FI105652B - NANBV-polypeptidejä, immunologisia määritysmenetelmiä ja välineitä - Google Patents

Description

ι 105652 NANBV-polypeptidejä, immunologisia määritysmenetelmiä ja välineitä

Keksintö koskee materiaaleja ja metodologiaa hepatitisvirustartunnan, joka ei ole tyyppiä A tai B (NANBV), levinneisyyden selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee diagnosti-5 siä proteiineja ja diagnostisia vasta-aineita NANB-hepatitiksen, s.o. hepatitis C-viruksen r etiologista ainetta varten.

, Selityksessä viitataan RMiraaviin julkaisuihin

Barr et ai. (1986), Biotechniques 4:428. i0 Botstein (1979), Gene 8:17.

Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 327-374.

Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Vol.l, J5 s.445, Cold Spring Harbor Press.

Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.

Chang et al. (1977), Nature 198:1056.

Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294.

Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.

20 Clewell et al. (1969), Proc. Nad. Acad. Sci. USA 62:1159.

Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

Cohen (1972), Proc. Nad. Acad! Sci. USA 69:2110.

Cousens et al. (1987), Gene 61:265.

De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.

25 Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.

Feinstone, S.M. and Hoofhagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 311:185.

Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.)

Fiersetal. (1978), Nature 221:113.

Gerety, R.J. et al. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, 30 B.N., Dienstag, J.L., and Hoofhagle, J.H., toim., Grune and Stratton, Inc., 1984) ss. 23- ' 47.

Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057.

Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21:3961.

35 Grych et al. (1985), Nature 116:74.

Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263.

Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL

2 105652 HYBRIDOMAS.

Hess et ai. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 2:149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 25:1929.

Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

5 Holland et al. (1978), Biochemistry 12:4900.

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.

Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:247.

Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss. 49-78. io Immun. Rev. (1982)62:185.

Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.

Kenneth et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.

Laemmli (1970), Nature 222, 680.

Lee et al. (1988), Science 239:1288.

15 Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Mayer and Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.

20 MacNamara et al. (1984), Science 226:1325.

Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis.

25 Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND

FLAVIRIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 375-440.

Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.

Neurath et al. (1984), Science 224:392.

30 Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.

Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193.

35 Pferrerkom and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, toim., Plenum, N.Y.) ss. 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.

3 105652

Rice et ai. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 279-328.

Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND 5 FLAVIRIDAE (Saijan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja r Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press).

Sadler et ai. (1980), Gene &, 279. s Saiki et ai. (1986), Nature 324:163.

Sanger et ai. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 24:5463.

10 Schlesinger et ai. (1986), J. Virol. 6Q:1153.

Schreier, M., et ai. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.

Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).

Shimatake et al. (1981), Nature 232:128.

15 Steimer et al. (1986), J.Virol. 5£:9.

Stollar (1980), julkaisussa THE TOGA VIRUSES (R.W. Schlesinger, toim., Academic Press, N.Y.), ss. 584-622.

Taylor et al. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324.

Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 26:4350.

20 Tsu and Herzenberg (1980), julkaisussa SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) ss. 373-391.

Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 134:1225.

Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.

Valenzuela, P., et al. (1984), julkaisussa HEPATITIS B (Millman, I., et al., toim., Ple-. 25 num Press) ss. 225-236.

Warner (1984), DNA 3:401.

Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology, Vol. 154, RECOMBINANT DNA, Part E.

" Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F.

30 Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

* · .... .......

Viitataan myös seuraaviin US-patentteihin: 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890.

35 ________________ .

Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva tauti tai tautiperhe, jonka ' uskotaan olevan viruksen aiheuttama ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheutta- 4 105652 mistä maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka aiheuttavat tunnetut hepa-titisvirukset, s.o. hepatitis-A-virus (HAV), hepatitis-B-virus (HBV) ja deltahepatitisvi-rus (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein-Barr-viruksen (EBV) aiheuttamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiirtopotilaissa. Tarttuminen 5 ihmisestä simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että NANBHrn syy on siirtyvä infektioaiheuttaja tai -aiheuttajat. Kuitenkin NANBH:n aiheuttavaa siirtyvää aiheuttajaa ei ole vieläkään määritetty ja taudin aiheuttavien aineiden lukumäärä on tuntematon.

io Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja satunnaisesti esiintyvä (yhteisön hankkima = community acquired) tyyppi. Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa NANBH.n on tuntematon.

15 Kliininen NANBHrn diagnoosi ja tunnistus on tehty etupäässä sulkemalla pois muut virusmerkkiaineet. Niiden menetelmien joukossa, joita käytetään havaitsemaan oletettuja NANBV-antigeenejä ja vasta-aineita ovat agargeelidiffuusio, vas-taimmunoeletroforeesi, immunofluoresenssimikroskopia, immunoelektronimikroskopia. radioimmunologinen analyysi ja entsyymiin kytketty immunosorbenttianalyysi. Kuiten-20 kaan mikään näistä analyyseistä ei ole osoittautunut olevan riittävän herkkä, spesifinen ja toistettava käytettäväksi NANBH:n diagnostisena kokeena.

Tähän mennessä ei ole ollut selvyyttä eikä sopimusta NANBHin aiheuttajiin liittyvien antigeeni-vasta-ainejäijestelmien identtisyyden tai spesifisyyden suhteen. Tämä johtuu . 25 ainakin osittain siitä, että henkilöillä on ennalta tai samanaikaisesti NANBVin kanssa saatu HBV-tartunta ja liukoisten ja partikkelimuotoisten HBV:een liittyvien antigeenien tunnetusta monimutkaisuudesta ja myös HBV:n DNA:n integraatiosta maksasolujen genomiin. Lisäksi on mahdollisuus, että NANBHin aiheuttaa useampi kuin yksi infek-toiva aine, minkä lisäksi on mahdollista, että NANBH on diagnosoitu väärin. Edelleen 30 on epäselvää, mitä serologiset analyysit havaitsevat NANBH-potilaiden seerumista. On väitetty, että agargeelidiffuusio-ja vastaimmunoelektroforeesianalyysit havaitsevat au-toimmuunivasteita tai epäspesifisiä proteiinien keskinäisiä reaktioita, joita esiintyy seeruminäytteiden välillä ja että ne eivät edusta spesifisiä NANBV-antigeeni-vasta-ainereaktioita. Immunofluoresenssi ja entsyymin kytketty immunosorbentti ja radioim-35 munologiset analyysit näyttävät havaitsevan alhaisia reumatekijän kaltaisen materiaalin tasoja, jota on tavantakaa läsnä sellaisten potilaiden seerumissa, joilla on NANBH, sa-• moin kuin myös potilaissa, joilla on muita maksasairauksia tai maksaan liittymättömiä i 105652 5 sairauksia. Jonkin verran havaittua reaktiivisuutta voi edustaa vasta-ainetta isännän määri ttämille sytoplasmisille antigeeneille.

5 On olemassa lukumäärä NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi selontekoja Prince (1983), Feinstone ja Hoofiiagle (1984) ja Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikkelia. Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä ehdokkaista „ edustaisi NANB V :n etiologista aiheuttajaa.

1 o Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kantajien ja NANBV:n saastut taman veren tai verituotteiden seulomiseksi tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:lla verensiirron saaneista potilaista ja NANBH:n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääongelma tässä taudissa on sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioik-15 si (25-55 %).

Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin välityksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä NANBVrhen liittyvien nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden havaitse-20 miseksi.

Keksintö liittyy vastikään keksityn NANBH:n etiologisen aiheuttajan, hepatitis C-viruksen (HCV), eristämiseen ja kuvaamiseen. Tarkemmin keksintö antaa HCV-genomin osien cDNA-kopioiden perheen. Nämä cDNA-kopiot eristettiin tekniikalla, 25 joka sisälsi uuden vaiheen, jossa seulottiin ekspressiotuotteita cDNA-kirjastoista, jotka oli luotu hiukkasmaisesta aiheuttajasta kudoksesta, joka oli tartutettu NANBV-potilai-den seerumilla sellaisten vastasyntetisoitujen antigeenien havaitsemiseksi, jotka ovat peräisin tähän asti eristämättömän tai kuvaamattoman virusaiheuttajan genomista ja sellaisten kloonien valitsemiseksi, jotka tuottavat tuotteita, jotka reagoivat immunologiko sesti vain tartutettujen yksilöiden seerumien kanssa, verrattuna tartuttamatomiin yksilöihin.

Tutkimukset HCV:n genomin luonteesta käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin HCV:n cDNA:sta, ehdottavat, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus.

55 HCV:stä peräisin olevien cDNA-sekvenssien osat ovat hyödyllisiä koettimia viruksen näytteissäolon diagnosoimiseksi ja luonnollisesti esiintyvien viruksen muunnoksien • eristämiseksi. Nämä cDNA:t tuovat myös saataville HCV-genomiin koodattujen HCV- 6 105652 antigeenien polypeptidisekvenssit ja sallivat sellaisten polypeptidien tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä standardeina tai reagensseina diagnostisissa testeissä. Vasta-aineet, sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset, jotka on kohdistettu HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät näihin polypeptidisekvensseihin, ovat hyödyllisiä diagnostisia tes-5 tejä varten, virustenvastaisien aineitten seulomiseen ja sellaisen NANBV-aiheuttajan eristämiseksi, josta nämä cDNA:t ovat peräisin. Lisäksi käyttämällä näistä cDNA:oista johdettuja koettimia, on mahdollista eristää ja sekventoida muita HCV-genomin osia, edistäen näin lisäkoettimien ja polypeptidien saamista, jotka ovat hyödyllisiä NANBH:n diagnoosissa.

10

Keksinnön kohteita ovat: polypeptidivalmiste puhdistetusta HCV:stä; puhdistettu HCV-polypeptidi; puhdistettu polypeptidi, joka käsittää epitoopin, joka on immunologisesti määritettävissä HCV:n sisältämällä epitoopilla.

15 Keksintöön sisältyviä seikkoja ovat yhdistelmä-HCV-polypeptidi; yhdistelmä-polypeptidi, joka muodostuu sekvenssistä, joka on peräisin HCV-genomista tai HCV-cDNA:sta; yhdistelmäpolypeptidi, joka muodostuu HCV-epitoopista; ja fuusiopolypep-tidin, joka muodostuu HCV-polypeptidistä.

20 Keksintöön sisältyvät myös monoklonaalinen vasta-aine, joka on suunnattu HCV-epitooppia vastaan; ja puhdistettu polyklonaalisten vasta-aineitten valmiste, joka on suunnattu HCV-epitooppia vastaan.

Ne keksinnön kohteet, jotka koskevat välinesaijoja, ovat seuraavia: näytteiden analy-. 25 sointi sellaisten polynukleotidien läsnäolon osoittamiseksi, jotka ovat peräisin HCV:stä, joka käsittää polynukleotidikoettimen, joka sisältää noin 8:n tai lukuisampien nukleotidien HCV:n nukleotidisekvenssin sopivassa astiassa; näytteiden analysointi sellaisen HCV-antigeenin osoittamiseksi, joka on suunnattu havaittavaa HCV-antigeeniä vastaan, sopivassa astiassa; näytteiden analysointi sellaisten vasta-aineiden osoittamiseksi, jotka 20 on suunnattu HCV-antigeeniä vastaan, joka käsittää polypeptidin, joka sisältää HCV- :. antigeenissä läsnäolevan HCV-epitoopin, sopivassa säiliössä.

Muita keksinnön seikkoja ovat: polypeptidi, joka muodostuu HCV-epitoopista kiinnittyneenä kiinteään kantaja; ja HCV-epitoopin vasta-aine kiinnittyneenä kiinteään kanta-35 jaan.

’ Keksintö sisältää myös menetelmän HCV-nukleiinihappojen havaitsemiseksi näyttees- 7 105652 sä, käsittäen sen, että annetaan näytteen nukleiinihappojen reagoida HCV-polynukleotidia varten olevan koettimen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat polynukle-otididupleksin muodostumisen koettimen ja näytteestä tulevan HCV-nukleiinihapon välille; ja osoitetaan koettimen sisältävä polynukleotidi.

5 ? Keksintöön sisältyy myös immunologisia analyysejä. Nämä sisältävät immunologisen analyysin HCV-antigeenin osoittamiseksi, käsittäen sen, että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän HCV-antigeeniä, koettimen kanssa, joka on suunnattu osoitettavaa HCV-antigeenia vastaan olosuhteissa, jotka sallivat antigeeni-vasta-ainekompleksin 1 o muodostumisen; ja sen että osoitetaan koettimen vasta-aineen sisältävä antigeeni-vasta-ainekompleksi. Immunologinen analyysi HCV-antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden osoittamiseksi käsittää sen että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän anti-HCV-vasta-aineita yhdessä koetinpolypeptidin kanssa, joka sisältää HCV:n epitoo-pin, olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-antigeenikompleksin muodostumisen; ja sen 15 että osoitetaan koetinantigeenin sisältävä vasta-aine-antigeenikompleksi.

Kuvio 1 esittää kloonissa 5-1-1 olevan HCV:n cDNA-insertin kaksoiskierteisen nukleo-tidisekvenssin ja siihen koodatun polypeptidin oletetun aminohapposekvenssin.

20

Kuvio 2 esittää HCV:n cDNA-sekvensien homologien päällekkäisyyttä klooneissa 5-1-1,81, 1-2 ja 91.

Kuvio 3 esittää päällekkäisistä klooneista 81, 1-2 ja 91 peäisin olevaa HCV:n cDNA:n . 25 yhdistelmäsekvenssiäja siihen koodattua aminohapposekvenssiä.

Kuvio 4 esittää HCV:n kloonissa 81 olevan cDNA-insertin kaksoiskierteellistä nukleo-tidisekvenssiä ja sinne koodatun polypeptidin oletettua aminohapposekvenssiä.

20 Kuvio 5 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 36, segmenttiä, joka menee pääl-« ........

lekkäin NANBV:n cDNA:n kanssa kloonissa 81 ja klooniin 36 koodattua polypepti-disekvenssiä.

Kuvio 6 esittää yhdistettyä avointa lukurakennetta HCV:n c DN Aloista klooneissa 36 ja 35 81 ja siihen koodattua polypeptidiä.

’ Kuvio 7 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 32, segmenttiä, joka menee pääl- lekkäin kloonin 81 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

8 105652

Kuvio 8 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 35, segmenttiä, joka menee päälle-käin kloonin 36 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

5

Kuvio 9 esittää HCV:n cDNA:oiden yhdistettyä avointa lukurakennetta klooneissa 35, 36, 81 ja 32 ja siihen koodattua polypeptidiä.

Kuvio 10 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 37b, segmenttiä, joka menee pääl-10 lekkäin kloonin 35 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

Kuvio 11 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 33b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 32 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

15 Kuvio 12 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 40b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 37b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

Kuvio 13 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 25c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.

20

Kuvio 14 esittää avoimen lukurakenteen, joka ulottuu HCV:n cDNA:oiden kauna klooneissa 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b ja 25c, nukleotidisekvenssiä ja siihen koodattua polypeptidiä.

, 25 Kuvio 15 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 33c, segmenttiä, joka menee pääl lekkäin kloonien 40b ja 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 16 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 8h, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

30 t _

Kuvio 17 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 7e, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8h kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 18 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 14c, segmenttiä, joka menee pääl-35 lekkäin kloonin 25c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 19 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 8f, segmenttiä, joka menee pääl- :.9 lekkäin kloonin 14c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

105652

Kuvio 20 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 33f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

5 ϊ Kuvio 21 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 33g, segmenttiä, joka menee pääl lekkäin kloonin 33f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

"* 7_________________*

Kuvio 22 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 7f, segmenttiä, joka menee pääl-t o lekkäin kloonin 7e kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 23 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 1 Ib, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 7f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

15 Kuvio 24 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 14i, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 1 Ib kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 25 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 39c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

20

Kuvio 26 esittää HCV:n yhdistelmä-cDNA-sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista cDNA:oista klooneissa 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g; esitettynä on myös sieltä peräisin olevassa sekvenssissä olevaan laajennettuun avoimeen lukurakenteeseen koodatun polypeptidin aminohapposekvenssi. 25 Kuvio 27 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 12f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14i kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 28 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 35f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 39c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

30

Kuvio 29 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 19g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 35f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 30 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 26g, segmenttiä, joka menee pääl-35 lekkäin kloonin 19g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

• Kuvio 31 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 15e, segmenttiä, joka menee pääl- lekkäin kloonin 26g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

10 105652

Kuvio 32 esittää yhdistelmä-cDNA:n sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista klooneista 12f - 15e suunnassa 5' -3'; se esittää myös ORF:ään koodattuja aminohappo- 5 ja·

Kuvio 33 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5.1.1 Westem-blotteja BB-NANBtllä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen simpanssien seerumin kanssa.

10 Kuvio 34 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5.1-1 Westem-bloteista NANBVdlä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen ihmisten ja kontrolli-ihmisten seerumin kanssa.

Kuvio 35 on kartta, joka esittää vektorin pAB24 merkittävät piirteet.

15

Kuvio 36 esittää fuusiopolypeptidin Cl00-3 karboksipään oletetusta aminohapposekvenssistä ja sitä koodaavaa nukleotidisekvenssiä.

Kuvio 37A on valokuva coomassiesinisellä väsätystä polyakryyliamidigeelistä, joka identifioi hiivassa ekspressoituä Cl00-3:a.

20

Kuvio 37B esittää Cl00-3:n Westem-blottia NANBV:llä tartutetun ihmisen seerumin kanssa.

Kuvio 38 esittää autoradiografin Northem-blotista RNA:lle, joka on eristetty BB-··; 25 NANBV-tartutetun simpanssin maksasta ja jossa koettimena on kloonin 81 BB- NANBV:n cDNA.

Kuvio 39 esittää autoradiografin NANBV-nukleiinihaposta, jota on käsitelty ribonukle-aasi A:lla tai deoksinukleaasi I:llä ja jossa koettimena on klooni 81 :n NANBV:n cDNA.

30

Kuvio 40 esittää autoradiografin nukleiinihapoista, jotka on uutettu NANBV-partikkeleista, jotka on saatu infektoidusta plasmasta anti-NANB5.|.i:lla ja jossa koettimena on 32P-leimattu kloonin 81 NANBV:n cDNA.

35 Kuvio 41 esittää autoradiografeja suodattimista, jotka sisältävät eristettyjä NANBV-nukleiinihappoja, joissa koettimena on 32P-leimattuja plus- ja - kierteisiä DNA-. koettimia, jotka ovat peräisin kloonin 81 NANBV:n cDNA:sta.

105652 11

Kuvio 42 esittää HCV:n cDNArssa koodattujen polypeptidien ja Dengue-flaviviruksen NS-proteiinin väliset homologit.

5 Kuvio 43 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä määritettynä ELISA-seulonnalla.

Kuvio 44 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä käyttäen kahta immunoglobuliini-entsyymikonjugaatin konfiguraatiota ELISA-ana-10 lyysissä.

Kuvio 45 esittää primeriseoksen sekvenssejä, jotka ovat peräisin säilyvistä sekvensseistä flaviviruksien NS1 :ssä.

i5 Kuvio 46 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa k9-1, segmenttiä, joka menee päällekkäin kuviossa 26 esitetyn cDNA:n kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.

Kuvio 47 esittää sekvenssiä yhdistelmä-cDNArssa, joka on peräisin asettamalla kohdakkain kloonit k9-l-15e suunnassa 5' - 3'; se esittää myös ORF:ään koodatut aminoha-20 pot.

I. Määritelmät

Termi "hepatitis-C-virus" on varattu alalla tähän asti tuntemattomalle NANBV:n etiolo-25 giselle aiheuttajalle. Niinpä tässä käytettynä "hepatititis-C-virus" (HCV) viittaa NANBV:n syynä olevaan aiheuttajaan, johon aikaisemmin viitattiin NANBV.nä ja/tai BB-NANBV:nä. Termejä HCV, NANBV ja BB-NANBV käytetään tässä keskenään vaihdellen. Tämän terminologian jatkona kutsutaan HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikaisemmin kutsuttiin NANB-hepatitikseksi (NANBH), hepatitis-C:ksi. Termejä 30 NANBH ja hepatitis-C käytetään tässä keskenään vaihdellen.

Termi "HCV" merkitsee tässä käytettynä viruslajia, joka aiheuttaa NANBH.n ja siitä johdettuja heikennettyjä kantoja tai puutteellisia häiritseviä partikkeleita. Kuten esitetään myöhemmin, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että viruksia sisältä-35 väliä RNA:lla on suhteellisen korkea spontaanien mutaatioiden nopeus, s.o. on raportoitu suuruusluokkaa 10° - KT4 nukleotidia kohti olevista nopeuksista (Fields & Knipe • - (1986)). Siksi alla kuvatun HCV-lajin joukossa on monia kantoja. Tässä kuvatut koos- 12 105652 tumukset ja menetelmät tekevät mahdolliseksi eri sukulaiskantojen lisääntymisen, määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen. Edelleen ne myös sallivat diagnostisten välineiden valmistamisen eri kantoja varten ja niillä on käyttöä seulontamenetelmissä antivi-raalisia aineita varten farmakologiseen käyttöön siinä, että ne estävät HCV:n replikaati-5 on.

Tässä annettu tieto, vaikkakin se on peräisin yhdestä HCV-kannasta, johon tästä lähtien viitataan nimellä CDC/HCV1, on riittävä virustaksonomeille salliakseen muidenkin kantojen identifioinnin, jotka ovat lajin sisällä. Kuten tässä kuvataan, olemme keksineet, 10 että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. Flaviviruksen morfologia ja koostumus ovat tunnettuja ja niistä keskustellaan Brintonin (1986) julkaisussa. Yleisesti morfologian suhteen, Flavivirukset sisältävät keskeisen ydinkapsidin, jota ympäröi kaksikerroksinen lipidi. Virionit ovat pallomaisia ja niiden halkaisija on noin 40-50 nm. Niiden ytimet ovat noin 25-30 nm halkaisijaltaan. Pitkin virionikuoren ulkopintaa on ulok-15 keitä, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja niiden päässä olevat nupit ovat noin 2 nm halkaisijaltaan.

HCV koodaa epitooppia, joka on immunologisesti identifioitavissa sen epitoopin kanssa HCV-genomissa, josta tässä kuvatut cDNA:t ovat peräisin; mielellään epitooppi on 20 koodattu tässä kuvatussa cDNA:ssa. Epitooppi on vain HCV:ssa esiintyvä, kun sitä verrataan muihin tunnettuihin Flaviviruksiin. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää sen immunologisella reaktiivisuudella HCV:n kanssa ja immunologisen reaktivisuuden puuttumisena muiden Flaviviruslajien kanssa. Menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla, esimerkiksi radioimmunologinen analyysi, 25 ELISA-analyysi, hemoagglutinaatio ja tässä annetaan lukuisia esimerkkejä sopivista tekniikoista analyysejä varten.

Edellisen lisäksi voidaan käyttää seuraavia parametrejä, joko yksin tai yhdistelmänä, kannan identifioimiseksi HCV:ksi. Koska HCV-kannat ovat kehityksensä suhteen suku-20 laisia, odotetaan että genomien kokonaishomologia nukleotiditasolla on noin 40 % tai :* enemmän, mieluummin noin 60 % tai enemmän ja vielä mieluummin noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sekvenssejä. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin ja CDC/CH1 HCV:n cDNA-sekvenssin välinen vastaavuus voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimer-35 kiksi ne voidaan määrittää vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sek-venssitietoa ja tässä kuvattuja HCV:n cDNA-sekvenssejä. Esimerkiksi myös ne voidaan ·. . määrittää hybridisoimalla poly nukleotideja olosuhteissa, jotka muodostavat stabiileja i 10E652 13 duplekseja homologisten alueiden välille (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen Si-pätkimistä), mitä seuraa pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla. mitä seuraa pätkittyjen fragmenttien koon määritys.

5 HCV-kantojen kehitykseen liittyvän suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tunnis-» taa niiden polypeptiditasolla vallitsevan homologiansa avulla. Yleisesti HCV-kannat ovat enemmän kuin noin 40 % homologisia, mieluummin enemmän kuin noin 60 % homologisia ja vielä mieluummin enemmän kuin 80 % homologisia polypeptiditasolla. Tekniikat aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. 1° Esimerkiksi aminohapposekvenssi voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan veiTata tässä annettuihin sekvensseihin. Myös esimerkiksi oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan määrittää (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta); siinä koodattu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita voidaan verrata.

15 Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta sekvenssistä, esimerkiksi HCV:n cDNA, erityisesti kuvioissa 1-32 esimerkkeinä annetut, tai HCV-genomista johdettu, viittaa polynukleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta noin 6 nukleotidin sekvenssistä, joka on mieluummin ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin 10-12 nukleotidin ja vieläkin mieluummin vastaavasti ainakin noin 15-20 nuk-20 leotidin pituinen,s.o. homologinen tai komplementaarinen annetun nukleotidisekvenssin alueen kanssa. Mieluummin alueen sekvenssi, josta polynukleotidi on peräisin, on homologinen tai komplementaarinen sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. Olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan verrata tieto-25 pankkien, esimerkiksi Genebank'in sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja hepatitiksen aiheuttajia, esimerkiksi HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviri-dae-perheen jäseniin. Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden 30 sekvenssien välillä voidaan määrittää myös hydridisaation avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybridisaatiotekniikat nukleiinihapposekvenssien komplementaarisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan myöhemmin. Katso myös esimerkiksi julkaisua Maniatis et ai. (1982). Lisäksi hybridisaatiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimattomuus voidaan määrittää tunnetuilla tekniikoilla, 35 sisältäen esimerkiksi pätkimisen nukleaasilla, kuten Siiliä, joka spesifisesti katkoo yk-sisäikeisiä alueita polynukleotideissa. Alueet, joista tyypillisiä DNA-sekvenssejä voi-·. . daan "johtaa", sisältävät, mutteivät ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jotka 14.

105652 koodaavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei-transkriptoituja ja/tai ei-transloituja alueita.

Johdettu polynukleotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidise-kvenssistä, mutta se voidaan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemial-5 lisen synteesin tai DNA:n replikoimisen tai käänteisen transkription tai transkription, jotka perustuvat siihen tietoon, jonka antaa emässekvenssi alueilla, joista polynukleotidi on peräisin. Lisäksi niiden alueiden yhdistelmiä, jotka vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään alalla vastaavan aiottua käyttöä.

10 Samoin polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on peräisin annetusta nukleiinihap-posekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-32 sekvensseistä, tai HCV-genomista, viittaa polypeptidiin, jossa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen sen polypeptidin aminohapposekvenssin kanssa, joka on koodattu sekvenssiin tai sen osaan, jossa osa käsittää ainakin 3-5 aminohappoa ja mieluummin ainakin 8-10 aminohappoa ja vielä mie-15 luummin ainakin 11-15 aminohappoa tai joka on immunologisesti tunnistettavissa sekvenssiin koodatun polypeptidin avulla.

Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi ei ole välttämättä transloitu annetusta nukleiini-happosekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-26 sekvensseistä tai HCV-genomista; se voi 20 olla luotu millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai yhdistel-mäekspressiojäijestelmän ekspression tai eristämisen mutatoituneesta HCVistä.

Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee polynukleotidia, joka on peräisin genomista, cDNA:sta, se on semiynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka al-25 kuperänsä tai manipulaationsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin polynukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy luonnossa tai kirjaston muodossa; ja/tai (2) on kytketty poly nukleotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty luonnossa.

Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa pituisten nukleotidien, 30 joko ribonukleotidien tai deoksiribonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi :* viittaa vain molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikeistä DNA:ta ja lisäksi kaksi-ja yksisäikeistä RNA:ta. Se sisältää myös modifioituja, esimerkiksi metyloimalla ja/tai kapseloimalla ja modifioimattomia poly nukleotidin muotoja.

35 Tässä käytettynä termi "HCV, joka sisältää sekvenssin, joka vastaa cDNA:ta" merkitsee, ·. . että HCV sisältää polynukleotidisekvenssin, joka on homologinen tai komple- 105652 15 mentaarinen sekvenssille annetussa DNA:ssa; homologia-asteen tai komplemen-taaiisuusasteen ollessa suurin piirtein 50 % tai enemmän, on mieluummin ainakin noin 70 % ja vielä mieluummin se on ainakin noin 90 %. Sekvenssit, jotka vastaavat toisiaan ovat ainakin noin 70 nukleotidia ja vielä mieluummin ainakin noin 90 nukleotidia pit-5 kiä. HCV-sekvenssin ja cDNA:n välinen vastaavuus voidaan määrittää tekniikoilla, jot-i ka ovat alalla tunnettuja, sisältäen esimerkiksi sekventoidun materiaalin suoran vertailun cDNA:t kuvattuna tai hybridisaation ja pilkkomisen yksisäikeisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pilkottuj en fragmenttien koon määrittäminen.

J o Termi "puhdistettu viruspolynukleotidista" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen puhdas, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % polypeptidejä, joihin viruspolynukleotidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolynukleotidien puhdistamiseksi viruspartikkeleista ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi partikklein 15 katkaisun kaotrooppisella aineella ja polynukleotidien ja polypeptidien erottamisen jo-ninvaihtokromatografian, affiniteettikromatografian ja sedimentoimisen avulla tiheyden mukaan.

Termi "puhdistettu viruspolypeptidi" viittaa HCV-polypeptidiin tai sen fragmenttiin, 20 joka on olennaisen vapaa, s.o. se siältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % solu-komponentteja, joihin viruspolypeptidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolypepti-dien puhdistamiseksi ovat alalla tunnettuja ja näiden tekniikoiden esimerkeistä keskustellaan alla.

25 ........

• ------- 4 4 "Yhdistelmäisäntäsolut", isäntäsolut", "solut", "solulinjat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset termit, jotka merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukarioottisolulinjoja, joita viljellään yksisoluisina kokonaisuuksina viittaavat soluihin, joita voidaan käyttää tai on voitu käyttää yhdistelmävektorin tai muun siirto-DNA:n vastaanottajana ja jotka oo sisältävät sen alkuperäisen solun perimän, johon siirros on tehty. Ymmärretään, että yksittäisen emäsolun perimä ei välttämättä ole täysin identtinen morfologialtaan tai ge- • · - - ---------- nomiltaan tai ole täysi DNA-komplementti alkuperäisenä vanhempana onnettomuuden seurauksena tapahtuneen tai tarkoitetun mutaation seurauksena. Emäsolun perimä, mikä on riittävän samanlainen asiaan kuuluvalta ominaisuudeltaan, kuten haluttua peptidiä 05 koodaavan nukleotidisekvenssin läsnäolon suhteen, määritettävän emäsolun kanssa, sisältyy tähän määritelmään aiottuun perimään ja ylläolevat termit kattavat ne.

·· ____ 16 105652 "Replikoni" (replicon) on mikä tahansa geneettinen elementti, esimerkiksi plasmidi, kromosomi, virus, joka käyttäytyy autonomisena polynukleotidin replikaation yksikkönä solun sisällä; s.o. se pystyy replikoituinaan oman kontrollinsa alaisena.

5 "Vektori" on replikoni, johon on kiinnittynyt toinen polynukleotidisegmentti tuodakseen mukaan kiinnittyneen segmentin replikaation ja/tai ekspression.

"Säätösekvenssi” viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä niiden koodaussekvenssien, joihin ne ovat sitoutuneet, ekspression aikaansaamiseen. Sellaisten 10 säätösekvenssien luonne eroaa isäntäorganismin mukaan; prokariooteissa sellaiset sää-tösekvenssit sisältävät yleisesti promoottorin, ribosomin sidoskohdan ja terminaattorei-ta; eukariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti promoottoreita, terminaat-toreita ja joissakin tapauksissa vahvistajia. Termi "säätösekvenssit" on aiottu sisältämään minimissään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätöntä ekspressiota 15 varten ja ne voivat myös sisältää lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi johtosekvenssejä.

"Toiminnallisesti kytketty" viittaa rinnakkainasetteluun, jossa niin kuvatut komponentit ovat sellaisessa suhteessa, joka sallii niiden toiminnan aiotulla tavalla. Säätösekvenssi, 20 joka on "toiminnallisesti kytketty" koodaussekvenssiin, on sidottu sellaisella tavalla, että koodaussekvenssin ekspressio saadaan aikaan olosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia säätösekvenssien kanssa.

"Avoin lukurakenne" (Open reading frame ORF) on polynukleotidisekvenssin alue, joka 25 koodaa polypeptidiä; tämä alue voi edustaa koodaussekvenssin osaa tai kokonaista koo- • · daussekvenssiä.

"Koodaussekvesnssi" on polynukleotidisekvenssi, joka on transkriptoitu mRNA.han ja/tai transloitu polypeptidiin, kun se on pantu sopivien säätävien sekvenssien kontrol- 20 Hin. Koodaussekvenssin rajat määrittävät translaation aloittava kodoni 5'-päässä ja *’ translaation lopettava kodoni 3'-päässä. Koodaussekvenssi voi sisältää, muttei se ole • rajoitettu niihin, mRNA:n, cDNA:n jayhdistelmäpolynukleotidisekvenssejä.

"Immunologisesti tunnistettavissa jollakin/jonakin" viittaa sellaisten epitooppien ja po-35 lypeptidien läsnäoloon, jotka ovat myös läsnä ja ovat ainutkertaisia annetuille polypep-tideille, tavallisesti HCV-proteiineille. Immunologisen identiteetin voi määrittää vasta-... . aineen sitoutuminen ja/tai kilpailu sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan 105652 17 keskitason ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan myös määrittää tietokonehaulla tunnetuissa tietopankeissa, esimerkiksi Genebank-ssa, epitooppia koodaavien polynukleotidisekvenssien löytämiseksi ja vertaamalla aminohapposekvenssiä muihin tunnettuihin proteiineihin.

5 : * Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin antigeeniseen polypeptidin determi nanttiin; epitooppi voisi käsittää kolme aminohappoa epitoopille ainutkertaisessa ava-ruuskonformaatiossa, yleisesti epitooppi käsittää ainakin viisi sellaista aminohappoa ja tavallisemmin se käsittää ainakin 8-10 sellaista aminohappoa. Aminohappojen avaruus-10 konformaation määrittämismenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi röntgenkristallografian ja kaksiulotteisen ydinmagneettisen resonanssin.

Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen siten, että se tunnistaa tietyn polypeptidin sisältämän epitoopin. Immunolo-15 gisen reaktiivisuuden voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen, erityisemmin vasta-aineen sitoutumisen kinetiikka ja/tai kilpailu sitoutumisessa käyttäen kilpailijoina tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota vastaan vasta-aine on suunnattu. Tekniikat sen määrittämiseksi onko polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vasta-aineen kanssa vai ei, ovat alalla tunnettuja.

20 Tässä käytettynä termi "HCV-epitoopin sisältävä immunogeeninen polypeptidi" sisältää luonnollisesti esiintyviä HCV-polypeptidejä tai niiden fragmentteja ja myös polypeptidejä, jotka on valmistettu muilla tavoin, esimerkiksi kemiallisella synteesillä tai eks-pressoimalla polypeptidi yhdistelmäorganismissa.

... 25

Termi "polypeptidi" viittaa aminohappojen molekyyliketjuun, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituuteen; täten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit sisältyvät polypeptidin määritelmään. Tämä termi ei myöskään viittaa polypeptidien ekspression jälkeisiin muunnoksiin, esimerkiksi glykosylaatiöihin, asetylaatioihin, fosforylaatioihin ja sen kaltaisiin.

30 .....

-·· "Transformaatio" tässä käytettynä viittaa ulkopuolisen polynukleotidin panemiseen isäntäsoluun, riippumatta panemiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora otto, transduktio tai f-liitto. Ulkoinen polvnukleotidi voidaan pitää integroimattomana vektorina, esimerkiksi plasmidina tai vaihtoehtoisesti se voidaan integroida isäntägenomiin.

35 "Yksilö" tässä käytettynä viittaa selkärankaisiin, erityisesti imettäväislajin jäseniin ja ’ sisältää, muttei ole niihin rajoitettu, kotieläimet, urheilueläimet, kädelliset ja ihmiset.

18.

105652 Tässä käytettynä nukleiinihapon "plussäie" sisältää sekvensin, joka koodaa polypepti-diä. "Miinussäie" sisältää sekvenssin, joka on plussäikeelle komplementaarinen.

5 Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodaa viruspolypeptidejä. Esimerkkejä positiivisen säikeen RNA-viruksista ovat Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae, ja Caliciviridae. Mukaan sisältyvät myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986).

10 Tässä käytettynä " vasta-aineen sisältävä ruumiin osa" viittaa yksilön ruumiin osaanjoka on kyseessä olevien vasta-aineiden lähde. Vasta-aineita sisältävät ruumiin osat ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, 15 kyyneleet, syljen, maidon, veren valkosolut ja myeloomat.

Tässä käytettynä "puhdistettu HCV" viittaa HCV-valmisteeseen, joka on eristetty so-luosasista, joihin virus tavallisesti liittyy ja muista virustyypeistä, jotka voivat olla läsnä infektoituneessa kudoksessa. Tekniikat virusten eristämiseksi ovat tunnettuja alan am-20 mattilaisille ja sisältävät esimerkiksi sentrifugoinnin ja affiniteettikromatografian; menetelmästä puhdistetun HCV:n valmistamiseksi keskustellaan alla.

II. Kfflfgirmftn kiivaus :· 25 Tämän keksinnön käytännön suorituksessa käytetään, ellei toisin ole mainittu, molekyy libiologian, mikrobiologian, yhdistelmä-DNA-tekniikan ja immunologian tavanomaisia tekniikoita, jotka ovat alalla käytössä. Sellaisia tekniikoita selvitetään täysin kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi seuraavia: Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I 30 AND II (D.N. Glover toim. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait toim. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney toim. 1986); IMMOBOLIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); saija, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic 35 Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller ja M.P.Calos toim. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology * Vol. 154 and Vol. 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.), Mayer ja Walker, 105652 19 toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academis Press, Lontoo), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.), ja HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.Weir ja 5 C.C. Blackwell toim. 1986).

% -- 'TT .... .

Kaikki patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään tähän mukaan käsitelväksi viitejulkaisuina.

1 o Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee mahdolliseksi läheisesti homologisten nukleotidisekvenssien, jotka on eristetty cDNA-kiijastosta, joka on peräisin HCV-infektoituneen simpanssin plasmassa olevista nukleiinihapposekvensseistä, aikaansaaminen. Tämä nukleotidisekvenssien perhe ei ole peräisin ihmisestä tai simpanssista, koska se ei hybridisoidu infektoitumattomista yksilöistä peräisin olevan ihmi-15 sen eikä simpanssin genomin DNA:n kanssa, koska sekvenssien tämän perheen nukleo tidit ovat läsnä vain simpanssien maksassa ja plasmassa HCV-infektion myötä ja koska sekvenssi ei ole läsnä Genebank'issa. Lisäksi sekvenssien perhe ei osoita mitään merkittävää homologiaa HBV-genomiin sisältyvien sekvenssien kanssa.

20 Yhden perheen jäsenen sekvenssissä, joka jäsen sisältyy klooniin 5-1-1, on jatkuva avoin lukualue (ORF), joka koodaa arviolta 50 aminohapon polypeptidiä. HCV-infektoituneen ihmisen seerumi sisältää vasta-aineita, jotka sitoutuvat tähän polypeptidiin, kun taas infektoitumattomien ihmisten seerumi ei sisällä tämän polypeptidin vasta-aineita. Lopulta infektoitumattomien simpanssien seerumi ei sisällä tämän polypeptidin ·: 25 vasta-aineita, vasta-aineet syntyvät simpansseihin seuraten akuuttia NANBH-infektiota.

Edelleen tämän polypeptidin vasta-aineita ei havaita simpansseissa tai ihmisissä, joilla on HAV- tai HBV-infektio. Näillä perusteilla sekvenssi on cDNA virussekvenssille, jossa virus aiheuttaa NANBH:n täi liittyy NANBH:hon; tämä cDNA-sekvenssi esitetään kuviossa 1. Kuten keskustellaan seuraavassa, kloonin 5-1-1 cDNA-sekvenssi eroaa tois-30 ten eristettyjen cDNA.oiden sekvensseistä siinä, että se sisältää 28 ylimääräistä emäspa-;; ria.

