JP2009512426A - 偏性細胞内病原体の治療および診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血液試料における、特に血漿および血清試料における、病原体、特に、クラミジア属(Chlamydia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)およびウレアプラズマ属(Ureaplasma)種などの偏性細胞内または膜会合微生物の持続型の検出に関する。本発明の方法およびキットは、病原体感染を検出し、そして病原体関連疾患状態を評価する際に、そしてまた、新規抗微生物薬剤、製品および療法の発展およびスクリーニングのために、有用でありうる。
Description
本発明は、クラミジア属(Chlamydia)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)およびウレアプラズマ属(Ureaplasma)種などの、偏性細胞内または膜会合の病原体の検出に関する。これは、例えば、病原体感染および病原体感染と関連する疾患の診断および治療に有用でありうる。
現在、病原性微生物の診断に関する慣用的アッセイは、例えばスワブ(swab)から得られる、宿主細胞の試料に基づく。これらのアッセイによって得られるこれらの結果は、非常に変動しやすく、そして病原体の検出のための改善法が望ましいであろう。
本発明者らは、血漿および血清などの血液の無細胞分画において、細胞内または膜会合の病原体細胞を、高感度にそして確実に検出可能であることを発見した。基本小体(elementary bodies)の形または他の細胞型であってもよいこれらの細胞は、慣用的手段によると確実には検出可能でない、病原体の独特の持続型に相当する。患者の血漿および血清におけるこれらの病原体細胞の検出のためのアッセイは、病原体感染を検出し、そして病原体関連疾患状態を評価する際に有用でありうる。
本発明のある側面は、病原体感染に関して、個体を評価するための方法であって:
該個体から得た血液試料中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
該個体から得た血液試料中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含む、前記方法に関する。
病原体細胞の存在は、病原体感染の指標となりうる。病原体細胞には、偏性細胞内病原性微生物の持続型の基本小体が含まれてもよい。
好ましくは、血液試料中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定することによって、細胞の存在を決定する。
方法はさらに、試料中の基本小体などの病原体細胞を濃縮する(concentratingまたはenriching)、例えば特異的結合メンバーを用いて、濃縮分画を産生する工程をさらに含んでもよい。偏性細胞内病原性微生物の持続型での感染に関して個体を評価するための方法は、例えば:
個体由来の血液試料を、特異的結合メンバーと接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体由来の血液試料を、特異的結合メンバーと接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する
工程を含んでもよい。
単離/精製分画は、血液試料に比較して、増加した濃度の、病原性微生物の持続型の基本小体または他の細胞を含むことも可能である。
試料または単離分画中の病原性微生物由来の核酸の存在は、試料あるいは単離しそして/または精製した分画が、病原性微生物の持続型の基本小体または他の細胞を含み、そして個体が、偏性細胞内病原性微生物の持続型での感染によって感染していることの指標となる。
本発明の側面において、使用が好ましい特異的結合分子には、抗体および断片またはその誘導体(「抗体分子」)が含まれる。
任意の適切な技術により、抗体などの特異的結合メンバーを用いて、試料の構成要素および分画の単離および/または精製を行ってもよく、そして当業者は、好みおよび一般的な知識にしたがって、適切な様式を選択することが可能である。
いくつかの好ましい態様において、血液試料の無細胞分画において(すなわち血漿または血清において)、基本小体または他の病原体細胞の存在を検出してもよい。
無細胞分画は全血試料中に含まれていてもよく、または検出前に、全血試料から無細胞分画を分離して、無細胞血液試料(すなわち血漿または血清試料)を産生してもよい。本明細書記載の方法は、個体から得られる血液の無細胞試料(すなわち無細胞血液試料)を提供する工程を含んでもよい。
無細胞血液試料は、個体の血液細胞を含有しない、すなわち赤血球、白血球、血小板および血中に見られる他の宿主細胞を欠く、個体由来の血液試料である。無細胞血液試料は
、例えば、凝固因子を含む血漿試料、または凝固因子を欠く血清試料であってもよい。
、例えば、凝固因子を含む血漿試料、または凝固因子を欠く血清試料であってもよい。
個体から得られる血液試料から血液細胞を除去することによって、無細胞血液試料を産生してもよい。いかなる好適な方法によって、血液試料または調製物から、血液細胞を除去してもよい。例えば、典型的には2,000g、10分間の遠心分離、あるいは例えばカラム、膜、フィルター、または他の分離デバイスを介したろ過によって、細胞を除去してもよい。
病原体細胞は、病原性微生物の単一の単位であり、そしてこれには、基本小体、網様体および微生物の他の型が含まれる。
持続性感染は、病原体が宿主応答または療法治療によって一掃されずに、感染した個体の特定の細胞中に残るか、またはその膜に会合したままとなる、感染である。
本明細書に記載するように評価される個体は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。個体は、健康であってもよく、すなわち病原体感染または病原体関連障害の症状をまったく示さなくてもよい(すなわち無症状であってもよい)し、あるいは病原体感染または病原体関連障害と関連する1以上の既知の症状を示してもよい。いくつかの態様において、個体は、病原体感染または関連障害を発展させるリスクを有すると推測されるか、またはリスクがあってもよい。
1以上の血漿/血清分子を含む複合体に結合する特異的結合メンバーと試料を接触させて、1以上の前記複合体を含む分画を単離しそして/または精製してもよい。
1以上の血漿/血清分子は抗体であってもよく、そして複合体は免疫複合体であってもよい。特異的結合メンバーは、試料中の免疫グロブリンに、そしてしたがって、免疫複合体に結合してもよい。適切な特異的結合メンバーには、プロテインA、または抗Ig、抗IgA、抗IgM抗体、あるいは他の免疫グロブリンまたは免疫複合体結合/捕捉分子が含まれる。
1以上の血漿/血清分子は、血清リポタンパク質またはリポ多糖結合タンパク質(LBP)であってもよい。特異的結合メンバーは、これらの血清リポタンパク質またはリポ多糖結合タンパク質に結合してもよく、例えば抗リポタンパク質または抗LBP抗体であってもよい。
病原体細胞は、好ましくは、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物、特に偏性細胞内病原性細菌の持続型である。
例には、クラミジア属種、例えば肺炎クラミジアまたはトラコーマクラミジア、あるいはマイコプラズマ科種、例えばマイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)などのマイコプラズマ、あるいはウレアプラズマ・ウレアリティクム(Ureaplasma urealyticum)などのウレアプラズマの細菌が含まれる。
細胞は、例えば、呼吸器の病原体、例えば肺炎クラミジア、あるいは生殖器または尿路の病原体、例えばトラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムであってもよい。
例えば、クラミジア属感染に関して、個体を評価するための方法は:
個体から得た血液試料中のクラミジア属細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体から得た血液試料中のクラミジア属細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
クラミジア属細胞は、肺炎クラミジアまたはトラコーマクラミジア細胞であってもよい。病原体が肺炎クラミジアである態様において、血液試料は、好ましくは、本明細書に記載するような無細胞血液試料である。
マイコプラズマ科(Mycoplasmataceae)感染に関して、個体を評価するための方法は:
個体から得た血液試料中のマイコプラズマ科細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体から得た血液試料中のマイコプラズマ科細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
マイコプラズマ科細胞には、マイコプラズマまたはウレアプラズマ細胞が含まれてもよい。マイコプラズマ細胞は、マイコプラズマ・ゲニタリウム細胞であってもよい。ウレアプラズマ細胞は、ウレアプラズマ・ウレアリティクム細胞であってもよい。
本明細書記載の方法は、病原体関連障害または状態を評価する際に有用でありうる。
病原体関連障害に関して個体を評価する方法は:
個体から得た血液試料中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体から得た血液試料中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
病原体細胞の存在が、病原体と関連する障害または状態の存在の指標となってもよい。
病原体関連障害に関する個体の評価には、個体において病原体関連障害を診断するか;個体における病原体関連障害の存在を決定するか;または個体において病原体関連障害を検出する工程が含まれてもよい。他の態様において、個体における病原体関連障害の重症度または予後を評価してもよいし、あるいは個体が、将来、病原体関連障害を患うリスクを決定してもよい。
肺炎クラミジアに関連する疾患には、呼吸器、関節、脳または血管状態が含まれてもよく、例えばアテローム硬化性状態が含まれる。アテローム硬化性状態には、アテローム性動脈硬化症、虚血性(冠状動脈)心臓疾患、心筋虚血(狭心症)、心筋梗塞、動脈瘤疾患、アテローム性末梢血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、慢性および重篤下肢虚血、内臓虚血、腎動脈疾患、脳血管疾患、脳卒中、アテローム硬化性網膜症、血栓症および異常な血液凝固、および高血圧などの、心臓血管障害が含まれてもよい。こうした状態は、医学的または獣医学的状態であってもよい。
トラコーマクラミジアに関連する疾患には、例えば、膣、子宮頸部、子宮内膜、ファロピウス管、前立腺、膀胱、尿道の慢性炎症性疾患および生殖機能障害、または関節状態が含まれる。
マイコプラズマおよびウレアプラズマに関連する疾患には、肺炎および他の呼吸障害、子宮、膣、子宮頸部、子宮内膜、ファロピウス管、前立腺、膀胱、尿道の慢性炎症性疾患、および生殖機能障害が含まれる。
本発明の方法を用いて試験するのに適した個体は、急性性器感染の症状を示してもよい。本発明の方法は、スワブまたは尿の慣用的PCR試験において陽性に診断された患者において、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウム、またはウレアプラズマ・ウレアリティクム(種)などの病原体による感染の存在を確認してもよいし、あるいはスワブまたは尿の慣用的PCR試験において陰性に診断された患者において、感染の存在を同定してもよい。
本明細書に記載するような試験に適した他の個体は、急性性器感染の症状をまったく示さなくてもよいが、子宮、ファロピウス管、前立腺、膀胱、尿道などの慢性炎症性疾患の症状を示してもよい。これらの患者は、典型的には、スワブまたは尿の慣用的PCR試験において陰性である。本発明の方法を用いて、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリティクム(種)などの病原体が陽性に検出されると、慢性感染の存在が確認されるであろう。
本明細書に記載するような試験に適した他の個体は、生殖系における慢性無症状性炎症の存在が排除不能である、不妊問題を有してもよい。トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリティクム(種)などの病原体は、流産と関連付けられてきており、そして本発明の方法による感染の検出は、不妊問題の治療に有用でありうる。
本明細書記載の方法は、治療後の病原体感染の排除を監視し、そして検証し、そして例えば、慣用的試験によっては病原体感染に関して陰性であるが、本発明の方法によっては陽性である個体由来の血液の輸血または血液製剤の使用による、病原体感染の伝染を防止する際にもまた、有用でありうる。
好ましくは、試料中の病原体細胞を濃縮し、単離し、そして/または精製することによって、例えば検出前に、基本小体または他の病原体細胞に関して濃縮した、単離しそして/または精製した分画を産生することによって、試料中の基本小体などの病原体細胞の存在を評価する。
いくつかの態様において、基本小体および他の病原体細胞を含む試料中の複合体、またはこうした複合体を含む試料の分画を単離し、精製し、そして/または濃縮することによ
って、試料を濃縮する。次いで、単離し、精製しそして/または濃縮した複合体中に病原体細胞が存在しているかどうかを決定してもよい。
って、試料を濃縮する。次いで、単離し、精製しそして/または濃縮した複合体中に病原体細胞が存在しているかどうかを決定してもよい。
基本小体または病原体細胞の他の型を含む病原体細胞を含む複合体は、血清および/または血漿に存在する、免疫グロブリン分子、血清リポタンパク質、リポ多糖結合タンパク質または他の細菌結合分子などの、1以上の血漿/血清分子をさらに含んでもよい。例えば、基本小体または他の病原体細胞は、1以上の抗体との免疫複合体中に含まれていてもよい。例えば免疫グロブリン結合剤を用いて、前記試料から、免疫複合体を単離し、精製し、そして/または濃縮することによって、細胞を濃縮してもよい。
複合体を単離しそして/または精製するための多くの技術が当該技術分野に知られ、そしてこうした技術を用いて、基本小体または他の病原体細胞を濃縮してもよい。これらには、物理的および化学的/生化学的技術ならびにその組み合わせが含まれる。例えば、試料を、プロテインAまたは抗Ig抗体などの免疫グロブリン結合剤と接触させ、そして未結合物質を除去するかまたは洗い流してもよい。ルーチンの技術を用いて、剤に結合した免疫複合体を溶出してもよいし、または病原体細胞の存在に関して直接試験してもよい。
あるいは、例えばシリカゲル(silico−gel)カラム、または病原体細胞および/またはその複合体の保持に適した孔サイズを持つ、他の適切なフィルターを用いて、試料をろ過に供してもよい。
いかなる慣用的手段によって、試料またはその濃縮分画における基本小体または他の病原体細胞の存在を決定してもよい。例えば、免疫化学アッセイ(例えばELISA)、または核酸アッセイ(例えばPCR)、細胞培養法、または動物試験を行なってもよい。
いくつかの態様において、細胞培養アッセイを用いて、試料中の病原体細胞の存在を検出してもよい。
試料を、病原体の増殖に適した条件下で、例えば培養して、そして試料中の病原体細胞の増殖を決定してもよい。
肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムおよびウレアプラズマ・ウレアリティクムなどの病原性微生物の細胞培養および同定のための技術は、当該技術分野に周知である。
他の態様において、非ヒト動物モデルを用いて、試料中の病原体細胞の存在を検出してもよい。
動物モデル、例えばげっ歯類に、前記試料を接種して、そして前記動物モデルにおける病原体感染の存在を決定してもよい。動物における感染の存在は、試料中の病原体細胞の存在の指標となる。
他の態様において、免疫化学アッセイ(例えばELISA)を用いて、試料中の病原体細胞抗原の存在を検出してもよい。例えば、血液試料中の病原体細胞の存在を決定する方法は;
試料を、病原体細胞に特異的に結合する抗体と接触させて;そして、
前記抗体の結合を決定する
工程を含んでもよい。
試料を、病原体細胞に特異的に結合する抗体と接触させて;そして、
前記抗体の結合を決定する
工程を含んでもよい。
病原体細胞に特異的に結合する抗体は、病原体細胞に特徴的な抗原に結合可能であり、そして他の病原体種の細胞にいかなる有意な結合も示してはならない。肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムおよびウレアプラズマ・ウレアリティクムなどの病原体に特異的に結合する抗体が当該技術分野に周知である。
いかなる適切な手段によって、抗体分子の結合を決定してもよい。個々のレポーター分子でのタグ付けが、1つの可能性である。レポーター分子は、直接または間接的に、検出可能で、そして好ましくは測定可能なシグナルを生じてもよい。レポーター分子の連結は、直接または間接的、例えばペプチド結合を介して共有的、または非共有的であってもよい。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果としてであってもよい。例えば、抗体を、FITCまたはローダミンなどの蛍光体、放射性同位体、あるいはビオチンまたはジゴキシゲニンなどの非同位体標識試薬で標識してもよく;蛍光色素などの任意の望ましい標識にコンジュゲート化された
アビジンなどの「検出試薬」を用いて、ビオチン含有抗体を検出してもよい。いくつかの態様において、さらなる抗体を用いて、一次抗体の結合を検出してもよい。
アビジンなどの「検出試薬」を用いて、ビオチン含有抗体を検出してもよい。いくつかの態様において、さらなる抗体を用いて、一次抗体の結合を検出してもよい。
結合を決定する様式は本発明の特徴ではなく、そして当業者は、好みおよび一般的な知識にしたがって、適切な様式を選択することが可能である。
適切なアプローチには、免疫組織化学染色、免疫細胞化学染色、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫放射線測定アッセイ(IRMA)および免疫酵素アッセイ(IEMA)が含まれ、モノクローナルおよび/またはポリクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイが含まれる。これらのアプローチはすべて、当該技術分野に周知である。
本明細書記載の方法で使用するための抗体は、固定されてもよいし、または固定されなくても、すなわち溶液中に遊離していてもよい。
好ましい態様において、核酸アッセイを用いて、試料中の病原体由来の核酸、例えばDNAまたはRNAの存在を検出する。
いくつかの好ましい態様において、試料から核酸を単離するかまたは抽出してもよい。好ましくは、核酸を非特異的に単離するかまたは抽出する、すなわち試料中のすべての核酸を、タンパク質などの、試料の他の構成要素から精製し、そして/または除去する。次いで、単離または抽出核酸中の病原体由来の核酸の存在を決定してもよい。
方法は、例えば;
個体から得た血液試料から、免疫複合体などの複合体を単離しそして/または精製し、
複合体からDNAを単離しそして/または抽出し、そして;
抽出した核酸中の病原体核酸の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体から得た血液試料から、免疫複合体などの複合体を単離しそして/または精製し、
複合体からDNAを単離しそして/または抽出し、そして;
抽出した核酸中の病原体核酸の存在を決定する
工程を含んでもよい。
試料から核酸を抽出する多くの適切な方法が当該技術分野に知られ、そしてこれらが使用されており、これらには、シリカゲル膜カラム、例えばQIAamp DNA血液ミニキット(QIAgen)、Chelexキレート樹脂(Chelex 100、Sigma)、またはHigh Pure PCRテンプレート調製キット(BMキット;Boehringer)などが含まれる。また、慣用的なプロテイナーゼKフェノール−クロロホルム・プロトコルによって、DNAを抽出してもよい。例えば、Trizol法(Invitrogen)を用いて、RNAを好適に単離してもよい。
核酸の抽出、単離および精製を含めて、核酸を操作するための技術およびプロトコルが、Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubelら監修 John Wiley & Sons, 1992、およびMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 第3版, Russellら, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに詳細に記載される。
Ausubelら監修 John Wiley & Sons, 1992、およびMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 第3版, Russellら, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに詳細に記載される。
場合によって核酸抽出後に、ノーザンおよびサザンブロッティングなどのDNAプローブハイブリダイゼーション技術を含めて、核酸増幅(NAA)技術および非核酸増幅技術を含む、いかなる適切な技術を用いて、試料中の病原体核酸の存在を決定してもよい。
いくつかの好ましい態様において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの、核酸増幅技術によって、病原体核酸の存在を決定する。
PCRは、テンプレート核酸の変性、テンプレートへのプライマーのアニーリング、およびテンプレートに沿ったプライマーの伸長の反復周期を含む。PCRは当該技術分野に周知であり、そして例えば”PCR protocols; A Guide to Methods and Applications”, Innisら監修, 1990, Academic Press, New York, Mullisら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich(監修), PCR technology,
Stockton Press, NY, 1989、およびEhrlichら, Science, 252:1643−1650, (1991)に記載される。周期数、個々の工程のそれぞれの条件、反応試験管内の試薬組成、または反応設定の他のいかなる
パラメーターも、環境に応じて、多様であってもよいし、または当業者によって調節されてもよい。さらなる工程(最初の変性、ホットスタート、タッチダウン、酵素時間放出PCR、複製PCRなど)もまた、使用可能である。
Stockton Press, NY, 1989、およびEhrlichら, Science, 252:1643−1650, (1991)に記載される。周期数、個々の工程のそれぞれの条件、反応試験管内の試薬組成、または反応設定の他のいかなる
パラメーターも、環境に応じて、多様であってもよいし、または当業者によって調節されてもよい。さらなる工程(最初の変性、ホットスタート、タッチダウン、酵素時間放出PCR、複製PCRなど)もまた、使用可能である。
PCRの変形には、第一の増幅産物内の配列由来の第二の対のプライマーを用いて第二の増幅を行う、入れ子(nested)PCR、およびRNAがcDNAに逆転写され、そして続いてPCRによって増幅される、RT−PCR(逆転写酵素PCR)が含まれる。
リアルタイムPCR(またはリアルタイム逆転写酵素PCR)は、初期量のテンプレートを定量化する、非常に高感度な検出法である(Aryaら, 2005, Expert Rev Mol Diagn. 5:209−219; Klein, 2002,
Trends Mol Med 8:257−260)。いくつかの態様において、リアルタイムPCRを使用してもよい。
Trends Mol Med 8:257−260)。いくつかの態様において、リアルタイムPCRを使用してもよい。
PCRおよびRT−PCRの多くの変形および修飾が当該技術分野に知られ、そして本発明の方法を実行する際に、当業者によって使用可能である。PCRまたはRT−PCR反応を実行するための化学薬品、キット、材料および試薬が商業的に入手可能である。
他の特異的核酸増幅技術には、鎖置換活性化、QBレプリカーゼ系、修復連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、連結活性化転写、SDA(鎖置換増幅)およびTMA(転写仲介増幅)が含まれる。便宜上、そして一般的に好ましいため、用語、PCRは、本明細書において、他の核酸増幅技術が当業者によって適用可能である文脈で、用いられる。文脈が別の意味を必要としない限り、PCRへの言及は、当該技術分野で利用可能ないかなる適切な核酸増幅反応の使用も含むと解釈すべきである。
病原体特異的増幅によって、病原体核酸の存在を決定してもよい。病原体特異的増幅は、試料中に、病原体由来の核酸が存在する場合にのみ起こる。病原体特異的増幅後に増幅産物が産生されると、試料中の病原体細胞の存在の指標となる。
典型的には、1以上の病原体特異的プライマーを用いて、病原体特異的増幅を行ってもよい。例えば、PCRにおいて、試料中に病原体核酸が存在する際にのみ、プライマーによって増幅産物が産生されるように、1つまたは両方のプライマーが病原体核酸に特異的にハイブリダイズしてもよい。
試料中の病原体を特異的に検出するためのPCRの使用が当該技術分野に周知であり、そして当業者は、適切なプライマーの設計、反応条件等を熟知している。適切なプライマーには、長さ約10以下のコドン(例えば6、7または8)、すなわち約30以下のヌクレオチド(例えば18、21または24)を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。一般的に、特異的プライマーは、長さ14ヌクレオチドを超えるが、18〜20より長い必要はない。プライマーの設計には多様なソフトウェアが利用可能であり、Primer ExpressTM、Primer Premier 5TM、FastPCRTM、PrimoTMおよびOligoTMが含まれる。
オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための多様な技術が当該技術分野に周知であり、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル合成法が含まれる。多くの商業的供給源から、特注のオリゴヌクレオチドプライマーを得ることも可能である。
入手可能な配列情報に基づいて、特定の病原体、例えば、肺炎クラミジアまたはトラコーマクラミジアなどのクラミジア属由来の核酸のみを増幅するであろう適切なプライマーを設計することは、当業者にはルーチンである。
他の病原体由来のゲノム核酸配列、例えば配列データベース中のゲノム核酸配列に対して、プライマーの配列を比較することによって、特定の病原体由来の核酸配列に対するプライマーの特異性を決定してもよい。好ましくは、系統学的に関連する病原体由来のゲノム核酸配列をプライマー配列に比較する。系統学的に関連する病原体由来のゲノム核酸配列に対して、ほとんどまたはまったく配列同一性を示さないプライマーは、増幅条件下で、こうした配列にほとんどまたはまったくハイブリダイゼーションを示さないと予測可能であり、そして特定の病原体に特異的と見なしてもよい。
例えば、プライマーの配列を、クラミジア科(Chlamydiaceae)の他のメ
ンバー由来のゲノム核酸配列に比較することによって、肺炎クラミジア由来の核酸に対するプライマーの特異性を決定してもよい。例えば、GenBankデータベース中の他の細菌および真核生物のDNA配列と、プライマーセットがターゲットとするDNA配列を並列させることによって、プライマーの特異性を確認してもよい。
ンバー由来のゲノム核酸配列に比較することによって、肺炎クラミジア由来の核酸に対するプライマーの特異性を決定してもよい。例えば、GenBankデータベース中の他の細菌および真核生物のDNA配列と、プライマーセットがターゲットとするDNA配列を並列させることによって、プライマーの特異性を確認してもよい。
慣用的な配列分析ソフトウェア、例えば、BLAST、TBLASTN(Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:405−410の方法を用いる)、プサイ−Blast(Nucl. Acids Res.(1997) 25 3389−3402)またはFASTA(PearsonおよびLipman(1988) PNAS USA 85: 2444−2448の方法を用いる)を用いて、配列比較を行ってもよい。
あるいは、一団の微生物由来のゲノム核酸に対するプライマーを用いて行った核酸増幅によって、特定の病原体、例えば肺炎クラミジアなどのクラミジア属細胞由来の核酸配列に対するプライマーの特異性を決定してもよい。関心対象の病原体のゲノム核酸のみを増幅するプライマーは、その病原体に特異的でありうる。
多くの種のゲノム配列が入手可能であり、そしてこうした配列を用いて、特定の病原体に特有の核酸配列を同定してもよいし、そしてこうした配列を、病原体特異的増幅プライマーを設計するためのターゲットとして用いてもよい。例えば、肺炎クラミジアのゲノムは、例えば、データベース参照番号、gi15835535、NC_002491.1;
gi15617929、NC_000922.1; gi33241335、NC_005043.1;ならびにgi58021288およびNC_002179.2を有する。他の病原体のゲノムもまた、公的データベース上で入手可能である。
gi15617929、NC_000922.1; gi33241335、NC_005043.1;ならびにgi58021288およびNC_002179.2を有する。他の病原体のゲノムもまた、公的データベース上で入手可能である。
病原体に特異的なプライマーは、病原体に特有であり、そして他の病原体、特に系統学的に関連する病原体には見られない、その病原体のゲノム内のターゲット核酸配列に、増幅条件下でハイブリダイズし、すなわちプライマーは、増幅条件下で、ターゲット病原体以外の病原体ゲノム内の核酸配列にハイブリダイズしない。例えば、肺炎クラミジア特異的プライマーは、増幅条件下で、トラコーマクラミジア・ゲノム中の配列にハイブリダイズせず、そして逆もまた同様であり、そしてM.ゲニタリウム特異的プライマーは、増幅条件下で、U.ウレアリティクム・ゲノム中の配列にハイブリダイズしない。
