PT1947104E - Métodos e composições para identificação e caracterização de hepatite c - Google Patents

Description

ΡΕ1947104 1

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE HEPATITE C"

Pedidos de patente relacionados 0 presente pedido de patente reclama prioridade relativamente ao pedido de patente provisório U.S. n° de série 60/363603 entregue em 11 de Março de 2002.

Fundamento do invento O vírus da hepatite C (HCV) é o principal agente etiológico da hepatite não A não B. Estima-se que cerca de 400 milhões de pessoas ou >2% da população mundial esteja infectada (Di Bisceglie, A.M. (1998) Hepatitis C. Lancet 351:351-5; Houghton M. (1996), p. 1035-1058. In B. N. Fields and D. M. Knipe and Η. P. M. (ed.), Fields' Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia/New York). O HCV, geralmente, dá origem a uma infecção crónica em 60 a 80% dos indivíduos infectados, com 20% apresentando progressão para cirrose, carcinoma hepatocelular ou falência hepática crónica. A nível mundial, foram identificados pelo menos 6 genótipos virais principais e mais de 50 subtipos foram propostos para o HCV (Simmonds, P. et al. (1994) Identification of genotypes of hepatitis C virus by 2 ΡΕ1947104 sequence comparisons in the core, EI and NS-5 regions. J Gen Virol 75:1053-1061). Estes genótipos são baseados na diversidade de sequências nucleotidicas e de aminoácidos, diferindo os isolados mais divergentes em mais de 30% (Bréchot, C. (1996) Hepatitis C virus: Molecular biology and genetic variability. Digestive Diseases and Sciences 41:6S-21S; Bukh, J. et al. (1995) Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin Liver Dis 15:41-63). Entre os diferentes tipos, existem regiões que são altamente conservadas e possuem homologia de sequências perto de 100%. No entanto, nas regiões altamente variáveis, tais como as proteínas do invólucro, a homologia é <70% (Booth, J.C. et al. (1998) Comparison of the rate of sequence variation in the hypervariable region of E2/NS1 region of hepatitis C virus in normal and hypogammaglobulinemic patients. Hepatology 27:223-27; Hayashi, N. et al. (1993) Molecular cloning and heterogeneity of the human hepatitis C virus (HCV) genome. J Hepatol 17:S94-107; Hijikata, M. et al. (1991) Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C virus. Biochem Biophys Res Commun 175:220-228; Kato, N. et al. (1992) Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses. Virus Res 22:107-123; Lesniewski, R.R. et al. (1993) Hypervariable 5'-terminus of hepatitis C virus E2/NS1 encodes antigenically distinct variants. J Med Virol 40:150-156; Pozzetto, B. et al. (1996) Structure, genomic organization, replication and variability of hepatitis C virus. Nephrol Dial Transplant 11 [ Suppl 4 ] : 2 - 5; Vizmanos, J.L. et al. (1998) Degree and 3 ΡΕ1947104 distribution of variability in the 5' untranslated, El, E2/NS1 and NS5 regions of the hepatitis C vírus (HCV) . J Virai Hepat 5:227-240). O HCV é um membro da família Flaviviridae cujos outros membros incluem os Flavivirus e os Pestivirus (Kato, N. et ai. (1991) Molecular structure of the Japanese hepatitis C virai genome. FEBS Lett 280:325-328). O genoma do HCV consiste num RNA de polaridade positiva de ~9,5 kb, o qual possui uma única grelha de leitura aberta codificadora de uma poliproteína de 3010 a 3033 aminoácidos (Takamizawa, A. et al. (1991) Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol 65:1105-1113). 0 processamento proteolítico da poliproteína é conseguido por proteases do hospedeiro e virais. As peptidases sinal do hospedeiro cortam as proteínas estruturais que estão situadas no extremo 5', enquanto duas proteases virais cortam as proteínas não estruturais. Estes cortes resultam em pelo menos 10 proteínas virais na ordem NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Existem ainda regiões não codificadoras situadas nos extremos 5' e 3' que estão envolvidas na ligação aos ribossomas e iniciação da replicação, respectivamente.

Uma das proteases virais, a protease NS3, é codificada pela região N-terminal do gene NS3 do HCV. Consiste em 181 aminoácidos e é uma protease serínica, tipo tripsina, responsável pelo corte das proteínas não 4 ΡΕ1947104 estruturais do HCV (Bartenschlager, R. et al. (1993) Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. J Virol 67:3835-3844; Eckart, M.R. et al. (1993) The hepatitis C virus encodes a serine protease involved. in processing of the putative nonstructural proteins from the virai polyprotein precursor. Biochem Biophys Res Commun 192:399-406; Gallinari, P. et al. (1998) Multiple enzymatic activities associated with recombinant NS3 protein of hepatitis C virus. J Virol 72:6758-6769; Hahm, B. et al. (1995) NS3-4A of hepatitis C virus is a chymotrypsin-like protease. J Virol 69:2534-2539; Hijikata, M. et al. (1993) Two distinct proteinase activities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis C virus. J Virol 67:4665-4675; Hijikata, M. et al. (1993) Proteolytic processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sei USA. 90:10773-10777; Manabe, S. et al. (1994) Production of nonstructural proteins of hepatitis C virus requires a putative virai protease encoded by NS3. Virology 198:636-644; Tomei, L. et al. (1993) NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J Virol 67:4017-4026). O processamento das proteínas estruturais por NS3 ocorre numa cascata bem ordenada, com o primeiro corte a ocorrer entre NS3 e NS4A seguido de NS5A-NS5B, NS4A-NS4B e NS4B-NS5A (Bartenschlager, R. et al. (1994) Kinetic and structural analysis of hepatitis C virus polyprotein processing. J Virol 68:5045-5055; D'Souza, E.D. et al. (1994) Analysis of 5 ΡΕ1947104 NS3-mediated processing of the hepatitis C virus non-structural region in vitro. J Gen Virol 75:3469-3476; Eckart M.R., et al., 1993, supra; Failla, C. et al. (1994) Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins. J Virol 68:3753-3760; Kolykhalov, A.A. et ai. (1994) Specificity of the hepatitis C virus NS3 serine protease: effects of substitutions at the 3/4A, 4A/4B, 4B/5A, and 5A/5B cleavage sites on polyprotein processing. J Virol 68:7525-7533; Shimotohno, K. et ai. (1995) Processing of the hepatitis C virus precursor protein. J Hepatol 22:87-92; Shoji, I. et al. 1999 Internai processing of hepatitis C virus NS3 protein. Virology 254:315-323; Tomei, L. et al., 1993, supra). 0 corte entre NS3 e NS4 ocorre em cis, enquanto os outros cortes são em trans. O cofactor NS4A, codificado pelo virus, é necessário para a função eficiente de NS3. Foi demonstrado que a eficiência do processamento proteolitico aumenta dramaticamente na presença da proteina NS4A (Failla, C. et al. (1995) An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 proteinase is essential for the interaction with NS4A. J Virol 69:1769-1777; Failla, 1994, supra; Gallinari, P. et al. 1999 Modulation of hepatitis C virus NS3 protease and helicase activities through the interaction with NS4A. Biochemistry 38:5620-5632; Lin, C. et al. (1995) A central region in the hepatitis C virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro. J Virol 69:4373-4380; Satoh, S. et al. (1995) The N-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3) is 6 ΡΕ1947104 essential for stable complex formation with NS4A. J Virol 69:4255-4260; Tanji, Y. et al. (1995) Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in virai protein Processing. J Virol 69:1575-1581). Ainda, NS3 possui um átomo de zinco ligado tetraedricamente, o qual parece desempenhar um papel estrutural (De Francesco, R. et al. (1996) A zinc binding site in virai serine proteinases. Biochemistry 35:13282-13287; Stempniak, M. et al. (1997) The NS3 proteinase domain of hepatitis C virus is a zinc-containing enzyme. J Virol 71:2881-2886).

Recentemente, foram feitos progressos consideráveis na determinação de como a protease NS3 processa o polipéptido de HCV (Kolykhalov, A. A. et ai., 1994 supra; Steinkuhler, C. et al. (1996) Activity of purified hepatitis C virus protease NS3 on peptide substrates. J Virol 70:6694-6700; Urbani, A. et al. (1997) Substrate specificity of the hepatitis C virus serine protease NS3. J Biol Chem 272:9204-9209). Os modelos de como a protease interage com cofactores e o substrato identificaram quatro dominios, os quais estão envolvidos na função enzimática (Barbato, G. et al. 1999. The solution structure of the N-terminal proteinase domain of the hepatitis C virus (HCV) NS3 protein provides new insights into its activation and catalytic mechanism. J Mol Biol 289:371-384). Estes são a triade catalítica, locais de ligação ao cofactor e a metais e a bolsa de ligação ao substrato. Estes dominios estão bem definidos e possuem residuos de aminoácidos que são altamente conservados em todos os genes da protease do HCV 7 ΡΕ1947104 até agora sequenciados (ver Figura 1 em Holland-Staley, C. A., et al . (2002) Genetic diversity and response to IFN of the NS3 protease gene f rom clinicai strains of the hepatitis C virus . Arch Virol 147:1385-1406, que é aqui incluída como referência). Apesar deste recente aumento de informação estrutural e de estudos que mostram o envolvimento directo e conservação de resíduos de aminoácidos, o impacto da variabilidade das sequências naturais na função da enzima não está bem compreendido. Ainda, os efeitos da terapia antiviral na sequência da protease NS3 são desconhecidos. A elucidação da diversidade genética natural da protease NS3 do HCV em amostras de doentes é de interesse significativo médico e teórico. Apesar de todas as proteases NS3 do HCV até agora sequenciadas possuírem aminoácidos conservados nos centros activos, a variação da sequência ao longo do gene NS3 é significativa ((Martell, M. et al. (1992) Hepatitis C virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes:quasispecies nature of HCV distribution. J Virol. 66:3225-32; Okamoto, H. et al. (1992) Genetic drift of hepatitis C virus during an 8.2-year infection in a chimpanzee: variability and stability. Virology 190:894-899; Okamoto, H. et al. (1992) supra) . Igualmente, a presença de múltiplas espécies dentro do mesmo doente, conhecido como quasispécies, cria um potencial problema para o desenvolvimento de fármacos e resistência. A compreensão do grau de variação da sequência NS3 em estirpes clínicas permitirá o desenvolvimento mais eficaz de fármacos dirigidos para a protease do HCV. Por isso, devem estar ΡΕ1947104 disponíveis dados que descrevam a variabilidade da sequência tal como ocorre nas pessoas infectadas com HCV.

As helicases são enzimas responsáveis pelo desenrolamento de duplas hélices de DNA/DNA, RNA/DNA e RNA/RNA numa direcção 3'-5'. (Bartenschlager, R. et ai., 1993, supra; Hahm B., et ai., 1995, supra; Tomei, et ai., 1993, supra). Ainda, foi proposto que as enzimas helicases desempenham papéis na replicação e recombinação virais, controlo virai das funções celulares do hospedeiro, estabilidade do mRNA incluindo "splicing" ou processamento, transcrição, transporte e iniciação da tradução do RNA (Luking, et ai. (1998) The protein family of RNA helicases. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33:259-296). A helica-se/NTPase NS3 do HCV possui 450 aminoácidos. A componente NTPase hidrolisa 5'-trifosfatos de nucleósido, proporcionando os requisitos energéticos. A helicase/NTPase, juntamente com a protease NS3 e a polimerase dependente de RNA NS5b pensa-se que constituam um grande complexo, o qual é responsável pela replicação virai. Recentemente, foram feitos progressos consideráveis na determinação da estrutura da helicase NS3 do HCV e do seu mecanismo de desenrolamento de duplas hélices. Foram publicadas pelo menos três estruturas cristalinas diferentes (Paolini, Cho et al., 1998, supra; Kim et al., 1998, supra; and Yao et al. 1997, supra). Nas três, a enzima apresenta 3 domínios, sendo os domínios 1 e 2 estruturalmente semelhantes. A enzima possui sete motivos, incluindo dois motivos que estão envolvidos na ligação a NTP e hidrólise (motivo I [GxGKS] e motivo II [DExH] ) e um que está envolvido na 9 ΡΕ1947104 hidrólise de ATP e desenrolamento de RNA (motivo VI) . A maioria dos motivos está situada entre os dominios estruturais 1 e 2, com o domínio 3 separado dos outros dois pela ligação do nucleótido. Os investigadores identificaram resíduos altamente conservados dentro de cada motivo. Estes motivos, juntamente com a análise comparativa com outras helicases, revelam que é um membro da família da caixa DEAD ("DEAD-box") das helicases de RNA, especificamente da subfamília DExH. 0 magnésio é necessário para as actividades de helicase e de NTPase. A única terapia aprovada pela FDA para a infecção pelo vírus da hepatite C é o interferão (IFN) ou interferão peguilado com ou sem ribavirina. Foi demonstrada a indução da produção de interferão após infecções com bactérias, parasitas e vírus, assim como na resposta a tumores. Os interferões são proteínas secretadas da família das cito-cinas, as quais inibem indirectamente o ciclo replicativo virai através da ligação a receptores celulares, induzindo assim a síntese proteica (Hijikata, M. et al. (1993) Proteolytic Processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sei USA. 90:10773-10777). Os genes induzidos pelo interferão possuem uma região de promotor designada elemento de resposta estimulado pelo IFN (ISRE). Cerca de 30 genes são induzidos pelo interferão, no entanto, a função da maioria destes genes é desconhecida (Holmes, E. C. et al. (2000) The causes and consequences of genetic variation in dengue virus. Trends Microbiol 8:74-77). 10 ΡΕ1947104

Recentemente, foi sugerido que um pequeno segmento de 4 0 aminoácidos do gene NS5A do HCV desempenhe um papel na resistência ao IFN, no entanto, enquanto isto parece ser verdadeiro para os isolados japoneses, outros investigadores possuem dados contraditórios. Os efeitos da terapia com interferão nos outros genes estruturais são desconhecidos.

