JP2662351B2 - Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン - Google Patents

Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 本発明は，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）伝染
の流行を処置するための材料および方法に関する。さら
に詳しくは，本発明は，診断用ＤＮＡ断片，診断用タン
パク，診断用抗体，そしてＮＡＮＢ型肝炎の病因因子
（すなわち，Ｃ型肝炎ウイルス）に対する防御抗原およ
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５−２３６．Ｗａｒｎｅｒ（１９８４），ＤＮＡ ３：
４０１．ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ（１９８７），Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．
１５４，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ
Ｅ．Ｗｕ（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １５５，ＲＥＣＯＭＢＩＮＡ
ＮＴ ＤＮＡ，ｐａｒｔ Ｆ．Ｚｏｌｌｅｒ（１９８
２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６
４８７．引用される特許 米国特許第４，３４１．７６１号 米国特許第４，３９９，１２１号 米国特許第４，４２７，７８３号 米国特許第４，４４４，８８７号 米国特許第４，４６６，９１７号 米国特許第４，４７２，５００号 米国特許第４，４９１，６３２号 米国特許第４，４９３，８９０号背景技術 非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は，伝染性の疾患である
か，あるいはウイルスが誘発すると考えられている疾患
群およびウイルスに関連する他の形態の肝臓疾患とは区
別し得る疾患群に属する。これらの疾患には，周知の肝
炎ウイルス（すなわち，Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ），
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），Δ型肝炎ウイレス（ＨＤ
Ｖ），およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエ
プスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））により引き起こ
される疾患が包含される。ＮＡＮＢＨは輸血した個体に
おいて初めて同定された。ヒトからチンパンジーへの伝
染およびチンパンジー間における一連の継代は，ＮＡＮ
ＢＨが１種または複数種の伝染性感染因子によるという
証拠を与える。しかしながら，ＮＡＮＢＨの原因である
伝染性因子はまだ同定されておらず，疾患の原因となる
因子の数も知られていない。
【０００３】疫学的証拠によると，ＮＡＮＢＨには次の
３つの型があると示唆される：つまり，飲料水媒介の流
行型；血液または注射針に関連する型；および散発（集
団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ））型
の３つの型である。しかしながら，ＮＡＮＢＨの原因と
なり得る因子の数は知られていない。
【０００４】ＮＡＮＢＨの臨床における診断および同定
は，他のウイルスマーカーを排除することにより，まず
行われてきた。推定されるＮＡＮＢＶ抗原および抗体を
検出するために用いられる方法には，寒天ゲル拡散法，
対向免疫電気泳動法，免疫蛍光顕微鏡法，免疫電子顕微
鏡法，放射性免疫検定法，および酵素結合免疫吸着検定
法がある。しかしながら，これらの検定法はいずれも，
ＮＡＮＢＨに関する診断検査として用いるのに充分感度
が高く，特異的であり，かつ再現性があるとは示されて
いない。
【０００５】これまで，ＮＡＮＢＨ因子に関連する抗原
抗体系の同一性または特異性に関しては，明確ではな
く，しかも−致することはなかった。これは，その少な
くとも一部は，以下のことが原因である：つまり，個体
におけるＨＢＶの前感染またはＮＡＮＢＶとの同時感
染；ＨＢＶに関連する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑
さ；および肝臓細胞のゲノムへのＨＢＶ ＤＮＡの組込
みである。さらに，ＮＡＮＢＨが１種より多くの病原体
により引き起こされる可能性，およびＮＡＮＢＨが誤診
されてきた可能性がある。また，血漿学的な検定法によ
り，ＮＡＮＢＨ患者の血清中に何が検出されるかは不明
であった。寒天ゲル拡散法および対向免疫電気泳動法に
よれば，血清検体間に時々生じる自動免疫反応または非
特異的なタンパク相互作用は検出されるが，特異的なＮ
ＡＮＢＶ抗原−抗体反応は示されないと考えられてき
た。免疫蛍光法，酵素結合免疫吸着検定法，および放射
性免疫検定法によれば，ＮＡＮＢＨ患者の血清中，なら
びに他の肝臓疾患および非肝臓疾患を有する患者におい
ても，しばしば存在するリウマチ因子様物質が低レベル
で検出されるようである。検出された反応性のいくつか
は，宿主により定まる細胞質抗原に対して抗体を表現し
得る。
【０００６】ＮＡＮＢＶの候補となるものは，数多く存
在する。例えば，Ｐｒｉｎｃｅ（１９８３），Ｆｅｉｓ
ｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎａｇｌｅ（１９８４），そし
てＯｖｅｒｂｙ（１９８５，１９８６，１９８７）によ
る総説，ならびにＩｗａｒｓｏｎ（１９８７）による論
文を参照にされたい。しかしなから，これらの候補がＮ
ＡＮＢＨの病因因子に相当するという証拠はない。
【０００７】ＮＡＮＢＶのキャリア，およびＮＡＮＢＶ
で汚染された血液または血液製剤をスクリーニングしか
つ同定するための感度が高く特異的な方法が非常に要求
されている。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の
約１０％において発生する。この場合，９０％までがＮ
ＡＮＢＨである。この疾患における大きな問題は，しば
しば慢性的な肝臓損傷へ進行することである（２５〜５
５％）。
【０００８】患者を看護し，血液および血液製剤による
ＮＡＮＢＨの感染あるいは個体が緊密に接触することに
より起こるＮＡＮＢＨの感染を予防するために，ＮＡＮ
ＢＶに関する核酸，抗原，および抗体を検出する信頼性
の高い診断手段および予診手段が必要とされている。さ
らに，この疾患を予防および／または処置するための効
果的なワクチンおよび免疫療法剤も必要とされている。
【０００９】発明の開示 本発明は，新しく発見されたＮＡＮＢＶ病因因子である
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の単離および特徴付けに関
する。さらに詳しくは，本発明は，ＨＣＶゲノムの部分
的なｃＤＮＡ複製物群を提供する。これらのｃＤＮＡ複
製物は，以下の新規な工程を包含する方法により単離さ
れた：つまり，これまでに単離も特徴付けもされていな
いウイルス因子のゲノムから誘導される新しく合成され
た抗原を検出するために，ＮＡＮＢＨ患者の血清で感染
した組織中の粒子状因子から調製されたｃＤＮＡライブ
ラリー由来の発見産物をスクリーニングする工程；およ
び非感染個体に比べて感染個体の血清とのみ免疫学的に
反応する産物を生産するクローンを選択する工程であ
る。
【００１０】ＨＣＶ ｃＤＮＡから誘導されたプローブ
を利用したＨＣＶゲノムの性質，およびＨＣＶ ｃＤＮ
Ａ内に含まれる配列情報に関する研究は，ＨＣＶがフラ
ビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆し
ている。
【００１１】ＨＣＶから誘導されたｃＤＮＡ配列の一部
は，試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブ
として，および天然に存在するウイルスの変異型を単離
するためのプローブとして有用である。これらのｃＤＮ
Ａを用いれば，ＨＣＶゲノム内にコードされているＨＣ
Ｖ抗原の有効なポリペプチド配列を調製し，診断検査に
おける標準または試薬として，および／またはワクチン
の成分として有用なポリペプチドを生産することができ
る。これらのポリペプチド配列内に含まれるＨＣＶエピ
トープに対する抗体は，ポリクローナル抗体およびモノ
ウローナル抗体のいずれもが，診断検査に，治療薬とし
て，抗ウイルス剤のスクリーニングに，そしてこれらの
ｃＤＮＡから誘導されるＮＡＮＢＶ因子の単離に有用で
ある。さらに，これらのｃＤＮＡから誘導されるプロー
ブを利用することにより，ＨＣＶゲノムの他の部分を単
離し，かつ配列決定することができる。従って，ＮＡＮ
ＢＨの診断および／または処置，予防および治療の両方
に有用な追加のプローブおよびポリペプチドが提供され
る。
【００１２】従って，ポリヌクレオチドに関する本発明
のいくつかの局面は以下のとおりである：精製されたＨ
ＣＶポリヌクレオチド；組換えＨＣＶポリヌクレオチ
ド；ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ ｃＤＮＡに由来する配
列を有する組換えポリヌクレオチド；ＨＣＶのエピトー
プをコードする組換えポリヌクレオチド；上記の組換え
ポリヌクレオチドのいずれかを有する組換えベクター；
およびこれらベクターのいずれかで形質転換された宿主
細胞。
【００１３】本発明の他の局面は以下のとおりである：
ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ ｃＤＮＡに由来するＤＮＡ
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する組
換え発現系であって，該ＯＲＦが所望の宿主と適合し得
る制御配列に対して作動可能なように連結されている，
組換え発現系；該組換え発現系で形質転換された細胞；
および該形質転換細胞により生産されるポリペプチド。
【００１４】本発明のさらに他の局面は以下のとおりで
ある：精製されたＨＣＶ；該精製ＨＣＶに由来するポリ
ペプチドの調製物；精製されたＨＣＶポリペプチド；お
よびＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に同一であ
るとみなし得るエピトープを有する精製されたポリペプ
チド。
【００１５】本発明には以下の局面も包含される：組換
えＨＣＶポリペプチド；ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ ｃ
ＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリペプチド；Ｈ
ＣＶエピトープを有する組換えポリペプチド；およびＨ
ＣＶポリペプチドを有する融合ポリペプチド。本発明に
は以下のものも包含される：ＨＣＶエピトープに対する
モノクローナル抗体；およびＨＣＶエピトープに対する
ポリクローナル抗体の精製された調製物。本発明の他の
局面は，ＨＣＶ感染に対して免疫原性の粒子であって，
真核生物宿主内で生産される場合に粒子を形成し得るア
ミノ酸配列を有する非ＨＣＶポリペプチドと，ＨＣＶエ
ピトープを有する粒子である。
【００１６】本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対す
るポリヌクレオチドプローブである。キットに関する本
発明の局面は以下のようなキットである：ＨＣＶに由来
するポリヌクレオチドの存在について試料を分析するた
めのキットであって，適当な容器内に，約８個またはそ
れ以上のヌクレオチドからなるＨＣＶ由来のヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有するキッ
ト；ＨＣＶ抗原の存在について試料を分析するためのキ
ットであって，適当な容器内に，検出されるべきＨＣＶ
抗原に対する抗体を有するキット；ＨＣＶ抗原に対する
抗体の存在について試料を分析するためのキットであっ
て，適当な容器内に，ＨＣＶ抗原に存在するＨＣＶエピ
トープを含むポリペプチドを有するキットである。
【００１７】本発明の他の局面は，固体担体に付着させ
た，ＨＣＶエピトープを有するポリペプチド；および固
体担体に付着させた，ＨＣＶエピトープに対する抗体で
ある。
【００１８】本発明のさらに他の局面は以下のような方
法である：ＨＣＶエピトープを含むポリペプチドを生産
する方法であって，ＨＣＶエピトープを含むポリペプチ
ドをコードする配列を含む発現ベクターで形質転換させ
た宿主細胞を，該ポリペプチドを発現させる条件下でイ
ンキュベートすること，を包含する生産方法；およびこ
の方法により生産された，ＨＣＶエピトープを含むポリ
ペプチド。
【００１９】本発明はまた，以下のような方法も包含す
る：試料中のＨＣＶ核酸を検出する方法であって，該試
料の核酸を，ＨＣＶポリヌクレオチドに対するプローブ
と，該プローブと該試料由来のＨＣＶ核酸との間にポリ
ヌクレオチド二本鎖を形成する条件下で反応させるこ
と；および核プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を
検出すること，を包含する検出方法。
【００２０】免疫学的検定法もまた，本発明に包含され
る。これらの免疫学的検定法には，以下のような工程を
包含するＨＣＶ抗原を検出するための免疫学的検定法が
包含される：ＨＣＶ抗原を含んでいる疑いのある試料
を，検出されるべきＨＣＶ抗原に対するプローブ抗体と
共に，抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベ
ートすること；および該プローブ抗体を含む抗原−抗体
複合体を検出すること。以下の工程を包含するＨＣＶ抗
原に対する抗体を検出するための免疫学的検定法：抗Ｈ
ＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試料を，ＨＣＶのエピ
トープを含むプローブポリペプチドと共に，抗体一抗原
複合体を形成する条件下でインキュベートすること；お
よび該プローブ抗原を含む抗体−抗原複合体を検出する
こと。
【００２１】本発明には以下のものも包含される：ＨＣ
Ｖ感染を処置するためのワクチンであって，ＨＣＶエピ
トープを含む免疫原性ペプチド，不活性化されたＨＣＶ
調製物，または弱毒化されたＨＣＶ調製物を含有するワ
クチン。
【００２２】本発明の他の局面は，ＨＣＶに感染した組
織培養増殖細胞である。
【００２３】本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対す
る抗体を生産する方法であって，ＨＣＶエピトープを含
む単離された免疫原性ポリペプチドを，免疫反応を生ず
るのに充分な量で個体に投与することを包含する生産方
法である。
【００２４】本発明のさらに他の局面は，未確認の感染
因子のゲノムに由来するｃＤＮＡを単離する方法であっ
て，該方法は以下の工程（ａ）〜（ｆ）を包含する：
（ａ）該感染因子に感染した組織から単離された核酸か
ら調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む発現ベクター
で形質転換させた宿主細胞を用意し，該ｃＤＮＡにコー
ドされたポリペプチドを発現する条件下で該宿主細胞を
増殖させること；（ｂ）該ｃＤＮＡの発現産物を，該感
染因子に感染した個体の抗体含有身体構成部分と，免疫
反応を起こす条件下で反応させ，その結果として形成さ
れる抗体−抗原複合体を検出すること；（ｃ）該工程
（ｂ）の抗体−抗原複合体を形成するポリペプチドを発
現する宿主細胞を，個々のクローンとして増殖する条件
下で増殖させ，該クローンを単離すること；（ｄ）該工
程（ｃ）のクローン由来の細胞を，該ｃＤＮＡ内にコー
ドされたポリペプチドを発現する条件下で増殖させ，該
発現産物を，該工程（ａ）の個体以外の個体であって該
感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分お
よび該感染因子に感染していない対照個体と反応させ，
その結果として形成される抗体一抗原複合体を検出する
こと；（ｅ）感染した個体および感染している疑いのあ
る個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体を
形成するが，対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体
を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々
のクローンとして増殖する条件下で増殖させ，該クロー
ンを単離すること；および（ｆ）該工程（ｅ）の宿主細
胞クローンからｃＤＮＡを単離すること。
【００２５】発明を実施する方法 Ｉ．定義 「Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒ
ｕｓ）」という用語は，非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）
の従来知られていなかった病原因子に対して，この分野
の研究者が保留していた用語である。従って，本願で用
いる場合，「Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）という用語は
ＮＡＮＢＨの病原因子を意味し，またこのＮＡＮＢＨ
は，以前にはＮＡＮＢＶおよび／またはＢＢ−ＮＡＮＢ
Ｖと呼ばれていたものである。本願では，ＨＣＶ，ＮＡ
ＮＢＶおよびＢＢ−ＮＡＮＢＶという用語を互換性のあ
る語として使用する。この用語法を拡張して，以前はＮ
ＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼んでいたＨＣＶによって
発病する疾患をＣ型肝炎と呼ぶ。本願では，ＮＡＮＢＨ
とＣ型肝炎という用語を互換性のある語として使用して
もよい。
【００２６】「ＨＣＶ」という用語は，本願で用いる場
合，ＮＡＮＢＨを発病させるウイルス種および弱毒化さ
れたウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味す
る。後に述べるように，ＨＣＶゲノムは，ＲＮＡで構成
されている。ＲＮＡを含有するウイルスの偶発変異率が
比較的高いということが知られており，すなわち約１０
−３〜１０−４／ヌクレオチドであると報告されている
〔フィールズとナイプ（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｋｎｉ
ｐｅ）１９８６年〕。それ故，後に述べるＨＣＶ種の中
には，多くのウイルス株がある。本願記載の組成物と方
法によって，種々の関連ウイルス株の増殖，同定，検出
および単離を行うことができる。さらに各種ウイルス株
に対する診断薬とワクチンを製造することができ，また
薬理学的用途の抗ウイルス剤を，ＨＣＶの複製を阻害す
るということによりスクリーニングすることができる。
【００２７】本願で提供する情報は，ある種のＨＣＶ株
由来のものであり， このウイルス株は以後ＣＤＣ／Ｈ
ＣＶ１と呼ぶが，ウイルス分離学者がこの種に属する他
のウイルス株を同定するのに充分なものである。本願に
記載するように，本願の発明者らは，ＨＣＶがフラビウ
イルス（Ｆｌａｖｉｉｒｕｓ）またはフラビ様ウイルス
（Ｆｌａｖｉ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）であることを発
見した。フラビウイルス粒子の形態と組成は公知であ
り，ブリントン（Ｂｒｉｎｔｏｎ．１９８６年）が考察
している。形態については，一般にフラビウイルス類
は，脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有し
ている。ビリオンは球形で直径が約４０〜５０ｎｍであ
る。そのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオ
ンのエンベロープの外面には，直径が約２ｎｍの端末ノ
ブ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｎｏｂ）を有する約５〜１０
ｎｍ長の突起を有する。
【００２８】ＨＣＶは，本願に記載のｃＤＮＡが誘導さ
れるＨＣＶゲノム内のエピトープと免疫学的に同定可能
なエピトープをコードするが，このエピトープは本願に
記載のｃＤＮＡ内にコードされることが好ましい。この
エピトープは，他の公知のフラビウイルス類と比較した
場合，ＨＣＶに特有のものである。このエピトープの独
自性は，ＨＣＶとの免疫学的反応性と，他のフラビウイ
ルス種との免疫学的反応性の欠如とによって決定するこ
とができる。免疫学的反応性を決定する方法は当該技術
分野では公知であり，例えば，放射性免疫検定法，ＥＬ
ＩＳＡ法，血球凝集反応法などがあり，分析技術の適切
ないくつかの例を本願に示す。
【００２９】上記に加えて，ウイルス株をＨＣＶとして
同定する際に，単独もしくは組合わせて，下記のパラメ
ータを利用することができる。ＨＣＶ株は，進化論的に
関連しているので，ヌクレオチドレベルでのゲノムの全
相同性は，約４０％以上であり，好ましくは約６０％以
上で，さらに好ましくは約８０％以上であり，さらに少
なくとも約１３のヌクレオチドの対応する連続配列があ
ると考えられる。推定上のＨＣＶ株のゲノム配列とＣＤ
Ｃ／ＣＨ１ ＨＣＶのｃＤＮＡ配列との同一性は，当該
技術分野で公知の技術によって決定することができる。
例えば，推定上のＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの配列
情報と，本願に記載のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列とを直接比
較することによって決定することができる。また例え
ば，相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下（例え
ば，Ｓ１消化の前に用いられる条件）でポリヌクレオチ
ドをハイブリダイゼーションし，次いで一本鎖に特異的
なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断し，次に切断
によって生成した断片の大きさを測定することによって
決定することができる。
【００３０】ＨＣＶ株の進化的類縁関係のために，推定
上のＨＣＶ株は，ポリペプチドのレベルの，その相同性
によって同定可能である。一般にＨＣＶ株は，ポリペプ
チドのレベルで，約４０％以上相同であり，好ましくは
約６０％以上，さらに好ましくは８０％以上相同であ
る。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は，当該技術
分野で知られている。例えば，アミノ酸配列を直接決定
して，本願に示した配列と比較することができる。また
例えば，推定上のＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配
列を決定してもよく（通常，ｃＤＮＡ中間体を介し
て），これにコードされているアミノ酸配列は決定可能
で，対応する領域を比較することができる。
【００３１】本願で使用される場合，指定された配列
（例えば，ＨＣＶ ｃＤＮＡ，特に第１〜４６図に例示
した配列）か，またはＨＣＶゲノム「由来」のポリヌク
レオチドは，少なくとも約６個の対応するヌクレオチド
配列からなり，好ましくは少なくとも約８個のヌクレオ
チド，さらに好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌ
クレオチド，さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０
個のヌクレオチドの配列からなる対応するポリヌクレオ
チド配列を意味する。つまり，これらのヌクレオチド
は，指定されたヌクレオチド配列の領域に相同か，また
は相補的である。上記ポリヌクレオチドが誘導される領
域の配列は，ＨＣＶゲノムに特有の配列に相同または相
補的であるのが好ましい。一つの配列がＨＣＶゲノムに
特有のものであるか否かは当業者に公知の技術で決定す
ることができる。例えば，その配列を，データバンク，
例えばジーンバンク（ｇｅｎｅｂａｎｋ）の配列と比較
して，未感染の宿主または他の生物に存在するか否かを
決定する。またその配列は，公知の配列を有する他のウ
イルス因子，すなわち，肝炎，例えば，ＨＡＶ，ＨＢＶ
およびＨＤＶを誘発することが知られているウイルス因
子，ならびにフラビウイルス科のウイルス（Ｆｒａｖｉ
ｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーと比較することもでき
る。また，誘導された配列が他の配列と一致しているか
または一致していないかは，適切な厳密条件下でハイブ
リダイゼーションさせることによって決定することがで
きる。核酸の配列の相補性を決定するためのハイブリダ
イゼーション技術は，当該技術分野で公知であり，後に
検討する。例えば，マニアチスら（ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ，１９８２年）の文献を参照せよ。さらにハ
イブリダイゼーションによって形成された，不適正な二
本鎖のポリヌクレオチドも公知の方法で決定することが
でき，この方法には，例えば，Ｓ１のようなヌクレアー
ゼによって，二本鎖のポリヌクレオチドの一本鎖領域を
特異的に切断する方法がある。代表的なＤＮＡ配列が
「誘導される」領域は，例えば，特異的なエピトープを
コードする領域および転写されない領域および／または
翻訳されない領域を含むが，これに限定されるものでは
ない。
【００３２】誘導されたポリヌクレオチドは，必らずし
も，提示されたヌクレオチド配列が物理的に誘導される
とは限らず，いずれの方法で生成されていてもよい。例
えば，化学合成法，ＤＮＡ複製法，逆転写法または転写
法が挙げられ，これらの方法は，ポリヌクレオチドが誘
導される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供す
る情報に基づいて実施される。さらに，指定された配列
の領域に対応する領域の組合わせは，当該技術分野で公
知の方法で改変され，意図する用途に合致させることが
できる。
【００３３】同様に，指定された核酸の配列（例えば，
第１〜４６図に示す配列）またはＨＣＶゲノム「から誘
導された」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は，上記
の配列にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列
もしくはその一部分の配列（少なくとも３〜５のアミノ
酸，好ましくは少なくとも８〜１０のアミノ酸，さらに
好ましくは少なくとも１１〜１５のアミノ酸で構成され
た部分）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド，ま
たは上記の配列にコードされているポリペプチドと免疫
学的に同定しうるポリペプチドを意味する。
【００３４】組換え体ポリペプチドもしくは誘導された
ポリペプチドは，指定された核酸配列（例えば第１〜３
４図に示す配列），またはＨＣＶゲノムから必らずしも
翻訳される必要はなく，例えば化学合成法もしくは組換
え体発現系の発現もしくは変異ＨＣＶからの単離を含む
いずれの方法でも生成され得る。
【００３５】本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチ
ド」という用語は，ゲノム，ｃＤＮＡ，半合成もしくは
合成の起源のポリヌクレオチドを意味し，その起源もし
くは操作によって，（１）天然もしくはライブラリーの
形態でポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチ
ドの全体もしくは一部分と連結していないもの，および
／または（２）天然にポリヌクレオチドが連結している
ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されて
いるのを意味する。
【００３６】本願で用いる「ポリヌクレオチド」という
用語は，任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチ
ド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ド）を意味する。この用語は，分子の一次構造のみを意
味する。したがって，この用語には，二本鎖ＤＮＡと一
本鎖ＤＮＡ，および二本鎖と一本鎖のＲＮＡが含まれ
る。またこの用語には，例えばメチル化反応および／ま
たはキャッピングによって修飾された形態のポリヌクレ
オチドと，未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。
【００３７】本願で用いる「ｃＤＮＡに対応する配列を
有するＨＣＶ」という用語は，そのＨＣＶが指定された
ＤＮＡの配列と相同もしくは相補的な関係にあるポリヌ
クレオチド配列をもっていることを意味し，ｃＤＮＡに
対する相同性もしくは相補性の程度は，約５０％以上，
好ましくは少なくとも約７０％，さらに好ましくは少な
くとも約９０％である。対応する配列は，長さが，少な
くとも約７０のヌクレオチド，好ましくは少なくとも約
８０のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約９
０のヌクレオチドである。ＨＣＶの配列とｃＤＮＡとの
対応は，当該技術分野で公知の方法で決定することがで
き，例えば配列された物質と記載されたｃＤＮＡとを直
接比較すること，またはハイブリダイゼーションし，一
本鎖ヌクレアーゼで切断し，切断により生成した断片の
大きさを測定するという方法がある。
【００３８】「精製されたウイルスポリヌクレオチド」
という用語は，ＨＣＶゲノムもしくはその断片を意味
し，この断片は，本質的に遊離の形態で，すなわち，ウ
イルスのポリヌクレオチドが自然に連結されているポリ
ヌクレオチドの約５０％未満，好ましくは約７０％未
満，さらに好ましくは約９０％未満を含有している。ウ
イルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する方
法は，当該技術分野で知られており，例えば，ウイルス
粒子をカオトロピック剤で破壊する方法，およびイオン
交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラ
フィー，および密度による遠心沈降法によってポリヌク
レオチドとポリペプチドを分離する方法がある。
【００３９】「精製されたウイルスポリペプチド」とい
う用語は，ＨＣＶポリペプチドもしくはその断片を意味
し，その断片は，本質的に遊離の形態で，ウイルスポリ
ペプチドが天然に連結されている細胞成分の，約５０％
未満，好ましくは約７０％未満，さらに好ましくは約９
０％未満を含有している。ウイルスポリペプチドを精製
する技術は当該技術で公知であり，この技術の例につい
ては後に考察する。
【００４０】単細胞因子として培養される微生物もしく
は高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」，「宿主
細胞」，「細胞」，「細胞系」，「細胞培養物」などの
用語は，組換え体ベクターもしくは他の転移ＤＮＡの受
容体として使用可能か，または使用されてきた細胞を意
味し，トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれ
る。単一の親細胞の後代は，偶発的または計画的な変異
によって，形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性
が元の親細胞と，必らずしも完全に同一ではない。所望
のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するよ
うな適切な性質によって特徴づけられ，親細胞に充分類
似している親細胞の後代は，上記定義の意味する後代に
含まれ，上記用語で扱われる。
【００４１】「レプリコン」は，遺伝要素であって，例
えばプラスミド，染色体，ウイルスが含まれ，細胞内で
ポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し，
すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
【００４２】「ベクター」は，他のポリヌクレオチドの
セグメントが結合しているレプリコンであって，複製を
行い，および／または結合しているセグメントを発現す
る。
【００４３】「制御配列」は，ある種のポリヌクレオチ
ド配列を意味し，この配列が連結している，コード配列
を発現するのに必要なものである。このような制御配列
の性質は，宿主の生物によって異なり，このような制御
配列には，原核細胞内では一般に，プロモーター，リボ
ソーム結合部位およびターミネーターが含まれ，真核細
胞内では一般に，プロモーター，ターミネーターおよび
ある場合にはエンハンサーが含まれる。「制御配列」と
いう用語は，最小限発現に必要なすべての要素を包含
し，さらに発現に有利な追加の要素，例えばリーダー配
列を包含し得る。
【００４４】「作動可能に連結された」という用語は，
上記のような要素が，意図した方法で機能しうるような
関係に並置されていることを意味する。コード配列に
「作動可能に連結された」制御配列は，制御配列に適合
した条件下でコード配列の発現が達成されるように，連
結される。
【００４５】「読み取り枠」（ＯＲＦ）は，ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり，こ
の領域は，コード配列の一部またはコード配列全体を意
味する。
【００４６】「コード配列」は，適切な調節配列の制御
下に置かれた場合に，ｍＲＮＡに転写され，および／ま
たはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列で
ある。コード配列の境界は，５’末端の翻訳開始コドン
と，３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コ
ード配列は，ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡおよび組換え体ポリヌ
クレオチド配列を包含するが，これらに限定されるもの
ではない。
【００４７】「免疫学的に…と同定可能な」という用語
は，指定されたポリペプチド（通常はＨＣＶタンパク）
内に存在し，かつそのタンパクに特有であるエピトープ
およびポリペプチドが存在することを意味する。免疫学
的な同一性は，抗体の結合および／または結合における
競争によって決定されるが，この技術は当業者には知ら
れていることであり，後述する。エピトープの独自性
も，エピトープをコードするポリヌクレオチド配列につ
いて，公知のデータバンク（例えば，ジーンバンク）を
コンピュータで調査し，他の公知のタンパクとアミノ酸
配列を比較することによって決定することができる。
【００４８】本願で用いる“エピトープ”という用語
は，ポリペプチドの抗原決定基を意味し，エピトープ
は，エピトープに特有の立体配置で３個のアミノ酸を含
有し得るが，エピトープは，一般に少なくとも５個のこ
のようなアミノ酸で構成され，より一般的には少なくと
も８〜１０個のこのようなアミノ酸で構成されている。
アミノ酸の立体配置の決定法は，当該技術分野では公知
であり，例えば，Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気
共鳴法がある。
【００４９】ポリペプチドは，これに含まれている特異
的なエピトープが抗体を認識することによって，抗体と
結合する場合，抗体と「免疫学的に反応性がある」。免
疫学的反応性は，抗体結合反応，特に抗体結合反応の速
度論，および／または抗体が指向しているエピトープを
含有する公知のポリペプチドを，競争者として用いる結
合競争法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免
疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は，当該技
術分野で公知である。
【００５０】本願に用いる場合，「ＨＣＶエピトープを
含有する免疫原性を有するポリペプチド」という用語に
は，自然に発生するＨＣＶポリペプチドもしくはその断
片，および他の手段（例えば，化学合成法または組換え
体生物内でのポリペプチドの発現）によって調製される
ポリペプチドが包含される。
【００５１】「ポリペプチド」という用語は，アミノ酸
の分子鎖を意味し，特定の長さの生産物を意味しない。
したがってポリペプチドの定義には，ペプチド，オリゴ
ペプチドおよびタンパクが包含される。またこの用語
は，ポリペプチドの発現後修飾物，例えば，グリコシル
化物，アシル化物，リン酸化物などを意味しない。
【００５２】本願で用いる「形質転換」という用語は，
外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意
味し，挿入法はどんな方法でもよく，例えば，直接取込
み法，形質導入法またはｆ−交配法がある。外因性ポリ
ヌクレオチドは，組込まれていないベクター，例えば，
プラスミドとして保持されるか，または代わりに宿主ゲ
ノムに組込れてもよい。
【００５３】本願で用いる「処理」という用語は，予防
および／または治療を意味する。
【００５４】本願で用いる「個体」という用語は，脊推
動物，特に哺乳動物種のメンバーを意味し，家畜，競技
用動物，霊長動物およびヒトを含むが，これに限定され
るものではない。
【００５５】本願で用いる場合，核酸の「正鎖」は，ポ
リペプチドをコードする配列を含有している。また「負
鎖」は，「正鎖」の配列を相補する配列を含有してい
る。
【００５６】本願で用いる，ウイルスの「正鎖ゲノム」
は，ＲＮＡまたはＤＮＡにかかわらず，一本鎖のゲノム
であり，ウイルスのポリペプチドをコードする。正鎖の
ＲＮＡウイルスの例としては，トガウイルス科ウイルス
（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ），コロナウイルス科ウイル
ス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ），レトロウイルス科
ウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ），ピコルナウイ
ルス科ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ−ｖｉｒｉｄａｅ）お
よびカリチウイルス科ウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉ
ｄａｅ）がある。またフラビウイルス科ウイルスも含ま
れるが，これは以前にトガウイルス科に分類されていた
〔フィールドとナイプの文献（１９８６年）を参照〕。
【００５７】本願で用いる「抗体を含有する身体成分」
は，問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味す
る。抗体を含有する身体成分は，当該技術分野で知られ
ており，例えば，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，呼吸
器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション（ｓｅｃｔｉ
ｏｎ），涙，唾液，乳，白血球および骨髄腫細胞が含ま
れるが，これに限定されるものではない。
【００５８】本願で用いる「精製されたＨＣＶ」は，ウ
イルスが通常連結されている細胞構成要素および感染組
織中に存在する他の種のウイルスから単離されたＨＣＶ
の製剤を意味する。ウイルスを単離する技術は，当業者
には知られており，例えば，遠心分離法およびアフィニ
ティークロマトグラフィーが含まれるが，精製ＨＣＶの
製法については後述する。
【００５９】ＩＩ．発明の構成 本発明の実施においては，特に指示されない限り，当該
分野で既知である分子生物学，微生物学，組み換えＤＮ
Ａ，および免疫学の従来の手法が採用される。このよう
な手法は，文献中に充分に説明されている。例えば，次
の文献を参照されたい：Ｍａｎｉｓｔｉｓ，Ｆｉｔｓｃ
ｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬ
ＯＮＩＮＧ；Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＩＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
（１９８２）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻およびＩ
Ｉ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編集，１９８５）；ＯＬＩ
ＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．
Ｊ．Ｇａｉｔ編集，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣ
ＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍ
ｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，１９８４）；
ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡ
ＴＩＯＮ （Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ編集，１９８４）；ＡＮＩＭＡＬＣＥＬＬ Ｃ
ＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集，１９８
６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ
ＥＮＺＹＨＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤ
Ｅ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９
８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹの
シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．）：ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ
ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．
ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集，１９８
７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それ
ぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ；Ｗｕ編集），Ｍａｙ
ｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集（１９８７）；ＩＭＭＵＮ
ＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ
ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ），Ｓｃｏｐ
ｅｓ，（１９８７）；ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣ
ＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣ
ＴＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．），およびＨＡＮＤＢＯ
ＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．
Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）。
【００６０】ここで述べられる前出および後述の特許出
願および公報は参考文献としてここに取り入れられてい
る。
【００６１】本発明の有用な物質および方法は，ＨＣＶ
感染チンバンジーの血漿中に存在する核酸配列由来のｃ
ＤＮＡライブラリーから単離されたヌクレオチド配列と
非常に相同なヌクレオチド配列群の供給により可能とな
る。このヌクレオチド配列群はヒトあるいはチンパンジ
ーの起源ではない。なぜなら，このヌクレオチド配列群
は，非感染個体から得られるヒトおよびチンパンジーの
ゲノムＤＮＡのいずれにもハイブリダイズせず，この配
列群のヌクレオチドはＨＣＶ感染したチンパンジーの肝
臓および血漿にのみ存在し，そして，この配列は遺伝子
バンクには存在しないからである。さらに，この配列群
は，ＨＢＶゲノム内に含有される配列に有意な相同性を
示さない。
【００６２】クローン５−１−１内に含有されるこの群
のある配列は，およそ５０個のアミノ酸のポリペプチド
をコードする１つの連続的なオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）を有する。ＨＣＶ感染者から得られた血
清にはこのポリペプチドに結合する抗体が含有されてい
る一方，非感染者から得られた血清には，このポリペプ
チドに対する抗体が含有されない。最終的に非感染チン
パンジーから得られた血清には，このポリペプチドに対
する抗体が含有されないが，この抗体は，急性ＮＡＮＢ
Ｈに感染したチンパンジーにおいて誘導される。さら
に，このポリペプチドに対する抗体はＨＡＶおよびＨＢ
Ｖに感染したチンパンジーおよびヒトにおいては検出さ
れない。これらの基準によると，この配列はウイルスの
配列に対するｃＤＮＡであり，このウイルスにより生
じ，ＮＡＮＢＨと関連する配列である。このｃＤＮＡ配
列を第１図に示す。後述のように，クローン５−１−１
におけるｃＤＮＡ配列は，単離された他のｃＤＮＡ（さ
らに２８個の塩基対を含有する）とは異なる。
【００６３】他の同定されたＤＮＡ群（これらは，クロ
ーン５−１−１におけるｃＤＮＡの断片と同等な合成配
列をプローブとして用い，単離された）との複合配列を
第３図に示す。クローン８１におけるｃＤＮＡ由来の合
成配列を用いて単離されたｃＤＮＡ群の構成要素を第５
図に示し，クローン８１の配列とこの配列との複合配列
を第６図に示す。ｃＤＮＡ群の他の構成要素は，クロー
ン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０
ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５
ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３３ｇ，および３９
ｃに存在する配列を含み，これらは，ＩＶ．Ａ節で詳細
に説明される。これらクローン中のｃＤＮＡ複合配列は
ＩＶ．Ａ．１８節で詳細に説明されており，第２９〜３
４図に示される。ｃＤＮＡ複合配列はひとつの連続した
ＯＲＦを含有し，従って，ポリタンパクをコードしてい
ることが示される。このデータは，後に考察されるよう
に，ＨＣＶがフラビウイルスあるいはフラビ様ウイルス
であるという示唆と一致する。
【００６４】第１図〜第４６図に包括して示すｃＤＮＡ
群が入手可能となるため，ＤＮＡプローブの構築および
ポリペプチドを得ることが可能となる。上記ポリペプチ
ドは，ＨＣＶ感染によるＮＡＮＢＨの診断において，そ
して，供血者，供給された血液および血液産物が感染し
ているか否かについてスクリーニングすることにおい
て，有用である。例えば，この配列から，約８〜１０個
あるいはそれより長いヌクレオチドを有するＤＮＡオリ
ゴマーを合成することが可能である。このＤＮＡオリゴ
マーは，例えばウイルスを保有している疑いがある被験
者血清におけるウイルスゲノムの存在を検出するため
の，あるいは供給された血液についてウイルスの存在の
有無をスクリーニングするための，ハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして，有用である。ｃＤＮＡ配列の群に
よりまた，ＮＡＮＢＨにおいて生じる抗体の存在を検出
する診断用試薬として有用なＨＣＶに特異的なポリペプ
チドの設計および産生が可能となる。ｃＤＮＡ由来の精
製ポリペプチドに対する抗体は感染個体および血液中の
ウイルス抗原を検出するためにも用いられ得る。
【００６５】これらのｃＤＮＡ配列の知識によリ，ＨＣ
Ｖに対するワクチンとしてそして抗体産生のためにも用
いられ得る，ポリペプチドの設計および調製が可能とな
る。そしてこのポリペプチドは，次に，ＨＣＶ疾患に対
する保護および／またはＨＣＶ感染個体の治療に用いら
れ得る。
【００６６】さらに，ｃＤＮＡ配列群によりＨＣＶゲノ
ムを，より特徴づけることを可能にする。これらの配列
から得られたポリヌクレオチドプローブは，重複してい
る付加的なｃＤＮＡ配列についてｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングするために用いられ得，このｃＤＮＡ
配列はさらに，重複している別の配列を得るためにも用
いられ得る。ゲノムが分割されており，そのセグメント
が共通配列を欠いている限り，この手法はゲノム全体の
配列を得るために用いられ得る。しかし，ゲノムが分割
されているならば，ゲノムの他のセグメントは，ここで
述べられているｃＤＮＡクローンを単離するために用い
られたλ−ｇｔ１１の血清学的なスクリーニング工程を
繰り返すことより，あるいは，精製ＨＣＶ粒子からのゲ
ノムを単離することにより得られ得る。
【００６７】ｃＤＮＡ配列群およびこれら配列由来のポ
リペプチド，そして，これらペプチドに対する抗体もま
た，ＢＢ−ＮＡＮＢＶ因子の単離および同定に有用であ
る。例えば，ｃＤＮＡ由来のポリペプチドに含まれるＨ
ＣＶエピトープに対する抗体は，アフィニティークロマ
トグラフィーをもとにした工程で，ウイルスを単離する
ために用いられ得る。あるいは，この抗体は他の手法に
より単離されたウイルス粒子を同定するために用いられ
得る。単離されたウイルス粒子のウイルス抗原およびゲ
ノム物質が，さらに特徴づけられ得る。
【００６８】ＨＣＶゲノムをさらに配列決定することに
よって得られる情報により，およびＨＣＶ抗原がさらに
特徴づけられ，ゲノムが特徴づけられることにより，付
加的なプローブおよびポリペプチド，そして抗体の設計
および合成が可能となる。これらは，ＨＣＶ誘発ＮＡＮ
ＢＨの診断，予防，および治療に，そして感染血液およ
び血液関連産物のスクリーニングに用いられ得る。
【００６９】抗原および抗体を含むＨＣＶのプローブ，
およびｃＤＮＡ群が誘導されるゲノム由来のポリヌクレ
オチドが利用可能であることにより，ＨＣＶの生物的性
質を明らかにするにあたり主として用いられる組織培養
系の発達が可能となった。このことにより，ＨＣＶ複
製，あるいはＨＣＶ感染を選択的に阻害する抗ウイルス
化合物に基づいた新しい治療法が開発され得る。
【００７０】ＮＡＮＢＨの病因因子を同定および単離す
るために用いられる本法は新規であり，次のような今ま
でに特徴づけられていない因子の同定および／または単
離に適用され得る。上記因子はゲノムを含有し，ウイル
ス，ウィロイド，細菌類，菌類，および寄生虫によって
引き起こされる疾患を包含するさまざまな疾患に関連す
る因子である。この方法ではｃＤＮＡライブラリーが，
感染個体から得られる感染組織中に存在する核酸から，
調製された。このライブラリーは，ｃＤＮＡをコードす
るポリペプチドを発現し得るベクター中に調製された。
ベクターを含む宿主細胞のクローンは，病因因子のポリ
ペプチドの免疫反応性断片を発現し，これは，推定され
る因子に以前に感染した別の個体由来の抗体含有体成分
を有するこのライブラリーの発現産物を免疫学的にスク
リーニングすることによって選択される。免疫学的なス
クリーニング法における工程は，次の工程を包含してい
た；：ベクターを含むｃＤＮＡの発現産物と，二次的に
感染した個体の抗体含有体成分とを相互作用させる工
程；および発現産物と二次感染個体の抗体との間の抗原
−抗体複合配列の形成を検出する工程。単離されたクロ
ーンはさらに次のようにして免疫学的にスクリーニング
される：発現産物を，推定される因子に感染した他の個
体および推定される因子に感染していない対照の個体の
抗体含有体成分と相互に作用させること，および，感染
個体由来の抗体との抗原−抗体複合配列の形成を検出す
ること。そして，感染個体および該因子に感染している
疑いのある個体由来の抗体と免疫学的に反応するが，対
照の個体由来のものとは反応しないポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡ含有ベクターが，単離される。ｃＤＮＡ
ライブラリーの構築および免疫学的なスクリーニングに
用いた感染個体は同種である必要はない。
【００７１】本法により単離されたＤＮＡ発現産物，そ
して該発現産物に対する抗体は，病因因子の特徴づけお
よび／または捕捉に有用である。さらに，詳細に後述す
るように，この方法は，ＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡ群
を単離するために，好適に利用される。
【００７２】ＩＩ．Ａ．ｃＤＮＡ配列の調製 慢性ＨＣＶ感染チンパンジー由来の貯留血清であって，
ウイルスを高力価で，つまり少なくとも１０６チンパン
ジー感染量／ｍｌ（ｃｈｉｍｐ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ
ｄｏｓｅｓ／ｍｌ；ＣＩＤ／ｍｌ）を有する血清を，
ウイルス粒子を単離するために用いた。そして，このウ
イルス粒子から単離した核酸を，ウイルスゲノムに対す
るｃＤＮＡライブラリーの構築においてテンプレートと
して用いた。推定ＨＣＶ粒子の単離およびλ−ｇｔ１１
におけるｃＤＮＡライブラリーの構築のための手順は，
ＩＶ．Ａ．１節で考察されている。λ−ｇｔ１１は，β
−ガラクトシダーゼを有する融合ポリペプチドとして挿
入ｃＤＮＡを発現するために，そして，特定の抗原に対
して生じた特異的な抗血清で多数の組み換え体ファージ
をスクリーニングするために，特に開発されたベクター
である。およその平均サイズが２００塩基対のｃＤＮＡ
を有するｃＤＮＡプールからのλ−ｇｔ１１ｃＤＮＡラ
イブラリーが以前にＮＡＮＢ肝炎にかかつたことのある
患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコードされ
たエピトープについてスクリーニングされた。Ｈｕｙｎ
ｈ，Ｔ．Ｖ．ら（１９８５）。約１０６個のファージガ
スクリーニングされ，５個の陽性ファージが同定，精製
され，次に，ＨＣＶ因子に以前に感染した異なるヒトお
よびチンパンジーから得た血清に対する結合の特異性が
テストされた。このファージの１つである５−１−１
が，テストしたヒト血清８個のうちの５個と結合した。
７個の正常血清はこのような結合を示さなかったので，
この結合は以前にＮＡＮＢ肝炎にかかった患者由来の血
清に選択的であるらしい。
【００７３】組換え体ファージ５−１−１におけるｃＤ
ＮＡ配列が，決定され，それは第１図に示される。この
クローン化されたｃＤＮＡによってコードされたポリペ
プチドは，融合ポリペプチドのＮ末端β−ガラクトシダ
ーゼ部分として同一の翻訳枠内にあり，その配列は，該
ヌクレオチド配列の上に示される。従って，翻訳ＯＲＦ
は，ＮＡＮＢ肝炎に感染した患者由来の血清によって特
別に認識されるエピトープをコードする。
【００７４】組換えファージ５−１−１においてｃＤＮ
Ａが利用できるため，ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡ
の付加的な断片および／または他の断片を有する他のク
ローンを単離することが可能となる。前出のλ−ｇｔ１
１ ｃＤＮＡライブラリーは，クローン化された５−１
−１ ｃＤＮＡ配列由来の合成ポリヌクレオチドを用い
てスクリーニングされた。このスクリーニングにより，
８１，１−２， および９１として同定された３個の他
のクローンが得られた。これらのクローン内にあるｃＤ
ＮＡが配列決定された。ＩＶ．Ａ．３節およびＩＶ．
Ａ．４節を参照されたい。４個の独立したクローン間の
相同性を第２図に示す。第２図では相同性が縦線により
示されている。クローン５−１−１，８１，および９１
において独特のヌクレオチド配列を小文字で示す。
【００７５】クローン５−１−１．８１，１−２，およ
び９１における組換え体ファージにクローン化されたｃ
ＤＮＡは，相同性が高く，わずかに２個の領域において
異なるにすぎない。第一に，クローン１−２の６７番目
のヌクレオチドはチミジンである一方，他の３個のクロ
ーンは，この位置にシチジンを有する。しかし，この置
き変えにより，コードされたアミノ酸の性質は変化しな
い。
【００７６】この４つのクローンの第２の違いは，クロ
ーン５−１−１が，他のクローンには存在しないような
２８の塩基対を５’末端に有していることである。この
特別な配列はクローニングにより５’末端に人工的に形
成されたものである。クローニングにより５’末端に形
成される人工的な配列は，通常，ｃＤＮＡ法の生成物中
に観察される。
【００７７】クローン８１におけるＨＣＶ ｃＤＮＡの
５’領域および３’領域由来の合成配列は，クローン８
１ ｃＤＮＡと重複するλ−ｇｔ１１のＮＡＮＢＶｃＤ
ＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡのスクリーニングおよ
び単離に用いられた（ＩＶ．Ａ．５節）。クローン３６
およびクローン３２の中にそれぞれ存在する得られたｃ
ＤＮＡ配列は，第５図および第７図に示される。
【００７８】同様に，クローン３６の５’領域に基づい
た合成ポリヌクレオチドは，クローン３６ｃＤＮＡに重
複するλ−ｇｔ１１ ＮＡＮＢＶ ｃＤＮＡライブラリ
ーからｃＤＮＡをスクリーニングし単離するのに用いら
れた（ＩＶ．Ａ．８節）。合成ポリヌクレオチドプロー
ブにハイブリダイズする組換えファージ含有ｃＤＮＡの
精製クローンはクローン３５と命名され，このクローン
の中に含まれるＮＡＮＢＨ ｃＤＮＡ配列は第８図に示
される。
【００７９】重複ｃＤＮＡ配列を単離する手法を利用す
ることによって，上流および下流にＨＣＶ ｃＤＮＡの
付加的な配列を有するクローンが得られた。これらクロ
ーンの単離はＩＶ．Ａ節で後述する。
【００８０】単離されたクローン内にコードされたＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析により，複合ｃ
ＤＮＡがひとつの長い連続したＯＲＦを有することが示
される。第２９〜３４図に，これらのクローンからの複
合ＤＮＡ配列を，それによりコードされた推定されるＨ
ＣＶポリペプチドとともに，示す。
【００８１】ｃＤＮＡ配列を得るための方法の記述は，
歴史的に興味深い。得られた配列（およびその相補配
列）は本発明により提供され，その配列あるいはその部
分的な配列は合成法を用いて，あるいは，合成法と，こ
こに記載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方
法とを組み合わせて，調製される。
【００８２】ＨＣＶ ｃＤＮＡライブラリーからの，そ
してクローン５−１−１，８１，１−２および９１から
複製されるλ−ｇｔ１１株は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．， Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，に，
ブダペスト条約により寄託されており，次の受託番号を
有する。
【００８３】 本出願が米国特許として許可され発行されると，これら
寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取
り除かれる。そして上記命名された寄託物は，３７ＣＦ
Ｒ１．１４および３５ＵＳＣ １．２２によりコミッシ
ョナーによって権利を与えられた上記出願が係属してい
る間は，入手可能である。さらに，その寄託物は，寄託
日から３０年間，あるいは寄託物の最終要求から５年
間；あるいは，米国特許の有効である期間のいずれか長
い方の期間の間，維持される。これらの寄託物およびこ
こで述べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託され
たものであり，ここでの記載された内容により本発明を
実施することを意図していない。すべての寄託物におけ
るＨＣＶ ｃＤＮＡ配列は，参考として，ここに述べら
れている。
【００８４】ＨＣＶ λ−ｇｔ１１ライブラリーからの
重複ｃＤＮＡ配列を単離することによりゲノムを「ウォ
ーキング（Ｗａｌｋｉｎｇ）」する上記記載により，全
ＨＣＶゲノムに対するｃＤＮＡを単離し得る方法が提供
される。しかし，本明細書で提供される情報が与えられ
たとしても，これらのｃＤＮＡを単離する他の方法は当
業者には自明である。そのような方法のいくつかはこの
後のＩＶ．Ａ節で述べられる。
【００８５】ＩＩ．Ｂ．ウイルス性ポリペプチドおよび
フラグメントの調製 第１〜４６図のｃＤＮＡ配列を利用して，後述のように
単離されたｃＤＮＡ配列であっても，これらの図のｃＤ
ＮＡ配列であっても，このようなｃＤＮＡ配列を利用し
得るため，いずれかの鎖においてコードされているポリ
ペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクタ
ーの構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域は
コートまたはエンベロープ（外被）抗原，あるいはコア
抗原由来であり得，それには例えば，ポリヌクレオチド
結合タンパク，ポリヌクレオチドポリメラーゼ，および
ウイルス粒子の複製および／または構築（ａｓｓｅｍｂ
ｌｙ）に必要とされる他のウイルス性タンパクが包含さ
れる。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは
従来の制限消化を用いてあるいは合成法により，ｃＤＮ
Ａクローンから誘導され，例えばタンパクβ−ガラクト
シダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ（Ｓ
ＯＤ）（好ましくはＳＯＤ）のような融合配列の一部を
有するベクター中に連結される。ＳＯＤの融合配列を有
するポリペプチドの産生に有用な方法およびベクター
は，１９８６年１０月１日に公開されたヨーロッパ特許
出願公開番号第０１９６０５６号に記載されている。Ｓ
ＯＤおよびＨＣＶポリペプチドの融合ポリペプチドをコ
ードするベクター（つまりＮＡＮＢ５−１−１’ＮＡＮ
Ｂ８１およびＣ１００−３；ＨＣＶ ｃＤＮＡの複合配
列中にコードされている）は，それぞれＩＶ．Ｂ．１，
ＩＶ．Ｂ．２，およびＩＶ．Ｂ．４節に記載されてい
る。どちらのセンス鎖においても，オープンリーディン
グフレームを有するＨＣＶ ｃＤＮＡの所望の部分は，
成熟タンパクあるいは融合タンパクのような組換えポリ
ペプチドとして得られる。あるいは，このｃＤＮＡにコ
ードされるポリペプチドは，化学合成により供給され得
る。
【００８６】所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は，融合型であっても成熟型であっても，分泌を可能に
するシグナル配列を有していてもいなくても，適当な宿
主に適した発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物お
よび原核生物の両宿主が，組換えポリペプチドを形成す
るために現在用いられている。より一般的な制御系およ
び宿主細胞系を，後述のＩＶ．Ａ節にまとめて示す。こ
のポリペプチドは，次に，溶解した細胞あるいは培地か
ら単離され，実際の使用に必要な程度にまで精製され
る。精製には，当該分野で公知の手法が用いられ得，そ
れには例えば，塩分画，イオン交換樹脂でのクロマトグ
ラフィー，アフィニティクロマトグラフィー，遠心分離
などがある。例えば，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙの種々のタンパク精製法を参照されたい。
このようなポリペプチドは，診断用として用いられ得る
か，あるいは抗体を中和するようなポリペプチドはワク
チンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生
じた抗体もまた，診断薬として，あるいは受動免疫治療
に用いられ得る。さらに，後述のＩＩ．Ｊ節で考察する
ように，これらポリペプチドに対する抗体は，ＨＣＶ粒
子の単離および同定に有用である。
【００８７】このＨＣＶ抗原はまた，ＨＣＶビリオンか
ら単離され得る。このビリオンは，組織培養物中のＨＣ
Ｖ感染細胞，あるいは感染宿主中で増殖し得る。
【００８８】ＩＩ．Ｃ．抗原性ポリペプチドの調製およ
びキャリアーとの結合 ポリペプチドの抗原性領域は，通常は比較的小さく，代
表的には８〜１０個あるいはそれを下まわる長さのアミ
ノ酸である。せいぜい５個のアミノ酸フラグメントが抗
原性領域を特徴づけている。これらのセグメントは，Ｈ
ＣＶ抗原領域に対応する。従って，このＨＣＶのｃＤＮ
Ａを基本的に用いると，ＨＣＶポリペプチドの短いセグ
メントをコードするＤＮＡは，融合タンパクとして，あ
るいは単離ポリペプチドとして，組換え手法により発現
させることができる。さらに，短いアミノ酸配列は，化
学合成で都合よく得ることができる。合成ポリペプチド
が正しいエピトープを提供するために正しく形成されて
いるが，小さすぎて免疫原性がない場合には，このポリ
ペプチドは，適当なキャリアーと結合させることができ
る。
【００８９】このような結合を得るための多くの手法が
当該分野では公知であり，それにはＰｉｅｒｃｅ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから
入手されるＮ−サクシイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびサクシイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボネート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド結合を形
成する方法が包含される（もしこのペプチドがスルフヒ
ドリル基を欠いていれば，システイン残基を付加するこ
とにより，この方法が用いられ得る）。これらの試薬
は，その試薬自身とあるタンパクのペプチドのシステイ
ン残基との間のジスルフィド結合，およびリジンのε−
アミノ，あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド
結合を生成する。このようなさまざまなジスルフィド／
アミド形成試薬は公知である。例えば，Ｉｍｍｕｎ．Ｒ
ｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照されたい。他の
二官能性カップリング試薬は，ジスルフィド結合よりむ
しろチオエーテルを形成する。これらのチオ−エーテル
生成試薬の多くは市販されており，それには６−マレイ
ミドカプロン酸，２−ブロモ酢酸，２−ヨード酢酸，４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボン酸などの反応性エステルが包含される。このカルボ
キシル基は，そのカルボキシル基とコハク酸イミドと
を，あるいは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スル
ホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性
化される。上述の化合物の名称は，それが全てであるこ
とを意味せず，その化合物の修飾物もまた明らかに用い
られ得る。
【００９０】キャリアーとしては，それ自身が宿主に対
して有害な抗体の産生を誘導しないものであれば，いず
れのキャリアーもが用いられ得る。適当なキャリアー
は，典型的には，大きく，ゆっくり代謝される高分子物
質であり，それには例えば，タンパク；ラテックス機能
付与セファロース，アガロース，セルロース，セルロー
スビーズなどの多糖体；ポリグルタミン酸，ポリリジン
などのような重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および
不活性ウイルス粒子がある（例えば，ＩＩ．Ｄ節を参照
のこと）。特に有用なタンパク基質には，血清アルブミ
ン，キーホールリンペットヘモシアニン，免疫グロブリ
ン分子，サイログロブリン，オボアルブミン，テタヌス
毒素，および当業者に公知の他のタンパクがある。
【００９１】ＩＩ．Ｄ．ＨＣＶエピトープを有するハイ
ブリッド粒子免疫原の調製 ＨＣＶのエピトープの免疫原性はまた，粒子形成タンパ
ク（例えば，Ｂ型肝炎の表面抗原と結合するタンパク）
と融合もしくは結合させた哺乳動物の系あるいは酵母の
系で調製することによって増強される。ＮＡＮＢＶエピ
トープガ粒子形成タンパクコード配列に直接結合してい
る構築物は，ＨＣＶエピトープに関して免疫原性のハイ
ブリッドを産生する。さらに，調製したすべてのベクタ
ーはＨＢＶに特異的なエピトープを有し，例えばプレＳ
ペプチドのように異なる度合の免疫原性を有する。この
ように，ＨＣＶ配列を有する粒子形成タンパクから構築
される粒子は，ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性で
ある。
【００９２】肝炎の表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は，Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，（１９
８２）），および例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕ
ｅｌａ，Ｐ．ら，（１９８４））において形成され，結
合して粒子となることが示されている。このような粒子
の形成は，単量体のサブユニットの免疫原性を増強する
ことが示されてきた。この構築物はまた，ＨＢＳＡｇの
免疫的に優性なエピトープを有し，それはプレ表面（プ
レＳ）領域の５５アミノ酸を含有する（Ｎｅｕｒａｔｈ
ら，（１９８４））。 酵母中に発現され得るプレＳ−
ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は，ヨーロッパ特許出願公開第
１７４，４４４号（１９８６年３月１９日公開）に開示
されている。酵母の発現のための異種ウイルス配列を有
するハイブリッドは，ヨーロッパ特許出願公開第１７
５，２６１号（１９６６年３月２６日公開）に開示され
ている。これらの出願の出願人は本出願人と同一であ
り，参考としてここに取り入れられている。
【００９３】これらの構築物もまた，ＳＶ４０のジヒド
ロ葉酸還元酵素ベクターを用いてチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞中で発現さ
せることができる（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８
４））。
【００９４】さらに，粒子形成タンパクをコードする配
列の部分は，ＨＣＶエピトープをコードするコドンで置
き換えられ得る。この置き換えにおいては，酵母あるい
は哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒
介するために必要とされない部分は削除され得，このよ
うにして，ＨＣＶエピトープと競合する部分から付加的
なＨＢＶ抗原部位が除去される。
【００９５】ＩＩ．Ｅ．ワクチンの調製 ワクチンは，ＨＣＶ ｃＤＮＡ由来の免疫原性ポリペプ
チドおよび第１〜４６図のｃＤＮＡ配列由来の免疫原性
ポリペプチド，あるいはこれらが対応するＨＣＶゲノム
由来の免疫原性ポリペプチドの１種あるいはそれ以上か
ら調製される。ＨＣＶおよびフラビウイルスの間に観察
される相同性は，ワクチンとして最も有効でありそうな
ポリペプチドと，それらがコードされているゲノム領域
に関する情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般
的な構造は，Ｒｉｃｅら（１９８６）により考察されて
いる。こフラビウイルスのゲノムＲＮＡは，ウイルス特
異的ｍＲＮＡ種のみであると考えられ，これは，３つの
ウイルスの構造タンパク（つまり，Ｃ，ＭおよびＥ），
そして，２つの大きな非構造タンパク（ＮＶ４およびＮ
Ｖ５）およびより小さな非構造タンパクの複合体の対に
翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープ
は，Ｅ（外被：ｅｎｖｅｌｏｐｅ）タンパクに属するこ
とは公知である（Ｒｏｅｈｒｉｇ（１９８６））。対応
するＨＣＶ Ｅ遺伝子およびポリペプチドをコードする
領域は，フラビウイルスに対する相同性に基づいて，予
想され得る。このように，ワクチンは，ＨＣＶＥのエピ
トープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。これ
らのポリペプチドは，細菌，酵母，あるいは哺乳動物細
胞において発現するか，あるいは，ウイルス調製物から
単離され得る。他の構造タンパクもまた，保護抗ＨＣＶ
抗体を生じるエピトープを有し得ることが予期される。
このように，Ｅ，Ｃ，およびＭのエピトープを有するポ
リペプチドもまた，単独であるいは組み合わせて，ＨＣ
Ｖワクチン中で用いられ得る。
【００９６】上記に加えて，ＮＳ１（非構造タンパク
１）で免疫すると黄熱病から保護されることが示されて
いる（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６））。たと
え，その免疫により中和抗体が生じないとしてもこのこ
とは正しい。このように，特に，このタンパクはフラビ
ウイルスの間で高い度合で保持されるらしいので，ＨＣ
Ｖ ＮＳ１もまた，ＨＣＶの感染に対して保護作用を有
するようである。さらに，たとえ非構造タンパクが中和
抗体の産生を行わないとしても，非構造タンパクは，ウ
イルスの病原性に対して保護作用を提供し得ることもま
た示される。
【００９７】上記の見解においては，ＨＣＶに対する多
価のワクチンは１あるいはそれ以上の構造タンパク，お
よび／または１あるいはそれ以上の非構造タンパクを含
有し得る。これらのワクチンは，例えば，組換えＨＣＶ
ポリペプチドおよび／またはビリオンから単離されたポ
リペプチドを含有し得る。さらに，ワクチンにおける不
活性化ＨＣＶの使用を可能にする。不活性化は，ウイル
ス溶解物の調製によるか，あるいはフラビウイルスの不
活性化を引き起こす当該分野で公知の他の方法（例え
ば，有機溶媒あるいは界面活性剤での処理，あるいはホ
ルマリンでの処理）により行われ得る。さらに，ワクチ
ンはまた，弱毒化ＨＣＶ株からも調製され得る。弱毒化
ＨＣＶ株の調製は，後述される。
【００９８】フラビウイルスにおけるタンパクのいくつ
かは高度に保持された領域を有することは公知であり，
従って，いくつかの免疫学的交差反応性がＨＣＶと他の
フラビウイルスとの間に予想される。フラビウイルスと
ＨＣＶとの共有のエピトープは，これら病原因子によっ
て引き起こされる１あるいはそれ以上の障害に対する保
護抗体を生じる可能性がある。このように，この認識に
基づく多目的ワクチンを設計することができる。
【００９９】活性成分として免疫原性のポリペプチドを
含有するワクチンの調製は，当業者に公知である。代表
的には，このようなワクチンは，液体溶液あるいは懸濁
液のいずれかとして，注射できるように調製される。注
射の前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適当な固形
物の形態としても調製され得る。この調製物はまた，乳
化することもでき，あるいは，リポソームにカプセル化
されるタンパクであってもよい。この活性免疫原性成分
は，薬学的に受容され得，この活性成分と適合性のある
賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤としては，
例えば，水，生理食塩水，デキストロース，グリセロー
ル，エタノールなど，およびこれらの組み合わせがあ
る。さらに必要に応じて，このワクチンには少量の補助
物質が含有され得，それには，補湿剤あるいは乳化剤，
ｐＨ緩衝剤，および／またはこのワクチンの効果を増強
するアジュバントがある。効果的なアジュバントの例と
しては，次の物質があり，そしてこれらには阻定されな
い：水酸化アルミニウム，Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ
−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤ
Ｐ），Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７，ｎｏｒ−Ｍ
ＤＰとする），Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−
２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキ
シホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３
５Ａ，ＮＴＰ−ＰＥとする），およびＲＩＢＩ。上記Ｒ
ＩＢＩは細菌から抽出される３つの成分，モノホスホリ
ル脂質Ａ，トレハロースジミコール酸，および細胞壁骨
格成分（ＮＰＬ＋ＴＤＮ＋ＣＷＳ），を，２％スクアレ
ン／トゥイーン８０乳液中に含んでいる。アジュバント
の効果は，ＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ポリペプチ
ドに対する抗体の量を測定することによって決定され得
る。このポリペプチドは，種々のアジュバントを含むワ
クチン中のこのポリペプチドを投与することにより生じ
る。
【０１００】このワクチンは，通常，非経口的に注射で
投与され，その形態は，例えば，皮下注射であっても筋
肉注射であってもよい。他の投与形態に適当な処方には
座薬があり，場合によっては経口処方もある。座薬とし
て従来のバインダーおよび担体か用いられ得，それには
例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリ
ドがある。このような座薬は，活性成分を０．５％〜１
０％，好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物か
ら形成される。経口処方物には，通常使用される賦形剤
が含有され，そのような賦形剤には例えば，製剤グレー
ドのマンニトール，ラクトース，デンプン，ステアリン
酸マグネシウム，サッカリンナトリウム，セルロース，
炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は，溶
液，懸濁液，錠剤，丸剤，カプセル剤，放出を維持する
ような処方，あるいは粉剤の形態を有し，活性成分を１
０％〜９５％，好ましくは２５％〜７０％の割合で含有
する。
【０１０１】このタンパクは，そのままであるいは塩の
形で，ワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る
塩には，酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形
成される）が包含され，この塩は，無機酸（例えば，塩
酸あるいはリン酸）あるいは有機酸（例えば酢酸，シュ
ウ酸，酒石酸，マレイン酸など）を用いて形成される。
遊離のカルボキシル基により形成される塩は，無機塩基
（例えば，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，アンモ
ニア，水酸化カルシウム，あるいは水酸化鉄）および有
機塩基（例えば，イソプロピルアミン，トリメチルアミ
ン，２−エチルアミノエタノール，ヒスチジン，プロカ
インなど）からも誘導され得る。
【０１０２】ＩＩ．Ｆ．ワクチンの用量および投与 このワクチンは投薬処方に適合するように，そして予防
効果および／または治療効果が得られる量で，投与され
る。投与される量は，一般に１回の投与あたり抗原が５
μｇ〜２５０μｇであり，この投与量は治療される個
体，該個体の免疫系の抗体合成能，および所望する保護
の度合に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確
な量は，医師の判断によるものであり，それぞれの個体
に特有であり得る。
【０１０３】このワクチンは，１回の投与計画で与えら
れるか，あるいは好ましくは複数回の投与計画で与えら
れ得る。複数回の投与計画では，最初のワクチン投与
は，１〜１０回に分けて行なわれ，第２回目の投与では
免疫応答維持もしくは強化するために第１回目とは別に
所定の間隔をおいて引き続いて１〜４ケ月投与され，そ
して必要であれば数ケ月後にさらに引続き投与が行なわ
れる。この投与形態はまた，少なくとも部分的には，個
人の必要量によって決定され，医師の判断による。
【０１０４】さらに，免疫原性のＨＣＶ抗原を有するワ
クチンは，他の免疫調整因子，例えば免疫グロブリンと
組み合わせて投与され得る。
【０１０５】ＩＩ．Ｇ．ＨＣＶエピトープに対する抗体
の調製 上述のようにして調製される免疫原性のポリペプチド
は，ポリクローナル，および，モノクローナルの両抗体
を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望
であれば，選択される哺乳動物（例えば，マウス，ウサ
ギ，ヤギ，ウマなど）はＨＣＶエピトープを有する免疫
原性ポリペプチドを用いて免疫される。免疫された動物
から得られる血清は回収され，公知の方法によって処理
される。
【０１０６】ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル
抗体を有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる
場合には，このポリクローナル抗体は免疫アフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクロ
ーナルな抗血清を産生し，処理する手法は，当該分野で
は公知であり，例えばＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ
（１９８７）を参照されたい。
【０１０７】あるいは，ポリクローナル抗体は，あらか
じめＨＣＶに感染させておいた哺乳動物から単離され得
る。感染個体の血清から得られるＨＣＶエピトープに対
する抗体を精製する方法の例は，Ｖ．Ｅ．節で述べられ
ており，これは，アフィニティークロマトグラフィーに
基づき，ＳＯＤとｃＤＮＡクローン５−１−１内にコー
ドされたポリペプチドとの融合ポリペプチドを利用する
方法である。
【０１０８】ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル
抗体もまた，当業者により容易に生産され得る。ハイブ
リドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的
な方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細
胞融合によって作成することができ，さらに，腫瘍原性
ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換，あるいはＥ
ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いたトランスフェ
クションのような他の手法によってもまた作成すること
ができる。例えば，Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８
０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｋｅｎｎ
ｅｔｔら（１９８０）の文献を参照されたい。さらに，
米国特許Ｎｏ．４，３４１，７６１；Ｎｏ．４，３９
９，１２１；Ｎｏ．４，４２７，７８３；Ｎｏ．４，４
４４，８８７；Ｎｏ．４，４６６，９１７；Ｎｏ．４，
４７２，５００；Ｎｏ．４，４９１，６３２；およびＮ
ｏ．４，４９３，８９０もまた，参照されたい。ＨＣＶ
エピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパ
ネルは，種々の目的（例えばアイソタイプ，エピトープ
親和性など）に応じてスクリーニングされ得る。
【０１０９】モノクローナルおよびポリクローナル両抗
体は，ＨＣＶエピトープに対して形成され，特に診断に
おいて有用であり，中和抗体は受動免疫治療に有用であ
る。特にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体
を生じさせるために用いられ得る。
【０１１０】抗イディオタイプ抗体は，それに対して保
護が望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ（ｉｎｔ
ｅｒｎａｌ ｉｍａｇｅ）」を伴う免疫グロブリンであ
る。例えば，Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ら（１９８５）お
よびＤｒｅｅｓｍａｎら（１９８５）を参照されたい。
【０１１１】抗イディオタイプ抗体を生じさせるための
手法は，当該分野で公知である。例えば，Ｇｒｚｙｃｈ
（１９８５）， ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４），
およびＵｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照れた
い。これらの抗イディオタイプ抗体は，ＮＡＮＢＨの治
療，およびＨＣＶ抗原の免疫原性領域を解明するのにも
有用である。
【０１１２】ＩＩ．Ｈ．診断用オリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびキット 単離されたＨＣＶ ｃＤＮＡの開示部分（第１〜４６図
に示される部分を包含する）を基本として用いて，約８
個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマー
が切断あるいは合成によって調製され得る。このオリゴ
マーは，ＨＣＶゲノムとハイブリダイズし，このウイル
ス性因子の同定，さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づ
け，および疾患個体のウイルスの検出に有用である。Ｈ
ＣＶポリヌクレオチドプローブ（天然あるいは誘導され
た）は，ハイブリダイゼーションによって独特のウイル
ス配列を検出し得る長さである。６〜８個のヌクレオチ
ドが，その機能を果たし得る長さであるが，１０〜１２
個のヌクレオチド配列が好適であり，約２０のヌクレオ
チドが最も好適であると考えられる。好ましくは，これ
ら配列は，異種性を欠いている領域由来である。これら
プローブは自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む，定
型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブに
は，例えば，本明細書で開示されたクローン５−１−１
および付加的なクローン，そして，ｃＤＮＡライブラリ
ーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーが
ある。ＨＣＶゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使
用され得る。フラグメントの長さが長くなるにつれ完全
に相補性を有する必要はなくなるのであるが，プローブ
として使用するには完全な相補性が望まれる。
【０１１３】診断用としてこのようなプローブを使用す
るには，血液あるいは血清のような分析されるべき生物
学的試料は，必要であれば，そこに含有されている核酸
を抽出するために処理される。この試料から得られた核
酸は，ゲル電気泳動あるいは他のサイズ分離手段にかけ
られ得る。あるいは，この核酸試料は，サイズ分離を行
うことなくドットプロットされ得る。次にこのプローブ
は標識化される。プローブを標識するための適当な標識
物，および方法は当該分野では公知であり，それには例
えば，ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理
で取り込まれた放射性標識物，ビオチン螢光プローブ，
および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出され
た核酸は，次に，適当な厳密さのハイブリダイゼーショ
ン条件下で，標識されたプローブと共に処理される。
【０１１４】このプローブは，ＨＣＶゲノムに完全に相
補的に作成され得る。従って，偽陽性を防ぐために，通
常，厳密性の高い条件が望まれる。しかし，プローブが
異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補性を有する場合
のみに，厳密性の高い条件が使用される。ハイブリダイ
ゼーションの厳密さは，ハイブリダイゼーションおよび
洗浄工程中の多くの因子（温度，イオン強度，時間の長
さおよびホルムアルデヒドの濃度を含む）により決定さ
れる。これらの因子は，例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ
（１９８２）により概説されている。
【０１１５】一般に，このＨＣＶゲノム配列は，感染個
体の血清中に比較的低レベル（つまり，１ｍｌあたり約
１０２〜１０３個の配列）で，存在する。このレベルは
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅手法が用
いられることが必要であり得ることを示している。その
ような手法は当該分野では公知である。例えばＥｎｚｏ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの
「Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ」システムでは，ＤＮＡプロー
ブに未修飾の３’−ポリ−ｄＴテールを付加するため
に，末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用
いている。ポリｄＴテールを付加したプローブは標的と
なるヌクレオチド配列にハイブリダイズされ，ついで，
ビオチン修飾ポリＡにハイブリダイズされる。ＰＣＴ出
願８４／０３５２０およびＥＰＡ１２４２２１には次の
ような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが
記述されている：（１）被分析物を，酵素標識オリゴヌ
クレオチドに相補的な単鎖ＤＮＡプローブにアニールす
る；および（２）得られたテールが付加された二本鎖を
酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。
ＥＰＡ２０４５１は次のような方法のＤＮＡハイブリダ
イゼーションアッセイが記述されている。この方法で
は，分析物であるＤＮＡを，例えば，ポリｄＴテールの
ようなテールを有するプローブと接触させ，次に増幅鎖
と接触させる。この増幅鎖は，プローブのテールとハイ
ブリダイズするポリＡ配列のような配列を有し，複数の
標識鎖を結合することが可能である。特に望ましい方法
では，まず血清中標的ＨＣＶ配列が約１０，０００倍，
つまり約１０６配列／ｍｌとなるように，標的ＨＣＶ配
列の増幅が行われる。これは，例えば，Ｓａｉｋｉら
（１９８６）の方法によって行なわれ得る。この増幅さ
れた配列は，ハイブリダイゼーションアッセイ法を用い
て検出され得る。このハイブリダイゼーションアッセイ
法は，本願出願人による係属中の米国出願（１９８７年
１０月１５日出願；代理人のＤｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２３
００−０１７１）中に記載されており，これは，参考文
献としてここに取り入れられている。１０６／ｍｌのレ
ベルで配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッ
セイ法では，単鎖の分析すべき核酸に結合し，多数の単
鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利
用する。標識されたポリヌクレオチドプローブを用い
る，適当な溶液相のサンドイッチアッセイ，およびプロ
ーブの調製法は，１９８７年６月１６日に公開された本
願出願人によるＥＰＯ ２２５，８０７に記載されてお
り，これを参考文献としてここに取り入れる。
【０１１６】このプローブは診断用キット中に組み入れ
ることができる。診断用キットは，プローブＤＮＡを有
し，このプローブＤＮＡは標識されているか，あるいは
このプローブＤＮＡは標識されておらず，標識用の成分
がキット中に入っている。このキットにはまた，特定の
ハイブリダイゼーションのプロトコルに必要な他の試薬
および材料（例えば，標準品，およびこのテストを行な
うための指示書）が適当に包装されて含まれる。
【０１１７】ＩＩ．Ｉ．イムノアッセイおよび診断用キ
ット ＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプ
チド，およびこれらのポリペプチドのＨＣＶ特異的エピ
トープに対して生じる抗体は，イムノアッセイにおい
て，例えば血液または血清試料を包含する生物学的試料
におけるＨＣＶ抗体の存在，あるいはウイルスおよび／
またはウイルス抗原の存在を検出するために有用であ
る。上記ＨＣＶ抗体は，例えば，ＩＶ．Ａ節で記載され
たクローン由来であり，あるいは，このクローン内にコ
ードされ，そしてそれらの複合体である。上記ＨＣＶ特
異的エピトープに対して生じる抗体については，例え
ば，ＩＶ．Ｅ節を参照されたい。このイムノアッセイの
設計は多くの変更を行うことが可能であり，これらアッ
セイの多様性については当該分野では既知である。例え
ば，このイムノアッセイでは，１種のウイルス抗原が利
用され得る。このウイルス抗原は，例えば，ＩＶ．Ａ節
で記載のＨＣＶ ｃＤＮＡを有するクローンのいずれか
由来のポリペプチド，あるいはこれらクローンのｃＤＮ
Ａ由来の複合ｃＤＮＡ由来のポリペプチド，あるいはこ
れらのクローンのｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶゲノム由
来のポリペプチドである。あるいは，このイムノアッセ
イには，これらの源由来のウイルス抗原の組合せが用い
られ得る。例えば，ウイルスのエピトープに対する１種
のモノクローナル抗体，ひとつのウイルスの抗原に対す
るモノクローナル抗体の組み合わせ，異なるウイルス抗
原に対する複数のモノクローナル抗体，同一のウイルス
抗原に対するポリクローナル抗体，あるいは異なるウイ
ルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。
プロトコルは，例えば，競合分析法，直接分析法，ある
いはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができ
る。このプロトコルではまた，固体支持体を用いるか，
あるいはこのプロトコルは，免疫沈澱法であり得る。ほ
とんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの
使用を含む。この標識物には例えば，螢光分子，化学発
光分子，放射性分子あるいは染色分子がある。このプロ
ーブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であ
る。その例としては，ビオチンおよびアビジンを利用す
るアッセイ，および酵素標識および酵素媒介イムノアッ
セイ（例えば，ＥＬＩＳＡアッセイ）がある。
【０１１８】ＨＣＶのフラビウイルスモデルにより，ビ
リオンの構造タンパクに対する診断用エピトープの位置
の推定が可能となる。Ｃ， プレＭ，ＭおよびＥドメイ
ンはすべて，ウイルス抗原を検出するために，特に診断
用に，有意な可能性のあるエピトープを含有していると
考えられる。同様に，非構造タンパクのドメインは，重
要な診断用エピトープ（例えば，推定のポリメラーゼを
コードするＮＳ５；および推定の補体結合抗原をコード
するＮＳ１）を有することが予想される。これらの特異
的ドメイン由来のエピトープを有する組換えポリペプチ
ドあるいはウイルスのポリペプチドは，感染血液提供お
よび感染患者におけるウイルス杭体の検出に有用であ
る。
【０１１９】さらに，Ｅおよび／またはＭタンパクに対
する抗体がＮＡＮＢＨによって引き起これるＨＣＶ患者
および感染血液提供者のウイルス抗原を検出するイムノ
アッセイにおいて用いられ得る。さらに，これら抗体は
急性期のドナーおよび患者を検定するのに非常に有用で
ある。
【０１２０】免疫診断に適し，適切に標識された試薬を
有するキットが，適切な材料を適当な容器中に包装する
ことによって得られる。この適切な材料には，ＨＣＶエ
ピトープを有する本発明のポリペプチド，あるいはＨＣ
Ｖエピトープに対する抗体，およびアッセイの遂行に用
いられる他の試薬および物質，さらにアッセイの指示書
のセットを含む。
【０１２１】ＩＩ．Ｊ．ウイルスゲノムに対するｃＤＮ
Ａのプローブを用いた，ＨＣＶゲノム，ビリオンおよび
ウイルス抗源の他の特性決定 ＩＶ．Ａ．節に記載したクローンのＨＣＶ ｃＤＮＡ配
列の情報は，第１図〜第４６図に示すように，ＨＣＶゲ
ノムの配列とＨＣＶ因子の同定と単離とについての情報
をさらに得るために用いられ得，その結果，ゲノムの性
質，ウイルス粒子の構造，およびウイルスが有する抗原
の性質を含めたウイルスの特性決定の助けになる。さら
に，この情報によって，付加的なポリヌクレオチドプロ
ーブ，ＨＣＶゲノム由来のポリペプチド，およびＨＣＶ
が原因のＮＡＮＢＨの診断および／または治療に有用な
ＨＣＶエピトープに対応する抗体が得られるようにな
る。
【０１２２】上記クローンのｃＤＮＡ配列の情報は，Ｉ
Ｖ．Ａ節に記載されたクローンのｃＤＮＡの起源である
ＨＣＶゲノムの未確定領域由来の他のｃＤＮＡ配列を単
離するためのプローブを設計するのに有用である。例え
ば，約８個またはそれ以上，好ましくは２０個またはそ
れ以上のヌクレオチドの配列を有する標識化プローブ
は，第１，第３，第６，第９〜１０，第１５〜１７およ
び第４０〜４６図に示すＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の群の
５’末端または３’末端に近い領域由来のものであり，
ＨＣＶ ｃＤＮＡライブラリーから重複ｃＤＮＡ配列を
単離するのに用いられ得る。上記クローンのｃＤＮＡと
重複するこれらの配列は，上記クローンのｃＤＮＡの起
源でないゲノムの領域由来の配列も含んでいるが，Ｉ
Ｖ．Ａ節に記載のクローンのｃＤＮＡと必らずしも重複
しない，他の重複断片を同定するためのプローブを合成
するのに利用することができる。ＨＣＶゲノムが切断さ
れ，そのセグメントが共通の配列を欠いていなければ，
ウイルスゲノム由来の重複ｃＤＮＡを単離する技術を利
用して，全ウイルスゲノムの配列を決定することができ
る。これとは異なり，ゲノムが切断されていて共通配列
を欠いている場合は，ゲノムの配列は，ＩＶ．Ａ節に記
載したクローンの単離および配列決定の技術を用い，ク
ローン５−１−１を単離するのに用いたのと同様に，λ
ｇｔ１１ ＨＣＶライブラリーを血清学的にスクリーニ
ングし，ｃＤＮＡ単離物の配列を決定し，単離されたｃ
ＤＮＡを利用して重複断片を単離することによって，決
定することができる。あるいは，ゲノムセグメントの特
性決定は，精製されたＨＣＶ粒子から単離されたウイル
スゲノムで行うことができる。ＨＣＶ粒子を精製し，精
製中の粒子を検出する方法は後述する。ポリヌクレオチ
ドのゲノムのウイルス粒子からの単離工程は，当該技術
分野では公知であり，利用される一方法を実施例ＩＶ．
Ａ．１．に示す。単離されたゲノムのセグメントは，次
に，クローン化され配列決定され得る。このように，こ
こで提供される情報によって，その性質にかかわりな
く，ＨＣＶゲノムをクローン化し配列を決定することが
できる。
【０１２３】ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は，
当該技術分野では公知であり，すでに記載し，あるいは
後で述べられる。λｇｔ１１内にＨＣＶ ｃＤＮＡライ
ブラリーを構築する方法は，ＩＶ・Ａ・節ですでに述べ
られている。しかし，核酸プローブでスクリーニングす
るのに有用なｃＤＮＡライブラリーもまた，当該技術分
野で公知の他のベクター内，例えばλｇｔ１０〔ヒュイ
ンら（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ），１９８５年〕内で構
築することができる。第１〜４６図のｃＤＮＡ由来のプ
ローブ，およびこれらｃＤＮＡ由来のポリヌクレオチド
から合成されたプローブによって検出された，ＨＣＶ由
来のｃＤＮＡは，単離されたポリヌクレオチドを，適当
な制限酵素で切断することによって，クローンから単離
し，配列を決定することができる。例えば，クローン５
−１−１中のＨＣＶ ｃＤＮＡと重複するＨＣＶ ｃＤ
ＮＡの単離と配列決定とに使用される手法については，
ＩＶ．Ａ．３節およびＩＶ．Ａ．４節を；クローン８１
中のＨＣＶ ｃＤＮＡと重複するＨＣＶ ｃＤＮＡの単
離と配列決定とについては，ＩＶ．Ａ．５〜ＩＶ．Ａ．
７節を；そして，他のクローン（クローン３６）および
クローン８１と重複するクローンの単離と配列決定とに
ついては，ＩＶ．Ａ．８節およびＩＶ．Ａ．９節を参照
されたい。
【０１２４】これらの重複ＨＣＶ ｃＤＮＡ由来の配列
情報は，ウイルスゲノム内の相同領域と異なる領域とを
決定するのに有用であり，このことにより，異なる種類
のゲノムおよび／または欠陥粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ
ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の集団の存在を示すことができ
る。ＩＩ．Ｇ．節に記載の手法を利用して，ＨＣＶの単
離（後述する）中に，生物学的試料中のＨＣＶ，ＨＣＶ
抗原またはＨＣＶ核酸を検出することはまた，ハイブリ
ダイゼーションプローブを設計するのに有用である。さ
らに，重複ｃＤＮＡは，クローン５−１−１，３６，８
１，９１および１−２内ならびにＩＶ．Ａ．節に記載の
他のクローン内にコードされているポリペプチドをコー
ドするＨＣＶゲノム由来のポリペプチドの発現ベクター
を作製するのに利用できる。ＨＣＶエピトープを有する
これらのポリペプチドを作製する技術と，ポリペプチド
に含有されているＨＣＶエピトープに対応する抗体とそ
の用途に関する技術とは，クローン５−１−１，３２，
３５，３６，１−２，８１および９１に含まれるＮＡＮ
ＢＶ ｃＤＮＡ配列由来のポリペプチドについて記載さ
れ，すでに検討されまた後にも検討される技術と類似す
る。
【０１２５】クローン５−１−１，３２，３５，３６，
８１，９１，１−２およびＩＶ．Ａ．節に記載の他のク
ローンに含まれているｃＤＮＡ配列の群内に，ＨＣＶに
特有のものと考えられるエピトープを含有する抗原がコ
ードされている。つまり，これらの抗原に対する抗体が
ＨＡＶもしくはＨＢＶに感染した個体に欠けており，そ
してＨＣＶに感染していない個体に欠けている（ＩＶ．
Ｂ．節に示す血清学的データ参照）。さらに，これらの
ｃＤＮＡの配列情報と，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＤＶの配列
および遺伝子バンクのゲノム配列とを比較すると，これ
らのｃＤＮＡと上記の起源のポリヌクレオチドの配列と
には最小の相同性が存在することが示されている。この
ように，これらクローンのｃＤＮＡ内にコードされてい
る抗原に対する抗体は，感染した個体から単離したＢＢ
−ＮＡＮＢＶ粒子を同定するのに用いることができる。
さらに，この抗体は，ＮＡＮＢＨ因子の単離にも有用で
ある。
【０１２６】ＨＣＶ粒子は，ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染し
た個体由来の血清または細胞培養物から，以下のような
当該技術分野で公知の方法で単離することができる。公
知の方法としては，例えば，沈降法もしくは排除法のよ
うなサイズ識別に基づく方法；密度勾配による超遠心分
離法のような密度に基づく方法；ポリエチレングリコー
ルのような試薬による沈澱法；またはアニオンもしくは
カチオン交換物質，疎水性によって結合する物質のよう
な種々の物質およびアフィニティカラムのカラムによる
クロマトグラフィー法がある。この分離工程中に，ＨＣ
Ｖの存在は次のような方法で検出できる。すなわち，先
に述べたＨＣＶ ｃＤＮＡ由来のプローブを用いて，抽
出されたゲノムをハイブリダイゼーション分析する方
法；または第１〜４６図に示すｃＤＮＡ配列の群内にコ
ードされたＨＣＶ抗原に対する抗体および先に述べた重
複ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列内にコードされたＨＣＶ抗原に
対する抗体をプローブとして用いる免疫検定法（ＩＩ．
Ｉ．節参照）がある。抗体はモノクローナル抗体であっ
てもポリクローナル抗体であってもよく，免疫検定法に
これら抗体を使用する前に精製することが望ましい。ク
ローン５−１−１内にコードされた抗原に対するポリク
ローナル抗体の精製法は，ＩＶ．Ｅ．節に記載されてい
るが，類似の精製法を，他のＨＣＶ抗原に対する抗体に
利用することができる。
【０１２７】第１〜４６図に示すｃＤＮＡの群内にコー
ドされたＨＣＶ抗原とに対する抗体は，固体の支持体に
固定されており，免疫アフィニティクロマトグラフィー
によるＨＣＶの単離に有用である。免疫アフィニティク
ロマトグラフィーの手法は，当該技術分野で知られてお
り，例えば，抗体を固体の支持体に固定しその免疫選択
活性を保持する方法がある。この方法には，抗体が支持
体に吸着されている方法〔例えば，カースタック（Ｋｕ
ｒｓｔａｋ）のＥＮＺＹＭＥ ＩＭＭＵＮＯＤＩＡＧＮ
ＯＳＩＳ，３１〜３７頁参照〕および抗体が支持体と共
有結合されている方法がある。一般に，これらの方法
は，抗原を固体支持体に共有結合させて使用する方法と
同様であり，それはＩＩ．Ｃ．節に概略記載されている
が，スペーサー茎が二官能性のカップリング試薬に含ま
れ，抗体の抗原と結合する部位が近づきやすいようにな
っている。
【０１２８】精製処理中に，ＨＣＶの存在が，すでに述
べた第１〜４６図に示すＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の群およ
び重複ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列由来のポリヌクレオチドを
プローブとして利用する核酸ハイブリダイゼーション法
によって検出および／または確認される。この場合，画
分は，ウイルス粒子の崩壊を起こすような条件下で，例
えば，キレート試薬の存在下およびＩＩ．Ｈ．節にも記
載したハイブリダイゼーション法によって検出されるウ
イルス核酸の存在下で，界面活性剤によって処理され
る。単離された粒子がＨＣＶを誘発する因子であるとい
うことは，単離されたウイルス粒子をチンパンジーに感
染させ，次いでＮＡＮＢＨの徴候が感染によるものであ
るか否かを決定することによって確認することができ
る。
【０１２９】次に，精製された調製物から得たウイルス
粒子は，さらに特性決定される。そのゲノム核酸が精製
された。このゲノム核酸がＲＮａｓｅに対して感受性で
ＤＮａｓｅ Ｉに感受性でないことから，そのウイルス
がＲＮＡゲノムで構成されていることが明らかである
（後述のＩＶ．Ｃ．２．節参照）。そのゲノム核酸のス
トランドの状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）および円
形性（ｃｉｒｃｕ ｌａｒｉｔｙ）であるか非円形性で
あるかということは，公知の技術，例えばそれを電子顕
微鏡により視覚化すること，密度勾配により移動させる
こと，および沈降特性を調べることによって測定され
る。捕捉されたＨＣＶゲノムがＨＣＶ ｃＤＮＡの負の
フトランドとハイブリダイズすることから，ＨＣＶは正
のストランドのＲＮＡゲノムを含むことが明らかである
（ＩＶ．Ｈ．１節参照）。このような手法は，例えば，
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹに記載さ
れている。さらに，精製された核酸は，クローン化さ
れ，公知の方法（例えば，ゲノム物質はＲＮＡなので逆
転写法）によって配列を決定することができる。例え
ば，マニアティス（１９８２年），およびグローバー
（Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８５年）の文献を参照された
い。ウイルス粒子由来の核酸を利用すれば，それが切断
されていてもいなくても，全ゲノムの配列を決定するこ
とができる。
【０１３０】１４ｉから３９ｃまでの結合クローン（第
２９〜３４図参照）の連続ＯＲＦ内にコードされたポリ
ペプチドの相同性の試験を行うと，ＨＣＶポリペプチド
が，フラビウイス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）の保存
された領域内の対応するタンパクと相同性のある領域を
有することが示される。この具体例は，ＩＶ．Ｈ．３．
節に示されている。この知見には，多くの重要な効果が
ある。第１に，この情報は，ＨＣＶが正のストランゲノ
ムを有し，その大きさが約１０，０００ヌクレオチドで
あることを示す試験結果とともに，ＨＣＶがフラビウイ
ルスかまたはフラビ様ウイルスであることを示唆してい
ると考えて矛盾しない。一般に，フラビウイルスのビリ
オンとゲノムとは，比較的変化しない構造と組織を有
し，このことは公知である。ライスら（Ｒｉｃｅ ｅｔ
ａｌ）（１９８６年），およびブリントン エム エー
（Ｂｒｉｎｔｏｎ Ｍ．Ａ．），（１９８８年）を参照
されたい。従って，ポリペプチドＣ．プレＭ／Ｍおよび
Ｅをコードする構造遺伝子は，クローン１４ｉの上流の
遺伝子の５’末端に位置し得る。さらに，他のフラビウ
イルスと比較することによって，これらのタンパクをコ
ードする配列の正確な位置を予想することができる。
【０１３１】クローン１４ｉのゲノムの上流の配列の単
離は，本明細書に示した多くの方法により達成され得，
そのことは，当業者に自明である。例えば，ゲノム“ウ
ォーキング法（ｇｅｎｏｍｅ“Ｗａｌｋｉｎｇ”ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅ）が，クローン１４ｉ内のゲノムの５’側
にありそのクローンと重複する他の配列を単離するのに
用いられ得るが，この方法によって，付加的な配列の単
離が行われる。この手法は，後述のＩＶ．Ａ．節で十分
に述べられている。例えば，フラビウイルスは，保存さ
れたエピトープと保存された核酸配列の領域とを有する
ことが知られている。保存された配列を含むポリヌクレ
オチドは，ＨＣＶゲノムを捕捉するプローブとして用い
て，それを単離することができる。さらに，これらの保
存された配列は，第２５図に示すＨＣＶ ｃＤＮＡ由来
の配列とともに，ポリメラーゼの連鎖反応の技術を用い
て，クローン１４ｉの配列の上流のゲノム配列を増幅す
る系に使用するプライマーを設計するのに利用される。
この例は後述される。
【０１３２】ＨＣＶの構造もまた，決定され，その成分
が単離され得る。その形態と大きさは，例えば電子顕微
鏡によって決定され得る。コート抗原もしくはエンベロ
ープ抗原のような特異的なウイルスポリペプチド抗原，
または核酸結合タンパク，コア抗原のような内部抗原，
およびポリヌクレオチドポリメラーゼの同定と位置決定
とは，例えば，抗原が大きなもしくは小さなウイルス成
分として存在するか否かを測定すること，および単離さ
れたｃＤＮＡ内にプローブとしてコードされた特異的抗
原に対する抗体を利用すること，によって行なわれ得
る。この情報は，ワクチンを設計するのに有用である。
例えば，ワクチン調製物に外部抗原を含有させることが
好ましい。多価ワクチン（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｖ
ａｃｃｉｎｅ）は，例えばＥのような構造タンパクをコ
ードするゲノム由来のポリペプチド，および例えば非構
造ポリペプチドもしくは構造ポリペプチドのような，ゲ
ノムの別の部分由来のポリペプチドで構成されていても
よい。
【０１３３】ＩＩ．Ｋ．ＨＣＶ複製用の細胞培養系と動
物モデル系 ＨＣＶがフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスであ
るという示唆によって，ＨＣＶ増殖法についての情報が
提供される。“フラビ様”という用語は，そのウイルス
が，フラビウイルスの公知の保存された領域に対して有
意の相同性を示し，そして，そのゲノムの大部分が単一
のＯＲＦであることを意味する。フラビウイルスの培養
法は，当業者に公知である〔例えば，ブリントン（１９
８６年）およびストラー，ブイ（Ｓｔｏｌｌａｒ，
Ｖ．）（１９８０年）の総論を参照されたい〕。一般
に，ＨＣＶを培養するのに適切な細胞もしくは細胞とし
ては，フラビウイルスの複製を維持することが知られて
いるもの，例えば次のものがある：サル腎臓細胞系（例
えば，ＭＫ２，ＶＥＲＯ）；ブタの腎臓細胞系（例え
ば，ＰＳ）；ベビーハムスターの腎臓細胞系（例えば，
ＢＨＫ）；ネズミマクロファージ細胞系（例えば，Ｐ３
８８Ｄ１，ＭＫ１，Ｍｍ１）；ヒトマクロファージ細胞
系（例えば，Ｕ−９３７）；ヒト末梢白血球；ヒトの付
着性単球；肝細胞もしくは肝細胞系（例えば，ＨＵＨ
７，ＨＥＰＧ２）；胚もしくは胚細胞系（例えば，ニワ
トリの胚繊維芽細胞）；または無脊椎動物由来の細胞
系。 上記無脊椎動物由来の細胞系として好ましいのは
昆虫由来のもの（例えば，ショウジョウバエの細胞系）
であり，さらに好ましいのは節足動物由来のもので，例
えば蚊の細胞系〔例えば，Ａ．アルボピクツス（Ａ．Ａ
ｌｂｏｐｉｃｔｕｓ），イーデス イージプチー（Ａｅ
ｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ），クーテックス トリテニオ
リンクス（Ｃｕｔｅｘ ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃ
ｈｕｓ）〕もしくはダニ細胞系〔例えば，ＲＭＬ−１４
ダーマセンター パルマペルツス（Ｄｅｒｍａｃｅｎ
ｔｏｒ ｐａｒｕｍａｐｅｒｔｕｓ）〕である。
【０１３４】一次肝細胞を培養しついでＨＣＶに感染さ
せてもよいし，あるいは肝細胞培養物を感染した個体
（例えば，ヒトもしくはチンパンジー）の肝臓から得て
もよい。後者の場合は，生体内で感染した細胞が生体外
で継代された例である。さらに，種々の永久増殖細胞化
法を，肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いるこ
とができる。例えば，一次肝臓培養物（肝細胞集団の集
積の前後）は，種々の細胞と融合され，安定性を保持す
る。例えば，永久的または半永久的細胞系を創製するた
めに，培養物を，形質転換ウイルスに感染させるか，ま
たは形質転換遺伝子でトランスフェクトさせる。さら
に，例えば，肝臓培養物中の細胞は，融合されて，確立
された細胞系（例えば，ＨｅｐＧ２）となり得る。細胞
融合法は，当該技術分野で既知であり，例えば，ポリエ
チレングリコール，センダイウイルスおよびエプスタイ
ン−バールウイルスのような融合因子が使用される。
【０１３５】上記で述べたように，ＨＣＶはフラビウイ
ルスもしくはフラビ様ウイルスである。従って，細胞系
のＨＣＶ感染は，おそらく，細胞をフラビウイルスに感
染させる当該技術分野で公知の方法によって達成するこ
とができる。これらの方法には，例えば，細胞内にウイ
ルスが侵入しうる条件下で，細胞をウイルス調製物とと
もにインキュベートする方法がある。さらに，細胞を単
離されたウイルスポリヌクレオチドでトランスフェクト
することによってウイルスの産生物を得ることができ
る。トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）およびフラビ
ウイルスのＲＮＡが，種々の脊椎動物の細胞系〔フェフ
ァーコーン（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ）およびシャピロ
（Ｓｈａｐｉｒｏ），１９７４年〕および蚊細胞系〔ペ
レーグ（ｐｅｌｅｇ），１９６９年〕に感染性であるこ
とが知られている。組織培養細胞を，ＲＮＡ二本鎖，正
のストランドのＲＮＡおよびＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）
でトランスフェクトする方法は，当該技術分野では公知
であり，例えば，エレクトロポーレーション法（ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ），およびＤＥＡＥ−デキス
トラン（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ）もしくはリン酸カ
ルシウムによる沈降法を用いる手法がある。ＨＣＶ Ｒ
ＮＡの多くの起源を，完全ゲノムに対応するＨＣＶ ｃ
ＤＮＡの転写を生体外で行うことによって得ることがで
きる。この物質もしくはクローン化されたＨＣＶ ｃＤ
ＮＡを用いたトランスフェクションによって，ウイルス
が複製されそしてウイルスが生体外で増殖するようにな
るはずである。
【０１３６】培養細胞に加えて，動物モデル系がウイル
ス複製に使用できるが，フラビウイルスが動物系に存在
するということは，当業者には公知である〔例えば，モ
ナース（Ｍｏｎａｔｈ）による総説（１９８６年）参
照〕。従って，ＨＣＶの複製は，チンパンジーで起こる
だけでなく，例えば，マーモセットやサックリングマウ
スでも起こる。
【０１３７】ＩＩ．Ｌ．ＨＣＶに対する抗ウイルス剤の
スクリーニング ＨＣＶの細胞培養物と動物モデル系とを利用することに
よって，ＨＣＶの複製を阻害する抗ウイルス剤，特に優
先的に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を
阻害する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができ
る。これらのスクリーニング法は，当業者には知られて
いる。一般に，抗ウイルス剤は，ウイルスの複製を維持
する細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と，動
物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害す
る効果（および低レベルの毒性）について種々の濃度で
試験される。
【０１３８】ＨＣＶ抗原とＨＣＶポリヌクレオチドを検
出するためのここに記載された方法と組成物は，ウイル
ス複製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方法とし
て，細胞プラーク検定法もしくはＩＤ５０検定法の代わ
りにこれらの方法よりもおそらく高感度の方法を提供す
ることから，抗ウイルス剤のスクリーニングに有用であ
る。例えば，ここに記載したＨＣＶポリヌクレオチドプ
ローブは，細胞培養で産生されたウイルス核酸を定量す
るのに利用できる。このことは，例えば感染した細胞の
核酸と標識したＨＣＶポリヌクレオチドプローブとのハ
イブリダイゼーションまたは競合ハイブリダイゼーショ
ンによって達成することができた。例えば，また抗ＨＣ
Ｖ抗体は，本明細書に記載の免疫検定法を利用して細胞
培養物中のＨＣＶ抗原を同定および定量するのに利用で
きる。さらに，感染細胞の培養物中のＨＣＶ抗原を競合
検定法で定量することは望ましいことであるから，本明
細書に記載したＨＣＶ ｃＤＮＡ内にコードされたポリ
ペプチドは，これらの競合検定法に有用である。一般
に，ＨＣＶ ｃＤＮＡ由来の組換え体ＨＣＶポリペプチ
ドに標識化し，この標識化ポリペプチドとＨＣＶポリペ
プチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によっ
て阻害されるのを監視する。さらに，これらの方法は，
ＨＣＶが細胞系内で細胞死を起こすことなく複製できる
場合，特に有用である。
【０１３９】ＩＩ．Ｍ．弱毒化されたＨＣＶ株の調製 上記のことに加えて，組織培養系および／または動物モ
デル系を利用して弱毒化されたＨＣＶ株を単離すること
ができる。これらの株は，ワクチン用もしくはウイルス
抗原単離用に適している。弱毒化ウイルス株は，細胞培
養および／または動物モデルでの複数の継代の後に単離
可能である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検
出は，当該技術分野で公知の方法で達成できる。それに
は，例えば，ＨＣＶにコードされたひとつまたはそれ以
上のエピトープに対する抗体をプローブとして用いるこ
と，あるいは，少なくとも約８個のヌクレオチドのＨＣ
Ｖ配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる
ことが包含される。その代わりにあるいはそれに加え
て，弱毒化株は，本明細書に記載のＨＣＶのゲノム情報
と，組換え技術を利用して構築することができる。一般
に，例えば病原に関連するポリペプチドをコードするが
ウイルスの複製は可能であるようなゲノム領域を除去す
ることを試みることができる。さらに，このゲノム構築
によって，ＨＣＶに対する抗体の中和を起こさせるエピ
トープの発現が可能になる。次いで，変化させたゲノム
は，ＨＣＶ複製が可能な細胞と，ウイルス複製が可能な
条件下で増殖する細胞を形質転換するのに利用できる。
弱毒化ＨＣＶ株は，ワクチン製造のみならずウイルス抗
原の商業的生産ソースとしても有用である。その理由
は，これらウイルスの処理が，ウイルス生産を行う従業
員に対してそれほど厳重な保護対策をとらなくてもよい
からである。
【０１４０】ＩＩＩ． 一般的方法 ウイルスからのゲノムの抽出，ｃＤＮＡライブラリーの
調製とプロービング，クローンの配列決定，発現ベクタ
ーの構築，細胞の形質転換，ラジオイムノアッセイおよ
びＥＬＩＳＡ検定法のような免疫検定の実施，培地での
細胞の培養などに用いられる一般的な方法は，当該技術
分野で公知であり，これらの方法を記載した実験室のマ
ニュアルを入手することができる。しかし，一般的な指
針として，上記の方法およびこれを実施するのに有用な
材料を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
【０１４１】ＩＩＩ．Ａ．宿主および発現制御配列 原核および真核の宿主細胞は，指定された宿主に適合す
る適切な制御配列が用いられた場合に，所望のコード配
列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち，
エシェリヒア コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）が最も汎用され
る。原核細胞の発現制御配列には，必要に応じてオペレ
ーター部分を有するプロモーター，およびリボソーム結
合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトラ
ンスファーベクターは，通常，例えば次のようなものに
由来する。つまリ，アンピシリンおよびテトラサイクリ
ンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドで
あるｐＢＲ３２２および抗生物質耐性のマーカーを与え
る配列を有する種々のｐＵＣベクター由来である。これ
らのマーカーは，適宜選択することによって，好適な形
質転換細胞を得るのに利用できる。通常用いられる原核
細胞の制御配列には，β−ラクタマーゼ（ベニシリナー
ゼ）およびラクトースプロモーター系〔チャンら（Ｃｈ
ａｎｇ ｅｔａｌ），１９７７年〕，トリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゴーデルら（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ ｅｔａｌ），１９８０年〕およびλ由来ＰＬプロモ
ーターおよびＮ 遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケ
ら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ）， １９８１
年〕，およびｔｒｐおよびｌａｃＵＶ５ プロモーター
の配列由来のハイブリツドｔａｃ プロモーター〔ド
ボールら（Ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ），１９８３
年〕がある。上記の系は，特にＥ． ｃｏｌｉに適合す
る。必要であれば，バシラスもしくはシュードモナス属
の菌株のような他の原核宿主を，対応する制御配列とと
もに用いてもよい。
【０１４２】真核宿主としては，酵母および培養系内の
哺乳動物の細胞がある。サッカロミセス セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）およびサッカロミセス カールスベルゲンシス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓ
ｉｓ）が最も普通に用いられる酵母宿主であり，便利な
真菌宿主である。酵母に適合するベクターは，栄養要求
突然変異体に原栄養性を与えるかまたは野生型菌株に重
金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転
換された形質転換体を選択することができるようにする
マーカーを保有する。酵母に適合するベクターとして
は，２ミクロンの複製起源〔ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ
ｅｔ ａｌ），１９８３年〕，ＣＥＮ３およびＡＲＳ
１の組み合わせ，または確実に複製を行わせる他の手段
（例えば，適切なフラグメントを宿主細胞のゲノムに組
込ませるような配列を採用することができる。酵母ベク
ターの制御配列は，当該技術分野で公知であり，解糖酵
素合成のプロモーター〔ヘスら（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａ
ｌ），１９６８年；ホーランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅ
ｔａｌ），１９７８年〕を含み，このようなプロモータ
ーには，３−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン
（Ｈｉｔｚｅｍａｎ），１９８０年〕に対するプロモー
ターが含まれる。ターミネーターには，例えばエノラー
ゼ遺伝子由来のターミネーター〔ホーランド（Ｈｏｌｌ
ａｎｄ），１９８１年〕が含まれ得る。特に有用な制御
系は，グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡ
ＰＤＨ）プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素
（ＡＤＨ）調節性プロモーター，ＧＡＰＤＨ由来のター
ミネーター，および分泌が所望の場合には，酵母α因子
由来のリーダー配列を含む系である。さらに，作動可能
に連結されている転写調節領域および転写開始領域は，
野生型生物に本来関係しないものであってもよい。これ
らの系については，欧州特許公開第１２０，５５１号
（１９８４年１０月３日公開）；同第１１６，２０１号
（１９８４年８月２２日公開）；および同第１６４，５
５６号）（１９８５年１２月１８日公開）に詳細に記載
されており，これらはすべて本発明の出願人によるもの
であり，本願に引用文献として記載する。
【０１４３】発現のために宿主として利用可能な哺乳類
の細胞系は当該技術分野で知られており，ｔｈｅ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの永久増殖
化細胞系がある。それには，Ｈｅｌａ細胞，チャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞，ベビーハムスター腎
臓（ＢＨＫ）細胞および多くの他の細胞系がある。哺乳
類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技術分野で
は公知であり，それには，シミアンウイルス４０（Ｓｉ
ｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）（ＳＶ４０）〔フィアース（Ｆ
ｉｅｒｓ），１９７８年〕，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ），アデノウイルス （ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウ
イルス（ＢＰＶ）由来のプロモーターのようなウイルス
プロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた，ターミネ
ーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし，発現を増
大させるエンハンサー配列も含まれ，そして，遺伝子の
増幅を引き起こす配列も望ましい。これらの配列は当該
技術分野で公知である。哺乳類の細胞で複製させるのに
適切なベクターには，ウイルスレプリコン，またはＮＡ
ＮＢＶエピトープをコードする適当な配列を宿主ゲノム
に確実に組込む配列が含まれる。
【０１４４】ＩＩＩ．Ｂ．形質転換 形質転換は，ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公
知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例
えば，ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージング
し，次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法
およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用
される形質転換法は，形質転換すべき宿主に依存する。
例えば，Ｅ． ｃｏｌｉ宿主細胞を，ＢＢ−ＮＡＮＢＶ
配列を有するλｇｔ１１で形質転換することが後述の実
施例の項で述べられている。直接取込み法による細菌の
形質転換には，一般に，塩化カルシウムまたは塩化ルビ
ジウムによる処理が用いられる〔コーヘン（Ｃｏｈｅ
ｎ），１９７２年；マニアティス，１９８２年〕。直接
取込み法による酵母の形質転換は，ヒネンら（Ｈｉｎｎ
ｅｎ ｅｔ ａｌ），１９７８年，の方法を用いて行わ
れ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換は，グラ
ハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファン デル エブ（Ｖａ
ｎｄｅｒＥｂ）１９７８年，のリン酸カルシウム沈澱法
またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ得
る。
【０１４５】ＩＩＩ．Ｃ．ベクターの構築 ベクターの構築には，当該技術分野で公知の技術が用い
られる。部位特異的なＤＮＡの切断が，適切な制御酵素
を用い，これら市販の酵素のメーカーによって一般に規
定されている条件下で処理することによって，実施され
る。一般に，約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡ配列
は，約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて３
７℃の条件下で１〜２時間インキュベートすることによ
り切断される。制限酵素とともにインキュベートした
後，タンパクを，フェノール／クロロホルムによって抽
出して除去し，エタノールで沈澱させてＤＮＡが回収さ
れる。切断断片は，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，６５巻，４９９〜５６０頁，１９８０年，
に記載された一般的な方法に従って，ポリアクリルアミ
ドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法により分
離することができる。
【０１４６】粘着末端を有する切断断片は，混合物に存
在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート
（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリ
メラーセＩ（クレノー）を用いて平滑末端とされ得る。
Ｓ１ヌクレアーゼによる処理も行なわれ得，一本鎖ＤＮ
Ａ部分の加水分解が行われる。
【０１４７】Ｔ４ＤＮＡリガーゼとＡＴＰとを用いて標
準の緩衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘
着末端の連結には，平滑末端の連結よりも，ＡＴＰおよ
びリガーゼの必要量が少い。ベクター断片が連結混合物
の一部として用いられる場合には，ベクター断片は，細
菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸ア
ルカリホスファターゼで処理され，５’末端のリン酸を
除去して，ベクターの再連結を防止することが多い。あ
るいは，不必要な断片の制限酵素による切断を利用して
連結を防止するのに利用することができる。
【０１４８】連結混合物は，Ｅ． ｃｏｌｉのような適
切なクローニング宿主に形質転換され，次いで，例え
ば，抗生物質耐性によって成功裏に形質転換された形質
転換体が選択され，そして正しい構築物がスクリーニン
グされる。
【０１４９】ＩＩＩ．Ｄ． 所望のＤＮＡ配列の構築 合成オリゴヌクレオチドは，ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ）
（１９８４年）が発表した自動オリゴヌクレオチド合成
装置を用いて調製され得る。必要に応じて，合成ＤＮＡ
鎖は，反応の標準条件を用いて，３２Ｐ−ＡＴＰの存在
下，ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって
３２Ｐで標識化され得る。
【０１５０】ＤＮＡ配列は，ｃＤＮＡライブラリーから
単離されたものも含めて，公知の方法で修飾することが
できる。そのような方法としては，例えば，ゾラー（Ｚ
ｏｌｌｅｒ）（１９８２年）が発表した部位特異的変異
誘発法がある。概略を述べると，修飾すべきＤＮＡを，
一本鎖配列としてファージにパッケージングし，次にプ
ライマーとして，修飾すべきＤＮＡの部分に相補的であ
り，それ自体の配列内に所望の修飾が含まれている合成
オリゴヌクレオチドを用いて，ＤＮＡポリメラーゼで二
本鎖ＤＮＡに変換する。得られた二本鎖ＤＮＡは，ファ
ージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換さ
れた細菌の培養物（ファージの各鎖の複製物を含む）
は，寒天にプレートされてプラークが得られる。理論的
には，新しいプラークの５０％が，変異した配列を有す
るファージを含有し，残りの５０％はもとの配列を有す
る。プラークのレプリカは，正しいストランドとハイブ
リダイゼーション可能であり，かつ未修飾の配列とはハ
イブリダイゼーションを行わない温度および条件下で，
標識化された合成プローブとハイブリダイゼーションを
行なう。ハイブリダイゼーションにより同定された配列
は，回収されクローン化される。
【０１５１】ＩＩＩ．Ｅ．プローブによるハイブリダイ
ゼーション ＤＮＡライブラリーは，グリンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔ
ｅｉｎ）およびホッグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７
５年）の方法を用いてプローブ化され得る。簡単にのべ
れば，この方法においては，プローブ化されるべきＤＮ
Ａは，ニトロセルロースフィルタ上に固定され，変性さ
れ，そして，０〜５０％ホルムアミド，０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ，７５ｍＭ クエン酸ナトリウム，各々０．０２
％（ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン，ポリビニルピロ
リドンおよびフィコール，５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ６．５），０．１％ＳＤＳ，そして１００μｇ／
ｍｌキャリヤーの変性ＤＮＡを含有する緩衝液で，プレ
ハイブリダイゼーションが行われる。緩衝液中のホルム
アミドの濃度（％），およびプレハイブリダイゼーショ
ンおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間
と温度条件は，必要とされる厳密さに依存する。厳密さ
がそれほど必要ではない条件下でのオリゴマーのプロー
ブは，一般に，ホルムアミドが低い濃度であり，低温お
よび長いハイブリダイゼーションの時間で用いられる。
ｃＤＮＡもしくはゲソムの配列由来のような３０もしく
は４０を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いる
ときには，−般に，例えば，約４０〜４２℃のような高
温，および５０％ホルムアミドのような高濃度が採用さ
れる。プレハイブリダイゼーションに続いて，５’末端
３２Ｐで標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液
に添加し，この混合物中で，ハイブリダイゼーションの
条件下にて，上記フィルターをインキュベートする。洗
浄後，処理されたフィルターをオートラジオグラフィー
に付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示され
る。もとの寒天プレート上の，対応する位置のＤＮＡを
所望のＤＮＡの起源として利用する。
【０１５２】ＩＩＩ．Ｆ． 構築物の確認および配列決
定 常套手段により，ベクターを構築する際には，連結混合
物を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株もしくは他の
適当な宿主を形質転換し，成功裏に形質転換された形質
転換体は，抗生物質耐性もしくは他のマーカーによって
選択される。次に，得られた形質転換体から，プラスミ
ドが，クレウェルら（Ｃｌｅｗｅｌｌｅｔ ａｌ．）
（１９６９年）の方法により調製され，通常，さらに，
クロラムフェニコールによる増幅（クレウェル，１９７
２年）が行なわれる。そのＤＮＡは，単離され，通常，
制限酵素分析法および／または配列決定法により分析さ
れる。配列決定は，サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９
７７）の，そしてさらにメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら
により述べられた（１９８１年），ジデオキシ法，ある
いはマキシムらの方法（１９８０年）により実施され得
る。ＧＣに富んだ領域において時おり観察されるバンド
コンプレッションの問題は，バールら（Ｂａｒｒ ｅｔ
ａｌ）（１９８６年）の方法に従って，Ｔ−デアゾグ
アノシン（ｄｅａｚｏ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を用いる
ことによって克服された。
【０１５３】ＩＩＩ．Ｇ．酵素連結イムノソルベント検
定法（ＥＬＩＳＡ法） ＥＬＩＳＡ法は，抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を
測定するのに利用され得る。この方法は，酵素と，抗原
もしくは抗体との結合に依存し，定量の標識として，結
合した酵素の活性を用いる。抗体を測定するには，既知
の抗原を固相（例えば，マイクロプレートまたはプラス
チック製カップ）に固定し，被検血清の希釈物とともに
インキュベートし，洗浄し，酵素で標識した抗免疫グロ
ブリンとともにインキュベートし，再び洗浄する。標識
化するために好適な酵素は，当該技術分野で公知であ
り，例えば，西洋ワサビベルオキシダーゼがある。固相
に結合した酵素活性は，特異的な基質を添加し，そして
生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定するこ
とによって測定される。結合した酵素の活性は，結合し
た抗体の量の一次関数である。
【０１５４】抗原を測定するには，既知の特異的抗体を
固相に固定し，抗原を含む被検物質を添加し，インキュ
ベートした後，固相を洗浄し，第２の酵素で標識した抗
体を添加する。洗浄後，基質を添加し，次いで酵素活性
を比色法で測定し，抗原濃度に換算する。
【０１５５】
【実施例】以下に述ベるのは本発明の実施例である。こ
の実施例は説明のみを目的として提供するのであって，
本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示内
容を考慮すると，特許請求の範囲内の多くの実施態様が
当業者に明らかである。例ば，ＩＶ．Ａ．節に述べる方
法は，もし望まれるならば繰り返し得るが，特にその必
要はない。なぜなら，本発明により提供される情報に基
づいた所望のヌクレオチド配列の構築のための技術が使
用可能であるためである。発現はＥ． ｃｏｌｉで例示
されているが，ＩＩＩ．Ａ．節でより十分に述べたよう
な他の系も使用され得る。ゲノム構造に由来する付加的
なエピトープも生産され得，以下に述べるように抗体を
生産するのに用いられる。
【０１５６】ＩＶ．Ａ．ＨＣＶ ｃＤＮＡの調製，単離
および配列決定 ＩＶ．Ａ．１ＨＣＶ ｃＮＡＤ調製 ＮＡＮＢ因子の原材料は，慢性ＮＡＮＢＨのチンバンジ
ーから得た血漿プールであった。このチンパンジーは，
プールしたヒト血清由来の第８因子濃縮物混入バッチ中
のＨＣＶで感染させて得られる別の慢性ＮＡＮＢのチン
パンジー由来の血液で，実験的に感染させられている。
このチンパンジーの血漿プールは，高レベルのアラニン
アミノトランスフェラーゼ活性（この活性はＨＣＶ感染
による肝障害に起因する）を有する多くの個体の血漿試
料を合わせて調製されたものである。静脈注射により投
与されたこの血清プールの１０−６倍希釈液の１ｍｌ
は，別のチンパンジーにＮＡＮＢＨを引き起こしたの
で，そのＣＩＤは少なくとも１０６／ｍｌである。つま
り，高いウィルス感染力価を有する。
【０１５７】高力価血漿プール由来のｃＤＮＡライブラ
リーを，以下のようにして調製した。まず，ウィルス粒
子を血漿から単離した。血漿の９０ｍｌを５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００
ｍＭ Ｎａｃｌを含有する溶液３１０ｍｌで希釈した。
細胞破砕物を，１５，０００×ｇで２０分間，２０℃に
て遠心分離することにより除去した。次いで，得られた
上清液中のウイルス粒子を，ベックマンＳＷ２８ロータ
ーで２８，０００ｒｐｍ，５時間，２０℃にて遠心分離
することによりペレットとした。ウィルスゲノムを遊離
させるために，ベレットを１％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５），および２ｍｇ／ｍｌのプロテイ
ナーゼＫを含有する溶液１５ｍｌに懸濁し，その後４５
℃にて９０分間インキュベートすることにより粒子を破
砕した。キャリアーとして０．８μｇのＭＳ２バクテリ
オファージＲＮＡを添加し，フェノール：クロロホルム
の１：１混合液（フェノールは０．５Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５），０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ
タノール，０．１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノリンで飽
和させたもの）で上記混合液を４回抽出し，その後クロ
ロホルムで２回抽出することにより核酸を単離した。
２．５倍容積の無水エタノールで−２０℃にて一晩沈澱
させるのに先立って，水層を１−ブタノールで濃縮し
た。ベックマンＳＷ４１ローターで４０，０００ｒｐ
ｍ，９０分間，４℃にて遠心分離することにより核酸を
回収し，０．０５％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネー
ト処理およびオートクレーブ処理してある水に溶解し
た。
【０１５８】上記方法により得られた核酸（＜２μｇ）
を，１７．５ｍＭ ＣＨ３ＨｇＯＨで変性させた。この
変性させた核酸を鋳型として用いてｃＤＮＡを合成し，
Ｈｕｙｎｈ（１９８５）により記載されている方法を用
いてファージλ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位にクローン
化した。ただし，逆転写酵素によりｃＤＮＡ第一鎖を合
成する間，ランダムプライマーをオリゴ（ｄＴ）１２−
１８で置き換えた（Ｔａｙｌｏｒら（１９７６））。得
られた２４鎖ｃＤＮＡをセファロースＣＬ−４Ｂカラム
でサイズに従って分画し；平均サイズ約４００，３０
０，２００，および１００塩基対の溶出された物質を，
それぞれｃＤＮＡプール１，２，３，および４とした。
プール３のｃＤＮＡから，λ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライ
ブラリーを作成した。
【０１５９】プール３から作成したλ−ｇｔ１１ ｃＤ
ＮＡライブラリーを，以前にＮＡＮＢＨにかかったこと
のある患者由来の血清と特異的に結合できるエピトープ
についてスクリーニングした。結合ヒト抗体を１２５Ｉ
で放射性標識したヒツジ抗−ヒトＩｇ抗血清を用いて検
出したことを除いては，Ｈｕｙｎｈら（１９８５）の方
法を用い，約１０６個のファージを患者血清を用いてス
クリーニングした。５個の陽性ファージが同定され，精
製された。次いで、この５個の陽性ファージを，同様の
方法を用いて，以前ＮＡＮＢＨ因子に感染したことのあ
る８人の異なるヒト由来の血清との結合の特異性につい
て試験した。４個のファージが，たった一人のヒト（つ
まリ，ファージライブラリーの最初のスクリーニングに
用いられたヒト）の血清と免疫学的に反応するポリペプ
チドをコードしていた。５番目のファージ（５−１−
１）は，８種の試験した血清のうち５種と免疫学的に反
応するポリペプチドをコードしていた。さらに，このペ
プチドは，７人の正常な血液提供者由来の血清と免疫学
的に反応しなかった。それゆえ，クローン５−１−１
は，ＮＡＮＢの患者由来の血清により免疫学的に特異的
に認識されるポリペプチドをコードすることがわかる。
【０１６０】ＩＶ．Ａ．２．組換え体ファージ５−１−
１におけるＨＣＶ ｃＤＮＡの配列，および該配列内に
コードされるポリペプチドの配列 組換え体ファージ５−１−１のｃＤＮＡを，Ｓａｎｇｅ
ｒら（１９７７）の方法により配列決定した。本質的に
は，ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し，ゲル電気泳動を用
いてサイズ分画することにより単離した。ＥｃｏＲＩ切
断フラグメントをＭ１３ベクターであるｍｐ１８および
ｍｐ１９にサブクローン化し（Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８
３）），Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）のジデオキシ鎖終
止法を用いて配列決定した。得られた配列を第１図に示
す。
【０１６１】第１図においてコードされるポリペプチド
は，ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされ，該ポリペプチドが
融合しているＮ−末端のβ−ガラクトシダーゼ部分と同
じ翻訳フレーム内にある。ＩＶ．Ａ．節で示したよう
に，５−１−１の翻訳オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）は，ＮＡＮＢＨに感染した患者およびチンパ
ンジー由来の血清により特異的に認識されるエピトープ
をコードする。
【０１６２】ＩＶ．Ａ．３ クローン５−１−１のｃＤ
ＮＡにオーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン５−１−１のｃＤＮＡにオーバーラップするＨ
ＣＶ ｃＤＮＡを，第１図に示すようなクローン５−１
−１のＨＣＶ ｃＤＮＡの配列由来の合成ポリヌクレオ
チドを用いて，ＩＶ．Ａ．１．節で記述したのと同様に
作成したλ−ｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングす
ることにより得た。スクリーニングに用いたポリヌクレ
オチドの配列は，次のようであった： ５’−ＴＣＣ ＣＴＴ ＧＣＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＣＧ ＧＴＡ ＡＧ Ｔ ＧＣＴ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＧ Ａ ＡＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＣＣ ＴＧＴ ＣＡ Ｇ ＧＴ−３’。
【０１６３】Ｈｕｙｎｈ（１９８５）に記載の方法を用
いて，λ−ｇｔ１１ライブラリーをこのプローブでスク
リーニングした。約５０，０００個のクローンのうち１
個のクローンが，このプローブとハイブリダイズした。
合成プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する３
個のクローンに，８１，１−２，および９１と番号をつ
けた。
【０１６４】ＩＶ．Ａ．４．クローン５−１−１のｃＤ
ＮＡにオーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列 クローン８１，１−２，および９１の３つのｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列は，ＩＶ．Ａ．２．節で述べたのと本
質的に同様にして決定した。これらのクローンの配列
は，ファージ５−１−１のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列に関連
しており，第２図で示される。第２図は，検出されたＨ
ＣＶエピトープをコードする鎖を示しており，ヌクレオ
チド配列における相同性が配列間の垂直線により示され
ている。
【０１６５】クローン化されたＨＣＶ ｃＤＮＡの配列
は，オーバーラップ領域で高い相同性を有する（第２図
を参照のこと）。 しかし，２つの領域には相違があ
る。クローン１−２の６７番目のヌクレオチドはチミジ
ンであるが，他の３つのクローンはこの位置にシチジン
残基を有する。しかし，この位置をＣまたはＴのいずれ
かが占める場合，同じアミノ酸がコードされるというこ
とは注意すべきである。
【０１６６】第二の相違は，クローン５−１−１が，他
の３つのクローンには存在しない２８塩基対を有するこ
とである。これらの塩基対は，５−１−１のｃＤＮＡ配
列の開始部分に存在し，小文字で示されている。後述の
ＩＶ．Ｄ．節で論じるラジオイムノアッセイのデータに
基づくと，ＨＣＶエピトープはこの２８ｂｐ領域でコー
ドされ得るということが可能である。
【０１６７】クローン８１，１−２，および９１に５−
１−１の２８塩基対が存在しないということは，これら
のクローンのｃＤＮＡは欠損したＨＣＶゲノムから得ら
れたということを意味し得る；あるいは，２８ｂｐ領域
はクローン５−１−１の末端が人工的に変化したもので
あり得る。
【０１６８】クローン８１および９１のヌクレオチド配
列における小文字の配列は，単にこれらの配列が他のｃ
ＤＮＡで見い出されていないことを示す。なぜならば，
これらの領域にオーバーラップするｃＤＮＡはまだ単離
されていないからである。
【０１６９】クローン５−１−１，８１，１−２，およ
び９１のオーバーラップしているｃＤＮＡ由来のＨＣＶ
ｃＤＮＡ複合配列を，第３図に示す。しかし，この図
では，クローン５−１−１に特有の２８塩基対は省略さ
れている。この図は，複合ＨＣＶ ｃＤＮＡのＯＲＦ内
にコードされるポリペプチドの配列も示す。
【０１７０】ＩＶ．Ａ．５．クローン８１のｃＤＮＡに
オーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン８１ ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列と
オーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の単離を，以
下のようにして行った。ＩＶ．Ａ．１．節に記述したよ
うにして調製したλ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー
を，クローン８１の５’末端配列と相同性を有する合成
ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせること
によりスクリーニングした。クローン８１の配列を第４
図に示す。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチ
ドの配列は，次のようであった： ５’ＣＴＧ ＴＣＡ ＧＧＴ ＡＴＧ ＡＴＴ ＧＣＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＡＣ ３’ 方法は，Ｈｕｙｎｈ（１９８５）に記載されているのと
本質的に同じであったが，厳密な条件下でライブラリー
のフィルターを２回洗浄した。すなわち，５×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ中で５５℃にてそれぞれ３０分間洗浄を
行った。約５０，０００個のクローンのうち１個のクロ
ーンがこのプローブとハイブリダイズした。この配列と
ハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する陽性組換え体ファ
ージを単離・精製した。このファージにクローン３６と
いう番号を付けた。
【０１７１】クローン８１のカルボキシル末端にオーバ
ーラップする下流ｃＤＮＡ配列を，上流ｃＤＮＡ配列の
単離に用いたのと同様の方法を用いて単離した。ただ
し，合成オリゴヌクレオチドプローブをクローン８１の
３’末端と相同性を有するように調製した。スクリーニ
ングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は，次のよう
であった： ５’ＴＴＴ ＧＧＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＡＧ ３’ この後者の配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する
陽性組換え体ファージを単離・精製し，クローン３２と
いう番号を付けた。
【０１７２】ＩＶ．Ａ．６．クローン３６のＨＣＶ ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列 クローン３６のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的
にＩＶ．Ａ．２．節に記述したようにして決定した。こ
のｃＤＮＡの二本鎖配列，クローン８１のＨＣＶ ｃＤ
ＮＡとオーバーラップする該ｃＤＮＡの領域，およびＯ
ＲＦによりコードされるポリペプチドを第５図に示す。
【０１７３】クローン３６のＯＲＦは，クローン８１で
コードされるＨＣＶ抗原と同じ翻訳フレーム内にある。
このように，組合せて，クローン３６および８１におけ
るＯＲＦは大きなＨＣＶ抗原の一部を表すポリペプチド
をコードする。この推定ＨＣＶポリペプチドの配列，な
らびに該配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列（クローン
３６および８１のＨＣＶ ｃＤＮＡの結合ＯＲＦ由来）
を第６図に示す。
【０１７４】ＩＶ．Ａ．７．クローン３２のＨＣＶ ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列 クローン３２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，クロー
ン５−１−１の配列についてＩＶ．Ａ．２．節で記述し
たのと本質的に同様にして決定した。配列のデータは，
クローン３２組換え体ファージのｃＤＮＡが，二つの異
なる材料原由来であることを示した。
【０１７５】ｃＤＮＡの一つのフラグメントはＨＣＶゲ
ノム由来の４１８ヌクレオチドを有し；他のフラグメン
トはバクテリオファージＭＳ２ゲノム由来の１７２ヌク
レオチドを有していた。このバクテリオファージＭＳ２
ゲノムは，λ−ｇｔ１１血漿ｃＤＮＡライブラリーの調
製の間キャリアーとして用いたものである。
【０１７６】ＨＣＶゲノムの配列に対応するクローン３
２のｃＤＮＡの配列を，第７図に示す。クローン８１の
配列とオーバーラップする配列の領域，およびＯＲＦに
よりコードされるポリペプチドもこの図に示す。この配
列は，クローン８１によりコードされるＨＣＶ抗原と同
じ翻訳フレーム内にある一つの連続したＯＲＦを有す
る。
【０１７７】ＩＶ．Ａ．８．クローン３６のｃＤＮＡに
オーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン３６ ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列と
オーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の単離を，ク
ローン８１のｃＤＮＡとオーバーラップする配列につい
てＩＶ．Ａ．５．節に記述したようにして行った。ただ
し，合成ポリヌクレオチドはクローン３６の５’領域に
基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポ
リヌクレオチドは，次のようであった： ５’ＡＡＧ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ３’ 約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，
このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブ
リダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離
・精製したクローンを，クローン３５と命名した。
【０１７８】ＩＶ．Ａ．９．クローン３５のＨＣＶ ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列 クローン３５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的
にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。こ
の配列，クローン３６のｃＤＮＡ配列とオーバーラップ
した該配列の領域，および該配列においてコードされる
推定ポリペプチドを，第８図に示す。
【０１７９】クローン３５は，明らかに一つの連続的な
ＯＲＦを有する。このＯＲＦは，クローン３６，クロー
ン８１，およびクローン３２によりコードされるのと同
じ翻訳フレーム内で，一つのポリペプチドをコードす
る。第９〜１０図は，クローン３５，３６，８１，およ
び３２にわたって延びている長く連続したＯＲＦの配列
を，該配列でコードされる推定ＨＣＶポリペプチドと共
に示す。この配列は，この結合配列は，同じλ−ｇｔ１
１ ｃＤＮＡライブラリー由来の他の独立したｃＤＮＡ
クローンを用いて確認されている。
【０１８０】ＩＶ．Ａ．１０．クローン３５のｃＤＮＡ
にオーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン３５ ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列と
オーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の単離を，ク
ローン３６のｃＤＮＡとオーバーラップする配列につい
てＩＶ．Ａ．８．節に記述したようにして行った。ただ
し，合成ポリヌクレオチドはクローン３５の５’領域に
基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポ
リヌクレオチドは，次のようであった： ５’ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＣＣ ＣＧＣ ＡＣＴ ＣＡ Ａ ＣＧＴ ３’ 約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，
このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブ
リダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離
・精製したクローンを，クローン３７ｂと命名した。
【０１８１】ＩＶ．Ａ．１１．クローン３７ｂのＨＣＶ
のヌクレオチド配列 クローン３７ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質
的にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。
この配列，クローン３５のｃＤＮＡの配列にオーバーラ
ップする該配列の領域，および該配列においてコードさ
れる推定ポリペプチドを，第１１図に示す。
【０１８２】クローン３５の５’末端のヌクレオチドは
Ｔであるが，クローン３７ｂの対応するヌクレオチドは
Ａである。ＩＶ．Ａ．１０．節に記述した，クローン３
７ｂを単離した工程の間に単離された他の３つの独立し
たクローン由来のｃＤＮＡも，配列決定されている。こ
れらのクローン由来のｃＤＮＡも，この位置にＡを有す
る。このように，クローン３５の５’末端のＴは，クロ
ーニング工程の人工産物であり得る。しばしばｃＤＮＡ
分子の５’末端に人工的に変化したものが生じるという
ことは，公知である。
【０１８３】クローン３７ｂは明らかに，オーバーラッ
プしているクローン３５，３６，８１および３２にわた
って延びているＯＲＦにおいてコードされるポリペプチ
ドの続きであるポリペプチドをコードする，一つの連続
的なＯＲＦを有する。
【０１８４】ＩＶ．Ａ．１２．クローン３２のｃＤＮＡ
にオーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン３２の下流のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の単離は，
以下のようにして行った。まず，クローンｃｌａを，ク
ローン３２のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列
に基づいた合成ハイブリダイゼーションプローブを用い
て単離した。方法は，本質的にＩＶ．Ａ．５．節に記述
したとおりであった。ただし，合成プローブの配列は次
のようであった。 ５’ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＡＴ ＡＧＣ ＣＴＴ ３’。
【０１８５】クローンｃｌａ由来のヌクレオチド配列を
用いて，別の合成ヌクレオチドを合成した。この合成ヌ
クレオチドは次の配列を有していた： ５’ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＧＣ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＡＡ ＧＣＴ ３’。
【０１８６】クローンｃｌａ由来の配列をプローブとし
てを用いたλ−ｇｔ１１ライブラリーのスクリーニング
は，約５０，０００個の陽性コロニーのうち１個のコロ
ニーをもたらした。このプローブとハイブリダイズした
クローンを単離・精製し，クローン３３ｂと命名した。
【０１８７】ＩＶ．Ａ．１３．クローン３３ｂのＨＣＶ
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列 クローン３３ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質
的にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。
この配列，クローン３２のｃＤＮＡの配列とオーバーラ
ップする該配列の領域，および該配列においてコードさ
れる推定ポリペプチドを，第１２図に示す。
【０１８８】クローン３３ｂは明らかに，オーバーラッ
プしているクローン３７ｂ，３５，３６，８１および３
２のＯＲＦの延長である，−つの連続的なＯＲＦを有す
る。クローン３３ｂでコードされるポリペプチドは，こ
れらのオーバーラップしているクローンの延長されたＯ
ＲＦでコードされるのと同じ翻訳フレーム内にある。
【０１８９】ＩＶ．Ａ．１４．クローン３７ｂのｃＤＮ
Ａおよびクローン３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラップす
るＨＣＶ ｃＤＮＡの単離 クローン３７ｂおよびクローン３３ｂのｃＤＮＡにオー
バーラップするＨＣＶｃＤＮＡを単離するために，これ
らのクローンのｃＤＮＡ由来の次の合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用い，本質的にＩＶ．Ａ．３．節に記述
した方法を用いて，λ−ｇｔ１１ライブラリーをスクリ
ーニングした。それぞれ，クローン３７ｂおよび３３ｂ
の配列にオーバーラップするＨＣＶ ｃＤＮＡ配列を有
するコロニーを検出するためのプローブは，次のようで
あった： ５’ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＣＣ ＣＧＣ ＡＣＴ ＣＡ Ａ ＣＧＴ Ｃ ３’ および ５’ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＧＣ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＧ Ａ ＴＡＡ ＧＣＴ ３’ 約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，
それぞれのプローブを用いて検出された。クローン３７
ｂのｃＤＮＡの上流にあり，該ｃＤＮＡにオーバーラッ
プするｃＤＮＡを有するクローンを，クローン４０ｂと
命名した。クローン３３ｂのｃＤＮＡの下流にあり，該
ｃＤＮＡにオーバーラップするｃＤＮＡを有するクロー
ンを，クローン２５ｃと命名した。
【０１９０】ＩＶ．Ａ．１５．クローン４０ｂおよびク
ローン２５ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列 クローン４０ｂおよびクローン２５ｃのｃＤＮＡのヌク
