PT2014671E - Métodos e composições para identificar e caracterizar a hepatite c - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAR E CARACTERIZAR A HEPATITE C"

Antecedentes da Invenção 0 vírus da Hepatite C (HCV) é o principal agente etiológico para a hepatite não-A, não-B. Estima-se que cerca de 400 milhões de pessoas ou >2% da população mundial estejam infectadas (Di Bisceglie, A.M. (1998) Hepatitis C. Lancet 351:351-5; Houghton M. (1996), p. 1035-1058. In B. N. Fields e D. M. Knipe e Η. P. M. (ed.), Fields' Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia/New York). O HCV resulta normalmente numa infecção crónica em 60 a 80% dos indivíduos infectados tendo 20% progressão para cirrose, carcinoma hepatocelular ou falência hepática crónica. Foram identificados mundialmente pelo menos 6 genótipos virais principais e mais de 50 subtipos propostos de HCV (Simmonds, P. et al. (1994) Identification of genotypes of hepatitis C virus by sequence comparisons in the core, EI and NS-5 regions. J Gen Virol 75:1053-1061). Estes genótipos baseiam-se na diversidade de sequências de nucleótidos e de aminoácidos com os isolados mais divergentes a diferir em mais de 30% (Bréchot, C. (1996) 2 ΡΕ2014671

Hepatitis C virus: Molecular biology and genetic variability. Digestive Diseases and Sciences 41:6S-21S; Bukh, J. et al. (1995) Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin Liver Dis 15:41-63) . Entre os diferentes tipos, existem regiões que são altamente conservadas e possuem homologia de sequências próximo de 100%, todavia, em regiões altamente variáveis, tais como proteínas do envelope, a homologia é <70% (Booth, J.C. et al. (1998) Comparison of the rate of sequence variation in the hypervariable region of E2/NS1 region of hepatitis C virus in normal and hypogammaglobulinemic patients. Hepatology 27:223-27; Hayashi, N. et al. (1993) Molecular cloning and heterogeneity of the human hepatitis C virus (HCV) genome. J Hepatol 17:S94-107; Hijikata, M. et al. (1991) Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C virus. Biochem Biophys Res Commun 175: 220-228; Kato, N. et al. (1992) Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses. Virus Res 22:107-123; Lesniewski, R.R. et al. (1993) Hypervariable 5'-terminus of hepatitis C virus E2/NS1 encodes antigenically distinct variants. J Med Virol 40: 150-156; Pozzetto, B. et al. (1996) Structure, genomic organization, replication and variability of hepatitis C virus. Nephrol Dial Transplant 11 [Supl 4]:2 — 5; Vizmanos, J.L. et al. (1998) Degree e distribution of variability in the 5' untranslated, El, E2/NS1 and NS5 regions of the hepatitis C virus (HCV). J Virai Hepat 5:227-240). 3 ΡΕ2014671 HCV é um membro da família Flavivlridae cujos outros membros incluem os Flavivírus e Pestivírus (Kato, N. et al. (1991) Molecular structure of the Japanese hepatitis C virai genome. FEBS Lett 280: 325-328). 0 genoma de HCV é um RN A de cadeia positiva de ~9,5 kb que contém uma única grelha de leitura aberta codificando uma poliproteína de 3010 até 3033 aminoácidos (Takamizawa, A. et al. (1991) Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol 65:1105-1113). O processamento proteolítico da poliproteína é realizado através de proteases do hospedeiro e virais. As peptidases de sinal do hospedeiro clivam as proteínas estruturais que estão localizadas na extremidade 5', enquanto que duas proteases virais clivam as proteínas não estruturais. Estas clivagens resultam em pelo menos 10 proteínas virais na ordem NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Existem também regiões não codificantes localizadas nas extremidades 5' e 3' que estão envolvidas na ligação de ribossoma e iniciação de replicação, respectivamente.

Uma das proteases virais, a protease NS3, é codificada pela região N-terminal o gene NS3 de HCV. Consiste em 181 aminoácidos e é uma protease serínica do tipo quimiotripsina responsável pela clivagem das proteínas não estruturais de HCV (Bartenschlager, R. et al. (1993) Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. J Virol 67: 3835-3844; Eckart, M.R. et 4 ΡΕ2014671 al. (1993) The hepatitis C vírus encodes a serine protease involved in processing of the putative nonstructural proteins from the virai polyprotein precursor. Biochem Biophys Res Comrnun 192: 399-406; Gallinari, P. et al. (1998) Multiple enzymatic activities associated with recombinant NS3 protein of hepatitis C virus. J Virol 72:6758-6769; Hahm, B. et al. (1995) NS3-4A of hepatitis C virus is a chymotrypsin-like protease. J Virol 69:2534-2539; Hijikata, M. et al. (1993) Two distinct proteinase activities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J Virol 67:4665-4675; Hijikata, M. et al. (1993) Proteolytic processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sei USA. 90:10773-10777; Manabe, S. et al. (1994) Production of nonstructural proteins of hepatitis C virus requires a putative virai protease encoded by NS3. Virology 198:636-644; Tomei, L. et al. (1993) NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J Virol 67:4017-4026). O processamento das proteínas estruturais por NS3 ocorre numa cascata bem ordenada com a primeira clivagem ocorrendo entre NS3 e NS4A seguido por NS5A-NS5B, NS4A-NS4B e NS4B-NS5A (Bartenschlager, R. et al. (1994) Kinetic and structural analysis of hepatitis C virus polyprotein processing. J Virol 68:5045-5055; D'Souza, E.D. et ai. (1994) Analysis of NS3-mediated processing of the hepatitis C virus nonstructural region in vitro. J Gen Virol 75:3469-3476; Eckart M.R., et ai., 1993, supra; Failla, C. et al. (1994) 5 ΡΕ2014671

Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins. J Virol 68:3753-3760; Kolykhalov, A.A. et al. (1994) Specificity of the hepatitis C virus NS3 serine protease: effects of substitutions at the 3/4A, 4A/4B, 4B/5A, and 5A/5B cleavage sites on polyprotein processing. J Virol 68:7525-7533; Shimotohno, K. et al. (1995) Processing of the hepatitis C virus precursor protein. J Hepatol 22: 87-92; Shoji, I. et al. 1999 Internai processing of hepatitis C virus NS3 protein. Virology 254:315-323; Tomei, L. et al., 1993, supra). A clivagem entre NS3 e NS4A ocorre em cis, enquanto que as outras clivagens são em trans. O cofactor codificado pelo virus, NS4A, é necessário para a função eficiente de NS3. A eficiência do processamento proteolitico demonstrou aumentar dramaticamente na presença da proteina NS4A (Failla, C. et al. (1995) An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 proteinase is essential for the interaction with NS4A. J Virol 69:1769-1777; Failla, 1994, supra; Gallinari, P. et al. 1999 Modulation of hepatitis C virus NS3 protease and helicase activities through the interaction with NS4A. Biochemistry 38: 5620-5632; Lin, C. et al. (1995) A central region in the hepatitis C virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro. J Virol 69:4373-4380; Satoh, S. et al. (1995) The N-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3) is essential for stable complex formation with NS4A. J Virol 69:4255-4260; Tanji, Y. et al. (1995) Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions 6 ΡΕ2014671 in virai protein processing. J Virol 69: 1575-1581). Adicionalmente, NS3 contém um átomo de zinco ligado tetraedricamente, que parece desempenhar um papel estrutural (De Francesco, R. et al. (1996) A zinc binding site in virai serine proteinases. Biochemistry 35:13282-13287; Stempniak, M. et al. (1997) The NS3 proteinase domain of hepatitis C virus is a zinc-containing enzyme. J Virol 71:2881-2886).

Recentemente, foi alcançado um progresso considerável na determinação sobre como a protease NS3 processa o polipéptido de HCV (Kolykhalov, A. A. et al., 1994 supra; Steinkuhler, C. et al. (1996) Activity of purified hepatitis C virus protease NS3 on peptide substrates. J Virol 70: 6694-6700; Urbani, A. et al. (1997) Substrate specificity of the hepatitis C virus serine protease NS3. J Biol Chem 272:9204-9209). Modelos sobre como a protease interactua com cofactores e o substrato identificaram quatro domínios, que estão envolvidos na função da enzima (Barbato, G. et al. 1999. The solution structure of the N-terminal proteinase domain of the hepatitis C virus (HCV) NS3 protein provides new insights into its activation and catalytic mechanism. J Mol Biol 289:371-384). Estes são a tríade catalítica, cofactor e sítio de ligação ao metal e a bolsa de ligação ao substrato. Estes domínios estão bem definidos e contêm resíduos de aminoácidos que são altamente conservados em todos os genes da protease de HCV sequenciados até ao presente (Ver Figura 1 em Holland-Staley, C. A., et al. (2002) Genetic diversity and response 7 ΡΕ2014671 to IFN of the NS3 protease gene from clinicai strains of the hepatitis C virus. Arch Virol 147:1385-1406, que é aqui incorporado por referência). Apesar deste recente surto de informação estrutural e estudos que apresentam envolvimento directo e conservação dos residuos de aminoácidos, o impacto da variabilidade da sequência natural sobre a função enzimática não é bem entendida. Adicionalmente, os efeitos de terapia anti-viral na sequência da protease NS3 são desconhecidos. Elucidação sobre a diversidade genética natural da protease NS3 de HCV em amostras de doentes tem um significado médico, assim como um interesse teórico. Embora todas as proteases NS3 de HCV sequenciadas até ao presente contenham aminoácidos de sitio activo conservados, a variação de sequência ao longo do gene NS3 é significativa (Martell, M. et al. (1992) Hepatitis C virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV distribution. J Virol. 66:3225-32; Okamoto, H. et al. (1992) Genetic drift of hepatitis C virus during an 8.2-year infection in a chimpanzee: variability e stability. Virology 190:894-899; Okamoto, H. et al. (1992) supra). Também, a presença de múltiplas espécies no mesmo doente, conhecido as quasies-pécies, cria um problema potencial para o desenvolvimento de fármaco e resistência. O conhecimento da extensão da variação da sequência NS3 em estirpes clinicas permitirá o desenvolvimento mais eficaz de fármacos tendo como alvo a protease de HCV. Para isto, devem estar disponíveis resultados que descrevem a variabilidade de sequência como ocorre em pessoas infectadas com HCV. ΡΕ2014671

As helicases são enzimas que são responsáveis pelo desenrolar de duplexes de DNA/DNA, RNA/DNA e RNA/RNA numa direcção 3'-para-5'. (Bartenschlager, R. et al., 1993, supra; Hahm B., et al., 19 95, supra; Tomei, et al., 1993, supra). Adicionalmente, tem sido proposto que as enzimas helicase desempenhem papéis na replicação e recombinação virai, controlo virai de funções celulares do hospedeiro, estabilidade de mRNA incluindo excisão ou processamento, transcrição, transporte, e iniciação de tradução de RNA (Luking, et al. (1998) The protein family of RNA helicases. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33:259-296). A helica-se/NTPase NS3 de HCV contém 450 aminoácidos. A componente de NTPase hidrolisa 5'-trifosfatos de nucleósido, proporcionando os requisitos energéticos. Crê-se que a helica-se/NTPase, juntamente com a protease NS3 e a polimerase dependente de RNA NS5b, constituam um grande complexo, que é responsável pela replicação do RNA virai. Recentemente, foi alcançado um progresso considerável na determinação da estrutura da helicase NS3 de HCV e o seu mecanismo de desenrolar o duplex. Foram publicadas pelo menos três estruturas de cristal diferentes (Paolini, Cho et al., 1998, supra ; Kim et al ., 1998 , supra; e Yao et al. 1997, supra) . Em todos os três, a enzima demonstrou conter 3 dominios, sendo os dominios 1 e 2 estruturalmente semelhantes. A enzima contém sete motivos, incluindo dois motivos que estão envolvidos na ligação e hidrólise de NTP (motivo I [GxGKS] e motivo II [DExH]) e um que está envolvido na hidrólise de ATP e desenrolar de RNA (motivo 9 ΡΕ2014671 VI) . A maioria dos motivos está localizada entre os dominios estruturais 1 e 2, com o domínio 3 separado dos outros dois através da ligação do nucleótido. Os investigadores identificaram resíduos altamente conservados em cada motivo. Estes motivos, juntamente com a análise de comparação com outras helicases, revelam ser um membro da família DEAD-box das helicases de RNA, especificamente a subfamília DExH. É necessário magnésio para ambas as actividades de helicase e NTPase. A única terapia aprovada pela FDA para a infecção com hepatite C é o interferão (IFN) ou interferão peguilado com ou sem ribavirão. A produção de interferão demonstrou ser induzida após infecções com bactérias, parasitas e vírus bem como na resposta a tumores. Os interferões são proteínas secretadas na família das citocinas, que inibem indirectamente o ciclo de vida virai através de ligação a receptores celulares, induzindo desse modo a síntese de proteínas (Hijikata, M. et al. (1993) Proteolytic Processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sei USA. 90: 10773-10777). Os genes de interferão indutíveis contêm uma região de promotor, denominada o elemento de resposta estimulada por IFN (ISRE) . Mais de 30 genes são induzidos pelo interferão, contudo, a função da maioria destes genes é desconhecida (Holmes, E. C. et al. (2000) The causes and consequences of genetic variation in dengue virus. Trends Microbiol 8:74-77). 10 ΡΕ2014671

Recentemente foi sugerido que uma curta sequência de 40 aminoácidos no gene NS5A de HCV desempenha um papel na resistência a IFN, todavia, embora pareça ser verdade para alguns isolados Japoneses outros investigadores têm resultados contraditórios. Os efeitos da terapia de interferão nos outros genes estruturais são desconhecidos.

Sumário da Invenção A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de sequências de ácido nucleico novas, isoladas, para amplificar e sequenciar porções do genoma de HCV. A presente invenção proporciona novas sequências e método para as utilizar, que amplificam consistentemente o genoma de HCV. As sequências de ácido nucleico da presente invenção são úteis como reagentes para detectar e identificar sequências virais em amostras biológicas e permitir a caracterização futura do genoma de HCV. Os métodos aqui descritos, a sequência de ácido nucleico apresentada como SEQ ID NO: e seus equivalentes funcionais, assim como os estojos ("kits") os contêm, são úteis para determinar com precisão a presença de HCV em amostras biológicas, assim como a sequência especifica de uma porção do genoma de HCV. A sequência de ácido nucleico e os métodos da presente invenção podem ser úteis para: (i) detectar infecção por HCV, incluir a detecção de estágio precoce; (ii) identificação do tipo de infecção por HCV; (iii) detecção de estirpes variantes de HCV incluindo heterogeneidade num doente; (iv) detecção de uma mutação no 11 ΡΕ2014671 ácido nucleico de HCV que é responsável pela resistência ou sensibilidade a uma terapia; (v) detecção de novas mutações no genoma de HCV que estão correlacionados com a resistência ou sensibilidade a uma terapia com fármaco; (vi) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente anti-viral, será eficaz; (vii) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente anti-viral, deve ou não ser continuado; (viii) identificação da interacção entre HCV e outros virus e/ou doenças; (ix) criar um ácido nucleico, e.g., DNA, vacina, que pode ser especifico para o doente; e (x) desenvolvimento de novos fármacos, e.g., com base em cristalografia de raios x. A presente invenção apresenta uma sequência iniciadora nova, isolada a partir do genoma de HCV apresentada aqui como SEQ ID N0:1 (Tabelas 1A-1G) . Sequências que correspondem aos subtipos la e lb de HCV são apresentadas como SEQ ID NOS :1-23 e SEQ ID NO: 64 (Tabelas IA e 1G); sequências que correspondem ao subtipo 2a de HCV são apresentados como SEQ ID NOS :24-27 (Tabela 1B); sequências que correspondem ao subtipo 2b de HCV são apresentadas como SEQ ID NOS:28-42 (Tabela 1C) ; sequências que correspondem ao subtipo 3a de HCV são apresentadas como SEQ ID NOS:43-46 (Tabela ID) ; sequências que correspondem ao subtipo 3b de HCV são apresentadas como SEQ ID NOS :47-50 (Tabela 1E); e sequências que correspondem ao subtipo 4a de HCV são apresentadas como SEQ ID NOS :51-63 (Tabela 1F) .