Sumário do invento incluindo O presente invento baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de novas sequências de ácido nucleico isoladas para amplificação e sequenciação de porções do genoma do HCV. O presente invento proporciona novas sequências e métodos de utilização das mesmas que, consistentemente, amplificam o genoma do HCV. As sequências de ácido nucleico do presente invento são úteis como reagentes para a detecção e identificação de sequências virais em amostras biológicas e permitem uma melhor caracterização do genoma do HCV. Os métodos aqui descritos, a sequência de ácido nucleico descrita como SEQ ID NO: 3 e seus equivalentes funcionais, assim como kits que os incluem, são úteis para a determinação precisa da presença de HCV em amostras biológicas, assim como a sequência especifica de uma porção do genoma do HCV. A sequência de ácido nucleico e métodos do presente invento podem ser úteis para: (i) detecção da infecção por HCV, incluindo detecção na fase precoce; (ii) identificação do tipo de HCV causador da infecção; (iii) detecção de estirpes variantes de HCV, 11 ΡΕ1947104 heterogeneidade num doente; (iv) detecção de uma mutação no ácido nucleico do HCV que seja responsável pela resistência ou sensibilidade a uma terapia; (v) detecção de novas mutações no genoma do HCV que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a terapia com fármacos; (vi) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente antiviral, será eficaz; (vii) determinação se o tratamento com um agente, e.g., um agente antiviral, deverá ou não ser continuado; (viii) identificação da interacção entre HCV e outros virus e/ou doenças; (ix) geração de um ácido nucleico, e.g., DNA, vacina, que possa ser específico de um doente; e (x) desenvolvimento de novos fármacos, e.g., baseados em cristalografia de raios X. 0 presente invento corresponde a uma nova sequência iniciadora isolada do genoma de HCV aqui descrita como SEQ ID NO:3 (Tabelas 1A-1G). As sequências que correspondem aos subtipos la e lb do HCV estão descritas como SEQ ID NOS :1-23 e SEQ ID NO: 64 (Tabelas IA e 1G) ; as sequências que correspondem ao subtipo 2a do HCV estão descritas como SEQ ID NOS:24-27 (Tabela 1B); as sequências que correspondem ao subtipo 2b do HCV estão descritas como SEQ ID NOS:28-42 (Tabela 1C); as sequências que correspondem ao subtipo 3a do HCV estão descritas como SEQ ID NOS:43-46 (Tabela ID); as sequências que correspondem ao subtipo 3b do HCV estão descritas como SEQ ID NOS :47-50 (Tabela 1E); e as sequências que correspondem ao subtipo 4a do HCV estão descritas como SEQ ID NOS :51-63 (Tabela 1F) . 12 ΡΕ1947104

Numa realização, o presente invento corresponde a um oligonucleótido como descrito em SEQ ID NO:3. Numa outra realização, o oligonucleótido do invento é pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico à sequência de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:3. Ainda, numa outra realização, o oligonucleótido de SEQ ID NO:3 tem pelo menos 4, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleótidos de comprimento. Será considerado que o extremo 5' poderá ter mais variabilidade (e.g., substituições de nucleótidos), ainda que mantendo-se funcional (e.g., capaz de emparelhar com a porção NS3 e NS4 do genoma do HCV). Numa outra realização, o invento proporciona uma combinação de um ou mais oligonucleótidos do presente invento. Ainda numa outra realização, o invento proporciona uma série de oligonucleótidos, igualmente referido como "sequências iniciadoras" e "sequências iniciadoras de ácido nucleico", seleccionadas do grupo que consiste em dois ou mais oligonucleótidos do presente invento. Ainda numa outra realização, o invento proporciona oligonucleótidos que são capazes de amplificar uma amostra de um doente tendo uma sequência de nucleótidos seleccionada como descrito em SEQ ID NO:3, ou o seu complemento. Num aspecto do invento, o oligonucleótido do presente invento compreende uma marca para detecção. Tais marcas podem ser, e.g., marcas radioactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., "nick translation" ou fosforilação), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes 13 ΡΕ1947104 (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos dirigidos), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações dos mesmos e similares. Um outro aspecto do invento compreende um vector compreendendo um oligonucleótido do presente invento.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um oligonucleótido para amplificação de uma sequência de ácido nucleico numa amostra, em que a amostra possui a sequência nucleotidica descrita como SEQ ID NO: 3 ou o seu complemento. Num aspecto do invento, a amostra é de um doente infectado com HCV.

Numa outra realização, o invento proporciona uma sequência de ácido nucleico, em que a sequência de ácido nucleico é um promotor-sequência iniciadora compreendendo um oligonucleótido do presente invento, em que uma porção 5' da sequência inclui uma sequência de promotor.

As sequências de ácido nucleico do HCV amplificadas geradas pelos método aqui descrito podem ser clonadas num vector hospedeiro com um promotor de expressão e usadas como uma vacina de DNA para amplificar uma resposta do doente à infecção pelo virus HCV, proporcionando assim uma vacina de DNA contra o HCV específica de doente. Num outro aspecto do invento, o clone pode ser usado para gerar RNA para usar como vacina anti-sentido.

Será considerado que uma amostra usada nos 14 ΡΕ1947104 métodos do presente invento pode ser uma amostra biológica, e.g., de um doente infectado com HCV. Tais amostras podem incluir, sem limites, sangue, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, as secções externas da pele, trato respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, urina, células sanguíneas, tumores, órgãos, DNA genómico, RNA ou cDNA em solução ou ligadas a um substrato e também amostras de constituintes de culturas celulares in vitro incluindo, mas não estando limitado a meio condicionado resultante do crescimento de células no meio de cultura celular, células putativamente infectadas com vírus, células recombinantes e componentes celulares, e.g., cromossoma(s) , organelos, tecidos embebidos em parafina ou membranas isoladas de uma célula.

Numa realização do invento, é analisada a porção de protease serínica do gene NS3 do HCV. Isto pode ser conseguido através da amplificação e sequenciação da porção de protease serínica do gene com as composições e métodos do presente invento. Quando um par de sequências iniciadoras é empregue como sequências iniciadoras de sequenciação, um ou ambos os membros do par podem ser adequadamente marcados, e.g., com marcas radioactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., "nick translation" ou fosforilação) , isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos dirigidos), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações dos mesmos e similares. 15 ΡΕ1947104

Numa outra realização do invento, foi analisada a porção de helicase do gene NS3 do HCV. Tal pode ser conseguido através da amplificação e sequenciação da porção helicase do gene com as composições e métodos do presente invento. Quando um par de sequências iniciadoras é empregue como sequências de sequenciação, um ou ambos os membros do par podem ser adequadamente marcados, e.g., com marcas radioactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., "nick translation" ou fosforilação), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos dirigidos), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes, combinações dos mesmos e similares.

As combinações de sequências iniciadoras, por exemplo, incluindo pelo menos uma sequência iniciadora directa e uma inversa, que em conjunto podem ser usadas na amplificação e/ou sequenciação de uma porção relevante do genoma do HCV, e.g., o gene NS3 ou NS4, podem ser adequadamente acondicionadas num estojo ("kit")· São preferidos os pares de sequências iniciadoras para amplificação em duas reacções sucessivas e as sequências iniciadoras para sequenciação. Numa realização, o invento proporciona um estojo ("kit") para a detecção de HCV, compreendendo um ou mais oligonucleótidos do presente invento. Numa outra realização, o estojo ("kit") compreende uma série de sequências iniciadoras seleccionadas do grupo consistindo 16 ΡΕ1947104 em oligonucleótidos do presente invento. As sequências iniciadoras de tais kits podem estar marcadas ou não marcadas. 0 estojo ("kit") pode também incluir reagentes adicionais, tais como reagentes para a realização de uma reacção em cadeia da polimerase (PCR), uma transcriptase reversa para a conversão do RNA do HCV em cDNA para amplificação, polimerases de DNA, e stocks de dNTPs e ddNTPs. 0 estojo ("kit") pode também incluir instruções de utilização. 0 presente invento também inclui novos métodos para amplificação de um ácido nucleico alvo, e.g., regiões especificas do genoma do HCV de um doente, tais como os genes NS3 e NS4 do genoma do HCV, usando o oligonucleótido do presente invento. Os novos métodos do presente invento podem ser usados, por exemplo, para: (i) detecção da infecção por HCV, incluindo detecção na fase precoce; (ii) identificação do tipo de infecção por HCV; (iii) detecção de estirpes variantes de HCV incluindo heterogeneidade num doente; (iv) detecção de uma mutação no ácido nucleico do HCV que é responsável pela resistência ou sensibilidade a uma terapia; (v) detecção de novas mutações no genoma do HCV que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a uma terapia com fármacos; (vi) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente antiviral, será eficaz; (vii) determinar se o tratamento com um agente, e.g., um agente antiviral, deverá ou não ser continuado; (viii) identificação da interacção entre HCV e outros virus e/ou doenças; (ix) geração de um ácido 17 ΡΕ1947104 nucleico, e.g., DNA, vacina, que possa ser específico de um doente; e (x) desenvolvimento de novos fármacos, e.g., baseados em cristalografia de raios X. Esta análise pode ser realizada por sequenciação directa ou usando outras técnicas para caracterização de polimorfismos de sequência, incluindo mas não estando limitado a hibridação com sondas oligonucleotídicas específicas de sequência.

Assim, numa realização, o invento proporciona métodos para amplificação de um ácido nucleico alvo, e.g., porções do gene NS3 ou NS4, através da combinação de um ácido nucleico alvo em condições que permitam que ocorra uma reacção de amplificação com uma ou mais sequências de sequências iniciadoras de ácido nucleico do presente invento e outros agentes de amplificação necessários, tais como uma polimerase de ácido nucleico e uma pluralidade de nucleótidos. Num aspecto do presente invento, a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo resulta numa quantidade acrescida do ácido nucleico alvo amplificado. Ainda num outro aspecto do invento, a sequência de ácido nucleico alvo é do genoma do HCV, e.g., o gene NS3 ou NS4A. Noutros aspectos do invento, o ácido nucleico alvo é a porção protease serínica do gene NS3. Ainda noutros aspectos do invento, o ácido nucleico alvo é a porção helicase do gene NS3. Num outro aspecto do invento, é usada uma polimerase de ácido nucleico e pode ser seleccionada do grupo consistindo em transcriptase reversa e polimerase de DNA estável à temperatura. Noutras realizações do invento, o ácido nucleico amplificado do HCV foi sequenciado. Ainda 18 ΡΕ1947104 noutro aspecto do invento, a sequência é avaliada relativamente a mutações.

Numa outra realização do presente invento, um método para a detecção e caracterização de ácidos nucleicos do HCV numa amostra é proporcionado através do contacto da amostra com uma ou mais sequências iniciadoras de ácido nucleico do presente invento, em condições tais que os ácidos nucleicos do HCV podem hibridar com as sequências iniciadoras do invento, fazendo a transcrição reversa e amplificação dos ácidos nucleicos para obter ácidos nucleicos de HCV amplificados e detecção da presença de ácidos nucleicos de HCV amplificados. Os ácidos nucleicos de HCV amplificados podem ser ainda caracterizados através, por exemplo, de sequenciação dos ácidos nucleicos amplificados. Num aspecto do invento, a detecção da presença dos ácidos nucleicos do HCV amplificados compreende contacto dos ácidos nucleicos do HCV amplificados com um oligonucleótido marcado para obter ácidos nucleicos de HCV marcados e identificação dos ácidos nucleicos marcados. Ainda noutros aspectos do invento, a amplificação dos ácidos nucleicos pode ser conseguida por amplificação baseada em sequências de ácidos nucleicos (NASBA),

Amplificação Mediada por Transcrição (TMA), reacção em cadeia da polimerase (PCR), outros métodos de amplificação de alvos, métodos de amplificação do sinal ou métodos de amplificação de sondas tais como reacção em cadeia com ligase. Ainda num outro aspecto do invento, os métodos ainda compreendem o passo de sequenciação dos ácidos 19 ΡΕ1947104 nucleicos do HCV amplificados. Ainda noutra realização, os métodos ainda compreendem avaliação da sequência relativamente a mutações.

Uma vez sequenciado, as mutações no genoma do HCV podem ser identificadas através da comparação da sequência com uma sequência conhecida ou controlo, e.g., uma sequência de consenso. Assim, o presente invento proporciona composições e métodos para identificação de mutações particulares no genoma do HCV. Conhecendo-se uma mutação particular no genoma do HCV de uma amostra de doente, pode ser identificada e administrada a terapia ou terapia de combinação adequada. Por exemplo, os métodos do presente invento podem ser usados para determinar um regime de tratamento particular dependendo do genótipo de HCV que infectou o doente. Numa outra realização, o invento proporciona composições e métodos para determinar se um doente é sensivel ou resistente a um agente através da obtenção de uma amostra do doente compreendendo DNA, realização da amplificação, e.g. PCR, no DNA da amostra do doente usando uma sequência iniciadora de ácido nucleico do presente invento e análise do produto amplificado, por exemplo, através de sequenciação para identificar mutações particulares. Ainda noutros aspectos do invento, o agente pode ser um agente antiviral, como seja um inibidor da protease, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção helicase do gene NS3, alfa-interferão, ribavirina, interferão peguilado ou uma combinação dos mesmos. 20 ΡΕ1947104

Devido à sequência iniciadora do presente invento derivar de regiões conservadas do genoma do HCV, as composições e métodos aqui descritos ajudarão à detecção e/ou identificação de estirpes variantes do HCV. Isto, por sua vez, conduzirá ao desenvolvimento de agentes imuno-lógicos adicionais para a detecção e diagnóstico do HCV, assim como ao desenvolvimento de outros agentes polinucleo-tídicos para a detecção e/ou tratamento do HCV.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um método para determinar se um agente pode ou não ser usado para tratar um doente com HCV através da obtenção de uma amostra de um doente infectado com HCV, amplificação da amostra do doente usando as sequências de ácido nucleico iniciadoras do presente invento, sequenciação das sequências de ácido nucleico de HCV amplificadas resultantes e identificação de mutações na sequência do HCV amplificada que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente, determinando assim se o agente pode ou não ser usado para tratar um doente com HCV. Num aspecto do invento, as sequências de ácido nucleico são uma série de sequências iniciadoras.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um método para determinar se o tratamento com um agente adequado deverá ser continuado num doente infectado com HCV, o método compreendendo a obtenção de duas ou mais amostras compreendendo DNA de um doente no decurso do 21 ΡΕ1947104 tratamento, amplificação e sequenciação de uma sequência de ácido nucleico alvo a partir da amostra usando as sequências de ácido nucleico iniciadoras do presente invento nos métodos aqui descritos, identificação de mutações presentes na sequência de ácido nucleico amplificada que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente e continuação do tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado não se alterem no decurso do tratamento.

Ainda numa outra realização, o invento proporciona um método para determinar se o tratamento com um agente deverá ser continuado num doente infectado com HCV, o método compreendendo a obtenção de duas ou mais amostras compreendendo DNA de um doente no decurso do tratamento, amplificação e sequenciação das sequências de ácido nucleico alvo a partir das amostras usando as sequências de ácido nucleico iniciadoras do presente invento nos métodos aqui descritos, identificação de mutações presentes na sequência de ácido nucleico amplificada que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente e descontinuação do tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado se alterem no decurso do tratamento, e.g., um aumento no número de mutações durante o tratamento é um indicador de resistência a um agente.

Os exemplos específicos descritos abaixo também estabelecem uma correlação entre o tipo de HCV, parti- 22 ΡΕ1947104 cularmente conforme determinado pela análise do gene NS3, e a probabilidade de o virus responder a uma terapia antiviral, e.g., terapia com IFN alfa. Assim, um outro aspecto do invento é um método de avaliação de um doente diagnosticado ou suspeito de ter uma infecção por HCV para avaliar se a terapia, e.g., terapia com IFN alfa, tem probabilidade de ser bem-sucedida, compreendendo os passos de obtenção de uma amostra a partir do DNA do doente, comparação da porção protease serinica do gene NS3 e/ou da porção helicase do gene NS3, com as sequências de consenso do subtipo, em que a presença de uma ou mais mutações é indicativa de resistência à terapia. Será considerado que este mesmo tipo de metodologia pode ser usado para determinar se o virus (e portanto o doente) será sensivel ou resistente a outros agentes antivirais tais como um inibidor de proteases, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3 e um inibidor da porção helicase do gene NS3.

