JP2810032B2 - Ｎａｎｂｖの診断用薬 - Google Patents

Ｎａｎｂｖの診断用薬

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野 本発明は，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（NANBV ）伝染の流
行を処置するための材料および方法に関する。さらに詳
しくは，本発明は，診断用DNA 断片，診断用タンパク，
診断用抗体，そしてNANB型肝炎の病因因子（すなわち，
Ｃ型肝炎ウイルス）に対する防御抗原および防御抗体に
関する。
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あるいはウイルスが誘発すると考えられている疾患群お
よびウイルスに関連する他の形態の肝臓疾患とは区別し
得る疾患群に属する。これらの疾患には，周知の肝炎ウ
イルス（すなわち，Ａ型肝炎ウイルス（HAV ），Ｂ型肝
炎ウイルス（HBV），Δ型肝炎ウイルス（HDV），および
サイトメガロウイルス（CMV ）またはエプスタイン−バ
ーウイルス（EBV ））により引き起こされる疾患が包含
される。NANBH は輸血した個体において初めて同定され
た。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー
間における一連の継代は，NANBH が１種または複数種の
伝染性感染因子によるという証拠を与える。しかしなが
ら，NANBH の原因である伝染性因子はまだ同定されてお
らず，疾患の原因となる因子の数も知られていない。
【０００３】疫学的証拠によると，NANBH には次の３つ
の型があると示唆される：つまり，飲料水媒介の流行
型；血液または注射針に関連する型；および散発（集団
獲得（community acquired））型の３つの型である。し
かしながら，NANBH の原因となり得る因子の数は知られ
ていない。
【０００４】NANBH の臨床における診断および同定は，
他のウイルスマーカーを排除することにより，まず行わ
れてきた。推定されるNANBV 抗原および抗体を検出する
ために用いられる方法には，寒天ゲル拡散法，対向免疫
電気泳動法，免疫蛍光顕微鏡法，免疫電子顕微鏡法，放
射性免疫検定法，および酵素結合免疫吸着検定法があ
る。しかしながら，これらの検定法はいずれも，NANBH
に関する診断検査として用いるのに充分感度が高く，特
異的であり，かつ再現性があるとは示されていない。
【０００５】これまで，NANBH 因子に関連する抗原抗体
系の同一性または特異性に関しては，明確ではなく，し
かも一致することはなかった。これは，その少なくとも
一部は，以下のことが原因である：つまり，個体におけ
るHBV の前感染またはNANBVとの同時感染；HBV に関連
する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑さ；および肝臓細
胞のゲノムへのHBV DNA の組込みである。さらに，NANB
H が１種より多くの病原体により引き起こされる可能
性，およびNANBH が誤診されてきた可能性がある。ま
た，血漿学的な検定法により，NANBH 患者の血清中に何
が検出されるかは不明であった。寒天ゲル拡散法および
対向免疫電気泳動法によれば，血清検体間に時々生じる
自動免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は検出
されるが，特異的なNANBV 抗原−抗体反応は示されない
と考えられてきた。免疫蛍光法，酵素結合免疫吸着検定
法，および放射性免疫検定法によれば，NANBH 患者の血
清中，ならびに他の肝臓疾患および非肝臓疾患を有する
患者においても，しばしば存在するリウマチ因子様物質
が低レベルで検出されるようである。検出された反応性
のいくつかは，宿主により定まる細胞質抗原に対して抗
体を表現し得る。
【０００６】NANBVの候補となるものは，数多く存在す
る。例えば，Prince（1983），FeistoneおよびHoofnagl
e （1984），そしてOverby（1985，1986，1987）による
総説，ならびにIwarson （1987）による論文を参照にさ
れたい。しかしながら，これらの候補がNANBH の病因因
子に相当するという証拠はない。
【０００７】NANBV のキャリア，およびNANBV で汚染さ
れた血液または血液製剤をスクリーニングしかつ同定す
るための感度が高く特異的な方法が非常に要求されてい
る。輸血後肝炎（PTH ）は輸血された患者の約10％にお
いて発生する。この場合，90％までがNANBH である。こ
の疾患における大きな問題は，しばしば慢性的な肝臓損
傷へ進行することである（25〜55％）。
【０００８】患者を看護し，血液および血液製剤による
NANBH の感染あるいは個体が緊密に接触することにより
起こるNANBH の感染を予防するために，NANBV に関する
核酸，抗原，および抗体を検出する信頼性の高い診断手
段および予診手段が必要とされている。さらに，この疾
患を予防および／または処置するための効果的なワクチ
ンおよび免疫療法剤も必要とされている。
【０００９】発明の開示 本発明は，新しく発見されたNANBV 病因因子であるＣ型
肝炎ウイルス（HCV ）の単離および特徴付けに関する。
さらに詳しくは，本発明は，HCV ゲノムの部分的なcDNA
複製物群を提供する。これらのcDNA複製物は，以下の新
規な工程を包含する方法により単離された：つまり，こ
れまでに単離も特徴付けもされていないウイルス因子の
ゲノムから誘導される新しく合成された抗原を検出する
ために，NANBH 患者の血清で感染した組織中の粒子状因
子から調製されたcDNAライブラリー由来の発見産物をス
クリーニングする工程；および非感染個体に比べて感染
個体の血清とのみ免疫学的に反応する産物を生産するク
ローンを選択する工程である。
【００１０】HCV cDNAから誘導されたプローブを利用し
たHCV ゲノムの性質，およびHCV cDNA内に含まれる配列
情報に関する研究は，HCV がフラビウイルスまたはフラ
ビ様ウイルスであることを示唆している。
【００１１】HCV から誘導されたcDNA配列の一部は，試
料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとし
て，および天然に存在するウイルスの変異型を単離する
ためのプローブとして有用である。これらのcDNAを用い
れば，HCV ゲノム内にコードされているHCV 抗原の有効
なポリペプチド配列を調製し，診断検査における標準ま
たは試薬として，および／またはワクチンの成分として
有用なポリペプチドを生産することができる。これらの
ポリペプチド配列内に含まれるHCV エピトープに対する
抗体は，ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
のいずれもが，診断検査に，治療薬として，抗ウイルス
剤のスクリーニングに，そしてこれらのcDNAから誘導さ
れるNANBV 因子の単離に有用である。さらに，これらの
cDNAから誘導されるプローブを利用することにより，HC
V ゲノムの他の部分を単離し，かつ配列決定することが
できる。従って，NANBH の診断および／または処置，予
防および治療の両方に有用な追加のプローブおよびポリ
ペプチドが提供される。
【００１２】従って，ポリヌクレオチドに関する本発明
のいくつかの局面は以下のとおりである：精製されたHC
Vポリヌクレオチド；組換えHCV ポリヌクレオチド；HCV
ゲノムまたはHCV cDNAに由来する配列を有する組換え
ポリヌクレオチド；HCV のエピトープをコードする組換
えポリヌクレオチド；上記の組換えポリヌクレオチドの
いずれかを有する組換えベクター；およびこれらベクタ
ーのいずれかで形質転換された宿主細胞。
【００１３】本発明の他の局面は以下のとおりである：
HCV ゲノムまたはHCV cDNAに由来するDNA のオープンリ
ーディングフレーム（ORF ）を有する組換え発現系であ
って，該ORF が所望の宿主と適合し得る制御配列に対し
て作動可能なように連結されている，組換え発現系；該
組換え発現系で形質転換された細胞；および該形質転換
細胞により生産されるポリペプチド。
【００１４】本発明のさらに他の局面は以下のとおりで
ある：精製されたHCV ；該精製HCVに由来するポリペプ
チドの調製物；精製されたHCV ポリペプチド；およびHC
V に含まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみな
し得るエピトープを有する精製されたポリペプチド。
【００１５】本発明には以下の局面も包含される：組換
えHCV ポリペプチド；HCV ゲノムまたはHCV cDNAに由来
する配列を有する組換えポリペプチド；HCV エピトープ
を有する組換えポリペプチド；およびHCV ポリペプチド
を有する融合ポリペプチド。本発明には以下のものも包
含される：HCV エピトープに対するモノクローナル抗
体；およびHCV エピトープに対するポリクローナル抗体
の精製された調製物。本発明の他の局面は，HCV 感染に
対して免疫原性の粒子であって，真核生物宿主内で生産
される場合に粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非
HCV ポリペプチドと，HCV エピトープを有する粒子であ
る。
【００１６】本発明のさらに他の局面は，HCV に対する
ポリヌクレオチドプローブである。キットに関する本発
明の局面は以下のようなキットである：HCV に由来する
ポリヌクレオチドの存在について試料を分析するための
キットであって，適当な容器内に，約８個またはそれ以
上のヌクレオチドからなるHCV 由来のヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチドプローブを有するキット；HCV
抗原の存在について試料を分析するためのキットであっ
て，適当な容器内に，検出されるべきHCV 抗原に対する
抗体を有するキット；HCV 抗原に対する抗体の存在につ
いて試料を分析するためのキットであって，適当な容器
内に，HCV 抗原に存在するHCV エピトープを含むポリペ
プチドを有するキットである。
【００１７】本発明の他の局面は，固体担体に付着させ
た，HCV エピトープを有するポリペプチド；および固体
担体に付着させた，HCV エピトープに対する抗体であ
る。
【００１８】本発明のさらに他の局面は以下のような方
法である：HCV エピトープを含むポリペプチドを生産す
る方法であって，HCV エピトープを含むポリペプチドを
コードする配列を含む発現ベクターで形質転換させた宿
主細胞を，該ポリペプチドを発現させる条件下でインキ
ュベートすること，を包含する生産方法；およびこの方
法により生産された，HCV エピトープを含むポリペプチ
ド。
【００１９】本発明はまた，以下のような方法も包含す
る：試料中のHCV 核酸を検出する方法であって，該試料
の核酸を，HCV ポリヌクレオチドに対するプローブと，
該プローブと該試料由来のHCV 核酸との間にポリヌクレ
オチド二本鎖を形成する条件下で反応させること；およ
び核プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出する
こと，を包含する検出方法。
【００２０】免疫学的検定法もまた，本発明に包含され
る。これらの免疫学的検定法には，以下のような工程を
包含するHCV 抗原を検出するための免疫学的検定法が包
含される：HCV 抗原を含んでいる疑いのある試料を，検
出されるべきHCV 抗原に対するプローブ抗体と共に，抗
原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベートする
こと；および該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を
検出すること。以下の工程を包含するHCV 抗原に対する
抗体を検出するための免疫学的検定法：抗HCV抗体を含
んでいる疑いのある試料を，HCV のエピトープを含むプ
ローブポリペプチドと共に，抗体−抗原複合体を形成す
る条件下でインキュベートすること；および該プローブ
抗原を含む抗体−抗原複合体を検出すること。
【００２１】本発明には以下のものも包含される：HCV
感染を処置するためのワクチンであって，HCV エピトー
プを含む免疫原性ペプチド，不活性化されたHCV調製
物，または弱毒化されたHCV 調製物を含有するワクチ
ン。
【００２２】本発明の他の局面は，HCV に感染した組織
培養増殖細胞である。
【００２３】本発明のさらに他の局面は，HCV に対する
抗体を生産する方法であって，HCVエピトープを含む単
離された免疫原性ポリペプチドを，免疫反応を生ずるの
に充分な量で個体に投与することを包含する生産方法で
ある。
【００２４】本発明のさらに他の局面は，未確認の感染
因子のゲノムに由来するcDNAを単離する方法であって，
該方法は以下の工程(a)〜(f)を包含する：(a)該感染因
子に感染した組織から単離された核酸から調製されたcD
NAライブラリーを含む発現ベクターで形質転換させた宿
主細胞を用意し，該cDNAにコードされたポリペプチドを
発現する条件下で該宿主細胞を増殖させること；(b)該c
DNAの発現産物を，該感染因子に感染した個体の抗体含
有身体構成部分と，免疫反応を起こす条件下で反応さ
せ，その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出
すること；(c)該工程(b)の抗体−抗原複合体を形成する
ポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々のクローンと
して増殖する条件下で増殖させ，該クローンを単離する
こと；(d)該工程(c)のクローン由来の細胞を，該cDNA内
にコードされたポリペプチドを発現する条件下で増殖さ
せ，該発現産物を，該工程(a)の個体以外の個体であっ
て該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部
分および該感染因子に感染していない対照個体と反応さ
せ，その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出
すること；(e)感染した個体および感染している疑いの
ある個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体
を形成するが，対照個体の該部分からは抗体−抗原複合
体を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を，個
々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ，該クロ
ーンを単離すること；および(f)該工程(e)の宿主細胞ク
ローンからcDNAを単離すること。
【００２５】発明を実施する方法 Ｉ．定義 「Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus ）」という用
語は，非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH ）の従来知られていなか
った病原因子に対して，この分野の研究者が保留してい
た用語である。従って，本願で用いる場合，「Ｃ型肝炎
ウイルス（HCV） という用語はNANBHの病原因子を意味
し，またこのNANBHは，以前にはNANBVおよび／またはBB
-NANBVと呼ばれていたものである。本願では，HCV ，NA
NBV およびBB-NANBVという用語を互換性のある語として
使用する。この用語法を拡張して，以前はNANB肝炎（NA
NBH ）と呼んでいたHCV によって発病する疾患をＣ型肝
炎と呼ぶ。本願では，NANBH とＣ型肝炎という用語を互
換性のある語として使用してもよい。
【００２６】「HCV」という用語は，本願で用いる場
合，NANBHを発病させるウイルス種および弱毒化された
ウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味する。
後に述べるように，HCV ゲノムは，RNA で構成されてい
る。RNA を含有するウイルスの偶発変異率が比較的高い
ということが知られており，すなわち約10-3〜10-4／ヌ
クレオチドであると報告されている〔フィールズとナイ
プ（Fields and Knipe）1986年〕。それ故，後に述べる
HCV 種の中には，多くのウイルス株がある。本願記載の
組成物と方法によって，種々の関連ウイルス株の増殖，
同定，検出および単離を行うことができる。さらに各種
ウイルス株に対する診断薬とワクチンを製造することが
でき，また薬理学的用途の抗ウイルス剤を，HCV の複製
を阻害するということによりスクリーニングすることが
できる。
【００２７】本願で提供する情報は，ある種のHCV株由
来のものであり， このウイルス株は以後 CDC／HCV1と
呼ぶが，ウイルス分離学者がこの種に属する他のウイル
ス株を同定するのに充分なものである。本願に記載する
ように，本願の発明者らは，HCV がフラビウイルス（Fl
avivirus）またはフラビ様ウイルス（Flavi-like viru
s）であることを発見した。フラビウイルス粒子の形態
と組成は公知であり，ブリントン（Brinton,1986年）が
考察している。形態については，一般にフラビウイルス
類は，脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有
している。ビリオンは球形で直径が約40〜50nmである。
そのコアは直径が約25〜30nmである。ビリオンのエンベ
ロープの外面には，直径が約２nmの端末ノブ（terminal
knob ）を有する約５〜10nm長の突起を有する。
【００２８】HCV は，本願に記載のcDNAが誘導されるHC
V ゲノム内のエピトープと免疫学的に同定可能なエピト
ープをコードするが，このエピトープは本願に記載のcD
NA内にコードされることが好ましい。このエピトープ
は，他の公知のフラビウイルス類と比較した場合，HCV
に特有のものである。このエピトープの独自性は，HCV
