JP2008007508A - Nanbvの診断用薬およびワクチン - Google Patents

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Abstract

【課題】非A非B型肝炎ウイルスを検出または処置する手段を提供する。
【解決手段】特定の少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を有するポリペプチドに免疫学的に結合し得る抗C型肝炎ウイルス(HCV)モノクローナル抗体。上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、HCVゲノムから単離した特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドから得られる。さらに薬学的に受容可能な賦型剤中に、少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を含む配列を有するポリペプチドを含有するワクチン組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は,非A非B型肝炎ウイルス(NANBV)伝染の流行を処置するための材料および方法に関する。さらに詳しくは,本発明は,診断用DNA断片,診断用タンパク,診断用抗体,そしてNANB型肝炎の病因因子(すなわち,C型肝炎ウイルス)に対する防御抗原および防御抗体に関する。
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米国特許第4,491,632号
米国特許第4,493,890号
非A非B型肝炎(NANBH)は,伝染性の疾患であるか,あるいはウイルスが誘発すると考えられている疾患群およびウイルスに関連する他の形態の肝臓疾患とは区別し得る疾患群に属する。これらの疾患には,周知の肝炎ウイルス(すなわち,A型肝炎ウイルス(HAV),B型肝炎ウイルス(HBV),Δ型肝炎ウイルス(HDV),およびサイトメガロウイルス(CMV)またはエプスタイン−バーウイルス(EBV))により引き起こされる疾患が包含される。NANBHは輸血した個体において初めて同定された。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー間における一連の継代は,NANBHが1種または複数種の伝染性感染因子によるという証拠を与える。しかしながら,NANBHの原因である伝染性因子はまだ同定されておらず,疾患の原因となる因子の数も知られていない。
疫学的証拠によると,NANBHには次の3つの型があると示唆される:つまり,飲料水媒介の流行型;血液または注射針に関連する型;および散発(集団獲得(community acquired))型の3つの型である。しかしながら,NANBHの原因となり得る因子の数は知られていない。
NANBHの臨床における診断および同定は,他のウイルスマーカーを排除することにより,まず行われてきた。推定されるNANBV抗原および抗体を検出するために用いられる方法には,寒天ゲル拡散法,対向免疫電気泳動法,免疫蛍光顕微鏡法,免疫電子顕微鏡法,放射性免疫検定法,および酵素結合免疫吸着検定法がある。しかしながら,これらの検定法はいずれも,NANBHに関する診断検査として用いるのに充分感度が高く,特異的であり,かつ再現性があるとは示されていない。
これまで,NANBH因子に関連する抗原抗体系の同一性または特異性に関しては,明確ではなく,しかも一致することはなかった。これは,その少なくとも一部は,以下のことが原因である:つまり,個体におけるHBVの前感染またはNANBVとの同時感染;HBVに関連する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑さ;および肝臓細胞のゲノムへのHBV DNAの組込みである。さらに,NANBHが1種より多くの病原体により引き起こされる可能性,およびNANBHが誤診されてきた可能性がある。また,血漿学的な検定法により,NANBH患者の血清中に何が検出されるかは不明であった。寒天ゲル拡散法および対向免疫電気泳動法によれば,血清検体間に時々生じる自動免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は検出されるが,特異的なNANBV抗原−抗体反応は示されないと考えられてきた。免疫蛍光法,酵素結合免疫吸着検定法,および放射性免疫検定法によれば,NANBH患者の血清中,ならびに他の肝臓疾患および非肝臓疾患を有する患者においても,しばしば存在するリウマチ因子様物質が低レベルで検出されるようである。検出された反応性のいくつかは,宿主により定まる細胞質抗原に対して抗体を表現し得る。
NANBVの候補となるものは,数多く存在する。例えば,Prince(1983),FeistoneおよびHoofnagle(1984),そしてOverby(1985,1986,1987)による総説,ならびに非特許文献1を参照にされたい。しかしながら,これらの候補がNANBHの病因因子に相当するという証拠はない。
NANBVのキャリア,およびNANBVで汚染された血液または血液製剤をスクリーニングしかつ同定するための感度が高く特異的な方法が非常に要求されている。輸血後肝炎(PTH)は輸血された患者の約10%において発生する。この場合,90%までがNANBHである。この疾患における大きな問題は,しばしば慢性的な肝臓損傷へ進行することである(25〜55%)。
Iwarson(1987),British Medical J.295:946.
患者を看護し,血液および血液製剤によるNANBHの感染あるいは個体が緊密に接触することにより起こるNANBHの感染を予防するために,NANBVに関する核酸,抗原,および抗体を検出する信頼性の高い診断手段および予診手段が必要とされている。さらに,この疾患を予防および/または処置するための効果的なワクチンおよび免疫療法剤も必要とされている。
(項目1)少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を有するポリペプチドに免疫学的に結合し得る抗C型肝炎ウイルス(HCV)モノクローナル抗体、ここで、この抗体は、上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列に結合し、そして上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列から得られる:
Figure 2008007508
Figure 2008007508
Figure 2008007508
(項目2)薬学的に受容可能な賦型剤中に、少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を含む配列を有するポリペプチドを含有するワクチン組成物、ここで、上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、HCVに対する抗体によって結合され得る少なくとも1つの部位を有し、そして上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列から得られる:
Figure 2008007508
Figure 2008007508
Figure 2008007508

発明の開示
本発明は,新しく発見されたNANBV病因因子であるC型肝炎ウイルス(HCV)の単離および特徴付けに関する。さらに詳しくは,本発明は,HCVゲノムの部分的なcDNA複製物群を提供する。これらのcDNA複製物は,以下の新規な工程を包含する方法により単離された:つまり,これまでに単離も特徴付けもされていないウイルス因子のゲノムから誘導される新しく合成された抗原を検出するために,NANBH患者の血清で感染した組織中の粒子状因子から調製されたcDNAライブラリー由来の発見産物をスクリーニングする工程;および非感染個体に比べて感染個体の血清とのみ免疫学的に反応する産物を生産するクローンを選択する工程である。
HCV cDNAから誘導されたプローブを利用したHCVゲノムの性質,およびHCV cDNA内に含まれる配列情報に関する研究は,HCVがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆している。
HCVから誘導されたcDNA配列の一部は,試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとして,および天然に存在するウイルスの変異型を単離するためのプローブとして有用である。これらのcDNAを用いれば,HCVゲノム内にコードされているHCV抗原の有効なポリペプチド配列を調製し,診断検査における標準または試薬として,および/またはワクチンの成分として有用なポリペプチドを生産することができる。これらのポリペプチド配列内に含まれるHCVエピトープに対する抗体は,ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれもが,診断検査に,治療薬として,抗ウイルス剤のスクリーニングに,そしてこれらのcDNAから誘導されるNANBV因子の単離に有用である。さらに,これらのcDNAから誘導されるプローブを利用することにより,HCVゲノムの他の部分を単離し,かつ配列決定することができる。従って,NANBHの診断および/または処置,予防および治療の両方に有用な追加のプローブおよびポリペプチドが提供される。
従って,ポリヌクレオチドに関する本発明のいくつかの局面は以下のとおりである:精製されたHCVポリヌクレオチド;組換えHCVポリヌクレオチド;HCVゲノムまたはHCV cDNAに由来する配列を有する組換えポリヌクレオチド;HCVのエピトープをコードする組換えポリヌクレオチド;上記の組換えポリヌクレオチドのいずれかを有する組換えベクター;およびこれらベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞。
本発明の他の局面は以下のとおりである:HCVゲノムまたはHCV cDNAに由来するDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を有する組換え発現系であって,該ORFが所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている,組換え発現系;該組換え発現系で形質転換された細胞;および該形質転換細胞により生産されるポリペプチド。
本発明のさらに他の局面は以下のとおりである:精製されたHCV;該精製HCVに由来するポリペプチドの調製物;精製されたHCVポリペプチド;およびHCVに含まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみなし得るエピトープを有する精製されたポリペプチド。
本発明には以下の局面も包含される:組換えHCVポリペプチド;HCVゲノムまたはHCVcDNAに由来する配列を有する組換えポリペプチド;HCVエピトープを有する組換えポリペプチド;およびHCVポリペプチドを有する融合ポリペプチド。
本発明には以下のものも包含される:HCVエピトープに対するモノクローナル抗体;およびHCVエピトープに対するポリクローナル抗体の精製された調製物。本発明の他の局面は,HCV感染に対して免疫原性の粒子であって,真核生物宿主内で生産される場合に粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非HCVポリペプチドと,HCVエピトープを有する粒子である。
本発明のさらに他の局面は,HCVに対するポリヌクレオチドプローブである。
キットに関する本発明の局面は以下のようなキットである:HCVに由来するポリヌクレオチドの存在について試料を分析するためのキットであって,適当な容器内に,約8個またはそれ以上のヌクレオチドからなるHCV由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有するキット;HCV抗原の存在について試料を分析するためのキット
であって,適当な容器内に,検出されるべきHCV抗原に対する抗体を有するキット;HCV抗原に対する抗体の存在について試料を分析するためのキットであって,適当な容器内に,HCV抗原に存在するHCVエピトープを含むポリペプチドを有するキットである。
本発明の他の局面は,固体担体に付着させた,HCVエピトープを有するポリペプチド;および固体担体に付着させた,HCVエピトープに対する抗体である。
本発明のさらに他の局面は以下のような方法である:HCVエピトープを含むポリペプチドを生産する方法であって,HCVエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を,該ポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートすること,を包含する生産方法;およびこの方法により生産された,HCVエピトープを含むポリペプチド。
本発明はまた,以下のような方法も包含する:試料中のHCV核酸を検出する方法であって,該試料の核酸を,HCVポリヌクレオチドに対するプローブと,該プローブと該試料由来のHCV核酸との間にポリヌクレオチド二本鎖を形成する条件下で反応させること;および核プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出すること,を包含する検出方法。
免疫学的検定法もまた,本発明に包含される。これらの免疫学的検定法には,以下のような工程を包含するHCV抗原を検出するための免疫学的検定法が包含される:HCV抗原を含んでいる疑いのある試料を,検出されるべきHCV抗原に対するプローブ抗体と共に,抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベートすること;および該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること。以下の工程を包含するHCV抗原に対する抗体を検出するための免疫学的検定法:抗HCV抗体を含んでいる疑いのある試料を,HCVのエピトープを含むプローブポリペプチドと共に,抗体−抗原複合体を形成する条件下でインキュベートすること;および該プローブ抗原を含む抗体−抗原複合体を検出すること。
本発明には以下のものも包含される:HCV感染を処置するためのワクチンであって,HCVエピトープを含む免疫原性ペプチド,不活性化されたHCV調製物,または弱毒化されたHCV調製物を含有するワクチン。
本発明の他の局面は,HCVに感染した組織培養増殖細胞である。
本発明のさらに他の局面は,HCVに対する抗体を生産する方法であって,HCVエピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドを,免疫反応を生ずるのに充分な量で個体に投与することを包含する生産方法である。
本発明のさらに他の局面は,未確認の感染因子のゲノムに由来するcDNAを単離する方法であって,該方法は以下の工程(a)〜(f)を包含する:(a)該感染因子に感染した組織から単離された核酸から調製されたcDNAライブラリーを含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を用意し,該cDNAにコードされたポリペプチドを発現する条件下で該宿主細胞を増殖させること;(b)該cDNAの発現産物を,該感染因子に感染した個体の抗体含有身体構成部分と,免疫反応を起こす条件下で反応させ,その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること;(c)該工程(b)の抗体−抗原複合体を形成するポリペプチドを発現する宿主細胞を,個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ,該クローンを単離すること;(d)該工程(c)のクローン由来の細胞を,該cDNA内にコードされたポリペプチドを発現する条件下で増殖させ,該発現産物を,該
工程(a)の個体以外の個体であって該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分および該感染因子に感染していない対照個体と反応させ,その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること;(e)感染した個体および感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体を形成するが,対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を,個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ,該クローンを単離すること;および(f)該工程(e)の宿主細胞クローンからcDNAを単離すること。
発明を実施する方法
I.定義
「C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)」という用語は,非A非B型肝炎(NANBH)の従来知られていなかった病原因子に対して,この分野の研究者が保留していた用語である。従って,本願で用いる場合,「C型肝炎ウイルス(HCV)という用語はNANBHの病原因子を意味し,またこのNANBHは,以前にはNANBVおよび/またはBB−NANBVと呼ばれていたものである。本願では,HCV,NANBVおよびBB−NANBVという用語を互換性のある語として使用する。この用語法を拡張して,以前はNANB肝炎(NANBH)と呼んでいたHCVによって発病する疾患をC型肝炎と呼ぶ。本願では,NANBHとC型肝炎という用語を互換性のある語として使用してもよい。
「HCV」という用語は,本願で用いる場合,NANBHを発病させるウイルス種および弱毒化されたウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味する。後に述べるように,HCVゲノムは,RNAで構成されている。RNAを含有するウイルスの偶発変異率が比較的高いということが知られており,すなわち約10−3〜10−4/ヌクレオチドであると報告されている〔フィールズとナイプ(Fields and Knipe)1986年〕。それ故,後に述べるHCV種の中には,多くのウイルス株がある。本願記載の組成物と方法によって,種々の関連ウイルス株の増殖,同定,検出および単離を行うことができる。さらに各種ウイルス株に対する診断薬とワクチンを製造することができ,また薬理学的用途の抗ウイルス剤を,HCVの複製を阻害するということによりスクリーニングすることができる。
本願で提供する情報は,ある種のHCV株由来のものであり,このウイルス株は以後CDC/HCV1と呼ぶが,ウイルス分離学者がこの種に属する他のウイルス株を同定するのに充分なものである。本願に記載するように,本願の発明者らは,HCVがフラビウイルス(Flavivirus)またはフラビ様ウイルス(Flavi−like virus)であることを発見した。フラビウイルス粒子の形態と組成は公知であり,ブリントン(Brinton,1986年)が考察している。形態については,一般にフラビウイルス類は,脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有している。ビリオンは球形で直径が約40〜50nmである。そのコアは直径が約25〜30nmである。ビリオンのエンベロープの外面には,直径が約2nmの端末ノブ(terminal knob)を有する約5〜10nm長の突起を有する。
HCVは,本願に記載のcDNAが誘導されるHCVゲノム内のエピトープと免疫学的に同定可能なエピトープをコードするが,このエピトープは本願に記載のcDNA内にコードされることが好ましい。このエピトープは,他の公知のフラビウイルス類と比較した場合,HCVに特有のものである。このエピトープの独自性は,HCVとの免疫学的反応性と,他のフラビウイルス種との免疫学的反応性の欠如とによって決定することができる。免疫学的反応性を決定する方法は当該技術分野では公知であり,例えば,放射性免疫検定法,ELISA法,血球凝集反応法などがあり,分析技術の適切ないくつかの例を本願
に示す。
上記に加えて,ウイルス株をHCVとして同定する際に,単独もしくは組合わせて,下記のパラメータを利用することができる。HCV株は,進化論的に関連しているので,ヌクレオチドレベルでのゲノムの全相同性は,約40%以上であり,好ましくは約60%以上で,さらに好ましくは約80%以上であり,さらに少なくとも約13のヌクレオチドの対応する連続配列があると考えられる。推定上のHCV株のゲノム配列とCDC/CH1
HCVのcDNA配列との同一性は,当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば,推定上のHCV由来のポリヌクレオチドの配列情報と,本願に記載のHCV cDNA配列とを直接比較することによって決定することができる。また例えば,相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下(例えば,S1消化の前に用いられる条件)でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし,次いで一本鎖に特異的なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断し,次に切断によって生成した断片の大きさを測定することによって決定することができる。
HCV株の進化的類縁関係のために,推定上のHCV株は,ポリペプチドのレベルの,その相同性によって同定可能である。一般にHCV株は,ポリペプチドのレベルで,約40%以上相同であり,好ましくは約60%以上,さらに好ましくは80%以上相同である。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は,当該技術分野で知られている。例えば,アミノ酸配列を直接決定して,本願に示した配列と比較することができる。また例えば,推定上のHCVのゲノム物質のヌクレオチド配列を決定してもよく(通常,cDNA中間体を介して),これにコードされているアミノ酸配列は決定可能で,対応する領域を比較することができる。
本願で使用される場合,指定された配列(例えば,HCV cDNA,特に第1〜46図に例示した配列)か,またはHCVゲノム「由来」のポリヌクレオチドは,少なくとも約6個の対応するヌクレオチド配列からなり,好ましくは少なくとも約8個のヌクレオチド,さらに好ましくは少なくとも約10〜12個のヌクレオチド,さらに好ましくは少なくとも約15〜20個のヌクレオチドの配列からなる対応するポリヌクレオチド配列を意味する。つまり,これらのヌクレオチドは,指定されたヌクレオチド配列の領域に相同か,または相補的である。上記ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列は,HCVゲノムに特有の配列に相同または相補的であるのが好ましい。一つの配列がHCVゲノムに特有のものであるか否かは当業者に公知の技術で決定することができる。例えば,その配列を,データバンク,例えばジーンバンク(genebank)の配列と比較して,未感染の宿主または他の生物に存在するか否かを決定する。またその配列は,公知の配列を有する他のウイルス因子,すなわち,肝炎,例えば,HAV,HBVおよびHDVを誘発することが知られているウイルス因子,ならびにフラビウイルス科のウイルス(Fraviviridae)の他のメンバーと比較することもできる。また,誘導された配列が他の配列と一致しているかまたは一致していないかは,適切な厳密条件下でハイブリダイゼーションさせることによって決定することができる。核酸の配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は,当該技術分野で公知であり,後に検討する。例えば,マニアチスら(maniatis et al,1982年)の文献を参照せよ。さらにハイブリダイゼーションによって形成された,不適正な二本鎖のポリヌクレオチドも公知の方法で決定することができ,この方法には,例えば,S1のようなヌクレアーゼによって,二本鎖のポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に切断する方法がある。代表的なDNA配列が「誘導される」領域は,例えば,特異的なエピトープをコードする領域および転写されない領域および/または翻訳されない領域を含むが,これに限定されるものではない。
誘導されたポリヌクレオチドは,必ずしも,提示されたヌクレオチド配列が物理的に誘導されるとは限らず,いずれの方法で生成されていてもよい。例えば,化学合成法,DN
A複製法,逆転写法または転写法が挙げられ,これらの方法は,ポリヌクレオチドが誘導される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供する情報に基づいて実施される。さらに,指定された配列の領域に対応する領域の組合わせは,当該技術分野で公知の方法で改変され,意図する用途に合致させることができる。
同様に,指定された核酸の配列(例えば,第1〜46図に示す配列)またはHCVゲノム「から誘導された」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は,上記の配列にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列もしくはその一部分の配列(少なくとも3〜5のアミノ酸,好ましくは少なくとも8〜10のアミノ酸,さらに好ましくは少なくとも11〜15のアミノ酸で構成された部分)と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド,または上記の配列にコードされているポリペプチドと免疫学的に同定しうるポリペプチドを意味する。
組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは,指定された核酸配列(例えば第1〜34図に示す配列),またはHCVゲノムから必らずしも翻訳される必要はなく,例えば化学合成法もしくは組換え体発現系の発現もしくは変異HCVからの単離を含むいずれの方法でも生成され得る。
本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチド」という用語は,ゲノム,cDNA,半合成もしくは合成の起源のポリヌクレオチドを意味し,その起源もしくは操作によって,(1)天然もしくはライブラリーの形態でポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と連結していないもの,および/または(2)天然にポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているのを意味する。
本願で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は,任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)を意味する。この用語は,分子の一次構造のみを意味する。したがって,この用語には,二本鎖DNAと一本鎖DNA,および二本鎖と一本鎖のRNAが含まれる。またこの用語には,例えばメチル化反応および/またはキャッピングによって修飾された形態のポリヌクレオチドと,未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。
本願で用いる「cDNAに対応する配列を有するHCV」という用語は,そのHCVが指定されたDNAの配列と相同もしくは相補的な関係にあるポリヌクレオチド配列をもっていることを意味し,cDNAに対する相同性もしくは相補性の程度は,約50%以上,好ましくは少なくとも約70%,さらに好ましくは少なくとも約90%である。対応する配列は,長さが,少なくとも約70のヌクレオチド,好ましくは少なくとも約80のヌクレオチド,さらに好ましくは少なくとも約90のヌクレオチドである。HCVの配列とcDNAとの対応は,当該技術分野で公知の方法で決定することができ,例えば配列された物質と記載されたcDNAとを直接比較すること,またはハイブリダイゼーションし,一本鎖ヌクレアーゼで切断し,切断により生成した断片の大きさを測定するという方法がある。
「精製されたウイルスポリヌクレオチド」という用語は,HCVゲノムもしくはその断片を意味し,この断片は,本質的に遊離の形態で,すなわち,ウイルスのポリヌクレオチドが自然に連結されているポリヌクレオチドの約50%未満,好ましくは約70%未満,さらに好ましくは約90%未満を含有している。ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は,当該技術分野で知られており,例えば,ウイルス粒子をカオトロピック剤で破壊する方法,およびイオン交換クロマトグラフィー,アフィニティークロマトグラフィー,および密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポリペプチドを分離する方法がある。
「精製されたウイルスポリペプチド」という用語は,HCVポリペプチドもしくはその断片を意味し,その断片は,本質的に遊離の形態で,ウイルスポリペプチドが天然に連結されている細胞成分の,約50%未満,好ましくは約70%未満,さらに好ましくは約90%未満を含有している。ウイルスポリペプチドを精製する技術は当該技術で公知であり,この技術の例については後に考察する。
単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」,「宿主細胞」,「細胞」,「細胞系」,「細胞培養物」などの用語は,組換え体ベクターもしくは他の転移DNAの受容体として使用可能か,または使用されてきた細胞を意味し,トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は,偶発的または計画的な変異によって,形態またはゲノムもしくは全DNAの相補性が元の親細胞と,必らずしも完全に同一ではない。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するような適切な性質によって特徴づけられ,親細胞に充分類似している親細胞の後代は,上記定義の意味する後代に含まれ,上記用語で扱われる。
「レプリコン」は,遺伝要素であって,例えばプラスミド,染色体,ウイルスが含まれ,細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し,すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
「ベクター」は,他のポリヌクレオチドのセグメントが結合しているレプリコンであって,複製を行い,および/または結合しているセグメントを発現する。
「制御配列」は,ある種のポリヌクレオチド配列を意味し,この配列が連結している,コード配列を発現するのに必要なものである。このような制御配列の性質は,宿主の生物によって異なり,このような制御配列には,原核細胞内では一般に,プロモーター,リボソーム結合部位およびターミネーターが含まれ,真核細胞内では一般に,プロモーター,ターミネーターおよびある場合にはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は,最小限発現に必要なすべての要素を包含し,さらに発現に有利な追加の要素,例えばリーダー配列を包含し得る。
「作動可能に連結された」という用語は,上記のような要素が,意図した方法で機能しうるような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は,制御配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるように,連結される。
「読み取り枠」(ORF)は,ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり,この領域は,コード配列の一部またはコード配列全体を意味する。
「コード配列」は,適切な調節配列の制御下に置かれた場合に,mRNAに転写され,および/またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は,5’末端の翻訳開始コドンと,3’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は,mRNA,cDNAおよび組換え体ポリヌクレオチド配列を包含するが,これらに限定されるものではない。
「免疫学的に…と同定可能な」という用語は,指定されたポリペプチド(通常はHCVタンパク)内に存在し,かつそのタンパクに特有であるエピトープおよびポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的な同一性は,抗体の結合および/または結合における競争によって決定されるが,この技術は当業者には知られていることであり,後述する。エピトープの独自性も,エピトープをコードするポリヌクレオチド配列について,公知の
データバンク(例えば,ジーンバンク)をコンピュータで調査し,他の公知のタンパクとアミノ酸配列を比較することによって決定することができる。