Numa outra realização, o invento corresponde a um método de avaliação da eficácia de um agente para o tratamento de HCV, o método compreendendo a comparação de sequências ácido nucleico numa primeira amostra obtida a partir de um doente exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados de uma ou mais sequências de ácido nucleico iniciadoras do presente invento, e sequências de ácido nucleico numa segunda amostra obtida a partir de um doente que não tenha sido exposto a um agente, em que as sequências de ácido 23 ΡΕ1947104 nucleico são produtos amplificados a partir de uma ou mais sequências de ácido nucleico iniciadoras do presente invento, em que um número aumentado de mutações nas sequências de ácido nucleico da primeira amostra, relativamente à segunda amostra, é uma indicação que o agente não é eficaz no tratamento do HCV. A realização do presente invento empregará, a menos que de outra forma seja indicado, técnicas convencionais de quimica, biologia molecular, DNA recombinante e imunologia, as quais estão dentro dos conhecimentos dos familiarizados com a matéria. Tais técnicas estão explicadas detalhadamente na literatura. (Ver e.g., Maniatis, Fitsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Volumes I e II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Sunthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); a série, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), particularmente o Vol. 154 e o Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectivamente) . Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações aqui mencionadas, supra e infra, são assim incluídas aqui como referência.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 descreve os resultados de uma reacção de PCR em duas reacções sucessivas da protease NS3 do vírus da hepatite C a partir de 7 amostras de doentes. 0 produto NS3 é de 2746 pb. A escada de tamanhos moleculares de DNA está na pista 1. 24 ΡΕ1947104

As Figuras 2A-2B descrevem árvores filogenéticas construídas a partir da protease NS3 de 30 estirpes de HCV usando a análise parcimónia e junção de vizinhos. A Figura 2A descreve uma árvore de consenso da análise de parcimónia, enquanto a Figura 2B descreve uma árvore de "bootstrap" a partir da análise de junção de vizinhos.

Descrição detalhada do invento O termo "agente" inclui qualquer substância conhecida destinada a tratar uma infecção ou doença, em particular agentes conhecidos por tratarem as infecções virais. 0 termo "agente" destina-se ainda a abranger agentes antivirais incluindo, mas não lhes estando limitados, um inibidor de proteases, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção helicase do gene NS3, interferão alfa, ribavirina e interferão peguilado.

Os termos "amplificação" ou "amplificar" incluem as reacções necessárias para aumentar o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico (e.g., uma sequência de DNA). Para fins do presente invento, amplificação refere-se ao aumento exponencial in vitro do número de cópias de uma sequência de ácido nucleico alvo, como seja a mediada por uma reacção de amplificação da polimerase como seja, e.g., PCR, no entanto outras reacções abrangidas pelo invento incluem, e.g., RT-PCR (ver, e.g., U.S.P.N. 4,683,202; 25 ΡΕ1947104

Mullis et al.) e a reacção em cadeia com ligase (Barany, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193 (1991)).

Os termos "vírus da hepatite C" e "HCV" referem-se à espécie virai que é o principal agente etiológico de BB-NANBH, o isolado protótipo do qual está identificado em WO89/046699; Publicação EPO 318,216; e Pat. U.S. No. 5,350,671, cujas descrições estão aqui incluídas como referência. "HCV" como aqui usado inclui as estirpes patogénicas capazes de causar hepatite C e estirpes atenuadas ou partículas defectivas interferentes derivadas das mesmas. 0 genoma do HCV é constituído por RNA. Sabe-se que os vírus de RNA possuem taxas relativamente elevadas de mutação espontânea, descritas como sendo da ordem de 10”3 a IO”4 por nucleótido incorporado (Fields & Knipe, "Fundamental Virology" (1986, Raven Press, N.Y.)). Uma vez que a heterogeneidade e plasticidade do genótipo são caracterís-ticas inerentes dos vírus de RNA, haverá múltiplas estirpes/isolados que podem ser virulentos ou avirulentos dentro da espécie do HCV.

Os termos "hibridar" ou "hibridação" são conhecidos e incluem a ligação de hidrogénio entre sequências de DNA e/ou RNA complementares para formar uma molécula de dupla hélice. 0 termo "estojo ("kit")" é qualquer objecto (e.g., embalagem ou recipiente) contendo pelo menos um reagente, e.g., uma sequência iniciadora, para amplificar 26 ΡΕ1947104 e/ou sequenciar especificamente uma porção do genoma do HCV, o objecto sendo promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para a realização dos métodos do presente invento. Um estojo ("kit") pode também incluir instruções para a sua utilização. 0 termo "marca" refere-se a um grupo molecular capaz de ser detectado, incluindo como exemplo, sem limites, marcas radioactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., "nick translation" ou fosfo-rilação), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos dirigidos), digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes e similares. 0 termo "nucleótidos" refere-se a qualquer nucle-ótido (incluindo nucleótidos modificados, e.g., nucleótidos metilados ou biotinilados) que podem ser incorporados num ácido nucleico por uma polimerase.

Como aqui usado o termo "ácido nucleico" inclui moléculas de DNA (e.g., cDNA ou DNA genómico), moléculas de RNA (e.g., mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados usando os análogos de nucleótidos ou usando química de ácidos nucleicos. Modificações típicas incluem metilação, biotinilação e outras modificações conhecidas. Ainda, a molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. 27 ΡΕ1947104 0 termo "ácido nucleico alvo" ou "matriz" inclui qualquer ácido nucleico destinado a ser copiado, e.g., numa reacção de amplificação com polimerase, como seja PCR. 0 termo "sonda" refere-se a uma estrutura constituída por um polinucleótido que forma uma estrutura híbrida com uma sequência alvo, devido à complementaridade de pelo menos uma sequência na sonda com uma sequência na região alvo. As regiões polinucleotídicas das sondas podem ser compostas por DNA e/ou RNA, e/ou análogos sintéticos de nucleótidos. Estão incluídas nas sondas as "sondas de captura", "sondas bloqueadoras" e "sondas marcadas". 0 termo "sequência iniciadora" ou "sequência iniciadora de ácido nucleico" inclui oligonucleótidos de cadeia simples que, tipicamente, têm entre cerca de 4 e cerca 100 bases ou, alternativamente, entre cerca de 17 e 30 bases, ou como alternativa 20 ou mais bases, e destinam-se a hibridar com um correspondente ácido nucleico alvo. As moléculas de sequências iniciadoras podem ser complementares da cadeia codificadora ou não codificadora de um ácido nucleico matriz e são tipicamente usadas como pares complementares que flanqueiam uma região de ácido nucleico de interesse.

O termo "polimerase" inclui qualquer um de uma mistura de enzimas de polimerização de nucleótidos E. coli, DNA polimerase I de E. coli, fragmento Klenow de DNA 28 ΡΕ1947104 polimerase I de E. coli, DNA polimerase de T4, transcri-ptase reversa em que a matriz é RNA e o produto de extensão é DNA ou uma DNA polimerase estável à temperatura. 0 termo "DNA polimerase estável à temperatura" inclui uma DNA polimerase estável à temperatura isolada de Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Pyrococcus furiosus, Thermococcus literolis, uma espécie de Thermotoga ou uma sua forma recombinante. 0 termo "amostra" ou "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo mas não estando limitado a sangue, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, as secções externas da pele, trato respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, urina células sanguíneas, tumores, órgãos, DNA genómico, RNA ou cDNA em solução ou ligada a um substrato e também amostras de constituintes de culturas celulares in vitro incluindo, mas não estando limitadas a meio condicionado resultante do crescimento de células no meio de cultura celular, células putativamente infectadas com vírus, células recombinantes e componentes celulares, e.g., cromossoma(s), organelos, tecido embebido em parafina ou membranas isoladas de uma célula. A "cadeia codificadora" de um ácido nucleico possui a sequência que tem homologia de sequência com a do mRNA. A "cadeia não codificadora" possui uma sequência que é complementar da "cadeia codificadora". 29 ΡΕ1947104 0 termo "região alvo" refere-se a uma região do ácido nucleico que se pretende amplificar e/ou detectar. 0 termo "sequência alvo" refere-se a uma sequência com a qual uma sonda ou sequência iniciadora formará um hibrido estável nas condições pretendidas. 0 termo "sequência polinucleotidica de alvejamen-to" como aqui usado, refere-se a uma sequência polinucleotidica que é constituída por nucleótidos complementares de uma sequência nucleotidica alvo; a sequência possui um comprimento e complementaridade relativamente à sequência alvo suficientes para formar uma dupla hélice que tem suficiente estabilidade para o fim pretendido. 0 HCV possui pelo menos seis genótipos e múltiplos subtipos dentro de cada genótipo. As sequências que correspondem aos subtipos la e lb do HCV podem ser seleccionadas de entre SEQ ID NOS :1-23 e SEQ ID NO:64, descritas nas Tabelas IA e 1G. As sequências que correspondem ao subtipo 2a do HCV podem ser seleccionadas de entre SEQ ID NOS:24-27, descritas na Tabela 1B. As sequências que correspondem ao subtipo 2b do HCV podem ser seleccionadas de entre SEQ ID NOS:28-42, descritas na Tabela 1C. As sequências que correspondem ao subtipo 3a do HCV podem ser seleccionadas de entre SEQ ID NOS :43-46, descritas na Tabela ID. As sequências que correspondem ao subtipo 3b do HCV podem ser seleccionadas de entre SEQ ID NOS :47-50, descritas na Tabela 1E. As sequências que correspondem ao subtipo 4a do HCV podem ser seleccionadas 30 ΡΕ1947104 de entre SEQ ID NOS :51-63, descrito na Tabela 1F. As sequências do invento descritas como SEQ ID NOS :1-64, estão descritas na Listagem de Sequências do pedido de patente.

Numa realização, os oligonucleótidos do presente invento são pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticos à sequência de nucleótidos descrita como SEQ ID NO:3. Ainda numa outra realização, o oligonucleótido de SEQ ID NO:3 tem pelo menos 4, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleótidos de comprimento. Será considerado que o extremo 5' poderá ter mais variabilidade (e.g., substituições de nucleótidos), ainda que mantendo-se funcional (e.g., capaz de emparelhar com a porção NS3 e NS4 do genoma do HCV). A preparação da sequência de ácido nucleico do presente invento é efectuada por meios conhecidos dos especialistas na matéria, incluindo, por exemplo, métodos que incluem excisão, transcrição ou síntese química. A sequência alvo e/ou regiões do genoma que são seleccionadas, com as quais a sequência de ácido nucleico alvo é complementar, dependem do objectivo. Por exemplo, se o objectivo for testar a presença de HCV em amostras biológicas (e.g. sangue), a sequência de ácido nucleico preferida será usada como sequência iniciadora e hibridará com regiões conservadas do genoma do HCV. Algumas das regiões conservadas do genoma do HCV com as quais a sequência de ácido nucleico do presente invento se pode 31 ΡΕ1947104 ligar estão aqui descritas. Outras regiões do genoma que são conservadas são deduzidas por comparação das sequências nucleotidicas de vários isolados do HCV como aqui descrito.

Será considerado que a sequência de ácido nucleico do presente invento não necessita de consistir apenas na sequência que é complementar da sequência alvo do HCV. Assim, a sequência de ácido nucleico do presente invento pode ainda conter sequências de nucleótidos ou outros grupos que sejam adequadas para os fins a que as sequências de ácido nucleico se destinam. Por exemplo, a utilização de sequências de ácido nucleico como sequências iniciadoras podem encontrar utilidade na amplificação de sequências de HCV através de PCR, podendo conter sequências que quando em dupla hélice formam locais de restrição que facilitam a clonagem das sequências amplificadas. A sequência de ácido nucleico do invento pode ser usada como sonda para detectar a presença de polinucleó-tidos de HCV (por exemplo no rastreio de sangue contaminado) , a amostra biológica a ser analisada, como seja sangue ou soro, pode ser tratada, caso se pretenda, para extrair os ácidos nucleicos nela existentes. 0 ácido nucleico resultante da amostra pode ser sujeito a electroforese em gel ou outras técnicas de separação; como alternativa, a amostra de ácido nucleico pode ser colocada numa membrana sem separação prévia de acordo com o tamanho. Para formar duplas hélices com a sequência de alvejamento 32 ΡΕ1947104 da sonda, a região alvo do ácido nucleico deve estar na forma de cadeia simples. Quando a sequência está naturalmente na forma de cadeia simples, não é necessária desnaturação. No entanto, quando a sequência está presente na forma de cadeia dupla, a sequência será desnaturada. A desnaturação pode ser efectuada por várias técnicas conhecidas na área. Após desnaturação, o ácido nucleico da amostra a analisar e a sonda são incubados em condições que promovem a formação de hibridos estáveis da sequência alvo na sonda com a sequência alvo putativa na amostra a analisar e as duplas hélices resultantes contendo a sonda são detectadas. A detecção da dupla hélice resultante, se existir, é geralmente conseguida através da utilização de sondas marcadas; como alternativa, a sonda pode não ser marcada, mas pode ser detectável pela ligação especifica com um ligando que está marcado, directamente ou indirectamente. Marcas e métodos adequados para a marcação de sondas e ligandos são conhecidos na área e incluem, por exemplo, marcas radioactivas que podem ser incorporadas por métodos conhecidos (e.g., "nick translation" ou fosfori-lação), isótopos radioactivos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos dirigidos) , digoxigenina, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação, corantes e similares. 33 ΡΕ1947104

As sequências de ácido nucleico do HCV amplificadas, geradas pelos métodos aqui descritos, podem ser clonadas num vector hospedeiro com um promotor de expressão e usadas como uma vacina de DNA para amplificar uma resposta do doente ao virus HCV, proporcionando assim uma vacina de DNA contra o HCV especifica de um doente. Numa outra realização, o clone pode ser usado para gerar RNA para usar como uma vacina não codificadora. Numa realização, é proporcionada uma vacina contra o HCV e empregue como agente imunoterapêutico para o tratamento de HCV.

Como exemplo, uma vacina contra o HCV pode ser empregue para a prevenção e/ou tratamento de HCV num indivíduo através da administração da vacina por uma variedade de vias, e.g., intradermicamente, subcutaneamente ou intramuscularmente. Ainda, a vacina contra o HCV pode ser administrada juntamente com adjuvantes e/ou imunomoduladores para reforçar a actividade da vacina e a resposta do hospedeiro. Numa realização, os sistemas e/ou composições contendo a vacina, adequados para a libertação controlada ou intermitente poderão ser implantados no corpo ou aplicados topicamente para a libertação relativamente lenta de tais materiais no corpo. A vacina contra o HCV pode ser introduzida juntamente com compostos imunomoduladores, os quais podem alterar o tipo de resposta imune produzida, de forma a produzir uma resposta que será mais eficaz na eliminação do virus. 34 ΡΕ1947104 EXEMPLOS ESPECÍFICOS EXEMPLO 1

DIVERSIDADE GENÉTICA E RESPOSTA AO INTERFERÃO DO GENE DA PROTEASE NS3 DAS ESTIRPES CLÍNICAS DO VÍRUS DA HEPATITE C

Este exemplo descreve uma análise da diversidade genética natural dentro do gene NS3, em que um método de PCR de duas reacções sucessivas foi desenvolvido para se obter os dados da sequência NS3 do HCV directamente a partir das estirpes dos doentes. Os dados foram analisados para determinar a diversidade genética global, filogenia do virus e selecção de variantes genéticas pela terapia com interferão, com ou sem ribavirina. Foram determinados os efeitos da diversidade genética na estrutura da enzima usando modulação molecular. Assim, uma abordagem compreensiva foi desenvolvida para facilitar a análise de variação genética natural dentro deste gene e o seu efeito na estrutura da proteína. 0 terço N-terminal do gene não estrutural 3 (NS3) do vírus da hepatite C codifica uma protease serínica (ver Figura 1 em Holland-Staley, C.A., et al., 2002, supra).