との免疫学的反応性と，他のフラビウイルス種との免疫
学的反応性の欠如とによって決定することができる。免
疫学的反応性を決定する方法は当該技術分野では公知で
あり，例えば，放射性免疫検定法，ELISA 法，血球凝集
反応法などがあり，分析技術の適切ないくつかの例を本
願に示す。
【００２９】上記に加えて，ウイルス株をHCV として同
定する際に，単独もしくは組合わせて，下記のパラメー
タを利用することができる。HCV 株は，進化論的に関連
しているので，ヌクレオチドレベルでのゲノムの全相同
性は，約40％以上であり，好ましくは約60％以上で，さ
らに好ましくは約80％以上であり，さらに少なくとも約
13のヌクレオチドの対応する連続配列があると考えられ
る。推定上のHCV 株のゲノム配列とCDC／CH1 HCV のcD
NA配列との同一性は，当該技術分野で公知の技術によっ
て決定することができる。例えば，推定上のHCV 由来の
ポリヌクレオチドの配列情報と，本願に記載のHCV cDNA
配列とを直接比較することによって決定することができ
る。また例えば，相同領域間の安定な二本鎖を形成する
条件下（例えば，S1消化の前に用いられる条件）でポリ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーションし，次いで一本
鎖に特異的なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断
し，次に切断によって生成した断片の大きさを測定する
ことによって決定することができる。
【００３０】HCV 株の進化的類縁関係のために，推定上
のHCV 株は，ポリペプチドのレベルの，その相同性によ
って同定可能である。一般にHCV 株は，ポリペプチドの
レベルで，約40％以上相同であり，好ましくは約60％以
上，さらに好ましくは80％以上相同である。アミノ酸配
列の相同性を決定する技術は，当該技術分野で知られて
いる。例えば，アミノ酸配列を直接決定して，本願に示
した配列と比較することができる。また例えば，推定上
のHCV のゲノム物質のヌクレオチド配列を決定してもよ
く（通常，cDNA中間体を介して），これにコードされて
いるアミノ酸配列は決定可能で，対応する領域を比較す
ることができる。
【００３１】本願で使用される場合，指定された配列
（例えば，HCV cDNA，特に第１〜46図に例示した配列）
か，またはHCV ゲノム「由来」のポリヌクレオチドは，
少なくとも約６個の対応するヌクレオチド配列からな
り，好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド，さら
に好ましくは少なくとも約10〜12個のヌクレオチド，さ
らに好ましくは少なくとも約15〜20個のヌクレオチドの
配列からなる対応するポリヌクレオチド配列を意味す
る。つまり，これらのヌクレオチドは，指定されたヌク
レオチド配列の領域に相同か，または相補的である。上
記ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列は，HCV ゲ
ノムに特有の配列に相同または相補的であるのが好まし
い。一つの配列がHCV ゲノムに特有のものであるか否か
は当業者に公知の技術で決定することができる。例え
ば，その配列を，データバンク，例えばジーンバンク
（genebank）の配列と比較して，未感染の宿主または他
の生物に存在するか否かを決定する。またその配列は，
公知の配列を有する他のウイルス因子，すなわち，肝
炎，例えば，HAV ，HBV およびHDV を誘発することが知
られているウイルス因子，ならびにフラビウイルス科の
ウイルス（Fraviviridae）の他のメンバーと比較するこ
ともできる。また，誘導された配列が他の配列と一致し
ているかまたは一致していないかは，適切な厳密条件下
でハイブリダイゼーションさせることによって決定する
ことができる。核酸の配列の相補性を決定するためのハ
イブリダイゼーション技術は，当該技術分野で公知であ
り，後に検討する。例えば，マニアチスら（maniatis e
t al，1982年）の文献を参照せよ。さらにハイブリダイ
ゼーションによって形成された，不適正な二本鎖のポリ
ヌクレオチドも公知の方法で決定することができ，この
方法には，例えば，S1のようなヌクレアーゼによって，
二本鎖のポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に切断
する方法がある。代表的なDNA 配列が「誘導される」領
域は，例えば，特異的なエピトープをコードする領域お
よび転写されない領域および／または翻訳されない領域
を含むが，これに限定されるものではない。
【００３２】誘導されたポリヌクレオチドは，必らずし
も，提示されたヌクレオチド配列が物理的に誘導される
とは限らず，いずれの方法で生成されていてもよい。例
えば，化学合成法，DNA 複製法，逆転写法または転写法
が挙げられ，これらの方法は，ポリヌクレオチドが誘導
される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供する
情報に基づいて実施される。さらに，指定された配列の
領域に対応する領域の組合わせは，当該技術分野で公知
の方法で改変され，意図する用途に合致させることがで
きる。
【００３３】同様に，指定された核酸の配列（例えば，
第１〜46図に示す配列）またはHCVゲノム「から誘導さ
れた」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は，上記の配
列にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列もし
くはその一部分の配列（少なくとも３〜５のアミノ酸，
好ましくは少なくとも８〜10のアミノ酸，さらに好まし
くは少なくとも11〜15のアミノ酸で構成された部分）と
同じアミノ酸配列を有するポリペプチド，または上記の
配列にコードされているポリペプチドと免疫学的に同定
しうるポリペプチドを意味する。
【００３４】組換え体ポリペプチドもしくは誘導された
ポリペプチドは，指定された核酸配列（例えば第１〜34
図に示す配列），またはHCV ゲノムから必らずしも翻訳
される必要はなく，例えば化学合成法もしくは組換え体
発現系の発現もしくは変異HCV からの単離を含むいずれ
の方法でも生成され得る。
【００３５】本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチ
ド」という用語は，ゲノム，cDNA，半合成もしくは合成
の起源のポリヌクレオチドを意味し，その起源もしくは
操作によって，(1) 天然もしくはライブラリーの形態で
ポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチドの全
体もしくは一部分と連結していないもの，および／また
は(2) 天然にポリヌクレオチドが連結しているポリヌク
レオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているのを
意味する。
【００３６】本願で用いる「ポリヌクレオチド」という
用語は，任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチ
ド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ド）を意味する。この用語は，分子の一次構造のみを意
味する。したがって，この用語には，二本鎖DNA と一本
鎖DNA ，および二本鎖と一本鎖のRNA が含まれる。また
この用語には，例えばメチル化反応および／またはキャ
ッピングによって修飾された形態のポリヌクレオチド
と，未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。
【００３７】本願で用いる「cDNAに対応する配列を有す
るHCV 」という用語は，そのHCV が指定されたDNA の配
列と相同もしくは相補的な関係にあるポリヌクレオチド
配列をもっていることを意味し，cDNAに対する相同性も
しくは相補性の程度は，約50％以上，好ましくは少なく
とも約70％，さらに好ましくは少なくとも約90％であ
る。対応する配列は，長さが，少なくとも約70のヌクレ
オチド，好ましくは少なくとも約80のヌクレオチド，さ
らに好ましくは少なくとも約90のヌクレオチドである。
HCV の配列とcDNAとの対応は，当該技術分野で公知の方
法で決定することができ，例えば配列された物質と記載
されたcDNAとを直接比較すること，またはハイブリダイ
ゼーションし，一本鎖ヌクレアーゼで切断し，切断によ
り生成した断片の大きさを測定するという方法がある。
【００３８】「精製されたウイルスポリヌクレオチド」
という用語は，HCV ゲノムもしくはその断片を意味し，
この断片は，本質的に遊離の形態で，すなわち，ウイル
スのポリヌクレオチドが自然に連結されているポリヌク
レオチドの約50％未満，好ましくは約70％未満，さらに
好ましくは約90％未満を含有している。ウイルス粒子か
らウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は，当該技
術分野で知られており，例えば，ウイルス粒子をカオト
ロピック剤で破壊する方法，およびイオン交換クロマト
グラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，およ
び密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポ
リペプチドを分離する方法がある。
【００３９】「精製されたウイルスポリペプチド」とい
う用語は，HCV ポリペプチドもしくはその断片を意味
し，その断片は，本質的に遊離の形態で，ウイルスポリ
ペプチドが天然に連結されている細胞成分の，約50％未
満，好ましくは約70％未満，さらに好ましくは約90％未
満を含有している。ウイルスポリペプチドを精製する技
術は当該技術で公知であり，この技術の例については後
に考察する。
【００４０】単細胞因子として培養される微生物もしく
は高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」，「宿主
細胞」，「細胞」，「細胞系」，「細胞培養物」などの
用語は，組換え体ベクターもしくは他の転移DNA の受容
体として使用可能か，または使用されてきた細胞を意味
し，トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれ
る。単一の親細胞の後代は，偶発的または計画的な変異
によって，形態またはゲノムもしくは全DNA の相補性が
元の親細胞と，必らずしも完全に同一ではない。所望の
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するよう
な適切な性質によって特徴づけられ，親細胞に充分類似
している親細胞の後代は，上記定義の意味する後代に含
まれ，上記用語で扱われる。
【００４１】「レプリコン」は，遺伝要素であって，例
えばプラスミド，染色体，ウイルスが含まれ，細胞内で
ポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し，
すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
【００４２】「ベクター」は，他のポリヌクレオチドの
セグメントが結合しているレプリコンであって，複製を
行い，および／または結合しているセグメントを発現す
る。「制御配列」は，ある種のポリヌクレオチド配列を
意味し，この配列が連結している，コード配列を発現す
るのに必要なものである。このような制御配列の性質
は，宿主の生物によって異なり，このような制御配列に
は，原核細胞内では一般に，プロモーター，リボソーム
結合部位およびターミネーターが含まれ，真核細胞内で
は一般に，プロモーター，ターミネーターおよびある場
合にはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用
語は，最小限発現に必要なすべての要素を包含し，さら
に発現に有利な追加の要素，例えばリーダー配列を包含
し得る。「作動可能に連結された」という用語は，上記
のような要素が，意図した方法で機能しうるような関係
に並置されていることを意味する。コード配列に「作動
可能に連結された」制御配列は，制御配列に適合した条
件下でコード配列の発現が達成されるように，連結され
る。
【００４３】「読み取り枠」(ORF) は，ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の領域であり，この領
域は，コード配列の一部またはコード配列全体を意味す
る。「コード配列」は，適切な調節配列の制御下に置か
れた場合に，mRNAに転写され，および／またはポリペプ
チドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード
配列の境界は，5'末端の翻訳開始コドンと，3'末端の翻
訳停止コドンによって決定される。コード配列は，mRN
A，cDNAおよび組換え体ポリヌクレオチド配列を包含す
るが，これらに限定されるものではない。
【００４４】「免疫学的に…と同定可能な」という用語
は，指定されたポリペプチド（通常はHCV タンパク）内
に存在し，かつそのタンパクに特有であるエピトープお
よびポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的
な同一性は，抗体の結合および／または結合における競
争によって決定されるが，この技術は当業者には知られ
ていることであり，後述する。エピトープの独自性も，
エピトープをコードするポリヌクレオチド配列につい
て，公知のデータバンク（例えば，ジーンバンク）をコ
ンピュータで調査し，他の公知のタンパクとアミノ酸配
列を比較することによって決定することができる。
【００４５】本願で用いる“エピトープ”という用語
は，ポリペプチドの抗原決定基を意味し，エピトープ
は，エピトープに特有の立体配置で３個のアミノ酸を含
有し得るが，エピトープは，一般に少なくとも５個のこ
のようなアミノ酸で構成され，より一般的には少なくと
も８〜10個のこのようなアミノ酸で構成されている。ア
ミノ酸の立体配置の決定法は，当該技術分野では公知で
あり，例えば，Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共
鳴法がある。
【００４６】ポリペプチドは，これに含まれている特異
的なエピトープが抗体を認識することによって，抗体と
結合する場合，抗体と「免疫学的に反応性がある」。免
疫学的反応性は，抗体結合反応，特に抗体結合反応の速
度論，および／または抗体が指向しているエピトープを
含有する公知のポリペプチドを，競争者として用いる結
合競争法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免
疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は，当該技
術分野で公知である。
【００４７】本願に用いる場合，「HCV エピトープを含
有する免疫原性を有するポリペプチド」という用語に
は，自然に発生するHCV ポリペプチドもしくはその断
片，および他の手段（例えば，化学合成法または組換え
体生物内でのポリペプチドの発現）によって調製される
ポリペプチドが包含される。
【００４８】「ポリペプチド」という用語は，アミノ酸
の分子鎖を意味し，特定の長さの生産物を意味しない。
したがってポリペプチドの定義には，ペプチド，オリゴ
ペプチドおよびタンパクが包含される。またこの用語
は，ポリペプチドの発現後修飾物，例えば，グリコシル
化物，アシル化物，リン酸化物などを意味しない。
【００４９】本願で用いる「形質転換」という用語は，
外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意
味し，挿入法はどんな方法でもよく，例えば，直接取込
み法，形質導入法またはf-交配法がある。外因性ポリヌ
クレオチドは，組込まれていないベクター，例えば，プ
ラスミドとして保持されるか，または代わりに宿主ゲノ
ムに組込れてもよい。
【００５０】本願で用いる「処理」という用語は，予防
および／または治療を意味する。
【００５１】本願で用いる「個体」という用語は，脊椎
動物，特に哺乳動物種のメンバーを意味し，家畜，競技
用動物，霊長動物およびヒトを含むが，これに限定され
るものではない。
【００５２】本願で用いる場合，核酸の「正鎖」は，ポ
リペプチドをコードする配列を含有している。また「負
鎖」は，「正鎖」の配列を相補する配列を含有してい
る。
【００５３】本願で用いる，ウイルスの「正鎖ゲノム」
は，RNA またはDNA にかかわらず，一本鎖のゲノムであ
り，ウイルスのポリペプチドをコードする。正鎖のRNA
ウイルスの例としては，トガウイルス科ウイルス（Toga
viridae ），コロナウイルス科ウイルス（Coronavirida
e），レトロウイルス科ウイルス （Retroviridae），ピ
コルナウイルス科ウイルス（Picorna-viridae）および
カリチウイルス科ウイルス（Caliciviridae） があ
る。またフラビウイルス科ウイルスも含まれるが，これ
は以前にトガウイルス科に分類されていた〔フィールド
とナイプの文献（1986年）を参照〕。
【００５４】本願で用いる「抗体を含有する身体成分」
は，問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味す
る。抗体を含有する身体成分は，当該技術分野で知られ
ており，例えば，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，呼吸
器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション（section
），涙，唾液，乳，白血球および骨髄腫細胞が含まれ
るが，これに限定されるものでばない。
【００５５】本願で用いる「精製されたHCV 」は，ウイ
ルスが通常連結されている細胞構成要素および感染組織
中に存在する他の種のウイルスから単離されたHCV の製