レオチド配列は，ＩＶ．Ａ．２．節で記述述したのと本
質的に同様にして決定した。４０ｂおよび２５ｃの配
列，クローン３７ｂおよび３３ｂのｃＤＮＡにオーバー
ラップする該配列の領域，およびそこでコードされる推
定ポリペプチドを，第１３図（クローン４０ｂ）および
第１４図（クローン２５ｃ）に示す。
【０１９１】クローン４０ｂの５’末端のヌクレオチド
はＧである。しかし，ＩＶ．Ａ．１４．節で記述した，
クローン４０ｂを単離した工程の間に単離された他の独
立した５個のクローン由来のｃＤＮＡも配列決定されて
いる。これらのクローン由来のｃＤＮＡもまた，この位
置にＴを有する。このように，Ｇはクローニングの結果
人工的に変化したものであることを意味し得る（ＩＶ．
Ａ．１１．節の考察を参照のこと）。
【０１９２】クローン２５ｃの５’末端はＡＣＴである
が，クローンｃｌａ（配列は示していない），およびク
ローン３３ｂの領域の配列はＴＣＡである。この違いは
また，クローン５−１−１の２８個の過剰の５’末端ヌ
クレオチドのように，クローニングの人工産物を意味し
得る。
【０１９３】クローン４０ｂおよび２５ｃはそれぞれ，
明らかに，以前に配列決定したクローンの連続的なＯＲ
Ｆの延長であるＯＲＦを有する。クローン４０ｂ，３７
ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，および２５ｃに
わたって延びているＯＲＦのヌクレオチド配列，および
該配列においてコードされる推定ポリペプチドのアミノ
酸配列を，第１５〜１７図に示す。この図では，可能性
のある人工的に変化したものは配列から省かれており，
その代わりに，オーバーラップする複数のクローンの非
５’末端領域の対応する配列が示されている。
【０１９４】ＩＶ．Ａ．１６．クローン３６，８１，お
よび３２のｃＤＮＡからの複合ＨＣＶｃＤＮＡの調製 複合ＨＣＶ ｃＤＮＡであるＣ１００は，以下のように
して構築した。まず，クローン３６，８１，および３２
由来のｃＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉを用いて切り出した。各
クローン由来のｃＤＮＡのＥｃｏＲ Ｉフラグメント
を，ベクターｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ）のＥｃｏＲ Ｉ部位に個々にクローン化
した。クローン３６，８１，および３２由来のｃＤＮＡ
を有する得られた組換え体ベクターを，それぞれｐＧＥ
Ｍ３−ｂｌｕｅ／３６，ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／８１，
およびｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３２と命名した。適当な
方向性を有するｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／８１組換え体を
ＮａｅＩおよびＮａｒＩで切断し，大きい（約２８５０
ｂｐ）フラグメントを精製した。そしてこのフラグメン
トを，ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３６から得た小さな（約
５７０ｂｐ）ＮａｅＩ／ＮａｒＩ制限フラグメント精製
物と連結した。このクローン３６および８１由来のｃＤ
ＮＡの複合配列を，これらのクローンのオーバーラップ
しているｃＤＮＡに含まれる，連続的なＨＣＶ ＯＲＦ
を有する他のｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅベクターを作成する
のに用いた。次いで，約６８０ｂｐのフラグメントを切
り離すために，この新しいプラスミドをＰｖｕＩＩおよ
びＥｃｏＲ Ｉで切断した。次いで，このフラグメント
を適当な方向性を有するｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３２プ
ラスミドから単離した小さな（５８０ｂｐ）ＰｖｕＩＩ
／ＥｃｏＲ Ｉフラグメントと連結した。そして，クロ
ーン３６，８１，および３２由来の複合ｃＤＮＡを，Ｉ
Ｖ．Ｂ．１．節に記述されているベクターｐＳＯＤｃｆ
１をＥｃｏＲ Ｉで直線化させたものに連結し，これを
細菌においてクローン５−１−１を発現するのに用い
た。複合ＨＣＶ ｃＤＮＡの約１２７０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉフラグメント（Ｃ１００）を有する組換え体を選択
し，プラスミド由来のｃＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉで切断
し，精製した。
【０１９５】ＩＶ．Ａ．１７．クローン１４ｉ．１１
ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３
ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡの単離お
よびヌクレオチド配列 クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，
１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨＣＶ
ｃＤＮＡを，ＩＶ．Ａ．１．節に記述したＨＣＶ ｃ
ＤＮＡのλ−ｇｔ１１ライブラリー由来のオーバーラッ
プしたｃＤＮＡフラグメントを単離する方法により単離
した。使用した方法は，ＩＶ．Ａ．３．節に記述したの
と本質的に同様であった。ただし，使用したプローブ
は，最後に単離したクローンのヌクレオチド配列の，複
合ＨＣＶ配列の５’末端および３’末端から設計された
ものである。以下に記述するプローブとハイブリダイズ
するクローンの頻度は，それぞれの場合で約５０，００
０個につき１個であった。
【０１９６】クローン１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３
ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨ
ＣＶ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．
Ａ．２．節に記述したのと同様にして決定した。ただ
し，クローン５−１−１から単離したｃＤＮＡの代わり
にこれらのファージから切り出したｃＤＮＡを用いた。
【０１９７】クローン３３ｃは，クローン４０ｂのヌク
レオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプロー
ブを用いて単離した。クローン４０ｂのヌクレオチド配
列は，第１３図に示されている。３３ｃを単離するのに
用いたプローブのヌクレオチド配列は，次のようであっ
た： ５’ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＣ ＡＣＴ ３’。
【０１９８】クローン３３ＣのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，
およびクローン４０ｂのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列とのオー
バーラップを，第１８図に示す。この図は，該配列でコ
ードされるアミノ酸も示す。
【０１９９】クローン８ｈは，クローン３３ｃのヌクレ
オチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。この
プローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＴＴ Ｃ ３’。
【０２００】クローン８ｈのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列，
およびクローン３３ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列とのオ
ーバーラップ，ならびに該配列でコードされるアミノ酸
を，第１９図に示す。
【０２０１】クローン７ｅは，クローン８ｈのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプ
ローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＴＣＧ ＧＡＣ ＣＴＴ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＧ Ｇ ＣＡＣ ３’。
【０２０２】クローン７ｅのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列，
クローン８ｈとのオーバーラップ，および該配列でコー
ドされるアミノ酸を，第２０図に示す。
【０２０３】クローン１４ｃは，クローン２５ｃのヌク
レオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。ク
ローン２５ｃの配列を第１４図に示す。クローン１４ｃ
の単離に用いたプローブは，次の配列を有していた： ５’ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＧＧＣ３’。
【０２０４】クローン１４ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，該配列のクローン２５ｃのＨＣＶｃＤＮＡの配列と
のオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ
酸を，第２１図に示す。
【０２０５】クローン８ｆは，クローン１４ｃのヌクレ
オチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。この
プローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＣＧＣ ＴＡＡ ３’。
【０２０６】クローン８ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列，
該配列のクローン１４ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列との
オーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸
を，第２２図に示す。
【０２０７】クローン３３ｆは，クローン８ｆに存在す
るヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離し
た。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであ
った： ５’ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＴ ３’。
【０２０８】クローン３３ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，該配列のクローン８ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列と
のオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ
酸を，第２３図に示す。
【０２０９】クローン３３ｇは，クローン３３ｆのヌク
レオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。こ
のプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＧＣＧ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＡＧＣ ＣＣＧ ３’。
【０２１０】クローン３３ｇのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，該配列のクローン３３ｆのＨＣＶｃＤＮＡの配列と
のオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ
酸を，第２４図に示す。
【０２１１】クローン７ｆは，クローン７ｅのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプ
ローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＴＡＧ ＧＧＴ ＧＣＡ ＴＡＡ Ｔ ３’。
【０２１２】クローン７ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの配列，
該配列のクローン７ｅとのオーバーラップ，および該配
列でコードされるアミノ酸を，第２５図に示す。
【０２１３】クローン１１ｂは，クローン７ｆの配列に
基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌ
クレオチド配列は，次のようであった： ５’ＣＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＴＴＡ ＴＡＡ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＣＴ ３’。
【０２１４】クローン１１ｂのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，骸配列のクローン７ｆとのオーバーラップ，および
該配列でコードされるアミノ酸を，第２６図に示す。
【０２１５】クローン１４ｉは，クローン１１ｂのヌク
レオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。こ
のプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＣＴＣ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＧＣ ＧＣＴ ＡＴＡ ＴＣＡ ３’。
【０２１６】クローン１４ｉのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，該配列の１１ｂとのオーバーラップ，および該配列
でコードされるアミノ酸を，第２７図に示す。
【０２１７】クローン３９ｃは，クローン３３ｇのヌク
レオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。こ
のプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった： ５’ＣＴＣ ＧＴＴ ＧＣＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ３’。
【０２１８】クローン３９ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡの配
列，該配列のクローン３３ｇとのオーバーラップ，およ
び該配列でコードされるアミノ酸を，第２８図に示す。
【０２１９】ＩＶ．Ａ．１８．ＨＣＶ ｃＤＮＡを有す
る単離クローン由来の複合ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列 複合ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列を作成するために，前述の単
離クローンのＨＣＶｃＤＮＡ配列を並べた。５’から
３’の方向に並べた単離クローンは：１４ｉ，７ｆ，７
ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８
１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３
３ｇおよび３９ｃである。
【０２２０】単離クローン由来の複合ＨＣＶ ｃＤＮＡ
配列，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２９
〜３４図に示す。
【０２２１】複合配列を作成するにあたり，以下の配列
の異質性が考慮されている。クローン３３ｃは，クロー
ン４０ｂおよび３７ｃのｃＤＮＡとオーバーラップする
８００塩基対のＨＣＶ ｃＤＮＡを有する。クローン３
３ｃにおいては，他の５つのオーバーラツプしているク
ローンと同様に，７８９番目のヌクレオチドはＧであ
る。しかし，クローン３７ｂにおいては（ＩＶ．Ａ．１
１．節を参照のこと），対応するヌクレオチドはＡであ
る。この配列の違いは，該配列でそれぞれＧまたはＡに
対してコードされるアミノ酸は，ＣＹＳまたはＴＹＲの
いずれかであるという明らかな異質性をもたらす。この
異質性は，タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を
有し得る。
【０２２２】クローン８ｈのＨＣＶ ｃＤＮＡの２番目
のヌクレオチド残基はＴである。しかし，以下に示すよ
うに，クローン７ｅの対応する残基はＡであり；さら
に，この位置のＡは，他の３つのオーバーラップしてい
る単離クローンでも見い出される。このように，クロー
ン８ｈのＴ残基は，クローニングの人工的な変化を意味
し得る。それゆえ，第２９〜３４図では，この位置の残
基はＡとされる。
【０２２３】クローン８ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの３’末
端ヌクレオチドはＧである。しかし，クローン３３ｆお
よび他の２つのオーバーラップするクローンの対応する
残基はＴである。それゆえ，第２９〜３４図では，この
位置の残基はＴとされる。
【０２２４】クローン３３ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡの３’
末端配列はＴＴＧＣである。しかし，クローン３３ｇお
び他の２つのオーバーラップするクローンの対応する配
列はＡＴＴＣである。それゆえ，第２９〜３４図では，
対応する領域はＡＴＴＣで示される。
【０２２５】クローン３３ｇのＨＣＶ ｃＤＮＡの４番
目のヌクレオチド残基はＴである。しかし，クローン３
３ｆおよび他の２つのオーバーラップするクローンの対
応する残基はＡである。それゆえ，第２９〜３４図で
は，対応する残基はＡで示される。
【０２２６】クローン１４ｉの３’末端はＡＡである。
しかし，クローン１１ｂおよび他の３つのクローンの対
応するジヌクレオチドはＴＡである。それゆえ，第２９
〜３４図では，ＴＡ残基が示されている。
【０２２７】他の配列の異質性の解明については，前述
で考察している。
【０２２８】複合ＨＣＶ ｃＤＮＡを調べると，該ｃＤ
ＮＡが一つの大きなＯＲＦを有することが示される。こ
のことは，ウイルスのゲノムが，翻訳と同時に，または
その後プロセッシングされる大きなポリペプチドに翻訳
されるということを示唆する。
【０２２９】ＩＶ．Ａ．１９．クローン１２ｆ，３５
ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅのＨＣＶ ｃＤＮＡ
の単離およびヌクレオチド配列 クローン１２ｆ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５
ｅのＨＣＶ ｃＤＮＡを，本質的にＩＶ．Ａ．１７．節
に記述した方法により単離した。ただし，プローブは以
下に示すようであった。クローンがこのプローブとハイ
ブリダイズする頻度は，それぞれの場合で約５０，００
０個につき１個であった。これらのクローンのＨＣＶ
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．
２．節に記述したようにして決定した。ただし，クロー
ン５−１−１から単離したｃＤＮＡの代わりに，指示し
たクローン由来のｃＤＮＡを用いた。
【０２３０】第２９〜３４図のＨＣＶ ｃＤＮＡの上流
のｃＤＮＡを有するクローン１２ｆの単離は，クローン
１４ｉのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼー
ションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレ
オチド配列は，次のようであった： ５’ＴＧＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＴＡ ＴＣＣ ＣＡＡ ３’。
【０２３１】クローン１２ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，
該配列のクローン１４ｉとのオーバーラップ，および該
配列でコードされるアミノ酸を，第３５図に示す。
【０２３２】第２９〜３４図のＨＣＶ ｃＤＮＡ下流の
ｃＤＮＡを有するクローン３５ｆの単離は，クローン３
９ｃのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーシ
ョンプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオ
チド配列は，次のようであった： ５’ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＴＡＡ ＣＴＴ ３’。
【０２３３】クローン３５ｆの配列，該配列のクローン
３９ｃの配列とのオーバーラップ，および該配列でコー
ドされるアミノ酸を，第３６図に示す。
【０２３４】クローン１９ｇの単離は，クローン３５ｆ
の３’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブ
を用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，
次のようであった： ５’ＴＴＣ ＴＣＧ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＣＣ ３’。
【０２３５】クローン９ＧのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，該
配列のクローン３５ｆの配列とのオーバーラップ，およ
び該配列でコードされるアミノ酸を，第３７図に示す。
【０２３６】クローン２６ｇの単離は，クローン１９ｇ
の３’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブ
を用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，
次のようであった： ５’ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＡＣＴ ＴＡＧ ＴＣＧ ＴＴＡ ＴＣＴ ＧＴＧ ３’。
【０２３７】クローン２６ｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，
該配列のクローン１９ｇの配列とのオーバーラップ，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第３８図に示
す。
【０２３８】クローン１５ｅは，クローン２６ｇの３’
配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用い
て単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次の
ようであった： ５’ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＡＴ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ３’。
【０２３９】クローン１５ｅのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，
該配列のクローン２６ｇの配列とのオーバーラップ，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第３９図に示
す。
【０２４０】この節で記述したクローンは，ＩＩ．Ａ．
節で記述した期間および条件でＡＴＣＣに寄託されてお
り，以下の受託番号が授与されている。
【０２４１】λ−ｇｔ１１ ＡＴＣＣ番号 寄託日 クローン１２ｆ クローン３５ｆ クローン１５ｅ 前述の単離クローンのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列は，複合Ｈ
ＣＶ ｃＤＮＡ配列を作成するのに並べられている。
５’から３’の方向に並べられた単離クローンは：１２
ｆ，１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７
ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４
ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，
２６ｇ，および１５ｅである。
【０２４２】単離クローン由来の複合ＨＣＶ ｃＤＮＡ
配列，および該配列でコードされるアミノ酸を，第４０
〜４６図に示す。
【０２４３】ＩＶ．Ａ．２０．クローン１２ｆのＨＣＶ
ｃＤＮＡ配列上流のｃＤＮＡ配列を単離する別の方法 上流の配列の逆転写を開始させるために，クローン１２
ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ由来の第４０〜４６図の５’ＨＣ
Ｖ配列のほとんどに基づいて，逆転写酵素の小さな合成
オリゴヌクレオチドプライマーを合成し，ＨＣＶゲノム
ＲＮＡ中の対応する配列に結合させるのに用いる。プラ
イマー配列はクローン１２ｆの既知の５’末端配列に近
いが，プライマー配列上流のプローブ配列の設計を許容
するのに十分に下流である。プライミングおよびクロー
ニングの公知の標準法が用いられる。得られたｃＤＮＡ
ライブラリーは，プライミング部位（クローン１２ｆの
明らかにされた配列から推定される）の上流の配列を用
いてスクリーニングされる。ＨＣＶゲノムＲＮＡは，Ｎ
ＡＮＢＨのチンパンジー由来の血漿または肝臓試料，ま
たはＮＡＮＢＨのヒト由来の類似の試料のいずれかから
得られる。
【０２４４】ＩＶ．Ａ．２１．ＨＣＶゲノムの５’末端
領域から配列を単離するための，尾部付加（ｔａｉｌｉ
ｎｇ）を利用した別の方法 ＨＣＶ ＲＮＡゲノムの５’最末端配列を単離するため
に，逆転写の初回ｃＤＮＡ生成物（これは，鋳型ＲＮＡ
により二本鎖とされる）を，オリゴＣで尾部付加処理す
る。これは，この生成物をＣＴＰ存在下でターミナルト
ランスフェラーゼとインキュベートすることにより行わ
れる。ｃＤＮＡの第一鎖の相補鎖を生成させる第２回の
ｃＤＮＡ合成は，逆転写酵素反応のプライマーとしてオ
リゴＧを用いて行われる。ゲノムＨＣＶ ＲＮＡの材料
源は，ＩＶ．Ａ．２０．節で記述したのと同様である。
ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾部付加処理，
および逆転写酵素反応のための方法は，Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２）と同様である。次いで，ｃＤＮＡ生成
物をクローン化し，スクリーニングし，そして配列決定
する。
【０２４５】ＩＶ．Ａ．２２．ＨＣＶゲノムの３’末端
領域から配列を単離するための，尾部付加を利用した別
の方法 この方法は，フラビウイルスのＲＮＡのｃＤＮＡをクロ
ーニングするために以前に使用された方法に基づいてい
る。この方法では，ＲＮＡは，３’末端の二次構造を除
去するために変性条件に置かれる。そして，その後ｒＡ
ＴＰを基質として用い，ポリＡポリメラーゼで尾部付加
処理される。ポリＡを尾部付加処理したＲＮＡの逆転写
は，オリゴｄＴをプライマーとして用い，逆転写酵素に
より触媒される。ｃＤＮＡの第２鎖を合成し，ｃＤＮＡ
生成物をクローン化し，スクリーニングし，そして配列
決定する。
【０２４６】ＩＶ．Ａ．２３ 大きなｃＤＮＡインサー
トを有するλ−ｇｔ１１ ＨＣＶ ｃＤＮＡライブラリ
ーの作成 λ−ｇｔ１１ライブラリーを作成し，スクリーニングす
るのに用いた方法は，ＩＶ．Ａ．１．節に記述したのと
本質的に同様である。ただし，ライブラリーはセファロ
ースＣＬ−４Ｂカラムから溶出した大きなサイズのｃＤ
ＮＡのプールから作成した。
【０２４７】ＩＶ．Ａ．２４．プライマーとして合成オ
リゴマーを用いたＨＣＶｃＤＮＡライブラリーの作成 新しいＨＣＶ ｃＤＮＡライブラリーは，ＩＶ．Ａ．
１．節に記述した感染チンパンジーの血漿プール由来の
ＲＮＡから，ならびにこの感染動物の肝臓由来のポリＡ
＋ＲＮＡ画分から調製されている。ｃＤＮＡは，Ｇｕｂ
ｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）により記述さ
れているのと本質的に同様にして構築した。ただし，最
初のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーは，前述のＨＣ
Ｖゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであっ
た。クロン１１ｂおよび７ｅの配列に基づいたプライマ
ーは，それぞれ， ５’ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＴＣ ３’ および ５’ＡＧＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＴＡＴ
ＧＣ ３’ であった。得られたｃＤＮＡは，λバクテリオファージ
ベクターにクローン化し，配列が第４０〜４６図のＨＣ
Ｖ配列に基づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてス
クリーニングした。
【０２４８】ＩＶ．Ｂ．ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされ
るポリペプチドの発現および発現された生成物のＨＣＶ
誘導抗原としての同定 ＩＶ．Ｂ．１．クローン５−１−１においてコードされ
るポリペプチドの発現 クローン５−１−１においてコードされるＨＣＶポリペ
プチド（ＩＶ．Ａ．２．節を参照のこと，前出）を，ス
ーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）との融合ポリペ
プチドとして発現させた。これは，以下のように，クロ
ーン５−１−１のｃＤＮＡインサートを発現ベクターｐ
ＳＯＤｃｆ１（Ｓｔｅｉｍｅｒら（１９８６））にサブ
クローン化することにより行った。
【０２４９】まず，ｐＳＯＤｃｆ１から単離したＤＮＡ
をＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで処理し，これらの
制限酵素により作られる直線状のＤＮＡに以下のリンカ
ーを結合させた： ５’ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＡＴＡ Ａ ３’ ３’ ＧＡ ＣＣＴ ＴＡＡ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡ ５’ クローニングの後，インサートを有するプラスミドを単
離した。
【０２５０】インサートを有するプラスミドを，Ｅｃｏ
Ｒ Ｉで切断した。クローン５−１−１のＨＣＶ ｃＤ
ＮＡインサートをＥｃｏＲ Ｉで切断し，このＥｃｏＲ
Ｉ直線化プラスミドＤＮＡに連結した。このＤＮＡ混
合物を，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ１２１０株（Ｓａｄｌｅｒら
（１９８０））を形質転換するのに用いた。第１図に示
した，ＯＲＦの発現について正しい方向性を有する５−
１−１ ｃＤＮＡでの組換え体は，制限酵素切断地図作
製およびヌクレオチド配列決定により同定した。
【０２５１】ＩＰＴＧの存在下で細菌を生育させること
により，１個のクローン由来の組換え体細菌が，ＳＯＤ
−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドを発現するように誘
導された。
【０２５２】ＩＶ．Ｂ．２．クローン８１においてコー
ドされるポリペプチドの発現 クローン８１に含まれるＨＣＶ ｃＤＮＡを，ＳＯＤ−
ＮＡＮＢ８１融合ポリペプチドとして発現させた。この
融合ポリペプチドをコードするベクターを調製するため
の方法は，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１をコードするベ
クターを作製するのに用いたのと類似の方法であった。
ただし，ＨＣＶ ｃＤＮＡの材料源はクローン８１であ
り，これはＩＶ．Ａ．３節で記述したように単離され，
ｃＤＮＡ配列がＩＶ．Ａ．４節で記述したように決定さ
れたものである。クローン８１のＨＣＶ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列，および該配列でコードされるポリペプ
チドの推定アミノ酸配列を，第４図に示す。
【０２５３】クローン８１のＨＣＶ ｃＤＮＡインサー
トをＥｃｏＲ Ｉで切断し，リンカー（ＩＶ．Ｂ．１．
節を参照のこと）を有し，かつＥｃｏＲ Ｉでの処理に
より直線化されたｐＳＯＤｃｆ１に連結した。このＤＮ
Ａ混合物を，Ｅ．ｃｏｌｉＤ１２１０株を形質転換する
のに用いた。第４図に示されるＯＲＦの発現について正
しい方向でクローン８１ ＨＣＶ ｃＤＮＡを有する組
換え体を，制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配
列決定により同定した。
【０２５４】ＩＰＴＧの存在下で細菌を生育させること
により，１個のクローンからの組換え体細菌が，ＳＯＤ
−ＮＡＮＢ８１ポリペプチドを発現するように誘導され
た。
【０２５５】ＩＶ．Ｂ．３．クローン５−１−１におい
てＨＣＶおよびＮＡＮＢＨ関連抗原としてコードされる
ポリペプチドの同定 クローン５−１−１のＨＣＶ ｃＤＮＡ内にコードされ
るポリペプチドを，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー
およびヒトの血清が融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ
５−１−１と免疫学的に反応することを証明することに
より，ＮＡＮＢＨ関連抗原として同定した。このＳＯＤ
−ＮＡＮＢ５−１−１は，そのＮ末端にスーパーオキサ
イドジスムターゼを，そしてそのＣ末端にフレーム内
（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）の５−１−１抗原を有する。この
同定は，以下のような“ウェスタン”ブロッティング法
（Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９））により行った。
【０２５６】ＩＶ．Ｂ．Ｉ．節で記述した，ＳＯＤ−Ｎ
ＡＮＢ５−１−１をコードする発現ベクターで形質転換
した細菌の組換え体株を，ＩＰＴＧの存在下で生育させ
ることにより融合ポリペプチドを発現するように誘導し
た。全部の細菌溶解物を，Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）
に従って，ＳＤＳ存在下でポリアクリルアミドゲルに通
して電気泳動を行った。分離されたペプチドは，ニトロ
セルロースフィルターに移した（Ｔｏｗｂｉｎら（１９
７９））。次いで，このフィルターを細片に切断し，こ
の細片を異なるチンパンジーおよびヒトの血清と個々に
インキュベートした。結合した抗体は，ＩＶ．Ａ．１．
節に記述したように，１２５Ｉ−標識ヒツジ抗ヒトＩｇ
と共にさらにインキュベートすることにより検出した。
【０２５７】ウェスタンブロットに用いたチンパンジー
血清の特徴付け，およびオートラジオグラフィーを行っ
た細片の写真に示される結果を，第４７〜４８図に示
す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片を，急性
ＮＡＮＢＨ（ハッチンソン株）感染（レーン１−１
６），Ａ型肝炎感染（レーン１７−２４），およびＢ型
肝炎感染（レーン３４−４４）の間の異なった時期にお
けるチンパンジーから得た血清とインキュベートした。
レーン２５および４５は，陽性の対照を示す。該対照で
は，免疫ブロットを，λ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラ
リーのオリジナルスクリーニングにおいて組換え体クロ
ーン５−１−１を同定するのに用いた（ＩＶ．Ａ．１．
節を参照のこと）患者由来の血清とインキュベートし
た。
【０２５８】第４８図の対照レーン２５および４５にお
ける目視しうるバンドは，抗体がＳＯＤ融合ポリペプチ
ドのＮＡＮＢ５−１−１部分に結合していることを示
す。これらの抗体は，単独のＳＯＤとの結合を示さな
い。なぜならば，単独のＳＯＤもこれらの試料における
陰性の対照として含まれており，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ
５−１ −１融合ポリペプチドよりも有意に速く移動する
バンドとして現れるからである。
【０２５９】第４７〜４８図のレーン１−１６は，４匹
のチンパンジーの血清試料中の抗体の結合を示し；この
血清は，ＮＡＮＢＨに感染する直前およびその後の急性
感染の期間中に得たものである。図からわかるように，
ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドと免疫学的に
反応する抗体は，感染性のＨＣＶ接種材料の投与前およ
び感染の急性期の早い時期に得た血清試料には存在しな
かった。ところが，４匹の動物は全て，急性期後期また
はその後の時期に，最終的にこのポリペプチドに対する
循環抗体を誘導した。番号３および４のチンパンジーの
場合の免疫ブロットで観察される付加的なバンドは，宿
主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドによるも
のであった。
【０２６０】ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー由来の
血清で得られた結果とは対照的に，融合ポリペプチドの
ＮＡＮＢ５−１−１部分に対する抗体の発生は，ＨＡＶ
に感染した４匹のチンパンジーまたはＨＢＶに感染した
３匹のチンパンジーでは観察されなかった。これらの場
合における唯一の結合は，ＨＣＶに感染した試料でも生
じる，宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンド
であった。
【０２６１】ウェスタンブロットに用いたヒト血清の特
徴付け，およびオートラジオグラフを行った細片の写真
に示される結果を，第４９〜５０図に示す。ポリペプチ
ドを含むニトロセルロース細片を，ＮＡＮＢＨ（レーン
１−２１），ＨＡＶ（レーン３３−４０），およびＨＢ
Ｖ（レーン４１−４９）に感染している間の異なった時
期におけるヒトから得た血清とインキュベートした。レ
ーン２５および５０は，陽性の対照を示す。該対照で
は，免疫ブロットを，前述のλ−ｇｔ１１ライブラリー
のオリジナルスクリーニングで用いた患者由来の血清と
インキュベートした。レーン２２−２４および２６−３
２は，血清を“正常な”血液提供者から得た，“非感染
の”対照を示す。
【０２６２】第４９〜５０図からわかるように，λ−ｇ
ｔ１１ライブラリーをスクリーニングするのに用いた血
清を含む９人のＮＡＮＢＨ患者由来の血清は，融合ポリ
ペプチドのＮＡＮＢ５−１−１部分に対する抗体を含有
していた。ＮＡＮＢＨの３人の患者由来の血清は，これ
らの抗体を含有しなかった。これらの患者に抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体が将来発生する可能性はある。異なった
ＮＡＮＢＶ因子に起因するこの反応の欠如が，非反応血
清を採取した個体に病気を引き起こし得ることもまた，
可能である。
【０２６３】第４９〜５０図はまた，ＨＡＶおよびＨＢ
Ｖに感染した多くの患者由来の血清が抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体を含有していないこと，およびこれらの
抗体は“正常な”対照由来の血清にも存在しないことも
示す。あるＨＡＶ患者（レーン３６）は抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体を有するように見えるが，この患者は以
前にＨＣＶに感染していたということが可能である。な
ぜならば，ＮＡＮＢＨの発生率は非常に高く，しばしば
潜在性であるからである。
【０２６４】これらの血清学的な研究は，ＢＢ−ＮＡＮ
ＢＶに感染した患者および動物由来の血清により特異的
に認識されるエピトープを，クローン５−１−１のｃＤ
ＮＡがコードすることを示している。さらに，ｃＤＮＡ
は霊長類のゲノム由来ではないらしい。クローン５−１
−１またはクローン８１から作製されたハイブリダイゼ
ーションプローブは，唯一のシングルコピー遺伝子が検
出され得る条件下で，非感染個体由来の対照のヒトおよ
びチンパンジーのゲノムＤＮＡの“サザン”ブロットに
ハイブリダイズしなかッた。これらのプローブはまた，
対照のウシのゲノムＤＮＡのサザンブロットにもハイブ
リダイズしなかった。
【０２６５】ＩＶ．Ｂ．４．クローン３６，８１および
３２の複合ＨＣＶ ｃＤＮＡにおいてコードされるポリ
ペプチドの発現 クローン３６，８１および３２にわたるＯＲＦでコード
されるＨＣＶポリペプチドを，ＳＯＤとの融合ポリペプ
チドとして発現させた。これは，複合ｃＤＮＡであるＣ
１００をヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子
を有する発現カセットに挿入すること，発現カセットを
酵母の発現ベクターに挿入すること，および酵母でポリ
ペプチドを発現させることにより行った。
【０２６６】クローン３６，８１および３２由来の複合
Ｃ１００ ｃＤＮＡを有する発現カセットを，約１２７
０ｂｐのＥｃｏＲ ＩフラグメントをベクターｐＳ３−
５６（ｐＳ３５６とも呼ばれる）のＥｃｏＲ Ｉ部位に
挿入することにより構築し，プラスミドｐＳ３−５６
Ｃ１００を作製した。Ｃ１００の構築は，前述のＩＶ．
Ａ．１６節に記述されている。
【０２６７】ｐＢＲ３２２の誘導体であるベクターｐＳ