本願で用いる「エピトープ」という用語は,ポリペプチドの抗原決定基を意味し,エピトープは,エピトープに特有の立体配置で3個のアミノ酸を含有し得るが,エピトープは,一般に少なくとも5個のこのようなアミノ酸で構成され,より一般的には少なくとも8〜10個のこのようなアミノ酸で構成されている。アミノ酸の立体配置の決定法は,当該技術分野では公知であり,例えば,X線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴法がある。
ポリペプチドは,これに含まれている特異的なエピトープが抗体を認識することによって,抗体と結合する場合,抗体と「免疫学的に反応性がある」。免疫学的反応性は,抗体結合反応,特に抗体結合反応の速度論,および/または抗体が指向しているエピトープを含有する公知のポリペプチドを,競争者として用いる結合競争法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は,当該技術分野で公知である。
本願に用いる場合,「HCVエピトープを含有する免疫原性を有するポリペプチド」という用語には,自然に発生するHCVポリペプチドもしくはその断片,および他の手段(例えば,化学合成法または組換え体生物内でのポリペプチドの発現)によって調製されるポリペプチドが包含される。
「ポリペプチド」という用語は,アミノ酸の分子鎖を意味し,特定の長さの生産物を意味しない。したがってポリペプチドの定義には,ペプチド,オリゴペプチドおよびタンパクが包含される。またこの用語は,ポリペプチドの発現後修飾物,例えば,グリコシル化物,アシル化物,リン酸化物などを意味しない。
本願で用いる「形質転換」という用語は,外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味し,挿入法はどんな方法でもよく,例えば,直接取込み法,形質導入法またはf−交配法がある。外因性ポリヌクレオチドは,組込まれていないベクター,例えば,プラスミドとして保持されるか,または代わりに宿主ゲノムに組込まれてもよい。
本願で用いる「処理」という用語は,予防および/または治療を意味する。
本願で用いる「個体」という用語は,脊椎動物,特に哺乳動物種のメンバーを意味し,家畜,競技用動物,霊長動物およびヒトを含むが,これに限定されるものではない。
本願で用いる場合,核酸の「正鎖」は,ポリペプチドをコードする配列を含有している。また「負鎖」は,「正鎖」の配列を相補する配列を含有している。
本願で用いる,ウイルスの「正鎖ゲノム」は,RNAまたはDNAにかかわらず,一本鎖のゲノムであり,ウイルスのポリペプチドをコードする。正鎖のRNAウイルスの例としては,トガウイルス科ウイルス(Togaviridae),コロナウイルス科ウイルス(Coronaviridae),レトロウイルス科ウイルス(Retroviridae),ピコルナウイルス科ウイルス(Picorna−viridae)およびカリチウイルス科ウイルス(Caliciviridae)がある。またフラビウイルス科ウイルスも含まれるが,これは以前にトガウイルス科に分類されていた〔フィールドとナイプの文献(1986年)を参照〕。
本願で用いる「抗体を含有する身体成分」は,問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味する。抗体を含有する身体成分は,当該技術分野で知られており,例えば,血漿
,血清,脊髄液,リンパ液,呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション(section),涙,唾液,乳,白血球および骨髄腫細胞が含まれるが,これに限定されるものではない。
本願で用いる「精製されたHCV」は,ウイルスが通常連結されている細胞構成要素および感染組織中に存在する他の種のウイルスから単離されたHCVの製剤を意味する。ウイルスを単離する技術は,当業者には知られており,例えば,遠心分離法およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが,精製HCVの製法については後述する。
II.発明の構成
本発明の実施においては,特に指示されない限り,当該分野で既知である分子生物学,微生物学,組み換えDNA,および免疫学の従来の手法が採用される。このような手法は,文献中に充分に説明されている。例えば,次の文献を参照されたい:Manistis,FitschおよびSambrook,MOLECULAR CLONING;A LABORATIRY MANUAL(1982);DNA CLONING,I 巻およびII巻(D.N Glover編集,1985);OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編集,1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編集,1984);TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.Hames および S.J.Higgins 編集,1984);ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編集,1986);IMMOBILIZED CELLS ANDENZYMES(IRL Press,1986);B.Perbal,A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984);
METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ(Academic Press,Inc.);GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H.MillerおよびM.P.Calos編集,1987,ColdSpring Harbor Laboratory);Methods in
EnzymologyVol.154およびVol.155(それぞれWuおよびGrossman;Wu編集),MayerおよびWalker編集(1987);IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL ANDMOLECULAR BIOLOGY(Academic Press,London),Scopes,(1987);PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND
PRACTICE,Second Edition(Springer−Verlag,N.Y.),およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,I 〜IV巻(D.M.Weir およびC.C.Blackwell編,1986)。
ここで述べられる前出および後述の特許出願および公報は参考文献としてここに取り入れられている。
本発明の有用な物質および方法は,HCV感染チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列由来のcDNAライブラリーから単離されたヌクレオチド配列と非常に相同なヌクレオチド配列群の供給により可能となる。このヌクレオチド配列群はヒトあるいはチンパンジーの起源ではない。なぜなら,このヌクレオチド配列群は,非感染個体から得られるヒトおよびチンパンジーのゲノムDNAのいずれにもハイブリダイズせず,この配列群のヌクレオチドはHCV感染したチンパンジーの肝臓および血漿にのみ存在し,そして,この配列は遺伝子バンクには存在しないからである。さらに,この配列群は,HBVゲノム内に含有される配列に有意な相同性を示さない。
クローン5−1−1内に含有されるこの群のある配列は,およそ50個のアミノ酸のポリペプチドをコードする1つの連続的なオープンリーディングフレーム(ORF)を有する。HCV感染者から得られた血清にはこのポリペプチドに結合する抗体が含有されている一方,非感染者から得られた血清には,このポリペプチドに対する抗体が含有されない。最終的に非感染チンパンジーから得られた血清には,このポリペプチドに対する抗体が含有されないが,この抗体は,急性NANBHに感染したチンパンジーにおいて誘導される。さらに,このポリペプチドに対する抗体はHAVおよびHBVに感染したチンパンジーおよびヒトにおいては検出されない。これらの基準によると,この配列はウイルスの配列に対するcDNAであり,このウイルスにより生じ,NANBHと関連する配列である。このcDNA配列を第1図に示す。後述のように,クローン5−1−1におけるcDNA配列は,単離された他のcDNA(さらに28個の塩基対を含有する)とは異なる。
他の同定されたDNA群(これらは,クローン5−1−1におけるcDNAの断片と同等な合成配列をプローブとして用い,単離された)との複合配列を第3図に示す。クローン81におけるcDNA由来の合成配列を用いて単離されたcDNA群の構成要素を第5図に示し,クローン81の配列とこの配列との複合配列を第6図に示す。cDNA群の他の構成要素は,クローン14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,および33g,および39cに存在する配列を含み,これらは,IV.A節で詳細に説明される。これらクローン中のcDNA複合配列はIV.A.18節で詳細に説明されており,第29〜34図に示される。cDNA複合配列はひとつの連続したORFを含有し,従って,ポリタンパクをコードしていることが示される。このデータは,後に考察されるように,HCVがフラビウイルスあるいはフラビ様ウイルスであるという示唆と一致する。
第1図〜第46図に包括して示すcDNA群が入手可能となるため,DNAプローブの構築およびポリペプチドを得ることが可能となる。上記ポリペプチドは,HCV感染によるNANBHの診断において,そして,供血者,供給された血液および血液産物が感染しているか否かについてスクリーニングすることにおいて,有用である。例えば,この配列から,約8〜10個あるいはそれより長いヌクレオチドを有するDNAオリゴマーを合成することが可能である。このDNAオリゴマーは,例えばウイルスを保有している疑いがある被験者血清におけるウイルスゲノムの存在を検出するための,あるいは供給された血液についてウイルスの存在の有無をスクリーニングするための,ハイブリダイゼーションプローブとして,有用である。cDNA配列の群によりまた,NANBHにおいて生じる抗体の存在を検出する診断用試薬として有用なHCVに特異的なポリペプチドの設計および産生が可能となる。cDNA由来の精製ポリペプチドに対する抗体は感染個体および血液中のウイルス抗原を検出するためにも用いられ得る。
これらのcDNA配列の知識により,HCVに対するワクチンとしてそして抗体産生のためにも用いられ得る,ポリペプチドの設計および調製が可能となる。そしてこのポリペプチドは,次に,HCV疾患に対する保護および/またはHCV感染個体の治療に用いられ得る。
さらに,cDNA配列群によりHCVゲノムを,より特徴づけることを可能にする。これらの配列から得られたポリヌクレオチドプローブは,重複している付加的なcDNA配列についてcDNAライブラリーをスクリーニングするために用いられ得,このcDNA配列はさらに,重複している別の配列を得るためにも用いられ得る。ゲノムが分割されており,そのセグメントが共通配列を欠いている限り,この手法はゲノム全体の配列を得るために用いられ得る。しかし,ゲノムが分割されているならば,ゲノムの他のセグメントは,ここで述べられているcDNAクローンを単離するために用いられたλ−gt11の血清学的なスクリーニング工程を繰り返すことにより,あるいは,精製HCV粒子からの
ゲノムを単離することにより得られ得る。
cDNA配列群およびこれら配列由来のポリペプチド,そして,これらペプチドに対する抗体もまた,BB−NANBV因子の単離および同定に有用である。例えば,cDNA由来のポリペプチドに含まれるHCVエピトープに対する抗体は,アフィニティークロマトグラフィーをもとにした工程で,ウイルスを単離するために用いられ得る。あるいは,この抗体は他の手法により単離されたウイルス粒子を同定するために用いられ得る。単離されたウイルス粒子のウイルス抗原およびゲノム物質が,さらに特徴づけられ得る。
HCVゲノムをさらに配列決定することによって得られる情報により,およびHCV抗原がさらに特徴づけられ,ゲノムが特徴づけられることにより,付加的なプローブおよびポリペプチド,そして抗体の設計および合成が可能となる。これらは,HCV誘発NANBHの診断,予防,および治療に,そして感染血液および血液関連産物のスクリーニングに用いられ得る。
抗原および抗体を含むHCVのプローブ,およびcDNA群が誘導されるゲノム由来のポリヌクレオチドが利用可能であることにより,HCVの生物的性質を明らかにするにあたり主として用いられる組織培養系の発達が可能となった。このことにより,HCV複製,あるいはHCV感染を選択的に阻害する抗ウイルス化合物に基づいた新しい治療法が開発され得る。
NANBHの病因因子を同定および単離するために用いられる本法は新規であり,次のような今までに特徴づけられていない因子の同定および/または単離に適用され得る。上記因子はゲノムを含有し,ウイルス,ウィロイド,細菌類,菌類,および寄生虫によって引き起こされる疾患を包含するさまざまな疾患に関連する因子である。この方法ではcDNAライブラリーが,感染個体から得られる感染組織中に存在する核酸から,調製された。このライブラリーは,cDNAをコードするポリペプチドを発現し得るベクター中に調製された。ベクターを含む宿主細胞のクローンは,病因因子のポリペプチドの免疫反応性断片を発現し,これは,推定される因子に以前に感染した別の個体由来の抗体含有体成分を有するこのライブラリーの発現産物を免疫学的にスクリーニングすることによって選択される。免疫学的なスクリーニング法における工程は,次の工程を包含していた;:ベクターを含むcDNAの発現産物と,二次的に感染した個体の抗体含有体成分とを相互作用させる工程;および発現産物と二次感染個体の抗体との間の抗原−抗体複合配列の形成を検出する工程。単離されたクローンはさらに次のようにして免疫学的にスクリーニングされる:発現産物を,推定される因子に感染した他の個体および推定される因子に感染していない対照の個体の抗体含有体成分と相互に作用させること,および,感染個体由来の抗体との抗原−抗体複合配列の形成を検出すること。そして,感染個体および該因子に感染している疑いのある個体由来の抗体と免疫学的に反応するが,対照の個体由来のものとは反応しないポリペプチドをコードするcDNA含有ベクターが,単離される。cDNAライブラリーの構築および免疫学的なスクリーニングに用いた感染個体は同種である必要はない。
本法により単離されたDNA発現産物,そして該発現産物に対する抗体は,病因因子の特徴づけおよび/または捕捉に有用である。さらに,詳細に後述するように,この方法は,HCVゲノム由来のcDNA群を単離するために,好適に利用される。
II.A.cDNA配列の調製
慢性HCV感染チンパンジー由来の貯留血清であって,ウイルスを高力価で,つまり少なくとも10チンパンジー感染量/ml(chimp infections doses/ml;CID/ml)を有する血清を,ウイルス粒子を単離するために用いた。そ
して,このウイルス粒子から単離した核酸を,ウイルスゲノムに対するcDNAライブラリーの構築においてテンプレートとして用いた。推定HCV粒子の単離およびλ−gt11におけるcDNAライブラリーの構築のための手順は,IV.A.1節で考察されている。λ−gt11は,β−ガラクトシダーゼを有する融合ポリペプチドとして挿入cDNAを発現するために,そして,特定の抗原に対して生じた特異的な抗血清で多数の組み換え体ファージをスクリーニングするために,特に開発されたベクターである。およその平均サイズが200塩基対のcDNAを有するcDNAプールからのλ−gt11 cDNAライブラリーが以前にNANB肝炎にかかったことのある患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコードされたエピトープについてスクリーニングされた。Huynh,T.V.ら(1985)。約10個のファージがスクリーニングされ,5個の陽性ファージが同定,精製され,次に,HCV因子に以前に感染した異なるヒトおよびチンパンジーから得た血清に対する結合の特異性がテストされた。このファージの1つである5−1−1が,テストしたヒト血清8個のうちの5個と結合した。7個の正常血清はこのような結合を示さなかったので,この結合は以前にNANB肝炎にかかった患者由来の血清に選択的であるらしい。
組換え体ファージ5−1−1におけるcDNA配列が,決定され,それは第1図に示される。このクローン化されたcDNAによってコードされたポリペプチドは,融合ポリペプチドのN末端β−ガラクトシダーゼ部分として同一の翻訳枠内にあり,その配列は,該ヌクレオチド配列の上に示される。従って,翻訳ORFは,NANB肝炎に感染した患者由来の血清によって特別に認識されるエピトープをコードする。
組換えファージ5−1−1においてcDNAが利用できるため,ウイルスゲノムに対するcDNAの付加的な断片および/または他の断片を有する他のクローンを単離することが可能となる。前出のλ−gt11 cDNAライブラリーは,クローン化された5−1−1 cDNA配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いてスクリーニングされた。このスクリーニングにより,81,1−2,および91として同定された3個の他のクローンが得られた。これらのクローン内にあるcDNAが配列決定された。IV.A.3節およびIV.A.4節を参照されたい。4個の独立したクローン間の相同性を第2図に示す。第2図では相同性が縦線により示されている。クローン5−1−1,81,および91において独特のヌクレオチド配列を小文字で示す。
クローン5−1−1,81,1−2,および91における組換え体ファージにクローン化されたcDNAは,相同性が高く,わずかに2個の領域において異なるにすぎない。第一に,クローン1−2の67番目のヌクレオチドはチミジンである一方,他の3個のクローンは,この位置にシチジンを有する。しかし,この置き変えにより,コードされたアミノ酸の性質は変化しない。
この4つのクローンの第2の違いは,クローン5−1−1が,他のクローンには存在しないような28の塩基対を5’末端に有していることである。この特別な配列はクローニングにより5’末端に人工的に形成されたものである。クローニングにより5’末端に形成される人工的な配列は,通常,cDNA法の生成物中に観察される。
クローン81におけるHCV cDNAの5’領域および3’領域由来の合成配列は,クローン81cDNAと重複するλ−gt11の NANBVcDNAライブラリー由来のcDNAのスクリーニングおよび単離に用いられた(IV.A.5節)。クローン36およびクローン32の中にそれぞれ存在する得られたcDNA配列は,第5図および第7図に示される。
同様に,クローン36の5’領域に基づいた合成ポリヌクレオチドは,クローン36
cDNAに重複するλ−gt11 NANBV cDNAライブラリーからcDNAをスクリーニングし単離するのに用いられた(IV.A.8節)。合成ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする組換えファージ含有cDNAの精製クローンはクローン35と命名され,このクローンの中に含まれるNANBHcDNA配列は第8図に示される。
重複cDNA配列を単離する手法を利用することによって,上流および下流にHCV cDNAの付加的な配列を有するクローンが得られた。これらクローンの単離はIV.A節で後述する。
単離されたクローン内にコードされたHCV cDNAのヌクレオチド配列の分析により,複合cDNAがひとつの長い連続したORFを有することが示される。第29〜34図に,これらのクローンからの複合DNA配列を,それによりコードされた推定されるHCVポリペプチドとともに,示す。
cDNA配列を得るための方法の記述は,歴史的に興味深い。得られた配列(およびその相補配列)は本発明により提供され,その配列あるいはその部分的な配列は合成法を用いて,あるいは,合成法と,ここに記載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方法とを組み合わせて,調製される。
HCV cDNAライブラリーからの,そしてクローン5−1−1,81,1−2および91から複製されるλ−gt11株は,American Type Culture
Collection(ATCC),12301 Parklawn Dr.,Rockville,Maryland 20852,に,ブダペスト条約により寄託されており,次の受託番号を有する。
λ−gt11 ATCC No寄託日
HCV cDNAライブラリー 40394 1987年12月 1日
クローン81 40388 1987年11月17日
クローン91 40389 1987年11月17日
クローン1−2 40390 1987年11月17日
クローン5−1−1 40391 1987年11月18日
本出願が米国特許として許可され発行されると,これら寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取り除かれる。そして上記命名された寄託物は,37CFR 1.14および35USC 1.22によりコミッショナーによって権利を与えられた上記出願が係属している間は,入手可能である。さらに,その寄託物は,寄託日から30年間,あるいは寄託物の最終要求から5年間;あるいは,米国特許の有効である期間のいずれか長い方の期間の間,維持される。これらの寄託物およびここで述べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託されたものであり,ここでの記載された内容により本発明を実施することを意図していない。すべての寄託物におけるHCVcDNA配列は,参考として,ここに述べられている。
HCV λ−gt11ライブラリーからの重複cDNA配列を単離することによりゲノムを「ウォーキング(walking)」する上記記載により,全HCVゲノムに対するcDNAを単離し得る方法が提供される。しかし,本明細書で提供される情報が与えられたとしても,これらのcDNAを単離する他の方法は当業者には自明である。そのような方法のいくつかはこの後のIV.A節で述べられる。
II.B.ウイルス性ポリペプチドおよびフラグメントの調製
第1〜46図のcDNA配列を利用して,後述のように単離されたcDNA配列であっても,これらの図のcDNA配列であっても,このようなcDNA配列を利用し得るため,いずれかの鎖においてコードされているポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードす
る発現ベクターの構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域はコートまたはエンベロープ(外被)抗原,あるいはコア抗原由来であり得,それには例えば,ポリヌクレオチド結合タンパク,ポリヌクレオチドポリメラーゼ,およびウイルス粒子の複製および/または構築(assembly)に必要とされる他のウイルス性タンパクが包含される。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは従来の制限消化を用いてあるいは合成法により,cDNAクローンから誘導され,例えばタンパクβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)(好ましくはSOD)のような融合配列の一部を有するベクター中に連結される。SODの融合配列を有するポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは,1986年10月1日に公開されたヨーロッパ特許出願公開番号第0196056号に記載されている。SODおよびHCVポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベクター(つまりNANB5−1−1,NANB81およびC100−3;HCV cDNAの複合配列中にコードされている)は,それぞれIV.B.1,IV.B.2,およびIV.B.4節に記載されている。どちらのセンス鎖においても,オープンリーディングフレームを有するHCV cDNAの所望の部分は,成熟タンパクあるいは融合タンパクのような組換えポリペプチドとして得られる。あるいは,このcDNAにコードされるポリペプチドは,化学合成により供給され得る。
所望のポリペプチドをコードするDNAは,融合型であっても成熟型であっても,分泌を可能にするシグナル配列を有していてもいなくても,適当な宿主に適した発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物および原核生物の両宿主が,組換えポリペプチドを形成するために現在用いられている。より一般的な制御系および宿主細胞系を,後述のIV.A節にまとめて示す。このポリペプチドは,次に,溶解した細胞あるいは培地から単離され,実際の使用に必要な程度にまで精製される。精製には,当該分野で公知の手法が用いられ得,それには例えば,塩分画,イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー,アフィニティークロマトグラフィー,遠心分離などがある。例えば,Methods in Enzymologyの種々のタンパク精製法を参照されたい。このようなポリペプチドは,診断用として用いられ得るか,あるいは抗体を中和するようなポリペプチドはワクチンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生じた抗体もまた,診断薬として,あるいは受動免疫治療に用いられ得る。さらに,後述のII.J節で考察するように,これらポリペプチドに対する抗体は,HCV粒子の単離および同定に有用である。
このHCV抗原はまた,HCVビリオンから単離され得る。このビリオンは,組織培養物中のHCV感染細胞,あるいは感染宿主中で増殖し得る。
II.C.抗原性ポリペプチドの調製およびキャリアとの結合
ポリペプチドの抗原性領域は,通常は比較的小さく,代表的には8〜10個あるいはそれを下まわる長さのアミノ酸である。せいぜい5個のアミノ酸フラグメントが抗原性領域を特徴づけている。これらのセグメントは,HCV抗原領域に対応する。従って,このHCVのcDNAを基本的に用いると,HCVポリペプチドの短いセグメントをコードするDNAは,融合タンパクとして,あるいは単離ポリペプチドとして,組換え手法により発現させることができる。さらに,短いアミノ酸配列は,化学合成で都合よく得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピトープを提供するために正しく形成されているが,小さすぎて免疫原性がない場合には,このポリペプチドは,適当なキャリアと結合させることができる。
このような結合を得るための多くの手法が当該分野では公知であり,それにはPierce Company,Rockford,Illinoisから入手されるN−サクシイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)およびサクシイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボネート(SMCC)を用いてジスルフィド結合を形成する方法が包含される(もしこのペプチドがスルフヒドリル基を
欠いていれば,システイン残基を付加することにより,この方法が用いられ得る)。これらの試薬は,その試薬自身とあるタンパクのペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合,およびリジンのε−アミノ,あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結合を生成する。このようなさまざまなジスルフィド/アミド形成試薬は公知である。例えば,Immun.Rev.(1982)62:185を参照されたい。他の二官能性カップリング試薬は,ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオ−エーテル生成試薬の多くは市販されており,それには6−マレイミドカプロン酸,2−ブロモ酢酸,2−ヨード酢酸,4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸などの反応性エステルが包含される。このカルボキシル基は,そのカルボキシル基とコハク酸イミドとを,あるいは1−ヒドロキシル−2−ニトロ−4−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性化される。上述の化合物の名称は,それが全てであることを意味せず,その化合物の修飾物もまた明らかに用いられ得る。
キャリアとしては,それ自身が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導しないものであれば,いずれのキャリアもが用いられ得る。適当なキャリアは,典型的には,大きく,ゆっくり代謝される高分子物質であり,それには例えば,タンパク;ラテックス機能付与セファロース,アガロース,セルロース,セルロースビーズなどの多糖体;ポリグルタミン酸,ポリリジンなどのような重合アミノ酸;アミノ酸共重合体;および不活性ウイルス粒子がある(例えば,II.D節を参照のこと)。特に有用なタンパク基質には,血清アルブミン,キーホールリンペットヘモシアニン,免疫グロブリン分子,サイログロブリン,オボアルブミン,テタヌス毒素,および当業者に公知の他のタンパクがある。
II.D.HCVエピトープを有するハイブリッド粒子免疫原の調製
HCVのエピトープの免疫原性はまた,粒子形成タンパク(例えば,B型肝炎の表面抗原と結合するタンパク)と融合もしくは結合させた哺乳動物の系あるいは酵母の系で調製することによって増強される。NANBVエピトープが粒子形成タンパクコード配列に直接結合している構築物は,HCVエピトープに関して免疫原性のハイブリッドを産生する。さらに,調製したすべてのベクターはHBVに特異的なエピトープを有し,例えばプレSペプチドのように異なる度合の免疫原性を有する。このように,HCV配列を有する粒子形成タンパクから構築される粒子は,HCVおよびHBVに関して免疫原性である。
肝炎の表面抗原(HBSAg)は,S.cerevisiae(Valenzuela
ら,(1982)),および例えば哺乳動物細胞(Valenzuela,P.ら,(1984))において形成され,結合して粒子となることが示されている。このような粒子の形成は,単量体のサブユニットの免疫原性を増強することが示されてきた。この構築物はまた,HBSAgの免疫的に優性なエピトープを有し,それはプレ表面(プレS)領域の55アミノ酸を含有する(Neurathら,(1984))。酵母中に発現され得るプレS−HBSAg粒子の構築物は,ヨーロッパ特許出願公開第174,444号(1986年3月19日公開)に開示されている。酵母の発現のための異種ウイルス配列を有するハイブリッドは,ヨーロッパ特許出願公開第175,261号(1966年3月26日公開)に開示されている。これらの出願の出願人は本出願人と同一であり,参考としてここに取り入れられている。
これらの構築物もまた,SV40のジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のような哺乳動物細胞中で発現させることができる(Michelleら(1984))。
さらに,粒子形成タンパクをコードする配列の部分は,HCVエピトープをコードするコドンで置き換えられ得る。この置き換えにおいては,酵母あるいは哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するために必要とされない部分は削除され得,このよ
うにして,HCVエピトープと競合する部分から付加的なHBV抗原部位が除去される。
II.E.ワクチンの調製
ワクチンは,HCV cDNA由来の免疫原性ポリペプチドおよび第1〜46図のcDNA配列由来の免疫原性ポリペプチド,あるいはこれらが対応するHCVゲノム由来の免疫原性ポリペプチドの1種あるいはそれ以上から調製される。HCVおよびフラビウイルスの間に観察される相同性は,ワクチンとして最も有効でありそうなポリペプチドと,それらがコードされているゲノム領域に関する情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は,Riceら(1986)により考察されている。こフラビウイルスのゲノムRNAは,ウイルス特異的mRNA種のみであると考えられ,これは,3つのウイルスの構造タンパク(つまり,C,MおよびE),そして,2つの大きな非構造タンパク(NV4およびNV5)およびより小さな非構造タンパクの複合体の対に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープは,E(外被:envelope)タンパクに属することは公知である(Roehrig(1986))。対応するHCV E遺伝子およびポリペプチドをコードする領域は,フラビウイルスに対する相同性に基づいて,予想され得る。このように,ワクチンは,HCV Eのエピトープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドは,細菌,酵母,あるいは哺乳動物細胞において発現するか,あるいは,ウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパクもまた,保護抗HCV抗体を生じるエピトープを有し得ることが予期される。このように,E,C,およびMのエピトープを有するポリペプチドもまた,単独であるいは組み合わせて,HCVワクチン中で用いられ得る。