剤を意味する。ウイルスを単離する技術は，当業者には
知られており，例えば，遠心分離法およびアフィニティ
ークロマトグラフィーが含まれるが，精製HCV の製法に
ついては後述する。
【００５６】II. 発明の構成 本発明の実施においては，特に指示されない限り，当該
分野で既知である分子生物学，微生物学，組み換えDNA
，および免疫学の従来の手法が採用される。このよう
な手法は，文献中に充分に説明されている。例えば，次
の文献を参照されたい：Manistis, FitschおよびSambro
ok, MOLECULAR CLONING； A LABORATIRYMANUAL (198
2)；DNA CLONING, I 巻およびII巻 (D.N Glover編集，
1985) ；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait編集，
1984) ；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hamesおよ
びS.J. Higgins編集，1984) ； TRANSCRIPTION AND TRA
NSLATION (B.D. Hames および S.J. Higgins 編集，198
4) ；ANIMAL CELL CULTURE(R.I. Freshney編集，198
6)； IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press,198
6) ； B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CL
ONING (1984)；METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ (Aca
demic Press, Inc.)； GENE TRANSFERVECTORS FOR MAM
MALIAN CELLS (J.H. MillerおよびM.P. Calos編集，198
7, ColdSpring Harbor Laboratory)； Methods in Enz
ymology Vol. 154およびVol.155 (それぞれWuおよびGro
ssman；Wu編集), MayerおよびWalker編集(1987)；IMMUN
OCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (A
cademic Press,London ), Scopes, (1987)； PROTEIN
PURIFICATION： PRINCIPLES AND PRACTICE, Second Ed
ition(Springer-Verlag, N.Y.), およびHANDBOOK OF EX
PERIMENTAL IMMUNOLOGY, I 〜IV巻 (D.M. Weir および
C.C. Blackwell編，1986) 。
【００５７】ここで述べられる前出および後述の特許出
願および公報は参考文献としてここに取り入れられてい
る。
【００５８】本発明の有用な物質および方法は，HCV 感
染チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列由来のcDNA
ライブラリーから単離されたヌクレオチド配列と非常に
相同なヌクレオチド配列群の供給により可能となる。こ
のヌクレオチド配列群はヒトあるいはチンパンジーの起
源ではない。なぜなら，このヌクレオチド配列群は，非
感染個体から得られるヒトおよびチンパンジーのゲノム
DNA のいずれにもハイブリダイズせず，この配列群のヌ
クレオチドはHCV 感染したチンパンジーの肝臓および血
漿にのみ存在し，そして，この配列は遺伝子バンクには
存在しないからである。さらに，この配列群は，HBV ゲ
ノム内に含有される配列に有意な相同性を示さない。
【００５９】クローン5-1-1 内に含有されるこの群のあ
る配列は，およそ50個のアミノ酸のポリペプチドをコー
ドする１つの連続的なオープンリーディングフレーム
（ORF）を有する。HCV 感染者から得られた血清にはこ
のポリペプチドに結合する抗体が含有されている一方，
非感染者から得られた血清には，このポリペプチドに対
する抗体が含有されない。最終的に非感染チンパンジー
から得られた血清には，このポリペプチドに対する抗体
が含有されないが，この抗体は，急性NANBH に感染した
チンパンジーにおいて誘導される。さらに，このポリペ
プチドに対する抗体はHAV およびHBV に感染したチンパ
ンジーおよびヒトにおいては検出されない。これらの基
準によると，この配列はウイルスの配列に対するcDNAで
あり，このウイルスにより生じ，NANBH と関連する配列
である。このcDNA配列を第１図に示す。後述のように，
クローン5-1-1 におけるcDNA配列は，単離された他のcD
NA（さらに28個の塩基対を含有する）とは異なる。
【００６０】他の同定されたDNA 群（これらは，クロー
ン5-1-1 におけるcDNAの断片と同等な合成配列をプロー
ブとして用い，単離された）との複合配列を第３図に示
す。クローン81におけるcDNA由来の合成配列を用いて単
離されたcDNA群の構成要素を第５図に示し，クローン81
の配列とこの配列との複合配列を第６図に示す。cDNA群
の他の構成要素は，クローン14ｉ，11ｂ，７ｆ，７ｅ，
８ｈ，33ｃ，40ｂ，37ｂ，35, 36, 81, 32, 33ｂ，25
ｃ，14ｃ，８ｆ，33ｆ，および33ｇ，および39ｃに存在
する配列を含み，これらは，IV.A節で詳細に説明され
る。これらクローン中のcDNA複合配列はIV.A .18節で詳
細に説明されており，第29〜34図に示される。cDNA複合
配列はひとつの連続したORF を含有し，従って，ポリタ
ンパクをコードしていることが示される。このデータ
は，後に考察されるように，HCV がフラビウイルスある
いはフラビ様ウイルスであるという示唆と一致する。
【００６１】第１図〜第46図に包括して示すcDNA群が入
手可能となるため，DNA プローブの構築およびポリペプ
チドを得ることが可能となる。上記ポリペプチドは，HC
V 感染によるNANBH の診断において，そして，供血者，
供給された血液および血液産物が感染しているか否かに
ついてスクリーニングすることにおいて，有用である。
例えば，この配列から，約８〜10個あるいはそれより長
いヌクレオチドを有するDNA オリゴマーを合成すること
が可能である。このDNA オリゴマーは，例えばウイルス
を保有している疑いがある被験者血清におけるウイルス
ゲノムの存在を検出するための，あるいは供給された血
液についてウイルスの存在の有無をスクリーニングする
ための，ハイブリダイゼーションプローブとして，有用
である。cDNA配列の群によりまた，NANBH において生じ
る抗体の存在を検出する診断用試薬として有用なHCV に
特異的なポリペプチドの設計および産生が可能となる。
cDNA由来の精製ポリペプチドに対する抗体は感染個体お
よび血液中のウイルス抗原を検出するためにも用いられ
得る。
【００６２】これらのcDNA配列の知識により，HCV に対
するワクチンとしてそして抗体産生のためにも用いられ
得る，ポリペプチドの設計および調製が可能となる。そ
してこのポリペプチドは，次に，HCV 疾患に対する保護
および／またはHCV 感染個体の治療に用いられ得る。
【００６３】さらに，cDNA配列群によりHCV ゲノムを，
より特徴づけることを可能にする。これらの配列から得
られたポリヌクレオチドプローブは，重複している付加
的なcDNA配列についてcDNAライブラリーをスクリーニン
グするために用いられ得，このcDNA配列はさらに，重複
している別の配列を得るためにも用いられ得る。ゲノム
が分割されており，そのセグメントが共通配列を欠いて
いる限り，この手法はゲノム全体の配列を得るために用
いられ得る。しかし，ゲノムが分割されているならば，
ゲノムの他のセグメントは，ここで述べられているcDNA
クローンを単離するために用いられたλ−gt11の血清学
的なスクリーニング工程を繰り返すことにより，あるい
は，精製HCV粒子からのゲノムを単離することにより得
られ得る。
【００６４】cDNA配列群およびこれら配列由来のポリペ
プチド，そして，これらペプチドに対する抗体もまた，
BB-NANBV因子の単離および同定に有用である。例えば，
cDNA由来のポリペプチドに含まれるHCV エピトープに対
する抗体は，アフィニティークロマトグラフィーをもと
にした工程で，ウイルスを単離するために用いられ得
る。あるいは，この抗体は他の手法により単離されたウ
イルス粒子を同定するために用いられ得る。単離された
ウイルス粒子のウイルス抗原およびゲノム物質が，さら
に特徴づけられ得る。
【００６５】HCV ゲノムをさらに配列決定することによ
って得られる情報により，およびHCV 抗原がさらに特徴
づけられ，ゲノムが特徴づけられることにより，付加的
なプローブおよびポリペプチド，そして抗体の設計およ
び合成が可能となる。これらは，HCV 誘発NANBH の診
断，予防，および治療に，そして感染血液および血液関
連産物のスクリーニングに用いられ得る。
【００６６】抗原および抗体を含むHCV のプローブ, お
よびcDNA群が誘導されるゲノム由来のポリヌクレオチド
が利用可能であることにより，HCV の生物的性質を明ら
かにするにあたり主として用いられる組織培養系の発達
が可能となった。このことにより，HCV 複製，あるいは
HCV 感染を選択的に阻害する抗ウイルス化合物に基づい
た新しい治療法が開発され得る。
【００６７】NANBH の病因因子を同定および単離するた
めに用いられる本法は新規であり，次のような今までに
特徴づけられていない因子の同定および／または単離に
適用され得る。上記因子はゲノムを含有し，ウイルス，
ウィロイド，細菌類，菌類，および寄生虫によって引き
起こされる疾患を包含するさまざまな疾患に関連する因
子である。この方法ではcDNAライブラリーが，感染個体
から得られる感染組織中に存在する核酸から，調製され
た。このライブラリーは，cDNAをコードするポリペプチ
ドを発現し得るベクター中に調製された。ベクターを含
む宿主細胞のクローンは，病因因子のポリペプチドの免
疫反応性断片を発現し，これは，推定される因子に以前
に感染した別の個体由来の抗体含有体成分を有するこの
ライブラリーの発現産物を免疫学的にスクリーニングす
ることによって選択される。免疫学的なスクリーニング
法における工程は，次の工程を包含していた；：ベクタ
ーを含むcDNAの発現産物と，二次的に感染した個体の抗
体含有体成分とを相互作用させる工程；および発現産物
と二次感染個体の抗体との間の抗原−抗体複合配列の形
成を検出する工程。単離されたクローンはさらに次のよ
うにして免疫学的にスクリーニングされる：発現産物
を，推定される因子に感染した他の個体および推定され
る因子に感染していない対照の個体の抗体含有体成分と
相互に作用させること，および，感染個体由来の抗体と
の抗原−抗体複合配列の形成を検出すること。そして，
感染個体および該因子に感染している疑いのある個体由
来の抗体と免疫学的に反応するが，対照の個体由来のも
のとは反応しないポリペプチドをコードするcDNA含有ベ
クターが，単離される。cDNAライブラリーの構築および
免疫学的なスクリーニングに用いた感染個体は同種であ
る必要はない。
【００６８】本法により単離されたDNA 発現産物，そし
て該発現産物に対する抗体は，病因因子の特徴づけおよ
び／または捕捉に有用である。さらに，詳細に後述する
ように，この方法は，HCV ゲノム由来のcDNA群を単離す
るために，好適に利用される。
【００６９】II.A. cDNA配列の調製 慢性HCV 感染チンパンジー由来の貯留血清であって，ウ
イルスを高力価で，つまり少なくとも106 チンパンジー
感染量／ml（chimp infections doses／ml；CID/ml）を
有する血清を，ウイルス粒子を単離するために用いた。
そして，このウイルス粒子から単離した核酸を，ウイル
スゲノムに対するcDNAライブラリーの構築においてテン
プレートとして用いた。推定HCV 粒子の単離およびλ−
gt11におけるcDNAライブラリーの構築のための手順は，
IV.A.1節で考察されている。λ−gt11は，β−ガラクト
シダーゼを有する融合ポリペプチドとして挿入cDNAを発
現するために，そして，特定の抗原に対して生じた特異
的な抗血清で多数の組み換え体ファージをスクリーニン
グするために，特に開発されたベクターである。およそ
の平均サイズが 200塩基対のcDNAを有するcDNAプールか
らのλ−gt11 cDNAライブラリーが以前にNANB肝炎にか
かったことのある患者由来の血清に特異的に結合し得る
ようなコードされたエピトープについてスクリーニング
された。Huynh, T.V.ら (1985) 。約106個のファージが
スクリーニングされ，５個の陽性ファージが同定，精製
され，次に，HCV 因子に以前に感染した異なるヒトおよ
びチンパンジーから得た血清に対する結合の特異性がテ
ストされた。このファージの１つである5-1-1 が，テス
トしたヒト血清８個のうちの５個と結合した。７個の正
常血清はこのような結合を示さなかったので，この結合
は以前にNANB肝炎にかかった患者由来の血清に選択的で
あるらしい。
【００７０】組換え体ファージ5-1-1 におけるcDNA配列
が，決定され，それは第１図に示される。このクローン
化されたcDNAによってコードされたポリペプチドは，融
合ポリペプチドのＮ末端β−ガラクトシダーゼ部分とし
て同一の翻訳枠内にあり，その配列は，該ヌクレオチド
配列の上に示される。従って，翻訳ORF は，NANB肝炎に
感染した患者由来の血清によって特別に認識されるエピ
トープをコードする。組換えファージ5-1-1 においてcD
NAが利用できるため，ウイルスゲノムに対するcDNAの付
加的な断片および／または他の断片を有する他のクロー
ンを単離することが可能となる。前出のλ−gt11 cDNA
ライブラリーは，クローン化された5-1-1 cDNA配列由来
の合成ポリヌクレオチドを用いてスクリーニングされ
た。このスクリーニングにより，81, 1-2, および91と
して同定された３個の他のクローンが得られた。これら
のクローン内にあるcDNAが配列決定された。IV.A.3節お
よびIV.A.4節を参照されたい。４個の独立したクローン
間の相同性を第２図に示す。第２図では相同性が縦線に
より示されている。クローン5-1-1, 81, および91にお
いて独特のヌクレオチド配列を小文字で示す。
【００７１】クローン5-1-1, 81, 1-2, および91におけ
る組換え体ファージにクローン化されたcDNAは，相同性
が高く，わずかに２個の領域において異なるにすぎな
い。第一に，クローン1-2 の67番目のヌクレオチドはチ
ミジンである一方, 他の３個のクローンは，この位置に
シチジンを有する。しかし，この置き変えにより，コー
ドされたアミノ酸の性質は変化しない。
【００７２】この４つのクローンの第２の違いは，クロ
ーン5-1-1 が，他のクローンには存在しないような28の
塩基対を5'末端に有していることである。この特別な配
列はクローニングにより5'末端に人工的に形成されたも
のである。クローニングにより5'末端に形成される人工
的な配列は，通常，cDNA法の生成物中に観察される。ク
ローン81におけるHCV cDNAの5'領域および3'領域由来の
合成配列は，クローン81 cDNA と重複するλ−gt11の N
ANBVcDNAライブラリー由来のcDNAのスクリーニングおよ
び単離に用いられた（IV.A.5節）。クローン36およびク
ローン32の中にそれぞれ存在する得られたcDNA配列は，
第５図および第７図に示される。
【００７３】同様に，クローン36の5'領域に基づいた合
成ポリヌクレオチドは，クローン36cDNAに重複するλ−
gt11 NANBV cDNAライブラリーからcDNAをスクリーニン
グし単離するのに用いられた（IV.A.8節）。合成ポリヌ
クレオチドプローブにハイブリダイズする組換えファー
ジ含有cDNAの精製クローンはクローン35と命名され，こ
のクローンの中に含まれるNANBH cDNA配列は第８図に示
される。
【００７４】重複cDNA配列を単離する手法を利用するこ
とによって，上流および下流にHCVcDNAの付加的な配列
を有するクローンが得られた。これらクローンの単離は
IV.A節で後述する。
【００７５】単離されたクローン内にコードされたHCV
cDNAのヌクレオチド配列の分析により，複合cDNAがひと
つの長い連続したORF を有することが示される。第29〜
34図に，これらのクローンからの複合DNA 配列を，それ
によりコードされた推定されるHCV ポリペプチドととも
に，示す。
【００７６】cDNA配列を得るための方法の記述は，歴史
的に興味深い。得られた配列（およびその相補配列）は
本発明により提供され，その配列あるいはその部分的な
配列は合成法を用いて，あるいは，合成法と，ここに記
載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方法とを
組み合わせて，調製される。
【００７７】HCV cDNAライブラリーからの，そしてクロ
ーン5-1-1, 81, 1-2 および91から複製されるλ−gt11
株は，American Type Culture Collection(ATCC), 1230
1 Parklawn Dr., Rockville,Maryland 20852, に，ブダ
ペスト条約により寄託されており，次の受託番号を有す
る。
【００７８】 λ−gt11 ATCC No. 寄託日 HCV cDNAライブラリー 40394 1987年12月１日 クローン81 40388 1987年11月17日 クローン91 40389 1987年11月17日 クローン1-2 40390 1987年11月17日 クローン5-1-1 40391 1987年11月18日 本出願が米国特許として許可され発行されると，これら
寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取
り除かれる。そして上記命名された寄託物は，37CFR 1.
