JPH05130874A - ヒトＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ、そのクローン及びこれらの利用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト C 型肝炎ウイルスの cDNA、そのクロー
ン及びこれらの利用法を提供する。 【構成】 確定診断された NANB 患者の肝臓組織由来の
RNA を鋳型として cDNAライブラリーを作製し、このラ
イブラリーを用い且つ既知の HCV 遺伝子をコードする
塩基配列の一部をプローブとして cDNA クローニングを
行い当該プローブと反応する幾つかのクローンを得、反
応したクローンをプローブとして更にクローニングを行
い、反応した複数個の塩基配列を決定し、最終的にはこ
れらのポジティブクローンを継ぎ合わせて 1 個の HCV
クローンとして確立する。このクローンは、配列表に示
される通り、約 9500 個のヌクレオチドを有している。 【効果】 この HCV クローンの塩基配列及びアミノ酸
配列を基に、プローブ及び抗原物質を作製し、これを用
いることよりヒト C 型肝炎の診断、HCV の検出、ワク
チンの開発を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト C 型肝炎ウイルス
(以下「HCV」と称する) の cDNA、そのクローン及びこ
れらの利用法に係る。

【０００２】

【従来の技術】ヒト C 型肝炎は輸血に起因する肝炎の
90 -95% を占めており、治療法も未だ確立するに至って
いないのでその診断法、治療薬及び予防用のワクチンの
開発が強く要望されている。

【０００３】近年に至り、米国のカイロン社がヒト非 A
非 B 型肝炎 (以下「NANB」と称する) ウイルスを感染
させたチンパンジーの肝臓由来の cDNA をクローン化
し、これをベクターλgt11 に組み込んだ大腸菌で発現
させた処、その産物が NANB 患者血清と反応することを
見い出した。最終的にはこれが約 9000 個のヌクレオチ
ドを有する 1 本鎖 RNA ウイルスであって、フラビウイ
ルスに近似するウイルスであることを発見し、これをHC
V と命名すると共に、その内の約 7000 個のヌクレオチ
ドからなる cDNA塩基配列を公表した [EP-03 18 216
(A)]。一方、日本人の NANB 患者から分離された HCV
の塩基配列については、これまで岡本等 ["The Japan j
ounal of Experimental Medicine", 60, 167 - 177(199
0)]、加藤等 ["Proceedings of the National Academy
of Sciences of theU.S.A.", 87, 9524 - 9528 (199
0)]、榎本等 ("Biochemical and biophysicalresearch
communications", 170, 1021- 1025 (1990)] の報告が
ある。これらの公表された配列を比較すると、塩基及び
アミノ酸レベルにおいてかなりの多様性のあることが認
められる。

【０００４】上記のカイロン社は、HCV 遺伝子の一部を
用いて酵母で発現させたポリペプチドを抗原として、そ
れに反応するＮＡＮＢ患者血清中の抗体を検出する診断
キットを開発した。このキットによれば、疫学的には約
70% の確率で血清中の抗体を検出できる旨発表されて
いるが、未だその検出率において充分とは云えない。

【０００５】以上の如く、HCV の塩基配列に関しては充
分な情報がないため、C 型肝炎に対する的確かつ正確な
診断法、治療法、輸血用血液の無害化処理及び予防用ワ
クチン開発も未だ確立するに至っていないのが実情であ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】これまで、HCV 遺伝子
の構造については、上記のように米国のカイロン社がNA
NB 感染チンパンジーの肝臓から、又岡本等、加藤等及
び榎本等が日本人のNANB 患者の血漿から HCV を分離し
て解析している。しかしながら、カイロン社のものはチ
ンパンジー由来のものであり、岡本等及び榎本等の報告
では一部分の配列しか明らかにされておらず、更に加藤
等の報告はほぼ全長をカバーする約9500 個のヌクレオ
チドからなるものではあるが、NANB 患者数人のプール
血清から RNA を抽出してcDNA を作製しており、単一の
クローンを得ているわけではない。従って、HCV はその
多様性故に単一のクローン間において正確に比較検討す
る必要があるが、現在迄このような研究に関する成果は
公表されていない。

【０００７】HCV の塩基配列に関する情報不足及び HCV
遺伝子に多様性が存在することを考慮に入れると、C
型肝炎に対する的確かつ正確な診断法、治療法、輸血用
血液の無害化処理及び予防用ワクチンを開発するために
は、HCV の構造に関する更に多くの情報が必要とされ
る。従って本発明の課題は、これまで知られている HCV
とは異なる新たな HCV 株を見い出すことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者等は、
先ず確定診断された 1 名の NANB 患者由来の肝臓組織
及び血清からＲＮＡを分離精製し、この精製ＲＮＡを鋳
型として既知の方法で cDNA ライブラリを作製した。こ
の cDNA ライブラリを基とし、既に金子等により明らか
にされている HCV 遺伝子をコードする塩基配列の一部
(特開平1 - 344876) をプローブとして cDNA クローニ
ングを行い、幾つかのクローンを得、最終的にはこれら
のクローンを継ぎ合わせて１個の HCV クローンとして
確立した。この HCV クローンは後記の配列表に示され
る通りの塩基配列及びアミノ酸配列を有していた。