３−５６は，ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺
伝子上流のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッド酵母プロ
モーター，および下流のＧＡＰＤＨ転写終結信号を含む
発現カセットを有する。これらの制御要素およびスーパ
ーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する同様のカセッ
トは，Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９８７），および本発明の
出願人による同時係属のヨーロッパ特許出願第１９６，
０５６号（１９８６年１０月１日公開）に記載されてい
る。しかしながら，ｐＳ３−５６のカセットはＣｏｕｓ
ｅｎｓら（１９８７）のカセットとは異なる。ｐＳ３−
５６のカセットには，異種のプロインシュリン遺伝子お
よび免疫グロブリンのヒンジが欠失しており，かつスー
パーオキサイドジスムターゼのｇｌｎ１５４にＥｃｏＲ
Ｉ部位を有するアダプター配列が続いている。このア
ダプターの配列は次のようである： ５’−ＡＡＴ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＡ ＴＧＡ Ｇ − ３’ ＡＣ ＣＣＴ ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＣＡＧ ＣＴ。
【０２６８】ＥｃｏＲ Ｉ部位は，カセットを有するベ
クターから発現する場合には，次のアミノ酸配列を有す
るオリゴペプチドリンカーを介してスーパーオキサイド
ジスムターゼに融合するポリペプチドを生じる，異種配
列の挿入を可能にしている： −ａｓｎ−ｌｅｕ−ｇｌｙ−ｉｌｅ−ａｒｇ−。
【０２６９】ｐＳ３５６の試料は，ブタペスト条約のも
とに１９８８年４月２９日にアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌ
ａｗｎ Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ ２０８５３に寄託されており，受託番号第６７６８
３号が与えられている。寄託物を入手し得る期間および
寄託物の入手方法，ならびに寄託物の保持については，
ＮＡＮＢＶ−ｃＤＮＡを有する株についてＩＩ．Ａ．節
で明記したのと同様である。この寄託は便宜のみを意図
しており，本明細書の記述により本発明を実施するため
のものではない。この寄託物を，参照としてここに引用
する。
【０２７０】正しい方向でＣ１００ ｃＤＮＡインサー
トを有する組換え体を単離した後，Ｃ１００ ｃＤＮＡ
を有する発現カセットをｐＳ３−５６Ｃ１００からＢａ
ｍＨＩで切り出し，このカセットを有する約３４００ｂ
ｐのフラグメントを単離・精製した。次いで，このフラ
グメントを酵母ベクターｐＡＢ２４のＢａｍＨ Ｉ部位
に挿入した。
【０２７１】重要な特徴を第５１図に示すプラスミドｐ
ＡＢ２４は，複製のための完全な２μ配列［Ｂｒｏａｃ
ｈ（１９８１）］およびｐＢＲ３２２配列を有する酵母
シャトルベクターである。このプラスミドは，プラスミ
ドＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）］由来
の酵母ＵＲＡ３遺伝子，およびプラスミドｐＣ１／１由
来の酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子も有する。ＥＰＯ公開第１１
６，２０１号公報。プラスミドｐＡＢ２４は，部分的な
２μ配列を除去するためにＹＥｐ２４をＥｃｏＲ Ｉで
消化し，このベクターを再連結することにより構築し
た。得られたプラスミドＹＥＰ２４ｄｅｌｔａＲＩを，
Ｃｌａ Ｉで切断することにより直線化し，Ｃｌａ Ｉ
で直線化されている完全な２μプラスミドと連結した。
次いで，得られたプラスミドｐＣＢｏｕをＸｂａ Ｉで
切断し，８６０５ｂｐのベクターフラグメントをゲルで
単離した。この単離されたＸｂａ Ｉフラグメントを，
ｐＣ１／１から単離されたＬＥＵ２ｄ遺伝子を有する４
４６０ｂｐのＸｂａ Ｉフラグメントと連結した。この
ＬＥＵ２ｄ遺伝子の方向は，ＵＲＡ３遺伝子と同じ方向
である。発現の挿入は，ｐＢＲ３２２配列の唯一のＢａ
ｍＨ Ｉ部位であった。従って，テトラサイクリンに対
する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻止している。
【０２７２】ＳＯＤ−Ｃ１００発現カセットを有する組
換え体プラスミドｐＡＢ２４Ｃ１００−３を，酵母ＪＳ
Ｃ ３０８株およびその他の株に導入した。細胞をＨｉ
ｎｎｅｎら（１９７８）により記載されているように形
質転換し，ｕｒａ−選択プレートにプレーティングし
た。単一のコロニーをｌｅｕ−選択培地に接種し，飽和
状態となるまで増殖させた。この培養物は，１％グルコ
ースを含有するＹＥＰで生育させることにより，ＳＯＤ
−Ｃ１００ポリペプチド（Ｃ１００−３と呼ぶ）を発現
するように誘導された。
【０２７３】ＪＳＣ ３０８株は，ＡＤＲ１遺伝子座に
組み込まれている遺伝子型がＭＡＴ＠，ｌｅｕ２，ｕｒ
ａ３（ｄｅｌ）ＤＭ１５（ＧＡＰ／ＡＤＲ１）である。
ＪＳＣ ３０８においては，正の活性化遺伝子産物ＡＤ
Ｒ１の過剰な発現は，発現された異種タンパクがＡＤＨ
２ ＵＡＳ調節システムにより合成される場合には，過
度の抑制解除（ｈｙｐｅｒｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）
（ＡＤＲ１野生型対照に関連する）と，そのようなタン
パクの非常に高い収量とをもたらす。酵母ＪＳＣ ３０
８株の構築は，係属中の米国特許出願番号（代理人Ｄｏ
ｃｋｅｔＮｏ．２３００−０２２９）に開示されてお
り，この特許出願を本願と同時に出願し，これを参照文
献としてここに引用する。ＪＳＣ ３０８の試料は，ブ
タペスト条約の下に１９８８年５月５日に，ＡＴＣＣに
寄託されており，受託番号第２０８７９号が与えられて
いる。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入手方
法，ならびに寄託物の保持については，ＨＣＶ ｃＤＮ
Ａを有する株についてＩＩ．Ａ．節で明記したのと同じ
である。
【０２７４】ｐＡＢ２４Ｃ１００−３でコードされる完
全なＣ１００−３融合ポリペプチドは，アミノ末端にヒ
トＳＯＤの１５４個のアミノ酸と，ＥｃｏＲ Ｉ部位を
有する合成アダプター由来の５個のアミノ酸残基と，Ｃ
１００ ｃＤＮＡ由来の３６３個のアミノ酸残基と，ク
ローン３２のＨＣＶ ｃＤＮＡに隣接したＭＳ２ヌクレ
オチド配列由来の５個のカルボキシ末端アミノ酸とを有
するはずである。（ＩＶ．Ａ．７．節を参照のこと）。
ＳＯＤの最後から２つ目のＡｌａ残基で始まる，このポ
リペプチドのカルボキシ末端の推定アミノ酸配列を，第
５２〜５３図に示す。このポリペプチドのこの部分をコ
ードするヌクレオチド配列も同様に示す。
【０２７５】ＩＶ．Ｂ．５．Ｃ１００内にコードされる
ポリペプチドのＮＡＮＢＨ関連抗原としての同定 酵母ＪＳＣ ３０８株内のプラスミドｐＡＢ２４Ｃ１０
０−３から発現するＣ１００−３融合ポリペプチドを，
サイズについて特徴付けした。そして，Ｃ１００内にコ
ードされるポリペプチドを，その慢性ＮＡＮＢＨのヒト
由来の血清との免疫学的反応性によりＮＡＮＢＨ−関連
抗原として同定した。
【０２７６】ＩＶ．Ｂ．４．節で記述したように発現す
るＣ１００−３ポリペプチドは，以下のようにして分析
した。酵母ＪＳＣ ３０８細胞をｐＡＢ２４またはｐＡ
Ｂ２４Ｃ１００−３で形質転換し，外来プラスミドがコ
ードするポリペプチドを発現するように誘導した。培養
物（ＯＤ６５０ｎｍが約２０）１ｍｌ中の誘導酵母細胞
を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより
ペレットとし，それらを２容量の溶液および１容量のガ
ラスビーズ（直径０．２ミリミクロン）とともに激しく
渦巻攪拌（１０×１分）することにより細胞溶解させ
た。この溶液は，５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ），および１μｇ／ｍｌペプ
スタチンを含有していた。Ｃ１００−３ポリペプチドを
含有する細胞溶解物中の不溶性物質を，遠心分離（１
０，０００ｒｐｍ，５分間）により集め，Ｌａｅｍｍｌ
ｉのＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸することにより溶
解させた。〔Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）を参照のこ
と〕。誘導された酵母培養物０．３ｍｌ中の量に相当す
る量のポリペプチドを，Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に
従い，ＳＤＳ存在下で１０％ポリアクリルアミドゲルに
より電気泳動を行った。タンパク標準物質を一緒にゲル
電気泳動した。発現されたポリペプチドを含有するゲル
は，クマシーブリリアントブルーで染色するか，または
ｐＡＢ２４およびｐＡＢ２４Ｃ１００−３から発現され
たポリペプチドの免疫学的反応性を決定するために慢性
ＮＡＮＢＨの患者由来の血清を用いて，ＩＶ．Ｂ．２．
節で記述したような“ウェスタン”ブロットに供した。
【０２７７】結果を第５４図に示す。第５４図Ａでは，
ポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色し
た。ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ３０８由来の不溶
性ポリペプチド，およびｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質
転換したＪＳＣの異なる二つのコロニー由来の不溶性ポ
リペプチドを，それぞれレーン１（ｐＡＢ２４），なら
びにレーン２および３に示す。レーン２および３とレー
ン１との比較は，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換し
たＪＳＣ ３０８由来の分子量が約５４，０００ダルト
ンに相当するポリペプチドの，誘導された発現を示す。
このポリペプチドは，ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ
３０８では誘導されない。このポリペプチドを矢印で
示す。
【０２７８】第５４図（ｂ）は，ｐＡＢ２４（レーン
１）またはｐＡＢ２４Ｃ１００−３（レーン２）で形質
転換したＪＳＣ ３０８で発現される，不溶性ポリペプ
チドのウェスタンブロットの結果を示す。ｐＡＢ２４か
ら発現されるポリペプチドは，ＮＡＮＢＨのヒト由来の
血清と免疫学的な反応性を示さなかった。しかしなが
ら，矢印で示したように，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形
質転換したＪＳＣ ３０８は，ヒトＮＡＮＢＨ血清と免
疫学的に反応する約５４，０００ダルトンのポリペプチ
ドを発現した。レーン２の，免疫学的に反応性のあるそ
の他のポリペプチドは，この約５４，０００ダルトンの
ポリペプチドの分解産物および／または凝集物であり得
る。
【０２７９】ＩＶ．Ｂ．６．融合ポリペプチドＣ１００
−３の精製 Ｎ末端にＳＯＤを，そしてＣ末端にフレーム内（ｉｎ−
ｆｒａｍｅ）のＣ１００ ＨＣＶ−ポリペプチドを有す
る融合ポリペプチドＣ１００−３を，ポリペプチドが発
現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分を分別抽出す
ることにより精製した。
【０２８０】融合ポリペプチドＣ１００−３を，ＩＶ．
Ｂ．４．節に記述したように，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３
で形質転換した酵母ＪＳＣ ３０８株で発現させた。次
いで，酵母細胞をホモジナイズすることにより溶解さ
せ，溶解物中の不溶性物質をｐＨ１２．０で抽出した。
そして，残った不溶性画分中のＣ１００−３を，ＳＤＳ
を含有する緩衝液に可溶化した。
【０２８１】酵母溶解物を，本質的にＮａｇａｈｕｍａ
ら（１９８４）に従って調製した。２０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭジチオスレイトール，および
１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）を含有する溶液（緩衝液Ａ）中に，３３％細胞（ｖ
／ｖ）の割合で，酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁
液の所定量（１５ｍｌ）を等量のガラスビーズ（直径
０．４５−０．５０ｍｍ）と混合し，この混合物をＳｕ
ｐｅｒ Ｍｉｘｅｒ（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）の最高速度で８分間渦巻攪拌し
た。このホモジネートおよびガラスビーズを分離し，も
との細胞沈澱物と同様に，ガラスビーズを等量の緩衝液
Ａで３回洗浄した。洗浄液とホモジネートとを合わせた
後，ホモジネートを７，０００×ｇで１５分間，４℃で
遠心分離し，ペレットをもとの細胞沈澱物の２倍量に相
当する量の緩衝液Ａに再懸濁し，７，０００×ｇで１５
分間遠心分離して物質を再びペレットとすることによ
り，溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を３回
繰り返した。
【０２８２】溶解物からの不溶性物質は，以下のように
してｐＨ １２．０で抽出した。ペレットを０．５Ｍ
ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に懸濁し
た。ここで，懸濁液の容量は，もとの細胞沈澱物の１．
８倍量に相当した。懸濁液のｐＨは，０．２容量の０．
４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２．０）を添加す
ることにより調整した。混合した後，懸濁液を７，００
０×ｇで１５分間，４℃で遠心分離し，上清を除去し
た。この抽出を２回繰り返した。抽出したペレットは，
もとの細胞沈澱物の２倍量に相当する懸濁液量を用い，
該ペレットを０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡに
懸濁し，次いで７，０００×ｇで１５分間，４℃で遠心
分離することにより洗浄した。
【０２８３】ペレット抽出物中のＣ１００−３ポリペプ
チドは，ＳＤＳで処理することにより可溶化した。この
ペレットをもとの細胞沈澱物の容量の０．９容量に相当
する量の緩衝液Ａに懸濁し，０．１容量の２％ＳＤＳを
添加した。懸濁液を混合した後，７，０００×ｇで１５
分間，４℃で遠心分離した。得られたペレットをＳＤＳ
で３回以上抽出した。Ｃ１００−３を含有する，得られ
た上清をプールした。
【０２８４】この工程により，Ｃ１００−３は酵母ホモ
ジネートの不溶性画分から１０倍以上精製され，ポリペ
プチドの回収率は５０％以上を越える。
【０２８５】融合ポリペプチドの精製調製物は，Ｌａｅ
ｍｍｌｉ（１９７０）に従い，ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分析した。この分析に基づくと，ポリペ
プチドはその純度が８０％を越え，見かけの分子量約５
４，０００ダルトンを有していた。
【０２８６】ＩＶ．Ｃ．ＨＣＶ ｃＤＮＡにハイブリダ
イズする，感染個体のＲＮＡの同定 ＩＶ．Ｃ．１．ＨＣＶ ｃＤＮＡにハイブリダイズす
る，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓内のＲＮＡの同定 以下のように，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓由来の
ＲＮＡは，ノーザンブロットによりクローン８１に含有
されるＨＣＶ ｃＤＮＡとハイブリダイズする種類のＲ
ＮＡを含有することが示された。
【０２８７】ＲＮＡを，高力価の血漿が得られたチンパ
ンジーの肝臓の生検材料から単離した（ＩＶ．Ａ．１．
節を参照のこと）。これには，哺乳動物細胞からの全Ｒ
ＮＡの単離，ならびに該ＲＮＡのポリＡ＋画分およびポ
リＡ−画分への分離についてＭａｎｉａｔｉｓら（１９
８２）に記載された技術を用いた。これらのＲＮＡ画分
を，ホルムアルデヒド／アガロースゲル（１％ ｗ／
ｖ）での電気泳動に供し，ニトロセルロース膜に移し
た。（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２））。ニトロセル
ロースフィルターを，クローン８１由来の放射性標識Ｈ
ＣＶ ｃＤＮＡ（インサートのヌクレオチド配列につい
ては，第４図を参照のこと）とハイブリダイズさせた。
放射性標識プローブを調製するために，クローン８１か
ら単離したＨＣＶ ｃＤＮＡインサートを，ＤＮＡポリ
メラーゼＩを用いたニックトランスレーション（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら（１９８２））により３２Ｐで放射性標識
した。ハイブリダイゼーションは，１０％（ｗ／ｖ）デ
キストランスルフェート，５０％（ｗ／ｖ）脱イオン化
ホルムアミド，７５０ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン
酸ナトリウム，２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．
５），０．１％ＳＤＳ，０．０２％（ｗ／ｖ）ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ），０．０２％（ｗ／ｖ）フィコー
ルー４００，０．０２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリド
ン，１００μｇ／ｍｌの超音波処理および変性処理によ
りせん断したサケ精子ＤＮＡ，および１０６ＣＰＭ／ｍ
ｌのニックトランスレーションしたｃＤＮＡプローブを
含有する溶液中で１８時間，４２℃で行った。
【０２８８】プローブで処理したフィルターのオートラ
ジオグラフを，第５５図に示す。レーン１は，３２Ｐ−
標識した制限フラグメントマーカーを含有する。レーン
２−４は，以下のようなチンパンジー肝臓のＲＮＡを含
有する：レーン２は，３０μｇの全ＲＮＡを含有し；レ
ーン３は，３０μｇのポリＡ−ＲＮＡを含有し；そして
レーン４は，２０μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含有する。第
５５図に示すように，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓
は，ＨＣＶ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズし，か
つ約５０００ヌクレオチドから約１１，０００ヌクレオ
チドの大きさと考えられる，ポリＡ＋ＲＮＡ分子関連の
異種集団を含有する。ＨＣＶ ｃＤＮＡにハイブリダイ
ズするこのＲＮＡは，細菌ゲノムおよび／または細菌ゲ
ノムの特異的転写物を意味し得る。
【０２８９】以下のＩＶ．Ｃ．２．節に記述した実験
は，ＨＣＶは一つのＲＮＡゲノムを有するという示唆と
一致する。
【０２９０】ＩＶ．Ｃ．２．感染個体から得た血清中の
ＨＣＶ由来ＲＮＡの同定 ＩＶ．Ａ．１．節で記述したように，核酸を，高力価の
チンパンジーＮＡＮＢＨ血漿から単離した粒子から抽出
した。単離した核酸の一定量（もとの血漿の１ｍｌに相
当する）を，２０μｌの５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ
７．５），１ｍｍＥＤＴＡおよび１６μｇ／ｍｌ酵母可
溶性ＲＮＡに再懸濁した。試料は，５分間煮沸した後，
直ちに凍結することにより変性させ，ＲＮａｓｅ Ａ
（５μｌ；２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液，４０ｍＭＨｅｐｅ
ｓ（ｐＨ ７．５）に０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ
Ａを含有する）またはＤＮａｓｅ Ｉ（５μｌ；１０ｍ
ＭＭｇＣｌ２，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）
中に１単位のＤＮａｓｅＩを含有する）で処理した。対
照の試料は，酵素なしでインキュベートした。インキュ
ベーションの後，２μｇ／ｍｌ酵母可溶性ＲＮＡを含有
する２３０μｌの氷冷２×ＳＳＣを添加し，試料をニト
ロセルロースフィルターで濾過した。このフィルター
を，ニックトランスレーションにより３２Ｐ−標識した
クローン８１由来のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズ
させた。第５６図は，このフィルターのオートラジオグ
ラフを示す。ハイブリダイゼーションのシグナルは，Ｄ
Ｎａｓｅ処理試料および対照試料（それぞれ，レーン２
および１）で検出されたが，ＲＮａｓｅで処理した試料
（レーン３）では検出されなかった。このように，ＲＮ
ａｓｅ Ａ処理により粒子から単離した核酸が分解さ
れ，ＤＮａｓｅ処理は何の影響もなかったので，この証
拠により，ＨＣＶゲノムがＲＮＡにより構成されるとい
うことが強く示唆される。
【０２９１】ＩＶ．Ｃ．３．ＮＡＮＢＨを有するチンパ
ンジーから得られる肝臓および血漿試料におけるＨＣＶ
核酸配列由来の増幅ＨＣＶ核酸配列の検出 ＮＡＮＢＨを有するチンパンジーの肝臓および血漿中に
存在するＨＣＶ核酸，および対照のチンパンジーにおけ
るＨＣＶ核酸は， 基本的にＳａｉｋｉら（１９８６）
が記述したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の手法を用い
て増幅された。このプライマーオリゴヌクレオチドは，
クローン８１，あるいはクローン３６および３７におけ
るＨＣＶ ｃＤＮＡ由来であった。この増幅された配列
は，適当なｃＤＮＡオリゴマー（これは，２つのプライ
マーの間の領域を有するが２つのプライマーを含まな
い）をプローブとして用い，ゲル電気泳動およびサザン
ブロッティングによって検出された。
【０２９２】増幅系によって調べられるＨＣＶ配列を含
むＲＮＡ試料は，ＮＡＮＢＨを保有する３匹のチンパン
ジーおよび２匹の対照のチンパンジーの肝臓の生体試料
から単離された。ＲＮＡ画分の単離は，ＩＶ．Ｃ．１節
に記載したグアニジウムチオシアネート法により行なっ
た。
【０２９３】増幅系によって調べられるべきＲＮＡ試料
もまた，２匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジーおよび１匹
の対照チンパンジー，さらに対照のチンパンジーから得
られる貯留した血漿から単離された。１匹の感染チンパ
ンジーは，１０６と同等かそれを越えるＣＩＤ／ｍｌを
有し，他の感染チンパンジーは，１０５と同等かそれを
越えるＣＩＤ／ｍｌを有する。
【０２９４】この核酸は，次のようにして血漿から抽出
した。血漿の０．１ｍｌのもしくは０．０１ｍｌを１０
μｇ／ｍｌのポリアデニル酸を含有するＴＥＮＢ／プロ
ティナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ８．０，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ
ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ，および
０．５％ ＳＤＳ）で最終体積が１．０ｍｌになるよう
に希釈し，３７℃にて６０分間インキュベートした。こ
のプロテイナーゼＫによる分解の後，フェノール飽和Ｔ
Ｅ（１０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１
ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた抽出により，脱タンパクし
た。遠心分離によりフェノール層を分離し，０．１％の
ＳＤＳを含むＴＥＮＢで再抽出した。それぞれの抽出で
得られる水相をプールし，等容量のフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール〔１：１（９９：２）〕
溶液で２度抽出し，その後等容量のクロロホルム／イソ
アミルアルコール（９９：１）の混液を用いて，２度抽
出した。遠心分離により相分離し，水相を，酢酸ナトリ
ウムの最終濃度が０．２Ｍとなるようにし，エタノール
を２倍量添加することにより核酸を沈澱させた。沈澱し
た核酸は，ＳＷ４１のローターで３８Ｋにて４℃で６０
分間超遠心分離を行なうことにより回収した。
【０２９５】上記に加えて，高力価のチンパンジーの血
漿およびプールされた対照の血漿のどちらか一方を，Ｃ
ｈｏｍｃｙｚｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）の
方法により，５０μｇのポリＡ担体を用いて抽出した。
この方法では，酸グアニジウムチオシアナート（ａｃｉ
ｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ）抽出を使用する。ＲＮＡを，エッペンドルフ マ
イ，クロフュージ中で，４℃にて１０分間，１０，００
０ＲＰＭにて遠心分離することにより回収した。
【０２９６】２つの場合においては，ＰＣＲ反応におけ
るｃＤＮＡの合成に先立って，プロテイナーゼＫ／ＳＤ
Ｓ／フェノール法によって血漿から抽出された核酸は，
さらにＳおよびＳエルチップ−Ｒ（Ｓ Ｅｌｕｔｉｐ−
Ｒ）カラムに結合させ，このカラムから溶出させること
により精製した。それに続く工程は製造者の指示により
行なった。
【０２９７】ＰＣＲ反応の鋳型として用いられたｃＤＮ
Ａは，上述のように調製された核酸（全核酸または全Ｒ
ＮＡ）から誘導された。エタノール沈澱に続き，沈澱し
た核酸を乾燥し，蒸留水処理したＤＥＰＣに再懸濁し
た。核酸の２次構造を，試料を６５℃にて１０分間加温
することによって引き離し，そして，速やかに試料を氷
で冷却した。ｃＤＮＡは，肝臓，あるいは１０〜１００
μｌの血漿から抽出された核酸（あるいはＲＮＡ）から
得られる総チンパンジーＲＮＡ １〜３μｇを用いて合
成された。この合成は逆転写酵素を利用し，製造者ＢＲ
Ｌによって詳細に述べられているプロトコールを用い，
２５μｌの反応液中で行われた。ｃＤＮＡ合成用のプラ
イマーは，後述のＰＣＲ反応でもまた利用されているプ
ライマーであった。ｃＤＮＡ合成のすべての反応混合物
には，ＲＮＡａｓｅ阻害剤であるＲＮＡＳＩＮＴＭ（Ｆ
ｉｓｈｅｒ／Ｐｒｏｍｅｇａ）を２３Ｕ含有していた。
ｃＤＮＡ合成に続き，この反応混合物を水で希釈し，１
０分間煮沸し，氷上ですばやく冷却した。
【０２９８】このＰＣＲ反応は，１μｇのＲＮａｓｅ
Ａの添加を除いては，製造者（Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って行なった。この反応
は，最終容量が１００μｌとなるように行なわれた。こ
のＰＣＲは，３７℃，７２℃，および９４℃の条件下
で，３５サイクルにわたって行なわれた。
【０２９９】ｃＤＮＡ合成用プライマーおよびＰＣＲ反
応プライマーは，クローン８１，クローン３６，あるい
はクローン３７ｂのいずれかにおけるＨＣＶ ｃＤＮＡ
配列から得られた。（クローン８１，３６および３７ｂ
のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列は，第４図，第５図および第１
１図にそれぞれ示されている。）クローン８１由来の２
個の１６量体プライマーの配列は次のとりである： ５’ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｇ ３’ および ５’ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＴＧ Ａ ３’。
【０３００】クローン３６から得られるプライマーの配
列は次のとおりである： ５’ＧＣＡ ＴＧＴ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＴＡ Ｔ ３’。
【０３０１】クローン３７ｂから得られるプライマーの
配列は次のとおりである： ５’ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ Ｃ ３’。
【０３０２】このＰＣＲ反応において，このプライマー
の対は，クローン８１由来の２つの１６量体プライマー
対；あるいはクローン３６由来の１６量体プライマーと
クローン３７ｂ由来の１６量体プライマーとの対のいず
れによっても構成される。
【０３０３】このＰＣＲ反応生産物は，該生産物をアル
カリゲル電気泳動にかけサザンブロッティングを行い，
プライマーと重複しないＨＣＶ ｃＤＮＡ領域由来の
３２Ｐ標識内部のオリゴヌクレオチドプローブにより増
幅されたＨＣＶ−ｃＤＮＡ配列を検出することによって
分析された。このＰＣＲ反応混合物をフェノール／クロ
ロホルムで抽出し，核酸を，塩およびエタノールを用い
て水相から沈澱さた。沈澱させた核酸を遠心分離で回収
し，蒸留水に溶解させた。試料の一部は，１．８％アル
カリアガロースゲルで電気泳動を行った。６０，１０８
および１６１のヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡを，分子
量マーカーとして，同時に電気泳動にかけた。電気泳動
後，このゲル中のＤＮＡを，Ｂｉｏｒａｄ Ｚｅｔａ
ＰｒｏｂｅＴＭ紙に移した。プレハイブリダイゼーショ
ンおよびハイブリダイゼーション，および洗浄条件は，
製造者（Ｂｉｏｒａｄ）によって規定される条件に従っ
た。
【０３０４】増幅されたＨＣＶ ｃＤＮＡ配列のハイブ
リダイゼーション検出に用いられたプローブは次のとお
りである。ＰＣＲプライマーの対がクローン８１由来で
あるときには，２つのプライマーの配列の間の領域に位
置する配列に対応する配列を有する１０８量体であっ
た。このＰＣＲプライマー対がクローン３６および３７
ｂ由来であるとき，このプローブはクローン３５由来
の，ニック翻訳されたＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入物であっ
た。このプライマーはクローン３７挿入物の１５５〜１
７０ヌクレオチドおよびクローン３６挿入物の２０６〜
２６８ヌクレオチド由来である。クローン３５における
ＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入物の３’末端は，クローン３６の
挿入物の１〜１８６のヌクレオチドと重複しており，そ
して，クローン３５挿入物の５’末端はクローン３７ｂ
の挿入物の２０７〜２６９ヌクレオチドと重複する。
（第５，第８，および第１１図を比較されたい。）この
ように，クローン３５中のｃＤＮＡの挿入物は，クロー
ン３６および３７ｂ由来のプライマーの配列間の領域部
分にまでおよび，これらプライマーを含む増幅配列のた
めのプローブとして有用である。
【０３０５】肝臓試料由来のＲＮＡの分析は，プライマ
ーおよびプローブの両セットを利用する上記方法に従っ
て行なった。３匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジーの肝臓
由来のＲＮＡは，予期されるサイズの増幅配列（８１お
よび３６および３７ｂにおいて，それぞれ１６１および
５８６ヌクレオチド）については，ハイブリダイゼーシ
ョンの結果が陽性であり，他方，対照のチンパンジーに
ついては，ハイブリダイゼーションの結果が陰性であっ
た。この実験を３回繰りかえしたところ同じ結果が得ら
れた。
【０３０６】血漿から得られる核酸およびＲＮＡの分析
もまた，クローン８１由来のプライマーおよびプローブ
を利用する上記方法により行なわれた。この血漿は，２
匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジー由来の血漿，対照のチ
ンパンジー由来の血漿，そして対照のチンパンジーから
得られるプールされた血漿である。両ＮＡＮＢＨ血漿
は，核酸／ＲＮＡを有し，ＰＣＲ増幅アッセイで陽性の
結果が得られ，他方，両対照血漿は陰性の結果が得られ
た。これらの結果は数回繰り返して得られた。
【０３０７】ＩＶ．Ｄ．感染個体由来の血清中のＨＣＶ
抗体を検出するためのラジオイムノアッセイ ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノア
ッセイは，ＴｓｕおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８
０）の方法を基にして開発された。マイクロタイタープ
レート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２，Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌｓ
ｔｒｉｐｓ）をＨＣＶエピトープを有する精製ポリペプ
チドで被覆する。この被覆プレートは，ＨＣＶエピトー
プに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試料，ある
いは適当な対照試料とともにインキュベートされる。イ
ンキュベートを行なう間に，抗体が存在するのであれ
ば，該抗体は固相抗原に免疫学的に結合する。非結合物
質を除去し，そしてこのマイクロタイタープレートを洗
浄後，ヒト抗体−ＮＡＮＢＶ抗原複合体は，１２５Ｉ標
識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベート
することによって検出される。結合しなかった標識抗体
を吸引によって除去し，そしてプレートを洗浄する。個
々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト抗ＨＣＶ抗
体の量はウェル中の放射能に比例する。
【０３０８】ＩＶ．Ｄ．１．融合ポリペプチドＳＯＤ−
ＮＡＮＢ５−１−１の精製 ＩＶ．Ｂ．１．節に記載の組換え体細菌中で発現する融
合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１は，組換え
体Ｅ． ｃｏｌｉから，尿素で細胞抽出物を分画抽出す
ることによって，次いで，次のように陰イオンおよび陽
イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかけること
によって精製された。
【０３０９】１リッターの培養物から得られる溶解細胞
を，０．０１Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，を含有
する１０ｍｌの２０％（Ｗ／Ｖ）シュークロース中に再
懸濁し，０．４ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．
０，を添加した。０℃にて５分後，この混合物を４，０
００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られたペレット
を０．０５Ｍ トリス−ＨＣＬ，ｐＨ８．０，１ｍＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およ
びペプスタチンＡ １μｇを含有する１０ｍｌの２５％
（Ｗ／Ｖ）シュークロース液に懸濁させ，次いで，０．
５ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し，０℃
で１０分間インキュベートした。０．０５Ｍ トリス−
ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ中に１％（Ｖ／
Ｖ）のトリトンＸ−１００を含む溶液１０ｍｌを添加
後，この混合液を，時々振盪しながらひきつづき０℃に
て１０分間インキュベートした。得られた粘稠な溶液
を，２０ゲージの滅菌皮下注射針を６回通すことによ
り，ホモジナイズし，１３，０００×ｇにて２５分間遠
心分離した。ペレット化した物質を，０．０１Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）５ｍｌに懸濁させ，この懸
濁液を，４，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。Ｓ
ＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１融合タンパクを含有するペレ
ットを，０．０２Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），
１ｍＭジチオスレイトール（緩衝液Ａ）中に６Ｍ尿素を
含む溶液５ｍｌに溶解させ，緩衝液Ａで平衡化したＱ−
セファロースファースト フローカラムにかけた。ポリ
ペプチドは，緩衝液ＡのＮａＣｌ中０．０〜０．３Ｍの
リニアグラジエントで溶出した。溶出後，各画分を，Ｓ
ＯＤの存在下，ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
て分析し，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１の含量を決定し
た。このポリペプチドを含有する画分をプールし，０．
０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），１ｍＭ
ジオチスレイトール，に６Ｍ尿素を含む緩衝液（緩衝液
Ｂ）に対して透析した。この透析試料を，緩衝液Ｂで平
衡化したＳ−セファロース ファースト フローカラム
にかけ，ポリペプチドを緩衝液Ｂ中でＮａＣｌ０．０〜
０．３Ｍのリニアグラジエントで溶出させた。この画分
を，ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し，ＳＯＤ
−ＮＡＮＢ５−１−１の存在を調べ，適当な画分をプー
ルした。このＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチド
の最終調製物を，ＳＤＳの存在下で，ポリアクリルアミ
ド電気泳動にかけて調べた。この分析によれば，この調
製物は，８０％を越える純度であった。
【０３１０】ＩＶ．Ｄ．２ 融合ポリペプチドＳＯＤ−
ＮＡＮＢ８１の精製 ＩＶ．Ｂ．２．節で記載の組換え体細菌中で発現した融
合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１は，組換え体Ｅ．
ｃｏｌｉから，尿素を用いた細胞抽出物の分画抽出に
より，次いで，融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ
５−１−１を単離するために記載された工程（ＩＶ．
Ｄ．１．節を参照されたい）を用いて，陰イオンおよび
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行なうことに
より精製された。
【０３１１】ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１ポリペプチドの最終
調製物は，ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって調べられた。この分析によれば，この調
製物は５０％を越える純度であった。
【０３１２】ＩＶ．Ｄ．３．固相ラジオイムノアッセイ
によるＨＣＶエピトープに対する抗体の検出 ＮＡＮＢＨを有すると診断された３２人の患者から得ら
れる血清試料を，ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によ
って分析し，融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ
５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１中に存在するＨ
ＣＶエピトープに対する抗体が検出されるか否か決定し
た。
【０３１３】マイクロタイタープレートをＳＯＤ−ＮＡ
ＮＢ５−１−１あるいはＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１（それぞ
れ，ＩＶ．Ｄ．１節およびＩＶ．Ｄ．２節に従って，部
分精製されている）で被覆した。この分析は，次のよう
にして行なわれた。
【０３１４】０．１２５Ｍホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３，
０．０７５ Ｍ ＮａＣｌ（ＢＢＳ）中 に０．１〜
０．５μｇのＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１あるいはＳＯ
Ｄ−ＮＡＮＢ８１を含む１００μｌを，マイクロタイタ
ープレート（ＤｙｎａｔｅｃｈＩｍｍｕｌｏｎ ２ Ｒ
ｅｍｏｖａｗｅｌｌ Ｓｔｒｉｐｓ）の各ウェルに添加
した。このプレートを湿潤チャンバー内で４℃にて一晩
インキュベートし，その後，このタンパク溶液を除去
し，０．０２％ トリトンＸ−１００を含有するＢＢＳ
（ＢＢＳＴ）で３度このウェルを洗浄した。非特異的な
結合を防ぐために，このウェルを牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）で被覆した。この操作は，ＢＳＡを５ｍｇ／ｍｌ
の割合でＢＢＳに溶解させた溶液１００μｌ添加し，次
いで，室温で１時間インキュベートすることによって行
なった。このインキュベートの後，ＢＳＡ溶液を除去し
た。被覆されたウェル中のポリペプチドを血清と反応さ
せ，該血清含有ウェルを３７℃にて１時間インキュベー
トした。上記血清との反応は，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
を含有する含０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
７．２ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ＰＢＳ）中に１：１０