Numa forma de realização, a presente invenção 12 ΡΕ2014671 apresenta um oligonucleótido apresentado como SEQ ID NO: 23. Noutra forma de realização, o oligonucleótido da invenção é pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico à sequência de nucleótidos apresentada como SEQ ID NO:23. Ainda noutra forma de realização, o oligonucleótido da SEQ ID NO:23 tem pelo menos 4, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleótidos de comprimento. Será entendido que a extremidade 5' pode conter maior variabilidade (e.g., substituições de ácido nucleico), contudo permanece funcional (e.g., capaz de emparelhar à porção NS3 e NS4 do genoma de HCV) . Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma combinação de um ou mais oligonucleótidos da presente invenção. Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um conjunto de oligonucleótidos, também aqui referidos como "iniciadores" e "sequências de iniciadores de ácido nucleico" seleccionados a partir do grupo consistindo em dois ou mais dos oligonucleótidos da presente invenção. Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona oligonucleótidos que são capazes de amplificar uma amostra de doente possuindo uma sequência de nucleótidos seleccionada apresentada como SEQ ID NO: 23, ou seu complemento. Num aspecto da invenção, o oligonucleótido da presente invenção compreende um marcador para detecção. Esses marcadores podem ser, e.g., marcadores radioactivos que podem ser incorporados através de métodos conhecidos (e.g., tradução ou tratamento com cinase de interrupções), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, gru- 13 ΡΕ2014671 pos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos desencadeados), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações destes, e semelhantes. Outro aspecto da invenção compreende um vector compreendendo um oligo-nucleótido da presente invenção.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um oligonucleótido para amplificar uma sequência de ácido nucleico numa amostra, em que a amostra contém uma sequência de nucleótidos apresentada como SEQ ID NO:23, ou a sua complementar. Num aspecto da invenção, a amostra é de um doente infectado com HCV.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico, em que a sequência de ácido nucleico é um promotor-iniciador compreendendo um oligonucleótido da presente invenção, em que uma porção 5' da sequência inclui uma sequência de promotor.

As sequências de ácido nucleico de HCV amplificadas criadas a partir dos métodos aqui apresentados podem ser clonados num vector hospedeiro com um promotor de expressão e utilizado como uma vacina de DNA para amplificar uma resposta do doente ao virus HCV, proporcionando assim uma vacina de DNA especifico para o doente, contra HCV. Noutro aspecto da invenção, o clone pode ser utilizado para criar RNA para utilização como uma vacina anti-sentido. 14 ΡΕ2014671

Será entendido que uma amostra utilizada nos métodos da presente invenção pode ser uma amostra biológica, e.g., de um doente infectado com HCV. Essas amostras podem incluir, sem limitação, sangue, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, as secções externas da pele, tractos respiratório, intestinal, e genitourinário, lágrimas, saliva, leite, urina, células sanguíneas, tumores, órgãos, DNA genómico, RNA, ou cDNA em solução ou ligados a um substrato, e também amostras de constituintes de cultura de células in vitro incluindo, mas não limitados a, meio condicionado resultante do crescimento das células em meio de cultura de células, putativamente células infectadas com vírus, células recombinantes, e componentes de células, e.g., cromossoma(s), organelos, tecido embebido em parafina, ou membranas isoladas a partir de uma célula.

Numa forma de realização da invenção, a porção da protease serínica do gene NS3 de HCV é analisada. Isto pode ser realizado amplificando e sequenciando a porção da protease serínica do gene com as composições e métodos da presente invenção. Quando é empregue um par de iniciadores como iniciadores de sequenciação, qualquer um deles ou ambos os membros do par pode ser adequadamente marcado, e.g., marcadores radioactivos que podem ser incorporados através de métodos conhecidos (e.g., tradução ou tratamento com cinase de interrupção), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos desencadeados), 15 ΡΕ2014671 digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações destes, e semelhantes.

Noutra forma de realização da invenção, a porção de helicase do gene NS3 de HCV é analisada. Isto pode ser realizado amplificando e sequenciando a porção de helicase do gene com as composições e métodos da presente invenção. Quando é empregue um primeiro par como iniciadores de sequenciação, qualquer um deles ou ambos os membros do par pode ser marcado adequadamente, e.g., marcadores radio-activos que podem ser incorporados através de métodos conhecidos (e.g., tradução ou tratamento com cinase de interrupção), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos desencadeados), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações destes, e semelhantes.

Combinações de iniciadores, por exemplo, incluindo pelo menos um iniciador em sentido directo e um em sentido reverso, que juntamente podem ser utilizados para amplificação e/ou sequenciação de uma porção relevante do genoma de HCV, e.g., o gene NS3 ou NS4, pode ser empacotado adequadamente num estojo ("kit")· Os pares de iniciadores internos de amplificação e sequenciação são preferidos. Numa forma de realização, a invenção proporciona um estojo ("kit") para a detecção de HCV, compreendendo um ou mais oligonucleótidos da presente invenção. Noutra forma de 16 ΡΕ2014671 realização, o estojo ("kit") compreende um conjunto de iniciadores seleccionados do grupo consistindo nos oligonucleótidos da presente invenção. Os iniciadores nesses estojos ("kits") podem ser marcados ou não marcados. 0 estojo ("kit") pode também incluir reagentes adicionais, tais como reagentes para realizar a reacção da polimerase em cadeia (PCR), uma transcriptase reversa para conversão do RNA de HCV em cDNA para amplificação, polimerases de DNA, fornecimentos de dNTP e ddNTP. 0 estojo ("kit") pode também incluir instruções para utilização.

A presente invenção também apresenta novos métodos para amplificar um ácido nucleico alvo, e.g., regiões específicas do genoma de HCV de um doente, tais como os genes NS3 e NS4 do genoma de HCV, utilizando os oligonucleótido da presente invenção. Os novos métodos da presente invenção podem ser utilizados para, por exemplo: (i) detectar infecção com HCV, incluindo a detecção de estádio precoce; (ii) identificação do tipo de infecção com HCV; (iii) detecção de estirpes variantes de HCV incluindo heterogeneidade num único doente; (iv) detecção de uma mutação no ácido nucleico de HCV que é responsável pela resistência ou sensibilidade a uma terapia; (v) detecção de novas mutações no genoma de HCV que estão correlacionados com resistência ou sensibilidade a uma terapia; (vi) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente anti-viral, será eficaz; (vii) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente antiviral, deve ser ou não continuado; (viii) identificação da interacção entre o HCV 17 ΡΕ2014671 e outros vírus e/ou doenças; (ix) criar um ácido nucleico, e.g., DNA, vacina, que pode ser específica para um doente; e (x) desenvolvimento de novos fármacos, e.g., baseado em cristalografia de raios x. Esta análise pode ser realizada por sequenciação directa, ou utilizando outras técnicas para caracterização de polimorfismos da sequência, incluindo mas não limitado a, hibridação com sondas de oligonu-cleótidos específicos para a sequência.

Consequentemente, numa forma de realização, a invenção proporciona métodos para amplificar um ácido nucleico alvo, e.g., porções do geme NS3 ou NS4, combinando um ácido nucleico alvo em condições que permitem uma reacção de amplificação para ocorrer com uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção e outros agentes de amplificação necessários, tais como uma polimerase de ácido nucleico e uma pluralidade de nucleótidos. Num aspecto da presente invenção, a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo resulta numa quantidade aumentada do ácido nucleico alvo amplificado. Ainda outro aspecto da invenção, a sequência de ácido nucleico alvo é do genoma de HCV, e.g., o gene NS3 ou NS4A. Noutros aspectos da invenção, o ácido nucleico alvo é a porção de protease serínica do gene de NS3. Ainda noutros aspectos da invenção, o ácido nucleico alvo é a porção de helicase do gene NS3. Noutro aspecto da invenção, é utilizada uma polimerase de ácido nucleico e pode ser seleccionada a partir do grupo consistindo em transcriptase reversa e polimerase de DNA termoestável. Noutras formas de 18 ΡΕ2014671 realização da invenção, o ácido nucleico amplificado de HCV é sequenciado. Ainda noutro aspecto da invenção, a sequência é avaliada para mutações.

Noutra forma de realização da presente invenção, é proporcionado um método para detectar e caracterizar ácidos nucleicos de HCV numa amostra através do contacto da amostra com uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção em condições tais que os ácidos nucleicos de HCV podem hibridar com os iniciadores da invenção, realizando transcrição reversa e amplificação dos ácidos nucleicos para obter ácidos nucleicos de HCV amplificados, e detectar a presença dos ácidos nucleicos de HCV amplificados. Os ácidos nucleicos de HCV amplificados podem ser ainda caracterizados através de, por exemplo, sequenciar os ácidos nucleicos amplificados. Num aspecto da invenção, a detecção da presença dos ácidos nucleicos de HCV amplificados compreende contactar os ácidos nucleicos de HCV amplificados com um oligonucleótido marcado para obter ácidos nucleicos de HCV marcados e identificar os ácidos nucleicos marcados. Ainda outros aspectos da invenção, a amplificação dos ácidos nucleicos podem ser realizados por amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA), Amplificação Mediada por Transcrição (TMA), reacção em cadeia pela polimerase (PCR), outros métodos de amplificação do alvo, métodos de amplificação de sinal ou métodos de amplificação de sonda, tais como a reacção em cadeia por ligase. Ainda noutro aspecto da invenção, os métodos compreendem ainda o passo de 19 ΡΕ2014671 sequenciar os ácidos nucleicos de HCV amplificados. Ainda noutra forma de realização, os métodos compreendem ainda avaliar a sequência para mutações.

Uma vez sequenciada, as mutações no genoma de HCV podem ser identificadas comparando a sequência com uma sequência conhecida ou de controlo, e.g., uma sequência de consenso. Assim, a presente invenção proporciona composições e métodos para identificar mutações particulares no genoma de HCV. Com o conhecimento de uma mutação particular no genoma de HCV de uma amostra de um doente, pode ser identificada e administrada terapia ou terapia de combinação apropriada para o doente. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para determinar um regime de tratamento particular dependendo do genótipo do HCV que infectou o doente. Noutra forma de realização, a invenção proporciona composições e métodos para determinar se um doente é sensível ou resistente a um agente para obter uma amostra de um doente compreendendo DNA, realizando amplificação, e.g., PCR, no DNA da amostra do doente utilizando uma sequência de iniciador de ácido nucleico da presente invenção, e analisando o produto amplificado, por exemplo, por sequenciação, para identificar mutações particulares. Ainda noutros aspectos da invenção, o agente pode ser um agente antiviral, tal como um inibidor de protease, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção helicase do gene NS3, interferão alfa, ribavirina, interferão peguilado, ou uma combinação destes. 20 ΡΕ2014671

Dado que a sequência do iniciador da presente invenção ter sido derivada de regiões conservadas do genoma de HCV, as composições e métodos aqui descritos irão auxiliar na detecção e/ou identificação de estirpes variantes de HCV. Isto, por sua vez, irá conduzir ao desenvolvimento de agentes imunológicos adicionais para a detecção e diagnóstico de HCV, assim como o desenvolvimento de agentes polinucleotídicos adicionais para a detecção e ou tratamento de HCV.

Ainda outra forma de realização, a invenção proporciona um método para determinar se um agente pode ou não ser utilizado para tratar um doente de HCV obtendo uma amostra de um doente infectado com HCV, amplificando a amostra do doente utilizando as sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção, sequenciar as sequências de ácido nucleico de HCV amplificadas resultantes, e identificar mutações na sequência de ácido nucleico de HCV amplificada que está correlacionada com resistência ou sensibilidade a um agente, determinando desse modo se o agente pode ou não ser utilizado para tratar um doente com HCV. Num aspecto da invenção, as sequências de ácidos nucleicos são um conjunto de iniciadores.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para determinar se o tratamento com um agente deve ser continuado num doente infectado com HCV, compreendendo o método a obtenção de duas ou mais amostras 21 ΡΕ2014671 compreendendo DNA de um doente durante o decurso do tratamento, amplificando e sequenciando uma sequência de ácido nucleico alvo da amostra utilizando as sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção nos métodos aqui descritos, identificando mutações presentes na sequência de ácido nucleico amplificada que está correlacionada com a resistência ou sensibilidade a um agente, e continuando o tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado não se altera durante o decurso do tratamento.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para determinar se o tratamento com um agente não deve ser continuado num doente infectado com HCV, compreendendo o método obter duas ou mais amostras compreendendo DNA de um doente durante o decurso do tratamento, amplificar e sequenciar as sequências de ácido nucleico alvo a partir das amostras utilizando as sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção nos métodos aqui descritos, identificar mutações presentes na sequência de ácido nucleico amplificado que estão correlacionadas com a resistência ou sensibilidade a um agente, e descontinuar o tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado mudam, e.g., um aumento no número de mutações durante o decurso do tratamento é um indicador de resistência a um agente.

Os Exemplos Específicos apresentados abaixo também estabelecem uma correlação entre o tipo de HCV, 22 ΡΕ2014671 particularmente como determinado por análise do gene NS3, e a probabilidade de o virus dar resposta à terapia anti-viral, e.g., terapia alfa-IFN. Assim, um outro aspecto da invenção é um método para avaliar um doente diagnosticado como ou suspeito de possuir uma infecção com HCV para avaliar se a terapia, e.g., terapia de alfa-IFN, tem probabilidade de sucesso, compreendendo os passos de obter uma amostra do doente contendo DNA, comparando a porção de protease serinica do gene NS3 e/ou a porção de helicase do gene NS3, com as sequências de consenso do subtipo, em que a presença de uma ou mais mutações é indicadora de resistência à terapia. Será entendido que esta mesma metodologia pode ser utilizada para determinar se o virus (e por conseguinte o doente), será sensivel ou resistente a outros agentes anti-virais, tais como o inibidor da protease, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3, e um inibidor da porção de helicase do gene NS3.

Noutra forma de realização, a invenção apresenta um método de avaliar a eficácia de um agente para tratar HCV, compreendendo o método comparar sequências de ácido nucleico numa primeira amostra obtida a partir de um doente exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados de uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico da presente invenção, e sequências de ácido nucleico numa segunda amostra obtida de um doente que não foi exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados de uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico da 23 ΡΕ2014671 presente invenção, em que um número aumentado de mutações nas sequências de ácido nucleico da primeira amostra, em relação a uma sequnda amostra, é uma indicação de que o agente não é eficaz no tratamento de HCV. A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de quimica, biologia molecular, microbiologia, DNA recombi-nante, e imunologia, que estão dentro da especialidade na técnica. Essas técnicas são explicadas com todo o detalhe na literatura. (Ver e.g., Maniatis, Fitsch & Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Volumes I e II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); da série, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) , particularmente Vol. 154 e Vol. 155 (Wu e Grossman, e Wu, eds., respectivamente)). Todas as patentes, pedidos e publicações de patentes, aqui mencionados, tanto supra como infra, são aqui incorporados por referência.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 apresenta os resultados de uma reacção de PCR interna da protease NS3 do virus da Hepatite C de amostras de 7 doentes. 0 produto NS3 tem 2746 pb. 0 marcador de Peso Molecular de DNA em escada está na pista 1. As Figuras 2A-2B apresentam árvores filogenéticas construidas a partir de 30 estirpes de protease NS3 de HCV 24 ΡΕ2014671 utilizando A Análise de Parsimónia e Neighbor-joining. A Figura 2A apresenta uma árvore de consenso da análise de parcimónia, enquanto que a Figura 2B apresenta uma árvore de bootstrap da análise de Neighbor joining.

Descrição Detalhada da invenção 0 termo "agente" inclui qualquer substância conhecida que pretende tratar uma infecção ou doença, em particular, agentes conhecidos para tratar infecções virais. 0 termo "agente" é ainda pretendido para cobrir agentes anti-virais incluindo, mas não limitado a, um inibidor de protease, um inibidor da porção da protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção de helicase do gene NS3, alfa-interferão, ribavirina, e interferão peguilado.

