CN1059758A - 非a非b型肝炎病毒颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离的至少含有选自非A非
B型肝炎病毒之核心抗原、基质抗原和包膜抗原中之
一个抗原的非A非B型肝炎病毒颗粒及以基因工程
技术有效地生产该病毒颗粒的方法。非A非B肝炎
病毒颗粒不仅可有效地用于生产显示极高免疫原性
的NANBV肝炎疫苗和具有极高抗体检测率和检测
精确度的诊断试剂,而且也用于肝脏疾病如肝癌的研
究。
Description
本发明涉及非A非B型肝炎病毒颗粒和它们的制备方法。具体地说,本发明涉及通过表达选自非A、非B型肝炎病毒基因组的整个区域、其ORF的整个区域以及从ORF上切掉NS4和/或NS5所得到的ORF区域之一的核苷酸序列而获得的非A非B型肝炎病毒颗粒,并且还涉及有效地产生它们的方法。本发明的非A、非B肝炎病毒颗粒可用于提供各自以非A、非B型肝炎病毒颗粒作为活性成分的一种非A、非B型肝炎疫苗,一种非A、非B型肝炎诊断试剂以及一种用于筛选输血血液以防止输血后肝炎的试剂。并用于提供用非A、非B型肝病毒颗粒所制备的多克隆或单克隆抗体。因此,本发明的非A、非B型肝炎病毒颗粒用于提供一种疫苗、一种免疫球蛋白、一种免疫诊断试剂,一种用于亲合性柱层析以从输血液中除去非A、非B型肝炎病毒的试剂。非A、非B型肝炎病毒的定义:
病毒性肝炎是一种由肝炎病毒感染引起的肝脏疾病。在此之前,A型肝炎病毒、B型肝炎病毒和D(δ)型肝炎病毒已经分离和鉴定。D型肝炎病毒(δ-肝炎病毒)是一种有缺陷的病毒,它不能够自身增殖,它的增殖需要B型肝炎病毒作为辅助病毒共存。因此,D型肝炎病毒病只存在于B型肝炎患者身上。在1974年,报导了许多肝炎患者是由A型肝炎病毒或B型肝炎病毒之外的一种因子引起的。这种肝炎称为“非A、非B型肝炎”,并且对非A、非B型肝炎病毒已经在世界各地进行了很广泛的研究。此后,已发现存在许多类型的非A、非B型肝炎病毒。到目前为止的研究结果表明,按照感染途径,非A、非B型肝炎病毒被分为两种类型:流行性肝炎病毒,即一种肠道传染的非A、非B型肝炎病毒,它是通过水和食物传播的;和一种通过输血等经血液传染的非A非B型肝炎病毒。其中只对传播于非洲、印度以及南亚地区的肠道传染性非A、非B型肝炎病毒作了病毒学鉴定,但对血液传播的非A、非B型肝炎病毒仍然未鉴定。
下文中将血液传染的非A、非B型肝炎简写为“NANB肝炎”,血液传染的非A、非B型肝炎病毒简写为“NANBV”。
有关NANB肝炎研究的情况和问题:
以诊断学、组织病理学、免疫学、分子生物学等方面的知识[“Japan Medical Journal”,No.3320,pp3-10,1987;“Igaku-no Ayumi(Progress of medicine)”,151(13),pp.735-923,1989;“Kan Tan Sui(Liver,Gallbladder,Pancreas)”,21(1),pp.5-113,1990;“Jikken Igaku(Experimental Medicine)”,8(3),pp.201-233,1990]为基础,通过NANBV与其他肝炎病毒的比较,已经在世界各地展开了关于NANB肝炎的流行病学、临床检查、诊断、治疗和预防及病毒学的研究。
关于NANB肝炎,已经报导了下列的发现:
(1)流行病学:在日本,按照原生省的估计,大约60%的慢性肝炎患者(即约72万患者),约40%的肝硬化患者(即约10万患者)和大约40%的肝癌患者(即约7千患者)是NANB肝炎。在美国每年输血后肝炎患者的数量达到15万至30万人,并且90%的输后肝炎患者是NANB肝炎患者。进一步地说,据推测,有1至6%的供血者是NANBV携带者。据进一步估计在其他国家也是如此,它们的NANB肝炎发病率和NANBV携带者与美国和日本相同或高于美国和日本。因此,NANB肝炎的预防、早期诊断和早期治疗成为具有全球性重要性的问题。
(2)病毒学:此前,有人报导NANBV是由一个被膜和推测直径为50nm的球形病毒颗粒组成的,分类学研究表明已知的NANBV是一种与披盖病毒或黄色病毒相似的病毒,或是一种与披盖病毒或黄色病毒不同的新病毒。对注射NANBV肝炎患者血清之黑猩猩的许多肝细胞细胞质的病理学观察结果表明,在某些黑猩猩的肝细胞细胞质中有管状结构产生,但在其他黑猩猩肝细胞的细胞质中则没有,并且在某些黑猩猩的肝细胞细胞质中形成细胞核内颗粒。这些结果和流行病学研究研果,在氯仿敏感性存在或不存在下试验以及免疫学诊断都表明存在多种类型的NANBV(如参见“Science”,205,197-200,1979,“Journal of Infectious Disease”,148,254-265,1983,and“Biseibutsu”(Microorganism),5(5)463-475,1989)。存在于NANB肝炎患者血液中之NANBV的数量与其存在于A型肝炎患者粪便中之A型肝炎病毒的数量或存在于B型肝炎患者血液中之B型肝炎病毒的数量相比是极小的。例如,根据黑猩猩感染剂量(CID),肝炎患者血液中B型肝炎病毒的数量为每毫升108到109个,而根据CID,患者血液中的NANBV数量仅是每毫升104-105个(Bradley,D.W.:Research perspectives in post-transfusion non-A,non-B hepatitis,in“Infection,Immunity and Blood Transfusion”,edited by Dodd,R.Y.& Barker,L.F.,published by Alan R.Liss,Inc.,New York(1985)pp.81-97)。进一步说,已知除去人类外,除了黑猩猩没有任何动物对NANBV敏感,并且会通过NANBV感染,在肝细胞的细胞质中偶然地形成一种典型的管状结构。因为只有黑猩猩能被作为用于NANBV感染的实验动物,因此需要大量的黑猩猩用于NANBV研究。但是,黑猩猩不易获得并且很贵,因此,NANBV的研究,如:由NANBV的感染实验,NANBV的鉴定和寻找用于NANBV的标记物,都需要受到限制和推延。为了解决这些问题,已对NANBV的研究作了各种尝试。如:在一个尝试中,从患NANB肝炎的黑猩猩的血浆中克隆NANBV基因组cDNA[所谓″C型肝炎病毒,“hepatitis C Virus(HCV)”](Science,244,359-362,1989),并进一步证实通过表达cDNA所获得的抗原(称为“C-100”)可与NANB肝炎患者血液中的抗体产生抗原-抗体反应(Science,244,362-364,1989),另外,在另一个不使用黑猩猩的尝试中,从NANB肝炎患者的血浆中克隆NANBV基因组cDNA,并已确认通过表达的cDNA所得到的抗原可与NANB肝炎患者血清中的抗体发生抗原-抗体反应(Gastroenter-ologia Japanica,24,540-544和545-548,1989)。再者,关于克隆NANBV基因组cDNA和其核苷酸序列及相应的氨基酸顺序的确定,由于下列机构提供的克隆是已知的:Mitsubishi Kasei Corp,Japan(欧洲专利申请公开号293274),Chiron Corporation,U.S.A(欧洲专利申请公开号318216,388232和398748),Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University,Japan(欧洲专利申请公开号363025和Journal of Virology,65,1105-1113,1991),Sanwa Kagaku Kenkyusko Co.,Ltd.,Japan(日本专利申请公开说明书No.1-186990),National Cancer Center Research Institute,Japan[Proceedings of the National Academy of Sciences(U.S.A),87,9524-9528,1990],Jichi Medical School(Japanese Journal of Experimental Medicine,60,167-177,1990),National Institute of Health,Japan[Nucleic Acid Research,17(24),10367-10372,1989;同一文献,18(15),4626,1990;Gene,91,287-291,1990;和Journal of General Virology,71,3027-3033,1990)等。此外,关于NANBV基因的结构已有报道:NANBV基因组的全长约10kb;该基因是由5′未端的非编码区,一个开放读码(ORF)区和3′未端的非编码区组成;在ORF区,基因编码病毒的核心抗原(蛋白质)(C抗原)、基质抗原(蛋白质)(M抗原),被膜抗原(蛋白质)(E抗原)、和6种非结构蛋白(NS蛋白质),这一顺序按从5′未端到3′未端方向排列;且NS蛋白质基因按5′到3′排列,包括NS1,NS2,NS3,NS4a、NS4b和NS5。关于这些抗原(蛋白质)的功能,据信C抗原负责基因的保护,E抗原负责感染,M抗原负责E抗原结构的保持,NS1作为补体固定抗原,NS3作为蛋白酶,NS5作为聚合酶且非编码区负责基因组结构的保持和基因组的复制。NS2和NS4的功能尚不明僚。
(3)临床观察:按照肝突的发生人数和频率,一般将肝炎分为流行性肝炎和散发性肝炎,或者按照肝炎病人的严重程度和阶段分为急性肝炎,暴发性肝炎,亚急性肝炎,迁延续肝炎和慢性肝炎。NANB肝炎的潜伏期是2至26周。NANB肝炎的症状在早期与B型肝炎相比较轻微。例如:NANB肝炎患者仅有发烧及疲倦的主诉。另外,70%的患者没有黄疸征象。因此,NANB肝炎常常被忽略。但NANB肝炎是很危险的,因NANB肝炎很可能变成慢性的,然后发展成肝硬变。数字表明,40%至50%血清转氨酶活性升高的NANB患者发展成慢性肝炎。10%至20%的慢性肝炎病例成为肝硬化。另外,每年有0.5%至1%的接受输血者成为没有自觉征兆的肝硬变患者。但严重地是,肝硬变能进一步发展成为肝癌或肝细胞瘤。因此,为了防止由输血和出血引起的生物危险性,根除NANB肝炎是一件着眼于公共健康事业的全球性重要的问题。
(4)诊断:如上面提到的,NANBV(血液传播型)尚未被鉴定,而且病毒标记,如用于NANB肝炎诊断的NANBV抗原仍未被发现。因此,NANB型肝炎的诊断已通过检测患者血清中的抗体滴度来进行,这种检测对各种已知病原性病毒都是特异的,如甲型肝炎病毒,乙型肝炎病毒、巨细胞病毒,EB病毒、水痘病毒及单纯性疱疹病毒,以及将其血清中对于上述病毒的抗体特异性反应均为阴性的病人诊断为NANB肝炎病人,或通过作肝脏活组织病理组织学检查诊断NANB肝炎〔“Disease of the Liver and biliary System”,8th edition,S.Shenlock,pp.326-333,1989,Blackwell Scientific Publications)。同时,也已使用另一诊断方法。例如,采用这样一种方法,即测定酶在血清如GPT〔谷丙转氨酶,亦称“ALT”(alanine aminotransa-minase)〕.GOT〔谷草乙转氨酶,亦称“AST”(aspartate aminotransferase)〕和鸟嘌呤脱氨基酶(亦称“Guanase”)的活性(“Kan Tan Sui(Liver,Gallbladder,Pancreas)”,Vol.14,pp.519-522,1987)。就上述血清中的GPT或GOT而言,日本是采用NANB肝炎诊断的标准,其中持效和变态高活性GPT和GOT用作诊断NANB肝炎的判据(“Journal of Blood Transfusion Society in Japan”,31(4),316-320,1985;和“Nippon Rinsho”,46,2635-2638,1988)。至于免疫诊断,在上述难以分离和鉴别NANBV的目前形势下,是采用由NANBV cDNA克隆表达得到的抗原(用遗传工程技术和免疫学知识分离出)跟NANB肝炎患者的血清之间的抗原-抗体反应作为判据。已知抗原的例子有由NANB肝炎患者的血浆制取的NANBV cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开号363025),由具有NANB肝炎症状的黑猩猩的血浆制取的“HCV”cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开号318216和日本专利申请公开未决说明书2-500880),由感染了NANBV的黑猩猩的肝脏得到的NANBV cDNA的表达产物(欧洲专利申请公开号293274,日本专利告说明书64-2576和日本专利申请公开未决说明书1-124387)。对于测定抗原抗体反应的方法,一般采用RIA法(放射免疫测定法)和EIA法(酶免疫测定法)。但是,这些表达产物的抗原性不同。以HCV cDNA的表达产物作为抗原(即,提到的C-100抗原)可以是诊断由HCV感染造成的慢性肝炎的判据或检验标准。尽管如此,由于抗原(C-100)显示其抗原性的区域有限,抗体的检测比不利地低达约70%〔“Biseibutsu(Microorganism)”,5,463-475,1989;”Kan tan sui(Liver,Gallbladder,Pancreas)”,20 47-51,1990;和“Igaku-no Ayumi(Progress of Medicine)”,151,871,1989〕,从NANB肝炎和NANBV感染的精确诊断以及对慢性肝炎患者病情发展的精确确定和急性肝炎病人的治疗角度来看,这种抗原是不能令人满意的。因此,期望得到一种可靠的诊断和预测NANB肝炎进展的方法。
(5)治疗和预防:最近,已经报导了使用α-和β-干扰素治疗慢性NANB肝炎[“Kan Tan Sui(Liver,Gallbladder,Panceras)”Vol.20,pp.59-64,1990;“Igaku-no Ayumi(progress of Med icine)”Vol.151,pp.871-876,1989]。但是仍未确定α-和β-干扰素的适宜治疗剂量和适宜治疗期限。
另一方面,为了NANB肝炎的预防,已使用了各种疫苗,其中包括以NANBV cDNA(欧洲专利申请公开号363025)或HCV cDNA(欧洲专利申请公开号318216)之常规表达产物作为抗原的疫苗。但正如从事实所见的,在本发明完成之前,NANBV本身仍未被分离和鉴定,不可能详细说明用于NANBV疫苗、来自上述各有一种抗原决定基(抗原决定部位)之表达产物的抗原,并确定这种抗原的有效性和安全性以便将其用于临床。因此,尚没有能在实际中使用的NANBV疫苗。