Muiden tunnistettujen cDNA-perheen jäsenien yhdistelmä, jotka jäsenet eristettiin käyttäen koettimena synteettistä sekvenssiä, joka oli samanlainen kuin kloonissa 5-1-1 oleva 35 cDNA:n fragmentti, esitetään kuviossa 3. cDNA-perheen jäsen, joka eristettiin käyttäen synteettistä sekvenssiä, joka on peräisin kloonin 81 cDNA.sta, esitetään kuviossa 5 ja tämän sekvenssin yhdistelmä kloonin 81 sekvenssin kanssa esitetään kuviossa 6. Muita 20 105652 cDNA-perheen jäseniä, mukaanlukien ne, jotka ovat klooneissa 12f, 14i, 1 Ib, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e, kuvataan osassa IV.A.. Näissä klooneissa olevien cDNA:aiden yhdistelmää kuvataan osassa IV.A. 19 ja se esitetään kuviossa 32. cDNA:jen yhdistelmä osoittaa, että se sisäl-5 tää yhden jatkuvan ORF:n ja täten se koodaa polyproteiinia. Tämä tieto on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, josta keskustellaan seuraavassa, että HCV on flavivirus tai flavi-tyyppinen virus.

Vain tämän kuvioissa 1-32 esitetyn cDNA-perheen saatavuus sallii sellaisten DNA-o koettimien ja polypeptidien rakentamisen, jotka ovat hyödyllisiä HCV-infektion seurauksena syntyneen NANBH:n diagnosoimisessa ja seulottaessa verenluovuttajia ja myös luovutettua verta ja verituotteita infektion suhteen. Esimerkiksi sekvensseistä on mahdollista syntetisoida DN A-oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, jotka ovat hyödyllisiä hybridisaatiokoettimina virusgenomin osoittamiseksi esimerkiksi 3 5 sellaisten kohteiden seerumissa, joiden epäillään kantavan virusta tai luovutetun veren seulomiseksi viruksen läsnäolon varalta. cDNA-sekvenssien perhe sallii myös HCV-spesifisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, jotka polypeptidit ovat hyödyllisiä diagnostisina reagensseina NANBHm aikana syntyvien vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi. cDNA:sta peräisin olevien puhdistettujen polypeptidien vasta-aineita 20 voidaan myös käyttää virusantigeenien osoittamiseksi infektoituneissa yksilöissä ja veressä.

Lisäksi cDNA-sekvenssien perhe tekee mahdolliseksi HCV-genomin lisäkuvaamisen. Näistä sekvensseistä peräisin olevia polynukleotidikoettimia voidaan käyttää seulomaan ·: 25 cDNA-kiijastoja sellaisten lisä-cDNA-sekvenssien varalta, jotka menevät päällekkäin niiden kanssa, joita vuorostaan voidaan käyttää päällekkäin menevien sekvenssien lisän saamiseen. Ellei genomi ole segmentoitu, eikä segmenteillä ole yhteisiä sekvenssejä, tätä tekniikkaa voidaan käyttää koko genomin sekvenssin saamiseksi. Kuitenkin jos genomi on segmentoitu, muita genomin segmenttejä voidaan saada toistamalla lambda-30 gt 11-serologinen seulontamenettely, jota käytetään tässä kuvattujen cDNA-kloonien ” eristämiseksi tai vaihtoehtoisesti eristämällä genomi puhdistetuista HCV-partikkeleista.

cDNA-sekvenssien perhe ja polypeptidit, jotka ovat peräisin näistä sekvensseistä ja myös vasta-aineet, jotka on suunnattu näitä polypeptidejä vastaan, ovat myös hyödylli-35 siä BB-NANBV-aineiden eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät polypeptideihin, jotka ovat peräisin cDNA:sta, voidaan käyttää menetelmissä, jotka perustuvat affiniteettik- . 105652 21 romatografiaan viruksen eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti vasta-aineita voidaan käyttää tunnistamaan viruspartikkeleita, jotka on eristetty muilla tekniikoilla. Virusantigeenit ja genomimateriaali eristetyissä viruspartikkeleissa voidaan sitten edelleen määrittää.

5 Tieto, joka saadaan sekventoimäha HCV-genomeita edelleen, samoin kuin myös HCV-, antigeenejä edelleen karakterisoimalla ja genomia karakterisoimalla tekee mahdolliseksi lisäkoettimien ja polypeptidien ja vasta-aineiden suunnittelun ja synteesin, joita aineita , voidaan käyttää HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosiin, estämiseen ja hoitoon ja infektoituneen veren ja vereen liittyvien tuotteiden seulomiseen.

10 HCV-koettimien saatavuus, sisältäen antigeenit ja vasta-aineet ja polynukleotidit, jotka ovat peräisin genomista, josta cDNA-perhe on peräisin, sallii myös kudosten viljelyjärjestelmien kehittämisen, jotka järjestelmät ovat suuresti käytössä HCV:n biologiaa selvitettäessä. Tämä vuorostaan voi johtaa uusien hoito-ohjeiden kehittymiseen, jotka 15 perustuvat antiviraalisiin yhdisteisiin, jotka etupäässä estävät HCV:n replikaation tai sen tarttumisen.

Menetelmä, jota käytetään NANBHrn etiologisen aiheuttajan tunnistamiseen ja eristämiseen, on uusi ja se voi olla käyttökelpoinen tätä ennen karakterisoimattomien ainei-2 o den, jotka sisältävät genomin, tunnistamiseen ja/tai eristämiseen, ja jotka liittyvät lukui siin tauteihin, mukaan lukien ne, jotka aiheutuvat viruksista, viroideista, bakteereista, sienistä ja loisista. Tässä menetelmässä luotiin cDNA-kirjasto nukleiinihapoista, jotka olivat läsnä infektoituneen yksilön infektoituneessa kudoksessa. Kirjasto luotiin vektoriin, joka salli sellaisten polypeptidien ekspression, jotka olivat koodattuna cDNA:ssa. ; 25 Isäntäsolujen klooneja, jotka sisälsivät vektorin, joka ekspressoi immunologisesti reak tiivisen etiologisen aiheuttajan polypeptidin fragmenttia, valittiin kirjaston ekspres-siotuotteiden immunologisella seulonnalla vasta-aineen sisältävän ruumiin komponentin kanssa toisesta yksilöstä, Joka oli aikaisemmin infektoitu oletetulla aiheuttajalla. Immunologisen seulontatekniikan vaiheet käsittivät cDNA:n sisältävien vektoreiden saattami-20 sen reagoimaan vasta-aineen sisältävän, toisen infektoidun yksilön ruumiin kom-~ ·· ponentin kanssa ja antigeeni-vasta-ainekompleksin syntymisen osoittamisen ekspres- siotuotteiden ja toisen infektoidun yksilön vasta-aineiden välille. Eristetyt kloonit seulotaan edelleen immunologisesti saattamalla niiden ekspressiotuotteet reagoimaan vasta-aineen sisältävän, oletetulla aiheuttajalla infektoitui en toisten yksilöiden ruumiin kom-35 ponenttien kanssa ja vertailuyksilöiden kanssa, joita yksilöitä ei ole infektoitu oletetulla aiheuttajalla ja osoittamalla antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostuminen infek-* toiduista yksilöistä olevien vasta-aineiden kanssa; ja eristetään cDNA:n sisältävät vekto- . 22 105652 rit, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka reagoivat immunologisesti vasta-aineiden kanssa, jotka ovat peräisin infektoiduista yksilöistä ja yksilöistä, joiden epäillään olevan aiheuttajan infektoimia, mutta jotka eivät reagoi kontrolliyksilöiden kanssa. Infektoitu en yksilöiden, joita käytetään cDNA-kiijaston rakentamiseen ja immunologiseen seulon-5 taan, ei tarvitse olla samaa lajia.

Tämän menetelmän tuloksena eristetyt cDNA:t ja niiden ekspressiotuotteet ja ekspres-siotuotteita vastaan suunnatut vasta-aineet, ovat hyödyllisiä etiologisen aiheuttajan tunnistamisessa ja/tai löytämisessä. Kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin alla, tätä mene-10 telmää on käytetty menestyksellisesti eristämään HCV-genomista peräisin olevan cDNA-kiijaston eristämiseen.

II.A. r.nNA_«tfflfypnggin valmictaminpn 15 Varastoitua seerumia simpanssista, jolla oli krooninen HCV-infektio ja mikä sisälsi korkean virustiitterin, s.o. ainakin 104 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ml), käytettiin viruspartikkeleiden eristämiseen; näistä partikkeleista eristettyjä nukleiinihappoja käytettiin mallina rakennettaessa cDNA-kiijastoa virusgenomille. Menetelmistä oletettujen HCV-partikkeleiden eristämiseksi ja cDNA-kiijaston rakentamiseksi lambda-20 gtl 1 :een keskustellaan osassa IV.A. 1. Lambda-gtl 1 on vektori, joka on kehitetty erityi sesti ekspressoimaan soluun liitettyjä cDNA:ja fuusiopolypetideinä beta-galaktosidaasin kanssa ja seulomaan suuria joukkoja yhdistelmäfaageja erityisellä antiseerumilla, joka syntyy annettua antigeeniä vastaan. Vektoriin lambda-gtl 1 tehtyä cDNA-kiijastoa, joka oli luotu cDNA-varastosta, joka sisälsi arviolta 200 emäsparin keskimääräisen kokoista :* 25 cDNA:ta, seulottiin koodattujen epitooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaista, joilla oli aikaisemmin ollut NANB-hepatitis. Huynh, T.V. et ai. (1985). Seulottiin arviolta 106 faagia ja viisi positiivista faagia tunnistettiin, puhdistettiin ja sitten testattiin spesifisyyden suhteen sitoutua eri ihmisistä ja simpansseista, jotka olivat aikaisemmin infektoituneet HCV-aiheuttajalla, peräisin olevaan 20 seerumiin. Yksi faageista, 5-1-1, sitoutui viiteen kahdeksasta kokeillusta ihmissee- · · rumista. Tämä sitoutuminen tapahtui selektiivisesti sellaiseen seerumiin, joka oli otettu potilaista, joilla oli ollut aikaisemmin NANB-hepatitisinfektio, sillä seitsemän normaalin verenluovuttajan seerumit eivät osoittaneet sellaista sitoutumista.

25 Yhdistelmäfaagissa 5-1-1 olevan cDNA:n sekvenssi määritettiin ja se nähdään kuviossa 1. Tämän kloonatun cDNA:n koodaama polypeptidi, joka on samalla translaatioalueella * kuin fuusiopolypeptidin N-pään betagalaktosidaasipuolisko, esitetään nukleotidise- 105652 23 kvenssin yläpuolella. Tämä translaatio-ORF koodaa sen vuoksi epitooppia, jonka tunnistaa spesifisesti niiden potilaiden seerumi, joilla on NANB-hepatitisinfektioita.

cDNA:n saatavuus yhdistelmäfaagissa 5-1-1 on sallinut eristää muikein klooneja, jotka 5 sisältävät cDNA:n lisäsegmenttejä ja/tai vaihtoehtoisia segmenttejä virusgenomiin. * Lambda-gtll:ssä oleva cDNA-kiijasto, jota kuvattiin yllä, seulottiin käyttäen synteet tistä polynukleotidia, joka oli peräisin kloonatun 5-1 -1 :n cDNA:n sekvenssistä. Tämä » seulonta antoi tuloksena kolme muuta kloonia, joiden tunnistettiin olevan 81, 1 -2 ja 91; näiden kloonien sisältämät cDNA:t sekventoitiin. Katso osia IV.A.3. ja IV.A.4. Neljän 10 itsenäisen kloonin väliset homölogiat esitetään kuviossa 2, jossa homologiat on merkitty pystyviivoilla. Nukleotidisekvenssit, jotka ovat läsnä ainutkertaisesti klooneissa 5-1-1, 81 ja 91, on merkitty pienillä knjaimilla.

Yhdistelmäfaageissa klooneissa 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 läsnä olevat kloonatut cDNA:t ovat 15 hyvin homologisia ja eroavat väin kahdella alueella. Ensiksi nukleotidi numero 67 kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät tässä asemassa syti-diinij äännöksen. Tämä korvaus ei kuitenkaan muuta koodatun aminohapon luonnetta.

Toinen ero kloonien välillä on, että klooni 5-1-1 sisältää 28 emäsparia 5-päässä, jotka 20 parit eivät ole läsnä muissa klooneissa. Ylimääräinen sekvenssi voi olla 5'-päätä kloo-naava tekotuote; 5'-päätä kloonaavia tekotuotteita huomataan usein cDNA-menetelmien tuotteissa.

HCV:n cDNA:n synteettisiä sekvenssejä, jotka olivat peräisin 5'-alueelta ja 3'-alueelta, 25 käytettiin seulomaan ja eristämään lambda-gtll:ssä olevia NANBV:n cDNA-kiijaston cDNA:ta, jotka menivät päällekkäin kloonin 81 cDNA:n kanssa (Osa IV.A.5.). Tuloksena olevien cDNA:jen sekvenssit, jotka ovat kloonissa 36 ja vastaavasti kloonissa 32, esitetään kuviossa 5 ja kuviossa 7.

i 30 Samoin synteettistä polynukleotidia, joka perustui kloonin 36 5'-alueeseen, käytettiin seulomaan ja eristämään lambda-gtl l :ssä olevan NANBV:n cDNA-kiijaston cDNA:oja, jotka menivät päällekkäin kloonin 36 cDNA:n kanssa (osa IV.A.8:). Yhdistelmäfaagin sisältävän cDNA:n puhdistettu klooni, joka hybridisoitui synteettiseen polynukleotidi-koettimeen, nimettiin klooniksi 33 ja tämän kloonin sisältämä NANBV:n cDNA-35 sekvenssi esitetään kuviossa 8.

Käyttäen tekniikkaa eristää päällekkäin meneviä cDNA-sekvenssejä on saatu lisäse- 24 105652 kvenssejä HCV:n cDNArsta ylävirtaan ja alavirtaan. Näiden kloonien eristämistä kuvataan alla osassa IV.A.

Eristettyihin klooneihin koodattujen HCV:n cDNArojen nukleotidisekvenssien analyysi 5 osoittaa, että yhdistelmä-cDNA sisältää yhden pitkän, jatkuvan ORF:n. Kuvio 26 esittää näistä klooneista peräisin olevan yhdistelmä-cDNA:n sekvenssin yhdessä siihen koodatun oletetun HCV -polypeptidin kanssa.

Menetelmän kuvaus cDNA-sekvenssien saamiseksi on enimmäkseen historiallisesti 10 mielenkiintoista. Tuloksena olevat sekvenssit (ja niiden komplementit) annetaan tässä ja sekvenssit tai niiden osat voitaisiin valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmiä saaden osittaisia sekvenssejä käyttäen menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin ne joita kuvataan tässä. Lambda-gtl 1-kannat, jotka on replikoitu HCV:n cDNA-kiijastosta ja klooneista 5-1-1, 81, 1-2 ja 91, on talletettu Bu-15 dapest Treaty'n mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), osoitteessa 12310 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852 ja niille on annettu seuraavat talletus-numerot.

I.amhda-gtl 1 ATCC No TalUtngpaiva 20 HCV:n cDNA-kiijasto 40394 1.12.1987 klooni 81 40388 17.11.1987 klooni 91 40389 17.11.1987 klooni 1-2 40390 17.11.1987 klooni 5-1-1 40391 18.11.1987 25 • «

Kun tätä vastaava hakemus on mennyt patentiksi USA.ssa, kaikki rajoitukset näiden tallenteiden saatavuuden suhteen tullaan poistamaan peruuttamattomasti; ja pääsy mainittuihin tallenteisiin on mahdollinen yllämainitun US-hakemuksen käsittelyn aikana sille, jonka "Commissioner" siihen valtuuttaa säännösten 37 CFR 1.14 ja 35 USC 1.22 30 nojalla. Lisäksi mainittuja tallenteita ylläpidetään kolmenkymmenen vuoden ajan talle-tuspäivästä lukien tai viidn vuoden ajan siitä, kun joku on viimeksi tallenteita kysellyt; tai US-patentin voimassaoloajan, mikä tahansa edellämainituista aikarajoista onkin pitempi. Nämä tallenteet ja tässä mainitut muut talletetut materiaalit ovat tarkoitetut ainoastaan mukavuutta varten, eikä niitä vaadita tämän keksinnön käytäntöön so vei-35 tamisessa tässä annetun kuvauksen valossa. Kaikessa talletetussa materiaalissa olevat HCV:n cDNA-sekvenssit liitetään tähän viittauksena.

105652 25

Yllä oleva kuvaus genomin "kävelystä" eristämällä päällekkäin menevät cDNA-sekvenssit HCV:n lambda-gtl 1-kirjastosta aikaansaa yhden menetelmän, jolla voidaan eristää cDNA:t, jotka vastaavat koko HCV-genomia. Kuitenkin, kun tässä annettu tieto on hallussa, muut menetelmät näiden cDNArojen eristämiseksi ovat ilmeisiä alan am-•5 mattilaiselle. Muutamia näistä menetelmistä kuvataan osassa IV .A. alla.

> ------'“·“.....

II.B. VinicpnlyppptiHien ja -fragmenttien valmUtiic cDNA-sekvenssien saatavuus, joko niiden, jotka on eristetty käyttäen kuvioiden 1 - 32 1 o cDNA-sekvenssejä ja myös näissä kuvioissa esitettyjen cDNA-sekvenssien, sallii sellaisten ekspressiovektoreiden rakentamisen, jotka koodaavat jompaan kumpaan säikee-seen koodatun polypeptidin antigeenisesti aktiivisia alueita. Nämä antigeenisesti aktiiviset alueet voidaan johtaa päällys- tai kuoriantigeeneistä tai ydinantigeeneistä, sisältäen esimerkiksi polynukleotidia sitovat proteiinit, polynukleotidipolymeraasit ja muut vi-15 rusproteiinit, joita vaaditaan viruspartikkelin replikaatiota ja/tai kokoonpanoa varten. Fragmentit, jotka koodaavat haluttua polypeptidiä, johdetaan cDNA-klooneista käyttäen tavanomaista restriktiopilkkomista tai synteettisillä menetelmillä ja ne liitetään vekto-reihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia fuusiosekvensseistä, kuten betagalak-tosidaasista tai superoksididismutaasista (SOD), mieluummin SOD:sta. Menetelmiä ja 20 vektoreita, jotka ovat hyödyllisiä sellaisten polypeptidien tuottamiseksi, jotka sisältävät SOD:n fuusiosekvenssejä, kuvataan EP-julkaisussa numero 0196056, joka on julkaistu lokakuun 1 päivänä, 1986. Vektoreita, jotka koodaavat SOD:n fuusiopolypeptidejä ja HCV-polypeptidejä, s.o. NANBj-m, NANBgi, ja C100-3, joka on koodattu HCV:n cDNA:ojen yhdistelmässä, kuvataan osissa IV.B.l., IV.B.2. ja vastaavasti IV.B.4.. Mikä ; 25 tahansa HCV.n cDNA:n osa, joka sisältää avoimen lukualueen, kummassa tahansa säi- keessä, voidaan saada yhdistelmäpolypeptidinä, kuten maturaattina tai fuusioprote-iinina; vaihtoehtoisesti cDNAihan koodattu polypeptidi voidaan saada aikaan kemiallisella synteesillä.

30 Haluttua polypeptidiä koodaava DNA, joko fuusioidussa tai maturoidussa muodossa ja *; sisältäen signaalisekvenssin salliakseen erityksen tai ollen sisältämättä, voidaan liittää ekspressiovektoreihin, jotka ovat sopivia mitä tahansa sopivia isäntiä varten. Sekä euka-riootti- että prokariootti-isäntäjäqestelmiä käytetään nykyään muodostettaessa yhdis-telmäpolypeptidejä ja tiivistelmä muutamista yleisemmin käytetyistä säätöjäijestelmistä 35 ja isäntäsolulinjöistä on annettu osassa III.A. alla. Polypeptidi eristetään sitten hajotetuista soluista tai viljely väliaineesta ja puhdistetaan siinä määrin kuin tarvitaan sen aiottua käyttöä varten. Puhdistus voidaan tehdä tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, esi- 105652 merkiksi suolafraktioinnilla, ioninvaihtohartseilla kromatografoimalla, affiniteettikro-matografialla, linkoamalla ja sen kaltaisilla. Katso esimerkiksi: Methods in Enzymology lukuisia proteiinien puhdistusmenetelmiä varten. Sellaisia polypeptidejä voidaan käyttää diagnostisina välineinä. Näitä polypeptidejä vastaan syntyneitä vasta-aineita voidaan 5 myös käyttää diagnostiikassa. Lisäksi, kuten keskustellaan osassa II.J. alla, näiden poly-peptidien vasta-aineet ovat hyödyllisiä HCV-partikkeleiden eristämisessä ja tunnistamisessa.

HCV-antigeenejä voidaan eristää myös HCV-virioneista. Virioneja voidaan kasvattaa 10 HCV-infektoiduissa soluissa kudosviljelmässä tai infektoidussa isännässä.

II.C. Antigeeni Sten pnlypeptiHien valmistaminen ja krmjngaatin kantajan kanssa

Polypeptidin antigeeninen alue on yleensä suhteellisen pieni - tyypillisesti pituudeltaan 15 8-10 aminohappoa tai vähemmän. Niinkin vähästä kuin 5 aminohaposta koostuvat fragmentit voivat karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä segmentit voivat vastata HCV-antigeenin alueita. Niinpä, käyttäen HCV:n cDNAroita pohjana, DNA:ja koodaa-via HCV-polypeptidien lyhyitä segmenttejä voidaan ekspressoida yhdistelmänä joko fuusioproteiineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lisäksi lyhyitä aminohap-20 posekvenssejä voidaan saada sopivasti kemiallisella synteesillä. Esimerkiksi missä syntetisoitu polypeptidi on muotoiltu oikein saadakseen aikaan oikean epitoopin, mutta on liian pieni ollakseen immunogeeninen, polypeptidi voidaan liittää sopivaan kantajaan.

Lukuisia tekniikoita sellaisen liitoksen saamiseksi on tunnettu alalla, mukaanlukien di-· 2 5 sulfidiliitoksien muodostamisen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)- propionaattia (SPDP) ja sukkinimidyyli 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-l-karboksylaattia (SMCC), joita saadaan Pierce Company'sta, Rockford, Illinois (jos peptidissä ei ole sulfhydryyliryhmää, se voidaan varustaa lisäämällä kysteiinijäännös). Nämä reagenssit luovat disulfidiliitoksen itsensä ja peptidin kysteiinijäännöksen välille 30 yhdessä proteiinissa ja amidiliitoksen lysiinin epsilonaminon kautta tai muun vapaan, ··' toisessa ryhmässä olevan aminoryhmän kautta. Tunnetaan lukuisia sellaisia disulfi- di/amidin muodostavia aineita. Katso esimerkiksi Immun. Rev. (1982) 62:185. Muut kaksitoimiset kytkentäaineet muodostavat pikemminkin tioeetteri- kuin disulfidikytken-töjä. Monet näistä tioeettereitä muodostavista aineista ovat kaupallisesti saatavia ja si-35 sältävät 6-maleiini-imidokaproiinihapon, 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-l-karboksyylihapon ja sellaisten reaktiiviset este-' rit. Karboksyyliryhmät voidaan aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai 1-hydrok- 105652 27 syyli-2-nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Edellisen listan ei ole tarkoitettu olevan tyhjentävä ja nimettyjen yhdisteiden muunnoksia voidaan vapaasti käyttää.

Voidaan käyttää mitä tahansa kantajaa, joka ei itse aiheuta isännälle haitallisten vastaai-5 neiden tuotantoa. Sopivat kantajat ovat tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia mak-' romolekyylejä, kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten lateksilla funktionalisoitua sefaroosia, agaroosia, selluloosaa, selluloosapalloja ja sen kaltaisia; polymeerisiä aminohappoja, kuten polyglutaamihappo, polylysiini ja sen kaltaiset; aminohappoko-polymeerejä; ja inaktiivisia viruspartikkeleita, katso esimerkiksi osaa II.D. Erityisen 10 hyödyllisiä proteiinikantajia ovat seerumialbumiinit, "keyhole limpet"-hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, ovalbumiini, jäykkäkouristustoksoidi, ja muut proteiinit, jotka ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaiselle.

II.D. HCV-epitnnppeja sisältävien hybridipartikkeli=immiinogeenien valmistaminen 15 HCV:n epitooppien immunogeenisyyttä voidaan myös vahvistaa valmistamalla ne imet-täväis- tai hiivajäijestelmässä, jotka on fuusioitu tai asennettu siten, että niissä on partikkeleita muodostavia proteiineja, kuten esimerkiksi se, joka liittyy hepatitis-B:n pinta-antigeeniin. Rakenteet, joissa NANBV-epitooppi on liitetty suoraan partikkeleita muo-20 dostavaa proteiinia koodaaviin sekvensseihin, tuottavat hybridejä, jotka ovat immuno-geenisiä HCV-epitoopin suhteen. Lisäksi kaikki valmistetut vektorit sisältävät HBV:lle spesifisiä epitooppeja, joissa on vaihteleva määrä immunogeenisyyttä, kuten esimerkiksi pre-S-peptidi (pre surface protein). Täten partikkeleita muodostavista proteiineista rakennetut partikkelit, jotka proteiinit sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat im-25 munogeenisiä HCV :n ja HBV :n suhteen.

Hepatitiksen pinta-antigeenien (HBSAg) on osoitettu muodostuvan ja liittyvän S-.ceres visiae:n partikkeleihin (Valenzuela et ai. (1982)) ja myös esimerkiksi imettäväissoluihin (Valenzuela, P., et ai. (1984)). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on osoitettu 30 vahvistavan monomeerialayksikön immunogeenisyyttä. Rakenteet voivat myös sisältää hepatitiksen pinta-antigeenin immunodominantin epitoopin, joka käsittää ennen pintaa (pre-S) olevan alueen 55 aminohappoa. Neurath et ai. (1984). Ennen pintaa olevia hepatitiksen pinta-antigeenipartikkeita, jotka ovat ekspressoitavissa hiivassa, esitetään EP-julkaisussa 174,444, joka on julkaistu 19.03.1986; hybridejä, jotka sisältävät heterologi-35 siä virussekvenssejä hiivaekspressiota varten, on esitetty EP-julkaisussa 175,261, joka on julkaistu 26.03.1986. Molemmat julkaisut ovat tämän julkaisun hakijan nimissä ja niihin viitataan tässä. Rakenteet voivat olla ekspressoituja imettäväissoluissa, kuten kii- 28 105652 nalaisen hamsterin munararjasoluissa (CHO) käyttäen SV40-dihydrofolaatti-reduktaasi-vektoria (Michelle et ai. (1984)).

Lisäksi osia partikkeleita muodostavaa proteiinia koodaavasta sekvenssistä voidaan 5 vaihtaa kodoneihin, jotka koodaavat HCV-epitooppia. Tässä vaihdossa alueet, joita ei vaadita välittämään yksiköiden yhdistämistä immunogeenisien partikkeleiden muodostamiseksi hiivoissa tai imettäväisissä, voidaan poistaa välttäen täten ylimääräisten HBV-antigeenipaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa.

3 0 II.E. Poistettu II.F. Poistettu II.G. Vasta-aineiden valmistaminen HCV-epitooppeja vastaan 15

Immunogeenisiä polypeptidejä, jotka on valmistettu yllä kuvatusti, käytetään tuottamaan vasta-aineita, sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia. Jos halutaan polyklonaa-lisia vasta-aineita, valittu imettäväinen (esimerkiksi hiiri, kani, vuohi, hevonen jne.) immunoidaan immunogeenisellä polypeptidillä, joka kantaa HCV-epitooppeja. Seeru-20 mia immunoidusta eläimestä kerätään ja sitä käsitellään tunnetuilla menettelytavoilla.

Jos seerumi, joka sisältää polyklonaalisia vasta-aineita HCV-epitoopille, sisältää vasta-aineita muille antigeeneille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa immunoaffi-niteettikromatografialla. Tekniikat polyklonaalisen antiseerumin tuottamiseksi ja käsittelemiseksi ovat alalla tunnettuja, katso esimerkiksi Mayer ja Walker (1987).

25 * ·

Vaihtoehtoisesti polyklonaaliset vasta-aineet voidaan eristää imettäväisestä, joka on aikaisemmin infektoitu HCV:llä. Esimerkki HCV-epitooppien vasta-aineiden puhdistusmenetelmästä infektoidun yksilön seerumista, perustuen affmiteettik-romatografiaan ja käyttäen SOD:n fuusiopolypeptidiä ja polypeptidiä, joka on koodattu 30 kloonin 5-1-1 cDNA:ssa, on esitetty osassa V.E.

• 7 • ·

Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HCV-epitooppeja vastaan, voi myös tuottaa helposti alan ammattimies. Yleiset menetelmät monoklonaalisten vasta-aineiden tekemiseksi hybridoomien kautta ovat hyvin tunnettuja. Kuolemattomia vasta-aineita 35 tuottavia solulinjoja voidaan luoda solufuusiolla ja myös muilla tekniikoilla, kuten suoralla B-lymfosyyttien trasformaatiolla onkogeenisellä DNA:lla tai Epstein-Barr-viruksen avulla tehtävällä transfektiolla. Katso esimerkiksi M.Schreier et ai. (1980); 105652 29

Hammerling et ai. (1981); Kennett et ai. (1980); katso myös US-patentteja numerot 4,371,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444, 887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. HCV-epitooppeja vastaan tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden sarjoja voidaan seuloa eri ominaisuuksien suhteen; s.o. isotyypin, epitoopin affiniteetin jne. 5 suhteen.

Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, ovat erityisen hyödyllisiä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erityisesti synnyttämään jänti-idiotyypin vasta-aineita.

10

Anti-idiotyypin vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, joissa on "sisäinen kuva" infek-toivan aineen, jota vastaan suojaa halutaan, antigeenistä. Katso esimerkiksi Nisonoff, A., et ai. (1981) jaDreesman et ai. (1985).

15 Tekniikat anti-idiotyypin vasta-aineiden synnyttämiseksi ovat alalla tunnettuja. Katso esimerkiksi Grzych (1985), MacNamara et ai. (1984), ja Uytdehaag et ai. (1985). Nämä anti-idiotyypin vasta-aineet voivat olla myös hyödyllisiä NANBH:n hoidossa ja myös HCV-antigeenien immunogeeriisten alueiden selventämisessä.

20 II.H. Diagnostiset nliginiikleotidikoettunet ja välinesaijat Käyttäen eristettyjä HCV:n cDNA:ojen esitettyjä osia, mukaanlukien ne, jotka on esitetty kuvioissa 1-32, pohjana, voidaan valmistaa oligomeerejä, joissa on noin 8 nukleotidia tai enemmän, joko pätkimällä tai synteettisesti, jotka oligomeerit hybridisoituvat HCV-25 genomin kanssa ja ovat hyödyllisiä virusaineiden tunnistamisessa, virusgenomien lisä-karakterisoinnissa ja myös virusten havaitsemisessa sairaissa yksilöissä. HCV-polynukleotidejä varten olevlenlcoettimien (joko luonnollisten tai johdettujen) pituudet ovat sellaisia, että ne sallivat, ainutkertaisten virussekvenssien osoittamisen hybri-disaation avulla. Kun 6-8 nukleotidia voi olla toimiva pituus, pidetään 10-12 nukle-00 otidin sekvenssejä parempana ja noin 20 nukleotidia näyttää olevan optimi. Mieluum- Λ · min nämä sekvenssit ovat peräisin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koet-timet voidaan valmistaa käyttäen rutiinimenetelmiä, sisältäen automatisoidut oligo-nukleotidin synteettiset menetelmät. Hyödyllisten koettimien joukossa ovat esimerkiksi klooni 5-1-1 ja muut tässä esitetyt kloonit ja myös eri oligomeerit, jotka ovat hyödylli-35 siä cDNA-kiijastoja tutkittaessa, ja joita on kuvattu alla. Minkä tahansa HCV-genomin ainutkertaisen osan komplementti on myös tyydyttävä. Käytettäväksi koettimina on täydellinen komplementaarisuus toivottavaa, vaikka se voi olla tarpeetonta, kun frag- 30 105652 mentin pituus kasvaa.

Sellaisten koettimien käyttämiseksi diagnostiikassa, biologista analysoitavaa näytettä, kuten verta tai seerumia, käsitellään haluttaessa sen sisältämien nukleiinihappojen uut-5 tamiseksi. Näytteestä tuloksena olevat nukleiinihapot voidaan alistaa geelielektroforee-siin tai johonkin muuhun koon mukaan erottelevaan tekniikkaan; vaihtoehtoisesti nukle-iinihapponäyte voidaan pisteblotata ilman kokoerottelua. Koettimet leimataan sitten. Sopivat leimat ja koettimien leimausmenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka on liitetty nicktranslaation tai kinaasion avulla, 10 biotiinin, fluoresoivat koettimet ja kemiluminisoivat koettimet. Näytteestä uutettuja mukleiinihappoja käsitellään sitten leimatulla koettimella sopivan tiukoissa hybridi-saatio-olosuhteissa.

Koettimet voidaan tehdä täysin komplementaarisiksi HCV-genomille. Siksi hyvin tiukat 15 olosuhteet ovat toivottavia väärien positiivisten estämiseksi. Kuitenkin hyvin tiukkoja olosuhteita tulisi käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia sellaiselle virus-genomin alueelle, jossa ei ole heterogeenisyyttä. Hybridisaation tiukkuuden määrittävät lukuisat hybridisaation aikaiset ja pesumenettelyn aikaiset tekijät, mukaanlukien lämpötila, ionivahvuus, ajan pituus jä formamidin pitoisuus. Näitä tekijöitä on hahmotellut 20 esimerkiksi Maniatis, T. (1982).

Yleisesti on odotettavissa, että HCV-genomia on läsnä infektoituneiden uksilöiden seerumissa suhteellisen alhaisina tasoina, s.o. tasolla noin 10z-103 sekvenssiä ml:aa kohti. Tämä taso voi vaatia, että hybridisaatioanalyysissä käytetään amplifikaatiotekniikkaa. 25 Sellaiset tekniikat ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporationin "Bio-Bridge"-jäijestelmä käyttää terminaalista deoksinukleotiditransferaasia modifioi-mattoman 3'-poly-dT-häntien lisäämiseksi DNA-koettimeen. Poly dT-häntäinen koetin hybridisoidaan kohdenukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimodifioituun poIy-A:han. PCT-hakemus 84/03250 ja EP-julkaisu 124221 kuvaavat DNA-hybridisaatioanalyysiä, 30 jossa: (1) analyytti lämpökäsitellään yksisäikeiseksi DNA-koettimeksi, joka on komplementaarinen entsyymileimatulle olinukleotidille; ja (2) tuloksena oleva hännällinen dup-leksi hybridisoidaan entsyymileimattuun oligonukleotidiin. EP-julkaisu 204510 kuvaa DNA-hybridisaatioanalyysiä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jolla on häntä, kuten poly- dT-häntä, amplifikaatiosäie, jossa on sekvenssi, joka 35 hybridisoituu koettimen häntään, kuten poly-A-sekvenssi, ja joka voi sitoa useita leimattuja säikeitä. Erityisen haluttava tekniikka voi ensin käsittää seerumissa kohteena ’ olevien HCV-sekvenssien amplifikaation noin 10000-kertaiseksi, s.o. noin 106 sekvens- 105652 31 siin/ml. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi tekniikalla, jonka esitti Saiki et ai. (1986). Amplifioidut sekvenssit voidaan sitten osoittaa käyttäen hybridisaatioanalyysiä, jota on kuvattu vireillä olevassa US-hakemuksessa, joka jätettiin 15.10.1987, asiamiehen numero 2300-0171, ja joka on saman hakijan nimissä kuin tämäkin keksintö ja johon 5 viitataan tässä. Tämä hybridisaatioanalyysi, jonka tulisi havaita sekvenssit tasolla lOVml, käyttää nukleiinihappomultimeerejä, jotka sitoutuvat yksisäikeiseen analyyttinukleiinihappoon ja jotka sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin , oligonukleotideihin. Sopivaa liuosmuotoista sandvvich-analyysiä, jota voidaan käyttää leimattujen polynukleotidikoettimien kanssa ja menetelmiä koettimien valmistamiseksi 10 on kuvattu EP-julkaisussa 225,807, joka on julkaistu 16.6.1987, jonka hakija on sama kuin tämän keksinnön hakija ja johon tässä viitataan.

Koettimet voidaan pakata diagnostisiksi välinesaijoiksi. Diagnostiset välinesaijat sisältävät koetin-DNA:n, joka voi olla leimattu; vaihtoehtoisesti koetin-DNA voi olla lei-13 maamaton ja leimaamistarvikkeet voivat sisältyä välinesaijaan. Välinesaija voi myös sisältää muita sopivasti pakattuja reagensseja ja materiaaleja, joita tarvitaan tiettyä hyb-ridisaatiotoimintatapaa varten, esimerkiksi standardeja ja myös ohjeet kokeen suorittamiseksi.

20 Π.Ι. Immunologinen analyysi ja diagnostiset välinesaijat

Sekä polypeptidit, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-aineita sisältävän seerumin kanssa, esimerkiksi ne, jotka ovat peräisin osassa IV.A. kuvatuista klooneista tai jotka ovat niissä koodattuja ja niiden kompositiot (ks. osa IV.A.) ja vasta-aineet, *: 25 jotka ovat syntyneet näissä polypeptideissä olevia HCV-spesifisiä epitooppeja vastaan, ks. esimerkiksi osa IV.E., ovat hyödyllisiä immunologisissa analyyseissä HCV-vasta-aineiden läsnäolon osoittamiseksi tai viruksen ja/tai rirusantigeenien osoittamiseksi biologisissa näytteissä, sisältäen esimerkiksi veri- ja seeruminäytteet. Immunologisten analyysien suunnittelu on suuren vaihtelun kohde ja näitä tunnetaan alalla lukuisia. 30 Esimerkiksi immunologinen analyysi voi käyttää yhtä virusantigeeniä, esimerkiksi ” polypeptidiä, joka on peräisin mistä tahansa kloonista, joka sisältää HCV:n cDNA:ta, jota kuvataan osassa IV.A. tai yhdistelmä-cDNA:oista, jotka ovat peräisin näissä klooneissa olevasta cDNA:sta tai HCV-genomista, josta näiden kloonien cDNA on peräisin; vaihtoehtoisesti immunologinen analyysi voi käyttää virusantigeenien 35 yhdistelmää, jotka antigeenit ovat peräisin näistä lähteistä. Se voi käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu virusepitooppeja vastaan, monok-lonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, joka on suunnattu yhtä virusantigeeniä vastaan, 32 105652 monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnatut erilaisia virusantigeenejä vastaan, polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on summattu samaa virusantigeeniä vastaan tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja eri virusantigeenejä vastaan. Toimintatavat voivat perustua esimerkiksi kilpailuun, tai suoraan reaktioon tai 5 sandwich-tyyppiseen analyysiin. Toimintatavat voivat myös käyttää esimerkiksi kiinteitä kantajia tai ne voivat käyttää immunosaostusta. Useimmat analyysit käsittävät leimatun vasta-aineen tai polypeptidin käytön; leimat voivat olla esimerkiksi fluoresoivia, kemiluminisoivia, radioaktiivisia tai värillisiä molekyylejä. Analyysit, jotka vahvistavat koettimelta tulevat signaalit, ovat myös tunnettuja; joista esimerkkejä ovat 10 analyysit, jotka käyttävät biotiinia ja avidiinia ja entsyymileimattuja ja entsyymivälitteisiä immunologisia analyysejä, kuten ELISA-analyysiä.

Flavivirusmalli HCV:tä varten sallii ennustamiset koskien diagnostisten epitooppien todennäköistä sijaintia virionin rakenteellisia proteiineja varten. C-, pre-M-, M- ja E-15 alueet sisältävät kaikki todennäköisesti merkittävän voimakkaita epitooppeja virusantigeenien osoittamiseksi ja erityisesti diagnoosia varten. Samoin odotetaan ei-rakenneproteiinien alueiden sisältävän tärkeitä diagnostisia epitooppeja (esimerkiksi NS5, joka koodaa oletettua polymeraasia; ja NS 1, joka koodaa oletettua komplementtia sitovaa antigeeniä). Yhdistelmäpolypeptidit tai viruspolypeptidit, jotka sisältävät 20 epitooppeja näiltä erityisiltä alueilta, voivat olla hyödyllisiä virusvasta-aineiden osoittamiseksi sairaista verenluovuttajista ja sairaista potilaista.

