JP2008007508A - Nanbvの診断用薬およびワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を有するポリペプチドに免疫学的に結合し得る抗C型肝炎ウイルス(HCV)モノクローナル抗体。上記少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列は、HCVゲノムから単離した特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドから得られる。さらに薬学的に受容可能な賦型剤中に、少なくとも8個のアミノ酸の連続する配列を含む配列を有するポリペプチドを含有するワクチン組成物。
【選択図】なし
Description
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引用される特許
米国特許第4,341.761号
米国特許第4,399,121号
米国特許第4,427,783号
米国特許第4,444,887号
米国特許第4,466,917号
米国特許第4,472,500号
米国特許第4,491,632号
米国特許第4,493,890号
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発明の開示
本発明は,新しく発見されたNANBV病因因子であるC型肝炎ウイルス(HCV)の単離および特徴付けに関する。さらに詳しくは,本発明は,HCVゲノムの部分的なcDNA複製物群を提供する。これらのcDNA複製物は,以下の新規な工程を包含する方法により単離された:つまり,これまでに単離も特徴付けもされていないウイルス因子のゲノムから誘導される新しく合成された抗原を検出するために,NANBH患者の血清で感染した組織中の粒子状因子から調製されたcDNAライブラリー由来の発見産物をスクリーニングする工程;および非感染個体に比べて感染個体の血清とのみ免疫学的に反応する産物を生産するクローンを選択する工程である。
であって,適当な容器内に,検出されるべきHCV抗原に対する抗体を有するキット;HCV抗原に対する抗体の存在について試料を分析するためのキットであって,適当な容器内に,HCV抗原に存在するHCVエピトープを含むポリペプチドを有するキットである。
工程(a)の個体以外の個体であって該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分および該感染因子に感染していない対照個体と反応させ,その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること;(e)感染した個体および感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体を形成するが,対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を,個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ,該クローンを単離すること;および(f)該工程(e)の宿主細胞クローンからcDNAを単離すること。
I.定義
「C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)」という用語は,非A非B型肝炎(NANBH)の従来知られていなかった病原因子に対して,この分野の研究者が保留していた用語である。従って,本願で用いる場合,「C型肝炎ウイルス(HCV)という用語はNANBHの病原因子を意味し,またこのNANBHは,以前にはNANBVおよび/またはBB−NANBVと呼ばれていたものである。本願では,HCV,NANBVおよびBB−NANBVという用語を互換性のある語として使用する。この用語法を拡張して,以前はNANB肝炎(NANBH)と呼んでいたHCVによって発病する疾患をC型肝炎と呼ぶ。本願では,NANBHとC型肝炎という用語を互換性のある語として使用してもよい。
に示す。
HCVのcDNA配列との同一性は,当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば,推定上のHCV由来のポリヌクレオチドの配列情報と,本願に記載のHCV cDNA配列とを直接比較することによって決定することができる。また例えば,相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下(例えば,S1消化の前に用いられる条件)でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし,次いで一本鎖に特異的なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断し,次に切断によって生成した断片の大きさを測定することによって決定することができる。
A複製法,逆転写法または転写法が挙げられ,これらの方法は,ポリヌクレオチドが誘導される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供する情報に基づいて実施される。さらに,指定された配列の領域に対応する領域の組合わせは,当該技術分野で公知の方法で改変され,意図する用途に合致させることができる。
データバンク(例えば,ジーンバンク)をコンピュータで調査し,他の公知のタンパクとアミノ酸配列を比較することによって決定することができる。
,血清,脊髄液,リンパ液,呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション(section),涙,唾液,乳,白血球および骨髄腫細胞が含まれるが,これに限定されるものではない。
本発明の実施においては,特に指示されない限り,当該分野で既知である分子生物学,微生物学,組み換えDNA,および免疫学の従来の手法が採用される。このような手法は,文献中に充分に説明されている。例えば,次の文献を参照されたい:Manistis,FitschおよびSambrook,MOLECULAR CLONING;A LABORATIRY MANUAL(1982);DNA CLONING,I 巻およびII巻(D.N Glover編集,1985);OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編集,1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編集,1984);TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.Hames および S.J.Higgins 編集,1984);ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編集,1986);IMMOBILIZED CELLS ANDENZYMES(IRL Press,1986);B.Perbal,A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984);
METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ(Academic Press,Inc.);GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H.MillerおよびM.P.Calos編集,1987,ColdSpring Harbor Laboratory);Methods in
EnzymologyVol.154およびVol.155(それぞれWuおよびGrossman;Wu編集),MayerおよびWalker編集(1987);IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL ANDMOLECULAR BIOLOGY(Academic Press,London),Scopes,(1987);PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND
PRACTICE,Second Edition(Springer−Verlag,N.Y.),およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,I 〜IV巻(D.M.Weir およびC.C.Blackwell編,1986)。
ゲノムを単離することにより得られ得る。
慢性HCV感染チンパンジー由来の貯留血清であって,ウイルスを高力価で,つまり少なくとも106チンパンジー感染量/ml(chimp infections doses/ml;CID/ml)を有する血清を,ウイルス粒子を単離するために用いた。そ
して,このウイルス粒子から単離した核酸を,ウイルスゲノムに対するcDNAライブラリーの構築においてテンプレートとして用いた。推定HCV粒子の単離およびλ−gt11におけるcDNAライブラリーの構築のための手順は,IV.A.1節で考察されている。λ−gt11は,β−ガラクトシダーゼを有する融合ポリペプチドとして挿入cDNAを発現するために,そして,特定の抗原に対して生じた特異的な抗血清で多数の組み換え体ファージをスクリーニングするために,特に開発されたベクターである。およその平均サイズが200塩基対のcDNAを有するcDNAプールからのλ−gt11 cDNAライブラリーが以前にNANB肝炎にかかったことのある患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコードされたエピトープについてスクリーニングされた。Huynh,T.V.ら(1985)。約106個のファージがスクリーニングされ,5個の陽性ファージが同定,精製され,次に,HCV因子に以前に感染した異なるヒトおよびチンパンジーから得た血清に対する結合の特異性がテストされた。このファージの1つである5−1−1が,テストしたヒト血清8個のうちの5個と結合した。7個の正常血清はこのような結合を示さなかったので,この結合は以前にNANB肝炎にかかった患者由来の血清に選択的であるらしい。
cDNAに重複するλ−gt11 NANBV cDNAライブラリーからcDNAをスクリーニングし単離するのに用いられた(IV.A.8節)。合成ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする組換えファージ含有cDNAの精製クローンはクローン35と命名され,このクローンの中に含まれるNANBHcDNA配列は第8図に示される。
Collection(ATCC),12301 Parklawn Dr.,Rockville,Maryland 20852,に,ブダペスト条約により寄託されており,次の受託番号を有する。
λ−gt11 ATCC No. 寄託日
HCV cDNAライブラリー 40394 1987年12月 1日
クローン81 40388 1987年11月17日
クローン91 40389 1987年11月17日
クローン1−2 40390 1987年11月17日
クローン5−1−1 40391 1987年11月18日
本出願が米国特許として許可され発行されると,これら寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取り除かれる。そして上記命名された寄託物は,37CFR 1.14および35USC 1.22によりコミッショナーによって権利を与えられた上記出願が係属している間は,入手可能である。さらに,その寄託物は,寄託日から30年間,あるいは寄託物の最終要求から5年間;あるいは,米国特許の有効である期間のいずれか長い方の期間の間,維持される。これらの寄託物およびここで述べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託されたものであり,ここでの記載された内容により本発明を実施することを意図していない。すべての寄託物におけるHCVcDNA配列は,参考として,ここに述べられている。
第1〜46図のcDNA配列を利用して,後述のように単離されたcDNA配列であっても,これらの図のcDNA配列であっても,このようなcDNA配列を利用し得るため,いずれかの鎖においてコードされているポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードす
る発現ベクターの構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域はコートまたはエンベロープ(外被)抗原,あるいはコア抗原由来であり得,それには例えば,ポリヌクレオチド結合タンパク,ポリヌクレオチドポリメラーゼ,およびウイルス粒子の複製および/または構築(assembly)に必要とされる他のウイルス性タンパクが包含される。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは従来の制限消化を用いてあるいは合成法により,cDNAクローンから誘導され,例えばタンパクβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)(好ましくはSOD)のような融合配列の一部を有するベクター中に連結される。SODの融合配列を有するポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは,1986年10月1日に公開されたヨーロッパ特許出願公開番号第0196056号に記載されている。SODおよびHCVポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベクター(つまりNANB5−1−1,NANB81およびC100−3;HCV cDNAの複合配列中にコードされている)は,それぞれIV.B.1,IV.B.2,およびIV.B.4節に記載されている。どちらのセンス鎖においても,オープンリーディングフレームを有するHCV cDNAの所望の部分は,成熟タンパクあるいは融合タンパクのような組換えポリペプチドとして得られる。あるいは,このcDNAにコードされるポリペプチドは,化学合成により供給され得る。
ポリペプチドの抗原性領域は,通常は比較的小さく,代表的には8〜10個あるいはそれを下まわる長さのアミノ酸である。せいぜい5個のアミノ酸フラグメントが抗原性領域を特徴づけている。これらのセグメントは,HCV抗原領域に対応する。従って,このHCVのcDNAを基本的に用いると,HCVポリペプチドの短いセグメントをコードするDNAは,融合タンパクとして,あるいは単離ポリペプチドとして,組換え手法により発現させることができる。さらに,短いアミノ酸配列は,化学合成で都合よく得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピトープを提供するために正しく形成されているが,小さすぎて免疫原性がない場合には,このポリペプチドは,適当なキャリアと結合させることができる。
欠いていれば,システイン残基を付加することにより,この方法が用いられ得る)。これらの試薬は,その試薬自身とあるタンパクのペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合,およびリジンのε−アミノ,あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結合を生成する。このようなさまざまなジスルフィド/アミド形成試薬は公知である。例えば,Immun.Rev.(1982)62:185を参照されたい。他の二官能性カップリング試薬は,ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオ−エーテル生成試薬の多くは市販されており,それには6−マレイミドカプロン酸,2−ブロモ酢酸,2−ヨード酢酸,4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸などの反応性エステルが包含される。このカルボキシル基は,そのカルボキシル基とコハク酸イミドとを,あるいは1−ヒドロキシル−2−ニトロ−4−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性化される。上述の化合物の名称は,それが全てであることを意味せず,その化合物の修飾物もまた明らかに用いられ得る。
HCVのエピトープの免疫原性はまた,粒子形成タンパク(例えば,B型肝炎の表面抗原と結合するタンパク)と融合もしくは結合させた哺乳動物の系あるいは酵母の系で調製することによって増強される。NANBVエピトープが粒子形成タンパクコード配列に直接結合している構築物は,HCVエピトープに関して免疫原性のハイブリッドを産生する。さらに,調製したすべてのベクターはHBVに特異的なエピトープを有し,例えばプレSペプチドのように異なる度合の免疫原性を有する。このように,HCV配列を有する粒子形成タンパクから構築される粒子は,HCVおよびHBVに関して免疫原性である。
ら,(1982)),および例えば哺乳動物細胞(Valenzuela,P.ら,(1984))において形成され,結合して粒子となることが示されている。このような粒子の形成は,単量体のサブユニットの免疫原性を増強することが示されてきた。この構築物はまた,HBSAgの免疫的に優性なエピトープを有し,それはプレ表面(プレS)領域の55アミノ酸を含有する(Neurathら,(1984))。酵母中に発現され得るプレS−HBSAg粒子の構築物は,ヨーロッパ特許出願公開第174,444号(1986年3月19日公開)に開示されている。酵母の発現のための異種ウイルス配列を有するハイブリッドは,ヨーロッパ特許出願公開第175,261号(1966年3月26日公開)に開示されている。これらの出願の出願人は本出願人と同一であり,参考としてここに取り入れられている。
うにして,HCVエピトープと競合する部分から付加的なHBV抗原部位が除去される。
ワクチンは,HCV cDNA由来の免疫原性ポリペプチドおよび第1〜46図のcDNA配列由来の免疫原性ポリペプチド,あるいはこれらが対応するHCVゲノム由来の免疫原性ポリペプチドの1種あるいはそれ以上から調製される。HCVおよびフラビウイルスの間に観察される相同性は,ワクチンとして最も有効でありそうなポリペプチドと,それらがコードされているゲノム領域に関する情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は,Riceら(1986)により考察されている。こフラビウイルスのゲノムRNAは,ウイルス特異的mRNA種のみであると考えられ,これは,3つのウイルスの構造タンパク(つまり,C,MおよびE),そして,2つの大きな非構造タンパク(NV4およびNV5)およびより小さな非構造タンパクの複合体の対に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープは,E(外被:envelope)タンパクに属することは公知である(Roehrig(1986))。対応するHCV E遺伝子およびポリペプチドをコードする領域は,フラビウイルスに対する相同性に基づいて,予想され得る。このように,ワクチンは,HCV Eのエピトープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドは,細菌,酵母,あるいは哺乳動物細胞において発現するか,あるいは,ウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパクもまた,保護抗HCV抗体を生じるエピトープを有し得ることが予期される。このように,E,C,およびMのエピトープを有するポリペプチドもまた,単独であるいは組み合わせて,HCVワクチン中で用いられ得る。
に受容され得,この活性成分と適合性のある賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤としては,例えば,水,生理食塩水,デキストロース,グリセロール,エタノールなど,およびこれらの組み合わせがある。さらに必要に応じて,このワクチンには少量の補助物質が含有され得,それには,補湿剤あるいは乳化剤,pH緩衝剤,および/またはこのワクチンの効果を増強するアジュバントがある。効果的なアジュバントの例としては,次の物質があり,そしてこれらには限定されない:水酸化アルミニウム,N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP),N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP 11637,nor−MDPとする),N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP 19835A,MTP−PEとする),およびRIBI。上記RIBIは細菌から抽出される3つの成分,モノホスホリル脂質A,トレハロースジミコール酸,および細胞壁骨格成分(MPL+TDM+CWS),を,2%スクアレン/トゥイーン80乳液中に含んでいる。アジュバントの効果は,HCV抗原配列を有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定され得る。このポリペプチドは,種々のアジュバントを含むワクチン中のこのポリペプチドを投与することにより生じる。
このワクチンは投薬処方に適合するように,そして予防効果および/または治療効果が得られる量で,投与される。投与される量は,一般に1回の投与あたり抗原が5μg〜250μgであり,この投与量は治療される個体,該個体の免疫系の抗体合成能,および所望する保護の度合に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は,医師の判断によるものであり,それぞれの個体に特有であり得る。
よって決定され,医師の判断による。
さらに,免疫原性のHCV抗原を有するワクチンは,他の免疫調整因子,例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与され得る。
上述のようにして調製される免疫原性のポリペプチドは,ポリクローナル,および,モノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望であれば,選択される哺乳動物(例えば,マウス,ウサギ,ヤギ,ウマなど)はHCVエピトープを有する免疫原性ポリペプチドを用いて免疫される。免疫された動物から得られる血清は回収され,公知の方法によって処理される。
にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体を生じさせるために用いられ得る。
れたい。これらの抗イディオタイプ抗体は,NANBHの治療,およびHCV抗原の免疫原性領域を解明するのにも有用である。
単離されたHCV cDNAの開示部分(第1〜46図に示される部分を包含する)を基本として用いて,約8個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断あるいは合成によって調製され得る。このオリゴマーは,HCVゲノムとハイブリダイズし,このウイルス性因子の同定,さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づけ,および疾患個体のウイルスの検出に有用である。HCVポリヌクレオチドプローブ(天然あるいは誘導された)は,ハイブリダイゼーションによって独特のウイルス配列を検出し得る長さである。6〜8個のヌクレオチドが,その機能を果たし得る長さであるが,10〜12個のヌクレオチド配列が好適であり,約20のヌクレオチドが最も好適であると考えられる。好ましくは,これら配列は,異種性を欠いている領域由来である。これらプローブは自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む,定型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブには,例えば,本明細書で開示されたクローン5−1−1および付加的なクローン,そして,cDNAライブラリーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーがある。HCVゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメントの長さが長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるのであるが,プローブとして使用するには完全な相補性が望まれる。
となるように,標的HCV配列の増幅が行われる。これは,例えば,Saiki ら(1986)の方法によって行なわれ得る。この増幅された配列は,ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて検出され得る。このハイブリダイゼーションアッセイ法は,本願出願人による係属中の米国出願(1987年10月15日出願;代理人のDocket No.2300−0171)中に記載されており,これは,参考文献としてここに取り入れられている。106/mlのレベルで配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ法では,単鎖の分析すべき核酸に結合し,多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利用する。標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる,適当な溶液相のサンドイッチアッセイ,およびプローブの調製法は,1987年6月16日に公開された本願出願人によるEPO 225,807に記載されており,これを参考文献としてここに取り入れる。