(6)NANBV颗粒的生产和其重要性:虽然如(2)中所描述的各种NANBV cDNA克隆都是已知的,但仍未见报导使用已知的克隆成功地生产NANBV颗粒。这意味着建立一个约10kb的覆盖NANBV基因组全部区域的cDNA是极困难的,而cDNA对于生产NANBV颗粒又是必需的。即是说,使用选择用于提取NANBV基因组RNA之材料的现有技术和有关提取和纯化RNA的现有技术,只能分离最多几百个核苷酸的短RNA片段和其cDNA克隆。当打算使用这种短的cDNA片段构建一个含NANBV基因组整个区域的cDNA时,需要在组合中选择多于几十个不同类型的cDNA片段,以使cDNA片段的ORF形成NANBV基因组的整个区域,并按顺序没有差错地准确将它们连接起来。无疑如此严格要求地按顺序成功地连接cDNA片段是极麻烦和困难的,应该提到的是,在连接cDNA片段的操作中,发生致命错误的几率将随连接数目的增加而增加。因此,为了精确地构建NANBV基因组整个区域的cDNA,需要使用尽可能长的cDNA片段来减少连接步骤的数目。还应注意的是,就大约2kb至5kb长NANBV基因组RNA片段的提取制备和克隆其cDNA来说,需要有高水平学术知识和经验以及非凡的操作技术。另一方面,如在(4)中描述的,因为用于NANB肝炎的商业上可获得之诊断剂的抗原是一种NANBV基因组cDNA片段的部分表达产物,因此,其抗原谱很窄,抗原主要与慢性肝炎患者的血清反应,并且显出的抗原检测率低达不能令人满意的70%左右。因此,特别需要有一种不仅与慢性NANB肝炎患者的血清,而且与急性NANB肝炎患者的血清在抗原-抗体反应上能显示出极好特异性,并且其抗体检测率高的诊断试剂。为了满足这一需要,很早就期望发展一种诊断试剂,作为抗原,例如,一种有广泛抗原谱并能对抗体显示出高检测率的NANBV颗粒。进一步说,NANBV颗粒的生产被认为有助于解决(5)中所述的问题,以便得到一种在实践中特别适用的NANB肝炎疫苗。从上述可见,构建NANBV基因组整个区域的cDNA并通过表达该cDNA以实现NANBV的大量生产,已成了一个全球性亟待解决的问题。
本发明人作了大量的研究工作,通过发展典型的分离的NANBV颗粒而解决上述现有技术中存在的问题。结果,本发明人已经成功地构建了一个从NANBV基因组cDNA的c抗原基因到NS3的ORF(开放读码)区域,一个比上述ORF区域更长的NANBV基因cDNA的整个ORF区域,以及由上述整个ORF区域组成的完整的NANBV区域,而且通过熟练地连接10个以上各至少包含1000个核苷酸的不同NANBV cDNA克隆,使5′端和3′端的非编码区连接到其5′端和3′端上,从而构建了在3′和5′端有或没有非编码区的所需之ORF。此外,本发明人通过将上述NANBV基因组的各个区域单独地引入或插入到一表达载体中,并表达这个区域而得以成功地大量生产NANBV颗粒。在本发明中,术语“非A、非B型肝类病毒颗粒”是指NANBV基因组之上述区域的表达产物并含有至少一个选自非A、非B肝类病毒之核心抗原,基质抗原和包膜抗原中的抗原。非A、非B型肝类病毒颗粒的实例包括有下列结构者:一个完整的NANBV颗粒,其为主要由c(核心)抗原、M(基质)抗原和E(包膜)抗原组成的NANBV抗原集合体,并且该病毒颗料中有核酸;一个不完整的包括c抗原、M抗原和E抗原之NANBV抗原集合体,但其中没有核酸的NANBV颗粒;一个主要由c抗原组成的NANBV抗原集合体并在核心中有核酸的NANBV核心;一个不完整的NANBV核心,其为主要由c抗原组成的NANBV抗原集合体,但核心中没有核酸;以及一个主要由E抗原组成的NANBV表面抗原集合体。这种成功归功于本发明人独特的技术,以便获得一个可靠的NANBV基因组,直接从NANBV颗粒中提取NANBV RNA,所说的NANBV颗粒包含在NANB肝炎患者的全血中或包含在NANB肝类合并肝癌的患者的切除的肝中,而没有在有被认为增加NANBV分离难度之未知因子的黑猩猩中增殖,虽然在血液或切除肝中NANBV的数量极少,即少于A型肝类病毒和B型肝类病毒的1/10,000,但在操作过程中谨慎小心,便可使NANBV和其基因组在NANBV基因组的新鲜材料储存期间不被体液作用或血液酶切割和/或分解,从而得到一个有2kb或5kb长的完整的NANBV基因组RNA或RNA片段。从人的新鲜材料中制备的RNA,然后即可借助反转录酶转录成cDNA,以获得一个cDNA文库。为了从cDNA文库中筛选的1000到5000个核苷酸的NANBV基因组cDNA,cDNAs被分别地插入到入gtll噬菌体载体中,并在高浓度的噬菌体噬斑上表达,然后使用恢复期急性NANB肝炎患者和慢性NANB肝炎患者的血清反复进行酶免疫分析(E1A)来筛选NANBV基因组ODNA。因此,以高纯度低成品大批量生产没有生物危害的NANBV颗料或NANBV抗原集合体,已第一次通过DNA重组技术表达NANBV基因组cDNA的全部区域或NANBV基因组cDNA的全部ORF区域而得以实现。NANBV基因组cDNA的全部区域或全部ORF区域是通过筛选覆盖NANBV基因组cDNA之全部区域或全部ORF区域的cDNA克隆,从cDNA克隆中切掉任何重叠部分并按顺序连接CDNA克隆而构建的。另外,已发现本发明的表达产物与短的NANBV基因组cDNA片段的常规表达产物相比有极广的抗原谱,并且与慢性NANB肝炎患者和急性NANB肝炎患者的血清显示特异性抗原-抗体反应,从而使检测率达到95%或更高,并解决了(6)中所提到的问题。即通过提供了增强抗体检测率的诊断剂和对抗体制备的改进,发现本发明的表达产物大大有利于NANB肝炎的预防,诊断和治疗。基于以上所述,本发明已经完成。
因此,本发明的一个目的是提供一种用为NANB肝炎诊断试剂和疫苗之活性成分的分离的NANB肝炎病毒颗粒。
本发明的另一个目的是提供一种生产分离的NANBV颗料的方法。
本发明的再一个目的是提供一种NANB肝炎的诊断试剂。
本发明的进一步的目的是提供一种NANB肝炎疫苗。
本发明前述的和其他的目的、特点及优点可从下列详细描述和权利要求及相关附图看出。
附图:
图1(1)和图1(2)显示用于本发明NANBV基因之cDNA克隆间的关系,表明与NANBV基因组的整个区域相关。
图2(1)到图2(16)显示用于本发明之NANBV基因组cDNA整个区域的核苷酸顺序及由该核苷酸顺序编码的氨基酸顺序。
图3显示本发明的NANBV和日本脑类病毒(JEV)的疏水性曲线,其中是NANBV的疏水指数与JEV的相比,且其中横坐标表示氨基酸数目,纵坐标表示疏水指数,空白三角表示糖基化位点,星号表示与RNA多聚酶所共有之氨基酸顺序的位点(Gly-Asp-Asp),并且C、M、E、和NS各代表核心抗原、基质抗原、包膜抗原和非结构蛋白。
图4是显示在动物细胞中表达NANBV基因组cDNA之质粒pMAN-neo10的构建步骤图。
图5是在酵母菌中表达NANBV基因组cDNA之质粒pYHC5的构建步骤图。
图6是用于制备重组牛痘病毒之pXX-49,pXX-51和pXE-39的构建步骤图。
图7是显示蔗糖密度梯度离心重组牛痘病毒VXX39的培养物上清液所得各部分的蔗糖浓度和抗原活性的关系图。
图8是用重组牛痘病毒VXX39感染之培养细胞产生的NANBV颗粒的电子显微镜照片。
本发明主要是提供分离的含有至少一个选自非A、非B肝炎病毒的核心抗原、基质抗原和包膜抗原中之抗原的非A、非B肝炎病毒颗粒。
在本发明NANBV颗粒的优选实施方案中,核心抗原、基质抗原和包膜抗原分别由表示在图2(1)到图2(16)中的非A非B肝炎病毒的从第1到第9426位全部核苷酸的顺序中的从第333到667位、第678到905位和第906到第1499位苷酸顺序编码。
本发明的另一方面,提供了具有与图2(1)到图2(16)所示核苷酸顺序的至少一部分相应之核糖核酸的非A非B肝炎病毒颗粒。
在本发明中,除非另外说明,脱氧核糖核酸的左末端和右末端分别为5′末端和3′末端。另外,除非另有说明,本发明氨基酸顺序的左末端和右末端分别代表N末端和C末端。
可按下列(Ⅰ)至(Ⅸ)步骤制备和鉴定本发明的分离的NANBV颗粒。
步骤(Ⅰ):用于提取NANBV基因组RNA之实验材料的选择和收集
可以用作提取NANBV RNA的实验材料包括血液、淋巴液、腹水和作为NANBV载体的肝细胞,或者是患有NANB肝炎的人或大猩猩的肝细胞,以及患有NANB型肝炎和肝癌或合并有肝肿瘤病人的肝细胞。与来源于人类的材料相比:来源于大猩猩的材料含有相对小量的NANBV,并且,在大猩猩中还未弄清楚一些被认为会给NANBV的分离带来困难的因素,因此,最好是来源于人类的材料。在来源于人类的血液、淋巴液、腹水和肝细胞这些材料之中,血液最易于大量获得。例如,可以大量地从血库获得不能接受为输血之用的血液。这种血液益于用作提取NANBV RNA的材料。当以血液作为实验材料时,血液将被分成血浆和红细胞两部分,检验如此获得的血浆以决定该血浆是否为B型肝炎病毒表面抗原阳性(WHO expert committee on viral hepatitis:Advancee in viral hepatitis,WHO Technical Report Series,602 28-33,1977)和B型肝炎病毒基因组RNA阴性(Brechot,C.,Hadchouel,M.,Scotto,J.,Degos,F.,Charnay,P.Trepo,C.Tiollais,P.:Detection of hepatitis B virus DNA in liver and serum:a direct appraisal of the chronic carrier state.Lancet Z:765-768,1981)。此外,还要对血浆的酶活性方面进行检验,如GPT(Wroblewski,F.& Ladue,J.S.:Serum glutamic-pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease,Pooc.Soc.Exp.Biol.Med.,91,569,1956),GOT、乌嘌呤酶等等,这些酶通常作为NANB型肝炎的诊断标准。上文提及的将血液分离成血浆和红细胞的过程以及对所得血浆的检验过程是针对血液的多种不同方面进行的。可收集B型肝炎表面抗原和基因组cDNA两者均为阴性并且上文提及的各利酶显示出了极高活性,如GPT活性为35IU/ml或更高的血浆。
与前文提及的B型肝炎病毒颗粒数目相比,血液中存在极少数量的NANB肝炎病毒颗粒。从感染实验结果看,估计血液中NANB型肝炎病毒数目约为B型肝炎病毒颗粒的1/10,000(Bradley,D.W.,(1985):Research perspectives in post-transfusion non-A,non-B hepatitis,in“Infection,Immunity and Blood Transfusion”,edited by Dodd,R.Y.& Barker,L.F.,published by Alan R.Liss,Inc.,New York,pp.81-97)。因此,对于提取RNA而言,优选大量的血液为材料,例如,用多达3-10升的血液。用于从NANBV颗粒中提取NANB RNA的新鲜全血材料储存于1-5℃以防止在酶的作用下NANB及其基因变性和NANB基因裂解或分解。从收集新鲜全血到利用步骤(Ⅱ)完成NANBV RNA的制备要求在48-72小时以内进行。当以肝细胞作为实验材料时,可以选用1-3g从慢性NANB型肝炎并发肝癌的患者肝脏切除的非癌性或癌性肝组织。所用的肝细胞材料冻存于-70℃下。
步骤(Ⅱ):NANBV RNA的制备
从步骤(Ⅰ)获取的材料中经常规方法提取和纯化RNA。例如,当用新鲜全血作材料时,取约3-10升新鲜全血经低速离心收集上清,得血浆部分。可采用在下文提取和纯化RNA过程中用到的纯化技术从血浆中得到病毒部分。
另一方面,当以肝细胞作为提取NANBV RNA的材料时,将5-30倍体积的含核糖核酸酶抑制剂的稀释液加到肝组织中。然后,按常规技术,用一个匀浆器或类似物将肝组织压碎或破裂,获得肝细胞匀浆。所用的稀释液可以是10-50mM的常规缓冲液。然后,组织匀浆经低速离心后收集上清液。所收集的上清液即为提取和纯化NANBV RNA的原液。用常规方法提取和纯化NANBV RNA,如应用核糖核酸酶抑制剂混合物的提取方法,其中的酶抑制剂混合物包括如肝素、焦碳酸二乙酯、硫氰酸胍以及一种表面活性剂、一种螯合剂,或者一种能增强蛋白变性作用的还原剂;密度梯度离心的分离方法,如可选用蔗糖、氯化铯、三氯乙酸铯、Ficoll(Pharmacia Fince Chemicals AB,Sweden)等作为梯度溶液;利用mRNA特有的3′末端poly A链经亲和柱层析技术进行的分离方法;利用对根据多聚体上合成的蛋白质有特异性的抗体经免疫沉淀技术获得mRNA结合之多聚体的分离方法;基于两相分离原则进行的苯酚提取法;利用聚乙烯乙二醇、硫酸葡萄糖、醇或类似物进行的沉淀法。上述方法可以单独使用或联合使用。上述NANBV RNA的提取和纯化过程最好在pH值为3-10的范围进行,以防RNA发生不可逆的变性。至此,得到NANBV RNAs。
步骤(Ⅲ):从NANBV RNA制备双链cDNA
将从步骤(Ⅱ)获得的每一种NANBV RNA作为模板,经标准方法制备cDNA。这就是说,用寡脱氧胸苷和随机六核苷酸引物作为合成体系的引物,并使用逆转录酶,以NANBV RNA作模板合成一段与NANBV RNA互补的cDNA,即所得含有彼此互补结合之cDNA和NANBV RNA的双链,然后,使如此所得的双链与核糖核酸酶H反应,从而使NANBV RNA分解而得到cDNA。如此即得到了单链cDNA。用得到的单链RNA作模板,借助于DNA聚合酶的作用可以合成双链cDNA。应用市售的cDNA合成试剂盒,可以容易地进行双链cDNA的合成。这类试剂盒如cDNASynthesis System Plue (Amersham,England;BRL Inc.,U.S.A生产并销售)、cDNA System试剂盒 (Pharmacia LKB,Sweden生产并销售)、cDNA Synthesis试剂盒 (Boehringer Mannheim GmbH,Germany生产并销售)等。当合成的cDNA的量很少时,可用PCR(聚合酶链反应)方法(“PCR Technology”,edited by A.A.Erlich,published by Stockton Press,1989)等常规方法扩增cDNA,所用的PCR试剂盒如AmpliTaq(Perkio Elmer Cetus,U.S.A生产并销售)。至此,得到了双链cDNA。
步骤(Ⅳ):cDNA文库的制备
用步骤(Ⅲ)制得的cDNA经常规方法制备cDNA文库。这就是说,将步骤(Ⅲ)制得的cDNA单个地连接到可复制的克隆载体上而获得cDNA文库。作为可复制的克隆载体,可以是任何已知的或市售的载体,如噬菌体,粘性质粒、质料和动物病毒。当用噬菌体或粘性质粒作为可复制性载体时,为了使每一cDNA片段单个插入到载体中后载体还能获得高度稳定性和高转化能力,按常规方法体外包装每个插入了cDNA的载体。因此,可以重组噬菌体颗粒的形式得到插入了cDNA克隆的cDNA文库。另一方面,当以质粒作为可复制性载体时,上述cDNA片段被单个插入到质粒载体中,然后按常规方法将所得到的插入cDNA的载体单个地导入敏感的宿主细胞中,如大肠杆菌,枯草杆菌、酵母等。如此获得的转化体作为用于cDNA克隆的cDNA文库。此外,当以动物病毒基因作为可复制性载体时,将上述的cDNA片段单个地插入病毒载体中,然后用所得的重组病毒按标准方法感染敏感的动物细胞,并使之在细胞中增殖。在这种情况下,便可使用所得到的重组病毒作为cDNA文库。
可用市售的试剂盒很容易地进行cDNA文库的制备,这类试剂盒如cDNA克隆系统λgt10和λgt11(Amersham,England;BRL Inc.,U.S.A生产并销售),及体外包装系统(Amersham,England;BRL Inc.,U.S.A;Stratagene Inc.,U.S.A生产并销售)等。
步骤(Ⅴ):从cDNA文库中克隆含有NANBV基因的cDNA克隆