Os termos "amplificação" ou "amplificar" incluem as reacções necessárias para aumentar o número de cópias da sequência de ácido nucleico (e.g., uma sequência de DNA) . Para os objectivos desta invenção, a amplificação refere-se ao aumento exponencial in vitro do número de cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo, tal como é mediada por uma reacção de amplificação da polimerase tal como e.g., PCR, todavia, outras reacções de amplificação compreendidas por uma invenção incluem, e.g., RT-PCR (ver, e.g., U.S.P.N. 4 683 202; Mullis et al.), e a reacção em cadeia pela ligase (Barany, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193 (1991)). 25 ΡΕ2014671

Os termos "Vírus da Hepatite C" e "HCV" refere-se à espécie virai que é o agente etiológico principal de BB-NANBH, cujo isolado de protótipo é identificado em WO89/046699; publicação EPO 318 216; e Pat. U.S. No. 5 350 671, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. "HCV", como aqui utilizado inclui as estirpes patogénicas capazes de provocar a hepatite C, e estirpes atenuadas ou partículas de interferência defectiva derivadas destas. O genoma de HCV é compreendido por RNA. É conhecido que o vírus contendo RNA possui taxas relativamente elevadas de mutação espontânea, designadamente na ordem de 10~3 até 10”4 por nucleótido incorporado (Fields & Knipe, "Fundamental Virology" (1986, Raven Press, N.Y.)). Como a heterogeneidade e fluidez do genótipo são características inerentes ao vírus do RNA, existirão múltiplas estirpes/isolados, que podem ser virulentos ou avirulentos, na espécie de HCV.

Os termos "híbrida" ou "hibridação" são conhecidos na técnica e incluem a ligação de hidrogénio de sequências de DNA complementar e/ou de RNA para formar uma molécula de duplex. O termo "estojo ("kit")" é qualquer manufactura (e.g., uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, e.g., um iniciador, para amplificar especificamente e/ou sequenciar uma porção do genoma de HCV, sendo o fabrico promovido, distribuído, ou vendido 26 ΡΕ2014671 como uma unidade para realizar os métodos da presente invenção. Um estojo ("kit") pode também incluir instruções para utilização. 0 termo "marcador" refere-se a uma unidade molecular capaz de detecção incluindo, a titulo de exemplo, sem limitação, marcadores radioactivos que podem ser incorporados através de métodos conhecidos (e.g., tradução ou tratamento com cinase da interrupção), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimio-luminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos desencadeados), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, e semelhantes . 0 termo "nucleótidos" refere-se a qualquer nucleótido (incluindo nucleótidos modificados, e.g., nucleótidos metilados ou biotinilados) que podem ser incorporados num ácido nucleico por uma polimerase.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" inclui moléculas de DNA (e.g., cDNA ou DNA genómico) , moléculas de RNA (e.g., mRNA) , e análogos do DNA ou RNA criados utilizando análogos de nucleótidos ou utilizando química dos ácidos nucleicos. Modificações típicas incluem metilação, biotinilação, e outras modificações conhecidas na técnica. Adicionalmente, a molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. 27 ΡΕ2014671 0 termo "ácido nucleico alvo" ou "molde" inclui qualquer ácido nucleico que se pretende ser copiado em, e.g., uma reacção de amplificação pela polimerase tal como PCR. 0 termo "sonda" refere-se a uma estrutura compreendida por um polinucleótido que forma uma estrutura híbrida com uma sequência alvo, devido à complementaridade de pelo menos uma sequência na sonda com uma sequência na região alvo. As regiões polinucleotídicas das sondas podem ser compostas por DNA, e/ou RNA, e/ou análogos de nucleótidos sintéticos. Estão incluídas nas sondas "sondas de captura", "sondas bloqueadoras" e "sondas de marcação". 0 termo "iniciador" ou "iniciador de ácido nucleico" ou "sequência de iniciador de ácido nucleico" inclui oligonucleótidos de cadeia simples que, tipicamente, têm entre cerca de 4 até cerca de 100 bases, ou alternativamente entre cerca de 17 até 30 bases, ou alternativamente 20 ou mais bases, e são concebidos para hibridar com um molde de ácido nucleico correspondente. As moléculas iniciadoras podem ser complementares à cadeia de sentido ou à cadeia anti-sentido de um molde de ácido nucleico e são tipicamente utilizados como pares complementares que flanqueiam uma região de ácido nucleico de interesse. O termo "polimerase" inclui qualquer um de, ou uma mistura de, as enzimas de polimerização de nucleótidos, 28 ΡΕ2014671 DNA polimerase I de E. coli, fragmento de Klenow da DNA polimerase I de E. coli, T4 DNA polimerase, transcriptase reversa em que o molde é RNA e o produto da extensão é DNA, ou uma DNA polimerase termoestável. 0 termo "DNA polimerase termoestável" inclui uma DNA polimerase termoestável isolada de Thermus aguaticus, Thermus thermophilus, Thermus fili forrais, Thermus flavus, Pyrococcus furiosus, Thermo-coccus literolis, uma espécie Thermotoga, ou uma forma recombinante desta. 0 termo "amostra" ou "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo mas não limitado a, sangue, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, as secções externas da pele, tractos respiratórios, intestinais, e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, urina, células sanguíneas, tumores, fluido amniótico, órgãos, DNA genómico, RNA, ou cDNA em solução ou ligado a um substrato, e também amostras de cultura de células in vitro constituintes incluindo, mas não limitada a, meio condicionado resultando do crescimento das células em meio de cultura de células, putativamente células infectadas com virus, células recombinantes, e componentes celulares, e.g., cromossoma (s), organelos, tecidos embebidos em parafina, ou membranas isoladas de uma célula. A "cadeia de sentido" de um ácido nucleico contém a sequência que possui homologia de sequências com a do mRNA. A "cadeia anti-sentido" contém uma sequência que é complementar à da "cadeia de sentido". 29 ΡΕ2014671 0 termo "região alvo" refere-se a uma região do ácido nucleico que se quer amplificar e/ou detectar. 0 termo "sequência alvo" refere-se a uma sequência com a qual a sonda ou iniciador formará um hibrido estável sob condições desejadas. 0 termo "sequência de polinucleótido alvo" como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de polinucleótido que é compreendida por nucleótidos que são complementares a uma sequência de nucleótidos alvo; a sequência tem comprimento e complementaridade suficiente com a sequência alvo para formar um duplex que possui estabilidade suficiente para os objectivos pretendidos. 0 HCV possui pelo menos seis genótipos, e múltiplos subtipos em cada genótipo. Sequências que correspondem aos subtipos la e lb de HCV podem ser seleccionadas a partir de SEQ ID NOS :1-23 e SEQ ID NO: 64, apresentadas nas Tabelas IA e 1G. Sequências que correspondem ao subtipo 2a de HCV podem ser seleccionadas a partir das SEQ ID NOS: 24-27, apresentadas na Tabela 1B. Sequências que correspondem ao subtipo 2b de HCV podem ser seleccionadas a partir das SEQ ID NOS :28-42, apresentadas na Tabela 1C. Sequências que correspondem ao subtipo 3a de HCV podem ser seleccionadas a partir das SEQ ID NOS :43-46, apresentadas na Tabela ID. Sequências que correspondem ao subtipo 3b de HCV podem ser seleccionadas a partir das SEQ ID NOS :47-50, apresentadas na Tabela 1E. Sequências que 30 ΡΕ2014671 correspondem ao subtipo 4a de HCV podem ser seleccionadas a partir das SEQ ID NOS :51-63, apresentadas na Tabela 1F. As sequências da invenção, apresentadas como SEQ ID NOS :1-64, são definidas na Listagem de Sequências do pedido.

Numa forma de realização, os oligonucleótidos da presente invenção são pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, idênticos à sequência de nucleótidos apresentada como SEQ ID NO:23. Ainda noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NOS:23 tem pelo menos 4, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleótidos de comprimento. Será entendido que a extremidade 5' pode conter maior variabilidade (e.g., substituições de ácido nucleico), no entanto permanecer funcional (e.g., capaz de emparelhar com a porção NS3 e NS4 do genoma de HCV). A preparação da sequência de ácido nucleico da presente invenção é conhecida na técnica por vários meios, incluindo, por exemplo, através de métodos que incluem excisão, transcrição, ou sintese química. As sequências e/ou regiões alvo do genoma que são seleccionadas em relação à quais a sequência alvo de ácido nucleico são complementares dependem do objectivo. Por exemplo, se o objectivo é rastrear a presença de HCV em amostras biológicas (e.g., sangue), a sequência preferida de ácido nucleico seria utilizada como iniciador, e iria hibridar com regiões conservadas do genoma de HCV. Algumas das 31 ΡΕ2014671 regiões conservadas do genoma de HCV às quais a sequência de ácido nucleico da presente invenção se pode ligar são aqui descritas. Outras regiões do genoma que são conservadas são avaliadas por comparação das sequências de nucleótidos de vários isolados de HCV como aqui descrito.

Será entendido que a sequência de ácido nucleico da presente invenção não precisa de consistir apenas na sequência que é complementar à sequência de HCV alvo. Assim, a sequência de ácido nucleico da presente invenção pode conter adicionalmente, sequências de nucleótidos ou outras unidades que são adequados para os objectivos para os quais as sequências de ácido nucleico são utilizadas. Por exemplo, a utilização das sequências de ácido nucleico como iniciadores podem ser utilizadas para a amplificação de sequências de HCV via PCR, elas podem conter sequências que, quando em duplex, formam sitios de enzima de restrição que facilitam a clonagem das sequências amplificadas. A sequência de ácido nucleico da invenção pode ser utilizada como sonda para detectar a presença de polinucleótidos de HCV (por exemplo no rastreio para sangue contaminado), a amostra biológica a ser analisada, tal como sangue ou soro, pode ser tratado, se desejado, para extrair os ácidos nucleicos ai contidos. 0 ácido nucleico resultante da amostra pode ser sujeito a electroforese em gel ou outras técnicas de separação de tamanho; alternativamente, a amostra de ácido nucleico pode ser sujeita a transferência em gota sem separação de tamanho. De modo a 32 ΡΕ2014671 formar duplexes híbridos com a sequência alvo da sonda, a região alvo do ácido nucleico deve estar na forma de cadeia simples. Quando a sequência está naturalmente presente na forma de cadeia simples, não será necessária desnaturação. Todavia, quando a sequência está presente na forma de cadeia dupla, a sequência será desnaturada. A desnaturação pode ser realizada através de várias técnicas conhecidas na arte. Subsequentemente à desnaturação, o ácido nucleico do analito e a sonda são incubados em condições que promovem a formação híbrida estável da sequência alvo na sonda com a sequência alvo putativa no analito, e os duplexes resultantes contendo a(s) sonda (s) são detectados. A detecção do duplex resultante, se ocorrer, é normalmente realizado pela utilização de sondas marcadas; alternativamente, a sonda pode ser não marcada, mas pode ser detectável por ligação específica com um ligando que é marcado, seja directamente ou indirectamente. Os marcadores adequados, e métodos para marcar sondas e ligandos são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, marcadores radioactivos que podem ser incorporados através de métodos conhecidos (e.g., tradução ou tratamento com cinase de interrupção), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos desencadeados), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, e semelhantes.

As sequências de ácido nucleico de HCV amplifi- 33 ΡΕ2014671 cadas criadas a partir dos métodos aqui apresentados podem ser clonadas num vector hospedeiro com um promotor de expressão e utilizadas como uma vacina de DNA para amplificar a resposta de um doente ao virus HCV, proporcionando desse modo uma vacina de DNA especifica para o doente contra HCV. Noutra forma de realização, o clone pode ser utilizado para criar RNA para utilização como uma vacina anti-sentido. Numa forma de realização, é proporcionada uma vacina de HCV e empregue como um agente imunoterapêutico para a prevenção de HCV. Noutra forma de realização, é proporcionada uma vacina de HCV e empregue como um agente imunoterapêutico para o tratamento de HCV. A titulo de exemplo, uma vacina de HCV pode ser empregue para a prevenção e/ou tratamento de HCV num indivíduo, administrando a vacina por uma variedade de vias, e.g., intradermicamente, subcutaneamente, ou intramuscularmente. Adicionalmente, a vacina de HCV pode ser administrada juntamente com adjuvantes e/ou imunomodula-dores para reforçar a actividade da vacina e a resposta do indivíduo. Numa forma de realização, dispositivos e/ou composições contendo a vacina, adequados para libertação sustentada ou intermitente devem ser, implantados no corpo ou aplicados topicamente a este para a libertação relativamente lenta desses materiais no corpo. A vacina HCV pode ser introduzida juntamente com compostos imunomodu-ladores, que podem alterar o tipo de resposta imunitária produzida de modo a produzir uma resposta que será mais eficaz a eliminar o virus. 34 ΡΕ2014671 EXEMPLOS ESPECÍFICOS EXEMPLO 1

DIVERSIDADE GENÉTICA E RESPOSTA AO INTERFERÃO DO GENE DA PROTEASE NS3 DAS ESTIRPES CLÍNICAS DO VÍRUS DA HEPATITE C

Este exemplo descreve uma análise de diversidade genética natural no gene NS3, em que foi desenvolvido um método de PCR interna para obter dados da sequência NS3 de HCV directamente a partir das estirpes do doente. Os dados foram analisados para determinar a diversidade genética global, filogenia do virus, e selecção de variantes genéticas por terapia de interferão com ou sem ribavirina. Os efeitos da diversidade genética na estrutura da enzima utilizando modelação molecular foram determinados. Assim, foi desenvolvida uma abordagem exaustiva para facilitar a análise da variação genética natural neste gene e os seus efeitos na estrutura da proteína.

Um terço da região N-terminal do gene 3 não estrutural do vírus da hepatite C (NS3) codifica para uma protease serínica (ver Figura 1 em Holland-Staley, C. A., et al., 2002, supra).