上記に加えて,NS1(非構造タンパク1)で免疫すると黄熱病から保護されることが示されている(Schlesingerら(1986))。たとえ,その免疫により中和抗体が生じないとしてもこのことは正しい。このように,特に,このタンパクはフラビウイルスの間で高い度合で保持されるらしいので,HCV NS1もまた,HCVの感染に対して保護作用を有するようである。さらに,たとえ非構造タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても,非構造タンパクは,ウイルスの病原性に対して保護作用を提供し得ることもまた示される。
上記の見解においては,HCVに対する多価のワクチンは1あるいはそれ以上の構造タンパク,および/または1あるいはそれ以上の非構造タンパクを含有し得る。これらのワクチンは,例えば,組換えHCVポリペプチドおよび/またはビリオンから単離されたポリペプチドを含有し得る。さらに,ワクチンにおける不活性化HCVの使用を可能にする。不活性化は,ウイルス溶解物の調製によるか,あるいはフラビウイルスの不活性化を引き起こす当該分野で公知の他の方法(例えば,有機溶媒あるいは界面活性剤での処理,あるいはホルマリンでの処理)により行われ得る。さらに,ワクチンはまた,弱毒化HCV株からも調製され得る。弱毒化HCV株の調製は,後述される。
フラビウイルスにおけるタンパクのいくつかは高度に保持された領域を有することは公知であり,従って,いくつかの免疫学的交差反応性がHCVと他のフラビウイルスとの間に予想される。フラビウイルスとHCVとの共有のエピトープは,これら病原因子によって引き起こされる1あるいはそれ以上の障害に対する保護抗体を生じる可能性がある。このように,この認識に基づく多目的ワクチンを設計することができる。
活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有するワクチンの調製は,当業者に公知である。代表的には,このようなワクチンは,液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとして,注射できるように調製される。注射の前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた,乳化することもでき,あるいは,リポソームにカプセル化されるタンパクであってもよい。この活性免疫原性成分は,薬学的
に受容され得,この活性成分と適合性のある賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤としては,例えば,水,生理食塩水,デキストロース,グリセロール,エタノールなど,およびこれらの組み合わせがある。さらに必要に応じて,このワクチンには少量の補助物質が含有され得,それには,補湿剤あるいは乳化剤,pH緩衝剤,および/またはこのワクチンの効果を増強するアジュバントがある。効果的なアジュバントの例としては,次の物質があり,そしてこれらには限定されない:水酸化アルミニウム,N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP),N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP 11637,nor−MDPとする),N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP 19835A,MTP−PEとする),およびRIBI。上記RIBIは細菌から抽出される3つの成分,モノホスホリル脂質A,トレハロースジミコール酸,および細胞壁骨格成分(MPL+TDM+CWS),を,2%スクアレン/トゥイーン80乳液中に含んでいる。アジュバントの効果は,HCV抗原配列を有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定され得る。このポリペプチドは,種々のアジュバントを含むワクチン中のこのポリペプチドを投与することにより生じる。
このワクチンは,通常,非経口的に注射で投与され,その形態は,例えば,皮下注射であっても筋肉注射であってもよい。他の投与形態に適当な処方には座薬があり,場合によっては経口処方もある。座薬として従来のバインダーおよび担体が用いられ得,それには例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリドがある。このような座薬は,活性成分を0.5%〜10%,好ましくは1%〜2%の範囲で含有する混合物から形成される。経口処方物には,通常使用される賦形剤が含有され,そのような賦形剤には例えば,製剤グレードのマンニトール,ラクトース,デンプン,ステアリン酸マグネシウム,サッカリンナトリウム,セルロース,炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は,溶液,懸濁液,錠剤,丸剤,カプセル剤,放出を維持するような処方,あるいは粉剤の形態を有し,活性成分を10%〜95%,好ましくは25%〜70%の割合で含有する。
このタンパクは,そのままであるいは塩の形で,ワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には,酸付加塩(ペプチドの遊離のアミノ基により形成される)が包含され,この塩は,無機酸(例えば,塩酸あるいはリン酸)あるいは有機酸(例えば酢酸,シュウ酸,酒石酸,マレイン酸など)を用いて形成される。遊離のカルボキシル基により形成される塩は,無機塩基(例えば,水酸化ナトリウム,水酸化カリウム,アンモニア,水酸化カルシウム,あるいは水酸化鉄)および有機塩基(例えば,イソプロピルアミン,トリメチルアミン,2−エチルアミノエタノール,ヒスチジン,プロカインなど)からも誘導され得る。
II.F.ワクチンの用量および投与
このワクチンは投薬処方に適合するように,そして予防効果および/または治療効果が得られる量で,投与される。投与される量は,一般に1回の投与あたり抗原が5μg〜250μgであり,この投与量は治療される個体,該個体の免疫系の抗体合成能,および所望する保護の度合に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は,医師の判断によるものであり,それぞれの個体に特有であり得る。
このワクチンは,1回の投与計画で与えられるか,あるいは好ましくは複数回の投与計画で与えられ得る。複数回の投与計画では,最初のワクチン投与は,1〜10回に分けて行なわれ,第2回目の投与では免疫応答維持もしくは強化するために第1回目とは別に所定の間隔をおいて引き続いて1〜4ヶ月投与され,そして必要であれば数ヶ月後にさらに引続き投与が行なわれる。この投与形態はまた,少なくとも部分的には,個人の必要量に
よって決定され,医師の判断による。
さらに,免疫原性のHCV抗原を有するワクチンは,他の免疫調整因子,例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与され得る。
II.G.HCVエピトープに対する抗体の調製
上述のようにして調製される免疫原性のポリペプチドは,ポリクローナル,および,モノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望であれば,選択される哺乳動物(例えば,マウス,ウサギ,ヤギ,ウマなど)はHCVエピトープを有する免疫原性ポリペプチドを用いて免疫される。免疫された動物から得られる血清は回収され,公知の方法によって処理される。
HCVエピトープに対するポリクローナル抗体を有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる場合には,このポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナルな抗血清を産生し,処理する手法は,当該分野では公知であり,例えばMayerおよびWalker(1987)を参照されたい。
あるいは,ポリクローナル抗体は,あらかじめHCVに感染させておいた哺乳動物から単離され得る。感染個体の血清から得られるHCVエピトープに対する抗体を精製する方法の例は,V.E.節で述べられており,これは,アフィニティークロマトグラフィーに基づき,SODとcDNAクローン5−1−1内にコードされたポリペプチドとの融合ポリペプチドを利用する方法である。
HCVエピトープに対するモノクローナル抗体もまた,当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的な方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞融合によって作成することができ,さらに,腫瘍原性DNAを用いたBリンパ球の直接形質転換,あるいはEpstein−Barrウイルスを用いたトランスフェクションのような他の手法によってもまた作成することができる。例えば,M.Schreierら(1980);Hammerlingら(1981);Kennettら(1980)の文献を参照されたい。さらに,米国特許No.4,341,761;No.4,399,121;No.4,427,783;No.4,444,887;No.4,466,917;No.4,472,500;No.4,491,632;およびNo.4,493,890もまた,参照されたい。HCVエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは,種々の目的(例えばアイソタイプ,エピトープ親和性など)に応じてスクリーニングされ得る。
モノクローナルおよびポリクローナル両抗体は,HCVエピトープに対して形成され,特に診断において有用であり,中和抗体は受動免疫治療に有用である。特
にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体を生じさせるために用いられ得る。
抗イディオタイプ抗体は,それに対して保護が望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ(internal image)」を伴う免疫グロブリンである。例えば,Nisonoff,A.ら(1985)およびDreesmanら(1985)を参照されたい。
抗イディオタイプ抗体を生じさせるための手法は,当該分野で公知である。例えば,Grzych(1985),MacNamaraら(1984),およびUytdehaagら(1985)を参照さ
れたい。これらの抗イディオタイプ抗体は,NANBHの治療,およびHCV抗原の免疫原性領域を解明するのにも有用である。
II.H.診断用オリゴヌクレオチドプローブおよびキット
単離されたHCV cDNAの開示部分(第1〜46図に示される部分を包含する)を基本として用いて,約8個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断あるいは合成によって調製され得る。このオリゴマーは,HCVゲノムとハイブリダイズし,このウイルス性因子の同定,さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づけ,および疾患個体のウイルスの検出に有用である。HCVポリヌクレオチドプローブ(天然あるいは誘導された)は,ハイブリダイゼーションによって独特のウイルス配列を検出し得る長さである。6〜8個のヌクレオチドが,その機能を果たし得る長さであるが,10〜12個のヌクレオチド配列が好適であり,約20のヌクレオチドが最も好適であると考えられる。好ましくは,これら配列は,異種性を欠いている領域由来である。これらプローブは自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む,定型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブには,例えば,本明細書で開示されたクローン5−1−1および付加的なクローン,そして,cDNAライブラリーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーがある。HCVゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメントの長さが長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるのであるが,プローブとして使用するには完全な相補性が望まれる。
診断用としてこのようなプローブを使用するには,血液あるいは血清のような分析されるべき生物学的試料は,必要であれば,そこに含有されている核酸を抽出するために処理される。この試料から得られた核酸は,ゲル電気泳動あるいは他のサイズ分離手段にかけられ得る。あるいは,この核酸試料は,サイズ分離を行うことなくドットブロットされ得る。次にこのプローブは標識化される。プローブを標識するための適当な標識物,および方法は当該分野では公知であり,それには例えば,ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理で取り込まれた放射性標識物,ビオチン螢光プローブ,および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出された核酸は,次に,適当な厳密さのハイブリダイゼーション条件下で,標識されたプローブと共に処理される。
このプローブは,HCVゲノムに完全に相補的に作成され得る。従って,偽陽性を防ぐために,通常,厳密性の高い条件が望まれる。しかし,プローブが異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補性を有する場合のみに,厳密性の高い条件が使用される。ハイブリダイゼーションの厳密さは,ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程中の多くの因子(温度,イオン強度,時間の長さおよびホルムアルデヒドの濃度を含む)により決定される。これらの因子は,例えばManiatis,T(1982)により概説されている。
一般に,このHCVゲノム配列は,感染個体の血清中に比較的低レベル(つまり,1mlあたり約10〜10個の配列)で,存在する。このレベルはハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅手法が用いられることが必要であり得ることを示している。そのような手法は当該分野では公知である。例えばEnzo Biochemical Corporationの「Bio−Bridge」システムでは,DNAプローブに未修飾の3’−ポリ−dTテールを付加するために,末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いている。ポリdTテールを付加したプローブは標的となるヌクレオチド配列にハイブリダイズされ,ついで,ビオチン修飾ポリAにハイブリダイズされる。PCT出願84/03520およびEPA124221には次のような方法のDNAハイブリダイゼーションアッセイが記述されている:(1)被分析物を,酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な単鎖DNAプローブにアニールする;および(2)得られたテールが付加された二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。EPA20451は次のような方法のDNAハイブリダイゼーションアッセイが記述されている。この方法では,分析物であるDNAを,例えば,ポリdTテールのようなテールを有するプローブと接触させ,次に増幅鎖と接触させる。この増幅鎖は,プローブのテールとハイブリダイズするポリA配列のような配列を有し,複数の標識鎖を結合することが可能である。特に望ましい方法では,まず血清中標的HCV配列が約10,000倍,つまり約10配列/ml
となるように,標的HCV配列の増幅が行われる。これは,例えば,Saiki ら(1986)の方法によって行なわれ得る。この増幅された配列は,ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて検出され得る。このハイブリダイゼーションアッセイ法は,本願出願人による係属中の米国出願(1987年10月15日出願;代理人のDocket No.2300−0171)中に記載されており,これは,参考文献としてここに取り入れられている。10/mlのレベルで配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ法では,単鎖の分析すべき核酸に結合し,多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利用する。標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる,適当な溶液相のサンドイッチアッセイ,およびプローブの調製法は,1987年6月16日に公開された本願出願人によるEPO 225,807に記載されており,これを参考文献としてここに取り入れる。
このプローブは診断用キット中に組み入れることができる。診断用キットは,プローブDNAを有し,このプローブDNAは標識されているか,あるいはこのプローブDNAは標識されておらず,標識用の成分がキット中に入っている。このキットにはまた,特定のハイブリダイゼーションのプロトコールに必要な他の試薬および材料(例えば,標準品,およびこのテストを行なうための指示書)が適当に包装されて含まれる。
II.I.イムノアッセイおよび診断用キット
HCV抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプチド,およびこれらのポリペプチドのHCV特異的エピトープに対して生じる抗体は,イムノアッセイにおいて,例えば血液または血清試料を包含する生物学的試料におけるHCV抗体の存在,あるいはウイルスおよび/またはウイルス抗原の存在を検出するために有用である。上記HCV抗体は,例えば,IV.A節で記載されたクローン由来であり,あるいは,このクローン内にコードされ,そしてそれらの複合体である。上記HCV特異的エピトープに対して生じる抗体については,例えば,IV.E節を参照されたい。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能であり,これらアッセイの多様性については当該分野では既知である。例えば,このイムノアッセイでは,1種のウイルス抗原が利用され得る。このウイルス抗原は,例えば,IV.A節で記載のHCV cDNAを有するクローンのいずれか由来のポリペプチド,あるいはこれらクローンのcDNA由来の複合cDNA由来のポリペプチド,あるいはこれらのクローンのcDNAが誘導されるHCVゲノム由来のポリペプチドである。あるいは,このイムノアッセイには,これらの源由来のウイルス抗原の組合せが用いられ得る。例えば,ウイルスのエピトープに対する1種のモノクローナル抗体,ひとつのウイルスの抗原に対するモノクローナル抗体の組み合わせ,異なるウイルス抗原に対する複数のモノクローナル抗体,同一のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体,あるいは異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロトコールは,例えば,競合分析法,直接分析法,あるいはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができる。このプロトコールではまた,固体支持体を用いるか,あるいはこのプロトコールは,免疫沈澱法であり得る。ほとんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。この標識物には例えば,螢光分子,化学発光分子,放射性分子あるいは染色分子がある。このプローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては,ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ,および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ(例えば,ELISA アッセイ)がある。
HCVのフラビウイルスモデルにより,ビリオンの構造タンパクに対する診断用エピトープの位置の推定が可能となる。C,プレM,MおよびEドメインはすべて,ウイルス抗原を検出するために,特に診断用に,有意な可能性のあるエピトープを含有していると考えられる。同様に,非構造タンパクのドメインは,重要な診断用エピトープ(例えば,推定のポリメラーゼをコードするNS5;および推定の補体結合抗原をコードするNS1)を有することが予想される。これらの特異的ドメイン由来のエピトープを有する組換えポ
リペプチドあるいはウイルスのポリペプチドは,感染血液提供および感染患者におけるウイルス抗体の検出に有用である。
さらに,Eおよび/またはMタンパクに対する抗体がNANBHによって引き起こされるHCV患者および感染血液提供者のウイルス抗原を検出するイムノアッセイにおいて用いられ得る。さらに,これら抗体は急性期のドナーおよび患者を検定するのに非常に有用である。
免疫診断に適し,適切に標識された試薬を有するキットが,適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。この適切な材料には,HCVエピトープを有する本発明のポリペプチド,あるいはHCVエピトープに対する抗体,およびアッセイの遂行に用いられる他の試薬および物質,さらにアッセイの指示書のセットを含む。
II.J.ウイルスゲノムに対するcDNAのプローブを用いたHCVゲノム,ビリオンおよびウイルス抗原の他の特性決定
IV.A.節に記載したクローンのHCV cDNA配列の情報は,第1図〜第46図に示すように,HCVゲノムの配列とHCV因子の同定と単離とについての情報をさらに得るために用いられ得,その結果,ゲノムの性質,ウイルス粒子の構造,およびウイルスが有する抗原の性質を含めたウイルスの特性決定の助けになる。さらに,この情報によって,付加的なポリヌクレオチドプローブ,HCVゲノム由来のポリペプチド,およびHCVが原因のNANBHの診断および/または治療に有用なHCVエピトープに対応する抗体が得られるようになる。
上記クローンのcDNA配列の情報は,IV.A節に記載されたクローンのcDNAの起源であるHCVゲノムの未確定領域由来の他のcDNA配列を単離するためのプローブを設計するのに有用である。例えば,約8個またはそれ以上,好ましくは20個またはそれ以上のヌクレオチドの配列を有する標識化プローブは,第1,第3,第6,第9〜10,第15〜17および第40〜46図に示すHCV cDNA配列の群の5’末端または3’末端に近い領域由来のものであり,HCV cDNAライブラリーから重複cDNA配列を単離するのに用いられ得る。上記クローンのcDNAと重複するこれらの配列は,上記クローンのcDNAの起源でないゲノムの領域由来の配列も含んでいるが,IV.A節に記載のクローンのcDNAと必らずしも重複しない,他の重複断片を同定するためのプローブを合成するのに利用することができる。HCVゲノムが切断され,そのセグメントが共通の配列を欠いていなければ,ウイルスゲノム由来の重複cDNAを単離する技術を利用して,全ウイルスゲノムの配列を決定することができる。これとは異なり,ゲノムが切断されていて共通配列を欠いている場合は,ゲノムの配列は,IV.A節に記載したクローンの単離および配列決定の技術を用い,クローン5−1−1を単離するのに用いたのと同様に,λgt11 HCVライブラリーを血清学的にスクリーニングし,cDNA単離物の配列を決定し,単離されたcDNAを利用して重複断片を単離することによって,決定することができる。あるいは,ゲノムセグメントの特性決定は,精製されたHCV粒子から単離されたウイルスゲノムで行うことができる。HCV粒子を精製し,精製中の粒子を検出する方法は後述する。ポリヌクレオチドのゲノムのウイルス粒子からの単離工程は,当該技術分野では公知であり,利用される一方法を実施例IV.A.1.に示す。単離されたゲノムのセグメントは,次に,クローン化され配列決定され得る。このように,ここで提供される情報によって,その性質にかかわりなく,HCVゲノムをクローン化し配列を決定することができる。
cDNAライブラリーを構築する方法は,当該技術分野では公知であり,すでに記載し,あるいは後で述べられる。λgt11内にHCV cDNAライブラリーを構築する方法は,IV.A.節ですでに述べられている。しかし,核酸プローブでスクリーニングす
るのに有用なcDNAライブラリーもまた,当該技術分野で公知の他のベクター内,例えばλgt10〔ヒュインら(Huynh et al),1985年〕内で構築することができる。第1〜46図のcDNA由来のプローブ,およびこれらcDNA由来のポリヌクレオチドから合成されたプローブによって検出された,HCV由来のcDNAは,単離されたポリヌクレオチドを,適当な制限酵素で切断することによって,クローンから単離し,配列を決定することができる。例えば,クローン5−1−1中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単離と配列決定とに使用される手法については,IV.A.3節およびIV.A.4節を;クローン81中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単離と配列決定とについては,IV.A.5〜IV.A.7節を;そして,他のクローン(クローン36)およびクローン81と重複するクローンの単離と配列決定とについては,IV.A.8節およびIV.A.9節を参照されたい。
これらの重複HCV cDNA由来の配列情報は,ウイルスゲノム内の相同領域と異なる領域とを決定するのに有用であり,このことにより,異なる種類のゲノムおよび/または欠陥粒子(defective particles)の集団の存在を示すことができる。II.G.節に記載の手法を利用して,HCVの単離(後述する)中に,生物学的試料中のHCV,HCV抗原またはHCV核酸を検出することはまた,ハイブリダイゼーションプローブを設計するのに有用である。さらに,重複cDNAは,クローン5−1−1,36,81,91および1−2内ならびにIV.A.節に記載の他のクローン内にコードされているポリペプチドをコードするHCVゲノム由来のポリペプチドの発現ベクターを作製するのに利用できる。HCVエピトープを有するこれらのポリペプチドを作製する技術と,ポリペプチドに含有されているHCVエピトープに対応する抗体とその用途に関する技術とは,クローン5−1−1,32,35,36,1−2,81および91に含まれるNANBV cDNA配列由来のポリペプチドについて記載され,すでに検討されまた後にも検討される技術と類似する。
クローン5−1−1,32,35,36,81,91,1−2およびIV.A.節に記載の他のクローンに含まれているcDNA配列の群内に,HCVに特有のものと考えられるエピトープを含有する抗原がコードされている。つまり,これらの抗原に対する抗体がHAVもしくはHBVに感染した個体に欠けており,そしてHCVに感染していない個体に欠けている(IV.B.節に示す血清学的データ参照)。さらに,これらのcDNAの配列情報と,HAV,HBV,HDVの配列および遺伝子バンクのゲノム配列とを比較すると,これらのcDNAと上記の起源のポリヌクレオチドの配列とには最小の相同性が存在することが示されている。このように,これらクローンのcDNA内にコードされている抗原に対する抗体は,感染した個体から単離したBB−NANBV粒子を同定するのに用いることができる。さらに,この抗体は,NANBH因子の単離にも有用である。
HCV粒子は,BB−NANBVに感染した個体由来の血清または細胞培養物から,以下のような当該技術分野で公知の方法で単離することができる。公知の方法としては,例えば,沈降法もしくは排除法のようなサイズ識別に基づく方法;密度勾配による超遠心分離法のような密度に基づく方法;ポリエチレングリコールのような試薬による沈澱法;またはアニオンもしくはカチオン交換物質,疎水性によって結合する物質のような種々の物質およびアフィニティカラムのカラムによるクロマトグラフィー法がある。この分離工程中に,HCVの存在は次のような方法で検出できる。すなわち,先に述べたHCV cDNA由来のプローブを用いて,抽出されたゲノムをハイブリダイゼーション分析する方法;または第1〜46図に示すcDNA配列の群内にコードされたHCV抗原に対する抗体および先に述べた重複HCV cDNA配列内にコードされたHCV抗原に対する抗体をプローブとして用いる免疫検定法(II.I.節参照)がある。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく,免疫検定法にこれら抗体を使用する前に精製することが望ましい。クローン5−1−1内にコードされた抗原に対するポリクロ
ーナル抗体の精製法は,IV.E.節に記載されているが,類似の精製法を,他のHCV抗原に対する抗体に利用することができる。
第1〜46図に示すcDNAの群内にコードされたHCV抗原に対する抗体は,固体の支持体に固定されており,免疫アフィニティークロマトグラフィーによるHCVの単離に有用である。免疫アフィニティークロマトグラフィーの手法は,当該技術分野で知られており,例えば,抗体を固体の支持体に固定しその免疫選択活性を保持する方法がある。この方法には,抗体が支持体に吸着されている方法〔例えば,カースタック(Kurstak)のENZYME IMMUNODIAGNOSIS,31〜37頁参照〕および抗体が支持体と共有結合されている方法がある。一般に,これらの方法は,抗原を固体支持体に共有結合させて使用する方法と同様であり,それはII.C.節に概略記載されているが,スペーサー茎が二官能性のカップリング試薬に含まれ,抗体の抗原と結合する部位が近づきやすいようになっている。
精製処理中に,HCVの存在が,すでに述べた第1〜46図に示すHCV cDNA配列の群および重複HCV cDNA配列由来のポリヌクレオチドをプローブとして利用する核酸ハイブリダイゼーション法によって検出および/または確認される。この場合,画分は,ウイルス粒子の崩壊を起こすような条件下で,例えば,キレート試薬の存在下およびII.H.節にも記載したハイブリダイゼーション法によって検出されるウイルス核酸の存在下で,界面活性剤によって処理される。単離された粒子がHCVを誘発する因子であるということは,単離されたウイルス粒子をチンパンジーに感染させ,次いでNANBHの徴候が感染によるものであるか否かを決定することによって確認することができる。
次に,精製された調製物から得たウイルス粒子は,さらに特性決定される。そのゲノム核酸が精製された。このゲノム核酸がRNaseに対して感受性でDNase Iに感受性でないことから,そのウイルスがRNAゲノムで構成されていることが明らかである(後述のIV.C.2.節参照)。そのゲノム核酸のストランドの状態(strandedness)および円形性(circu larity)であるか非円形性であるかということは,公知の技術,例えばそれを電子顕微鏡により視覚化すること,密度勾配により移動させること,および沈降特性を調べることによって測定される。捕捉されたHCVゲノムがHCV cDNAの負のフトランドとハイブリダイズすることから,HCVは正のストランドのRNAゲノムを含むことが明らかである(IV.H.1節参照)。このような手法は,例えば,METHODS IN ENZYMOLOGY に記載されている。さらに,精製された核酸は,クローン化され,公知の方法(例えば,ゲノム物質はRNAなので逆転写法)によって配列を決定することができる。例えば,マニアティス(1982年),およびグローバー(Glover)(1985年)の文献を参照されたい。ウイルス粒子由来の核酸を利用すれば,それが切断されていてもいなくても,全ゲノムの配列を決定することができる。
14iから39cまでの結合クローン(第29〜34図参照)の連続ORF内にコードされたポリペプチドの相同性の試験を行うと,HCVポリペプチドが,フラビウイルス(flaviviruses)の保存された領域内の対応するタンパクと相同性のある領域を有することが示される。この具体例は,IV.H.3.節に示されている。この知見には,多くの重要な効果がある。第1に,この情報は,HCVが正のストランゲノムを有し,その大きさが約10,000ヌクレオチドであることを示す試験結果とともに,HCVがフラビウイルスかまたはフラビ様ウイルスであることを示唆していると考えて矛盾しない。一般に,フラビウイルスのビリオンとゲノムとは,比較的変化しない構造と組織を有し,このことは公知である。ライスら(Rice et al)(1986年),およびブリントン エム エー(Brinton M.A.),(1988年)を参照されたい。従って,ポリペプチドC.プレM/MおよびEをコードする構造遺伝子は,クローン1
4iの上流の遺伝子の5’末端に位置し得る。さらに,他のフラビウイルスと比較することによって,これらのタンパクをコードする配列の正確な位置を予想することができる。