例えば、肺炎クラミジア特異的プライマーは、例えば、肺炎クラミジアの16S rRNA遺伝子(データベース・エントリー、L06108.1 GI: 174111)または可変ドメインIV(VDIV)領域の一部を増幅してもよい。
肺炎クラミジアの16S rRNA遺伝子に向けられるプライマーを:
からなる群より選択してもよい。
肺炎クラミジアのompA遺伝子の可変ドメインIV(VDIV)領域に向けられるプライマーを:
からなる群より選択してもよい。
トラコーマクラミジア特異的プライマーは、例えば、この病原体の潜在性プラスミド(例えば、X06707.2 GI:4691224)の一部を増幅してもよい。
適切なトラコーマクラミジア特異的プライマーには;
が含まれる。
マイコプラズマ・ゲニタリウム特異的プライマーは、例えば、140kDa接着タンパク質遺伝子、MgPa(Jensen JSら J. Clin. Microbiol. 1991 Jan; 29(1): 46−50; M31431.1 GI:150157)のすべてまたは一部を増幅してもよい。
適切なマイコプラズマ・ゲニタリウム特異的プライマーには
が含まれる。
ウレアプラズマ・ウレアリティカ特異的プライマーは、例えば、ウレアプラズマ属種のウレアーゼ遺伝子(Blanchard Aら Clin Infect Dis. 1993 Aug;17 Suppl 1:S148−53; AF085724.2 GI:9967025)のすべてまたは一部を増幅してもよい。適切なウレアプラズマ・ウレアリティカ特異的プライマーには:
が含まれる。
試料の病原体特異的増幅後、増幅産物の存在を検出してもよい。病原体特異的増幅後に増幅産物が存在すると、試料中の病原体細胞存在の指標となる。
核酸増幅産物の検出のための多くの技術が当該技術分野に知られる。適切な技術には、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、アレイハイブリダイゼーション、鎖置換増幅(SDA)、または配列決定が含まれる。増幅された核酸産物の検出および/または単離は、実際の増幅反応と同時かまたはそれに続いてのいずれかで、核酸断片の標識またはタグ付けを必要としうる。
本発明の他の側面は、細胞性または無細胞性血液試料中の病原体細胞の検出のため、例えば病原体感染の検出または病原体に関連する疾患の評価のためのキットの提供に関する。
上述のような病原体特異的プライマーが、例えば内容物が外部環境から保護されるバイアルなどの適切な容器中で、こうしたキットの一部を形成してもよい。
病原体感染を検出するか、または病原体感染に関連する疾患に関して個体を評価するためのキットは:
1以上の病原体特異的プライマー
該プライマーを用いて、血清試料から病原体特異的核酸を増幅するための試薬、および;プライマーを用いて血清試料を増幅した産物を検出するための検出試薬
を含んでもよい。
1以上の病原体特異的プライマー
該プライマーを用いて、血清試料から病原体特異的核酸を増幅するための試薬、および;プライマーを用いて血清試料を増幅した産物を検出するための検出試薬
を含んでもよい。
検出試薬は、緩衝溶液、洗浄溶液等を含んでもよい。
キットは、血液試料の除去、取り扱いおよび保存のための装置、ならびに/あるいは血液試料から血液細胞を取り除くための手段をさらに含んでもよい。適切な手段には、ろ過デバイスが含まれてもよい。
キットは、前記持続性病原体感染の基本小体を含む血液試料の分画を単離しそして/または精製するための特異的結合メンバーをさらに含んでもよい。適切な特異的結合メンバーには、血液試料中の免疫複合体を単離しそして/または精製するための免疫グロブリン結合剤が含まれる。免疫グロブリン結合剤には、プロテインAおよび抗Ig抗体が含まれる。免疫グロブリン結合剤を、固体支持体またはマトリックス上に固定してもよい。
キットは、前記プライマーによる増幅のため、DNAを単離しそして/または精製するための装置をさらに含んでもよい。適切な装置は当該技術分野に周知であり、そして本明細書の別の箇所に記載される。
キットにはまた、本明細書に記載するような、例えば、病原体感染または病原体に関連する疾患を検出する方法において、血清試料に対して、病原体特異的プライマーを使用するための使用説明書も含まれてもよい。
本発明の別の側面は、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型の細胞を単離する方法であって;
前記持続型の細胞を含む、個体から得た血液試料の分画を単離しそして/または精製し、前記分画から前記細胞を単離しそして/または精製する
工程を含む、前記方法を提供する。
前記持続型の細胞を含む、個体から得た血液試料の分画を単離しそして/または精製し、前記分画から前記細胞を単離しそして/または精製する
工程を含む、前記方法を提供する。
細胞は、微生物の持続型の基本小体であってもよい。
単離基本小体または他の細胞は、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群より選択される
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型に由来してもよい。
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型に由来してもよい。
持続型微生物の単離基本小体または他の細胞は、細胞を感染させて、前記微生物の参照株に比較してLPS欠損性および抗生物質非感受性である網様体を産生することが可能でありうる。単離基本小体または他の細胞はまた、小さい細胞内封入体の特殊な形態を有してもよい。
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の適切な参照株には、肺炎クラミジア、TW−183、AR−39、Kajaani 6、トラコーマクラミジア、Bu434、マイコプラズマ・ゲニタリウム、G37およびM30、ならびにウレアプラズマ・ウレアリティクム血清型1〜10が含まれる。これらは、商業的カルチャーコレクション(例えば、European Collection of Cell Cultures(ECACC)英国ソールズベリー)から入手可能である。
吸着剤、フィルターまたは超遠心分離などの慣用的濃縮技術を用いて、持続型微生物の基本小体または他の細胞を単離しそして/または精製してもよい。
いくつかの態様において、単離基本小体または他の細胞は、細胞を感染させて、Omp2(60kDa)、Omp3(9kDa)またはPmpDを発現せず、そしてトラコーマクラミジアの参照株に比較して、増加したレベルのHsp60;および減少したレベルのMOMPを発現する網様体を産生することが可能な、トラコーマクラミジアの持続型に由来してもよい。
いくつかの態様において、単離基本小体または他の細胞は、細胞を感染させて、LPSを発現せず、そして肺炎クラミジアの参照株に比較して、減少したサイズの封入体を含む網様体を産生することが可能な、肺炎クラミジアの持続型に由来してもよい。
本発明の別の側面は、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型に感染した宿主細胞を産生する方法であって;
前記持続型の基本小体を含む、個体から得た血液試料の分画を単離しそして/または精製し、
前記分画と宿主細胞集団を接触させ、そして前記集団において、微生物の持続型を含む宿主細胞を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
前記持続型の基本小体を含む、個体から得た血液試料の分画を単離しそして/または精製し、
前記分画と宿主細胞集団を接触させ、そして前記集団において、微生物の持続型を含む宿主細胞を同定する
工程を含む、前記方法を提供する。
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物に適した宿主細胞には、McCoy、HL、Hep−2、またはHeLa細胞などの培養哺乳動物細胞が含まれる。
例えば細胞内網様体の形の、微生物の持続型を含むと同定される宿主細胞を単離しそして/または精製してもよい。
同定した宿主細胞をさらに培養してもよい。哺乳動物細胞培養のための方法および技術が当該技術分野に周知である(例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293, Ho WYら J Immunol Methods. (2006) 310:40−52を参照されたい)。標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば37℃、21%酸素、5%二酸化炭素を使用してもよい。好ましくは培地を2日ごとに交換して、そして細胞を重力によって落ち着かせる。
より詳細に上に記載される、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムおよびウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群から、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物を選択してもよい。
本発明の別の側面は、上記方法によって得られうる、持続型偏性細胞内または膜会合の
病原性微生物を含む宿主細胞を提供する。
病原性微生物を含む宿主細胞を提供する。
宿主細胞は、微生物の参照株に比較して、減少した抗生物質感受性を有する、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型の、網様体の形の1以上の細胞を含んでもよい。
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型の網様体は、前記微生物の参照株に比較して、減少したリポ多糖を有するかまたはリポ多糖を欠いていてもよい。
偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型の網様体は、前記微生物の参照株に比較して、改変された遺伝子発現を有してもよい。いくつかの態様において、網様体は、例えば感染の急性型の参照株によって典型的に発現される特定の遺伝子を発現していない可能性もあり、そして参照株によって発現されない遺伝子を発現している可能性もある。網様体はまた、参照株に比較して、他の遺伝子の過剰、過少、または他の異常な発現を所持する可能性もある。例えば、トラコーマクラミジアの持続型の網様体は、Omp2(60kDa)、Omp3(9kDa)またはPmpDを発現せず、そして;トラコーマクラミジアの参照株に比較して、増加したレベルのHsp60;および減少したレベルのMOMPを発現する。
本発明の他の側面は、本明細書に記載するような病原体感染と関連する状態の治療に有用でありうる化合物に関してスクリーニングする方法に関する。
抗微生物化合物に関してスクリーニングする方法は;
本明細書に記載するような偏性細胞内病原性微生物の持続型に感染した宿主細胞を、試験化合物と接触させて;そして
前記宿主細胞中の病原性微生物に対する前記化合物の効果を決定する
ここで、対照に比較した前記宿主細胞中の前記病原性微生物の量の減少が、試験化合物が抗微生物化合物である指標となる
工程を含んでもよい。
本明細書に記載するような偏性細胞内病原性微生物の持続型に感染した宿主細胞を、試験化合物と接触させて;そして
前記宿主細胞中の病原性微生物に対する前記化合物の効果を決定する
ここで、対照に比較した前記宿主細胞中の前記病原性微生物の量の減少が、試験化合物が抗微生物化合物である指標となる
工程を含んでもよい。
好ましくは、試験化合物は、宿主細胞に対して毒性でない。宿主細胞に対して毒性でない試験化合物または調製物の濃度範囲を最初に同定してもよい。次いで、宿主細胞を、この範囲内の濃度の試験化合物と接触させて、病原性微生物に対する効果を決定してもよい。
当業者は、ルーチンのスキルおよび知識を用いて、本明細書に記載する方法を実行するための正確な形式を変化させてもよい。
本明細書記載の方法を用いてスクリーニング可能な化合物は、薬剤スクリーニングプログラムで用いられる、天然または合成化学的化合物であってもよい。いくつかの性質決定されたまたは性質決定されていない構成要素を含有する、植物、微生物または他の生物の抽出物もまた、使用可能である。
コンビナトリアルライブラリー技術は、相互作用を調節する能力に関して、潜在的に膨大な数の異なる化合物を試験する効率的な方法を提供する。とりわけ天然産物、小分子およびペプチドのすべての様式に関する、こうしたライブラリーおよびその使用が当該技術分野に知られる。特定の状況において、ペプチドライブラリーの使用が好ましい可能性もある。
試験化合物または本発明の方法に添加可能な化合物の量は、通常、一連の希釈実験によって決定されるであろう。典型的には、約0.001nM〜1mM以上の推定上の阻害剤化合物を用いてもよく、例えば0.01nM〜100μM、例えば0.1〜50μM、例えば約10μMを用いてもよい。
方法は、抗微生物化合物として試験化合物を同定する工程を含んでもよい。こうした化合物は、例えば本明細書に記載するような感染または感染関連状態の治療において、例えば、本明細書に記載するような微生物での感染を減少させるかまたは除去する際に有用でありうる。
1以上の初期スクリーニングを用いて、対照に比較して、前記宿主細胞中の前記病原性微生物の量を減少させる能力を有すると同定された試験化合物を、1以上の二次スクリーニングを用いて、さらに評価してもよい。二次スクリーニングは、例えば、動物モデルにおいて、微生物感染または微生物感染に関連する障害に対する効果に関して試験する工程
を含んでもよい。
を含んでもよい。
試験化合物を単離しそして/または精製してもよいし、あるいは組換え発現または化学合成の慣用的技術を用いて合成してもよい。さらに、医薬品、薬学的組成物または薬剤などの組成物の調製、すなわち製造または処方において、試験化合物を製造しそして/または用いてもよい。微生物感染または微生物感染と関連する障害の治療のために、これらを個体に投与してもよい。したがって、本発明の方法は、以下にさらに論じるように、療法的適用のため、薬学的に許容されうる賦形剤、ビヒクルまたはキャリアーを含む、薬学的組成物中に試験化合物を処方することを含んでもよい。
抗微生物活性を所持する化合物の同定後、方法は、化合物を修飾して、その薬学的特性を最適にする工程をさらに含んでもよい。
生物学的に活性であると同定された「リード」化合物の修飾は、薬剤の開発に向かう既知のアプローチであり、そして活性化合物を合成するのが困難であるかまたは高価である場合、あるいは投与の特定の方法に適さない場合、例えば、消化管においてプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるため、ペプチドは、経口組成物の活性剤としてはふさわしくないが、そのような場合、「リード」化合物の修飾が望ましい可能性もある。既知の活性化合物の修飾(例えば擬似体を産生するためのもの)を用いて、ターゲット特性に関して、多数の分子をランダムにスクリーニングするのを回避してもよい。
薬学的特性を最適化するための「リード」化合物の修飾は、通常、いくつかの工程を含む。最初に、ターゲット特性を決定する際に必須および/または重要な、化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、ペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変化させることによって、例えば各残基を順番に置換することによって、これを行ってもよい。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「ファーマコフォア(pharmacophore)」として知られる。