Embora a diversidade genética tenha demonstrado ser extensa noutras regiões do genoma de HCV, tal como a 35 ΡΕ2014671 região do envelope, a extensão da diversidade na região da protease NS3 de HCV é em grande parte desconhecida. Consequentemente, o conjunto dos resultados aqui apresentados foi utilizado para determinar as taxas evolutivas do virus e para identificar os efeitos das mutações na estrutura da enzima. Para investigar a diversidade genética natural desta enzima foi desenvolvida uma reacção de PCR interna para obter resultados da sequência da protease NS3 directamente a partir das estirpes do doente. Estes resultados foram utilizados para determinar a diversidade genética, taxas flogenética e evolutiva, e selecção de variantes por terapia de interferão. 0 efeito potencial da diversidade genética na estrutura da enzima utilizando modelação molecular foi também tentado. Ao realizar estas experiências, foi estabelecida uma base de dados de sequências que ocorrem naturalmente. Esta base de dados é útil no desenvolvimento de nova terapia antiviral. A diversidade genética entre estirpes é importante devido à evidência de alguns tipos de HCV serem mais patogénicas do que outros Cooreman, M.P. et al. (1996) Hepatitis C virus: biological and clinicai consequences of genetic heterogeneity. Scand J Gastroenterol Supl 218: 106-115; Dusheiko, G. et al. (1994) Hepatitis C virus genotypes: an investigation of type-specific differences in geographic origin and disease. Hepatology 19:13-18; Stempniak, M. et al. (1997) O dominio da proteinase NS3 do virus da hepatite C é uma enzima contendo zinco. J Virol 71:2881-2886), i. e., HCV tipo 1 em relação a outros tipos, 36 ΡΕ2014671 e subtipo lb em relação ao subtipo la. A causa para um aumento da patogénese nestas estirpes não é clara. Descrever diferenças entre estirpes que têm uma progressão rápida da doença em comparação com aqueles que não a têm, ajudará a elucidar a possível causa e mecanismos da patogénese (Farei, P. et al. (2000) The outeome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the virai quasispecies. Science 288:339-344). Recentemente, Yanagi et al. (Yanagi, et al. (1998) Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype lb are infectious in vivo. Virology 244:161-172) demonstraram que o número de mutações no genoma de HCV pode estar directamente relacionado com a infecciosidade. Eles escolheram três clones de cDNA quiméricos da mesma fonte e chimpanzés inoculados. Dos três clones, apenas um era infeccioso. Este clone continha 3 substituições de aminoácidos quando comparados com a estirpe parental, enquanto que os clones não infecciosos continham 7 e 9 substituições de aminoácidos. Isto pode indicar uma selecção enviesada em chimpanzés devido a diferenças no sistema imunitário em vez de uma estirpe de HCV característica (Bassett, S.E. et al. (1998) Analysis of hepatitis C virus-inoculated chimpanzees reveals unexpected clinicai profiles. J Virol 72:2589-2599) . Noutro estudo, quando foi examinada a região hipervariável 1 (Shindo, M. et al. T (1996) The clinicai significance of changes in genetic heterogeneity of the hypervariable region 1 in chronic hepatitis C with therapy with interferon. Hepatology 24:1018-1023) foi demonstrado que quantidades mais elevadas de heterogeneidade estavam 37 ΡΕ2014671 associadas a uma resposta global mais fraca apesar do tratamento com interferão alfa. Adicionalmente, Chambers, T.J. et al. (Chambers, T.J. et al. (1991) Processing of the yellow fever virus nonstructural poliprotein: a cataly-tically active NS3 proteinase domain and NS2B are required for cleavages at dibasic sites. J Virol 65:6042-6050); estabeleceram que mutações com actividade afectada da protease NS3 do virus da Febre Amarela, eram letais para a replicação virai. O resultado destes estudos afirma a necessidade de caracterizar ainda mais o papel que a heterogeneidade desempenha na infecção com HCV. As composições e métodos da presente invenção proporcionam um mecanismo para essa caracterização. Filocamo et al., 1999. Selection of functional variants of the NS3-NS4A protease of hepatitis C virus by using chimeric sindbis virus. J Virol 73:561-575 utilizaram virus Sindbis (SBV) quimérico para analisar variantes da protease NS3/NS4A, contudo, o seu estudo utilizou uma protease clonada e baseou-se na maquinaria de replicação de SBV para produzir variação de sequências. Embora isto tenha permitido a caracterização de novas variantes de protease, estas variantes podem representar ou não aquelas obtidas a partir da replicação de HCV in vivo. Adicionalmente, Forns et al. (Forns X., et al. (1997) How Escherichia coli can bias the results of molecular cloning: preferential selection of defective genomes of hepatitis C virus during the cloning procedure. Proc Natl Acad Sei USA 94:13909-13914) descobriram, quando clonaram produtos de PCR de proteinas estruturais de HCV em E. coli, que ocorreu uma forte selecção para clones 38 ΡΕ2014671 deficientes e não ocorreu uma representação correcta da verdadeira diversidade genética. A razão para isto não é claro; todavia, a toxicidade para o hospedeiro de E. coli por proteínas virais pode desempenhar um papel. A sequenciação directa de amostras de doentes deve originar uma representação mais correcta da verdadeira diversidade genética. A maioria dos vírus de RNA possuem uma taxa de mutação elevada devido à falta de enzimas de controlo de leitura e porque se pensa que as polimerases dependentes de RNA produzem aleatoriamente um erro por cada ronda de replicação genómica (Drake, J.W. (1993) Rates of spontaneous mutation among RNA viruses. Proc Natl Acad Sei USA 90: 4171-4175). Por isso, se existirem 107”8 vírus produzidos por dia e a taxa de mutação for aleatória, então cada sítio irá teoricamente conter um número igual de mutações. Os resultados aqui apresentados, todavia, demonstram que não foi este o caso, indicando que embora as mutações fossem aleatórias, algumas regiões do vírus são mais permissivas a mutações do que outras regiões. Isto sugere que o vírus, ou pelo menos a região da protease NS3, está sujeita a outros constrangimentos funcionais. A localização das alterações de aminoácidos na protease NS3 de HCV de estirpes clínicas indica que as substituições de aminoácidos ocorrem em ambos os domínios dos terminais N- e C-. Foi já demonstrado que o domínio N-terminal de NS3 apresenta uma plasticidade estrutural na ligação de NS4A. Kim, J.L. et al. (Kim, J.L. et al. (1996) Crystal structure 39 ΡΕ2014671 of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell 87:343-355) e; Yan, Y. et al. (Yan, Y. et al. (1998) Complex of NS3 protease and NS4A peptide of BK strain hepatitis C virus: a 2.2 A resolution structure in a hexagonal crystal form. Protein Sei 7:837-847) relataram que o dominio N-terminal é flexível, uma vez que a ligação do NS4A conduz a ordenar no N-terminal 28 resíduos e provoca rearranjos locais para uma conformação cataliticamente mais favorável do sítio activo. A activação da protease NS3 pelo péptido NS4A conduz a um aumento de -950 vezes de hidrólise catalítica de péptidos que mimetizam a junção NS4A/NS4B (Yan. Y. et al. 1998 supra). Com base nas alterações estruturais previstas a partir das sequências de estirpes de HCV clínicas, crê-se que existirão alterações funcionais em relação à protease de tipo selvagem. Um exemplo de uma tal alteração seria a alteração da constante da taxa de pseudo-segunda-ordem (kcat/KM) para as várias estirpes clínicas. Uma segunda observação é que a variação estrutural do complexo NS3/NS4A de HCV deve ser construído na concepção com base na estrutura dos inibidores de modo a reter a eficácia contra uma vasta gama de isolados clínicos.

Para as estirpes de doentes 23 e 25, as diferenças na designação do subtipo entre a região não traduzida 5' e a região de protease NS3 é desconhecida, mas pode ocorrer devido à presença de mais do que um subtipo. A infecção simultânea com múltiplas espécies do vírus Dengue foi observada ocorrer (Gubler, D.J. et al. (1985) A case of 40 ΡΕ2014671 natural concurrent human infection with two dengue viruses. Am J Trop Med Hyg 34:170-173). Para a infecção com HCV, isto é mais provável devido a múltiplas transfusões de sangue ou infecções através de IVDA. Devido aos subtipos de HCV la e lb serem mais predominantes nesta distribuição geográfica, a probabilidade de eles poderem recombinar aumenta. A evidência da recombinação foi observada no virus Dengue, onde a diversidade genética ocorre quando a polimerase de RNA muda entre dois genomas diferentes durante a replicação, resultante num RNA híbrido (Holmes, E. C. et al. (2000) The causes and consequences of genetic variation in dengue virus. Trends Microbiol 8: 74-77). Este pode ser o caso com as estirpes 23 e 25, em que elas foram tipadas como HCVla com base na região 5' não traduzida, mas mais próxima do ciado de HCVlb pela sequência de nucleótidos da protease NS3. Os resultados de sequência foram limpos, e não apresentam evidência de mais do que uma espécie, sugerindo que a recombinação ocorreu antes do início de NS3. Todavia, a comparação da sequência de aminoácidos, todavia, apresentou resultados muito diferentes. O doente 23 tem 3 mutações quando comparado com o consenso de tipo la e 16 mutações quando comparado com o consenso de tipo lb. O doente 25 apresenta resultados semelhantes com 4 mutações quando comparado com o tipo la e 16 quando comparado com o tipo lb. As diferenças entre a análise da sequência de nucleótidos e a análise de proteínas são desconhecidas. Sem estar limitado pela teoria, crê-se que estas duas estirpes representam um novo subtipo, que cai na árvore evolutiva entre os subtipos la e lb. 41 ΡΕ2014671

Este exemplo revelou que existe uma variabilidade significativa nas estirpes clinicas de HCV em ambos os nucleótidos (30,2% para la e 25,8% para lb) e as sequências de aminoácidos (12,2% para la e 12,2% para lb) . A análise filogénica apresentou dois ciados distintos com dois isolados de HCV agrupando como um ciado irmão para lb. Para além disso, a análise estrutural revelou que a maioria das mutações reside no terminal N da enzima. Quando as estirpes foram classificadas em termos de o doente ter ou não recebida terapia antiviral, não foram encontradas diferenças no número ou localizações de mutações nas estirpes la. Todavia, as estirpes lb demonstraram uma queda global no número de posições que foram mutadas. Assim, este estudo demonstrou que existem diferenças significativas entre estirpes naturais que podem colocar um problema para o desenvolvimento de fármaco com base na estrutura, para o qual esta invenção proporciona uma solução. A relação entre a variação da sequência e alterações estruturais no complexo HCV NS3/NS4A pode também ser realizado através de cristalografia de raios X. Com base nas composições e métodos da presente invenção, fármacos antivirais, incluindo anti-HCV, podem ser concebidos e desenvolvidos com o conhecimento da variabilidade na estrutura no complexo NS3/NS4A das estripes clinicas de HCV para, no final, desenvolver terapias eficazes contra HCV. 42 ΡΕ2014671

MATERIAIS E MÉTODOS

Extracção de RNA Virai. 0 RNA de HCV foi isolado do soro do doente utilizando o "QIAamp virai RNA mini isolation estojo ("kit")" (Qiagen Inc., Valência, CA.). 0 isolamento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR e Amplificação de RNA Virai. A Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia pela

Polimerase (RT-PCR) seguido por uma 2a ronda de reacção de PCR 'interna' foi utilizada para amplificar o gene NS3 inteiro de subtipos de HCV la ou lb, de estirpes clinicas. Para o passo de RT-PCR, foi utilizado o "Promega Access Reverse Transcriptase PCR estojo ("kit")" (Promega Corporation, Madison, WI.) . Para isto, foram concebidos iniciadores oligonucleótidos flanqueadores do gene NS3 de HCV. 0 conjunto do iniciador 5' apresentado na SEQ ID N0:1 emparelha com 881 pb antes do inicio do gene NS3. 0 iniciador 3' apresentado na SEQ ID NO:2 emparelha 338 pb a jusante de NS3 e é utilizado para iniciar o passo de RT (Tabela 1G, SEQ ID N0S:l-4, SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO: 6,

subsecção "Amplificação"). Isto permite a produção de cDNA seguido por amplificação inicial da região desejada. A

mistura de amplificação continha 25 pmol de cada iniciador, 200 μΜ dNTPs, 2,5 U de AMV RT-polimerase, 2,5 U de DNA polimerase de Tfl, 1,5 mM de MgS04, e foi adicionado 20 pL 43 ΡΕ2014671 de RN A virai a um termociclador pré-aquecido (48 °C)

Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA.)· O protocolo de PCR consistiu num passo de RT a 48 °C durante 45 minutos, seguido por uma desnaturação inicial de 94 °C durante 2 minutos, e 35 ciclos de, 94 °C durante 15 segundos; 55 °C durante 20 segundos; 72 °C durante 2 minutos; e uma extensão final a 72 °C durante 10 minutos.

Para a reacção de PCR de segundo passo, o produto de PCR da Ia ronda foi amplificado utilizando iniciadores que emparelham dentro da reacção anterior, criando uma amplificação 'interna'. A reacção de PCR da segunda ronda utilizou o iniciador 5' apresentado como SEQ ID NO: 3 que emparelha 693 pb a montante de NS3 e o iniciador 3' apresentado como SEQ ID NO: 4 que emparelha 161 pb a jusante. A mistura de amplificação contendo 25 pmol de cada iniciador, 200 μΜ dNTPs, 2,5U Taq© DNA polimerase, 1,5 mM MgS04, e 5 pL do produto da Ia ronda foi adicionado a um termociclador pré-aquecido (94 °C) . A desnaturação inicial consistiu em 10 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos de, 94 °C durante 15 segundos; 55 °C durante 20 segundos; 72 °C durante 2 minutos e uma extensão final a 72 °C durante 10 minutos. O produto de amplificação resultante é uma única banda de 2746 pb num gel de agarose a 1%. O gene NS3 inteiro foi amplificado utilizando este método, todavia, apenas o gene da protease NS3 é aqui caracterizado. Os produtos do segundo passo de reacção foram purificados e concentrados utilizando o Protocolo "Gene Clean Spin" (Bio 101, Vista, CA.). Os produtos purificados foram utilizados 44 ΡΕ2014671 directamente para a sequenciação de DNA. Para assegurar que cada isolamento de RNA de HCV foi bem sucedido, os iniciadores que cobrem a região altamente conservada não traduzida 5' (5'-UTR) foram utilizados como controlo (Yuki, N. et al. (1997) Hepatitis C virus replicative leveis and efficiency of genotyping by specific PCR and antibody assay. J Clin Microbiol 35:1184-1189). Os produtos de PCR desta região de controlo foram também purificados como apresentado acima e sequenciados. Os resultados das sequências da região 5'UTR foram então utilizados para genotipar cada estirpe de HCV (0'Brien, C.B. et al. D (1997) cDNA sequencing of the 5' noncoding region (5' NCR) to determine hepatitis C genotypes in patients with chronic hepatitis C. Digestive Diseases and Sciences 42: 1087- 1093) . Se a segunda ronda de amplificação por PCR foi mal sucedida, foi realizada nova ronda de amplificação utilizando um segundo conjunto de iniciadores internos de ' backup '. 0 iniciador de 5' de 'backup' apresentado como SEQ ID NO:64 e o iniciador 3' 1 de 'backup' apresentado como SEQ ID NO:6 resultou num produto de amplificação de 2377 pb , que trunca o gene NS3 (região de helicase) em 19 pb.

Sequenciação de DNA. A sequenciação dos produtos de reacção de PCR do segundo passo purificados foi realizada utilizando a tecnologia de ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram utilizados cinco iniciadores 45 ΡΕ2014671 apresentados como SEQ ID NOS :7-11 (ver Tabela 1G, subsecção de "Sequenciação") concebidos para cobrir a região da protease NS3 em ambas as cadeias de sentido e anti-sentido.

Para a análise de ABI , as reacções das sequências foram corridas em placas de microtitulação utilizando um termociclador durante 25 ciclos de 96 °C durante 10 segundos ; 50 °C durante 5 segundos; e 60 °C durante 4 minutos. Os produtos de reacção foram purificados com

NaOAc/ETOH, ressuspensos em tampão de aplicação, desnaturados e corridos num sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems).

Análise de Sequências.

Os resultados das sequências do sistema ABI foram analisados utilizando o programa informático de análise de sequências ABI, versão 3.3. Sequências individuais foram alinhadas contra um consenso derivado dos resultados de sequências de todos os doentes e contra os tipos de HCV la e lb (Números de Acesso AF009606 e AJ000009) (Yanagi, M. et al. (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl Acad Sei USA 94:8738-8743; e Yanagi, M. et ai., (1998),. Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype lb are infectious in vivo. Virology 244:161-172). As duas sequências do Genbank foram seleccionadas para comparação porque eles estão disponíveis como construções clonadas para utilização como controlos positivos para 46 ΡΕ2014671 ensaios subsequentes de expressão de proteínas (resultados não apresentados). Os aminoácidos que diferem do consenso são comparados e utilizados para determinar que resíduos são conservados ou variáveis.

Análise Filogenética.

As sequências foram alinhadas utilizando o Sequencer 3.0, e o alinhamento múltiplo foi exportado como o ficheiro Nexus. A análise de Parsimónia foi corrida utilizando PAUP 3.1.1 (Swofford, D.L. (1993) PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony. 3.1 ed. Illinois Natural History Survey, Champaign, IL) com uma pesquisa heurística com troca de ramo. Para comparação, foi também utilizada uma opção de ramificação e ligação para pesquisar as árvores de maior parsimónia. Foi criada uma matriz de distâncias com base nas distâncias de Dois-Parâmetros de Kimura utilizando o programa DNADIST de PHYLIP Versão 3.573c (Felsenstein, J. (1993) PHYLIP (phylogenetic Inference Package), 3.5p ed. Department of Genetics,

University of Washington, Seattle). Foi utilizada uma taxa de transição para transversão de dois para um. A matriz de distância foi então analisada por Análise de Neighbor-Joining (NJ) utilizando o programa NEIGHBOR no PHYLIP. A análise de apoio de bootstrap foi executada utilizando 1000 reamostragens para ambas as Análises de NJ e Parsimónia. Os conjuntos de resultados múltiplos para o NJ foram criados pelo programa SEQBOOT e as árvores múltiplas foram determinadas para o consenso pelo programa CONSENSE, ambos 47 ΡΕ2014671 em PHYLIP. 0 bootstrap da Parsimónia foi completado utilizando a opção de bootstrap no PAUP. 0 número de sitios de segregação para cada população foi contado a partir dos alinhamentos múltiplos criados pelo Seguencher 3.0. A distinção de substituições sinónimas versus não sinónimas foi realizada com base nas traduções propostas das seguências. O parâmetro da população da mutação θ=2Νμ foi estimado de acordo com Watterson (Watterson, G.A. (1975) On the number of segregating sites in genetical models without recom-bination. Theoretical Pop Biol 7:256-276). Testes de neutralidade de acordo com McDonald e Kreitman (McDonald, J. et al. (1991) Adaptive protein evolution at adh locus in Drosophilia. Nature 351:652-654).