在这一步骤中,将获得含有NANBV基因的cDNA克隆。当cDNA文库含有转化体时,在一准准琼脂培养基中培养转化体以形成克隆。另一方面,当cDNA文库由重组噬菌体颗粒或重组病毒组成时,用这些噬菌体颗粒或重组病毒来感染已知的敏感宿主细胞,如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、动物细胞培养物等,并进行培养以形成噬菌斑,或增殖被感染的细胞。对如上获得的转化体克隆、噬菌斑或被感染细胞要至少以一种标准方法进行免疫学试验,其中将分别使用急性NANB型肝炎病人的恢复期血清、慢性NANB型肝炎病人的血清、感染了NANBV之大猩猩的血清(不论NANBV是否为在大猩猩肝细胞浆中引起管状结构形成的类型),从而可筛选并分离产生了与上述血清之一发生特异性反应之NANBV抗原的菌落、噬菌斑或被感染细胞。对菌落、噬菌斑和被感染细胞进行严格的筛选最好是重复上述过程。根据T.Maniatis等人描述的标准方法(T.Maniatis et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Published by Cold Spring Harbor Laboratory,U.S.A,pp.309-433,1982)从上述筛选和分离出的各菌落、噬菌斑或被感染细胞中分离含NANBV基因的cDNA克隆。可用下述技术进行免疫学试验,如酶标抗体技术,其中用诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶这样的酶标记抗体;荧光抗体技术,其中用异硫氰酸盐荧光素、铕标记抗体。以上述技术进行的免疫学试验最好按间接方法完成,因为在间接方法中,即使只用极小量的病人血清也能进行高敏感度的免疫学试验。用于间接方法中的第一抗体,最好使用来自NANB型肝类病人的血清或来自NANB型肝炎大猩猩的血清,因为这些血清含有相对大量的、对NANBV抗原特异的抗体。作为用于间接方法中的第二抗体,可使用市售的、用酶、荧光素物质等标记的抗人Ig(免疫球蛋白)抗体。
用于免疫学试验的样品可按常规方法制备,例如印迹方法,使菌落、噬菌斑和感染细胞中的核酸和蛋白质吸附到滤膜上;为便于显微镜观察可使用微量培养板或载玻片的方法等。当印迹方法与一种间接酶标抗体技术联合使用时,从极大量的原始菌落、原始噬菌斑或原始感染细胞中筛选想要的菌落、噬菌斑或感染细胞的工作就可容易而快速地进行。在这种情况下,印迹法是将市售硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等滤膜与菌落、噬菌斑或感染之细胞接触而进行的。
上面得到的cDNA克隆是NANBV基因的一部分。因此,为了得到包括NANBV基因全部区域的cDNA克隆,还需要通过一种用cDNA克隆的3′末端和5′末端作探针将与cDNA克隆相邻之cDNA片段分离出来的方法来延伸cDNA克隆。在这种情况下,可以使用被称为“基因行走”(也称为“基因组行走”或“染色体行走”)的技术(“DNA Cloning Volume Ⅲ”,edited by D.M.Glover,PP.37-39,IRL Press,1987;“Molecular Cloning-a laboratory Manual”2nd edit.,T.Maniatis et al.,3.12-3.23,1989)。借助于反复进行的克隆程序和基因行走技术,便可以cDNA克隆形式得到NANBV基因的全部区域。
此外,还要确定所获得的各cDNA克隆的核苷酸顺序。可以按常规方法测定cDNA克隆的核苷酸顺序,如Maxam-Gilbert法、二脱氧链终止法(Analytical Biochemistry,152,232-283,1986)等。
可在测定的核苷酸顺序的基础上,推测出氨基酸顺序。氨基酸的顺序是从起始密码子(cDNA上为ATG或mRNA上为AUG)的位置开始的。可以用下述方法鉴定氨基酸顺序的重要部分,如被认为是构成抗原决定簇的亲水部分:合成相当于各亲水部分的段肽,经HPLC(高效液相层析法)纯化合成的多肽,然后对纯化的肽进行E1A(酶免疫试验)或R1A(放射免疫试验)。
最好按由cDNA克隆编码的NANBV抗原的各自性质将cDNA克隆分成几组,以使各克隆彼此区分开来。在这一关系中,可用各cDNA克隆在NANBV基因之限制性图谱上的定位作分类[见图1(1)和图1(2)]的尺码。另外,已发现某些NANBV具有在大猩猩肝细胞浆中形成管状结构的能力,而有的NANBV则没有这种能力(Science,205,pp.197-200,1979)。因此,可以通过检验每一cDNA克隆的血清学反应来进行鉴定和分类cDNA克隆,即分别检测各cDNA克隆与感染了能在大猩猩肝细胞浆中形成管状结构之NANBV和感染了不具备这种能力的NANBV之大猩猩血清的血清学反应性。有关的血清学反应的检验可以按照前文介绍的免疫学试验进行。
在本发明中,如图1(1)和图1(2)所示,将用于本发明的NANBV基因之cDNA克隆均以前缀“BK”标示。
图1(1)是以图解方式显示用于本发明的NANBV基因之cDNA克隆间的相互关系,显示了它们与NANBV基因完整区域的比例;图1(2)是图解显示通过基因行走技术获得的cDNA克隆间的相互关系,显示了它们与NANBV基因完整区域的比例。
这些BK NANBV cDNA克隆包括,如大肠杆菌BK108(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-2971)、大肠杆菌BK129(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-2972)、大肠杆菌BK138(保藏于Fermetation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-2973)、大肠杆菌BK153(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM B-2974)、大肠杆菌BK157(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-3243)、大肠杆菌BK166(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-2975)和大肠杆菌BK172(保藏于Fermentation Research Institute,Japan,保藏登记号FERM BP-2976)。这7个BK NANBV cDNA克隆被认为至少包括了NANBV基因开放读码的完整区域并可能包括了NANBV基因的完整区域(见图1(1)和图1(2))。另外,除了上述cDNA克隆外,下面的5个克隆作为BK NANBV cDNA克隆的代表保藏于Fermentation Research Institute,Japan:大肠杆菌BK102(保藏登记号FERM BP-3384)、大肠杆菌BK106(保藏登记号FERM BP-3385)、大肠杆菌BK112(保藏登记号FERM BP-3386)、大肠杆菌BK146(保藏登记号FERM BP-3387)和大肠杆菌BK147(保藏登记号FERM BP-3388)。
被上述BK NANBV cDNA克隆复盖的NANBV基因的完整区域的核苷酸顺序和由这些核苷酸顺序编码的氨基酸顺序示于图2(1)到图2(16)中。基于图2(1)到图2(16)中列出的完整的NANBV核苷酸顺序和完整的NANBV氨基酸顺序,可以进行有关的各种研究和观察,如研究NANBV基因的核苷酸顺序和氨基酸顺序与其它病毒基因相应顺序的同源性,示于图3(疏水性/亲水性分布图)中的亲水性指数、NANBV基因的结构以及抗原决定基的区域等。
关于同源性的研究,可以通过将NANBV基因的核苷酸顺序和氨基酸顺序与已经了解得很清楚的多种病毒(日本专利申请公开说明书:No.62-286930和“Virology”,Vol.161,pp.497-510,1987)以及诸如牛痘病毒性腹泻-粘膜病病毒(“Virology”,Vol.165,pp.497-510,1988)、猪霍乱病毒(“Virology”,Vol.171.pp.555-567,1989)、烟草叶脉斑驳病病毒(“Nucleic Acid Research,Vol.165,pp.5417-5430,1986)等其它病毒的相应顺序进行比较来完成。
疏水性指数的分析研究,可以应用下列技术完成:如遗传信息加工程序系统、SDC-Genetyx(SDC Software Co.,Ltd.,Japan生产并销售)、Doolittle′s程序(Jourral of Molecular Biology,Vol.157,pp.105-132,1982)等。
NANBV基因中编码NANB病毒颗粒之不同抗原(蛋白质)的区域,可以通过该基因编码的肽与已知的黄色病毒在疏水指数方面进行比较,并比较该肽的氨基酸顺序与通过来源于宿主细胞的信号肽酶(Journal of Moleculcr Biology,167,391-409,1983)以及来源于已知的黄色病毒的丝氨酸蛋白酶(Vivology,171,637-639,1989)发挥作用的肽连接位点来确定。其中所说的多种抗原是指三种结构蛋白,亦即病毒核心抗原(蛋白质)(C抗原)、基质抗原(蛋白质)(M抗原)和包膜抗原(蛋白质)(E抗原),以及六种非结构蛋白(NS蛋白)。就本发明的NANBV颗粒而言,这些抗原(蛋白质)分别由示于图2(1)到(16)中的下列核苷酸顺序编码:
C抗原:从第333到第677位核苷酸
M抗原:从第678到第905位核苷酸
E抗原:从第906到第1499位核苷酸
NS1蛋白:从第1500到第2519位核苷酸
NS2蛋白:从第2520到第3350位核苷酸
NS3蛋白:从第3551到第5177位核苷酸
NS4a蛋白:从第5178到第5918位核苷酸
NS4b蛋白:从第5919到第6371位核苷酸
NS5蛋白:从第6372到第9362位核苷酸
这些核苷酸顺序对于NANB肝炎的诊断是有用的。由这些核苷酸顺序分别编码的抗原不仅可在疫苗中用作抗原,而且也可在NANB肝炎的诊断试剂中用作抗原。此外,还发现由于本发明的NANBV颗粒具有不同类型的抗原决定簇,使用本发明的NANBV颗粒或NANBV抗原集合体作为抗原的诊断试剂具有广泛的抗原-抗体反应谱,因此,与只含有单个抗原决定簇的抗原相比,这种诊断试剂可以与感染NANB肝炎病毒后所产生的各种抗体发生反应,从而正如在后面的实施例中所描述的那样,它在检测NANB肝炎中具高度敏感性。
步骤(Ⅵ):NANBV基因组cDNA及其ORF完整区域的表达和NANBV抗原集合体、不完整NANBV颗粒及感染性、完整NANBV颗粒的大量生产
为了表达在步骤(Ⅴ)中所克隆的NANBV基因组cDNA和以商业规模生产NANBV颗粒,将存在于cDNA克隆中的部分或全部克隆的cDNA从可复制的克隆的载体中切下取出,然后与可复制的表达载体重组。具体地说,经限制性酶切割取出各cDNA克隆的部分或全部cDNA以获得含有NANBV抗原范围(以下称作“NANBV DNA片段”)的cDNA片段。将NANBV DNA片段按顺序连接起来以构建NANBV基因的完整区域或其ORF的完整区域,然后再插入到可复制的表达载体中。为简化克隆载体中。为了简化克隆的NANBV DNA片段的连接步骤并防止在连接中发生差错,用于构建NANBV基因组cDNA完整区域或其ORF完整区域或其ORF完整区域的不同的NANBV DNA片段不超过10个,最好不超过5个。为了达到这一要求,对包含NANBV基因完整区域或其ORF完整区域的NANBV DNA片段及每一个至少具有1000个核苷酸,最好是1500个核苷酸的片段要严格地筛选,并去掉每一个出现在两片段间的重迭部分,然后将NANBV DNA片段按顺序连接,以构建NANBV基因的完整区域或其ORF的完整区域。也就是说,需要提供少于10个的不同cDNA克隆,它们分别含有至少1000个核苷酸,并从至少含1000个核苷酸的NANBV基因组RNA片段制得。这些不同的cDNA克隆含有其各自的克隆化cDNA片段,它们基本上包括了非A非B肝炎病毒从第1到第9416位核苷酸这一完整核苷酸顺序(见图2(1)到(16))中至少是从第333到第5177位核苷酸的区域。从cDNA克隆中切下cDNA片段以使其各自具有预定的核苷酸顺序,当按顺序排列这些预定的核苷酸顺序后,所得的核苷酸顺序将至少包括一个与第333到第5177位核苷酸区相一致的区域。
可以使用选自公开于图1(1)和图1(2)中的NANBV cDNA片段,如BK112、BK146、BK147、BK157和BK166来构建上述预期的NANBV基因区域。
按顺序连接分别含有上述预定核苷酸顺序的cDNA片段以构建含有一段至少包括非A非B肝炎病毒从第1到第9416位核苷酸这一完整核苷酸顺序(见图2(1)到(16))中第333到第5177位核苷酸的核苷酸顺序的第一脱氧核糖核酸。
在本步骤中应用的可复制性表达载体可以是已知的或市售的表达载体。表达载体的例子包括适用于肠细菌的质粒载体pSN508(U.S.Patent No.4,703,005)、适用于酵母的质粒载体pBH103及其系列(日本专利申请公开说明书No.63-220987)、质粒载体pJM105(日本专利申请公开说明书No.62-286930)、牛痘病毒WR株(ATCCVR-119)及牛痘病毒LC16m8株(日本专利申请公告55-23252)、减毒水痘病毒OKa株(U.S.Patent No.3,985,615),减毒Marek′s病病毒(The Journal of Japanese Society of Veterinary,27,20-24,1984,and Gan Monograph on Cancer Researeh,10,91-107,1971)、质粒载体pTTQ系列(Amersham England生产并销售)、质粒载体pSLV系列(Pharmacia LKB,Sweden生产并销售)等。
按常规方法将插入了NANBV DNA的表达质粒载体分别导入或转染到对载体敏感的宿主细胞中,获得能产生NANBV颗粒的转化体。然后筛选能产生NANBV颗粒的转化体。可以用在步骤(Ⅴ)中所介绍的免疫学检测法检测NANBV颗粒的产生。另外,可按下列常规方法征实或检测NANBV颗粒的产生,如电子显微镜检法、免疫电镜检法、密度梯度离心法、光散射测光法等。如前文所述,当以质粒作为表达载体时,可以获得有产生NANBV颗粒能力的转化体。另一方面,当以动物病毒基因作表达载体时,可以获得能产生NANBV颗粒的重组体病毒。
按照常规方法培养上面所得的转化体或重组病毒,即可在其培养物中获得商业生产规模的NANBV颗粒。有关用动物病毒基因作表达载体的详细方法,可参见欧洲专利0334530A1号。
因此,本发明的另外一个方面是提供一种生产分立的非A非B型肝炎病毒颗粒的方法,它包括:
(a)提供少于10个不同的cDNA克隆,每个克隆至少含有1000个核苷酸,并由至少有1000个核苷酸的非A非B型肝炎病毒基因组RNA片段制备之。所说的少于10个不同cDNA克隆分别含有基本上复盖了非A非B型肝炎病毒从第1至第9416位核苷酸完整区域(见图2(1)到(16))中至少从第333到第5177位核苷酸区域的克隆化cDNA片段。
(b)从所说的cDNA克隆中切取分别具有预定之核苷酸顺序的cDNA片段,以便当按顺序排列这些预定核苷酸顺序时,所得的核苷酸顺序至少含有一段与第333到第5177位核苷酸区域相一致的区域;
(c)按顺序连接分别含有预定之核苷酸顺序的上述的cDNA片段,以构建含有非A非B型肝炎病毒从第1到第9416位核苷酸完整区域(见图2(1)到(16))中至少从第333到5177位核苷酸之核苷酸顺序第一脱氧核糖核酸;
(d)将从所说的第一脱氧核糖核酸以及根据遗传密码的简性对第一脱氧核糖核酸的核苷酸顺序中至少一种核苷酸进行取代所得到的第二脱氧核糖核酸中选出的至少一种脱氧核糖核酸导入到从质粒和动物病毒基因中选出的可复制性表达载体中,当所说的可复制性载体是质粒时,可得到含有所说载体质粒和插入其中之至少一种脱氧核糖核酸的可复制性重组DNA,当所说的可复制性表达载体是动物病毒基因时,则得到含有所说的动物病毒载体和所说导入其中之至少一种脱氧核糖核酸的重组病毒。
(e)当用于步骤(d)中的可复制表达载体是质粒时,用所说的重组DNA转染原核或真核细胞以形成转化体,然后从真核或原核细胞培养物的亲代细胞中筛选所说的转化体;