ファーマコフォアが見出されたならば、さまざまな供給源、例えば分光光度技術、X線回折データおよびNMR由来のデータを用いて、物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび/または電荷にしたがって、その構造をモデリングする。
コンピュータ分析、類似性マッピング(原子間の結合よりも、ファーマコフォアの電荷および/または体積をモデリングする)および他の技術を、このモデリングプロセスで用いてもよい。
このアプローチの変形において、抗微生物化合物の三次元構造をモデリングする。これは、化合物がコンホメーションを変化させ、リード化合物の最適化において、モデルがこれを考慮に入れることを可能にする場合、特に有用でありうる。
次いで、ファーマコフォアを模倣する化学基を移植可能な、テンプレート分子を選択する。修飾された化合物の合成が容易であり、該化合物が薬理学的に許容可能であり、そしてリード化合物の生物学的活性を保持しながら、in vivoで分解しないように、テンプレート分子および該分子上に移植される化学基を好適に選択してもよい。次いで、このアプローチによって見出した修飾化合物をスクリーニングして、ターゲット特性を有するか、またはどの程度まで該特性を示すかを調べてもよい。修飾化合物には、リード化合物の擬似体が含まれる。
次いで、さらなる最適化または修飾を実行して、in vivoまたは臨床試験のための1以上の最終化合物にたどり着いてもよい。
上述のように、本発明の方法を用いて、同定しそして/または得た化合物を、薬学的組成物内に処方してもよい。
活性抗微生物化合物を単独で投与することも可能であるが、1以上の薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、潤滑剤、または当業者に周知の他の成分、および場合によって他の療法剤または予防剤とともに、上に定義するような、少なくとも1つの活性化合物を含む、薬学的組成物(例えば処方物)として、提示することが好ましい。
1以上の薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤、緩衝剤、アジュバント、安定化剤、または他の物質と一緒に混合されたかまたは処方された、上に定義するような抗微生物
化合物、例えば阻害剤を含む薬学的組成物を、本明細書に記載する方法で用いてもよい。
化合物、例えば阻害剤を含む薬学的組成物を、本明細書に記載する方法で用いてもよい。
用語「薬学的に許容されうる」は、本明細書において、合理的な利点/リスク比と釣り合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題または合併症を伴わずに、被験体(例えばヒト)の組織と接触させるのに適した、正常な医学的判断の範囲内である、化合物、物質、組成物、および/または投薬型に関する。各キャリアー、賦形剤等はまた、処方物の他の成分と適合するという意味で、「許容可能」でなければならない。
適切なキャリアー、賦形剤等を標準的な薬学教科書、例えば、Remington’s
Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見出すことも可能である。
Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見出すことも可能である。
処方物は、好適に、単位投薬型で存在してもよく、そして薬学業に周知のいかなる方法によって、処方物を調製してもよい。こうした方法には、活性化合物を、1以上の補助成分を構成してもよいキャリアーと会合させる工程が含まれる。一般的に、均一にそして密接に、活性化合物と、液体キャリアーまたは細かく分割した固体キャリアーあるいはその両方を会合させ、そして次いで、必要であれば産物を成形することによって、処方物を調製する。
処方物は、液体、溶液、懸濁物、エマルジョン、エリキシル剤、シロップ、錠剤、ロゼンジ、顆粒、粉末、カプセル、カシェー剤、丸薬、アンプル剤、座薬、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、泡、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、またはエアロゾルの形であってもよい。
本発明の他の側面は、本明細書記載の方法を用いた、病原体感染に関連する状態の治療および監視に関する。
病原体感染と関連する状態を治療する方法は;
個体に抗微生物化合物を投与し;そして
前記投与後、個体から得た血液試料の無細胞分画中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体に抗微生物化合物を投与し;そして
前記投与後、個体から得た血液試料の無細胞分画中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
病原体細胞が、血液試料の無細胞分画から欠けていることが見出されるまで、個体に対する抗微生物化合物の投与を反復してもよい。
血液試料の無細胞分画中の病原体細胞の存在の決定法は、より詳細に上記に記載される。
病原体は、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型であってもよい。個体における、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物での持続性感染の治療法は:
i)個体に抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に個体から血液試料を得て、
iii)前記血液試料と特異的結合メンバーを接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
(iii)前記試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定して
iv)試料由来の分画に病原性微生物由来の核酸がまったく存在しないことが決定されるまで、工程i)〜iii)を反復する
工程を含んでもよい。
i)個体に抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に個体から血液試料を得て、
iii)前記血液試料と特異的結合メンバーを接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
(iii)前記試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定して
iv)試料由来の分画に病原性微生物由来の核酸がまったく存在しないことが決定されるまで、工程i)〜iii)を反復する
工程を含んでもよい。
試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定するための方法は、より詳細に上記に記載される。
抗微生物化合物は、微生物、特にクラミジア属種またはマイコプラズマ科種などの病原性細菌を殺すか、またはその増殖を阻害する。適切な抗微生物化合物には、エリスロマイシン、リファラジル、ロキシスロマイシン、オフロキサシン、クリナフロキサシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、モキシフロキサシン、リファンピン、コアリスロマイシン(coarithromycin)、グレパフォアキシン(grepafoaxcin)、ルボフロキサシン(luvofloxacin)、トロバフロキサシン、テリスロマイシン、クラリスロマイシン、キノロンおよび/または他のフルオロキノロン、マクロリド、ケ
トリド、あるいは抗微生物薬剤の他の群由来のものが含まれる。
トリド、あるいは抗微生物薬剤の他の群由来のものが含まれる。
病原体には、トラコーマクラミジアまたは肺炎クラミジアなどのクラミジア属種、あるいはマイコプラズマ科種、例えばマイコプラズマ・ゲニタリウムなどのマイコプラズマ、またはウレアプラズマ・ウレアリティクムなどのウレアプラズマが含まれてもよい。
これらの病原体に関連する疾患は、より詳細に上記に記載される。
例えば、病原体感染に関連する、性感染症または骨盤内炎症性疾患などの炎症性障害を治療する方法は;
個体に抗微生物化合物を投与し;そして
前記投与後、個体から得た血液試料の無細胞分画中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
個体に抗微生物化合物を投与し;そして
前記投与後、個体から得た血液試料の無細胞分画中の病原体細胞の存在を決定する
工程を含んでもよい。
性感染症には、トラコーマクラミジアまたはマイコプラズマ科種での感染が含まれる。骨盤内炎症性疾患などの炎症性障害は、トラコーマクラミジアまたはマイコプラズマ科種などの病原体での感染に関連している可能性もある。
本明細書記載の方法は、トラコーマクラミジアなどの病原体の診断において、偽陰性症例の数を減少させ、治療完了の可能性を増加させることによって抗微生物治療の有効性を増加させ、そしてトラコーマクラミジアなどの病原体の根絶を確実にすることによって感染の慢性持続型の発展を防止する際に、有用でありうる。
本発明の他の側面は、本明細書記載の方法を用いた、アテローム硬化性状態の治療および監視に特に関する。
アテローム硬化性状態は、肺炎クラミジア感染に関連し、そして特に、脂質を酸化させそして肺炎クラミジアと反応性である、「アブザイム」として知られる触媒性抗体に関する。したがって、アテローム硬化性状態の有効な治療は、アブザイムレベルを減少させる治療、および根底にある肺炎クラミジア感染を減少させるかまたは排除する治療の両方を必要とする。
本明細書に記載するような、血中の肺炎クラミジアの検出は、抗微生物治療に適した個体を同定し、治療完了の可能性を増加させることによって抗微生物治療の有効性を増加させ、そして肺炎クラミジアの根絶を確実にして、抗クラミジア属の脂質酸化性アブザイムの再出現、およびアテローム硬化性状態の発展を防止する際に、有用でありうる。
個体において、アテローム硬化性状態を治療する方法は;
i)個体に、アブザイム阻害剤および抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、
ここで、アブザイム活性が、無細胞分画から実質的に欠如するまで、個体に対するアブザイム阻害剤の前記投与を反復する、そして
iv)上記方法を用いて、血液試料の無細胞分画から肺炎クラミジア基本小体または他の細胞の存在または非存在を決定する、
ここで、肺炎クラミジア基本小体または他の細胞が、血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対する抗微生物化合物の前記投与を反復する
工程を含んでもよい。
i)個体に、アブザイム阻害剤および抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、
ここで、アブザイム活性が、無細胞分画から実質的に欠如するまで、個体に対するアブザイム阻害剤の前記投与を反復する、そして
iv)上記方法を用いて、血液試料の無細胞分画から肺炎クラミジア基本小体または他の細胞の存在または非存在を決定する、
ここで、肺炎クラミジア基本小体または他の細胞が、血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対する抗微生物化合物の前記投与を反復する
工程を含んでもよい。
アブザイム阻害剤は、血清または血漿中の触媒性抗体、例えばIgG分子の脂質酸化活性を阻害する化合物である。脂質酸化活性を示す触媒性抗体は、抗クラミジア属抗体であることも可能である。
適切なアブザイム阻害剤には、アジスロマイシン、ラクトリコペン(lactolycopene)、カロテン、α−トコフェロール、メシル酸デスフェリオキサミン、EGCGなどのカテキン、ヘム誘導体、ペニシラミン、チオプロニン、トリエンチン二塩酸、ジエチルジチオカルバメート、エデト酸二ナトリウム/三ナトリウム、アセチルサリチル酸、エデト酸、ケトリド、ユニチオール、α−トコフェロール、マンニトール、シリジアニン、アスコルビン酸および低pHで有効な他の酸化防止剤が含まれる。
適切な抗微生物化合物は上に記載される。
いくつかの態様において、抗微生物活性およびアブザイム阻害活性の両方を有する単一
の化合物を使用してもよい。適切な化合物には、アジスロマイシンおよびテリスロマイシン(ケテック)が含まれる。
の化合物を使用してもよい。適切な化合物には、アジスロマイシンおよびテリスロマイシン(ケテック)が含まれる。
例えば、個体において、アテローム硬化性状態を治療する方法は;
i)個体に、アジスロマイシンを投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、そして;
iv)上記方法を用いて、血液試料の無細胞分画における肺炎クラミジア細胞の存在または非存在を決定する、
ここで、アブザイム活性および肺炎クラミジア細胞が、個体から得た血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対するアジスロマイシンの前記投与を反復する
工程を含んでもよい。
i)個体に、アジスロマイシンを投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、そして;
iv)上記方法を用いて、血液試料の無細胞分画における肺炎クラミジア細胞の存在または非存在を決定する、
ここで、アブザイム活性および肺炎クラミジア細胞が、個体から得た血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対するアジスロマイシンの前記投与を反復する
工程を含んでもよい。
アブザイム阻害剤および抗微生物化合物を薬学的組成物として投与してもよい。薬学的組成物には、活性アブザイム阻害剤または抗微生物化合物に加えて、薬学的に許容されうる賦形剤、キャリアー、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の物質が含まれてもよい。こうした物質は、非毒性であるべきであり、そして活性成分の有効性に干渉すべきでない。キャリアーまたは他の物質の正確な性質は、経口であるか、あるいは例えば皮膚、皮下または静脈内注射によってもよい、投与経路に応じるであろう。
経口投与用の薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体型であってもよい。錠剤には、ゼラチンなどの固体キャリアー、またはアジュバントが含まれてもよい。液体薬学的組成物には、一般的に、水、石油、動物または植物油、ミネラルオイルまたは合成油などの液体キャリアーが含まれる。生理学的生理食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカリド溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。
静脈内、皮膚または皮下注射のため、活性成分は、発熱物質不含であり、そして適切なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容されうる水性溶液の形であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を十分に調製可能である。必要に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤および/または他の添加剤が含まれてもよい。