Lisäksi vasta-aineita, jotka ovat suunnatut E- ja/tai M-proteiineja vastaan, voidaan käyttää immunologisissa analyyseissä virusantigeenien osoittamiseksi potilaissa, joilla *: 25 on HCV:n aiheuttama NANBH ja sairaissa verenluovuttajissa. Vielä nämä vasta-aineet ovat äärimmäisen hyödyllisiä akuutin vaiheen luovuttajien ja potilaiden havaitsemisessa.

Välinesaijat, jotka ovat sopivia immunologisia diagnooseja varten ja jotka sisältävät 30 sopivasti leimattuja reagensseja, ovat rakennetut pakkaamalla sopivat materiaalit mukaanlukien keksinnön polypeptidit, jotka sisältävät HCV-epitooppeja tai HCV-epitooppeja vastaan suunnattuja vasta-aineita sopivissa astioissa yhdessä niiden muiden reagenssien ja materiaalien kanssa, joita vaaditaan analyysin suorittamiseksi ja myös sopivat analyysiohjeet.

II.J. HrV.gpnnmin virionipn ja vinmantigppniftn li«äkarakteri<;mnti k-äyttäpn lcnettimia 35 „ 105652 HCV:n cDNA-sekvenssitietoa klooneissa, joita kuvataan osassa IV.A., kuten on esitetty kuvioissa 1-32, voidaan käyttää saamaan lisää tietoa HCV-genomin sekvenssistä ja tunnistamaan ja eristämään HCV-aine ja täten se auttaa karakterisoinnissaan sisältäen 5 genomin luonteen, viruspartikkelin rakenteen ja niiden antigeenien luonteen, joista se <· koostuu. Tämä tieto vuorostaan voi johtaa lisämäärään polynukleotidikoettimia, polypeptidejä, jotka ovat peräisin HCV-genomista ja vasta-aineita HCV-epitooppeja . vastaan, jotka voisivat olla hyödyllisiä HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosissa ja/tai hoidossa.

10

Yllämainittujen kloonien cDNA-sekvenssitieto on hyödyllinen suunniteltaessa koettimia lisä-cDNA-sekvenssien erottamiseksi, jotka ovat peräisin HCV-genomien vielä tunnistamattomilta alueilta, joista genomeista cDNA:t osasssa IV.A. kuvatuissa klooneissa ovat peräisin. Esimerkiksi leimattuja koettimia, jotka sisältävät noin 8 tai 15 enemmän nukleotidin sekvenssin ja mieluummin 20 tai enenmmän nukleotidin sekvenssin, jotka nukleotidit ovat peräisin alueilta, jotka ovat lähellä kuvioissa 1, 3,6, 9, 14 ja 32 esitettyjen HCV:n cDNA-sekvenssien perheen 5'-päätä tai 3'-päätä, voidaan käyttää eristämään päällekkäin meneviä cDNA-sekvenssejä HCV:n cDNA-kiijastoista. Näitä sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin yllämainituissa klooneissa olevien 20 cDNArojen kanssa, mutta jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka ovat peräisin genomin alueilta, joista cDNA yllämainituissa klooneissa ei ole peräisin, voidaan sitten käyttää koettimien syntetisoimiseen muiden päällekkäin menevien fragmenttien tunnistamiseen, jotka fragmentit eivät välttämättä mene päällekkäin osassa IV.A. kuvattujen kloonien cDNA:ojen kanssa. Ellei HCV-genomi ole segmentoitu ja segmenteillä . 25 ei ole yhteisiä sekvenssejä, on mahdollista sekventoida koko virusgenomit käyttäen virusgenomista johdettujen päällekkäin menevien cDN Arojen eristystekniikkaa. Vaikkakin on epätodennäköistä^ jos genomi on segmentoitu genomi, jossa ei ole yhteisiä sekvenssejä, genomin sekvenssi voidaan määrittää seulomalla serologisesti lambda-gtl lrssä olevia HCV:n cDNA-kiijastoja, kuten käytettiin kloonin 5-1-1 30 eristämiseen, sekventoimalla cDNA-eristeitä ja käyttämällä eristettyjä cDNAroja ·* päällekkäin menevien fragmenttien eristämiseen käyttäen tekniikkaa, jota kuvattiin osassa IV.A. kuvattujen kloonien eristämiseen ja sekventointiin. Vaihtoehtoisesti genomisegmenttien karakterisointi voitaisiin tehdä virusgenomeista, jotka on eristetty puhdistetuista HCV-partikkeleista. Menetelmiä HCV-partikkeleiden puhdistamiseksi ja 35 niiden osoittamiseksi puhdistusmenettelyn aikana kuvataan tässä alla. Menettelyt polynukleotidigenomien eristämiseksi viruspartikkelista ovat tunnettuja alalla ja eräs ' käyttökelpoinen menetelmä on esitetty Esimerkissä IV.A.l. Eristetyt genomisegmentit 34 105652 voitaisiin sitten kloonata ja sekventoida. Täten tässä annetun tiedon nojalla on mahdollista kloonata ja sekventoida HCV-genomeita niiden luonteesta riippumatta.

Menetelmät cDNA-kiijastojen luomiseksi ovat alalla tunnettuja ja niistä keskustellaan 5 ylempänä ja alempana; menetelmästä HCV:n cDNA-kiijaston luomiseksi lambda-gtl 1-vektoriin, keskustellaan alla osassa IV.A. Kuitenkin cDNA-kiijastoja, jotka ovat käyttökelpoisia nukleiinihappokoettimilla seulomiseen, voidaan myös rakentaa muilla alalla tunnetuilla vektoreilla, esimerkiksi lambda-gtl 0:llä (Huynh et ai. (1985)). HCV:stä peräisin oleva cDNA, jonka kuvioiden 1-32 cDNA:sta ja näistä cDNA:sta 10 johdetuista polynukleotideista syntetisoiduista koettimista peräisin olevat koettimet havaitsevat, voidaan eristää kloonista katkomalla eristetty polynukleotidi sopivilla restriktioentsyymeillä ja sekventoimalla. Katso esimerkiksi osista IV.A.3. ja IV.A.4. tekniikoita, joita käytetään sen HCV:n cDNA:n eristämiseen ja sekventointiin, mikä menee päällekkäin kloonin 5-1-1 HCV:n cDNA:n kanssa, osista IV.A.5. -IV.A.7. sen 15 HCV:n cDNA:n eristystä ja sekventointia, mikä menee päällekkäin kloonin 81 cDNA:n kanssa ja osista IV.A.8. ja IV.A.9. sen kloonin eristämistä ja sekventoimista, mikä menee päällekkäin toisen kloonin kanssa (klooni 36), mikä menee päällekkäin kloonin 81 kanssa.

20 Näistä päällekkäin menevistä HCV:n cDNA:sta johdettu sekvenssitieto on hyödyllinen määritettäessä homologia- ja heterogeenisyysalueita virusgenomeissa, jotka voisivat merkitä genomin erilaisen kannan läsnäoloa ja/tai viallisten partikkeleiden populaatioiden läsnäoloa. Hybridisaatiokoettimien suunnittelulle on myös hyödyllistä havaita HCV ja HCV-antigeenit tai HCV-nukleiinihapot biologisissa näytteissä ja *: 25 HCV:n eristämisen aikana (mistä keskustellaan alla), käyttäen osassa II.G. kuvattua tekniikkaa. Vielä päällekkäin meneviä cDNA.oita voidaan käyttää luomaan ekspressiovektoreita polypeptideille, jotka ovat peräisin HCV-genomeista, jotka myös koodaavat polypeptidejä, jotka on koodattu klooneissa 5-1-1, 36, 81 ja 1-2 ja muissa osassa IV.A. kuvatuissa klooneissa. Tekniikat näiden polypeptidien, jotka sisältävät 30 HCV-epitooppeja, ja sellaisten vasta-aineiden luomiseksi, jotka ovat suunnatut niihin " sisältyviä HCV-epitooppeja vastaan ja myös niiden käytöt ovat analogisia niille, joita kuvattiin polypeptidejä varten, jotka ovat peräisin NANBV:n cDNA-sekvensseistä, jotka sisältyivät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 1-2, 81 ja 91, joista on keskusteltu yllä ja alla.

cDNA-sekvenssien perheeseen, jotka sekvenssit sisältyvät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 81,91, 1-2 ja muihin osassa IV.A. kuvattuihin klooneihin, koodattuna on antigeenejä, 35 105652 35 jotka sisältävät epitooppeja, jotka näyttävät olevan ainutkertaisia HCV:lle; s.o. vasta-aineet, jotka ovat suunnatut näitä antigeenejä vastaan ovat poissa yksilöistä, joilla on HAV- tai HBV-tartunta ja yksilöistä, joilla ei ole HCV-tartuntaa (ks. osassa IV.B. esitettyä serologista tietoa). Lisäksi näiden cDNA:ojen sekvenssitiedon vertailu HAV:n, 5 HBV:n, HDV:n ja Genebank'in genomisekvenssien kanssa osoittaa, että näiden cDNA:ojen ja noiden lähteiden polynukleotidisekvenssien välillä vallitsee minimaalinen homologia. Täten vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä antigeenejä vastaan, jotka ovat koodatut näiden kloonien cDNArssa, voidaan käyttää BB-NANBV-partikkeleiden tunnistamiseen, jotka ovat eristettyjä sairaista yksilöistä. Lisäksi ne ovat myös hyödyl-10 lisiä NANBH:n aiheuttajien eristämisessä.

HCV-partikkelit voidaan eristää seerumista, joka on peräisin yksilöistä, joilla on BB-NANBV-tartunta tai soluviljelmistä, millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, sisältäen esimerkiksi tekniikat, jotka perustuvat koon valintaan, kuten saostamis- tai 15 poissulkemismenetelmät tai tekniikat, jotka perustuvat tiheyteen, kuten ultralinkous tiheysgradienteissa tai saostus aineilla, kuten polyetyleeniglykoli tai kromatografia lukuisilla materiaaleilla, kuten anionin- tai kationinvaihtomateriaaleilla ja materiaaleilla, jotka sitoutuvat hydrofobisuuden takia ja myös affiniteteettipylväillä. Eristystä suoritettaessa voidaan HCV:n läsnäolo havaita uutetun genomin hybridisaatioanalyy-20 sillä käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin yllä kuvatuista HCV:n cDNA.oista tai immunologisella analyysillä (ks. osa II.I.) käyttäen koettimina vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cDNA-sekvenssien perheessä ja jotka ovat myös suunnattuja niitä HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja yllä keskustelluissa päällekkäin menevissä •I 25 HCV:n cDNA-sekvensseissä. Vasta-aineet voivat olla monoklonaalisia tai polyklonaa-lisia ja voi olla toivottavaa puhdistaa vasta-aineet ennen niiden käyttöä immunologisessa analyysissä. Puhdistusmenettelyä polyklonaalisia vasta-aineita varten, jotka ovat suunnattuja sellaisia antigeenejä vastaan, jotka on koodattu kloonissa 5-1-1, kuvataan osassa IV.E; analogisia puhdistusmenettelyjä voidaan käyttää sellaisia vasta- 3 o aineita varten, jotka ovat suunnattuja muita HCV-antigeenejä vastaan.

•« . . ._

Vasta-aineet, jotka ovat suunnattuja HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cDNArojen perheessä ja myös niitä vastaan, jotka ovat koodattuja päällekkäin menevissä HCV:n cDNA:oissa, jotka ovat kiinnitettyjä 35 kiinteisiin kantajiin, ovat hyödyllisiä HCV:n eristämiseksi immunoaffiniteettikroma-tografialla. Tekniikat immunoaffiniteettikromatografiaa varten ovat alalla tunnettuja ja sisältävät tekniikat vasta-aineiden kiinnittämiseksi kiinteisiin kantajiin niin, että ne säi- 36 105652 lyttävät immunoselektiivisen aktiivisuutensa; tekniikat voivat olla niitä, joissa vasta-aineet adsorboidaan kantajaan (ks. esimerkiksi Kurstak julkaisussa ENZYME IMMUNODIAGNOSIS, sivut 31-37), ja myös niitä, joissa vasta-aineet ovat kantajaan kovalenttisesti kiinnitettyjä. Yleisesti tekniikat ovat samanlaisia kuin ne, joita käytetään 5 antigeenien kovalenttiseksi kiinnittämiseksi kiinteään kantajaan ja joita kuvataan yleisesti osassa II.C.; kuitenkin kaksitoimisiin kytkentäaineisiin voidaan sisällyttää väli-iyhmiä niin, että vasta-aineen antigeenin sitoutumispaikka jää saataville.

Puhdistusmenettelyn aikana HCV:n läsnäolo voidaan havaita ja/tai todentaa 1° nukleiinihappohybridisaation avulla, käyttäen koettimina polynukleotideja, jotka ovat peräisin kuvioissa 1-32 esitettyjen HCV:n cDNA-sekvenssien perheestä ja myös päällekkäin menevistä HCV:n cDNA-sekvensseistä, joita on kuvattu yllä. Tässä tapauksessa fraktioita käsitellään olosuhteissa, jotka aiheuttaisivat viruspartikkeleidn katkeamisen, esimerkiksi pesuaineilla kelatoivien ahneiden läsnäollessa ja virusnukle-15 iinihapon läsnäolo määritetään hybridisaatiotekniikoilla, joita kuvataan osassa II.H. Lisävahvistusta sille, että eristetyt partikkelit ovat aineita, jotka indusoivat HCV:a, voidaan saada infektoimalla simpansseja eristetyillä viruspartikkeleilla, mitä seuraa sen määrittäminen, seuraako tartuttamista NANBH:n oireita vai ei.

20 Viruspartikkelit puhdistetuista valmisteista voidaan sitten karakterisoida edelleen. Genominukleiinihappo on puhdistettu. Perustuen sen herkkyyteen ribonukleaasille, muttei ribonukleaasi I:lle, havaitaan, että virus muodostuu RNA-genomista. Katso esimerkki IV.C.2. alla. Säikeettömyys ja ympyränmuotoisuus tai se, ettei se ole ympyränmuotoinen, voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen ·; 25 esimerkiksi sen tekemisen näkyväksi elektronimikroskoopin avulla, sen jakaantumisen tiheysgradientteihin ja sen saostumisominaisuudet. Siepatun HCV-genomin hybridisaatioon HCV:n cDNA:ojen negatiivisiin säikeisiin perustuen käy ilmi, että HCV voi muodostua positiivisista säikeistä koostuvasta RNA-genomista (ks. osa IV.H.l). Tekniikoita, kuten tässä esitettyjä, kuvataan esimerkiksi julkaisussa 50 METHODS IN ENZYMOLOGY. Lisäksi puhdistettu nukleiinihappo voidaan kloonata '* ja sekventoida tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen käänteistranskription, koska genomi- materiaali on RNA:ta. Katso esimerkiksi Maniatis (1982) ja Glover (1985). Käyttäen viruspartikkeleista peräisin olevaa nukleiinihappoa on mahdollista sekventoida koko genomi riippumatta siitä onko se segmentoitu vai ei.

Yhdistettyjen kloonien 14i-39c (ks. kuvio 26) jatkuvaan lukualueeseen (ORF) koodattujen polypeptidien homologian tutkiminen osoittaa, että HCV-polypeptidi 35 105652 37 sisältää homologia-alueita flaviviruksien säilyneiden alueiden vastaavien proteiinien kanssa. Esimerkki tästä on kuvattu osassa IV.H.3. Tällä löydöksellä on monta tärkeää seuraamusta. Ensiksi tämä todiste, yhdessä niiden tuloksien kanssa, jotka osoittavat, että HCV sisältää positiivisesti säikeisen genomin, jonka koko on noin 10000 nukleotidia, 5 on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus.

, Yleisesti flaviviruksien virioneissa ja niiden genomeissa on suhteellisen yhtäpitävä rakenne ja jäijestys, jotka ovat tunnettuja. Katso Rice et ai. (1986) ja Brinton, M.A.

# (1988). Täten polypeptidejä C, pre-M/M ja E koodaavat rakenteelliset geenit voidaan paikallistaa kloonista 14i ylävirtaan olevan genomin S'-päähän. Lisäksi käyttäen io vertailua muihin flaviviruksiin, voidaan tehdä ennusteita näitä proteiineja koodaavien sekvenssien tarkasta paikasta.

Niiden sekvenssien eristäminen, jotka ovat ylävirtaan päin kloonin 14i sekvensseistä, voidaan täydentää lukuisilla tavoilla, jotka tässä annetun tiedon kanssa olisivat ilmeisiä 15 alan ammattilaiselle. Esimerkiksi genomin "kävelytys"-tekniikkaa voidaan käyttää eristämään muita sekvenssejä, jotka ovat 5-asemassa kloonin 14i sekvensseihin nähden, mutta jotka menevät päällekkäin tuon kloonin kanssa; tämä vuorostaan johtaa lisäsek-venssien eristämiseen. Tätä tekniikkaa on havainnollistettu kunnolla alla osassa IV.A.. On esimerkiksi myös tunnettua, että flaviviruksissa on säilyviä epitooppeja ja säilyvien 20 nukleiinihapposekvenssien alueita. Polynukleotideja, jotka sisältävät säilyviä sekvenssejä, voidaan käyttää koettimina, jotka sitovat HCV-genomin sallien täten sen eristämisen. Lisäksi näitä säilyviä sekvenssejä, yhdessä niiden kanssa, jotka ovat peräisin kuviossa 22 esitetyistä HCV:n cDNA:oista, voidaan käyttää primereiden suunnitteluun, käytettäväksi järjestelmissä, jotka amplifioivat niitä genomisekvenssejä, jotka :* 25 sijaitsevat ylävirtaan kloonin 14i sekvensseistä, käyttäen polymeraasi-ketjureak- tioteknologiaa. Esimerkki tästä on kuvattu alla.

HCV:n rakenne voidan myös määrittää ja sen komponentit eristää. Morfologia ja koko voidaan määrittää esimerkiksi elektronimikroskoopilla. Tiettyjen 30 viruspolypeptidiantigeenien, kuten päällys- tai kuoriantigeenien tai sisäisten antigee-nien, kuten nukleiinihappoa sitovat proteiinit, ydinantigeenit ja polynukle-otidipolymeraasit, tunnistus ja sijainti voidaan määrittää esimerkiksi määrittämällä, ovatko antigeenit läsnä pääviruskomponentteina vai vähemmistökomponentteina ja myös käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja erityisiä antigeenejä vastaan, 35 jotka ovat koodattuja eristetyissä cDNA.oissa koettimina.

II.K. Sohndljelyjärjestelmät ja eläinmallijärjestelmät HCV-repIikaatiota varten 38 105652

Ehdotus, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus, antaa myös tietoa HCV:n kasvatusmenetelmistä. Termi "flavityyppinen" merkitsee, että viruksessa on merkittävä määrä homologiaa flaviviruksien tunnettujen säilyvien alueiden kanssa ja että suurin osa genomista on yksinkertaista avointa lukualuetta (ORF). Menetelmät flaviviruksien vilje-5 lemiseksi ovat tunnettuja alan ammattilaisille (katso esimerkiksi katsauksia Brinton (1986) ja Stollar, V. (1980)). Yleisesti sopivat solut tai solulinjat HCV:n viljelemiseksi voivat sisältää ne, joiden tiedetään tukevan Flaviviruksien replikaatiota, esimerkiksi seuraavat: apinan munuaissolulinjat (esim. MK2, VERO); sian munuaissolulinjat (esim. PS); nuoren hamsterin munuaissolulinjat (esim. BHK); hiiren makrofaagisolulinjat (esim. P388D1, MK1, Mml); ihmisen makrofaagisolulinjat (esim. U-937); ihmisen perifeerisen veren leukosyytit; ihmisen kiinnittyvät monosyytit; hepatosyytit tai hepatosyyttisolulinjat (esim. HUH7, HEPG2); sikiöt tai sikiösolut (esim. kananpojan sikiön flbroblastit); tai solulinjat, jotka ovat peräisin selkärangattomista, mieluummin hyönteisistä (esim. drosophila-solulinjat), tai vielä mieluummin niveljalkaisista, esimer-15 kiksi moskiiton solulinjat (esim. A. Albopictus, Aedes aegypti, Cutex tritaeniorhynchus) tai punkin solulinjoista (esim. RML-14 Dermacentor parumapertus).

On mahdollista, että primäärisiä hepatosyyttejä voidaan viljellä ja sitten tartuttaa HCV:llä; tai vaihtoehtoisesti hepatosyyttiviljelmät voisivat olla peräisin sairaiden yksilo löiden (esim. ihmisten tai simpanssien) maksoista. Jälkimmäinen tapaus on esimerkki solusta, joka on infektoitu in vivo ja siirretään sitten in vitro. Lisäksi voidaan käyttää erilaisia menetelmiä solujen säilyttämiseksi hengissä hepatosyyttiviljelmistä peräisin olevien solulinjojen saamiseksi. Esimerkiksi primäärisiä maksaviljelmiä (ennen ja jälkeen hepatosyyttisolujen rikastamisen) voidaan fuusioida eri soluihin stabiilisuuden ‘1 25 ylläpitämiseksi. Esimerkiksi viljelmiä voidaan infektoida myös transformoivilla viruksilla tai transfektoida transformoivilla geeneillä pysyvien tai puolipysyvien solulinjojen luomiseksi. Lisäksi esimerkiksi maksaviljelmien soluja voidaan fuusioida pysyviin solulinjoihin (esim. HepG2). Solufuusiomenetelmät ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi fuusioaineiden, kuten polyetyleeniglykolin, Sendai-viruksen ja Epstein-30 Barr-viruksen käyttö on tunnettua.

Kuten keskusteltiin yllä, HCV on Flavivirus tai Flavityyppinen virus. Siksi on luultavaa, että solulinjojen HCV-infektio voidaan suorittaa tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja solujen infektoimiseksi Flaviviruksilla. Nämä sisältävät esimerkiksi solujen inkuboinnin 35 virusvalmisteen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat viruksen siirtymisen soluun. Lisäksi voi olla mahdollista saada virustuotantoa transfektoimalla solut eristetyillä viruspolynukleotideilla. On tunnettua, että Togaviruksien ja Flaviviruksien RNA:t ovat i 105652 39 infektoivia lukuisissa selkärankaisten solulinjoissa (Pfefferkom ja Shapiro (1974)), ja moskiiton solulinjassa (Peleg (1969)). Menetelmät kudosviljelmän solujen transfektoimiseksi RNA-duplekseilla, positiivisen kierteen RNA:oilla ja DNA:oilla (sisältäen cDNA:t) ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi tekniikat, jotka 5 käyttävät elektroporaatiota ja saostusta DEAE-dekstraanilla tai kalsiumfosfaatilla. » Runsas HCV:n RNA:n lähde voidaan saada suorittamalla in vitro transkriptio HCV:n cDNA:lle, joka vastaa koko genomia. Transfektion tällä materiaalilla tai kloonatulla . HCV:n cDNA:lla tulisi antaa tuloksena viruksen replikaatio ja viruksen in vitro lisääntyminen.

10

Viljeltyjen solujen lisäksi voidaan käyttää eläinmallijäijestelmiä viruksien replikaatioon; eläinjäijestelmät, joissa käytetään Flaviviruksia, ovat alan ammattilaisille tunnettuja (katso esimerkiksi Monath'in (1986) katsausta). Täten HCV-repIikaatio voi tapahtua, ei vain simpansseissa, mutta myös esimerkiksi silkkiapinoissa ja imevissä 15 hiirissä.

II.L. HCV:ta..vastaan suunnattujen antiviraalisten aineiden seulonta

Soluviljelmä- ja eläinmallijäijelmien saatavuus HCV:tä varten tekee myös 20 mahdolliseksi HCV:n replikaation estävien viruksenvastaisten aineiden seulonnan ja erityisesti sellaisten aineiden seulonnan, jotka etupäässä sallivat solujen kasvun ja monistumisen, mutta estävät virusten replikaation. Nämä seulontamenetelmät ovat tunnettuja alan ammattilaisille. Yleisesti virusten vastaisia aineita testataan lukuisilla pitoisuuksilla niiden tehon suhteen estää viruksen replikaatio solunviljelyjäijestelmissä, ·: 25 jotka tukevat viruksen implikaatiota ja sitten viruspatogeenin infektiivisyyden eston suhteen (ja alhaisen tason myrkyllisyyden suhteen) eläinmallijäijestelmässä.

Nämä menetelmät ja koostumukset, jotka tässä annetaan HCV-antigeenien ja HCV-polynukleotidien havaitsemiseksi, ovat hyödyllisiä virusten vastaisten aineiden 30 seulonnassa siinä, että antavat vaihtoehdon ja ehkä herkemmän välineen aineen tehon havaisemiseen virusreplikaation suhteen, kuin soluplakkianalyysi tai ID50-analyysi.

• .............

Esimerkiksi tässä kuvattuja HCV-polynukleotidikoettimia voidaan käyttää soluviljelmässä tuotetun virusnuklenhihapon määrän selvittämisessä. Tämä voitaisiin tehdä esimerkiksi infektoitujen solunukleiinihappojen hybridisaation tai kompetitiohybri-35 disaation avulla leimatun HCV-polynukleotidikoettimen kanssa. Esimerkiksi myös anti-HCV-vasta-aineita voidaan käyttää soluviljelmässä olevien HCV-antigeenien tunnistamiseen ja niiden määrän selvittämiseen käyttäen tässä kuvattuja immunologisia 40 105652 analyysejä. Lisäksi, koska voi olla toivottavaa selvittää HCV-antigeenien määrä infektoidussa soluviljelmässä kompetitioanalyysillä, tässä kuvattuihin HCV:n cDNAioihin koodatut polypeptidit ovat hyödyllisiä näissä kompetitioanalyyseissä. Yleisesti yhdistelmä-HCV-polypeptidi, joka on peräisin HCV:n cDNA.sta, voisi olla 5 leimattu ja tämän leimatun polypeptidin sitoutumisen estoa HCV-polypeptidiin soluviljelmäjäijestelmässä tuotetun antigeenin takia, tarkkailtaisiin. Lisäksi nämä tekniikat ovat erityisen hyödyllisiä tapauksissa, joissa HCV voi kyetä replikoituinaan solulinjassa aiheuttamatta solukuolemaa.

10 TT M Hf»-ikf»nnf».tfyjen HrV-kantnjen valmictaminpn

Edellisen lisäksi, käyttäen kudosviljelyjäijestelmiä ja/tai eläinmallijäijestelmiä, voi olla mahdollista eristää heikennettyjä HCV-kantoja. Nämä kannat olisivat sopivia virusantigeenien eristämistä varten. Heikennetyt kannat ovat eristettävissä käytyään 15 monia kertoja soluviljelmässä ja/tai eläinmallissa. Heikentyneen kannan havaitseminen infektoidussa solussa tai yksilössä voidaan saada aikaan alalla tunnetuilla tekniikoilla ja voisi sisältää esimerkiksi vasta-aineiden käytön yhtä tai useampaa epitooppia vastaan, joka on koodattu HCVrssa, koettimena tai sellaisen polynukleotidin käytön, joka sisältää HCV-sekvenssin, jossa on ainakin noin 8 nukleotidia, koettimena. Vaihtoeh-20 toisesti tai sen lisäksi heikentynyt kanta voidaan rakentaa käyttäen tässä annettua HCV:n genomitietoa ja käyttäen yhdistelmätekniikkaa. Yleisesti voitaisiin yrittää poistaa sellainen genomin alue, joka koodaa esimerkiksi polypeptidiä, joka liittyy patogeenisyyteen, mutta joka sallii virusreplikaation. Lisäksi genomin rakenne voisi sallia sellaisen epitoopin ekspression, joka synnyttää neutraloivia vasta-aineita HCV:lle. • 25 Muutettua genomia voitaisiin sitten käyttää transformoimaan soluja, jotka sallivat replikaation ja soluja, jotka on kasvatettu olosuhteissa, jotka sallivat virusreplikaation. Heikentyneet HCV-kannat ovat hyödyllisiä virusantigeenien kaupallisen tuotannon lähteinä, koska näiden viruksien käsittely vaatisi vähemmän ankaria suojaustoimenpiteitä työntekijöille, jotka toimivat virustuotannossa ja/tai 30 virustuotteiden tuotannossa.

« « III. Yleisiä menetelmiä

Yleiset tekniikat, joita käytetään genomin uuttamiseen viruksesta, cDNA-kirjaston •35 valmistamiseen ja testaamiseen, kloonien sekventoimiseen, ekspressiovektoreiden rakentamiseen, solujen transformoimiseen, immunologisten analyysien, kuten radioimmunologiset analyysit ja ELISA-analyysit, suorittamiseen, solujen 41 10E652 kasvattamiseen viljelmässä ja sen kaltaisiin, ovat alalla tunnettuja ja laboratoriokäsikiijoja, jotka kuvaavat näitä tekniikoita, on saatavana. Kuitenkin yleisenä ohjeena seuraava asettaa esiin muutamia lähteitä, jotka ovat nykyään saatavilla sellaisia menettelyjä varten ja materiaaleja varten, jotka ovat hyödyllisiä niiden suorittamiseksi.

5 * ΠΙ.Α. Isännät ja ekspression säätösekvenssit ' Sekä prokariootti- että eiflcariootti-isäntäsoluja voidaan käyttää haluttujen koodaussekvenssien ekspressiota varten, kun käytetään sopivia säätösekvenssejä. jotka 10 ovat yhteensopivia aiotun isännän kanssa. Prokariootti-isäntien joukosta käytetään useimmiten E. Coli'a. Ekspression säätösekvenssit prokarioottisoluja varten sisältävät promoottoreita, jotka sisältävät mahdollisesti operaattoriosia, ja ribosomin sitoutumis-paikkoja. Siirtovektorit, jotka ovat yhteensopivia prokariootti-isäntien kanssa, ovat yleensä peräisin esimerkiksi pBR322:sta, plasmidista, joka sisältää operoneja, jotka 15 anatavat ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin ja erilaisia pUC-vektoreita, jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka antavat antibioottiresistenssimarkkereita. Näitä markkereita voidaan käyttää saamaan onnistuneita transformantteja valinnan kautta. Yleisesti käytetyt prokarioottisäätösekvenssit sisältävät betalaktamaasi- (penisillinaasi) ja lak-toosipromoottorijäijestelmiä (Chang et ai. (1977)), tryptofaanipromoottorijäijestelmän 20 (trp) (Goeddel et ai. (1980)) ja lambdajohdetun PL-promoottorin ja N-geenin ribosomin sitoutumispaikan (Shimatake et ai. (1981)) ja hybridin tac-promoottorin (De Boer et ai. (1983)), joka on peräisin trp-ja lac-UV5-promoottoreiden sekvensseistä. Edelläolevat jäijestelmät ovat erityisen yhteensopivia E. Coli:n kanssa; haluttaessa voidaan käyttää muita prokariootti-isäntiä, kuten Bacillus- tai Pseudomonas-kantoja voidaan käyttää 25 vastaavien säätösekvenssien kanssa.

• ·

Eukariootti-isännät sisältävät hiiva- ja nisäkässolut viljelyjäijestelmissä. Saccharomyces cerevisiae ja .Sacr.harnmyce.s carlshergensis ovat yleisimmin käytettyjä hiivaisäntiä ja ne ovat mukavia sieni-isäntiä. Hiivaan sopivat vektorit omaavat markkereita, jotka sallivat 30 onnistuneiden transformanttien valinnan anatamalla prototrofian auksotrooppisille II! mutanteille tai resistenssin raskaille metalleille villityyppisillä kannoilla. Hiivojen kanssa yhteensopivat vektorit voivat käyttää 2 μπι:η replikaatioalkua (Broach et ai. (1983)), CEN3:n ja ARSl:n yhdistelmää tai muita välineitä replikaation varmistamiseksi, kuten sekvenssejä, jotka aikaansaavat sopivan fragmentin liittymisen 35 isäntäsolun genomiin. Säätösekvenssit hiivavektoreita varten ovat tunnettuja alalla ja sisältävät promoottoreita glykolyyttisten entsyymien synteesiä varten (Hess et ai. (1968); Holland et ai. (1978)), sisältäen promoottorin 3-fosfoglyseraattikinaasia varten 42 •S0CC12 (Hitzeman (1980)). Tenninaattoreita voidaan myös sisällyttää, kuten niitä, jotka ovat peräisin enolaasigeenistä (Holland (1981)). Erityisen hyödyllisiä säätöjärjestelmiä ovat ne, jotka käsittävät glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasipromoottorin (GAPDH) tai alkoholidehydrogenaasin (ADH) säädettävän promoottorin, terminaattoreita, jotka ovat 5 peräisin myös GAPDH:sta ja jos halutaan eritystä, johtosekvenssit hiivan alfatekijästä. Lisäksi transkriptiota säätävä alue ja transkription aloittava alue, jotka ovat toiminnallisesti liitettyjä toisiinsa, voivat olla sellaisia, että ne eivät luonnostaan liity villityyppisiin organismeihin. Näitä järjestelmiä kuvataan yksityiskohtaisesti EP-julkaisuissa 120,551, julkaistu 3.10.1984; 116,201, julkaistu 22.8.1984 ja 164,556, jul-10 kaistu 18.12.1985, jotka ovat kaikki tämän keksinnön hakijan omistuksessa ja joihin tässä viitataan.

Imettäväissolulinjat, jotka ovat saatavissa isäntinä ekspressiota varten, ovat tunnettuja alalla ja sisältävät monia elossa pidettyjä solulinjoja, jotka ovat saatavilla American 15 Type Culture Collection'ista (ATCC), sisältäen HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO), hamsterinpoikasen munuaissolut (BHK) ja lukuisia muita solulinjoja. Alalla tunnetaan myös sopivia promoottoreita imettäväissoluja varten ja ne sisältävät viruspromoottoreita, kuten ne jotka ovat peräisin Ihmisapinaviruksesta 40 (SV40) (Fiers (1978)), Rous'n sarkoomaviruksesta (RSV), adenoviruksesta (ADV) ja 20 härän papilloomaviruksesta (BPV). Imettäväissolut voivat myös vaatia terminaattorisekvenssejä ja poly-A-additiosekvenssejä; vahvistussekvenssejä, jotka lisäävät ekspressiota voidaan myös sisällyttää ja sekvenssit, jotka aiheuttavat geenin amplifikaation, voivat olla myös haluttavia. Nämä sekvenssit ovat alalla tunnettuja. Imettäväissoluissa tapahtuvaa replikaatiota varten sopivat vektorit voivat sisältää ·; 25 virusreplikoneja tai sekvenssejä, jotka varmistavat sopivien NANBV-epitooppeja koodaavien sekvenssien integraation isäntägenomiin.

III.B. Transformaatiot 30 Transformaatio voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä " polynukleotidien viemiseksi isäntäsoluun, sisältäen esimerkiksi polynukleotidin pakkaamisen virukseen ja isäntäsolun muuntamisen viruksella tai polynukleotidin suoralla otolla. Käytetty transformaatiomenettely riippuu trasformoitavasta isännästä. Esimerkiksi E. Coli-isäntäsolujen transformaatiosta BB-NANBV-sekvenssejä sisäl-35 tävällä lambda-gt 11-vektorilla keskustellaan esimerkkiosassa alla. Baktee- ritransformaatio suoralla otolla yleensä käyttää käsittelyä kalsium- tai rubidiumkloridil-la (Cohen (1972); Maniatis (1982)). Hiivatransformaatio suoralla otolla voidaan suorit- 43 105652 taa käyttäen Hinnen et ai. (1978) menetelmää. Imettäväistransformaatio suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen kalsiumfosfaattisaostusta, jonka ovat esittäneet Graham ja Van der Eb (1978) tai sen erilaisia tunnettuja muunnoksia.

5 III.C. Vektorin rakentaminen

Vektorin rakentaminen käyttää tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Paikkaspesifinen . DNA-lohkaisu suoritetaan käsittelemällä sopivilla restriktioentsyymeillä olosuhteissa, jotka on yleensä määritellyt näiden kaupallisesti saatavien entsyymien valmistaja. 10 Yleensä noin 1 pg plasmidia tai DNA-sekvenssiä lohkaistaan 1 yksiköllä entsyymiä noin 20 μ!:η puskuriliuoksessa inkuboimalla 1 - 2 tuntia 37°C lämpötilassa. Restrik-tioentsyymillä inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan fenoli/kloroformiuutoksella ja DNA palautetaan saostamalla etanolilla. Lohjenneet fragmentit voidaan erottaa käyttäen polyakryyliamidi- tai agaroosigeelielektroforeesitekniikoita niiden yleisten menet-15 telytapojen mukaan, jotka löydetään julkaisusta Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Tarttuvapäisiä lohkaisufragmentteja voidaan typistää päästään käyttäen E.Coli'n DNA-polymeraasi I:tä /Klenow) sopivien deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) ollessa läsnä 20 seoksessa. Käsittelyä Sl-nukleaasilla voidaan myös käyttää, mistä tulee tulokseksi minkä tahansa yksisäikeisen DNA-osan hydrolyysi.

Liittämiset suoritetaan käyttäen standardeja puskuri- ja lämpötilaolosuhteita käyttäen T4-DNA-ligaasia ja ATP:tä; tarttuvapäiset liittämiset vaativat vähemmän ATP:tä ja ‘Γ 25 vähemmän ligaasia kuin tylppäpäiset liitokset. Kun vektorifragmentteja käytetään osana liitosseosta, vektorifragmenttia käsitellään usein bakteerisella alkaalifosfataasilla (BAP) tai vasikan suolen alkaalifosfataasilla 5’-fosfaatin poistamiseksi ja täten vektorin uudelleen liittymisen estämiseksi; vaihtoehtoisesti haluamattomien fragmenttien restrik-tioentsyymikatkominen voidaan suorittaa liittymisen estämiseksi.

30

Liittymisseokset transformoidaan sopiviin kloonausisäntiin, kuten E.Coli'in ja onnistuneet transformantit valitaan esimerkiksi antibioottiresistenssin perusteella ja ne seulotaan oikean rakenteen löytämiseksi.

35 ------- 44 mm m.D. Haluttujen DN A -sekvenssien rakenne

Synteettisiä oligonukleotideja voidaan valmistaa käyttäen automatisoituja oligonukleotidisyntetisoijia, kuten Warner (1984) kuvaa. Haluttaessa synteettiset säikeet 5 voidaan leimata fosfori-32:Ila käsittelemällä polynukleotidikinaasilla 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardeja reaktio-olosuhteita.

DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cDNA-kiijastoista, voidaan muokata tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoinnin, 10 jota on kuvannut Zoller (1982). Lyhyesti muokattava DNA pakataan faagiin yk-sisäikeisenä sekvenssinä ja se muutetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi DNA-polymeraasilla käyttäen primerinä synteettistä oligonukleotidia, joka on komplementaarinen DNA:n muokattavalle osalle ja jossa on haluttu modifikaatio sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tuloksena oleva kaksisäikeinen DNA transformoi-15 daan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeria. Transformoidun bakteerin viljelmät, jotka sisältävät faagin kunkin säikeen replikaatioita, pinnoitetaan agarilla plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutaattisekvenssi ja jäljellä olevassa 50 %:ssa on alkuperäinen sekvenssi. Plakkien replikaatit hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koettimiin lämpötiloissa ja olosuhteissa, jotka sallivat 20 hybridisaation oikean säikeen kanssa, mutta ei modifioimattoman sekvenssin kanssa. Sekvenssit, jotka on tunnistettu hybridisaation avulla, palautetaan ja kloonataan.