(f)培养步骤(e)中从原核或真核细胞获得的转化体以生产非A非B型类病毒颗粒,或者培养步骤(d)中从真核细胞获得的重组病毒以与动物细胞一起生产非A非B型肝炎病毒颗粒;
(g)分离所说的非A非B型肝炎病毒颗粒。
在上述方法中,脱氧核糖核酸最好含有下列核苷酸顺序:第333列第5918位核苷酸的顺序,从第333到6371位核苷酸的顺序,第333到第9362位核苷酸的顺序或从第1到第9416位核苷酸的顺序。
应该注意到,为了生产本发明的NANBV颗粒,要求待表达的NANBV cDNA区域除了包括分别编码NANBV核心抗原、基质抗原和包膜抗原的全部核苷酸顺序外,还应包括分别编码NANBV中NS1蛋白、NS2蛋白和NS3蛋白的全部核苷酸顺序。
步骤(Ⅶ):NANBV颗粒的纯化
可适当合用常规技术纯化培养转化体或重组病毒所生产的NANBV颗粒,这些技术包括盐析、用硅胶或活性碳等吸附和解吸附、经有机溶剂沉淀、经超离心分离、经离子交换层析或亲和柱层析分离、经高效液相层析或电泳等方法分离。
当从大肠杆菌转化体或酵母转化体的培养物中纯化NANBV颗粒时,考虑到有效去除来自大肠杆菌和酵母并引起NANBV颗粒产量明降低的变应原,最好按下述步骤进行纯化:例如,(1)用硅胶吸附和洗脱,经活性碳吸附去掉杂质;(2)经密度梯度离心分离(日本专利申请公开说明书No.63-297)。当从重组病毒培养物,如重组病毒感染的细胞培养物中纯化NANBV颗粒时,可将含有病毒颗粒的粗溶液经反复超离心和密度梯度离心纯化,得到高纯度的NANBV颗粒。而且,为了灭活培养物中的NANBV颗粒以保证安全操作并且固定病毒颗粒以稳定其免疫原性和抗原性,最好向转化体或重组病毒感染之细胞的培养物中,或在除去转化体细胞或重组病毒感染之细胞后所得到的培养液中加入常规灭活剂。例如,以0.0001(V/V)%至0.001(V/V)%的终浓度加入灭活剂福尔马林,然后在4-37℃下保温5-90天以灭活NANBV颗粒。应该注意到,当用减毒病毒作表达载体时,从重组病毒获得的NANBV颗粒可不经灭活步骤而直接用作活减毒疫苗的活性成分。可用如此获得的高纯度的NANBV颗粒悬液作为制备疫苗和诊断试剂的原始NANBV颗粒溶液(一种原始NANBV疫苗溶液)。
本发明还提供了一种含有可复制性表达载体和脱氧核糖核酸的重组体,其中的载体选自质粒和动物病毒,脱氧核糖核酸至少包含一种来自下列一组顺序的核苷酸顺序:非A非B型肝炎病毒第1到第9416位核苷酸完整核苷酸顺序(见图2(1)到(16)中之第333到第5177位核苷酸的第一核苷酸顺序,以及根据遗传密码简性对上述第一核苷酸顺序的至少一个核苷酸进行置换所得的第二核苷酸顺序。
在上述重组体中,第一核苷酸顺序最好含有下列序列:第333到第5918位核苷酸的序列,第333到6371位核苷酸的序列,第333到第9362位核苷酸的序列,第1到第9416位核苷酸的序列。
可复制性重组体不仅可用于生产本发明的NANBV颗粒,而且可通过复制来扩增用于本发明的NANBV基因组cDNA。
本发明的纯化之NANBV颗粒可用作检测非A非B型肝炎的诊断试剂。
可按下述方法将本发明的NANBV颗粒配制成诊断试剂。将上述步骤(Ⅶ)中得到的纯化之NANBV颗粒分散到一个容器如小瓶或安瓿中并密封之。在进行上述同样操作时,可在密封前冻干容器中的NANBV颗粒溶液。容器中NANBV颗粒的量通常为1μg到10mg。此外,也可使NANBV颗粒吸附到常用的支持物表面,如微量培养板、聚苯乙烯珠、滤纸或膜上。
可按与步骤(Ⅴ)所述者基本相同的方式确定血清与NANBV颗粒的反应活性。也就是说,可用常规免疫学方法,如放射免疫试验(RIA)、酶联免般吸附试验(ELISA)、荧光素抗体技术(FA)、被动血凝试验(PHA)、反相被动血凝试验(rPHA)等方法来确定反应性。用于上述免疫学试验中的NANBV颗粒的量一般为每毫升血清0.1-100mg。具体地说,用于RIA、ELISA、FA、PHA和rPHA中NANBV的量分别为0.1-1mg/ml、0.1-1mg/ml、1-100mg/ml、1-50mg/ml和1-50mg/ml。
本发明NANBV颗粒还可以用于筛选输血用血液。筛选方法包括:
a)从全血中分离血清;
b)使未知血液的血清与分离的NANBV颗粒接触;
c)确定血清是否与NANBV颗粒发生反应;
d)根据反应特性将血清分成非A非B型肝炎阳性或阴性两类;
e)根据上述鉴定结果有效地分离血液。
未知血液的血清与本发明NANBV颗粒的接触,血清与NANBV颗粒反应性的确定均可按照前文介绍的有关诊断非A非B型肝炎的相同方式进行。可经上述方法选择无NANBV的输血用血液。
可用对本发明的NANBV颗粒具特异性的多克隆抗体和单克隆抗体作为从输血用血液中去除NANBV的因子。这就是说,通过NANBV与多克隆抗体或单克隆抗体的抗原-抗体反应可有效地去除存在于血液中的NANBV。
另外,本发明的NANBV颗粒益于用作非A非B型肝炎疫苗的活性成分。按下述方法制备非A非B型肝炎疫苗:按照前文介绍的相同方式培养携带编码NANBV颗粒cDNA之重组噬菌体或质粒的转化体,或培养用带有编码NANBV颗粒cDNA之重组病毒感染的细胞,以生产NANBV颗粒。为了灭活培养物中的NANBV颗粒以保证安全和为了固定NANBV颗粒以稳定其免疫原性和抗原性,最好在转化体培养物或重组病毒感染的细胞培养物中加入一种常规灭活剂,或在除去转化细胞或重组病毒感染之细胞的培养基中加入灭活剂。例如,可以加入灭活剂如0.0001-0.001V/V%的福尔马林,然后在4-37℃下保温5-90天。再按上述方法纯化所得培养物或培养基。因此而获得含有纯化之NANBV颗粒的原始非A非B型肝炎疫苗溶液。
以标准的微过滤方法过滤原始NANBV肝炎疫苗溶液以使该溶液除菌。用生理盐水稀释滤液使得用Lowry法测得的蛋白浓度为大约1-500μg/ml。另外,可加入至少一种稳定剂。任何市售的稳定剂都可以用。稳定剂的例子包括明胶及其水解产物、人白蛋白、糖类如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和乳糖、氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。还可以使用佐剂以制得一种被吸附的疫苗。在这种情况下,在加入稳定剂之前将佐剂如氢氧化铝凝胶加到溶液中使所所加凝胶的浓度约为0.1-1.0mg/ml,然后进行混合,从而将NANBV颗粒吸附到佐剂上。作为佐剂,还可以选用沉淀储存佐剂如磷酸钙凝胶、磷酸铝凝胶、硫酸铝、铝和皂土以及能诱导抗体产生的佐剂如胞壁酰酞衍生物、多核苷酸、Krestin (Kureha Chemieal Industry Co.,Ltd.,Japan生产并销售)和picibanil(二者均为抗肿瘤剂)。
然后,将如此获得的含有凝胶吸附的或非吸附的NANBV颗粒的非A非B型肝炎疫苗溶液分散于一小容器中如安瓿或小瓶中并密封之。这样便得到了含有(吸附或非吸附的)NANBV颗粒的纯化之(吸附或非吸附的)NANBV型肝炎疫苗。
可将如此获得的NANBV肝炎疫苗溶液冻干,得到干燥状态的NANB肝炎疫苗,使得该产品能够运输到并储存于气候恶劣的地方,如热带地区。可在将液体(吸附或未吸附的)NANB肝炎疫苗分散于小瓶和安瓿瓶等容器中后按常规方法冻干。冻干后,向含干燥疫苗的容器内通入氮气,然后密封。有时顺按日本厚生省关于“生物产品最低要求”(“Minimum Requirements for Biological Products”)的159号通知中,“提供的有关”吸附的B型肝炎疫苗”、“干燥的日本脑类疫苗”和“吸附的百日咳疫苗”的检测方法测定所产生之疫苗的量。
可以将NANB肝炎疫苗制成含有一种上述可吸附NANBV颗粒和至少一种除本发明NANBV颗粒以外之抗原的混合疫苗。作为本发明NANBV颗粒之外的其他抗原,可以使用任何常规用作相应疫苗活性成份的抗原,只要这些其他抗原与NANBV颗粒联合使用不会对这些抗原和NANBV颗粒引起的不利影响和副作用产生额外和协同加强作用,并且不会因为NANBV颗粒引起的不利影响而降低NANBV颗粒与这些其他抗原的抗原性和免疫原性。在如上所述的这种NANBV颗粒和抗原的副作用和有害反应不额外或协同加强以及其抗原性和免疫原性不被降低的情况下,可与NANBV颗粒混合的抗原数量和类型不限。一般,有2到6种类型的抗原可以与本发明NANBV颗粒混合,如包括从日本脑类病毒,HFRS(有肾病综合症的出血热)病毒、流感病毒、副流感病毒、乙肝病毒、登革热病毒、艾滋病病毒;百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、脑膜炎双球菌、肺炎球菌等衍生的去毒性抗原、灭活抗原或类毒素。
一般情况下,含有本发明NANBV颗粒的疫苗可以存放于密封的小瓶、安瓿或类似容器中。本发明疫苗一般是以液体或悬浮液的形式给药。如果疫苗是干燥形式的,可在给药前要将疫苗溶于或悬浮于无苗蒸馏水中,所加蒸馏水的量要达到冻干前的原始体积。一般该疫苗是皮下给药。该疫苗的给药剂量一般为大约0.5ml。通常情况下,该疫苗的儿童用量为成人的一半。这种疫苗一般是从一周到一个月的时间间隔给药两次,然后半年以后再给药一次。
另外,还可以用NANBV颗粒来制备NANBV颗粒特异性抗体,如多克隆抗体和单克隆抗体。例如,可以按照下述常规方法制备对NANBV颗粒有特异性的多克隆抗体。将本发明的纯化之NANBV颗粒给一种动物,如小鼠、豚鼠、和兔,作皮下、肌肉、腹膜内或静脉内接种。NANBV颗粒的接种一般按1至4周的时间间隔进行几次,以使该动物完全免疫。为了加强免疫作用,可以使用一种常规的商业上可得到的佐剂。然后,从被免疫的动物中收集血清,并且按常规方法从血清中分离和纯化抗NANBV颗粒多克隆抗体。
另一方面,可以按已述的常规方法,例如Cell Technology,1.23-29(1982)一书中所述方法来制备对NANBV颗粒特异的单克隆抗体。例如,可使从用纯化NANBV颗粒免疫的小鼠中得到的脾细胞与商业上可得到的小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合技术融合,以得到杂交瘤。对杂交瘤进行筛选以获得能够产生与NANBV颗粒反应之抗体的杂交瘤。按常规方法培养所得到的杂交瘤并按常规方法从培养物上清中分离和纯化抗NANBV颗粒单克隆抗体。
上述的多克隆和单克隆抗体也可以用作诊断NANB肝炎的诊断试剂。可以通过与上述用NANBV颗粒诊断NANB肝炎基本相同的免疫测定方法,使用该抗体诊断NANB肝炎。使用多克隆抗体或单克隆抗体,可对存在于肝组织和血液中的NANBV颗粒进行识别和定量。
本发明的NANBV颗粒具有非常广谱的抗原性,并且不仅能与慢性NANBV病人,还可以与急性NANBV病人的血清发生特异性反应。因此,NANBV颗粒能够提供一种有高度可靠性的诊断试剂,它不仅对抗体有高的检出率,而且这种检测具有高度的精确度。此外,当用本发明的NANBV颗粒来筛选输血血液时,可以高度可靠而且容易地检测出被NANBV感染的血清,并且将其从未被NANBV感染的血清中去除。因此,可以预防输血后NANB肝炎。
再者,还可以用本发明的NANBV颗粒作为疫苗的活性成份来预防NANB肝炎,其具有极其明显的免疫原性。另外,可用重组病毒,如向牛痘病毒中插入NANBV基因组cDNA而制备的重组牛痘病毒作为疫苗的活性成分。
而且,使用本发明的NANBV颗粒,可以容易地制备对NANBV具有特异性的抗体,尤其是单克隆抗体。这种对NANBV有特异性的抗体的优点是,它不仅可以用作诊断试剂来检查NANB肝炎,而且也可以用作从输血血液中去除NANBV的试剂。
再者,应当指出的是本发明的NANBV颗粒不是用病毒感染动物耐制备的,而是通过在宿主细胞中对编码本发明NANBV颗粒的DNA进行基因表达而以分离形式制备的。因此,在制备本发明NANBV颗粒的过程中基本上消除了感染的可能性,其生产成本也降低了。而且,由于制备过程中所用的所有物质,如保温系统的培养基组成是公知的,故纯化是容易做到的,而且可以获得高纯度的NANBV颗粒产物。
借助本发明,能够制备出分离的NANBV颗粒及其自然界中不存在的高纯度基因。所制备的NANBV颗粒及其基因对于NANB肝炎、肝肿瘤、肝癌等的研究具有重要的意义。
下列实施例及参考实施例将对本发明作详细的描述,这些实施例不对本发明的范围有所限制。实施例1分为第Ⅰ部分和第Ⅱ部分,中间插入参考实施例1-3。
实施例1(部分Ⅰ)
步骤1(制备从血浆中得到的用于产生cDNA而且与NANBV基因RNA互补的RNA)
为了从血浆中得到NANBV,将4.8升具有35IU/升或更高谷丙转氨酶(GPT)活性(用Wrobleuski,F&J.S.LaDue的方法测定:Serum glutamic-pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,91:569,1965)的人血浆加入到30%(W/W)蔗糖水溶液中,在4℃下以48,000xg离心13小时得到沉淀物。将沉淀物悬浮于含有50mM Tris·HCl(pH8.0)和1mM EDTA的水溶液中,在40℃下以250,000xg再次离心3小时得到沉淀物。将得到的沉淀物溶于75ml含有5.5M硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠(pH7.0)、0.05%sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)和0.1M2-巯基乙醇的5.5MGTC溶液中。将所得溶液加入到16ml的CsTEA-0.1MEDTA溶液中(ρ=1.51),并在15℃下以140,000xg离心20小时,得到RNA的沉淀物。抽吸除去含有蛋白和DNA的上清并将沉淀物溶解于200μl含有10mM Tris·Hcl(pH8.0)和1mMEDTA的缓冲液中。向该溶液中加入20μl 3M氯化钠和乙醇,并于-70℃下静置90分钟。将该混合液在4℃下以12,000xg离心30分钟得到沉淀物。将沉淀物溶于TF中,并以上述同样的方式加入氯化钠和乙醇。-70℃下静置该混合物得到沉淀物。将沉淀物溶于10μlTE中即得到纯化的RNA。
步骤2(从肝细胞制备用以产生cDNA的与NANBV基因组RNA互补的RNA)
按OKayama等人的方法从NANBV肝炎病人的肝组织中制备NANBV基因组RNA(见H·OKayama,M·Kawaichi,M·Brownstain,F·Lce,T·Yokota,and K·Arai:High-Efficiency Cloning of Full-Length cDNA;Construction and Screening of cDNA Expression Libraries for Mammalian Cells,Mehtods in Enzymology154.3-28,1987)。
更具体地说,将1g肝组织切成小碎块。将这些小碎块悬浮于100ml如步骤1中所用的5.5M GTC溶液中,用特氟隆玻璃匀浆器匀浆。接着将匀浆液移入一个带有18号针头的注射器中,使匀浆液从注射器中通过针头反复喷出从而机械分裂DNA。将所得到的匀浆液于4℃以1,500xg(低离心力)离心15分钟得到上清液。把上清液加到CsTFA溶液上并以步骤1中所述的基本相同方法离心得到作为RNA部分的沉淀物。然后将所得到的沉淀物悬浮于0.4ml 4M GTC溶液中。向悬浮液中加入10μl 1M乙酸和300μl乙醇,并使之于-20℃下静置至少3小时,以得到RNA沉淀物。4℃下以12,000xg离心10分钟分离该沉淀物,并将其溶于1ml TE溶液中。向该溶液中加入100ml 2M氯化钠溶液和3ml乙醇溶液,并将混合液于-20℃下静置3小时。离心收集所得到的沉淀物,并将其溶解于10μl TE中,从而得到纯化的肝脏细胞衍生的RNA。