Modelação de estrutura de proteína por homologia. A modelação da estrutura de proteína por homologia por satisfação das restrições espaciais foi realizada de acordo com o método de Sali, et al., 1995 (Sali, A (1995) Comparative protein modeling by satisfaction of spatial restraints. Mol Med Today 1:270-277). A modelação de estrutura de proteína por homologia baseia-se na construção de um modelo estrutural de uma proteína com base na estrita semelhança com uma proteína molde de estrutura conhecida.

No primeiro estádio da modelação da estrutura da 48 ΡΕ2014671 proteína, foram obtidos os alinhamentos entre a sequência desconhecida e estruturas molde relacionadas. Em Segundo lugar, as restrições em várias distâncias, ângulos, e ângulos diédricos na sequência foram derivados com base no seu alinhamento com as estruturas molde. Finalmente, os modelos tridimensionais foram obtidos minimizando as violações de restrições de energia e derivados de homologia, utilizando gradientes conjugados e processos dinâmicos moleculares. Um passo importante nas experiências de modelação de proteína por homologia é a avaliação da qualidade do modelo. Para assegurar a qualidade, foram utilizadas verificações de consistência internas como implementado no pacote de software MODELLER 4 (Sali, A. et al. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol 234:779-815) para testar o perfil tridimensional.

Foi utilizado o pacote de software de modelação de proteínas comparativas MODELLER para calcular as estruturas do complexo HCV NS3/NS4. Este pacote de software foi testado exaustivamente em projectos genómicos estruturais por Sanchez e Sali, 1998 (Sanchez, R. et al. (1998) Large-scale protein structure modeling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Proc Natl Acad Sei USA 95:13597-13602). A estrutura de cristal de 2.2Â do complexo da protease NS3 de HCV e péptido NS4A (Yan, Y. et al. 1998, supra) foi utilizado como um molde para as experiências de modelação por homologia para examinar as alterações estruturais nas estirpes clínicas da protease NS3 de HCV. A 49 ΡΕ2014671 estrutura de cristal do complexo NS3/NS4A de HCV e as estruturas modeladas das proteases NS3/NS4A de HCV foram os quadrados mínimos superimpostos utilizando o programa suite 0 (Jones, T.A. et al. (1991). Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst A47: 110-11932. A optimização dos modelos NS3/NS4A de HCV foi realizada utilizando as condições por defeito de MODELLER 4.0 (número de iterações na optimização = 200; tipo de restrição não ligada = termos de repulsa de esfera mole dinâmica). O modelo é obtido por optimização de uma função objectiva (restrições espaciais combinadas e termos de energia de CHARMM estimulando a estereoquímica apropriada) no espaço Cartesiano. Números de Acesso das Sequências de Nucleótidos de GenBank.

As sequências de nucleótidos aqui descritas foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 9 de Abril de 2001 e foram-lhes atribuídos os Números de Acesso AF369214 até AF369263. Estes depósitos serão mantidos nos termos do tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Objectivos de Processo de Patente. Estes depósitos foram realizados meramente como conveniência para os especialistas da técnica e não uma admissão de que o depósito seja necessário sob 35 U.S.C. §112. 50 ΡΕ2014671

RESULTADOS

População de doentes.

Foram analisados os soros de trinta doentes infectados com os subtipos de HCV la ou lb. Foram incluídos dezoito homens e doze mulheres com uma idade média de 50,2 anos (intervalo, 21 - 76). Dezanove não tinham sido submetidos a qualquer tratamento, enquanto que os restantes 11 tiveram tratamento quer com α-IFN isoladamente (doentes 11, 183 e 205), α-IFN + ribavirina (pt. 176) ou um tratamento inicial de α-IFN seguido por uma segunda ronda de terapia de combinação (doentes 252, 174, 186, 1D, 1Y, 179, 25). Todos os doentes receberam 3 milhões de unidades, 3x por semana durante 12 meses, excepto os doentes 11. e 205, que receberam um segundo tratamento com terapia com oí-IFN de 5 milhões de unidades 4x por semana, e 1,5 milhões de unidades 3x por semana, respectivamente, e os doentes 186 e 1Y, aos quais a terapia foi terminada após 6 meses. Nenhum teve uma resposta sustentada. Todos os doentes tinham cargas virais de RNA de HCV entre 5,lxl04 e 2,3xl06 cópias/mL, como determinado utilizando o Teste de Monitorização de HCV Amplicor® da Roche.

Genotipagem. A região não traduzida 5' conservada foi sequen-ciada para colocar cada estirpe no respectivo genótipo 51 ΡΕ2014671 utilizando o método de 0'Brien et al. (0'Brien, C.B. et al. (1997) cDNA sequencing of the 5' noncoding region (5' NCR) to determine hepatitis C genotypes in patients with chronic hepatitis C. Digestive Diseases and Sciences 42:1087-1093). Os resultados dos genótipos demonstraram que 21 sequências eram do subtipo de HCV la e 9 eram do subtipo lb. Estes resultados são consistentes com a população de doentes, sendo os subtipos de HCV la e lb os mais prevalentes nesta região do mundo. Os resultados aqui apresentados demonstram uma correlação entre os resultados do genótipo 5'-UTR e os dados das sequências de NS3.

Amplificação e sequenciação da região NS3 de estirpes clínicas. O gene protease NS3 foi aqui sequenciado e amplificado com sucesso a partir dos soros de 30 doentes infectados com os subtipos de HCV la ou lb. O produto de amplificação produziu uma banda isolada com uma taxa de sucesso >80% (Figura 1). As sequências resultantes foram então traduzidas e uma sequência de consenso foi derivada do alinhamento de todas as sequências do doente. Cada sequência de doente foi comparada com uma sequência de consenso e contra as sequências protótipo encontradas no Genbank para cada subtipo (Genbank # AF009606 & # AJ000009) (Yanagi, M. et al., 1998, supra; ver também Yanagi, M. et al., 1998, supra). As regiões variáveis e conservadas nestas sequências foram então determinadas para ambos os resíduos de nucleótidos e de aminoácidos. 52 ΡΕ2014671

Análise da sequência de nucleótidos.

Existem 543 nucleótidos que codificam o gene da protease NS3. Os resultados das sequências foram analisados para determinar a distribuição de nucleótidos em cada posição quando comparada com a sequência de consenso derivada do doente e as duas sequências protótipo do Genbank. Para as estirpes que pertencem ao subtipo la de HCV, 164 posições continham uma ou mais substituições de nucleótidos quando comparadas com a sequência de consenso do doente, resultando numa variação de sequência global de 30,2% (resultados não apresentados). Estes incluíram 133 transições, 9 transversões e 22 sitios com ambas as transições e tranversões. Quando comparado com o protótipo la, 20 posições eram diferentes (variação de sequências global de 3,5%), com 17 posições contendo transições e 3 contendo transversões (Tabela 2A) . Não havia inserções ou deleções detectadas. Para a tipagem de estirpes como o subtipo de HCV lb, 140 posições continham uma ou mais substituições quando comparadas com a sequência de consenso do doente, para uma variação de sequências global de 25,8%. Havia 114 transições, 8 transversões e 18 sitios contendo ambas transições e transversões. Havia 38 posições que variavam da sequência do protótipo lb (global 7,4%), com 34 transições e 4 transversões (Tabela 2B) . Não foram detectadas inserções ou deleções em quaisquer sequências. Sem estar limitado pela teoria, devido à taxa de mutação prevista introduzida durante a amplificação por PCR ter 53 ΡΕ2014671 sido -0,1%, crê-se que os resultados apresentam uma representação rigorosa da variação da sequência genética natural.

Análise da sequência de aminoácidos. Há 181 aminoácidos que compreendem a protease NS3. Os efeitos da substituição de nucleótidos na sequência de aminoácidos demonstrou que a maioria das substituições era silenciosa. Para as sequências de 21 doentes pertencendo ao subtipo de HCV la, 22 residuos ou 12,2% diferiram do consenso da estirpe do doente (Tabela 3) . A sequência do protótipo diferiu do consenso do doente em 5 residuos (A40T, K80Q, A91S, I153L, E176G) incluindo uma mutação não encontrada em quaisquer sequências do doente (sublinhado). Três sitios tinham mais do que duas espécies de aminoácidos presentes (Vizmanos, J.L. et al., 1998, supra; Yanagi, M. et al. (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl Acad Sei USA 94:8738-8743), e um sitio (resíduo 86) foi capaz de tolerar 4 resíduos diferentes. Incluindo a sequência de controlo, 9 sítios tinham substituições do mesmo tipo de aminoácido, 9 sítios foram capazes de acomodar aminoácidos ou neutros ou polares, 3 sítios básicos ou polares, 2 sítios acídicos ou polares, e um sítio acídico ou neutro. Apenas duas estirpes eram idênticas ao consenso sem substituições de aminoácidos (K e 161). 54 ΡΕ2014671

Para as estirpes de doentes que foram tipadas como HCVlb, havia uma variação de sequência global de 12,2%, com 22 sitios diferentes do consenso derivado do doente (Tabela 4). 0 consenso do doente diferiu da sequência protótipo em 8 resíduos (L13V, V48I, Q80L, L94M, T98S, A150V, I153V, V170I) incluindo 4 sítios não previamente identificados (sublinhado), subindo o número total de sítios contendo um ou mais aminoácidos para 26. Mais do que duas espécies de aminoácidos estavam presentes nos 2 sítios (61 e 80), e os resíduos 67 tinha até 4 resíduos diferentes (o resíduo 86 não continha quaisquer mutações). O mesmo tipo de substituição foi observado em onze sítios, 8 sítios acomodaram quer aminoácidos neutros ou polares, 1 site básico ou polar, 2 sítios básicos ou neutros e o sítio restante tinha uma alteração de aminoácidos de neutro para aromático. Apenas a estirpe 153 era idêntica ao consenso. Para qualquer dos tipos la ou lb não foram encontradas substituições de aminoácidos nos resíduos conservados conhecidos.

Selecção por terapia com interferão

As diferenças mais significativas foram notadas quando as estirpes foram agrupadas de acordo com o hospedeiro ter ou não recebido terapia com interferão. Para estirpes que não foram sujeitas a terapia com interferão com ou sem ribavirão, o número global de mutações por doente apresentou uma média de 1,9 para as estirpes do tipo la, com 14 sítios contendo mutações. Após terapia com 55 ΡΕ2014671 interferão, o número de mutações por doente apresentou uma média de 2,6 com 15 sítios contendo diferentes aminoácidos. Apenas 7 sítios foram semelhantes antes e depois da terapia (Tabela 3) . Para as estirpes do tipo lb, o número médio de mutações por doente para as estirpes não sujeitas a terapia com interferão foi de 3,6 com 18 sítios de variação global. No entanto, após terapia com interferão, embora o número de mutações por doente não tenha sido significativamente diferente (3,0), o número de sítios que continha mutações nas estirpes lb caiu para 10, ou em 56% (Tabela 4) com 6 sítios semelhantes nas estirpes com ou sem terapia. Isto sugere que as estirpes sensíveis foram eliminadas durante a terapia com interferão e estes 10 sítios restantes podem de algum modo estar envolvidos na resistência do vírus ao interferão.

Resumidamente, as alterações de aminoácidos que ocorrem mais frequentemente são representadas por mutações de aminoácidos hidrofóbicos para hidrofóbicos seguidas por alterações de cadeias laterais positivamente carregadas para neutrais. A taxa de mutações de uma cadeia lateral mais densa para uma menos densa ocorre a uma maior taxa e vice-versa. Em estirpes do tipo lb, a diversidade de sequências na protease NS3 é significativamente reduzida em estirpes de doentes que estiveram sujeitos a terapia com IFN. Isto sugere que as estirpes sensíveis são eliminadas durante terapia com interferão e que estas estirpes que permanecem após terapia podem ser menos sensíveis ao fármaco. ΡΕ2014671 56

Análise Filogenética e Evolução Molecular. A análise de parsimónia utilizando uma pesquisa heurística com permuta de ramos detectou 141 árvores igualmente parcimoniosas com 696 passos. Uma opção comparável de ramo e ligação detectou 144 árvores igualmente parcimoniosas com 696 passos. As sequências são agrupadas em mais de 95% das árvores em dois ciados, os ciados HCVla e HCVlb. 0 ciado HCVla consiste em 19 estirpes (K, 4,11,12, 24, 161 , 170, 174, 176, 177, 183, 186, 194, 252, 1C, 1D, 1H, >< \—1 e 1Y) em vez de 21 como identificado com genotipagem. As restantes amostras (1, 23, 25, 153, 179, 205, IA, 1G, 1U, 2D, e 2F) agruparam com HCVlb. Estes resultados são fortemente apoiados na análise "bootstrap", embora as relações hierárquicas nos dois ciados não sejam fortemente suportadas (Figura 2A). Em particular, a Figura 2A apresenta uma árvore de consenso da análise de parsimónia. O comprimento dos ramos é estendido para coincidir com os grupos hierárquicos e não reflecte os passos mutacionais entre estirpes. No ciado de HCVlb, as duas estirpes 23 e 25 são taxa irmãs das restantes estirpes. Estas duas amostras, 23 e 25, agruparam com o tipo HCVla por genotipagem e comparação de sequências de aminoácidos. A Figura 2B apresenta uma árvore de bootstrap da análise de Neighbor-joining. A análise de Neighbor-Joining produziu resultados muito semelhantes à análise de 57 ΡΕ2014671 parsimónia indicando um ciado HCVlb bem separado consistindo nas estirpes 1, 1G, 153, 2D, IA, 179, 2F, 1U, e 205 (Figura 2B) . Os bootstrap apoiam os ciados, como aqui apresentado, estão indicados ao lado dos seus ramos apropriados. Adicionalmente, s comprimentos dos ramos estão à escala das distâncias genéticas.

As estirpes 23 e 25 agrupam novamente como uma linhagem irmã com o ciado HCVlb. Estes resultados, juntamente com s dados de aminoácidos, sugerem que a sua representação de um terceiro ciado geneticamente diferenciado. As relações hierárquicas nos dois ciados principais diferem em grande medida daquelas de uma árvores de Parsimónia de consenso, mas nenhuma das diferenças são fortemente suportadas no bootstrap de NJ. O ciado HCVlb é apoiado em 100% das amostragens de bootstrap. O agrupamento separado 23-25 é apoiado em 97,4% das amostragens de bootstrap. No ciado HCVla, as estirpes 4 e 1Y são monof iléticas com 84,9% de apoio, e 11, 170, e 177 são monofiléticas com 66% de apoio.

Análise das taxas evolutivas.

As taxas de evolução de populações para as três linhagens foram estimadas de acordo com (Watterson, G.A., 1975, supra). Os estimadores de Θ (± D.P.) para HCVla, HCVlb, e os PT's 23-25 são 42,28 ± 53,77, 49,49 ± 61,81, e 40 ± 40,50, respectivamente. Deste modo, não há indicação de taxas diferenciais de evolução ocorrendo entre as três 58 ΡΕ2014671 linhagens. Os testes de evolução não neutra entre as duas linhagens principais HCVla e HCVlb foram executados utilizando o método de McDonald e Kreitman (McDonald, J. et al. (1991) Adaptive protein evolution at adh locus in Drosophilia. Nature 351:652-65441). Em neutralidade, a proporção de sitios de agregação sinónimos e não sinónimos devem ser constantes dentro e entre as populações. Em comparações das populações HCVla e HCVlb, o valor de χ2 é 2,30 indicando não haver desvio significativo das expectativas neutras para desvio de sequência entre as duas populações.

Modelação molecular.

Experiências de modelação por homologia de proteínas do complexo protease NS3/NS4A de HCV foram realizados com o molde da estrutura de cristal 2,2 Â da protease NS3 e do péptido NS4A de (Yan, Y. et al., 1998, supra); para examinar as alterações tridimensionais devidas à variação da sequência em estirpes clinicas. As estirpes mais divergentes foram seleccionadas para modelação. O foco foi colocado nos subtipos A e B e, por isso, foram seleccionados dois isolados de subtipo IA altamente divergentes e dois muito diferentes em termos de sequência, pertencendo ao subtipo 1B para estes estudos. Foram seleccionadas quatro estirpes clinicas (252, 1G, 1H, e 1U) para experiências de modelação. Duas das estirpes (252 e 1H) pertencendo ao subtipo la e as outras duas estirpes (1G e 1U) pertencendo ao subtipo lb. As mutações ocorrem mais 59 ΡΕ2014671 frequentemente em regiões de ansa ou nos terminais das cadeias β. As mutações também ocorrem nas hélices cx de NS3.