クローン14iのゲノムの上流の配列の単離は,本明細書に示した多くの方法により達成され得,そのことは,当業者に自明である。例えば,ゲノム“ウォーキング法(genome“Walking”technique)が,クローン14i内のゲノムの5’側にありそのクローンと重複する他の配列を単離するのに用いられ得るが,この方法によって,付加的な配列の単離が行われる。この手法は,後述のIV.A.節で十分に述べられている。例えば,フラビウイルスは,保存されたエピトープと保存された核酸配列の領域とを有することが知られている。保存された配列を含むポリヌクレオチドは,HCVゲノムを捕捉するプローブとして用いて,それを単離することができる。さらに,これらの保存された配列は,第25図に示すHCV cDNA由来の配列とともに,ポリメラーゼの連鎖反応の技術を用いて,クローン14iの配列の上流のゲノム配列を増幅する系に使用するプライマーを設計するのに利用される。この例は後述される。
HCVの構造もまた,決定され,その成分が単離され得る。その形態と大きさは,例えば電子顕微鏡によって決定され得る。コート抗原もしくはエンベロープ抗原のような特異的なウイルスポリペプチド抗原,または核酸結合タンパク,コア抗原のような内部抗原,およびポリヌクレオチドポリメラーゼの同定と位置決定とは,例えば,抗原が大きなもしくは小さなウイルス成分として存在するか否かを測定すること,および単離されたcDNA内にプローブとしてコードされた特異的抗原に対する抗体を利用すること,によって行なわれ得る。この情報は,ワクチンを設計するのに有用である。例えば,ワクチン調製物に外部抗原を含有させることが好ましい。多価ワクチン(multivalent vaccine)は,例えばEのような構造タンパクをコードするゲノム由来のポリペプチド,および例えば非構造ポリペプチドもしくは構造ポリペプチドのような,ゲノムの 別の部分由来のポリペプチドで構成されていてもよい。
II.K.HCV 複製用の細胞培養系と動物モデル系
HCVがフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスであるという示唆によって,HCV増殖法についての情報が提供される。“フラビ様”という用語は,そのウイルスが,フラビウイルスの公知の保存された領域に対して有意の相同性を示し,そして,そのゲノムの大部分が単一のORFであることを意味する。フラビウイルスの培養法は,当業者に公知である〔例えば,ブリントン(1986年)およびストラー,ブイ(Stollar,V.)(1980年)の総論を参照されたい〕。一般に,HCVを培養するのに適切な細胞もしくは細胞としては,フラビウイルスの複製を維持することが知られているもの,例えば次のものがある:サル腎臓細胞系(例えば,MK,VERO);ブタの腎臓細胞系(例えば,PS);ベビーハムスターの腎臓細胞系(例えば,BHK);ネズミマクロファージ細胞系(例えば,P388D1,MK1,Mm1);ヒトマクロファージ細胞系(例えば,U−937);ヒト末梢白血球;ヒトの付着性単球;肝細胞もしくは肝細胞系(例えば,HUH7,HEPG2);胚もしくは胚細胞系(例えば,ニワトリの胚繊維芽細胞);または無脊椎動物由来の細胞系。上記無脊椎動物由来の細胞系として好ましいのは昆虫由来のもの(例えば,ショウジョウバエの細胞系)であり,さらに好ましいのは節足動物由来のもので,例えば蚊の細胞系〔例えば,A.アルボピクツス(A.Albopictus),イーデス イージプチー(Aedesaegypti),クーテックス トリテニオリンクス(Cutex tritaeniorhynchus)〕もしくはダニ細胞系〔例えば,RML−14 ダーマセンター パルマペルツス(Dermacentor parumapertus)〕である。
一次肝細胞を培養しついでHCVに感染させてもよいし,あるいは肝細胞培養物を感染した個体(例えば,ヒトもしくはチンパンジー)の肝臓から得てもよい。後者の場合は,
生体内で感染した細胞が生体外で継代された例である。さらに,種々の永久増殖細胞化法を,肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いることができる。例えば,一次肝臓培養物(肝細胞集団の集積の前後)は,種々の細胞と融合され,安定性を保持する。例えば,永久的または半永久的細胞系を創製するために,培養物を,形質転換ウイルスに感染させるか,または形質転換遺伝子でトランスフェクトさせる。さらに,例えば,肝臓培養物中の細胞は,融合されて,確立された細胞系(例えば,HepG2)となり得る。細胞融合法は,当該技術分野で既知であり,例えば,ポリエチレングリコール,センダイウイルスおよびエプスタイン−バールウイルスのような融合因子が使用される。
上記で述べたように,HCVはフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスである。従って,細胞系のHCV感染は,おそらく,細胞をフラビウイルスに感染させる当該技術分野で公知の方法によって達成することができる。これらの方法には,例えば,細胞内にウイルスが侵入しうる条件下で,細胞をウイルス調製物とともにインキュベートする方法がある。さらに,細胞を単離されたウイルスポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによってウイルスの産生物を得ることができる。トガウイルス(Togavirus)およびフラビウイルスのRNAが,種々の脊椎動物の細胞系〔フェファーコーン(Pfefferkorn)およびシャピロ(Shapiro),1974年〕および蚊細胞系〔ペレーグ(Peleg),1969年〕に感染性であることが知られている。組織培養細胞を,RNA二本鎖,正のストランドのRNAおよびDNA(cDNAを含む)でトランスフェクトする方法は,当該技術分野では公知であり,例えば,エレクトロポーレーション法(electroporation),およびDEAE−デキストラン(DEAE−Dextran)もしくはリン酸カルシウムによる沈降法を用いる手法がある。HCV RNAの多くの起源を,完全ゲノムに対応するHCV cDNAの転写を生体外で行うことによって得ることができる。この物質もしくはクローン化されたHCV cDNAを用いたトランスフェクションによって,ウイルスが複製されそしてウイルスが生体外で増殖するようになるはずである。
培養細胞に加えて,動物モデル系がウイルス複製に使用できるが,フラビウイルスが動物系に存在するということは,当業者には公知である〔例えば,モナース(Monath)による総説(1986年)参照〕。従って,HCVの複製は,チンパンジーで起こるだけでなく,例えば,マーモセットやサックリングマウスでも起こる。
II.L.HCVに対する抗ウイルス剤のスクリーニング
HCVの細胞培養物と動物モデル系とを利用することによって,HCVの複製を阻害する抗ウイルス剤,特に優先的に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング法は,当業者には知られている。一般に,抗ウイルス剤は,ウイルスの複製を維持する細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と,動物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害する効果(および低レベルの毒性)について種々の濃度で試験される。
HCV抗原とHCVポリヌクレオチドを検出するためのここに記載された方法と組成物は,ウイルス複製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方法として,細胞プラーク検定法もしくはID50検定法の代わりにこれらの方法よりもおそらく高感度の方法を提供することから,抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。例えば,ここに記載したHCVポリヌクレオチドプローブは,細胞培養で産生されたウイルス核酸を定量するのに利用できる。このことは,例えば感染した細胞の核酸と標識したHCVポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションまたは競合ハイブリダイゼーションによって達成することができた。例えば,また抗HCV抗体は,本明細書に記載の免疫検定法を利用して細胞培養物中のHCV抗原を同定および定量するのに利用できる。さらに,感染細胞の培養物中のHCV抗原を競合検定法で定量することは望ましいことであるから,本明細書に記載
したHCV cDNA内にコードされたポリペプチドは,これらの競合検定法に有用である。一般に,HCVcDNA由来の組換え体HCVポリペプチドに標識化し,この標識化ポリペプチドとHCVポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によって阻害されるのを監視する。さらに,これらの方法は,HCVが細胞系内で細胞死を起こすことなく複製できる場合,特に有用である。
II.M.弱毒化されたHCV株の調製
上記のことに加えて,組織培養系および/または動物モデル系を利用して弱毒化されたHCV株を単離することができる。これらの株は,ワクチン用もしくはウイルス抗原単離用に適している。弱毒化ウイルス株は,細胞培養および/または動物モデルでの複数の継代の後に単離可能である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検出は,当該技術分野で公知の方法で達成できる。それには,例えば,HCVにコードされたひとつまたはそれ以上のエピトープに対する抗体をプローブとして用いること,あるいは,少なくとも約8個のヌクレオチドのHCV配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いることが包含される。その代わりにあるいはそれに加えて,弱毒化株は,本明細書に記載のHCVのゲノム情報と,組換え技術を利用して構築することができる。一般に,例えば病原に関連するポリペプチドをコードするがウイルスの複製は可能であるようなゲノム領域を除去することを試みることができる。さらに,このゲノム構築によって,HCVに対する抗体の中和を起こさせるエピトープの発現が可能になる。次いで,変化させたゲノムは,HCV複製が可能な細胞と,ウイルス複製が可能な条件下で増殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒化HCV株は,ワクチン製造のみならずウイルス抗原の商業的生産ソースとしても有用である。その理由は,これらウイルスの処理が,ウイルス生産を行う従業員に対してそれほど厳重な保護対策をとらなくてもよいからである。
III.一般的方法
ウイルスからのゲノムの抽出,cDNAライブラリーの調製とプロービング,クローンの配列決定,発現ベクターの構築,細胞の形質転換,ラジオイムノアッセイおよびELISA検定法のような免疫検定の実施,培地での細胞の培養などに用いられる一般的な方法は,当該技術分野で公知であり,これらの方法を記載した実験室のマニュアルを入手することができる。しかし,一般的な指針として,上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
III.A.宿主および発現制御配列
原核および真核の宿主細胞は,指定された宿主に適合する適切な制御配列が用いられた場合に,所望のコード配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち,エシェリヒア コリ(E.coli)が最も汎用される。原核細胞の発現制御配列には,必要に応じてオペレーター部分を有するプロモーター,およびリボソーム結合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスファーベクターは,通常,例えば次のようなものに由来する。つまり,アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるpBR322および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有する種々のpUCベクター由来である。これらのマーカーは,適宜選択することによって,好適な形質転換細胞を得るのに利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配列には,β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系〔チャンら(Chang et al),1977年〕,トリプトファン(trp)プロモーター系〔ゴーデルら(Goeddel et al),1980年〕およびλ由来PプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケら(Shimatake et al),1981年〕,およびtrpおよびlac UV5プロモーターの配列由来のハイブリッドtacプロモーター〔ド ボールら(DeBoer et al),1983年〕がある。上記の系は,特にE.coliに適合する。必要であれば,バシラスもしくはシュードモナス属の菌株のような他の原核宿主を,対応する制御配列とともに用いてもよい。
真核宿主としては,酵母および培養系内の哺乳動物の細胞がある。サッカロミセス セレビシエ( Saccharomyces cerevisiae)およびサッカロミセス カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)が最も普通に用いられる酵母宿主であり,便利な真菌宿主である。酵母に適合するベクターは,栄養要求突然変異体に原栄養性を与えるかまたは野生型菌株に重金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転換された形質転換体を選択することができるようにするマーカーを保有する。酵母に適合するベクターとしては,2ミクロンの複製起源〔ブローチら(Broach et al),1983年〕,CEN3およびARS1の組み合わせ,または確実に複製を行わせる他の手段(例えば,適切なフラグメントを宿主細胞のゲノムに組込ませるような配列を採用することができる。酵母ベクターの制御配列は,当該技術分野で公知であり,解糖酵素合成のプロモーター〔ヘスら(Hess et
al),1968年;ホーランドら(Holland et al),1978年〕を含み,このようなプロモーターには,3−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン(Hitzeman),1980年〕に対するプロモーターが含まれる。ターミネーターには,例えばエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター〔ホーランド(Holland),1981年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は,グリセルアルデヒド3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素(ADH)調節性プロモーター,GAPDH由来のターミネーター,および分泌が所望の場合には,酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さらに,作動可能に連結されている転写調節領域および転写開始領域は,野生型生物に本来関係しないものであってもよい。これらの系については,欧州特許公開第120,551号(1984年10月3日公開);同第116,201号(1984年8月22日公開);および同第164,556号)(1985年12月18日公開)に詳細に記載されており,これらはすべて本発明の出願人によるものであり,本願に引用文献として記載する。
発現のために宿主として利用可能な哺乳類の細胞系は当該技術分野で知られており,the American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの永久増殖化細胞系がある。それには,Hela細胞,チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞,ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞および多くの他の細胞系がある。哺乳類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技術分野では公知であり,それには,シミアンウイルス40(SimianVirus)(SV40)〔フィアース(Fiers),1978年〕,ラウス肉腫ウイルス(RSV),アデノウイルス(ADV)およびウシ乳頭腫ウイルス(BPV)由来のプロモーターのようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた,ターミネーター配列およびポリA付加配列を必要とし,発現を増大させるエンハンサー配列も含まれ,そして,遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましい。これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類の細胞で複製させるのに適切なベクターには,ウイルスレプリコン,またはNANBVエピトープをコードする適当な配列を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。
III.B.形質転換
形質転換は,ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例えば,ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージングし,次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用される形質転換法は,形質転換すべき宿主に依存する。例えば,E.coli宿主細胞を,BB−NANBV配列を有するλgt11で形質転換することが後述の実施例の項で述べられている。直接取込み法による細菌の形質転換には,一般に,塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン(Cohen),1972年;マニアティス,1982年〕。直接取込み法による酵母の形質転換は,ヒネンら(Hinnen et al),1978年,の方法を用いて行われ得る。直接取込み法によ
る哺乳類の形質転換は,グラハム(Graham)およびファン デル エプ(Van der Eb)1978年,のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ得る。
III.C.ベクターの構築
ベクターの構築には,当該技術分野で公知の技術が用いられる。部位特異的なDNAの切断が,適切な制御酵素を用い,これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定されている条件下で処理することによって,実施される。一般に,約1μgのプラスミドもしくはDNA配列は,約20μlの緩衝溶液中で1単位の酵素を用いて37℃の条件下で1〜2時間インキュベートすることにより切断される。制限酵素とともにインキュベートした後,タンパクを,フェノール/クロロホルムによって抽出して除去し,エタノールで沈澱させてDNAが回収される。切断断片は,Methodsin Enzymology,65巻,499〜560頁,1980年,に記載された一般的な方法に従って,ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法により分離することができる。
粘着末端を有する切断断片は,混合物に存在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート(dNTP)の存在下で,E.coli DNAポリメラーゼI(クレノー)を用いて平滑末端とされ得る。S1ヌクレアーゼによる処理も行なわれ得,一本鎖DNA部分の加水分解が行われる。
T4 DNAリガーゼとATPとを用いて標準の緩衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘着末端の連結には,平滑末端の連結よりも,ATPおよびリガーゼの必要量が少ない。ベクター断片が連結混合物の一部として用いられる場合には,ベクター断片は,細菌アルカリホスファターゼ(BAP)または子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理され,5’末端のリン酸を除去して,ベクターの再連結を防止することが多い。あるいは,不必要な断片の制限酵素による切断を利用して連結を防止するのに利用することができる。
連結混合物は,E.coliのような適切なクローニング宿主に形質転換され,次いで,例えば,抗生物質耐性によって成功裏に形質転換された形質転換体が選択され,そして正しい構築物がスクリーニングされる。
III.D.所望のDNA配列の構築
合成オリゴヌクレオチドは,ワーナー(Warner)(1984年)が発表した自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。必要に応じて,合成DNA鎖は,反応の標準条件を用いて,32P−ATPの存在下,ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって32Pで標識化され得る。
DNA配列は,cDNAライブラリーから単離されたものも含めて,公知の方法で修飾することができる。そのような方法としては,例えば,ゾラー(Zoller)(1982年)が発表した部位特異的変異誘発法がある。概略を述べると,修飾すべきDNAを,一本鎖配列としてファージにパッケージングし,次にプライマーとして,修飾すべきDNAの部分に相補的であり,それ自体の配列内に所望の修飾が含まれている合成オリゴヌクレオチドを用いて,DNAポリメラーゼで二本鎖DNAに変換する。得られた二本鎖DNAは,ファージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物(ファージの各鎖の複製物を含む)は,寒天にプレートされてプラークが得られる。理論的には,新しいプラークの50%が,変異した配列を有するファージを含有し,残りの50%はもとの配列を有する。プラークのレプリカは,正しいストランドとハイブリダイゼーション可能であり,かつ未修飾の配列とはハイブリダイゼーションを行わない温度および条件下で,標識化された合成プローブとハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイゼ
ーションにより同定された配列は,回収されクローン化される。
III.E.プローブによるハイブリダイゼーション
DNAライブラリーは,グリンスタイン(Grunstein)およびホッグネス(Hogness)(1975年)の方法を用いてプローブ化され得る。簡単にのべれば,この方法においては,プローブ化されるべきDNAは,ニトロセルロースフィルター上に固定され,変性され,そして,0〜50%ホルムアミド,0.75M NaCl,75mM
クエン酸ナトリウム,各々0.02%(wt/v)のウシ血清アルブミン,ポリビニルピロリドンおよびフィコール,50mMリン酸ナトリウム(pH6.5),0.1% SDS,そして100μg/mlキャリアの変性DNAを含有する緩衝液で,プレハイブリダイゼーションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度(%),およびプレハイブリダイゼーションおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件は,必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど必要ではない条件下でのオリゴマーのプローブは,一般に,ホルムアミドが低い濃度であり,低温および長いハイブリダイゼーションの時間で用いられる。cDNAもしくはゲノムの配列由来のような30もしくは40を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いるときには,一般に,例えば,約40〜42℃のような高温,および50%ホルムアミドのような高濃度が採用される。プレハイブリダイゼーションに続いて,5’末端32Pで標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し,この混合物中で,ハイブリダイゼーションの条件下にて,上記フィルターをインキュベートする。洗浄後,処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示される。もとの寒天プレート上の,対応する位置のDNAを所望のDNAの起源として利用する。
III.F.構築物の確認および配列決定
常套手段により,ベクターを構築する際には,連結混合物を用いてE.coli HB101株もしくは他の適当な宿主を形質転換し,成功裏に形質転換された形質転換体は,抗生物質耐性もしくは他のマーカーによって選択される。次に,得られた形質転換体から,プラスミドが,クレウェルら(Clewell et al.)(1969年)の方法により調製され,通常,さらに,クロラムフェニコールによる増幅(クレウェル,1972年)が行なわれる。そのDNAは,単離され,通常,制限酵素分析法および/または配列決定法により分析される。配列決定は,サンガー(Sanger)ら(1977)の,そしてさらにメシング(Messing)らにより述べられた(1981年),ジデオキシ法,あるいはマキシムらの方法(1980年)により実施され得る。GCに富んだ領域において時おり観察されるバンドコンプレッションの問題は,バールら(Barr et
al)(1986年)の方法に従って,T−デアゾグアノシン(deazo−guanosine)を用いることによって克服された。
III.G.酵素連結イムノソルベント検定法(ELISA法)
ELISA法は,抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は,酵素と,抗原もしくは抗体との結合に依存し,定量の標識として,結合した酵素の活性を用いる。抗体を測定するには,既知の抗原を固相(例えば,マイクロプレートまたはプラスチック製カップ)に固定し,被検血清の希釈物とともにインキュベートし,洗浄し,酵素で標識した抗免疫グロブリンとともにインキュベートし,再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は,当該技術分野で公知であり,例えば,西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は,特異的な基質を添加し,そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定することによって測定される。結合した酵素の活性は,結合した抗体の量の一次関数である。
抗原を測定するには,既知の特異的抗体を固相に固定し,抗原を含む被検物質を添加し,インキュベートした後,固相を洗浄し,第2の酵素で標識した抗体を添加する。洗浄後,基質を添加し,次いで酵素活性を比色法で測定し,抗原濃度に換算する。
以下に述べるのは本発明の実施例である。この実施例は説明のみを目的として提供するのであって,本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示内容を考慮すると,特許請求の範囲内の多くの実施態様が当業者に明らかである。例えば,IV.A.節に述べる方法は,もし望まれるならば繰り返し得るが,特にその必要はない。なぜなら,本発明により提供される情報に基づいた所望のヌクレオチド配列の構築のための技術が使用可能であるためである。発現はE.coliで例示されているが,III.A.節でより十分に述べたような他の系も使用され得る。ゲノム構造に由来する付加的なエピトープも生産され得,以下に述べるように抗体を生産するのに用いられる。
IV.A.HCV cDNAの調製,単離および配列決定
IV.A.1 HCV cDNAの調製
NANB因子の原材料は,慢性NANBHのチンパンジーから得た血漿プールであった。このチンパンジーは,プールしたヒト血清由来の第8因子濃縮物混入バッチ中のHCVで感染させて得られる別の慢性NANBのチンパンジー由来の血液で,実験的に感染させられている。このチンパンジーの血漿プールは,高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ活性(この活性はHCV感染による肝障害に起因する)を有する多くの個体の血漿試料を合わせて調製されたものである。静脈注射により投与されたこの血清プールの10−6倍希釈液の1mlは,別のチンパンジーにNANBHを引き起こしたので,そのCIDは少なくとも10/mlである。つまり,高いウイルス感染力価を有する。
高力価血漿プール由来のcDNAライブラリーを,以下のようにして調製した。まず,ウイルス粒子を血漿から単離した。血漿の90mlを50mM トリス−HCl(pH 8.0),1mM EDTA,100mM NaCl を含有する溶液 310mlで希釈した。細胞破砕物を,15,000×gで20分間,20℃にて遠心分離することにより除去した。次いで,得られた上清液中のウイルス粒子を,ベックマンSW28ローターで28,000rpm,5時間,20℃にて遠心分離することによりペレットとした。ウイルスゲノムを遊離させるために,ペレットを1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS),10mM EDTA,10mM トリス−HCl(pH 7.5),および2mg/mlのプロテイナーゼKを含有する溶液15mlに懸濁し,その後45℃にて90分間インキュベートすることにより粒子を破砕した。キャリアとして0.8μgのMS2バクテリオファージRNAを添加し,フェノール:クロロホルムの1:1混合液(フェノールは0.5Mトリス−HCl(pH 7.5),0.1%(v/v)β−メルカプトエタノール,0.1%(w/v)ヒドロキシキノリンで飽和させたもの)で上記混合液を4回抽出し,その後クロロホルムで2回抽出することにより核酸を単離した。2.5倍容積の無水エタノールで−20℃にて一晩沈澱させるのに先立って,水層を1−ブタノールで濃縮した。ベックマンSW41ローターで40,000rpm,90分間,4℃にて遠心分離することにより核酸を回収し,0.05%(v/v)ジエチルピロカーボネート処理およびオートクレーブ処理してある水に溶解した。
上記方法により得られた核酸(<2μg)を,17.5mM CHHgOHで変性させた。この変性させた核酸を鋳型として用いてcDNAを合成し,Huynh(1985)により記載されている方法を用いてファージλ−gt11のEcoRI部位にクローン化した。ただし,逆転写酵素によりcDNA第一鎖を合成する間,ランダムプライマーをオリゴ(dT)12−18で置き換えた(Taylor ら(1976))。得られた2本鎖cDNAをセファロースCL−4Bカラムでサイズに従って分画し;平均サイズ約400,300,200,および100塩基対の溶出された物質を,それぞれcDNAプール1,2,3,および4とした。プール3のcDNAから,λ−gt11 cDNAライブラリーを作成した。
プール3から作成したλ−gt11 cDNAライブラリーを,以前にNANBHにかかったことのある患者由来の血清と特異的に結合できるエピトープについてスクリーニングした。結合ヒト抗体を125Iで放射性標識したヒツジ抗−ヒトIg抗血清を用いて検出したことを除いては,Huynhら(1985)の方法を用い,約10個のファージを患者血清を用いてスクリーニングした。5個の陽性ファージが同定され,精製された。次いで,この5個の陽性ファージを,同様の方法を用いて,以前NANBH因子に感染したことのある8人の異なるヒト由来の血清との結合の特異性について試験した。4個のファージが,たった一人のヒト(つまり,ファージライブラリーの最初のスクリーニングに用いられたヒト)の血清と免疫学的に反応するポリペプチドをコードしていた。5番目のファージ(5−1−1)は,8種の試験した血清のうち5種と免疫学的に反応するポリペプチドをコードしていた。さらに,このペプチドは,7人の正常な血液提供者由来の血清と免疫学的に反応しなかった。それゆえ,クローン5−1−1は,NANBの患者由来の血清により免疫学的に特異的に認識されるポリペプチドをコードすることがわかる。
IV.A.2.組換え体ファージ5−1−1におけるHCV cDNAの配列,および該配列内にコードされるポリペプチドの配列
組換え体ファージ5−1−1のcDNAを,Sangerら(1977)の方法により配列決定した。本質的には,cDNAをEcoRIで切断し,ゲル電気泳動を用いてサイズ分画することにより単離した。EcoRI切断フラグメントをM13ベクターであるmp18およびmp19にサブクローン化し(Messing(1983)),Sangerら(1977)のジデオキシ鎖終止法を用いて配列決定した。得られた配列を第1図に示す。
第1図においてコードされるポリペプチドは,HCVcDNAでコードされ,該ポリペプチドが融合しているN−末端のβ−ガラクトシダーゼ部分と同じ翻訳フレーム内にある。IV.A.節で示したように,5−1−1の翻訳オープンリーディングフレーム(ORF)は,NANBHに感染した患者およびチンパンジー由来の血清により特異的に認識されるエピトープをコードする。
IV.A.3.クローン5−1−1のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン5−1−1のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAを,第1図に示すようなクローン5−1−1のHCV cDNAの配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いて,IV.A.1.