HCV抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプチド,およびこれらのポリペプチドのHCV特異的エピトープに対して生じる抗体は,イムノアッセイにおいて,例えば血液または血清試料を包含する生物学的試料におけるHCV抗体の存在,あるいはウイルスおよび/またはウイルス抗原の存在を検出するために有用である。上記HCV抗体は,例えば,IV.A節で記載されたクローン由来であり,あるいは,このクローン内にコードされ,そしてそれらの複合体である。上記HCV特異的エピトープに対して生じる抗体については,例えば,IV.E節を参照されたい。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能であり,これらアッセイの多様性については当該分野では既知である。例えば,このイムノアッセイでは,1種のウイルス抗原が利用され得る。このウイルス抗原は,例えば,IV.A節で記載のHCV cDNAを有するクローンのいずれか由来のポリペプチド,あるいはこれらクローンのcDNA由来の複合cDNA由来のポリペプチド,あるいはこれらのクローンのcDNAが誘導されるHCVゲノム由来のポリペプチドである。あるいは,このイムノアッセイには,これらの源由来のウイルス抗原の組合せが用いられ得る。例えば,ウイルスのエピトープに対する1種のモノクローナル抗体,ひとつのウイルスの抗原に対するモノクローナル抗体の組み合わせ,異なるウイルス抗原に対する複数のモノクローナル抗体,同一のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体,あるいは異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロトコールは,例えば,競合分析法,直接分析法,あるいはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができる。このプロトコールではまた,固体支持体を用いるか,あるいはこのプロトコールは,免疫沈澱法であり得る。ほとんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。この標識物には例えば,螢光分子,化学発光分子,放射性分子あるいは染色分子がある。このプローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては,ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ,および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ(例えば,ELISA アッセイ)がある。
リペプチドあるいはウイルスのポリペプチドは,感染血液提供および感染患者におけるウイルス抗体の検出に有用である。
IV.A.節に記載したクローンのHCV cDNA配列の情報は,第1図〜第46図に示すように,HCVゲノムの配列とHCV因子の同定と単離とについての情報をさらに得るために用いられ得,その結果,ゲノムの性質,ウイルス粒子の構造,およびウイルスが有する抗原の性質を含めたウイルスの特性決定の助けになる。さらに,この情報によって,付加的なポリヌクレオチドプローブ,HCVゲノム由来のポリペプチド,およびHCVが原因のNANBHの診断および/または治療に有用なHCVエピトープに対応する抗体が得られるようになる。
るのに有用なcDNAライブラリーもまた,当該技術分野で公知の他のベクター内,例えばλgt10〔ヒュインら(Huynh et al),1985年〕内で構築することができる。第1〜46図のcDNA由来のプローブ,およびこれらcDNA由来のポリヌクレオチドから合成されたプローブによって検出された,HCV由来のcDNAは,単離されたポリヌクレオチドを,適当な制限酵素で切断することによって,クローンから単離し,配列を決定することができる。例えば,クローン5−1−1中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単離と配列決定とに使用される手法については,IV.A.3節およびIV.A.4節を;クローン81中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単離と配列決定とについては,IV.A.5〜IV.A.7節を;そして,他のクローン(クローン36)およびクローン81と重複するクローンの単離と配列決定とについては,IV.A.8節およびIV.A.9節を参照されたい。
ーナル抗体の精製法は,IV.E.節に記載されているが,類似の精製法を,他のHCV抗原に対する抗体に利用することができる。
4iの上流の遺伝子の5’末端に位置し得る。さらに,他のフラビウイルスと比較することによって,これらのタンパクをコードする配列の正確な位置を予想することができる。
HCVがフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスであるという示唆によって,HCV増殖法についての情報が提供される。“フラビ様”という用語は,そのウイルスが,フラビウイルスの公知の保存された領域に対して有意の相同性を示し,そして,そのゲノムの大部分が単一のORFであることを意味する。フラビウイルスの培養法は,当業者に公知である〔例えば,ブリントン(1986年)およびストラー,ブイ(Stollar,V.)(1980年)の総論を参照されたい〕。一般に,HCVを培養するのに適切な細胞もしくは細胞としては,フラビウイルスの複製を維持することが知られているもの,例えば次のものがある:サル腎臓細胞系(例えば,MK2,VERO);ブタの腎臓細胞系(例えば,PS);ベビーハムスターの腎臓細胞系(例えば,BHK);ネズミマクロファージ細胞系(例えば,P388D1,MK1,Mm1);ヒトマクロファージ細胞系(例えば,U−937);ヒト末梢白血球;ヒトの付着性単球;肝細胞もしくは肝細胞系(例えば,HUH7,HEPG2);胚もしくは胚細胞系(例えば,ニワトリの胚繊維芽細胞);または無脊椎動物由来の細胞系。上記無脊椎動物由来の細胞系として好ましいのは昆虫由来のもの(例えば,ショウジョウバエの細胞系)であり,さらに好ましいのは節足動物由来のもので,例えば蚊の細胞系〔例えば,A.アルボピクツス(A.Albopictus),イーデス イージプチー(Aedesaegypti),クーテックス トリテニオリンクス(Cutex tritaeniorhynchus)〕もしくはダニ細胞系〔例えば,RML−14 ダーマセンター パルマペルツス(Dermacentor parumapertus)〕である。
生体内で感染した細胞が生体外で継代された例である。さらに,種々の永久増殖細胞化法を,肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いることができる。例えば,一次肝臓培養物(肝細胞集団の集積の前後)は,種々の細胞と融合され,安定性を保持する。例えば,永久的または半永久的細胞系を創製するために,培養物を,形質転換ウイルスに感染させるか,または形質転換遺伝子でトランスフェクトさせる。さらに,例えば,肝臓培養物中の細胞は,融合されて,確立された細胞系(例えば,HepG2)となり得る。細胞融合法は,当該技術分野で既知であり,例えば,ポリエチレングリコール,センダイウイルスおよびエプスタイン−バールウイルスのような融合因子が使用される。
HCVの細胞培養物と動物モデル系とを利用することによって,HCVの複製を阻害する抗ウイルス剤,特に優先的に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング法は,当業者には知られている。一般に,抗ウイルス剤は,ウイルスの複製を維持する細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と,動物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害する効果(および低レベルの毒性)について種々の濃度で試験される。
したHCV cDNA内にコードされたポリペプチドは,これらの競合検定法に有用である。一般に,HCVcDNA由来の組換え体HCVポリペプチドに標識化し,この標識化ポリペプチドとHCVポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によって阻害されるのを監視する。さらに,これらの方法は,HCVが細胞系内で細胞死を起こすことなく複製できる場合,特に有用である。
上記のことに加えて,組織培養系および/または動物モデル系を利用して弱毒化されたHCV株を単離することができる。これらの株は,ワクチン用もしくはウイルス抗原単離用に適している。弱毒化ウイルス株は,細胞培養および/または動物モデルでの複数の継代の後に単離可能である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検出は,当該技術分野で公知の方法で達成できる。それには,例えば,HCVにコードされたひとつまたはそれ以上のエピトープに対する抗体をプローブとして用いること,あるいは,少なくとも約8個のヌクレオチドのHCV配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いることが包含される。その代わりにあるいはそれに加えて,弱毒化株は,本明細書に記載のHCVのゲノム情報と,組換え技術を利用して構築することができる。一般に,例えば病原に関連するポリペプチドをコードするがウイルスの複製は可能であるようなゲノム領域を除去することを試みることができる。さらに,このゲノム構築によって,HCVに対する抗体の中和を起こさせるエピトープの発現が可能になる。次いで,変化させたゲノムは,HCV複製が可能な細胞と,ウイルス複製が可能な条件下で増殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒化HCV株は,ワクチン製造のみならずウイルス抗原の商業的生産ソースとしても有用である。その理由は,これらウイルスの処理が,ウイルス生産を行う従業員に対してそれほど厳重な保護対策をとらなくてもよいからである。
ウイルスからのゲノムの抽出,cDNAライブラリーの調製とプロービング,クローンの配列決定,発現ベクターの構築,細胞の形質転換,ラジオイムノアッセイおよびELISA検定法のような免疫検定の実施,培地での細胞の培養などに用いられる一般的な方法は,当該技術分野で公知であり,これらの方法を記載した実験室のマニュアルを入手することができる。しかし,一般的な指針として,上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
原核および真核の宿主細胞は,指定された宿主に適合する適切な制御配列が用いられた場合に,所望のコード配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち,エシェリヒア コリ(E.coli)が最も汎用される。原核細胞の発現制御配列には,必要に応じてオペレーター部分を有するプロモーター,およびリボソーム結合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスファーベクターは,通常,例えば次のようなものに由来する。つまり,アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるpBR322および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有する種々のpUCベクター由来である。これらのマーカーは,適宜選択することによって,好適な形質転換細胞を得るのに利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配列には,β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系〔チャンら(Chang et al),1977年〕,トリプトファン(trp)プロモーター系〔ゴーデルら(Goeddel et al),1980年〕およびλ由来PLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケら(Shimatake et al),1981年〕,およびtrpおよびlac UV5プロモーターの配列由来のハイブリッドtacプロモーター〔ド ボールら(DeBoer et al),1983年〕がある。上記の系は,特にE.coliに適合する。必要であれば,バシラスもしくはシュードモナス属の菌株のような他の原核宿主を,対応する制御配列とともに用いてもよい。
al),1968年;ホーランドら(Holland et al),1978年〕を含み,このようなプロモーターには,3−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン(Hitzeman),1980年〕に対するプロモーターが含まれる。ターミネーターには,例えばエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター〔ホーランド(Holland),1981年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は,グリセルアルデヒド3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素(ADH)調節性プロモーター,GAPDH由来のターミネーター,および分泌が所望の場合には,酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さらに,作動可能に連結されている転写調節領域および転写開始領域は,野生型生物に本来関係しないものであってもよい。これらの系については,欧州特許公開第120,551号(1984年10月3日公開);同第116,201号(1984年8月22日公開);および同第164,556号)(1985年12月18日公開)に詳細に記載されており,これらはすべて本発明の出願人によるものであり,本願に引用文献として記載する。