Os modelos de homologia para as sequências de consenso de HCVla ou HCVlb utilizando a estrutura de cristal do complexo NS3/NS4A de (Yan, Y. et al., 1998, supra) foram computadas com o programa suite MODELLER. Os modelos para o consenso de la e lb foram superimpostos para análise detalhada (ver Figura 4 em Holland-Staley, C. A., et al., 2002, supra), que indica as maiores diferenças entre os dois subtipos. Para além disso, foram observadas diferenças tanto no sitio activo como noutras posições. Existem diferenças distinguiveis nas posições de três residuos da triade catalítica, Asp81, His57 e Serl39. Os resultados da modelação sugerem diferenças funcionais para os dois subtipos.

Os modelos para as estirpes clinicas de HCV 252, 1G, 1H, e 1U que contêm alterações de aminoácidos múltiplas foram superimpostas na estrutura de cristal do complexo NS3/NS4A selvagem de Yan, Y. et al. , 1998, supra. 0 complexo NS3/NS4A da estirpe 1G foi comparado com a estrutura de cristal selvagem (ver Figura 5 em Holland- Staley, C . A., et al ., 2002, supra) . Existem diferenças distinguiveis nas posições dos três residuos para a triade catalítica (Asp81, His57 e Serl39). Foram observadas diferenças potenciais semelhantes para as estirpes 252, 1H e 1U (resultados não apresentados) (Holland-Staley, C. A., et al. (2002) Genetic diversity and response to IFN of the 60 ΡΕ2014671 NS3 protease gene from clinicai strains of the hepatitis C virus. Arch Virol 147:1385-1406), que é aqui incorporado por referência. EXEMPLO 2

UMA DIMINUIÇÃO NA DIVERSIDADE GENÉTICA NO GENE DA NS3 HELICASE DE ISOLADOS CLÍNICOS DO VÍRUS DA HEPATITE C CORRELACIONA-SE COM A TERAPIA COM INTERFERÃO

Este exemplo descreve os efeitos da terapia com interferão (com ou sem ribavirão) no gene da helicase NS3 de doentes infectados com HCV do tipo la ou lb. para isto, foi desenvolvida uma reacção de PCR interno, que permite a recuperação dos dados da sequência NS3 de HCV sequência directamente dos isolados do doente. Para analisar os efeitos da terapia com IFN, foi preparada uma sequência de consenso derivada do doente e utilizada para determinar o número global de mutações em cada isolado clinico. Depois as sequências foram agrupadas por o doente ter sido ou não sujeito a terapia com IFN (naive vs experimentados), e o número de posições que foram mutadas foi analisado. Estas mutações foram também utilizadas para prever a resposta a IFN. Os resultados demonstram que um decréscimo significativo na variabilidade geral da sequência ocorre nos isolados que foram sujeitos a terapia com IFN. Deste modo, a presente invenção proporciona um método para analisar os efeitos de IFN no gene NS3 de HCV e determinar os seus efeitos na população de quasiespécies. ΡΕ2014671 61

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras de Doentes e Extracção de RNA Virai. 0 soro de quarenta e três doentes infectados com os subtipos la ou lb de HCV foi analisado. Foram incluídos vinte e três homens e vinte mulheres com uma média de idade de 51,1 anos (intervalo, 21 - 76). Vinte e nove tiveram um

tratamento naíve, enquanto que os restantes 14 tiveram um tratamento com interferão isolado ou combinado com ribavirão. Todos os doentes possuíam cargas de RNA de HCV virai entre 5,lxl04 e 2.3xl06 viriões/mL como determinado utilizando o Roche Amplicor® HCV Monitor Test. 0 RNA de HCV foi isolado de soro de doentes utilizando o QIAamp virai RNA mini isolation estojo ("kit") (Qiagen Inc., Valência, CA.). isolamento foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR e Amplificação de RNA Virai. A Reacção de Transcriptase Reversa - Polimerase em Cadeia (RT-PCR) seguida por uma 2a ronda de reacção de PCR 'interna' foi utilizada para amplificar na totalidade o gene de NS3 de HCV dos subtipos la ou lb, a partir de isolados clínicos. 0 passo de RT-PCR utilizou o Promega Access Reverse Transcriptase PCR estojo ("kit") (Promega Corporation, Madison, WI.) . Para isto, foram concebidos dois oligonucleótidos iniciadores de flanco do gene. 0 62 ΡΕ2014671 iniciador 5' (5'- CTA CTC CTG CTC CTG CTG GCG TT -3') emparelha 693 pb antes do inicio do gene NS3. 0 iniciador 3' (5'- CTG ATG AAA TTC CAC ATG TGC TTC GCC CA - 3') emparelha 338 pb a jusante de NS3 e é utilizado para iniciar o passo de RT. Isto permite a produção de cDNA seguido pela amplificação inicial da região desejada. A mistura de amplificação contendo 25 pmol de cada iniciador, 200 μΜ de dNTPs, 2,5 U de RT-polimerase de AMV, 2,5 U de Tfl DNA polimerase, 1,5 mM de MgSCy e 20 pL de RNA virai foram adicionados a um termociclador pré-aquecido (48 °C) Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA.). O protocolo de PCR consistiu de um passo de RT a 48 °C durante 45 minutos, seguido por uma desnaturação inicial a 94 °C durante 2 minutos, e 35 ciclos de, 94 °C durante 15 segundos; 55 °C durante 20 segundos; 72 °C durante 2 minutos; e uma extensão final de 72 °C durante 10 minutos.

Para o segundo passo da reacção de PCR, o produto da Ia ronda de PCR foi amplificado utilizando iniciadores, que emparelham internamente à reacção anterior, produzindo uma amplificação 'interna'. A segunda ronda de reacção de PCR utilizou o iniciador 5' (5'- GAG CCC GTC GTC TTC TC -3') e o iniciador 3' (5'- CAC TCT TCC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG -3'). A mistura de amplificação contendo 25 pmol de cada iniciador, 200 pM de dNTPs, 2,5 U de Taq© DNA polimerase, 1,5 mM de MgS04 e foram adicionados 5 pL do produto da Ia ronda a um termociclador aquecido (94°C). A desnaturação inicial consistiu de 10 minutos a 94 °C, seguido por 35 ciclos de, 94 °C durante 15 segundos; 55 °C 63 ΡΕ2014671 durante 20 segundos; 72 °C durante 2 minutos e uma extensão final a 72 °C durante 10 minutos. O produto de amplificação resultante é uma banda única de 2219 pb num gel de agarose a 1%. A totalidade do gene NS3 foi amplificado utilizando este método. No entanto, apenas o gene da helicase de NS3 é aqui caracterizado. Os produtos do Segundo passo da reacção foram purificados e concentrados utilizando o Gene Clean Spin Protocol (Bio 101, Vista, CA.). Os produtos purificados foram utilizados directamente para sequenciação de DNA. Para assegurar que cada isolamento de RNA de HCV era bem sucedido, os iniciadores que cobrem a região 5'-não traduzida (5'-UTR) altamente conservada foi utilizada como um controlo (Yuki, 1997 #226) . Os produtos de PCR desta região de controlo foram também purificados como acima e sequenciados. Os dados da sequência da região 5'UTR foram então utilizados para o genótipo de cada HCV isolado (0'Brien, 1997 #30). Se a amplificação não foi bem sucedida, foi realizada uma nova ronda de RT-PCR utilizando um segundo iniciador 3' de 'backup'. Um iniciador 3' de backup (5'- GCC GAC ATG CAT GYC ATG ATG TAT TT -3') resulta num produto de amplificação de 2039 pb, que trunca o gene NS3 em 20 pb.

Sequenciação de DNA A sequenciação dos produtos de reacção de PCR do segundo passo purificados foi realizada utilizando a tecnologia de ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Foram utilizados onze iniciadores (A-K) 64 ΡΕ2014671 concebidos para cobrir a região de helicase NS3 em ambas as cadeias de sentido e anti-sentido. Os iniciadores de sentido são: A(5'-TCG GAC CTT TAC TTG GTC ACG AG-3'), B(5'-TAC TCC ACC TAT GGC AAG TTC CT-3')f C(5'-CAT CTC ATY TTC TGC CA-3 ' ) , D (5 ' -GAG TGC TAT GAC GCG GGC TGT GCT T-3'), E (5 ' -CCA TCG TGG GAY CAA ATG TGG AAG TGT-3' ) , F(5'-AAA TAC ATC ATG RCA TGC ATG TCG GC-3') . Os iniciadores de anti-sentido são: G(5'-AGG AAC TTG CCA TAG GTG GAG TA-3'), H(5'-GAG TGG CAC TCA TCA CA- 3'), 1(5'-TCG ACT GTC TGR GTG ACA CA-3'), J(5'-GCC GAC ATG CAT GYC ATG ATG TAT TT-3'), K(5'-CAC TCT TCC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG-3'). Para a análise de ABI, as reacções de sequenciação foram corridas em placas de microtitulação utilizando um termociclador para 25 ciclos de 96 °C durante 10 segundos; 50 °C durante 5 segundos; e 60 °C durante 4 minutos. Os produtos de reacção foram purificados com NaOAc/ETOH, ressuspensos em tampão de aplicação, desnaturados e separados num sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems).

Análise de Sequências.

Os resultados de sequenciação de ABI foram analisados utilizando o software de análise de sequências de ABI versão 3.3. As sequências individuais foram alinhadas contra um consenso derivado de todas as sequências dos doentes e contra HCV dos tipos la (Número de acesso AF009606) e lb (Número de acesso AJ000009) depositados no Genbank (Yanagi, 1997 #227) (Yanagi, 1998 #228) . As duas sequências do Genbank foram seleccionados 65 ΡΕ2014671 por comparação porque estas estão disponíveis como construções clonadas para utilização como controlos positivos para subsequentes ensaios de expressão de proteína (resultados não apresentados). Os aminoácidos que diferem do consenso são comparados e utilizados para determinar que resíduos são conservados ou variáveis. Números de Acesso no GenBank das Sequências de Nucleótidos.

As sequências de nucleótidos aqui descritas foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 9 de Abril de 2001 e foi-lhes atribuído os Números de Acesso AF369214 até AF369263. Estes depósitos serão mantidos nos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Efeitos de Processo de Patente. Estes depósitos foram realizados meramente como uma conveniência para s especialistas na técnica e não é uma admissão de que é necessário um depósito de acordo com 35. U.S.C. §112.

RESULTADOS

Análise de Sequências do gene da helicase NS3 de HCV.

Uma reacção de PCR interna foi utilizada para 66 ΡΕ2014671 amplificar e sequenciar o gene da helicase NS3 de HCV dos soros de 43 doentes infectados com HCV dos subtipos la ou lb. A região conservada não traduzida 5' foi utilizada para colocar cada isolado no respectivo genótipo utilizando o método de 0'Brien et al. Os resultados dos genótipos demonstram que 30 sequências foram HCV subtipo la e 13 foram subtipo lb. Estes resultados são consistentes com a população de doentes, sendo os subtipos la e lb de HCV os mais prevalentes nesta região do mundo. A partir dos resultados das sequências de NS3, foi criada uma sequência de consenso derivada do doente e utilizada para determinar a variabilidade genética dos doentes isolados para a distribuição de nucleótidos e substituição de aminoácidos.

Nas sequências analisadas, foi identificada variação significativa na sequência de nucleótidos e aminoácidos. Existem 1350 nucleótidos que codificam o gene da helicase NS3. Os resultados das sequências foram analisados para determinar a distribuição de nucleótidos em cada posição quando comparado com a sequência de consenso derivada do doente e as duas sequências de protótipo do Genbank (Genbank # AF009606 & # AJ000009). Para estes isolados que pertencem ao HCV subtipo la, 436 posições continham uma ou mais substituições de nucleótidos quando comparadas com a sequência de consenso do doente, resultando numa variação de sequência global de 32,30%. Estas incluíram 355 (26,30%) transições, 30 (2,22%) transversões e 51 (3,78%) com ambas transições e 67 ΡΕ2014671 transversões. 0 protótipo HCVla diferiu em 34 posições (variação da sequência global de 2,52%), com 30 posições contendo transições e 4 contendo transversões. Não foram detectadas inserções ou deleções nem nas sequências de doente nem do protótipo. Para tipagem dos isolados como HCV subtipo lb, 390 posições continham uma ou mais substituições quando comparadas com a sequência de consenso do doente, para uma variação de sequência global de 28,89%. Existiram 309 (22,89%) transições, 36 (2,67%) transversões e 45 (3,33%) contendo ambas transições e transversões. Existiram 55 posições na sequência do protótipo HCV lb que foram diferentes do consenso derivado do doente, com uma diferença de sequência global de 4,07%, com 47 transições e 8 transversões. Não foram detectadas inserções ou deleções em quaisquer sequências. Uma vez que a taxa de mutação prevista introduzida durante amplificação por PCR é ~0,1%, crê-se que os resultados aqui apresentados apresentam uma representação rigorosa da variação da sequência genética natural.

Existem 450 aminoácidos que compreendem a protease NS3. Os efeitos da substituição de nucleótidos na sequência de aminoácidos demonstrou que a maioria das substituições foram silenciosas. Para as 30 sequências de doentes que pertencem ao HCV subtipo la, 65 residuos ou 14,44% diferiram do consenso derivado de doentes (Tabela 5A). A sequência publicada diferiu do consenso do doente em 5 residuos. A maioria dos sitios tinha substituições de uma 68 ΡΕ2014671 única espécie, 6 sitios tinham presentes três espécies de aminoácidos, com 2 sitios (resíduos 334 & 383; numeração em NS3) capazes de tolerar 4 resíduos diferentes. Incluindo a sequência de controlo, 38 sítios tinha substituições do mesmo tipo de aminoácidos, 20 sítios foram capazes de alojar quer aminoácidos neutros ou polares, 2 sítios básicos ou polares, 2 sítios acídicos ou polares, 1 sítio básico ou neutro, 1 sítio acídico ou neutro, e 1 sítio básico, polar ou neutro. Apenas 1 doente (pt. 186) foi idêntico ao consenso sem substituições de aminoácidos. A Tabela 5A sumariza estas mutações que ocorrem em mais do que uma sequência de doente.