節で記述したのと同様に作成したλ−gt11ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。スクリーニングに用いたポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’−TCCCTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT
GAG AGC ACT CTT CCA TCT
CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAGGT−3’。
Huynh(1985)に記載の方法を用いて,λ−gt11ライブラリーをこのプローブでスクリーニングした。約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,このプローブとハイブリダイズした。合成プローブとハイブリダイズしたcDNAを有する3個のクローンに,81,1−2,および91と番号をつけた。
IV.A.4.クローン5−1−1のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン81,1−2,および91の3つのcDNAのヌクレオチド配列は,IV.A
.2.節で述べたのと本質的に同様にして決定した。これらのクローンの配列は,ファージ5−1−1のHCV cDNA配列に関連しており,第2図で示される。第2図は,検出されたHCVエピトープをコードする鎖を示しており,ヌクレオチド配列における相同性が配列間の垂直線により示されている。
クローン化されたHCV cDNAの配列は,オーバーラップ領域で高い相同性を有する(第2図を参照のこと)。しかし,2つの領域には相違がある。クローン1−2の67番目のヌクレオチドはチミジンであるが,他の3つのクローンはこの位置にシチジン残基を有する。しかし,この位置をCまたはTのいずれかが占める場合,同じアミノ酸がコードされるということは注意すべきである。
第二の相違は,クローン5−1−1が,他の3つのクローンには存在しない28塩基対を有することである。これらの塩基対は,5−1−1のcDNA配列の開始部分に存在し,小文字で示されている。後述のIV.D.節で論じるラジオイムノアッセイのデータに基づくと,HCVエピトープはこの28bp領域でコードされ得るということが可能である。
クローン81,1−2,および91に5−1−1の28塩基対が存在しないということは,これらのクローンのcDNAは欠損したHCVゲノムから得られたということを意味し得る;あるいは,28bp領域はクローン5−1−1の末端が人工的に変化したものであり得る。
クローン81および91のヌクレオチド配列における小文字の配列は,単にこれらの配列が他のcDNAで見い出されていないことを示す。なぜならば,これらの領域にオーバーラップするcDNAはまだ単離されていないからである。
クローン5−1−1,81,1−2,および91のオーバーラップしているcDNA由来のHCV cDNA複合配列を,第3図に示す。しかし,この図では,クローン5−1−1に特有の28塩基対は省略されている。この図は,複合HCV cDNAのORF内にコードされるポリペプチドの配列も示す。
IV.A.5.クローン81のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン81 cDNAの配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,以下のようにして行った。IV.A.1.節に記述したようにして調製したλ−gt11 cDNAライブラリーを,クローン81の5’末端配列と相同性を有する合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。クローン81の配列を第4図に示す。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’ CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3’
方法は,Huynh(1985)に記載されているのと本質的に同じであったが,厳密な条件下でライブラリーのフィルターを2回洗浄した。すなわち,5×SSC,0.1% SDS中で55℃にてそれぞれ30分間洗浄を行った。約50,000個のクローンのうち1個のクローンがこのプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する陽性組換え体ファージを単離・精製した。このファージにクローン36という番号を付けた。
クローン81のカルボキシル末端にオーバーラップする下流cDNA配列を,上流cDNA配列の単離に用いたのと同様の方法を用いて単離した。ただし,合成オリゴヌクレオチドプローブをクローン81の3’末端と相同性を有するように調製した。スクリーニン
グに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA
CAG 3’
この後者の配列とハイブリダイズしたcDNAを有する陽性組換え体ファージを単離・精製し,クローン32という番号を付けた。
IV.A.6.クローン36のHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン36のcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節に記述したようにして決定した。このcDNAの二本鎖配列,クローン81のHCVcDNAとオーバーラップする該cDNAの領域,およびORFによりコードされるポリペプチドを第5図に示す。
クローン36のORFは,クローン81でコードされるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内にある。このように,組合せて,クローン36および81におけるORFは大きなHCV抗原の一部を表すポリペプチドをコードする。この推定HCVポリペプチドの配列,ならびに該配列をコードする二本鎖DNA配列(クローン36および81のHCVcDNAの結合ORF由来)を第6図に示す。
IV.A.7.クローン32のHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン32のcDNAのヌクレオチド配列は,クローン5−1−1の配列についてIV.A.2.節で記述したのと本質的に同様にして決定した。配列のデータは,クローン32組換え体ファージのcDNAが,二つの異なる材料原由来であることを示した。
cDNAの一つのフラグメントはHCVゲノム由来の418ヌクレオチドを有し;他のフラグメントはバクテリオファージMS2ゲノム由来の172ヌクレオチドを有していた。このバクテリオファージMS2ゲノムは,λ−gt11血漿cDNAライブラリーの調製の間キャリアとして用いたものである。
HCVゲノムの配列に対応するクローン32のcDNAの配列を,第7図に示す。クローン81の配列とオーバーラップする配列の領域,およびORFによりコードされるポリペプチドもこの図に示す。この配列は,クローン81によりコードされるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内にある一つの連続したORFを有する。
IV.A.8.クローン36のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン36 cDNA の配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,クローン81のcDNAとオーバーラップする配列についてIV.A.5.節に記述したようにして行った。ただし,合成ポリヌクレオチドはクローン36の5’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは,次のようであった:
5’AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG
CCC 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを,クローン35と命名した。
IV.A.9.クローン35のHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン35のcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン36のcDNA配列とオーバーラップした該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第8図に示す。
クローン35は,明らかに一つの連続的なORFを有する。このORFは,クローン36,クローン81,およびクローン32によりコードされるのと同じ翻訳フレーム内で,
一つのポリペプチドをコードする。第9〜10図は,クローン35,36,81,および32にわたって延びている長く連続したORFの配列を,該配列でコードされる推定HCVポリペプチドと共に示す。この配列は,この結合配列は,同じλ−gt11 cDNAライブラリー由来の他の独立したcDNAクローンを用いて確認されている。
IV.A.10.クローン35のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン35 cDNAの配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,クローン36のcDNAとオーバーラップする配列についてIV.A.8.節に記述したようにして行った。ただし,合成ポリヌクレオチドはクローン35の5’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは,次のようであった:
5’ CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを,クローン37bと命名した。
IV.A.11.クローン37bのHCVのヌクレオチド配列
クローン37bのcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン35のcDNAの配列にオーバーラップする該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第11図に示す。
クローン35の5’末端のヌクレオチドはTであるが,クローン37bの対応するヌクレオチドはAである。IV.A.10.節に記述した,クローン37bを単離した工程の間に単離された他の3つの独立したクローン由来のcDNAも,配列決定されている。
これらのクローン由来のcDNAも,この位置にAを有する。このように,クローン35の5’末端のTは,クローニング工程の人工産物であり得る。しばしばcDNA分子の5’末端に人工的に変化したものが生じるということは,公知である。
クローン37bは明らかに,オーバーラップしているクローン35,36,81および32にわたって延びているORFにおいてコードされるポリペプチドの続きであるポリペプチドをコードする,一つの連続的なORFを有する。
IV.A.12.クローン32のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン32の下流のHCVc DNA配列の単離は,以下のようにして行った。まず,クローンclaを,クローン32のHCVcDNA配列のヌクレオチド配列に基づいた合成ハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。方法は,本質的にIV.A.5.節に記述したとおりであった。ただし,合成プローブの配列は次のようであった:
5’AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC
CTT 3’。
クローンcla 由来のヌクレオチド配列を用いて,別の合成ヌクレオチドを合成した。この合成ヌクレオチドは次の配列を有していた:
5’TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA
GCT 3’。
クローンcla 由来の配列をプローブとしてを用いたλ−gt11ライブラリーのスクリーニングは,約50,000個の陽性コロニーのうち1個のコロニーをもたらした。このプローブとハイブリダイズしたクローンを単離・精製し,クローン33bと命名した
IV.A.13.クローン33bのHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン33bのcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン32のcDNAの配列とオーバーラップする該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第12図に示す。
クローン33bは明らかに,オーバーラップしているクローン37b,35,36,81および32のORFの延長である,一つの連続的なORFを有する。クローン33bでコードされるポリペプチドは,これらのオーバーラップしているクローンの延長されたORFでコードされるのと同じ翻訳フレーム内にある。
IV.A.14.クローン37bのcDNAおよびクローン33bのcDNAにオーバーラップするHCVcDNAの単離
クローン37bおよびクローン33bのcDNAにオーバーラップするHCV cDNAを単離するために,これらのクローンのcDNA由来の次の合成オリゴヌクレオチドプローブを用い,本質的にIV.A.3.節に記述した方法を用いて,λ−gt11ライブラリーをスクリーニングした。それぞれ,クローン37bおよび33bの配列にオーバーラップするHCVcDNA配列を有するコロニーを検出するためのプローブは,次のようであった:
5’ CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3’
および
5’ TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,それぞれのプローブを用いて検出された。クローン37bのcDNAの上流にあり,該cDNAにオーバーラップするcDNAを有するクローンを,クローン40bと命名した。クローン33bのcDNAの下流にあり,該cDNAにオーバーラップするcDNAを有するクローンを,クローン25cと命名した。
IV.A.15.クローン40bおよびクローン25cのHCV cDNAのヌクレオチド配列
クローン40bおよびクローン25cのcDNAのヌクレオチド配列は,IV.A.2.節で記述したのと本質的に同様にして決定した。40bおよび25cの配列,クローン37bおよび33bのcDNAにオーバーラップする該配列の領域,およびそこでコードされる推定ポリペプチドを,第13図(クローン40b)および第14図(クローン25c)に示す。
クローン40bの5’末端のヌクレオチドはGである。しかし,IV.A.14.節で記述した,クローン40bを単離した工程の間に単離された他の独立した5個のクローン由来のcDNAも配列決定されている。これらのクローン由来のcDNAもまた,この位置にTを有する。このように,Gはクローニングの結果人工的に変化したものであることを意味し得る(IV.A.11.節の考察を参照のこと)。
クローン25cの5’末端はACTであるが,クローンcla(配列は示していない),およびクローン33bのこの領域の配列はTCAである。この違いはまた,クローン5−1−1の28個の過剰の5’末端ヌクレオチドのように,クローニングの人工産物を意味し得る。
クローン40bおよび25cはそれぞれ,明らかに,以前に配列決定したクローンの連続的なORFの延長であるORFを有する。クローン40b,37b,35,36,81,32,33b,および25cにわたって延びているORFのヌクレオチド配列,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドのアミノ酸配列を,第15〜17図に示す。この図では,可能性のある人工的に変化したものは配列から省かれており,その代わりに,オーバーラップする複数のクローンの非5’末端領域の対応する配列が示されている。
IV.A.16.クローン36,81,および32のcDNAからの複合HCV cDNAの調製
複合HCV cDNAであるC100は,以下のようにして構築した。まず,クローン36,81,および32由来のcDNAをEcoRIを用いて切り出した。各クローン由来のcDNAのEcoRIフラグメントを,ベクターpGEM3−blue(Promega Biotec)のEcoRI部位に個々にクローン化した。クローン36,81,および32由来のcDNAを有する得られた組換え体ベクターを,それぞれpGEM3−blue/36,pGEM3−blue/81,およびpGEM3−blue/32と命名した。適当な方向性を有するpGEM3−blue/81組換え体をNaeIおよびNarIで切断し,大きい(約2850bp)フラグメントを精製した。そしてこの
フラグメントを,pGEM3−blue/36から得た小さな(約570bp)NaeI/NarI制限フラグメント精製物と連結した。このクローン36および81由来のcDNAの複合配列を,これらのクローンのオーバーラップしているcDNAに含まれる,連続的なHCV ORFを有する他のpGEM3−blueベクターを作成するのに用いた。次いで,約680bpのフラグメントを切り離すために,この新しいプラスミドをPvuIIおよびEcoRIで切断した。次いで,このフラグメントを適当な方向性を有するpGEM3−blue/32プラスミドから単離した小さな(580bp)PvuII/EcoRIフラグメントと連結した。そして,クローン36,81,および32由来の複合cDNAを,IV.B.1.節に記述されているベクターpSODcf1をEcoRIで直線化させたものに連結し,これを細菌においてクローン5−1−1を発現するのに用いた。複合HCV cDNAの約1270bpのEcoRIフラグメント(C100)を有する組換え体を選択し,プラスミド由来のcDNAをEcoRIで切断し,精製した。
IV.A.17.クローン14i,11b,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g,および39cのHCV cDNAの単離およびヌクレオチド配列
クローン14i,11b,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g,および39cのHCV cDNAを,IV.A.1.節に記述したHCV cDNAのλ−gt11ライブラリー由来のオーバーラップしたcDNAフラグメントを単離する方法により単離した。使用した方法は,IV.A.3.節に記述したのと本質的に同様であった。ただし,使用したプローブは,最後に単離したクローンのヌクレオチド配列の,複合HCV配列の5’末端および3’末端から設計されたものである。以下に記述するプローブとハイブリダイズするクローンの頻度は,それぞれの場合で約50,000個につき1個であった。
クローン14i,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g,および39cのHCV cDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節に記述したのと同様にして決定した。ただし,クローン5−1−1から単離したcDNAの代わりにこれらのファージから切り出したcDNAを用いた。
クローン33cは,クローン40bのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。クローン40bのヌクレオチド配列は,第13図に示さ
れている。33cを単離するのに用いたプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3’。
クローン33CのHCV cDNA配列,およびクローン40bのHCV cDNA配列とのオーバーラップを,第18図に示す。この図は,該配列でコードされるアミノ酸も示す。
クローン8hは,クローン33cのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3’。
クローン8hのHCV cDNAの配列,およびクローン33cのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ,ならびに該配列でコードされるアミノ酸を,第19図に示す。
クローン7eは,クローン8hのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3’。
クローン7eのHCVcDNAの配列,クローン8hとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第20図に示す。
クローン14cは,クローン25cのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。クローン25cの配列を第14図に示す。クローン14cの単離に用いたプローブは,次の配列を有していた:
5’ ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3’。
クローン14cのHCV cDNAの配列,該配列のクローン25cのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第21図に示す。
クローン8fは,クローン14cのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3’。
クローン8fのHCV cDNAの配列,該配列のクローン14cのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第22図に示す。
クローン33fは,クローン8fに存在するヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3’。
クローン33fのHCV cDNAの配列,該配列のクローン8fのHCVcDNAの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第23図に示す。
クローン33gは,クローン33fのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3’。
クローン33gのHCV cDNAの配列,該配列のクローン33fのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第24図に示す。
クローン7fは,クローン7eのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA
TAA T 3’。
クローン7fのHCVcDNAの配列,該配列のクローン7eとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第25図に示す。
クローン11bは,クローン7fの配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3’。
クローン11bのHCV cDNAの配列,該配列のクローン7fとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第26図に示す。
クローン14iは,クローン11bのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3’。
クローン14iのHCV cDNAの配列,該配列の11bとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第27図に示す。
クローン39cは,クローン33gのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3’。
クローン39cのHCV cDNAの配列,該配列のクローン33gとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第28図に示す。
IV.A.18.HCV cDNAを有する単離クローン由来の複合 HCVcDNA配列
複合HCV cDNA配列を作成するために,前述の単離クローンのHCV cDNA配列を並べた。5’から3’の方向に並べた単離クローンは:14i,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33gおよび39cである。
単離クローン由来の複合HCV cDNA配列,および該配列でコードされるアミノ酸
を,第29〜34図に示す。
複合配列を作成するにあたり,以下の配列の異質性が考慮されている。クローン33cは,クローン40bおよび37cのcDNAとオーバーラップする800塩基対のHCV
cDNAを有する。クローン33cにおいては,他の5つのオーバーラップしているクローンと同様に,789番目のヌクレオチドはGである。しかし,クローン37bにおいては(IV.A.11.節を参照のこと),対応するヌクレオチドはAである。この配列の違いは,該配列でそれぞれGまたはAに対してコードされるアミノ酸は,CYSまたはTYRのいずれかであるという明らかな異質性をもたらす。この異質性は,タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を有し得る。
クローン8hのHCVcDNAの2番目のヌクレオチド残基はTである。しかし,以下に示すように,クローン7eの対応する残基はAであり;さらに,この位置のAは,他の3つのオーバーラップしている単離クローンでも見い出される。このように,クローン8hのT残基は,クローニングの人工的な変化を意味し得る。それゆえ,第29〜34図では,この位置の残基はAとされる。
クローン8fのHCVcDNAの3’末端ヌクレオチドはGである。しかし,クローン33fおよび他の2つのオーバーラップするクローンの対応する残基はTである。それゆえ,第29〜34図では,この位置の残基はTとされる。
クローン33fのHCV cDNAの3’末端配列はTTGCである。しかし,クローン33gおよび他の2つのオーバーラップするクローンの対応する配列はATTCである。それゆえ,第29〜34図では,対応する領域はATTCで示される。
クローン33gのHCV cDNAの4番目のヌクレオチド残基はTである。しかし,クローン33fおよび他の2つのオーバーラップするクローンの対応する残基はAである。それゆえ,第29〜34図では,対応する残基はAで示される。
クローン14iの3’末端はAAである。しかし,クローン11bおよび他の3つのクローンの対応するジヌクレオチドはTAである。それゆえ,第29〜34図では,TA残基が示されている。
他の配列の異質性の解明については,前述で考察している。
複合HCV cDNAを調べると,該cDNAが一つの大きなORFを有することが示される。このことは,ウイルスのゲノムが,翻訳と同時に,またはその後プロセッシングされる大きなポリペプチドに翻訳されるということを示唆する。
IV.A.19.クローン12f,35f,19g,26g,および15eのHCV cDNAの単離およびヌクレオチド配列
クローン12f,35f,19g,26g,および15eのHCV cDNAを,本質的にIV.A.17.節に記述した方法により単離した。ただし,プローブは以下に示すようであった。クローンがこのプローブとハイブリダイズする頻度は,それぞれの場合で約50,000個につき1個であった。これらのクローンのHCV cDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節に記述したようにして決定した。ただし,クローン5−1−1から単離したcDNAの代わりに,指示したクローン由来のcDNAを用いた。
第29〜34図のHCV cDNAの上流のcDNAを有するクローン12fの単離は
,クローン14iのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC
CAA 3’。
クローン12fのHCV cDNA配列,該配列のクローン14iとのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第35図に示す。
第29〜34図のHCV cDNA下流のcDNAを有するクローン35fの単離は,クローン39c のヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3’。
クローン35fの配列,該配列のクローン39cの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第36図に示す。
クローン19gの単離は,クローン35fの3’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC
TCC 3’。
クローン19GのHCV cDNA配列,該配列のクローン35fの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第37図に示す。
クローン26gの単離は,クローン19gの3’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT
GTG 3’。
クローン26gのHCV cDNA配列,該配列のクローン19gの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第38図に示す。
クローン15eは,クローン26gの3’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC
AAC 3’。
クローン15eのHCV cDNA配列,該配列のクローン26gの配列とのオーバーラップ,および該配列でコードされるアミノ酸を,第39図に示す。
この節で記述したクローンは,II.A.節で記述した期間および条件でATCCに寄託されており,以下の受託番号が授与されている。
λ−gt11 ATCC番号 寄託日
クローン12f
クローン35f
クローン15e
前述の単離クローンのHCV cDNA配列は,複合HCV cDNA配列を作成するのに並べられている。5’から3’の方向に並べられた単離クローンは:12f,14i
,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g,および15eである。
単離クローン由来の複合HCV cDNA配列,および該配列でコードされるアミノ酸を,第40〜46図に示す。
IV.A.20.クローン12fのHCV cDNA配列上流のcDNA配列を単離する別の方法
上流の配列の逆転写を開始させるために,クローン12fのHCV cDNA由来の第40〜46図の5’HCV配列のほとんどに基づいて,逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し,HCVゲノムRNA中の対応する配列に結合させるのに用いる。プライマー配列はクローン12fの既知の5’末端配列に近いが,プライマー配列上流のプローブ配列の設計を許容するのに十分に下流である。プライミングおよびクローニングの公知の標準法が用いられる。得られたcDNAライブラリーは,プライミング部位(クローン12fの明らかにされた配列から推定される)の上流の配列を用いてスクリーニングされる。HCVゲノムRNAは,NANBHのチンパンジー由来の血漿または肝臓試料,またはNANBHのヒト由来の類似の試料のいずれかから得られる。
IV.A.21.HCVゲノムの5’末端領域から配列を単離するための,尾部付加(tailing)を利用した別の方法
HCV RNAゲノムの5’最末端配列を単離するために,逆転写の初回cDNA生成物(これは,鋳型RNAにより二本鎖とされる)を,オリゴCで尾部付加処理する。これは,この生成物をCTP存在下でターミナルトランスフェラーゼとインキュベートすることにより行われる。cDNAの第一鎖の相補鎖を生成させる第2回のcDNA合成は,逆転写酵素反応のプライマーとしてオリゴGを用いて行われる。ゲノムHCV RNAの材料源は,IV.A.20.節で記述したのと同様である。ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾部付加処理,および逆転写酵素反応のための方法は,Maniatisら(1982)と同様である。次いで,cDNA生成物をクローン化し,スクリーニングし,そして配列決定する。
IV.A.22.HCVゲノムの3’末端領域から配列を単離するための,尾部付加を利用した別の方法
この方法は,フラビウイルスのRNAのcDNAをクローニングするために以前に使用された方法に基づいている。この方法では,RNAは,3’末端の二次構造を除去するために変性条件に置かれる。そして,その後rATPを基質として用い,ポリAポリメラーゼで尾部付加処理される。ポリAを尾部付加処理したRNAの逆転写は,オリゴdTをプライマーとして用い,逆転写酵素により触媒される。cDNAの第2鎖を合成し,cDNA生成物をクローン化し,スクリーニングし,そして配列決定する。
IV.A.23 大きなcDNAインサートを有するλ−gt11 HCVcDNAライブラリーの作成
λ−gt11ライブラリーを作成し,スクリーニングするのに用いた方法は,IV.A.1.節に記述したのと本質的に同様である。ただし,ライブラリーはセファロースCL−4Bカラムから溶出した大きなサイズのcDNAのプールから作成した。
IV.A.24.プライマーとして合成オリゴマーを用いたHCV cDNAライブラリーの作成
新しいHCV cDNAライブラリーは,IV.A.1.節に記述した感染チンパンジーの血漿プール由来のRNAから,ならびにこの感染動物の肝臓由来のポリARNA画
分から調製されている。cDNAは,GublerおよびHoffman(1983)により記述されているのと本質的に同様にして構築した。ただし,最初のcDNA鎖合成のためのプライマーは,前述のHCVゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであった。クローン11bおよび7eの配列に基づいたプライマーは,それぞれ,
5’ CTG GCT TGA AGA ATC 3’
および
5’ AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3’
であった。得られたcDNAは,λバクテリオファージベクターにクローン化し,配列が第40〜46図のHCV配列に基づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてスクリーニングした。
IV.B.HCV cDNAでコードされるポリペプチドの発現および発現された生成物のHCV誘導抗原としての同定
IV.B.1.クローン5−1−1においてコードされるポリペプチドの発現
クローン5−1−1においてコードされるHCVポリペプチド(IV.A.2.節を参照のこと,前出)を,スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)との融合ポリペプチドとして発現させた。これは,以下のように,クローン5−1−1のcDNAインサートを発現ベクターpSODcf1(Steimerら(1986))にサブクローン化することにより行った。
まず,pSODcf1から単離したDNAをBamHIおよびEcoRIで処理し,これらの制限酵素により作られる直線状のDNAに以下のリンカーを結合させた:
5’ GAT CCT GGA ATT CTG ATAA 3’
3’ GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5’
クローニングの後,インサートを有するプラスミドを単離した。
インサートを有するプラスミドを,EcoRIで切断した。クローン5−1−1のHCV cDNAインサートをEcoRIで切断し,このEcoRI直線化プラスミドDNAに連結した。このDNA混合物を,coli D1210株(Sadlerら(1980))を形質転換するのに用いた。第1図に示した,ORFの発現について正しい方向性を有する5−1−1 cDNAでの組換え体は,制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定により同定した。
IPTGの存在下で細菌を生育させることにより,1個のクローン由来の組換え体細菌が,SOD−NANB5−1−1ポリペプチドを発現するように誘導された。