14および35USC 1.22によりコミッショナーによって権利
を与えられた上記出願が係属している間は，入手可能で
ある。さらに，その寄託物は，寄託日から30年間, ある
いは寄託物の最終要求から５年間；あるいは，米国特許
の有効である期間のいずれか長い方の期間の間，維持さ
れる。これらの寄託物およびここで述べられている寄託
物は便宜のためにのみ寄託されたものであり，ここでの
記載された内容により本発明を実施することを意図して
いない。すべての寄託物におけるHCV cDNA配列は，参考
として，ここに述べられている。
【００７９】HCV λ−gt11ライブラリーからの重複cDNA
配列を単離することによりゲノムを「ウォーキング（wa
lking)」する上記記載により，全HCV ゲノムに対するcD
NAを単離し得る方法が提供される。しかし，本明細書で
提供される情報が与えられたとしても，これらのcDNAを
単離する他の方法は当業者には自明である。そのような
方法のいくつかはこの後のIV.A節で述べられる。
【００８０】II.B. ウイルス性ポリペプチドおよびフラ
グメントの調製 第１〜46図のcDNA配列を利用して, 後述のように単離さ
れたcDNA配列であっても，これらの図のcDNA配列であっ
ても, このようなcDNA配列を利用し得るため,いずれか
の鎖においてコードされているポリペプチドの抗原的に
活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能とな
る。これらの抗原的に活性な領域はコートまたはエンベ
ロープ（外被）抗原, あるいはコア抗原由来であり得，
それには例えば, ポリヌクレオチド結合タンパク, ポリ
ヌクレオチドポリメラーゼ, およびウイルス粒子の複製
および／または構築（assembly）に必要とされる他のウ
イルス性タンパクが包含される。所望のポリペプチドを
コードするフラグメントは従来の制限消化を用いてある
いは合成法により, cDNAクローンから誘導され, 例えば
タンパクβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサ
イドジスムターゼ（SOD) (好ましくはSOD)のような融合
配列の一部を有するベクター中に連結される。SOD の融
合配列を有するポリペプチドの産生に有用な方法および
ベクターは,1986年10月１日に公開されたヨーロッパ特
許出願公開番号第0196056 号に記載されている。SOD お
よびHCV ポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする
ベクター（つまりNANB5-1-1, NANB81およびC100-3；HCV
cDNAの複合配列中にコードされている）は，それぞれI
V.B.1, IV.B.2, およびIV.B.4節に記載されている。ど
ちらのセンス鎖においても, オープンリーディングフレ
ームを有するHCV cDNAの所望の部分は, 成熟タンパクあ
るいは融合タンパクのような組換えポリペプチドとして
得られる。あるいは，このcDNAにコードされるポリペプ
チドは，化学合成により供給され得る。
【００８１】所望のポリペプチドをコードするDNA は,
融合型であっても成熟型であっても，分泌を可能にする
シグナル配列を有していてもいなくても，適当な宿主に
適した発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物および
原核生物の両宿主が, 組換えポリペプチドを形成するた
めに現在用いられている。より一般的な制御系および宿
主細胞系を，後述のIV.A節にまとめて示す。このポリペ
プチドは, 次に, 溶解した細胞あるいは培地から単離さ
れ, 実際の使用に必要な程度にまで精製される。精製に
は，当該分野で公知の手法が用いられ得, それには例え
ば, 塩分画, イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー,
アフィニティクロマトグラフィー, 遠心分離などがあ
る。例えば, Methods in Enzymology の種々のタンパク
精製法を参照されたい。このようなポリペプチドは, 診
断用として用いられ得るか, あるいは抗体を中和するよ
うなポリペプチドはワクチンに処方され得る。これらの
ポリペプチドに対して生じた抗体もまた，診断薬とし
て, あるいは受動免疫治療に用いられ得る。さらに，後
述のII.J節で考察するように, これらポリペプチドに対
する抗体は, HCV 粒子の単離および同定に有用である。
【００８２】このHCV 抗原はまた，HCV ビリオンから単
離され得る。このビリオンは，組織培養物中のHCV 感染
細胞, あるいは感染宿主中で増殖し得る。
【００８３】II.C. 抗原性ポリペプチドの調製およびキ
ャリアーとの結合 ポリペプチドの抗原性領域は, 通常は比較的小さく, 代
表的には８〜10個あるいはそれを下まわる長さのアミノ
酸である。せいぜい５個のアミノ酸フラグメントが抗原
性領域を特徴づけている。これらのセグメントは, HCV
抗原領域に対応する。従って, このHCV のcDNAを基本的
に用いると, HCV ポリペプチドの短いセグメントをコー
ドするDNA は，融合タンパクとして, あるいは単離ポリ
ペプチドとして, 組換え手法により発現させることがで
きる。さらに，短いアミノ酸配列は, 化学合成で都合よ
く得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピト
ープを提供するために正しく形成されているが, 小さす
ぎて免疫原性がない場合には，このポリペプチドは，適
当なキャリアーと結合させることができる。
【００８４】このような結合を得るための多くの手法が
当該分野では公知であり, それにはPierce Company,Roc
kford,Illinoisから入手されるN-サクシイミジル-3-(2-
ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP) およびサクシイ
ミジル4-(N- マレイミドメチル）シクロヘキサン-1- カ
ルボネート（SMCC) を用いてジスルフィド結合を形成す
る方法が包含される（もしこのペプチドがスルフヒドリ
ル基を欠いていれば，システイン残基を付加することに
より, この方法が用いられ得る）。これらの試薬は, そ
の試薬自身とあるタンパクのペプチドのシステイン残基
との間のジスルフィド結合, およびリジンのε−アミ
ノ, あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結合
を生成する。このようなさまざまなジスルフィド／アミ
ド形成試薬は公知である。例えば, Immun.Rev.(1982)6
2:185を参照されたい。他の二官能性カップリング試薬
は, ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成す
る。これらのチオ−エーテル生成試薬の多くは市販され
ており, それには６−マレイミドカプロン酸, ２−ブロ
モ酢酸, ２−ヨード酢酸, ４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エス
テルが包含される。このカルボキシル基は，そのカルボ
キシル基とコハク酸イミドとを, あるいは１−ヒドロキ
シル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩とを組
み合わせることによって活性化される。上述の化合物の
名称は, それが全てであることを意味せず,その化合物
の修飾物もまた明らかに用いられ得る。
【００８５】キャリアーとしては, それ自身が宿主に対
して有害な抗体の産生を誘導しないものであれば，いず
れのキャリアーもが用いられ得る。適当なキャリアー
は，典型的には, 大きく, ゆっくり代謝される高分子物
質であり, それには例えば, タンパク; ラテックス機能
付与セファロース, アガロース, セルロース, セルロー
スビーズなどの多糖体；ポリグルタミン酸, ポリリジン
などのような重合アミノ酸; アミノ酸共重合体; および
不活性ウイルス粒子がある（例えば, II.D節を参照のこ
と）。特に有用なタンパク基質には, 血清アルブミン,
キーホールリンペットヘモシアニン, 免疫グロブリン分
子, サイログロブリン，オボアルブミン,テタヌス毒素,
および当業者に公知の他のタンパクがある。
【００８６】II.D. HCV エピトープを有するハイブリッ
ド粒子免疫原の調製 HCV のエピトープの免疫原性はまた, 粒子形成タンパク
（例えば, Ｂ型肝炎の表面抗原と結合するタンパク）と
融合もしくは結合させた哺乳動物の系あるいは酵母の系
で調製することによって増強される。NANBV エピトープ
が粒子形成タンパクコード配列に直接結合している構築
物は, HCV エピトープに関して免疫原性のハイブリッド
を産生する。さらに，調製したすべてのベクターはHBV
に特異的なエピトープを有し, 例えばプレＳペプチドの
ように異なる度合の免疫原性を有する。このように，HC
V 配列を有する粒子形成タンパクから構築される粒子
は,HCV およびHBV に関して免疫原性である。
【００８７】肝炎の表面抗原（HBSAg)は，S.cerevisiae
（Valenzuelaら, (1982)）, および例えば哺乳動物細胞
（Valenzuela, P.ら, (1984)）において形成され，結合
して粒子となることが示されている。このような粒子の
形成は, 単量体のサブユニットの免疫原性を増強するこ
とが示されてきた。この構築物はまた，HBSAg の免疫的
に優性なエピトープを有し，それはプレ表面（プレＳ）
領域の55アミノ酸を含有する（Neurathら, (1984)) 。
酵母中に発現され得るプレS-HBSAg 粒子の構築物は, ヨ
ーロッパ特許出願公開第174,444 号（1986年３月19日公
開）に開示されている。酵母の発現のための異種ウイル
ス配列を有するハイブリッドは，ヨーロッパ特許出願公
開第175,261 号（1966年３月26日公開）に開示されてい
る。これらの出願の出願人は本出願人と同一であり, 参
考としてここに取り入れられている。
【００８８】これらの構築物もまた，SV40のジヒドロ葉
酸還元酵素ベクターを用いてチャイニーズハムスター卵
巣（CHO)細胞のような哺乳動物細胞中で発現させること
ができる（Michelleら（1984)）。
【００８９】さらに，粒子形成タンパクをコードする配
列の部分は，HCV エピトープをコードするコドンで置き
換えられ得る。この置き換えにおいては, 酵母あるいは
哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介
するために必要とされない部分は削除され得, このよう
にして, HCV エピトープと競合する部分から付加的なHB
V 抗原部位が除去される。
【００９０】II.E. ワクチンの調製 ワクチンは, HCV cDNA由来の免疫原性ポリペプチドおよ
び第１〜46図のcDNA配列由来の免疫原性ポリペプチド,
あるいはこれらが対応するHCV ゲノム由来の免疫原性ポ
リペプチドの１種あるいはそれ以上から調製される。HC
V およびフラビウイルスの間に観察される相同性は，ワ
クチンとして最も有効でありそうなポリペプチドと，そ
れらがコードされているゲノム領域に関する情報を提供
する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は, Riceら
(1986)により考察されている。こフラビウイルスのゲノ
ム RNAは, ウイルス特異的mRNA種のみであると考えら
れ,これは, ３つのウイルスの構造タンパク（つまり，
C,M およびE), そして，２つの大きな非構造タンパク
（NV4 およびNV5)およびより小さな非構造タンパクの複
合体の対に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エ
ピトープは, E(外被：envelope) タンパクに属すること
は公知である（Roehrig(1986))。対応するHCV E遺伝子
およびポリペプチドをコードする領域は, フラビウイル
スに対する相同性に基づいて, 予想され得る。このよう
に，ワクチンは，HCV E のエピトープを有する組換えポ
リペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドは, 細
菌, 酵母,あるいは哺乳動物細胞において発現するか,
あるいは, ウイルス調製物から単離され得る。他の構造
タンパクもまた，保護抗HCV 抗体を生じるエピトープを
有し得ることが予期される。このように，E, C, および
M のエピトープを有するポリペプチドもまた, 単独であ
るいは組み合わせて, HCV ワクチン中で用いられ得る。
【００９１】上記に加えて, NS1(非構造タンパク１）で
免疫すると黄熱病から保護されることが示されている(S
chlesingerら(1986)) 。たとえ，その免疫により中和抗
体が生じないとしてもこのことは正しい。このように，
特に, このタンパクはフラビウイルスの間で高い度合で
保持されるらしいので，HCV NS1 もまた, HCV の感染に
対して保護作用を有するようである。さらに，たとえ非
構造タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても, 非
構造タンパクは, ウイルスの病原性に対して保護作用を
提供し得ることもまた示される。
【００９２】上記の見解においては, HCV に対する多価
のワクチンは１あるいはそれ以上の構造タンパク, およ
び／または１あるいはそれ以上の非構造タンパクを含有
し得る。これらのワクチンは, 例えば, 組換えHCV ポリ
ペプチドおよび／またはビリオンから単離されたポリペ
プチドを含有し得る。さらに，ワクチンにおける不活性
化HCV の使用を可能にする。不活性化は，ウイルス溶解
物の調製によるか，あるいはフラビウイルスの不活性化
を引き起こす当該分野で公知の他の方法（例えば, 有機
溶媒あるいは界面活性剤での処理, あるいはホルマリン
での処理）により行われ得る。さらに，ワクチンはま
た, 弱毒化HCV 株からも調製され得る。弱毒化HCV 株の
調製は, 後述される。
【００９３】フラビウイルスにおけるタンパクのいくつ
かは高度に保持された領域を有することは公知であり，
従って, いくつかの免疫学的交差反応性がHCV と他のフ
ラビウイルスとの間に予想される。フラビウイルスとHC
V との共有のエピトープは,これら病原因子によって引
き起こされる１あるいはそれ以上の障害に対する保護抗
体を生じる可能性がある。このように，この認識に基づ
く多目的ワクチンを設計することができる。
【００９４】活性成分として免疫原性のポリペプチドを
含有するワクチンの調製は, 当業者に公知である。代表
的には, このようなワクチンは, 液体溶液あるいは懸濁
液のいずれかとして, 注射できるように調製される。注
射の前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適当な固形
物の形態としても調製され得る。この調製物はまた，乳
化することもでき，あるいは，リポソームにカプセル化
されるタンパクであってもよい。この活性免疫原性成分
は, 薬学的に受容され得, この活性成分と適合性のある
賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤としては，
例えば，水, 生理食塩水, デキストロース, グリセロー
ル，エタノールなど, およびこれらの組み合わせがあ
る。さらに必要に応じて, このワクチンには少量の補助
物質が含有され得, それには，補湿剤あるいは乳化剤,
pH緩衝剤, および／またはこのワクチンの効果を増強す
るアジュバントがある。効果的なアジュバントの例とし
ては, 次の物質があり，そしてこれらには限定されな
い：水酸化アルミニウム, Ｎ−アセチル−ムラミル-L-
スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr-MDP), Ｎ−アセ
チル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタ
ミン（CGP 11637, nor-MDPとする）, Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラ
ニン−２−（1'−2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−
３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（CG
P 19835A, MTP-PEとする）, およびRIBI。上記RIBIは細
菌から抽出される３つの成分, モノホスホリル脂質Ａ,
トレハロースジミコール酸, および細胞壁骨格成分（MP
L+TDM+CWS), を, ２％スクアレン／トゥイーン80乳液中
に含んでいる。アジュバントの効果は, HCV 抗原配列を
有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定す
ることによって決定され得る。このポリペプチドは，種
々のアジュバントを含むワクチン中のこのポリペプチド
を投与することにより生じる。
【００９５】このワクチンは，通常, 非経口的に注射で
投与され, その形態は, 例えば, 皮下注射であっても筋
肉注射であってもよい。他の投与形態に適当な処方には
座薬があり，場合によっては経口処方もある。座薬とし
て従来のバインダーおよび担体が用いられ得, それには
例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリ
ドがある。このような座薬は, 活性成分を0.5 ％〜10
％, 好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から
形成される。経口処方物には, 通常使用される賦形剤が
含有され, そのような賦形剤には例えば, 製剤グレード
のマンニトール,ラクトース, デンプン, ステアリン酸
マグネシウム, サッカリンナトリウム, セルロース, 炭
酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は, 溶液,
懸濁液, 錠剤, 丸剤, カプセル剤, 放出を維持するよう
な処方, あるいは粉剤の形態を有し, 活性成分を10％〜
95％, 好ましくは25％〜70％の割合で含有する。
【００９６】このタンパクは，そのままであるいは塩の
形で, ワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る
塩には，酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形
成される）が包含され, この塩は, 無機酸（例えば, 塩
酸あるいはリン酸）あるいは有機酸（例えば酢酸, シュ
ウ酸, 酒石酸, マレイン酸など）を用いて形成される。
遊離のカルボキシル基により形成される塩は，無機塩基
（例えば, 水酸化ナトリウム, 水酸化カリウム, アンモ
ニア, 水酸化カルシウム, あるいは水酸化鉄）および有
機塩基（例えば, イソプロピルアミン, トリメチルアミ
ン, ２−エチルアミノエタノール, ヒスチジン，プロカ
インなど）からも誘導され得る。
【００９７】II.F. ワクチンの用量および投与 このワクチンは投薬処方に適合するように，そして予防
効果および／または治療効果が得られる量で, 投与され
る。投与される量は, 一般に１回の投与あたり抗原が５
μg 〜250 μg であり，この投与量は治療される個体,
該個体の免疫系の抗体合成能, および所望する保護の度
合に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量
は, 医師の判断によるものであり, それぞれの個体に特
有であり得る。
【００９８】このワクチンは, １回の投与計画で与えら
れるか, あるいは好ましくは複数回の投与計画で与えら
れ得る。複数回の投与計画では, 最初のワクチン投与
は，１〜10回に分けて行なわれ, 第２回目の投与では免
疫応答維持もしくは強化するために第１回目とは別に所
定の間隔をおいて引き続いて１〜４ヶ月投与され, そし
て必要であれば数ヶ月後にさらに引続き投与が行なわれ
る。この投与形態はまた，少なくとも部分的には, 個人
の必要量によって決定され, 医師の判断による。さら
に，免疫原性のHCV 抗原を有するワクチンは，他の免疫
調整因子, 例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与さ
れ得る。
【００９９】II.G. HCV エピトープに対する抗体の調製 上述のようにして調製される免疫原性のポリペプチド
は，ポリクローナル, および，モノクローナルの両抗体
を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望
であれば, 選択される哺乳動物（例えば, マウス, ウサ
ギ，ヤギ，ウマなど）はHCV エピトープを有する免疫原
性ポリペプチドを用いて免疫される。免疫された動物か
ら得られる血清は回収され，公知の方法によって処理さ
れる。
【０１００】HCV エピトープに対するポリクローナル抗
体を有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる場
合には, このポリクローナル抗体は免疫アフィニティー
クロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクロー
ナルな抗血清を産生し, 処理する手法は, 当該分野では
公知であり, 例えばMayer およびWalker(1987)を参照さ
れたい。
【０１０１】あるいは，ポリクローナル抗体は, あらか
じめHCV に感染させておいた哺乳動物から単離され得
る。感染個体の血清から得られるHCV エピトープに対す
る抗体を精製する方法の例は, Ｖ.E. 節で述べられてお
り, これは，アフィニティークロマトグラフィーに基づ
き, SOD とcDNAクローン5-1-1 内にコードされたポリペ
プチドとの融合ポリペプチドを利用する方法である。
【０１０２】HCV エピトープに対するモノクローナル抗
体もまた，当業者により容易に生産され得る。ハイブリ
ドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的な
方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞
融合によって作成することができ，さらに，腫瘍原性DN
A を用いたＢリンパ球の直接形質転換, あるいはEpstei
n-Barrウイルスを用いたトランスフェクションのような
他の手法によってもまた作成することができる。例え
ば, M.Schreierら(1980); Hammerlingら(1981);Kennett
ら(1980)の文献を参照されたい。さらに，米国特許No.