【０００９】このクローンは、ヒトの HCV の全塩基配
列を含むものであり、これまでに報告されているカイロ
ン社の HCV と比較する場合に塩基配列に関しては 22%
以上、アミノ酸配列に関しては 16% 以上異なっている
ので、従来のものとは明らかに異なる HCV クローン株
であることが判明した。

【００１０】尚、二本鎖 DNA 断片の組み込まれるべき
ベクターに発現ベクターを選択して、本発明による遺伝
子を含む組換えベクターを作製し、このベクターを大腸
菌、酵母等の微生物や動物細胞に取り込ませ、該微生物
または動物細胞を培養すれば、HCV に起因する抗原物質
を大量に生産することができる。この産物を用いて患者
血液中に存在する抗 HCV 抗体量の測定が可能になり、H
CV に起因する肝炎、癌の進行程度、回復の程度を診断
することが可能となり、又キャリヤーの診断も可能とな
る。更に上記の抗原物質を用い、継代免疫等の手法によ
り弱毒化させることによりワクチン開発の途が開かれ、
また上記の産物を動物に免疫させることにより、抗体性
物質を産生させ、これを取得すれば治療薬や輸血用血液
の無害化処理剤を提供することができ、該抗体性物質を
モノクローン又はポリクローン化すれば治療薬としての
安定供給が可能となる。

【００１１】

【実施例】次に、実施例に関連して本発明を更に詳細に
且つ具体的に説明する。

【００１２】実施例 1 (A) NANB 患者からの RNA の分離精製と相補 DNAの合成 NANB 患者 (1 名) からの RNA の分離精製は特開平 1 -
163715 公報に記載の方法に従って行われた。これによ
り得られた精製 RNA に対して、ランダムヘキサマーを
プライマーとして逆転写酵素にて cDNA を合成した。更
に T4 DNA ポリメラーゼにより二本鎖 cDNA の合成を行
い、得られた DNA断片の両端を平滑化し、EcoRI リンカ
ーを付加し、EcoRI により消化処理した後に精製するこ
とにより所望の DNA 断片を得た。

【００１３】(B) cDNA ライブラリの作製とクローニン
グ ベクターとしてファージベクターである λgt11 を選択
し、これを EcoRI にて切断し、上記 (A) にて得られ且
つ EcoRI 認識部位を両端に有する DNA 断片を挿入し、
in vitro パッケージング法により cDNA ライブラリー
を作製した。このcDNA ライブラリより、金子等によっ
て明らかにされている HCV 遺伝子をコードする塩基配
列の一部であり、約 240 個のヌクレオチドからなる DN
A (特開平 1 - 344876) をプローブとしてクローニング
を行い、このプローブと反応する幾つかのクローンを得
た。反応したこれらのクローンをプローブとして更にク
ローニングを重ねて、最終的には 13 個のクローンを選
択した。これらのクローンの塩基配列につきダイデオキ
シ法を用いて決定し、配列の一致する部分を重ね合わせ
ることにより 1 個のクローンとして確立した。その結
果、このクローンは約9500 個のヌクレオチドからなる
ものであることが明らかとなった。このクローンの全塩
基配列並びにこの塩基配列から翻訳可能なアミノ酸配列
は、後記の配列表に示されている。

【００１４】実施例 2 (A) HCV 由来 DNA クローンの 5'-非翻訳領域を用い
る、ヒト C 型肝炎の遺伝子的診断法 NANB 患者と推定される患者の血清から、グアニジンチ
オシアネートを用いるチルグーイン等の方法 ["Biochem
istry", 18, 5294 - 5299 (1979)] により全 RNA を抽
出した。この RNA に関して、配列表に示した配列の一
部 (配列表における塩基番号の 7 番目から 26 番目迄
の配列と 310 番目から 334 番目迄の相補鎖配列) をプ
ライマーとして用い、逆転写酵素の存在下に 42℃ で 1
時間インキュベーションすることにより相補 DNA を合
成した。この相補 DNA を用い、金子等の方法 ["Jounal
of Clinical Microbiology", 27, 1930 - 1933 (198
9)]に従って PCR [ポリメラーゼ連鎖反応 (Polymerase
chain reaction)] を行った後に電気泳動させた。この
電気泳動の結果は図１に示されており、予想された約 3
10 塩基対長さのバンドの存在が確認された。このこと
は被験血清を提供した患者がヒト C型肝炎感患者である
ことを意味している。何故ならば、NANB 患者の血清由
来の RNAを用いた場合には上記のように予想された塩基
対長さ位置に PCR 産物由来のバンドが検出されるが、
健常人の血清由来の RNA を用いた場合には当該バンド
は検出されなかったからである。

【００１５】

【発明の効果】本発明によれば、HCV 遺伝子をコードす
る塩基配列を有する一本鎖 DNA 及び該一本鎖ＤＮＡと
その相補一本鎖 DNAとからなる二本鎖 DNA が提供され
る。上記の一本鎖 DNA は、その一部をプローブとして
用いることにより遺伝子レベルでのヒト C 型肝炎の診
断に利用することができ、又二本鎖 DNA は制限酵素に
より切断することにより適宜の鎖長を有するものとなし
て構造と生理活性との相関究明等に利用することができ
る。