III.E. Hybridisaatio koettimen kanssa 25 DNA-kiijastoja voidaan seuloa koettimilla käyttäen Grunsteinin ja Hognessin (1975) menetelmää. Lyhyesti tässä menettelyssä tutkittava DNA immobilisoidaan nitrosellu-loosafilttereille, denaturoidaan ja esihybridisoidaan puskurin kanssa, joka sisältää 0 - 50 % formamidia, 0,75 M NaCl:a, 75 mM Na-sitraattia, 0,02 % (w/v) häränseerumialbu-miinia, polyvinyylipyrrolidonia ja Fricoll'ia kutakin, 50 mM Na-fosfaattia (pH 6,5), 0,1 30 % SDS:a ja 100 pg/ml kantajadenaturoitua DNA:ta. Formamidin prosenttimäärä puskurissa ja myös esihybridisaatio- ja sen jälkeisen hybridisaatiovaiheiden aika- ja lämpötilaolosuhteet riippuvat vaadittavasta ankaruudesta. Oligomeerikoettimia, jotka vaativat alhaisemman ankarat olosuhteet, käytetään yleisesti alhaisten formamidimää-rien, alhaisempien lämpötilojen ja pitempien hybridisaatioaikojen kanssa. Koettimet, 35 jotka sisältävät enemmän kuin 30 tai 40 nukleotidia, kuten ne, jotka ovat peräisin cDNA:sta tai genomisekvensseistä käyttävät yleensä korkeampia lämpötiloja, esim. noin 40-42°C ja korkeaa formamidipitoisuutta, esim. 50 %. Seuraten esihybridisaatiota i 105652 45 5'-32P-leimattu oligonukleotidikoetin lisätään puskuriin ja filttereitä inkuboidaan tässä seoksessa hybridisaatio-olosuhteissa. Pesun jälkeen käsitellyt filtterit auto-radiografoidaan hybridisoidun koettimen paikan osoittamiseksi; DNA:ta vastaavissa paikoissa alkuperäisillä agarlevyillä käytetään halutun DNA:n lähteenä.

5 , III.F. Ralfftntftftn ja splrvf>ntnimigpn tntppnnävttäminpn . Rutiineja vektorirakenteita varten liitosseokset transformoidaan E.Coli-kantaan HB 101 tai muuhun sopivaan isäntään ja onnistuneet transformantit valitaan antibioottiresistens-io sin tai muiden markkereiden avulla. Sitten valmistetaan plasmideja transformanteista Clewell et ai. (1969) esittämän menetelmän mukaisesti, tavallisesti seuraten klooriam-fenikoliamplifikaatiota (Clewell (1972)). DNA eristetään ja analysoidaan tavallisesti restriktioentsyymianalyysin ja/tai sekventoimisen avulla. Sekventoiminen voidaan tehdä dideoksimenetelmällä, jonka on esittänyt Sanger et ai. (1977) ja jota on edelleen 15 kuvannut Messing et ai. (1981) tai menetelmällä, jonka on kuvannut Maxam et ai. (1980). Ongelmat, jotka liittyivät nauhojen kokoonpuristumiseen, mitä huomataan joskus GC-rikkailla alueilla, voitettiin käyttämällä T-deatsoguanosiinia Barr et ai. (1986) mukaisesti.

20 III.G. F.ntsyyminliittävä immiinosorbentti analyysi

Entsyyminliittävää immunosorbenttia analyysiä (ELISA) voidaan käyttää mittaamaan joko antigeeni- tai vasta-ainepitoisuuksia. Tämä menetelmä riippuu entsyymin liittymisestä joko antigeeniin tai vasta-aineeseen ja se käyttää sidotun entsyymin :* 25 aktiivisuutta kvantitatiivisena leimana. Vasta-aineen mittaamiseksi tunnettu antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin (esim. mikrolevyyn tai muovikuppiin), sitä inkuboidaan tutkittavan seerumin laimennoksilla, pestään, inkuboidaan entsyymillä leimatun anti-im-munoglobuliinin kanssa ja pestään taas. Leimaukseen sopivat entsyymit ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi pipaijuuriperoksidaasin. Kiinteään faasin sidottu 30 entsyymiaktiivisuus mitataan lisäämällä spesifistä substraattia ja määrittämällä tuotteen ” muodostuminen tai substraatin käyttö kolorimetrisesti. Sidottu entsyymiaktiivisuus on suora sidotun vasta-aineen määrän funktio.

Antigeenin mittaamiseksi kiinnitetään tunnettu spesifinen vasta-aine kiinteään faasiin, 35 lisätään tutkittava materiaali, joka sisältää antigeenin, inkuboinnin jälkeen kiinteä faasi pestään ja lisätään toinen entsyymileimattu vasta-aine. Pesun jälkeen lisätään substraatti 46 105652 ja entsyymiaktiivisuus arvioidaan kolorimetrisesti ja se suhteutetaan antigeenipitoisuu-teen.

IV. Esimerkit 5

Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu vain kuvaamistarkoituksessa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön piiriä. Tämän selvityksen valossa lukuisat suoritusmuodot vaatimusten suojapiirissä ovat ilmeisiä alan keskitason ammattimiehille. Esitettyjä menettelytapoja, esimerkiksi osassa IV.A. olevia, voidaan l o haluttaessa toistaa, muttei siihen ole tarvetta, koska saatavailla on tekniikoita haluttujen nukleotidisekvenssien rakentamiseksi perustuen keksinnön antamaan tietoon. Ekspres-sio on valaistu esimerkein E.Coli'ssa; kuitenkin muitakin jäijestelmiä on saatavilla, kuten on täydellisemmin kuvattu osassa ΙΠ.Α. Voidaan tuottaa myös Iisäepitooppeja, jotka ovat peräisin genomirakenteesta ja niitä voidaan käyttää vasta-aineiden 15 synnyttämiseen, kuten on esitetty alla.

IV.A. ΗΓ.ν-η rHNA-n valmistin! prictyg ja cpln/pntniminpn IV.A. 1. ΗΓν·η r.DNA-n valmistin; 20 NANB-aiheuttajan lähde oli plasmavarasto, joka oli peräisin simpanssista, jolla oli krooninen NANBH. Simpanssi oli kokeellisesti tartutettu toisen simpanssin verellä.

jolla simpanssilla oli krooninen NANBH, joka oli tulos HCV-infektiosta ihmisen varastoidun seerumin tekijä-8-rikasteen kontaminoituneesta erästä. Simpanssin plasman . 25 varasto tehtiin yhdistämällä monia yksittäisiä plasmaeriä, jotka sisälsivät korkeita • · alaniiniaminotransferaasiaktiivisuuden tasoja; tämä aktiivisuus on tulos HCV-infektion aiheuttamasta maksavauriosta. Koska 1 ml laimennosta KV6 tästä varastoidusta seerumista annettuna suonensisäisesti aiheutti NANBH:n toisessa simpanssissa, sen CID oli ainakin 106/ml, s.o. sen infektiotiitteri oli korkea.

30

Luotiin cDNA-kiijasto korkean tiitterin plasmavarastosta seuraavasti. Ensiksi eristettiin • · viruspartikkelit plasmasta; 90 ml:n erä laimennettiin 310 ml:lla liuosta, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl. Haluamaton aines poistettiin linkoamalla 20 minuuttia nopeudella 15000 x g 20°C lämpötilassa. Tuloksena olevassa 35 nesteessä olevat viruspartikkelit pelletoitiin linkoamalla Beckman SW28-roottorissa 28000 kierr/min 5 tuntia 20°C:ssa. Virusgenomin vapauttamiseksi partikklelit rikottiin :·· suspendoimalla pelletit 15 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1 % natriumdodekyylisulfaattia i 47 105652 (SDS), 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, ja myös 2 mg/ml proteinaasi k:ta, mitä seurasi 90 minuutin inkubaatio 45°C:ssa. Nukleiinihapot eristettiin lisäämällä 0,8 pg MS2-bakteriofaagi-RNA:ta kantajana ja uuttamalla seosta neljä kertaa l:l-seoksella fenolia ja kloroformia (fenoli oli kyllästetty 0,5 M Tris-HCl:llä, pH 7,5, 0,1 % (v/v) 5 betamerkaptoetanoli, 0,1 % (w/v) hydroksikinoloni, mitä seurasi uuttaminen kaksi « kertaa kloroformilla. Vesifaasi konsentroitiin 1-butanolin kanssa ennen saostamista 2,5 keltaisella tilavuudella absoluuttista etanolia yli yön >20°C:ssa. Nukleiinihappo , palautettiin linkoamalla Beckman SW41-roottorissa 40000 kierr/min 90 minuutin ajan 4eC:ssa ja se liuotettiin veteen, jota oli käsitelty 0,05 % (v/v) dietyylipyrokarbonaatilla 10 ja autoklaavikäsiteltiin.

Ylläolevalla menettelyllä saatu nukleiinihappo (<2 pg) denaturoitiin 17,5 mM CH3HgOH:lla; cDNA syntetisoitiin käyttäen tätä denaturoitua nukleiinihappoa mallineena ja se kloonattiin EcoRI-kohtaan faagissa lambda-gtl 1 käyttäen menetelmiä, 15 jotka on kuvannut Huynh (1985), paitsi että satunnaisprimerit korvasivat oligo(dT)-12- 18:n ensimmäisen cDNA-kierteen synteesin aikana käänteistranskriptaasilla (Taylor et ai. (1976)). Tuloksena olevat kaksoiskierteelliset cDNArt fraktioitiin koon mukaan Sepharose CL-4B-kolonnissa; keskikooltaan noin 400, 300, 200 ja 100 emäsparia oleva eluoitu materiaali varastoitiin cDNA-varastoihin 1, 2, 3 ja vastaavasti 4. Lambda-gtl 1-20 cDNA-kiijasto luotiin varaston 3 cDNAista.

Varastosta 3 luotu lambda-gtl 1-cDNA-kiijasto seulottiin sellaisten epitooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaasta, jolla oli aikaisemmin ollut NANBH. Noin 106 faagia seulottiin potilasseerumilla käyttäen Huynh 25 et ai. (1985) menetelmiä, lukuunottamatta sitä, että sidottu ihmisen vasta-aine osoitettiin lampaan anti-ihmis-Ig-antiseerumilla, joka oli radioleimattu l25I:lla. Viisi positiivista faagia tunnistettiin ja puhdistettiin. Nämä viisi positiivista faagia tutkittiin sitten spesifisyyden suhteen sitoutua kahdeksan eri ihmisen, joilla oli aikaisemmin ollut NANBH, seerumiin käyttäen samaa menetelmää. Neljä faageista koodasi polypeptidiä, joka reagoi 30 immunologisesti vain yhden ihmisseerumin kanssa, s.o. sen yhden kanssa, jota käytettiin faagikiijaston alkuseulontaan. Viides faagi (5-1-1) koodasi polypeptidiä, joka reagoi immunologisesti viiden kanssa kahdeksasta tutkitusta seerumista. Lisäksi tämä polypeptidi ei reagoinut immunologisesti seitsemän normaalin verenluovuttajan seerumien kanssa. Siksi näyttää siltä, että klooni 5-1-1 koodaa polypeptidiä, jonka spesifisesti 35 tunnistaa immunologisesti NANB-potilaiden seerumi.

, · · 105652 48 IV.A.2. HCV ·η r.ON A -sekvenssit yhHictelm3faagi<;<;a S-1-1 ja pnlyppptidkelfvpnccit jotka on koodattu em sekvenssiin

Yhdistelmäfaagissa 5-1-1 oleva cDNA sekventoitiin Sanger'in et ai. (1977) 5 menetelmällä. Olennaista oli, että cDNA poistettiin EcoRLHa ja eristettiin koon mukaan fraktioimalla käyttäen geelielektroforeesia. EcoRI-restriktiofragmentit alikloonattiin M13-vektoreihin mpl8 ja mpl9 (Messing (1983)) ja ne sekventoitiin käyttäen dideoksiketjun Sanger'in et ai. (1977) tenninaatiomenetelmää. Saatu sekvenssi on esitetty kuviossa 1.

10

Kuviossa 1 koodattu polypeptidi, joka on koodattu HCV:n cDNA:ssa, on sama translaatioalue kuin N-pään betagalaktosidaasipuolisko, johon se on fuusioitu. Kuten esitetään osassa IV.A. 5-1-1 :n translaation avoin lukualue (ORF) koodaa epitooppeja, jotka sellaisten potilaiden ja simpanssien seerumi, joilla on NANBH-infektio, spesifisesti tunnistaa.

IV.A.3. HCVm_cDNA:n ja klnnnin 5-1-1 r.nNAn päällpkkiiigtpn ngjpn pristaminpn HCV:n cDNA:n ja kloonin 5-1-1 cDNA:n päällekkäisyys saatiin seulomalla samaa 20 lambda-gtll-kirjastoa, joka luotiin osassa IV.A.1. kuvatusti, synteettisellä polynukleotidilla, joka oli peräisin HCV:n cDNA:n sekvenssistä klooneissa 5-1-1, kuten esitetään kuviossa 1. Seulomiseen käytetyn polynukleotidin sekvenssi oli: 5-TCC CTT GCT CGATGT ACG GTA AGTGCT GAG AGC ACTCTTCCA ; 25 TCT CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-3'.

Lambda-gtl 1-kirjasto seulottiin tällä koettimella käyttäen menetelmää, jonka on kuvannut Huynh (1985). Arviolta yksi 50000 kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Kolme kloonia, jotka sisälsivät cDNA:oita, jotka hybridisoituivat synteettisen koettimen 30 kanssa, on numeroitu 81,1-2 ja 91.

• · < · · IV.A.4. HC-Ym—cDNA:n—ja—kloonin—5--U1_eDNA-η päällekkäisten osien nnkleotidisekvenssit 75 Klooneissa 81, 1-2 ja 91 olevien kolmen cDNA:n nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti osan IV.A.2. tavalla. Näiden kloonien sekvenssit suhteessa HCV:n cDNA-sekvenssiin faagissa 5-1-1 on esitetty kuviossa 2, joka esittää säikeen, joka koodaa i 49 10E652 havaittua HCV-epitooppia ja missä nukleotidisekvensseissä olevat homologiat on merkitty sekvenssien välisillä pystyviivoilla.

Kloonatun HCV:n cDNAriden sekvenssit ovat erittäin homologisia päällekkäin 5 menevillä elueilla (ks. kuvio 2). Kuitenkin eroja on kahdella alueella. Nukleotidi 67 . kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät sytidiinijäännöksen tässä asemassa. On huomattava, kuitenkin, että sama aminohappo on koodattu, kun joko , C tai T on tässä asemassa.

10 Toinen ero on, että klooni 5-1-1 sisältää 28 emäsparia, joita ei ole kolmessa muussa kloonissa. Nämä emäsparit esiintyvät 5-1-1 :n cDNA-sekvenssin alussa ja niitä merkitään pienillä kiijaimiHa. Perustuen radioimmunologisen analyysin tietoihin on mahdollista, että HCV-epitooppi voi olla koodattuna tähän 28 emäsparin alueeseen.

15 5-1-1 :n 28 emäsparin puuttuminen klooneista 81, 2-1 ja 91 voi tarkoittaa, että näiden kloonien cDNA on peräisin viallisista HCV-genomeista; vaihtoehtoisesti 28 emäsparin alue voisi olla päätetekotuote kloonissa 5-1-1.

Pienten kirjaimien sekvenssit kloonien 81 ja 91 nukleotidisekvensseissä merkitsevät 20 yksinkertaisesti sitä, että näitä sekvenssejä ei ole löydetty muista cDNA:ista, koska cDNA:ita, jotka menevät päällekkäin näiden alueiden kanssa, ei ollut vielä eristetty.

HCVtn cDNA-sekvenssiyhdistelmä, joka oli peräisin kloonien 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 päällekkäin menevistä cDNA:ista, on esitetty kuviossa 3. Kuitenkin tässä kuviossa on . 25 jätetty esittämättä kloonin 5-1-1 ainutkertaiset 28 emäsparia. Kuvio esittää myös sen polypeptidin sekvenssin, joka on koodattu HCV:n cDNA-yhdistelmän ORF:ään.

IV.A.5. HC.V'n Γ.ΠΝΑ-iden..ja kloonin 81—cDNA;n päällekkäin menevien soien eristäminen 30 m · HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan päin kloonin 81 cDNArsta ja menevät

päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin seuraavasti. Lambda-gtll-kiijasto, joka oli valmistettu, kuten kuvattiin osassa IV.A. 1., seulottiin hydridisoimalla synteettisellä polynukleotidikoettimella, joka oli homologinen kloonin 81 5-pään kanssa. Kloonin 81 35 sekvenssi on esitetty kuviossa 4. Seulomiseen käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: JL

105652 50 5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3'.

Menetelmät olivat olennaisesti samat kuin ne, jotka Huynh (1985) oli kuvannut, paitsi että kiijastofiltterit pestiin kahdesti ankarissa olosuhteissa, s.o. pesut suoritettiin 5 x 5 SSC, 0,1 % SDS 55°C kukin 30 minuuttia. Arviolta 1 50000:sta kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Positiivinen yhdistelmäfaagi, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui sekvenssin kanssa, eristettiin ja puhdistettiin. Tämä faagi on numeroitu klooniksi 36.

Alavirtaan päin olevat cDNA-sekvenssit, jotka menevät päällekkäin kloonin 81 cDNA:n karboksyylipäisien sekvenssien kanssa, eristettiin käyttäen menettelytapaa, joka oli 10 samanlainen kuin se, joka käytettiin ylävirtaan olevien cDNA-sekvenssien eristämiseen, paitsi että valmistettiin synteettinen oligonukleotidikoetin, joka oli homologinen kloonin 81 3'-pään sekvenssin kanssa. Seulomiseen käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 15 5' TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'.

Positiivinen yhdistelmäfaagi, joka sisälsi cDNArta, joka hybridisoitui jälkimmäisen sekvenssin kanssa, eristettiin ja puhdistettiin ja se on numeroitu klooniksi 32.

20 IV.A.6. HCV-n γ.ΠΝΑ'π niilflftntiHisftlfvgnssi klnnnigga cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 36 määritettiin olennaisesti samoin kuin on kuvattu osassa IV.A.2. Tämän cDNA:n kaksisäikeinen sekvenssi, sen kloonin 81 HCV:n cDNA:n kanssa päällekkäinen alue ja ORF:n koodaama polypeptidi on esitetty 25 kuviossa 5.

Kloonin 36 ORF on samassa translaatioalueessa kuin klooniin 81 koodattu HCV-antigeeni. Täten, yhdistelmänä, kloonien 36 ja 81 ORF:t koodaavat polypeptidiä, joka 7 edustaa osaa suuresta HCV-antigeenistä. Tämän oletetun HCV-polypeptidin sekvenssi 20 ja sitä koodaava kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka on peräisin kloonien 36 ja 81 : HC V:n cDNA:iden yhdistetyistä ORF :istä, on esitetty kuviossa 6.

IV.A.7. HCV-n rTVMA-n niiklpntidi^lfVfln^cit Hormiaa 3? 55 cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 32 määritettiin olennaisesti kuten kuvattiin osassa IV.A.2. kloonin 5-1-1 sekvenssiä varten. Sekvenssitieto merkitsi, että kloonin 32 *··. yhdistelmäfaagin cDNA oli peräisin kahdesta eri lähteestä. cDNA:n yksi fragmentti i 51. ' 105652 muodostui 418 nukleotidista, jotka olivat peräisin HCV-genomista; toinen fragmentti muodostui 172 nukleotidista, jotka olivat peräisin bakteriofaagin MS2 genomista, jota oli käytetty kantajana plasman lambda-gtl 1-cDNA-kiijaston valmistuksessa.

5 Kloonin 32 cDNArn sekvenssi vastasi kuviossa 7 esitetyn HCV-genomin sekvenssiä. Se * sekvenssialue, joka menee päällekkäin kloonin 81 kanssa ja ORF:n koodaama polypeptidi on myös esitety kuviossa. Tämä sekvenssi sisältää yhden jatkuvan ORF:n, , joka on samalla translaatioalueella kuin kloonin 81 koodaama HCV-antigeeni.

10 IV.A.8. HCV.n—r.DNA-n ja Unnnin_36 r.TTNJA-n paailpkksin—menevän—alueen eristäminen HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka olivat ylävirtaan kloonin 36 cDNA-sekvenssistä ja menivät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten kuvattiin osassa IV.A.5.

15 kloonin 81 cDNA:n sekvenssin kanssa päällekkäin menevän sekvenssin yhteydessä, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 36 5'-alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'.

20

Arviolta 1 50000:sta kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klooni, joka sisälsi cDNArta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin, nimettiin klooniksi 35.

25 IV.A.9. HflVrn γ.ΠΝΑτι nnkipiotirlkplfvpncsi kloonina 3^ cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 35 määritettiin olennaisesti samoin kuin kuvattiin osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen päällekkäin menevä alue kloonin 36 cDNA.n sekvenssin kanssa ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 8.

30 ** Klooni 35 sisältää ilmeisesti yksinkertaisen jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä samassa translaatioalueessa kuin se, jota koodaavat kloonit 36, 81 ja 32. Kuvio 9 esittää pitkän jatkuvan ORF:n sekvenssin, joka ulottuu kloonien 35, 36, 81 32 läpi siihen koodattua oletettua HCV-polypeptidiä pitkin. Tämä yhdistetty sekvenssi on vahvistettu 35 käyttäen muita riippumattomia cDNA-klooneja, jotka ovat peräisin samasta lambda-gtl 1-kiijastosta.

• 52 105652 IV.A. 10. HflV:n r.DNAin ja kloonin lAcnNA-n^aallokkaisfen osion oristaminpn HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan kloonin 35 cDNA:sta ja menevät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten on kuvattu osassa IV.A.8. niitä 5 sekvenssejä varten, jotka menevät päällekkäin kloonin 36 cDNA:n kanssa, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 35 5-alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3'.

10

Arviolta 1 klooni 50000:sta hybridisoitui koettimen kanssa. Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klooni, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin, nimettiin klooniksi 37b.

IV.A. 11. Hr.V:n nukleotidi sekvenssi kloonissa 15 cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 37b määritettiin olennaisesti kuten osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen päällekkäin menevä alue kloonin 35 cDNA:n kanssa ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 10.

20 Kloonin 35 5'-pään nukleotidi on T, kun taas vastaava nukleotidi kloonissa 37b on A. cDNA:t kolmesta muusta riippumattomasta kloonista, jotka eristettiin kloonin 37b eristämismenettelyn aikana, jota kuvattiin osassa IV.A. 10., on myös sekventoitu. Näistä klooneista olevat cDNA:t sisältävät myös A:n tässä asemassa. Täten 5-pään T kloonissa '35 voi olla kloonausmenettelystä syntynyt tekotuote. On tunnettua, että tekotuotteita 25 syntyy usein cDNA-molekyylien 5'-päissä.

Klooni 37b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä, joka on jatko sille polypeptidille, joka on koodattu siihen ORF.ään, joka ulottuu päällekäin menevien kloonien 35, 36, 81 ja 32 läpi.

30 /· IV.A.12. HCV:n cDNArn ja kloonin 3?-χ·.ΠΝΑ:η päällekkäisten osien eristäminen

Kloonista 32 alavirtaan päin olevan HCV:n cDNA:n eristäminen suoritettiin seuraavasti. Ensiksi klooni cla eristettiin käyttäen synteettistä hybridisaatiokoetinta, joka perustui 35 kloonin 32 HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssiin. Menetelmä oli olennaisesti sama kuin kuvattiin osassa IV.A.5., paitsi että synteettisen koettimen sekvenssi oli: • · .53 105652 5’ AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'.

Käyttäen kloonista cla saatua jiukleotidisekvenssiä, syntetisoitiin toinen synteettinen nukleotidi, jonka sekvenssi oti: 5 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3'.

, Lambda-gtll-kiijaston seulominen käyttäen kloonista cla peräisin olevaa sekvenssiä koettimena antoi arviolta 1 positiivisen osuman 50000:sta.*Eristetty, puhdistettu klooni, 10 joka hybridisoitui tämän koettimen kanssa, nimettiin klooniksi 33b.

IV.A.13. HCV:n cGNAm nukleotidisekvenssi kloonissa33b cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 33b määritettiin olennaisesti kuten on kuvattu 15 osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen kloonin 32 cDNA:n kanssa päällekkäin menevä alue ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 11.

Klooni 33b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka on pidentymä päällekkäin menevien kloonien 37b, 35, 36, 81 ja 32 ORF:lle. Klooniin 33b koodattu polypeptidi on 20 samassa translaatioalueessa kuin se, mikä on koodattu näiden päällekkäin menevien kloonien pidennettyyn ORF:ään.

IV.A.14. HCV-niT)NA-jHgnTjntlfa mpnpvät päallplflrain Hormin 37h rtlNA-n Wangga ja kloonin 33b r.DNA'n kanssa^ eristäminen 25 • · —------- HCV:n cDNA:iden, jotka menevät päällekkäin kloonien 37b ja 33b cDNA:iden kanssa, eristämiseksi käytettiin seuraavia synteettisiä oligonukleotidikoettimia, jotka ovat peräisin kloonien cDNA:ista, seulomaan lambda-gtll-kiijastoa käyttäen olennaisesti samaa menetelmää kuin kuvattiin osassa IV.A.3. Käytetyt koettimet olivat: 30 ’ 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3' • · ja 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3' 35 havaitsemaan sellaisia HCV:n cDNA-sekvenssejä sisältäviä pesäkkeitä, jotka sekvenssit menevät päällekkäin kloonin 37b ja vastaavat! 33b sekvenssien kanssa. Arviolta 1 :* . pesäke 50000:sta havaittiin kullakin koettimella. Klooni, joka sisälsi cDNA:ta, joka oli 54 105652 ylävirtaan päin kloonin 37b cDNA:sta ja meni päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 40b. Klooni, joka sisälsi cDNA:ta alavirtaan kloonin 33b cDNAista ja meni päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 25c.

5 TV-A-15- ΗΓΥ n γ.ΠΝΑ-π niiklpjitiHi«^.lfVP.n<LsitJflnnni<Lsa 40h ja Hormissa 7^r

Kloonissa 40b ja kloonissa 25c olevat cDNA:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti kuten kuvattiin osassa IV.A.2. 40b:n ja 25c:n sekvenssit, niiden päällekkäin menevät alueet kloonien 37b ja 33b cDNA:iden kanssa ja niihin koodatut oletetut 1° polypeptidit on esitetty kuviossa 12 (klooni 40b) ja kuviossa 13 (klooni 25c).

Kloonin 40b 5-pään nukleotidi on G. Kuitenkin myös viiden muun riippumattoman kloonin, jotka eristettiin menettelyn aikana, jossa klooni 40b eristettiin, kuten on kuvattu osassa IV.A.14, cDNA:t on myös sekventoitu. Näiden kloonien cDNA:t 15 sisältävät myös T:n tässä asemassa. Täten G voi edustaa kloonaustekotuotetta (ks. keskustelua osassa IV.A. 11).

Kloonin 25c 5'-pää on ACT, mutta tämän alueen sekvenssi kloonissa cla (sekvenssiä ei ole esitetty) ja kloonissa 33b on TCA. Tämä ero voi myös edustaa kloonaustekotuotetta, kuten voivat 28 ylimääräistä 5'-pään nukleotidia kloonissa 5-1-1.

20

Kumpikin klooneista 40b ja 25c ilmeisesti sisältää ORF:n, joka on aikaisemmin sekventoitujen kloonien jatkuvan ORF:n pidentymä. Kloonien 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b ja 25c kautta ulottuvan ORF:n nukleotidisekvenssi ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 14. Kuviossa on todennäköiset tekotuotteet poistettu 25 sekvenssistä ja sen sijaan monien päällekkäin menevien kloonien vastaavat sekvenssit alueilla, jotka eivät ole 5'-päässä, on esitetty.

IV.A.16. YhdistelmärHCV:n.cDNA:n valmistaminen-kloonien 36, 81 ja 32-f.DNA ista 30 Yhdistelmä-HCV:n cDNA, Cl00, rakennettiin seuraavasti. Ensiksi kloonien 36, 81 ja • · 32 cDNA:t pilkottiin EcoRI:lla. Kustakin kloonista tuleva cDNA:n EcoRI-fragmentti kloonattiin yksilöllisesti vektorin pGEM3-sininen (Promega Biotec) EcoRI-kohtaan.Tuloksena olevat yhdistelmävektorit, jotka sisälsivät kloonien 36, 81 ja 32 cDNA:t, nimettiin pGEM3-sininen/36:ksi, pGEM3-sininen/81:ksi ja vastaavasti 35 pGEM3-sininen/32:ksi. Sopivasti orientoitunut yhdistelmä pGEM3-sininen/81 pilkottiin Nael:llä ja Narl:llä ja suuri (-2850 emäsparia) fragmentti puhdistettiin ja liitettiin ·: pieneen (-570 emäsparia) Nael/Narl-puhdistettuun pGEM3-sininen/36- 105652 55 restriktiofragmenttiin. Tätä kloonien 36 ja 81 cDNA:iden yhdistelmää käytettiin toisen pGEM3-sininen-vektorin luomiseen, joka sisälsi jatkuvan HCV:n ORF:n näiden kloonien kanssa päällekkäin menevässä cDNA:ssa. Tämä uusi plasmidi pilkottiin sitten PvuII:lIa ja EcoRI:lla noin 680 emäsparin fiagmentin vapauttamiseksi, mikä sitten 5 kiinnitettiin pieneen (580 emäsparia) PvuII/EcoRI-fragmenttiin, joka oli eristetty • sopivasti orientoituneesta pGEM3-sininen/32-plasmidista ja kloonien 36, 81 ja 32 yhdistelmä-cDNA kiinnitettiin EcoRIrlla linearisoituun vektoriin pSODcfl, jota kuva-, taan osassa IV.B.1, ja jota käytettiin kloonin 5-1-1 ekspressoimiseen bakteereissa.

Valittiin yhdistelmät, jotka sisälsivät yhdistelmä-HCV:n cDNA:n ~1270 emäsparin 10 EcoRI-fiagmentin ja plasmidien cDNA pilkottiin EcoRI.lla ja puhdistettiin.

IV.A.17. Kloonien-141,.1.1 h, 7f, 7e,..8h, 33c, 14c,.8f, 33f, 33g ja 39c eristäminen^3 niiden Hf!Vn r.DNAiiden nnkleotidisekvenssit 15 Kloonien 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n cDNA:t eristettiin tekniikalla, jolla eristettiin HCV:n cNDA:iden lambda-gtll-kiijaston päällekkäin meneviä cDNA-fiagmentteja, kuten kuvattiin osassa IV.A. 1.. Käytetty tekniikka oli olennaisesti sama, jota kuvattiin osassa IV.A.3., paitsi että käytetyt koettimet olivat peräisin viimeksi eristettyjen kloonien nukleotidisekvenssien yhdistelmä-HCV-2o sekvensenssien 5'- ja 3-päistä! Hybridisointitaajuus klooneille, jotka hybridisoituivat alla kuvattujen koettimien kanssa, oli noin 1 50000:sta kussakin tapauksessa. Kloonien 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n cDNA:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti samoin kuin on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että näistä faageista pilkotulla cDNA.lla korvattiin kloonista 5-1-1 eristetty 25 cDNA.

Klooni 33c eristettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 40b nukleotidien sekvenssiin. Kloonin 40b nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 12. Kloonin 33c eristämisen käytetjmkoettimen nukleotidisekvenssi oli: 30 \ 5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA AC A ATT ACC ACT 3'

Kloonin 33c HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 40b sekvenssin kanssa on esitetty kuviossa 15, joka esittää myös siihen koodatut aminohapot.

35

Klooni 8h eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 33c nukleotidisekvenssiin.

•. . Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 56.

105652 5' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3'

Kloonin 8h HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 33c sekvenssin 5 kanssa ja siihen koodatut aminohapot ovat esitetyt kuviossa 16.

Klooni 7e eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8h nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 10 5' TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3'

Kloonin 7e HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 8h kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 17.

15 Klooni 14c eristettiin koettimella, joka perustui kloonin 25c nukleotidien sekvenssiin. Kloonin 25c sekvenssi on esitetty kuviossa 13. Kloonin 14c eristämiseen käytetyn koettimen sekvenssi oli: 5' ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3' 20 Kloonin 14c HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 25c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 18.

Klooni 8f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 14c nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 25 5' TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3’

Kloonin 8f HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 14c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 19.

30

Klooni 33f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8f nukleotidisekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3' 35

Kloonin 33f HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 8f sekvenssin ·. . kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 20.

i .105652 57

Klooni 33g eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 33f. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5 5' GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3' • ----------

Kloonin 33f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33f sekvenssin , kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 21.

10 Klooni 7f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 7e. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3' 15 Kloonin 7f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 7e sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 22.

Klooni 11b eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 7f. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 20 5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3’

Kloonin 11b HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 7f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 23.

25

Klooni 14i eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 1 Ib. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3' 30

Kloonin 14i HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 11b sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 24.

Klooni 39c eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin 35 kloonissa 33g. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: i 5' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3' 58 1056E2

Kloonin 39c HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 25.

5 IV.A.18. Yhdistftlma-HrV n r.DNA-sricvenssi; joka nn puraisin HfV-n rTTNfA ra sisältävistä pri<:tptyi<rta Iflnnnpjgta HCVtn cDNA-sekvenssit ylläkuvatuissa eristetyissä klooneissa ovat kohdakkain yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssin luomiseksi. Eristeyt kloonit, jotka ovat 10 kohdakkain suunnassa 5':sta 3':een ovat : 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c.

Yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, joka on peräisin eristetyistä klooneista ja siihen koodattu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 26.

15

Yhdistelmäsekvenssien luomisessa on havaittu seuraavia sekvenssiheterogeenisyyksiä. Klooni 33c sisältää 800 emäsparin HCV:n sDNAita, joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 37c cDNA:iden kanssa. Kloonissa 33c ja myös viidessä muussa päällekkäin menevässä kloonissa nukleotidi #789 on G. Kuitenkin kloonissa 37b (ks. osa IV.A. 11.) 20 vastaava nukleotidi on A. Tämä sekvenssiero luo ilmeisen heterogeenisyyden siihen koodattuihin aminohappoihin, joka olisi joko CYS tai TYR G:lle tai vastaavasti A:lle. Tällä heterogeenisyydellä voi olla tärkeitä seuraamuksia proteiinien muodostumisessa.

Kloonin 8f HCV:n cDNA:n nukleotidijäännös #2 on T. Kuiten kuten osoitetaan alla. 25 vastaava jäännös kloonissa 7e on A; lisäksi A tässä asemassa löydetään myös kolmesta muusta eristetystä päällekkäin menevästä kloonista. Täten T-jäännös kloonissa 8h voi edustaa kloonaustekotuotetta. Siksi kuviossa 26 merkitään tässä asemassa olevaa jäännöstä A:lla.

30 Kloonin 8f HCV:n cDNA:n 3'-pään nukleotidi on G. Kuitenkin vastaava kloonin 33f jäännös ja kahden muun päällekkäin menevän kloonin jäännös on T. Siksi kuviossa 26 tässä asemassa olevaa jäännöstä merkitään T:llä.

Kloonin 33f HCV:n cDNA:n 3'-pään sekvenssi on TTGC. Kuitenkin vastaava sekvenssi 35 kloonissa 33g ja kahdessa muussa päällekkäin menevässä kloonissa on ATTC. Siksi kuviossa 26 vastaavaa aluetta merkitään ATTC:llä.

105652 59

Kloonin 33g HCV:n cDNA.n nukleotidijäännös #4 on T. Kuitenkin kloonissa 33f ja kahdessa muussa päällekkäin menevässä kloonissa vastaava jäännös on A. Siksi kuviossa 26 vastaavaa jäännöstä merkitään A:lla.

5 Kloonin 14i 3'-pää on AA, kun taas vastaava dinukleotidi kloonissa 11b ja kolmessa muussa kloonissa on TA. Siksi kuviossa 26 päätä merkitään TA:lla.

„ Muiden sekvenssiheterogeenisyyksien analysoinnista keskustellaan yllä.

10 Yhdistemä-HCV:n cDNA:n tutkiminen merkitsee, että se sisältää yhden suuren ORF:n. Tämä ehdottaa, että virusgenomi on transloitusuureen polypeptidiin, jota käsitellään samanaikaisesti translaation kanssa tai sen jälkeen.

IV.A.19. Klnnnipn 17f 35f, IQg, 76g ja 1 5p prigtSininpn ja niiden nnklpnti'Hi<;pWpnggit 15 .

Kloonien 12f, 35f, 19g, 26g ja 15e HCV:n cDNA:t eristettiin olennaisesti osassa IV.A.17 kuvatulla tekniikalla, paitsi että koettimet olivat sellaisia kuin on merkitty alla. Koettimien kanssa hybridisoituvien kloonien frekvenssi oli noin 1 50000:sta kussakin tapauksessa. Näiden kloonien HCV:n cDNA:iden nukleotidisekvenssit määritettiin 20 olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että merkittyjen kloonien cDNA:lla korvattiin kloonista 5-1-1 eristetty cDNA.

Kloonin 12f, joka sisältää cDNA:ta ylävirtaan kuvion 26 HCV:n cDNA:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 14i nukleotidien ♦:· 25 sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5’ TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3'

Kloonin 12f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 14i sekvenssin 20 kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 27.

» ·

Kloonin 35f, joka sisältää cDNA:ta alavirtaan kuvion 26 HCV:n cDNA:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 39c. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3' • --- • · .60 105652

Kloonin 35f sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 39c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 28.

Kloonin 19g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui 5 kloonin 35f 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3’

Kloonin 19g HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 35f sekvenssin 1 o kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 29.

Kloonin 26g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 19g 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 15 5’ TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'

Kloonin 26g HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 19g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 30.

20 Kloonin 15e eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 26g 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3' ·: 25 Kloonin 15e HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 26g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 31.

Tässä osassa kuvatut kloonit on talletettu osassa Π.Α. kuvatuilla ehdoilla ja niissä olosuhteissa ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot.

30 lamhda-gtll ΑΤΓ.Γ. No. Xalletnspäivä klooni 12f 40514 10.11.1988 klooni 35f 40511 10.11.1988 klooni 15e 40513 10.11.1988 35 klooni K9-1 40512 10.11.1988 : Eristettyjen kloonien ylläkuvatut HCV:n cDNA-sekvenssit on asetettu kohdakkain i 61.

105652 yhdisteImä-HCV:n cDNA-sekvenssin luomiseksi. Eristetyt kloonit, jotka ovat kohdakkain suunnassa 5':sta 3':uun ovat: 12f, 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32,33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e.

5 Eristetyistä klooneista peräisin oleva yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi ja siihen > koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 32.

„ IV.A.20. Vaihtoehtoinen menetelmä kloonin 12f ΗΓ.Υ-n r.DN A-sekvenssistä ylävirtaan olevien cDN A-sekvenssi en eristämiseksi 10

Perustuen useimpiin 5'-HCV:n sekvensseihin kuviossa 32, jotka ovat peräisin kloonin 12f HCV:n cDNA:sta, syntetisoitiin käänteistranskriptaasin pieniä synteettisiä oligonuk-leotidiprimereitä ja niitä käytettiin sitoutumaan vastaaviin sekvensseihin HCV:n genomin RNA:han ylävirtaan olevien sekvenssien käänteistranskription aloittamiseksi. is Primerisekvenssit ovat lähinnä kloonin 12f tunnettua 5'-pään sekvenssiä, mutta siitä riittävästi alavirtaan salliakseen sellaisten koetinsekvenssien suunnittelun, jotka ovat ylävirtaan primerisekvensseistä. Tunnettuja standardimenetelmiä käytetään aloitukseen ja kloonaukseen. Tuloksena olevia cDNA-kiijastoja seulotaan aloituspaikoista ylävirtaan olevilla sekvensseillä (vähennettynä selvitetystä kloonin 12f sekvenssistä). 20 HCV:n genomin RNA saadaan joko plasma- tai maksanäytteistä simpansseista, joilla on NANBH tai vastaavista näytteistä ihmisistä, joilla on NANBH.

IV.A.21. Vaihtoehtoinen menetelmä, joka käyttää-hännän lisäämistä, sekvenssien eristämiseksi HflVn genomin 5-pään alueelta .. 25 Äärimmäisten 5-pään sekvenssien eristämiseksi HCV:n RNA-genomista ensimmäisen käänteistranskriptiokierroksen cDNA-tuotteeseen, joka on dupleksoitu malli-RNA:lla, lisätään oligo C-häntä. Tämä suoritetaan inkuboimalla tuotetta terminaalitransferaasin kanssa CPT:n läsnäollessa. eDNÄ-synteesin toinen kierros, joka tuottaa ensimmäisen 30 cDNA-säikeen komplementin, suoritetaan käyttäen oligo-G:tä primerinä käänteistranskriptaasireaktiota varten. Genomi-HCV-RNA:n lähteet ovat samoja, joita on kuvattu osassa IV.A.20. Menetelmät hännän lisäämiseksi terminaalitramsferaasilla ja käänteistranskriptaasireaktioita varten ovat niitä, jotka on kuvannut Maniatis et ai. (1982). cDNA_tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan sitten.