アブザイム阻害剤および/または抗微生物化合物の投与は、好ましくは「予防的に有効な量」または「療法的に有効な量」(場合によっては、予防法を療法を見なしうるが)であり、これは、個体に利点を示すのに十分である。実際に投与する量、ならびに投与速度および時間経過は、治療中のものの性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量等に関する決定は、一般開業医および他の医師の責任内である。
いくつかの好ましい態様において、アブザイム阻害剤および/または抗微生物化合物を、定期的に、例えば毎時、毎日、毎週、隔週、または毎月、個体に投与する。アブザイム活性および/または病原体細胞が、個体から得た血液試料から減少したかまたは排除されたことが見出されるまで、定期的投与を続けてもよい。
個体がアブザイム阻害剤および/または抗微生物化合物での治療を受けている間、個体から定期的に、例えば、毎日、毎週、隔週、または毎月、血液試料を得て、そして試料中のアブザイム活性レベルおよび/または病原体細胞の存在を決定してもよい。
分画中の抗体仲介脂質酸化活性、特に抗クラミジア属抗体によって仲介される、分画中の脂質酸化活性を決定することによって、個体から得た血液試料の無細胞分画中のアブザイム活性レベルを決定してもよい。例えば、脂質を酸化する能力に関して、試料の血清または血漿分画由来の抗体、好ましくはクラミジア属結合抗体を試験してもよい。
宿主脂質(すなわち試料由来の脂質)、クラミジア属細胞などの外来抗原由来の脂質、または例えばアッセイ法の一部として添加されていてもよい別の供給源由来の脂質の酸化を決定することによって(例えば測定するかまたは検出することによって)、脂質過酸化活性を含む脂質酸化活性を決定してもよい。
産物または副産物、例えば同時酸化された共役レポーター分子の集積、あるいは非修飾脂質などの基質または酸素などの共基質の消失または消費を測定することによって、脂質
酸化を決定してもよい。
酸化を決定してもよい。
脂質過酸化を決定するための多くの方法が当該技術分野に知られ、そして本発明にしたがって使用するのに適している。脂質酸化を決定する正確な様式は本発明の特徴ではなく、そして当業者は、好みおよび一般的な知識にしたがって、適切な様式を選択することが可能である。
適切な方法は、例えば、CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca
Raton, Florida (1985)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990); Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994);およびFree Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載される。
Raton, Florida (1985)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990); Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994);およびFree Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載される。
好ましい態様において、脂質酸化産物の産生(すなわち存在または量)を決定することによって、酸化を決定する。
酸化が開始された脂質の酸化産物および/または中間体を決定してもよいし、あるいは酸化が増加した脂質の酸化産物および/または中間体を決定してもよい。
適切な脂質酸化産物には、マロンジアルデヒド(MDA)などのアルデヒド、(脂質)過酸化物、ジエン・コンジュゲートまたは炭化水素ガスが含まれてもよい。いかなる適切な方法によって、脂質酸化産物を決定してもよい。例えば、HPLC(Brown, R.K., およびKelly, F.J : Free Radicals. A practical approach.中 IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119−131)、UV分光測定(Kinter, M. Quantitative analysis of 4−hydroxy−2−nonenal. 同書,133−145)、またはガスクロマトグラフィー−質量分析(Morrow, J.D., およびRoberts, L.J. F2−Isoprostanes: prostaglandin−like products of lipid peroxidation. 同書, 147−157)を用いて、脂質過酸化産物を決定してもよい。
脂質の過酸化は、タンパク質、炭水化物、核酸および他の種類の分子の酸化につながりうる。こうした酸化の産物もまた、アブザイム活性の間接的な測定に用いてもよい。さらに、過酸化は、脂質酸化増加に関連するレポーター分子の特性の変化につながりうる。以下に記載するように、レポーター分子を、例えばリポソームとして、これらの脂質内に被包してもよく、そしてリポソームからのレポーター分子の放出が酸化の指標となる。
適切なレポーター物質および分子には、損なわれていない(intact)発光細菌、ルミノール、ルシゲニン、フォラシン(pholasin)およびルシフェリンが含まれてもよい。こうした物質を、例えば、H2O2/O2 ・ ̄/O2利用分子、例えばペルオキシダーゼ、エラスターゼ、オキシダーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ペリレン、NAD+、およびアクリジニウムエステルビス(トリクロロフェニル)オキサレート(Campbell A.K. Chemiluminescence. VCH, Ellis Horwood Ltd., England,
1988)にカップリングさせてもよい。
1988)にカップリングさせてもよい。
また、フリーラジカル連鎖反応感受性の他の物質を用いて、脂質酸化を決定してもよい。例えば、連鎖プロセスとしての脂質過酸化は、アクリルアミドの重合を開始し、そして増進する。したがって、14C−アクリルアミドの共重合を決定することによって、脂質酸化を決定してもよい(Kozlov Yu P. (1968) Role of Free Radicals in normal and pathological
processes. Doctorate thesis − MGU Moscow
1968)。
processes. Doctorate thesis − MGU Moscow
1968)。
脂質およびリポタンパク質過酸化は、フリーラジカルが仲介するプロセスであるため、これらのラジカルの検出によって、脂質酸化アブザイムを測定してもよい。内在性の低レベル化学発光(増感剤を伴うまたは伴わない)(Vladimirov, Y.A., およびArchakov, A.I. Lipid Peroxidation in Biological Membranes. Nauka, Moscow (1972); Vladimirov, Y.A. Intrinsic low−level
chemiluminescence.: Free Radicals. A practical approach.中 IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65−82)、電子スピン共鳴(スピン捕捉を伴う(Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radical metabolites with electron spin resonance.: Free Radicals. A practical approach.中 IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 11−24)またはスピン捕捉を伴わない(Petyaev, M.M. Biophysical approaches in the diagnosis of cancer. Medicina, Moscow (1972))、または当該技術分野に周知の他の技術を用いて、ラジカルを検出するかまたは決定してもよい。また、脂肪酸またはこの反応の他の基質の消費を決定することによって、脂質酸化を決定してもよい。
chemiluminescence.: Free Radicals. A practical approach.中 IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65−82)、電子スピン共鳴(スピン捕捉を伴う(Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radical metabolites with electron spin resonance.: Free Radicals. A practical approach.中 IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 11−24)またはスピン捕捉を伴わない(Petyaev, M.M. Biophysical approaches in the diagnosis of cancer. Medicina, Moscow (1972))、または当該技術分野に周知の他の技術を用いて、ラジカルを検出するかまたは決定してもよい。また、脂肪酸またはこの反応の他の基質の消費を決定することによって、脂質酸化を決定してもよい。
いくつかの態様において、525nmなどの適切な波長で吸光度を測定することによって、2−チオバルビツール酸(好適には1mM)との反応後のマロンジアルデヒドの産生(MDA)を決定する。
いくつかの態様において、試料の血清または血漿分画由来の抗体が、クラミジア属細胞、例えば肺炎クラミジア、C.シッタシ(C. psittaci)、またはトラコーマクラミジア細胞に結合する能力を決定してもよい。
アブザイム活性の決定は、WO03/019196、WO03/019198およびWO03/017992に、より詳細に記載される。
個体由来の血液試料の無細胞分画中のアブザイム活性レベルが、ゼロであるかまたは実質的にゼロであると決定されるまで、アブザイム阻害剤での個体の治療を続けてもよい。個体由来の血液試料の無細胞分画中のアブザイム活性レベルが、ゼロまたは実質的にゼロまで減少した後、アブザイム阻害剤での治療をやめてもよい。
上述の方法を用いて、血液試料の無細胞分画中の肺炎クラミジア細胞の存在または非存在を決定してもよい。
個体由来の血液試料の無細胞分画中に、肺炎クラミジア細胞がまったく検出されなくなるまで、抗微生物化合物での治療を続けてもよい。肺炎クラミジア細胞が血液試料の無細胞分画から除去された後、抗微生物化合物での治療をやめてもよい。
いくつかの態様において、個体における、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物での持続性感染を治療する際の抗微生物化合物の有効性を試験してもよい。方法は:
i)抗微生物化合物の投与前および投与後、個体から血液試料を得て、
(ii)特異的結合メンバーと前記血液試料を接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
(iii)前記試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する、
ここで、投与前に得た試料に比較して、投与後に得た試料由来の前記分画中の病原性微生物由来の核酸量の減少が、抗微生物調製物が持続性感染を治療する際に有効であることの指標となる
工程を含んでもよい。
i)抗微生物化合物の投与前および投与後、個体から血液試料を得て、
(ii)特異的結合メンバーと前記血液試料を接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
(iii)前記試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する、
ここで、投与前に得た試料に比較して、投与後に得た試料由来の前記分画中の病原性微生物由来の核酸量の減少が、抗微生物調製物が持続性感染を治療する際に有効であることの指標となる
工程を含んでもよい。
本発明の多様なさらなる側面および態様が、本開示を考慮すると、当業者には明らかであろう。本明細書に言及されるすべての文書は、その全体が本明細書に援用される。
本発明は、上に記載する特徴のあらゆる組み合わせおよびサブコンビネーションを含む。
ここで、本発明の特定の側面および態様を、例として、そして以下に記載する図および表に関連して、例示する。
表1は、本明細書に記載するような血清に基づくPCR DNA検出アッセイと、全血に対して行った慣用的な検出アッセイの比較を示す。患者群は、バイパス手術(by−surgery)のために入院したCHDの個体、および肺炎クラミジアの関与が推測される、呼吸疾患の個体を含む。
表2は、本明細書に記載するような血清に基づくPCR DNA検出アッセイと、全血に対して行った慣用的な検出アッセイの比較を示す。患者群は、CHD/無症候性虚血の個体を含む。対照群は、健康な個体を含む。
表3は、慣用的およびリアルタイムPCRの間の核酸検出の相関を示す。
表4は、血液試料中のトラコーマクラミジアの検出を示す。
表5は、血液試料中のマイコプラズマ・ゲニタリウムの検出を示す。
表6は、血液試料中のウレアプラズマ・ウレアリティクム(種)の検出を示す。
表7は、トラコーマクラミジア性器感染の治療における、スワブ診断に対する血清DNA試験の診断価値の比較を示す。
表8は、急性トラコーマクラミジア感染(膣炎/子宮頸管炎/尿道炎)の診断における、スワブ診断に対する血清DNA試験の診断価値の比較を示す。
表9は、反応性関節炎(ライター病)におけるトラコーマクラミジア感染の診断における、スワブ診断に対する血清DNA試験の診断価値の比較を示す。
表10は、慢性骨盤内炎症性疾患におけるトラコーマクラミジア感染の診断における、スワブ診断に対する血清DNA試験の診断価値の比較を示す。
表11は、無症状患者におけるトラコーマクラミジア感染の診断における、スワブ診断に対する血清DNA試験の診断価値の比較を示す。
表12は、トラコーマクラミジアにおける遺伝子発現の分析を示す。
表13は、アジスロマイシンに対する、トラコーマクラミジアおよび肺炎クラミジアの参照株および持続性株の感受性を示す。
表14は、対照、CHD/無症候性虚血、および末梢閉塞性疾患患者に関する、標準的プロトコルに比較した、PCRによる血液中の肺炎クラミジアDNAの陽性検出を示す。
表15は、対照およびCHD患者に関する、血中の肺炎クラミジア感染の検出を示す。
実験
材料および方法
試料
3つの異なる臨床群:バイパス手術(by−surgery)のため入院したCHD患者;肺炎クラミジアの関与が推測される呼吸疾患患者;および対照として用いる臨床的に健康な個体から、静脈血試料を収集した。
材料および方法
試料
3つの異なる臨床群:バイパス手術(by−surgery)のため入院したCHD患者;肺炎クラミジアの関与が推測される呼吸疾患患者;および対照として用いる臨床的に健康な個体から、静脈血試料を収集した。
性器/泌尿器感染の徴候がある患者、およびその徴候がない患者から、そして対照として用いる臨床的に健康な個体からもまた、静脈血試料を収集した。