【００１６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９４０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Hepatitis C Virus 単離クローン名：ＳＫ−１ 組織の種類：肝臓細胞 GGCGACACTC CACCATAGAT CACTCCCCTG TGAGGAACTG CTGTCTTCAC 50 GACGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTAGTAT GACTGTCGTG CAGCCTGCAG 100 GACCCCCCCT CCCGGGAGAG CCATAGTGGT CTGCGGAACC GGTGAGTACA 150 CCGGAATTGC CAGGACGACC GGGTCCTTTC TTGGATCACC CCGCTCAATG 200 CCTGGAGATT TGGGCATGCC CCCGCGAGAC TGCTAGCCGA GTAGTGTTGG 250 GTCGCGAAAG GCCTTGTGGT ACTGCCTGAT AGGGTGCTTG CGAGTGCCCC 300 GGGAGGTCTC GTAGACCGTG CATC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCT CAA 348 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln 1 5 AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC 396 Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe 10 15 20 CCG GGC GGT GGC CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 444 Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 25 30 35 40 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG 492 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 45 50 55 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG 540 Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu 60 65 70 GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CCC TAT GGC AAT 588 Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Pro Tyr Gly Asn 75 80 85 GAG GGT CTG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG 636 Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg 90 95 100 CCT AGT TGG GGC CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT 684 Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 105 110 115 120 AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC 732 Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr 125 130 135 ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGA GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG 780 Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala 140 145 150 CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAC GCA ACA GGG AAT 828 His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 155 160 165 CTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT CTG CTG TCT TGT 876 Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 170 175 180 TTG ACC ATC CCA GCA TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG TTG 924 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Leu 185 190 195 200 TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA 972 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala 205 210 215 GCG GAC TTG ATC ATG CAC ACC CCT GGG TGC GTG CCC TGC GTC CTG GAG 1020 Ala Asp Leu Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Leu Glu 220 225 230 GGA AAC TCC TCC CGT TGC TGG GTA GCG CTC ACT CTC ACG CTC GCG GCC 1068 Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Leu Thr Leu Ala Ala 235 240 245 AGG AAC AGC AGC ATC CCC ACT ACG ACA ATA CGA CGT CAC GTC GAC TTG 1116 Arg Asn Ser Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 250 255 260 CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 1164 Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 265 270 275 280 TGC GGA TCT GTT TTC CTC GTC TCC CAG CTA TTC ACC TTT TCA CCT CGC 1212 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg 285 290 295 CGG TAT GAG ACG GTA CAA GAC TGC AAT TGC TCA CTC TAT TCC GGC CAC 1260 Arg Tyr Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Ser Gly His 300 305 310 GTA TCA GGT CAC CGC ATG GCC TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC 1308 Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro 315 320 325 ACA ACA GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTC 1356 Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val 330 335 340 GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC TTG GCA GGC CTC GCC 1404 Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala 345 350 355 360 TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC TTG ATT GTG ATG CTA 1452 Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu 365 370 375 CTC TTT GCC GGC GTC GAC GGG AGA ACC CAA GTG ACG GGA GCA CAG GCA 1500 Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Arg Thr Gln Val Thr Gly Ala Gln Ala 380 385 390 GGC CAC ACC ACC AGT GGC CTT GCG TCC CTC TTC ACA CCA GGG CCG TCT 1548 Gly His Thr Thr Ser Gly Leu Ala Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser 395 400 405 CAG AAA ATC CAG CTT GTA AAC TCT AAC GGC AGT CGG CAC ATC AAC AGA 1596 Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Ser Asn Gly Ser Arg His Ile Asn Arg 410 415 420 ACT GCC CTG AGT TGC AAC GAC TCC CTC AAA ACT GGC TTC CTT GCC GCG 1644 Thr Ala Leu Ser Cys Asn Asp Ser Leu Lys Thr Gly Phe Leu Ala Ala 425 430 435 440 CTG TTC TAC ACA CAT AAG TTC AAC GCG GCT GGA TGC CCG GAG CGC ATG 1692 Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ala Ala Gly Cys Pro Glu Arg Met 445 450 455 GCC AGC TGC TGC TCT ATT GAC ACG TTC GAC CAA GGG TGG GGT CCC ATC 1740 Ala Ser Cys Cys Ser Ile Asp Thr Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile 460 465 470 ACC CAT GCT GAG TCT CGC AGC TCG GAC CAA AGG CCT TAC TGC TGG CAC 1788 Thr His Ala Glu Ser Arg Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His 475 480 485 TAC GCA CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGC GGT 1836 Tyr Ala Pro Gln Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu Gln Val Cys Gly 490 495 500 CCA GTG TAT TGT TTC ACC CCA AGC CCT GTT GTA GTG GGG ACG ACC GAC 1884 Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp 505 510 515 520 CGT TTC GGC GTC CCC ACG TAT AAC TGG GGG GAC AAT GAG ACG GAC GTG 1932 Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Asp Asn Glu Thr Asp Val 525 530 535 CTA CTC CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCG CAA GGA AAC TGG TTC GGC TGT 1980 Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys 540 545 550 ACA TGG ATG AAC AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACG TGC GGG GGC CCC CCG 2028 Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro 555 560 