4,341,761;No.4,399,121;No.4,427,783;No.4,444,887;N
o.4,466,917;No.4,472,500;No.4,491,632;およびNo.4,4
93,890 もまた, 参照されたい。HCV エピトープに対し
て産生されるモノクローナル抗体のパネルは，種々の目
的（例えばアイソタイプ, エピトープ親和性など）に応
じてスクリーニングされ得る。
【０１０３】モノクローナルおよびポリクローナル両抗
体は, HCV エピトープに対して形成され, 特に診断にお
いて有用であり, 中和抗体は受動免疫治療に有用であ
る。特にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体
を生じさせるために用いられ得る。
【０１０４】抗イディオタイプ抗体は, それに対して保
護が望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ（intern
al image) 」を伴う免疫グロブリンである。例えば, Ni
sonoff, A.ら(1985)およびDreesmanら(1985)を参照され
たい。
【０１０５】抗イディオタイプ抗体を生じさせるための
手法は, 当該分野で公知である。例えば, Grzych(198
5), MacNamaraら(1984), およびUytdehaag ら(1985)を
参照されたい。これらの抗イディオタイプ抗体は, NANB
H の治療, およびHCV 抗原の免疫原性領域を解明するの
にも有用である。
【０１０６】II.H. 診断用オリゴヌクレオチドプローブ
およびキット 単離されたHCV cDNAの開示部分（第１〜46図に示される
部分を包含する）を基本として用いて, 約８個あるいは
それ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断ある
いは合成によって調製され得る。このオリゴマーは, HC
V ゲノムとハイブリダイズし, このウイルス性因子の同
定, さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づけ, および疾
患個体のウイルスの検出に有用である。HCV ポリヌクレ
オチドプローブ（天然あるいは誘導された）は, ハイブ
リダイゼーションによって独特のウイルス配列を検出し
得る長さである。６〜８個のヌクレオチドが, その機能
を果たし得る長さであるが, 10〜12個のヌクレオチド配
列が好適であり, 約20のヌクレオチドが最も好適である
と考えられる。好ましくは, これら配列は, 異種性を欠
いている領域由来である。これらプローブは自動化オリ
ゴヌクレオチド合成法を含む, 定型的な方法を用いて調
製され得る。有用なプローブには，例えば,本明細書で
開示されたクローン5-1-1 および付加的なクローン, そ
して, cDNAライブラリーをプローブする際に有用な後述
の種々のオリゴマーがある。HCV ゲノムのどの独特な部
分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメントの長さが
長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるの
であるが，プローブとして使用するには完全な相補性が
望まれる。
【０１０７】診断用としてこのようなプローブを使用す
るには，血液あるいは血清のような分析されるべき生物
学的試料は, 必要であれば, そこに含有されている核酸
を抽出するために処理される。この試料から得られた核
酸は, ゲル電気泳動あるいは他のサイズ分離手段にかけ
られ得る。あるいは，この核酸試料は，サイズ分離を行
うことなくドットブロットされ得る。次にこのプローブ
は標識化される。プローブを標識するための適当な標識
物, および方法は当該分野では公知であり, それには例
えば, ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理
で取り込まれた放射性標識物, ビオチン螢光プローブ,
および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出され
た核酸は, 次に, 適当な厳密さのハイブリダイゼーショ
ン条件下で, 標識されたプローブと共に処理される。
【０１０８】このプローブは, HCV ゲノムに完全に相補
的に作成され得る。従って, 偽陽性を防ぐために, 通
常, 厳密性の高い条件が望まれる。しかし，プローブが
異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補性を有する場合
のみに，厳密性の高い条件が使用される。ハイブリダイ
ゼーションの厳密さは，ハイブリダイゼーションおよび
洗浄工程中の多くの因子（温度, イオン強度, 時間の長
さおよびホルムアルデヒドの濃度を含む）により決定さ
れる。これらの因子は，例えばManiatis,T(1982)により
概説されている。
【０１０９】一般に, このHCV ゲノム配列は, 感染個体
の血清中に比較的低レベル（つまり，１mlあたり約102
〜103 個の配列）で, 存在する。このレベルはハイブリ
ダイゼーションアッセイにおいて増幅手法が用いられる
ことが必要であり得ることを示している。そのような手
法は当該分野では公知である。例えばEnzo Biochemical
Corporationの「Bio-Bridge」システムでは，DNA プロ
ーブに未修飾の3'−ポリ−dTテールを付加するために,
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて
いる。ポリdTテールを付加したプローブは標的となるヌ
クレオチド配列にハイブリダイズされ，ついで，ビオチ
ン修飾ポリＡにハイブリダイズされる。PCT 出願84/035
20およびEPA124221 には次のような方法のDNA ハイブリ
ダイゼーションアッセイが記述されている：(1) 被分析
物を, 酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な単鎖DNA
プローブにアニールする; および(2) 得られたテールが
付加された二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズさせる。EPA20451は次のような方法のDNA ハ
イブリダイゼーションアッセイが記述されている。この
方法では，分析物であるDNA を，例えば, ポリdTテール
のようなテールを有するプローブと接触させ, 次に増幅
鎖と接触させる。この増幅鎖は, プローブのテールとハ
イブリダイズするポリＡ配列のような配列を有し, 複数
の標識鎖を結合することが可能である。特に望ましい方
法では, まず血清中標的HCV 配列が約10,000倍, つまり
約106 配列／mlとなるように，標的HCV 配列の増幅が行
われる。これは，例えば，Saiki ら(1986)の方法によっ
て行なわれ得る。この増幅された配列は, ハイブリダイ
ゼーションアッセイ法を用いて検出され得る。このハイ
ブリダイゼーションアッセイ法は, 本願出願人による係
属中の米国出願（1987年10月15日出願; 代理人のDocket
No. 2300-0171）中に記載されており，これは，参考文
献としてここに取り入れられている。106／mlのレベル
で配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ
法では，単鎖の分析すべき核酸に結合し,多数の単鎖標
識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利用す
る。標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる, 適
当な溶液相のサンドイッチアッセイ, およびプローブの
調製法は, 1987年６月16日に公開された本願出願人によ
るEPO 225,807 に記載されており, これを参考文献とし
てここに取り入れる。
【０１１０】このプローブは診断用キット中に組み入れ
ることができる。診断用キットは,プローブDNA を有し,
このプローブDNA は標識されているか，あるいはこの
プローブDNA は標識されておらず，標識用の成分がキッ
ト中に入っている。このキットにはまた, 特定のハイブ
リダイゼーションのプロトコルに必要な他の試薬および
材料（例えば, 標準品, およびこのテストを行なうため
の指示書）が適当に包装されて含まれる。
【０１１１】II.I. イムノアッセイおよび診断用キット HCV 抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプチ
ド, およびこれらのポリペプチドのHCV 特異的エピトー
プに対して生じる抗体は, イムノアッセイにおいて, 例
えば血液または血清試料を包含する生物学的試料におけ
るHCV 抗体の存在, あるいはウイルスおよび／またはウ
イルス抗原の存在を検出するために有用である。上記HC
V 抗体は, 例えば, IV.A節で記載されたクローン由来で
あり，あるいは, このクローン内にコードされ, そして
それらの複合体である。上記HCV特異的エピトープに対
して生じる抗体については，例えば, IV.E節を参照され
たい。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うこ
とが可能であり，これらアッセイの多様性については当
該分野では既知である。例えば, このイムノアッセイで
は，１種のウイルス抗原が利用され得る。このウイルス
抗原は, 例えば, IV.A節で記載のHCV cDNAを有するクロ
ーンのいずれか由来のポリペプチド, あるいはこれらク
ローンのcDNA由来の複合cDNA由来のポリペプチド, ある
いはこれらのクローンのcDNAが誘導されるHCV ゲノム由
来のポリペプチドである。あるいは，このイムノアッセ
イには，これらの源由来のウイルス抗原の組合せが用い
られ得る。例えば, ウイルスのエピトープに対する１種
のモノクローナル抗体, ひとつのウイルスの抗原に対す
るモノクローナル抗体の組み合わせ, 異なるウイルス抗
原に対する複数のモノクローナル抗体, 同一のウイルス
抗原に対するポリクローナル抗体, あるいは異なるウイ
ルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。
プロトコルは, 例えば，競合分析法, 直接分析法, ある
いはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができ
る。このプロトコルではまた，固体支持体を用いるか，
あるいはこのプロトコルは, 免疫沈澱法であり得る。ほ
とんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの
使用を含む。この標識物には例えば, 螢光分子，化学発
光分子, 放射性分子あるいは染色分子がある。このプロ
ーブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であ
る。その例としては，ビオチンおよびアビジンを利用す
るアッセイ, および酵素標識および酵素媒介イムノアッ
セイ（例えば, ELISA アッセイ）がある。
【０１１２】HCV のフラビウイルスモデルにより，ビリ
オンの構造タンパクに対する診断用エピトープの位置の
推定が可能となる。C, プレM , M およびE ドメインは
すべて，ウイルス抗原を検出するために, 特に診断用
に，有意な可能性のあるエピトープを含有していると考
えられる。同様に，非構造タンパクのドメインは，重要
な診断用エピトープ（例えば，推定のポリメラーゼをコ
ードするNS5;および推定の補体結合抗原をコードするNS
1)を有することが予想される。これらの特異的ドメイン
由来のエピトープを有する組換えポリペプチドあるいは
ウイルスのポリペプチドは，感染血液提供および感染患
者におけるウイルス抗体の検出に有用である。
【０１１３】さらに，Eおよび／またはMタンパクに対す
る抗体がNANBHによって引き起こされるHCV 患者および
感染血液提供者のウイルス抗原を検出するイムノアッセ
イにおいて用いられ得る。さらに，これら抗体は急性期
のドナーおよび患者を検定するのに非常に有用である。
【０１１４】免疫診断に適し, 適切に標識された試薬を
有するキットが, 適切な材料を適当な容器中に包装する
ことによって得られる。この適切な材料には, HCV エピ
トープを有する本発明のポリペプチド, あるいはHCV エ
ピトープに対する抗体, およびアッセイの遂行に用いら
れる他の試薬および物質, さらにアッセイの指示書のセ
ットを含む。
【０１１５】II．Ｊ．ウイルスゲノムに対するcDNAのプ
ローブを用いた，HCV ゲノム，ビリオンおよびウイルス
抗源の他の特性決定 IV．Ａ．節に記載したクローンのHCV cDNA配列の情報
は，第１図〜第46図に示すように，HCV ゲノムの配列と
HCV 因子の同定と単離とについての情報をさらに得るた
めに用いられ得，その結果，ゲノムの性質，ウイルス粒
子の構造，およびウイルスが有する抗原の性質を含めた
ウイルスの特性決定の助けになる。さらに，この情報に
よって，付加的なポリヌクレオチドプローブ，HCV ゲノ
ム由来のポリペプチド，およびHCV が原因のNANBH の診
断および／または治療に有用なHCVエピトープに対応す
る抗体が得られるようになる。
【０１１６】上記クローンのcDNA配列の情報は，IV．Ａ
節に記載されたクローンのcDNAの起源であるHCV ゲノム
の未確定領域由来の他のcDNA配列を単離するためのプロ
ーブを設計するのに有用である。例えば，約８個または
それ以上，好ましくは20個またはそれ以上のヌクレオチ
ドの配列を有する標識化プローブは，第１，第３，第
６，第９〜10，第15〜17および第40〜46図に示すHCV cD
NA配列の群の5'末端または3'末端に近い領域由来のもの
であり，HCV cDNAライブラリーから重複cDNA配列を単離
するのに用いられ得る。上記クローンのcDNAと重複する
これらの配列は，上記クローンのcDNAの起源でないゲノ
ムの領域由来の配列も含んでいるが，IV．Ａ節に記載の
クローンのcDNAと必らずしも重複しない，他の重複断片
を同定するためのプローブを合成するのに利用すること
ができる。HCV ゲノムが切断され，そのセグメントが共
通の配列を欠いていなければ，ウイルスゲノム由来の重
複cDNAを単離する技術を利用して，全ウイルスゲノムの
配列を決定することができる。これとは異なり，ゲノム
が切断されていて共通配列を欠いている場合は，ゲノム
の配列は，IV．Ａ節に記載したクローンの単離および配
列決定の技術を用い，クローン５−１−１を単離するの
に用いたのと同様に，λgt11 HCV ライブラリーを血清
学的にスクリーニングし，cDNA単離物の配列を決定し，
単離されたcDNAを利用して重複断片を単離することによ
って，決定することができる。あるいは，ゲノムセグメ
ントの特性決定は，精製されたHCV 粒子から単離された
ウイルスゲノムで行うことができる。HCV 粒子を精製
し，精製中の粒子を検出する方法は後述する。ポリヌク
レオチドのゲノムのウイルス粒子からの単離工程は，当
該技術分野では公知であり，利用される一方法を実施例
IV．Ａ．１. に示す。単離されたゲノムのセグメント
は，次に，クローン化され配列決定され得る。このよう
に，ここで提供される情報によって，その性質にかかわ
りなく，HCV ゲノムをクローン化し配列を決定すること
ができる。
【０１１７】cDNAライブラリーを構築する方法は，当該
技術分野では公知であり，すでに記載し，あるいは後で
述べられる。λgt11内にHCV cDNAライブラリーを構築す
る方法は，IV．Ａ．節ですでに述べられている。しか
し，核酸プローブでスクリーニングするのに有用なcDNA
ライブラリーもまた，当該技術分野で公知の他のベクタ
ー内，例えばλgt10〔ヒュインら（Huynh et al ），19
85年〕内で構築することができる。第１〜46図のcDNA由
来のプローブ，およびこれらcDNA由来のポリヌクレオチ
ドから合成されたプローブによって検出された，HCV 由
来のcDNAは，単離されたポリヌクレオチドを，適当な制
限酵素で切断することによって，クローンから単離し，
配列を決定することができる。例えば，クローン５−１
−１中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単離と配列決定
とに使用される手法については，IV．Ａ．３節およびI
V．Ａ．４節を；クローン81中のHCV cDNAと重複するHCV
cDNAの単離と配列決定とについては，IV．Ａ．５〜I
V．Ａ．７節を；そして，他のクローン（クローン36）
およびクローン81と重複するクローンの単離と配列決定
とについては，IV．Ａ．８節およびIV．Ａ．９節を参照
されたい。
【０１１８】これらの重複HCV cDNA由来の配列情報は，
ウイルスゲノム内の相同領域と異なる領域とを決定する
のに有用であり，このことにより，異なる種類のゲノム
および／または欠陥粒子（defective particles ）の集
団の存在を示すことができる。II．Ｇ．節に記載の手法
を利用して，HCV の単離（後述する）中に，生物学的試
料中のHCV ，HCV 抗原またはHCV 核酸を検出することは
また，ハイブリダイゼーションプローブを設計するのに
有用である。さらに，重複cDNAは，クローン５−１−
１，36，81，91および１−２内ならびにIV．Ａ．節に記
載の他のクローン内にコードされているポリペプチドを
コードするHCV ゲノム由来のポリペプチドの発現ベクタ
ーを作製するのに利用できる。HCV エピトープを有する
これらのポリペプチドを作製する技術と，ポリペプチド
に含有されているHCV エピトープに対応する抗体とその
用途に関する技術とは，クローン５−１−１，32，35，
36，１−２，81および91に含まれるNANBV cDNA配列由来
のポリペプチドについて記載され，すでに検討されまた
後にも検討される技術と類似する。
【０１１９】クローン５−１−１，32，35，36，81，9
1，１−２およびIV．Ａ．節に記載の他のクローンに含
まれているcDNA配列の群内に，HCV に特有のものと考え
られるエピトープを含有する抗原がコードされている。
つまり，これらの抗原に対する抗体がHAV もしくはHBV
に感染した個体に欠けており，そしてHCV に感染してい
ない個体に欠けている（IV．Ｂ．節に示す血清学的デー
タ参照）。さらに，これらのcDNAの配列情報と，HAV ，
HBV ，HDV の配列および遺伝子バンクのゲノム配列とを
比較すると，これらのcDNAと上記の起源のポリヌクレオ
チドの配列とには最小の相同性が存在することが示され
ている。このように，これらクローンのcDNA内にコード
されている抗原に対する抗体は，感染した個体から単離
したBB-NANBV 粒子を同定するのに用いることができ
る。さらに，この抗体は，NANBH 因子の単離にも有用で
ある。
【０１２０】HCV 粒子は，BB-NANBVに感染した個体由来
の血清または細胞培養物から，以下のような当該技術分
野で公知の方法で単離することができる。公知の方法と
しては，例えば，沈降法もしくは排除法のようなサイズ
識別に基づく方法；密度勾配による超遠心分離法のよう
な密度に基づく方法；ポリエチレングリコールのような
試薬による沈澱法；またはアニオンもしくはカチオン交
換物質，疎水性によって結合する物質のような種々の物
質およびアフィニティカラムのカラムによるクロマトグ
ラフィー法がある。この分離工程中に，HCV の存在は次
のような方法で検出できる。すなわち，先に述べたHCV
cDNA由来のプローブを用いて，抽出されたゲノムをハイ
ブリダイゼーション分析する方法；または第１〜46図に
示すcDNA配列の群内にコードされたHCV 抗原に対する抗
体および先に述べた重複HCV cDNA配列内にコードされた
HCV 抗原に対する抗体をプローブとして用いる免疫検定
法（II．I ．節参照）がある。抗体はモノクローナル抗
体であってもポリクローナル抗体であってもよく，免疫
検定法にこれら抗体を使用する前に精製することが望ま
しい。クローン５−１−１内にコードされた抗原に対す
るポリクローナル抗体の精製法は，IV．Ｅ．節に記載さ
れているが，類似の精製法を，他のHCV 抗原に対する抗
体に利用することができる。
【０１２１】第１〜46図に示すcDNAの群内にコードされ
たHCV 抗原とに対する抗体は，固体の支持体に固定され
ており，免疫アフィニティクロマトグラフィーによるHC
V の単離に有用である。免疫アフィニティクロマトグラ
フィーの手法は，当該技術分野で知られており，例え
ば，抗体を固体の支持体に固定しその免疫選択活性を保
持する方法がある。この方法には，抗体が支持体に吸着
されている方法〔例えば，カースタック（Kurstak） の
ENZYME IMMUNODIAGNOSIS，31〜37頁参照〕および抗体が
支持体と共有結合されている方法がある。一般に，これ
らの方法は，抗原を固体支持体に共有結合させて使用す
る方法と同様であり，それはII．Ｃ．節に概略記載され
ているが，スペーサー茎が二官能性のカップリング試薬
に含まれ，抗体の抗原と結合する部位が近づきやすいよ
うになっている。
【０１２２】精製処理中に，HCV の存在が，すでに述べ
た第１〜46図に示すHCV cDNA配列の群および重複HCV cD
NA配列由来のポリヌクレオチドをプローブとして利用す
る核酸ハイブリダイゼーション法によって検出および／
または確認される。この場合，画分は，ウイルス粒子の
崩壊を起こすような条件下で，例えば，キレート試薬の
存在下およびII．Ｈ．節にも記載したハイブリダイゼー