収集後、いくつかの試料を凍結し、そして試験まで−20℃で保存し、いくつかを+4℃で維持し、そしていくつかを収集直後に試験した。
2,000gで10分間遠心分離することによって、全血から血清を分離した。
プロテインAを用いた細胞の濃縮
プロテインA−アガロースを血清試料と、37℃で30〜60分間、同時インキュベーションした。
プロテインA−アガロースを血清試料と、37℃で30〜60分間、同時インキュベーションした。
固定された免疫グロブリン(遊離および免疫複合体中)と吸着剤を、3,000〜5,000gで10分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。
次いで、吸着剤ペレットをPBSに再懸濁し、そして遠心分離法を反復した。この洗浄工程をさらに2回反復した。
その後、再懸濁したペレットを、DNA試験のため採取した。
ろ過による細胞の濃縮
1,000μl、200μl、2,000μlの血清試料をQIAGENシリカゲルカラム上に装填し、そして1,000gで5分間、または8,000gで1分間、遠心分離した。200μlのQIAGEN緩衝液ALおよび20μlのプロテアーゼをカラム上に装填し、そして56℃で10分間インキュベーションした。200μlのエタノールを添加して、そしてカラムを8,000gで1分間遠心分離した。その後、カラム製造者のプロトコルにしたがった。
1,000μl、200μl、2,000μlの血清試料をQIAGENシリカゲルカラム上に装填し、そして1,000gで5分間、または8,000gで1分間、遠心分離した。200μlのQIAGEN緩衝液ALおよび20μlのプロテアーゼをカラム上に装填し、そして56℃で10分間インキュベーションした。200μlのエタノールを添加して、そしてカラムを8,000gで1分間遠心分離した。その後、カラム製造者のプロトコルにしたがった。
簡潔には、500μlのAW1緩衝液を添加し、そして8,000gで1分間遠心分離した。500μlのAW2緩衝液を添加し、そして12,000gで3分間遠心分離した。100μlのAE緩衝液を添加し、そしてカラムを1分間インキュベーションし、そして8,000gで1分間遠心分離した。次いで、PCRのため、5〜10μlの試料を取り除いた。
PCR
QIAamp DNA血液ミニキット(QIAGen)を用いて、1mlの血清試料からDNAを抽出し、そして100μlの緩衝液AE(QIAGen)に再懸濁した。
QIAamp DNA血液ミニキット(QIAGen)を用いて、1mlの血清試料からDNAを抽出し、そして100μlの緩衝液AE(QIAGen)に再懸濁した。
肺炎クラミジアに特異的な、16S rRNA遺伝子の可変断片に対する、以下のプライマーを用いたPCRによって、抽出したDNAを増幅した:CPN90 −5’GGT
CTC AAC CCC ATC CGT GTC GG 3およびCPN91 − 5’ TGC GGA AAG CTG TAT TTC TAC AGT T 3’ (Madico G.ら, J. Clin. Microbiol. 2000, 38:1085−1093)。増幅断片のサイズは197塩基対であった。
CTC AAC CCC ATC CGT GTC GG 3およびCPN91 − 5’ TGC GGA AAG CTG TAT TTC TAC AGT T 3’ (Madico G.ら, J. Clin. Microbiol. 2000, 38:1085−1093)。増幅断片のサイズは197塩基対であった。
10mM Tris/HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、15pmolの各プライマー、1U Taq−DNA−ポリメラーゼ(Promega)および5μlの試料を含有するPCR溶液25μl中で、増幅反応を行った。
以下のPCRプログラムを使用した:DNAサーモサイクラーPerkin−Elmer Cetusでの45周期の94℃45秒間、60℃45秒間、および72℃45秒間。
アッセイの分析感度は、PCRあたり100ゲノム当量(GE)であった。
1.2%アガロースゲル中の電気泳動分離後、エチジウムブロミド染色によって、PCR産物を視覚化した。
リアルタイムPCR
「Taqmanプローブ」用の設計プログラム「Primer Express」(Applied Biosystems)を用いて、肺炎クラミジアの16S rRNA遺伝子に基づいて、プライマーおよびプローブを設計した。用いたプライマーおよびプローブは:プローブ553: 5’−CAAGTCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGC−3’、プローブ557: 5’−TCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGCATCG−3’、プライマーСPN90: 5’−GGTCTCAACCCCATCCGTGTCGG−3’、プライマーСPN91: 5’−TGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT−3’であった。BLASTプログラムを用いて、クラミジア科の他の種の16S rRNA遺伝子に対する選択したプライマーの特異性を確認した。
「Taqmanプローブ」用の設計プログラム「Primer Express」(Applied Biosystems)を用いて、肺炎クラミジアの16S rRNA遺伝子に基づいて、プライマーおよびプローブを設計した。用いたプライマーおよびプローブは:プローブ553: 5’−CAAGTCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGC−3’、プローブ557: 5’−TCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGCATCG−3’、プライマーСPN90: 5’−GGTCTCAACCCCATCCGTGTCGG−3’、プライマーСPN91: 5’−TGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT−3’であった。BLASTプログラムを用いて、クラミジア科の他の種の16S rRNA遺伝子に対する選択したプライマーの特異性を確認した。
16S rRNAに基づく定量的リアルタイムPCR
Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて、肺炎クラミジア(GenBank寄託番号AF131889.1 GI: 4545320またはAE009440.1 GI:33236960)の16S rRNAから、PCRプライマーおよびプローブの肺炎クラミジア特異的配列を選択して、そしてこれらの配列は、Applied Biosystemsによって合成された。生成されたPCR産物は197bpであり;そしてプライマーおよびTaqManプローブの配列は以下のとおりであった:順方向プライマーС
PN90、5’−GGTCTCAACCCCATCCGTGTCGG−3’;逆方向プライマーСPN91、5’−TGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT−3’;およびTaqManプローブ557、5’−TCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGCATCG−3’。TaqManプローブは、レポーター色素としての6−カルボキシフルオレセインを用いて5’端で、そして消光剤としての6−カルボキシテトラメチルローダミンを用いて3’端で、蛍光標識された。BLASTプログラムで検索を行って、プライマーおよびプローブの特異性をチェックした。
Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて、肺炎クラミジア(GenBank寄託番号AF131889.1 GI: 4545320またはAE009440.1 GI:33236960)の16S rRNAから、PCRプライマーおよびプローブの肺炎クラミジア特異的配列を選択して、そしてこれらの配列は、Applied Biosystemsによって合成された。生成されたPCR産物は197bpであり;そしてプライマーおよびTaqManプローブの配列は以下のとおりであった:順方向プライマーС
PN90、5’−GGTCTCAACCCCATCCGTGTCGG−3’;逆方向プライマーСPN91、5’−TGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT−3’;およびTaqManプローブ557、5’−TCCAGGTAAGGTCCTTCGCGTTGCATCG−3’。TaqManプローブは、レポーター色素としての6−カルボキシフルオレセインを用いて5’端で、そして消光剤としての6−カルボキシテトラメチルローダミンを用いて3’端で、蛍光標識された。BLASTプログラムで検索を行って、プライマーおよびプローブの特異性をチェックした。
PCR伸長期中、Taq DNAポリメラーゼの5’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断された際の蛍光の増加として、PCR産物を検出した。この切断は、蛍光共鳴エネルギー移動を中断させ、そして生成されたPCR産物レベルに比例して、レポーター色素が蛍光を発しはじめる。レポーター色素の蛍光が、計算バックグラウンドレベルを最初に超えた周期数として定義される、周期閾値(CT)は、各反応に関して、計器によって自動的に概算された。精製肺炎クラミジアDNAの連続希釈からCT値の標準グラフを得た。未知の臨床的血清試料に関するCT値を、精製肺炎クラミジアDNAの標準グラフに対してプロットした。
既知の濃度の培養肺炎クラミジアDNAを1fg〜10pgの間の希釈で標準として用いた。
iCycler IQ系(BIO−RAD)を用いて、リアルタイムPCRを行った。総体積50μl中、PCR混合物を用いて、5μlの抽出DNAを分析した。PCR混合物は、10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、5UのTermostar Taq DNAポリメラーゼ(Sintol);200nMプローブ;ならびに300nM順方向および逆方向プライマーからなった。リアルタイムPCR実行は、95℃10分間、ならびに94℃1分間および63℃1.5分間の50回の反復であった。すべての試料を3つ組で分析した。3つ組試験において、3回のアッセイ結果のうち3回が陽性であるならば、そしてPCR実行の平均値が、1.0以上であるならば、試料は陽性と見なされた。
慣用的な肺炎クラミジア検出
8ml Vacutainer CPT細胞調製試験管(BD Vacutainer
Systems, ニュージャージー州フランクリンレークス)内に、静脈穿刺によって、循環PBMCを得た。CPT試験管は、チキソトロピック・ポリエステルゲルおよび密度勾配液体溶液で構成される血液分離培地を含有する。簡潔には、CPT試験管を、Beckman GPR遠心分離装置中、1,500xgで30分間遠心分離し、そして冷蔵した。実験室に移した後、反転によって標本を混合し、そして再度遠心分離し、そしてゲルのすぐ上の単核細胞層または1mlの血漿を吸引し、そして−70℃で凍結した。まとめて、単核細胞調製物を融解し、そしてQIAamp DNAミニキット(Qiagen、カナダ・オンタリオ州ミシサーガ)を用いて、200μlアリコットを100μlの溶出緩衝液中に抽出した。
8ml Vacutainer CPT細胞調製試験管(BD Vacutainer
Systems, ニュージャージー州フランクリンレークス)内に、静脈穿刺によって、循環PBMCを得た。CPT試験管は、チキソトロピック・ポリエステルゲルおよび密度勾配液体溶液で構成される血液分離培地を含有する。簡潔には、CPT試験管を、Beckman GPR遠心分離装置中、1,500xgで30分間遠心分離し、そして冷蔵した。実験室に移した後、反転によって標本を混合し、そして再度遠心分離し、そしてゲルのすぐ上の単核細胞層または1mlの血漿を吸引し、そして−70℃で凍結した。まとめて、単核細胞調製物を融解し、そしてQIAamp DNAミニキット(Qiagen、カナダ・オンタリオ州ミシサーガ)を用いて、200μlアリコットを100μlの溶出緩衝液中に抽出した。
肺炎クラミジアの入れ子PCR検出
ompA遺伝子の可変ドメインIV(VDIV)領域をターゲットとする入れ子PCRを用いた(外部プライマーCpn5P[5’ CCA ATA TGC ACA GTC
CAA ACC TAA AA 3’]およびCpn3P[5’ CTA GAT TTA AAC TTG TTG ATC TGA CAG 3’];入れ子プライマー−Cpn5N[5’ CTC TGT AAA CAA ACC GGG C 3’]およびCpn3N[5’ GAT CTG ACA GGA AAC AAT TTG CAT 3’])。
ompA遺伝子の可変ドメインIV(VDIV)領域をターゲットとする入れ子PCRを用いた(外部プライマーCpn5P[5’ CCA ATA TGC ACA GTC
CAA ACC TAA AA 3’]およびCpn3P[5’ CTA GAT TTA AAC TTG TTG ATC TGA CAG 3’];入れ子プライマー−Cpn5N[5’ CTC TGT AAA CAA ACC GGG C 3’]およびCpn3N[5’ GAT CTG ACA GGA AAC AAT TTG CAT 3’])。
10mM Tris/HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、15pmolの各プライマー、1U Taq−DNA−ポリメラーゼ(Promega)および5μlの試料を含有するPCR溶液25μl中で、増幅反応を行った。
サイクリング条件は、95℃5分間の最初の変性、その後、95℃30秒間の変性、6
0℃30秒間のアニーリング、および72℃30秒間の伸長の45周期からなった。第2周期のPCRのため、プライマーCpn5NおよびCpn3Nを用いて、2μlの第一周期産物を25μlの上記増幅混合物と混合し、そして同じサイクリング条件下で増幅した。
0℃30秒間のアニーリング、および72℃30秒間の伸長の45周期からなった。第2周期のPCRのため、プライマーCpn5NおよびCpn3Nを用いて、2μlの第一周期産物を25μlの上記増幅混合物と混合し、そして同じサイクリング条件下で増幅した。
1.2%アガロースゲル中の電気泳動分離後、エチジウムブロミド染色によって、PCR産物を視覚化した。
トラコーマクラミジアの検出
トラコーマクラミジアの潜在性プラスミドの特異的DNA断片をこの病原体の検出に用いた。210bp断片を生成する、以下のプライマーセットを用いた:
トラコーマクラミジアの潜在性プラスミドの特異的DNA断片をこの病原体の検出に用いた。210bp断片を生成する、以下のプライマーセットを用いた:
10mM Tris/HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、15pmolの各プライマー、1U Taq−DNA−ポリメラーゼ(Promega)および5μlの試料を含有するPCR溶液25μl中で、PCRを行った。
PCR Thermocycler Perkin Elmerで、45周期の増幅を行った。各周期は、94℃45秒間の変性工程、55℃45秒間のプライマーアニーリング、72℃45秒間のプライマー伸長からなった。1.5%アガロースゲル中の電気泳動、およびエチジウムブロミド染色によって、増幅産物(10μl)を視覚化した。