565 TGT AAT ATC GGG GGG GCC GGC AAC AAC ACC TTG ACC TGC CCC ACG GAT 2076 Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp 570 575 580 TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAG TGC GGC TCG GGG 2124 Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly 585 590 595 600 CCT TGG TTG ACA CCT AGG TGC ATG GTT GAC TAC CCA TAC AGA CTT TGG 2172 Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp 605 610 615 CAC TAC CCC TGC ACT TTC AAC TTT ACC ATC TTT AAG ATC AGG ATG TAT 2220 His Tyr Pro Cys Thr Phe Asn Phe Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr 620 625 630 GTG GGG GGT GTG GAG CAC AGG CTC AAC GCA GCG TGC AAC TGG ACT CGA 2268 Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg 635 640 645 GGA GAG CGT TGT AAC ATA GAG GAC AGG GAT AGG TCA GAG CTT AGC CCG 2316 Gly Glu Arg Cys Asn Ile Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro 650 655 660 CTG CTA CTG TCT ACA ACG GAG TGG CAG ATA CTA CCC TGT TCC TTT ACC 2364 Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr 665 670 675 680 ACC CTA CCA GCT CTG TCC ACT GGT TTG ATC CAC CTC CAT CAG AAC ATC 2412 Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile 685 690 695 GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC GGT GTA GGG TCA GCA GTT GTC TCC ATT 2460 Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Ile 700 705 710 GTG ATC AAA TGG GAG TAC GTT CTG CTG CTC TTC CTC CTC CTG GCG GAC 2508 Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp 715 720 725 GCG CGC GTC TGC GCC TGC TTA TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CAG GCT 2556 Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala 730 735 740 GAG GCC ACC TTA GAA AAC CTG GTG GTC CTC AAT TCT GCG TCC GTG GCC 2604 Glu Ala Thr Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ser Ala Ser Val Ala 745 750 755 760 GGA GCG CAT GGC ATC CTC TCA TTT CTT GTG TTC TTC TGT GCA GCC TGG 2652 Gly Ala His Gly Ile Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp 765 770 775 TAC ATC AAG GGC AGG CTG GTC CCT GGG GCG GCA TAT GCT TTA TAT GGC 2700 Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Leu Tyr Gly 780 785 790 GTG TGG CCG CTG CTC CTG CTC CTG TTG GCG TTA CCA CCA CGG GCA TAC 2748 Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr 795 800 805 GCC ATG GAC CGG GAG ATG GCC GCA TCG TGC GGA GGC GCG GTT TTC GTA 2796 Ala Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val 810 815 820 GGT CTA GCA CTC TTG ACC TTG TCA CCA CAC TAT AAA GCA TTC CTC GCC 2844 Leu Thr Leu Ser Gly Leu Ala Leu Pro His Tyr Lys Ala Phe Leu Ala 825 830 835 840 AGG CTC ATA TGG TGG TTA CAA TAT TTT ATC ACC AGG GCT GAG GCG TGC 2892 Arg Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala Cys 845 850 855 TTG CAA GTG TGG GTC CCC CCT CTC AAC GCA CGG GGG GGC CGC GAT GCC 2940 Leu Gln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Ala Arg Gly Gly Arg Asp Ala 860 865 870 ATC ATC CTC CTC ACG TGC GCG GTC CAC TCA GAG CTA ATC TTT GAC ATC 2988 Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala Val His Ser Glu Leu Ile Phe Asp Ile 875 880 885 ACC AAA ATT CTG CTC GCC ATA CTA GGA CCG CTC ATG GTG CTC CAG GCT 3036 Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala 890 895 900 GGC ATT ACT AGA GTG CCG TAC TTC GTG CGC GCT CAA GGG CTC ATA CGT 3084 Gly Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg 905 910 915 920 GCA TGC ATG TTG GTG CGG AAG GTC GCT GGG GGC CAT TAT GTC CAA ATG 3132 Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met 925 930 935 GCT CTC ATG AAG CTG GCC GCA CTG ACT GGG ACG TAC ATA TAT GAC CAT 3180 Ala Leu Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Asp His 940 945 950 CTT ACT CCG CTG CGG GAC TGG GAT CGG TCG GGC CTG CGA GAC CTT GTG 3228 Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Asp Arg Ser Gly Leu Arg Asp Leu Val 955 960 965 GTA GCG GTC GAG CCC GTC GTC TTC TCC GAC ATG GAG ACC AAG ATC ATC 3276 Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile 970 975 980 ACC TGG GGG GCG GAC ACA GCG GCG TGT GGG GAC ATC ATC TTG GGT CTG 3324 Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Leu 985 990 995 1000 CCC GTC TCC GCC CGA AGG GGG AAA GAG ATA CTT CTG GGA CCG GCC GAT 3372 Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Lys Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp 1005 1010 1015 TCA TTC AGA GAG CAG GGA CTC CGA CTC CTT GCG CCC ATC ACG GCC TAC 3420 Ser Phe Arg Glu Gln Gly Leu Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr 1020 1025 1030 TCC CAA CAG ACG CGG GGC CTA TTT GGC TGC ATC GTC ACT AGT CTC ACA 3468 Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Cys Ile Val Thr Ser Leu Thr 1035 1040 1045 GGT CGG GAC AAG AAC CAG GTC GAA GGG GAG GCT CAG GTG CTA TCC ACC 3516 Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Ala Gln Val Leu Ser Thr 1050 1055 1060 GCA ACG CAA TCT TTC TTG GCG ACC TGT GTC AAC GGC GTG TGT TGG ACT 3564 Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr 1065 1070 1075 1080 GTT TAC CAT GGC GCC GGC TCA AAG ACC CTA GCC GGC CCA AAG GGG CCA 3612 Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro 1085 1090 1095 ATC AAC CAA ATG TAC ACT AAT GTG GAT CAG GAC CTC GTC GGC TGG CAG 3660 Ile Asn Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln 1100 1105 1110 GCG CCC TCC GGG GCG GCT TCC TTG ACA CCG TGC ACC TAC GGC AGC TCG 3708 Ala Pro Ser Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ser 1115 1120 1125 GAC CTT TAC TTG GTC ACG AGG CAT GCT GAT GTC ATT CCG GTG CGC CGG 3756 Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg 1130 1135 1140 CGG GGC GAC AGC AGG GGG AGT CTA CTT TCC CCC AGG CCC GTC TCC TAC 3804 Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr 1145 1150 1155 1160 TTG AAG GGC TCT TCC GGT GGT CCA CTG CTC TGC CCC TCG GGG CAC GCT 3852 Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala 1165 1170 1175 GTG GGC ATC TTC CGG GCT GCT GTG TGC ACC CGG GGG GTT GCG AAG GCG 3900 Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 1180 1185 1190 GTG GAC TTC GTC CCC GTT GAG TCT ATG GAA ACT ACC ATG CGG TCT CCG 3948 Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro 1195 1200 1205 GTC TTC ACG GAT AAT TCT TCT CCC CCG GCC GTA CCG CAG ACA TTC CAA 3996 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln 1210 1215 1220 GTG GCC CAT CTA CAT GCT CCC ACT GGC AGC GGC AAG AGC ACT AAG GTG 4044 Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val 1225 1230 1235 1240 CCG GCT GCA TAC GCA GCC CAA GGG TAC AAG GTA CTC GTC CTG AAC CCG 4092 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 1245 1250 1255 TCC GTT GCC GCC ACC TTG GGT TTT GGG GCA TAC ATG TCC AAG GCA CAT 4140 Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His 1260 1265 1270 GGT GTT GAC CCT AAC ATC AGT ACT GGG GTA AGG ACC ATC ACC ACG GGC 4188 Gly Val Asp Pro Asn Ile Ser Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly 1275 1280 1285 GCC CCT ATC ACG TAC TCC ACC TAC GGC AAG TTC CTT GCC GAC GGT GGT 4236 Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly 1290 1295 1300 TGC TCC GGG GGC GCC TAT GAC ATC ATA ATA TGT GAC GAG TGC CAT TCA 4284 Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser 1305 1310 1315 1320 ACT GAC TCG ACT ACA ATC TTA GGC ATC GGC ACG GTC CTG GAC CAA GCG 4332 Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 1325 1330 1335 GAG ACG GCT GGA GCG CGG CTC GTC GTG CTC GCC GCC GCT ACG CCT CCG 4380 Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Ala Ala Thr Pro Pro 1340 1345 1350 GGA TCG ATA ACC GTG CCA CAT CCC AAC ATT GAG GAG GTG GCC TTG CCT 4428 Gly Ser Ile Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Pro 1355 1360 1365 AAC ACC GGA GAG ATT CCC TTC TAT GGC AAA GCC ATC CCC ATA GAG ACC 4476 Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Thr 1370 1375 1380 ATC CGC GGG GGG AGG CAT CTC ATC TTC TGC CAT TCC AAG AAG AAG TGT 4524 Ile Arg Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys 1385 1390 1395 1400 GAT GAG CTC GCT GCA AAG CTG TCG GGG CTC GGG GTC AAT GCT GTA GCG 4572 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu Gly Val Asn Ala Val Ala 1405 1410 1415 TAC TAC CGG GGC CTT GAT GTG TCC GTC ATA CCG ACA ATT GGA GAC GTC 4620 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ile Gly Asp Val 1420 1425 1430 GTT GTC GTG GCA ACA GAC GCC CTA ATG ACA GGC TTT ACC GGT GAC TTT 4668 Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe 1435 1440 1445 GAT TCA GTG ATC GAC TGT AAT ACA TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAC TTC 4716 Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe 1450 1455 1460 AGC TTG GAC CCT ACC TTC ACC ATT GAG ACG ACA ACG GTC CCC CAA GAC 4764 Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp 1465 1470 1475 1480 GCG GTG TCG CGC TCA CAA CGG CGA GGC AGA ACT GGC AGG GGT AGA GGG 4812 Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Gly 1485 1490 1495 GGC ATA TAC AGG TTT GTG ACT CCA GGG GAA CGG CCT TCG GGT ATG TTC 4860 Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe 1500 1505 1510 GAT TCT TCG GTC CTA TGT GAG TGC TAT GAC GCG GGC TGT GCT TGG TAC 4908 Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr 1515 1520 1525 GAG CTC ACG CCC GCA GTG ACC TCG GTT AGG CTG CGG GCT TAC CTA AAT 4956 Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Ser Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn 1530 1535 1540 ACA CCA GGG TTG CCC GTC TGC CAG GTC CAC CTG GAG TTC TGG GAG AGC 5004 Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Val His Leu Glu Phe Trp Glu Ser 1545 1550 1555 1560 GTC TTT ACA GGC CTC ACC CAC ATA GAT GCC CAC TTC TTG TCC CAG ACT 5052 Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr 1565 1570 1575 AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCA TAC CAG GCC ACA 5100 Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr 1580 1585 1590 GTG TGC GCC AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCG TGG GAT CAA ATG TGG 5148 Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp 1595 1600 1605 AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACG CTG CAC GGG CCA ACA CCC CTG 5196 Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu 1610 1615 1620 TTG TAT AGG CTA GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC ACA CAC CCC 5244 Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro 1625 1630 1635 1640 ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCG GCT GAT CTA GAG GTC GTC 5292 Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val 1645 1650 1655 ACC AGC ACC TGG GTG CTG GTA GGC GGA GTC CTC GCA GCT CTG GCC GCG 5340 Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala 1660 1665 1670 TAC TGC CTG ACA ACG GGC AGC GTG GTT ATT GTG GGC AGG ATC ATC TTG 5388 Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu 1675 1680 1685 TCC GGG AGG CCG GCT GTG GTA CCT GAC AGG GAA CTG CTC TAC CAG GAG 5436 Ser Gly Arg Pro Ala Val Val Pro Asp Arg Glu Leu Leu Tyr Gln Glu 1690 1695 1700 TTT GAT GAG ATG GAG GAG TGC GCC TCA CAC CTT CCT TAC ATC GAA CAA 5484 Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln 1705 1710 1715 1720 GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAA TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGG CTG CTG 5532 Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu 1725 1730 1735 CAA ACA GCC ACG AAG CAA GCG GAG GCT GCT GCT CCT GTG GTA GAG TCC 5580 Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Glu Ser 1740 1745 1750 AAG TGG AGG GCC CTT GAG GCC TTC TGG GCG AAG CAC ATG TGG AAC TTC 5628 Lys Trp Arg Ala Leu Glu Ala Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe 1755 1760 1765 ATC AGC GGG ATA CAG TAT CTA GCA GGC TTG TCC ACC CTG CCT GGA AAC 5676 Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn 1770 1775 1780 CCC GCA ATA GTA TCA CTG ATG GCA TTC ACA GCC TCT ATC ACT AGC CCG 5724 Pro Ala Ile Val Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Ile Thr Ser Pro 1785 1790 1795 1800 CTC ACC ACC CAA CAT ACC CTC CTG TTT AAC ATC TTA GGG GGA TGG GTG 5772 Leu Thr Thr Gln His Thr Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val 1805 1810 1815 GCC GCC CAA CTC GCC CCC CCC AGC GCT GCT TCA GCC TTC GTG GGC GCC 5820 