IV.B.2.クローン81においてコードされるポリペプチドの発現
クローン81に含まれるHCV cDNAを,SOD−NANB81融合ポリペプチドとして発現させた。この融合ポリペプチドをコードするベクターを調製するための方法は,SOD−NANB5−1−1をコードするベクターを作製するのに用いたのと類似の方法であった。ただし,HCV cDNAの材料源はクローン81であり,これはIV.A.3節で記述したように単離され,cDNA配列がIV.A.4節で記述したように決定されたものである。クローン81のHCVcDNAのヌクレオチド配列,および該配列でコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を,第4図に示す。
クローン81のHCVcDNAインサートをEcoRIで切断し,リンカー(IV.B.1.節を参照のこと)を有し,かつEcoRIでの処理により直線化されたpSODcf1に連結した。このDNA混合物を,coli D1210株を形質転換するのに用いた。第4図に示されるORFの発現について正しい方向でクローン81HCV cDNAを有する組換え体を,制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定により同定
した。
IPTGの存在下で細菌を生育させることにより,1個のクローンからの組換え体細菌が,SOD−NANB81ポリペプチドを発現するように誘導された。
IV.B.3.クローン5−1−1においてHCVおよびNANBH関連抗原としてコードされるポリペプチドの同定
クローン5−1−1のHCV cDNA内にコードされるポリペプチドを,NANBHに感染したチンパンジーおよびヒトの血清が融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1と免疫学的に反応することを証明することにより,NANBH関連抗原として同定した。このSOD−NANB5−1−1は,そのN末端にスーパーオキサイドジスムターゼを,そしてそのC末端にフレーム内(in−frame)の5−1−1抗原を有する。この同定は,以下のような“ウェスタン”ブロッティング法(Towbinら(1979))により行った。
IV.B.I.節で記述した,SOD−NANB5−1−1をコードする発現ベクターで形質転換した細菌の組換え体株を,IPTGの存在下で生育させることにより融合ポリペプチドを発現するように誘導した。全部の細菌溶解物を,Laemmli(1970)に従って,SDS存在下でポリアクリルアミドゲルに通して電気泳動を行った。分離されたペプチドは,ニトロセルロースフィルターに移した(Towbinら(1979))。次いで,このフィルターを細片に切断し,この細片を異なるチンパンジーおよびヒトの血清と個々にインキュベートした。結合した抗体は,IV.A.1.節に記述したように,125I−標識ヒツジ抗ヒトIgと共にさらにインキュベートすることにより検出した。
ウェスタンブロットに用いたチンパンジー血清の特徴付け,およびオートラジオグラフィーを行った細片の写真に示される結果を,第47〜48図に示す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片を,急性NANBH(ハッチンソン株)感染(レーン1−16),A型肝炎感染(レーン17−24),およびB型肝炎感染(レーン34−44)の間の異なった時期におけるチンパンジーから得た血清とインキュベートした。レーン25および45は,陽性の対照を示す。該対照では,免疫ブロットを,λ−gt11cDNAライブラリーのオリジナルスクリーニングにおいて組換え体クローン5−1−1を同定するのに用いた(IV.A.1.節を参照のこと)患者由来の血清とインキュベートした。
第48図の対照レーン25および45における目視しうるバンドは,抗体がSOD融合ポリペプチドのNANB5−1−1部分に結合していることを示す。これらの抗体は,単独のSODとの結合を示さない。なぜならば,単独のSODもこれらの試料における陰性の対照として含まれており,SOD−NANB5−1−1融合ポリペプチドよりも有意に速く移動するバンドとして現れるからである。
第47〜48図のレーン1−16は,4匹のチンパンジーの血清試料中の抗体の結合を示し;この血清は,NANBHに感染する直前およびその後の急性感染の期間中に得たものである。図からわかるように,SOD−NANB5−1−1ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体は,感染性のHCV接種材料の投与前および感染の急性期の早い時期に得た血清試料には存在しなかった。ところが,4匹の動物は全て,急性期後期またはその後の時期に,最終的にこのポリペプチドに対する循環抗体を誘導した。番号3および4のチンパンジーの場合の免疫ブロットで観察される付加的なバンドは,宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドによるものであった。
NANBHに感染したチンパンジー由来の血清で得られた結果とは対照的に,融合ポリペプチドのNANB5−1−1部分に対する抗体の発生は,HAVに感染した4匹のチン
パンジーまたはHBVに感染した3匹のチンパンジーでは観察されなかった。これらの場合における唯一の結合は,HCVに感染した試料でも生じる,宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドであった。
ウェスタンブロットに用いたヒト血清の特徴付け,およびオートラジオグラフを行った細片の写真に示される結果を,第49〜50図に示す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片を,NANBH(レーン1−21),HAV(レーン33−40),およびHBV(レーン41−49)に感染している間の異なった時期におけるヒトから得た血清とインキュベートした。レーン25および50は,陽性の対照を示す。該対照では,免疫ブロットを,前述のλ−gt11ライブラリーのオリジナルスクリーニングで用いた患者由来の血清とインキュベートした。レーン22−24および26−32は,血清を“正常な”血液提供者から得た,“非感染の”対照を示す。
第49〜50図からわかるように,λ−gt11ライブラリーをスクリーニングするのに用いた血清を含む9人のNANBH患者由来の血清は,融合ポリペプチドのNANB5−1−1部分に対する抗体を含有していた。NANBHの3人の患者由来の血清は,これらの抗体を含有しなかった。これらの患者に抗NANB5−1−1抗体が将来発生する可能性はある。異なったNANBV因子に起因するこの反応の欠如が,非反応血清を採取した個体に病気を引き起こし得ることもまた,可能である。
第49〜50図はまた,HAVおよびHBVに感染した多くの患者由来の血清が抗NANB5−1−1抗体を含有していないこと,およびこれらの抗体は“正常な”対照由来の血清にも存在しないことも示す。あるHAV患者(レーン36)は抗NANB5−1−1抗体を有するように見えるが,この患者は以前にHCVに感染していたということが可能である。なぜならば,NANBHの発生率は非常に高く,しばしば潜在性であるからである。
これらの血清学的な研究は,BB−NANBVに感染した患者および動物由来の血清により特異的に認識されるエピトープを,クローン5−1−1のcDNAがコードすることを示している。さらに,cDNAは霊長類のゲノム由来ではないらしい。クローン5−1−1またはクローン81から作製されたハイブリダイゼーションプローブは,唯一のシングルコピー遺伝子が検出され得る条件下で,非感染個体由来の対照のヒトおよびチンパンジーのゲノムDNAの“サザン”ブロットにハイブリダイズしなかった。これらのプローブはまた,対照のウシのゲノムDNAのサザンブロットにもハイブリダイズしなかった。
IV.B.4.クローン36,81および32の複合HCV cDNAにおいてコードされるポリペプチドの発現
クローン36,81および32にわたるORFでコードされるHCVポリペプチドを,SODとの融合ポリペプチドとして発現させた。これは,複合cDNAであるC100をヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する発現カセットに挿入すること,発現カセットを酵母の発現ベクターに挿入すること,および酵母でポリペプチドを発現させることにより行った。
クローン36,81および32由来の複合C100 cDNAを有する発現カセットを,約1270bpのEcoRIフラグメントをベクターpS3−56(pS356とも呼ばれる)のEcoRI部位に挿入することにより構築し,プラスミドpS3−56C100を作製した。C100の構築は,前述のIV.A.16節に記述されている。
pBR322の誘導体であるベクターpS3−56は,ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子上流のADH2/GAPDHハイブリッド酵母プロモーター,および下流
のGAPDH転写終結信号を含む発現カセットを有する。これらの制御要素およびスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する同様のカセットは,Cousensら(1987),および本発明の出願人による同時係属のヨーロッパ特許出願第196,056号(1986年10月1日公開)に記載されている。しかしながら,pS3−56のカセットはCousensら(1987)のカセットとは異なる。pS3−56のカセットには,異種のプロインシュリン遺伝子および免疫グロブリンのヒンジが欠失しており,かつスーパーオキサイドジスムターゼのgln154にEcoRI部位を有するアダプター配列が続いている。このアダプターの配列は次のようである:
5’−AATTTG GGA ATT CCA TAA TGA G −3’AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT。
EcoRI部位は,カセットを有するベクターから発現する場合には,次のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドリンカーを介してスーパーオキサイドジスムターゼに融合するポリペプチドを生じる,異種配列の挿入を可能にしている:
−asn−leu−gly−ile−arg−。
pS356の試料は,ブタペスト条約のもとに1988年4月29日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC),12301 Parklawn Dr.,Rockville,Maryland 20853に寄託されており,受託番号第67683号が与えられている。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入手方法,ならびに寄託物の保持については,NANBV−cDNAを有する株についてII.A.節で明記したのと同様である。この寄託は便宜のみを意図しており,本明細書の記述により本発明を実施するためのものではない。この寄託物を,参照としてここに引用する。
正しい方向でC100 cDNAインサートを有する組換え体を単離した後,C100
cDNAを有する発現カセットをpS3−56C100からBamHIで切り出し,このカセットを有する約3400bpのフラグメントを単離・精製した。次いで,このフラグメントを酵母ベクターpAB24のBamHI部位に挿入した。
重要な特徴を第51図に示すプラスミドpAB24は,複製のための完全な2μ配列[Broach(1981)]およびpBR322配列を有する酵母シャトルベクターである。
このプラスミドは,プラスミドYEp24[Botsteinら(1979)]由来の酵母URA3遺伝子,およびプラスミドpC1/1由来の酵母LEU2d遺伝子も有する。EPO公開第116,201号公報。プラスミドpAB24は,部分的な2μ配列を除去するためにYEp24をEcoRIで消化し,このベクターを再連結することにより構築した。得られたプラスミドYEP24deltaRIを,ClaIで切断することにより直線化し,ClaIで直線化されている完全な2μプラスミドと連結した。次いで,得られたプラスミドpCBouをXbaIで切断し,8605bpのベクターフラグメントをゲルで単離した。この単離されたXbaIフラグメントを,pC1/1から単離されたLEU2d遺伝子を有する4460bpのXbaIフラグメントと連結した。このLEU2d遺伝子の方向は,URA3遺伝子と同じ方向である。発現の挿入は,pBR322配列の唯一のBamHI部位であった。従って,テトラサイクリンに対する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻止している。
SOD−C100発現カセットを有する組換え体プラスミドpAB24C100−3を,酵母JSC 308株およびその他の株に導入した。細胞をHinnenら(1978)により記載されているように形質転換し,ura−選択プレートにプレーティングした。単一のコロニーをleu−選択培地に接種し,飽和状態となるまで増殖させた。この培
養物は,1%グルコースを含有するYEPで生育させることにより,SOD−C100ポリペプチド(C100−3と呼ぶ)を発現するように誘導された。
JSC308株は,ADR1遺伝子座に組み込まれている遺伝子型がMAT @,leu2,ura3(del)DM15(GAP/ADR1)である。JSC 308においては,正の活性化遺伝子産物ADR1の過剰な発現は,発現された異種タンパクがADH2 UAS調節システムにより合成される場合には,過度の抑制解除(hyperderepression)(ADR1野生型対照に関連する)と,そのようなタンパクの非常に高い収量とをもたらす。酵母JSC 308株の構築は,係属中の米国特許出願番号(代理人Docket No.2300−0229)に開示されており,この特許出願を本願と同時に出願し,これを参照文献としてここに引用する。JSC 308の試料は,ブタペスト条約の下に1988年5月5日に,ATCCに寄託されており,受託番号第20879号が与えられている。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入手方法,ならびに寄託物の保持については,HCV cDNAを有する株についてII.A.節で明記したのと同じである。
pAB24C100−3でコードされる完全なC100−3融合ポリペプチドは,アミノ末端にヒトSODの154個のアミノ酸と,EcoRI部位を有する合成アダプター由来の5個のアミノ酸残基と,C100 cDNA由来の363個のアミノ酸残基と,クローン32のHCV cDNAに隣接したMS2ヌクレオチド配列由来の5個のカルボキシ末端アミノ酸とを有するはずである。(IV.A.7.節を参照のこと)。SODの最後から2つ目のAla残基で始まる,このポリペプチドのカルボキシ末端の推定アミノ酸配列を,第52〜53図に示す。このポリペプチドのこの部分をコードするヌクレオチド配列も同様に示す。
IV.B.5.C100内にコードされるポリペプチドのNANBH関連抗原としての同定
酵母JSC 308株内のプラスミドpAB24C100−3から発現するC100−3融合ポリペプチドを,サイズについて特徴付けした。そして,C100内にコードされるポリペプチドを,その慢性NANBHのヒト由来の血清との免疫学的反応性によりNANBH−関連抗原として同定した。
IV.B.4.節で記述したように発現するC100−3ポリペプチドは,以下のようにして分析した。酵母JSC 308細胞をpAB24またはpAB24C100−3で形質転換し,外来プラスミドがコードするポリペプチドを発現するように誘導した。培養物(OD650nmが約20)1ml中の誘導酵母細胞を10,000rpmで1分間遠心分離することによりペレットとし,それらを2容量の溶液および1容量のガラスビーズ(直径0.2ミリミクロン)とともに激しく渦巻攪拌(10×1分)することにより細胞溶解させた。この溶液は,50mM トリス−HCl(pH 8.0),1mM EDTA,1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF),および1μg/mlペプスタチンを含有していた。C100−3ポリペプチドを含有する細胞溶解物中の不溶性物質を,遠心分離(10,000rpm,5分間)により集め,LaemmliのSDS試料緩衝液中で5分間煮沸することにより溶解させた。〔Laemmli(1970)を参照のこと〕。誘導された酵母培養物0.3ml中の量に相当する量のポリペプチドを,Laemmli(1970)に従い,SDS存在下で10%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。タンパク標準物質を一緒にゲル電気泳動した。発現されたポリペプチドを含有するゲルは,クマシーブリリアントブルーで染色するか,またはpAB24およびpAB24C100−3から発現されたポリペプチドの免疫学的反応性を決定するために慢性NANBHの患者由来の血清を用いて,IV.B.2.節で記述したような“ウェスタン”ブロットに供した。
結果を第54図に示す。第54図Aでは,ポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した。pAB24で形質転換したJSC308由来の不溶性ポリペプチド,およびpAB24C100−3で形質転換したJSCの異なる二つのコロニー由来の不溶性ポリペプチドを,それぞれレーン1(pAB24),ならびにレーン2および3に示す。レーン2および3とレーン1との比較は,pAB24C100−3で形質転換したJSC 308由来の分子量が約54,000ダルトンに相当するポリペプチドの,誘導された発現を示す。このポリペプチドは,pAB24で形質転換したJSC 308では誘導されない。このポリペプチドを矢印で示す。
第54図(b)は,pAB24(レーン1)またはpAB24C100−3(レーン2)で形質転換したJSC308で発現される,不溶性ポリペプチドのウェスタンブロットの結果を示す。pAB24から発現されるポリペプチドは,NANBHのヒト由来の血清と免疫学的な反応性を示さなかった。しかしながら,矢印で示したように,pAB24C100−3で形質転換したJSC 308は,ヒトNANBH血清と免疫学的に反応する約54,000ダルトンのポリペプチドを発現した。レーン2の,免疫学的に反応性のあるその他のポリペプチドは,この約54,000ダルトンのポリペプチドの分解産物および/または凝集物であり得る。
IV.B.6.融合ポリペプチドC100−3の精製
N末端にSODを,そしてC末端にフレーム内(in−frame)のC100 HCV−ポリペプチドを有する融合ポリペプチドC100−3を,ポリペプチドが発現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分を分別抽出することにより精製した。
融合ポリペプチドC100−3を,IV.B.4.節に記述したように,pAB24C100−3で形質転換した酵母JSC 308株で発現させた。次いで,酵母細胞をホモジナイズすることにより溶解させ,溶解物中の不溶性物質をpH 12.0で抽出した。そして,残った不溶性画分中のC100−3を,SDSを含有する緩衝液に可溶化した。
酵母溶解物を,本質的にNagahumaら(1984)に従って調製した。20mM
トリスHCl(pH 8.0),1mM ジチオスレイトール,および1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する溶液(緩衝液A)中に,33%細胞(v/v)の割合で,酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁液の所定量(15ml)を等量のガラスビーズ(直径0.45−0.50mm)と混合し,この混合物をSuper
Mixer(Lab Line Instruments,Inc.)の最高速度で8分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよびガラスビーズを分離し,もとの細胞沈澱物と同様に,ガラスビーズを等量の緩衝液Aで3回洗浄した。洗浄液とホモジネートとを合わせた後,ホモジネートを7,000×gで15分間,4℃で遠心分離し,ペレットをもとの細胞沈澱物の2倍量に相当する量の緩衝液Aに再懸濁し,7,000×gで15分間遠心分離して物質を再びペレットとすることにより,溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を3回繰り返した。
溶解物からの不溶性物質は,以下のようにしてpH 12.0で抽出した。ペレットを0.5MNaCl,1mM EDTAを含有する緩衝液に懸濁した。ここで,懸濁液の容量は,もとの細胞沈澱物の1.8倍量に相当した。懸濁液のpHは,0.2容量の0.4M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 12.0)を添加することにより調整した。混合した後,懸濁液を7,000×gで15分間,4℃で遠心分離し,上清を除去した。この抽出を2回繰り返した。抽出したペレットは,もとの細胞沈澱物の2倍量に相当する懸濁液量を用い,該ペレットを0.5M NaCl,1mM EDTAに懸濁し,次いで7,000×gで15分間,4℃で遠心分離することにより洗浄した。
ペレット抽出物中のC100−3ポリペプチドは,SDSで処理することにより可溶化した。このペレットをもとの細胞沈澱物の容量の0.9容量に相当する量の緩衝液Aに懸濁し,0.1容量の2%SDSを添加した。懸濁液を混合した後,7,000×gで15分間,4℃で遠心分離した。得られたペレットをSDSで3回以上抽出した。C100−3を含有する,得られた上清をプールした。
この工程により,C100−3は酵母ホモジネートの不溶性画分から10倍以上精製され,ポリペプチドの回収率は50%以上を越える。
融合ポリペプチドの精製調製物は,Laemmli(1970)に従い,ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。この分析に基づくと,ポリペプチドはその純度が80%を越え,見かけの分子量約54,000ダルトンを有していた。
IV.C.HCV cDNAにハイブリダイズする,感染個体のRNAの同定
IV.C.1.HCV cDNAにハイブリダイズする,NANBHのチンパンジーの肝臓内のRNAの同定
以下のように,NANBHのチンパンジーの肝臓由来のRNAは,ノーザンブロットによりクローン81に含有されるHCV cDNAとハイブリダイズする種類のRNAを含有することが示された。
RNAを,高力価の血漿が得られたチンパンジーの肝臓の生検材料から単離した(IV.A.1.節を参照のこと)。これには,哺乳動物細胞からの全RNAの単離,ならびに該RNAのポリA画分およびポリA画分への分離についてManiatisら(1982)に記載された技術を用いた。これらのRNA画分を,ホルムアルデヒド/アガロースゲル(1% w/v)での電気泳動に供し,ニトロセルロース膜に移した。(Maniatisら(1982))。ニトロセルロースフィルターを,クローン81由来の放射性標識HCV cDNA(インサートのヌクレオチド配列については,第4図を参照のこと)とハイブリダイズさせた。放射性標識プローブを調製するために,クローン81から単離したHCV cDNAインサートを,DNAポリメラーゼIを用いたニックトランスレーション(Maniatisら(1982))により32Pで放射性標識した。ハイブリダイゼーションは,10%(w/v)デキストランスルフェート,50%(w/v)脱イオン化ホルムアミド,750mM NaCl,75mM クエン酸ナトリウム,20mM
NaHPO(pH 6.5),0.1%SDS,0.02%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA),0.02%(w/v)フィコール−400,0.02%(w/v)ポリビニルピロリドン,100μg/mlの超音波処理および変性処理によりせん断したサケ精子DNA,および10CPM/mlのニックトランスレーションしたcDNAプローブを含有する溶液中で18時間,42℃で行った。
プローブで処理したフィルターのオートラジオグラフを,第55図に示す。レーン1は,32P−標識した制限フラグメントマーカーを含有する。レーン2−4は,以下のようなチンパンジー肝臓のRNAを含有する:レーン2は,30μgの全RNAを含有し;レーン3は,30μgのポリARNAを含有し;そしてレーン4は,20μgのポリARNAを含有する。第55図に示すように,NANBHのチンパンジーの肝臓は,HCV
cDNAプローブにハイブリダイズし,かつ約5000ヌクレオチドから約11,000ヌクレオチドの大きさと考えられる,ポリARNA分子関連の異種集団を含有する。HCV cDNAにハイブリダイズするこのRNAは,細菌ゲノムおよび/または細菌ゲノムの特異的転写物を意味し得る。
以下のIV.C.2.節に記述した実験は,HCVは一つのRNAゲノムを有するとい
う示唆と一致する。
IV.C.2.感染個体から得た血清中のHCV由来RNAの同定
IV.A.1.節で記述したように,核酸を,高力価のチンパンジーNANBH血漿から単離した粒子から抽出した。単離した核酸の一定量(もとの血漿の1mlに相当する)を,20μlの50mMHepes(pH 7.5),1mm EDTAおよび16μg/ml酵母可溶性RNAに再懸濁した。試料は,5分間煮沸した後,直ちに凍結することにより変性させ,RNaseA(5μl;25mM EDTA溶液,40mMHepes(pH 7.5)に0.1mg/ml RNase Aを含有する)またはDNase I(5μl;10mM MgCl,25mM Hepes(pH 7.5)中に1単位のDNaseIを含有する)で処理した。対照の試料は,酵素なしでインキュベートした。インキュベーションの後,2μg/ml酵母可溶性RNAを含有する230μlの氷冷2×SSCを添加し,試料をニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを,ニックトランスレーションにより32P−標識したクローン81由来のcDNAプローブとハイブリダイズさせた。第56図は,このフィルターのオートラジオグラフを示す。ハイブリダイゼーションのシグナルは,DNase処理試料および対照試料(それぞれ,レーン2および1)で検出されたが,RNaseで処理した試料(レーン3)では検出されなかった。このように,RNase A処理により粒子から単離した核酸が分解され,DNase処理は何の影響もなかったので,この証拠により,HCVゲノムがRNAにより構成されるということが強く示唆される。
IV.C.3.NANBHを有するチンパンジーから得られる肝臓および血漿試料におけるHCV核酸配列由来の増幅HCV核酸配列の検出
NANBHを有するチンパンジーの肝臓および血漿中に存在するHCV核酸,および対照のチンパンジーにおけるHCV核酸は,基本的にSaikiら(1986)が記述したポリメラーゼ鎖反応(PCR)の手法を用いて増幅された。このプライマーオリゴヌクレオチドは,クローン81,あるいはクローン36および37におけるHCV cDNA由来であった。この増幅された配列は,適当なcDNAオリゴマー(これは,2つのプライマーの間の領域を有するが2つのプライマーを含まない)をプローブとして用い,ゲル電気泳動およびサザンブロッティングによって検出された。
増幅系によって調べられるHCV配列を含むRNA試料は,NANBHを保有する3匹のチンパンジーおよび2匹の対照のチンパンジーの肝臓の生体試料から単離された。RNA画分の単離は,IV.C.1節に記載したグアニジウムチオシアネート法により行なった。
増幅系によって調べられるべきRNA試料もまた,2匹のNANBH保有チンパンジーおよび1匹の対照チンパンジー,さらに対照のチンパンジーから得られる貯留した血漿から単離された。1匹の感染チンパンジーは,10と同等かそれを越えるCID/mlを有し,他の感染チンパンジーは,10と同等かそれを越えるCID/mlを有する。
この核酸は,次のようにして血漿から抽出した。血漿の0.1mlのもしくは0.01mlを10μg/mlのポリアデニル酸を含有するTENB/プロテイナーゼK/SDS溶液(0.05M Tris−HCl,pH8.0,0.001 M EDTA,0.1M NaCl,1mg/mlプロテイナーゼK,および0.5% SDS)で最終体積が1.0mlになるように希釈し,37℃にて60分間インキュベートした。このプロテイナーゼKによる分解の後,フェノール飽和TE(10.0mM Tris−HCl,pH8.0,1mM EDTA)を用いた抽出により,脱タンパクした。遠心分離によりフェノール層を分離し,0.1%のSDSを含むTENBで再抽出した。それぞれの抽出で得られる水相をプールし,等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール〔1
:1(99:2)〕溶液で2度抽出し,その後等容量のクロロホルム/イソアミルアルコール(99:1)の混液を用いて,2度抽出した。遠心分離により相分離し,水相を,酢酸ナトリウムの最終濃度が0.2Mとなるようにし,エタノールを2倍量添加することにより核酸を沈澱させた。沈澱した核酸は,SW41のローターで38Kにて4℃で60分間超遠心分離を行なうことにより回収した。
上記に加えて,高力価のチンパンジーの血漿およびプールされた対照の血漿のどちらか一方を,ChomcyzskiおよびSacchi(1987)の方法により,50μgのポリA担体を用いて抽出した。この方法では,酸グアニジウムチオシアナート(acid guanidiniumthiocyanate)抽出を使用する。RNAを,エッペンドルフ マイクロフュージ中で,4℃にて10分間,10,000RPMにて遠心分離することにより,回収した。
2つの場合においては,PCR反応におけるcDNAの合成に先立って,プロテイナーゼK/SDS/フェノール法によって血漿から抽出された核酸は,さらにSおよびSエルチップ−R(SElutip−R)カラムに結合させ,このカラムから溶出させることにより精製した。それに続く工程は製造者の指示により行なった。
PCR反応の鋳型として用いられたcDNAは,上述のように調製された核酸(全核酸または全RNA)から誘導された。エタノール沈澱に続き,沈澱した核酸を乾燥し,蒸留水処理したDEPCに再懸濁した。核酸の2次構造を,試料を65℃にて10分間加温することによって引き離し,そして,速やかに試料を氷で冷却した。cDNAは,肝臓,あるいは10〜100μlの血漿から抽出された核酸(あるいはRNA)から得られる総チンパンジーRNA1〜3μgを用いて合成された。この合成は逆転写酵素を利用し,製造者BRLによって詳細に述べられているプロトコールを用い,25μlの反応液中で行われた。cDNA合成用のプライマーは,後述のPCR反応でもまた利用されているプライマーであった。cDNA合成のすべての反応混合物には,RNAase阻害剤であるRNASINTM(Fisher/Promega)を23U含有していた。cDNA合成に続き,この反応混合物を水で希釈し,10分間煮沸し,氷上ですばやく冷却した。
このPCR反応は,1μgのRNase Aの添加を除いては,製造者(Cetus−Perkin−Elmer)の指示に従って行なった。この反応は,最終容量が100μlとなるように行なわれた。このPCRは,37℃,72℃,および94℃の条件下で,35サイクルにわたって行なわれた。
cDNA合成用プライマーおよびPCR反応プライマーは,クローン81,クローン36,あるいはクローン37bのいずれかにおけるHCV cDNA配列から得られた。(クローン81,36および37bのHCV cDNA配列は,第4図,第5図および第11図にそれぞれ示されている。)クローン81由来の2個の16量体プライマーの配列は次のとおりである:
5’ CAA TCA TAC CTG ACA G 3’
および
5’ GAT AAC CTC TGC CTG A 3’。
クローン36から得られるプライマーの配列は次のとおりである:
5’ GCA TGT CAT GAT GTA T 3’。
クローン37bから得られるプライマーの配列は次のとおりである:
5’ ACA ATA CGT GTG TCA C 3’。
このPCR反応において,このプライマーの対は,クローン81由来の2つの16量体プライマー対;あるいはクローン36由来の16量体プライマーとクローン37b由来の16量体プライマーとの対のいずれによっても構成される。
このPCR反応生産物は,該生産物をアルカリゲル電気泳動にかけサザンブロッティングを行い,プライマーと重複しないHCV cDNA領域由来の32P標識内部のオリゴヌクレオチドプローブにより増幅されたHCV−cDNA配列を検出することによって分析された。このPCR反応混合物をフェノール/クロロホルムで抽出し,核酸を,塩およびエタノールを用いて水相から沈澱さた。沈澱させた核酸を遠心分離で回収し,蒸留水に溶解させた。試料の一部は,1.8%アルカリアガロースゲルで電気泳動を行った。60,108および161のヌクレオチド長の一本鎖DNAを,分子量マーカーとして,同時に電気泳動にかけた。電気泳動後,このゲル中のDNAを,Biorad Zeta ProbeTM紙に移した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション,および洗浄条件は,製造者(Biorad)によって規定される条件に従った。
増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼーション検出に用いられたプローブは次のとおりである。PCRプライマーの対がクローン81由来であるときには,2つのプライマーの配列の間の領域に位置する配列に対応する配列を有する108量体であった。このPCRプライマー対がクローン36および37b由来であるとき,このプローブはクローン35由来の,ニック翻訳されたHCV cDNA挿入物であった。このプライマーはクローン37挿入物の155〜170ヌクレオチドおよびクローン36挿入物の206〜268ヌクレオチド由来である。クローン35におけるHCV cDNA挿入物の3’末端は,クローン36の挿入物の1〜186のヌクレオチドと重複しており,そして,クローン35挿入物の5’末端はクローン37bの挿入物の207〜269ヌクレオチドと重複する。(第5,第8,および第11図を比較されたい。)このように,クローン35中のcDNAの挿入物は,クローン36および37b由来のプライマーの配列間の領域部分にまでおよび,これらプライマーを含む増幅配列のためのプローブとして有用である。
肝臓試料由来のRNAの分析は,プライマーおよびプローブの両セットを利用する上記方法に従って行なった。3匹のNANBH保有チンパンジーの肝臓由来のRNAは,予期されるサイズの増幅配列(81および36および37bにおいて,それぞれ161および586ヌクレオチド)については,ハイブリダイゼーションの結果が陽性であり,他方,対照のチンパンジーについては,ハイブリダイゼーションの結果が陰性であった。この実験を3回繰りかえしたところ同じ結果が得られた。
血漿から得られる核酸およびRNAの分析もまた,クローン81由来のプライマーおよびプローブを利用する上記方法により行なわれた。この血漿は,2匹のNANBH保有チンパンジー由来の血漿,対照のチンパンジー由来の血漿,そして対照のチンパンジーから得られるプールされた血漿である。両NANBH血漿は,核酸/RNAを有し,PCR増幅アッセイで陽性の結果が得られ,他方,両対照血漿は陰性の結果が得られた。これらの結果は数回繰り返して得られた。
IV.D.感染個体由来の血清中のHCV 抗体を検出するためのラジオイムノアッセイ
HCV抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノアッセイは,TsuおよびHe
rzenberg(1980)の方法を基にして開発された。マイクロタイタープレート(Immulon 2,Removawellstrips)をHCVエピトープを有する精製ポリペプチドで被覆する。この被覆プレートは,HCVエピトープに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試料,あるいは適当な対照試料とともにインキュベートされる。インキュベートを行なう間に,抗体が存在するのであれば,該抗体は固相抗原に免疫学