形質転換は,ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例えば,ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージングし,次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用される形質転換法は,形質転換すべき宿主に依存する。例えば,E.coli宿主細胞を,BB−NANBV配列を有するλgt11で形質転換することが後述の実施例の項で述べられている。直接取込み法による細菌の形質転換には,一般に,塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン(Cohen),1972年;マニアティス,1982年〕。直接取込み法による酵母の形質転換は,ヒネンら(Hinnen et al),1978年,の方法を用いて行われ得る。直接取込み法によ
る哺乳類の形質転換は,グラハム(Graham)およびファン デル エプ(Van der Eb)1978年,のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ得る。
ベクターの構築には,当該技術分野で公知の技術が用いられる。部位特異的なDNAの切断が,適切な制御酵素を用い,これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定されている条件下で処理することによって,実施される。一般に,約1μgのプラスミドもしくはDNA配列は,約20μlの緩衝溶液中で1単位の酵素を用いて37℃の条件下で1〜2時間インキュベートすることにより切断される。制限酵素とともにインキュベートした後,タンパクを,フェノール/クロロホルムによって抽出して除去し,エタノールで沈澱させてDNAが回収される。切断断片は,Methodsin Enzymology,65巻,499〜560頁,1980年,に記載された一般的な方法に従って,ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法により分離することができる。
合成オリゴヌクレオチドは,ワーナー(Warner)(1984年)が発表した自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。必要に応じて,合成DNA鎖は,反応の標準条件を用いて,32P−ATPの存在下,ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって32Pで標識化され得る。
ーションにより同定された配列は,回収されクローン化される。
DNAライブラリーは,グリンスタイン(Grunstein)およびホッグネス(Hogness)(1975年)の方法を用いてプローブ化され得る。簡単にのべれば,この方法においては,プローブ化されるべきDNAは,ニトロセルロースフィルター上に固定され,変性され,そして,0〜50%ホルムアミド,0.75M NaCl,75mM
クエン酸ナトリウム,各々0.02%(wt/v)のウシ血清アルブミン,ポリビニルピロリドンおよびフィコール,50mMリン酸ナトリウム(pH6.5),0.1% SDS,そして100μg/mlキャリアの変性DNAを含有する緩衝液で,プレハイブリダイゼーションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度(%),およびプレハイブリダイゼーションおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件は,必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど必要ではない条件下でのオリゴマーのプローブは,一般に,ホルムアミドが低い濃度であり,低温および長いハイブリダイゼーションの時間で用いられる。cDNAもしくはゲノムの配列由来のような30もしくは40を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いるときには,一般に,例えば,約40〜42℃のような高温,および50%ホルムアミドのような高濃度が採用される。プレハイブリダイゼーションに続いて,5’末端32Pで標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し,この混合物中で,ハイブリダイゼーションの条件下にて,上記フィルターをインキュベートする。洗浄後,処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示される。もとの寒天プレート上の,対応する位置のDNAを所望のDNAの起源として利用する。
常套手段により,ベクターを構築する際には,連結混合物を用いてE.coli HB101株もしくは他の適当な宿主を形質転換し,成功裏に形質転換された形質転換体は,抗生物質耐性もしくは他のマーカーによって選択される。次に,得られた形質転換体から,プラスミドが,クレウェルら(Clewell et al.)(1969年)の方法により調製され,通常,さらに,クロラムフェニコールによる増幅(クレウェル,1972年)が行なわれる。そのDNAは,単離され,通常,制限酵素分析法および/または配列決定法により分析される。配列決定は,サンガー(Sanger)ら(1977)の,そしてさらにメシング(Messing)らにより述べられた(1981年),ジデオキシ法,あるいはマキシムらの方法(1980年)により実施され得る。GCに富んだ領域において時おり観察されるバンドコンプレッションの問題は,バールら(Barr et
al)(1986年)の方法に従って,T−デアゾグアノシン(deazo−guanosine)を用いることによって克服された。
III.G.酵素連結イムノソルベント検定法(ELISA法)
ELISA法は,抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は,酵素と,抗原もしくは抗体との結合に依存し,定量の標識として,結合した酵素の活性を用いる。抗体を測定するには,既知の抗原を固相(例えば,マイクロプレートまたはプラスチック製カップ)に固定し,被検血清の希釈物とともにインキュベートし,洗浄し,酵素で標識した抗免疫グロブリンとともにインキュベートし,再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は,当該技術分野で公知であり,例えば,西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は,特異的な基質を添加し,そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定することによって測定される。結合した酵素の活性は,結合した抗体の量の一次関数である。
IV.A.1 HCV cDNAの調製
NANB因子の原材料は,慢性NANBHのチンパンジーから得た血漿プールであった。このチンパンジーは,プールしたヒト血清由来の第8因子濃縮物混入バッチ中のHCVで感染させて得られる別の慢性NANBのチンパンジー由来の血液で,実験的に感染させられている。このチンパンジーの血漿プールは,高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ活性(この活性はHCV感染による肝障害に起因する)を有する多くの個体の血漿試料を合わせて調製されたものである。静脈注射により投与されたこの血清プールの10−6倍希釈液の1mlは,別のチンパンジーにNANBHを引き起こしたので,そのCIDは少なくとも106/mlである。つまり,高いウイルス感染力価を有する。
組換え体ファージ5−1−1のcDNAを,Sangerら(1977)の方法により配列決定した。本質的には,cDNAをEcoRIで切断し,ゲル電気泳動を用いてサイズ分画することにより単離した。EcoRI切断フラグメントをM13ベクターであるmp18およびmp19にサブクローン化し(Messing(1983)),Sangerら(1977)のジデオキシ鎖終止法を用いて配列決定した。得られた配列を第1図に示す。
クローン5−1−1のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAを,第1図に示すようなクローン5−1−1のHCV cDNAの配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いて,IV.A.1.
節で記述したのと同様に作成したλ−gt11ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。スクリーニングに用いたポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’−TCCCTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT
GAG AGC ACT CTT CCA TCT
CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAGGT−3’。
クローン81,1−2,および91の3つのcDNAのヌクレオチド配列は,IV.A
.2.節で述べたのと本質的に同様にして決定した。これらのクローンの配列は,ファージ5−1−1のHCV cDNA配列に関連しており,第2図で示される。第2図は,検出されたHCVエピトープをコードする鎖を示しており,ヌクレオチド配列における相同性が配列間の垂直線により示されている。
クローン81 cDNAの配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,以下のようにして行った。IV.A.1.節に記述したようにして調製したλ−gt11 cDNAライブラリーを,クローン81の5’末端配列と相同性を有する合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。クローン81の配列を第4図に示す。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’ CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3’
方法は,Huynh(1985)に記載されているのと本質的に同じであったが,厳密な条件下でライブラリーのフィルターを2回洗浄した。すなわち,5×SSC,0.1% SDS中で55℃にてそれぞれ30分間洗浄を行った。約50,000個のクローンのうち1個のクローンがこのプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する陽性組換え体ファージを単離・精製した。このファージにクローン36という番号を付けた。
グに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は,次のようであった:
5’TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA
CAG 3’
この後者の配列とハイブリダイズしたcDNAを有する陽性組換え体ファージを単離・精製し,クローン32という番号を付けた。
クローン36のcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節に記述したようにして決定した。このcDNAの二本鎖配列,クローン81のHCVcDNAとオーバーラップする該cDNAの領域,およびORFによりコードされるポリペプチドを第5図に示す。
クローン32のcDNAのヌクレオチド配列は,クローン5−1−1の配列についてIV.A.2.節で記述したのと本質的に同様にして決定した。配列のデータは,クローン32組換え体ファージのcDNAが,二つの異なる材料原由来であることを示した。
cDNAの一つのフラグメントはHCVゲノム由来の418ヌクレオチドを有し;他のフラグメントはバクテリオファージMS2ゲノム由来の172ヌクレオチドを有していた。このバクテリオファージMS2ゲノムは,λ−gt11血漿cDNAライブラリーの調製の間キャリアとして用いたものである。