Ala Ala Gln Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe Val Gly Ala 1820 1825 1830 GGC ATC GCT GGC GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG AAG GTG CTT 5868 Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu 1835 1840 1845 GTG GAC ATC CTG GCG GGT TAT GGA GCA GGG GTG GCA GGC GCA CTC GTG 5916 Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val 1850 1855 1860 GCC TTT AAG GGC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG GAC CTG GTC 5964 Ala Phe Lys Gly Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val 1865 1870 1875 1880 AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGC GCC CTG GTC GTC GGG GTC 6012 Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val 1885 1890 1895 GTG TGC GCA GCA ATA CTG CGT CGG CAT GTG GGC CCA GGG GAG GGG GCT 6060 Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala 1900 1905 1910 GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCA TTC GCC TCG CGG GGT AAC CAC 6108 Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His 1915 1920 1925 GTT TCC CCC ACG CAT TAT GTG CCT GAG AGC GAT GCT GCG GCG CGT GTC 6156 Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val 1930 1935 1940 ACC AAG ATC CTC TCC AGC CTT ACC ATC ACT CAG CGT CTA AAA AGG CTC 6204 Thr Lys Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Gln Arg Leu Lys Arg Leu 1945 1950 1955 1960 CAC CAG TGG ATT AAT GAG GAC TGC TCC ACG CCA TGC TCC GGT TCG TGG 6252 His Gln Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp 1965 1970 1975 CTC AAA GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACG GTG TTG ACT GAC TTC AAG 6300 Leu Lys Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Thr Asp Phe Lys 1980 1985 1990 ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGG CTG CCG GGA GAC CCC TTC 6348 Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly Asp Pro Phe 1995 2000 2005 TTC TCA TGT CAA CGT GGA TAC AGG GGG GTC TGG CGG GGA GAT GGC GTC 6396 Phe Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Val 2010 2015 2020 ATG CAA ACC ACC TGC CCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA CAT GTC AAA 6444 Met Gln Thr Thr Cys Pro Cys Gly Ala Gln Ile Thr Gly His Val Lys 2025 2030 2035 2040 AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAA ACC TGT AGC AAC ACG TGG 6492 Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp 2045 2050 2055 CAC GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC TGC ACG CCC 6540 His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro 2060 2065 2070 TCC CCG GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG GCT GCT GAG 6588 Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val Ala Ala Glu 2075 2080 2085 GAG TAT GTG GAA GTC ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC GTG ACG GGC 6636 Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly 2090 2095 2100 ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCA TGC CAG GTT CCA GCC CCC GAA 6684 Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro Ala Pro Glu 2105 2110 2115 2120 TTC TTC UCC GAA GTG GAT GGG GTG CGG TTG CAC AGG TAC GCT CCA GCT 6732 Phe Phe Ser Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala 2125 2130 2135 TGC AGG CCT CTC CTA CGG GAT GAG GTT ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC 6780 Cys Arg Pro Leu Leu Arg Asp Glu Val Thr Phe Gln Val Gly Leu Asn 2140 2145 2150 CAA TTC TTA GTT GGG TCA CAG CTC CCG TGT GAG CCC GAA CCG GAT GTA 6828 Gln Phe Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val 2155 2160 2165 ACA GTG CTC ACT TCC ATG CTT ACC GAC CCC TCC CAC ATT ACA GCG GAG 6876 Thr Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu 2170 2175 2180 ACG GCT AAG CGT AGG TTG GCC AGA GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC 6924 Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser 2185 2190 2195 2200 TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCT TTG AAG GCG ACA TGC ACT 6972 Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr 2205 2210 2215 ACC CGT CAT GTG TCC CCG GAC GCC GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG 7020 Thr Arg His Val Ser Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu 2220 2225 2230 TGG CGG CAG GAG ATG GGC GGG AAC ATC ACC CGG GTG GAG TCA GAG AAT 7068 Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn 2235 2240 2245 AAG GTA GTA GTA CTA GAC TCT TTT GAA CCG ATA CGG GCG GTC GAG GAT 7116 Lys Val Val Val Leu Asp Ser Phe Glu Pro Ile Arg Ala Val Glu Asp 2250 2255 2260 GAG AGG GAA GTA TCC GTG GCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA CCG AAA AAG 7164 Glu Arg Glu Val Ser Val Ala Ala Glu Ile Leu Arg Lys Pro Lys Lys 2265 2270 2275 2280 TTC CCC CCA GCG ATG CCC ATA TGG GCA CGC CCG AGC TAC AAC CCA CCA 7212 Phe Pro Pro Ala Met Pro Ile Trp Ala Arg Pro Ser Tyr Asn Pro Pro 2285 2290 2295 CTC CTA GAG TCT TGG AAG GAC CCG GAC TAC GTC CCT CCG GTG GTA CAC 7260 Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His 2300 2305 2310 GGG TGC CCT CTG CCA AGC ACC ATG GCC CCT CCA ATA CCA CCT CCA CGG 7308 Gly Cys Pro Leu Pro Ser Thr Met Ala Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg 2315 2320 2325 AGG AAG AGG ACG GTT GTC CTG ACA GAA TCC TCG GTG TCT TCT GCC TTG 7356 Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Ser Val Ser Ser Ala Leu 2330 2335 2340 GCT GAG CTT GCC ACA AAG ACC TTC GGC AGC TCC GGA TCG TCA GCC GTT 7404 Ala Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ala Val 2345 2350 2355 2360 GAC AGC GGC ACG GCG ACG GCC CCT CCT GAC CAG CCC TCC GAT GAC GGA 7452 Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Pro Ser Asp Asp Gly 2365 2370 2375 GAC AGA GGA TCT GAC GAT GAG TCG TAC TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG 7500 Asp Arg Gly Ser Asp Asp Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu 2380 2385 2390 GGG GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG 7548 Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val 2395 2400 2405 AGC GAG GAG GCT AGT GAG GAC GTC GCT TGC TGC TCG ATG TCT TAC ACG 7596 Ser Glu Glu Ala Ser Glu Asp Val