35 IV.A.22. Vaihtoehtoinen menetelmä, joka käyttää, hännän lisäämisiä, sekvenssien : eristämiseksi ΗΓλ/η genomin “V-pään aluilta 105652 62 Tämä menetelmä perustuu aikaisemmin käytettyihin menetelmiin Flaviviruksen RNA.n cDNA:n klooaamiseksi. Tässä menetelmässä RNA alistetaan denaturointiolosuhteisiin sekundääristen rakenteiden poistamiseksi 3'-päästä ja sitten siihen lisätään häntä 5 käyttäen Poly-A-polymeraasia käyttäen rATP:tä substraattina. Poly-A-hännällä varustetun RNA:n käänteistranskriptiota katalysoi käänteistranskriptaasi käyttäen oligo-dT:tä primerinä. cDNA:n toiset säikeet syntetosoidaan, cDNA-tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan.

10 IV.A.23. Suurempia r.nNA-inserttpjä_ sisältävien -Iamhria-gtl 1 ssä olevien ΗΓΥ-η c.DN A-kirjastojen luominen

Menetelmä, jota käytetään luomaan ja seulomaan lambda-gt 11-kirjastoja, on olennaisesti sama kuin se, jota on kuvattu osassa IV.A. 1., paitsi että kirjasto luodaan 15 Sepharose CL-4B-pylväästä eluoidun suuremman koon cDNA:iden varastosta.

IV.A.24. HC.V:n—c.DN A-kirjastojen—hiominen—käyttäen_synteettisiä_nlignineerpja primereinä 20 Uusia HCV:n cDNA-kirjastoja on valmistettu RNArsta, joka on peräisin tautia kantavan simpanssin plasmavarastosta, jota kuvattiin osassa IV.A. 1., ja poly-A"-RNA-fraktiosta, joka on peräisin tämän tautia kantavan eläimen maksasta. cDNA rakennettiin olennaisesti, kuten ovat kuvanneet Gubler ja Hoffman (1983), paitsi että ensimmäisien cDNA-säikeiden synteesiä varten olevat primerit olivat kaksi synteettistä oligomeeriä, ·: 25 jotka perustuivat yllä kuvattuun HCV:n genomin sekvenssiin.Primerit, jotka perustuivat kloonien 1 Ib ja 7e sekvenssiin livat: 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3’ ja 51 AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3’ 30

Tuloksena olevat cDNA:t kloonattiin lambda-bakteriofaagivektoreihin ja niitä seulottiin eri synteettisillä oligomeereillä, joiden sekvenssit perustuivat kuvion 32 HCV:n sekvenssiin.

25 IV.B. ΗΓ-Vrn eUNIA-issa koodattujen polypeptide ekspressin ja ekspressnitnjep tuotteiden tnnnistamineaHCYminrinsoimina antigeeneinä 105652 63 IV.B. 1. Klooniin 5-1-1 koodatun polypeptidin ekspnessio

Klooniin 5-1-1 koodattu HCV-polypeptidi (ks. osa IV.A.2., yllä) ekspressoitiin ftzusiopolypeptidinä superoksididismutaasilla. Tämä tehtiin alikloonaamalla kloonin 5-5 1-1 cDNA-insertti ekspressiovektoriin pSODcfl (Steimer et ai. (1986)) seuraavasti.

▼

Ensiksi pSODcfl :stä eristettyä DNA:ta käsiteltiin BamHI:lla ja EcoRI:lla ja seuraava , linkkeri liitettiin lineaariseen DNA:han, joka luotiin restriktioentsyymeillä: 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3’ io 3' GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5'

Kloonauksen jälkeen eristettiin insertin sisältävä plasmidi.

Insertin sisältävä plasmidi restriktoitiin EcoRIdla. HCV:n cDNA-insertti kloonissa 5-1-15 1 pilkottiin EcoRI:llä ja se liitettiin tähän EcoRI:llä linearisoituun plasmidi-DNA:han.

DNA-seosta käytettiin transformoimaan E.Coli-kantaa D1210 (Sadler et ai. (1980)). Kloonin 5-1-1 cDNA:n kanssa oikeassa orientaatiossa ORF:n ekspressiota varten olevat rekombinantit, jotka on esitetty kuviossa 1, tunnistettiin restriktiokartoituksen ja nukleotidien sekventoimisen avulla.

20

Yhden kloonin rekombinanttibakteerit saatetiin ekspressoimaaan SOD-NANB5.|.r polypeptidiä kasvattamalla bakteeria IPTG:n läsnäollessa.

TV.B.2. KJnnniin_R1 knndatiin pnlyppptidin pik<;prp<;gin ... 25 • · -

Kloonin 81 sisältämä HCV:n cDNA ekspressoitiin SOD-NANBgi-fuusiopolypeptidinä. Tätä fuusiopolypeptidiä koodaavan vektorin valmistusmenetelmä oli analoginen sen kanssa, mitä käytettiin SOD-NANB5.m koodaavan vektorin luomiseen, paitsi että HCV:n cDNA:n lähde oli .klooni 81, joka eristettiin osassa IV.A.3. kuvatulla tavalla ja 30 jota varten cDNA_sekvenssi määritettiin kuten kuvattiin osassa IV.A.4.. Kloonissa 81 oleva HCV:n cDNA-nukleotidisekvenssi ja siihen koodatun polypeptidin oletettu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 4.

HCV:n cDNA-insertti kloonissa 81 pilkottiin EcoRI:lla ja liitettiin pSODcfl :een, joka 35 sisälsi linkkerin (ks. IV.B.i.) ja joka linearisoitiin EcoRIilla. DNA-seosta käytettiin sitten transformoimaan E.Coli-kantaa D1210. Rekombinantit kloonin 81 HCV:n *·· cDNArn kanssa oikeassa orientaatiossa kuviossa 4 esitetyn ORF:n ekspressiota varten, 105652 64 tunnistettiin restriktiokartoituksen ja nukleotidin sekventoimisen avulla.

Yhdestä kloonista tulleet rekombinanttibakteeria saatettiin ekspressoimaan SOD-NANBst:tä kasvattamalla bakteereita IPTGrn läsnäollessa.

5 IV.B.3. ΚΊonniin 5-1-t knnrifltim pnlyppptidin tunnistaminen HfV nfl ja MANRH-hnn liittyvänä antigeeninä

Kloonin 5-1-1 HCV:n cDNA:han koodattu polypeptidi tunnistettiin NANBH:hon 10 liittyväksi antigeeniksi toteamalla kokeellisesti, että NANBH-infektoituneiden simpanssien ja ihmisten seerumi reagoi immunologisesti fuusiopolypeptidin SOD-NANBj.i.1, kanssa, joka muodostuu superoksididismutaasista sen N-päässä ja 5-1-1-antigeenistä sen C-päässä. Tämä suoritettiin Westem-blottauksen avulla (Towbin et ai. (1979)) seuraavasti.

15

Rekombinantti bakteerikanta, joka oli transformoitu ekspressiovektorilla, joka koodasi osassa IV.B.l. kuvattua SOD-NANB5.|.| -polypeptidiä saatettiin ekspressoimaan fuu-siopolypeptidiä kasvattamalla IPTG:n läsnäollessa. Koko bakteeriliuos saatettiin elektroforeesiin polyakiyyliamidigeelien läpi SDS:n läsnäollessa Laemmlin (1970) 20 mukaan. Erotetut polypeptidit siirrettiin nitroselluloosafilttereille (Towbin et ai (1979)). Filtterit leikattiin sitten ohuiksi kaistaleiksi ja kaistaleita inkuboitiin yksilöllisesti eri simpanssin ja ihmisen seerumin kanssa. Sidotut vasta-aineet osoitettiin lisäinkubaatiolla l2SI-leimatun lampaan anti-ihmis-Ig:n kanssa, kuten kuvattiin osassa IV.A. 1.

25 Westem-blottausta varten käytetyn simpanssin seerumin karakterisointi ja tulokset, • · jotka ovat esitetyt autoradiografoitujen kaistaleiden valokuvassa, on esitetty kuviossa 33. Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptidejä, inkuboitiin simpanssien seerumin kanssa eri aikoina akuutin NANBH:n (Hutchinson-kanta) aikana (kaistat 1 -16), hepatitis-A-infektioiden aikana (kaistat 17 - 24 ja 26 - 33) ja hepatitis-B-infektion 20 aikana (kaistat 34 - 44). Kaistat 25 ja 45 esittävät positiivisia kontrolleja, joissa immunoblotteja inkuboitiin seerumin kanssa potilaasta, jota käytettiin rekombinanttikloonin 5-1-1 tunnistamiseen alkuperäisessä lambda-gtl l:ssa olevan cDNA-kiijaston seulomisessa (ks. osa IV.A.l.).

25 Kontrollikaistoilla 25 ja 45, kuviossa 23 näkyvä nauha heijastaa vasta-aineiden sitoutumista SOD-fuusiopolypeptidin N ANB5.1.1-puoliskoon. Nämä vasta-aineet eivät • sitoudu yksin SOD:hen, koska tämä on sisällytetty negatiivisena kontrollina näihin 105652 65 näytteisiin, ja se olisi ilmaantunut nauhana, joka liikkuu huomattavasti nopeammin kuin SOD-NANBj.|.i-fuusiopolypeptidi.

Kaistat 1-16 kuviossa 33 esittävät vasta-aineiden sitoutumista neljän simpanssin 5 seeruminäytteisiin; seerumit saatiin juuri ennen NANBH-infektiota ja jaksoittain , akuutin infektion aikana. Kuten kuviosta nähdään, koska vasta-aineet, jotka reagoivat immunologisesti SOD-NANBs.i.i-polypeptidin kanssa, eivät olleet läsnä , seeruminäytteissä, jotka saatiin ennen infektoivan HCV-istutteen antamista ja infektion aikaisen akuutin vaiheen aikana, kaikki neljä eläintä lopulta synnyttivät kiertäviä vasta-1 o aineita tälle polypeptidille akuuttia vaihetta seuranneen myöhäisemmän vaiheen aikana. Lisänauhat, joita huomattiin immunobloteissa simpanssien numerot 3 ja 4 tapauksissa, johtuivat taustasitoutumisestaisäntäbakteeriproteiineihin.

Vastakohtana tuloksille, jotka saatiin NANBH-infektion omaavien simpanssien 15 seerumista, vasta-aineiden kehittymistä fuusiopolypeptidin NANB5.M-puoliskolle ei huomattu neljässä simpanssissa, jotka oli infektoitu HAV:llä tai kolmessa simpanssissa, jotka oli infektoitu HBV:llä. Ainoa sitoutuminen näissä tapauksissa oli taustasitoutuminen isäntäbakteeriproteiineihin, mitä tapahtui myös HCV-infektoiduissa näytteissä.

20

Ihmisseerumin, jota käytettiin Westem-blottausta varten karakterisointi ja tulokset, jotka nähdään autoradiografoitujen kaistaleiden valokuvassa, ovat esitetyt kuviossa 34. Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptideitä, inkuboitiin seerumin kanssa, joka oli peräisin ihmisistä eri aikoina NANBH-infektion aikana (kaistat 1 -21), HAV-·; 25 infektion aikana (kaistat 33 -40) ja HBV-infektion aikana (kaistat 41 - 49). Kaistat 25 ja 50 esittävät positiivisia kontrolleja, joissa immunoblotteja inkuboitiin sen potilaan seerumin kanssa, jota käytettiin lambda-gtl 1-kiijaston alkuperäisessä seulonnassa, jota on kuvattu yllä. Kaistat 22 - 24 ja 26 - 32 esittävät infektoitumattomia kontrolleja, joissa seerumi oli peräisin normaaleista verenluovuttajista.

30

Kuten nähdään kuviosta. 34, yhdeksän NANBH-potilaan seerumit, mukaanlukien seerumi, jota käytettiin lambda-gtl 1-kirjaston seulomiseen, sisälsivät vasta-aineita fuusiopolypeptidin NANBs.|.rpuoliskolle. Kolmen NANBH-potilaan seerumi ei sisältänyt näitä vasta-aineita. On mahdollista, että tulevaisuudessa näihin potilaisiin 35 kehittyy anti-NANB$.M-vasta-aineita. On myös mahdollista, että tämä reaktion puuttuminen johtui erilaisesta NANBV-aineesta, joka aiheuttaa taudin yksilöissä, joista otettiin se seerumi, joak ei aiheuttanut vastetta.

66 105652

Kuvio 34 esittää myös, että seerumit monista HAV- ja HBV-infektoiduista potilaista eivät sisältäneet anti-NANB5.i.rvasta-aineita ja että nämä vasta-aineet eivät olleet myöskään läsnä normaalien kontrollien seerumissa. Vaikka yksi HAV-potilas näyttääkin 5 sisältävän anti-NANB5.|.rvasta-aineita, on mahdollista, että tällä potilaalla oli ollut aikaisemmin HCV-infektio, koska NANBH:n mahdollisuus on hyvin korkea ja koska se on usein oireeton.

Nämä serologiset tutkimukset merkitsevät, että kloonin 5-1-1 cDNA koodaa 10 epitooppeja, jotka tunnistetaan erityisesti sellaisten potilaiden ja eläimien seerumista, joilla on BB-NANBV-infektio. Lisäksi cDNA ei näytä olevan peräisin kädellisten genomista.Kloonista 5-1-1 tai kloonista 81 tehty hybridisaatiokoetin ei hybridisoitunut kontrolli-ihmisten tai -simpanssien infektoitumattomien yksilöiden genomi-DNA:n " Southern"-blotteihin olosuhteissa, joissa ainutkertaisia, yksittäiskopiogeenejä 15 havaitaan. Nämä koettimet eivät myöskään hybridisoituneet kontrollina käytettyyn härän genomi-DNA:n Southern blotteihin.

IV.B.4. Kloonien 36, 81 ja 32-HCV:n CDNAriden yhdistelmään koodaattnjen-poiypep-tidien ekspressio 20 HCV-polypeptidi, joka oli koodattu ORF:ään, joka ulottui kloonien 36, 81 ja 32 kautta, ekspressoitiin fuusiopolypeptidinä SOD:n kanssa. Tämä suoritettiin liittämällä yhdis-telmä-cDNA, C100, ekspressiokasettiin, joka sisälsi ihmisen superoksididismutaasigeenin, liittämällä ekspressiokasetti hiivan ekspressiovektoriin ja :* 25 ekspressoimalla polypeptidi hiivassa.

Ekspressiokasetti, joka sisälsi C100-yhdistelmä-cDNA:ta, joka oli peräisin klooneista 36, 81 ja 32, rakennettiin liittämällä ~1270 emäsparin EcoRI-fragmenttivektorin pS3-56 (myös kutsuttu pS356:ksi) EcoRI-paikkaan, mistä on tuloksena pS3-56Cioo-plasmidi. 30 C100:n rakennetta on kuvattu osassa IV.A. 16 yllä.

Vektori pS3-56, joka on pBR322:n johdannainen, sisältää ekspressiokasetin, joka muodostuu ihmisen superoksididismutaasigeenistä ylävirtaan olevan ADH2/GAPDH-hybridihiivapromoottorin ja alavirtaan olevan GAPDH-transkriptioterminaattorin. Samanlaista kasettia, joka sisältää nämä kontrollielementit ja 35 superoksididismutaasigeenin, on kuvannut Cousens et ai. (1987) ja sitä kuvataan myös EP-julkaisussa 196,056, joka on julkaistu 1.10.1986 ja joka on tämän keksinnön hakijan ·· nimissä. Kasetti vektorissa pS3-56 eroaa kuitenkin Cousens et ai. (1987) kasetista siinä, 105652 67 että heterologinen proinsuliinigeeni ja immunoglobuliinisarana on poistettu ja että superoksididismutaasin gln,54:a seuraa sovitussekvenssi, mikä sisältää EcoRI-paikan. Sovittimen sekvenssi on: 5 5-AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3'

„ AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT

EcoRI-paikka sallii hetrologisen sekvenssin liittämisen, joka sekvenssi, kun se ekspressoidaan kasetin sisältävästä vektorista, antaa polypeptidejä, jotka ovat fuusioituja 10 superoksididismutaasiin oligopeptidilinkkerin kautta, joka sisältää aminohapposekvenssin: -asn-leu-gly-ile-arg-.

15 pS356-näyte on talletettu 29.4.1988 Budapest Treaty'n ehtojen mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20853 ja sille on annettu talletusnumero 67683. Ehdot ja olosuhteet talletuksen saatavuutta ja siihen käsiksipääsyä ja talletuksen ylläpitoa varten ovat samat kuin osassa II.A. määritellyt NANBV-cDNA:oita varten määritellyt ehdot ja olosuhteet. Tämä talletus on 2 0 tarkoitettu vain mukavuudeksi, eikä sitä vaadita tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa tässä esitetyn selityksen valossa. Talletettu materiaali liitetään tässä mukaan viitteeksi.

Sen jälkeen, kun rekombinantit, jotka sisältävät Cl00 cDNA-insertin oikeassa orientaatiossa, oli eristetty, ekspressiokasetti, joka sisälsi Cl00 cDNA:n pilkottiin pS3-·: 25 56cioo:sta BamHMla ja ~3400 emäsparin fragmentti, joka sisälsi kasetin eristettiin ja puhdistettiin. TämäfragmenttiliitettiinsittenhiivavektorinpAB24:nBamHI-paikkaan.

Plasmidi pAB24, jonka merkittävät piirteet on esitetty kuviossa 35, on hiivan sukkulavektori, joka sisältää täydellisen 2 μτη:η sekvenssin replikaatiota varten (Broach 30 (1981)) ja pBR322-sekvenssit. Se sisältää myös hiivan URA3-geenin, joka on peräisin plasmidista YEp24 (Botstein et ai. (1979)) ja hiivan LEU2d-geenin, joka on peräisin plasmidista pCl/1. EP-julkafsu" l 16,201. Plasmidi pAB24 rakennettiin pilkkomalla YEp24 EcoRI:lla ja religoimalla vektori poistamaan osittaiset 2 pm:n sekvenssit. Tuloksena oleva plasmidi, YEP24deltaRI, linearisoitiin pilkkomalla Clal:lla ja liitettiin 35 täydelliseen 2 |im:n plasmidiin, joka oli linearisoitu Clal:lla. Tuloksena oleva plasmidi pCBou pilkottiin sitten Xbal:lla ja 8605 emäsparin vektorifragmentti geelieristettiin.

• Tämä eristetty Xbal-fragmentti liitettiin 4460 emäsparin Xbal-fragmenttiin, joka sisälsi 105652 68 LEU2d-geenin, joka oli eristetty pCl/l:stä; LEU2d-geenin orientaatio on samassa suunnassa kuin URA3-geenin. Ekspression liittäminen oli ainutkertaisessa pBR322-sekvenssin BamBI-paikassa, mikä täten katkaisi geenin bakteeriresistenssiä varten tetrasykliinille.

5

Yhdistelmäplasmidi, joka sisälsi SOS-ClOO-ekspressiokasetin, pAB24C100-3, transformoitiinhiivakantaan JSC 308 ja myös muihin hiivakantoihin. Solut transformoitiin, kuten on kuvannut Hinnen et ai. (1978) ja ne siirrettiin ura-selektiivisil-le levyille. Yksittäisiä pesäkkeitä istutettiin leu-selektiiviseen väliaineeseen ja niitä 10 kasvatettiin kyllästymiseen asti. Viljelmä saatettiin ekspressoimaan SOD-CIOO-polypeptidiä (jota kutsutaan C100-3:ksi) kasvattamalla YEP:ssä, joka sisälsi 1 % glukoosia.

Kanta JSC 308 on genotyyppiä MAT @, leu2, ura3(del) DM15 (GAP/ADR1), joka on 15 liitetty ADR1 -paikkaan.JSC 308:ssa positiivisen aktivaattorigeenituotteen, ADR1, yliekspressio aikaansaa ylimääräisen tukahduttamisen eston (ADRl-villityypin säädön suhteen) ja kspressoitujen heterologisten proteiinien merkittävästi paremman saannon, kun sellaisia proteiineja syntetisoidaan ADH2 UAS-säätöjäijestelmän kautta. Hiivakannan JSC 308 rakenne on selvitetty yhdessä tämän hakemuksen kanssa jätetyssä 20 US-patenttihakemuksessa, jonka asiamiehen viitenumero on 2300-0229 ja johon tässä viitataan. Näyte JSC 308:sta on talletettu 5.5.1988 ATCC:hen Budapest Treaty'n ehtojen mukaisesti ja sille on annettu talletusnumero 20879. Ehdot ja olosuhteet talletuksen saatavuudeksi ja siihen käsiksi pääsemiseksi ja talletuksen ylläpitämiseksi ovat samat kuin ne, jotka on määritetty osassa II.A. kannoille, jotka sisältävät HCV:n *: 25 cDNA:ita.

« « Täydellisen C100-3-fuusiopolypeptidin, joka on koodattu pAB24C100-3:ssa, tulisi sisältää ihmisen SOD:n 154 aminohappoa aminopäässä, joista viisi aminohappoa on peräisin synteettisestä sovittimesta, joka sisältää EcoRJ-paikan, 363 30 aminohappotähdettä, jotka ovat peräisin C100:n cDNA:sta ja viisi karboksipään aminohappoa, jotka ovat peräisin MS2-nukleotidisekvenssistä, joka liittyy HCV:n cDNA-sekvenssiin kloonissa 32. (Ks. osa IV.A.7.). Tämän polypeptidin karboksipään oletettu aminohapposekvenssi, alkaen SOD:n viimeistä edellisestä Ala-tähteestä, on esitetty kuviossa 36; esitettynä on myös nukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidin 35 tätä osaa.

m . 105652 69 IV.B.5. C100:aan—koodatun .polypeptidin tunnistaminen -NANBH:hon—liittyvänä antigeeninä C100-3-fuusiopolypeptidi, joka on ekspressoitu plasmidista pAB24C 100-3 5 hiivakannassa JSC 308 karakterisoitiin koon suhteen ja C100:aan koodattu polypeptidi . tunnistettiin NANBH.hon liittyvänä antigeeninä sen immunologisen reaktiivisuuden mukaan kroonista NANBH:a sairastavan ihmisen serumin kanssa.

s- . ___________ C100-3-polypeptidi, joka oli ekspressoitu, kuten kuvattiin osassa IV.B.4, analysoitiin 1 o seuraavasti. Hiivan JSC 308 solut transformoitiin pAB24:llä tai pAB24C 100-3:11a ja ne saatettiin ekspressoimaan heterologista plasmidikoodattua polypeptidiä. Tuottamaan saatetut hiivasolut 1 ml:ssa elatusainetta (OD6jo ™ ~20) pelletoitiin linkoamalla 10000 kierroksella minuutissa yhden minuutin ajan ja ne liuotettiin pyörteistämällä niitä voimakkaasti (10x1 min) kahden tilavuusosan kanssa liuosta ja yhden tilavuusosan 15 kanssa lasihelmiä (0,2 nm halkaisijaltaan). Liuos sisälsi 50 mM Tris-HCl:a, pH 8,0, 1 nM EDTA, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 pg/ml pepstatiinia.Liukenematon materiaali liuoksesta, sisältäen C100-3-polypeptidin, kerättiin linkoamalla (10000 kierr./min 5 minuuttia) ja se liuotettiin keittämällä 5 minuutin ajan Laemmli SDS-näytepuskurissa. (ks. Laemmli (1970)). Sellainen polypeptidimäärä, 20 joka vastasi 0,3 ml:aa hiivaviljelmää, saatettiin elektroforeesiin 10 %:sten polyak-ryyliamidigeelien läpi SDS:n läsnäollessa Laemmlin (1970) mukaisesti. Proteiinis-tandardeja elktroforoitiin samalla geeleillä. Geelit jotka sisälsivät ekspressoituja polypeptidejä joko värjättiin Coomassie-loistavan sinisellä tai ne Westem-blotattiin, kuten on esitetty osassa IV.B.2., käyttäen kroonista NANBH:a potevan potilaan ·: 25 seerumia pAB24:stä tai pAB24CIÖ0-3:sta ekspressoitujen polypeptidien immunolo gisen reaktiivisuuden määrittämiseksi.

Tulokset esitetään kuviossa 37. Kuviossa 37A polypeptidit värjättiin Coomassie-loistavan sinisellä. pAB24:llä transformoidusta JSC 308:sta ja kahdesta eri JSC-30 pesäkkeestä, joka JSC oli transformoitu pAB24C 100-3:11a peräisin olevat liukenemattomat polypeptidit on esitetty kaistalla 1 (pAB24), ja vastaavasti kaistoilla 2 ja 3. Kaistojen 2 ja 3 vertailu kaistan 1 kanssa osoittaa sen polypeptidin aiheutettua ekspressiota, joka vastaa pAB24C 100-3:11a transformoidun JSC 308:n ~54000 daltonin molekyylipainoa, mutta jota ekspressiota ei synny pAB24:llä transformoidulla JSC 35 308:11a. Tätä polypeptidiä on merkitty nuolella.

ϊ· Kuvio 37B esittää pAB24:llä (kaista 1) tai pAB24C 100-3:11a (kaista 2) 70 105652 transformoidussa JSC 308:ssa ekspressoitujen liukenemattomien polypeptidien Westem-blotteja. pAB24:stä exspressoidut polypeptidit eivät olleet immunologisesti reaktiivisia NANBH:a sairastavan ihmisen seerumin kanssa. Kuitenkin, kuten on merkitty nuolella, pAB24C 100-3:11a transformoitu JSC 308 ekspressoi 5 molekyylipainoltaan ~54000 daltonin polypeptidiä, joka reagoi immonologisesti ihmisen NANBH-seerumin kanssa. Muut immunologisesti reaktiiviset polypeptidit kaistalla 2 saattavat olla tämän ~54000 daltonin polypeptidin hajaantumistuotteita tai kasaantumistuotteita.

10 TV R f> Finiginpnlypftptidin Γ.1 ΠΟ-Ί pnViHictiic

Fuusiopolypeptidi Cl00-3, joka muodostuu SOD:sta N-päässä ja in-frame C100:n HCV-popypeptidistä C-päässä, puhdistettiin uutettujen isäntähiivasolujen, joissa polypetidi oli ekspressoitu, liukenemattoman fraktion differentiaaliuuttamisen avulla.

15

Fuusiopolypeptidi Cl00-3 oli ekspressoitu hiivakannassa JSC 308, joka oli transformoitu pAB24C 100-3:11a, kuten on kuvattu osassa IV.B.4.. Hiivasolut liuotettiin sitten homogenoimalla, liuoksen liukenematonta materiaalia uutettiin pH:ssa 12 ja Cl00 jäljelle jäävässä liukenemattomassa fraktiossa tehtiin liukenevaksi SDS:ää sisältävässä 20 puskurissa.

Hiivaliuos valmistettiin olennaisesti Nagahuma et ai. (1984) mukaan. Hiivasolususpensio valmistettiin, jossa oli 33 % soluja (v/v) suspendoituna liuokseen (Puskuri A), joka sisälsi 20 mM Tris-HCl:a, pH 8,0, 1 mM ditiotreitolia ja 1 mM 25 fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Suspensionäyte (15 ml) sekoitettiin samanlaiseen tilavuuteen lasehelmiä (0,45 - 0,50 mm halkaisijaltaan) ja seosta pyörteistettiin huippunopeudella Super Mixer-laitteessa (Lab line Instruments, Inc.) 8 minuutin ajan. Homogenaatti ja lasihelmet erotettiin toisistaan ja lasihelmiä pestiin kolme kertaa samalla tilavuudella puskuri A.ta, kuin alkuperäisiä solujakin. 30 Pesunesteiden ja homogenaatin yhdistämisen jälkeen liuoksen liukenematon materiaali saatiin linkoamalla homogenaattia 7000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan 4°C lämpötilassa, suspendoimalla pelletit uudelleen puskuriin A, jonka tilavuus oli kaksi kertaa se, mitä käytettiin alkuperäisiä soluja varten ja materiaali pelletoitiin uudelleen linkomalla 15 minuuttia 7000 x g:n voimalla. Tämä pesutapahtuma toistettiin kolme kertaa.

35

Liuoksen liekenematonta materiaalia uutettiin pH:ssa 12 seuraavasti. Pelletit • suspendoitiin puskuriin joka sisälsi 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, jossa 105652 71 suspendointitilavuus oli sama kuin 1,8 kertaa se tilavuus, jota käytettiin alkuperäisiä soluja varten. Suspension pH säädettiin lisäämällä 0,2 tilavuusosaa Na-fosfaattipuskurin, pH 12,0. Sekoituksen jälkeen suspensio lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C lämpötilassa ja neste poistettiin. Uuttaminen toistettiin kaksi kertaa. 5 Uutetut pelletit pestiin suspendoimalla ne 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA ja käyttäen kaksinkertaista tilavuutta alkuperäisiä soluja varten käytettyyn verrattuna, mitä seurasi linkous 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C:ssa.

, Uutetuissa pelleteissä oleva C100-3-polypeptidi tehtiin liukenevaksi käsittelemällä SDS:llä. Pelletit suspendoitiin puskuriin A, jonka tilavuus oli 0,9 kertaa alkuperäisiä •Z o soluja varten käytetty tilavuus ja 0,1 tilavuusosaa 2 % SDS:ää lisättiin. Kun suspensiota oli sekoitettu, se lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C:ssa.Tuloksena olevia pellettejä uutettiin vielä kolme kertaa SDS:llä. Tuloksena olleet nesteet, jotka sisälsivät C100-3 :n, yhdistettiin.

15 Tämä menettely puhdistaa Cl00-3:n enemmän kuin 10-kertaiseksi hiivahomogenaatin liukenemattomasta fraktiosta ja polypeptidiä saadaan talteen enemmän kuin 50 %.

Fuusiopolypeptidin puhdistettu valmiste analysoitiin polyakryyliamidigeelillä elektroforeesilla Laemmlin (1970) mukaan. Tähän analyysiin perustuen polypeptidi oli 20 enemmän kuin 80 % puhdasta ja sen ilmeinen molekyylipaino oli -54000 daltonia.

IV.C. RNA‘n,_joka_hyhridi soitu»_HCV;n_cDNAn kanssa,—mnnistaminen infektoituneissa yksilöissä ·: 25 IV.C.l. RNA:n, joka hyhridisninm HCVrn cUNA-n kanssa, tunnistaminen simpanssin, jolla on NANRH, maksassa NANBH:ta sairastavan simpanssin maksasta peräisin olevan RNA:n esitettiin sisältävän sellaisia RNA-lajeja, jotka hybridisoituivat HCV:n cDNA:n kanssa, joka sisältyi kloo-oo niin 81 Northem-blottauksen avulla seuraavasti.

• _______ RNA eristettiin simpanssin mäksabiopsiasta, josta oli peräisin korkean tiitterin plasma (ks. osa IV.A. 1.) käyttäen tekniikkaa, jonka on kuvannut Maniatis et ai. (1982) koko- nais-RNA:n eristämiseksi imettäväissoluista ja sen erottamiseksi poly-A+- ja poly-A“ 35 fraktioihin. Näille RNA-fraktioille suoritettiin elektroforeesi formaldehydi/agaroosige- elillä (1 % w/v), ja ne siirrettiin nitroselluloosalle. (Maniatis et ai. (1982)).

Nitroselluloosafiltterit hybridisoitiin radioleimatim kloonin 81 HCV:n cDNA:n kanssa 72 105652 (ks. kuvio 4 inserdn nukleotidisekvenssiä). Radioleimatun koettimen valmistamiseksi kloonista 81 eristetty HCV:n cDNA-insertti radioleimattiin 32P:lIä nicktranslaation avulla käyttäen DNA-polymeraasi I:tä (Maniatis et ai. (1982)). Hybridisaatiota suoritettiin 18 tuntia 42°C lämpötilassa liuoksessa, joka sisälsi 10 % (w/v) 5 dekstraanisulfaattia, 50 % (w/v) deionisoitua formamidia, 750 mM NaCI, 75 mM Na-sitraattia, 20 mM NajHPO*, pH 6,5, 0,1 % SDS, 0,02 % (w/v) härän seerumialbumiinia (BSA), 0,02 % (w/v) Ficoll-400, 0,02 % (w/v) polyvinyylipyrrolidonia, 100 μg/ml lohen sperma-DNAita, joka oli rikottu ääniaaltojen avulla ja denaturoitu ja 106 cpm/ml nicktransloitua cDNA-koetinta.

10 Autoradiografi koetetusta filtteristä esitetään kuviossa 38. Kaista 1 sisältää 32P-leimattua restriktiofragmenttimarkkeria. Kaistat 2-4 sisältävät simpanssin maksan RNA:ta seuraavasti: kaista 2 sisältää 30 pg kokonais-RNA:ta; kaista 3 sisältää 30 pg poly-A-RNA:ta; ja kaista 4 sisältää 20 pg poly-A+-RNA:ta. Kuten on esitetty kuviossa 38 NANBH:ta sairastavan simpanssin maksa sisältää toistensa suhteen sukulaisia olevien 15 poly-A+-RNA-molekyylien heterogeenisen populaation, mikä hybridisoituu HCV:n cDNA-koettimeen ja mikä näyttää olevan kooltaan noin 5000 nukleotidia - noin 11000 nukleotidia. Tämä RNA, mikä hybridisoituu HCV:n cDNA:han, voisi edustaa virusgenomeita ja/tai virusgenomin erityisiä transkriptioita.

20 Osassa IV.C.2. alla kuvattu koe on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, että HCV sisältää RNA-genomin.

IV.C.2. HflV-gta puraisin nlpvan PM An hinnictaminpn qairaiHpn yt-cilniH^n qppmmkta 25 Nukleiinihapot uutettiin partikkelista, jotka oli eristetty korkean tiitterin simpanssin NANBH-pIasmasta, kuten kuvattiin osassa IV.A.l.. Eristettyjen nukleiinihappojen näytteitä (vastaten 1 ml:aa alkuperäistä plasmaa) suspendoitiin uudestaan 20 pl.aan Hepes.ä, pH 7,5, 1 mM EDTA:aan, ja 16 pg/ml hiivan liukoista RNA:ta. Näytteet denaturoitiin keittämällä 5 minuuttia, mitä seurasi välittömästi pakastus ja niitä käsiteltiin 20 ribonukleaasi A:lla (5 pl, joka sisälsi 0,1 mg/ml ribonukleaasi A:ta 25 mM:ssa ·. EDTA.ssa, 40 mM Hepes, pH 7,5) tai deoksinukleaasi I:llä ( 5 pl, joka sisälsi 1 yksikön deoksinukleaasi I:tä 10 mM MgCU, 25 mM Hepes, pH 7,5); vertailunäytteitä inkuboitiin ilman entsyymiä. Inkubaation jälkeen lisättiin 230 pl jääkylmää 2XSSC:tä, joka sisälsi 2 pg/ml hiivan liukoista RNA:ta ja näytteetsuodatettiin nitroselluloosafilttereillä. Filtterit 25 hybridisoitiin cDNA-koettimella, joka oli peräisin kloonista 81 ja joka oli nicktranslaation avulla 32P-leimattu. Kuvio 39 esittää filtterin autoradiografin. Hybridisaa-tiosignaaleita havaittiin deoksinukleaasikäsitellyissä ja vertailunäytteissä (kaistat 2 ja l 105652 73 vastaavasti 1), mutta niitä ei havaittu ribonukleaasikäsitellyssä näytteessä (kaista 3). Täten koska ribonukleaasi-A-käsittely tuhosi nukleiinihapot, jotka oli eristetty partikkeleista ja deoksinukleaasi-I-käsittelyllä ei ollut vaikutusta, todisteet ehdottavat vakavasti, että HCV:n genomi koostuu RNA:sta.

5 . IV.C.3. Amplifioinijen-HCV:n mnklftiinihappnskvenssieny.jotka-ovat peräisin HCV:n nnkleiinihappasekvensseistä—NANBH:ta_sairastavan-simpanssin_maksaa_ja , plasmanäytteistä, .osoittaminen 10 NANBH:ta sairastavien simpanssien ja vertailusimpanssien maksa- ja plasmanäytteissä läsnäolevia HCV:n nukleiinihappoja amplifioitiin käyttäen olennaisesti polymeraasiketjureaktio-(PCR)-tekniikkaa, jonka on kuvannut Saiki et ai. (1986). Primerioligonukleotidit olivat peräisin kloonin 81 tai kloonien 36 ja 37 HCV:n cDNA-sekvensseistä. Amplifioidut sekvenssit osoitettiin geelielektroforeesin ja Southem-15 blottauksen avulla käyttäen koettimina sopivaa cDNA-oligomeeriä, jonka sekvenssi oli kahden primerin väliseltä alueelta, mutta ei sisältynyt niihin.

Amplifikaatiojäijestelmän avulla tutkittavat RNA-näytteet, jotka sisälsivät HCV-sekvenssejä, eristettiin kolmen NANBH:ta sairastavan simpanssin ja kahden 20 vertailusimpanssin maksabiopsioista. RNA-fraktion eristäminen tehtiin gaunidiinitio- syanaattimenettelyllä, jota kuvattiin osassa IV.C. 1..

Amplifikaatiojäijestelmällä tutkittavat RNA-näytteet eristettiin myös kahden NANBH:ta sairastavan simpanssin ja yhden vertailusimpanssin plasmasta ja myös 25 vertailusimpanssien plasmojen varastosta. Yhden sairaan simpanssin CID/ml oli 106 tai enemmän ja toisen sairaan simpanssin arvo oli 10* tai enemmän.

Nukleiinihapot uutettiin plasmasta seuraavasti. Joko 0,1 ml tai 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopulliseen 1,0 ml:n tilavuuteen TENB/proteinaasi K/SDS-liuoksella 30 (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml proteinaasi K:ta ja 0,5 % SDS) sisältäen 10 pg/ml polyadenyylihappoa ja sitä inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa. Tämän proteinaasi-K-pilkkomisen jälkeen tuloksena olevat plasmafraktiot deproteinisoitiin uuttamalla TE;llä (10,0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) kyllästetyllä fenolilla. Fenolifaasi erotettiin linkoamalla ja sitä uutettiin uudelleen 35 TENBdlä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Kustakin uutoksesta tuloksena olevat vesifaasit yhdistettiin ja niitä uutettiin kahdesti samalla tilavuudella 99:1-seoksella kloroformi/isoamyylialkoholia. Linkoamalla tapahtuneen faasin erottamisen jälkeen 74 105652 vesifaasi saatettiin lopulliseen 0,2 M Na-asetaattipitoisuuteen ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Saostetut nukleiinihapot palautettiin ultralinkouksen avulla SW 41-roottorissa 38000 kierr./min 60 minuutin ajan 4°C:ssa.

5

Edellisen lisäksi korkean tiitterin simpanssin plasmaa ja varastoitua vertailuplasmaa uutettiin vuoronperään 50 pg:lla poly-A-kantajaa menettelyllä, jota ovat kuvanneet Chomcyzski ja Sacchi (1987). Tämä menettely käyttää hapanta guanidiini-tiosyanattiuutosta. RNA palautettiin linkoamalla 10000 10 kierT./min 10 minuutin ajan 4°C:ssa Eppendorf microfuge-laitteessa.

Kahdessa tapauksessa, ennen cDNA:n synteesiä PCR-reaktiossa, nukleiinihapot, jotka oli uutettu plasmasta proteinaasi K/SDS/fenoli-menetelmällä, puhdistetiin edelleen sitomalla ne S- ha S Elutip-R-kolonneihin ja eluoimalla ne sieltä. Seurattu menettely oli 15 valmistajan ohjeiden mukainen.

PCR-reaktiota varten mallina käytetty cDNA oli peräisin nukleiinihapoista (joko kokonaisnukleiinihapoista tai RNA:sta), jotka oli valmistettu yllä kuvatusti. Etanolisa-ostuksen jälkeen saostuneet nukleiinihapot kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 20 DEPC:llä käsiteltyyn tislattuun veteen. Nukleiinihappojen sekundääriset rakenteet rikottiin kuumentamalla 65°C:ssa 10 minuutin ajan ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäissä. cDNA syntetisoitiin käyttäen 1 - 3 pg simpanssin kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNArsta), jotka oli uutettu 10 -100 pl:sta plasmaa. Synteesi käytti käänteistranskriptaasia ja tapahtui 25 μ1:η reaktiossa käyttäen valmistajan, BRL. ·· 25 määrittelemää toimintaohjetta. cDNA-synteesiin käytetyt primerit olivat niitä, joita käytettiin myös alla kuvatussa PCR-reaktiossa. cDNA-synteesiä varten olevat kaikki reaktioseokset sisälsivät 23 yksikköä ribonukelaasi-inhibiittoria, RNASIN™ (Fisher/Promega). cDNA-synteesin jälkeen reaktioseokset laimennettiin vedellä, niitä keitettiin 10 minuuttia ja jäähdytettiin nopeasti jäissä.