步骤3(用cDNA合成药盒制备双链cDNA)
使用商业上可得到的cDNA合成药盒(由Amersham Intermational,England生产和出售)制备双链cDNA。
更详细地说,将0.75μg从步骤1得到的纯化RNA和2μl随机六核苷酸引物以及2μl药盒中所含有的反转录酶加入到反应试管中。然后,加入蒸馏水使混合物终体积为20μl。将混合液在42℃下保温40分钟,制备第一股cDNA。接着,按照下述方法在冰水上冷却反应混合物合成第二股cDNA。向20μl反应混合液中加入37.5μl用于第二条链合成反应的缓冲液、1μl大肠杆菌核糖核酸酶H和6.6μl DNA聚合酶Ⅰ(这些试剂均可从药盒中得到),接自加入34.9μl蒸馏水。将混合物于12℃保温60分钟,在22℃下保温60分钟,再在70℃下保温10分钟。然后,再将混合物液在冰水中冷却一次。加入1μl T4DNA聚合酶,于37℃下保温10分钟,再加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)以终止反应。将反应混合物与酚和氯仿充分混合,并以12,000xg离心1分钟,以分离含水层。按照上述方法再次提取含水层,并加入等体积氯仿。充分搅拌混合物并离合水层。接着,向该水层中加入等体积4M乙酸铵和两倍量的乙醇,并将混合液冷却至-70℃,从而得到纯化之双股cDNA的沉淀物。将沉淀物溶于50μl 2M乙酸铵中。向该混合液中加入100μl乙醇,并将所得到的混合液冷却于-70℃以得到沉淀物。以12,000xg离心10分钟收集该沉淀物。干燥收集的沉淀物,并溶解于20μl TE中。
步骤4(以聚合酶链反应(PCR)方法制备双股cDNA)
以PCR方法(参见Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffer,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.,and Erlich,H.A.,Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA Polymerase,Science 239:487-491,1988),对使用步骤1和2中制备RNAs作为模板,借助反转录酶制备的cDNAs分别进行扩增。将5到1,000ng RNA在20μl含有50mM Tris·HCl(pH8.3),40mM KCl,6mM MgCl2,1μM3′引物[含有图2(14)所示第7949至第7973位之25个核苷酸的合成的寡核苷酸],10mM dNTP和0.5单位反转录酶(New England Bio Lab.,USA的产品)的反转录酶溶液中于37℃保温30分钟。向所得混合液中加入80μl含有18mMTris·HCl(pH8.3)48mM KCl、1.5mM MgCl2、各0.6μM、5′引物[包含图2(13)所示第7612至7636位之25个核苷酸的合成的寡聚核苷酸]和上述3′引物、10mM dNTP和2.5单位Taq DNA聚合酶(由Perkin Elmer Cetus Co.,Ltd.,U.S.A生产并出售)的PCR反应溶液。将混合物在94℃下保温1分钟,50℃下保温2分钟并在72℃下保温3分钟。此保温过程反复进行40次。对所得混合物进行琼脂糖凝胶电泳,从而得到扩增的cDNA。将此扩增的cDNA用苯酚处理,乙醇沉淀并干燥。将干燥的cDNA溶解于10μlTE中。
步骤5(使用λgt11制备cDNA库)
可使用商业上可得到的cDNA克隆药盒(Amersham International,England生产并出售)制备cDNA库。即向步骤3中制备的130ng cDNA内加入2μl L/K缓冲液,2μl EcoRⅠ衔接子和2μl的T4DNA连接酶(这些试剂均可以克隆药盒中取得)。向该溶液内加入蒸馏水使所得到的混合物总体积达到20μl。将混合物于15℃下保温16至20小时,再向其中加入2μl 0.25M EDTA以终止该反应。接着,使混合液通过一个药盒中带有的分级分离层析柱,以除掉没有连接到cDNA上的EcoRⅠ接头片段。向700μl已连接上EooRⅠ接头的cDNA中加入83μl L/K缓冲液和8μl T4多核苷酸激酶。混合液在37℃下保温30分钟。用苯酚将所得混合物提取两次,借助丁醇浓缩至350到400μl,然后用乙醇沉淀得到沉淀物。将沉淀物溶于5μl TE中。
然后,为了将已连接了EcoRⅠ接头的cDNA插入到克隆载体λgt11的EcoRⅠ位点中,向1μl(10ng)上述已连接了EcoRⅠ接头的cDNA中加入1μl L/K缓冲液、2μl(1μg)的λgt11臂DNA和2μl T4 DNA连接酶。向混合物中加入一定量的蒸馏水使其总体积达到10μl。将混合物在15℃下保温16至20小时。从而制得重组λgt11 DNA溶液。然后使用商业上可得到的含有Gigapack 11 Gold溶液A和B,SM缓冲液和氯仿的体外包裹药盒(由stratagene Co.Ltd.,U.S.A.生产和出售)经体外包裹得到重组λ噬菌体。即向4μl上述重组λgt11 DNA溶液中加10μl Gigapack Ⅱ Gold溶液A和15μl GigapackⅡ Gold溶液B。将混合物于22℃下保温2小时以得到重组噬菌体。保温之后,加入470μl SM缓冲液和10μl氯仿,并将该重组噬菌体存放在4℃下。
步骤6(用大肠杆菌质粒pUC19克隆cDNA)
使用一种商业上可得到的含有溶液A和B的DNA连接药盒(由日本Takara Shuzo有限公司生产和出售),将cDNA插入到大肠杆菌质粒PUC19(C.Yanishi-Perron,J.Vieira,J.Messing,Gene 33,103,1985)中,并在大肠杆菌中克隆。也即将40μl溶液A和10μl溶液B加入到5μl步骤4中经聚合酶链反应(PCR)制得的cDNA和5μl(50ng)已经被限制酶SamⅠ消化并去磷酸化的质粒PUC19 DNA中。将混合液在15℃下保温16小时。按照氯化钙方法(见Mandel,M.和A.Higa,J.Mol.Biol.,53,154,1970)用所得到的质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109(见Messing,J.,Crea,R.,and Seeburg,P.H.,Nuclelc Acids Res.9,309,1981)。从而得到含有已连接了cDNA之质粒的转化大肠杆菌。
步骤7(从cDNA库中筛选具有NANBV基因的克隆)
在50ml含有1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物、1%氯化钠、50μg/ml氯苄青霉素和0.4%麦芽糖的LBM培养基中37℃下培养大肠杆菌菌株Y1090(见Richard A.Young and Ronald W.Davis,Science,222,778,1983)。将处于对数生长期的大肠杆菌细胞悬浮于15ml用冰冷却的10mM硫酸镁中。用含有0.1M氯化钠、8mM硫酸镁、50mM Tris·HCl(pH7.5)和0.01%白明胶的SM缓冲液稀释步骤5中得到的噬菌体溶液。将0.1ml稀释的噬菌体溶液与等体积上述大肠杆菌细胞悬浮液混合,并将混合液于37℃下保温15分钟。向混合物中加入4ml含有1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取液,0.5%氯化钠,0.25%硫酸镁和0.7%琼脂(pH7.0)并加热到45℃的软琼脂培养基。将该混合液铺敷在含有1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取液,1%氯化钠,1.5%琼脂和100μg/ml氨苄青毒素(pH7.0)的L-琼脂平皿上,并在42℃下保温3小时。然后,使10mM IPTG(异丙基β-D硫代吡喃半乳糖苷)渗透到硝化纤维素滤纸中,并干燥该硝化纤维素滤纸,然后使之与平皿紧密接触。将与滤纸接触的平皿于37℃保温3小时。取出滤纸,并用TBS缓冲液洗三次。将洗过的滤纸浸没于2%牛血清白蛋白溶液中,并于室温下保温1小时。将包含在商业可得到的免疫筛选药盒(由英国Amersham International生产并出售)中的1/20体积的大肠杆菌溶胞产物溶液加到从NANB肝炎病人收集的血清中,室温下保温30分钟。之后,用加有0.2%牛血清白蛋白的TBS缓冲液将该血清稀释至50倍,并将滤纸浸泡于稀释的血清溶液中,于室温下保温1小时。
用含有0.05%吐温20的TBS缓冲液将所得到的滤纸冲洗4次。将洗过的滤纸置于经1000倍稀释之过氧化物酶标记的抗人IgG(德国Cappel有限公司生产和出售)而制备的抗体溶液中浸泡1小时。用上述的吐温-TBS缓冲液冲洗该滤纸,然后再将其浸泡于通过向50ml TBS缓冲液中加入0.4ml DAB(四氢氯化-3,3′-二氨基联苯胺)和15μl 30%过氧化氢水溶液所制成的溶液中,于室温下保温5至30分钟使之显色。用蒸馏水彻底冲洗所得到的滤纸以终止该反应。
按上述步骤纯化所得到的噬斑。结果分离出9个阳性克隆,分别命名为BK102,BK103,BK105,BK106,BK108,BK109,BK110,BK111和BK112。所有这些克隆都不与从健康人体中采集的血清反应,但是能与从患有NANB肝炎的病人体内采集的血清发生反应。
参见表1。
表1
得自NANB肝炎病人的血清与重组λgt11噬菌体克隆间的反应性
克隆 健康人血清 NANB肝炎病人的血清
BK 102 0/10* 10/11
BK 103 0/10 9/11
BK 105 0/10 11/11
BK 106 0/10 11/11
BK 108 0/10 9/11
BK 109 0/10 9/11
BK 110 0/10 9/11
BK 111 0/10 9/11
BK 112 0/10 10/11
*阳性样品数/样品数
步骤8(测定所得克隆的核苷酸顺序)
纯化克隆BK102到BK112的重组噬菌体DNA,并且用限制酶EcoRⅠ消化之。然后,分离NANBV的cDNA片段,并将分离的cDNA分别插入到质粒PUC19的EcoRⅠ位点上。按照与步骤6中基本上相同的方法用这些质粒转化大肠杆菌菌株JM109。从转化的大肠杆菌中获得质粒DNA并纯化之。使用7-DEAZA顺序测定药盒(日本Takara Shuzo有限公司生产和出售;参见Mizusawa,S.,Nishimura,S.and Seela,F.,Nucleic Acids Res.,14 1319,1986)测定各NANBV cDNA的核苷酸顺序。所获得cDNA克隆的核苷酸顺序间的关系如图1(1)所示。
步骤9(通过基因组行走克隆cDNA库中的NANBV cDNA克隆)
经用32p-dCTP标记步骤8中所获得的克隆BK102,克隆BK106和克隆BK112的cDNA片段来制备探针。使用这些探针,可以从步骤5制得的克隆载体λgt11的cDNA库中经杂交反应得到含有NANBV cDNA的噬菌体克隆。即借助碱方法(参见T.Maniatis,E.F.Fritsch,and J.Sambrook:Isolation of Bacteriophage λ and Plasmid DNA:“Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Lab.,pp 75-96)。由步骤8所得到的克隆BK102,克隆BK106和克隆BK112转化的大肠杆菌中制备质粒DNA。
用限制酶NcoⅠ和HincⅡ消化克隆BK102的质粒DNA,并对所得到的位于DNA 5′端的0.7kb片段进行琼脂糖凝胶电泳并收集之。用限制酶NcoⅠ消化克隆BK106和克隆BK112的质粒DNA。按照上述的相同方法,从克隆BK106中制备1.1kb DNA片段,并从克隆BK112中制备位于3′端的0.7kb片段。使用商业上可得到的DNA标记药盒(Nippon Gene Co.,Ltd.生产),将25ng至1μg的DNA片段与[α-32p]dCTP(3000Ci/mmol;Amersham Co.,Ltd.,Emgland生产)在37℃下保温3到5小时。这样便制得了用于杂交反应的探针。
接着,如步骤7中所述,将步骤5中所得到cDNA库噬菌体于42℃下在L-琼脂培养基中保温3小时。然后再将噬菌体于37℃下继续保温3小时并冷却之。将硝化纤维素滤纸与噬菌斑接触,并放置30到60秒钟。从而使噬菌斑被吸附到滤纸上。
用一种含有0.5N氢氧化钠和1.5M氯化钠的水溶液对滤纸进行碱变性1至5分钟,再用含有1.5M氯化钠的0.5M Tris·HCl(pH8.0)中和1至5分钟。用含有0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠的2XSSC溶液冲洗该滤纸、干燥、并在80℃下烘烤2小时。
将该滤纸置于含有50%甲酰胺、5XSSC、5XDenhart溶液,50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH6.5),100μg/ml鲑鱼精子DNA和0.1% SDS的杂交溶液中42℃保温6小时。然后,将该滤纸浸泡于300ml加有1ml大约4×108cpm/ml上述探针的杂交溶液中,并在42℃下保温16至20小时。用含有0.1%(W/W)SDS的2XSSC溶液将该滤液纸洗4次,再用含有0.1%(W/W)SDS的0.1XSSC溶液洗两次。冲洗之后,干燥该滤纸,并进行放射自显影。从而分离出杂交阳性克隆。结果获得27个与从克隆BK102衍生之探针发生反应的克隆;14个与衍生于克隆BK106之探针发生反应的克隆和13个与衍生于克隆BK112的探针发生反应的克隆,这些克隆分别被命名为BK114至BK169。
按照步骤8中所述的方法测定BK114至BK169各个克隆的核苷酸顺序,然后绘制各个克隆的酶切图。结果得到被认为是NANBV基因组之总长度的长约9.5kb的核苷酸序列。[见图1(2)]。
用限制酶KpnⅠ消化位于5′端的克隆BK157以分离位于5′端上的0.55kb的片段。另外用限制酶HpaⅠ和EcoRⅠ消化位于3′末端的克隆BK116,以分离位于3′端的0.55kb片段。用上述相同的方法制备32p标记的探针,并与步骤5中所得到的cDNA库噬菌体进行噬斑杂交。结果利用衍生于克隆BK157的探针分离出三个另外的新克隆。这些新克隆分别被命名为克隆BK170,BK171和BK172。
步骤10(分析cDNA的核苷酸顺序)
从步骤8和9中所得克隆的核苷酸顺序可以测知NANBV基因的完整核苷酸顺序,并如图2(1)至2(16)所示。从这些图中可以推知克隆的NANBV基因组cDNAs是由9416个核苷酸组成的,其中有一个编码含3010个氨基酸残基之蛋白质的由9030个核苷酸组成的开放读码。该蛋白蛋的亲水/疏水形型式与已经报道的黄热病病毒相似(参见H.Sumiyoshi,C.Mori,I.Fuke et al.,Complete Nucleotide Sequence of the Japanese Encephalitis Virus Genome RNA.Virology,161,497-510,1987)。克隆BK157复盖了图2(1)到2(16)中的第1至1962位核苷酸。克隆BK172覆盖了第5至366位核苷酸,克隆BK153覆盖了第338至1802位核苷酸,克隆BK138覆盖了第1755至5124位核苷酸,克隆BK129覆盖了第4104至6973位核苷酸,克隆BK108复盖了第6886至8344位核苷酸,克隆166复盖了8082至9416位核苷酸。这些克隆分别作为大肠杆菌BK108(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2971)、BK129(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2972)、BK138(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2973)、BK153(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2974)、BK157(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-3243)、BK166(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2975),和BK172(保藏于日本发酵研究所,登记号为FERM BP-2976)保藏。