Para doentes isolados que foram tipados como HCV lb, havia uma variação de sequência global de 11,33% com 51 sítios diferentes do consenso derivado do doente (Tabela 5B) . O consenso do doente diferiu da sequência de GenBank em 13 resíduos, incluindo 4 novos resíduos, levando o número total de sítios contendo um ou mais aminoácidos para 55 ou 12,22% de variação de sequências. Três espécies de aminoácidos estavam presentes em 9 sítios, com o resíduo 402 capaz de possuir 5 aminoácidos diferentes e o resíduo 470 possuindo 7 aminoácidos diferentes. Foi observado o mesmo tipo de substituição de aminoácidos em 26 sítios, enquanto que, 20 sítios foram capazes de alojar quer aminoácidos neutros ou polares, 5 sítios básicos ou polares, 1 sítio acídico ou polar, 1 acídico ou básico e dois sítios podem alojar aminoácidos neutros ou polares ou 69 ΡΕ2014671 básicos (Tabela 5B). Nenhum doente era idêntico à sequência de consenso. A diferença entre as sequências de consenso para HCV tipos la ou lb apresentou uma semelhança global de sequências de aminoácidos de 96,4%. Os motives conservados eram surpreendentemente semelhantes diferindo em apenas 4 residuos (259, 263, 269 & 270). Não foi possível fazer uma correlação entre as mutações nos HCV tipos la e lb. Entre todas as sequências, não foram encontradas substituições de aminoácidos nos resíduos que são homólogos em função das de outras helicases na mesma família (resíduos a sombreado nas Tabelas 5A e 5B) . No entanto, foram encontradas várias mutações nos sete motives e na sua vizinhança mais próxima. Ocorrem mais substituições apenas numa sequência, sugerindo uma substituição aleatória devido à incorporação errada de bases pela RT polimerase. As sequências de HCVla não apresentam substituições no motivo I, 1 substituição de L226I no motivo Ia (pt. 4C) , 1 substituição de S263G no motivo de ligação ao ácido nucleico (pt. 4B) , 1 substituição V329I no motivo III (pt's. 23, 24, 270, 1H, IX, 3T, 1C), 2 substituições no motivo IVa; K371 R (pt. 1D) e K372R (pt's 4 e 1C), e 3 substituições no motivo V; A410S (la controlo), A410T (pt. 3S) e F418Y (pt' s. 4, 12, 177, 194, 198, 3P, 3S, 3T, 4C, K, e 174) . O primeiro motivo de porteiro tinha 1 substituição, S424T (pt's IX e K), o motivo VI tinha 5 substituições; R458S (pt. 3S), T459S (pt. 5P) , R461L (pt. 3S) , K469R (pt' s. IX, 5P, 174 e 183) e 70 ΡΕ2014671 P470Q (pt. 4C), e o último motivo porteiro tinha 3 substituições; D496N (pt. 38), A497T (pt. 11) e G498S (pt. 4B) . De todas as mutações, as substituições no motivo IVa foram as mais surpreendentes uma vez que estes dois resíduos de lisina, nas posições 371 e 372, demonstraram ser importantes na estabilização da cadeia ss de ácido nucleico. A alteração de aminoácidos de lisina para arginina em ambos os cases indica uma necessidade para um aminoácido básico nesta posição. Outra substituição que foi interessante ocorreu na posição 410 no motivo V. Isto foi interessante porque a sequência do protótipo continha uma serina em vez de uma alanina, está uma serina nesta posição na maioria das sequências publicadas, no entanto, a sequência aqui apresentada identificada na SEQ ID NO:l apresentou uma presença de alanina no consenso derivado do doente excepto para um doente que tinha uma treonina nesta posição (pt. 3S) . As posições 229, 418 e 469 demonstraram ser interessantes porque vários doentes continham estas substituições, no entanto, o seu significado permanece desconhecido.

As substituições de aminoácidos nos isolados HCVla nas posições fora dos motivos existentes demonstraram uma prevalência mais elevada de mutações nas várias regiões. Uma alteração de isoleucina para valina na posição 248 ocorreu em 9 de 30 doentes com HCVla. Os resíduos circundantes de 240 para 252 também apresentaram um grau de mutação elevado. O resíduo 281 pode ser ou glicina 71 ΡΕ2014671 (consenso) ou arginina (7 doentes). Isto é surpreendente porque a transição é desde uma cadeia simples até uma cadeia lateral volumosa. Outras regiões que contêm frequência de substituição mais elevada eram desde o residuo 229 até 358 e 382 até 386, residuos 455 até 461, residuo 557 e o terminal COOH. 0 motivo I nas sequências HCVlb tinha 1

substituição, K213R (pt's. 3N e 3Q), nenhuma substituição em Ia, 3 no motivo de ligação ao ácido nucleico; A263G (controlo), P264S (controlo, pt's IA, 2D, 3N, 6A) e I265V (pt. 3Q) . 0 motivo II tinha 2 substituições; I288M (pt. 1U) , e T295I (pt. IA) , os motivos III e IVa não continha quaisquer mutações, enquanto que o motivo V continha 2; V406A (pt. 30) e F418Y (pt. 3Q) . Ambos os motivos porteiro não continham mutações. O motivo VI continha 1 na posição 470. Esta mutação foi significativa na qual foram encontrados um total de 7 aminoácidos: R470S (controlo e pt. 6A), R470M (pt's. 1G, 1U e 3N), R470G (pt's 179 e 3Q), R47 0V (ptl28) , R470P (pt. 30) e R470A (pt. 1). Foram encontradas semelhanças com HCVla nas regiões fora dos motivos conhecidos. As posições 240 até 256, 334 até 358, 382 até 386 e o terminal COOH continha regiões 'quentes'.

Os Efeitos do Tratamento com IFN.

As diferenças mais significativas foram registadas quando os isolados foram agrupados de acordo com o 72 ΡΕ2014671 hospedeiro ter ou não recebido terapia com interferão. Uma diminuição global significativa na variabilidade das sequência em ambos os tipos de HCV la e lb foi evidente após terapia com IFN com ou sem ribavirina. Deste modo, o interferão desempenha um papel na selecção de quasiespécies.

Para os isolados HCVla que não tinham sido sujeitos a terapia com interferão, o número global de mutações por doente era em média 6,47 por sequência. Foram afectados um total de 59 resíduos diferentes. Após terapia com interferão, o número de mutações era em média 5,0 por doente com 25 sítios contendo diferentes aminoácidos produzindo uma quebra global de 56,14% nas posições mutadas (Tabela 5A). Para os isolados de tipo lb, o número médio de mutações por doente para isolados não sujeitos a terapia com interferão foi de 8,9 com 53 sítios de variação global. No entanto, após terapia com interferão, o número de mutações por doente foi 6,33, e o número de sítios que continham mutações caiu dramaticamente nos isolados lb para apenas 16, ou em 69, 78% (Tabela 5B) . Isto sugere que as estirpes sensíveis foram eliminadas durante terapia com interferão e estes sítios restantes podem de alguma forma estar envolvidos na resistência do vírus ao interferão. Não foram registadas diferenças em qualquer dos tipos la ou lb para os isolados que foram sujeitos a terapia de combinação com ribavirina em oposição ao interferão isoladamente, e não foi possível obter uma correlação entre o número ou posições de mutações e a carga virai. ΡΕ2014671 73 TABELA la SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA i 25mi í'- CCTGCITGTGOArOATG -3> 5622L S'.CT0ATGA.4.ArrCCA6JA-rGTGCITCGCCCA - 3' 3 zmu 5f- CTACTCCTGCTCCTGCTGGC0TT -3' 4 mu. r^CTCTrCCÁTCTCAfmAÁCTCCTOGTAGAG -3 ’ 5 meu .?·- GTGTGGGTYCCCCCCCTCAAC -3* 6 S2Ê8L 50 GCCGACATGCATGYCATGATGTATíT -3! 7 la and 5b 33S4U 5’· GAGCCCCTCGTCTTCTC -3* 8 34S6U 5'- GGCCGGGACAASAACCA -3’ 9 3723U 5'- TCGGACCnTACTTGGTCACGAG 4Γ 1» 424QL 5’- AGGAACTTGCCWTAGGTGGAGTA -3’ Π 37531. 5'- OGCCGGCGCACCGGAATGAC ATC -3 ’ 12 42180 5’- TACTCGACCTATGGCAAGTTCC7 -3 ’ 13 48960 5'* ÔAGimCTAlOACGCGGCÍCTGTGCTT -3' 14 42841. 5*- GAGTGGCACTCATCACA ~T 15 45090 5’- CATClOATYTTCTGCeA -3’ 1« 47100 S^TCGACTGTGTGRGTG ACACA -3* 17 5Í45U 5*. CCATCGTGGGAYCAAATGTGGAAGTGT-3' 18 S28SO 5’- AAATACATCATGRCATGCATGTCGGC-3’ 19 56220 5·- TGGGCGáAGCACaTCTGOAATTTCATCAG -3’ 2« 59930 5'- GGCATCGTCrcrrCCTGGIGCCCT-3' 21 5790! y-CACccAYCccca;'a akatgtt ~s · 22 31270 5’- CCGORGCiTCATTAYGTSCAAATGG -3* 2» 57O0L 5** CGCGGGGTTTCCAGGCAG ~ 3’

TABELA 1B SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA | n ! KCVSalM 5*' GGC acy tac atc tat c»ày ca ~y 25 I HCV2sU-2 5'-TCA TCT TCA GTC CGA TGG AGA-3* Γ 36 : KCV2aL-! SATO CCG GTE ATC AAR TTC CÂC AT -3* j * 27™ ! HCV2aL-2 ! 5’-CTG AAY GCC ATC ATC GAR GCC A -3'

TABELA 1C SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA ~ 28 29 HCVÍblM 5*- CCA ATG GAG AAG AAG GTC A -3' · HCV2&U-2 5’. ATG TCG ACA CAT CCT GCA ~3* a» 33 HCV2bL“ 1 5 ’* TTG TGG CCT GTT GTA ÕGA ~3 * HCV2b3A2 5’- OCO CAT TCT TCC ATC TCA -3' St 2b HCV2b sealíl 5’» CCG AAA COC TCA YGT CAT-3’ 33 HCV2b S£5CtU2 3 ’«GGA TGG AGG CTC CTC AGC -3 ’ 34 HCV2b ssqU3 5’» AQA CCC ÓÃC CTT TAC CAT -3’ 85 36 HCV2bs«fU4 3'- TTA CCC GTC TCT CAA GAC CA -3* HCV2b^U HCVSbseqU 5’· CCA ATG ATC GAR ATG CAG -3 ’ 5*- CCT TTC CSC TAG CGC ATA ~3* 37 38 39 HCVTb scqU 5’- GAG CAC TAC OCT GTC GÀA -3 * H€V2b*í;L4 S'· TGG CTG TCG CTA OAA CCA -3' 48 HCV2b seqLS S'- GTA GGC COC AAA ACC AAG -3· 41 HCVabsocílA 5’* GCYCrc AAC AAG CCC ACG-3’ 42 HCV2b sts)L? 5’- ÀCÀTCTGRGTGA CTC GTC-3'

TABELA 1D SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA 48 HCVáalM 5!» OCY GTA ATÀTXT ÀGT CCC A-3’ 44 3a HCV3sH-2 3*- TCG AAA TCA AGG TCA TCA-3* 45 MCV3aL*l 5'- GTA GCT ACT ATC GGC TCA A -3 ' 45 HCV3ítL-2 3·- GCT TCC TCG ATG TAC GGG ~S>

TABELA 1E SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA 47 HCV3i>U'I f 5v- ccc gtc atc ffr agt cct ã -3’ 11 48 3b HCV3bU-2 ! 5'- TGG ΑΟΑ Π Α AGG TTATCA -3' 48 HCV3bL-l 1 y- oát tgc act ãtc obt côa a-3* 58 HCV3i>L-2 } .r- GCT TGC TCG ATG TAA GGA -3' ΡΕ2014671 75

TABELA 1F SEQ ID NO: Tipo HCV NOME SEQUÊNCIA 51 34860 5’» QS3C COO GAC AAS AÂC CA -3’ 52 3723U s'- tcg cac crr tac ttg gtc aog ao-j’ 33 3753L 5’-OsC CGQ CSC ACC CGA ATG ACA TC-3’ 54 4a 4218U 5’« TAC fCC ACC TAT GGC AAG TTG CT -3* 35 4248L 5'* ÃGG AAC TTG CCW TAG GTG GAG TA-3' m 4284L 5'- GAG TGG CAC TCA TCA CA -3’ 57 4509U 5'* CAT CTC ATT TTC TGC CA —3’ 58 47S8L 5’ - TCG ACT GTC TOR GTG ACA CA -3’ 3$ 4S96U 5*. GAG TGCTÀf GÃC GCG GGC TGTGCT T-3’ m I 51450 5’- CCÀTCG TGG GÀV CAA ATG TGG AAG TGT-3’ «1 1 52580 5'- AAA TAC ÀTC ATO RCÀ TGC ATG TCG GC -3’ 82 528SL 5’· OCC GACÀTG CAT GYC ATG ATG XÀTTT-3' 63 1 S443L 5’- CAC TCT ICC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG 4’ |

TABELA 1G SEQ ID NO: PARES DE BASES TIPO SEQUÊNCIA j -8811(1! AMPLIFICAÇÃO 5’- CCTGCTT GTGGATGAT G -5' % 5*- CTGATOAAATTCCACATGTGCTTCOCCCA - 3' 3 3053 5‘- CTACTCCTGCTCCTGCTGGCGTT -3 - _________ S'* CACTCTTCCATCTCATCGAACTCCfSoTAGAG *3' 4 64 -584 b» 5*- GTGTGGGTTCCCCCCCTCAACGT -3’ 6 1873 b» 5'- GCC6ACATGCATGYCATGATGTATTT -3* 7 -186 b» SEQUENCIAÇÃO 5*- GAGCCCGTCGTCTTCTC -3' .............9........... 66 bt> 5’- GGCCCíGGACAASAACCA -3’ 9 383 b» S’-TCGGACCnTACrrGGTCACGAG -3* to 918 bo 5’- AGGAACTTGCCWTAGOTGaAGTA 4’ li 355 b» S'~ COCCGGCGCACCGGAATGACATC -3* LZ.917 l-023d TABELA 2 A.Posição de NS3 rt w v * * * N N N w ti « M W *11V* IídCVTO la consenso G À f G C Á C C 6 C T T T À f 0 C A G A ( AGCRTGTT AACGCGCAAGAG vl B.Posição de NS3 ......................... " ”Γ' Π' * Kíft88*^^*fcOÔ«^#fc&NW^QO!2«««tfW«r*flP©Ortrttf | !b(CT« lb consenso A G T A T A C T G TATÀTCAGfAÀATCACTTTTCGTCCATCT GCCGCGTCACGCRATTCCGGGCTGTCCCCIAVITGCTC A posição de nucleótidos ei MS3 está indicada TABELA 3 (folha 1 de 2) ÍZ9t7 U023d ií 20 30 « 50 50 n 50 » 1601« e® mptm muam mrnm «wsjh otwjcw varnm wriew ymwn amucu mames Ij *¥¥«*¥¥*** »....*«»» *»*»**»*«J ¥¥¥*,¥¥¥¥¥,¥ uu |>**»>··.« Λ Λ¥ ¥¥ * *>¥ »Q ^ *¥ A*'·*·» *.¥« £».*«**0*0# to tet»!; St, K St* 4 ft. 12 fí> 24 ,*.***«* +*HVV*A# nunrirfA*¥ st, 178 pt,m PUM ft, K pi, ΪΗ — $t. IX — ÍFN Imtmi ?t< U ·**» Msa — PU74 PUIS pU!J í*'iS8 Pt* 1B 1Ϊ «i **yy*A*<v¥ 1 **¥¥***“* * ******** I VMWfl * * , k»**Attf*AA ^UiMúi «VV**'¥ ******* *v>*«v***^ s —4 * ** »»*»**!*** 4- **>**«§*«· —1~» **»,,,!*»* ΛΑ, ¥¥¥É„ , * . #..*--------—M* . t*¥¥*A»¥¥A g¥....„t*f *. ·,.*......T-*-M. I ¥¥¥¥¥¥.^'4* lã ί I......— «Φ 11—......Μ* Ι_.------------α,Μ. Ι~- 7™*&Ι* Ι-™ ♦— ϊ.....Μ« '»* §**¥¥**¥¥¥ ¥¥« ¥*****!«»* >«*>*»*“", .*.χ***·**¥ |**»***¥¥Α 3¥α*”"ΙΊ*

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pt t pt, 4 pt 12 pt. 24 fUSl$.vn ptiíM pt 1C pt 1» |t Ut gtv 11pt.ssa ptl?4'PU76 ptill ptissk w pt ar TABELA 3 (folha 2/2) 110 220 130 UQ ISO XC« »0 230

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Motivo 1 Motivo la

U m M TABELA 5A (folha 2 de 5)

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Motivo II

Motivo III

Motivo IVa

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Motivo V

Porteiro

Motivo VI U m w TABELA 5A (folha 4 de 5) * 0)

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Motivo I

Motivo Ia

Ligação de ácido nucleico TABELA 5B (folha 2 de 5) m m - 320 m m sso 370 m cmmm mmm mmm mmm mmm mmm mmm wmm mmm mmm mmm lh ..............™ ........—15 -U—----------h----------------0.......— i> txmm puas *t>*#¥*4 **** Hl ^ ****,*„,* *«*44·** "V «««»«»» **#*# *#*** ««ffvrtA#*** ***#****** **ΙΤ*<ΙΗΪ1)?1γ «a*****·#!**· ********** ιτί*ϊ·ί*ν»β ,

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Motivo II

Motivo III

Motivo iVa 9 8 - UZ9t7 l-023d UZ.9I7 LOZ3d TABELA 5B (folha 3 de 5) m m μ 430 * m 440 4$ô m m w toam wmm mmm mmm iraram mmm mmm mmm mum mmm mm&