IV.A.8.クローン36のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン36 cDNA の配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,クローン81のcDNAとオーバーラップする配列についてIV.A.5.節に記述したようにして行った。ただし,合成ポリヌクレオチドはクローン36の5’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは,次のようであった:
5’AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG
CCC 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを,クローン35と命名した。
クローン35のcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン36のcDNA配列とオーバーラップした該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第8図に示す。
一つのポリペプチドをコードする。第9〜10図は,クローン35,36,81,および32にわたって延びている長く連続したORFの配列を,該配列でコードされる推定HCVポリペプチドと共に示す。この配列は,この結合配列は,同じλ−gt11 cDNAライブラリー由来の他の独立したcDNAクローンを用いて確認されている。
IV.A.10.クローン35のcDNAにオーバーラップするHCV cDNAの単離
クローン35 cDNAの配列の上流にあり,該配列とオーバーラップするHCV cDNA配列の単離を,クローン36のcDNAとオーバーラップする配列についてIV.A.8.節に記述したようにして行った。ただし,合成ポリヌクレオチドはクローン35の5’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは,次のようであった:
5’ CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを,クローン37bと命名した。
クローン37bのcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン35のcDNAの配列にオーバーラップする該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第11図に示す。
クローン32の下流のHCVc DNA配列の単離は,以下のようにして行った。まず,クローンclaを,クローン32のHCVcDNA配列のヌクレオチド配列に基づいた合成ハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。方法は,本質的にIV.A.5.節に記述したとおりであった。ただし,合成プローブの配列は次のようであった:
5’AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC
CTT 3’。
5’TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA
GCT 3’。
。
クローン33bのcDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節で記述したようにして決定した。この配列,クローン32のcDNAの配列とオーバーラップする該配列の領域,および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを,第12図に示す。
クローン37bおよびクローン33bのcDNAにオーバーラップするHCV cDNAを単離するために,これらのクローンのcDNA由来の次の合成オリゴヌクレオチドプローブを用い,本質的にIV.A.3.節に記述した方法を用いて,λ−gt11ライブラリーをスクリーニングした。それぞれ,クローン37bおよび33bの配列にオーバーラップするHCVcDNA配列を有するコロニーを検出するためのプローブは,次のようであった:
5’ CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3’
および
5’ TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3’
約50,000個のクローンのうち1個のクローンが,それぞれのプローブを用いて検出された。クローン37bのcDNAの上流にあり,該cDNAにオーバーラップするcDNAを有するクローンを,クローン40bと命名した。クローン33bのcDNAの下流にあり,該cDNAにオーバーラップするcDNAを有するクローンを,クローン25cと命名した。
クローン40bおよびクローン25cのcDNAのヌクレオチド配列は,IV.A.2.節で記述したのと本質的に同様にして決定した。40bおよび25cの配列,クローン37bおよび33bのcDNAにオーバーラップする該配列の領域,およびそこでコードされる推定ポリペプチドを,第13図(クローン40b)および第14図(クローン25c)に示す。
複合HCV cDNAであるC100は,以下のようにして構築した。まず,クローン36,81,および32由来のcDNAをEcoRIを用いて切り出した。各クローン由来のcDNAのEcoRIフラグメントを,ベクターpGEM3−blue(Promega Biotec)のEcoRI部位に個々にクローン化した。クローン36,81,および32由来のcDNAを有する得られた組換え体ベクターを,それぞれpGEM3−blue/36,pGEM3−blue/81,およびpGEM3−blue/32と命名した。適当な方向性を有するpGEM3−blue/81組換え体をNaeIおよびNarIで切断し,大きい(約2850bp)フラグメントを精製した。そしてこの
フラグメントを,pGEM3−blue/36から得た小さな(約570bp)NaeI/NarI制限フラグメント精製物と連結した。このクローン36および81由来のcDNAの複合配列を,これらのクローンのオーバーラップしているcDNAに含まれる,連続的なHCV ORFを有する他のpGEM3−blueベクターを作成するのに用いた。次いで,約680bpのフラグメントを切り離すために,この新しいプラスミドをPvuIIおよびEcoRIで切断した。次いで,このフラグメントを適当な方向性を有するpGEM3−blue/32プラスミドから単離した小さな(580bp)PvuII/EcoRIフラグメントと連結した。そして,クローン36,81,および32由来の複合cDNAを,IV.B.1.節に記述されているベクターpSODcf1をEcoRIで直線化させたものに連結し,これを細菌においてクローン5−1−1を発現するのに用いた。複合HCV cDNAの約1270bpのEcoRIフラグメント(C100)を有する組換え体を選択し,プラスミド由来のcDNAをEcoRIで切断し,精製した。
クローン14i,11b,7f,7e,8h,33c,14c,8f,33f,33g,および39cのHCV cDNAを,IV.A.1.節に記述したHCV cDNAのλ−gt11ライブラリー由来のオーバーラップしたcDNAフラグメントを単離する方法により単離した。使用した方法は,IV.A.3.節に記述したのと本質的に同様であった。ただし,使用したプローブは,最後に単離したクローンのヌクレオチド配列の,複合HCV配列の5’末端および3’末端から設計されたものである。以下に記述するプローブとハイブリダイズするクローンの頻度は,それぞれの場合で約50,000個につき1個であった。
れている。33cを単離するのに用いたプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’ ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3’。
5’ AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3’。
5’ TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3’。
5’ ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3’。
5’ TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3’。
5’ TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3’。
5’ GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3’。
5’AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA
TAA T 3’。
5’ CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3’。
5’ CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3’。
5’ CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3’。
複合HCV cDNA配列を作成するために,前述の単離クローンのHCV cDNA配列を並べた。5’から3’の方向に並べた単離クローンは:14i,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33gおよび39cである。
を,第29〜34図に示す。
cDNAを有する。クローン33cにおいては,他の5つのオーバーラップしているクローンと同様に,789番目のヌクレオチドはGである。しかし,クローン37bにおいては(IV.A.11.節を参照のこと),対応するヌクレオチドはAである。この配列の違いは,該配列でそれぞれGまたはAに対してコードされるアミノ酸は,CYSまたはTYRのいずれかであるという明らかな異質性をもたらす。この異質性は,タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を有し得る。
クローン12f,35f,19g,26g,および15eのHCV cDNAを,本質的にIV.A.17.節に記述した方法により単離した。ただし,プローブは以下に示すようであった。クローンがこのプローブとハイブリダイズする頻度は,それぞれの場合で約50,000個につき1個であった。これらのクローンのHCV cDNAのヌクレオチド配列は,本質的にIV.A.2.節に記述したようにして決定した。ただし,クローン5−1−1から単離したcDNAの代わりに,指示したクローン由来のcDNAを用いた。
,クローン14iのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は,次のようであった:
5’TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC
CAA 3’。
5’ AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3’。
5’TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC
TCC 3’。
5’TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT
GTG 3’。
5’CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC
AAC 3’。
クローン12f
クローン35f
クローン15e
前述の単離クローンのHCV cDNA配列は,複合HCV cDNA配列を作成するのに並べられている。5’から3’の方向に並べられた単離クローンは:12f,14i
,7f,7e,8h,33c,40b,37b,35,36,81,32,33b,25c,14c,8f,33f,33g,39c,35f,19g,26g,および15eである。
上流の配列の逆転写を開始させるために,クローン12fのHCV cDNA由来の第40〜46図の5’HCV配列のほとんどに基づいて,逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し,HCVゲノムRNA中の対応する配列に結合させるのに用いる。プライマー配列はクローン12fの既知の5’末端配列に近いが,プライマー配列上流のプローブ配列の設計を許容するのに十分に下流である。プライミングおよびクローニングの公知の標準法が用いられる。得られたcDNAライブラリーは,プライミング部位(クローン12fの明らかにされた配列から推定される)の上流の配列を用いてスクリーニングされる。HCVゲノムRNAは,NANBHのチンパンジー由来の血漿または肝臓試料,またはNANBHのヒト由来の類似の試料のいずれかから得られる。