30 PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan (Cetus-Perkin-Elmer) ohjeiden mukaisesti, paitsi että lisättiin 1 pg ribonukleaasi A:ta. Reaktiot suoritettiin 100 μ!:η lopullisessa tilavuudessa. PCR suoritettiin 35 syklin ajan käyttäen lämpötiloina 37°C, 72°C ja 94°C.

35 cDNA-synteesiä ja PCR-reaktioita varten olevat primerit olivat peräisin joko kloonin " 81, kloonin 36 tai kloonin 37b HCV:n cDNA-sekvensseistä. (Kloonien 81, 36 ja 37b i 75 .105652 HCV:n cDNA-sekvenssit on esitetty kuvioissa 4, 5 ja vastaavasti 10). Kahden 16-meerin primerin sekvenssit, jotka olivat peräisin kloonista 81 olivat: 5'CAA TCA TAC CTG ACA G 3' 5 ja 5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'

Kloonista 36 peräisin olevan primerin sekvenssi oli: a 5’ GCA TGT CAT GAT GTA T 3’.

ίο . ............

Kloonista 37b peräisin olevan primerin sekvenssi oli: 5’ ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.

PCR-reaktioissa primeriparit koostuivat joko kloonista 81 peräisin olevista kahdesta 16-15 meeristä tai 16-meeristä kloonista 36 ja 16-meeristä kloonista 37b.

PCR-rekation tuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet alkaalisella geelielektroforeesilla, mitä seurasi Southem-blottaus ja amplifioituneiden HCV:n cDNA-sekvenssien osoittaminen 32P-leimatulla sisäisellä oligonukleotidikoettimella, joka oli peräisin siltä 20 HCV:n cDNA:n alueelta, mikä ei mene päällekkäin primereiden kanssa. PCR-reaktioseoksia uutettiin fenoli/kloroformilla ja nukleiinihapot saostettiin vesifaasista suolalla ja etanolilla. Saostuneet nukleiinihapot kerättiin linkoamalla ja ne liuotettiin tislattuun veteen. Näyte-erille tehtiin elektroforeesi 1,8 % alkaalisella agaroosigeeleillä. 60, 108 ja 161 nukleotidin pituista yksisäikeistä DNA:ta saatettiin samanaikaisesti 25 elektroforeesiin geeleillä molekyylipainon merkkeinä. Elektroforeesin jälkeen geelillä olevat DNA:t siirrettiin Biorad Zeta Probe™-paperiIle. Esihybridisointi- ja hybri-disointi-ja pesuolosuhteet olivat valmistajan (Biorad) ohjeiden mukaisia.

Amplifioitujen HCV:n cDNÄ-sekvenssien hybridisaatioon ja osoittamiseen käytetyt 30 koettimet olivat seuraavia. Kun PCR-primeripari johdettiin kloonista 81, koetin oli 108-meeri, jonka sekvenssi vastasi sitä, mikä sijaitsee kahden primerin sekvenssien välisellä alueella. Kun PCR-primeripari oli peräisin klooneista 36 ja 37b, koetin oli kloonista 35 peräisin oleva nicktransloitu HCV:n cDNA-insertti. Primerit ovat peräisin kloonin 37b insertin nukleotideista 155 - 170 ja kloonin 36 insertin nukleotideista 206 -268. HCV:n 35 cDNA-insertin 3'-pää kloonissa 35 menee päällekkäin kloonin 36 insertin nukleotidien 1 - 186 kanssa; ja kloonin 35 insertin 5'-pää menee päällekkäin kloonin 37b insertin nukleotidien 207 -269 kanssa. (Vrt. kuviot 5, 8 ja 10). Täten kloonin 35 cDNA-insertti 105652 76 ulottuu osan alueen yli klooneista 36 ja 37b peräisin olevien primereiden sekvenssien välissä ja se on hyödyllinen koetin nämä primerit sisältäviä amplifioituja sekvenssejä varten.

5 Maksanäytteistä peräisin olevan RNA:n analyysi tehtiin ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen molempia primereiden ja koettimien Saijoja. Kolmen NANBHrta sairastavan simpanssin maksasta saatu RNA antoi positiivisia hybridisaatiotuloksia odotetun kokoisille amplifikaatiosekvensseille (161 ja 586 nukleotidia klooneille 81 ja 36 ja vastaavasti 37b), kun taas vertailusimpanssit antoivat negatiivisia hybridisaatio-1 o tuloksia. Samoja tuloksia saatiin, kun kokeet toistettiin kolme kertaa.

Plasmasta peräisin olevien nukleiinihappojen ja RNA:n analyysi tehtiin myös ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen kloonista 81 saatuja primereita ja koetinta. Plasmat olivat NANBH:ta sairastavista simpansseista, vertailusimpanssista, ja 15 vertailusimpanssien varastoiduista plasmoista. Molemmat NANBH-plasmat sisälsivät nukleiinihappoja/RNA:ta, joka antoi positiivisia tuloksia PCR-amplifioidussa analyysissä, kun taas molemmat vertailuplasmat antoivat negatiivisisa tuloksia. Näitä tuloksia on saatu toistuvasti useita kertoja.

20 IV.D. Radioimmunologinen_analyysi_HCV=vasta-ainp.idfin_osoittamiseksi infektoituneiden yksiöiden seerumissa

Kehitettiin kiinteän faasin radioimmunologisia analyysejä vasta-aineiden havaitsemiseksi HCV-antigeeneille perustuen Tsu'n ja Herzenberg'in julkaisuun (1980).

25 Mikrotiitterilevyt (Immulon 2, Removawell-kaistaleet) päällystetään puhdistetuilla polypeptideillä, jotka sisältävät HCV-epitooppeja. Päällystettyjä levyjä inkuboidaan joko ihmisen seeruminäytteiden, joiden epäillään sisältävän vasta-aineita HCV-epitoo-peille, kanssa tai sopivien vertailujen kanssa. Inkubaation aikana vasta-aine, jos sellainen on läsnä, sitoutuu immunologisesti kiinteän faasin antigeeniin.

20 Sitoutumattoman materiaalin poistamisen jälkeen ja mikrotiitterilevyjen pesun jälkeen osoitetaan ihmisen vasta-aine-NANBV-antigeenikompleksit inkuboimalla ,25I-leimatun lampaan ei-ihmisimmunoglobuliinin kanssa. Sitoutumaton leimattu vasta-aine poistetaan imun avulla ja levyt pestään. Yksittäisten kuoppien radioaktiivisuus määritetään; sidotun ihmisen anti-HCV-vasta-aineen määrä on verrannollinen kuopan 25 radioaktiivisuuteen.

.105652 77 IV.D. 1. Fuusiopolypeptidin SOD-NANB^^-pnhriistaminen

Fuusiopolypetidi SOD-NANBj.m, joka on ekspressoitu yhdistelmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.1., puhdistettiin yhdistelmä-E.Colista differentiaaliuuttamalla solu-5 uutteita urealla, mitä seurasi kromatografia anionin- ja kationinvaihtopylväissä seuraavasti.

, 1 litran viljelmän sulatetut solut suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan 20 % (w/v) sukroosia, joka sisälsi 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0, ja 0,4 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 lisättiin. 10 Viiden minuutin kuluttua 0°C:ssa seos lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuuttia. Tuloksena oleva pelletti suspendoitiin 10 ml:aan 25 % (w/v) suksroosia, joka sisälsi 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 pg/ml pepstatiini A:ta, mitä seurasi 0,5 ml:n lisäys lysotsyymiä (10 mg/ml) ja 10 minuutin inkubaatio 0°C:ssa. Sen jälkeen kun oli lisätty 10 ml 1 % (v/v) Triton X-100 0,06 M Tris-HCl:ssä, 15 PH 8,0, 1 mM EDTA, seosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia 0°C:ssa silloin tällöin ravistaen. Tuloksena oleva viskoosi liuos homogenoitiin kuljettamalla se kuusi kertaa kooltaan 20 gauge'n injektioneulan läpi ja sitä lingottiin 13000 x g:ssä 25 minuutin ajan. Pelletoitu materiaali suspendoitiin 5 ml:aan 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0, ja suspensiota lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuutin ajan. Pelletti, joka sisälsi SOD-NANB5.1.1-20 fuusioproteiinin, liuotettiin 5 ml:aan 6 M ureaa 0,02 M Tris-HCl:ssä, pH 8,0, 1 mM ditiotreitolia (puskuri A) ja se pantiin Q-Sepharose Fast Flow-merkkiseen pylvääseen, joka oli tasapainotettu puskuri A:lla. Polypeptidit eluoitiin 0,0 - 0,3 M NaCI:n puskuri A:ssa olevalla lineaarisella gradientilla. Eluoinnin jälkeen fraktiot analysoitiin polyakryyyliamidigeelielektroforeesilla SDS:n läsnäollessa niiden SOD-NANB5.m-25 pitoisuuden määrittämiseksi. Fraktiot, jotka sisälsivät tätä polypeptidiä, yhdistettiin ja dialysoitiin 6 M ureaa. vastaan 0,02 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,0, 1 mM ditiotreitolissa (puskuri B). Dialysoitu näyte pantiin puskuri B:Ilä tasapainotettuun S-Sepharose Fast Flovv-pylvääseen ja polypeptidit eluoitiin 0,0 - 0,3 M NaCl:n puskuri B:ssä olevalla lineaarisella gradientilla. Fraktiot analysoitiin polyakiyyliamidigeelie-30 lektroforeesin avulla SOD-NANBj.m m läsnäolon selvillesaamiseksi ja sopivat fraktiot yhdistettiin. __________ SOD-NANB5.|.|-polypeptidin lopullinen valmiste tutkittiin elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa. Tähän analyysiin perustuen valmiste oli 35 yli 80 % puhdas.

IV.D.2. Fuusiopolypeptidin -SOD-NANBa puhdistaminen 78 105652

Fuusiopolypeptidi SOD-NANB8|, joka on ekspressoitu yhdistelmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.2., puhdistettiin yhdistelmä-E.Colista solu-uutteiden differentiaali-uuttamisen avulla ureal la, mitä seurasikromatografia anionin- ja 5 kationinvaihtopylväissäkäyttäen menettelyä, jota on kuvattu fuusiopolypeptidin SOD-NANBj-i-i eristämisen yhteydessä (ks. osa IV.D. 1.).

Lopullinen SOD-NANBsi-poly peptidin valmiste tutkittiin elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa. Perustuen tähän analyysiin valmiste oli t 0 yli 50 % puhdas.

IV.D.3. HCV-epitOOppien-vasta-aineiden_osoittaminen _kiinteän faasin 15 Seeruminäytteet 32 potilaasta, joiden oli diagnosoitu sairastavan NANBH:a. analysoitiin radioimmunologisella analyysillä (RIA) sen määrittämiseksi, havaitaanko vasta-aineita HCV-epitoopeille, jotka ovat läsnä fuusiopolypeptideissä SOD-NANB5.M ja SOD-NANB81.

20 Mikrotiitterilevyt päällystettiin SOD-NANB5.|.i:lla tai SOD-NANBg|.llä, jotka oli osittain puhdistettu osien IV.D.l. ja vastaavasti IV.D.2. mukaisesti. Analyysit suoritettiin seuraavasti.

100 μΐ näytteitä, jotka sisälsivät 0,1 - 0,5 pg SOD-25 NANB5.M:a tai SOD-NANB8!:a 0,125 M Na-boraattipuskurissa, pH 8,3, 0,075 M NaCl:ssa (BBS) lisättiin mikrotiitterilevyn (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboitiin 4°C:ssa yli yön kosteassa kammiossa, minkä jälkeen proteiiniliuos poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBS:llä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST). Ei-spesifisen sitoutumisen estämiseksi kuopat peitettiin härän 30 seerumin albumiinilla (BSA) lisäämällä 100 μΐ 5 mg/ml:n BSA-liuosta BBS:ssä, mitä seurasi 1 tunnin inkubaatio huoneenlämpötilassa; tämän inkubaation jälkeen liuos poistettiin. Päällystetyissä kuopissa olevat polypeptidit saatettiin reagoimaan seerumin kanssa lisäämällä 100 μΐ seeruminäytteitä, jotka oli laimennettu 1:100 0,01 M Na-fosfaattipuskuriin, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS) sisältäen 10 mg/ml BSA:ta ja inkuboitiin 35 seerumia sisältäviä kuoppia 1 tunti 37°C:ssa. Inkubaation jälkeen seeruminäytteet poistettiin imulla ja kuopat pestiin 5 kertaa BBST:lIä. Anti-NANB5.M ja anti-NANBg(, jotka olivat sitoutuneet fuusiopolypeptideihin, määritettiin kiinnittämällä l25I-leimattua 105652 79 F'(ab)2-lampaan anti-ihmis IgG:tä päällystettyihin kuoppiin. 100 μ1:η näytteitä leimattua koetinta (spesifinen aktiivisuus 5-20 μCi/μg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja 5 pesua BBST:llä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä 5 määritettiin laskemalla laskurissa, joka havaitsee gammasäteilyn.

Anti-NANB$.|.i:n ja anti-NANB«i:n havaitsemisen tulokset yksilöistä, joilla oli , NANBH, on esitetty taulukossa 1.

10 Taulukko 1

Anti-5-1 -1 :n ja anti-81 :n osoittaminen NANB-, HAV- ja HBV-potilaiden seerumista Potilas

15 viite- S/N

numero Diagnoosi Anti-5-1-1 Anti-81 1. 281 Kroon, NANB, IVD2 0,77 4,20

Kroon. NANB, IVD 1,14 5,14 20 Kroon. NANB, IVD 2,11 4,05 2. 291 AVH3, NANB, ajoitt. 1,09 1,05

Kroon. NANB 33,89 11,39

Kroon. NANB 36,22 13,67 25 3. 301 AVH, NANB, IVD 1,90 1,54

Kroon. NANB, IVD 34,17 30,28

Kroon. NANB, IVD 32,45 30,84 30 4. 31 Kroon'. 'NANB,.....PT4 16, 09 8,05 5. 321 Myöh.'AVH, NANB, IVD 0,69 0,94

Myöh. AVH,NANB, IVD 0,73 0,68 35 6. 331 AVH, NANB, IVD 1,66 1,96 AVH, NANB, IVD 1,53 0,56 7. 341 Kroon. NANB, PT 34,40 7,55

Kroon. NANB, PT 45,55 13,11 40 Kroon. NANB, PT 41,58 13,45

Kroon. NANB", PT 44,20 15, 48

Potilas

' viite- S/N

numero Diagnoosi Anti-5-1-1 Anti-81 45 -----------------— ------------------------------------- 8. 351 AVH, NANB, IVD 31,92 31,95 "terve" äskett.

NANB, AVH 6,87 4,45 50 9. 36 Myöh. AVH, NANB, PT 11,84 5,79 80 105652 10. 37 AVH, NANB, IVD 6,52 1,33 11. 38 Myöh. AVH, NANB, PT 39,44 39,18 5 12. 39 Kroon. NANB, PT 42,22 37,54 13. 40 AVH, NANB, PT 1,35 1,17 10 14. 41 Kroon. NANB?, PT 0,35 0,28 15. 42 AVH, NANB, IVD 6,25 2,34 16. 43 Kroon. NANB, PT 0,74 0,61 15 17. 44 AVH, NANB, PT 5,40 1,83 18. 45 Kroon. NANB, PT 0,52 0,32 20 19. 46 AVH, NANB 23,35 4,45 20. 47 AVD, tyyppi A 1,60 1,35 21. 48 AVH, tyyppi A 1,30 0,66 25 22. 49 AVH, tyyppi A 1,44 0,74

23. 50 Päätt. äskett. AVH

tyyppi A 0,48 0,56 30 24. 51 AVH, tyyppi A 0,68 0,64 Päätt. AVH, tyyppi A 0,80 0,65

25. 52 Päätt. äskett. AVH

35 tyyppi A 1,38 1,04

Päätt. äskett. AVH

tyyppi A 0,80 0,65 26. 53 AVH, tyyppi A 1,85 1,16

40 Päätt. äskett. AVH

tyyppi A 1,02 0,88 27. 54 AVH, tyyppi A 1,35 0,74 45 28. 55 Myöh. AVH, HBV 0,58 0,55 i Potilas

viite- S/N

numero Diagnoosi Anti-5-1-1 Anti-81 50 ---------------------------------------------------------- 29. 56 Kroon. HBV 0,84 1,06 30. 57 Myöh. AVH, HBV 3,20 1,60 55 31. 58 Kroon. HBV 0,47 0,46 . 105652 81 32. 591 AVH, HBV 0,73 0,60 terveht. AVH, HBV 0,43 0,44 33. 601 AVH, HBV 1,06 0,92 5 terveht. AVH, HBV 0,75 0,68 34. 611 AVH, HBV 1,66 0,61 terveht. AVH, HBV 0,63 0,36 10 35. 621 AVH, HBV 1,02 0,73 terveht. AVH, HBV 0,41 0,42 36. 631 AVH, HBV 1,24 1,31 terveht. AVH, HBV 1,55 0,45 15 37. 641 AVH, HBV 0,82 0,79 terveht. AVH, HBV 0,53 0,37 38. 651 AVH, HBV 0,95 0,92 20 terveht. AVH, HBV 0,70 0,50 39. 661 AVH, HBV "" 1,03 0,68 terveht. AVH, HBV 1,71 1,39 25 ' jaksottaisia seeruminäytteitä saatavissa näistä potilaista 2IVD = Intravenous Drug User = suonensisäisten lääkkeiden käyttäjä 3 AVH = Acute Viral Hepatitis = akuutti virushepatiitti 4 PT = Post transfusion - verensiirron jälkeinen.

30 Kuten nähdään taulukosta 1, 19 32:sta seerumista potilaista, joilla oli diagnosoitu olevan NANBH, oli positiivisia SOD-NANBj.i.i:ssä ja SOD-NANB8):ssä läsnä olevia HCV-epitooppeja vastaan suunnattujen vasta-aineiden suhteen.

Kuitenkaan seeruminäytteet, jotka olivat positiivisia, eivät olleet samalla tavalla • reaktiivisia SOD-NANB5-i-i:n ja SOD-NANB8):n kanssa. Potilaasta No. 1 otetut 35 seeruminäytteet olivat positiivisia SOD-NANB81:n suhteen , mutteivät SOD-NANB5.|. i:n suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 10, 15 ja 17 olivat positiivisia SOD-NANBs-i.iin suhteen, mutteivät SOD-NANB8i:n suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 3, 8, 11 ja 12 reagoivat samalla tavalla molempien fuusiopolypeptidien kanssa, kun taas seeruminäytteet potilaista numerot 2, 4, 7 ja 9 olivat 2-3 kertaa korkeampia ; 40 reaktiossaan SOD-NANBj.i-i:n kanssa kuin SOD-NANB8i:n kanssa. Nämä tulokset ehdottavat, että NANBs.m ja NANBji voivat sisältää ainakin kolme erilaista epitooppia; s.o. on mahdollista, että itukin polyppetidi sisältää ainakin yhden ainutkertaisen epitoopinja että näillä kahdella polypeptidillä on ainakin yksi yhteinen epitooppi.

45 82 105652 IV.D.4. Kiinteän faasin RT A tn spgsifigyyg NATsTRH 11<»

Kiinteän faasin NANBH:ta varten olevien RIA.iden spesifisyys kokeiltiin käyttäen analyysiä sellaisten potilaiden seerumiin, joilla oli HAV tai HBV ja vertailuyksilöiden 5 seerumiin. Analyysit käyttäen osittain puhdistettua SOD-NANBs.M:a ja SOD-NANB»,:a suoritettiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.D.3., paitsi että seerumi oli peräisin potilaista, joilla oli aikaisemmin diagnosoitu joko HAV tai HBV tai yksilöistä, jotka olivat veripankkiluovuttajia. Tulokset HAV- tai HBV-sairaiden potilaiden seerumista on esitetty taulukossa 1. RIA suoritettiin käyttäen 11 seeruminäytettä HAV-sairaista potilaista ja 20 seeruminäytettä HBV-sairaista potilaista. Kuten nähdään taulukosta 1, mikään näistä seerumeista ei antanut positiivista immunologista reaktiota BB-NANBV-epitooppeja sisältävien fuusiopolypeptidien kanssa.

Suoritettiin RIA käyttäen NANBj.t.i-antigeeniä vertailuyksilöiden seerumin 15 immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi. 230:stä seeruminäytteestä, jotka saatiin normaalista verenluovuttajaväestöstä, saatiin vain kaksi positiivista reaktiota RIA:ssa (tietoja ei ole esitetty). On mahdollista, että kaksi verenluovuttajaa, joista seeruminäytteet olivat peräisin, olivat aikaisemmin altistuneet HCV:lle.

20 IV.D.5. NANR<.i.iU1 reaktiivisuus NANRH-infelffifin aikana

Anti-NANBs-i-i-vasta-aineiden läsnäoloa NANBH-infektion aikana 2 potilaassa ja 4 simpanssissa seurattiin käyttäen RIA:aa, kuten on kuvattu osassa IV.D.3. Lisäksi RIA:aa käytettiin määrittämään anti-NANB5-i-i-vasta-aineiden läsnäoloa tai poissaoloa • 25 HAV-tai HBV-infektion aikana sairaissa simpansseissa.

• · ·

Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 2, osoittavat että simpansseissa ja ihmisissä havaittiin anti-NANB5-i-rvasta-aineita NANBH-infektion akuutin vaiheen puhkeamisen jälkeen. Anti-NANB5.m-vasta-aineita ei havaittu joko HAV- tai HBV-infektoituneiden simpanssien seeruminäytteissä. Täten anti-NANB5.M-vasta-aineet toimivat markkereina 30 yksilön joutumiselle HCV:n hyökkäyksen kohteeksi.

Taulukko 2

Seerumin muuttuminen jaksottaisissa seeruminäytteissä hepatitispotilaissa ja -35 simpansseissa käyttäen 5-1-1-antigeeniä i . 83 105652

Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT

simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (mp/ml) 5 Potilas 29 T# NANB 1,09 1180 T+180 33,89 425 T+208 36,22

Potilas 30 T NANB 1,90 1830 10 T+307 34,17 290 T+799 32,45 276

Simp. 1 0 NANB 0,87 9 76 0,93 71 15 118 23,67 19 154 32,41

Simp. 2 0 NANB 1,00 5 21 1,08 58 20 73 4,64 13 138 25,01

Simp. 3 0 NANB 1,08 8 43 1,44 205 25 53 1,82 14 159 11,87 6

Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (πιμ/ml) 30 ----------------------------------------------------------

Simp. 4 -3 NANB 1,12 11 55 1,25 132 83 6, 60 35 140 17,51

Simp. 5 0 HAV 1,50 4 : 25 2,39 147 40 1,92 18 40 268 1,53 5

Simp. 6 -8 HAV 0,85 15 - 106 41 0,81 10 45 129 1,33-

Simp. 7 0 HAV 1,17 22 1,60 83 115 1,55 5 50 139 1,60

Simp. 8 0 HAV 0,77 15 26 __ 1,98 130 74 1,77 8 55 205 1,27 5 . 105652 84

Simp. 9 -290 HBV 1,74 379 3,29 9 435 2,77 6 5 Simp. 10 0 HBV 2,35 8 111-118 (var.) 2,74 96-155 (var.) 205 2,05 9 240 1,78 13 10

Simp. 11 0 HBV 1,82 11 28-56 (var.) 1,26 8-100 (var.) 169 - 9 15 223 0,52 10 #T = alkuperäisen näytteen päivä IV.E. NANR5l|nl:a-vastaan olevien pnlyklnnaalistPin <ranimiva<;ta-flineirlpn pnhHictami- 20 npn

Perustuen SOD-NANB5.i.i-polypeptidin spesifiseen immunologiseen reaktiivisuuteen NANBH-potilaiden seeruminäytteiden vasta-aineiden kanssa kehitettiin menetelmä sellaisten seerumivasta-aineiden puhdistamiseksi, jotka reagoivat immunologisesti 25 NANBj.M:ssä olevien epitooppien kanssa. Tämä menetelmä käyttää affxniteettikroma-tografiaa. Puhdistettu SOD-NANB5.|.i-polypeptidi (ks. osa IV.D.l.) kiinnitettiin liukenemattomalle kantajalle; kiinnitys on sellainen, että immobilisoitu polypeptidi säilyttää affmitetttinsa NANBs-i.iin vasta-aineelle. Seeruminäytteiden vasta-aine absorboidaan matriisiin sidot-30 tuun polypeptidiin. Kun on suoritettu pesu epäspesifisesti sitoutuneiden materiaalien • ·· poistamiseksi, sitoutunut vasta-aine vapautetaan sitoutuneesta SOD-HCV-polyppetidistä pH:n muutoksella ja/tai kaotrooppisilla reagensseilla, esimerkiksi urealla.

Nitroselluloosakalvoja, jotka sisälsivät sitoutunutta SOD-NANB5.|.i:a, valmistettiin seu-35 raavasti. Nitroselluloosakalvoa, 2,1 cm:n Sartoriusta, jonka huokoskoko oli 0,2 pm, pestiin kolme minuuttia kolme kertaa BBS:llä. SOD-NANB5.1.1 kiinnitettiin kalvoon • « " inkuboimalla puhdistettua valmistetta BBS:ssä huoneen lämpötilassa 2 tuntia; vaihtoeh toisesti sitä inkuboitiin 4°C:ssa yli yön. Liuos, joka sisälsi sitoutumatonta antigeeniä, poistettiin ja suodatin pestiin kolme kertaa BBS:llä kolme minuuttia pesua kohti. Jäljelle 40 jääneet aktiiviset paikat kalvossa blokattiin BSA:lla inkuboimalla 5 mg/ml:n BSA-liuoksella 30 minuuttia. Ylimääräinen BSA poistettiin pesemällä kalvoa viisi kertaa BBS:llä ja kolme kertaa tislatulla vedellä. Kalvoa, joka sisälsi virusantigeenin ja BSA:n, i 105652 85 käsiteltiin sitten 0,05 M glysiinihydrokloridilla, pH 2,5, 0,10 M NaCl (GlyHCl) 15 minuutin ajan, mitä seurasi kolme kolmen minuutin pesua PBS:llä.

Polyklonaaliset anti-NANBj.|.t-vasta-aineet eristettiin inkuboimalla kalvoja, jotka sisäl-5 sivät fuusiopolypeptidin seerumin kanssa yksiöstä, jolla oli NANBH, kaksi tuntia. In-. kubaation jälkeen suodattimia pestiin viisi kertaa BBS:llä ja kahdesti tislatulla vedellä.

Sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin sitten kustakin suodattimesta viidellä eluoinnilla GlyHClrllä, kolme minuuttia per eluointi. Eluaattien pH säädettiin pH 8,Oraan keräämällä kukin eluaatti koeputkeen, joka sisälsi 2,0 M Tris-HCl, pH 8,0. Anti-NANB$.i.rvasta-1 o aineen palautus affiniteettikromatografian jälkeen on suurin piirtein 50 %.

Nitroselluloosakalvoja, jotka sisältävät sidotun virusantigeenin, voidaan käyttää useita kertoja ilman, että niiden sitomiskyky merkittävästi alentuu. Kalvojen uudelleen käyttämiseksi sen jälkeen, kun vasta-aineet on eluoitu, kalvot pestään BBSrllä kolme kertaa 15 kolmen minuutin ajan. Niitä säilytetään sitten BBSrssä 4°C:ssa.

IV.F. HC.V-partikkeleiden.sieppaaminen, infektoimneestaplasmasta käyttäen puhdistettuja ihmisen polyklonaalisia anti-HCV^vasta-aineita; siepatuissa partikkeleissa olevien nukleiinihappojen hybridisaatio HCVrn cDNAhan 20 IV.F.l. HCV-partikkeleiden sieppaus infektoituneesta plasmasta käyttäen ihmisen polyklonaalisia anti-HCVrvasta-aineita NANBHrta sairastavan simpanssin infektoituneessa plasmassa olevat proteiini-25 nukleiinihappokompleksit eristettiin käyttäen puhdistettuja ihmisen polyklonaalisia anti- HCV-vasta-aineita, jotka kiinnitettiin polystyreenihelmiin.

Polyklonaaliset anti-NANB5.|.|-vasta-aineet puhdistettiin NANBHrta sairastavan ihmisen seerumista käyttäen SOD-HCV-polypeptidiä, joka on koodattu klooniin 5-1 -1. Puh-30 distusmenetelmä oli sama, joka on kuvattu osassa IV.E.

Puhdistetut anti-NANB5.i.i-vasta-aineet kiinnitettiin polystyreenipallosiin (halkaisijaltaan 6,35 mm, peilipinta, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois, USA) inkuboimalla kutakin huoneen lämpötilassa yli yön 1 mlrn kanssa vasta-aineita (1 pg/ml boraat-35 tipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 8,5). Yli yön tapahtuneen inkubaation jälkeen, palloset pestiin kerran TBSTrllä (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 raM NaCl, 0,05 % (v/v) 86 105652

Tween 20) ja sitten fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 10 mg/ml BSA:ta.

Vertailupalloset valmistettiin identtisellä tavalla, paitsi että puhdistettu anti-NANB5.M-5 vasta-aineet korvattiin ihmisen kokonaisimmunoglobuliinilla.

w HCV:n sieppaaminen NANBH:ta sairastavan simpanssin plasmasta käyttäen anti-NANBS-i-i-vasta-aineita, jotka oli kiinnitetty pallosiin, suoritettiin seuraavasti. NANBHrta sairastavan simpanssin plasmaa on kuvattu osassa IV.A. 1.. NANBV-infek-10 tottuneen simpanssin plasman erää (1 ml) inkuboitiin 3 tuntia 37°C:ssa kunkin viidestä pallosesta kanssa, jotka olivat peitettyjä joko anti-NANB}.i.rvasta-aineilla tai vertai-luimmunoglobuliineilla. Palloset pestiin kolme kertaa TBST:llä.

IV.F.2. Siepatuissa partikkeleissa nlpvipn nnlfleiinihappnjp.n hyhriHkaatin NANRV.

15 cDNAhan

Nukleiinihappokomponentti, joka oli vapautettu partikkeleista, jotka oli siepattu anti-NANBj.|.|-vasta-aineilla, analysoitiin kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cDNArn hyb-ridisaation suhteen.

20 HCV-partikkelit siepattiin NANBH-infektoituneen simpanssin plasmasta, kuten on kuvattu osassa IV.F. 1.. Nukleiinihappojen vapauttamiseksi partikkelista pestyjä pallosia inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa 0,2 ml:n kanssa per pallonen liuosta, joka sisälsi pro-teinaasi k:ta (1 mg/ml), 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,5, 10 mM EDTA:aa, 0,25 % (w/v) 25 SDS:ää, 10 pg/ml liukoista hiivan RNA:ta ja erottunut liuos poistettiin. Liuosta uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja nukleiinihapot saostettiin etanolilla yön aikana -20°C:ssa. Nukleiinihapposaostuma kerättiin linkoamalla, kuivattiin ja liuotettiin 50 mM Hepes-liuokseen pH:ssa 7,5. Kaksoiserät liukoisista nukleiinihapoista näytteistä, jotka saatiin pallosista, jotka oli päällystetty anti-NANB5.M-vasta-aineilla ja vertailupallosista, jotka 30 sisälsivät ihmisen kokonaisimmunoglobuliinia, suodatettiin nitroselluloosa- j 32 suodattimille. Suodattimet hybridisoitiin P-leimatulla, nicktranloidulla koettimella, joka oli tehty kloonin 81 puhdistetusta HCV:n cDNA-fragmentista. Menetelmiä koettimen valmistamiseksi ja hybridisoimiseksi on kuvattu osassa IV.C. 1..

35 Koettimella hybridisoitujen suodattimien, jotka sisältävät nukleiinihapot partikkeleista, jotka on siepattu anti-NANB5.|.i-vasta-aineita sisältävistä pallosista, autoradiografit on esitetty kuviossa 40. Uutos, joka on saatu käyttäen anti-NANB5.i.i-vasta-aineita (A|,A2), i 87.

105652 antoi selviä hybridisaatiosignaaleja verrattuna vertailuvasta-aineuutokseen (Aj.Ai) ja vertailuhiiva-RNA:han (Bi,B2)· Standardit, jotka muodostuivat puhdistetun kloonin 81 cDNA-fragmentin lpg:stä, 5pg:stä ja 10pg:stä, on esitetty kohdissa Cl - 3 vastaavasti.

5 Nämä tulokset osoittavat, että NANBH-plasmasta anti-NANB5.M-vasta-aineiden avulla siepatut partikkelit sisältävät nukleiinihappoja, jotka hybridisoituvat HCV:n cDNA:n kanssa kloonissa 81 ja täten antavat lisätodisteita, että näiden kloonien cDNA:t ovat peräisin NANBH:n etiologisesta aiheuttajasta.

10 IV.G. Cl 00-3;nimmunologinen reaktiivisuusanti-NANB<.i.i-vflgta-flinf»iHpn k-ancca C100-3-fuusiopolypeptidin immunologinen reaktiivisuus anti-NANB5.i.i-vasta-aineiden kanssa määritettiin radioimmunologisella analyysillä, jossa antigeenit, jotka olivat kiinnitettyjä kiinteään faasiin saatettiin kosketuksiin puhdistettujen anti-NANB5.i.,-vasta-15 aineiden kanssa ja antigeeni-vasta-ainekompleksi osoitettiin 125I-leimatuiIla veren anti-ihmisvasta-aineilla. C100-3-polypeptidin immunologista reaktiivisuutta verrattiin SOD-NANBj.|.i-antigeenin vastaavaan arvoon.

Fuusiopolypeptidi C10Ö-3 syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa 20 IV.B.5. ja vastaavasti osassa IV.B.6.. Fuusiopolypeptidi SOD-NANB5.1.1 syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.l. ja vastaavasti osassa IV.D.l.. Puhdistetut anti-NANB5.i.i-vasta-aineet saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.E..

100 μ1:η eriä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä puhdistettua Cl00-3-antigeeniä 0,125 *’ 25 M Na-boraattipuskurissa, pH 8,3, 0,075 M NaCl (BBS), lisättiin kuhunkin mikrotiitteri- levyn (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) kuoppaan. Levyä inkuboitiin yli yön 4°:ssa kosteassa kammiossa, minkä jälkeen proteiini]iuos poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBS:llä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST). Epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi kuopat peitettiin BSA:lla lisäämällä 100 μΐ 5 mg/ml:n BSA:n liuosta 30 BBSissä, mitä seurasi inkubaatio huoneenlämpötilassa tunnin ajan, minkä jälkeen yli-:* määräinen BSA-liuos pöistettim.Polypeptidien päällystetyissä kuopissa annettiin rea- goida puhdistettujen anti-NANBj.|.i-vasta-aineiden kanssa lisäämällä 1 pg vasta-ainetta kuoppaa kohti ja inkuboimalla näytteitä 1 tunti 37°C:ssa. Inkubaation jälkeen ylimääräinen liuos poistettiin imulla ja kuopat pestiin viisi kertaa BBST:llä. Anti-NANB}.|.|, 35 joka oli sitoutunut fuusiopolypeptideihin, määritettiin ,25I-leimatun F'(ab)2-lampaan anti-ihmis-IgG:n sitoutumisena päällystettyihin kuoppiin. 100 μ1:η eriä leimattua koetinta . (spesifinen aktiivisuus 5-20 pCi/pg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 88 105652 370°C:ssa yksi tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja viisi pesua BBSTrllä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin laskemalla laskurissa, joka tunnistaa gammasäteilyn.

5 C100:n immunologisen reaktiivisuuden tulokset anti-NANB$.i.i:n kanssa verrattuna NANB$.i.i:n reaktiivisuuteen puhdistettujen vasta-aineiden kanssa on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3 10

Cl00-3:n immunologinen reaktiivisuus verrattuna NANBs-i-iieen määritettynä radioimmunologisella analyysillä RIA (cpm/analyysi) 15 AG(ng) 400 320 240 160 60 0 NANBs-i-i 7332 6732 4954 4050 3051 57 C100-3 7450 6985 5920 5593 4096 67 20 Taulukon 3 tulokset osoittavat että anti-NANB5.i.i tunnistaa C100-3-polypeptidin C100-puoliskon epitoopit. Täten NANB5.M:llä ja C100:Ila on yhteisiä epitooppeja. Tulokset ehdottavat, että tätä NANBV-epitooppia koodaava cDNA-sekvenssi on se, joka on läsnä sekä kloonissa 5-1-1 että kloonissa 81.

25 TV H HfV-n lfaralftprigninti IV.H.l. HCV-ge.nomin.säikfte.ttftmyyden.karakterisointi HCV-genomi karakterisoitiin säikeettömyytensä suhteen eristämällä nukleiinihappoko fraktio partikkelista, jotka oli siepattu anti-NANB5.M-vasta-aineeIla päällystetyille poly-.· styreenipallosille ja määrittämällä, onko eristetty nukleiinihappo hydridisoitunut HCV :n cDNA:n plus- vai miinussäikeiseisiin.

Partikkelit siepattiin HCV-infektoituneen simpanssin plasmasta käyttäen polysty-35 reenipallosia, jotka oli päällystetty imniunopuhdistetulla anti-NANBs-i.i-vasta-aineella, kuten on kuvattu osassa IV.F.l. Partikkleiden nukleiinihappokomponentti vapautettiin ... käyttäen menetelmää, joka on kuvattu osassa IV.F.2. Eristetyn genomin numleiinihaposta peräisin olevia näytteitä, jotka vastasivat 3 ml:aa korkean tiitterin i 105652 89 posta peräisin olevia näytteitä, jotka vastasivat 3 ml:aa korkean tiitterin plasmaa, blotat-tiin nitroselluloosasuodattimille. Vertailuna blotattiin samoille suodattimille näytteitä denaturoidusta HCV:n cDNA:sta kloonista 81 (2 pg). Suodattimia tutkittiin 32P-leimatulla, HCV:n cDNA:sta kloonatulla yksisäikeisen DNA:n plus-ja miinussäikeiden 5 seoksella; cDNA:t leikattiin klooneista 40b, 81 ja 25c.

*

Yksisäikeiset koettimet saatiin leikkaamalla HCV:n cDNA:t klooneista 81, 40b ja 25c . EcoRLIla ja kloonaamalla cDNA-figamentit M13-vektoreihin mpl8 ja mpl9 (Messing (1983)). M13-kloonit sekventoitiin sen määrittämiseksi, sisälsivätkö ne HCV:n 1 o cDNA:sta peräisin olevia plus- vai miinnussäikeitä. Sekventointi suoritettiin Sanger et al.:n (1977) dedeoksiketjun terminaatiomenetelmällä.

Kukin kaksoissuodattimien Saijasta sisältäen näytteitä HCV-genomista, joka oli eristetty siepatuista partikkelista, hydridisoitiin joko plus- tai miinnussäikeisten, HCV:n 15 cDNA:sta peräisin olevien koettimien kanssa. Kuvio 41 esittää autoradiografit, jotka on saatu tutkimalla NANBV-genomia klooneista 81,40b ja 25c peräisin olevien koettimien seoksella. Tätä seosta käytettiin lisäämään hybridisaatioanalyysin herkkyyttä. Levyllä I olevat näytteet hybridisoitiin plussäikeisten koettimien seoksella. Levyllä II olevia näyt-teiutä tutkittiin hydridisaatiolla miinussäikeisten koettimien seoksen kanssa. Levyillä 2 o olevien immunoblottien näytteiden koostumukset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4

kaista A B

• 25 1 ________ HCV-genomi * 2..........

3 ________________* cDNA 81 4 ---- cDNA 81 30 * = kuvaamaton näyte. ™

Kuten nähdään kuvion 41 tuloksista, vain miinussäikeinen DNA-koetin hydridisoituu eristetyn HCV-genomin kanssa. Tämä tulos yhdessä sen tuloksen kanssa, joka osoittaa, että genomi on herkkä ribonukleaasille, muttei deoksinukleaasille (ks. osa IV.C.2.), eh-35 dottaa, että NANBV:n genomi on positiivissäikeistä RNA:ta.