M.ゲニタリウムの検出
マイコプラズマ・ゲニタリウムに特異的なPCRは、140kDa接着タンパク質遺伝子、MgPa(Jensen JSら J. Clin. Microbiol. 1991 Jan; 29(1):46−50)をターゲットとした。
マイコプラズマ・ゲニタリウムに特異的なPCRは、140kDa接着タンパク質遺伝子、MgPa(Jensen JSら J. Clin. Microbiol. 1991 Jan; 29(1):46−50)をターゲットとした。
281bp断片を生成する、以下のプライマーセットを用いた:
10mM Tris/HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、15pmolの各プライマー、1U Taq−DNA−ポリメラーゼ(Promega)および5μlの試料を含有するPCR溶液25μl中で、増幅反応を行った。
PCR Thermocycler Perkin Elmerで、45周期の増幅を行った。各周期は、94℃45秒間の変性工程、55℃45秒間のプライマーアニーリング、72℃45秒間のプライマー伸長からなった。
1.5%アガロースゲル中の電気泳動、およびエチジウムブロミド染色によって、増幅産物(10μl)を視覚化した。
ウレアプラズマ・ウレアリティクムの検出
ウレアプラズマ属種のウレアーゼ遺伝子中の非常に保存された領域(Blanchard Aら Clin Infect Dis. 1993 Aug;17 Suppl 1:S148−53)に特異的なプライマーを用いて、PCRを行った。
ウレアプラズマ属種のウレアーゼ遺伝子中の非常に保存された領域(Blanchard Aら Clin Infect Dis. 1993 Aug;17 Suppl 1:S148−53)に特異的なプライマーを用いて、PCRを行った。
429bp断片を生成する、以下のプライマーセットを用いた:
10mM Tris/HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μMの各dNTP、15pmolの各プライマー、1U Taq−DNA−ポリメラーゼ(Promega)および5μlの試料を含有するPCR溶液25μl中で、増幅反応を行った。
PCR Thermocycler(Perkin Elmer)で、45周期の増幅を行った。各周期は、94℃45秒間の変性工程、55℃45秒間のプライマーアニーリング、72℃45秒間のプライマー伸長からなった。
1.5%アガロースゲル中の電気泳動、およびエチジウムブロミド染色によって、増幅産物(10μl)を視覚化した。
細胞培養
トラコーマクラミジアを単離するためMcCoy細胞を用い、そして肺炎クラミジアを
単離するため、HL細胞を用いた。
トラコーマクラミジアを単離するためMcCoy細胞を用い、そして肺炎クラミジアを
単離するため、HL細胞を用いた。
各細胞株の細胞を、カバースリップを用いて、24ウェル細胞培養プレートに植え付け(ウェルあたりおよそ2x105細胞)、そして37℃で24時間インキュベーションして、単層集密(confluence)を達成した。
1mlの血清を、14,000xg、4℃で1時間遠心分離して、細菌細胞を沈降させた。上清を廃棄し、そしてペレットを0.5mlのGM(増殖培地:RPMI、5%(体積/体積)ウシ胎児血清、2.0mM L−グルタミン、8.8%(体積/体積)グルコース、mlあたり4.0μgのゲンタマイシンおよび5.0のアンホテリシンB/ml)中に懸濁した。細胞単層に懸濁物を接種し、そして2,500xg、20℃で1時間遠心分離した。感染細胞を37℃で2時間インキュベーションし;その後、培地を除去して、そしてシクロヘキシミド(1.0μg/ml)を含むGMと交換した。細胞を、4%CO2中、37℃で72時間インキュベーションした。
カバースリップ上の細胞を、アセトンで固定し、そしてフルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)標識クラミジア属特異的(抗LPS)およびトラコーマクラミジア特異的(抗MOMP)抗体で染色した。蛍光顕微鏡によって、クラミジア封入体を検出した。
製造者の使用説明書にしたがって、QIAGENミニキットを用いることによって、クラミジアおよび細胞DNAの混合物の単離を行った。100μlのTE緩衝液によってDNAを溶出した。
PCR
トラコーマクラミジアおよび肺炎クラミジアに関する商業的に入手可能なPCRキットを用いた。
トラコーマクラミジアおよび肺炎クラミジアに関する商業的に入手可能なPCRキットを用いた。
RNA単離
製造者の使用説明書にしたがって、SV総RNA単離系(Promega)によって、総RNAを単離した。RNアーゼ不含DNアーゼI酵素によってRNAを処理し、そして100μlのヌクレアーゼ不含水によって、Spin Basketから溶出させた。ゲノムDNA混入に関して、RNA試料を試験した。
製造者の使用説明書にしたがって、SV総RNA単離系(Promega)によって、総RNAを単離した。RNアーゼ不含DNアーゼI酵素によってRNAを処理し、そして100μlのヌクレアーゼ不含水によって、Spin Basketから溶出させた。ゲノムDNA混入に関して、RNA試料を試験した。
RT−PCR
RT−PCRによって、トラコーマクラミジアの16S rRNA、HSP60、MOMPおよび他の外膜タンパク質の遺伝子発現を分析した。
RT−PCRによって、トラコーマクラミジアの16S rRNA、HSP60、MOMPおよび他の外膜タンパク質の遺伝子発現を分析した。
用いたRT−PCRプライマーのヌクレオチド配列は以下のとおりである:
抗生物質感受性試験
上述のように、McCoyおよびHL細胞を植え付け、そして血清試料を接種したが、2,500xgで1時間遠心分離し、そして37℃で2時間インキュベーションした後、0.05〜0.8μg/mlの濃度範囲の抗生物質(アジスロマイシン、Pliva)の連続2倍希釈を含有する増殖培地を感染細胞に上層し、そして4%CO2中、37℃で72時間インキュベーションした。トラコーマクラミジアL−2および肺炎クラミジアKajaani 6株を参照株として用いた。封入体がまったく検出されない最低濃度として、MICを定義した。
上述のように、McCoyおよびHL細胞を植え付け、そして血清試料を接種したが、2,500xgで1時間遠心分離し、そして37℃で2時間インキュベーションした後、0.05〜0.8μg/mlの濃度範囲の抗生物質(アジスロマイシン、Pliva)の連続2倍希釈を含有する増殖培地を感染細胞に上層し、そして4%CO2中、37℃で72時間インキュベーションした。トラコーマクラミジアL−2および肺炎クラミジアKajaani 6株を参照株として用いた。封入体がまったく検出されない最低濃度として、MICを定義した。
結果
すべての患者群由来の60試料の血清中、肺炎クラミジアDNAのPCR検出を行い、そして同じ患者由来の全血の試料中、慣用的なフェノール抽出のPCRに基づくアッセイによるDNA検出率と比較した。
すべての患者群由来の60試料の血清中、肺炎クラミジアDNAのPCR検出を行い、そして同じ患者由来の全血の試料中、慣用的なフェノール抽出のPCRに基づくアッセイによるDNA検出率と比較した。
本明細書に記載する血清に基づくPCR DNA検出アッセイを用いて、38%の患者プール(60人の患者のうち23人)で、肺炎クラミジアDNAが増幅され、そして検出された。対照的に、循環PBMCから単離したDNAに基づく慣用的なPCR DNA検出アッセイは、同じ患者プールの1.7%(60人のうち1人)でしか、肺炎クラミジアDNAを検出しなかった(表1を参照されたい)。新規技術は、患者において細菌DNA感染を検出する感度を22倍増加させた。
循環PBMCから単離したDNAを用いた慣用的なPCRに基づくアッセイに比較して、そして健康な個体の対照群に比較して、CHD/無症候性虚血患者の血清中の肺炎クラミジアDNAのPCR検出を行った。
全血に基づく慣用的PCR DNA検出アッセイは、CHD/無症候性虚血患者の3.9%(102人の患者のうち4人)でしか、肺炎クラミジアDNAを検出しなかった(表2を参照されたい)。こうした低レベルのDNA回収は、PCRがCDH患者における肺炎クラミジア感染の検出のため、意味がある診断法となることを許さない。対照的に、血清に基づく、記載するPCR DNA検出アッセイを用いた場合、58%のCHD/無症候性虚血患者(24人の患者のうち14人)で、肺炎クラミジアDNAが増幅され、そして検出された。新規技術は、患者において細菌DNA感染を検出する感度を15倍増加させた。
健康な個体の対照群において、同じ技術は、症例の4.8%(22人の対照個体のうち1人)でしか、肺炎クラミジアDNAを検出しなかった。
同じ血清試料に対して、慣用的なPCRに基づくアッセイに比較して、CHD/無症候性虚血患者の血清中の肺炎クラミジアDNAのリアルタイムPCR検出を行った。
慣用的なPCR法は、定性的な方式でしか肺炎クラミジアの存在を決定できなかったが、リアルタイムPCRに基づく方法は、試料中に存在するDNAの定量化を可能にした。量は、血液1ml中、20〜180の肺炎クラミジア・ゲノム当量で多様であり、感染個体において細菌負荷が多様であることが示された(表3)。ompA遺伝子に対する入れ子PCRを用いて、血清試料中の肺炎クラミジアDNAを検出した(図7)。
急性性器感染ならびに生殖器系の慢性炎症および/または不妊問題を持つ患者において、血清中のトラコーマクラミジアの検出を、尿およびスワブ中の検出に比較した。結果を表4に示す。尿またはスワブを用いると陰性と示された急性性器感染患者5人の血清において、PCRまたはMIFによって、トラコーマクラミジアが検出された。尿またはスワブを用いると陰性と示された生殖器系の慢性炎症および/または不妊問題の患者6人の血清において、PCRまたはMIFによって、トラコーマクラミジアが検出された。
また、細菌保持フィルターとして低サイズ孔を持つシリカゲルカラム(Qiagen)を用いて、プロテインAの非存在下でも、血清試料中のトラコーマクラミジアの濃縮を行った。これらのカラムを用いて、血清試料からのトラコーマクラミジア細胞の濃縮が成功したことが観察された(図8)。
急性性器および/または尿路感染ならびに生殖器系の慢性炎症および/または不妊問題を持つ患者において、血清中のマイコプラズマ・ゲニタリウムの検出を、尿およびスワブ中の検出に比較した。結果を表5に示す。尿またはスワブを用いると陰性と示された急性性器および/または尿路感染患者2人の血清において、PCRまたはMIFによって、マイコプラズマ・ゲニタリウムが検出された。尿またはスワブを用いると陰性と示された生殖器系の慢性炎症および/または不妊問題の患者3人の血清において、PCRまたはMIFによって、マイコプラズマ・ゲニタリウムが検出された。
患者において、血清中のウレアプラズマ・ウレアリティクムの検出を、尿およびスワブ中の検出に比較した。結果を表6に示す。尿またはスワブを用いてもまた陽性と示された患者3人の血清において、PCRまたはMIFによって、ウレアプラズマ・ウレアリティクムが検出された。
トラコーマクラミジア感染を有すると診断された患者に対する抗微生物治療の効果を調べた。トラコーマクラミジア感染を有すると診断された2人の患者を、1日2回のAvelox(塩酸モキシフォキサシン(moxifoxacin))400mgで治療し、そして慣用的なスワブアッセイおよび本明細書に記載する血液試験の両方によってトラコーマクラミジア感染の存在を決定した。結果を表7に示す。どちらの場合も、本明細書記載の血液試験は、慣用的な試験が陰性である場合も、トラコーマクラミジアの存在を検出し続けた。
このことは、本明細書記載の血液試験が、トラコーマクラミジア診断において、偽陰性症例の数を減少させることを示唆する。さらに、感染の完全な根絶の可能性が増加するた
め、本発明の血液試験の使用によって、抗微生物治療の有効性が増加していることが示される。これはまた、感染の慢性持続型の発展を防止する際に有用でありうる。
め、本発明の血液試験の使用によって、抗微生物治療の有効性が増加していることが示される。これはまた、感染の慢性持続型の発展を防止する際に有用でありうる。
急性膣炎/子宮頸管炎/尿道炎患者に関して、血清DNA試験をトラコーマクラミジアに関する標準的DNAスワブ試験に比較し、そして結果を表8に示す。総数13人の患者において、11人(85%)がスワブ試験によって陽性と示され、そして12人(92%)が血液試験によって陽性と示された。
表9は、反応性関節炎(ライター病)におけるトラコーマクラミジアに関するDNAスワブ試験に比較した、血清DNA試験の臨床的検証結果を示す。総数15人の患者において、スワブ試験によって8人(53%)が陽性と示され、そして血液試験によって12人(80%)が陽性と示された。
表10は、慢性骨盤内炎症性疾患(膣炎、子宮頸管炎、子宮内膜炎、尿道炎、精巣上体炎および前立腺炎)におけるトラコーマクラミジアに関するDNAスワブ試験と比較した、血清DNA試験の臨床的検証結果を示す。総数215人の患者において、スワブ試験によって17人(8%)が陽性と示され、そして血液試験によって57人(26.5%)が陽性と示された。
表11は、無症状患者におけるトラコーマクラミジアに関するDNAスワブ試験と比較した、血清DNA試験の臨床的検証結果を示す。総数124人の患者において、スワブ試験によって3人(2.4%)が陽性と示され、そして血液試験によって24人(19%)が陽性と示された。
本発明の血液試験は、トラコーマクラミジアに関する偽陰性診断を、反応性関節炎患者においては50%、慢性骨盤内炎症性疾患患者においては335%、そして無症状感染患者においては800%、減少させることが見出された。
血清試験によるドナー血液試料の無作為チェックは、11人のうち2人、または18%が、トラコーマクラミジアDNAに関して陽性であることを示した。
遺伝子発現分析を表12に示す。
抗LPS(属特異的)および抗MOMP(種特異的)モノクローナル抗体で染色することによる、トラコーマクラミジア血清単離体の免疫化学検出によって、細胞膜におけるLPSおよびMOMPの減少が示された。血清単離体のLPSは、細胞培養の第一または第二継代において、有意に回復した。3継代後、MOMPは、同じ減少したレベルで検出された。
アジスロマイシン感受性を表13に示す。
冠状動脈心疾患および末梢閉塞性疾患患者の血液における肺炎クラミジアに関する新規PCR試験の結果を表14に示す。
対照およびCHD患者の血液における肺炎クラミジア感染診断中の直接および細胞培養PCR試験の結果を表15に示す。
上に示すデータは、本発明の方法が、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウム、またはウレアプラズマ・ウレアリティクムなどの細胞内病原体での感染の検出に有用であることを示す。血液バンク・スクリーニングに使用可能な、これらの4つの感染に関して現在利用可能な他の血液試験がないことに注目することが重要である。
本明細書記載の方法およびキットは、これらの持続性血液感染性感染および関連する疾患状態を治療し、そしてその伝播を予防する際に有用でありうる。
参考文献
Claims (78)
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型での感染に関して、個体を評価するための方法であって:
該個体から得た血液試料中の前記持続型の細胞の存在を決定する