Ala Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr 2410 2415 2420 TGG ACA GGC GCC CTA ATC ACA CCA TGC GCC GCG GAG GAG AGC AAG CTG 7644 Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu 2425 2430 2435 2440 CCC ATC AAT CCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC TCG ATG GTC 7692 Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Ser Met Val 2445 2450 2455 TAC GCC ACA ACA TCT CGC AGC GCA GGC CTA CGG CAG AAA AAG GTC ACC 7740 Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Gly Leu Arg Gln Lys Lys Val Thr 2460 2465 2470 TTT GAC AGA CTG CAG GTC CCG GAC GAC CAT TAC CGG GAC GTG CTC AAG 7788 Phe Asp Arg Leu Gln Val Pro Asp Asp His Tyr Arg Asp Val Leu Lys 2475 2480 2485 GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAA CTT CTA TCT ATT 7836 Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Ile 2490 2495 2500 GAA GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAC TCG GCC AGA TCC AAA TTT 7884 Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Arg Ser Lys Phe 2505 2510 2515 2520 GGC TAT GGG GCG AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AGA GCC GTT AAC 7932 Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Arg Ala Val Asn 2525 2530 2535 CAC ATC CAC TCC GTG TGG GAA GAC TTG CTG GAA GAC ACT GAA ACA CCA 7980 His Ile His Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Glu Thr Pro 2540 2545 2550 ATT GAC ACT ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTC TTC TGT GTT CAA CCA 8028 Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro 2555 2560 2565 GAG AAA GGA GGC CGC AAG CCA GCC CGC CTT ATC GTA TTC CCA GAA CTT 8076 Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Glu Leu 2570 2575 2580 GGG GTT CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTT TAC GAC GTG GTC TCC ACT 8124 Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr 2585 2590 2595 2600 CTT CCT CAG GTG GTG ATG GGC CCG TCA TAC GGA TTC CAG TAC TCT CCT 8172 Leu Pro Gln Val Val Met Gly Pro Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro 2605 2610 2615 GGG CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAT ACG TGG AAA TCG AAG AAA AAC 8220 Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp Lys Ser Lys Lys Asn 2620 2625 2630 CCT ATG GGC TTC GCA TAT TGC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACG GTC ACT 8268 Pro Met Gly Phe Ala Tyr Cys Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr 2635 2640 2645 GAG AGT GAT ATC CGT GTT GAG GAG TCA ATT TAC CAA TGT TGT GAC TTG 8316 Glu Ser Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu 2650 2655 2660 GCC CCC GAG GCC AGA CAG GTC ATA AGG TCG CTC ACG GAG CGG CTT TAT 8364 Ala Pro Glu Ala Arg Gln Val Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr 2665 2670 2675 2680 ATC GGG GGC CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGT TAT CGC 8412 Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln Asn Cys Gly Tyr Arg 2685 2690 2695 CGG TGC CGC GCC AGC GGT GTG CTG ACG ACT AAC TGC GGT AAT ACC CTC 8460 Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Asn Cys Gly Asn Thr Leu 2700 2705 2710 ACA TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG 8508 Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gln 2715 2720 2725 GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GAC CTT GTC GTT ATC TGT GAA 8556 Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu 2730 2735 2740 AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG 8604 Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu 2745 2750 2755 2760 GCT ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA 8652 Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu 2765 2770 2775 TAC GAC TTG GAG TTA ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAC GTG TCG GTC GCG 8700 Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala 2780 2785 2790 CAC GAC GCA TCT GGC AAG CGG GTG TAC TAC CTC ACT CGC GAC CCC ACC 8748 His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr 2795 2800 2805 ACC CCC CTC GCG AGG GCA GCG TGG GAA ACA GTT AGA CAC ACT CCA GTA 8796 Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val Arg His Thr Pro Val 2810 2815 2820 AAC TCC TGG CTA GGC AAC ATC ATC ATG TAC GCG CCC ACC CTG TGG GCA 8844 Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala 2825 2830 2835 2840 AGG ATG ATT CTG ATG ACC CAC TTC TTC TCC ATC CTT CTA GCT CAG GAG 8892 Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Leu Ala Gln Glu 2845 2850 2855 CAA CTT GAA AAA GCC CTG GGT TGT CAG ATC TAC GGG GCC ACT TAC TTC 8940 Gln Leu Glu Lys Ala Leu Gly Cys Gln Ile Tyr Gly Ala Thr Tyr Phe 2860 2865 2870 ATT GAA CCA CTT GAC CTA CCT CAG ATC ATT GAA CGA CTC CAC GGT CTT 8988 Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu 2875 2880 2885 AGC GCA TTT TCA CTC CAC AGT TAC TCT CCA GGT GAA ATC AAT AGG GTG 9036 Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val 2890 2895 2900 GCT TCA TGC CTC AGG AAA CTT GGG GTA CCA CCC TTG CGA GTC TGG AGA 9084 Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Val Trp Arg 2905 2910 2915 2920 CAT CGG GCC AGA AGT GTC CGC GCT AAG CTA CTG TCC CAG GGG GGG AGG 9132 His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Lys Leu Leu Ser Gln Gly Gly Arg 2925 2930 2935 GCC GCC ACT TGT GGC AAG TAC CTC TTC AAC TGG GCA GTG AAA ACC AAG 9180 Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys 2940 2945 2950 CTT AAA CTC ACT CCA ATT CCG GCT GCG TCC AGA TTG GAC TTA TCC GGC 9228 Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Arg Leu Asp Leu Ser Gly 2955 2960 2965 TGG TTC GTT GCT GGT TAC AAT GGG GGA GAC ATA TAT CAC AGC CTG TCT 9276 Trp Phe Val Ala Gly Tyr Asn Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser 2970 2975 2980 CGT GCC CGA CCC CGC TGG TTC ATG TGG TGC CTA CTC CTA CTT TCT GTA 9324 Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Trp Cys Leu Leu Leu Leu Ser Val 2985 2990 2995 3000 GGG GTA GGC ATC TAC CTG CTC CCC AAC CGG TGA ACGGGGAGCT 9370 Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg *** 3005 3010 AACCACTCCA GGCCAATAGG CCATTCCCTT TTTTT 9405