HCV RNAゲノムの5’最末端配列を単離するために,逆転写の初回cDNA生成物(これは,鋳型RNAにより二本鎖とされる)を,オリゴCで尾部付加処理する。これは,この生成物をCTP存在下でターミナルトランスフェラーゼとインキュベートすることにより行われる。cDNAの第一鎖の相補鎖を生成させる第2回のcDNA合成は,逆転写酵素反応のプライマーとしてオリゴGを用いて行われる。ゲノムHCV RNAの材料源は,IV.A.20.節で記述したのと同様である。ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾部付加処理,および逆転写酵素反応のための方法は,Maniatisら(1982)と同様である。次いで,cDNA生成物をクローン化し,スクリーニングし,そして配列決定する。
この方法は,フラビウイルスのRNAのcDNAをクローニングするために以前に使用された方法に基づいている。この方法では,RNAは,3’末端の二次構造を除去するために変性条件に置かれる。そして,その後rATPを基質として用い,ポリAポリメラーゼで尾部付加処理される。ポリAを尾部付加処理したRNAの逆転写は,オリゴdTをプライマーとして用い,逆転写酵素により触媒される。cDNAの第2鎖を合成し,cDNA生成物をクローン化し,スクリーニングし,そして配列決定する。
λ−gt11ライブラリーを作成し,スクリーニングするのに用いた方法は,IV.A.1.節に記述したのと本質的に同様である。ただし,ライブラリーはセファロースCL−4Bカラムから溶出した大きなサイズのcDNAのプールから作成した。
新しいHCV cDNAライブラリーは,IV.A.1.節に記述した感染チンパンジーの血漿プール由来のRNAから,ならびにこの感染動物の肝臓由来のポリA+RNA画
分から調製されている。cDNAは,GublerおよびHoffman(1983)により記述されているのと本質的に同様にして構築した。ただし,最初のcDNA鎖合成のためのプライマーは,前述のHCVゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであった。クローン11bおよび7eの配列に基づいたプライマーは,それぞれ,
5’ CTG GCT TGA AGA ATC 3’
および
5’ AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3’
であった。得られたcDNAは,λバクテリオファージベクターにクローン化し,配列が第40〜46図のHCV配列に基づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてスクリーニングした。
IV.B.1.クローン5−1−1においてコードされるポリペプチドの発現
クローン5−1−1においてコードされるHCVポリペプチド(IV.A.2.節を参照のこと,前出)を,スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)との融合ポリペプチドとして発現させた。これは,以下のように,クローン5−1−1のcDNAインサートを発現ベクターpSODcf1(Steimerら(1986))にサブクローン化することにより行った。
5’ GAT CCT GGA ATT CTG ATAA 3’
3’ GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5’
クローニングの後,インサートを有するプラスミドを単離した。
クローン81に含まれるHCV cDNAを,SOD−NANB81融合ポリペプチドとして発現させた。この融合ポリペプチドをコードするベクターを調製するための方法は,SOD−NANB5−1−1をコードするベクターを作製するのに用いたのと類似の方法であった。ただし,HCV cDNAの材料源はクローン81であり,これはIV.A.3節で記述したように単離され,cDNA配列がIV.A.4節で記述したように決定されたものである。クローン81のHCVcDNAのヌクレオチド配列,および該配列でコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を,第4図に示す。
した。
クローン5−1−1のHCV cDNA内にコードされるポリペプチドを,NANBHに感染したチンパンジーおよびヒトの血清が融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1と免疫学的に反応することを証明することにより,NANBH関連抗原として同定した。このSOD−NANB5−1−1は,そのN末端にスーパーオキサイドジスムターゼを,そしてそのC末端にフレーム内(in−frame)の5−1−1抗原を有する。この同定は,以下のような“ウェスタン”ブロッティング法(Towbinら(1979))により行った。
パンジーまたはHBVに感染した3匹のチンパンジーでは観察されなかった。これらの場合における唯一の結合は,HCVに感染した試料でも生じる,宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドであった。
クローン36,81および32にわたるORFでコードされるHCVポリペプチドを,SODとの融合ポリペプチドとして発現させた。これは,複合cDNAであるC100をヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する発現カセットに挿入すること,発現カセットを酵母の発現ベクターに挿入すること,および酵母でポリペプチドを発現させることにより行った。
のGAPDH転写終結信号を含む発現カセットを有する。これらの制御要素およびスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する同様のカセットは,Cousensら(1987),および本発明の出願人による同時係属のヨーロッパ特許出願第196,056号(1986年10月1日公開)に記載されている。しかしながら,pS3−56のカセットはCousensら(1987)のカセットとは異なる。pS3−56のカセットには,異種のプロインシュリン遺伝子および免疫グロブリンのヒンジが欠失しており,かつスーパーオキサイドジスムターゼのgln154にEcoRI部位を有するアダプター配列が続いている。このアダプターの配列は次のようである:
5’−AATTTG GGA ATT CCA TAA TGA G −3’AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT。
−asn−leu−gly−ile−arg−。
cDNAを有する発現カセットをpS3−56C100からBamHIで切り出し,このカセットを有する約3400bpのフラグメントを単離・精製した。次いで,このフラグメントを酵母ベクターpAB24のBamHI部位に挿入した。
養物は,1%グルコースを含有するYEPで生育させることにより,SOD−C100ポリペプチド(C100−3と呼ぶ)を発現するように誘導された。
酵母JSC 308株内のプラスミドpAB24C100−3から発現するC100−3融合ポリペプチドを,サイズについて特徴付けした。そして,C100内にコードされるポリペプチドを,その慢性NANBHのヒト由来の血清との免疫学的反応性によりNANBH−関連抗原として同定した。
N末端にSODを,そしてC末端にフレーム内(in−frame)のC100 HCV−ポリペプチドを有する融合ポリペプチドC100−3を,ポリペプチドが発現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分を分別抽出することにより精製した。
トリスHCl(pH 8.0),1mM ジチオスレイトール,および1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する溶液(緩衝液A)中に,33%細胞(v/v)の割合で,酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁液の所定量(15ml)を等量のガラスビーズ(直径0.45−0.50mm)と混合し,この混合物をSuper
Mixer(Lab Line Instruments,Inc.)の最高速度で8分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよびガラスビーズを分離し,もとの細胞沈澱物と同様に,ガラスビーズを等量の緩衝液Aで3回洗浄した。洗浄液とホモジネートとを合わせた後,ホモジネートを7,000×gで15分間,4℃で遠心分離し,ペレットをもとの細胞沈澱物の2倍量に相当する量の緩衝液Aに再懸濁し,7,000×gで15分間遠心分離して物質を再びペレットとすることにより,溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を3回繰り返した。
IV.C.1.HCV cDNAにハイブリダイズする,NANBHのチンパンジーの肝臓内のRNAの同定
以下のように,NANBHのチンパンジーの肝臓由来のRNAは,ノーザンブロットによりクローン81に含有されるHCV cDNAとハイブリダイズする種類のRNAを含有することが示された。
Na2HPO4(pH 6.5),0.1%SDS,0.02%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA),0.02%(w/v)フィコール−400,0.02%(w/v)ポリビニルピロリドン,100μg/mlの超音波処理および変性処理によりせん断したサケ精子DNA,および106CPM/mlのニックトランスレーションしたcDNAプローブを含有する溶液中で18時間,42℃で行った。
cDNAプローブにハイブリダイズし,かつ約5000ヌクレオチドから約11,000ヌクレオチドの大きさと考えられる,ポリA+RNA分子関連の異種集団を含有する。HCV cDNAにハイブリダイズするこのRNAは,細菌ゲノムおよび/または細菌ゲノムの特異的転写物を意味し得る。
う示唆と一致する。
IV.A.1.節で記述したように,核酸を,高力価のチンパンジーNANBH血漿から単離した粒子から抽出した。単離した核酸の一定量(もとの血漿の1mlに相当する)を,20μlの50mMHepes(pH 7.5),1mm EDTAおよび16μg/ml酵母可溶性RNAに再懸濁した。試料は,5分間煮沸した後,直ちに凍結することにより変性させ,RNaseA(5μl;25mM EDTA溶液,40mMHepes(pH 7.5)に0.1mg/ml RNase Aを含有する)またはDNase I(5μl;10mM MgCl2,25mM Hepes(pH 7.5)中に1単位のDNaseIを含有する)で処理した。対照の試料は,酵素なしでインキュベートした。インキュベーションの後,2μg/ml酵母可溶性RNAを含有する230μlの氷冷2×SSCを添加し,試料をニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを,ニックトランスレーションにより32P−標識したクローン81由来のcDNAプローブとハイブリダイズさせた。第56図は,このフィルターのオートラジオグラフを示す。ハイブリダイゼーションのシグナルは,DNase処理試料および対照試料(それぞれ,レーン2および1)で検出されたが,RNaseで処理した試料(レーン3)では検出されなかった。このように,RNase A処理により粒子から単離した核酸が分解され,DNase処理は何の影響もなかったので,この証拠により,HCVゲノムがRNAにより構成されるということが強く示唆される。
NANBHを有するチンパンジーの肝臓および血漿中に存在するHCV核酸,および対照のチンパンジーにおけるHCV核酸は,基本的にSaikiら(1986)が記述したポリメラーゼ鎖反応(PCR)の手法を用いて増幅された。このプライマーオリゴヌクレオチドは,クローン81,あるいはクローン36および37におけるHCV cDNA由来であった。この増幅された配列は,適当なcDNAオリゴマー(これは,2つのプライマーの間の領域を有するが2つのプライマーを含まない)をプローブとして用い,ゲル電気泳動およびサザンブロッティングによって検出された。
:1(99:2)〕溶液で2度抽出し,その後等容量のクロロホルム/イソアミルアルコール(99:1)の混液を用いて,2度抽出した。遠心分離により相分離し,水相を,酢酸ナトリウムの最終濃度が0.2Mとなるようにし,エタノールを2倍量添加することにより核酸を沈澱させた。沈澱した核酸は,SW41のローターで38Kにて4℃で60分間超遠心分離を行なうことにより回収した。
5’ CAA TCA TAC CTG ACA G 3’
および
5’ GAT AAC CTC TGC CTG A 3’。
5’ GCA TGT CAT GAT GTA T 3’。
5’ ACA ATA CGT GTG TCA C 3’。
HCV抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノアッセイは,TsuおよびHe
rzenberg(1980)の方法を基にして開発された。マイクロタイタープレート(Immulon 2,Removawellstrips)をHCVエピトープを有する精製ポリペプチドで被覆する。この被覆プレートは,HCVエピトープに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試料,あるいは適当な対照試料とともにインキュベートされる。インキュベートを行なう間に,抗体が存在するのであれば,該抗体は固相抗原に免疫学