ション法によって検出されるウイルス核酸の存在下で，
界面活性剤によって処理される。単離された粒子がHCV
を誘発する因子であるということは，単離されたウイル
ス粒子をチンパンジーに感染させ，次いでNANBH の徴候
が感染によるものであるか否かを決定することによって
確認することができる。
【０１２３】次に，精製された調製物から得たウイルス
粒子は，さらに特性決定される。そのゲノム核酸が精製
された。このゲノム核酸がRNase に対して感受性でDNas
e Ｉに感受性でないことから，そのウイルスがRNA ゲノ
ムで構成されていることが明らかである（後述のIV．
Ｃ．２．節参照）。そのゲノム核酸のストランドの状態
（strandedness）および円形性（circu larity）である
か非円形性であるかということは，公知の技術，例えば
それを電子顕微鏡により視覚化すること，密度勾配によ
り移動させること，および沈降特性を調べることによっ
て測定される。捕捉されたHCV ゲノムがHCV cDNAの負の
フトランドとハイブリダイズすることから，HCV は正の
ストランドのRNA ゲノムを含むことが明らかである（I
V．Ｈ．１節参照）。このような手法は，例えば，METHO
DS IN ENZYMOLOGY に記載されている。さらに，精製さ
れた核酸は，クローン化され，公知の方法（例えば，ゲ
ノム物質はRNA なので逆転写法）によって配列を決定す
ることができる。例えば，マニアティス（1982年），お
よびグローバー（Glover）（1985年）の文献を参照され
たい。ウイルス粒子由来の核酸を利用すれば，それが切
断されていてもいなくても，全ゲノムの配列を決定する
ことができる。
【０１２４】14ｉから39ｃまでの結合クローン（第29〜
34図参照）の連続ORF 内にコードされたポリペプチドの
相同性の試験を行うと，HCV ポリペプチドが，フラビウ
イルス（flaviviruses）の保存された領域内の対応する
タンパクと相同性のある領域を有することが示される。
この具体例は，IV．Ｈ．３．節に示されている。この知
見には，多くの重要な効果がある。第１に，この情報
は，HCV が正のストランゲノムを有し，その大きさが約
10,000ヌクレオチドであることを示す試験結果ととも
に，HCV がフラビウイルスかまたはフラビ様ウイルスで
あることを示唆していると考えて矛盾しない。一般に，
フラビウイルスのビリオンとゲノムとは，比較的変化し
ない構造と組織を有し，このことは公知である。ライス
ら（Rice etal）（1986年），およびブリントン エム
エー(Brinton M. A.),（1988年）を参照されたい。従
って，ポリペプチドＣ．プレM/M およびＥをコードする
構造遺伝子は，クローン14ｉの上流の遺伝子の5'末端に
位置し得る。さらに，他のフラビウイルスと比較するこ
とによって，これらのタンパクをコードする配列の正確
な位置を予想することができる。
【０１２５】クローン14ｉのゲノムの上流の配列の単離
は，本明細書に示した多くの方法により達成され得，そ
のことは，当業者に自明である。例えば，ゲノム“ウォ
ーキング法（ genome “Walking ”technique ）が，ク
ローン14ｉ内のゲノムの5'側にありそのクローンと重複
する他の配列を単離するのに用いられ得るが，この方法
によって，付加的な配列の単離が行われる。この手法
は，後述のIV．Ａ．節で十分に述べられている。例え
ば，フラビウイルスは，保存されたエピトープと保存さ
れた核酸配列の領域とを有することが知られている。保
存された配列を含むポリヌクレオチドは，HCV ゲノムを
捕捉するプローブとして用いて，それを単離することが
できる。さらに，これらの保存された配列は，第25図に
示すHCV cDNA由来の配列とともに，ポリメラーゼの連鎖
反応の技術を用いて，クローン14ｉの配列の上流のゲノ
ム配列を増幅する系に使用するプライマーを設計するの
に利用される。この例は後述される。
【０１２６】HCV の構造もまた，決定され，その成分が
単離され得る。その形態と大きさは，例えば電子顕微鏡
によって決定され得る。コート抗原もしくはエンベロー
プ抗原のような特異的なウイルスポリペプチド抗原，ま
たは核酸結合タンパク，コア抗原のような内部抗原，お
よびポリヌクレオチドポリメラーゼの同定と位置決定と
は，例えば，抗原が大きなもしくは小さなウイルス成分
として存在するか否かを測定すること，および単離され
たcDNA内にプローブとしてコードされた特異的抗原に対
する抗体を利用すること，によって行なわれ得る。この
情報は，ワクチンを設計するのに有用である。例えば，
ワクチン調製物に外部抗原を含有させることが好まし
い。多価ワクチン（multivalent vaccine ）は，例えば
Ｅのような構造タンパクをコードするゲノム由来のポリ
ペプチド，および例えば非構造ポリペプチドもしくは構
造ポリペプチドのような，ゲノムの別の部分由来のポリ
ペプチドで構成されていてもよい。
【０１２７】II．Ｋ．HCV 複製用の細胞培養系と動物モ
デル系 HCV がフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスである
という示唆によって，HCV 増殖法についての情報が提供
される。“フラビ様”という用語は，そのウイルスが，
フラビウイルスの公知の保存された領域に対して有意の
相同性を示し，そして，そのゲノムの大部分が単一のOR
F であることを意味する。フラビウイルスの培養法は，
当業者に公知である〔例えば，ブリントン（1986年）お
よびストラー，ブイ（Stollar, V.）（1980年）の総論
を参照されたい〕。一般に，HCVを培養するのに適切な
細胞もしくは細胞としては，フラビウイルスの複製を維
持することが知られているもの，例えば次のものがあ
る：サル腎臓細胞系（例えば，MK2 ，VERO）；ブタの腎
臓細胞系（例えば，PS）；ベビーハムスターの腎臓細胞
系（例えば，BHK ）；ネズミマクロファージ細胞系（例
えば，P388D1，MK1 ，Mm1 ）；ヒトマクロファージ細胞
系（例えば，U-937 ）；ヒト末梢白血球；ヒトの付着性
単球；肝細胞もしくは肝細胞系（例えば，HUH7，HEPG2
）；胚もしくは胚細胞系（例えば，ニワトリの胚繊維
芽細胞）；または無脊椎動物由来の細胞系。 上記無脊
椎動物由来の細胞系として好ましいのは昆虫由来のもの
（例えば，ショウジョウバエの細胞系）であり，さらに
好ましいのは節足動物由来のもので，例えば蚊の細胞系
〔例えば，Ａ．アルボピクツス（A. Albopictus ），イ
ーデス イージプチー（Aedes aegypti ），クーテック
ス トリテニオリンクス（Cutex tritaeniorhynchus
）〕もしくはダニ細胞系〔例えば，RML-14 ダーマセ
ンター パルマペルツス（Dermacentor parumapertu
s）〕である。
【０１２８】一次肝細胞を培養しついでHCV に感染させ
てもよいし，あるいは肝細胞培養物を感染した個体（例
えば，ヒトもしくはチンパンジー）の肝臓から得てもよ
い。後者の場合は，生体内で感染した細胞が生体外で継
代された例である。さらに，種々の永久増殖細胞化法
を，肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いること
ができる。例えば，一次肝臓培養物（肝細胞集団の集積
の前後）は，種々の細胞と融合され，安定性を保持す
る。例えば，永久的または半永久的細胞系を創製するた
めに，培養物を，形質転換ウイルスに感染させるか，ま
たは形質転換遺伝子でトランスフェクトさせる。さら
に，例えば，肝臓培養物中の細胞は，融合されて，確立
された細胞系（例えば，HepG2 ）となり得る。細胞融合
法は，当該技術分野で既知であり，例えば，ポリエチレ
ングリコール，センダイウイルスおよびエプスタイン−
バールウイルスのような融合因子が使用される。
【０１２９】上記で述べたように，HCV はフラビウイル
スもしくはフラビ様ウイルスである。従って，細胞系の
HCV 感染は，おそらく，細胞をフラビウイルスに感染さ
せる当該技術分野で公知の方法によって達成することが
できる。これらの方法には，例えば，細胞内にウイルス
が侵入しうる条件下で，細胞をウイルス調製物とともに
インキュベートする方法がある。さらに，細胞を単離さ
れたウイルスポリヌクレオチドでトランスフェクトする
ことによってウイルスの産生物を得ることができる。ト
ガウイルス（Togavirus ）およびフラビウイルスのRNA
が，種々の脊椎動物の細胞系〔フェファーコーン（Pfef
ferkorn ）およびシャピロ（Shapiro ），1974年〕およ
び蚊細胞系〔ペレーグ（Peleg ），1969年〕に感染性で
あることが知られている。組織培養細胞を，RNA 二本
鎖，正のストランドのRNA およびDNA （cDNAを含む）で
トランスフェクトする方法は，当該技術分野では公知で
あり，例えば，エレクトロポーレーション法（electrop
oration ），およびDEAE- デキストラン（DEAE-Dextra
n）もしくはリン酸カルシウムによる沈降法を用いる手
法がある。HCV RNA の多くの起源を，完全ゲノムに対応
するHCV cDNAの転写を生体外で行うことによって得るこ
とができる。この物質もしくはクローン化されたHCV cD
NAを用いたトランスフェクションによって，ウイルスが
複製されそしてウイルスが生体外で増殖するようになる
はずである。
【０１３０】培養細胞に加えて，動物モデル系がウイル
ス複製に使用できるが，フラビウイルスが動物系に存在
するということは，当業者には公知である〔例えば，モ
ナース（Monath）による総説（1986年）参照〕。従っ
て，HCV の複製は，チンパンジーで起こるだけでなく，
例えば，マーモセットやサックリングマウスでも起こ
る。
【０１３１】II．Ｌ．HCV に対する抗ウイルス剤のスク
リーニング HCV の細胞培養物と動物モデル系とを利用することによ
って，HCV の複製を阻害する抗ウイルス剤，特に優先的
に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を阻害
する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。
これらのスクリーニング法は，当業者には知られてい
る。一般に，抗ウイルス剤は，ウイルスの複製を維持す
る細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と，動物
モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害する
効果（および低レベルの毒性）について種々の濃度で試
験される。
【０１３２】HCV 抗原とHCV ポリヌクレオチドを検出す
るためのここに記載された方法と組成物は，ウイルス複
製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方法として，
細胞プラーク検定法もしくはID50検定法の代わりにこれ
らの方法よりもおそらく高感度の方法を提供することか
ら，抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。例え
ば，ここに記載したHCV ポリヌクレオチドプローブは，
細胞培養で産生されたウイルス核酸を定量するのに利用
できる。このことは，例えば感染した細胞の核酸と標識
したHCV ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーションまたは競合ハイブリダイゼーションによって達
成することができた。例えば，また抗HCV 抗体は，本明
細書に記載の免疫検定法を利用して細胞培養物中のHCV
抗原を同定および定量するのに利用できる。さらに，感
染細胞の培養物中のHCV 抗原を競合検定法で定量するこ
とは望ましいことであるから，本明細書に記載したHCV
cDNA内にコードされたポリペプチドは，これらの競合検
定法に有用である。一般に，HCV cDNA由来の組換え体HC
V ポリペプチドに標識化し，この標識化ポリペプチドと
HCV ポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された
抗原によって阻害されるのを監視する。さらに，これら
の方法は，HCV が細胞系内で細胞死を起こすことなく複
製できる場合，特に有用である。
【０１３３】II．Ｍ．弱毒化されたHCV 株の調製 上記のことに加えて，組織培養系および／または動物モ
デル系を利用して弱毒化されたHCV 株を単離することが
できる。これらの株は，ワクチン用もしくはウイルス抗
原単離用に適している。弱毒化ウイルス株は，細胞培養
および／または動物モデルでの複数の継代の後に単離可
能である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検出
は，当該技術分野で公知の方法で達成できる。それに
は，例えば，HCV にコードされたひとつまたはそれ以上
のエピトープに対する抗体をプローブとして用いるこ
と，あるいは，少なくとも約８個のヌクレオチドのHCV
配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いるこ
とが包含される。その代わりにあるいはそれに加えて，
弱毒化株は，本明細書に記載のHCV のゲノム情報と，組
換え技術を利用して構築することができる。一般に，例
えば病原に関連するポリペプチドをコードするがウイル
スの複製は可能であるようなゲノム領域を除去すること
を試みることができる。さらに，このゲノム構築によっ
て，HCV に対する抗体の中和を起こさせるエピトープの
発現が可能になる。次いで，変化させたゲノムは，HCV
複製が可能な細胞と，ウイルス複製が可能な条件下で増
殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒化HCV
株は，ワクチン製造のみならずウイルス抗原の商業的生
産ソースとしても有用である。その理由は，これらウイ
ルスの処理が，ウイルス生産を行う従業員に対してそれ
ほど厳重な保護対策をとらなくてもよいからである。
【０１３４】III. 一般的方法 ウイルスからのゲノムの抽出，cDNAライブラリーの調製
とプロービング，クローンの配列決定，発現ベクターの
構築，細胞の形質転換，ラジオイムノアッセイおよびEL
ISA 検定法のような免疫検定の実施，培地での細胞の培
養などに用いられる一般的な方法は，当該技術分野で公
知であり，これらの方法を記載した実験室のマニュアル
を入手することができる。しかし，一般的な指針とし
て，上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料を
現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
【０１３５】III.Ａ．宿主および発現制御配列 原核および真核の宿主細胞は，指定された宿主に適合す
る適切な制御配列が用いられた場合に，所望のコード配
列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち，
エシェリヒア コリ（E. coli）が最も汎用される。原
核細胞の発現制御配列には，必要に応じてオペレーター
部分を有するプロモーター，およびリボソーム結合部位
が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスフ
ァーベクターは，通常，例えば次のようなものに由来す
る。つまり，アンピシリンおよびテトラサイクリンに対
する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるpB
R322および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有す
る種々のpUC ベクター由来である。これらのマーカー
は，適宜選択することによって，好適な形質転換細胞を
得るのに利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配
列には，β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラ
クトースプロモーター系〔チャンら（Chang etal ），1
977年〕，トリプトファン（trp）プロモーター系〔ゴー
デルら（Goeddel et al ），1980年〕およびλ由来PL
プロモーターおよびＮ 遺伝子リボソーム結合部位〔シ
マタケら（Shimatake et al）， 1981年〕，およびtrp
およびlac UV5 プロモーターの配列由来のハイブリッド
tac プロモーター〔ド ボールら（De Boer et al ），
1983年〕がある。上記の系は，特にE. coliに適合す
る。必要であれば，バシラスもしくはシュードモナス属
の菌株のような他の原核宿主を，対応する制御配列とと
もに用いてもよい。
【０１３６】真核宿主としては，酵母および培養系内の
哺乳動物の細胞がある。サッカロミセス セレビシエ
（ Saccharomyces cerevisiae）およびサッカロミセス
カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsberge
nsis）が最も普通に用いられる酵母宿主であり，便利な
真菌宿主である。酵母に適合するベクターは，栄養要求
突然変異体に原栄養性を与えるかまたは野生型菌株に重
金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転
換された形質転換体を選択することができるようにする
マーカーを保有する。酵母に適合するベクターとして
は，２ミクロンの複製起源〔ブローチら（Broach et a
l），1983年〕，CEN3およびARS1の組み合わせ，または
確実に複製を行わせる他の手段（例えば，適切なフラグ
メントを宿主細胞のゲノムに組込ませるような配列を採
用することができる。酵母ベクターの制御配列は，当該
技術分野で公知であり，解糖酵素合成のプロモーター
〔ヘスら（Hess et al），1968年；ホーランドら（Holl
and et al ），1978年〕を含み，このようなプロモータ
ーには，3-ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン
（Hitzeman），1980年〕に対するプロモーターが含まれ
る。ターミネーターには，例えばエノラーゼ遺伝子由来
のターミネーター〔ホーランド（Holland ），1981年〕
が含まれ得る。特に有用な制御系は，グリセルアルデヒ
ド3-リン酸脱水素酵素（GAPDH ）プロモーターもしくは
アルコール脱水素酵素（ADH ）調節性プロモーター，GA
PDH 由来のターミネーター，および分泌が所望の場合に
は，酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さ
らに，作動可能に連結されている転写調節領域および転
写開始領域は，野生型生物に本来関係しないものであっ
てもよい。これらの系については，欧州特許公開第120,
551 号（1984年10月３日公開）；同第116,201 号（1984
年８月22日公開）；および同第164,556 号）（1985年12
月18日公開）に詳細に記載されており，これらはすべて
本発明の出願人によるものであり，本願に引用文献とし
て記載する。
【０１３７】発現のために宿主として利用可能な哺乳類
の細胞系は当該技術分野で知られており，the American
Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多く
の永久増殖化細胞系がある。それには，Hela細胞，チャ
イニーズハムスター卵巣（CHO ）細胞，ベビーハムスタ
ー腎臓（BHK ）細胞および多くの他の細胞系がある。哺
乳類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技術分野
では公知であり，それには，シミアンウイルス40（Simi
an Virus）（SV40）〔フィアース（Fiers），1978
年〕，ラウス肉腫ウイルス（RSV），アデノウイルス（A
DV）およびウシ乳頭腫ウイルス（BPV）由来のプロモー
ターのようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳類
細胞はまた，ターミネーター配列およびポリＡ付加配列
を必要とし，発現を増大させるエンハンサー配列も含ま
れ，そして，遺伝子の増幅を引き起こす配列も望まし
い。これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類
の細胞で複製させるのに適切なベクターには，ウイルス
レプリコン，またはNANBV エピトープをコードする適当
な配列を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。
【０１３８】III.Ｂ. 形質転換 形質転換は，ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公
知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例
えば，ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージング
し，次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法
およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用
される形質転換法は，形質転換すべき宿主に依存する。