的に結合する。非結合物質を除去し,そしてこのマイクロタイタープレートを洗浄後,ヒト抗体−NANBV抗原複合体は,125I標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートすることによって検出される。結合しなかった標識抗体を吸引によって除去し,そしてプレートを洗浄する。個々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト抗HCV抗体の量はウェル中の放射能に比例する。
IV.D.1.融合ポリペプチドSOD−NANB 5−1−1 の精製
IV.B.1.節に記載の組換え体細菌中で発現する融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1は,組換え体E.coliから,尿素で細胞抽出物を分画抽出することによって,次いで,次のように陰イオンおよび陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかけることによって精製された。
1リッターの培養物から得られる溶解細胞を,0.01M トリス−HCl,pH8.0,を含有する10mlの20%(W/V)シュークロース中に再懸濁し,0.4mlの0.5M EDTA,pH8.0,を添加した。0℃にて5分後,この混合物を4,000×gにて10分間遠心分離した。得られたペレットを0.05M トリス−HCL,pH 8.0 ,1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)およびペプスタチンA 1μgを含有する10mlの25%(W/V)シュークロース液に懸濁させ,次いで,0.5mlのリゾチーム(10mg/ml)を添加し,0℃で10分間インキュベートした。0.05M トリス−HCl,pH8.0,1mM EDTA中に1%(V/V)のトリトンX−100を含む溶液10mlを添加後,この混合液を,時々振盪しながらひきつづき0℃にて10分間インキュベートした。得られた粘稠な溶液を,20ゲージの滅菌皮下注射針を6回通すことにより,ホモジナイズし,13,000×gにて25分間遠心分離した。ペレット化した物質を,0.01M トリス−HCl(pH8.0)5mlに懸濁させ,この懸濁液を,4,000×gにて10分間遠心分離した。SOD−NANB5−1−1融合タンパクを含有するペレットを,0.02M トリス−HCl(pH8.0),1mMジチオスレイトール(緩衝液A)中に6M尿素を含む溶液5mlに溶解させ,緩衝液Aで平衡化したQ−セファロース ファースト フローカラムにかけた。ポリペプチドは,緩衝液AのNaCl中0.0〜0.3Mのリニアグラジエントで溶出した。溶出後,各画分を,SODの存在下,ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分析し,SOD−NANB5−1−1の含量を決定した。このポリペプチドを含有する画分をプールし,0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0),1mMジオチスレイトール,に6M尿素を含む緩衝液(緩衝液B)に対して透析した。この透析試料を,緩衝液Bで平衡化したS−セファロース ファースト フローカラムにかけ,ポリペプチドを緩衝液B中でNaCl 0.0〜0.3Mのリニアグラジエントで溶出させた。この画分を,ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し,SOD−NANB5−1−1の存在を調べ,適当な画分をプールした。このSOD−NANB5−1−1ポリペプチドの最終調製物を,SDSの存在下で,ポリアクリルアミド電気泳動にかけて調べた。この分析によれば,この調製物は,80%を越える純度であった。
IV.D.2 融合ポリペプチドSOD−NANB 81 の精製
IV.B.2.節で記載の組換え体細菌中で発現した融合ポリペプチドSOD−NANB81は,組換え体E.coliから,尿素を用いた細胞抽出物の分画抽出により,次いで,融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1を単離するために記載された工程(IV.D.1.節を参照されたい)を用いて,陰イオンおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行なうことにより精製された。
SOD−NANB81ポリペプチドの最終調製物は,SDSの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べられた。この分析によれば,この調製物は50%を越える純度であった。
IV.D.3.固相ラジオイムノアッセイによるHCVエピトープに対する抗体の検出
NANBHを有すると診断された32人の患者から得られる血清試料を,ラジオイムノアッセイ(RIA)によって分析し,融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81中に存在するHCVエピトープに対する抗体が検出されるか否か決定した。
マイクロタイタープレートをSOD−NANB5−1−1あるいはSOD−NANB81(それぞれ,IV.D.1節およびIV.D.2節に従って,部分精製されている)で被覆した。この分析は,次のようにして行なわれた。
0.125Mホウ酸緩衝液,pH8.3,0.075M NaCl(BBS)中に0.1〜0.5μgのSOD−NANB5−1−1あるいはSOD−NANB81を含む100μlを,マイクロタイタープレート(Dynatech Immulon 2 Removawell Strips)の各ウェルに添加した。このプレートを湿潤チャンバー内で4℃にて一晩インキュベートし,その後,このタンパク溶液を除去し,0.02%トリトンX−100を含有するBBS(BBST)で3度このウェルを洗浄した。非特異的な結合を防ぐために,このウェルを牛血清アルブミン(BSA)で被覆した。この操作は,BSAを5mg/mlの割合でBBSに溶解させた溶液100μl添加し,次いで,室温で1時間インキュベートすることによって行なった。このインキュベートの後,BSA溶液を除去した。被覆されたウェル中のポリペプチドを血清と反応させ,該血清含有ウェルを37℃にて1時間インキュベートした。上記血清との反応は,10mg/ml BSAを含有する含0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.2 0.15M NaCl(PBS)中に1:100の割合に希釈された血清試料100μlを添加することにより行なった。インキュベートの後,この血清試料を吸引除去し,このウェルをBBSTで5回洗浄した。この融合ポリペプチドに結合した抗NANB5−1−1およびNANB81は,125I標識F’(ab)ヒツジ抗ヒトIgGをこの被覆ウェルに結合させることにより,決定された。標識プローブ(比活性5〜20μCi/μg)100μlを各ウェルに添加し,このプレートを,37℃にて1時間インキュベートした。次いで,過剰のプローブを吸引除去し,BBSTで5回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量を,γ線を検出するカウンターでカウントし決定した。
NANBH保有個体における抗NANB5−1−1および抗NANB81の検出結果を,表1および表2に示す。
Figure 2008007508
Figure 2008007508
表1および表2からわかるように,NANBHを保有していると診断された患者から得られた32の血清のうち19が,SOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81に存在するHCVエピトープに対する抗体について陽性であった。
しかし,陽性であった血清試料は,SOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81と同様に免疫学的に反応性を有しているわけではなかった。No.1の患者から得られた血清試料は,SOD−NANB81に対しては陽性であったがSOD−NANB5−1−1に対しては陽性ではなかった。No.10,15および17の患者から得られた血清試料はSOD−NANB5−1−1に対しては陽性であったが,SOD−NANB81に対しては陽性ではなかった。No.3,8,11および12の患者から得られた血清試料はSOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81の両融合ポリペプチドと
同程度に反応するが,これに対してNo.2,4,7および9の患者から得られる血清試料においては,SOD−NANB81に対するよりもSOD−NANB5−1−1に対する反応の方が,2〜3倍反応性が高かった。これらの結果によりNANB5−1−1およびNANB81が少なくとも3個の異なるエピトープを有し得ることが示唆される。つまり,各ポリペプチドが少なくとも1個の独特のエピトープを有し,そして,2個のポリペプチドが少なくとも1個のエピトープを共有していることが可能である。
IV.D.4.NANBHについての固相RIAの特異性
NANBHについての固相RIAの特異性は,HAVあるいはHBVに感染した患者から得られる血清および対照個体から得られる血清の分析を行なうことにより試験された。部分精製されたSOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81を使用する分析は,実施例IV.D.3節に記載した方法により行なわれた。但し,血清は,HAVあるいはHBVを有しているとあらかじめ診断された患者から得られた血清であるか,あるいは血液バンクの提血者である個体から得られた血清である。HAVおよびHBV感染患者からの血清についての結果を表1および表2に示す。HAV感染患者から得られた11個の血清試料,およびHBV感染患者から得られた20個の血清試料を用いて,RIAにより試験が行なわれた。表1および表2に示すように,これら血清のいずれもがBB−NANBVエピトープを有する融合ポリペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかった。
NANB5−1−1抗原を用いたRIAが,対照個体から得られる血清の免疫学的反応性を決定するために用いられた。正常血液提供者集団から得られる230個の血清検体のかち,2個だけがRIAにおいて陽性反応を示した(データは示されていない)。これら血清サンプルの源である2人の血液提供者は,以前にHCVにさらされた可能性がある。IV.D.5.NANBH感染進行中におけるNANB 5−1−1 の反応性
2人の患者および4匹のチンパンジーのNANBH感染進行中における抗NANB5−1−1抗体の存在が,IV.D.3節に記載されたRIA法を用いて追跡された。さらに,感染チンパンジーにおいて,HAVおよびHBVの感染進行中における抗NANB5−1−1抗体の有無を決定するためにRIAが用いられた。
その結果を表3および表4に示す。この結果により,チンパンジーおよびヒトにおいては,抗NANB5−1−1抗体は,NANBH感染の急性症状の発現に従って検出された。抗NANB5−1−1抗体は,HAVあるいはHBVに感染したチンパンジーから得られる血清試料では検出されなかった。このように,抗NANB5−1−1抗体は,個体がHCVにさらされたことを示すマーカーとしての働きを有する。
Figure 2008007508
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IV.E.NANB 5−1−1 に対するポリクローナル血清抗体の精製
SOD−NANB5−1−1ポリペプチドと,NANBHの患者由来の血清試料中の抗体との特異的な免疫学的反応性に基づいて,NANB5−1−1中のエピトープと免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開発された。この方法はアフィニティークロマトグラフィーを利用する方法である。精製されたSOD−NANB5−1−1ポリペプチド(IV.D.1.節参照)を,不溶性の支持体に結合させたが,その結合は,固定されたポリペプチドが,NANB5−1−1に対する抗体の親和性を保持するような結合である。血清試料中の抗体は,マトリックスに結合したポリペプチドに吸収される。洗浄して,非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後,pHの変更および/またはカオトロピック試薬(例えば尿素)によって,結合した抗体を,これが結合しているSOD−HCVポリペプチドから脱離させる。
結合SOD−NANB5−1−1を含有するニトロセルロース膜を下記のようにして調製した。ニトロセルロースの膜〔2.1cmのザルトリウス(Sartorius),微細孔の径:0.2μm〕を,BBSで3分間ずつ3回洗浄した。精製した製剤を,BBS中,室温で2時間かまたは4℃で一夜インキュベートすることによってSOD−NANB5−1−1を上記の膜に結合させた。未結合の抗原を含有する溶液を除去し,フィルターをBBSで3分間ずつ3回洗浄した。膜に残っている活性部位を,5mg/mlのBSA溶液とともに30分間インキュベートすることにより,BSAでブロックした。得られた膜を,BBSで5回,蒸留水で3回洗浄して,過剰のBSAを除去した。ウイルス抗原とBSAを含有する膜を,次に,0.05Mの塩酸グリシン(pH 2.5),0.10M
NaCl(Gly HCl)で15分間処理し,次いでPBSで3分間ずつ3回洗浄した。
NANBHに感染した個体由来の血清との融合ポリペプチドを含有する膜を,2時間インキュベートすることによって,ポリクローナル抗NANB5−1−1抗体を単離した。インキュベーション後,フィルターをBBSで5回,蒸留水で2回洗浄した。次いで結合している抗体を,各フィルターから,GlyHClを5回,3分間ずつ用いて溶離した。各溶離液を,2.0MトリスHCl緩衝液(pH 8.0)の入っている試験管に集めて,溶離液のpHを8.0に調整した。アフィニティークロマトグラフィーで処理した後の抗NANB5−1−1抗体の回収率は約50%である。
結合ウイルス抗原を含有するニトロセルロース膜は,結合容量はそれほど減少することなしに数回使用することができる。膜を再使用するには,抗体を溶離した後,膜をBBSで3回3分間ずつ洗浄する。次いでBBS中,4℃で貯蔵する。
IV.F.精製ヒトポリクローナル抗−HCV抗体を用いて感染血漿からHCV粒子を捕獲する方法;捕獲された粒子中の核酸のHCV cDNAへのハイブリダイゼーション
IV.F.1.ヒトポリクローナル抗−HCV抗体を用いて感染血漿からHCV 粒子を捕獲する方法
NANBHに感染したチンパンジーの感染性血漿中に存在するタンパク−核酸複合体を,ポリスチレンビーズに結合させた精製ヒトポリクローナル抗HCV抗体を用いて精製した。
ポリクローナル抗NANB5−1−1抗体は,クローン5−1−1にコードされたSOD−HCVポリペプチドを用いて,NANBHに感染したヒト由来の血清から精製した。精製法はIV.E.節に記載の方法を用いた。
精製抗NANB5−1−1抗体を,ポリスチレンビーズ(直径1/4”,鏡面仕上げ,Precision Plastic Ball Co.,シカゴ,イリノイ)に,各々,室温で一夜,1mlの抗体〔ホウ酸緩衝食塩水(pH 8.5)中1μg/ml〕とともにインキュベートすることによって結合させた。一夜インキュベーションした後に,ビーズを,TBST(50mMトリスHCl pH8.0緩衝液,150mM NaCl,0.05%(V/V)Tween 20)で1回洗浄し,次に10mg/ml BSAを含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。
精製抗NANB5−1−1抗体を全ヒト免疫グロブリンと取替えること以外は,同様にして対照のビーズを調製した。
ビーズに結合させた抗NANB5−1−1抗体を用いて,NANBHに感染したチンパンジーの血漿から,HCVを次のようにして捕獲した。使用した,NANBHに感染したチンパンジーの血漿についてはIV.A.1.節に記載してある。NANBVに感染したチンパンジーの血漿の一部(1ml)を,抗NANB5−1−1抗体または対照の免疫グロブリンでコートした5個のビーズの各々と,37℃で3時間インキュベートした。得られたビーズをTBSTで3回洗浄した。
IV.F.2.捕獲された粒子中の核酸のNANBV−cDNAへのハイブリダイゼーション
抗NANB5−1−1抗体によって捕獲された粒子から遊離した核酸成分を,クローン81由来のHCVcDNAとハイブダイゼーションさせて分析した。
IV.F.1.節に記載したのと同様にして,HCV粒子をNANBHに感染したチン
パンジーの血清から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるために,洗浄したビーズを,プロテイナーゼK(1mg/ml),10mMトリス HCl pH7.5緩衝液,10mM EDTA,0.25%(W/V)SDS,10μg/mlの可溶性酵母RNAを含有する溶液の0.2ml/ビーズとともに,37℃で60分間インキュベートし,次いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフェノールとクロロホルムで抽出し,次いで核酸をエタノールで,一夜−20℃にて沈殿させた。この核酸の沈殿を,遠心分離して集め,乾燥し,50mM Hepes,pH7.5に溶解させた。抗NANB5−1−1抗体でコートされたビーズから得た試料および全ヒト免疫グロブリンを含有する対照ビーズで得た試料からの可溶性核酸の二つの部分をニトロセルロースフィルターに吸い取らせた。これらのフィルターを,クローン81中の精製HCV cDNA断片で作製した,32Pで標識し,ニックトランスレーションを行ったプローブとハイブッドさせた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション法は,IV.C.1.節に記載してある。
抗NANB5−1−1抗体を含有するビーズによって捕獲された粒子由来の核酸を含有するプローブされたフィルターのオートラジオグラフを第57図に示す。抗NANB5−1−1抗体を用いて得た抽出物(A,A)から,対照の抗体抽出物(A,A)および対照の酵母RNA(B,B)に比べて明確なハイブリダイゼーションシグナルを得た。精製クローン81 cDNA断片の1pg,5pgおよび10pgからなる標準物をそれぞれC1−3に示す。
これらの結果は,抗NANB5−1−1抗体によってNANBH血漿から捕獲された粒子が,クローン81内のHCV cDNAとハイブリダイゼーションする核酸を含有することを示し,その結果これらのクローン中のcDNAは,NANBHの病原体から誘導されるという別の証拠を提供している。
IV.G.C100−3と精製抗NANB 5−1−1 抗体との免疫学的反応性
C100−3融合ポリペプチドと抗NANB5−1−1抗体との免疫学的反応性を,放射性免疫検定法によって測定したが,この検定法では,固相に結合した抗原が,精製抗NANB5−1−1抗体に投与され,生成した抗原抗体複合物が,12Iで標識したヒツジ抗ヒト抗体で検出された。C100−3ポリペプチドの免疫学的反応性を,SOD−NANB5−1−1抗原のそれと比較した。
融合ポリペプチドC100−3を,IV.B.5.節とIV.B.6.節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精製した。融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1をIV.B.1.節とIV.D.1.節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精製した。精製抗NANB5−1−1抗体を,IV.E.節に記載したのと同様にして得た。
0.125Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.3),0.075M NaCl(BBS)中,種々の量の精製C100−3抗原を含有する100μlのアリコットを,マイクロタイタープレート(DynatechImmulon2 Removawell Strips)の各ウェルに添加した。このプレートを加湿チャンバー内で,一夜4℃にてインキュペートした。次いでタンパク溶液を除き,ウェルを0.02%のTriton X−100含有のBBS(BBST)で3回洗浄した。非特異的結合を防止するために,5mg/mlのBSAを含有するBBS溶液を100μl添加することによって,ウェルをBSAでコートし,次いで室温で1時間インキュベートした後,過剰のBSA溶液を除去した。ウェル当り1μgの抗体を添加することによって,コートされたウェル内のポリペプチドを,精製抗NANB5−1−1抗体と反応させ,次いでその試料を37℃で1時間インキュベートした。インキュベートした後,過剰の溶液を吸引によって除去し,ウェルをBBSTで5回洗浄した。12Iで標識したF’(ab)ヒツジ抗ヒトIgGを,コートされたウェルに結合させることによって,融合ポリペプチドに結合した抗NANB
5−1−1を測定した。標識したプローブ(比放射能:5〜20μCi/mg)の100μlずつを各ウェルに添加し,そのプローブを37℃で1時間インキュベートし,過剰のプローブを吸引で除去し,BBSTで5回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量は,γ線を検出するカウンターで計数することによって測定した。
C100の精製抗NANB5−1−1との免疫学的反応性を,NANB5−1−1の精製抗体との免疫学的反応性と比較した結果を表5に示す。
Figure 2008007508
表5の結果は,抗NANB5−1−1が,C100−3ポリペプチドのC100の部分内のエピトープを認識するということを示している。したがってNANB5−1−1とC100は共通のエピトープをもっている。これらの結果は,このNANBVエピトープをコードするcDNA配列が,クローン5−1−1とクローン81の両者に存在する配列であるということを示唆している。
IV.H.HCVの特性決定
IV.H.1.HCVゲノムのストランドの状態(strandedness)の特性決定
抗NANB5−1−1抗体でコートしたポリスチレンビーズに捕獲された粒子から核酸の画分を単離し,次に単離した核酸が,HCV cDNAの正鎖および/または負鎖とハイブリダイゼーションするか否かを測定することによって,HCVゲノムをそのストランドの状態について特性決定した。
IV.F.1.節に記載したようにして,免疫学的に精製した抗NANB5−1−1抗体でコートしたポリスチレンビーズを用いて,HCVに感染したチンパンジーの血漿から,粒子を捕獲した。粒子の核酸成分を,IV.F.2.節に記載した方法を用いて遊離させた。3mlの高力価血漿と当量の単離されたゲノム核酸のアリコットを,ニトロセルロースフィルターに吸い取らせた。対照として,クローン81由来の変性HCV cDNA(2pg)のアリコットを同じフィルターに吸い取らせた。そのフィルターを,HCV cDNAからクローン化された一本鎖DNAの,正鎖または負鎖の32Pで標識した混合物でプローブした。なお該cDNAは,クローン40b,81および25cから切り出されたものである。
EcoRIでクローン81,40bおよび25cからHCV cDNAを切り出し,そのcDNA断片をM13ベクターのmp18とmp19内でクローン化することによって,一本鎖のプローブを得た〔メシング(Messing)1983年〕。そのM13クローンの塩基配列を決定し,そのクローンがHCV cDNA由来のDNAの正鎖もしくは
負鎖をもっているかどうかを決定した。塩基配列の決定は,サンガーら(Sanger et al)(1977年)のジデオキシチェーンターミネーション法で行った。
捕獲された粒子から単離されたHCVゲノムの一部を含有する二重のフィルターの各セットを,HCV cDNA由来の正鎖または負鎖のプローブとハイブリダイゼーションさせた。第58〜60図は,NANBVゲノムを,クローン81,40bおよび25c由来のプローブの混合物でプローブして得たオートラジオグラフを示す。この混合物は,ハイブリダイゼーション検定法の感度を増大させるために用いた。パネルIの試料を,正鎖プローブの混合物とハイブリダイゼーションさせた。パネルIIの試料を,負鎖のプローブ混合物でハイブリダイゼーションさせることによってプローブした。免疫ブロット法に付したパネルの試料を表6に示す。
Figure 2008007508
第58〜60図の結果から分かるように,負鎖のDNAプローブだけが,単離されたHCVゲノムとハイブリダイゼーションする。この結果は,ゲノムがRNaseには感受性であるがDNaseには感受性でないという結果(IV.C.2.節参照)と併せて,NANBVのゲノムが正鎖のRNAであることを示唆している。
これらのデータと,推定上のNANBVの物理化学的性質に関する他の実験室のデータは,HCVがフラビウイルス科に属する可能性があることを示している。しかし,HCVが,新種のウイルス因子に相当する可能性も無視できなかった。
IV.H.2.PCRで増幅された場合,クローン81由来のHCV cDNAとハイブリダイゼーションする捕獲粒子の塩基配列の検出法
捕獲粒子のRNAを,IV.H.1.節に記載したのと同様にして得た。クローン81由来のHCV cDNAとハイブリダイゼーションする塩基配列の分析を,第IV.C.3節に記載したのと同様にしてPCR増幅法を利用して行ったが,ハイブリダイゼーションプローブはクローン81cDNA塩基配列由来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレオチドを用いた。試験結果は,増幅された塩基配列がクローン81由来のHCVcDNAプローブとハイブリダイゼーションすることを示した。
IV.H.3.デング熱フラビウイルス(MNWWVD1)の非構造タンパクと,39Cに結合されたクローン14iのORFによってコードされるHCVポリペプチドとの間の相同性
39Cによって結合されたクローン14iのHCV cDNAは,第29〜34図に示すように一つの連続ORFを含有している。これにコードされたポリペプチドを,デング熱フラビウイルス(MNWVD1)の非構造ポリペプチドの領域との配列相同性について分析した。この分析は,デイホッフ(Dayhoff)のタンパクデータベースを用い,コンピュータで行った。結果を第61図に示すが,図中,記号(:)は厳密な相同性を示
し,記号(.)は塩基配列が若干置換されていることを示し,ダッシュ記号は,最大の相同性を得るため塩基配列中に挿入されたスペースを示す。この図から分かるように,HCV cDNAにコードされた塩基配列と,デング熱フラビウイルス非構造タンパクとの間には有意な相同性がある。第61図に示す相同性に加えて,cDNAの3’末端の領域にコードされたポリペプチドセグメントには,分析した結果,デング熱ポリメラーゼの塩基配列と相同性の塩基配列が含まれていた。RNA依存性RNAポリメラーゼに対して必須であると考えられる標準的なGly−Asp−Asp(GDD)配列が,HCV cDNAにコードされたポリペプチドに含まれ,その位置がデング熱2ウイルス内の位置と一致しているということは重要なことである(データは記載していない)。
IV.H.4.HCV−DNAは,NANBHに感染した組織内には検出できない
2種の研究結果は,HCV−DNAが,NANBHに感染した個体由来の組織内には検出できないことを示唆している。これらの結果は,IV.C.とIV.H.1.とIV.H.2.の各節に記載した結果と併せて,HCVがDNAを含有するウイルスではなく,その複製にはcDNAを含まないという証拠を提供している。
IV.H.4.a.サザンブロット法
NANBHに感染したチンパンジーの肝臓が,検出可能なHCV−DNA(もしくはHCV−cDNA)を含有しているか否かを決定するために,この起源から単離したDNAの制限酵素による断片をサザンブロット法に付して,ブロット物を32Pで標識したHCV cDNAでプローブした。上記の標識したHCV cDNAは,感染チンパンジーの肝臓由来のブロットされたDNAとハイブリダイゼーションをしないという結果を示した。また同じ標識HCV cDNAは,正常なチンパンジーの肝臓由来の対照のブロットされたDNAともハイブリダイゼーションをしなかった。これに対して,陽性対照においては,β−インターフェロン遺伝子の標識したプローブが,制御酵素で切断したヒト胎盤DNAのサザンブロット法に付したものと強くハイブリダイゼーションした。これらの系は,標識したプローブで検出すべき遺伝子の単一コピーを検出するために設計された。
NANBHに感染した2頭のチンパンジーの肝臓からDNAを単離した。対照のDNAを,未感染のチンパンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。DNAの抽出は,基本的にはマニアティスら(1982年)の方法によって行い,そのDNA試料は,単離工程中,RNAseで処理した。
各DNA試料は,メーカーの説明書に従って,EcoRI,MboIまたはHincII(12μg)で処理した。切断したDNAを1%中性寒天ゲルで電気泳動し,ニトロセルロース上にサザンブロットし,次いでブロットされた物質は,適当なニックトランスレーションされたプローブcDNAとハイブリダイゼーションした(3×10cpm/mlのハイブリダイゼーションミックス)。感染チンパンジーの肝臓と正常な肝臓由来のDNAは,クローン36と81由来の32Pで標識したHCV cDNAとハイブリダイゼーションし,またヒト胎盤由来のDNAはβ−インターフェロン遺伝子由来の32Pで標識したDNAとハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後,ブロットしたものを,厳密条件下,すなわち,0.1×SSCと0.1%SDSを含む溶液を用い65℃で洗浄した。
β−インターフェロン遺伝子DNAを,ホートンら(Houghton et al)(1981年)が記述しているのと同様にして調製した。
IV.H.4.b.PCR法による増幅
HCV−DNAが,NANBHに感染したチンパンジーの肝臓内に検出できるか否かを決定するために,DNAをその組織から単離し,プライマーとクローン81のHCVcD
NA由来のプローブポリヌクレオチドを用いて,PCR増幅検出法に付した。陰性対照は,未感染HepG2組織の培養細胞と,未感染と思われるヒト胎盤とから単離したDNA試料を用いた。陽性対照は,陰性対照にクローン81由来のHCV cDNA挿入物の比較的少ない既知量(250分子)を添加した試料を用いた。
さらに,NANBHに感染したチンパンジーの同じ肝臓から単離したRNA画分が,HCV−cDNAプローブに対して相補的な配列をもっていることを確認するために,PCR増幅検出法を,単離したRNA試料にも用いた。
この研究では,DNAはIV.H.4.a節に記載の方法で単離し,RNAは,チャーギンら(Chirgwin et al)(1981年)が記述しているのと同様にして抽出した。
DNAの試料を,2頭の感染チンパンジーの肝臓,未感染のHepG2細胞およびヒト胎盤から単離した。各DNAの1μgをメーカーの説明書にしたがってHindIIIで切断した。逆転写酵素工程を省略したことを除いて,IV.C.3節に記載と基本的に同様にして,上記の切断試料を,PCR増幅法に付し,増幅したHCV cDNAを検出した。PCRプライマーとプローブは,HCV cDNAクローン81由来のものであり,IV.C.3.節に記載されている。増幅する前に,陽性対照については,各DNAの試料1μgは,クローン81から単離したHCV cDNA挿入物の250分子を添加することによって「スパイク」された。
HCV配列が,NANBHに感染したチンパンジーの肝臓から単離したRNAに存在しているか否かを決定するために,0.4μgの全RNAを含有する試料を,陰性対照試料のいくつかから逆転写酵素の工程を省略すること以外は,IV.C.3.節に記載したのと同様の増幅法に付した。PCRプライマーとプローブは,上記の記載と同様に,HCV
cDNAクローン81由来のものであった。
その結果,HCV cDNAプローブに相補的な増幅された配列は,感染チンパンジーの肝臓由来のDNA中には検出できず,また陰性対照にも検出できなかった。これとは異なり,感染チンパンジーの肝臓由来のDNAを含む試料が増幅される前にHCV cDNAでスパイクされた場合,クローン81の配列がすべての陽性対照の試料に検出された。さらに,RNAの研究では,増幅されたHCV cDNAクローン81の配列が,逆転写酵素を用いた時にのみ検出されたが,これは,この結果がDNA汚染が原因でないことを強く示唆している。
これらの結果は,NANBHに感染したチンパンジー由来の肝細胞が,HCV DNAを全く含有しないか,または検出不可能な濃度で含有していることを示している。スパイク法の研究によれば,HCV DNAが存在する場合,それは0.06コピー/肝細胞よりはるかに低い濃度である。これに対し,同じ肝臓試料由来の全RNAのHCV配列は,PCR法によって容易に検出された。
IV.I.試験抗原としてHCV c100−3を用いる,HCV感染のELISA法による決定
全試料を,HCV c100−3 ELISA法を用いて検定した。この検定法は,HCV c100−3抗原(IV.B.5節に記載したのと同様にして合成し精製した)と,マウスモノクローナル抗ヒトIgGのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)複合体とを利用する。
HCV c100−3抗原でコートしたプレートを次のようにして調製した。コーティ
ング緩衝液(50mM ホウ酸ナトリウム,pH9.0)の21ml/プレート,BSA(25μg/ml)およびc100−3(2.50μg/ml)を含有する溶液を,RemoveawellImmulon Iプレート(Dynatech Corp.)に添加する直前に調製した。5分間混合後,上記溶液0.2ml/ウェルをプレートに添加した。プレートをカバーし2時間37℃でインキュベートし,次いで溶液を吸引して除去した。ウェルを400μlの洗浄緩衝液〔100mMリン酸ナトリウム(pH7.4),140mM塩化ナトリウム,0.1%(W/V)カゼイン,1%(W/V)Triton X−100,0.01%(W/V)Thimerosal〕で1回洗浄した。洗浄液を除いた後,後コート溶液200μl/ウェル〔10mMリン酸ナトリウム(pH7.2),150mM塩化ナトリウム,0.1%(W/V)カゼインおよび2mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)〕を添加し,プレートをゆるくカバーして蒸発を防止し,室温で30分間放置した。次にウェルから吸引して溶液を除き,保存加熱せずに一夜凍結乾燥した。得られたプレートを,密封したアルミニウムパウチ内に2〜8℃で貯蔵する。
ELISA法で決定するために,20μlの血清試料または対照試料を,200μlの試料希釈剤〔100mMリン酸ナトリウム(pH7.4),500mM塩化ナトリウム,1mM EDTA,0.1%(W/V)カゼイン,0.015%(W/V)Therosal),1%(W/V)Triton X−100,100μg/ml酵母エキス〕の入ったウェルに添加した。プレートを密封し,37℃で2時間インキュベートし,その後溶液を吸引して除き,400μlの洗浄緩衝液〔0.05%のTween 20を含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)〕でウェルを洗浄した。洗浄したウェルを,200μlのマウス抗ヒトIgG−HRP複合体を含有する,オルト複合体希釈剤〔10mMリン酸ナトリウム(pH7.2),150mM塩化ナトリウム,50%(V/V)胎仔ウシ血清,1%(V/V)熱処理ウマ血清,1mM KFe(CN) 0.05%(W/V)Tween 20,0.02%(W/V)Thimerosal〕の溶液で処理した。37℃で1時間処理を行い,溶液を吸引によって除去し,ウェルを洗浄緩衝液で洗い,緩衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合体の量を測定するために,200μlの基質溶液(10mgの0−フェニレンジアミン二塩酸塩/5mlの展開剤溶液)を添加した。展開剤溶液は,リン酸によってpH5.1に調節された50mMのクエン酸ナトリウムと,0.6μl/mlの30%Hを含有している。基質溶液が入ったプレートを,暗所内で,30分間室温でインキュベートし,反応は50μl/mlの4N硫酸を添加して停止させ,ODを測定した。