Apesar de se ter demonstrado que a diversidade genética é extensa noutras regiões do genoma do HCV, como seja a região do invólucro, o grau de diversidade dentro da 35 ΡΕ1947104 região da protease NS3 do HCV é largamente desconhecido. Assim, os dados aqui descritos foram usados para determinar as taxas evolutivas do vírus e para identificar os efeitos de mutações na estrutura da enzima. Para investigar a diversidade genética natural desta enzima, foi desenvolvida uma reacção de PCR em duas reacções sucessivas para se obter dados da sequência da protease NS3 directamente a partir das estirpes dos doentes. Estes dados foram usados para determinar a diversidade genética, filogenias e taxas evolutivas e selecção de variantes pela terapia com interferão. 0 efeito potencial da diversidade genética na estrutura da enzima usando modulação molecular foi também tentado. Ao serem efectuadas estas experiências, foi estabelecida uma base de dados de sequências naturais. Esta base de dados é útil no desenvolvimento de novas terapias antivirais. A diversidade genética entre as estirpes é importante devido à evidência de que alguns tipos de HCV são mais patogénicos do que outros (Cooreman, M.P. et al. (1996) Hepatitis C vírus: biological and clinicai consequences of genetic heterogeneity. Scand J Gastroenterol Suppl 218:106-115; Dusheiko, G. et al. (1994) Hepatitis C virus genotypes: an investigation of type-specific differences in geographic origin and disease. Hepatology 19:13-18; Stempniak, M. et al. (1997) The NS3 proteinase domain of hepatitis C virus is a zinc-containing enzyme. J Virol 71:2881-2886),), i.e. o HCV do tipo 1 relativamente a outros tipos e o subtipo lb relativamente 36 ΡΕ1947104 ao subtipo la. A causa da maior patogenicidade destas estirpes é pouco clara. A descrição das diferenças entre estirpes que apresentam uma progressão rápida para doença, comparativamente com as que não apresentam esta caracterís-tica, ajudará a elucidar a causa possivel e os mecanismos de patogénese (Farei, P. et al. (2000) The outeome of acute hepatitis C predicted by the evolution of the virai quasispecies. Science 288:339-344). Recentemente, Yanagi et al. (Yanagi, et al. (1998) Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype lb are infectious in vivo. Virology 244:161-172) demonstraram que o número de mutações dentro do genoma do HCV pode estar directamente relacionado com a infecciosidade. Escolheram três clones quiméricos de cDNA da mesma fonte e inocularam chimpanzés. Dos três clones, apenas um era infeccioso. Este clone continha 3 substituições de aminoácidos quando comparado com a estirpe parental, enquanto os clones não infecciosos continham substituições de 7 e 9 aminoácidos. Isto pode indicar um enviesamento da selecção em chimpanzés devido a diferenças do sistema imune e não uma característica da estirpe de HCV (Bassett, S.E. et al. (1998) Analysis of hepatitis C virus-inoculated chimpanzees reveals unexpected clinicai profiles. J Virol 72:2589-2599). Num outro estudo, quando a região hipervariável 1 foi analisada (Shindo, M. et al. T (1996) The clinicai significance of changes in genetic heterogeneity of the hyper-variable region 1 in chronic hepatitis C with interferon therapy. Hepatology 24:1018-1023) foi demonstrado que quantidades maiores de heterogeneidade estavam associadas a uma resposta global 37 ΡΕ1947104 mais fraca apesar do tratamento com interferão alfa. Ainda,

Chambers, T . J. et al. (Chambers, T.J. et al. (1991) Processing of the yellow f ever virus nonstructural polyprotein: a catalytically active NS3 proteinase domain and NS2B are required for cleavages at dibasic sites. J Virol 65:6042-6050) estabeleceram que as mutações que afectavam a actividade da protease NS3 do virus da febre amarela, eram letais para a replicação virai. A conclusão destes estudos reafirma a necessidade de caracterizar melhor o papel que a heterogeneidade desempenha na infecção pelo HCV. As composições e métodos do presente invento proporcionam um mecanismo para tal caracterização. Filocamo et al. (Filocamo et al., 1999. Selection of functional variants of the NS3-NS4A protease of hepatitis C virus by using chimeric sindbis viruses. J Virol 73:561-575) usaram virus Sindbis (SBV) quiméricos para analisar variantes da protease NS3/NS4. No entanto, os seus estudos usaram uma protease clonada e basearam-se na maquinaria de replicação do SBV para produzir variação de sequências. Ainda que isto tenha permitido a caracterização de novas variantes de protease, estas variantes podem ou não representar as obtidas na replicação do HCV in vivo. Ainda, Forns et al. (Forns X., et al. (1997) How Escherichia coli can bias the results of molecular cloning: preferential selection of defective genomes of hepatitis C virus during the cloning procedure. Proc Natl Acad Sei USA 94:13909-13914) encontraram, quando da clonagem dos produtos de PCR das proteínas estruturais do HCV em E. coli, que ocorria uma forte selecção de clones defectivos e não ocorria uma 38 ΡΕ1947104 representação precisa da verdadeira diversidade genética. A razão para isto é pouco clara; no entanto, a toxicidade das proteínas virais para o hospedeiro E. coli poderá desempenhar um papel nesta ocorrência. A sequenciação directa a partir de amostras de doentes deverá dar uma representação mais precisa da verdadeira diversidade genética. A maioria dos virus de RNA possui uma elevada taxa de mutação devido à ausência de enzimas com actividade de revisão de provas e devido às RNA polimerases dependentes de RNA produzirem um erro, aleatoriamente, por cada ciclo de replicação genómica (Drake, J.W. (1993) Rates of spontaneous mutation among RNA viruses. Proc Natl Acad Sei USA 90:4171-4175). Assim, se forem produzidos IO7’8 virus por dia e a taxa de mutação for aleatória, então cada posição possuirá teoricamente um número igual de mutações. Os dados aqui descritos, no entanto, mostraram que tal não acontece, indicando que apesar das mutações serem ao acaso, algumas regiões do virus são mais permissivas às mutações do que outras regiões. Isto sugere que os virus, ou pelo menos a região da protease NS3, estão sujeitos a outras restrições funcionais. A localização das alterações dos aminoácidos na protease NS3 do HCV de estirpes clinicas indica que as substituições de aminoácidos ocorrem nos dominios terminais N e C. Foi igualmente demonstrado que o domínio terminal N de NS3 apresenta plasticidade estrutural quando da ligação a NS4A. Kim, J.L. et al. (Kim, J.L. et al. (1996) Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 39 ΡΕ1947104 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell 87:343-355) e Yan, Y. et al. (Yan, Y. et al. (1998) Complex of NS3 protease and NS4A peptide of BK strain hepatitis C vírus: a 2.2 A resolution structure in a hexagonal crystal form. Protein Sei 7:837-847) descreveram que o domínio terminal N é flexível uma vez que a ligação de NS4A conduz à estruturação dos 28 resíduos de aminoácidos do extremo N e causa rearranjos locais para uma conformação catalítica mais favorável do centro activo. A activação da protease NS3 pelo péptido NS4A leva a um aumento de -950 vezes da hidrólise catalítica de péptidos que simulam a junção NS4A/NS4B (Yan. Y. et al. 1998 supra). Com base nas alterações estruturais previstas a partir das sequências de estirpes clínicas do HCV, pensa-se que existam alterações funcionais relativamente à protease selvagem. Um exemplo de tais alterações seria a alteração da constante de velocidade de pseudo-segunda ordem (< kçat / J^m) para as várias estirpes clínicas. Uma segunda observação é que a variação estrutural do complexo NS3/NS4A do HCV deva ser considerada no desenho, baseado na estrutura, dos inibidores de forma a manterem a eficácia contra uma larga gama de isolados clínicos.

Para as estirpes clínicas 23 e 25, as diferenças na designação do subtipo entre a região não traduzida 5' e a região da protease NS3 é desconhecida mas pode ocorrer devido à presença de mais de um subtipo. Foi demonstrada a infecção simultânea com múltiplas espécies de vírus da dengue (Gubler, D.J. et al. (1985) A case of natural 40 ΡΕ1947104 concurrent human infection with two dengue viruses. Am J Trop Med Hyg 34:170-173). Para a infecção por HCV, provavelmente isto é devido a múltiplas transfusões de sangue ou infecções de IVDA. Devido aos subtipos la e lb do HCV serem os mais predominantes nesta distribuição geográfica, a probabilidade de recombinarem aumenta. Foi demonstrada evidência de recombinação no virus da dengue, em que ocorre diversidade genética quando a RNA polimerase passa de um genoma para outro diferente durante a replicação, resultando num RNA hibrido (Holmes, E. C. et al. (2000) The causes and consequences of genetic variation in dengue virus. Trends Microbiol 8:74-77). Pode ser este o caso das estirpes 23 e 25, em que foram tipadas como HCV la com base na região não traduzida 5', mas estão mais perto da linhagem HCVlb no que respeita à sequência de nucleótidos da protease NS3. Os resultados de sequenciação eram claros e não mostraram evidência de mais de uma espécie, sugerindo que ocorreu recombinação antes do inicio de NS3. A comparação da sequência de aminoácidos, no entanto, mostrou resultados muito diferentes. O doente 23 tinha 3 mutações quando comparado com o consenso do tipo la e 16 mutações quando comparado com o consenso do tipo lb. O doente 25 mostrou resultados semelhantes com 4 mutações quando comparado com o tipo la e 16 quando comparado com o tipo lb. A razão das diferenças entre a análise da sequência de nucleótidos e a análise proteica é desconhecida. Sem pretender estar limitado pela teoria, pensa-se que estas duas estirpes representem um novo subtipo, o qual se situa na árvore evolutiva entre os subtipos la e lb. 41 ΡΕ1947104

Este exemplo revelou que existe uma variabilidade significativa nas estirpes clinicas de HCV nas sequências nucleotidicas (30,2% para la e 25.8% para lb) e de aminoácidos (12,2% para la e 12,2% para lb) . A análise filogenética mostrou duas linhagens distintas, com dois isolados do HCV a formarem uma linhagem irmã de lb. Ainda, a análise estrutural revelou que a maioria das mutações se situa no extremo N da enzima. Quando as estirpes foram classificadas com base no doente ter recebido terapia antiviral, não foi encontrada diferença no número ou localização das mutações nas estirpes la. No entanto, as estirpes lb demonstraram uma queda global no número de posições que estavam mutadas. Assim, este estudo demonstrou que existiam diferenças significativas entre as estirpes naturais, as quais podem colocar um problema para o desenvolvimento de fármacos baseados na estrutura, para o qual este invento proporciona uma solução. A relação entre variação de sequência e alterações estruturais no complexo NS3/NS4A do HCV pode também ser feita por cristalografia de raios X. Com base nas composições e métodos do presente invento, podem ser projectados fármacos antivirais, incluindo anti-HCV e desenvolvidos com base no conhecimento da variabilidade estrutural no complexo NS3/NS4A de estirpes clinicas do HCV para, no final, desenvolver terapias eficazes contra o HCV. 42 ΡΕ1947104

MATERIAIS E MÉTODOS

Extracção de RNA virai 0 RNA de HCV foi isolado a partir do soro de um doente usando o estojo ("kit") de isolamento mini QIAamp virai RNA (Qiagen Inc., Valência, CA). 0 isolamento foi realizado de acordo com instruções do fabricante. RT-PCR e amplificação de RNA virai A transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) seguido de uma segunda reacção de PCR ("nested") foi usada para amplificar a totalidade do gene NS3 dos subtipos la ou lb do HCV, a partir de estirpes clinicas. Para o passo de RT-PCR, foi usado o estojo ("kit") Access Reverse Transcriptase PCR da Promega (Promega Corporation, Madison, WI) . Para tal foram desenhadas duas sequências de oligonucleótidos iniciadoras que flanqueiam o gene NS3 do HCV. A sequência iniciadora 5' descrita em SEQ ID N0:1 emparelha 881 pb antes do inicio do gene NS3. A sequência iniciadora 3' descrita em SEQ ID NO:2 emparelha 338 pb a jusante de NS3 e foi usada para iniciar o passo RT (Tabela 1G, SEQ ID NOS: 1-4, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO:6, subsecção "Amplificação"). Isto permite a produção de cDNA seguido da amplificação inicial da região pretendida. A mistura de amplificação contendo 25 pmoles de cada sequência iniciadora, dNTPs 200 μΜ, 2,5 U AMV RT-polimerase, 2,5 U DNA polimerase Tfl, MgS04 1,5 mM e 20 μΐ 43 ΡΕ1947104

de RNA virai foi colocada num termocilador Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA.) pré-aquecido (48°C) . 0 protocolo de PCR consistiu num passo RT a 48°C durante 45 minutos, seguido de uma desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos; 55°C durante 20 segundos; 72°C durante 2 minutos; e uma extensão final a 72°C durante 10 minutos.

Para um segundo passo de reacção de PCR, o produto da Ia reacção foi amplificado usando sequências iniciadoras que emparelham internamente relativamente à reacção anterior, criando uma amplificação "nested". A segunda reacção de PCR usou a sequência iniciadora 5' descrita como SEQ ID NO: 3 que emparelha 639 pb a montante de NS3 e a sequência iniciadora 3' descrita como SEQ ID NO:4 que emparelha 161 pb a jusante. A mistura de amplificação contendo 25 pmoles de cada sequência iniciadora, dNTPs 200 μΜ, 2,5 U DNA polimerase Taq, MgS04 1,5 mM e 5 μΐ do produto da Ia reacção foi colocada num termociclador pré-aquecido (94°C). A desnaturação inicial consistiu em 10 minutos a 94°C, seguida de 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos; 55°C durante 20 segundos; 72°C durante 2 minutos; e uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. O produto de amplificação resultante é uma banda isolada de 2746 pb num gel de 1% de agarose. A totalidade do gene NS3 foi amplificada usando este método, no entanto, apenas o gene da protease NS3 foi aqui caracterizado. Os produtos da segunda reacção de PCR foram purificados e concentrados usando o protocolo Gene Clean Spin (Bio 101, 44 ΡΕ1947104

Vista, CA.)· Os produtos purificados foram usados directamente para sequenciação de DNA. Para assegurar que cada isolamento de RNA de HCV teve êxito, as sequências iniciadoras que cobrem a região 5' não traduzida (5'-UTR) altamente conservada foram usadas como controlo (Yuki, N. et al. (1997) Hepatitis C virus replicative leveis and efficiency of genotyping by specific PCR and antibody assay. J Clin Microbiol 35:1184-1189). Os produtos de PCR desta região de controlo foram também purificados como descrito atrás e sequenciados. Os dados da sequência da região 5' UTR foram então usados para genotipar cada uma das estirpes de HCV (0'Brien, C.B. et al. D (1997) cDNA sequencing of the 5' noncoding region (5' NCR) to determine hepatitis C genotypes in patients with chronic hepatitis C. Digestive Diseases and Sciences 42:1087-1093). Se a segunda reacção de amplificação de PCR não tiver êxito, pode-se fazer um novo ciclo de amplificação usando uma segunda série de sequências iniciadoras internas de reserva. A sequência iniciadora 5' de reserva, descrita como SEQ ID NO:64, e a sequência iniciadora 3' de reserva, descrita como SEQ ID NO:6, resultam num produto de amplificação de 2377 pb, o qual trunca o gene NS3 da helicase em 19 pb.