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＡＮＢ肝炎であると確定診断された患者 3
名と、健常人 1 名の血清由来のRNA を鋳型とし、配列
表の 7 番目から26 番目迄及び 310 番目から 334 番目
迄の塩基配列のものをプライマーとして相補 DNA を合
成し、この相補 DNA を用いてポリメラーゼ連鎖反応を
行い、次いで電気泳動を行った結果を示す、電気泳動パ
ターンの模写図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ (72)発明者 林 祐二 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 鈴木 栄二 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内 (72)発明者 澤井 喜一 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト C 型肝炎ウイルス遺伝子をコード
   する約 9500 個のヌクレオチドを有する一本鎖 DNA 又
   は該一本鎖 DNAとその相補一本鎖 DNA とからなる二本
   鎖 DNA。
2. 【請求項２】 配列表に示される塩基配列を有している
   ことを特徴とする、請求項１に記載の、一本鎖 DNA 又
   は該一本鎖 DNA とその相補一本鎖 DNA とからなる二本
   鎖 DNA。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の cDNA の一部をプライ
   マーとして使用することを特徴とする、ポリメラーゼ連
   鎖反応法によるヒト C 型肝炎ウイルスの検出法並びに
   ヒト C 型肝炎の診断法。
4. 【請求項４】 配列表に示されるアミノ酸配列を有して
   いることを特徴とする、cDNA クローン。
5. 【請求項５】 配列表に示されているアミノ酸配列の一
   部を有している DNAを抗原として使用することを特徴と
   する、抗 C 型肝炎ウイルス抗体の検出法並びにヒト C
   型肝炎の診断法及びヒト C 型肝炎ワクチンの作製法。