０の割合に希釈された血清試料１００μｌを添加するこ
とにより行なった。インキュベートの後，この血清試料
を吸引除去し，このウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。
この融合ポリペプチドに結合した抗ＮＡＮＢ５−１−１
およびＮＡＮＢ８１は，１２５Ｉ標識Ｆ’（ａｂ）２ヒ
ツジ抗ヒトＩｇＧをこの被覆ウェルに結合させることに
より，決定された。標識プローブ（比活性５〜２０μＣ
ｉ／μｇ）１００μｌを各ウェルに添加し，このプレー
トを，３７℃にて１時間インキュベートした。次いで，
過剰のプローブを吸引除去し，ＢＢＳＴで５回洗浄し
た。各ウェルに結合した放射能の量を，γ線を検出する
カウンターでカウントし決定した。
【０３１５】ＮＡＮＢＨ保有個体における抗ＮＡＮＢ
５−１−１および抗ＮＡＮＢ８１の検出結果を，表１お
よび表２に示す。
【０３１６】
【表１】
【０３１７】
【表２】
【０３１８】表１および表２からわかるように，ＮＡＮ
ＢＨを保有していると診断された患者から得られた３２
の血清のうち１９が，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およ
びＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に存在するＨＣＶエピトープに
対する抗体について陽性であった。
【０３１９】しかし，陽性であった血清試料は，ＳＯＤ
−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１と同
様に免疫学的に反応性を有しているわけではなかった。
Ｎｏ．１の患者から得られた血清試料は，ＳＯＤ−ＮＡ
ＮＢ８１に対しては陽性であったがＳＯＤ−ＮＡＮＢ
５−１−１に対しては陽性ではなかった。Ｎｏ．１０，
１５および１７の患者から得られた血清試料はＳＯＤ−
ＮＡＮＢ５−１−１に対しては陽性であったが，ＳＯＤ
−ＮＡＮＢ８１に対しては陽性ではなかった。Ｎｏ．
３，８，１１および１２の患者から得られた血清試料は
ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ
８１の両融合ポリペプチドと同程度に反応するが，これ
に対してＮｏ．２，４，７および９の患者から得られる
血清試料においては，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に対するよ
りもＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１に対する反応の方が，
２〜３倍反応性が高かった。これらの結果によりＮＡＮ
Ｂ５−１−１およびＮＡＮＢ８１が少なくとも３個の異
なるエピトープを有し得ることが示唆される。つまり，
各ポリペプチドが少なくとも１個の独特のエピトープを
有し，そして，２個のポリペプチドが少なくとも１個の
エピトープを共有していることが可能である。
【０３２０】ＩＶ．Ｄ．４．ＮＡＮＢＨについての固相
ＲＩＡの特異性 ＮＡＮＢＨについての固相ＲＩＡの特異性は，ＨＡＶあ
るいはＨＢＶに感染した患者から得られる血清および対
照個体から得られる血清の分析を行なうことにより試験
された。部分精製されたＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１お
よびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１を使用する分析は，実施例Ｉ
Ｖ．Ｄ．３節に記載した方法により行なわれた。但し，
血清は，ＨＡＶあるいはＨＢＶを有しているとあらかじ
め診断された患者から得られた血清であるか，あるいは
血液バンクの提血者である個体から得られた血清であ
る。ＨＡＶおよびＨＢＶ感染患者からの血清についての
結果を表１および表２に示す。ＨＡＶ感染患者から得ら
れた１１個の血清試料，およびＨＢＶ感染患者から得ら
れた２０個の血清試料を用いて，ＲＩＡにより試験が行
なわれた。表１および表２に示すように，これら血清の
いずれもがＢＢ−ＮＡＮＢＶエピトープを有する融合ポ
リペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかった。
【０３２１】ＮＡＮＢ５−１−１抗原を用いたＲＩＡ
が，対照個体から得られる血清の免疫学的反応性を決定
するために用いられた。正常血液提供者集団から得られ
る２３０個の血清検体のかち，２個だけがＲＩＡにおい
て陽性反応を示した（データは示されていない）。これ
ら血清サンプルの源である２人の血液提供者は，以前に
ＨＣＶにさらされた可能性がある。
【０３２２】ＩＶ．Ｄ．５．ＮＡＮＢＨ感染進行中にお
けるＮＡＮＢ５−１−１の反応性 ２人の患者および４匹のチンパンジーのＮＡＮＢＨ感染
進行中における抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体の存在が，Ｉ
Ｖ．Ｄ．３節に記載されたＲＩＡ法を用いて追跡され
た。さらに，感染チンパンジーにおいて，ＨＡＶおよび
ＨＢＶの感染進行中における抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体
の有無を決定するためにＲＩＡが用いられた。
【０３２３】その結果を表３および表４に示す。この結
果により，チンパンジーおよびヒトにおいては，抗ＮＡ
ＮＢ５−１−１抗体は，ＮＡＮＢＨ感染の急性症状の発
現に従って検出された。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体は，
ＨＡＶあるいはＨＢＶに感染したチンパンジーから得ら
れる血清試料では検出されなかった。このように，抗Ｎ
ＡＮＢ５−１−１抗体は，個体がＨＣＶにさらされたこ
とを示すマーカーとしての働きを有する。
【０３２４】
【表３】
【０３２５】
【表４】
【０３２６】ＩＶ．Ｅ．ＮＡＮＢ５−１−１に対するポ
リクローナル血清抗体の精製 ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドと，ＮＡＮＢ
Ｈの患者由来の血清試料中の抗体との特異的な免疫学的
反応性に基づいて，ＮＡＮＢ５−１−１中のエピトープ
と免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開発された。
この方法はアフィニティークロマトグラフィーを利用す
る方法である。精製されたＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１
ポリペプチド（ＩＶ．Ｄ．１．節参照）を，不溶性の支
持体に結合させたが，その結合は，固定されたポリペプ
チドが，ＮＡＮＢ５−１−１に対する抗体の親和性を保
持するような結合である。血清試料中の抗体は，マトリ
ックスに結合したポリペプチドに吸収される。洗浄し
て，非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した
後，ｐＨの変更および／またはカオトロピック試薬（例
えば尿素）によって，結合した抗体を，これが結合して
いるＳＯＤ−ＨＣＶポリペプチドから脱離させる。
【０３２７】結合ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を含有す
るニトロセルロース膜を下記のようにして調製した。ニ
トロセルロースの膜〔２．１ｃｍのザルトリウス（Ｓａ
ｒｔｏｒｉｕｓ），微細孔の径：０．２μｍ〕を，ＢＢ
Ｓで３分間ずつ３回洗浄した。精製した製剤を，ＢＢＳ
中，室温で２時間かまたは４℃で一夜インキュベートす
ることによってＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を上記の膜
に結合させた。未結合の抗原を含有する溶液を除去し，
フィルターをＢＢＳで３分間ずつ３回洗浄した。膜に残
っている活性部位を，５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液ととも
に３０分間インキュベートすることにより，ＢＳＡでブ
ロックした。得られた膜を，ＢＢＳで５回，蒸留水で３
回洗浄して，過剰のＢＳＡを除去した。ウイルス抗原と
ＢＳＡを含有する膜を，次に，０．０５Ｍの塩酸グリシ
ン（ｐＨ２．５），０．１０ＭＮａＣｌ（Ｇｌｙ ＨＣ
ｌ）で１５分間処理し，次いでＰＢＳで３分間ずつ３回
洗浄した。
【０３２８】ＮＡＮＢＨに感染した個体由来の血清との
融合ポリペプチドを含有する膜を，２時間インキュベー
トすることによって，ポリクローナル抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体を単離した。インキュベーション後，フ
ィルターをＢＢＳで５回，蒸留水で２回洗浄した。次い
で結合している抗体を，各フィルターから，ＧｌｙＨＣ
ｌを５回，３分間ずつ用いて溶離した。各溶離液を，
２．０ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の入ってい
る試験管に集めて，溶離液のｐＨを８．０に調整した。
アフィニティークロマトグラフィーで処理した後の抗Ｎ
ＡＮＢ５−１−１抗体の回収率は約５０％である。
【０３２９】結合ウイルス抗原を含有するニトロセルロ
ース膜は，結合容量はそれほど減少することなしに数回
使用することができる。膜を再使用するには，抗体を溶
離した後，膜をＢＢＳで３回３分間ずつ洗浄する。次い
でＢＢＳ中，４℃で貯蔵する。
【０３３０】ＩＶ．Ｆ．精製ヒトポリクローナル抗−Ｈ
ＣＶ抗体を用いて感染血漿からＨＣＶ粒子を捕獲する方
法；捕獲された粒子中の核酸のＨＣＶ ｃＤＮＡへのハ
イブリダイゼーション ＩＶ．Ｆ．１．ヒトポリクローナル抗−ＨＣＶ抗体を用
いて感染血漿からＨＣＶ粒子を捕獲する方法 ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの感染性血漿中に存
在するタンパク−核酸複合体を，ポリスチレンビーズに
結合させた精製ヒトポリクローナル抗ＨＣＶ抗体を用い
て精製した。
【０３３１】ポリクローナル抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体
は，クローン５−１−１にコードされたＳＯＤ−ＨＣＶ
ポリペプチドを用いて，ＮＡＮＢＨに感染したヒト由来
の血清から精製した。精製法はＩＶ．Ｅ．節に記載の方
法を用いた。
【０３３２】精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を，ポリス
チレンビーズ（直径１／４”， 鏡面仕上げ，Ｐｒｅｃ
ｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａｌｌ Ｃｏ．，シカ
ゴ，イリノイ）に，各々，室温で一夜，１ｍｌの抗体
〔ホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ８．５）中１μｇ／ｍｌ〕と
ともにインキュベートすることによって結合させた。一
夜インキュベーションした後に，ビーズを，ＴＢＳＴ
（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０緩衝液，１５０ｍＭ
Ｎａｃｌ，０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で
１回洗浄し，次に１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するリ
ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
【０３３３】精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を全ヒト免
疫グロブリンと取替えること以外は，同様にして対照の
ビーズを調製した。
【０３３４】ビーズに結合させた抗ＮＡＮＢ５−１−１
抗体を用いて，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの血
漿から，ＨＣＶを次のようにして捕獲した。使用した，
ＮＡＮＢＨに感染したチンバンジーの血漿についてはＩ
Ｖ．Ａ．１．節に記載してある。ＮＡＮＢＶに感染した
チンパンジーの血漿の一部（１ｍｌ）を，抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体または対照の免疫グロブリンでコートし
た５個のビーズの各々と，３７℃で３時間インキュベー
トした。得られたビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した。
【０３３５】ＩＶ．Ｆ．２．捕獲された粒子中の核酸の
ＮＡＮＢＶ−ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション 抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体によって捕獲された粒子から
遊離した核酸成分を，クローン８１由来のＨＣＶ ｃＤ
ＮＡとハイブダイゼーションさせて分析した。
【０３３６】ＩＶ．Ｆ．１．節に記載したのと同様にし
て，ＨＣＶ粒子をＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの
血清から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるため
に，洗浄したビーズを，プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍ
ｌ），１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．５緩衝液，１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，０．２５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，１０μｇ
／ｍｌの可溶性酵母ＲＮＡを含有する溶液の０．２ｍｌ
／ビーズとともに，３７℃で６０分間インキュベート
し，次いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフェ
ノールとクロロホルムで抽出し，次いで核酸をエタノー
ルで，一夜−２０℃にて沈殿させた。この核酸の沈殿
を，遠心分離して集め，乾燥し，５０ｍＭＨｅｐｅｓ，
ｐＨ７．５に溶解させた。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体で
コートされたビーズから得た試料および全ヒト免疫グロ
ブリンを含有する対照ビーズで得た試料からの可溶性核
酸の二つの部分をニトロセルロースフィルターに吸い取
らせた。これらのフィルターを，クローン８１中の精製
ＨＣＶ ｃＤＮＡ断片で作製した，３２Ｐで標識し，ニ
ックトランスレーションを行ったプローブとハイブッド
させた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション
法は，ＩＶ．Ｃ．１．節に記載してある。
【０３３７】抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を含有するビー
ズによって捕獲された粒子由来の核酸を含有するプロー
ブされたフィルターのオートラジオグラフを第５７図に
示す。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を用いて得た抽出物
（Ａ，Ａ）から，対照の抗体抽出物（Ａ，Ａ）および対
照の酵母ＲＮＡ（Ｂ，Ｂ）に比べて明確なハイブリダイ
ゼーションシグナルを得た。精製クローン８１ ｃＤＮ
Ａ断片の１ｐｇ，５ｐｇおよび１０ｐｇからなる標準物
をそれぞれＣ１−３に示す。
【０３３８】これらの結果は，抗ＮＡＮＢ５−１−１抗
体によってＮＡＮＢＨ血漿から捕獲された粒子が，クロ
ーン８１内のＨＣＶ ｃＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンする核酸を含有することを示し，その結果これらのク
ローン中のｃＤＮＡは，ＮＡＮＢＨの病原体から誘導さ
れるという別の証拠を提供している。
【０３３９】ＩＶ．Ｇ．Ｃ１００−３と精製抗ＮＡＮＢ
５−１−１抗体との免疫学的反応性 Ｃ１００−３融合ポリペプチドと抗ＮＡＮＢ５−１−１
抗体との免疫学的反応性を，放射性免疫検定法によって
測定したが，この検定法では，固相に結合した抗原が，
精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体に投与され，生成した抗
原抗体複合物が，１２Ｉで標識したヒツジ抗ヒト抗体で
検出された。Ｃ１００−３ポリペプチドの免疫学的反応
性を，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１抗原のそれと比較し
た。
【０３４０】融合ポリペプチドＣ１００−３を，ＩＶ．
Ｂ．５．節とＩＶ．Ｂ．６．節にそれぞれ記載したのと
同様にして合成し精製した。融合ポリペプチドＳＯＤ−
ＮＡＮＢ５−１−１をＩＶ．Ｂ．１．節とＩＶ．Ｄ．
１．節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精製し
た。精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を，ＩＶ．Ｅ．節に
記載したのと同様にして得た。
【０３４１】０．１２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．３），０．０７５Ｍ ＮａＣｌ（ＢＢＳ）中，種
々の量の精製Ｃ１００−３抗原を含有する１００μｌの
アリコットを，マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ２Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ Ｓｔ
ｒｉｐｓ）の各ウェルに添加した。このプレートを加湿
チャンバー内で，一夜４℃にてインキュペートした。次
いでタンパク溶液を除き，ウェルを０．０２％のＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００含有のＢＢＳ（ＢＢＳＴ）で３回洗
浄した。非特異的結合を防止するために，５ｍｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含有するＢＢＳ溶液を１００μｌ添加するこ
とによって，ウェルをＢＳＡでコートし，次いで室温で
１時間インキュベートした後，過剰のＢＳＡ溶液を除去
した。ウェル当り１μｇの抗体を添加することによっ
て，コートされたウェル内のポリペプチドを，精製抗Ｎ
ＡＮＢ５−１−１抗体と反応させ，次いでその試料を３
７℃で１時間インキュベートした。インキュベートした
後，過剰の溶液を吸引によって除去し，ウェルをＢＢＳ
Ｔで５回洗浄した。１２Ｉで標識したＦ’（ａｂ）２ヒ
ツジ抗ヒトＩｇＧを，コートされたウェルに結合させる
ことによって，融合ポリペプチドに結合した抗ＮＡＮＢ
５−１−１を測定した。標識したプローブ（比放射能：
５〜２０μＣｉ／ｍｇ）の１００μｌずつを各ウェルに
添加し，そのプローブを３７℃で１時間インキュベート
し，過剰のプローブを吸引で除去し，ＢＢＳＴで５回洗
浄した。各ウェルに結合した放射能の量は，γ線を検出
するカウンターで計数することによって測定した。
【０３４２】Ｃ１００の精製抗ＮＡＮＢ５−１−１との
免疫学的反応性を，ＮＡＮＢ５−１−１の精製抗体との
免疫学的反応性と比較した結果を表５に示す。
【０３４３】
【表５】
【０３４４】表５の結果は，抗ＮＡＮＢ５−１−１が，
Ｃ１００−３ポリペプチドのＣ１００の部分内のエピト
ープを認識するということを示している。したがってＮ
ＡＮＢ５−１−１とＣ１００は共通のエピトープをもっ
ている。これらの結果は，このＮＡＮＢＶエピトープを
コードするｃＤＮＡ配列が，クローン５−１−１とクロ
ーン８１の両者に存在する配列であるということを示唆
している。
【０３４５】ＩＶ．Ｈ．ＨＣＶの特性決定 ＩＶ．Ｈ．１．ＨＣＶゲノムのストランドの状態（ｓｔ
ｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）の特性決定 抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体でコートしたポリスチレンビ
ーズに捕獲された粒子から核酸の画分を単離し，次に単
離した核酸が，ＨＣＶ ｃＤＮＡの正鎖および／または
負鎖とハイブリダイゼーションするか否かを測定するこ
とによって，ＨＣＶゲノムをそのストランドの状態につ
いて特性決定した。
【０３４６】ＩＶ．Ｆ．１．節に記載したようにして，
免疫学的に精製した抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体でコート
したポリスチレンビーズを用いて，ＨＣＶに感染したチ
ンパンジーの血漿から，粒子を捕獲した。粒子の核酸成
分を，ＩＶ．Ｆ．２．節に記載した方法を用いて遊離さ
せた。３ｍｌの高力価血漿と当量の単離されたゲノム核
酸のアリコットを，ニトロセルロースフィルターに吸い
取らせた。対照として，クローン８１由来の変性ＨＣＶ
ｃＤＮＡ（２ｐｇ）のアリコットを同じフィルターに
吸い取らせた。そのフィルターを，ＨＣＶ ｃＤＮＡか
らクローン化された一本鎖ＤＮＡの，正鎖または負鎖の
３２Ｐで標識した混合物でプローブした。なお該ｃＤＮ
Ａは，クローン４０ｂ，８１および２５ｃから切り出さ
れたものである。
【０３４７】ＥｃｏＲＩでクローン８１，４０ｂおよび
２５ｃからＨＣＶ ｃＤＮＡを切り出し，そのｃＤＮＡ
断片をＮ１３ベクターのｍｐ１８とｍｐ１９内でクロー
ン化することによって，一本鎖のプローブを得た〔メシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）１９８３年〕。そのＭ１３クロ
ーンの塩基配列を決定し，そのクローンがＨＣＶ ｃＤ
ＮＡ由来のＤＮＡの正鎖もしくは負鎖をもっているかど
うかを決定した。塩基配列の決定は，サンガーら（Ｓａ
ｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ）（１９７７年）のジデオキシチ
ェーンターミネーション法で行った。
【０３４８】捕獲された粒子から単離されたＨＣＶゲノ
ムの一部を含有する二重のフィルターの各セットを，Ｈ
ＣＶ ｃＤＮＡ由来の正鎖または負鎖のプローブとハイ
ブリダイゼーションさせた。第５８〜６０図は，ＮＡＮ
ＢＶゲノムを，クローン８１，４０ｂおよび２５ｃ由来
のプローブの混合物でプローブして得たオートラジオグ
ラフを示す。この混合物は，ハイブリダイゼーション検
定法の感度を増大させるために用いた。パネルＩの試料
を，正鎖プローブの混合物とハイブリダイゼーションさ
せた。パネルＩＩの試料を，負鎖のプローブ混合物でハ
イブリダイゼーションさせることによってプローブし
た。免疫ブロット法に付したパネルの試料を表６に示
す。
【０３４９】
【表６】
【０３５０】第５８〜６０図の結果から分かるように，
負鎖のＤＮＡプローブだけが，単離されたＨＣＶゲノム
とハイブリダイゼーションする。この結果は，ゲノムが
ＲＮａｓｅには感受性であるがＤＮａｓｅには感受性で
ないという結果（ＩＶ．Ｃ．２．節参照）と併せて，Ｎ
ＡＮＢＶのゲノムが正鎖のＲＮＡであることを示唆して
いる。
【０３５１】これらのデータと，推定上のＮＡＮＢＶの
物理化学的性質に関する他の実験室のデータは，ＨＣＶ
がフラビウイルス科に属する可能性があることを示して
いる。しかし，ＨＣＶが，新種のウイルス因子に相当す
る可能性も無視できなかった。
【０３５２】ＩＶ．Ｈ．２．ＰＣＲで増幅された場合，
クローン８１由来のＨＣＶ ｃＤＮＡとハイブリダイゼ
ーションする捕獲粒子の塩基配列の検出法 捕獲粒子のＲＮＡを，ＩＶ．Ｈ．１．節に記載したのと
同様にして得た。クローン８１由来のＨＣＶ ｃＤＮＡ
とハイブリダイゼーションする塩基配列の分析を，第Ｉ
Ｖ．Ｃ．３節に記載したのと同様にしてＰＣＲ増幅法を
利用して行ったが，ハイブリダイゼーションプローブは
クローン８１ ｃＤＮＡ塩基配列由来のキナーゼで活性
化されたオリゴヌクレオチドを用いた。試験結果は，増
幅された塩基配列がクローン８１由来のＨＣＶ ｃＤＮ
Ａプローブとハイブリダイゼーションすることを示し
た。
【０３５３】ＩＶ．Ｈ．３ デング熱フラビウイルス
（ＭＮＷＷＶＤｌ）の非構造タンパクと，３９Ｃに結合
されたクローン１４ｉのＯＲＦによってコードされるＨ
ＣＶポリペプチドとの間の相同性 ３９Ｃによって結合されたクローン１４ｉのＨＣＶ ｃ
ＤＮＡは，第２９〜３４図に示すように一つの連続ＯＲ
Ｆを含有している。これにコードされたポリペプチド
を，デング熱フラビウイルス（ＭＮＷＶＤｌ）の非構造
ポリペプチドの領域との配列相同性について分析した。
この分析は，デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）のタンパク
データベースを用い，コンピュータで行った。結果を第
６１図に示すが，図中，記号（：）は厳密な相同性を示
し，記号（．）は塩基配列が若干置換されていることを
示し，ダッシュ記号は，最大の相同性を得るため塩基配
列中に挿入されたスペースを示す。この図から分かるよ
うに，ＨＣＶ ｃＤＮＡにコードされた塩基配列と，デ
ング熱フラビウイルス非構造タンパクとの間には有意な
相同性がある。第６１図に示す相同性に加えて，ｃＤＮ
Ａの３’末端の領域にコードされたポリペプチドセグメ
ントには，分析した結果，デング熱ポリメラーゼの塩基
配列と相同性の塩基配列が含まれていた。ＲＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼに対して必須であると考えられる標
準的なＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（ＧＤＤ）配列が，ＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドに含まれ，そ
の位置がデング熱２ウイルス内の位置と一致していると
いうことは重要なことである（データは記載していな
い）。
【０３５４】ＩＶ．Ｈ．４．ＨＣＶ−ＤＮＡは，ＮＡＮ
ＢＨに感染した組織内には検出できない ２種の研究結果は，ＨＣＶ−ＤＮＡが，ＮＡＮＢＨに感
染した個体由来の組織内には検出できないことを示唆し
ている。これらの結果は，ＩＶ．Ｃ．とＩＶ．Ｈ．１．
とＩＶ．Ｈ．２．の各節に記載した結果と併せて，ＨＣ
ＶがＤＮＡを含有するウイルスではなく，その複製には
ｃＤＮＡを含まないという証拠を提供している。
【０３５５】ＩＶ．Ｈ．４．ａ．サザンブロット法 ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの肝臓が，検出可能
なＨＣＶ−ＤＮＡ（もしくはＨＣＶ−ｃＤＮＡ）を含有
しているか否かを決定するために，この起源から単離し
たＤＮＡの制限酵素による断片をサザンブロット法に付
して，ブロット物を３２Ｐで標識したＨＣＶ ｃＤＮＡ
でプローブした。上記の標識したＨＣＶｃＤＮＡは，感
染チンパンジーの肝臓由来のブロットされたＤＮＡとハ
イブリダイゼーションをしないという結果を示した。ま
た同じ標識ＨＣＶ ｃＤＮＡは，正常なチンパンジーの
肝臓由来の対照のブロットされたＤＮＡともハイブリダ
イゼーションをしなかった。これに対して，陽性対照に
おいては，β−インターフェロン遺伝子の標識したプロ
ーブが，制御酵素で切断したヒト胎盤ＤＮＡのサザンブ
ロット法に付したものと強くハイブリダイゼーションし
た。これらの系は，標識したプローブで検出すべき遺伝
子の単一コピーを検出するために設計された。
【０３５６】ＮＡＮＢＨに感染した２頭のチンパンジー
の肝臓からＤＮＡを単離した。対照のＤＮＡを，未感染
のチンパンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。ＤＮＡの
抽出は，基本的にはマニアティスら（１９８２年）の方
法によって行い，そのＤＮＡ試料は，単離工程中，ＲＮ
Ａｓｅで処理した。
【０３５７】各ＤＮＡ試料は，メーカーの説明書に従っ
て，ＥｃｏＲＩ，ＮｂｏＩまたはＨｉｎｃＩＩ（１２μ
ｇ）で処理した。切断したＤＮＡを１％中性寒天ゲルで
電気泳動し，ニトロセルロース上にサザンブロットし，
次いでブロットされた物質は，適当なニックトランスレ
ーションされたプローブｃＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンした（３×１０ｃｐｍ／ｍｌのハイブリダイゼーシ
ョンミックス）。感染チンパンジーの肝臓と正常な肝臓
由来のＤＮＡは，クローン３６と８１由来の３２Ｐで標
識したＨＣＶ ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションし，
またヒト胎盤由来のＤＮＡはβ−インターフェロン遺伝
子由来の３２Ｐで標識したＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンした。ハイブリダイゼーション後，ブロットしたも
のを，厳密条件下，すなわち，０．１×ＳＳＣと０．１
％ＳＤＳを含む溶液を用い６５℃で洗浄した。
【０３５８】β−インターフェロン遺伝子ＤＮＡを，ホ
ートンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔａｌ）（１９８１
年）が記述しているのと同様にして調製した。
【０３５９】ＩＶ．Ｈ．４．ｂ．ＰＣＲ法による増幅 ＨＣＶ−ＤＮＡが，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー
の肝臓内に検出できるか否かを決定するために，ＤＮＡ
をその組織から単離し，プライマーとクローン８１のＨ
ＣＶ ｃＤＮＡ由来のプローブポリヌクレオチドを用い
て，ＰＣＲ増幅検出法に付した。陰性対照は，未感染Ｈ
ｅｐＧ２組織の培養細胞と，未感染と思われるヒト胎盤
とから単離したＤＮＡ試料を用いた。陽性対照は，陰性
対照にクローン８１由来のＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入物の比
較的少ない既知量（２５０分子）を添加した試料を用い
た。
【０３６０】さらに，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジ
ーの同じ肝臓から単離したＲＮＡ画分が，ＨＣＶ−ｃＤ
ＮＡプローブに対して相補的な配列をもっていることを
確認するために，ＰＣＲ増幅検出法を，単離したＲＮＡ
試料にも用いた。
【０３６１】この研究では，ＤＮＡはＩＶ．Ｈ．４．ａ
節に記載の方法で単離し，ＲＮＡは，チャーギンら（Ｃ
ｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ）（１９８１年）が記述し
ているのと同様にして抽出した。
【０３６２】ＤＮＡの試料を，２頭の感染チンパンジー
の肝臓，未感染のＨｅｐＧ２細胞およびヒト胎盤から単
離した。各ＤＮＡの１μｇをメーカーの説明書にしたが
ってＨｉｎｄＩＩＩで切断した。逆転写酵素工程を省略
したことを除いて，ＩＶ．Ｃ．３節に記載と基本的に同
様にして，上記の切断試料を，ＰＣＲ増幅法に付し，増
幅したＨＣＶ ｃＤＮＡを検出した。ＰＣＲプライマー
とプローブは，ＨＣＶｃＤＮＡクローン８１由来のもの
であり，ＩＶ．Ｃ．３．節に記載されている。増幅する
前に，陽性対照については，各ＤＮＡ の試料１μｇ
は，クローン８１から単離したＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入物
の２５０分子を添加することによって「スパイク」され
た。
【０３６３】ＨＣＶ配列が，ＮＡＮＢＨに感染したチン
パンジーの肝臓から単離したＲＮＡに存在しているか否
かを決定するために，０．４μｇの全ＲＮＡを含有する
試料を，陰性対照試料のいくつかから逆転写酵素の工程
を省略すること以外は，ＩＶ．Ｃ．３．節に記載したの
と同様の増幅法に付した。ＰＣＲプライマーとプローブ
は，上記の記載と同様に，ＨＣＶ ｃＤＮＡクローン８
１由来のものであった。
【０３６４】その結果，ＨＣＶ ｃＤＮＡプローブに相
補的な増幅された配列は，感染チンパンジーの肝臓由来
のＤＮＡ中には検出できず，また陰性対照にも検出でき
なかった。これとは異なり，感染チンパンジーの肝臓由
来のＤＮＡを含む試料が増幅される前にＨＣＶ ｃＤＮ
Ａでスパイクされた場合，クローン８１の配列がすべて
の陽性対照の試料に検出された。さらに，ＲＮＡの研究
では，増幅されたＨＣＶ ｃＤＮＡクローン８１の配列
が，逆転写酵素を用いた時にのみ検出されたが，これ
は，この結果がＤＮＡ汚染が原因でないことを強く示唆
している。
【０３６５】これらの結果は，ＮＡＮＢＨに感染したチ
ンパンジー由来の肝細胞が，ＨＣＶＤＮＡを全く含有し
ないか，または検出不可能な濃度で含有していることを
示している。スパイク法の研究によれば，ＨＣＶ ＤＮ
Ａが存在する場合，それは０．０６コピー／肝細胞より
はるかに低い濃度である。これに対し，同じ肝臓試料由
来の全ＲＮＡのＨＣＶ配列は，ＰＣＲ法によって容易に
検出された。
【０３６６】ＩＶ．Ｉ．試験抗原としてＨＣＶ ｃ１０
０−３を用いる，ＨＣＶ感染のＥＬＩＳＡ法による決定 全試料を，ＨＣＶ ｃ１００−３ ＥＬＩＳＡ法を用い
て検定した。この検定法は，ＨＣＶ ｃ１００−３抗原
（ＩＶ．Ｂ．５節に記載したのと同様にして合成し精製
した）と，マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧのホース
ラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体とを利
用する。
【０３６７】ＨＣＶ ｃ１００−３抗原でコートしたプ
レートを次のようにして調製した。コーティング緩衝液
（５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０）の２１ｍ
ｌ／プレート，ＢＳＡ（２５μｇ／ｍｌ）およびｃ１０
０−３（２．５０μｇ／ｍｌ）を含有する溶液を，Ｒｅ
ｍｏｖｅａｗｅｌｌ Ｉｍｍｕｌｏｎ Ｉプレート（Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）に添加する直前に調製し
た。５分間混合後，上記溶液０．２ｍｌ／ウェルをプレ
ートに添加した。プレートをカバーし２時間３７℃でイ
ンキュベートし，次いで溶液を吸引して除去した。ウェ
ルを４００μｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．４），１４０ｍＭ塩化ナトリウム，０．
１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン，１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｉｍｅｒｏｓ
ａｌ〕で１回洗浄した。洗浄液を除いた後，後コート溶
液２００μｌ／ウェル（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．２），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．１％（Ｗ
／Ｖ）カゼインおよび２ｍＭフッ化フニルメチルスルホ
ニル（ＰＭＳＦ）〕を添加し，プレートをゆるくカバー
して蒸発を防止し，室温で３０分間放置した。次にウェ
ルから吸引して溶液を除き，保存加熱せずに一夜凍結乾
燥した。得られたプレートを，密封したアルミニウムパ
ウチ内に２〜８℃で貯蔵する。
【０３６８】ＥＬＩＳＡ法で決定するために，２０μｌ
の血清試料または対照試料を，２００μｌの試料希釈剤
〔１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），５００
ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭＥＤＴＡ，０．１％（Ｗ／
Ｖ）カゼイン，０．０１５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｅｒｏｓａ
ｌ），１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１０
０μｇ／ｍｌ酵母エキス〕の入ったウェルに添加した。
プレートを密封し，３７℃で２時間インキュベートし，
その後溶液を吸引して除き，４００μｌの洗浄緩衝液
〔０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）〕でウェルを洗浄した。洗浄したウェル
を，２００μｌのマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を
含有する，オルト複合体希釈剤〔１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．２），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，５０
％（Ｖ／Ｖ）胎仔ウシ血清，１％（Ｖ／Ｖ）熱処理ウマ
血清，１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６０．０５％（Ｗ／Ｖ）
Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｉｍｅｒｏ
ｓａｌ〕の溶液で処理した。３７℃で１時間処理を行
い，溶液を吸引によって除去し，ウェルを洗浄緩衝液で
洗い，緩衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合体の
量を測定するために，２００μｌの基質溶液（１０ｍｇ
の０−フェニレンジアミン二塩酸塩／５ｍｌの展開剤溶
液）を添加した。展開剤溶液は，リン酸によってｐＨ
５．１に調節された５０ｍＭのクエン酸ナトリウムと，
０．６μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有している。基
質溶液が入ったプレートを，暗所内で，３０分間室温で
インキュベートし，反応は５０μｌ／ｍｌの４Ｎ硫酸を
添加して停止させ，ＯＤを測定した。
【０３６９】下記の実施例は，ＨＣＶ Ｃ１００−３抗
原を利用するマイクロタイタープレートのスクリーニン
グＥＬＩＳＡ法が高い特異性を有することを示す。この
ことは，初期反応率が約１％で，反復反応率が任意のド
ナーについて約０．５％であることによって証明されて
いる。この検定法は，感染の急性期後および疾患の慢性
期の両方における免疫応答を検出することができる。さ
らに，この検定法は，ＮＡＮＢＨに対する代理試験につ
いてマイナスの評価をされているいくつかの試料を検出
することができる。なおこれらの試料は，ＮＡＮＢＨの
病歴を持つ個体またはＮＡＮＢＨ伝染に関係があるドナ
ー由来のものである。
【０３７０】以下の実施例では，次の略号が用いられ
る。
【０３７１】 ＡＬＴ アラニンアミノ転移酵素 抗−ＨＢｃ ＨＢｃに対する抗体 抗−ＨＢｓＡｇ ＨＢｓＡｇに対する抗体 ＨＢｃ Ｂ型肝炎コア抗原 ＡＢｓＡｇ Ｂ型肝炎表面抗原 ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ ＩＵ／Ｌ 国際単位／１ ＮＡ 入手不能 ＮＴ 試験せず Ｎ 試料の大きさ Ｎｅｇ 陰性 ＯＤ 光学密度 Ｐｏｓ 陽性 Ｓ／ＣＯ シグナル／カットオフ ＳＤ 標準偏差 ｘ 平均値 ＷＮＬ 標準限界内。
【０３７２】ＩＶ．Ｉ．１．任意のドナー集団における
ＨＣＶの感染 任意のドナーから得た１，０５６試料（新鮮な血清）
を，Ｉｒｗｉｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａ
ｎｄ（米国，カリフォルニア州，サンフランシスコ）か
ら得た。これらの試料によって得た試験結果を，ＯＤ値
の分布を示すヒストグラムにまとめる。（第６２図）。
第６２図から分かるように，４試料が３より大きい値を
示し，１試料が１と３の間，５試料が０．４と１の間，
および残りの１，０４６試料が０．４より小さい値を示
し，これらの試料の９０％以上が０．１より小さい。
【０３７３】反応性であった任意試料についての試験結
果を表７に示す。平均値＋５標準偏差に等しいカットオ
フ値を用いた場合，１，０５６試料中の１０試料（０．
９５％）が最初反応性であった。これらの試料中５試料
（０．４７％）は，前記のＥＬＩＳＡ法を用いて２回目
の検定を行ったところ繰り返し反応性を示した。また表
７は，繰り返し反応性を示した各試料に対してＡＬＴお
よび抗ＨＢｄ状態を示している。特に興味深いのは，繰
り返し反応性であった５試料全部が，ＮＡＮＢＨに対す
る両代理試験で陰性であり，一方ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ法
法では陽性であったということである。
【０３７４】
【表７】
【０３７５】ＩＶ．Ｉ．２．チンパンジー血清試料 １１匹のチンパンジーから得た血清試料を，ＨＣＶ ｃ
１００−３を用いたＥＬＩＳＡ法により試験した。これ
らのチンパンジーのうち４匹には，疾患管理センター
（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ ＤｉｓｅａｓｅＣ
ｏｎｔｒｏｌ）のＤａｎｉｅｌ Ｂｒａｄｌｅｙ博士と
共同して確立された方法に従って，第ＶＩＩＩ因子の汚
染バッチに由来するＮＡＮＢＨ（お くは，ハッチンソ
ン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）株であると推測される）を
感染させた。対照として，他の４匹のチンパンジーには
ＨＡＶを，そして３匹にはＨＢＶを感染させた。血清試
料は，感染後の様々な時期に採取した。
【０３７６】これらの結果は，表８および表９に要約さ
れているが，ハッチンソン株のＮＡＮＢＨに感染させた
すべてのチンパンジーにおいて実証された抗体の血清転
換を示している。感染の急性期（ＡＬＴレベルが有意に
上昇し，続いて正常レベルに戻ることから示される）の