参考实施例1
(在大肠杆菌中制备NANBV相关抗原,这些抗原与NANBV感染所伴随的抗体反应有关)。
将实施例1(部分1)中步骤8所制得的克隆BK106、克隆BK111和克隆BK112的自各(cDNA和实施例1(部分1)中步骤9所制得的克隆BK147的cDNA分别插入到质粒中,并按常规碱性方法收集如此获得的质粒DNA。接着,用限制酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化,收集克隆BK106的DNA,得到0.5μg长度为0.34Kb的DNA片段。将如此得到的DNA片段在含有67mM Tris·HCl(pH8.8)、6.7mM氯化镁、16.6mM硫酸铵、10mM 2-巯基乙醇、6.7μM EDTA、0.02%牛血清白蛋白、0.3mM dNTP和2-5单位T4DNA聚合酶的T4DNA聚合酶溶液中37℃保温60分钟,从而使两个末端变成平端。用限制酶BamHⅠ消化克隆BK102的DNA,以得到0.5μg长度为0.7kb的DNA片段,并基本上按上述相同方法用T4DNA聚合酶处理,使DNA片段的末端变成平端。用限制酶Sau3AⅠ消化克隆BK147的DNA,以得到0.5μg长度为1kb的DNA片段,并且以上述相同的方法使该DNA片段的末端变成平端。另外还用限制酶EcoRⅠ消化克隆BK111的DNA,以得到0.5μg长度为1kb的DNA片段。并且以与上述者基本相同的方法使该DNA片段的末端变成平端。然后,用限制酶Hind Ⅲ消化表达载体pKK233-2(Amann,E.and J.Brosius.ATG Vector for regulated high-Level expression of cloned genes in Escherichia coli.,Gene,Vol.40,183,1985)的DNA。所得2μg DNA在含有0.3M氯化钠、50mM乙酸钠(pH4.5)、1mM硫酸锌和100-200单位S1核酸酶的S1核酸酶溶液中于37℃保温20分钟,然后分别加于1/10体积的0.12M EDTA和1M Tris·HCl溶液(pH9.0)终止该反应。之后,进行苯酚提取,用乙醇沉淀具有钝性末端的载体DNA并收集之。另一方面,用限制酶PstⅠ消化载体pKK233-2的DNA,再用苯酚提取并用乙醇沉淀以纯化被消化的DNA。利用上述的T4DNA聚合酶反应使限制酶PstⅠ切割的2μg纯化之载体DNA的末端变成平端。用限制酶Hind Ⅲ分别切割如此得到的衍生于克隆BK106和克隆BK111的DNA片段。将各0.5μg已切割的DNA片段与0.5μg具有钝性末端的载体DNA混合。加入2μl含有500mM Tris·HCl(pH7.5)、100mM氯化镁、100mM DTT和10mM ATP、300-400单位T4DNA连接酶和蒸馏水的10X连接溶液将各混合物的体积调至20μl。将混合物在14℃下保温12-18小时,从而得到分别命名为pCE-06,pE-11,pB-02和pS-09的质粒。使用其中的每种质粒DNA,以实施例1(部分1)步骤6中所述的基本相同的方法转化大肠杆菌菌株JM109,得到转化的大肠杆菌。将转化的大肠杆菌在含有1(w/w)%胰蛋白胨,0.5(w/v)%酵母提取物和1(w/v)%氯化钠的LB培养基(pH7.5)中于37℃下培养,当处于对数生长期时,向培养基中加入1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷),继续培养3小时。然后离心(10,000xg离心15分钟)收集大肠杆菌细胞,并将收集的细胞在50mM Tris HCL(pH8.0)中溶解。对混合物进行超声处理(20KHZ,600W,5分钟)并以10,000xg离心15分钟以得到上清部分和沉淀部分。将各部分溶于含有20(v/v)%甘油、0.1M Tris·HCL(pH6.8),2(w/v)%SDS,2(v/v)%2-巯基乙醇和0.02%BPB的样本缓冲液中,在100℃下加热3分钟,并用0.1%SDS-7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳以分离蛋白质。电泳之后,通过转印迹小室(trans bolt Cell)(由美国BIO.RAD Co.,Ltd.,生产和出售)将蛋白质转移到硝化纤维素滤纸上。把滤纸浸于3%的明胶溶液中静置60分钟。该滤纸与从NANB肝炎病人采集的已稀释100倍的血清在室温下一起保温2到3小时。先用蒸馏水冲洗滤纸,再用含有0.02M Tris·HCL(pH7.5)、0.5M氯代钠和0.05(v/v)%吐温20的TTBS溶液冲洗。接着将洗过的滤纸浸泡于2000倍稀释的过氧化物酶标记之抗人IgG抗体溶液中,于室温下保温90分钟。先用蒸馏水,再用TTBS溶液冲洗该滤纸。将洗过的滤纸浸泡于如实施例1(部分1)步骤7所述的含有显色剂DAB和30%(基于底物)过氧化氢的缓冲液中5至30分钟,然后用水洗以终止反应。
结果如表2中所示,所有由质粒产生的抗原都与NANB肝炎病人的血清发生特异性反应,从而表明由插入到质粒中的cDNA产生的蛋白质在临床具有重要意义。
表2
用Weetern印迹方法评价各种质粒所产生的蛋白质与来源于
NANB肝炎病人的血清的反应活性
质粒 cDNA来源 提取物 NANB肝炎 健康人
病人血清 的血清
pCE-066 BK106 S ± -
P + -
pE-11-89 BK111 S ± -
P + -
pB-02-07 BK102 S + -
P - -
pS-09-07 BK109 S ± -
P + -
pKK233-3 - S - -
P - -
S:离心所得上清;P:离心所得沉淀物
+:阳性;±:轻度阳性;-:阴性
参考实施例2
(由大肠杆菌产生之NANBV相关抗原的纯化及其与肝炎病人血清的反应活性)
由被插入到表达载体中的cDNA产生的蛋白质的用途,可以经纯化该蛋白质并使用该纯化的蛋白质作为ELISA或放射免疫测定的抗原而得以证明。也就是,将参考实施例1中制得的已转化大肠杆菌的细胞溶解产物以10,000xg离心15分钟,得到上清和沉淀物。例如,把从转化体JM 109/pCE 066得到的沉淀物悬浮于含有100mM Tris·HCL(PH8.0)和0.1% Triston X-100的溶液中,并将该悬浮液以20KHZ(600W)的频率超声处理1分钟,然后以21,000xg离心15分钟,得到沉淀物。把该沉淀物重新悬浮于含有100mM Tris·HCL(PH8.0)和6M尿素的溶液中,然后进行超声处理和离心。
所得到的上清液对含有10mM磷酸盐缓冲液(PH7.5)和6M尿素的溶液透析得到抗原溶液。使20ml该抗原溶液通过一个装有羟基磷灰石,并已用上述缓冲液平衡过的柱子(21.5×250mm),使抗原吸附到填柱材料上。对该柱进行高速液相层析(HPLC),其中用上述的含有氯化钠的缓冲液进行洗脱,其浓度为0到2M变化的线性浓度梯度,从而得到一个含有抗原的部分。使所得到的部分在50mM含有0.05%十二烷基硫酸钠(SDS)的碳酸盐缓冲液(PH9.6)中进行透析。
另外,用35%饱和的硫酸铵处理离心转化体JM109/pB-02-10之溶解产物(以10,000g离心15分钟)所得到的上清液,并将所得到的沉淀物溶于50mM含有100mM 2-巯基乙醇的Tris·HCl(PH8.5)缓冲液中。将所得到的溶液对上述的缓冲液透析。然后,使100mM透析过的溶液通过一个装有DEAE纤维素,并用上述缓冲液平衡过的柱子(22.0×200mm),使抗原吸附到装柱材料上。对该柱进行高速液相层析,其中用含有100mM 2-巯基乙醇,并加有氯化钠的50mM Tris.HCL(PH8.5)缓冲液进行洗脱,洗脱液浓度为0到2M变化的线性浓度梯度,然后收集含有抗原的部分。
将该部分对含有10mM磷酸盐缓冲液和100mM 2-巯基乙醇的溶液透析,使透析过的溶液通过已用上述缓冲液平衡过的羟磷石柱进行高速液相层析,使抗原吸附到装柱材料上。该柱作高速液相层析时,用浓度由10到400mM变化的磷酸线性浓度梯度进行洗脱并收集含有抗原的部分。将所得到的部分对含有0.05%SDS的50mM碳酸盐缓冲液(PH9.6)透析。
将离心转化体JM109/pE-11-89之溶解产物所得到的沉淀物悬浮于10mM磷酸盐缓冲液(PH5.5)中。对悬浮液进行上述的超声处理1分钟,然后以21,000xg离心15分钟。将所得沉淀物悬浮于100mM含有500mM氯化钠和10mM EDTA的碳酸盐缓冲液中。对所得悬浮液再次超声处理1分钟,然后离心。将所得上清液对含有6M尿素的30mM磷酸盐缓冲液透析。然后使20ml透析过的溶液通过一个已用上述透析中使用的相同缓冲液平衡过的CM纤维素柱(22×200mm)进行高速液相层析(HPLC),以使抗原吸附到装柱材料上。对该柱进行高速液相层析,其中用上述含有浓度为0到1.5M之氯化钠线性浓度梯度的缓冲液进行洗脱,得到含有抗原的部分。将该部分对含有0.05%SDS的50mM碳酸盐缓冲液(PH9.6)透析,得到含有抗原的溶液。
用上面制备的抗原作为ELISA的抗原对非A非B肝炎病毒感染进行临床诊断。也即,将上述每种纯化抗原的蛋白浓度调节至1μg/ml,并以100μl量加入Microplate lmmulone 600(德国Greriner Co.,Ltd,生产和出售)之用于ELISA的各孔中,并于40℃下静止过夜。用含有10mM磷酸盐缓冲液(PH7.2)、0.8%氯化钠和0.05%吐温20的PBS-T缓冲液充分冲洗各孔内容物,并且以100μl/孔的量向孔内加入用PBS-T缓冲液稀释过的样本血清,然后在37℃下反应1小时。用PBS-T缓冲液将各孔内容物冲洗三次,然后再以100μl/孔的量向每孔内加入用含有1%胎牛血清的PBS-T缓冲液稀释8000倍的过氧化物酶标记之抗人IgG抗体(德国Cappel Co.,Ltd,生产和出售)。使各孔内容物在37℃下反应1小时,并用PBS-T缓冲液冲洗四次。以100μl/孔的量向各孔内加入含有9ml的0.05M柠檬酸-磷酸盐缓冲液、0.5μg邻苯二胺和20μl过氧化氢水溶液的底物显色剂溶液。使平板避光于室温下放置60分钟。向各孔内加入75μl 4N硫酸,测定其在490nm波长下的吸收率。结果如表3所示。从表中可以明显地看出,所有来源于转化体的抗原都与NANB肝炎病人的血清发生特异性反应,从而证明了由转化所产生的抗原在临床诊断中的用途。
表3
在ELISA中得自各种转化大肠杆菌的纯化抗原与NANB肝炎病人
血清间的反应性
来源于输血性肝炎病人的血清
抗原来源
(转化的大
肠杆菌) 急性 慢性 肝硬变 肝癌 健康人血清
JM109/pCE-066 2/3* 7/8 3/4 3/3 0/10
JM109/pB-02-10 2/3 8/8 4/4 3/3 0/10
JM109/pE-11-89 2/3 8/8 2/4 3/3 0/10
*阳性样本数/检查之样本数
用上述抗原通过放射免疫测定所得结果与表3中所示者相同。也就是说,将直径为1/4英寸的聚苯乙烯小珠(德国Pesel Co.,Ltd,生产和出售)放入0.2ml浓度为1μg/ml的上述各纯化之抗原溶液中,并于4℃下放置过夜。然后,用上述ELISA中所用的相同PBS-T缓冲液冲洗聚苯乙烯小珠5次,并以200μl/小珠的量加入用PBS-T缓冲液稀释20至2500倍的样本血清。使之于37℃下反应60分钟并用PBS-T缓冲液冲洗聚苯乙烯小珠5次,再以200μl/小珠的量加入125I-标记的抗人IgG抗体。使之于37℃下反应1小时,并用PBS-T缓冲液冲洗小珠5次。测定结合到聚苯乙烯小珠上的125I的cpm值,所得结果与表3中所示相同。因此,证明了上面得到的纯化的抗原在NANB肝炎病毒感染之临床诊断中的用途。
参考实施例3:[根据PCR(聚合酶链反应)方法检测NANBV核酸]
为了防止输血引起的NANBV肝炎,检测用于输血的血液中是否存在任何NANB病毒感染是很重要的。而且,为了诊断肝炎,研究肝组织内是否存在任何NANB病毒感染具有极其重要的临床价值。根据本发明方法得到的NANBV cDNA可用于制备聚合酶链反应(PCR)的引物,以便于检查NANB肝炎。即如实施例1(部分1)步骤1所述,从各1ml病人和健康人的血清中纯化RNA。同样,也可以如实施例1(部分1)步骤2所述从肝细胞中制备RNA。然后,如实施例1(部分1)步骤4所述,以PCR和电泳方法制备cDNA。按照常规,使用32P-标记的NABV cDNA克隆BK108衍生的cDNA制备的探针,经Sorthern杂交来研究扩增的cDNA是否衍生于NANBV。
结果如表4中所示。从表中可以明显地看出,使用本发明得到的NABV cDNA的核苷酸顺序所制备的引物并以克隆NANBV cDNA的片段做为探针,可以测定出血清中的NANBV核酸,并且能诊断出血清中NANB病毒的感染。
表4
经PCR检测NANB病毒核酸
样品 抗NANBV抗体 PCR
慢性肝炎病人的血清
NANB 1 + +
2 + +
HBV携带者 1 - -
2 - -
健康人 1 - -
2 - -
从NANB肝癌-1切
除的肝脏 +
癌部位 +
非癌部位 +
从NANB肝癌-2切
除的肝脏 +
癌部位 +
非癌部位 +
实施例1(部分Ⅱ)
步骤1(构建用于在大肠杆菌中表达NANBV基因组cDNA之完整编码区的质粒)
从图1(1)和图1(2)中所示的克隆BK112、BK146、BK147、BK157和BK166中分离cDNA,并按照下述方法制备用于在大肠杆菌中表达NANBV基因之完整编码区的质粒。
用限制酶BamHⅠ消化克隆BK157的质粒DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳,以得到一个长度为1.3kb的DNA片段。将该DNA片段插入到质粒pUC19(日本,Takara shugo Co.,Ltd.,生产和出售)的BamHⅠ位点上得到质粒pBm157。用限制酶XbaⅠ和NcoⅠ消化质粒pBm157得到一个长度约为3.9kb的DNA片段。另外,将带有XbaⅠ人工接头顺序的噬菌体T7RNA聚合酶的20bP启动子区顺序(TAATACGACTCACTATAGGG)连接到图2(1)中所示的带有NcoⅠ人工接头顺序的核苷酸1至73顺序上,以合成一个93bp的寡核苷酸(在3′侧有4个核苷酸缺失)。将如此得到的寡核苷酸连接到上述的3.9kb DNA片段上,从而得到质粒pDM-16。然后,用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化pDM-16,得到一个大约3.5kb的DNA片段,另外,用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK146的DNA得到长度为4,1kb的DNA片段。将上述的大约3.5kb的DNA片段连接到如此获得的4.1kb的DNA片段上,以得到质粒pDM-9。然后,用SacⅡ消化质粒pDM-9,从而得到2.7kb的DNA片段和4.9kb的DNA片段。将4.9kb的DNA片段用T4DNA连接酶连接到其SacⅡ位点上,然后用BamHⅠ和EcoRⅠ消化,得到一个大约7.5kb的DNA片段。另外,用BamHⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK147的DNA,得到一个大约2kb的DNA片段。将如此得到的DNA片段连接到上述7.5kb的DNA片段上以得到质粒pBE147。用SacⅡ消化质粒pBE147。将上述来源于pDM-9r 2.7kb DNA片段插入到SacⅡ消化的pBE147中,得到质粒pDM-B3。用XbaⅠ和EcoRⅠ消化质粒pDM-B3以得到6.7kb的DNA片段。