例えば，E. coli宿主細胞を，BB-NANBV配列を有するλ
gt11で形質転換することが後述の実施例の項で述べられ
ている。直接取込み法による細菌の形質転換には，一般
に，塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が
用いられる〔コーヘン（Cohen ），1972年；マニアティ
ス，1982年〕。直接取込み法による酵母の形質転換は，
ヒネンら（Hinnen et al），1978年，の方法を用いて行
われ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換は，グ
ラハム（Graham）およびファン デル エプ（Van der
Eb）1978年，のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法
の種々の公知の改変法を用いて行われ得る。
【０１３９】III.Ｃ．ベクターの構築 ベクターの構築には，当該技術分野で公知の技術が用い
られる。部位特異的なDNA の切断が，適切な制御酵素を
用い，これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定
されている条件下で処理することによって，実施され
る。一般に，約１μg のプラスミドもしくはDNA 配列
は，約20μl の緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて37℃
の条件下で１〜２時間インキュベートすることにより切
断される。制限酵素とともにインキュベートした後，タ
ンパクを，フェノール／クロロホルムによって抽出して
除去し，エタノールで沈澱させてDNA が回収される。切
断断片は，Methods in Enzymology ，65巻，499 〜560
頁，1980年，に記載された一般的な方法に従って，ポリ
アクリルアミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳
動法により分離することができる。
【０１４０】粘着末端を有する切断断片は，混合物に存
在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート
（dNTP）の存在下で，E. coli DNA ポリメラーゼＩ
（クレノー）を用いて平滑末端とされ得る。S1ヌクレア
ーゼによる処理も行なわれ得，一本鎖DNA 部分の加水分
解が行われる。
【０１４１】T4 DNA リガーゼとATP とを用いて標準の
緩衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘着末
端の連結には，平滑末端の連結よりも，ATP およびリガ
ーゼの必要量が少い。ベクター断片が連結混合物の一部
として用いられる場合には，ベクター断片は，細菌アル
カリホスファターゼ（BAP ）または子ウシ腸アルカリホ
スファターゼで処理され，5'末端のリン酸を除去して，
ベクターの再連結を防止することが多い。あるいは，不
必要な断片の制限酵素による切断を利用して連結を防止
するのに利用することができる。
【０１４２】連結混合物は，E. coliのような適切なク
ローニング宿主に形質転換され，次いで，例えば，抗生
物質耐性によって成功裏に形質転換された形質転換体が
選択され，そして正しい構築物がスクリーニングされ
る。
【０１４３】III.Ｄ． 所望のDNA 配列の構築 合成オリゴヌクレオチドは，ワーナー（Warner）（1984
年）が発表した自動オリゴヌクレオチド合成装置を用い
て調製され得る。必要に応じて，合成DNA 鎖は，反応の
標準条件を用いて，32P-ATP の存在下，ポリヌクレオチ
ドキナーゼで処理することによって32P で標識化され得
る。
【０１４４】DNA 配列は，cDNAライブラリーから単離さ
れたものも含めて，公知の方法で修飾することができ
る。そのような方法としては，例えば，ゾラー（Zolle
r）（1982年）が発表した部位特異的変異誘発法があ
る。概略を述べると，修飾すべきDNA を，一本鎖配列と
してファージにパッケージングし，次にプライマーとし
て，修飾すべきDNA の部分に相補的であり，それ自体の
配列内に所望の修飾が含まれている合成オリゴヌクレオ
チドを用いて，DNA ポリメラーゼで二本鎖DNA に変換す
る。得られた二本鎖DNA は，ファージを保持する宿主細
菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物（フ
ァージの各鎖の複製物を含む）は，寒天にプレートされ
てプラークが得られる。理論的には，新しいプラークの
50％が，変異した配列を有するファージを含有し，残り
の50％はもとの配列を有する。プラークのレプリカは，
正しいストランドとハイブリダイゼーション可能であ
り，かつ未修飾の配列とはハイブリダイゼーションを行
わない温度および条件下で，標識化された合成プローブ
とハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイゼー
ションにより同定された配列は，回収されクローン化さ
れる。
【０１４５】III．Ｅ．プローブによるハイブリダイゼ
ーション DNA ライブラリーは，グリンスタイン（Grunstein ）お
よびホッグネス（Hogness ）（1975年）の方法を用いて
プローブ化され得る。簡単にのべれば，この方法におい
ては，プローブ化されるべきDNA は，ニトロセルロース
フィルタ上に固定され，変性され，そして，０〜50％ホ
ルムアミド，0.75M NaCl，75mM クエン酸ナトリウム，
各々0.02％（wt/v）のウシ血清アルブミン，ポリビニル
ピロリドンおよびフィコール，50mMリン酸ナトリウム
（pH6.5 ），0.1 ％ SDS，そして100 μg ／mlキャリヤ
ーの変性DNA を含有する緩衝液で，プレハイブリダイゼ
ーションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度
（％），およびプレハイブリダイゼーションおよびこれ
に続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件
は，必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど
必要ではない条件下でのオリゴマーのプローブは，一般
に，ホルムアミドが低い濃度であり，低温および長いハ
イブリダイゼーションの時間で用いられる。cDNAもしく
はゲノムの配列由来のような30もしくは40を越えるヌク
レオチドを有するプローブを用いるときには，一般に，
例えば，約40〜42℃のような高温，および50％ホルムア
ミドのような高濃度が採用される。プレハイブリダイゼ
ーションに続いて，5'末端32P で標識したオリゴヌクレ
オチドプローブを緩衝液に添加し，この混合物中で，ハ
イブリダイゼーションの条件下にて，上記フィルターを
インキュベートする。洗浄後，処理されたフィルターを
オートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプ
ローブの位置が示される。もとの寒天プレート上の，対
応する位置のDNA を所望のDNA の起源として利用する。
【０１４６】III.Ｆ． 構築物の確認および配列決定 常套手段により，ベクターを構築する際には，連結混合
物を用いてE. coli HB101株もしくは他の適当な宿主を
形質転換し，成功裏に形質転換された形質転換体は，抗
生物質耐性もしくは他のマーカーによって選択される。
次に，得られた形質転換体から，プラスミドが，クレウ
ェルら（Clewell et al.）（1969年）の方法により調製
され，通常，さらに，クロラムフェニコールによる増幅
（クレウェル，1972年）が行なわれる。そのDNA は，単
離され，通常，制限酵素分析法および／または配列決定
法により分析される。配列決定は，サンガー（Sanger）
ら（1977）の，そしてさらにメシング（Messing ）らに
より述べられた（1981年），ジデオキシ法，あるいはマ
キシムらの方法（1980年）により実施され得る。GCに富
んだ領域において時おり観察されるバンドコンプレッシ
ョンの問題は，バールら（Barr et al）（1986年）の方
法に従って，T-デアゾグアノシン（deazo-guanosine ）
を用いることによって克服された。
【０１４７】III.Ｇ. 酵素連結イムノソルベント検定法
（ELISA 法） ELISA 法は，抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定
するのに利用され得る。この方法は，酵素と，抗原もし
くは抗体との結合に依存し，定量の標識として，結合し
た酵素の活性を用いる。抗体を測定するには，既知の抗
原を固相（例えば，マイクロプレートまたはプラスチッ
ク製カップ）に固定し，被検血清の希釈物とともにイン
キュベートし，洗浄し，酵素で標識した抗免疫グロブリ
ンとともにインキュベートし，再び洗浄する。標識化す
るために好適な酵素は，当該技術分野で公知であり，例
えば，西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合
した酵素活性は，特異的な基質を添加し，そして生成物
の生成または基質の利用率を比色法で測定することによ
って測定される。結合した酵素の活性は，結合した抗体
の量の一次関数である。
【０１４８】抗原を測定するには，既知の特異的抗体を
固相に固定し，抗原を含む被検物質を添加し，インキュ
ベートした後，固相を洗浄し，第２の酵素で標識した抗
体を添加する。洗浄後，基質を添加し，次いで酵素活性
を比色法で測定し，抗原濃度に換算する。
【０１４９】
【実施例】以下に述べるのは本発明の実施例である。こ
の実施例は説明のみを目的として提供するのであって，
本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示内
容を考慮すると，特許請求の範囲内の多くの実施態様が
当業者に明らかである。例えば，IV.A.節に述べる方法
は，もし望まれるならば繰り返し得るが，特にその必要
はない。なぜなら，本発明により提供される情報に基づ
いた所望のヌクレオチド配列の構築のための技術が使用
可能であるためである。発現はE. coliで例示されてい
るが，III.A.節でより十分に述べたような他の系も使用
され得る。ゲノム構造に由来する付加的なエピトープも
生産され得，以下に述べるように抗体を生産するのに用
いられる。
【０１５０】IV.A. HCV cDNAの調製，単離および配列決
定 IV.A.1 HCV cDNAの調製 NANB因子の原材料は，慢性NANBH のチンパンジーから得
た血漿プールであった。このチンパンジーは，プールし
たヒト血清由来の第8因子濃縮物混入バッチ中のHCVで感
染させて得られる別の慢性NANBのチンパンジー由来の血
液で，実験的に感染させられている。このチンパンジー
の血漿プールは，高レベルのアラニンアミノトランスフ
ェラーゼ活性（この活性は HCV感染による肝障害に起因
する）を有する多くの個体の血漿試料を合わせて調製さ
れたものである。静脈注射により投与されたこの血清プ
ールの10-6倍希釈液の１mlは，別のチンパンジーにNANB
Hを引き起こしたので，そのCIDは少なくとも106／mlで
ある。つまり，高いウィルス感染力価を有する。
【０１５１】高力価血漿プール由来のcDNAライブラリー
を，以下のようにして調製した。まず，ウィルス粒子を
血漿から単離した。血漿の90mlを50mM トリス−HCl（pH
8.0），１mM EDTA，100mM NaCl を含有する溶液 310ml
で希釈した。細胞破砕物を，15,000×ｇで20分間，20℃
にて遠心分離することにより除去した。次いで，得られ
た上清液中のウィルス粒子を，ベックマンSW28ローター
で28,000rpm，5時間，20℃にて遠心分離することにより
ペレットとした。ウィルスゲノムを遊離させるために，
ペレットを1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS），10mM E
DTA，10mM トリス−HCl（pH 7.5），および2mg／mlのプ
ロテイナーゼK を含有する溶液15mlに懸濁し，その後45
℃にて90分間インキュベートすることにより粒子を破砕
した。キャリアーとして0.8μgのMS2バクテリオファー
ジRNAを添加し，フェノール：クロロホルムの1：1混合
液（フェノールは0.5Mトリス−HCl（pH 7.5)，0.1％(v/
v)β−メルカプトエタノール，0.1％(w/v)ヒドロキシキ
ノリンで飽和させたもの）で上記混合液を4回抽出し，
その後クロロホルムで2回抽出することにより核酸を単
離した。 2.5倍容積の無水エタノールで−20℃にて一晩
沈澱させるのに先立って，水層を１−ブタノールで濃縮
した。ベックマンSW41ローターで 40,000rpm，90分間，
４℃にて遠心分離することにより核酸を回収し，0.05％
(v/v) ジエチルピロカーボネート処理およびオートクレ
ーブ処理してある水に溶解した。
【０１５２】上記方法により得られた核酸(＜2μg)を，
17.5mM CH3HgOHで変性させた。この変性させた核酸を鋳
型として用いてcDNAを合成し，Huynh (1985)により記載
されている方法を用いてファージλ−gt11のEcoRI部位
にクローン化した。ただし，逆転写酵素によりcDNA第一
鎖を合成する間，ランダムプライマーをオリゴ（dT）12
−18で置き換えた（Taylorら(1976)）。得られた2本鎖c
DNAをセファロースCL-4Bカラムでサイズに従って分画
し；平均サイズ約400，300，200，および100塩基対の溶
出された物質を，それぞれcDNAプール1，2，3，および4
とした。プール3のcDNAから，λ−gt11 cDNAライブラリ
ーを作成した。
【０１５３】プール3から作成したλ−gt11 cDNAライブ
ラリーを，以前に NANBHにかかったことのある患者由来
の血清と特異的に結合できるエピトープについてスクリ
ーニングした。結合ヒト抗体を125Iで放射性標識したヒ
ツジ抗−ヒトIg抗血清を用いて検出したことを除いて
は，Huynhら（1985）の方法を用い，約106個のファージ
を患者血清を用いてスクリーニングした。5個の陽性フ
ァージが同定され，精製された。次いで，この5個の陽
性ファージを，同様の方法を用いて，以前 NANBH因子に
感染したことのある８人の異なるヒト由来の血清との結
合の特異性について試験した。４個のファージが，たっ
た一人のヒト（つまり，ファージライブラリーの最初の
スクリーニングに用いられたヒト）の血清と免疫学的に
反応するポリペプチドをコードしていた。５番目のファ
ージ（5-1-1）は，8種の試験した血清のうち５種と免疫
学的に反応するポリペプチドをコードしていた。さら
に，このペプチドは，７人の正常な血液提供者由来の血
清と免疫学的に反応しなかった。それゆえ，クローン5-
1-1 は，NANBの患者由来の血清により免疫学的に特異的
に認識されるポリペプチドをコードすることがわかる。
【０１５４】IV.A.2. 組換え体ファージ5-1-1 における
HCV cDNAの配列，および該配列内にコードされるポリペ
プチドの配列 組換え体ファージ5-1-1 のcDNAを，Sangerら（1977）の
方法により配列決定した。本質的には，cDNAをEcoRIで
切断し，ゲル電気泳動を用いてサイズ分画することによ
り単離した。EcoRI切断フラグメントを M13ベクターで
あるmp18およびmp19にサブクローン化し（Messing(198
3)），Sangerら（1977）のジデオキシ鎖終止法を用いて
配列決定した。得られた配列を第1図に示す。
【０１５５】第1図においてコードされるポリペプチド
は， HCV cDNAでコードされ，該ポリペプチドが融合し
ているN−末端のβ-ガラクトシダーゼ部分と同じ翻訳フ
レーム内にある。IV.A. 節で示したように，5-1-1 の翻
訳オープンリーディングフレーム（ORF）は，NANBHに感
染した患者およびチンパンジー由来の血清により特異的
に認識されるエピトープをコードする。
【０１５６】IV.A.3 クローン5-1-1 の cDNAにオーバー
ラップする HCV cDNAの単離 クローン5-1-1のcDNAにオーバーラップする HCV cDNA
を，第1図に示すようなクローン5-1-1のHCV cDNAの配列
由来の合成ポリヌクレオチドを用いて，IV.A.1.節で記
述したのと同様に作成したλ−gt11ライブラリーをスク
リーニングすることにより得た。スクリーニングに用い
たポリヌクレオチドの配列は，次のようであった： 5'-TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA TCT CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-3'。
【０１５７】Huynh （1985）に記載の方法を用いて，λ
−gt11ライブラリーをこのプローブでスクリーニングし
た。約50,000個のクローンのうち１個のクローンが，こ
のプローブとハイブリダイズした。合成プローブとハイ
ブリダイズしたcDNAを有する３個のクローンに，81，1-
2，および91と番号をつけた。
【０１５８】IV.A.4. クローン5-1-1 の cDNAにオーバ
ーラップする HCV cDNAのヌクレオチド配列 クローン81，1-2，および91の3つのcDNAのヌクレオチド
配列は，IV.A.2.節で述べたのと本質的に同様にして決
定した。これらのクローンの配列は，ファージ5-1-1の
HCV cDNA配列に関連しており，第２図で示される。第２
図は，検出されたHCV エピトープをコードする鎖を示し
ており，ヌクレオチド配列における相同性が配列間の垂
直線により示されている。
【０１５９】クローン化されたHCV cDNAの配列は，オー
バーラップ領域で高い相同性を有する（第2図を参照の
こと）。しかし，2つの領域には相違がある。クローン1
-2の67番目のヌクレオチドはチミジンであるが，他の３
つのクローンはこの位置にシチジン残基を有する。しか
し，この位置をCまたはTのいずれかが占める場合，同じ
アミノ酸がコードされるということは注意すべきであ
る。
【０１６０】第二の相違は，クローン5-1-1が，他の3つ
のクローンには存在しない28塩基対を有することであ
る。これらの塩基対は，5-1-1のcDNA配列の開始部分に
存在し，小文字で示されている。後述のIV.D.節で論じ
るラジオイムノアッセイのデータに基づくと，HCVエピ
トープはこの28bp領域でコードされ得るということが可
能である。
【０１６１】クローン81，1-2，および91に5-1-1の28塩
基対が存在しないということは，これらのクローンのcD
NAは欠損したHCVゲノムから得られたということを意味
し得る；あるいは，28bp領域はクローン5-1-1 の末端が
人工的に変化したものであり得る。
【０１６２】クローン81および91のヌクレオチド配列に
おける小文字の配列は，単にこれらの配列が他のcDNAで
見い出されていないことを示す。なぜならば，これらの
領域にオーバーラップするcDNAはまだ単離されていない
からである。
【０１６３】クローン5-1-1，81，1-2，および91のオー
バーラップしているcDNA由来のHCVcDNA複合配列を，第3
図に示す。しかし，この図では，クローン5-1-1 に特有
の28塩基対は省略されている。この図は，複合 HCV cDN
AのORF内にコードされるポリペプチドの配列も示す。
【０１６４】IV.A.5. クローン81のcDNAにオーバーラッ
プするHCV cDNAの単離 クローン81 cDNA の配列の上流にあり，該配列とオーバ
ーラップするHCV cDNA配列の単離を，以下のようにして
行った。IV.A.1.節に記述したようにして調製したλ−g
t11 cDNAライブラリーを，クローン81の5'末端配列と相
同性を有する合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズさせることによりスクリーニングした。クローン
81の配列を第４図に示す。スクリーニングに用いた合成
ポリヌクレオチドの配列は，次のようであった： 5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3' 方法は，Huynh（1985）に記載されているのと本質的に
同じであったが，厳密な条件下でライブラリーのフィル
ターを2回洗浄した。すなわち，5×SSC，0.1％ SDS中で
55℃にてそれぞれ30分間洗浄を行った。約50,000個のク
ローンのうち1個のクローンがこのプローブとハイブリ
ダイズした。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有す
る陽性組換え体ファージを単離・精製した。このファー
ジにクローン36という番号を付けた。
【０１６５】クローン81のカルボキシル末端にオーバー
ラップする下流cDNA配列を，上流cDNA配列の単離に用い
たのと同様の方法を用いて単離した。ただし，合成オリ
ゴヌクレオチドプローブをクローン81の3'末端と相同性
を有するように調製した。スクリーニングに用いた合成
ポリヌクレオチドの配列は，次のようであった：5' TTT
GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'この後者の
配列とハイブリダイズしたcDNAを有する陽性組換え体フ
ァージを単離・精製し，クローン32という番号を付け
た。
【０１６６】IV.A.6. クローン36のHCV cDNAのヌクレオ
チド配列 クローン36のcDNAのヌクレオチド配列は，本質的に IV.