Sequenciação de DNA

A sequenciação dos produtos da segunda reacção de PCR purificados foi realizada usando a tecnologia ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram usados cinco sequências iniciadoras descritas como SEQ ID 45 ΡΕ1947104 NOS :7-11 (ver Tabela 1G, subsecção de "Sequenciação") destinados a cobrir a região da protease NS3 nas cadeias de ambos os sentidos. Para análise ABI, as reacções de sequenciação foram corridas em placas de microtitulação usando um termociclador durante 25 ciclos de 96°C durante 10 segundos; 50°C durante 5 segundos; e 60°C durante 4 minutos. Os produtos de reacção foram purificados com NaOAc/ETOH, suspensos em tampão de aplicação, desnaturados e corridos num sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems).

Análise de sequências

Os resultados da sequenciação ABI foram analisados usando o programa informático de análise de sequências ABI versão 3.3. Sequências individuais foram alinhadas com um consenso derivado de dados de sequências de todos os doentes e com sequências dos tipos la e lb do HCV (Números de acesso AF009606 e AJ000009) (Yanagi, M. et ai. (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl Acad Sei USA 94:8738-8743; e Yanagi, M. et ai., (1998),. Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype lb are infectious in vivo. Virology 244:161-172). As duas sequências do GenBank foram escolhidas para comparação devido a estarem disponiveis como construções clonadas para usar como controlos positivos para ensaios subsequentes de expressão proteica (dados não apresentados) . Os aminoácidos que diferem do consenso foram 46 ΡΕ1947104 comparados e usados para determinar quais os residuos conservados ou variáveis.

Análise filogenética

As sequências foram alinhadas usando o Sequencer 3.0 e o alinhamento de múltiplas sequências foi exportado como um ficheiro Nexus. A análise de máxima parcimónia foi corrida usando PAUP 3.1.1 (Swofford, D.L. (1993) PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony. 3.1 ed. Illinois Natural History Survey, Champaign, IL) com uma pesquisa heurística com permuta de ramos. Para comparação, foi também usada uma opção de enumeração e limitação ("branch and bound") para pesquisar as árvores de parcimónia máxima. Uma matriz de distâncias baseada em distâncias de Kimura a dois parâmetros foi gerada usando o programa DNADIST de PHYLIP Versão 3.573c (Felsenstein, J. (1993) PHYLIP (phylogenetic Inference Package), 3.5p ed. Department of

Genetics, University of Washington, Seattle). Usou-se uma proporção de transição para transversão de dois para um. A matriz de distâncias foi então analisada por análise de j unção de vizinhos (NJ) usando o programa NEIGHBOR do PHYLIP. A análise de suporte do indice de robustez ("bootstrap") foi realizada usando 1000 re-amostragens para as análises de NJ e de parcimónia. As séries de múltiplos dados para NJ foram geradas pelo programa SEQBOOT e as árvores múltiplas foram determinadas para o consenso pelo programa CONSENSE, ambos no PHYLIP. O indice de robustez da parcimónia foi completado usando a opção "bootstrap" no PAUP. 47 ΡΕ1947104 0 número de locais de segregação para cada população foi contado a partir dos alinhamentos múltiplos gerados com Sequencher 3.0. A distinção entre substituições sinónimas e não sinónimas foi feita com base nas traduções propostas das sequências. O parâmetro de mutações na população θ = 2Νμ foi estimado de acordo com Watterson (Watterson, G.A. (1975) On the number of segregating sites in genetical models without recombination. Theoretical Pop Biol 7:256-276). Os testes de neutralidade foram de acordo com McDonald e Kreitman (McDonald, J. et al. (1991) Adaptive protein evolution at adh locus in Drosophila. Nature 351:652-654).

Modelação da estrutura de proteínas por homologia A modelação da estrutura proteica por homologia através da satisfação das restrições espaciais foi realizada de acordo com o método de Sali et al., 1995 (Sali, A. (1995) Comparative protein modeling by satisfaction of spatial restraints. Mol Med Today 1:270-277). Modelação da estrutura de proteínas por homologia baseia-se na construção de um modelo estrutural com base na semelhança estreita com uma proteína matriz de estrutura conhecida.

Na primeira fase da modelação da estrutura proteica, é obtido o alinhamento entre a sequência conhecida e estruturas matrizes relacionadas. Em segundo lugar, as restrições relativamente a várias distâncias, 48 ΡΕ1947104 ângulos e ângulos diedrais na sequência foram derivados com base no seu alinhamento com as estruturas matrizes. Finalmente, os modelos tridimensionais foram obtidos através da minimização de violações de restrições derivadas da homologia e de energia, usando gradientes conjugados e procedimentos de dinâmica molecular. Um passo importante nas experiências de modelação proteica por homologia é a avaliação da qualidade do modelo. Para assegurar a qualidade, foram usados testes internos de consistência conforme implementados no pacote de programas MODELLER 4 (Sali, A. et al. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol 234:779-815) para testar o perfil tridimensional. 0 pacote de programas de modelação comparativa de proteínas MODELLER foi usado para calcular as estruturas do complexo NS3/NS4 do HCV. Este pacote de programas foi extensivamente testado em projectos de genómica estrutural por Sanchez e Sali, 1998 (Sanchez, R. et al. (1998) Large-scale protein structure modeling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Proc Natl Acad Sei USA 95:13597-13602). A estrutura cristalina 2,2Â do complexo da protease NS3 do e do péptido NS4 do HCV (Yan, Y. et al. 1998, supra) foi usada como matriz para as experiências de modelação por homologia para avaliar as alterações estruturais nas estirpes clínicas para a protéase NS3 do HCV. A estrutura cristalina do complexo NS3/NS4A do HCV e as estruturas modeladas das proteases NS3/NS4A do HCV foram sobrepostas pelos mínimos quadrados usando o programa "suite O" (Jones, 49 ΡΕ1947104 T.A. et al. (1991) Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst A47:110-11932). A optimização dos modelos de NS3/NS4A do HCV foi realizada usando os parâmetros por defeito do MODELLER 4.0 (número de iterações na optimização = 200; tipo de restrição não ligado = termos de repulsão dinâmica de esferas brandas ("soft-sphere")) . O modelo foi obtido através da optimização de uma função objectiva (restrições espaciais combinadas e termos de energia CHARMM forçando a estereoquimica correcta) no espaço cartesiano. Números de acesso das sequências de nucleótidos no GenBank

As sequências de nucleótidas aqui descritas foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 9 de Abril, 2001 e atribuídos os Números de Acesso AF369214 a AF369263. Estes depósitos serão mantidos nos termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimento de patentes. Estes depósitos foram feitos apenas por conveniência para os familiarizados com a área e não é uma admissão que seja necessário um depósito de acordo com 35 U. S.C.§112. 50 ΡΕ1947104

RESULTADOS

População de doentes

Analisou-se o soro de trinta doentes com HCV dos subtipos la ou lb. Foram incluídos dezoito homens e doze mulheres com uma média de idades de 50,2 anos (gama, 21-76). Dezanove não tinham sido previamente tratados, enquanto os restantes 11 tinham tratamento com IFN cx + ribavirina (pt 176) ou um curso inicial de IFN α seguido de um segundo ciclo de terapia de combinação (doentes 252, 174, 186, ID, 1Y, 179, 25) . Todos os doentes receberam 3 milhões de unidades, 3x por semana durante 12 meses excepto os doentes 11 e 205, os quais receberam um segundo ciclo de terapia com IFNa de 5 milhões de unidades 4x por semana e 1,5 milhões de unidades 3x por semana, respectivamente e os doentes 186 e 1Y que interromperam a terapia após 6 meses. Nenhum deles teve uma resposta sustentada. Todos os doentes possuíam cargas virais de RNA do HCV entre 5,1 x 104 e 2,3 x 106 cópias/ml, determinadas usando o teste Roche Amplicor® HCV Monitor.

Genotipagem A região não traduzida 5' conservada foi sequenciada para colocar cada uma das estirpes no respectivo genótipo usando o método de 0'Brien et al. (0'Brien, C.B. et al. (1997) cDNA sequencing of the 5' 51 ΡΕ1947104 noncoding region (5' NCR) to determine hepatitis C genotypes in patients with chronic hepatitis C. Digestive Diseases and Sciences 42:1087-1093). Os resultados dos genótipos mostraram que 21 sequências eram HCV subtipo la e 9 eram subtipo lb. Estes dados são consistentes com a população de doentes, com os subtipos la e lb do HCV a serem os mais prevalentes nesta região do mundo. Os dados aqui descritos demonstram uma correlação entre o genótipo de 5'-UTR e os dados das sequências de NS3.

Amplificação e sequenciação da região NS3 de estirpes clinicas O gene da protease NS3 foi aqui amplificado e sequenciado com êxito a partir de soro de 30 doentes infectados com HCV dos subtipos la ou lb. O produto de amplificação deu origem a uma banda única com uma taxa de sucesso >80% (Figura 1). As sequências resultantes foram então traduzidas e uma sequência de consenso foi derivada a partir do alinhamento das sequências de todos os doentes. Cada uma das sequências dos doentes foi comparada com a sequência de consenso e com as sequências protótipos encontradas no GenBank para cada subtipo ((Genbank # AF009606 & # AJ000009) (Yanagi, M. et al., 1998, supra; ver também

Yanagi, M. et al., 1998, supra) . As regiões variáveis e conservadas dentro destas sequências foram então determinadas para os resíduos de nucleótidos e de aminoácidos. 52 ΡΕ1947104

Análise da sequência de nucleótidos

Existem 543 nucleótidos que codificam o gene da protease NS3. Os dados de sequenciação foram analisados para determinar a distribuição de nucleótidos em cada posição quando comparados com a sequência de consenso derivada do doente e as duas sequências de consenso derivadas do Genbank. Para as estirpes pertencentes ao subtipo la do HCV, 164 posições possuíam uma ou mais substituições de nucleótidos quando comparadas com a sequência de consenso do doente, resultando numa variação global da sequência de 30,2% (dados não apresentados). Estas incluíram 133 transições, 9 transversões e 22 locais com transições e transversões. Quando comparado com o protótipo la, 20 posições eram diferentes (variação global da sequência de 3,5%), com 17 posições contendo transições e 3 contendo transversões (Tabela 2A). Não foram detectadas inserções ou deleções. Para as estirpes tipadas como HCV do subtipo lb, 140 posições possuíam uma ou mais substituições de nucleótidos quando comparadas com a sequência de consenso do doente, resultando numa variação global da sequência de 25,8% (dados não apresentados). Estas incluíram 114 transições, 8 transversões e 18 locais com transições e transversões. Quando comparadas com o protótipo lb, 38 posições eram diferentes (variação global da sequência de 7,4%), com 34 transições e 4 transversões (Tabela 2B) . Não foram detectadas inserções ou deleções em quaisquer sequências. Sem pretender estar limitado pela teoria, devido à taxa de mutação prevista introduzida 53 ΡΕ1947104 durante a amplificação por PCR ser de -0,1%, pensamos que os dados retractam uma representação precisa da variação natural das sequências genéticas.

Análise da sequência de aminoácidos

Existem 181 aminoácidos que constituem a protease NS3. Os efeitos da substituição de nucleótidos na sequência de aminoácidos mostraram que a maioria das substituições era silenciosa. Para as 21 sequências de doentes pertencentes ao subtipo la do HCV, 22 resíduos diferiam da estirpe consenso do doente (Tabela 3) . A sequência protótipo diferiu da sequência consenso dos doentes em 5 resíduos (A40T, K80K, A91S, I153L, E176G) incluindo uma mutação não encontrada em quaisquer sequências dos doentes (sublinhada) . Três locais tinham mais de duas espécies de aminoácidos presentes (Vizmanos, J.L. et al., 1998, supra; Yanagi, M. et al. (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C vírus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl Acad Sei USA 94:8738-8743), e um local (resíduo 86) podia tolerar 4 resíduos diferentes. Incluindo a sequência de controlo, 9 locais tinham substituições dos aminoácidos do mesmo tipo, 9 locais eram capazes de acomodar aminoácidos neutros ou polares, 3 locais básico ou polares, 2 locais acídicos ou polares e um local acídico ou neutro. Apenas duas estirpes eram idênticas ao consenso sem substituições de aminoácidos (K e 161). 54 ΡΕ1947104

Para as estirpes dos doentes tipadas como HCV lb, houve uma variação global da sequência de 12,2%, com 22 locais diferentes do consenso derivado dos doentes (Tabela 4) . 0 consenso dos doentes diferiu da sequência protótipo em 8 residuos (L13V, V48I, Q80L, L94M, T98S, A150V, I153V, V170I) incluindo 4 locais não identificados anteriormente (sublinhados), aumentando o número de locais contendo um ou mais aminoácidos para 26. Mais de duas espécies de aminoácidos estavam presentes em 2 locais (61 e 80) e o residuo 67 tinha até 4 residuos diferentes (resíduo 86 não continha qualquer mutação) . 0 mesmo tipo de substituição foi observado em onze locais, 8 locais acomodaram aminoácidos neutros ou polares, 1 local básicos ou polares, 2 locais básicos ou neutros e o local restante tinha uma alteração de aminoácido de neutro para aromático. Apenas a estirpe 153 era idêntica ao consenso. Para os tipos la ou lb não foram encontradas substituições de aminoácidos em resíduos conhecidos como conservados.

Selecção pela terapia com interferão

As diferenças mais significativas foram observadas quando as estirpes foram agrupadas de acordo com o hospedeiro ter sido sujeito ou não a terapia com interferão, com ou sem ribavirina, o número total de mutações por doente sendo em média de 1,9 para as estirpes do tipo la, com 14 locais contendo mutações. Após terapia com interferão, o número de mutações por doente era em média 55 ΡΕ1947104 2,6 com 15 locais contendo aminoácidos diferentes. Apenas 7 locais eram semelhantes antes e após terapia (Tabela 3) . Para as estirpes do tipo lb, o número médio de mutações por doente para as estirpes não sujeitas a terapia com interferão era de 3, 6 com 18 locais variando na globalidade. No entanto, após terapia com interferão, enquanto o número de mutações por doente não era significativamente diferente (3,0), o número de locais que continham mutações nas estirpes lb caiu para 10, ou seja em 56% (Tabela 4) com 6 locais semelhantes nas estirpes com ou sem terapia. Isto sugere que as estirpes sensíveis eram eliminadas durante a terapia com interferão e estes 10 locais restantes podem de alguma forma estar envolvidos na resistência do virus ao interferão.