的に結合する。非結合物質を除去し,そしてこのマイクロタイタープレートを洗浄後,ヒト抗体−NANBV抗原複合体は,125I標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートすることによって検出される。結合しなかった標識抗体を吸引によって除去し,そしてプレートを洗浄する。個々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト抗HCV抗体の量はウェル中の放射能に比例する。
IV.B.1.節に記載の組換え体細菌中で発現する融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1は,組換え体E.coliから,尿素で細胞抽出物を分画抽出することによって,次いで,次のように陰イオンおよび陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかけることによって精製された。
IV.B.2.節で記載の組換え体細菌中で発現した融合ポリペプチドSOD−NANB81は,組換え体E.coliから,尿素を用いた細胞抽出物の分画抽出により,次いで,融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1を単離するために記載された工程(IV.D.1.節を参照されたい)を用いて,陰イオンおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行なうことにより精製された。
IV.D.3.固相ラジオイムノアッセイによるHCVエピトープに対する抗体の検出
NANBHを有すると診断された32人の患者から得られる血清試料を,ラジオイムノアッセイ(RIA)によって分析し,融合ポリペプチドSOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81中に存在するHCVエピトープに対する抗体が検出されるか否か決定した。
同程度に反応するが,これに対してNo.2,4,7および9の患者から得られる血清試料においては,SOD−NANB81に対するよりもSOD−NANB5−1−1に対する反応の方が,2〜3倍反応性が高かった。これらの結果によりNANB5−1−1およびNANB81が少なくとも3個の異なるエピトープを有し得ることが示唆される。つまり,各ポリペプチドが少なくとも1個の独特のエピトープを有し,そして,2個のポリペプチドが少なくとも1個のエピトープを共有していることが可能である。
IV.D.4.NANBHについての固相RIAの特異性
NANBHについての固相RIAの特異性は,HAVあるいはHBVに感染した患者から得られる血清および対照個体から得られる血清の分析を行なうことにより試験された。部分精製されたSOD−NANB5−1−1およびSOD−NANB81を使用する分析は,実施例IV.D.3節に記載した方法により行なわれた。但し,血清は,HAVあるいはHBVを有しているとあらかじめ診断された患者から得られた血清であるか,あるいは血液バンクの提血者である個体から得られた血清である。HAVおよびHBV感染患者からの血清についての結果を表1および表2に示す。HAV感染患者から得られた11個の血清試料,およびHBV感染患者から得られた20個の血清試料を用いて,RIAにより試験が行なわれた。表1および表2に示すように,これら血清のいずれもがBB−NANBVエピトープを有する融合ポリペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかった。
2人の患者および4匹のチンパンジーのNANBH感染進行中における抗NANB5−1−1抗体の存在が,IV.D.3節に記載されたRIA法を用いて追跡された。さらに,感染チンパンジーにおいて,HAVおよびHBVの感染進行中における抗NANB5−1−1抗体の有無を決定するためにRIAが用いられた。
SOD−NANB5−1−1ポリペプチドと,NANBHの患者由来の血清試料中の抗体との特異的な免疫学的反応性に基づいて,NANB5−1−1中のエピトープと免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開発された。この方法はアフィニティークロマトグラフィーを利用する方法である。精製されたSOD−NANB5−1−1ポリペプチド(IV.D.1.節参照)を,不溶性の支持体に結合させたが,その結合は,固定されたポリペプチドが,NANB5−1−1に対する抗体の親和性を保持するような結合である。血清試料中の抗体は,マトリックスに結合したポリペプチドに吸収される。洗浄して,非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後,pHの変更および/またはカオトロピック試薬(例えば尿素)によって,結合した抗体を,これが結合しているSOD−HCVポリペプチドから脱離させる。
NaCl(Gly HCl)で15分間処理し,次いでPBSで3分間ずつ3回洗浄した。
IV.F.1.ヒトポリクローナル抗−HCV抗体を用いて感染血漿からHCV 粒子を捕獲する方法
NANBHに感染したチンパンジーの感染性血漿中に存在するタンパク−核酸複合体を,ポリスチレンビーズに結合させた精製ヒトポリクローナル抗HCV抗体を用いて精製した。
IV.F.2.捕獲された粒子中の核酸のNANBV−cDNAへのハイブリダイゼーション
抗NANB5−1−1抗体によって捕獲された粒子から遊離した核酸成分を,クローン81由来のHCVcDNAとハイブダイゼーションさせて分析した。
パンジーの血清から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるために,洗浄したビーズを,プロテイナーゼK(1mg/ml),10mMトリス HCl pH7.5緩衝液,10mM EDTA,0.25%(W/V)SDS,10μg/mlの可溶性酵母RNAを含有する溶液の0.2ml/ビーズとともに,37℃で60分間インキュベートし,次いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフェノールとクロロホルムで抽出し,次いで核酸をエタノールで,一夜−20℃にて沈殿させた。この核酸の沈殿を,遠心分離して集め,乾燥し,50mM Hepes,pH7.5に溶解させた。抗NANB5−1−1抗体でコートされたビーズから得た試料および全ヒト免疫グロブリンを含有する対照ビーズで得た試料からの可溶性核酸の二つの部分をニトロセルロースフィルターに吸い取らせた。これらのフィルターを,クローン81中の精製HCV cDNA断片で作製した,32Pで標識し,ニックトランスレーションを行ったプローブとハイブッドさせた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション法は,IV.C.1.節に記載してある。
C100−3融合ポリペプチドと抗NANB5−1−1抗体との免疫学的反応性を,放射性免疫検定法によって測定したが,この検定法では,固相に結合した抗原が,精製抗NANB5−1−1抗体に投与され,生成した抗原抗体複合物が,12Iで標識したヒツジ抗ヒト抗体で検出された。C100−3ポリペプチドの免疫学的反応性を,SOD−NANB5−1−1抗原のそれと比較した。
5−1−1を測定した。標識したプローブ(比放射能:5〜20μCi/mg)の100μlずつを各ウェルに添加し,そのプローブを37℃で1時間インキュベートし,過剰のプローブを吸引で除去し,BBSTで5回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量は,γ線を検出するカウンターで計数することによって測定した。
IV.H.1.HCVゲノムのストランドの状態(strandedness)の特性決定
抗NANB5−1−1抗体でコートしたポリスチレンビーズに捕獲された粒子から核酸の画分を単離し,次に単離した核酸が,HCV cDNAの正鎖および/または負鎖とハイブリダイゼーションするか否かを測定することによって,HCVゲノムをそのストランドの状態について特性決定した。
負鎖をもっているかどうかを決定した。塩基配列の決定は,サンガーら(Sanger et al)(1977年)のジデオキシチェーンターミネーション法で行った。
捕獲粒子のRNAを,IV.H.1.節に記載したのと同様にして得た。クローン81由来のHCV cDNAとハイブリダイゼーションする塩基配列の分析を,第IV.C.3節に記載したのと同様にしてPCR増幅法を利用して行ったが,ハイブリダイゼーションプローブはクローン81cDNA塩基配列由来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレオチドを用いた。試験結果は,増幅された塩基配列がクローン81由来のHCVcDNAプローブとハイブリダイゼーションすることを示した。
39Cによって結合されたクローン14iのHCV cDNAは,第29〜34図に示すように一つの連続ORFを含有している。これにコードされたポリペプチドを,デング熱フラビウイルス(MNWVD1)の非構造ポリペプチドの領域との配列相同性について分析した。この分析は,デイホッフ(Dayhoff)のタンパクデータベースを用い,コンピュータで行った。結果を第61図に示すが,図中,記号(:)は厳密な相同性を示
し,記号(.)は塩基配列が若干置換されていることを示し,ダッシュ記号は,最大の相同性を得るため塩基配列中に挿入されたスペースを示す。この図から分かるように,HCV cDNAにコードされた塩基配列と,デング熱フラビウイルス非構造タンパクとの間には有意な相同性がある。第61図に示す相同性に加えて,cDNAの3’末端の領域にコードされたポリペプチドセグメントには,分析した結果,デング熱ポリメラーゼの塩基配列と相同性の塩基配列が含まれていた。RNA依存性RNAポリメラーゼに対して必須であると考えられる標準的なGly−Asp−Asp(GDD)配列が,HCV cDNAにコードされたポリペプチドに含まれ,その位置がデング熱2ウイルス内の位置と一致しているということは重要なことである(データは記載していない)。
2種の研究結果は,HCV−DNAが,NANBHに感染した個体由来の組織内には検出できないことを示唆している。これらの結果は,IV.C.とIV.H.1.とIV.H.2.の各節に記載した結果と併せて,HCVがDNAを含有するウイルスではなく,その複製にはcDNAを含まないという証拠を提供している。
NANBHに感染したチンパンジーの肝臓が,検出可能なHCV−DNA(もしくはHCV−cDNA)を含有しているか否かを決定するために,この起源から単離したDNAの制限酵素による断片をサザンブロット法に付して,ブロット物を32Pで標識したHCV cDNAでプローブした。上記の標識したHCV cDNAは,感染チンパンジーの肝臓由来のブロットされたDNAとハイブリダイゼーションをしないという結果を示した。また同じ標識HCV cDNAは,正常なチンパンジーの肝臓由来の対照のブロットされたDNAともハイブリダイゼーションをしなかった。これに対して,陽性対照においては,β−インターフェロン遺伝子の標識したプローブが,制御酵素で切断したヒト胎盤DNAのサザンブロット法に付したものと強くハイブリダイゼーションした。これらの系は,標識したプローブで検出すべき遺伝子の単一コピーを検出するために設計された。
HCV−DNAが,NANBHに感染したチンパンジーの肝臓内に検出できるか否かを決定するために,DNAをその組織から単離し,プライマーとクローン81のHCVcD
NA由来のプローブポリヌクレオチドを用いて,PCR増幅検出法に付した。陰性対照は,未感染HepG2組織の培養細胞と,未感染と思われるヒト胎盤とから単離したDNA試料を用いた。陽性対照は,陰性対照にクローン81由来のHCV cDNA挿入物の比較的少ない既知量(250分子)を添加した試料を用いた。
cDNAクローン81由来のものであった。
全試料を,HCV c100−3 ELISA法を用いて検定した。この検定法は,HCV c100−3抗原(IV.B.5節に記載したのと同様にして合成し精製した)と,マウスモノクローナル抗ヒトIgGのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)複合体とを利用する。