後は，ＨＣＶ ｃ１００−３に対する抗体がＮＡＮＢＨ
に感染させた４匹のチンパンジーのうち４匹の血清中で
検出し得るようになった。これら試料は，すでにＩＶ．
Ｂ．３節で考察したように，ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ）分析および放射性免疫検定法（ＲＩＡ）により陽性
であることが示されている。これとは対照的に，ＨＡＶ
またはＨＢＶに感染させた対照のチンパンジーはＥＬＩ
ＳＡ法における反応性を示した。
【０３７７】
【表８】
【０３７８】
【表９】
【０３７９】ＩＶ．Ｉ．３．パネル１：慢性ヒトＮＡＮ
ＢＨキャリアから得られた保証感染性血清 コードされたパネルは，２２個の独自の試料から構成さ
れていた。ただし，これらの試料は，各々につき二重検
定を行うので，合計で４４個であった。これらの試料
は，慢性ＮＡＮＢＨキャリアから得た保証感染性血清，
関係供血者から得た感染性血清，および急性ＮＡＮＢＨ
患者から得た感染性血清からのものであった。さらに，
非常に由来が明確な陰性対照群，および他の疾患対照群
からも試料を得た。このパネルは，国立衛生研究所（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＨｅ
ａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ部の
Ｈ，Ａｌｔｅｒ博士から提供された。このパネルは，数
年前にＡｌｔｅｒ博士により構築され，推定ＮＡＮＢＨ
検定の適合パネルとして，Ａｌｔｅｒ博士により使用さ
れてきた。
【０３８０】上記の全パネルをＥＬＩＳＡ法で２度分析
し，その結果を評価するためにＡｌｔｅｒ博士に送付し
た。評価の結果を表１０に示す。この表には，二重検定
の一方の組の結果が示されているが，二重検定試料の各
々について同じ値が得られた。
【０３８１】表１０に示すように，チンパンジーモデル
において感染性であると証明された６個の血清は非常に
陽性であった。７番目の感染性血清は，急性ＮＡＮＢＨ
の場合の試料に対応しており，このＥＬＩＳＡにおいて
反応性ではなかった。正常ＡＬＴレベルを有し，かつチ
ンパンジーでの研究結果が不明確であった関係供血者か
ら得た試料は，上記の分析において反応性ではなかっ
た。急性ＮＡＮＢＨの１個体から得た３個の他の一連の
試料も反応性ではなかった。非常に由来が明確な陰性対
照群からの全ての試料は，少なくとも１０回の献血で肝
炎の疑いがなかった供血者から得たものであるが，上記
のＥＬＩＳＡにおいて反応性ではなかった。最後に，検
査試料のうち４個は，他人により開発された推定ＮＡＮ
ＢＨ検定において陽性であると以前は評価されていた
が，これらの分析では確定できなかった。これらの４個
の試料は上記のＨＣＶ ＥＬＩＳＡ法では陰性と判定さ
れた。
【０３８２】
【表１０】
【０３８３】ＩＶ．Ｉ．４．パネル２：供血者／受血者
のＮＡＮＢＨ 前記のコードされたパネルは，輸血に関連するＮＡＮＢ
Ｈについて供血者および受血者が明確な１０事例からな
り，試料の合計は１８８であった。各事例は，受血者に
対する数人またはすべての供血者の試料，およびこの受
血者から得た（輸血後，３カ月，６カ月，および１２カ
月目に採血した）一連の試料からなるものであった。ま
た，輸血前に予め受血者から採血された血液試料も含ま
れていた。コードされたパネルは，ＮＩＨのＨ．Ａｌｔ
ｅｒ博士により提供されたものであり，結果は評価を行
うために同博士へ送付した。
【０３８４】これらの結果は，表１１に要約したが，Ｅ
ＬＩＳＡ法により，輸血に関連するＮＡＮＢＨの１０事
例のうち９事例において，抗体血清転換が検出されたこ
とを示している。事例４の試料（血清転換か全く検出さ
れなかった）は，前記ＥＬＩＳＡ法において，一貫して
反応性に乏しかった。１０個の受血者試料のうち２個
は，輸血後３カ月で反応性があった。１２ヵ月では，事
例４を除いて，すべての試料が反応性であった。さら
に，少なくとも１人の抗体陽性供血者が１０事例のうち
７事例に見い出され，事例１０には２人の陽性供血者が
存在した。また，事例１０では，輸血前に採血した受血
者の血液はＨＣＶ抗体について陽性であった。この受血
者から得た１ヵ月目の採血試料は反応性レベルの境界線
まで低下したが，４ヵ月および１０ヵ月目の採血試料で
は陽性レベルにまで上昇した。一般に，Ｓ／ＣＯが０．
４であれば，陽性であると考えられる。従って，この事
例では，個体が事前にＨＣＶ感染していたことを示して
いる。
【０３８５】反応性である（すなわち，陽性である）す
べての試料に対するＡＬＴおよびＨＢｃの状態を表１２
に要約する。この表から明らかなように，供血者試料の
１／８は，代理マーカーに対しては陰性であったが，Ｈ
ＣＶ抗体ＥＬＩＳＡ法では反応性であった。他方，受血
者試料（輸血後１２ヵ月まで引き続き採血された）は，
高いＡＬＴを有するか，または抗ＨＢｃが陽性である
か，あるいはその両方であった。
【０３８６】
【表１１】
【０３８７】
【表１２】
【０３８８】ＩＶ．Ｉ．５．高危険率グループの試料に
おけるＨＣＶ感染の決定 高危険率グループから得られた試料は，ＨＣＶ ｃ１０
０−３抗原に対する反応性を決定するＥＬＩＳＡ法を用
いてモニターされた。これらの試料は，Ｇａｒｙ Ｔｅ
ｇｔｍｅｉｅｒ博士（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｂｌｏｏｄ
Ｂａｎｋ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ）から得られた。
結果を表１３に要約する。
【０３８９】この表に示されているように，反応性の最
も高い試料は，血友病者から得られる（７６％）。さら
に，ＡＬＴが上昇し，抗ＨＢｃについて陽性の個体から
得られた試料は，５１％が反応性であると評価された
が，この値は，臨床データから予想される値と一致して
おり，このグループ内にはＮＡＮＢＨが流行していた。
ＨＣＶに対する抗体の発生率は，ＡＬＴが高いだけの供
血者，Ｂ型肝炎コアに対する抗体について陽性であるだ
けの供血者，そして任意の志願供血者に比べてＡＬＴが
高いか，あるいは抗コア抗体を有するということ以外の
理由で拒否された供血者においても高かった。
【０３９０】
【表１３】
【０３９１】ＩＶ．Ｉ．６．ＨＣＶ ｃ１００−３ Ｅ
ＬＩＳＡ法における第２抗体として抗ＩｇＧまたは抗Ｉ
ｇＭモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を
用いた比較研究 抗ＩｇＧモノクローナル複合体を用いたＥＬＩＳＡ法の
測定感度は，抗ＩｇＭモノクローナル複合体を用いる
か，あるいはこれら両者をＨ鎖およびＬ鎖の両方に特異
的であると報告されたポリクローナル抗血清で置き換え
ることにより得られる測定感度と比較された。以下の研
究が行われた。
【０３９２】ＩＶ．Ｉ．６．ａ．血清転換者から得られ
た一連の試料 ＮＡＮＢ血清転換者の３つの事例から得られた一連の試
料を，ＨＣＶ ｃ１００−３ ＥＬＩＳＡ法で研究し
た。このＥＬＩＳＡ法では，酵素複合体に抗ＩｇＧモノ
クローナル抗体だけを用いるか，または抗ＩｇＭモノク
ローナル抗体と組合わせて用いるか，あるいはポリクロ
ーナル抗血清を用いた。これらの試料は，Ｃｌａｄｄ
Ｓｔｅｖｅｎｓ博士（Ｎ．Ｙ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅ
ｒ，Ｎ．Ｙ．Ｃ．，Ｎ．Ｙ．）により提供された。試料
の歴史を表１４に示す。
【０３９３】抗ＩｇＧモノクローナル抗体−酵素複合体
を用いて得られた結果を表１５に示す。これらのデータ
は，事例１，２，および３の各試料１−４，２−８，お
よび３−５において，最初に強い反応性が検出されるこ
とを示している。
【０３９４】抗ＩｇＧモノクローナル複合体および抗Ｉ
ｇＭ複合体の組合わせを用いて得られた結果を表１６に
示す。抗ＩｇＭに対する抗ＩｇＧの３つの異なる割合で
試験した；抗ＩｇＧの希釈率１：１０，０００は終始一
定であった。抗ＩｇＭモノクローナル複合体の試験され
た希釈率は，１：３０，０００，１：６０，０００，お
よび１：１２０，０００であった。これらのデータは，
抗ＩｇＧだけを用いた研究と同様に，試料１−４，２−
８，および３−５において，最初の強い反応性が検出さ
れることを示している。
【０３９５】抗ＩｇＧモノクローナル複合体（希釈率
１：１０，０００），またはＴａｇｏポリクローナル複
合体（希釈率１：８０，０００），あるいはＪａｃｋｓ
ｏｎポリクローナル複合体（希釈率１：８０，０００）
を用いたＥＬＩＳＡ法で得られた結果を表１７に示す。
これらのデータは，３種類の形態をすべて用いると，試
料１−４，２−８，および３−５において，最初の強い
反応性が検出されることを示している：Ｔａｇｏのポリ
クローナル抗体は最も低いシグナルを与えた。
【０３９６】上に与えた結果は，（ＡＬＴ上昇により明
らかとなる）疾患の急性期後の同時期に，３種類の形態
により，反応性の試料が検出されることを示している。
また，これらの結果は，抗ＩｇＧモノクローナルー酵素
複合体を用いたＨＣＶ ｃ１００．３ ＥＬＩＳＡ法の
感度が，該酵素複合体について試験された他の形態と同
等またはそれ以上であることを示している。
【０３９７】
【表１４】
【０３９８】
【表１５】
【０３９９】
【表１６】
【０４００】
【表１７】
【０４０１】ＩＶ．Ｉ．６．ｂ．任意抽出の供血者から
得られた試料 任意抽出の供血者から得られた試料（ＩＶ．Ｉ．１．節
参照）を，ＨＣＶ感染について，ＨＣＶ ｃ１００−３
ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。このとき，
抗体−酵素複合体は，抗ＩｇＧモノクローム複合体また
はポリクローナル複合体のいずれかであった。スクリー
ニングされた試料の総数は，ポリクローナル複合体およ
びモノクローナル複合体に対して，それぞれ１０７７個
および１０５６個であった。スクリーニング結果の要約
を表１８に示す。また，試料の分布を第６３図のヒスト
グラムに示す。
【０４０２】平均値および標準偏差の計算は，シグナル
が１．５を超えるような試料を除いて行った。すなわ
ち，ポリクローナル複合体を利用した場合の計算には１
０７３個のＯＤ値を用い，抗ＩｇＧモノクローナル複合
体を利用した場合の計算には１０５１個のＯＤ値を用い
た。表１５から明らかなように，ポリクローナル複合体
を用いた場合には，平均値が０．０４９３から０．０９
３１にシフトし，標準偏差は０．０７４から０．０９３
３に増加した。また，これらの結果は，ｘ＋５ＳＤとい
う基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれば，ＥＬ
ＩＳＡ法におけるポリクローナル酵素複合体の形態が，
より高いカットオフ値を必要とすることを示している。
このことは，モノクローナル系に比べて分析特異性が低
いことを示している。さらに，第６３図のヒストグラム
から明らかなように，抗ＩｇＧモノクローナル複合体を
用いたＥＬＩＳＡ法で任意抽出の供血者をスクリーニン
グした場合には，市販のポリクローナル標識を用いた分
析に比べて，陰性および陽性の結果の分布間が大きく分
離する。
【０４０３】
【表１８】
【０４０４】ＩＶ．Ｊ．様々な地域のＮＡＮＢＨ患者に
おけるＨＣＶ血清転換の検出 高いＡＬＴ値に基づくとＮＡＮＢＨ保持の疑いがある
が，ＨＡＶおよびＨＢＶ試験においては陰性である患者
から得られた血清を，ＨＣＶ ｃ１００−３抗原をマイ
クロタイタープレートのスクリーニング抗原として用い
たこと以外は実質的にＩＶ．Ｄ．節で述べたように，Ｒ
ＩＡ法を用いてスクリーニングした。表１９に示された
結果から明らかなように，ＲＩＡにより，陽性試料が高
い割合で検出された。
【０４０５】
【表１９】
【０４０６】ＩＶ．Ｋ．「集団獲得型］ＮＡＮＢＨの患
者におけるＨＣＶ血清転換の検出 明白でない（すなわち，輸血，静脈注射による薬剤使
用，乱婚などが危険因子として同定されない）１００人
のＮＡＮＢＨ患者から得た血清は，Ｍ．Ａｌｔｅｒ博士
（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ）およびＪ．Ｄｉｅｕｓｔａｇ博士（Ｈａ
ｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された。
これらの試料を，ＨＣＶ ｃ１００−３抗原をマイクロ
タイタープレートに付着させるスクリーニング用抗原と
して用いたこと以外は実質的にＩＶ．Ｄ．節で述べたよ
うに，ＲＩＡ法を用いてスクリーニングした。得られた
結果は，１００個の血清試料のうち５５個の試料が，Ｈ
ＣＶ ｃ１００−３抗原と免疫学的に反応する抗体を有
することを示した。
【０４０７】上述の結果は，「集団獲得型」ＮＡＮＢＨ
もまた，ＨＣＶにより引き起こされることを示唆してい
る。また，ＨＣＶがフラビウィルス属（その大部分は節
足動物により伝染する）と関係のあることがここで示さ
れているので，「集団獲得型」の場合におけるＨＣＶの
伝染もまた，節足動物による伝染に起因することが示唆
される。 ＩＶ．Ｌ．ＮＡＮＢＨの伝染に関係のある供血者のＨＣ
Ｖ抗体および代用マーカーの発生率の比較 ＮＡＮＢＨ陽性の疑いのある供血者から輸血され，ＮＡ
ＮＢＨとなった受血者が，抗ＨＣＶ抗体陽性に血清転換
するかどうかを決定し得る見込みがある研究を実施し
た。ＮＡＮＢＨ感染のマーカーとして現在使われている
代用マーカー（すなわち，高いＡＬＴ値および抗コア抗
体の存在）の異常について供血者を試験した。さらに，
抗ＨＣＶ抗体の存在についても供血者を試験した。抗Ｈ
ＣＶ抗体の存在は，ＩＶ．Ｋ．節で述べた放射性免疫検
定法を用いて決定した。この研究の結果を表２０に示
す。この表には以下の項目が示されている：患者の番号
（第１列）；患者の血清中における抗ＨＣＶ抗体の存在
（第２列）；患者の輸血回数，各輸血は異なる供血者に
よるものである（第３列）；供血者の血清中における抗
ＨＣＶ抗体の存在（第４列）；そして，供血者の代用マ
ーカーの異常（第５列）（ＮＴ，すなわち…試験してい
ないことを意味する）（ＡＬＴは高いトランスアミナー
ゼであり，抗ＨＢｃは抗コア抗体である）。
【０４０８】表２０の結果は，ＨＣＶ抗体試験が，感染
供血者を検出するのに，代用マーカー試験より正確であ
ることを示している。ＮＡＮＢＨの症状を示す１０人の
患者のうち９人を試験したところ，抗ＨＣＶ抗体血清転
換に関して陽性であった。陽性の疑いのある１１人の供
血者のうち（ＮＡＮＢＨキャリアである疑いのある２人
の別々の個体から輸血されたのは患者６であるが），９
人は抗ＨＣＶ抗体に関して陽性であり，１人は陽性の境
界線上であり，（患者１に対する供血者は）不明確であ
った。これに対し，高ＡＬＴ試験を用いると，１０人の
供血者のうち６人が陰性であり，抗コア抗体試験を用い
ると，１０人の供血者のうち５人が陰性であった。しか
しながら，非常に重要なことは，３つの場合（患者８，
患者９，および患者１０に対する供血者の場合）におい
て，ＡＬＴ試験および抗ＨＢｃ試験の結果が一致しなか
ったことである。
【０４０９】
【表２０】
【０４１０】ＩＶ．Ｍ．フラビウイルスのゲノム配列の
保存領域から誘導されたＰＣＲおよびプライマーを利用
したＨＣＶ ｃＤＮＡ配列のクローニングの増幅 ＨＣＶがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスである
ことを示唆している上記の結果は，ＰＣＲ技術と，フラ
ビウイルスの保存アミノ酸配列をコードする領域から誘
導されたプライマーとを利用して，特徴付けられていな
いＨＣＶ ｃＤＮＡ配列をクローニングすることを可能
にする。一般に，プライマーの一方は定義されたＨＣＶ
ゲノム配列から誘導され，配列決定されていないＨＣＶ
ポリヌクレオチド領域に隣接する他方のプライマーはフ
ラビウイルスゲノムの保存領域から誘導される。フラビ
ウイルスゲノムは，フラビウイルスゲノムの５’側領域
にコードされるＮＳ１ポリペプチドおよびＥポリペプチ
ド内に保存配列を有することが知られている。これらの
領域をコードする対応配列は，第２９〜３４図に示すＨ
ＣＶ ｃＤＮＡ配列の上流にある。従って，ＨＣＶゲノ
ムのこの領域から誘導されたｃＤＮＡ配列を単離するに
は，これらのフラビウイルスポリペプチド内の保存配列
から誘導される上流プライマーが設計される。下流プラ
イマーはＨＣＶ ｃＤＮＡの既知部分の上流側端部から
誘導される。
【０４１１】コードが縮重しているので，フラビウイル
スプローブと，対応するＨＣＶゲノム配列との間には不
一致が存在し得る。従って，Ｌｅｅ（１９８８）により
述べられた方法と同様の方法を用いる。Ｌｅｅの方法
は，アミノ酸配列の逆転写産物に相補的な混合オリゴヌ
クレオチドプライマーを利用する；混合プライマーの配
列は保存アミノ酸配列に関するすべてのコドン縮重を考
慮したものである。
【０４１２】３組のプライマー混合物は，デング熱−
２，４（Ｄ−２，４），日本脳炎（ＪＥＶ），黄熱病
（ＹＦ），および西ナイルウイルス（ＷＮ）を包含する
数種のフラビウイルスに見い出されるアミノ酸相同性に
基づいて生じたものである。最も上流の保存配列から誘
導されたプライマー混合物（５’−１）はアミノ酸配列
ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙに基づいており，このアミノ酸
配列は，Ｄ−２Ｐ ＪＥＶ，ＹＥ，およびＷＮのＥタン
パク中に見い出される保存配列ａｓｐ−ａｒｇ−ｇｌｙ
−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｓｐＮの一部である。次のプライ
マー混合物（５’−２）はＥタンパク中にある下流保存
配列ｐｈｅ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ
−ｉｌｅｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ
−ｉｌｅｕに基づいており，ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐか
ら誘導される；保存配列は，Ｄ−２，ＪＥＶ，ＹＥ，お
よびＷＮに存在する。第３のプライマー混合物（５’−
３）はアミノ酸配列ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓに基づいて
おり，このアミノ酸配列は，Ｄ−２，Ｄ−４，ＪＥＶ，
ＹＦ，およびＷＮのＮＳ１タンパク中にある保存配列ｃ
ｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓの一部である。
５’−３中で混合物を形成する各プライマーを第６４図
に示す。保存領域から誘導された様々な配列に加えて，
各混合物中の各プライマーもまた，制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩ，Ｍｂｏ Ｉ，およびＥｃｏＲ Ｉに対す部位をコ
ードする配列を含む５’末端の定常領域を有する。
【０４１３】下流プライマーｓｓｃ５ｈ２０Ａはクロー
ン５ｈのヌクレオチド配列から誘導されており，この配
列はクローン１４ｉおよび１１ｂの配列と重複する配列
を有するＨＣＶ ｃＤＮＡを含む。ｓｓｃ５ｈ２０Ａの
配列は， ５’ＧＴＡ ＡＴＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＡＧ ＡＧＴ ＣＡ ３’ である。他方のプライマーｓｓｃ５ｈ３４Ａもまた，使
用し得る。このプライマーはクローン５ｈの配列から誘
導され，さらに制限酵素部位を形成する５’末端のヌク
レオチドを有する。従って，クローニングが容易にな
る。ｓｓｃ５ｈ３４Ａの配列は， ５’ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＴＣ Ａ ３’ である。
【０４１４】Ｓａｉｋｉら（１９８６）により最初に述
べられたＰＣＲ反応は，ｃＤＮＡの鋳型が，ＩＶ．Ｃ．
２．節で述べたようにＨＣＶ感染したチンパンジーの肝
臓から単離されたＲＮＡであるか，あるいはＩＶ．Ａ節
で述べたようにＨＣＶ感染したチンパンジー血清から単
離されたウイルス粒子から単離されたＲＮＡであること
以外は，実質的にＬｅｅら（１９８８）が述べたように
して行われる。さらに，アニール条件は第１回目の増幅
ではあまり厳密でなくてもよい（０．６ＭＮａＣｌ，お
よび２５℃）。なぜなら，ＨＣＶ配列とアニールするプ
ライマー部分は，わずか９個のヌクレオチドであり，不
一致が存在し得るからである。また，ｓｓｃ５ｈ３４Ａ
を用いた場合には，ＨＣＶゲノムから誘導されなかった
付加配列はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化す
る傾向がある。第１回目の増幅後は，アニール条件は非
常に厳密である（０．０６６ＭＮａＣｌ，および３２℃
〜３７℃）。なぜなら，増幅される配列は，この段階で
は，プライマーに相補的な領域またはプライマーの重複
部分である領域を有するからである。さらに，最初の１
０サイクルの増幅は，クレノー酵素Ｉを用い，この酵素
に適したＰＣＲ条件下で実施される。これらのサイクル
が完了した後，試料を抽出し，Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒにより供給されているキット指示書に従
って，Ｔａｇポリメラーゼで処理する。
【０４１５】増幅後，増幅されたＨＣＶ ｃＤＮＡ配列
は，クローン５ｈから誘導されたプローブを用いたハイ
ブリダイゼーションにより検出される。このプローブ
は，プライマーを誘導するのに用いた配列の上流にある
配列から誘導されるが，プライマーを誘導したクローン
５ｈの配列とは重複しない。このプローブの配列は， ５’ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＧＣ ＧＣＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＣＧＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＧＣ ３’ である。
【０４１６】産業上の応用性 本発明は，ここに開示された様々な表現で，多くの産業
上の用途を有する。これらの用途のいくつかは次のとお
りである。ＨＣＶ ｃＤＮＡは，試料中のＨＣＶ核酸を
検出するためのプローブの設計に用いられる。ｃＤＮＡ
から誘導されたプローブは，例えば化学的な合成反応に
おいてＨＣＶ核酸を検出するのに用いられる。これらの
プローブはまた，培養細胞系または動物モデル系におい
てウイルスの複製を阻害する際に抗ウイルス剤の効果を
決定するためのスクリーニングプログラムに用いられ
る。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブは，ヒトにおいて
ウイルス核酸を検出するのにも有用であり，従ってヒト
におけるＨＣＶ感染の診断薬の主成分として役立ち得
る。
【０４１７】上記のことに加えて，ここで与えられるｃ
ＤＮＡは，ＨＣＶのエピトープを有するポリペプチドを
合成するための情報および手段を提供する。これらのポ
リペプチドはＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するのに有
用である。ＨＣＶ感染に対する一連の免疫検定法は，Ｈ
ＣＶエピトープを有する組換え体ポリペプチドに基づく
ものである。これらの免疫検定法は，ここで説明されて
おり，ＮＡＮＢＨを誘発するＨＣＶを診断したり，ＨＣ
Ｖにより引き起こされる伝染性肝炎について血液銀行に
おける供血者をスクリーニングしたり，また伝染性の供
血者に由来する汚染された血液を検出したりする産業上
の用途が見い出される。ウイルス抗原はまた，動物モデ
ル系における抗ウイルス剤の効力をモニターするのにも
有用である。さらに，ここに開示されたＨＣＶ ｃＤＮ
Ａから誘導されたポリペプチドは，ＨＣＶ感染を処置す
るためのワクチンとして有用である。
【０４１８】ＨＣＶ ｃＤＮＡから誘導されたポリペプ
チドは，上述の用途の他にも，抗ＨＣＶ抗体を生じさせ
るのにも有用である。従って，これらのペプチドは抗Ｈ
ＣＶワクチンに使用され得る。しかしながら，ＨＣＶポ
リペプチドで免疫した結果，生産される抗体もまた，試
料中のウイルス抗原の存在を検出するのに有用である。
従って，これらのペプチドは，化学系におけるＨＣＶポ
リペプチドの生産を分析するために用いられ得る。抗Ｈ
ＣＶ抗体はまた，抗ウイルス剤が組織培養系で試験され
るスクリーニングプログラムにおいて，これらの抗ウイ
ルス剤の効力をモニターするのに用いられる。これらの
抗ＨＣＶ抗体はまた，受動免疫療法や，供血者および受
血者の両方においてウイルス抗原を検出することによ
り，ＮＡＮＢＨを引き起こすＨＣＶを診断するのにも用
いられる。抗ＨＣＶ抗体の他の重要な用途には，ウイル
スおよびウイルスポリペプチドを精製するためのアフィ
ニティークロマトグラフィーにおける使用がある。精製
されたウイルスおよびウイルスポリペプチドの調製物は
ワクチンに用いられ得る。しかしながら，精製されたウ
イルスはまた，ＨＣＶを複製する細胞培養系の開発に有
用である。
【０４１９】ＨＣＶに感染した細胞を有する細胞培養系
は多くの用途を有する。これらの細胞培養系は，通常は
力価の低いウイルスであるＨＣＶの比較的大規模な生産
に用いられ得る。これらの培養系はまた，このウイルス
の分子生物学的な解明にも有用であり，抗ウイルス剤の
開発をもたらす。これらの細胞培養系はまた，抗ウイル
ス剤の効力をスクリーニングする際にも有用である。さ
らに，ＨＣＶ許容性の細胞培養系は，弱毒化したＨＣＶ
株の生産に有用である。
【０４２０】便宜的には，抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶポ
リペプチドは，天然物であっても組換え体であっても，
キットに組み込まれ得る。
【０４２１】ＨＣＶ ｃＤＮＡを単離するのに用いられ
る方法は，個体の感染組織から誘導されたｃＤＮＡライ
ブラリーを発現ベクター中に調製すること，および非感
染個体ではなく他の感染個体に由来する抗体含有身体構
成成分中の抗体と免疫学的に反応する発現産物を生産す
るクローンを選択することを包含する。この方法は，ゲ
ノム成分からなる，これまで特徴付けられていない他の
疾患関連因子から誘導されたｃＤＮＡの単離にも適用で
きる。この方法により，次には，これらの因子が単離さ
れ，かつ特徴付けられ，またこれらの他の疾患関連因子
に対する診断用の薬剤およびワクチンがもたらされ得
る。
【０４２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン５−１−１におけるＨＣＶ ｃＤＮＡ
挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列，およびこの配列内に
コードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図２】クローン５−１−１，８１，１−２，および９
１の重複ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の相同性を示す。
【図３】重複するクローン８１，１−２，および９１に
由来するＨＣＶ ｃＤＮＡの複合配列，およびこの配列
内にコードされたアミノ酸配列を示す。
【図４】クローン８１におけるＨＣＶ ｃＤＮＡ挿入物
の二本鎖ヌクレオチド配列，およびこの配列内にコード
されたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図５】その一部がクローン８１のＮＡＮＢＶ ｃＤＮ
Ａと重複するクローン３６のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，お
よびこの配列内にコードされたポリペプチド配列を示
す。
【図６】クローン３６および８１のＨＣＶ ｃＤＮＡの
結合ＯＲＦ，およびこのＯＲＦ内にコードされたポリペ
プチドを示す。
【図７】その一部がクローン８１と重複するクローン３
２のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列にコードさ
れたポリペプチドを示す。
【図８】その一部がクローン３６と重複するクローン３
５のＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコード
されたポリペプチドを示す。
【図９】クローン３５，３６，８１，および３２のＨＣ
Ｖ ｃＤＮＡの結合ＯＲＦ，およびこのＯＲＦ内にコー
ドされたポリペプチドを示す。
【図１０】図９のつづき
【図１１】その一部がクローン３５と重複するクローン
３７ｂのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたポリペプチドを示す。
【図１２】その一部がクローン３２と重複するクローン
３３ｂのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたポリペプチドを示す。
【図１３】その一部がクローン３７ｂと重複するクロー
ン４０ｂのＨＣＶ配列，およびこの配列内にコードされ
たポリペプチドを示す。
【図１４】その一部がクローン３３ｂと重複するクロー
ン２５ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたポリペプチドを示す。
【図１５】クローン４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８
１，３２，３３ｂ，および２５ｃの広がるＯＲＦのヌク
レオチド配列，およびこの配列内にコードされたポリペ
プチドを示す。
【図１６】図１５のつづき
【図１７】図１６のつづき
【図１８】その一部がクローン４０ｂおよび３３ｃと重
複するクローン３３ｃのＨＣＶｃＤＮＡ配列，およびこ
の配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図１９】その一部がクローン３３ｃと重複するクロー
ン８ｈのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。
【図２０】その一部がクローン８ｈと重複するクローン
７ｅのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコー
ドされたアミノ酸を示す。
【図２１】その一部がクローン２５ｃと重複するクロー
ン１４ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図２２】その一部がクローン１４ｃと重複するクロー
ン８ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。
【図２３】その一部がクローン８ｆと重複するクローン
３３ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。
【図２４】その一部がクローン３３ｆと重複するクロー
ン３３ｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図２５】その一部がクローン７ｅと重複するクローン
７ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコー
ドされたアミノ酸を示す。
【図２６】その一部がクローン７ｆと重複するクローン
１１ｂのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。
【図２７】その一部がクローン１１ｂと重複するクロー
ン１４ｉのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図２８】その一部がクローン３３ｇと重複するクロー
ン３９ｃのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図２９】クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８
ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３
２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３
３ｇの整列したｃＤＮＡに由来する複合ＨＣＶ ｃＤＮ
Ａ配列を示す。さらに，この誘導された配列の拡張ＯＲ
Ｆ内にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が示さ
れている。
【図３０】図２９のつづき
【図３１】図３０のつづき
【図３２】図３１のつづき
【図３３】図３２のつづき
【図３４】図３３のつづき
【図３５】その一部がクローン１４ｉと重複するクロー
ン１２ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図３６】その一部がクローン３９ｃと重複するクロー
ン３５ｆのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図３７】その一部がクローン３５ｆと重複するクロー
ン１９ｇのＨＣＶ ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内に
コードされたアミノ酸を示す。
【図３８】その一部がクローン１９ｇと重複するクロー
ン２６ｇの配列，およびこの配列内にコードされたアミ
ノ酸を示す。
【図３９】その一部がクローン２６ｇと重複するクロー
ン１５ｅの配列，およびこの配列内にコードされたアミ
ノ酸を示す。
【図４０】クローン１２ｆから１５ｅを５’から３’の
方向に整列させることにより誘導された複合ｃＤＮＡの
配列を示す；さらに，この連続ＯＲＦ内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図４１】図４０のつづき
【図４２】図４１のつづき
【図４３】図４２のつづき
【図４４】図４３のつづき
【図４５】図４４のつづき
【図４６】図４５のつづき
【図４７】ＢＢ−ＮＡＮＢ，ＨＡＶ，およびＨＢＶに感
染したチンパンジー由来のチンパンジー血清を用いた融
合タンパクＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１のウェスタンブ
ロットの写真である。
【図４８】図４７のつづき
【図４９】ＮＡＮＢＶ，ＨＡＶ，ＨＢＶに感染したヒト
由来の血清，および対照のヒト由来の血清を用いた融合
タンバクＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１のウェスタンブロ
ットの写真である。
【図５０】図４９のつづき
【図５１】ベクターｐＡＢ２４の有意な特徴を示す地図
である。
【図５２】融合ポリペプチドＣ１００−３のカルボキシ
ル末端の推定アミノ酸配列，およびこの配列をコードす
るヌクレオチドを示す。
【図５３】図５２のつづき
【図５４】Ａは，酵母内で発現されたＣ１００−３を同
定する，クーマシーブルーで染色されたポリアクリルア
ミドゲルの写真である。Ｂは，ＮＡＮＢＶに感染したヒ
トに由来する血清を用いたＣ１００−３のウェスタンブ
ロットを示す。
【図５５】ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーの
肝臓から単離され，クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶ
ｃＤＮＡでプローブされたＲＮＡのノーザンブロットの
オートラジオグラフを示す。
【図５６】ＲＮａｓｅ ＡまたはＤＮａｓｅ Ｉで処理
され，クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶ ｃＤＮＡでプ
ローブされたＮＡＮＢＶ核酸のオートラジオグラフを示
す。
【図５７】抗ＮＡＮＢ５−１−１を有する感染血漿から
得たＮＡＮＢＶ粒子から抽出され，クローン８１由来の
３２Ｐ標識化ＮＡＮＢＶ ｃＤＮＡでプローブされた核
酸のオートラジオグラフを示す。
【図５８】クローン８１のＮＡＮＢＶ ｃＤＮＡから誘
導された３２Ｐ標識化（＋）鎖および（−）鎖ＤＮＡプ
ローブでプローブされた，単離ＮＡＮＢＶ核酸を有する
フィルターのオートラジオグラフを示す。
【図５９】ＨＣＶ ｃＤＮＡにコードされたポリペプチ
ドと，デング熱フラビウイルス由来のＮＳタンパクとの
相同性を示す。
【図６０】図５９のつづき
【図６１】ＨＣＶ ｃＤＮＡにコードされたポリペプチ
ドと，デング熱フラビウイルス由来のＮＳタンパクとの
相同性を示す。
【図６２】ＥＬＩＳＡスクリーニング法で決定される，
任意抽出試料におけるＨＣＶ感染の分布ヒストグラムを
示す。
【図６３】ＥＬＩＳＡ検定法において免疫グロブリン−
酵素結合体の２つの形態を用いた，任意抽出試料におけ
るＨＣＶ感染の分布ヒストグラムを示す。
【図６４】フラビウイルスのＮＳ１における保存配列か
ら誘導されたプライマー混合物の配列を示す。
【図６５】図２９のｃＤＮＡと重複するセグメントであ
る，クローンｋ９−１中のＨＣＶｃＤＮＡ配列およびそ
れにコードされるアミノ酸を示す。
【図６６】図６５のつづき
【図６７】５’から３’の方向に，ｋ９−１から１５ｅ
にわたる並列したクローンに由来する複合ｃＤＮＡの配
列，および連続するＯＲＦ中にコードされるアミノ配列
を示す。
【図６８】図６７のつづき
【図６９】図６８のつづき
【図７０】図６９のつづき
【図７１】図７０のつづき
【図７２】図７１のつづき
【図７３】図７２のつづき
【図７４】図７３のつづき
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/576 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ２６３，５８４ (32)優先日 1988年10月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ２７１，４５０ (32)優先日 1988年11月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 早期審査対象出願 (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122 サンフランシスコ，シックスス アベニュー 1370 (56)参考文献 特表 平２−500880（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ，10（1985）Ｐ．307− 319 ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ （1985）88：Ｐ．773−779 ＳＥＭＩＮＡＲＳ ＩＮ ＬＩＶＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥ ６，Ｐ．56−66 （1986) Ｊ．ＯＦ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＳ Ｄ ＩＳＥＡＳＥ 156，（４）Ｐ．636 （1987．10) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．80，Ｐ．1194−1198（1983) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．80，Ｐ．3787−3791（1983)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 イムノアッセイキットを調製する方法で
    あって、以下の工程：少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を含む ポリペ
    プチドを合成する工程、ここで、該少なくとも８個のア
    ミノ酸の連続する配列は少なくとも一つの部位を有し、
    該部位は、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列
    からなる配列中においても該ポリペプチド中においても
    Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によって結合され得、そ
    して、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は以
    下のアミノ酸配列から得られる： 【化１】 【化２】 【化３】 および、 該ポリペプチド、および該ポリペプチドを含む抗原抗体
    複合体の存在を検出する試薬を、適当な容器に包装する
    工程； を包含する方法。
  2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、 （１）前記少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を
    コードするポリヌクレオチドを提供すること； （２）コード配列として該ポリヌクレオチドを用いて、
    組換えＤＮＡベクターを調製すること； （３）該ベクターによって、宿主細胞を形質転換するこ
    と；および （４）該コード配列の発現が可能な条件下で、該形質転
    換された宿主細胞をインキュベートすること； によって、合成される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが、化学的に合成され
    る、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチドを固体支持体に固定化
    する工程をさらに包含する、請求項１から３のいずれか
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記試薬が標識されている、請求項１か
    ら４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記イムノアッセイキットが、改良され
    た輸血用ヒト血液または血漿供給物の調製における使用
    に適する、請求項１に記載の方法。
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