Resumindo, as alterações de aminoácidos que mais frequentemente ocorreram estão representadas pelas mutações de aminoácidos de hidrofóbicos para hidrofóbicos seguido de alterações das cadeias laterais carregadas positivamente para neutras. A taxa de mutações de uma cadeia lateral de aminoácido mais volumosa para menos volumosa ocorre a uma taxa mais elevada que o seu contrário. Nas estirpes do tipo lb, a diversidade de sequências na protease NS3 é significativamente reduzida nas estirpes de doentes que tenham sofrido terapia com IFN. Isto sugere que as estirpes sensíveis são eliminadas durante a terapia com interferão e as estirpes que permanecem após terapia podem ser menos sensíveis ao fármaco. 56 ΡΕ1947104

Análise filogenética e evolução molecular A análise de parcimónia usando uma pesquisa heurística com permuta de ramos detectou 141 árvores igualmente parcimoniosas com 696 passos. As sequências foram agrupadas em mais de 95% das árvores em duas linhagens, as linhagens HCVla e HCVlb. A linhagem HCVla consiste em 19 estirpes (K, 4, 11, 12, 24, 161, 170, 174, 176, 177, 183, 186, 194, 252, 1C, 1D, 1H, IX e 1Y) em vez das 21 identificadas por genotipagem. As restantes amostras (1, 23, 25, 153, 179, 205, IA, 1G, 1U, 2D e 2F) agruparam- se HCVlb. Estes resultados são fortemente suportados na análise de índice de robustez, ainda que as relações hierárquicas dentro das duas linhagens não seja fortemente suportada (Figura 2A). Em particular, a Figura 2A descreve uma árvore de consenso da análise de parcimónia. Os comprimentos dos ramos foram desenhados para corresponderem aos grupos hierárquicos e não reflectem os passos de mutações entre as estirpes. Dentro da linhagem HCVlb, as duas estirpes 23 e 25 são grupos irmãos relativamente às restantes estirpes. Estas duas amostras, 23 e 25, agruparam com o tipo HCVla por genotipagem e na comparação das sequências de aminoácidos. A Figura 2B descreve uma árvore de índice de robustez derivada da análise de junção de vizinhos. A análise de junção de vizinhos produziu resultados muito semelhantes à análise de parcimónia indicando uma linhagem 57 ΡΕ1947104 HCVlb bem separada consistindo nas estirpes 1, 1G, 153, 2D, IA, 179, 2F, 1U e 205 (Figura 2B). Os suportes de "bootstrap" das linhagens, como aqui descrito, estão indicados a seguir aos seus ramos respectivos, Ainda, os comprimentos dos ramos estão à escala das suas distâncias genéticas.

As estirpes 23 e 25 agrupam-se novamente como uma linhagem irmã relativamente à linhagem do HCVlb. Estes dados, juntamento com os dados de aminoácidos, sugerem a sua arrumação numa terceira linhagem geneticamente diferenciada. As relações hierárquicas dentro das duas linhagens principais diferem da árvore de consenso de parcimónia, mas nenhuma das diferenças é fortemente suportada no NJbootstrap. A linhagem HCVlb é suportada em 100% das amostragens de indice de robustez. O agrupamento separado de 23-25 é suportado em 97,4% das amostragens do indice de robustez. Dentro da linhagem HCVla, as estirpes 4 e 1Y são monofiléticas com 84% de suporte, e 11, 170 e 117 são monofiléticas com 66% de suporte.

Análise das taxas evolutivas

As taxas de evolução das populações para as três linhagens foram estimadas de acordo com Watterson, G.A., 1975, supra. Os estimadores de (±DP) para HCVla, HCVlb, e PT 23-25 são 42,28153.77, 49,49161.81 e 40140,50, respectivamente. Assim, não existe indicação de taxas diferentes de evolução a ocorrer entre as três linhagens. 58 ΡΕ1947104

Os testes de evolução não neutra entre as duas principais linhagens HCVla e HCVlb foram executados usando o método de McDonald e Kreitman (McDonald, J. et al. (1991) Adaptive protein evolution at adh locus in Drosophilia. Nature 351:652-65441). Sob neutralidade, a razão entre locais de segregação sinónimos e não sinónimos deverá ser constante dentro entre populações. Nas comparações das populações de HCVla e de HCVlb, o valor de X2 é de 2,30 indicando a não existência de desvio significativo das expectativas neutras para o desvio das sequências entre as duas populações.

Modelação molecular

As experiências de modelação com homologias de proteínas do complexo protease NS3/NS4B do HCV foram realizadas com a matriz da estrutura de cristal de 2,2Â da protease NS3 e péptido NS4A de Yan, Y. et al., 1998, supra; para avaliar as alterações tridimensionais devido a variação da sequência em estirpes clínicas. As estirpes mais divergentes foram seleccionadas para modelação. O foco é nos subtipos A e B e, portanto, foram seleccionados para este estudo duas sequências de isolados muito divergentes do subtipo IA e duas sequências correspondentes muito diferentes pertencentes ao subtipo 1B. Quatro estirpes clínicas (252, 1G, 1H e 1U) foram seleccionadas para experiências de modelação. Duas das estirpes (252 e 1H) pertencem ao subtipo la e as outras duas estirpes (1G e 1U) pertencem ao subtipo lb. As mutações ocorrem mais frequentemente nas regiões de ansa ou nos extremos das cadeias β. As mutações também ocorrem nas hélices α de NS3. 59 ΡΕ1947104

Os modelos de homologia para as sequências de consenso HCVla ou HCVlb usando a estrutura cristalina do complexo NS3/NS4A de Yan, Y. et al., 1998, supra, foram computarizadas com o programa MODELLER. Os modelos dos consensos la e lb foram sobrepostos para análise detalhada (ver Figura 4 em Holland-Staley, C. A., et al., 2002, supra), indicando as maiores diferenças entre os dois subtipos. Ainda, existem diferenças notórias tanto no centro activo como noutras posições. Existem diferenças distintivas nas posições dos três resíduos da tríade catalítica, Asp81, His57 e Serl39. Os resultados de modelação sugerem diferenças funcionais para os dois subtipos.

Os modelos das estirpes clínicas de HCV 252, 1G,

1H e 1U que possuem múltiplas alterações de aminoácidos foram sobrepostos na estrutura cristalina do complexo selvagem de NS3/NS4A de Yan, Y. et al., 1998, supra. O complexo NS3/NS4A da estirpe 1G foi comparado com a estrutura cristalina selvagem (ver Figura 5 em Holland-

Staley, C. A., et al., 2002, supra) . Existem diferenças distintas nas posições dos três resíduos da tríade catalítica (Asp81, His57 e Serl39). Diferenças potenciais

semelhantes foram observadas para as estirpes 252, 1H e 1U (dados não apresentados) (Holland-Staley, C. A., et al. (2002) Genetic diversity and response to IFN of the NS3 protease gene from clinicai strains of the hepatitis C 60 ΡΕ1947104 virus. Arch Virol 147:1385-1406, que aqui é incluído como referência) . EXEMPLO 2

UM DECRÉSCIMO NA DIVERSIDADE GENÉTICA DENTRO DO GENE DA HELICASE NS3 DE ISOLADOS CLÍNICOS DO VÍRUS DA HEPATITE C ESTÁ CORRELACIONADO COM A TERAPIA COM INTERFERÃO

Este exemplo descreve os efeitos da terapia com interferão (com ou sem ribavirina) no gene da helicase NS3 de doentes infectados com HCV tipo la ou lb. Para tal, foi desenvolvida uma reacção de PCR de duas reacções sucessivas ("nested"), a qual permite a recuperação dos dados das sequências NS3 do HCV directamente a partir de isolados de doentes. Para analisar os efeitos da terapia com IFN, uma sequência de consenso derivada de doentes foi preparada e usada para determinar o número de mutações em cada isolado clinico. Em seguida, as sequências foram agrupadas de acordo com o doente ter ou não terapia com IFN (narve vs tratado) e analisado o números de posições que foram mutadas. Estas mutações foram também usadas para prever a resposta ao IFN. Os resultados demonstram que ocorre um decréscimo significativo na variabilidade global da sequência nos isolados que foram sujeitos a terapia com IFN. Assim, o presente invento proporciona um método para analisar os efeitos de IFN no gene NS3 do HCV e determina os seus efeitos na população de quasispécies. ΡΕ1947104 61

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras dos doentes e extracção de RNA virai

Foi analisado o soro de quarenta e três doentes infectados com os subtipos la ou lb do HCV. Foram incluídos vinte e três homens e vinte mulheres com uma idade média de 51,1 anos (gama, 21-76). Vinte e nove não tiveram tratamento, enquanto os restantes 14 tiveram tratamento com interferão apenas ou combinado com ribavirina. Todos os doentes tinham cargas de RNA virai de HCV entre 5,1 x 104 e 2,3 x 106 viriões/ml, determinado através da utilização do teste Roche Amplicor® HCV Monitor Test. 0 RNA do HCV foi isolado a partir do soro dos doentes usando o estojo ("kit") de isolamento de RNA virai "QIAamp virai RNA mini isolation kit" (Qiagen Inc., Valência, CA.). 0 isolamento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. rt-pcr e amplificação de RNA virai A reacção de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) seguida de uma segunda reacção de PCR ("nested") foi usado para amplificar o gene NS3 dos subtipos de HCV la ou lb a partir de isolados clínicos. 0 passo de RT-PCR usou o estojo ("kit") Promega Access Reverse Transcriptase PCR (Promega Corporation, Madison, WI.) . Para tal, foram desenhadas duas sequências iniciadoras oligonucleotídicas flanqueantes do gene. (5'-CTA CTC CTG CTC CTG CTG GCG TT -3') (emparelha 693 pb antes 62 ΡΕ1947104 da iniciação do gene NS3. A sequência iniciadora 3' 5'- CTG ATG AAA TTC CAC ATG TGC TTC GCC CA - 3') emparelha 338 pb a jusante de NS3 e foi usada para iniciar o passo de RT. Isto permite a produção de cDNA seguida da amplificação inicial da região pretendida. A mistura de amplificação contendo 25 pmoles de cada sequência iniciadora, dNTPs 200 μΜ, 2,5 U de RT AMV-polimerase, 2,5 U DNA-polimerase Tfu, MgSCg 1,5 mM e 20 μΐ de RNA virai foi colocada num termocilador Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA.) pré-aquecido (48°C). O protocolo de PCR consistiu num passo de RT a 48°C durante 45 minutos, seguido de uma desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos.

Para a segunda reacção de PCR, o produto da primeira reacção de pCR foi amplificado usando sequências iniciadoras, as quais emparelham dentro da reacção anterior, criando uma amplificação "nested". A segunda reacção de PCR usou a sequência iniciadora 5' (5'- GAGCCC GTC GTC TTC TC -3') e a sequência iniciadora 3' (5'- CAC TCT TCC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG -3'). A mistura de amplificação contendo 25 pmoles de cada sequência iniciadora, dNTPs 200 μΜ, 2,5 U de Taq©DNA-polimerase, MgS04 1,5 mM e 5 μΐ do produto da primeira reacção foi colocada num termociclador pré-aquecido (94°C). A desnaturação inicial consistiu em 10 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 15 segundos; 55°C durante 20 segundos; 72°C durante 2 minutos; e uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. O produto de amplificação 63 ΡΕ1947104 resultante é uma única banda de 2219 pb num gel de 1% de agarose. A totalidade do gene NS3 foi amplificado usando este método, no entanto apenas o gene da helicase NS3 foi aqui caracterizado. Os produtos da segunda reacção de PCR foram purificados e concentrados usando o protocolo Gene Clean Spin (Bio 101, Vista, CA.). Os produtos purificados foram usados directamente para sequenciação de DNA. Para assegurar que cada isolamento de RNA de HCV teve êxito, sequências iniciadoras que cobrem a região 5' não traduzida (5'-UTR) altamente conservada foram usadas como controlo (Yuki, 1997 #226) . Os produtos de PCR desta região de controlo foram também purificados como descrito atrás e sequenciados. Os dados da sequência da região 5' UTR foram então usados para genotipar cada um dos isolados de HCV (0'Brien, 1997 #30). Se a amplificação não teve êxito, fez-se um novo ciclo de RT-PCR usando uma segunda sequência iniciadora 3' de reserva. A sequência iniciadora 3' de reserva (5'- GCC GAC ATG CAT GYC ATG ATG TAT TT-3') resulta num produto de amplificação de 2039 pb, o qual trunca o gene NS3 em 20 pb.

Sequenciação de DNA

A sequenciação dos produtos da segunda reacção de PCR purificados foi realizada usando a tecnologia ABI Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram usadas onze sequências iniciadoras (A-K) destinadas a cobrir a região da helicase NS3 em ambas as cadeias. As sequências iniciadoras directas foram: A (5'-TCG GAC CTT 64 ΡΕ1947104 TAC TTG GTC ACG AG-3'), B (5'-TAC TCC ACC TAT GGC AAG TTC CT-3'), C (5'-CAT CTC ATY TTC TGC CA-3'), D (5'-GAG TGC TAT GAC GCG GGC TGT GCT T-3'), E (5'-CCA TCG TGG GAY CAA ATG TGG AAG TGT-3'), F (5'-AAA TAC ATC ATG RCA TGC ATG TCG GC-3'). As sequências iniciadoras inversas foram: G (5'-AGG AAC TTG CCA TAG GTG GAG TA-3'), H (5'-GAG TGG CAC TCA TCA CA-3'), I (5'-TCG ACT GTC TGR GTG ACA CA-3'), J (5'-GCC GAC ATG CAT GYC ATG ATG TAT TT-3'), K (5'-CAC TCT TCC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG-3'). Para a análise ABI, as reacções de sequenciação foram corridas em placas de microtitulação usando um termociclador durante 25 ciclos de 96°C durante 10 segundos, 50°C durante 5 segundos; e 60°C durante 4 minutos. Os produtos de reacção foram purificados com NaOAc/ETOH, suspensos em tampão de aplicação, desnaturados e corridos num sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems).

Análise de sequências

Os resultados da sequenciação ABI foram analisados usando o programa informático de análise de sequências ABI versão 3.3. Sequências individuais foram alinhadas com um consenso derivado de dados de sequências de todos os doentes e com sequências dos tipos la do HCV (Números de acesso AF009606) e lb (Número de acesso AJ000009) do HCV (Yanagi, 1997 #227) (Yanagi, 1998 #228) . As duas sequências do GenBank foram escolhidas para comparação devido a estarem disponíveis como construções clonadas para usar como controlos positivos para ensaios subsequentes de expressão proteica (dados não apresen- 65 ΡΕ1947104 tados). Os aminoácidos que diferiam do consenso foram comparados e usados para determinar quais os resíduos conservados ou variáveis.

Numeros de acesso das sequências de nucleótidos no GenBank

As sequências de nucleótidos aqui descritas foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 9 de Abril, 2001 e atribuídos os Números de Acesso AF369214 a AF369263. Estes depósitos serão mantidos nos termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimento de patentes. Estes depósitos foram feitos apenas por conveniência para os familiarizados com a área e não é uma admissão que seja necessário um depósito de acordo com 35 U. S.C.§112.

RESULTADOS

Análise das sequências do gene da helicase NS3 do HCV.