下記の実施例は,HCV C100−3抗原を利用するマイクロタイタープレートのスクリーニングELISA法が高い特異性を有することを示す。このことは,初期反応率が約1%で,反復反応率が任意のドナーについて約0.5%であることによって証明されている。この検定法は,感染の急性期後および疾患の慢性期の両方における免疫応答を検出することができる。さらに,この検定法は,NANBHに対する代理試験についてマイナスの評価をされているいくつかの試料を検出することができる。なおこれらの試料は,NANBHの病歴を持つ個体またはNANBH伝染に関係があるドナー由来のものである。
以下の実施例では,次の略号が用いられる。
ALT アラニンアミノ転移酵素
抗−HBc HBcに対する抗体
抗−HBsAg HBsAgに対する抗体
HBc B型肝炎コア抗原
ABsAg B型肝炎表面抗原
IgG 免疫グロブリンG
IgM 免疫グロブリンM
IU/L 国際単位/l
NA 入手不能
NT 試験せず
N 試料の大きさ
Neg 陰性
OD 光学密度
Pos 陽性
S/CO シグナル/カットオフ
SD 標準偏差
x 平均値
WNL 標準限界内。
IV.I.1.任意のドナー集団におけるHCVの感染
任意のドナーから得た1,056試料(新鮮な血清)を,Irwin Memorial Blood Band(米国,カリフォルニア州,サンフランシスコ)から得た。これらの試料によって得た試験結果を,OD値の分布を示すヒストグラムにまとめる。(第62図)。第62図から分かるように,4試料が3より大きい値を示し,1試料が1と3の間,5試料が0.4と1の間,および残りの1,046試料が0.4より小さい値を示し,これらの試料の90%以上が0.1より小さい。
反応性であった任意試料についての試験結果を表7に示す。平均値+5標準偏差に等しいカットオフ値を用いた場合,1,056試料中の10試料(0.95%)が最初反応性であった。これらの試料中5試料(0.47%)は,前記のELISA法を用いて2回目の検定を行ったところ繰り返し反応性を示した。また表7は,繰り返し反応性を示した各試料に対してALTおよび抗HBd状態を示している。特に興味深いのは,繰り返し反応性であった5試料全部が,NANBHに対する両代理試験で陰性であり,一方HCV ELISA法では陽性であったということである。
Figure 2008007508
IV.I.2.チンパンジー血清試料
11匹のチンパンジーから得た血清試料を,HCV c100−3を用いたELISA法により試験した。これらのチンパンジーのうち4匹には,疾患管理センター(the Centers for DiseaseControl)のDaniel Bradley博士と共同して確立された方法に従って,第VIII因子の汚染バッチに由来するNANBH(お くは,ハッチンソン(Hutchinson)株であると推測される)を感染させた。対照として,他の4匹のチンパンジーにはHAVを,そして3匹にはHBVを感染させた。血清試料は,感染後の様々な時期に採取した。
これらの結果は,表8および表9に要約されているが,ハッチンソン株のNANBHに感染させたすべてのチンパンジーにおいて実証された抗体の血清転換を示している。感染の急性期(ALTレベルが有意に上昇し,続いて正常レベルに戻ることから示される)の後は,HCV c100−3に対する抗体がNANBHに感染させた4匹のチンパンジーのうち4匹の血清中で検出し得るようになった。これら試料は,すでにIV.B.3節で考察したように,ウェスタン(Western)分析および放射性免疫検定法(RIA)により陽性であることが示されている。これとは対照的に,HAV
またはHBVに感染させた対照のチンパンジーはELISA法における反応性を示した。
Figure 2008007508
Figure 2008007508
IV.I.3.パネル1:慢性ヒトNANBHキャリアから得られた保証感染性血清
コードされたパネルは,22個の独自の試料から構成されていた。ただし,これらの試料は,各々につき二重検定を行うので,合計で44個であった。これらの試料は,慢性NANBHキャリアから得た保証感染性血清,関係供血者から得た感染性血清,および急性NANBH患者から得た感染性血清からのものであった。さらに,非常に由来が明確な陰性対照群,および他の疾患対照群からも試料を得た。このパネルは,国立衛生研究所(National Institutes of Health,Bethesda,Mary−land)のHealth and Human Service部のH.Alter博士から提供された。このパネルは,数年前にAlter博士により構築され,推定NANBH検定の適合パネルとして,Alter博士により使用されてきた。
上記の全パネルをELISA法で2度分析し,その結果を評価するためにAlter博士に送付した。評価の結果を表10に示す。この表には,二重検定の一方の組の結果が示されているが,二重検定試料の各々について同じ値が得られた。
表10に示すように,チンパンジーモデルにおいて感染性であると証明された6個の血清は非常に陽性であった。7番目の感染性血清は,急性NANBHの場合の試料に対応しており,このELISAにおいて反応性ではなかった。正常ALTレベルを有し,かつチンパンジーでの研究結果が不明確であった関係供血者から得た試料は,上記の分析において反応性ではなかった。急性NANBHの1個体から得た3個の他の一連の試料も反応性ではなかった。非常に由来が明確な陰性対照群からの全ての試料は,少なくとも10回の献血で肝炎の疑いがなかった供血者から得たものであるが,上記のELISAにおいて反応性ではなかった。最後に,検査試料のうち4個は,他人により開発された推定NANBH検定において陽性であると以前は評価されていたが,これらの分析では確定できなかっ
た。これらの4個の試料は上記のHCVELISA法では陰性と判定された。
Figure 2008007508
IV.I.4.パネル2:供血者/受血者のNANBH
前記のコードされたパネルは,輸血に関連するNANBHについて供血者および受血者が明確な10事例からなり,試料の合計は188であった。各事例は,受血者に対する数人またはすべての供血者の試料,およびこの受血者から得た(輸血後,3ヵ月,6ヵ月,および12ヵ月目に採血した)一連の試料からなるものであった。また,輸血前に予め受血者から採血された血液試料も含まれていた。コードされたパネルは,NIHのH.Alter博士により提供されたものであり,結果は評価を行うために同博士へ送付した。
これらの結果は,表11に要約したが,ELISA法により,輸血に関連するNANBHの10事例のうち9事例において,抗体血清転換が検出されたことを示している。事例4の試料(血清転換が全く検出されなかった)は,前記ELISA法において,一貫して反応性に乏しかった。10個の受血者試料のうち2個は,輸血後3ヵ月で反応性があった。12ヵ月では,事例4を除いて,すべての試料が反応性であった。さらに,少なくとも1人の抗体陽性供血者が10事例のうち7事例に見い出され,事例10には2人の陽性供血者が存在した。また,事例10では,輸血前に採血した受血者の血液はHCV抗体について陽性であった。この受血者から得た1ヵ月目の採血試料は反応性レベルの境界線まで低下したが,4ヵ月および10ヵ月目の採血試料では陽性レベルにまで上昇した。一般に,S/COが0.4であれば,陽性であると考えられる。従って,この事例では,個体が事前にHCV感染していたことを示している。
反応性である(すなわち,陽性である)すべての試料に対するALTおよびHBcの状態を表12に要約する。この表から明らかなように,供血者試料の1/8は,代理マーカーに対しては陰性であったが,HCV抗体ELISA法では反応性であった。他方,受血者試料(輸血後12ヵ月まで引き続き採血された)は,高いALTを有するか,または抗HBcが陽性であるか,あるいはその両方であった。
Figure 2008007508
Figure 2008007508
IV.I.5.高危険率グループの試料におけるHCV感染の決定
高危険率グループから得られた試料は,HCV c100−3抗原に対する反応性を決定するELISA法を用いてモニターされた。これらの試料は,Gary Tegtmeier博士(Community Blood Bank,KansasCity)から得られた。結果を表13に要約する。
この表に示されているように,反応性の最も高い試料は,血友病者から得られる(76%)。さらに,ALTが上昇し,抗HBcについて陽性の個体から得られた試料は,51%が反応性であると評価されたが,この値は,臨床データから予想される値と一致しており,このグループ内にはNANBHが流行していた。HCVに対する抗体の発生率は,A
LTが高いだけの供血者,B型肝炎コアに対する抗体について陽性であるだけの供血者,そして任意の志願供血者に比べてALTが高いか,あるいは抗コア抗体を有するということ以外の理由で拒否された供血者においても高かった。
Figure 2008007508
IV.I.6.HCV c100−3 ELISA法における第2抗体として抗IgG または抗IgM モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いた比較研究
抗IgGモノクローナル複合体を用いたELISA法の測定感度は,抗IgMモノクローナル複合体を用いるか,あるいはこれら両者をH鎖およびL鎖の両方に特異的であると報告されたポリクローナル抗血清で置き換えることにより得られる測定感度と比較された。以下の研究が行われた。
IV.I.6.a.血清転換者から得られた一連の試料
NANB血清転換者の3つの事例から得られた一連の試料を,HCV c100−3ELISA法で研究した。このELISA法では,酵素複合体に抗IgGモノクローナル抗体だけを用いるか,または抗IgMモノクローナル抗体と組合わせて用いるか,あるいはポリクローナル抗血清を用いた。これらの試料は,Cladd Stevens博士(N.Y.Blood Center,N.Y.C.,N.Y.)により提供された。試料の歴史を表14に示す。
抗IgGモノクローナル抗体−酵素複合体を用いて得られた結果を表15に示す。これ
らのデータは,事例1,2,および3の各試料1−4,2−8,および3−5において,最初に強い反応性が検出されることを示している。
抗IgGモノクローナル複合体および抗IgM複合体の組合わせを用いて得られた
結果を表16に示す。抗IgMに対する抗IgGの3つの異なる割合で試験した;抗IgGの希釈率1:10,000は終始一定であった。抗IgMモノクローナル複合体の試験された希釈率は,1:30,000,1:60,000,および1:120,000であった。これらのデータは,抗IgGだけを用いた研究と同様に,試料1−4,2−8,および3−5において,最初の強い反応性が検出されることを示している。
抗IgGモノクローナル複合体(希釈率1:10,000),またはTagoポリクローナル複合体(希釈率1:80,000),あるいはJacksonポリクローナル複合体(希釈率1:80,000)を用いたELISA法で得られた結果を表17に示す。これらのデータは,3種類の形態をすべて用いると,試料1−4,2−8,および3−5において,最初の強い反応性が検出されることを示している:Tagoのポリクローナル抗体は最も低いシグナルを与えた。
上に与えた結果は,(ALT上昇により明らかとなる)疾患の急性期後の同時期に,3種類の形態により,反応性の試料が検出されることを示している。また,これらの結果は,抗IgGモノクローナル−酵素複合体を用いたHCV c100−3 ELISA法の感度が,該酵素複合体について試験された他の形態と同等またはそれ以上であることを示している。
Figure 2008007508
Figure 2008007508
Figure 2008007508
Figure 2008007508
IV.I.6.b.任意抽出の供血者から得られた試料
任意抽出の供血者から得られた試料(IV.I.1.節参照)を,HCV感染について,HCVc100−3 ELISA法によりスクリーニングした。このとき,抗体−酵素複合体は,抗IgGモノクローム複合体またはポリクローナル複合体のいずれかであった。スクリーニングされた試料の総数は,ポリクローナル複合体およびモノクローナル複合体に対して,それぞれ1077個および1056個であった。スクリーニング結果の要約を表18に示す。また,試料の分布を第63図のヒストグラムに示す。
平均値および標準偏差の計算は,シグナルが1.5を超えるような試料を除いて行った。すなわち,ポリクローナル複合体を利用した場合の計算には1073個のOD値を用い,抗IgGモノクローナル複合体を利用した場合の計算には1051個のOD値を用いた。表15から明らかなように,ポリクローナル複合体を用いた場合には,平均値が0.0
493から0.0931にシフトし,標準偏差は0.074から0.0933に増加した。また,これらの結果は,x+5SDという基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれば,ELISA法におけるポリクローナル酵素複合体の形態が,より高いカットオフ値を必要とすることを示している。このことは,モノクローナル系に比べて分析特異性が低いことを示している。さらに,第63図のヒストグラムから明らかなように,抗IgGモノクローナル複合体を用いたELISA法で任意抽出の供血者をスクリーニングした場合には,市販のポリクローナル標識を用いた分析に比べて,陰性および陽性の結果の分布間が大きく分離する。
Figure 2008007508
IV.J.様々な地域のNANBH患者におけるHCV血清転換の検出
高いALT値に基づくとNANBH保持の疑いがあるが,HAVおよびHBV試験においては陰性である患者から得られた血清を,HCV c100−3抗原をマイクロタイタープレートのスクリーニング抗原として用いたこと以外は実質的にIV.D.節で述べたように,RIA法を用いてスクリーニングした。表19に示された結果から明らかなように,RIAにより,陽性試料が高い割合で検出された。
Figure 2008007508
IV.K.「集団獲得型」NANBHの患者におけるHCV血清転換の検出
明白でない(すなわち,輸血,静脈注射による薬剤使用,乱婚などが危険因子として同定されない)100人のNANBH患者から得た血清は,M.Alter博士(the Center for Disease Control)およびJ.Dieustag博士(Harvard University)から提供された。これらの試料を,HCV c100−3抗原をマイクロタイタープレートに付着させるスクリーニング用抗原として用いたこと以外は実質的にIV.D.節で述べたように,RIA法を用いてスクリーニングした。得られた結果は,100個の血清試料のうち55個の試料が,HCV c100−3抗原と免疫学的に反応する抗体を有することを示した。
上述の結果は,「集団獲得型」NANBHもまた,HCVにより引き起こされることを示唆している。また,HCVがフラビウイルス属(その大部分は節足動物により伝染する)と関係のあることがここで示されているので,「集団獲得型」の場合におけるHCVの伝染もまた,節足動物による伝染に起因することが示唆される。
IV.L.NANBHの伝染に関係のある供血者のHCV抗体および代用マーカーの発生率の比較
NANBH陽性の疑いのある供血者から輸血され,NANBHとなった受血者が,抗HCV抗体陽性に血清転換するかどうかを決定し得る見込みがある研究を実施した。NANBH感染のマーカーとして現在使われている代用マーカー(すなわち,高いALT値および抗コア抗体の存在)の異常について供血者を試験した。さらに,抗HCV抗体の存在についても供血者を試験した。抗HCV抗体の存在は,IV.K.節で述べた放射性免疫検定法を用いて決定した。この研究の結果を表20に示す。この表には以下の項目が示されている:患者の番号(第1列);患者の血清中における抗HCV抗体の存在(第2列);患者の輸血回数,各輸血は異なる供血者によるものである(第3列);供血者の血清中における抗HCV抗体の存在(第4列);そして,供血者の代用マーカーの異常(第5列)(NT,すなわち…試験していないことを意味する)(ALTは高いトランスアミナーゼであり,抗HBcは抗コア抗体である)。
表20の結果は,HCV抗体試験が,感染供血者を検出するのに,代用マーカー試験より正確であることを示している。NANBHの症状を示す10人の患者のうち9人を試験したところ,抗HCV抗体血清転換に関して陽性であった。陽性の疑いのある11人の供血者のうち(NANBHキャリアである疑いのある2人の別々の個体から輸血されたのは患者6であるが),9人は抗HCV抗体に関して陽性であり,1人は陽性の境界線上であり,(患者1に対する供血者は)不明確であった。これに対し,高ALT試験を用いると,10人の供血者のうち6人が陰性であり,抗コア抗体試験を用いると,10人の供血者のうち5人が陰性であった。しかしながら,非常に重要なことは,3つの場合(患者8,患者9,および患者10に対する供血者の場合)において,ALT試験および抗HBc試験の結果が一致しなかったことである。
Figure 2008007508
IV.M.フラビウイルスのゲノム配列の保存領域から誘導されたPCR およびプライマーを利用したHCV cDNA配列のクローニングの増幅
HCVがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆している上記の結果は,PCR 技術と,フラビウイルスの保存アミノ酸配列をコードする領域から誘導され
たプライマーとを利用して,特徴付けられていないHCV cDNA配列をクローニングすることを可能にする。一般に,プライマーの一方は定義されたHCVゲノム配列から誘導され,配列決定されていないHCVポリヌクレオチド領域に隣接する他方のプライマーはフラビウイルスゲノムの保存領域から誘導される。フラビウイルスゲノムは,フラビウイルスゲノムの5’側領域にコードされるNS1ポリペプチドおよびEポリペプチド内に保存配列を有することが知られている。これらの領域をコードする対応配列は,第29〜34図に示すHCV cDNA配列の上流にある。従って,HCVゲノムのこの領域から誘導されたcDNA配列を単離するには,これらのフラビウイルスポリペプチド内の保存配列から誘導される上流プライマーが設計される。下流プライマーはHCV cDNAの既知部分の上流側端部から誘導される。
コードが縮重しているので,フラビウイルスプローブと,対応するHCVゲノム配列との間には不一致が存在し得る。従って,Lee(1988)により述べられた方法と同様の方法を用いる。Leeの方法は,アミノ酸配列の逆転写産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドプライマーを利用する;混合プライマーの配列は保存アミノ酸配列に関するすべてのコドン縮重を考慮したものである。
3組のプライマー混合物は,デング熱−2,4(D−2,4),日本脳炎(JEV),黄熱病(YF),および西ナイルウイルス(WN)を包含する数種のフラビウイルスに見い出されるアミノ酸相同性に基づいて生じたものである。最も上流の保存配列から誘導されたプライマー混合物(5’−1)はアミノ酸配列gly−trp−glyに基づいており,このアミノ酸配列は,D−2P JEV,YE,およびWNのEタンパク中に見い出される保存配列asp−arg−gly−trp−gly−aspNの一部である。次のプライマー混合物(5’−2)はEタンパク中にある下流保存配列phe−asp−gly−asp−ser−tyr−ileu−phe−gly−asp−ser−tyr−ileuに基づいており,phe−gly−aspから誘導される;保存配列は,D−2,JEV,YE,およびWNに存在する。第3のプライマー混合物(5’−3)はアミノ酸配列arg−ser−cysに基づいており,このアミノ酸配列は,D−2,D−4,JEV,YF,およびWNのNS1タンパク中にある保存配列cys−cys−arg−ser−cysの一部である。5’−3中で混合物を形成する各プライマーを第64図に示す。保存領域から誘導された様々な配列に加えて,各混合物中の各プライマーもまた,制限酵素HindIII,Mbo I,およびEcoRIに対す部位をコードする配列を含む5’末端の定常領域を有する。
下流プライマーssc5h20Aはクローン5hのヌクレオチド配列から誘導されており,この配列はクローン14iおよび11bの配列と重複する配列を有するHCV cDNAを含む。ssc5h20Aの配列は,
5’ GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA3’
である。他方のプライマーssc5h34Aもまた,使用し得る。このプライマーはクローン5hの配列から誘導され,さらに制限酵素部位を形成する5’末端のヌクレオチドを有する。従って,クローニングが容易になる。ssc5h34Aの配列は,
5’ GAT CTC TAG AGA AAT CAA TATGGT GAC
AGA GTC A 3’
である。
Saikiら(1986)により最初に述べられたPCR反応は,cDNA の鋳型が,IV.C.2.節で述べたようにHCV感染したチンパンジーの肝臓から単離されたRNAであるか,あるいはIV.A節で述べたようにHCV感染したチンパンジー血清から単離されたウイルス粒子から単離されたRNAであること以外は,実質的にLeeら(1988)が述べたようにして行われる。さらに,アニール条件は第1回目の増幅ではあま
り厳密でなくてもよい(0.6M NaCl,および25℃)。なぜなら,HCV配列とアニールするプライマー部分は,わずか9個のヌクレオチドであり,不一致が存在し得るからである。また,ssc5h34Aを用いた場合には,HCVゲノムから誘導されなかった付加配列はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化する傾向がある。第1回目の増幅後は,アニール条件は非常に厳密である(0.066MNaCl,および32℃〜37℃)。なぜなら,増幅される配列は,この段階では,プライマーに相補的な領域またはプライマーの重複部分である領域を有するからである。さらに,最初の10サイクルの増幅は,クレノー酵素Iを用い,この酵素に適したPCR条件下で実施される。これらのサイクルが完了した後,試料を抽出し,Cetus/Perkin−Elmerにより供給されているキット指示書に従って,Tagポリメラーゼで処理する。
増幅後,増幅されたHCV cDNA配列は,クローン5hから誘導されたプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出される。このプローブは,プライマーを誘導するのに用いた配列の上流にある配列から誘導されるが,プライマーを誘導したクローン5hの配列とは重複しない。このプローブの配列は,
5’ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG
TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3’
である。
産業上の応用性
本発明は,ここに開示された様々な表現で,多くの産業上の用途を有する。これらの用途のいくつかは次のとおりである。HCV cDNAは,試料中のHCV核酸を検出するためのプローブの設計に用いられる。cDNAから誘導されたプローブは,例えば化学的な合成反応においてHCV核酸を検出するのに用いられる。これらのプローブはまた,培養細胞系または動物モデル系においてウイルスの複製を阻害する際に抗ウイルス剤の効果を決定するためのスクリーニングプログラムに用いられる。HCVポリヌクレオチドプローブは,ヒトにおいてウイルス核酸を検出するのにも有用であり,従ってヒトにおけるHCV感染の診断薬の主成分として役立ち得る。
上記のことに加えて,ここで与えられるcDNAは,HCVのエピトープを有するポリペプチドを合成するための情報および手段を提供する。これらのポリペプチドはHCV抗原に対する抗体を検出するのに有用である。HCV感染に対する一連の免疫検定法は,HCVエピトープを有する組換え体ポリペプチドに基づくものである。これらの免疫検定法は,ここで説明されており,NANBHを誘発するHCVを診断したり,HCVにより引き起こされる伝染性肝炎について血液銀行における供血者をスクリーニングしたり,また伝染性の供血者に由来する汚染された血液を検出したりする産業上の用途が見い出される。ウイルス抗原はまた,動物モデル系における抗ウイルス剤の効力をモニターするのにも有用である。さらに,ここに開示されたHCV cDNAから誘導されたポリペプチドは,HCV感染を処置するためのワクチンとして有用である。
HCV cDNAから誘導されたポリペプチドは,上述の用途の他にも,抗HCV抗体を生じさせるのにも有用である。従って,これらのペプチドは抗HCVワクチンに使用され得る。しかしながら,HCVポリペプチドで免疫した結果,生産される抗体もまた,試料中のウイルス抗原の存在を検出するのに有用である。従って,これらのペプチドは,化学系におけるHCVポリペプチドの生産を分析するために用いられ得る。抗HCV抗体はまた,抗ウイルス剤が組織培養系で試験されるスクリーニングプログラムにおいて,これらの抗ウイルス剤の効力をモニターするのに用いられる。これらの抗HCV抗体はまた,受動免疫療法や,供血者および受血者の両方においてウイルス抗原を検出することにより
,NANBHを引き起こすHCVを診断するのにも用いられる。抗HCV抗体の他の重要な用途には,ウイルスおよびウイルスポリペプチドを精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにおける使用がある。精製されたウイルスおよびウイルスポリペプチドの調製物はワクチンに用いられ得る。しかしながら,精製されたウイルスはまた,HCVを複製する細胞培養系の開発に有用である。
HCVに感染した細胞を有する細胞培養系は多くの用途を有する。これらの細胞培養系は,通常は力価の低いウイルスであるHCVの比較的大規模な生産に用いられ得る。これらの培養系はまた,このウイルスの分子生物学的な解明にも有用であり,抗ウイルス剤の開発をもたらす。これらの細胞培養系はまた,抗ウイルス剤の効力をスクリーニングする際にも有用である。さらに,HCV許容性の細胞培養系は,弱毒化したHCV株の生産に有用である。
便宜的には,抗HCV抗体およびHCVポリペプチドは,天然物であっても組換え体であっても,キットに組み込まれ得る。
HCV cDNAを単離するのに用いられる方法は,個体の感染組織から誘導されたcDNAライブラリーを発現ベクター中に調製すること,および非感染個体ではなく他の感染個体に由来する抗体含有身体構成成分中の抗体と免疫学的に反応する発現産物を生産するクローンを選択することを包含する。この方法は,ゲノム成分からなる,これまで特徴付けられていない他の疾患関連因子から誘導されたcDNAの単離にも適用できる。この方法により,次には,これらの因子が単離され,かつ特徴付けられ,またこれらの他の疾患関連因子に対する診断用の薬剤およびワクチンがもたらされ得る。
クローン5−1−1におけるHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。 クローン5−1−1,81,1−2,および91の重複HCV cDNA配列の相同性を示す。 重複するクローン81,1−2,および91に由来するHCV cDNAの複合配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸配列を示す。 クローン81におけるHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。 その一部がクローン81のNANBVcDNAと重複するクローン36のHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチド配列を示す。 クローン36および81のHCVcDNAの結合ORF,およびこのORF内にコードされたポリペプチドを示す。 その一部がクローン81と重複するクローン32のHCVcDNA配列,およびこの配列にコードされたポリペプチドを示す。 その一部がクローン36と重複するクローン35のHCVcDNA配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 クローン35,36,81,および32のHCV cDNAの結合ORF,およびこのORF内にコードされたポリペプチドを示す。 図9のつづき その一部がクローン35と重複するクローン37bのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 その一部がクローン32と重複するクローン33bのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 その一部がクローン37bと重複するクローン40bのHCV 配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 その一部がクローン33bと重複するクローン25cのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 クローン40b,37b,35,36,81,32,33b,および25cの広がるORF のヌクレオチド配列,およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 図15のつづき 図16のつづき その一部がクローン40bおよび33cと重複するクローン33cのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン33cと重複するクローン8hのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン8hと重複するクローン7eのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン25cと重複するクローン14cのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン14cと重複するクローン8fのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン8fと重複するクローン33fのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン33fと重複するクローン33gのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン7eと重複するクローン7fのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン7fと重複するクローン11bのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン11bと重複するクローン14iのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン33gと重複するクローン39cのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 クローン14i,11b,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,および33gの整列したcDNAに由来する複合HCV cDNA配列を示す。さらに,この誘導された配列の拡張ORF内にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が示されている。 図29のつづき 図30のつづき 図31のつづき 図32のつづき 図33のつづき その一部がクローン14iと重複するクローン12fのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン39cと重複するクローン35fのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン35fと重複するクローン19gのHCV cDNA配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン19gと重複するクローン26gの配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 その一部がクローン26gと重複するクローン15eの配列,およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 クローン12fから15eを5’から3’の方向に整列させることにより誘導された複合cDNAの配列を示す;さらに,この連続ORF内にコードされたアミノ酸を示す。 図40のつづき 図41のつづき 図42のつづき 図43のつづき 図44のつづき 図45のつづき BB−NANB,HAV,およびHBVに感染したチンパンジー由来のチンパンジー血清を用いた融合タンパクSOD−NANB5−1−1のウェスタンブロットの写真である。 図47のつづき NANBV,HAV,HBVに感染したヒト由来の血清,および対照のヒト由来の血清を用いた融合タンパクSOD−NANB5−1−1のウェスタンブロットの写真である。 図49のつづき ベクターpAB24の有意な特徴を示す地図である。 融合ポリペプチドC100−3のカルボキシル末端の推定アミノ酸配列,およびこの配列をコードするヌクレオチドを示す。 図52のつづき Aは,酵母内で発現されたC100−3を同定する,クーマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルの写真である。 Bは,NANBVに感染したヒトに由来する血清を用いたC100−3のウェスタンブロットを示す。 BB−NANBVに感染したチンパンジーの肝臓から単離され,クローン81のBB−NANBV cDNA でプローブされたRNA のノーザンブロットのオートラジオグラフを示す。 RNase AまたはDNase Iで処理され,クローン81のBB−NANBV cDNAでプローブされたNANBV 核酸のオートラジオグラフを示す。 抗NANB5−1−1を有する感染血漿から得たNANBV粒子から抽出され,クローン81由来の32P標識化NANBV cDNAでプローブされた核酸のオートラジオグラフを示す。 クローン81のNANBVcDNAから誘導された32P標識化(+)鎖および(−)鎖DNAプローブでプローブされた,単離NANBV核酸を有するフィルターのオートラジオグラフを示す。 HCV cDNAにコードされたポリペプチドと,デング熱フラビウイルス由来のNSタンパクとの相同性を示す。 図59のつづき HCVcDNAにコードされたポリペプチドと,デング熱フラビウイルス由来のNSタンパクとの相同性を示す。 ELISAスクリーニング法で決定される,任意抽出試料におけるHCV感染の分布ヒストグラムを示す。 ELISA検定法において免疫グロブリン−酵素結合体の2つの形態を用いた,任意抽出試料におけるHCV感染の分布ヒストグラムを示す。 フラビウイルスのNS1における保存配列から誘導されたプライマー混合物の配列を示す。 図29のcDNAと重複するセグメントである,クローンk9−1中のHCVcDNA配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。 図65のつづき 5’から3’の方向に,k9−1から15eにわたる並列したクローンに由来する複合cDNAの配列,および連続するORF中にコードされるアミノ配列を示す。 図67のつづき 図68のつづき 図69のつづき 図70のつづき 図71のつづき 図72のつづき 図73のつづき

Claims (1)

  1. 少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列からなるポリペプチド中の部位に免疫学的に結合する、抗C型肝炎ウイルス(HCV)抗体であって、
    ここで、該部位は、HCVに対する抗体によって結合され得、そして該少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列:
    Figure 2008007508
    Figure 2008007508
    Figure 2008007508
    中に1または数個の欠失、挿入、または置換を有するアミノ酸配列から得られる、抗体。
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