用BamHⅠ消化克隆BK166的DNA得到一个1.3kb的DNA片段。将该片段插入到PUC19的BamHⅠ位点上以得到pBam166。用NdeⅠ和HindⅢ消化pBam166得到一个2.8kb的DNA片段。用EcoRⅠ和NdeⅠ消化克隆BK112的DNA得到一个大约1.6kb的DNA片段。用EcoRⅠ和HindⅢ消化PUC19得到一个大约2.6kb的DNA片段。混合上述三个类型的DNA片段,并且与T4 DNA连接酶反应,得到一个这些片段以它们的EcoRⅠ、NdeⅠ和HindⅢ位点连接在一起的质粒pEN112。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化质粒pEN112得到2.7kb的DNA片段。用EcoEⅠ和XbaⅠ消化PEM-B3得到6.7kb的片段。将上述2.7kb的片段连接到6.7kb的片段上,并将已连接的DNA片段插入到pUC19的XbaⅠ位点上,得到质粒pDM-22和pDM-18。用质粒pDM-18可以转化动物细胞等,以使该细胞能够产生NANB病毒颗粒。也可以使用借助体外转录药盒(日本,Boehringer Mannheim Yamanouchi生产和出售)转录pDM-18而制备的RNA来进行转化。用HindⅢ和ClaⅠ消化其中cDNA插入方向与pDM-18相反的质粒pDM-22,得到大约9kb的DNA片段。
用BamHⅠ消化克隆BK106的DNA,得到一个大约1.0kb的DNA片段。将该片段插入到质粒pUC19的BamHⅠ位点上,得到质粒pBam106。用NcoⅠ消化如此得到的质粒DNA,并且用Mang Bean核酸酶(日本,Takara Shuzo Co.,Ltd.,生产和出售)将其粘性末端切成平头。进一步用XbaⅠ消化所得到的质粒,得到一个大约3.6kb的片段。将通过把图2(11)中所示的核苷酸333在372的顺序连接以XbaⅠ人工接头的下游所制得的合成寡聚核苷酸连接到该片段上,得到质粒pXb106。用HindⅢ和ClaⅠ消化质粒pXb106得到0.4kb的DNA片段。将该片段连接到上述衍生于质粒pDM-22的大约9kb的片段上得到质粒pORF-24。用XbaⅠ消化质粒pORF-24得到一个大约9.0kb的DNA片段。将该片段连接到一个连接有T7 RNA聚合酶基因启动子的表达载体(参见F.William Studier and B.A.Moffatt,J.Mol.Biol.,189,113,1986)上,得到表达质粒pJF-22。
步骤2(制备转化体大肠杆菌及其培养物)
使用步骤1中构建的表面质粒pJF-22,以氧化钙方法(Journal of Molecular Biology,53,154,1970)转化大肠杆菌菌株JM109(DE3)(Promega,U.S.A.生产并销售),得到转化体JM109(DM3)/pJE-2Z。
之后按参考实施例1所述方法处理转化体大肠杆菌JM109(DE3)/pJE-2Z。也就是,在LB培养基上培养该大肠杆菌,然后加入0.5mM IPTG,继续培养3小时。之后,收集培养过的细胞,并在含有2%SDS和2% 2-巯基乙醇的缓冲液中于100℃加热3分钟,用含有0.1(w/v)%SDS和12.5(w/v)%丙烯酰胺的凝胶对所得到的细胞进行电泳分离。使用转印迹装置(日本Nippon Eido Co.,Ltd.,生产和出售)将在凝胶上分离得到的蛋白质转印到硝化纤维素膜上,并进行Western印迹分析,以鉴定所得到的蛋白质。在Western印迹分析中,使用了经纯化由参考实施例1得到的转化体中制备的NANBV相关抗原及用其免疫豚鼠而获得的特异性抗血清。从Western印迹分析结果发现,由转化体JM109(PE3)/pJF-22产生的蛋白质可与所有抗血清发生反应(见表5)。
表5
转化体大肠杆菌JM109(DE3)/pJF-22中所产生的蛋白质与NANBV
相关抗体的反应活性
NANB肝炎 豚鼠抗血清
病人的血清
细胞 收集的 急性 慢性 抗- 抗- 抗-
提取物 血清 核心 NS3 NS5
JM109(DE3) +* + + + + +
/pJF22
JM109(DE3) - - - - - -
*′经Western印迹分析测定的反应活性
因此,结果表明在该转化体中,可以表达出从编码核心核原之基因组的5′端到编码非结构蛋白NS5之基因组的3′端的NANB病毒基因完整编码区。从这一结果可以明显地看出,该种转化体能够提供一种极为有用的抗原,这种抗原不仅可以用于制备诊断NANB病毒感染的试剂,而且还可用于制备NANB病毒病苗。
步骤3(通过在动物细胞中表达NANB病毒基因组cDNA来制备NANB病毒颗粒)
用XbaⅠ部分消化步骤1得到的质粒pORF-24,并进行低溶点琼脂糖凝胶电泳以得到一个大约9kb长的DNA片段。将如此得到的DNA片段插入到已经用NheⅠ切割过的质粒pMAM-neo(可以从Clontech.U.S.A得到)中,以构经建表达质粒pMAM-neo 10。以磷酸钙方法(“Molecular Laboratory,1989)将该表达质粒转染到人肝细胞Chang Liver(ACTT CCL13)和黑猩猩肝细胞(从日本Dainippon Pbarmaceutical Company Ltd.,购得)中。使已经导入了质粒pMAM-neo 10的肝细胞对氨基苷抗生素G418具有抗性,从而使该细胞能够在600μg/ml之G418存在下形成菌落。用这种抗生性作为标准,选择转化体,然后进行克隆。按照下文参考实施例4中所述的相同方法,将人肝细胞中产生的转化体克隆HL-A1和HL-A2以及黑猩猩肝细胞中产生的转化体克隆CL-B11和CL-B14分别加在含有5(v/v)%胎牛血清的Eagle氏MEM培养基中,在置于佩特里培养皿中的盖玻璃上37℃培养4天。对于由培养上述各克隆而产生的蛋白质,均以间接荧光抗体技术使用步骤2中所述的特异性抗血清检测NANBV抗原性。结果发现G418抗性细胞克隆所产生的蛋白质可与用参考实施例1中制得的NANBV相关抗原免疫之豚鼠的所有抗血清发生反应(见表6)。
表6
以荧光抗体技术检测人或黑猩猩肝细胞转化体中产生的
NANBV相关抗原
细胞 NANB肝类
提取物 病人的血清 豚鼠抗血清
收集的 急性 慢性 抗- 抗- 抗-
提取物 血清 核心 NS3 NS5
来源于人肝细胞的
HL-A1 + + + + + +
HL-A2 + + + + + +
正常chang Liver - - - - - -
来源于黑猩猩肝细胞的
CL-B11 + + + + + +
CL-B14 + + + + + +
正常
Chimp Liver - - - - - -
这一事实说明已经表达出了复盖核心抗原编码区到NS5编码区的NANBV基因的完整编码区。
步骤4(对由人肝细胞和黑猩猩肝细胞衍生之转化细胞克隆HL-A1和C-B11产生的NANBV相关抗原进行蔗糖密度梯度离心)
按步骤3所述的相同方法,将克隆HL-A1和CL-B11分别在直径为9cm的佩特里培养皿上于CO2保温箱中37℃培养4天。用橡胶淀帚刮除细胞并用培养液将其合并在一起,在20KHZ(200W)条件下超声处理2分钟,并以5000xg转速于4℃下离心15分钟。将所得到的上清液再以48000xg转速在4℃下离心14小时,得到沉淀物。将沉淀物悬浮于1ml M/75 PBS中,并超声处理2分钟,再以160000xg于4℃下进行蔗糖密度梯度离心,然后分级分离。对每部分进行SDS-聚丙烯酰胺电泳,并以步骤2中所述的相同方法进行Westem印迹分析,以检查核心抗原和包膜抗原。结果在40(w/v)%至50(w/v)%蔗糖密度处检出两种抗原,表明已得到NANB病毒颗粒。
实施例2
步骤1(构建能够在酵母中表达NANBV基因组cDNA之完整编码区的质粒并制备转化体酵母)
按照实施例1(部分2)步骤1所述的相同方法用XbaⅠ消化实施例1(部分2)步骤1制得的质粒pORF24,得到约9kb的NANBV cDNA片段。将0.5μg该cDNA片段溶解于含有67mM Tris·HCL(PH8.8)、6.7mM氯化镁、16.6mM硫酸铵、10mM 2-ME、6.7mM EDTA-2Na、0.02(w/v)%牛血清白蛋白和0.3mM dNTP并加有2到5单位T4DNA聚合酶(Takara shuzo Co.,Ltd.,Japan)的T4DNA聚合酶溶液中,将所得混合物在37℃下保温60分钟,以使该片段的两个末端变成平头。然后,用T4DNA连接酶在其上连接XhoⅠ人工接头(CCTCGAGG)。具体地说,将0.3μg DNA溶于20μl含有500mM Tris-HCL(PH7.5),100mM氯化镁,100mM DTT和10mM ATP的10x连接溶液中。向该混合液中加入300至400单位T4DNA连接酶(Takera Shuzo Co.,Ltd.,Japan)并加入一定量的蒸馏水使总体积为210μl,然后在14℃下保温18小时。将如此制备的cDNA片段插入到可用于酵母YEp133pCT(美国专利NO.4,810,492中所述)中之表达载体的XhoⅠ位点上,得到表达质粒pYHC5。以碱性阳离子方法(Ito,H.et al,J.Bacteriol.,153:163-168,1983)用该表达质粒pYHC5转化啤酒酵母(ATCC NO.44772),得到转化体酵母YHC5-1。对这种转化体进行设计以便当培养基中缺乏磷酸盐离子时,可以激活抑制性酸性磷酸酶基因以引起连接到其下游的NABV cDNA的转录,从而产生NANBV相关抗原。
步骤2(由酵母产生NANBV相关抗原并使其特征化)
将步骤1中得到的转化体酵母YHC5-1接种到经向含有1.5g/lh磷酸二氢钾的完全合成培养基Burkholder氏培养基(参见Barkholder.P.R.et al,Am.J.Botang,30,206-211,1943)中各加入20μg/ml尿嘧啶、L-色氨酸、和L-组氨酸而制备的100ml培养基中。在30℃下振荡培养已接种的培养基24小时。用生理盐水洗培养的酵母,并将其接种到除用1.5g/l氯化钾代替磷酸二氢钾外其他均与上述培养基相同的1000ml新鲜培养基中。在30℃下培养接种培养基24小时,并收集所得到的细胞。将收集的细胞悬浮于M/75 PBS中并向其中加入玻璃珠(直径:0.45-0.55mm),使悬浮液经过珠搅拌器(美国,Biospec Products生产和出售)处理,以破坏细胞,然后以10000xg于40℃下离心10分钟得到上清液。按照实施例1(部分Ⅱ)步骤2中所述的相同方法对如此得到上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析,从检查是否产生了NANB相关抗原。结果发现,转化体酵母YHC5-1的提取物可与对核心抗原、包膜抗原、NS3蛋白和NS5蛋白特异性的所有抗体发生反应。这一事实表明已经表达出了以核心抗原到NS5区的NANBV基因的完整编码区(见表7)。
表7
转化体酵母YHC5-1产生的蛋白质与NANBV相关抗体的反应活性
NANB肝炎病人血清 豚鼠血清
细胞提取物 收集的血清 急性 慢性 抗-核心 抗-NS3 抗-NS5
YHC5-1 +* + + + + +
正常啤酒酵母 - - - - - -
*用Western印迹分析法测定的反应活性
再以实施例1(部分Ⅱ)步骤4中所述的相同方法对细胞提取物进行蔗糖密度离心。结果在40(w/v)%到50(w/v)%蔗糖密度部分中检查出了核心抗原和包膜抗原,表明已经得到了NANBV颗粒。
实施例3
步骤1(构建要可引入到牛痘病毒中的质粒)
用限制酶EcoRⅠ消化质粒pUVI(Falko G.Falkner,Sekhar Chakrabarti and BernardMoss;Nucleic Acid Res.,15(17),7192,1987)并进行苯酚提取和乙醇沉淀,得到DNA。按照参考实施例1中所述的相同方法,将0.5μg该DNA溶解于T4DNA聚合酶溶液中,加入2到5单位T4DNA聚合酶(日本Takara Shuzo Co.,Ltd.,生产和出售),之后在37℃下保温60分钟,以使两个末端变成平头。另外,通过一种方法得到带有可编码NANBV蛋白的NANBV基因完整核苷酸顺序的DNA片段,在该方法中,用XbaⅠ或用XbaⅠ和EcoRⅠ消化实施例1(部分Ⅱ)步骤1中所述的质粒pORF-24,得到大约9kb的DNA片段或6.4kb的DNA片段,用T4DNA聚合酶处理所得到的DNA片段,以使两末端变成平头。以参考实施例1所述的相同方法将0.5μg如此得到的来源于pUVI的DNA和0.5μg来源于pORF-24的DNA溶解于21μl 10x连接溶液中,并向其中加入300至400单位T4DNA连接酶(日本Takara Shuzo Co.,Lta.,生产和出售)和一定量的蒸馏水,使总体积达到210μl,然后在14℃保温12至18小时。从而使来源于NANBV的cDNA连接到位于启动于下游的pUV1 EcoRⅠ位点上。对连接反应混合液进行苯酚提取,并对含水层进行乙醇沉淀以收集DNA。按实施例1(部分1)步骤6中所述的氯化钙方法用DNA转化大肠杆菌菌株JM109,得到分别带有约9kb之NANBV cDNA片段的质粒克隆pXX-49和pXX-51。另外,还得到具有下约6.4kb之NABV cDNA片段和缺乏NANBV之NS5区域的质粒pXE-39。结果如图5所示。
参考实施例4
(培养牛痘病毒WR株)
用常规方法培养牛痘病毒WK株。具体地说,在直径6cM的佩特里培养皿中培养单层培养细胞[如来源于小鼠的胸苷激酶(TK)缺乏性细胞系L-M(TK-)(ATCC CCL-1.3,Dainippon pharmaceutical Co.,Ltd.,Japan),来源于猿肾的Vero细胞和成人肝细胞Chang Liver(ATCC CCL-13,Dainippon Pharma ceutical Co.,Ltd.,Japan)]。用0.5ml牛痘病毒接种所培养的细胞,并于37℃静置1至2小时,然后去除病毒液。之后于37℃下培养含有5(v/v)%胎牛血清和细胞的5mlEagle′s MEM培养基(日本Missui制药有限公司生产和出售)24到48小时,直至出现满意的细胞病变效应。然后,收集病毒培养液或感染细胞,并将其悬浮于MEM中,以20KHZ(200W)超声处理2分钟,得到病毒液。
参考实施例5(用噬斑方法检测牛痘病毒的感染性)
按常规步骤实施噬斑方法。具体地说,用参考实施例4中所得到的已经用M-199(美国Sigma生产和出售)稀释10倍的病毒液,以0.1ml/皿的量在6cm直径佩特里培养皿中接种参考实施例4中所述的细胞培养物,并于37℃下静置2小时,使病毒吸附到细胞上。然后,去除接种物液体,并以5ml/皿的量加入一种含有琼脂的培养基(向M-199中加入3(v/v)%胎牛血清,0.14(w/v)%NaHCO3和0.8(w/v)%琼脂制成)。琼脂于室温下凝固之后,37℃培养24小时。然后,以2.5ml/皿的量铺敷一种通过向上述琼脂中加入大约0.006(w/v)%的中性红(日本Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,生产和出售)而制备的培养基,再于37℃下进一步培养之。计数所得的噬斑数以确定其感染性。
