc ccc tac tgc tgg cac tac ccc cca aaa 960
Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys
305 310 315 320
cct tgc ggt att gtg ccc gcg aag agt gtg tgt ggt ccg gta tat tgc 1008
Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys
325 330 335
ttc act ccc agc ccc gtg gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg 1056
Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala
340 345 350
ccc acc tac agc tgg ggt gaa aat gat acg gac gtc ttc gtc ctt aac 1104
Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn
355 360 365
aat acc agg cca ccg ctg ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac 1152
Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn
370 375 380
tca act gga ttc acc aaa gtg tgc gga gcg cct cct tgt gtc atc gga 1200
Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly
385 390 395 400
ggg gcg ggc aac aac acc ctg cac tgc ccc act gat tgc ttc cgc aag 1248
Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys
405 410 415
cat ccg gac gcc aca tac tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg atc aca 1296
His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr
420 425 430
ccc agg tgc ctg gtc gac tac ccg tat agg ctt tgg cat tat cct tgt 1344
Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys
435 440 445
acc atc aac tac act ata ttt aaa atc agg atg tac gtg gga ggg gtc 1392
Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val
450 455 460
gag cac agg ctg gaa gct gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgt tgc 1440
Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys
465 470 475 480
gat ctg gaa gat agg gac agg tcc gag ctc agc ccg tta ctg ctg acc 1488
Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr
485 490 495
act aca cag tgg cag gtc ctc ccg tgt tcc ttc aca acc ctg cca gcc 1536
Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala
500 505 510
ttg tcc acc ggc ctc atc cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag 1584
Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln
515 520 525
tac ttg tac ggg gtg ggg tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg 1632
Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp
530 535 540
gag tac gtc gtc ctc ctg ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc 1680
Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys
545 550 555 560
tcc tgc ttg tgg atg atg cta ctc ata tcc caa gcg gaa gcg gct ttg 1728
Ser Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu
565 570 575
gag aac ctc gta ata ctt aat gca gca tcc ctg gcc ggg acg cac ggt 1776
Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly
580 585 590
ctt gta tcc ttc ctc gtg ttc ttc tgc ttt gca tgg tat ctg aag ggt 1824
Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly
595 600 605
aag tgg gtg ccc gga gcg gtc tac acc ttc tac ggg atg tgg cct ctc 1872
Lys Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Thr Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu
610 615 620
ctc ctg ctc ctg ttg gcg ttg ccc cag cgg gcg tac gcg taa 1914
Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala
625 630 635
<210>4
<211>637
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:HCV-1 E1/E2/p7区域的氨基酸
<400>4
Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro
1 5 10 15
Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr
20 25 30
Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile
35 40 45
Leu His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser
50 55 60
Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys
65 70 75 80
Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser
85 90 95
Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val
100 105 110
Phe Leu Val Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr
115 120 125
Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His
130 135 140
Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu
145 150 155 160
Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile
165 170 175
Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met
180 185 190
Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly
195 200 205
Val Asp Ala Glu Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly His Thr Val
210 215 220
Ser Gly Phe Val Ser Leu Leu Ala Pro Gly Ala Lys Gln Asn Val Gln
225 230 235 240
Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Leu Asn Ser Thr Ala Leu Asn
245 250 255
Cys Asn Asp Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr His
260 265 270
His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg
275 280 285
Pro Leu Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn
290 295 300
Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Lys
305 310 315 320
Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys
325 330 335
Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala
340 345 350
Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn
355 360 365
Asn Thr Arg Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn
370 375 380
Ser Thr Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly
385 390 395 400
Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys
405 410 415
His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr
420 425 430
Pro Arg Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys
435 440 445
Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val
450 455 460
Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys
465 470 475 480
Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr
485 490 495
Thr Thr Gln Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala
500 505 510
Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln
515 520 525
Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp
530 535 540
Glu Tyr Val Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys
545 550 555 560
Ser Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu
565 570 575
Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly
580 585 590
Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly
595 600 605
Lys Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Thr Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu
610 615 620
Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala
625 630 635
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:CpG寡核苷酸
<400>5
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
Claims (24)
1.一种组合物,所述组合物包含丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和缺乏N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂,其特征在于,所述亚微米水包油乳剂能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答。
2.一种组合物,所述组合物包含丙肝病毒(HCV)E1E2抗原和免疫刺激核酸序列(ISS),其特征在于,所述ISS能增强对HCV E1E2抗原的免疫应答。
3.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括:
(a)丙肝病毒(HCV)E1E2抗原,所述抗原包括与图2A-2C的192-809位所示氨基酸连续序列有至少80%同一性的氨基酸序列;
(b)能增强对HCV E1E2抗原免疫应答的亚微米水包油乳剂,其中所述亚微米水包油乳剂包括(i)可代谢的油,其中油的量为总体积的1%到12%,和(ii)乳化剂,其中乳化剂存在量为0.01%到1%重量(w/v),并包括聚氧乙烯山梨聚糖单、二或三酯和/或山梨聚糖单、二或三酯,其中油和乳化剂以水包油乳剂形式存在,几乎所有乳剂的油滴直径为约100nm到小于1微米;
(c)CpG寡核苷酸,其中所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
4.一种组合物,其特征在于,所述组合物包括:
(a)包含图2A-2C中192-809位所示的氨基酸序列的丙肝病毒(HCV)E1E2抗原;
(b)能增强对HCV E1E2抗原免疫应答的亚微米水包油乳剂,其中所述亚微米水包油乳剂包括4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯,和/或0.25-1.0%山梨聚糖三油酸酯,以及任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE),其中油和乳化剂以水包油乳剂形式存在,几乎所有乳剂的油滴直径为约100nm到小于1微米;
(c)CpG寡核苷酸,其中所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO:1)或序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:5)。
5.如权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述HCV E1E2抗原包括与图2A-2C的192-809位所示氨基酸连续序列有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求3或5所述的组合物,其特征在于,所述HCV E1E2抗原包含图2A-2C中192-809位所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物进一步包含免疫刺激核酸序列(ISS)。
8.如权利要求2或7所述的组合物,其特征在于,所述ISS是CpG寡核苷酸。
9.如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述CpG寡核苷酸包括序列5’-X1X2CG X3 X4,其中X1和X2是选自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的序列,X3和X4选自TpT、CpT、ApT、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA、GpT、CpA和TpG,其中p表示磷酸键。
10.如权利要求8所述的组合物,其特征在于,所述CpG寡核苷酸包括序列GACGTT、GACGTC、GTCGTT或GTCGCT。
11.如权利要求1或10所述的组合物,其特征在于,所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO:1)。
12.如权利要求3或10所述的组合物,其特征在于,所述CpG寡核苷酸包括序列5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO:5)。
13.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述亚微米水包油乳剂包括:
(1)可代谢的油,其中油的量为总体积的0.5%到20%;
(2)乳化剂,其中乳化剂存在量为0.01%到2.5%重量(w/v),其中油和乳化剂以水包油乳剂形式存在,几乎所有乳剂的油滴直径为约100nm到小于1微米。
14.如权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述油的量为总体积的1%到12%且乳化剂存在量为0.01%到1%重量(w/v)。
15.如权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述乳化剂包括聚氧乙烯山梨聚糖单、二或三酯和/或山梨聚糖单、二或三酯。
16.如权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述亚微米水包油乳剂包括4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和/或0.25-1.0%山梨聚糖三油酸酯。
17.如权利要求3、4或13所述的组合物,其特征在于,所述亚微米水包油乳剂实质上由5%体积的鲨烯;和一种或多种乳化剂组成,所述乳化剂选自聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和山梨聚糖三油酸酯,其中所述乳化剂存在总量为1%重量(w/v)。
18.如权利要求17所述的组合物,其特征在于,所述一种或多种乳化剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和山梨聚糖三油酸酯,且聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯和山梨聚糖三油酸酯存在总量为1%重量(w/v)。
19.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述亚微米水包油乳剂包括4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯,和/或0.25-1.0%山梨聚糖三油酸酯,以及任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
20.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述HCV E1E2抗原包含图2A-2C中192-809位所示的氨基酸连续序列。
21.前述权利要求中任一项所述的组合物在制备用于在脊椎动物对象中刺激免疫应答的药物中的应用。
22.一种制造组合物的方法,其特征在于,所述方法包括将亚微米水包油乳剂与丙肝病毒(HCV)E1E2抗原结合,所述亚微米水包油乳剂缺乏N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述方法进一步包括将免疫刺激核酸序列(ISS)与E1E2抗原和亚微米水包油乳剂结合。
24.一种制造组合物的方法,其特征在于,所述方法包括将免疫刺激核酸序列(ISS)与丙肝病毒(HCV)E1E2抗原结合。
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