Uma reacção de PCR "nested" foi usada para amplificar e sequenciar o gene da helicase NS3 do HCV do soro de 43 doentes infectados co os subtipos la ou lb do HCV. A região não traduzida 5' conservada foi usada para colocar cada isolado no respectivo genótipo usando o método 66 ΡΕ1947104 de 0'Brien et ai., Os resultados da genotipagem mostram que 30 sequências eram HCV do subtipo la e 13 eram do subtipo lb. Estes dados são consistentes com a população de doentes, uma vez que os subtipos la e lb do HCV são os mais prevalentes nesta região do mundo. A partir dos dados das sequências NS3, uma sequência de consenso derivada dos doentes foi gerada e usada para determinar a variabilidade genética dos isolados dos doentes relativamente à distribuição de nucleótidos e à substituição de aminoácidos.

Dentro das sequências analisadas, foi identificada variação significativa na sequência de nucleótidos e de aminoácidos. Existem 1350 nucleótidos que codificam o gene da helicase de NS3. Os dados de sequenciação foram analisados para determinar a distribuição de nucleótidos em cada posição quando comparado coma sequência de consenso derivada de doentes e com as duas sequências de protótipos do Genbank (Genbank # AF009606 & # AJ000009) . Para os isolados pertencentes a HCV subtipo la, 436 posições continham uma ou mais substituições de nucleótidos quando comparadas com a sequência de consenso dos doentes, resultando numa variação global de sequências de 32,3%. Estas incluíram 355 (26,30%) de transições, 30 (2,22%) de transversões e 51 (3,78%) de transições e de transversões. O HCVla protótipo diferiu em 34 posições (variação global da sequência de 2, 52%) com 30 posições contendo transições e 4 contendo transversões. Não foram detectadas inserções ou deleções nas sequências dos doentes ou no protótipo. Para os isolados tipados como HCV subtipo lb, 390 posições 67 ΡΕ1947104 continham uma ou mais substituições quando comparados com a sequência de consenso, para uma variação global de sequências de 28,99%. Houve 309 (22,89%) de transições, 36 (2,67%) de transversões e 45 (3,33%) contendo transições e transversões. Houve 55 posições na sequência protótipo HCV lb que eram diferentes da sequência de consenso derivada dos doentes, com uma diferença global de sequência de 4,07%, com 47 transições e 8 transversões. Não foram detectadas inserções ou deleções em quaisquer sequências. Uma vez que a taxa de mutação prevista introduzida durante as amplificações por PCR é -0,1%, crê-se que os dados aqui apresentados são uma representação precisa da variação natural das sequências genéticas.

Existem 450 aminoácidos que constituem a protease NS3. Os efeitos da substituição de nucleótidos na sequência de aminoácidos mostraram que a maioria das substituições era silenciosa. Para as 30 sequências de doentes pertencentes ao HCV subtipo la, 65 residuos ou 14,4% diferiu do consenso derivado do doente (Tabela 5A). A sequência publicada diferiu do consenso dos doentes em 5 residuos. A maior parte das posições possui um único tipo de substituição, 6 posições possuem três espécies de aminoácidos, 2 posições (residuos 334 & 383; numeração dentro de NS3) podem tolerar 4 resíduos diferentes. Incluindo a sequência controlo, 38 posições tinham substituições do mesmo tipo de aminoácidos, 20 locais eram capazes de acomodar aminoácidos neutros ou polares, 2 locais básicos ou polares, 2 locais acídicos ou polares, 1 68 ΡΕ1947104 local básico ou neutro, 1 local acídico ou neutro e 1 local básico, polar ou neutro. Apenas 1 doente (pt. 186) era idêntico ao consenso sem substituições de aminoácidos. A Tabela A resume as mutações que ocorrem em mais de uma sequência de doente.

Para os isolados de doentes tipados como HCV lb, houve uma variação global das sequências de 11,33%, com 51 locais diferentes do consenso derivado dos doentes (Tabela 5B) . 0 consenso do doente diferiu da sequência do Genbank em 13 residuos, incluindo 4 residuos novos, elevando para 55 o número total de locais contendo um ou mais aminoácidos ou 12,22% de variação da sequência. Três tipos de aminoácidos estavam presentes em 9 locais, com o resíduo 402 capaz de ter 5 aminoácidos diferentes e o resíduo 470 tendo 7 aminoácidos diferentes. A substituição pelo mesmo tipo de aminoácido foi observada em 26 locais, enquanto 20 locais foram capazes de acomodar aminoácidos neutros ou polares, 5 locais básicos ou polares, 1 local acídico ou polar, 1 acídico ou básico e dois locais puderam acomodar aminoácidos neutros, polares ou básicos (Tabela 5B). Nenhum doente tinha sequência igual à do consenso. A diferença entre as sequências do consenso para o HCV dos tipos la ou lb mostrou uma similaridade global de sequências de aminoácidos 96,4%. Os motivos conservados foram surpreendentemente semelhantes diferindo em apenas 4 resíduos (259, 263, 269 & 270). Não pode ser feita qualquer correlação entre mutações em HCV dos tipos la e lb. Entre 69 ΡΕ1947104

todas as sequências, não foram encontradas substituições de aminoácidos em resíduos que são homólogos em termos de função relativamente aos de outras helicases da mesma família (resíduos a sombreado nas Tabelas 5A e 5B) . No entanto, foram encontradas várias mutações dentro e na proximidade dos sete motivos. A maioria das substituições ocorre apenas numa sequência, sugerindo uma substituição ao acaso devido à incorporação errada de bases pela polimerase RT. As sequências de HCVla não apresentaram substituições no motivo I, 1 substituição de L266I no motivo Ia (pt. 4C), 1 substituição de S263G no motivo de ligação a ácidos nucleicos (pt. 4B), 1 substituição V329I no motivo III (pts. 23, 24, 270, 1H, IX, 3T, 1C) , 2 substituições no motivo IVa; K371R (pt. 1D) e K372R (pts. 4 e 1C) , e 3 substituições no motivo V; A410S (controlo la), A410T (pt. 3S) e F418Y (pts. 4, 12, 177, 194, 198, 3P, 3S, 3T, 4C, K, e 174). O primeiro motivo anti-agregação ("gatekeeper") tinha 1 substituição, S424T (pts. IX e K), motivo VI tinha 5 substituições; R458S (pt. 3S), T459S (pt. 5P), R461L (pt. 3S), K469R (pts. IX, 5P, 174 e 183) e P470Q (pt. 4C), e o último motivo anti-agregação tinha 3 substituições; D496N (pt. 38), A497T (pt. 11) e G498S (pt. 4B) . De todas as mutações, as substituições no motivo IV foram as mais surpreendentes uma vez que se mostrou que estes dois resíduos de lisina, nas posições 371 e 372, são importantes na estabilização de ácidos nucleicos de cadeia simples. A alteração do aminoácido de lisina para arginina em ambos os casos indica uma necessidade de um aminoácido básico nesta posição. Uma outra substituição que foi interessante foi na 70 ΡΕ1947104 posição 410 no motivo V. Esta foi interessante devido à sequência protótipo conter uma serina em vez de uma alanina, uma serina nesta posição existe na maioria das sequências publicadas, no entanto, a sequência aqui apresentada identificada como SEQ ID NO:l apresentou uma alanina no consenso derivado de doentes excepto para o doente que tinha uma treonina nesta posição (t. 3S). As posições 229, 418 e 469 mostraram-se interessantes devido a vários doentes possuírem estas substituições, no entanto, a importância destas permanece desconhecida.

As substituições de aminoácidos nos isolados HCVla nas posições fora dos motivos existentes mostraram uma elevada prevalência de mutações em várias regiões. Uma alteração de isoleucina para valina na posição 248 ocorreu em 9 de 30 doentes HCVla. Os resíduos envolventes entre 240 e 252 também mostraram um elevado grau de mutação. O resíduo 281 pode ser glicina (consenso) ou arginina (7 doentes). Isto é surpreendente devido à transição ser de uma cadeia lateral simples para uma volumosa. Outras regiões que possuem maior frequência de substituições foram os resíduos 229 para 358 e 382 para 386, os resíduos 455 para 461, o resíduo 557 e o extremo COOH. 0 motivo I nas sequências HCVlb tinha 1 substituição, K213R (pts. 3N e 3Q), nenhuma substituição em Ia, 3 no motivo de ligação a ácidos nucleicos; A236G (controlo), P264S (controlo, pts. IA, 2D, 3N, 6A) e 1265V (pt. 3Q). O motivo II tinha 2 substituições; I288M (pt. 1U) 71 ΡΕ1947104 e T295I (pt. IA) , os motivos III e Iva não continham quaisquer mutações, enquanto o motivo V continha 2; V406A (pt. 30) e F418Y (pt. 3Q). Ambos os motivos anti-agregação não possuíam mutações. O motivo VI continha 1 na posição 470. Esta mutação foi significativa pois foi encontrado um total de 7 aminoácidos: R47S (controlo e pt. 6A) , R470M (pts. 1G, 1U e 3N) , R470G (pts. 179 e 3Q) , R470V (ptl28) , R470P (pt. 30) e R470A (pt. 1). As semelhanças com o HCVla foram encontradas em regiões fora dos motivos conhecidos. As posições 240 a 256, 334 a 358, 382 a 386 e o extremo COOH continham regiões "quentes".

Os efeitos do tratamento com IFN

As diferenças mais significativas foram observadas quando os isolados foram agrupados de acordo com o hospedeiro ter ou não recebido terapia com interferão. Um decréscimo global na variabilidade da sequência em ambos os tipos la e lb do HCV foi evidente após terapia com IFN com ou sem ribavirina. Assim, o interferão desempenha um papel na selecção de quasispécies.

Para os isolados de HCVla que não foram sujeitos a terapia com interferão, o número global de mutações por doente foi em média de 6,47 por sequência. Um total de 59 residuos diferentes foi afectado. Após terapia com interferão, o número de mutações foi em média 5,0 por doente com 25 locais contendo aminoácidos diferentes dando um total de 56,14 % de queda nas posições mutadas (Tabela 72 ΡΕ1947104 5a) . Para os isolados tipo lb, o número médio de mutações por doente para isolados não sujeitos a terapia com interferão foi de 8,9 com 53 locais a variarem na globalidade. No entanto, após terapia com interferão, o número de mutações por doente foi de 6,33 e o número de locais que continham mutações caiu dramaticamente nos isolados lb para apenas 16, ou seja 67,78% (Tabela 5B) . Isto sugere que as estirpes sensiveis foram eliminadas durante a terapia com interferão e estes locais restantes pode de alguma forma estar envolvidos na resistência do virus ao interferão. Não foram observadas diferenças no tipo la ou lb para os isolados que foram sujeitos a terapia de combinação com ribavirina em oposição a interferão apenas e não foi feita qualquer correlação entre o número ou posições de mutações e a carga virai. ΡΕ1947104 73 TABELA ΙΑ SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 1 la e 2539U 5'-CCTGCTTGTGGATGATG-3' 2 lb 5622L 5'-CTGATGAAAITCCACATGTGCTTCGCCCA-3' 3 2727U 5'-CTACTCCTGCTCCTGCTGGCGTT-3' 4 5442L 5'-CACTCTTCCATCTCATCGAACTCCTGGTAGAG-3' 5 2916U 5'-GTGTGGGTYCCCCCCCTCAAC-3' 6 5268L 5'-GCCGACATGCATGYCATGATGTATTT-3' 7 3254U 5'-GAGCCCGTCGTCTTCTC-3' 8 8 6U 5'-GGCCGGGACAASAACCA -3' 9 37323U 5'-TCGGACCTTTACTTGGTCACGAG-3' 10 4240L 5'-AGGAACTTGCCWTAGGTGGAGTA-3' 11 37 53L 5'-CGCCGGCGCACCGGAATGACATC-3' 12 4218U 5'-TACTCCACCTATGGCAAGTTCCT-3' 13 4896U 5'-GAGTGCTATGACGCGGGCTGTGCTT-3' 14 4284L 5'-GAGTGGCACTCATCACA-3' 15 4509U 5'-CATCTCATYTTCTGCCA-3' 16 4710L 5'-TCGACTGTCTGRGTGACACA-3' 17 514 SU 5'-CCATCGTGGGAYCAAATGTGGAAGTGT-3' 18 5268U 5'-AAATACATCATGRCATGCATGTCGGC-3' 19 5622U 5'-TGGGCGAAGCACATGTGGAATTTCATCAG-3' 20 5993U 5'-GCCATCCTCTCTCCTGGTGCCCT-3' 21 57901 5'-CACCCAYCCCCCCAAKATGTT-3' 22 3127U 5'-CCGGRGGTCATTAYGTSCAAATGG-3' 23 5700L 5'-CGCGGGGTTTCCAGGCAG-3' ΡΕ1947104 74

TABELA 1B SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 24 2a HCV2aU-l 5'-GGC ACY TAC ATC TAT GAY CA-3' 25 HCV2aU-2 5'-TCA TCT TCA GTC CGA TGG AGA-3' 26 HCV2aL-l 5'-ATG CCG CTR ATG AAR TTC CAC AT-3' 27 HCV2aL-2 5'-CTG AAY GCC ATC ATG GAR GCC A-3'

TABELA 1C SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 28 2b HCV2bU-l 5'- CCA ATG GAG AAG AAG GTC A-3' 29 HCV2bU-2 5'- ATG TGG AGA CAT CCT GCA-3' 30 HCV2bL-1 5'-TTG TGG CCT GTT GTA GGA-3' 31 HCV2bL-2 5'-GCG CAT TCT TCC ATC TCA -3' 32 HCV2b seqUl 5'- CCG AAA CGC TGA YGT CAT-3' 33 HCV2b seqU2 5'-GGA TGG AGG GTG CTC AGC-3' 34 HCV2b seqU3 5'-AGA CCC GAC CTT TAC CAT-3' 35 HCV2b seqU4 5'-TTA CCC GTG TGT CAA GAC CA-3' 36 HCV2b seqLl 5'-CCA ATG ATG GAR ATG CAG-3' 37 HCV2b seqL2 5'- CCT TTG CSC TAG CGC ATA-3' 38 HCV2b seqL3 5'- GAG CAC TAC GCT GTC GAA-3' 39 HCV2b seqL4 5'-TGG CTG TGG CTA GAA CCA 3' 40 HCV2b seqL5 5'- GTA GGC CCC AAA ACC AAG -3' 41 HCV2b seqL6 5'-GCY CTG AAC AAG CCC ACG-3' 42 HCV2b seqL7 5'-ACA TCT GRG TGA CTG GTC-3' ΡΕ1947104 75

TABELA 1D SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 43 3a HCV3aU-l 5'-CCY GTA ATA TTT AGT CCC A-3' 44 HCV3aU-2 5'-TGG AAA TCA AGG TCA TCA-3' 45 HCV3aL-l 5'-GTA GCT ACT ATG GGC TCA A-3' 46 HCV3aL-2 5'-GCT TGC TCG ATG TAC GGG-3'

TABELA 1E SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 47 3b HCV3bU-l 5'-CCC GTC ATC TTT ACT CCT A -3' 48 HCV3bU-2 5'-TGG AGA TTA AGG TTA TCA-3' 49 HCV3bL-l 5'-GAT TGC ACT ATG GGT CGA A-3' 50 HCV3bL-2 5'-GCT TGC TCG ATG TAA GGA-3'