步骤2(制备重组牛痘病毒)
在用于组织培养的直径9cm佩特里培养皿(美国.Falcon生产和出售)中培养Vero细胞24小时。用牛痘病毒WR株(ATCC VR-119)以0.05MOI值(感染多重性)接种培养的Vero细胞,并于37℃下静置2小时以使病毒吸附到细胞上。经过这段时间之后,除去病毒液并用MEM洗细胞两次。然后,以磷酸钙方法(Graham,F.L.,Van der Eb,A.J.:Virolgy,52,456-467,1973)对实施例3步骤1中所得到的1μg和5μg质粒DNAs分别进行DNA磷酸钙沉淀,每种质粒DNA得到1ml的DNA-磷酸钙沉淀溶液。将如此得到的各1ml的DNA-磷酸钙沉淀溶液加到上面得到的病毒感染之细胞中,并于室温下静置30分钟。然后,加入15ml参考实施例4中所述的病毒培养基,并于37℃下将所得混合物保温3.5小时。然后除去病毒培养基,并加入15ml的新鲜病毒培养基,于37℃下培养48小时。之后将细胞培养物冻融3次,得到一种病毒悬浮液。以参考实施例5中的相同方法,用该病毒悬浮液接种在培养用6cm直径佩特里培养皿中培养的L-M(TK-)细胞。病毒被吸附到细胞上之后,以5ml/皿的量加入一种含有25μg/ml5-溴-2′-脱氧尿苷(BUdR,美国Sigma生产和出售)的琼脂培养基,然后于37℃下培养8小时,之后,再以2.5ml/皿的量铺敷一种含有25μg/mlBUdR和25μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal,Takara Shuzo Co.,Ltd.,Japan)的琼脂培养基,并于37℃下继续培养2天。与铺敷的琼脂培养基一起收集已经出现的兰色噬斑,并将其悬浮于0.5ml的M-199中,再以上述相同的方法将上清接种到L-M(TK-)细胞中,然后经3次噬斑克隆过程纯化该克隆。如此得到的牛痘病毒是用带有NANBV cDNA的质粒载体经重组而转化的重组体牛痘病毒,其具有β-半乳糖苷酶基因且缺乏胸苷激酶。结果如表8中所示。
表8
重组牛痘病毒的特征:
重组牛痘病毒克隆 用于重组 NANBV 胸苷 β-半乳糖酶
的质粒 基因组 激酶 活性
(kb)活性
vUV17 pUV1 X X O
vUV27 pUV1 X X O
VXE17 pXD39 O(6.4) X O
VXE28 pXE39 O(6.4) X O
vXX19 pXX49 O(9.0) X O
vXX29 pXX51 O(9.0) X O
vXX39 pXX51 O(9.0) X O
注)O:已观察到
X:未观察到
步骤3(以荧光抗体方法检测和确定由重组牛痘病毒产生的NANBV相关抗原)
通过间接荧光抗体技术检测和确定由重组牛痘病毒产生的抗原。在盖玻璃上培养L-M(TK-)细胞,并用已经稀释10倍的重组牛痘病毒接种之,再以参考实施例4中所述的方法培养该细胞。培养48小时后,取出盖玻璃,并用M/75磷酸盐缓冲盐水(M/75PBS)(PH7.4)洗三次,然后再用蒸馏水洗一次并进行空气干燥。然后,用丙酮于-20℃下将该细胞固定5分钟。按传统方法用核心抗原和非结构蛋白抗原NS-3和NS-5免疫BALD/C小鼠,并将从该被免疫BALD/C小鼠中分离的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤,从该杂交瘤中得到可以用作第一抗体的抗NANBV小鼠单克隆抗体。使用将一种16聚体聚肽与牛血清白蛋白结合所产生的抗原来制备对衣壳蛋白有特异性的单克隆抗体,其中所说的16聚体聚肽包含由衣壳基因推断的氨基酸顺序(N末端方向的第1至第16位氨基酸)。按照常规方法进行间接荧光抗体试验。也就是说,于37℃下使丙酮固定的感染细胞与第一抗体反应1小时,并用M/75 PBS洗三次。然后,使该细胞与FITC(荧光染料)标记的抗人或小鼠IgG抗体(德国Cappel Co.,Ltd.,生产和出售)于37℃下反应小时,并用M/75 PBS洗三次后用荧光显微镜观察。结果如表9所示。
表9(1)
用荧光抗体技术检测由重组牛痘病毒感染之细胞所产生的NANBV相关抗原。
重组牛痘 健康人血清 NANB肝炎病人血清
病毒 #6 #8 #9 收集的血清 收集的血清 急性 慢性
#II-1 #PS-1
vUV17 - - - - - - -
vUV27 - - - - - - -
vXE17 - - - + + + +
vXE18 - - - + + + +
vXX19 - - - + + + +
vXX29 - - - + + + +
vXX39 - - - + + + +
表9(2)(续)
重组牛痘病毒 单克隆抗体
抗-核心 抗-EnV 抗-NS3 抗-NS5
#11 #755 #74-1 #8905
vUV17 - - - -
vUV27 - - - -
vXE17 + + + -
vXE28 + + + -
vXX19 + + + +
vXX29 + + + +
vXX39 + + + +
缺乏可编码NANBV NS5区之部分核苷酸顺序的重组牛痘病毒克隆VXE17和VXE28,以及带有编码NANBV蛋白之完整ORF的克隆VXX19,VXX29和VXX39都与NANB肝类病人的血清发生反应而不与任何健康人的血清发生反应。如果使用小鼠单克隆抗体,所有克隆VXE7和VXE28以及克隆VXX19,VXX29和VXX39与抗核心抗原单克隆抗体,抗衣壳抗原单克隆抗体和抗NS3单克隆抗体发生反应。就抗NS5单克隆抗体来说,缺少NANBV之NS5区的VXE17和VXE28均不与之发生反应,但是VXX19、VXX29和VXX39与之发生反应。这一事实表明,使用重组牛痘病毒已经较好地产生了所需要的表达产物,并且尤其说明,利用克隆VXX19、VXX29和VXX39,已经表达了从位于NANBV蛋白N末端侧之核心抗原到位于其C末端侧之NS5蛋白的整个区域。
步骤4(用蔗糖密度梯度离心法分析重组牛痘病毒感染之细胞培养物的上清液)
如参考实施例4中所述,将1.0ml(1.2×107PFU)重组牛痘病毒VXX39(1.2×107PFU/ml)接种到人肝细胞Chang Liver的细胞培养物中,使之在37℃下经2小时吸附到细胞上,然后只用M-199于37℃下培养3天。将200ml培养物上清以3000xg离心5分钟得到上清液,再以48000xg于40℃下离心该上清液14小时,得到沉淀物。将沉淀物悬浮于2ml的M/75PBS中,并以20KHZ(200W)超声处理2分钟,于40℃下以160,000xg对所得产物进行蔗糖密度梯度离心15小时[其中蔗糖密度变化为20(V/v)%到60(w/v)%],从而得到各部分。每一部分与一种含有终浓度为20(w/v)%甘油,100mM(PH6.8)Tris.HCL,2(w/v)%SDS,2(v/v)%2-巯基乙醇和0.02(w/v)%BPB的样品缓冲液混合,并于100℃下加热5分钟,然后进行0.1(w/v)%SDS-12.5聚丙烯酰胺凝胶电泳,以使蛋白质彼此分离开。然后用转印迹装置(日本Nippon Eido有限公司生产和出售)将凝胶上经电泳分离开的蛋白质转移到Hybond-ECL膜(Amershan,England生产和出售)上。将Hybond-ECL膜浸泡于由10mMTris.HCL(PH7.2)、15mM Nacl、0.05(w/v)%吐温-20(T-TBS)和5(w/v)%脱脂牛奶组成的溶液中,于室温下保温1小时,以封闭该膜。然后,使已经用含1%脱脂牛奶的T-TBS缓冲液稀释500-倍的抗核心抗原单克隆抗体(克隆29)与Hybond-ECL膜在37℃下反应1小时,并用新鲜的上述含有1%脱脂牛奶的T-TBS缓冲液充分冲洗该膜2次。然后,使该膜与生物素标记的抗小鼠IgG(由德国Cappel有限公司生产和出售;已稀释500倍)在室温下反应1小时。冲洗该Hybond-ECL膜2次,并用HRPO-标记的链球菌抗生物素蛋白,Amersham,England生产和出售;已稀释500倍)与该膜在室温下反应1小时,用T-TBS充分冲洗4次。利用ECL Western印迹检测系统(Amersham,England生产和出售)使该膜发生化学发光反应。用Saran wrap包裹该膜并与X线胶片接触30秒,之后冲洗该胶片。结果在蔗糖浓度44至58(w/v)%处观察到NANBV核心抗原和衣壳抗原活性(如图7中所示),这一事实表明已经得到了NANB病毒颗粒。
步骤5(在电子显微镜下观察重组牛痘病毒感染的细胞)
以参考实施4中所述的相同方法在人肝细胞上培养重组牛痘病毒克隆VXX39和VUX17(后者不具有NANBV基因组)2天。用橡胶淀帚收集感染的细胞。以常规方法将收集的细胞包埋在环氧树脂(日本Nissin EM有限公司生产和出售)中,并将其切成超薄切片样品。用2%乙酸铀和枸橼酸铅对样品进行铀-铅双染色,并在电子显微镜下检查之。如图8所示。结果在用VXX39感染的细胞中观察到了病毒颗粒,但是在用VUV17感染的细胞中没有观察到颗粒,并且胞质中没有NANBV基因组。这些结果与步骤4的结果一起说明VXX39已产生了NANBV颗粒。
本申请中涉及的大肠杆菌BK102、BK106、BK112、BK146和BK147已于1991年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏号依次为:CCTCC No.M91044、CCTCC No.M91045、CCTCC No.M91046、CCTCC No.M91047和CCTCC No.M91048。
Claims (21)
1、含有至少一个选自非甲非乙型肝炎病毒的核心抗原、基质抗原和包膜抗原之抗原的分离的非A、非B型肝炎病毒颗粒。
2、根据权利要求1的非A非B型肝炎病毒颗粒,其中所述的核心抗原、基质抗原和包膜抗原分别由图2(1)到图2(16)中所示非A非B型肝炎病毒从第1至第9416位完整核苷酸顺序中的第333到第677位核苷酸顺序,第678到905位核苷酸顺序和第906到1499位核苷酸顺序编码。
3、根据权利要求1或2的非A非B型肝炎病毒颗粒,其具有与图2(1)到图2(16)中所示核苷酸顺序的至少一部分相应的核糖核酸。
4、生产分离之非A非B型肝炎病毒颗粒的方法,其包括:
(a)提供至多10个不同的各含有至少1000核苷酸的cDNA克隆并从至少有1000核苷酸的非A非B型肝炎病毒基因组的RNA片段制备之,所述的至多10个不同的cDNA克隆分别包括复盖在图2(1)到图2(16)所示的非A非B型肝炎病毒从第1到第9416位核苷酸完整区域中的至少从第333到第5177位核苷酸区域的克隆化cDNA片段;
(b)为了分别有预定的核苷酸顺序通过切割从所述cDNA中切取分别有预定之核苷酸顺序的cDNA片段,以便当预定的核苷酸顺序被按顺序安排时,所得的核苷酸顺序至少有一段与第333到第5177位核苷酸顺序区域相一致的区域。
(c)按顺序连接具有所说预定核苷酸序列之所说切取的cDNA片段,以构建至少含有图2(1)到图2(16)所示的非甲非乙肝炎病毒从第1到第9416位全部核苷酸顺序中的第333到第5177位核苷酸顺序的第一脱氧核苷酸。
(d)把选自所说的第一脱氧核糖核酸和按遗传密码的简异性经取代所说的第一脱氧核糖核酸中的至少一个核苷酸所得到的第二脱氧核糖核的至少一个脱氧核糖核酸导入到选自质粒和动物病毒基因的可复制的表达型载体中,当所说的可复制表达型载体是质粒时可得到含有所说质粒和导入其中之至少一个脱氧核糖核酸导入其中的可复制重组DNA,或当所说的可复制表达型载体是动物病毒基因则得到含有所说之动物病毒及所说至少一个脱氧核糖核酸导入其中的重组病毒。
(e)当用在步骤(d)中所说的可复制表达载体是质粒时,用所说的重组DNA转染原核或真核细胞,由此形成一个转化体,然后从原核或真核细胞培养的亲代细胞中筛选所说的转化体。
(f)培养步骤(2)中从原核或真核细胞获得的转化体,以产生一个非甲非乙肝炎病毒颗粒或者培养步骤(d)中从真核细胞得到的重组病毒以与动物病毒一起产生非A非B型肝炎病毒颗粒,并且
(g)分离所说的非A非B型肝炎病毒颗粒。
5、根据权利要求4的方法,其中所说的第一脱氧核糖核酸含有第333到第5918位核苷酸的核苷酸顺序。
6、根据权利要求4的方法,其中所说的第一脱氧核糖核酸含有第333到第6371位核苷酸的核苷酸顺序。
7、根据权利要求4的方法,其中所说的第一脱氧核糖核酸含有第333到第9362位核苷酸的核苷酸顺序。
8、根据权利要求4的方法,其中所说的第一脱氧核糖核酸含有第1到第9416位核苷酸的核苷酸顺序。
9、重组体,其含有一个选自质粒和动物病毒基因的可复制的表达型载体和一个脱氧核糖核酸,脱氧核糖核酸选自至少含有图2(1)到图2(16)所示非A非B肝炎病毒第1到第9416位核苷酸完整核苷酸顺序中第333到第5177位核苷酸的第一脱氧核糖核酸顺序和按遗传密码的简异性取代所说的第一核苷酸顺序中至少一个核苷酸所得到的第二核苷酸顺序。
10、根据权利要求9的重组体,其中所述的第一核苷酸顺序含有第333玻第5918位核苷酸的核苷酸顺序。
11、根据权利要求9的重组体,其中所述的第一核苷酸顺序含有第333到第6371位核苷酸的核苷酸顺序。
12、根据权利要求9的重组体,其中所述的第一核苷酸顺序含有第333到第9362位核苷酸的核苷酸顺序。
13、根据权利要求9的重组体,其中所述的第一核苷酸顺序含有第333到第9416位核苷酸的核苷酸顺序。
14、通过抗原-抗体反应检测非A非B型肝炎的诊断试剂,其含有有效量的用于抗原-抗体反应的根据权利要求1或2的非A非B型肝炎病毒颗粒。
15、非A非B肝炎疫苗,其含有有效量的根据权利要求1或2的非A非B肝炎病毒颗粒,及至少一种药物学上可接受的载体,稀释剂或赋形剂。
16、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute),登记号为FERMBP-3384的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK102(CCTCC No.M91044)。
17、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute),登记号为FERMBP-3385的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK106(CCTCC No.M91045)。
18、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute),登记号为FERMBP-3386的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK112(CCTCC No.M91046)。
19、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute),登记号为FERMBP-3387的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK146(CCTCC No.M91047)。
20、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Research Institute),登记号为FERMBP-3388的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK147(CCTCC No.M91048)。
21、寄存在日本发酵研究所(Fermentation Re-search Lmsitute),登记号为FERMBP-3243的携带非A非B型肝炎病毒基因组cDNA的大肠杆菌菌株BK157。
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