Nämä tiedot ja tiedot muista laboratorioista, jotka koskevat oletetun NANBV:n fysiko- 105652 90 kemiallisia ominaisuuksia, ovat yhtäpitäviä sen mahdollisuuden kanssa, että HCV on Flaviviridaen jäsen. Kuitenkin mahdollisuutta, että HCV edustaisi uutta virusten luokkaa, ei ole eliminoitu.

5 IV.H.2. Sp.1 laisten cippattiijpn partiklfelpiHpn gplrvpngcipn havait<;pminpn jntlfa amplifi- koihina PCR:llä hyhridisoituvat kloonista 8.1 peräisin o levän HCV: n c.DNAn kanssa

Siepatuissa partikkeleissa oleva RNA saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.H. 1. Sellaisten sekvenssien analyysi, jotka hybridisoituvat kloonista 81 peräisin olevan HCV:n 10 cDNA:n kanssa, suoritettiin käyttäen PCR-amplifikaatiomenettelyä, kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi että hybridisaatiokoetin oli kinaasilla käsitelty oliginukleotidi, joka oli peräisin kloonin 81 cDNA-sekvenssistä. Tulokset osoittivat, että amplifioitu sekvenssi hybridisoitui kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cDNA-koettimen kanssa.

15 IV.H.3. Hnmolngia ei^stmlfturaaliRen Denguen Flavivimlfgen (MNWWVF)1) proteiinin ja„klnnnip.n 14i - 3Qr. yhdistettyyn ORF-aHn knnHattiijpn HrV-pnlyppptiriipn välillä

Kloonien 14i - 39c yhdistetyt HCV:n cDNA:t sisältävät yhden jatkuvan avoimen luku-alueen, kuten on esitetty kuviossa 26. Siihen koodattu polypeptidi analysoitiin homolo-20 giasekvenssin löytämiseksi Denguen flaviviruksen (MNWVD1) ei-strukturaalisten po-lypeptidien alueen kanssa. Analyysi käytti Dayhoffin proteiinitietokantaa ja se suoritettiin tietokoneella. Tulokset on esitetty kuviossa 42, jossa symboli (:) merkitsee tarkkaa homologiaa ja symboli (.) merkitsee vähäistä muutosta sekvenssissä; ajatusviivat merkitsevät välejä, jotka on tehty sekvenssiin suurimpien homologioiden aikaansaamiseksi. 25 Kuten kuvasta nähdään, HCV:n cDNA:han koodatun ja Denguen viruksen ei- strukturaalisten polypeptidien välillä on merkittävää homologiaa. Kuviossa 42 esitetyn homologian lisäksi sisälsi cDNA:n 3'-päähän koodattu polypeptidisekvenssi myös sekvenssejä, jotka ovat homologisia sekvenssien kanssa Denguen polymeraasissa. Tämän löydöksen seurauksena on, että kanooninen Gly-Asp-Asp (GDD)- sekvenssi, jonka aja-30 teltiin olevan olennainen RNA-riippuville RNA-polymeraaseille, sisältyy HCV:n CDNA:han koodattuun polypeptidiin asemassa, joka on yhtäpitävä Dengue 2-viruksen •« vastaavan osan kanssa. (Tietoa ei ole esitetty).

IV.H.4. HCV-DNA'ta-ei-haväitä NANBH.rinfektoituneessa kudoksessa 35

Kahden tyyppiset tutkimukset antavat tuloksia, jotka ehdottavat, ettei HCV-DNA ole .. havaittavissa sellaisen yksilön kudoksessa, jolla on NANBH. Nämä tulokset yhdessä 91 105652 osissa IV.C. ja IV.H.l. ja IV.H.2. saatujen tuloksien kanssa antavat todisteita siitä, ettei HCV ole DNArta sisältävä virus ja ettei sen replikaatio liity cDNArhan.

IV.H.4.a. Southern Blnttatismenettely . 5 _____ , Sen määrittämiseksi, sisältääkö NANBH-infektoituneen simpanssin maksa havaittavaa HCV-DNA:ta (tai HCV-cDNA:ta), tästä lähteestä eristetyn DNA:n restriktioentsyymi-, fragmentteja Southem-blotattiin ja blotteja tutkittiin 32P-leimatulla HCV:n cDNA:Ha.

Tulokset osoittivat, ettei leimattu HCV:n cDNA hybridisoitunut infektoituneen sim-io panssin maksasta peräisin olevan blotatun DNA:n kanssa. Se ei myöskään hybridisoitunut normaalin simpanssin maksasta olevan vertailuna käytetyn blotatun DNA:n kanssa. Tälle vastakohtana positiivisessa vertailussa leimattu betainterferonigeenin koetin hybridisoitui voimakkaasti restriktioentsyymillä pilkotun ihmisen istukka-DNA:n Southem-blotteihin. Nämä järjestelmät olivat suunniteltuja havaitsemaan sen geenin 15 yksittäinen kopio, joka oli tarkoitettu tulla havaituksi leimatulla koettimella.

DNA:t eristettiin kahden NANBH-simpanssin maksasta. Vertailu-DNA:t eristettiin in-fektoitumattoman simpanssin maksasta ja ihmisen istukoista. DNA:n uuttamismenettely oli olennaisesti Maniatis et ai. (1982) mukainen ja DNA-näytteitä käsiteltiin ribonukle-20 aasilla eristysmenettelyn aikana.

Kutakin DNA-näytettä käsiteltiin joko EcoRIlla, Mbollla tai HincII:lla (12 pg) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut DNA:t elektroforesoitiin l%:lle neutraalille agaroo-sigeeleille, ne Southem-blotattiin nitroselluloosalle ja blotattu materiaali hybridisoitiin :. 25 sopivalla nicktransloidulla koetin-cDNArlla (3 x 106 cpm/ml hybridisaatioseosta). Infek

toituneesta simpanssin maksasta ja normaalista maksasta peräisin oleva DNA hybridi-soitiin 32P-leimatulla kloonien 36 ja 81 HCV:n cDNArlla; ihmisen istukan DNA hybridisoitiin 32P-leimatulla betainterferonigeenin DNA.lla. Hybridisaation jälkeen hiotit , pestiin ankarissa olosuhteissa, s.o. liuoksella, joka sisälsi 0,1 x SSC, 0,1 % SDS

00 65°C:ssa. .

Betainterferoningeenin DNA valmistettiin kuten on kuvannut Houghton et ai. (1981).

IV.H.4.b. Amplifikflatin PR-tfflfniilfalla

Sen määrittämiseksi, voidaanko HCV-DNA:ta havaita NANBH:ta sairastavien simpans-sien maksasta, DNA eristettiin kudoksesta ja sille tehtiin PCR-amplifikaatio-määritys 35 92 105652 käyttäen primereita ja koetinpolynukleotideja, jotka olivat peräisin HCV.n cDNA:sta kloonista 81. Negatiiviset vertailut olivat DNA-näytteitä, jotka oli eristetty infektoitu-mattomista HepG2-kudoksen viljelysoluista ja oletettavasti infektoitumattomasta ihmisen istukasta. Positiiviset vertailut olivat negatiivisten vertailu-DNA:oitten näytteitä, 5 joihin oli lisätty tunnettu, suhteellisen pieni määrä (250 molekyyliä) HCV:n cDNA-inserttiä kloonista 81.

Lisäksi sen varmistamiseksi, että NANBH:ta sairastavien simpanssien samoista maksoista eristetyt RNA-fraktiot sisälsivät sekvenssejä, jotka olivat komplementäärisiä 10 HCV-cDNA-koettimelle, käytettiin PCR-amplifikaatio-määritysjäijestelmää myös eristettyihin RNA-näytteisiin.

Tutkimuksissa DNA:t eristettiin menetelmällä, jota on kuvattu osassa IV.H.4.a. ja RNA:t uutettiin olennaisesti siten, kuin on kuvannut Chirgwin et ai. (1981).

15 DNA-näytteet eristettiin kahden infektoituneen simpanssin maksasta, infektoitumatto-mista HepG2-soluista ja ihmisen istukasta. Yksi pg kutakin DNA:ta pilkottiin Hin-dIII:lla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut näytteet PCR-amplifikoitiin ja osoitettiin amplifioidusta HCV:n cDNA:sta olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi 20 että käänteistranskriptaasivaihe jätettiin pois. PCR-primerit ja koetin olivat HCV:n cDNA:ta kloonista 81 ja niitä on kuvattu osassa IV.C.3.. Ennen amplifiointia yhden mikrogramman näytteeseen kutakin DNArta, positiivisia vertailuja varten, lisättiin 250 molekyyliä HCV:n cDNA-inserttiä, joka oli eristetty kloonista 81.

. 25 Sen määrittämiseksi, oliko läsnä HCV-sekvenssejä RNA:ssa, joka oli eristetty NANBH:ta sairastavien simpanssien maksoista, näytteitä, jotka sisälsivät 0,4 pg ko-konais-RNA.ta amplifioitiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C-3., paitsi että käänteistranskriptaasi jätettiin pois joistakin näytteistä negatiivisena vertailuna. PCR-primerit ja koetin olivat peräisin kloonin 81 HCV:n cDNA:sta, kuten on kuvattu yllä.

30 ·· 1 : Tulokset osoittivat, että HCV:n cDNAdle komplementaarisia amplifioituja sekvenssejä ei ollut havaittavissa infektoituneen simpanssin maksan DNA:oissa, eikä myöskään negatiivisissa vertailuissa. Vastakohtana tälle, kun näytteisiin, sisältäen infektoituneen simpanssin maksasta olevan DNA:n, lisättiin HCV:n cDNA:ta ennen amplifikaatiota, 35 kloonin 81 sekvenssit havaittiin kaikissa positiivisissa kontrollinäytteissä. Lisäksi RNA-tutkimuksissa amplifioitu kloonin 81 HCV:n cDNA-sekvenssit havaittiin vain, kun :· käänteistranskriptaasia käytettiin, mikä viittaa vahvasti siihen, että tulokset eivät johtu- 105652 93 neet DNA-kontaminaatiosta.

Nämä tulokset osoittavat, että NANBH:ta sairastavien simpanssien maksasolut eivät sisällä HCV:n DNA:ta tai sisältävät niitä havaitemattoman määrän. Perustuen lisäystut-kimukseen, jos HCV:n cDNA:ta on läsnä, sitä on tasolla, joka on paljon alle 0,06 kopio-5 ta per maksasolu. Tälle vastakohtanasamoista maksanäytteistä peräisin olevan kokonais-. RNA:n HCV-sekvenssit havaittiin helposti PCR-tekniikalla.

IV.I. Hr.V-infpJrtmn FJ .TSÄ-määritys käyttäen. HCV rlflO-Va Ifnpantigeeninä 10 Kaikki näytteet analysoitiin käyttäen HCV cl00-3:a ELISA-menetelmällä. Tämä analyysi käyttää HCV cl00-3-antigeeniä (joka syntetisoitiin ja uhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.5.) ja hiiren monoklonaalisen anti-ihmis-IgG:n pipaijuuripe-roksidaasikonjugaattia (HRP).

15 Valmistettiin levyjä, jotka oli päällystetty HCV cl00-3~antigeenillä seuraavasti. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 21 ml/levy päällystyspuskuria (50mM Na-boraatti, pH 9,0), BSA:ta (25 μg/ml), cl00-3:a (2,50 pg/ml) juuri ennen lisäämistä Removeawell Immu-lon I-levyille (Dynatech CorpJ.Sen jälkeen kun sitä oli sekoitettu 5 minuuttia lisättiin 0,2 ml/kuoppa liuosta levyille, ne peitettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, minkä 20 jälkeen liuos poistettiin imemällä. Kuopat pestiin kerran 400 piillä Wash Bufferia (100 mM natriumfosfaattia. pH 7,4, 140 mM natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 1 % (w/v) Triton x-100:aa, 0,01 % (w/v) Thimerosal'ia). Pesuliuoksen poistamisen jälkeen lisättiin 200 μΐ/kuoppa Postcoat-liuosta (10 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, 150 mM natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia ja 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia . 25 (PMSF)), levyt peitettiin löysästi haihtumisen estämiseksi ja niiden annettiin olla huo- . « · neen lämpötilassa 30 minuuttia. Kuopat imettiin sitten liuoksen poistamiseksi ja ne lyo-filisoitiin kuivaksi yön yli ilman lämmitystä. Valmistetut levyt voidaan varastoida 2 -8°C:ssa saumatuissa alumiinipusselssa.

30 ELISA-määrityksen suorittamiseksi lisättiin 20 μΐ seeruminäytettä tai vertailunäytettä kuoppaan, joka sisälsi 200 μΐ näytteen laimenninta (100 mM natriumfosfaatti, pH 7,4, 500 mM natriumkloridi, 1 mM EDTA, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 0,015 % (w/v) Therosol, 1 % (w/v) Triton X-100, 100 pg/ml hiivauutetta). Levyt suljettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin 400 piillä 35 pesupuskuria (fosfaattipuskuroitu suola (PBS), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:a). Pestyjä kuoppia käsiteltiin 200 piillä hiiren anti-ihmis IgG-HRP-konjugaattia, joka oli Ortho'n ... konjugaatinlaimenninliuoksessa (10 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, 150 mM natriumklo- 94 105652 ridi, 50 % (v/v) härän sikiöseerumia, 1 % (v/v) lämpökäsitelty hevosseerumi, 1 mM KjFe(CN)6, 0,05 % (w/v) Tween 20, 0,02 % (w/v) Thimersal). Käsittelyä suoritettiin 1 tunti 37°C:ssa, liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin pesupuskurilla, mikä myös poistettiin imemällä. Sidotun entsyymikonjugaatin määrittämiseksi lisättiin 200 μΐ sub· 5 straattiliuosta (10 mg O-fenyleenidiamiinidihydrokloridia/ 5 ml Developer-liuosta). Developer-liuos sisältää 50 mM natriumsitraattia säädettynä pH-arvoon 5,1 fosforiha-polla ja 0,6 μΐ/ml 30% vetyperoksidia. Substraattiliuoksen sisältäviä levyjä inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, reaktiot pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ/ml 4 N rikkihappoa ja OD:t määritettiin.

10

Alla esitetyt esimerkit osoittavat, että mikrotiitterilevyseulonnalla ELISA-menetelmällä käyttäen HCV cl00-3-antigeeniä on korkean luokan spesifisyys, minkä todistaa noin 1 %:n alkuperäinen reaktiivisuusnopeus, jolla on noin 0,5 %:n toistettava reaktiivisuusno-peus sattumanvaraisilla luovuttajilla. Analyysillä voidaan havaita immunovaste sekä 15 akuutin vaiheen ohittaneella infektiolle että taudin krooniselle vaiheelle. Lisäksi analyysi voi havaita joitakin näytteitä, jotka antavat negatiivisen tuloksen NANBH:n korvaavissa kokeissa; nämä näytteet tulevat yksilöistä, joilla on olut NANBH tai luovuttajilta, jotka ovat mukana NANBH:n siirtymisessä.

20 Allakuvatuissa esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: ALT ai aniini aminotransferaasi

Anti-HBc HBc:n vastainen vasta-aine

Anti-HBsAg HBsAgrn vastainen vasta-aine . 25 HBc hepatitis-B:n ydinantigeeni • · · ABsAg hepatitis-B:n pinta-antigeeni

IgG immunoglobuliini-G

IgM immunoglobuliini-M

IU/L kansainvälisiä yksiköitä/1 30 NA ei saatavissa NT ei tutkittu • · N näytteen koko

Neg negatiivinen OD optinen tiheys 35 Pos positiivinen S/CO signaali/sulku ·· SD standardipoikkeama 95 .

105652 x keskimääräinen tai keskiarvo WNL normaalien rajojen sisällä IV.1.1. HCV-infektio .sattumanvaraisten verenluovuttajien joukossa 5

Saatiin 1056:n näytteen ryhmä (tuoretta seerumia) sattumanvaraisista verenluovuttajista Irwin Memorial Blood Bank'stä San Francisco, California. Koetulokset, jotka on saatu „ näistä näytteistä on esitetty histogrammissa, mikä esittää optisen tiheyden arvojen ja kaantuman (kuvio 43). Kuten nähdään kuviosta 43, 4 näytettä on arvoltaan > 3, yksi näyte on välillä 1 ja 3, 5 näytettä on välillä 0,4 ja 1 ja loput 1046 näytettä ovat alle 0,4. joista näytteistä yli 90 % on arvoltaan alle 0,1.

Reaktiivisten sattumanvaraisten näytteiden tulokset on esitetty taulukossa 5. Käyttäen sulkuarvona keskimääräistä arvoa plus miinus 5 standardipoikkeamaa, 10 näytettä 15 1056:sta (0,95 %) oli alunperin reaktiivisia. Näistä viisi näytettä (0,47 %) olivat toistu vasti reaktiivisia, kun ne analysoitiin toiseen kertaan käyttäen ELISA-menetelmää. Tau-I lukko 5 esittää myös ALT- ja antf-HBd-tilanteen kullekin toistuvasti reaktiiviselle näyt teelle. Erityisen mielenkiintoinen on se tosiasia, että kaikki viisi toistuvasti reaktiivista näytettä olivat negatiivisia molemmilla korvaavilla kokeilla tutkittaessa NANBH:n va-| 20 ralle, kun taas ne olivat positiivisia HCV:n ELISA-kokeessa.

Taulukko 5

Reaktiivisten sattumanvaraisten näytteiden tulokset 25 ¥=1051 j ' x=Ö,Ö49* ___________SD=±0,074 . Cut-off: x + 5SD = 0,419 (0,400 + negatiivinen vertailu) 30 Näyte Alkuper. Uusinta- ALT** Anti-HBc*** reaktiiv. reaktiiv. (IU/1) (opt.tih.) • ··· opt.tih. opt.tih.

4227 0,462 0,084 ΝΑ NA

35 6292 0,569' 0,294 ΝΑ NA

6188 0,699 0,326 NA NA

6157 0,735 0,187 NA NA

6277 0,883 0,152 NA NA

6397 1,567 1,392 30,14 1,433 40 6019 >3,000 >3,000 46,48 1,057 6651 >3,000 >3,000 48,53 1,343 6669 >3,000 >3,000 60,53 1,165 96 105652 4003 >3,000 3,000 WNL**** Neg.

10/1056 = 0,95 % 5/1056 = 0,47 % * arvoltaan >1,5 tuloksia ei otettu mukaan laskettaessa keskiarvoja ja standardipoik-keamia 5 ** ALT £ 68IU/1 on normaaliarvojen yläpuolella *** anti-HBc < 0,535 (kilpaileva analyysi) pidetään positiivisena **** WNL: normaalirajojen sisällä.

IV.I.2. Simpanssin seeruminäytteet 10

Yhdestätoista simpanssista peräisin olevat seeruminäytteet testattiin HCV cl00-3 ELISA-menetelmällä. Neljällä näistä simpansseista oli NANBH-infektio kontaminoituneesta tekijä VHI-erästä (oletettavasti Hutchinson-kanta), mitä seurasi yhdessä tri Daniel Bradleyn kanssa luotu toimintamalli Centers for Disease Control'ssa. Vertailuna 15 tartutettiin neljä muuta simpanssia HAV:lla ja kolme HBVrllä. Seeruminäytteet saatiin eri aikoina infektion jälkeen.

Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 6, esittävät dokumentoidun vasta-aineen serokon-version kaikissa Hutchinson-kantaa olevilla NANBH:lla infektoiduilla simpansseilla.

2o Akuutin infektiovaiheen jälkeen (mitä todisti ALT-tason merkittävä nousu ja sen jälkei nen palaaminen normaaliksi) voitiin havaita vasta-aineita HCV cl00-3:a vastaan kaikkien neljän NANBH-infektoidun simpanssin seerumissa. Näiden näytteiden oli aikaisemmin osoitettu, kuten on keskusteltu osassa IV.B.3., olevan positiivisia Westem-analyysillä ja RIA:lla. Tälle vastakohtana mikään vertailusimpansseista, jotka oli infek-25 toitu HAV-.lla tai HBV:llä, ei osoittanut todisteita reaktiivisuudesta ELISA-analyysissä.

• ·

Taulukko 6

Simpanssin seeruminäytteet 30

Opt. S/CO Istut. Näyte- ALT Virus pv pv IU/1 • · ψ .. Neg. vert 0,001 35 Pos.vert. 1,504

Cutoff 0,401

Simp 1 -0,007 0,00 24.5.84 24.5.84 9 NANB

0,003 0,01 7.8.84 71 40 >3,000 >7,48 18.9.84 19 >3,000 >7,48 24.10.84 ---

·: Simp 2 --- --- 7.6.84 NANB

105652 97 -0,003 0,00 31.5.84 5 -0,005 0,00 28.6.84 52 0,945 2,36 20.8.84 13 >3,000 >7,48 24.10.84 — 5

Simp 3 0,005 0,01 14.3.85 14.3.85 8 NANB

0,017 0,04 26.4.85 205 0,006 0,01 6.5.85 14 1,010 2,52 20.8.85 6 10

Simp 4 -0,006 0,00 11.3.85 11.3.85 11 NANB

0,003 0,01 9.5.85 132 0,523 1,31 6.6.85 — 1,574 3,93 1.8.85 — 15

Simp 5 -0,006 0,00 21.11.80 21.11.80 4 HAV

0,001 0,00 16.12.80 147 0,003 0,01 30.12.80 18 0,006 0,01 29.7-21-8.81 5 20 ----------

Simp 6 --- --- 25.5.82 --- --- HAV

-0,005 0,00 17.5.82 --- 0,001 0,00 10.6.82 --- 25 Opt. S/CO Istut. Näyte- ALT Virus pv pv IU/1 -0,004 0,00 6.7.82 106 0,290 0,72 1.10.82 —

JO

Simp 7 -0,008 0,00 25.5.82 25.5.82 7 HAV

-0,004 0,00 17.6.82 83 -0,006 0,00 16.9.82 5 0,005 0,01 9.10.82 --- 35

Simp 8 -0,007 0,00 21.11.80 21.11.80 15 HAV

0,000 " 07W 16.12.80 130 0,004 0,01 3.2.81 8 0,000 0,00 3.6 - 10.6.81 4,5 40

Simp 9 --- --- 24.7.80 -- --- HBV

0,019 0,05 22.8-10.10.79 --- --- --- 11.3.81 57 0,015 0,04 1.7 - 5.8.81 9 45 0,008 0,02 1.10.81 6 _ V(

Simp 10 --- — 12.5.82 --- --- HBV

0,011 0,03 21.4-12.5.82 9 0,015 0,04 1.9-8.9.82 126 50 0,008 0,02 2.12.82 9 0,010 0,02 6.1.83 13

Simp 11 --- --- 12.5.82 --- --- HBV

0,000 0,00 6.1-12.5.82 11 55 — -- 23.6.82 100 -0,003 0,00 9.6-7-7.82 --- 98 105652 -0,003 0,00 28.10.82 9 -0,003 0,00 20.12.82 10 IV.I.3. I.Avy. 1 · Ihmisistä peräisin nlevflNANTtH-kantajan tnriictetiisti infriftnitn gppni.

5 mi

Koodattu levy käsitti 22 erillistä näytettä, kukin niistä kahtena niin, että näytteitä oli 44 yhteensä. Näytteet olivat peräisin todistetusti infektoituneesta seerumista kroonisista NANBH-kantaj ista, infektoituneesta seerumista todetuista verenluovuttaj ista j a infektoi-10 tuneesta seerumista akuutin vaiheen NANBH-potilaista. Lisäksi näytteitä oli varmoista negatiivisista vertailuista ja muista sairausvertailuista. Levyn toimitti tri H. Alter, Department of Health and Human services, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. Levyn on suunnitellut tri Alter useita vuosia sitten ja sitä on käyttänyt tri Alter oletettujen NANBH-analyysien osoituslevynä.

15

Koko levy analysoitiin kahdesti ELISA-analyysillä ja tulokset lähetettiin tri Alterille arvioitavaksi. Arvioinnin tulokset on esitetty taulukossa 7. Vaikka taulukko antaakin tulokset vain toiselle kaksoisnäytteistä, samat arvot saatiin kussakin kaksoisnäytteessä.

20 Kuten on esitetty taulukossa 7, kuusi seerumia, jotka oli todettu infektoituneiksi sim-panssimallissa, oli voimakkaasti positiivisia. Seitsemäs infektoitunut seerumi vastasi akuutin NANBH-tapauksen näytettä, eikä se ollut reaktiivinen tässä ELISA-analyysissä.Todetusta verenluovuttajasta oleva näyte, jonka ALT-arvo oli normaali ja jonka simpanssitutkimuksessa saatu tulos oli epävarma, ei ollut reaktiivinen analyysissä.

25 Kolme muuta saijanäytettä yhdestä yksilöstä, jolla oli akuutti NANBH, eivät myöskään • olleet reaktiivisia. Kaikki näytteet, jotka tulivat varmoista negatiivisista vertailuista ja jotka oli saatu verenluovuttajilta, joilla oli ainakin 10 veren luovutusta ilman todettua hepatitista, eivät olleet reaktiivisia ELISA:ssa. Lopulta neljä näytteistä, jotka oli tutkittu aikaisemmin, oli arvioitu positiivisiksi oletetuissa NANBH-analyyseissä muiden toi-20 mesta, muttei näitä analyysejä voitu varmistaa. Nämä näytteet arvioitiin negatiivisiksi HCV ELISA :11a.

Taulukko 7 _H.ALTER'in levy-l: 35

Levy 1 mlos 2.tnlos 1) todettu inf. simpanssimallilla ·: A. Kroon. NANB:Post-Tx 105652 99 JF + + EB + + PG + +

B. Todettu luov. kohonn.ALT

5 BC + + JJ + + BB + + ' C. Akuutti NANB: Post-Tx

WH

10 2) Epäselv. infekt. simpanssimallilla

A. Todettu luov. normaali ALT CC

3) Akuutti NANB: Post-Tx JL viikko 1 -- 15 JL viikko 2 JL viikko 3 -- 4) Sairausvertailut

A. Primäärinen sappikirroosi EK

20 B. T oipumassa oleva alkoholihepatitis

HB

5) Varmat neg. vertailut

DM

DC -- 25 LV --

ML

AH -- 6) Potent. NANB-"antigeenejä" JS-80-01T-0 (Ishida) 30 Asterix (Trepo)

Zurtz (Arnold) . Becassdine (Trepo) » 9 % 35 IV.I.4.1-p.vy 2:Jjiovuttaja/vastaanottaja

Koodattu levy käsitti kymmenen epäselvää verensiirron luovuttaja-vastaan-ottajatapausta, joihin liittyi NANBH, kaikkiaan 188 näytettä. Kukin tapaus käsitti näyt-1 1' teitä joiltakin tai kaikilta vastaanottajan luovuttajilta ja saijanäytteitä (otettu 3, 6 ja 12 kuukautta verensiirron jälkeen) vastaanottajasta. Sisällytettynä oli myös verinäyte, joka 40 oli otettu vastaanottajasta ennen verensiirtoa. Koodatun levyn toimitti tri H.Alter NIHrstä ja tulokset lähetettiin hänelle arvioitavaksi.

Tulokset, jotka on annettu taulukossa 8, osoittavat, että ELISA havaitsi vasta-aineen j · serokonversion yhdeksässä kymmenestä NANB H ihon liittyvästä verensiirtotapauksesta.

100 105652

Tapauksesta 4 oleva näyte (jossa ei havaittu serokonversiota) yhtäpitävästi reagoi huonosti ELISA:ssa. Kaksi kymmenestä vastaanottajanäytteestä oli reaktiivista kolme kuukautta verensiirron jälkeen. Kuusi kuukautta verensiirron jälkeen kahdeksan vastaanot-tajanäytettä oli reaktiivisia; ja 12 kuukautta jälkeen olivat kaikki näytteet reaktiivisia lu-5 kuunottamatta tapausta 4. Lisäksi ainakin yksi vasta-ainepositiivinen luovuttaja huomattiin 7:ssä kymmenestä tapauksesta, jolloin tapauksella 10 oli kaksi positiivista luovuttajaa. Tapauksessa 10 myös vastaanottajan ennen verenluovutusta otettu näyte oli positiivinen HCV-vasta-aineille. Tästä vastaanottajasta otettu yhden kuukauden näyte putosi reaktiivisuuden rajatasolle, kun taas se kohosi positiiviseksi neljän ja kymmenen kuu-10 kauden näytteissä. Yleisesti suhdetta S/CO, joka on 0,4 pidetään positiivisena. Täten tämä tapaus voi edustaa yksilön aikaisempaa HCV-infektiota.

ALT- ja HBc-status kaikille reaktiivisille, s.o. positiivisille näytteille on esitetty taulukossa 9. Kuten taulukosta nähdään, 1/8 luovuttajanäytteistä oli negatiivinen korvaavilla 15 markkereina ja reaktiivinen HCV-vasta-aine-ELISA:ssa. Toisaalta vastaanottajanäytteet (joita seurattiin 12 kuukautta verensiirron jälkeen) olivat ALT-arvoltaan kohonneita. anti-HBc:n suhteen positiivisia tai molempia.

• · 3> 1 · 5 -Taulukko 8 101 105652 r.linyiltfaja/va<rfflarmttaja - >JANEUpvy H.Alterin Innvnttaja/vasfaannitaja -NAMK-lpvy 10 Tapaus Luovuttaja Vast.ott.

Opt.tih. S/CO näyte ennen verens.

Opt.tih. S/CO

T. rrz ~ 0,032 Ö7Ö7 15 2. --- — 0, 059 0, 14 3. 0, 403 0, 94 0, 049 0, 11 4. --- --- 0,065 0, 15 5. >3,000 >6,96 0,034 0,08 6. >3,000 >6,96 0,056 0,13 20 7. >3,000 >6,96 0,034 0,08 8. >3,000 >6,96 0,061 0,14 9. >3,000 >f,96 0,080 0,19 10. >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 25 _________________

Tapaus Verens. jälkeen 3 kk 6 kk 12 kk

OT S/CO OT S/CO OT S/CO

30 ---------------------------------------------------------- 1. 0,112 0,26 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 2. 0,050 0,12 1,681 3,90 >3,000 >6,96 3. 0,057 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 4. 0,073 0,17 0,067 0,16 0,217 0,50 35 5. 0,096 0,22 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 6. 1,475 3, 44 >3, 000 >6,96 >3,000 >6,96 7. 0,056 0,13 1 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 8. 0,078 0,18 2,262 5,28 >3,000 >6,96 9. 0,127 0,30 0,055 0,13 >3,000 >6,96 40 10. 0,3171 0, 74 >3,0002 >6,96 >3,0003 >6,96 •« 1 kk, 2 4 kk, 3 10 kk.

2 OT = optinen tiheys 3 " 1 _ ^

Taulukko 9 102 105652 5 ATT-jaHRr.-statm reaktiivisilla näytteillä H Alterin levyssä 1 Näytteet Anti-ALT* HBc** io Luovuttajat tapaus 3 normaali neg.

tapaus 5 kohonnut pos.

tapaus 6 kohonnut pos.

25 tapaus 7 ei saatavilla neg.

tapaus 8 normaali pos.

tapaus 9 kohonnut ei saatav.

tapaus 10 normaali pos.

tapaus 10 normaali pos.

20

Vastaanottajat tapaus 1 6 kk kohonnut pos.

12 kk kohonnut ei tutk.

25 tapaus 2 6 kk kohonnut neg.

12 kk kohonnut ei tutk.

tapaus 3 6 kk normaali ei tutk*** 12 kk kohonnut ei tutk*** tapaus 5 6 kk kohonnut ei tutk.

30 12 kk kohonnut ei tutk.

tapaus 6 3 kk kohonnut neg.

6 kk kohonnut neg.

12 kk kohonnut ei tutk.

tapaus 7 6 kk kohonnut neg.

35 12 kk kohonnut neg.

.. tapaus 8 6 kk normaali pos.

·· 12 kk kohonnut ei tutk.

tapaus 9 12 kk kohonnut ei tutk.

tapaus 10 4 kk kohonnut ei tutk.

40 10 kk kohonnut ei tutk.

* ALT 145 IU/1 on normaalirajojen yläpuolella ** Anti-HBc < 50 % (kilpaileva analyysi) pidetään positiivisena ** * ennen verensiirtoa otettu näyte ja 3 kk:n näyte olivat negatiivisia HBc:lle.

45 IV.I.5. HCV-infektion määrittäminen suuren ri ski n -ryhmän, näytteistä Näytteitä suuren riskin ryhmistä tarkkailtiin käyttäen ELISA:aa reaktiivisuuden määrit-tämiseksiHCV cl00-3-antigeenille. Nämä näytteet saatiin tri Gary Tegtmeieriltä, Com-50 munity Blood Bank, Kansas City. Tulokset on esitetty taulukossa 10.

105652 103

Kuten taulukosta nähdään, saatiin näytteet, joiden reaktiivisuus oli korkein verenvuototautia sairastavilta (76 %). Lisäksi näytteet yksilöistä, joiden ALT oli koholla ja jotka olivat positiivisia anti-HBc:lle, arvioitiin 51 % reaktiivisiksi, arvo mikä on yhtäpitävä sen arvon kanssa, joka arvioidaan kliinisestä tiedosta ja NANBH:n levinneisyydestä 5 tässä ryhmässä. HCV:n vastaisen vasta-aineen esiintyminen oli myös yleisempää veren-» luovuttajissa, joilla oli vain kohonnut ALT, verenluovuttajilla, jotka olivat positiivisia vain hepatitis-B-kuoren vasta-aineiden suhteen ja verenluovuttajissa, jotka oli hylätty muista syistä kuin korkean ALT-arvon tai anti-kuori-vasta-aineen takia verrattuna sattumanvaraisiin vapaaehtoisiin luovuttajiin.

10

Taulukko 10 15 NANBH:n suhteen suuren riskin ryhmän näytteet

Ryhmä N Jakaantuma % reakt.

N OT

20 ---------------------—-----------------------------------

Kohonnut ALT 35 3 >3,000 11,4 1 0,728

Anti-HBc 24 5 >3,000 20,8

Koh. ALT, Anti-HBc 33 12 >3,000 51,5 25 1 2, 768 1 2,324 1 0,939 1 0,951 1 0,906 30 Hylätyt luovuttajat 25 5 >3,000 20,0

Luov. hepatitis aikais 150 19 >3,000 14,7 1 0,837 1 0,714 1 0,469 35 Verenvuototautiset 50 31 >3,000 76,0 1 2,568 1 2,483 1 2,000 1 1,979 40 1 1,495 1 1,209 .'· . ...... 1 0,819 IV.I.6. Vertailututkimukset kSyttSpn Αηίι-ΤρΓι- tai Anti JgM-mnnnklnnaalisia vasta- 45 aineita tai pnlyklnnaalisia vasta-ainpita tnisp.na vasta-ainepna ΗΓΥ Γ.10Ω-3 F.T.ISA-ana- lyysissä ELISA-määrityksen herkkyyttä käyttäen anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia verrat- 104 105652 tiin siihen, mikä saatiin käyttäen joko anti-IgM-monoklonaalista konjugaattia tai korvaamalla molemmat polyklonaalisella antiseerumilla, jonka on ilmoitettu olevan spesifinen sekä raskaalle että kevyelle ketjulle, uoritettiin seuraavat tutkimukset.

5 IV.I.Ö.a. Satjanayttppt cprnWnnvprtnijigta

Saijanäytteitä kolmesta tapauksesta, jotka olivat NANB-serokonvertoijia, tutkittiin HCV cl00-3-ELISA-analyysillä käyttäen entsyymikonjugaatissa joko anti-IgG-monoklonaalista yksin tai yhdistelmänä anti-IgM-monoklonaalisen kanssa tai käyttäen io polyklonaalista antiseerumia. Näytteet toimitti tri Cladd Stevens, N.Y. Blood Center, N.Y.C., N.Y.. Näytehistoria on esitetty taulukossa 11.

Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-IgG-monoklonaalista vasta-aine-entsyymikonjugaattia, on esitetty taulukossa 12. Tiedot osoittavat, että voimakas reak-15 tiivisuus havaitaan alunperin näytteissä 1 -4,2-8 ja 3-5 vastaavasti tapauksista 1, 2 ja 3.

Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia yhdessä anti-IgM-konjugaatin kanssa, on esitetty taulukossa 13. Kolme erilaista anti-IgG:n ja anti-IgM:n suhdetta tutkittiin, anti-IgG:n laimennos 1:10000 oli vakio koko 20 ajan.Laimennokset, jotka tutkittiin anti-IgM-monoklonaaliselle konjugaatille olivat 1:30000, 1:60000 ja 1:120000. Tiedot osoittavat, että yhtäpitävästi yksin anti-IgG:llä saatujen tulosten kanssa, alkuperäinen voimakas reaktiivisuus havaittiin näytteissä 1 -4, 2-8 ja 3-5.

25 Tulokset, jotka saatiin ELISA:lla käyttäen anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia • · (1:10000 laimennos) tai Tago-polyklonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos) tai Jackson-polyklonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos), on esitetty taulukossa 14.

Tiedot merkitsevät, että alkuperäinen voimaks reaktiivisuus havaitaan näytteissä 1-4, 2- w 8 ja 3-5 käyttäen kaikkia kolmea jäijestelmää; Tago-polyklonaaliset vasta-aineet antoiko vat alhaisimmat signaalit.

• ·

Yllä esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki kolme jäijestelmää havaitsevat reaktiiviset näytteet samalla tavalla taudin akuutin vaiheen jälkeen (minkä todistaa ALT:n nousu).

Lisäksi tulokset merkitsevät, että HCV cl00-3-ELISA:n herkkyys käyttäen anti-IgG-25 monoklonaalista entsyymikonjugaattia on yhtä hyvä tai parempi kuin muiden tutkittujen entsyymikonjugaattien järjestelmien herkkyydet.