ング緩衝液(50mM ホウ酸ナトリウム,pH9.0)の21ml/プレート,BSA(25μg/ml)およびc100−3(2.50μg/ml)を含有する溶液を,RemoveawellImmulon Iプレート(Dynatech Corp.)に添加する直前に調製した。5分間混合後,上記溶液0.2ml/ウェルをプレートに添加した。プレートをカバーし2時間37℃でインキュベートし,次いで溶液を吸引して除去した。ウェルを400μlの洗浄緩衝液〔100mMリン酸ナトリウム(pH7.4),140mM塩化ナトリウム,0.1%(W/V)カゼイン,1%(W/V)Triton X−100,0.01%(W/V)Thimerosal〕で1回洗浄した。洗浄液を除いた後,後コート溶液200μl/ウェル〔10mMリン酸ナトリウム(pH7.2),150mM塩化ナトリウム,0.1%(W/V)カゼインおよび2mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)〕を添加し,プレートをゆるくカバーして蒸発を防止し,室温で30分間放置した。次にウェルから吸引して溶液を除き,保存加熱せずに一夜凍結乾燥した。得られたプレートを,密封したアルミニウムパウチ内に2〜8℃で貯蔵する。
ALT アラニンアミノ転移酵素
抗−HBc HBcに対する抗体
抗−HBsAg HBsAgに対する抗体
HBc B型肝炎コア抗原
ABsAg B型肝炎表面抗原
IgG 免疫グロブリンG
IgM 免疫グロブリンM
IU/L 国際単位/l
NA 入手不能
NT 試験せず
N 試料の大きさ
Neg 陰性
OD 光学密度
Pos 陽性
S/CO シグナル/カットオフ
SD 標準偏差
x 平均値
WNL 標準限界内。
任意のドナーから得た1,056試料(新鮮な血清)を,Irwin Memorial Blood Band(米国,カリフォルニア州,サンフランシスコ)から得た。これらの試料によって得た試験結果を,OD値の分布を示すヒストグラムにまとめる。(第62図)。第62図から分かるように,4試料が3より大きい値を示し,1試料が1と3の間,5試料が0.4と1の間,および残りの1,046試料が0.4より小さい値を示し,これらの試料の90%以上が0.1より小さい。
11匹のチンパンジーから得た血清試料を,HCV c100−3を用いたELISA法により試験した。これらのチンパンジーのうち4匹には,疾患管理センター(the Centers for DiseaseControl)のDaniel Bradley博士と共同して確立された方法に従って,第VIII因子の汚染バッチに由来するNANBH(お くは,ハッチンソン(Hutchinson)株であると推測される)を感染させた。対照として,他の4匹のチンパンジーにはHAVを,そして3匹にはHBVを感染させた。血清試料は,感染後の様々な時期に採取した。
またはHBVに感染させた対照のチンパンジーはELISA法における反応性を示した。
コードされたパネルは,22個の独自の試料から構成されていた。ただし,これらの試料は,各々につき二重検定を行うので,合計で44個であった。これらの試料は,慢性NANBHキャリアから得た保証感染性血清,関係供血者から得た感染性血清,および急性NANBH患者から得た感染性血清からのものであった。さらに,非常に由来が明確な陰性対照群,および他の疾患対照群からも試料を得た。このパネルは,国立衛生研究所(National Institutes of Health,Bethesda,Mary−land)のHealth and Human Service部のH.Alter博士から提供された。このパネルは,数年前にAlter博士により構築され,推定NANBH検定の適合パネルとして,Alter博士により使用されてきた。
た。これらの4個の試料は上記のHCVELISA法では陰性と判定された。
前記のコードされたパネルは,輸血に関連するNANBHについて供血者および受血者が明確な10事例からなり,試料の合計は188であった。各事例は,受血者に対する数人またはすべての供血者の試料,およびこの受血者から得た(輸血後,3ヵ月,6ヵ月,および12ヵ月目に採血した)一連の試料からなるものであった。また,輸血前に予め受血者から採血された血液試料も含まれていた。コードされたパネルは,NIHのH.Alter博士により提供されたものであり,結果は評価を行うために同博士へ送付した。
高危険率グループから得られた試料は,HCV c100−3抗原に対する反応性を決定するELISA法を用いてモニターされた。これらの試料は,Gary Tegtmeier博士(Community Blood Bank,KansasCity)から得られた。結果を表13に要約する。
LTが高いだけの供血者,B型肝炎コアに対する抗体について陽性であるだけの供血者,そして任意の志願供血者に比べてALTが高いか,あるいは抗コア抗体を有するということ以外の理由で拒否された供血者においても高かった。
抗IgGモノクローナル複合体を用いたELISA法の測定感度は,抗IgMモノクローナル複合体を用いるか,あるいはこれら両者をH鎖およびL鎖の両方に特異的であると報告されたポリクローナル抗血清で置き換えることにより得られる測定感度と比較された。以下の研究が行われた。
NANB血清転換者の3つの事例から得られた一連の試料を,HCV c100−3ELISA法で研究した。このELISA法では,酵素複合体に抗IgGモノクローナル抗体だけを用いるか,または抗IgMモノクローナル抗体と組合わせて用いるか,あるいはポリクローナル抗血清を用いた。これらの試料は,Cladd Stevens博士(N.Y.Blood Center,N.Y.C.,N.Y.)により提供された。試料の歴史を表14に示す。
らのデータは,事例1,2,および3の各試料1−4,2−8,および3−5において,最初に強い反応性が検出されることを示している。
結果を表16に示す。抗IgMに対する抗IgGの3つの異なる割合で試験した;抗IgGの希釈率1:10,000は終始一定であった。抗IgMモノクローナル複合体の試験された希釈率は,1:30,000,1:60,000,および1:120,000であった。これらのデータは,抗IgGだけを用いた研究と同様に,試料1−4,2−8,および3−5において,最初の強い反応性が検出されることを示している。
任意抽出の供血者から得られた試料(IV.I.1.節参照)を,HCV感染について,HCVc100−3 ELISA法によりスクリーニングした。このとき,抗体−酵素複合体は,抗IgGモノクローム複合体またはポリクローナル複合体のいずれかであった。スクリーニングされた試料の総数は,ポリクローナル複合体およびモノクローナル複合体に対して,それぞれ1077個および1056個であった。スクリーニング結果の要約を表18に示す。また,試料の分布を第63図のヒストグラムに示す。
493から0.0931にシフトし,標準偏差は0.074から0.0933に増加した。また,これらの結果は,x+5SDという基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれば,ELISA法におけるポリクローナル酵素複合体の形態が,より高いカットオフ値を必要とすることを示している。このことは,モノクローナル系に比べて分析特異性が低いことを示している。さらに,第63図のヒストグラムから明らかなように,抗IgGモノクローナル複合体を用いたELISA法で任意抽出の供血者をスクリーニングした場合には,市販のポリクローナル標識を用いた分析に比べて,陰性および陽性の結果の分布間が大きく分離する。
高いALT値に基づくとNANBH保持の疑いがあるが,HAVおよびHBV試験においては陰性である患者から得られた血清を,HCV c100−3抗原をマイクロタイタープレートのスクリーニング抗原として用いたこと以外は実質的にIV.D.節で述べたように,RIA法を用いてスクリーニングした。表19に示された結果から明らかなように,RIAにより,陽性試料が高い割合で検出された。
明白でない(すなわち,輸血,静脈注射による薬剤使用,乱婚などが危険因子として同定されない)100人のNANBH患者から得た血清は,M.Alter博士(the Center for Disease Control)およびJ.Dieustag博士(Harvard University)から提供された。これらの試料を,HCV c100−3抗原をマイクロタイタープレートに付着させるスクリーニング用抗原として用いたこと以外は実質的にIV.D.節で述べたように,RIA法を用いてスクリーニングした。得られた結果は,100個の血清試料のうち55個の試料が,HCV c100−3抗原と免疫学的に反応する抗体を有することを示した。
NANBH陽性の疑いのある供血者から輸血され,NANBHとなった受血者が,抗HCV抗体陽性に血清転換するかどうかを決定し得る見込みがある研究を実施した。NANBH感染のマーカーとして現在使われている代用マーカー(すなわち,高いALT値および抗コア抗体の存在)の異常について供血者を試験した。さらに,抗HCV抗体の存在についても供血者を試験した。抗HCV抗体の存在は,IV.K.節で述べた放射性免疫検定法を用いて決定した。この研究の結果を表20に示す。この表には以下の項目が示されている:患者の番号(第1列);患者の血清中における抗HCV抗体の存在(第2列);患者の輸血回数,各輸血は異なる供血者によるものである(第3列);供血者の血清中における抗HCV抗体の存在(第4列);そして,供血者の代用マーカーの異常(第5列)(NT,すなわち…試験していないことを意味する)(ALTは高いトランスアミナーゼであり,抗HBcは抗コア抗体である)。
HCVがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆している上記の結果は,PCR 技術と,フラビウイルスの保存アミノ酸配列をコードする領域から誘導され
たプライマーとを利用して,特徴付けられていないHCV cDNA配列をクローニングすることを可能にする。一般に,プライマーの一方は定義されたHCVゲノム配列から誘導され,配列決定されていないHCVポリヌクレオチド領域に隣接する他方のプライマーはフラビウイルスゲノムの保存領域から誘導される。フラビウイルスゲノムは,フラビウイルスゲノムの5’側領域にコードされるNS1ポリペプチドおよびEポリペプチド内に保存配列を有することが知られている。これらの領域をコードする対応配列は,第29〜34図に示すHCV cDNA配列の上流にある。従って,HCVゲノムのこの領域から誘導されたcDNA配列を単離するには,これらのフラビウイルスポリペプチド内の保存配列から誘導される上流プライマーが設計される。下流プライマーはHCV cDNAの既知部分の上流側端部から誘導される。
5’ GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA3’
である。他方のプライマーssc5h34Aもまた,使用し得る。このプライマーはクローン5hの配列から誘導され,さらに制限酵素部位を形成する5’末端のヌクレオチドを有する。従って,クローニングが容易になる。ssc5h34Aの配列は,
5’ GAT CTC TAG AGA AAT CAA TATGGT GAC
AGA GTC A 3’
である。
り厳密でなくてもよい(0.6M NaCl,および25℃)。なぜなら,HCV配列とアニールするプライマー部分は,わずか9個のヌクレオチドであり,不一致が存在し得るからである。また,ssc5h34Aを用いた場合には,HCVゲノムから誘導されなかった付加配列はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化する傾向がある。第1回目の増幅後は,アニール条件は非常に厳密である(0.066MNaCl,および32℃〜37℃)。なぜなら,増幅される配列は,この段階では,プライマーに相補的な領域またはプライマーの重複部分である領域を有するからである。さらに,最初の10サイクルの増幅は,クレノー酵素Iを用い,この酵素に適したPCR条件下で実施される。これらのサイクルが完了した後,試料を抽出し,Cetus/Perkin−Elmerにより供給されているキット指示書に従って,Tagポリメラーゼで処理する。
5’ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG
TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3’
である。
本発明は,ここに開示された様々な表現で,多くの産業上の用途を有する。これらの用途のいくつかは次のとおりである。HCV cDNAは,試料中のHCV核酸を検出するためのプローブの設計に用いられる。cDNAから誘導されたプローブは,例えば化学的な合成反応においてHCV核酸を検出するのに用いられる。これらのプローブはまた,培養細胞系または動物モデル系においてウイルスの複製を阻害する際に抗ウイルス剤の効果を決定するためのスクリーニングプログラムに用いられる。HCVポリヌクレオチドプローブは,ヒトにおいてウイルス核酸を検出するのにも有用であり,従ってヒトにおけるHCV感染の診断薬の主成分として役立ち得る。
,NANBHを引き起こすHCVを診断するのにも用いられる。抗HCV抗体の他の重要な用途には,ウイルスおよびウイルスポリペプチドを精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにおける使用がある。精製されたウイルスおよびウイルスポリペプチドの調製物はワクチンに用いられ得る。しかしながら,精製されたウイルスはまた,HCVを複製する細胞培養系の開発に有用である。
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