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Motivo V

Porteiro

Motivo VI Dϊ TABELA 5B (folha 4 de 5) m m ¥««**¥#**» 1*1*1**«»* μαμ*««1*»φ φφφφφφίφΙμ *(«»***»*» *»*«'**»*** «awwwammm# #φ»φ#φ*φ*φ LZ.9l7l.OZ3d pt'Oftpt,3lft.M gUO pt» 20 pt* » pt, 3ΙΪ pt» 30pt. n pt* & ¥»*»»**·** »»»«*»»»«* 0*»*»A»**A *«.*'**1***# »·*»»»*«♦» ***»*¥*»«» *»*»„»»,¥* ·*»»·«*#** vw*«1«**i# #*#*«»1(1«· 0*·*«(τ*Λ*« *1*1«.φ*1*» **»***«»«* maamavavbA #Φ*»#*#Φ*1 ^».Φ*Φ»*Φ« φφφφφΑΜΛΜΑ »«»1*1*111 y#*#**»**« »«l«»»»*»í #*#»*«**** ΒφφφφΜΑΜΛ* *·»***^φ«» MAVAMMMMM» ΜΑΜ*«*«AM* *...................β..........................................................ί».................. **»**<*·*» Φ#Φ#1***»» 0»»»*»»*»* *«»#*#»*** »***«»»»»« »Μ«***φ*φ« *1**φ»*«»« *»ΦΦ^Φ«φφφ **#φφφφφ*» »«»«*»¥»** »«««·*·«» *1*1*1**«» 0φφφφφφ#11φ **»1*1*1*# Ρ««ΦηνΦΦΦ1 **»#»»**** »·***»»»«* ****»»»,,»„ ,,»*,*,*»« «»»¥*1*1*1 «νν,φφφφ* »*»**«♦*** 0*»»*φφ*»φ *»«»»***** |^1*1****** Αν*1*·**1* *\?*»***1Φ1 *»*»***»,,« »*»*1*#**¥»««··»·>< «*«1*1**** Ol»V»1***1 **·»*«#«*» νΑ*«·φ«φ·$ ««»«»„„,«« **»*»»»*»* ,»«>·<···> *·»*»»**#* *# »»*«***·» »«»«****** 0Α»Α*«»»*φ *#**»««#** *****¥**** *¥«¥»1*#*# «Φφφφφ,,φ* ΑφΑνΰφΑΦΦΦ 1«#»*¥»¥·»» ******¥Α¥Α 1#**»**»1* C0C0 ít. Β ....................0-...................................................................... jti 1 »····<>·· »·»»·***** II*»»»»»*·» »***»»***» »»***»***» *»·»»«*»« «a»»»»*»*» **«»«»»*»· γ*··*·»*** ***** JM» #««»»*#*** ****»*»#*» 0**«»«··*^ *1***1*¥»1 #*»***#·*» φφΒ^Βφφφφφ *<»»*«***, κ*ί»«***ί »*' ΜΑ #1*1*»«»Μ¥ ****«*¥·*· **«*«»*1#* 0*»*»*φ*φ< .*»·»«»«·* *»**»*¥.¥» ««Μ^φφφφφί »*·«φ«*φφφ *1»*jLlfr»*1 ίΐ*·*»#*?* [.«*****«*#* 1***1*

ΙΙΙΙ MW

Porteiro L^9l7 1-033 d TABELA 5B (folha 5 de 5) 5» (W £10 £20 »0 cbmnte um® mum mvgievt mmm msm τ ib .............................i...................... K> ftMtWOt pt.lZJ .............................................*..... pt. U ......................*.............*.............. pt, .....τ.......................t..................... pt. M ........................."PI.....V................ pt, 20 .....*..........*...........I...................... pt, 2F .....T...............................*............. C0 10 pt, 38 .....................................1............. jjf JÁ ¥«wv>*tf«*»* *H*«w«**#* K*Q******* ##***#*»»# ^u*****#?· * pt. 38 ..................................Ϊ--Ι*·........ pt.tt ..............8.................................... i * iro ttestiwt pt, B *·—τ............r...............v—!*......... *· 1 ...........................í...........i-......... pt.27» ......*................................'............ líj ^ .....—*.....*«*»«..*** »>**K»u* t,

Ift A,λ* ΡΕ2014671 90 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Holland-Staley, Carol

CARACTERIZAR

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAR A HEPATITE C

<130> PCV-001PC <150> 60/363 603 <151> 2002-03-11 <160> 64 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 1 17 cctgcttgtg gatgatg

<210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 2 29 ctgatgaaat tccacatgtg cttcgccca

<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 3 ctactcctgc tcctgctggc gtt

<210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 91 <223> Iniciador < 4 0 0 > 4 cactcttcca tctcatcgaa ctcctggtag ag 32 <210> <211> 5 21 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 5 gtgtgggtyc cccccctcaa c 21 <210> <211> 6 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 6 gccgacatgc atgycatgat gtattt 26 <210> <211> 7 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 gagcccgtcg tcttctc 17 <210> <211> 8 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 8 ggccgggaca asaacca 17 <210> <211> 9 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 92 <223> Iniciador <400> 9 tcggaccttt acttggtcac gag 23 <210> <211> 10 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 10 aggaacttgc cwtaggtgga gta 23 <210> 11 <211> 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 11 cgccggcgca ccggaatgac ate 23 <210> <211> 12 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 12 tactccacct atggcaagtt cct 23 <210> <211> 13 25 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 13 gagtgctatg acgcgggctg tgctt 25 <210> 14 <211> 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 93 <223> Iniciador < 4 0 0 > 14 gagtggcact catcaca 17 <210> <211> 15 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 15 catctcatyt tctgcca 17 <210> <211> 16 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 16 tcgactgtct grgtgacaca 20 <210> <211> 17 27 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 17 ccatcgtggg aycaaatgtg gaagtgt 27 <210> <211> 18 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 18 aaatacatca tgrcatgcat gtcggc 26 <210> <211> 19 29 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 94 <223> Iniciador < 4 0 0 > 19 tgggcgaagc acatgtggaa tttcatcag 29 <210> <211> 20 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 20 gccatcctct ctcctggtgc cct 23 <210> 21 <211> 21 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 21 cacccayccc cccaakatgt t 21 <210> <211> 22 24 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 22 ccggrggtca ttaygtscaa atgg 24 <210> <211> 23 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 23 cgcggggttt ccaggcag 18 <210> 24 <211> 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> 20ΡΕ2014671 95 <223> Iniciador <400> 24 ggcacytaca tctatgayca <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 25 tcatcttcag tccgatggag a <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 26 atgccgctra tgaarttcca cat <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 27 ctgaaygcca tcatggargc ca <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 28 ccaatggaga agaaggtca <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial 21 23 22 <22 0> 19 ΡΕ2014671 96 <223> Iniciador <400> 29 atgtggagac atcctgca 18 <210> <211> 30 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 30 ttgtggcctg ttgtagga 18 <210> <211> 31 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 31 gcgcattctt ccatctca 18 <210> <211> 32 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 32 ccgaaacgct gaygtcat 18 <210> <211> 33 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 33 ggatggaggc tgctcagc 18 <210> <211> 34 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 97 <223> Iniciador <400> 34 agacccgacc tttaccat 18 <210> <211> 35 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 35 ttacccgtgt gtcaagacca 20 <210> <211> 36 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 36 ccaatgatgg aratgcag 18 <210> <211> 37 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 37 cctttgcsct agcgcata 18 <210> <211> 38 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 38 gagcactacg ctgtcgaa 18 <210> <211> 39 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 98 <223> Iniciador <400> 39 tggctgtggc tagaacca 18 <210> <211> 40 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 40 gtaggcccca aaaccaag 18 <210> 41 <211> 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 41 gcyctgaaca agcccacg 18 <210> <211> 42 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 42 acatctgrgt gactggtc 18 <210> <211> 43 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 43 ccygtaatat ttagtccca 19 <210> 44 <211> 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 99 <223> Iniciador <400> 44 tggaaatcaa ggtcatca 18 <210> <211> 45 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> 39 Iniciador <400> 45 gtagctacta tgggctcaa 19 <210> <211> 46 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 46 gcttgctcga tgtacggg 18 <210> <211> 47 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 47 cccgtcatct ttagtccta 19 <210> <211> 48 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 48 tggagattaa ggttatca 18 <210> <211> 49 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> ΡΕ2014671 100 <223> Iniciador <400> 49 gattgcacta tgggtcgaa 19 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 50 gcttgctcga tgtaagga 18 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 51 ggccgggaca asaacca 17 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 52 tcggaccttt acttggtcac gag 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 53 cgccggcgca ccggaatgac ate 23 <210> 54 <211> 23 ΡΕ2014671 101 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 54 tactccacct atggcaagtt cct 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 55 aggaacttgc cwtaggtgga gta 23 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 56 gagtggcact catcaca 17 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 57 catctcatyt tctgcca 17 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 58 ΡΕ2014671 102 tcgactgtct grgtgacaca 20 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 59 gagtgctatg acgcgggctg tgctt 25 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 60 ccatcgtggg aycaaatgtg gaagtgt 27 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 61 aaatacatca tgrcatgcat gtcggc 26 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 62 gccgacatgc atgycatgat gtattt 26 <210> 63 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial ΡΕ2014671 103 <22 0> <223> Iniciador <400> 63 cactcttcca tctcatcgaa ctcctggtag ag 32

<210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 64 gtgtgggttc cccccctcaa cgt 23

Lisboa, 9 de Junho de 2010

Claims (15)

1. ΡΕ2014671 1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico que possui uma sequência de nucleótidos que compreende uma sequência seleccionada a partir do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que possui uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 23; (b) um ácido nucleico que possui uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 23; em que o ácido nucleico é capaz de emparelhar com o gene NS4 de HCV, ou uma porção deste; (c) um fragmento de pelo menos 8 nucleótidos de um ácido nucleico possuindo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 23; e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntico a uma sequência de nucleótidos como definido em qualquer um de (a) a (c).
2. 2. Moclécula de ácido nucleico da reivindicação 1, compreendendo ainda um marcador seleccionado do grupo consistindo em um grupo fluorescente, dlgoxigenina, bio-tina, marcadores radioactivos, grupos quimioluminescentes, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, e corantes.
3. 3. Oligonucleótido para amplificar uma sequência de ácido nucleico numa amostra, em que a amostra é de 2 ΡΕ2014671 um doente infectado com HCV e que contém uma sequência de nucleótidos que consiste na SEQ ID NO: 23, ou complemento desta.
4. 4. Kit para a detecção de HCV, compreendendo um oligonucleótido ou um conjunto de oligonucleótidos, em que o oligonucleótido compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.
5. 5. Kit da reivindicação 4, em que o referido kit compreende um ou mais componentes seleccionados a partir do grupo que consiste em: pelo menos um oligo nucleótido marcado para detectar ácido nucleico de HCV amplificado, uma pluralidade de nucleótidos, uma polimerase de ácidos nucleicos, pelo menos um outro componente para realizar uma reacção de amplificação pela polimerase e instruções para a utilização.
6. 6. Método para amplificar um ácido nucleico alvo, compreendendo o método: combinar um ácido nucleico alvo do genoma de HCV em condições que permitem que ocorra uma reacção de amplificação, com: (a) uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência apresentada como SEQ ID NO: 23; (b) uma polimerase de ácido nucleico; e 3 ΡΕ2014671 (c) uma pluralidade de nucleótidos, resultando deste modo num ácido nucleico alvo amplificado.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que o ácido nucleico alvo é do gene NS3 ou NS4 do genoma de HCV.
8. 8. Método para detectar especificamente ácidos nucleicos de HCV numa amostra compreendendo: (a) colocar em contacto a referida amostra com uma ou mais sequências de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência apresentada como SEQ ID NO: 23, em condições nas quais os referidos ácidos nucleicos de HCV podem hibridar com os referidos iniciadores; (b) fazer a transcrição reversa e amplificar os referidos ácidos nucleicos para obter ácidos nucleicos amplificados de HCV; e (c) detectar a presença dos referidos ácidos nucleicos de HCV.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a detecção da presença dos referidos ácidos nucleicos de HCV amplificados compreende: (a) colocar em contacto os referidos ácidos nucleicos de HCV amplificados com um oligonucleótido 4 ΡΕ2014671 marcado para obter ácidos nucleicos de HCV marcados; e (b) identificar os referidos ácidos nucleicos marcados.
10. 10. Método de qualquer uma das reivindicações 6 a 9, compreendendo ainda o passo de sequenciar o ácido nucleico amplificado e, opcionalmente, o passo de avaliar a sequência para mutações.
11. 11. Método in vitro para determinar se um doente é resistente a um agente, comprendendo o método: a) realizar amplificação por PCR no DNA de uma amostra contendo DNA de um doente, utilizando uma sequência iniciadora de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica à sequência de nucleótidos da SEQ ID NO:23; e b) analisar o produto amplificado, determinando desse modo se um doente é resistente a um agente.
12. 12. Método da reivindicação 11, em que o agente é um agente antiviral, um inibidor de protease, um inibidor da porção da protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção de helicase do gene NS3, um interferão alfa, um interferão peguilado ou uma combinação de agentes. 5 ΡΕ2014671
13. 13. Método in vitro para determinar se um agente pode ou não ser utilizado para tratar um doente de HCV, compreendendo o método os passos de: a) amplificar uma amostra contendo um ácido nucleico de um doente infectado com HCV, utilizando uma sequência iniciadora de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica à sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 23; b) sequenciar as sequências de ácido nucleico de HCV amplificado resultantes; e c) identificar mutações na sequência de ácido nucleico de HCV amplificado que esteja correlacionada com a resistência ou sensibilidade a um agente antiviral, determinando desse modo se um agente pode ou não ser utilizado para tratar um doente de HCV.
14. 14. Método in vitro para determinar se o tratamento com um agente deve ser continuado ou não continuado num doente infectado com HCV, compreendendo o método: (a) realizar o método da reivindicação 6 em duas ou mais amostras, compreendendo DNA de um doente durante o decorrer do tratamento; 6 ΡΕ2014671 (b) sequenciar o produto de ácido nucleico alvo amplificado resultante, da reivindicação 6; (c) identificar as mutações presentes no produto amplificado que estão correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente; e (d) ter uma indicação para continuar o tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado não se alteram durante o decorrer do tratamento, ou ter uma indicação para descontinuar o tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado se alteram durante o decorrer do tratamento
15. 15. Método in vitro de avaliação da eficácia de um agente para o tratamento de HCV, compreendendo o método comparar: a) sequências de ácido nucleico numa primeira amostra de um doente exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados de uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência apresentada como SEQ ID NO: 23, e b) sequências de ácido nucleico numa segunda amostra de um doente que não foi exposto a um agente, em 7 ΡΕ2014671 que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados de uma ou mais sequências de iniciador de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência apresentada como SEQ ID NO:23, em que um número aumentado de mutações nas sequências de ácido nucleico da primeira amostra, em relação à segunda amostra, é um indicador de que o agente não é eficaz no tratamento de HCV. Lisboa, 9 de Junho de 2010 ΡΕ2014671 1/2

    Fig. 1 ΡΕ2014671 2/2

    HCV1A ΡΤ184 ΡΤ24 ΡΤ176 PT 183 PT188 PT11 PT177 PT170 PTK i PT1X | PT1H ! j" PT4 T-PT1Y ΙΓ™2 ¢- puo PT174 PT12 PT1C PT161 PT25 ! PT23 ! •ptig -PT1A PT2D PT1S3 -PT1 PT1U PT2F 'PT179 PT205 ; • H0V18 ! is. 2A

    1 ΡΕ2014671 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição » tiS 36360302 P · EP 318216 A • US PN4S83202 A, 1Af#iS · US 5350671 A * WO 89046639 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Bi ÉíScequi. Jíi. HepaútêC. Lancei.« voi. 351,. 351-5 * HOUGHTON M. Freiás' Vifdogy, UppiBEpii-RaveH, 19S:6;.; 1035-1058. * P, ef ai. iaertiiíinafcr·:! cr' gtnoiypes of fiepaííss C virus by seqyence coropanssos, m core, E 'i and MS-5 regians. J Geri Virai, 5334, voL 75. 1053-1Q61 BRÉCHOT, C. ara genéírcrvanabiSiíy. DigesSve Oízeases afió Sci-eiweS; 19S6, voi 41, SS-21S « BUKH, 4. etaí. 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