• «

Taulukko 11 105 105652

Clarirl Stevensin levyn näytteiden kuvaus 5 pvm HBsAg Anti- Anti- ALT Bili- HBs HBc rubin

Tapaus 1 10 1-1 5.8.81 1,0 91,7 12,9 40,0 -1,0 1-2 2.9.81 1,0 121,0 15,1 274,0 1,4 1-3 7.10.81 1,0 64,0 23,8 261,0 0,9 1- 4 19.11.81 1,0 67,3 33,8 75,0 0,9 15 1-5 15.12.81 1,0 50,5 27,6 71,0 1,0

Tapaus 2 20 2-1 19.10.82 1,0 1,0 116,2 17,0 -1,0 2- 2 17.11.81 1,0 0,8 89,5 46,0 1,1 2-3 2.12.81 1,0 1,2 78,3 63,0 1,4 2-4 14.12.81 1,0 0,9 90.6 152,0 1,4 2-5 23.12.81 1,0 0,8 93,6 624,0 1,7 25 2-6 20.1.82 1,0 0,8 92,9 66,0 1,5 2-7 15.2.82 1,0 0,8 86,7 70,0 1,3 2-8 17.3.82 1,0 0,9 69,8 24,0 -1,0 2-9 21.4.82 1,0 0,9 67,1 53,0 1,5 2- 10 19.5.82 1,0 0,5 74,8 95,0 1,6 30 2-11 14.6.82 1,0 0,8 82,9 37,0 -1,0

Tapaus 3 35 3-1 7.4.81 1,0 1,2 88,4 13,0 -1,0 3- 2 12.5.81 1,0 1,1 126,2 236,0 0,4 3-3 30.5.81 1,0 0,7 99, 9 471,0 0,2 3-4 9.6.81 1,0 1,2 110,8 315,0 0,4 3-5 6.7.81 1,0 1,1 89,9 273,0 0,4 40 3-6 10.8.81 1,0 1,0 118,2 158,0 0,4 3-7 8.9.81 1,0 " 1,0 112,3 84,0 0,3 3-8 14.10.81 1,0 0,9 102,5 180,0 0,5 3-9 11.11.81 1,0 1,0 84,6 154,0 0,3 45

Taulukko 12 106 105652

5 ELISA-tuIokse. iolka-οη saatu kflvttflPin anti-Tgfr-rnnnnklrmalkta knnjiigaattia Näyte Pvm ALT Opt.tih. S/CO

10

Neg. vertailu 0,076

Cutoff 0,476 PC (1:128) 1,390 15 Tapaus 1 1-1 5.8.81 40,0 0,178 0,37 1-2 2.9.81 274,0 0,154 0,32 1-3 7.10.81 261,0 0,129 0,27 20 1-4 19.11.81 75,0 0,937 1,97 1- 5 15.12.81 71,0 >3,000 >6,30

Tapaus 2 25 2-1 19.10.82 17,0 0,058 0,12 2- 2 17.11.81 46,0 0,050 0,11 2-3 2.12.81 63,0 0,047 0,10 2-4 14.12.81 152,0 0,059 0,12 2-5 23.12.81 624,0 0,070 0,15 30 2-6 20.1.82 66,0 0,051 0,11 2-7 15.2.82 70,0 0,139 0,29 2-8 17.3.82 24,0 1,867 3,92 2-9 21.4.82 53,0 >3,000 >6,3 2- 10 19.5.82 95,0 >3,000 >6,30 35 2-11 14.6.82 37,0 >3,000 >6,30 ··· Tapaus 3 3- 1 7.4.81 13,0 0,090 0,19 40 3-2 12.5.81 236,0 0,064 0,13 3-3 30.5.81 471,0 0,079 0,17 3-4 9.6.81 315,0 0,211 0,44 3-5 6.7.81 273,0 1,707 3,59 3-6 10.8.81 158,0 >3,000 >6,30 45 3-7 8.9.81 84,0 >3,000 >6,30 3-8 14.10.81 180,0 >3,000 >6,30 3-9 11.11.81 154,0 >3,000 >6,30 1 · 4

Taulukko 13 107 105652 EUSA-tlllnkSfit, jotka nn Saatu-kSyttap.n anti-Tgfi- ja anti-IgM-rnnnnlflrma^lista knnjn. 5 gaattia NANB ELISA:t

Monokl. Monokl. Monokl. IgG1 IgG1 IgG1 10 IgM** IgM*** IgM****

Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO

* - -

Neg. vertailu 0,100 0,080 0,079

Cutoff 15 PC (1:128) 1,083 1,328 1,197

Tapaus 1 1-1 5.8.81 40,0 0,173 0,162 0,070 20 1-2 2.9.81 274,0 0,194 0,141 0,079 1-3 7.10.81 261,0 0,162 0,129 0,063 1-4 19.11.81 75,0 0,812 0,85 0,709 1- 5 15.12.81 71,0 >3,000 >3,000 >3,000 25 Tapaus 2 2- 1 19.10.82 17,0 0,442 0,045 0,085 2-2 17.11.81 46,0 0,102 0,029 0,030 2-3 2.12.81 63,0 0,059 0,036 0,027 30 2-4 14.12.81 152,0 0,065 0,041 0,025 2-5 23.12.81 624,0 0,082 0,033 0,032 2-6 20.1.82 _ 66,0 0,102 0,042 0,027 2-7 15.2.82 70,0 0,188 0,068 0,096 2-8 17.3.82 24,0 1,728 1,668 1,541 35 2-9 21.4.82 53,0 >3,000 2,443 >3,000 2-10 19.5.82 95,0 >3,000 >3,000 >3,000 2- 11 14.6.82 37,0 >3,000 >3,000 >3,000

Tapaus 3 40 3- 1 7.4.81 13,0 0,193 0,076 0,049 3-2 12.5.81 236,0 0,201 0,051 0,038 3-3 30.5.81 471,0 0,132 0,067 0,052 3-4 9.6.81 315,0 0,175 0,155 0,140 45 3-5 6.7.81 IJ>73, 0 1,335 1,238 1,260 3-6 10.8.81 158,0 >3,00 >3,00 >3,00 3-7 8.9.81 84,0 >3,00 >3,00 >3,00 3-8 14.10.81 180,0 >3,00 >3,00 >3,00 3-9 11.11.81 154,0 >3,00 >3,00 >3,00 50 OT = optinen tiheys * = laimennos 1:10000, ** = laimennos 1:30000, *** = laimennos 1:60000, **** = laimennos 1:120000 > · · 55 108 105652

Taulukko 14 EII5vA---tlllnksp.f. jotka nnsaatu kayftapn pnlyklrmaalisia knnjngaattpja 5 NANR,F.IJSA:t

Monokl. Taqo Jackson 1:10000 1:80000 1:80000

10 Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO

Neg. vertailu 0,076 0,045 0,154

Cutoff 0,476 0,545 0,654 15 PC (1:128) 1,390 0,727 2,154

Tapaus 1 1-1 5.8.81 40 0,178 0,37 0,067 0,12 0,153 0,23 20 1-2 2.9.81 274 0,154 0,32 0,097 0,18 0,225 0,34 1-3 7.10.81 261 0,129 0,27 0,026 0,05 0,167 0,26 1-4 19.11.81 75 0,937 1,97 0,324 0,60 0,793 1,21 1- 5 15.12.81 71 >3,00 >6,30 1,778 3,27 >3,00 >4,59 25 Tapaus 2 2- 1 19.10.82 17 0,058 0,12 0,023 0,04 0,052 0,08 2-2 17.11.81 46 0,050 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 2-3 2.12.81 63 0,047 0,10 0,020 0,04 0,060 0,09 30 2-4 14.12.81 152 0,059 0,12 0,025 0,05 0,054 0,08 2-5 23.12.81 624 0,070 0,15 0,026 0,05 0,074 0,11 2-6 20.1.82 66 0,051 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 2-7 15.2.82 70 0,139 0,29 0,037 0,07 0,146 0,22 2-8 17.3.82 24 1,867 3,92 0,355 0,65 1,429 2,19 35 2-9 21.4.82 53 >3,00 >6,30 0,748 1,37 >3,00 >4,59 2-10 19.5.82 95 >3,00 >6,30 1.025 1,88 >3,00 >4,59 2- 11 14.6.82 37 >3,00 >6,30 0, 917 1,68 >3,00 >4,59

Tapaus 3 40 3- 1 7.4.81 13 0,090 0,19 0,049 0,09 0,138 0,21 3-2 12.5.81 236 0,064 0,13 0,040 0,07 0,094 0,14 3-3 30.5.81 471 0,079 0,17 0,045 0,08 0,144 0,22 3-4 9.6.81 315 0,211 0,44 0,085 0,16 0,275 0,42 45 3-5 6.7.81 273 1,707 3,59 0,272 0,50 1,773 2,71 3-6 10.8.81 158 >3,00 >6,30 1,347 2,47 >3,00 >4,59 3-7 8.9.81 84 >3,00 >6,30 2.294 4,21 >3,00 >4,59 3-8 14.10.81 180 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 3-9 11.11.81 154 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 50 105652 109 rv.l.6.b. Näytteet Rattiimanvqrai«;i«rta vprpnlnnvnttajkta Näytteitä sattumanvaraisista verenluovuttajista (ks. osa IV.I.l.) seulottiin HCV-infektion suhteen käyttäen cl00-3-ELISA:aa, jossa vasta-aine-entsyymikonjugaatti oli 5 joko anti-IgG-monoklonalinen konjugaatti tai polyklonaalinen konjugaatti. Seulottujen näytteiden kokonaismäärä oli 1077 polyklonaalisilla konjugaateilla ja vastaavasti 1056 monoklonaalisilla konjugaateilla. Seulonnan tulokset on esitetty taulukossa 15 ja näytteiden jakaantuma on esitetty kuvion 44 histogrammissa.

i o Keskimääräisen ja standardipoikkeaman laskeminen suoritettiin sulkemalla pois näytteet, jotka antoivat yli 1,5 olevan signaalin, s.o. 1073 optisen tiheyden arvoa käytettiin laskemisia varten käyttäen polyklonaalista konjugaattia ja 1051 käytettäessä anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia. Kuten nähdään taulukosta 15, kun käytettiin polyklonaalista konjugaattia, nousi keskiarvo 0,0493 :sta 0,093 l:een ja satndardipoikkeama 15 lisääntyi 0,074:stä 0,0933:een. Lisäksi tulokset osoittavat myös, että x + 5SD:n kriteeriä käytetään määrittämään analyysin cutoffia, polyklonaalisen konjugaatin jäijestelmä vaatii ELISA:ssa korkeamman cutoff-arvon. Tämä merkitsee alentunutta analyysispesifi-syyttä verrattuna monoklonaaliseen jäijestelmään. Lisäksi, kuten on kuvattu kuvion 44 histogrammissa, suurempi tulosten erottuminen negatiivisten ja positiivisten jakaantu-20 misien välillä tapahtuu, kun sattumanvaraisia verenluovuttajia seulotaan ELISA:lla käyttäen anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia verrattuna analyysiin, joka käyttää kaupallista polyklonaalista leimaa.

Taulukko 15 25 Kahden-EI.ISA-järiestelmän.vertailu tutkittaessa sattumanvaraisten verenluovuttajien * · näytteitä

Konjugaatti Polyklonaalinen Anti-IqG:n monoklon.

(Jackson) 30 Näytteiden lkm 1073 1051

Keskiarvo (x) 0,0931 0,04926 • I ...----

Standardipoikk. 0,0933 0,07427 5 SD 0,4666 0,3714

Cutoff (5 SD+x) 0,5596 0,4206 35 IVJ. NPV-gp.rnlfnnvprcinn hayflitsp.minpn NANRH-pntilak<;a pH maanfiptppllkiggä pai. ·'· koissa 110 105652

Seerumia potilaista, joiden epäiltiin sairastavan NANBH:a perustuen kohonneisiin ALT-tasoihin ja jotka olivat negatiivisia HAV- ja HBV-testeissä, seulottiin käyttäen RIA:aa olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV cl00-3-antigeeniä 5 käytettiin seulonta-antigeeninä mikrotiitterilevyillä. Kuten nähdään taulukossa 16 esitetyistä tuloksista, RIA:n avulla havaittiin positiivisia näytteitä suuressa tapausten prosenttimäärässä.

Taulukko 16 10 Semkonvftrsintaajiim tri maista pp.raisin filpvipn JsIAMRH-pntilaiHpn jnnlfncga Wäyrräpn anti-c.lQflrl^i

Maa Hollanti Italia Japani

Tutk.lkm 5 36 26 15 Positiivisia 3 29 19

Posit. % 60 80 73 IV.K. H CV-serokonversion—havaitspminpn_potilaina joilla_qq_"yhteisöhankittu"

NANRH

20

Seerumia joka saatiin 100 potilaasta, joilla oli NANBH, ja joille ei ollut ilmeistä siirty-mistietä (s.o. ei verensiirtoja, suonensisäistä lääkkeen käyttöä, vapaita sukupuolisuhteita jne. joita kysyttiin riskitekijöinä) toimitti tri M. Alter Center for Disease Controlista ja tri J. Dienstag Harvardin yliopistosta. Nämä näytteet seulottiin käyttäen RIA:aa olennai-- 25 sesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV cl00-3-antigeeniä käytettiin seu lonta-antigeeninä kiinnitettynä mikrotiitterilevyille. Tulokset osoittivat, että 100 seru-minäytteestä 55 sisälsi vasta-aineita, jotka reagoivat immunologisesti HCV cl00-3-anti-geenin kanssa.

30 Ylläkuvatut tulokset ehdottavat, että "yhteisöhankittu" NANBH aiheutuu myös HCVrstä. Lisäksi, koska tässä on todistettu, että HCV on Flaviviruksien sukua, joista useimmat siirtyvät niveljalkaisten välityksellä, herättää tämä ajatuksen, että HCV:n siirtyminen "yhteisöhankituissa" tapauksissa on myös tulosta siirtymisestä niveljalkaisten välityksellä.

• · 35 112 105652 IV.L. HCV-vasta-aineiden ja korvaavien markkereiden-esiinfymisen vertailu luovuttajissa, jotka liittyvät NANBH:n siirtymiseen

Tulevaisuutta kartoittava tutkimus suoritettiin sen määrittämiseksi, serokonvertoituvat-5 ko sellaiset veren vastaanottajat, jotka saavat verta epäillyistä NANBH-positiivisista , luovuttajista, jotka kehittivät NANBH:n, anti-HCV-vasta-ainepositiivisiksi. Veren luovuttajat tutkittiin korvaavien markkereiden epänormaalisuuksien suhteen, joita markkereita käytetään nykyään NANBH-infektion markkereina, s.o. kohonneet ALT-tasot ja antikuori-vasta-aneiden läsnäolo. Lisäksi luovuttajat tutkittiin myös anti-HCV-10 vasta-aineiden läsnäolon varalta. Anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon määrittäminen tehtiin käyttäen radioimmunologista analyysiä, kuten on kuvattu osassa IV.K. Tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 17, mikä esittää: potilaiden lukumäärän (palsta 1); anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon potilasseerumissa (palsta 2); potilaan saamien luovutusten lukumäärän, kunkin luovutuksen ollessa eri luovuttajalta (palsta 3); anti-15 HCV-vasta-aineiden läsnäolon luovuttajan seerumissa (palsta 4); ja luovuttajan korvaa van epänormaalisuuden (palsta 3) (NT tai — merkitsee, ettei sitä ole tutkittu) (ALT on kohonnut transaminaasi ja anti-HBc on antikuori vasta-aine).

Taulukon 17 tulokset osoittavat, että HCV-vasta-ainekoe on tarkempi havaitsemaan 20 infektoituneita verenluovuttajia kuin korvaavat markkerikokeet. Yhdeksän kymmenestä potilaasta, jotka kehittivät NANBH-oireita havaittiin positiivisiksianti-HCV-vasta-aineiden serokonversion suhteen. Yhdestätoista epäillystä luovuttajasta (potilas 6 sai luovutuksia kahdelta eri yksilöltä,’ joiden epäiltiin olevan NANBH-kantajia) yhdeksän oli positiivista anti-HCV-vasta-aineiden suhteen ja yksi oli rajatapaus positiivisena ja - 25 sen takia epävarma (potilaan 1 luovuttaja). Tälle vastakohtana, käyttäen kohonnutta ALT-koetta, kuusi kymmenestä luovuttajasta oli negatiivista ja käyttäen antikuori-vasta-ainekoetta, viisi kymmenestä luovuttajasta oli negatiivista. Suuremmasta merkityksestä on kuitenkin kolmessa tapauksessa (potilaiden 8, 9 ja 10 luovuttajat), että ALT-koe ja anti-HBc-koe antoivat tuloksena ristiriitaisia tuloksia.

30 » Taulukko 12 •«

Anti-HCV-vasta-aineiden kehittyminen potilaissa, jotka saivat verta luovuttajilta, joiden epäiltiin olevan NANBH-kantajia 1 35 · 112 105652

Anti-HCV- Luovut./ Anti-HCV- Korvaava serokonv. Luovutt. positiiv. epänorm.

Potilas potilaassa lkm luovutt. ALT Anti-HB

5 ---------------------------------------------------------- 1 kyllä 18 epäselvä ei ei 2 kyllä 18 kyllä NT kyllä 3 kyllä 13 kyllä ei ei 4 ei 18 ei --- --- 10 5 kyllä 16 kyllä kyllä kyllä 6 kyllä 11 kyllä(1) ei ei kyllä kyllä 7 kyllä 15 kyllä NT ei 8 kyllä 20 kyllä ei kyllä 15 9 kyllä 5 kyllä kyllä ei 10 kyllä 15 kyllä ei kyllä * sama luovuttaja kuin anti-NANBH-positiivinen IV.M. Amplifilcaatifi Hf.Vrn r.nNA-selrvpnssiftn klnnnaamigpksi käyttäen ΡΓρ-ää ja 20 primereitä, jotka ovatperäisin Flaviviniksen genomi,sekvenssien säilyneistä aineista

Yllä esitetyt tulokset, jotka ehdottavat, että Hcv on flavivirus tai flavityyppinen virus, sallii strategian karakterisoimattomien HCV:n cDNA-sekvenssien kloonaamiseksi käyttäen PCR-tekniikkaa ja primereita, jotka ovat peräisin niiltä alueilta, jotka kodaavat säi-25 lyviä aminohapposekvenssejä flaviviruksissa. Yleisesti yksi primereista on johdettu määritellystä HCV:n genomisekvenssistä ja toinen primeri, joka on sekventoimattoman HCV-polynukleotidin alueen vieressä, on peräisin flavivirusgenomin säilyvästä alueesta. Flaviviruksien genomien tiedetään sisältävän säilyviä sekvenssejä NS1- ja E-polypeptideissä, jotka ovat koodattuja flaviviruksen genomin 5'-alueella. Vastaavat näi-oo tä alueita koodaavat sekvenssit ovat kuviossa 26 esitetyistä HCV:n cDNA-sekvensseistä . ylävirtaan päin. Täten tältä HCV:n genomin alueelta peräisin olevien sekvenssien eris tämiseksi suunnitellaan ylävirran puolen primereita, jotka ovat peräisin näiden flavivi-ruspolypeptidien säilyvistä sekvensseistä. Alavirran puolen primerit ovat peräisin HCV :n cDNA.n tunnetun osan ylävirran puolen päästä.

35

Koodin degeneroitumisen takia on luultavaa, että flaviviruskoettimien ja vastaavan HCV-genomin sekvenssin välillä on sopimattomia alueita. Siksi käytetään strategiaa, joka samanlainen kuin se, minkä on kuvannut Lee (1988). Leen menettelytapa käyttää sekaoligonukleotidiprimereita, jotka ovat komplementaarisia aminohapposekvenssin 40 käänteistranslaatiotuotteille; sekaprimereiden sekvenssit ottavat huomioon jokaisen ko-donin degeneraation säilyvää aminohapposekvenssiä varten.

On luotu kolme saijaa primeriseoksia, jotka perustuvat useissa flaviviruksissa havaittui- 105652 113 hin aminohappohomologioihin, mukaanlukien Dengue-2,4 (D-2,4), japanilaisen enkefa-liittiviruksen (JEV), keltakuumeen (YF) ja Länsi-Niilin viruksen (WN). Useimmista ylävirran säilyvistä sekvensseistä (5'-l) peräisin oleva primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin gly-trp-gly, mikä on osa säilyvästä sekvenssistä asp-arg-gly-trp-gly-aspN. 5 joka on löydetty D-2:n, JEV:n, YF:n ja WN:n E-proteiinista. Seuraava primeriseos (5'- 2) perustuu alavirran säilyvään sekvenssiin E-proteiinissa, phe-asp--gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu ja se on peräisin phe-gly-asp:sta; säilyvä sekvenssi on läsnä D-2:ssa, JEVrssä, YF:ssä ja WN:ssä. Kolmas primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin arg-ser-cys, joka on osa säilyvää sekvenssiä cys-cys-arg-ser-cys D-2:n, D-4:n, JEV:n. 10 YF:n ja WN:n NS 1-proteiinissa. Yksittäiset primerit, jotka muodostavat seoksen 5'-3:ssa on esitetty kuviossa 45. Säilyvästä alueesta peräisin olevien eri sekvenssien lisäksi kukin primeri kussakin seoksessa sisältää myös vakioalueen 5'-päässä, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa paikkoja restriktioentsyymejä Hindlll, Mbol ja EcoRI varten.

15 Alavirran puolen primeri, ssc5h20A on peräisinkloonin 5h nukleotidisekvenssistä, joka sisältää HCV:n cDNA:ta, jonka sekvenssit menevät päällekkäin kloonien 14i ja 11b sekvenssien kanssa. ssc5h20A:n sekvenssi on 5’ GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' 20 _______________

Voidaan käyttää myös vaihtoehtoista primeria, ssc5h34A. Tämä primeri on peräisin kloonin 5h sekvenssistä ja se sisältää lisäksi nukleotideja 5'-päässä, jotka luovat restrik-tioentsyymin paikan täten helpottaen kloonausta. ssc5h34A:n sekvenssi on ; 25 5' GAT CTC TAG AGA AATCÄÄ TAT GGT GAC AGA GTC A 3’ PCR-reaktio, jota on alunperin kuvannut Saiki et ai. (1986), suoritetaan olennaisesti, kuten on kuvannut Lee et ai. (1988), paitsi että cDNA:n malline on RNA, joka on eristetty HCVinfektoidun simpanssin maksasta, kuten on kuvattu osassa IV.C.2., tai virusko partikkeleista, jotka on eristetty HCV-infektoidun simpanssin seerumista, kuten on kuvattu osassa IV.A.l. Lisäksi olosuhteet ovat vähemmän ankarat amplifikaation ensimmäisellä kierroksella (0,6 M NaCl ja 25°C), koska primerin se osa, joka liittyy HCV-sekvenssiin on vain 9 nukleotidin pituinen ja siinä voi olla huonosti yhteensopivia osia. Lisäksi, jos käytetään ssc5h34A:ta, lisäsekvenssit, jotka eivät ole peräisin HCV:n ge-25 nomista ovat taipuvaisia destabiloimaan primeri-mallinehybridin. Amplifikaation ensimmäisen kierroksen jälkeen liitosolosuhteet voivat olla ankarammat (0,066 M NaCl ja ·· 32 - 37°C), koska amplifioidut sekvenssit sisältävät nyt alueita, jotka ovat komplemen- 105652 114 taarisia primereille tai niiden kopioille. Lisäksi ensimmäiset kymmenen amplifikaatio-sykliä suoritetaan Klenowin entsyymi 1:119. tälle entsyymille sopivissa PCR-olosuhteissa. Syklien suorittamisen jälkeen näytteet uutetaan ja niihin käytetään Tag-polymeraasia pakkauksen ohjeiden mukaisesti, kuten Cetus/Perkin Elmer on esittänyt.

5

Amplifikaation jälkeen amplifioidut HCV:n cDNA-sekvenssit osoitetaan hybridisaation avulla käyttäen kloonista Sh peräisin olevaa koetinta. Tämä koetin on peräisin sekvensseistä ylävirtaan niistä, joita käytettiin primeria varten, ja joka ei mene päällekkäin kloonista 5h peräisin olevien primereiden sekvenssien kanssa. Koettimen sekvenssi on 10 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3' IV.N. 1. HCV-n r.DNA__kirjastrm lnnminpn infektoidun NANRHta sairastavan gimpang-15 gin makgagta

Luotiin HCV:n cDNA-kiijasto sellaisen simpanssin maksasta, josta oli luotu osan IV.A.l HCV:n cDNA-kiijasto. Tekniikka kiijaston luomiseksi oli samanlainen kuin se. jota käytettiin osassa IV.A.24., paitsi, että käytettiin tätä erilaista RNA:n lähdettä ja että 20 primeri perustui kloonin 11b HCV:n cDNA-sekvenssiin. Primerin sekvenssi oli 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' IV.N.2. Kloonissa k9U olevan HCV:n c.DNA n kloonin 1 lh r.DNA:n kanssa päälkkz 25 Wain mcnpvii nnlf lentiriigpikvpnggi ja prigtflminpn

Klooni k9-l eristettiin HCV.n cDNA-kiijastosta, joka oli luotu NANBH-infektoidun simpanssin maksasta, kuten kuvattiin osassa IV.A.25. Kiijasto seulottiin sellaisten kloonien suhteen, jotka menevät päällekkäin kloonin 11b sekvenssin kanssa käyttäen 20 kloonia, joka menee päällekkäin kloonin 11b kanssa 5'-päässä, kloonia lie. Kloonin 11b sekvenssi on esitetty kuviossa 23. Positiiviset kloonit eristettiin taajuudella 1 500000:sta. Yhtä eristettyä kloonia, k9-l, tutkittiin tarkemmin. Kloonin k9-l HCV:n cDNA:n päällekkäin menevä luonne kuvion 26 HCV:n cDNA:n 5'-pään kanssa varmistettiin tutkimalla kloonia kloonilla Alex46; jälkimmäinen klooni sisältää HCV:n cDNA-35 sekvenssin, jossa on 30 emäsparia, jotka vastaavat niitä emäspareja ylläkuvatun kloonin 14i HCV:n cDNA:n 5'-päässä.

105652 115

Kloonista k9-l eristetynHCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin käyttäen tekniikoita, joita kuvattiin yllä. Kloonin k9-l HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäisyys kuvion 26 HCV:n cDNA:n kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 46. Kloonin k9-l HCV:n cDNA-sekvenssi on rinnakkainen niiden sekvenssien 5 kanssa, jotka ovat klooneissa, joita on kuvattu osassa IV.A.19. yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssin luomiseksi, jolloin k9-l-sekvenssi on asetettu ylävirtaan kuviossa 32 esitetystä sekvenssistä. Yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, joka sisältää k9-l -sekvenssin ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 47.

10 Kuviossa 47 esitetyn HCV:n cDNA:n 5'-alueeseen koodattujen aminohappojen sekvenssiä on verrattu yllä kuvattujen Dengue-viruskantojen vastaavaan alueeseen alueiden hydrofobisuuden ja hydrofiilisyyden suhteen. Tämä vertailu osoitti, että HCV:n ja tälle alueelle koodatun Dengue-viruksen, mikä vastaa NS1 :tä (tai osaa siitä) koodaavaa aluetta, polypeptidit ovat hydrofobisuus-/hydrofiilisyysprofiileiltaan samanlaisia.

15

Alla annettu tieto sallii HCV-kantojen identifioinnin. Muiden HCV-kantojen eristäminen ja karakterisointi voidaan suorittaa eristämällä nukleiinihappoja ruumiin osista, jotka sisältävät viruspartikkeleita, luomalla cDNA-kiijastoja käyttäen poly-nukleotidikoettimia, jotka perustuvat alla kuvattuihin HCV:n cDNA-koettimiin, seuloko maila kiijastoja sellaisten kloonien varalta, jotka sisältävät alla kuvattuja HCV:n cDNA-sekvenssejä ja vertaamalla uusista eristetyistä osista olevia HCV:n cDNA.oita alla kuvattuihin cDNA:oihin. Niihin tai virusgenomiin koodattuja polypeptidejä voidaan tark-kaillaimmunologisen ristireagoivuuden suhteen käyttäen yllä kuvattuja polypeptidejä ja vasta-aineita. Kannat, jotka sopivat HCV:n parametreihin, kuten on kuvattu yllä olevas- ·; 25 sa Määritelmät-osassa, voidaan identifioida helposti. Muut menetelmät HCV-kantojen • « identifioimiseksi ovat ilmeisiä alan ammattilaisille perustuen tässä annettuun tietoon.

Keksinnöllä on, lukuisissa tässä esitetyissä ilmenemismuodoissaan, monia teollisia käyttöjä, joista muutamat ovat seuraavia. HCV:n cDNA:oita voidaan käyttää koettimien 50 suunnitteluun HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseeen näytteissä. cDNA:oista peräisin olevia koettimia voidaan käyttää HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseen esimerkiksi kemiallisissa synteettisissä reaktioissa. Niitä voidaan käyttää myös seulontaohjelmissa antiviraalisia aineita varten, aineiden tehon määrittämiseen estämään virusreplikaatiota soluviljelyjäijestelmissä ja eläinmallijäijestelmissä. HCV-polynukleotidikoettimet ovat 55 myös hyödyllisiä virusnukleiinihappojen osoittamisessa ihmisissä ja täten ne voivat toimia perusteena HCV-infektion diagnosoimiseksi ihmisissä.

116 105652

Yllä olevan lisäksi tässä esitetyt cDNA:t antavat tietoa ja välineet HCV:n epitooppeja sisältävien polypeptidien syntetisoimiseksi. Nämä polypeptidit ovat hyödyllisiä osoitettaessa vasta-aineita HCV-antigeeneille. Tässä kuvataan saija immunologisia analyysejä HCV-infektiolle perustuen yhdistelmäpolypeptideihin, jotka sisältävät HCV-5 epitooppeja ja ne ovat kaupallisesti käytettävissä diagnosoitaessa HCV:n aiheuttamaa NANBH:a, seulottaessa veripankkien luovuttajia HCV:n aiheuttaman tarttuvan maksatulehduksen varalta ja myös osoittamaan saastunut veri, joka tulee tartuttavista verenluovuttajista. Virusantigeeneillä on myös käyttöä tarkkailtaessa antiviraalisien aineiden tehoa eläinmallijäijestelmissä.

10 HCV:n cDNA:oista peräisin olevat polypeptidit ovat käyttökelpoisia, yllä kuvattujen käyttöjen lisäksi, anti-HCV-vasta-aineiden synnyttämiseksi. Kuitenkin vasta-aineet, jotka ovat syntyneet HCV-polypeptideillä tapahtuneen immunisoinnin seurauksena, ovat myös käyttökelpoisia osoitettaessa virusantigeenien läsnäolo näytteessä. Täten niitä 15 voidaan käyttää HCV-polypeptidien tuotannon analysoimiseen kemiallisissa järjestelmissä. HCV:n vastaisia vasta-aineita voidaan käyttää myös tarkkailemaan virustenvas-taisten aineiden tehoa seulontaohjelmissa, joissa näitä aineita testataan kudosviljelyjär-jestelmissä. Niitä voidaan käyttää diagnosoimaan HCV:n aiheuttamaa NANBH:a sallimalla virusantigeenien osoittaminen sekä verenluovuttajissa että -vastaanottajissa. 20 Toinen tärkeä käyttö HCV:n vastaisille vasta-aineille on affiniteettikromatografiassa viruksen ja viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistettu virus voi olla myös hyödyllinen soluviljelyjäijestelmien kehittämisessä, joissa jäijestelmissä HCV replikoituu.

Soluviljelyjärjestelmällä, joka sisältää HCV-infektoituneita soluja, on monia käyttöjä. ; 25 Niitä voidaan käyttää suhteellisen laajamittaiseen HCV:n tuotantoon, mikä on normaa listi alhaisen tiitterin virus. Nämä järjestelmät ovat myös hyödyllisiä viruksen molekyylibiologian selvittämiseen ja ne voivat johtaa virustenvastaisten aineiden kehittämiseen. Soluviljelyjärjestelmät ovat myös hyödyllisiä virustenvastaisten aineiden tehon seulonnassa. Lisäksi HCV:a sisältävät soluviljelyjärjestelmät ovat hyödyllisiä heikennettyjen 30 HCV-kantojen tuottamiseen.

Mukavuuden vuoksi HCV:n vastaiset vasta-aineet ja HCV-polypeptidit, joko luonnolliset tai yhdistelmät, voidaan pakata välinepakkauksiin.

Menetelmä, jota käytetään HCV:n cDNA:n eristämiseen ja joka käsittää cDNA-35 kirjaston valmistamisen ollen peräisin yksilön infektoituneesta kudoksesta ekspres-siovektoriin ja sellaisten kloonien valitsemisen, jotka tuottavat ekspressiotuotteita, jotka reagoivat immunologisestivasta-aineiden kanssa vasta-aineita sisältävissä muiden infek- i

Claims (22)

105652 117 toineiden yksilöiden, muttei infektoitumattomien yksilöiden, ruumiin osissa, voivat olla myös käyttökelpoisia cDNA:oitten eristämiseksi, jotka ovat peräisin muista tähän asti tuntemattomista, sairauteen liittyvistä aineista, jotka muodostuvat genomiosista. Tämä voisi vuorostaan johtaa näiden aineiden eristämiseen ja karakterisointiin ja diagnostisiin 5 reagensseihin näitä sairauksiin liittyviä aineita varten. , Patentti vaatinu ikset 10 l. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-HCV-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro.

1. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en

25 HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerl ig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 47, och kan användas ' för konstaterande av av antikroppar mot HCV (anti-HCV antikroppar) in vitro.

2. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en 30 HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosyror kodad i sekvensen enligt figur 14, och kan användas för konstaterande av av antikroppar mot HCV (anti-HCV antikroppar) in vitro. 122 105652

2. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastaisen vasta-aineen (anti-HCV-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro.

3. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosy-ror kodad i sekvensen enligt figur 26, och kan användas för konstaterande av av anti- 5 kroppar mot HCV (anti-HCV antikroppar) in vitro.

3. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssinpä sitä voidaan käyttää HCV:n vastai-·· sen vasta-aineen (anti-HCV-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro.

4. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosy-ror kodad i sekvensen enligt figur 32, och kan användas för konstaterande av av anti- 1° kroppar mot HCV (anti-HCV antikroppar) in vitro.

4. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin, ja sitä voidaan käyttää HCV:n vastai- t sen vasta-aineen (anti-HCV-vasta-aineen) toteamiseksi in vitro.

5. En polypeptid i väsentligen isolerad form, kännetecknad därav att den omfattar en HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 aminosy-ror kodad inom lambda-gtl 1 cDNA-biblioteket deponerat i American Type Culture Col- 15 lection (ATCC) under referensnummer 40394.

5. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polypeptidi, tunnettu siitä, että se käsittää HCV-antigeenisen determinantin ja sisältää jatkuvan, American Type Culture Collecti-on:iin (ATCC) viitenumerolla 40394 talletetun lambda-gtl 1 cDNA-kiijastossa koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin. 105652 118

6. En polypeptid enligt nägon av patentkrav 1-5, kännetecknad därav att den kontinu-erliga sekvensen omfattar minst 10 aminosyror.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että jatkuva sekvenssi käsittää vähintään 10 aminohappoa.

7. En polypeptid enligt nägon av patentkrav 1-5, kännetecknad därav att den kontinu- erliga sekvensen omfattar minst 15 aminosyror. • V

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että jatkuva sekvenssi käsittää vähintään 15 aminohappoa.

8. Fusionsprotein, kännetecknat därav att det omfattar en polypeptid enligt nägon av patentkrav 1-7 väri nämnda kontinuerliga sekvens är fusionerad tili en icke-HCV- 25 aminosyrasekvensvald ur gruppen superoxiddismutassekvens, betagalaktosidassekvens, sekvens vilken möjliggör utsöndring, sekvens vilken möjliggör partikelformation, pre-sekvens för hepatit-B yta samt antigensekvens för hepatit-B yta.

8. Fuusioproteiini, tunnettu siitä että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen polypeptidin missä mainittu jatkuva sekvenssi on fuusioitunut ei-HCV amino-l o happosekvenssiin joka on valittu ryhmästä superoksididismutaasisekvenssi, beetagalak-tosidaasisekvenssi, erittymisen mahdollistava sekvenssi, partikkelin muodostumisen mahdollistava sekvenssi, hepatiitti-B-pinnan esisekvenssi ja hepatiitti-B pinta-antigeenisekvenssi.

9. Utrustningsförpackning för en immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad 30 därav att den omfattar en polypeptid enligt nägot av patentkrav 1 -8 i ett lämpligt kärl. ... 10. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne- i 105652 123 tecknad därav att den omfattar följande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-HCV anti-kroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 47 och omfattande minst 8 aminosyror; 5 (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket » innehäller nämnda polypeptid.

9. Immunologisen määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaista polypeptidiä sopivassa astiassa.

10. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 20 (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine -25 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä.

11. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne- tecknad därav att den omfattar följande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-HCV antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en kontinuerlig se-kvens om minst 8 aminosyror, kodad inom lambda-gtll cDNA-biblioteket deponerat 15 vid American Type Culture Collection (ATCC) med referensnumret 40394; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehäller nämnda polypeptid. 20

11. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: .. (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti- 119 105652 HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää jatkuvan, American Type Culture Collection:iin (ATCC) viitenumerolla 40394 talletetun lambda-gtl 1 cDNA-kiijastossa koodatun vähintään 8 aminohapon sekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine -5 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä.

12. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne- .: tecknad därav att den omfattar följande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-HCV antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens 25 kodad i sekvensen enligt figur M och omfattande minst 8 aminosyror; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehäller nämnda polypeptid. 30

12. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu 1 o siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti-HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; 15 (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine · antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua polypeptidiä. 20

13. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne- ... tecknad därav att den omfattar följ ande steg: 124 105652 (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-HCV anti-kroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 26 och omfattande minst 8 aminosyror; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhitllanden vilka 5 möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket innehAller nämnda polypeptid.

13. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu ;· siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti-HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää 25 kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; * (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine - antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine · antigeenikompleksia joka käsittää mainittua 30 polypeptidiä. . 105652 120

14. En immunologisk bestämningsmetod för bestämning av antikroppar in vitro, känne-10 tecknad därav att den omfattar följande steg: (a) en polypeptid tas i bruk vilken ofattar en antigen determinant som anti-HCV antikroppar kan binda, varvid nämnda antigena determinant omfattar en aminosyrasekvens kodad i sekvensen enligt figur 26 och omfattande minst 8 aminosyror; (b) ett biologiskt prov inkuberas in vitro med nämnda polypeptid i förhällanden vilka 15 möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket inneMller nämnda polypeptid.

14. Immunologinen määritysmenetelmä vasta-aineen määrittämiseksi in vitro, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön polypeptidi, joka käsittää antigeenisen determinantin jonka anti-HCV vasta-aine pystyy sitomaan, jolloin mainittu antigeeninen determinantti käsittää 5 kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä koodatun jatkuvan, ainakin 8 aminohappoa käsittävän aminohapposekvenssin; (b) inkuboidaan biologinen näyte in vitro mainitun polypeptidin kanssa vasta-aine -antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää mainittua 10 polypeptidiä.

15. Antikroppkomposition, kännetecknad därav att den är en anti-HCV-20 antikroppkomposition som omfattar antikroppar vilka binder en HCV-antigen determinant i en polypeptid enligt nägot av patentkrav 1-8, och vilken antikroppkombination är ; (a) en renad produkt av polyklonala antikroppar, (b) en produkt av monoklonala anti kroppar.

15. Vasta-ainekoostumus, tunnettu siitä, että se on anti-HCV-vasta-ainekoostumus joka käsittää vasta-aineita jotka sitovat HCV:n antigeenistä determinanttia jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukaisessa polypeptidissä, ja joka vasta-ainekoostumus on (a) puh- 15 distettu valmiste polyklonaalisista vasta-aineista, (b) koostumus monoklonaalisista vasta-aineista.

16. En komposition enligt patentkrav 15, kännetecknad därav att anti-HCV- antikroppama är bundna till en fast bärare. • ·

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että anti-HCV vasta-aineet ovat sidottuina kiinteään kantajaan. 20

17. Utrustningsförpackning för en immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad därav att den omfattar en polypeptid enligt patentkrav 15 eller 16 i ett lämpligt kärl. 30 18. .En immunologisk bestämningsmetod, kännetecknad därav att därmed konstateras .. HCV-antigen i ett prov, och den omfattar följande steg: 125 105652 (a) en anti-HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15 eller 16 tas i bruk; (b) ett biologisia prov inkuberas med nämnda anti-HCV-antikroppkomposition i forhal-landen vilka möjliggör uppkomst av ett antikropp-antigenkomplex, och (c) en bestämning görs huruvida ett ett antikropp-antigenkomplex uppkommer, vilket 5 innehAller anti-HC V -antikroppar.

17. Immunologisen määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää : patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukaista anti-HCV-vasta-ainekoostumusta sopivassa as tiassa.

18. Immunologinen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että sillä todetaan näytteestä HCV-antigeeniä ja menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan käyttöön patenttivaatimuksen 15 tai 16 mukainen anti-HCV-vasta-ainekoostumus; (b) inkuboidaan näyte mainitun anti-HCV-vasta-ainekoostumuksen kanssa vasta-aine -30 antigeenikompleksin muodostumisen mahdollistavissa olosuhteissa, ja (c) määritetään, muodostuuko vasta-aine - antigeenikompleksia joka käsittää anti-HCV -vasta-ainetta. 105652 121

19. En väsentligen isolerad polypeptid för användning vid framställning av en anti- Ύ __________ HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15,, kännetecknad därav att den omfat-tar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino-1 o syror, kodad i sekvensen enligt figur 47.

19. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-HCV - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 47 esitetyssä sekvenssissä kooda- 5 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin.

20. En väsentligen isolerad polypeptid för användning vid framställning av en anti-HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15,, kännetecknad därav att den omfat-tar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 15 syror, kodad i sekvensen enligt figur 14.

20. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-HCV - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 14 esitetyssä sekvenssissä kooda- i o tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin.

21. En väsentligen isolerad polypeptid för användning vid framställning av en anti-HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15,, kännetecknad därav att den omfat-tar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 20 syror, kodad i sekvensen enligt figur 26.

21. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-HCV - vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 26 esitetyssä sekvenssissä kooda- 15 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin.

22. Olennaisesti eristetty polypeptidi käytettäväksi patenttivaatimuksen 15 mukaisen anti-HCV · vasta-ainekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää HCV-antigeenistä determinanttia ja sisältää kuviossa 32 esitetyssä sekvenssissä kooda- 20 tun, vähintään 8 aminohapon jatkuvan sekvenssin. : Eatenlkrav

22. En väsentligen isolerad polypeptid för användning vid framställning av en anti-HCV-antikroppkomposition enligt patentkrav 15,, kännetecknad därav att den omfat-tar HCV-antigen determinant och innehäller en kontinuerlig sekvens om minst 8 amino- 25 syror,kodadi sekvensenenligtfigur 32. « ··