TABELA 1F SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 51 4a 3486U 5'-GGC CGG GAC AAS AAC CA -3' 52 3723U 5'-TCG GAC CTT TAC TTG GTC ACG AG -3' 53 3753L 5'-CGC CGG CGC ACC GGA ATG ACA TC -3' 54 4218U 5'-TAC TCC ACC TAT GGC AAG TTC CT-3' 55 4240L 5'-AGG AAC TTG CCW TAG GTG GAG TA-3' 56 4284L 5'-GAG TGG CAC TCA TCA CA-3' 57 4509U 5'-CAT CTC ATY TTC TGC CA-3' 76 ΡΕ1947104 (continuação) SEQ ID NO TIPO DE HCV NOME SEQUÊNCIA 58 4710L 5'-TCG ACT GTC TGR GTG ACA CA-3' 59 4896U 5'-GAG TGC TAT GAC GCG GGC TGT GCT T-3' 60 5145U 5'-CCA TCG TGG GAY CAA ATG TGG AAG TGT-3' 61 5268U 5'-AAA TAC ATC ATG RCA TGC ATG TCG GC-3' 62 5268L 5'-GCC GAC ATG CAT GYC ATG ATG TAT TT -3' 63 5442L 5'-CAC TCT TCC ATC TCA TCG AAC TCC TGG TAG AG-3'

TABELA 1G SEQ ID NO PAPES DE BASES TIPO SEQUÊNCIA 1 -881 pb Amplificação 5'-CCTGCTTGTGGATGATG-3' 2 2230 pb 5'-CTGATGAAATTCCACATGTGCTTCGCCCA-3' 3 -293 pb 5'-CTACTCCTGCTCCTGCTGGCGTT-3' 4 2053 pb 5'-CACTCTTCCATCTCATCGAACTCCTGGTAGAG-3' 5 -504 pb 5'-GTGTGGGTTCCCCCCCTCAACGT-3' 6 1873 pb 5'-GCCGACATGCATGYCATGATGTATTT-3' 7 -166 pb 5'-GAGCCCGTCGTCTTCTC-3' 8 66 pb 5'-GGCCGGGACAASAACCA-3' 9 303 pb Sequenciação 5'-TCGGACCTTTACTTGGTCACGAG-3' 10 918 pb 5'-AGGAACTTGCCWTAGGTGGAGTA-3' 11 955 pb 5'-CGCCGGCGCACCGGAATGACATC-3' ΡΕ1947104 77 «Μ S* e#s tu \ Q m IK < m y 6$¥ u 11$ $·* ÍS¥ \ o mp o é## : m Cl# ÍZP r* m y < 10# i o U€ H Zi£ \< ! m < Ό m \< m b < Ut \< < 0 m $·* LSP y <: t íêZ ; O m o < ; mz < m y : \ HZ O tst < o ; $£Z jjwrt· ι«ε . H y m < ia H o mz |m nz \ jjmfi o mz < «tc y < $61 nz b < m IO III u •H ! LLt H mi u t- m U III < o CM. < m y 111 H1 0 : io D* < t# Ia* O SP §»* ti k O í£ O m b < LZ ; < , & 1 «fô g : 0· I fS R í·^· 1 4* 1 : g j j -*? *5}* !> v1 ; -c* : & i :0· : | fât ; m mo* o ** twM .1 & $ : Sw «O 4 O O o o o o D D U σ ο- o o Íífc g 5* $ 4? ϋ I fi tí Ç» 'k 4 & $ ΡΕ1947104 - 78 1 ! i I S « » * * · S > > i > • * * * * i ί ( 1 1 * ( * ί ί * · * * » * * i }>: * } ♦ * * » ( * « » * * · 1 ( [ » ♦ * * ♦

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Holland-Staley, Carol

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IDENTIFICAR E CARACTERIZAR A HEPATITE C <130> PCV-001PC <150> <151> 60/363 603 2002-03-11 <160> 64 <17 0> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> <211> <212> <213> 1 17 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 1 cctgcttgtg gatgatg 17 <210> <211> <212> <213> 2 29 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 2 ctgatgaaat tccacatgtg cttcgccca 29 <210> 3 <211> <212> <213> 23 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 3 ctactcctgc tcctgctggc gtt 23 <210> 4 <211> <212> <213> 32 DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 92 <400> 4 cactcttcca tctcatcgaa ctcctggtag ag 32 <210> <211> 5 21 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 5 gtgtgggtyc cccccctcaa c 21 <210> <211> 6 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 6 gccgacatgc atgycatgat gtattt 26 <210> <211> 7 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 gagcccgtcg tcttctc 17 <210> <211> 8 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 8 ggccgggaca asaacca 17 <210> <211> 9 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 93 <400> 9 tcggaccttt acttggtcac gag 23 <210> <211> 10 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 10 aggaacttgc cwtaggtgga gta 23 <210> <211> 11 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 11 cgccggcgca ccggaatgac ate 23 <210> <211> 12 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 12 tactccacct atggcaagtt cct 23 <210> <211> 13 25 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 13 gagtgctatg acgcgggctg tgctt 25 <210> <211> 14 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 94 <400> 14 gagtggcact catcaca 17 <210> <211> 15 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 15 catctcatyt tctgcca 17 <210> <211> 16 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 16 tcgactgtct grgtgacaca 20 <210> <211> 17 27 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 17 ccatcgtggg aycaaatgtg gaagtgt 27 <210> <211> 18 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 18 aaatacatca tgrcatgcat gtcggc 26 <210> <211> 19 29 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 95 < 4 Ο Ο > 19 tgggcgaagc acatgtggaa tttcatcag 29 <210> <211> 20 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 20 gccatcctct ctcctggtgc cct 23 <210> <211> 21 21 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 21 cacccayccc cccaakatgt t 21 <210> <211> 22 24 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 22 ccggrggtca ttaygtscaa atgg 24 <210> <211> 23 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 23 cgcggggttt ccaggcag 18 <210> <211> 24 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 96 < 4 Ο Ο > 24 ggcacytaca tctatgayca 20 <210> <211> 25 21 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 25 tcatcttcag tccgatggag a 21 <210> <211> 26 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 26 atgccgctra tgaarttcca cat 23 <210> <211> 27 22 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 27 ctgaaygcca tcatggargc ca 22 <210> <211> 28 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 28 ccaatggaga agaaggtca 19 <210> <211> 29 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 97 < 4 Ο Ο > 29 atgtggagac atcctgca 18 <210> <211> 30 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 30 ttgtggcctg ttgtagga 18 <210> <211> 31 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 31 gcgcattctt ccatctca 18 <210> <211> 32 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 32 ccgaaacgct gaygtcat 18 <210> <211> 33 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 33 ggatggaggc tgctcagc 18 <210> <211> 34 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 98 <4 Ο Ο> 34 agacccgacc tttaccat 18 <210> <211> 35 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 35 ttacccgtgt gtcaagacca 20 <210> <211> 36 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 36 ccaatgatgg aratgcag 18 <210> <211> 37 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 37 cctttgcsct agcgcata 18 <210> <211> 38 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 38 gagcactacg ctgtcgaa 18 <210> <211> 39 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 99 < 4 Ο Ο > 39 tggctgtggc tagaacca 18 <210> <211> 40 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 40 gtaggcccca aaaccaag 18 <210> <211> 41 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 41 gcyctgaaca agcccacg 18 <210> <211> 42 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 42 acatctgrgt gactggtc 18 <210> <211> 43 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 43 ccygtaatat ttagtccca 19 <210> <211> 44 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 100 <400> 44 tggaaatcaa ggtcatca 18 <210> <211> 45 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> 39 Iniciador <400> 45 gtagctacta tgggctcaa 19 <210> <211> 46 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 46 gcttgctcga tgtacggg 18 <210> <211> 47 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 47 cccgtcatct ttagtccta 19 <210> <211> 48 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 48 tggagattaa ggttatca 18 <210> <211> 49 19 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 101 <400> 49 gattgcacta tgggtcgaa 19 <210> <211> 50 18 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 50 gcttgctcga tgtaagga 18 <210> <211> 51 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 51 ggccgggaca asaacca 17 <210> <211> 52 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 52 tcggaccttt acttggtcac gag 23 <210> <211> 53 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 53 cgccggcgca ccggaatgac ate 23 <210> <211> 54 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 102 <400> 54 tactccacct atggcaagtt cct 23 <210> <211> 55 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 55 aggaacttgc cwtaggtgga gta 23 <210> <211> 56 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 56 gagtggcact catcaca 17 <210> <211> 57 17 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 57 catctcatyt tctgcca 17 <210> <211> 58 20 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 58 tcgactgtct grgtgacaca 20 <210> <211> 59 25 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 103 <400> 59 gagtgctatg acgcgggctg tgctt 25 <210> <211> 60 27 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 60 ccatcgtggg aycaaatgtg gaagtgt 27 <210> <211> 61 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 61 aaatacatca tgrcatgcat gtcggc 26 <210> <211> 62 26 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 62 gccgacatgc atgycatgat gtattt 26 <210> <211> 63 32 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 63 cactcttcca tctcatcgaa ctcctggtag ag 32 <210> <211> 64 23 <212> <213> DNA Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador ΡΕ1947104 104 <400> 64 gtgtgggttc cccccctcaa cgt 23

Lisboa, 2 de Agosto de 2012

Claims (15)

1. ΡΕ1947104 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleótidos compreendendo uma sequência seleccionada do grupo consistindo em: (a) um ácido nucleico tendo a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:3; (b) um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:3 em que o ácido nucleico é capaz de emparelhar com o gene NS4 do HCV ou uma porção do mesmo; (c) um fragmento de pelo menos 8 nucleótidos de um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleótidos de SEQ ID N0:3; e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntico a uma sequência de nucleótidos como definida em qualquer um de (a) a (c).
2. 2. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 1 compreendendo ainda uma marca seleccionada do grupo consistindo num grupo fluorescente, digoxigenina, biotina, marcas radioactivas, grupos quimioluminescentes, enzimas, anticorpos, agentes luminescentes, agentes de precipitação e corantes.
3. 3. Um oligonucleótido para amplificação de uma sequência de ácido nucleico numa amostra, em que a amostra é de um doente infectado com HCV e possui uma sequência de 2 ΡΕ1947104 nucleótidos consistindo em SEQ ID NO: 3, ou o seu complementar.
4. 4. Um estojo ("kit") para a detecção de HCV, compreendendo um oligonucleótido ou uma série de oligonu-cleótidos, em que o oligonucleótido compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.
5. 5. 0 estojo ("kit") da reivindicação 4, em que o referido estojo ("kit") ainda compreende um ou mais componentes seleccionados do grupo consistindo em: pelo menos um oligonucleótido marcado para detecção do ácido nucleico de HCV amplificado; uma pluralidade de nucleótidos, uma polimerase de ácidos nucleicos, pelo menos um outro componente para a realização da reacção de amplificação da polimerase e instruções para a sua utilização.
6. 6. Um método de amplificação de um ácido nucleico alvo, o método compreendendo: combinação de um ácido nucleico alvo do genoma do HCV em condições que permitem que ocorra uma reacção de amplificação com: (a) uma ou mais sequências de iniciadoras de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência descrita como SEQ ID NO: 3; (b) uma polimerase de ácido nucleico; e 3 ΡΕ1947104 (c) uma pluralidade de nucleótidos, resultando assim num ácido nucleico alvo amplificado.
7. 7. 0 método da reivindicação 6, em que o ácido nucleico alvo é do gene NS3 ou NS4 do genoma do HCV.
8. 8. Um método para a detecção especifica de ácidos nucleicos de HCV numa amostra compreendendo: a) contacto da referida amostra com uma ou mais sequências de ácido nucleico descritas como SEQ ID NO:3, em condições tais que os referidos ácidos nucleicos do HCV podem hibridar com as referidas sequências iniciadoras; b) transcrição reversa e amplificação dos referidos ácidos nucleicos para obter ácidos nucleicos de HCV amplificados; e c) detecção da presença dos referidos ácidos nucleicos do HCV amplificados.
9. 9. 0 método da reivindicação 8, em que a detecção da presença dos referidos ácidos nucleicos de HCV amplificados compreende: (a) contacto dos referidos ácidos nucleicos de HCV amplificados com um oligonucleótido marcado para obter ácidos nucleicos de HCV marcados; e b) identificação dos referidos ácidos nucleicos marcados. 4 ΡΕ1947104
10. 10. O método de qualquer uma das reivindicações 6 a 9, compreendendo ainda o passo de sequenciação do ácido nucleico amplificado e, facultativamente, o passo de avaliação da sequência relativamente a mutações.
11. 11. Um método in vitro para determinar se um doente é resistente a um agente, o método compreendendo: a) realização de amplificação por PCR do DNA de uma amostra contendo DNA de um doente usando uma sequência iniciadora de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica à sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:3; e b) análise do produto amplificado, determinando assim se um doente é resistente a um agente.
12. 12. O método da reivindicação 11, em que o agente é um agente antiviral, um inibidor de proteases, um inibidor da porção de protease serinica do gene NS3, um inibidor da porção helicase do gene NS3, um interferão alfa, um interferão alfa ou uma combinação de agentes.
13. 13. Um método in vitro para determinar se um agente pode ou não ser usado para tratar um doente com HCV, o método compreendendo os passos de: a) Amplificação de uma amostra contendo um ácido nucleico de um doente infectado com HCV usando uma sequência iniciadora de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica à sequência de nucleótidos de SEQ ID NO:3; 5 ΡΕ1947104 b) sequenciaçao das sequências de ácido nucleico do HCV amplificadas resultantes; e c) identificação de mutações na sequência de ácido nucleico de HCV amplificada que estejam correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente antiviral, determinando assim se um agente pode ou não ser usado para tratar um doente com HCV.
14. 14. Um método in vitro para determinar se o tratamento com um agente deverá ser continuado ou interrompido num doente infectado com HCV, o método compreendendo: a) realização do método da reivindicação 6 em duas ou mais amostras compreendendo DNA de um doente no decurso do tratamento; b) sequenciaçao do produto de ácido nucleico alvo amplificado resultante da reivindicação 6; c) identificação de mutações presentes no produto amplificado que estão correlacionadas com resistência ou sensibilidade a um agente; e d) continuação do tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado não se alteram no decurso do tratamento ou descontinuação do tratamento quando as mutações identificadas no produto amplificado se alteram no decurso do tratamento.
15. 15. Um método in vitro de avaliação da eficácia de um agente para o tratamento de HCV, o método compreendendo a comparação de: 6 ΡΕ1947104 a) sequências de ácido nucleico numa primeira amostra de um doente exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados a partir de uma ou mais sequências de ácido nucleico que são pelo menos 80% idênticas à sequência descrita como SEQ ID NO: 3 e b) sequências de ácido nucleico numa segunda amostra de um doente que não foi exposto a um agente, em que as sequências de ácido nucleico são produtos amplificados a partir de uma ou mais sequências de ácido nucleico iniciadoras que são pelo menos 80% idênticas à sequência descrita em SEQ ID NO:3, em que um aumento do número de mutações nas sequências de ácido nucleico da primeira amostra, relativamente à segunda amostra, é uma indicação de que o agente não é eficaz no tratamento de HCV. Lisboa, 2 de Agosto de 2012