工程を含む、前記方法。 - 個体由来の血液試料を、特異的結合メンバーと接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する
工程によって、細胞の存在を決定する、請求項1記載の方法。 - 血液試料、あるいは単離しそして/または精製した分画から、DNAを濃縮しそして/または抽出し、そして;
濃縮しそして/または抽出した核酸中の病原体核酸の存在を決定する
工程によって、細胞の存在を決定する、請求項1または請求項2記載の方法。 - 病原体細胞の存在を、血液試料の無細胞分画において決定する、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記血液試料から宿主血液細胞を取り除いて、無細胞血液試料を産生し、そして該無細胞血液試料中の病原体細胞の存在を決定する、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 血液試料が無細胞血液試料である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 特異的結合メンバーが、1以上の血漿/血清分子を含む複合体に結合し、そして単離しそして/または精製した分画が、1以上の前記複合体を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 1以上の血漿/血清分子が抗体であり、そして複合体が免疫複合体である、請求項7記載の方法。
- 特異的結合メンバーが免疫グロブリンに結合する、請求項8記載の方法。
- 特異的結合メンバーがプロテインAである、請求項9記載の方法。
- 血漿/血清分子が血清リポタンパク質またはリポ多糖結合タンパク質である、請求項7記載の方法。
- 特異的結合メンバーが前記血清リポタンパク質またはリポ多糖結合タンパク質に結合する、請求項11記載の方法。
- 単離しそして/または精製した分画が、病原性微生物の前記持続型の細胞の増加した濃度を含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 単離しそして/または精製した分画が、病原性微生物の前記持続型の基本小体の増加した濃度を含む、請求項13記載の方法。
- 前記分画中の病原体核酸の存在が、個体における病原体感染の存在の指標となる、先行する請求項いずれか1項記載の方法。
- 前記分画中の病原体核酸の存在が、病原体感染と関連する障害の存在の指標となる、請求項15記載の方法。
- 肺炎クラミジア(C. pneumoniae)核酸の存在が、個体におけるアテローム硬化性状態の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- トラコーマクラミジア(C. trachomatis)核酸の存在が、個体の生殖機能障害の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- トラコーマクラミジア核酸の存在が、膣炎、子宮頸管炎および尿道炎からなる群より選択される感染の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- トラコーマクラミジア核酸の存在が、反応性関節炎(ライター病)の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- トラコーマクラミジア核酸の存在が、慢性骨盤内炎症性疾患の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- トラコーマクラミジア核酸の存在が、無症状感染の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- マイコプラズマ科(Mycoplasmataceae)核酸の存在が、個体における呼吸障害、骨盤内炎症性疾患または生殖機能障害の存在の指標となる、請求項16記載の方法。
- 単離しそして/または精製した分画中の病原体核酸の存在を、病原体特異的プライマーでの増幅によって決定し、
増幅産物の存在が病原体核酸の存在の指標となる、
先行する請求項のいずれか1項記載の方法。 - 病原体特異的プライマーを用いたPCRによって、試料中の病原体核酸の存在を決定する、請求項24記載の方法。
- 病原体がクラミジア属(Chlamydia)種である、先行する請求項いずれか1項記載の方法。
- クラミジア属種が、肺炎クラミジアまたはトラコーマクラミジアである、請求項26記載の方法。
- クラミジア属特異的プライマーを用いて、クラミジア属核酸の存在を決定することによって、クラミジア属細胞の存在を決定する、請求項26または請求項27記載の方法。
- クラミジア属が肺炎クラミジアである、請求項28記載の方法。
- クラミジア属特異的プライマーが、肺炎クラミジアの16S RNA遺伝子のすべてまたは一部を増幅する、請求項29記載の方法。
- プライマーが:
- クラミジア属特異的プライマーが、肺炎クラミジアのOmpA遺伝子のすべてまたは一部を増幅する、請求項29記載の方法。
- プライマーが:
- 病原体がトラコーマクラミジアである、請求項28記載の方法。
- トラコーマクラミジア特異的プライマーが、トラコーマクラミジア潜在性プラスミドのすべてまたは一部を増幅する、請求項34記載の方法。
- プライマーが:
- 病原体がマイコプラズマ科種である、請求項1〜25のいずれか1項記載の方法。
- 病原体がマイコプラズマである、請求項37記載の方法。
- マイコプラズマがM.ゲニタリウム(M. genitalium)である、請求項38記載の方法。
- マイコプラズマ・ゲニタリウム特異的プライマーを用いて、マイコプラズマ・ゲニタリウム核酸の存在を決定することによって、マイコプラズマ・ゲニタリウムの存在を決定する、請求項39記載の方法。
- マイコプラズマ・ゲニタリウム特異的プライマーが、MgPa遺伝子のすべてまたは一部を増幅する、請求項40記載の方法。
- プライマーが:
- 病原体がウレアプラズマである、請求項37記載の方法。
- ウレアプラズマがU.ウレアリティクム(U. urealyticum)である、請求項43記載の方法。
- ウレアプラズマ・ウレアリティカ(Ureaplasma urealytica)特異的プライマーを用いて、ウレアプラズマ・ウレアリティカ核酸の存在を決定することによって、ウレアプラズマ・ウレアリティカの存在を決定する、請求項44記載の方法。
- ウレアプラズマ・ウレアリティカ特異的プライマーが、ウレアーゼ遺伝子のすべてまたは一部を増幅する、請求項45記載の方法。
- プライマーが:
- 1以上の病原体特異的プライマー
病原体特異的プライマーを用いて、血液試料から病原体特異的核酸を増幅するための試薬、および;
プライマーを用いて血清試料を増幅した産物を検出するための検出試薬
を含む、持続性病原体感染を検出するためのキット。 - 持続型病原体の細胞を含む血液試料の分画を単離しそして/または精製するための、特異的結合メンバーを含む、請求項48記載のキット。
- 特異的結合メンバーが、血液試料中の免疫複合体を単離しそして/または精製するための免疫グロブリン結合剤である、請求項49記載のキット。
- 血液試料の除去、取り扱いおよび保存のための装置をさらに含む、請求項48〜50のいずれか1項記載のキット。
- 血液試料から血液細胞を取り除くための手段をさらに含む、請求項48〜51のいずれか1項記載のキット。
- 前記プライマーによる増幅のため、DNAを単離しそして/または精製するための装置を含む、請求項48〜52のいずれか1項記載のキット。
- 肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群より選択される持続性偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の単離基本小体。
- 細胞を感染させて、前記微生物の参照株に比較してLPS欠損性および抗生物質非感受性である網様体を産生する、請求項54記載の単離基本小体。
- 病原性微生物がトラコーマクラミジアであり;
前記網様体がOmp2(60kDa)、Omp3(9kDa)またはPmpDを発現せず、そして;
前記網様体が、トラコーマクラミジアの参照株に比較して、増加したレベルのHsp60;および減少したレベルのMOMPを発現する
請求項55記載の単離基本小体。 - 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型に感染した宿主細胞を産生する方法であって;
前記持続型の細胞を含む、個体から得た血液試料の分画を単離しそして/または精製し、前記分画と宿主細胞集団を接触させ、そして前記集団において、微生物の持続型を含む宿主細胞を同定する
工程を含む、前記方法。 - 前記の同定した宿主細胞を単離するかまたは精製することを含む、請求項57記載の方法。
- 前記の同定した宿主細胞を培養する工程を含む、請求項57または請求項58記載の方法。
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物が、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群より選択される、請求項57〜59のいずれか1項記載の方法。
- 請求項57〜60のいずれか1項記載の方法によって得られうる、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物を含む宿主細胞。
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の前記持続型が、前記微生物の参照株に比較して、減少した抗生物質感受性を有する、請求項61記載の宿主細胞。
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の持続型が、前記微生物の参照株に比較して、減少したLPSを有するかまたはLPSを欠いている、請求項61または請求項62記載の宿主細胞。
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物が、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群より選択される、請求項61〜63のいずれか1項記載の宿主細胞。
- 病原性微生物がトラコーマクラミジアであり;
前記持続型細胞がOpm2(60kDa)、Omp3(9kDa)またはPmpDを発現せず、そして;
前記持続型細胞が、トラコーマクラミジアの参照株に比較して、増加したレベルのHsp60;および減少したレベルのMOMPを発現する
請求項64記載の単離宿主細胞。 - 抗微生物化合物に関してスクリーニングする方法であって;
請求項57〜65のいずれか1項記載の宿主細胞を、試験化合物と接触させて;そして
前記宿主細胞中の病原性微生物に対する前記化合物の効果を決定する
ここで、対照に比較した前記宿主細胞中の前記病原性微生物の量の減少が、試験化合物が抗微生物化合物である指標となる
工程を含んでもよい、前記方法。 - 個体において、偏性細胞内または膜会合の病原性微生物での持続性感染を治療する際に、抗微生物化合物の有効性を決定する方法であって:
i)抗微生物化合物の投与前および投与後、個体から血液試料を得て、
(ii)前記試料中の病原体細胞の量または濃度を決定する;
ここで、投与前に得た試料に比較して、投与後に得た試料由来の病原性微生物由来の細胞量が減少していることが、抗微生物調製物が持続性感染を治療する際に有効であることの指標となる
工程を含む、前記方法。 - 前記試料中の病原体細胞の量または濃度を;
(i)前記血液試料を特異的結合メンバーと接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
(ii)前記試料の前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する
ここで、投与前に得た試料に比較して、投与後に得た試料由来の前記分画中の病原性微生物由来の核酸量が減少していることが、抗微生物調製物が持続性感染を治療する際に有効であることの指標となる
工程によって決定する、請求項67記載の方法。 - 個体における、偏性細胞内病原性微生物での持続性感染の治療法であって:
i)個体に抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に個体から血液試料を得て、
iii)請求項1〜16のいずれか1項記載の方法を用いて、血液試料中の前記偏性細胞内または膜会合の病原性微生物の細胞の存在または非存在を決定して
iv)試料由来の分画に病原性微生物由来の細胞がまったく存在しないことが決定されるまで、工程i)〜iii)を反復する
工程を含む、前記方法。 - 個体由来の血液試料を特異的結合メンバーと接触させて、前記試料の分画を単離しそして/または精製し、そして;
前記分画中の病原性微生物由来の核酸の存在を決定する
工程によって、細胞の存在を決定する、請求項68または請求項69記載の方法。 - 前記特異的結合メンバーが免疫グロブリンに結合し、そして前記の単離しそして/または精製した分画が免疫複合体を含む、請求項70記載の方法。
- 前記特異的結合メンバーがリポタンパク質に結合し、そして前記の単離しそして/または精製した分画がリポタンパク質複合体を含む、請求項70記載の方法。
- 単離しそして/または精製した分画が前記持続型の基本小体を含む、請求項70〜72のいずれか1項記載の方法。
- 偏性細胞内または膜会合の病原性微生物が、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、マイコプラズマ・ゲニタリウムまたはウレアプラズマ・ウレアリティクムからなる群より選択される、請求項67〜73のいずれか1項記載の方法。
- 個体において、アテローム硬化性状態を治療する方法であって;
i)個体に、アブザイム阻害剤および抗微生物化合物を投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、
ここで、アブザイム活性が、無細胞分画から実質的に欠如するまで、個体に対するアブザイム阻害剤の前記投与を反復する、そして
iv)請求項1〜16のいずれか1項記載の方法を用いて、血液試料の無細胞分画から肺炎クラミジア細胞の存在または非存在を決定する、
ここで、肺炎クラミジア細胞が、血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対する抗微生物化合物の前記投与を反復する
工程を含む、前記方法。 - 個体において、アテローム硬化性状態を治療する方法であって;
i)個体に、アジスロマイシンを投与し;
ii)前記投与後に、個体から血液試料を得て、
iii)血液試料の無細胞分画におけるアブザイム活性レベルを決定し、そして;
iv)請求項1〜16のいずれか1項記載の方法を用いて、血液試料の無細胞分画における肺炎クラミジア細胞の存在または非存在を決定する;
ここで、アブザイム活性および肺炎クラミジア細胞の両方が、個体から得た血液試料の無細胞分画から欠如するまで、個体に対するアジスロマイシンの前記投与を反復する
工程を含む、前記方法。 - 分画中の抗体仲介性脂質酸化活性を決定することによって、アブザイム活性レベルを決
定する、請求項75または請求項76記載の方法。 - 分画中の抗クラミジア属抗体仲介性脂質酸化活性を決定することによって、アブザイム活性レベルを決定する、請求項77記載の方法。
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