A.2.節に記述したようにして決定した。このcDNAの二本
鎖配列，クローン81のHCV cDNAとオーバーラップする該
cDNAの領域，およびORFによりコードされるポリペプチ
ドを第5図に示す。
【０１６７】クローン36のORFは，クローン81でコード
されるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内にある。このよう
に，組合せて，クローン36および81におけるORFは大き
なHCV抗原の一部を表すポリペプチドをコードする。こ
の推定 HCVポリペプチドの配列，ならびに該配列をコー
ドする二本鎖 DNA配列（クローン36および81のHCV cDNA
の結合ORF由来）を第6図に示す。
【０１６８】IV.A.7. クローン32のHCV cDNAのヌクレオ
チド配列 クローン32のcDNAのヌクレオチド配列は，クローン5-1-
1 の配列について IV.A.2.節で記述したのと本質的に同
様にして決定した。配列のデータは，クローン32組換え
体ファージのcDNA が，二つの異なる材料原由来である
ことを示した。
【０１６９】cDNAの一つのフラグメントはHCVゲノム由
来の418ヌクレオチドを有し;他のフラグメントはバクテ
リオファージMS2ゲノム由来の 172ヌクレオチドを有し
ていた。このバクテリオファージMS2ゲノムは， λ−gt
11血漿cDNAライブラリーの調製の間キャリアーとして用
いたものである。
【０１７０】HCVゲノムの配列に対応するクローン32のc
DNAの配列を，第7図に示す。クローン81の配列とオーバ
ーラップする配列の領域，およびORFによりコードされ
るポリペプチドもこの図に示す。この配列は，クローン
81によりコードされるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内に
ある一つの連続したORFを有する。
【０１７１】IV.A.8. クローン36のcDNAにオーバーラッ
プするHCV cDNAの単離 クローン36 cDNA の配列の上流にあり，該配列とオーバ
ーラップするHCV cDNA配列の単離を，クローン81のcDNA
とオーバーラップする配列について IV.A.5.節に記述し
たようにして行った。ただし，合成ポリヌクレオチドは
クローン36の5'領域に基づいたものであった。スクリー
ニングに用いた合成ポリヌクレオチドは，次のようであ
った： 5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3' 約50,000個のクローンのうち1個のクローンが，このプ
ローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイ
ズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製した
クローンを，クローン35と命名した。
【０１７２】IV.A.9. クローン35のHCV cDNAのヌクレオ
チド配列 クローン35の cDNAのヌクレオチド配列は，本質的にIV.
A.2.節で記述したようにして決定した。この配列，クロ
ーン36のcDNA配列とオーバーラップした該配列の領域，
および該配列においてコードされる推定ポリペプチド
を，第8図に示す。
【０１７３】クローン35は，明らかに一つの連続的なOR
Fを有する。このORFは，クローン36，クローン81，およ
びクローン32によりコードされるのと同じ翻訳フレーム
内で，一つのポリペプチドをコードする。第9〜10図
は，クローン35，36，81，および32にわたって延びてい
る長く連続したORFの配列を，該配列でコードされる推
定HCVポリペプチドと共に示す。この配列は，この結合
配列は，同じλ−gt11 cDNAライブラリー由来の他の独
立したcDNAクローンを用いて確認されている。
【０１７４】IV.A.10. クローン35のcDNAにオーバーラ
ップするHCV cDNAの単離 クローン35 cDNA の配列の上流にあり，該配列とオーバ
ーラップするHCV cDNA配列の単離を，クローン36のcDNA
とオーバーラップする配列について IV.A.8.節に記述し
たようにして行った。ただし，合成ポリヌクレオチドは
クローン35の5'領域に基づいたものであった。スクリー
ニングに用いた合成ポリヌクレオチドは，次のようであ
った： 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3' 約50,000個のクローンのうち1個のクローンが，このプ
ローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイ
ズしたcDNAを有する組換え体ファージを単離・精製した
クローンを，クローン37bと命名した。
【０１７５】IV.A.11. クローン37bのHCVのヌクレオチ
ド配列 クローン37bのcDNAのヌクレオチド配列は，本質的にIV.
A.2.節で記述したようにして決定した。この配列，クロ
ーン35のcDNAの配列にオーバーラップする該配列の領
域，および該配列においてコードされる推定ポリペプチ
ドを，第11図に示す。
【０１７６】クローン35の5'末端のヌクレオチドは Tで
あるが，クローン37bの対応するヌクレオチドはAであ
る。IV.A.10.節に記述した，クローン37bを単離した工
程の間に単離された他の3つの独立したクローン由来のc
DNAも，配列決定されている。
【０１７７】これらのクローン由来のcDNAも，この位置
に Aを有する。このように，クローン35の5'末端の T
は，クローニング工程の人工産物であり得る。しばしば
cDNA分子の5'末端に人工的に変化したものが生じるとい
うことは，公知である。
【０１７８】クローン37b は明らかに，オーバーラップ
しているクローン35，36，81および32にわたって延びて
いる ORFにおいてコードされるポリペプチドの続きであ
るポリペプチドをコードする，一つの連続的なORFを有
する。
【０１７９】IV.A.12. クローン32のcDNAにオーバーラ
ップするHCV cDNAの単離 クローン32の下流のHCV cDNA配列の単離は，以下のよう
にして行った。まず，クローンcla を，クローン32のHC
V cDNA配列のヌクレオチド配列に基づいた合成ハイブリ
ダイゼーションプローブを用いて単離した。方法は，本
質的に IV.A.5.節に記述したとおりであった。ただし，
合成プローブの配列は次のようであった： 5' AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'。
【０１８０】クローンcla 由来のヌクレオチド配列を用
いて，別の合成ヌクレオチドを合成した。この合成ヌク
レオチドは次の配列を有していた： 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3'。
【０１８１】クローンcla 由来の配列をプローブとして
を用いたλ−gt11ライブラリーのスクリーニングは，約
50,000個の陽性コロニーのうち１個のコロニーをもたら
した。このプローブとハイブリダイズしたクローンを単
離・精製し，クローン33b と命名した。
【０１８２】IV.A.13. クローン33bのHCV cDNAのヌクレ
オチド配列 クローン33bのcDNAのヌクレオチド配列は，本質的にIV.
A.2.節で記述したようにして決定した。この配列，クロ
ーン32のcDNAの配列とオーバーラップする該配列の領
域，および該配列においてコードされる推定ポリペプチ
ドを，第12図に示す。
【０１８３】クローン33b は明らかに，オーバーラップ
しているクローン37b，35，36，81および32のORFの延長
である，一つの連続的なORFを有する。クローン33bでコ
ードされるポリペプチドは，これらのオーバーラップし
ているクローンの延長されたORFでコードされるのと同
じ翻訳フレーム内にある。
【０１８４】IV.A.14. クローン37bのcDNAおよびクロー
ン33bのcDNAにオーバーラップするHCVcDNAの単離 クローン37bおよびクローン33bのcDNAにオーバーラップ
するHCV cDNAを単離するために，これらのクローンのcD
NA由来の次の合成オリゴヌクレオチドプローブを用い，
本質的にIV.A.3.節に記述した方法を用いて，λ−gt11
ライブラリーをスクリーニングした。それぞれ，クロー
ン37bおよび33bの配列にオーバーラップするHCV cDNA配
列を有するコロニーを検出するためのプローブは，次の
ようであった： 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3' および 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3' 約50,000個のクローンのうち１個のクローンが，それぞ
れのプローブを用いて検出された。クローン37b のcDNA
の上流にあり，該cDNAにオーバーラップするcDNAを有す
るクローンを，クローン40bと命名した。クローン33bの
cDNAの下流にあり，該cDNAにオーバーラップするcDNAを
有するクローンを，クローン25cと命名した。
【０１８５】IV.A.15. クローン40bおよびクローン25c
のHCV cDNAのヌクレオチド配列 クローン40bおよびクローン25cのcDNAのヌクレオチド配
列は，IV.A.2.節で記述したのと本質的に同様にして決
定した。40bおよび25cの配列，クローン37bおよび33bの
cDNAにオーバーラップする該配列の領域，およびそこで
コードされる推定ポリペプチドを，第13図（クローン40
b）および第14図（クローン25c）に示す。
【０１８６】クローン40bの5'末端のヌクレオチドはGで
ある。しかし，IV.A.14.節で記述した，クローン40b を
単離した工程の間に単離された他の独立した５個のクロ
ーン由来のcDNAも配列決定されている。これらのクロー
ン由来のcDNAもまた，この位置にTを有する。このよう
に，Gはクローニングの結果人工的に変化したものであ
ることを意味し得る（IV.A.11.節の考察を参照のこ
と）。
【０１８７】クローン25cの5'末端はACTであるが，クロ
ーンcla（配列は示していない），およびクローン33bの
この領域の配列はTCAである。この違いはまた，クロー
ン5-1-1 の28個の過剰の5'末端ヌクレオチドのように，
クローニングの人工産物を意味し得る。
【０１８８】クローン40bおよび25cはそれぞれ，明らか
に，以前に配列決定したクローンの連続的なORFの延長
であるORFを有する。クローン40b，37b，35，36，81，3
2，33b，および25cにわたって延びている ORFのヌクレ
オチド配列，および該配列においてコードされる推定ポ
リペプチドのアミノ酸配列を，第15〜17図に示す。この
図では，可能性のある人工的に変化したものは配列から
省かれており，その代わりに，オーバーラップする複数
のクローンの非5'末端領域の対応する配列が示されてい
る。
【０１８９】IV.A.16. クローン36，81，および32のcDN
Aからの複合HCV cDNAの調製 複合HCV cDNAであるC100は，以下のようにして構築し
た。まず，クローン36，81，および32由来のcDNAをEcoR
Iを用いて切り出した。各クローン由来のcDNAのEcoRIフ
ラグメントを，ベクター pGEM3-blue（Promega Biote
c）の EcoRI部位に個々にクローン化した。クローン3
6，81，および32由来のcDNAを有する得られた組換え体
ベクターを，それぞれpGEM3-blue／36，pGEM3-blue／8
1，およびpGEM3-blue／32と命名した。適当な方向性を
有するpGEM3-blue／81組換え体を NaeIおよび NarIで切
断し，大きい（約2850bp）フラグメントを精製した。そ
してこのフラグメントを，pGEM3-blue／36から得た小さ
な（約570bp）NaeI／NarI 制限フラグメント精製物と連
結した。このクローン36および81由来のcDNAの複合配列
を，これらのクローンのオーバーラップしているcDNAに
含まれる，連続的な HCV ORFを有する他のpGEM3-blueベ
クターを作成するのに用いた。次いで，約680bp のフラ
グメントを切り離すために，この新しいプラスミドをPv
uIIおよびEcoRIで切断した。次いで，このフラグメント
を適当な方向性を有するpGEM3-blue／32プラスミドから
単離した小さな（580bp）PvuII／EcoRI フラグメントと
連結した。そして，クローン36，81，および32由来の複
合cDNAを， IV.B.1.節に記述されているベクターpSODcf
1をEcoRIで直線化させたものに連結し，これを細菌にお
いてクローン5-1-1 を発現するのに用いた。複合HCV cD
NAの約1270bpのEcoRIフラグメント（C100）を有する組
換え体を選択し，プラスミド由来のcDNAをEcoRIで切断
し，精製した。
【０１９０】IV.A.17. クローン 14i，11b，7f，7e，8
h，33c，14c，8f，33f，33g，および39cのHCV cDNAの単
離およびヌクレオチド配列 クローン14i，11b，7f，7e，8h，33c，14c，8f，33f，3
3g，および39cのHCV cDNAを，IV.A.1. 節に記述したHCV
cDNAのλ−gt11ライブラリー由来のオーバーラップし
たcDNAフラグメントを単離する方法により単離した。使
用した方法は，IV.A.3.節に記述したのと本質的に同様
であった。ただし，使用したプローブは，最後に単離し
たクローンのヌクレオチド配列の，複合HCV 配列の5'末
端および3'末端から設計されたものである。以下に記述
するプローブとハイブリダイズするクローンの頻度は，
それぞれの場合で約50,000個につき１個であった。
【０１９１】クローン 14i，7f，7e，8h，33c，14c，8
f，33f，33g，および39cのHCV cDNAのヌクレオチド配列
は，本質的にIV.A.2.節に記述したのと同様にして決定
した。ただし，クローン5-1-1 から単離したcDNAの代わ
りにこれらのファージから切り出したcDNAを用いた。
【０１９２】クローン33cは，クローン40bのヌクレオチ
ド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用
いて単離した。クローン40bのヌクレオチド配列は，第1
3図に示されている。33cを単離するのに用いたプローブ
のヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'。
【０１９３】クローン33CのHCV cDNA配列，およびクロ
ーン40bのHCV cDNA配列とのオーバーラップを，第18図
に示す。この図は，該配列でコードされるアミノ酸も示
す。
【０１９４】クローン8hは，クローン33c のヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロ
ーブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3'。
【０１９５】クローン8hの HCV cDNAの配列，およびク
ローン33cの HCV cDNAの配列とのオーバーラップ，なら
びに該配列でコードされるアミノ酸を，第19図に示す。
【０１９６】クローン7eは，クローン8hのヌクレオチド
配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロー
ブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3'。
【０１９７】クローン7eのHCV cDNAの配列，クローン8h
とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミ
ノ酸を，第20図に示す。
【０１９８】クローン14cは，クローン25cのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。クローン
25cの配列を第14図に示す。クローン14cの単離に用いた
プローブは，次の配列を有していた： 5' ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3'。
【０１９９】クローン14cのHCV cDNAの配列，該配列の
クローン25cのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第21図に示す。
【０２００】クローン8fは，クローン14c のヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロ
ーブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3'。
【０２０１】クローン8fの HCV cDNAの配列，該配列の
クローン14cのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第22図に示す。
【０２０２】クローン33f は，クローン8fに存在するヌ
クレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。
このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであっ
た： 5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3'。
【０２０３】クローン33fの HCV cDNAの配列，該配列の
クローン8fのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ，およ
び該配列でコードされるアミノ酸を，第23図に示す。
【０２０４】クローン33gは，クローン33fのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロ
ーブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3'。
【０２０５】クローン33gのHCV cDNAの配列，該配列の
クローン33fのHCV cDNAの配列とのオーバーラップ，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第24図に示す。
【０２０６】クローン7fは，クローン7eのヌクレオチド
配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロー
ブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3'。
【０２０７】クローン7fのHCV cDNAの配列，該配列のク
ローン7eとのオーバーラップ，および該配列でコードさ
れるアミノ酸を，第25図に示す。
【０２０８】クローン11b は，クローン7fの配列に基づ
いたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレ
オチド配列は，次のようであった： 5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3'。
【０２０９】クローン11b のHCV cDNAの配列，該配列の
クローン7fとのオーバーラップ，および該配列でコード
されるアミノ酸を，第26図に示す。
【０２１０】クローン14iは，クローン11bのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロ
ーブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3'。
【０２１１】クローン14iのHCV cDNAの配列，該配列の1
1bとのオーバーラップ，および該配列でコードされるア
ミノ酸を，第27図に示す。
【０２１２】クローン39cは，クローン33gのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプロ
ーブのヌクレオチド配列は，次のようであった： 5' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3'。
【０２１３】クローン39cのHCV cDNAの配列，該配列の
クローン33gとのオーバーラップ，および該配列でコー
ドされるアミノ酸を，第28図に示す。
【０２１４】IV.A.18. HCV cDNA を有する単離クローン
由来の複合 HCV cDNA配列 複合HCV cDNA配列を作成するために，前述の単離クロー
ンのHCV cDNA配列を並べた。5'から3'の方向に並べた単
離クローンは：14i，7f，7e，8h，33c，40b，37b，35，
36，81，32，33b，25c，14c，8f，33f，33gおよび39cで
ある。
【０２１５】単離クローン由来の複合HCV cDNA配列，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第29〜34図に示
す。
【０２１６】複合配列を作成するにあたり，以下の配列
の異質性が考慮されている。クローン33c は，クローン
40b および37c のcDNAとオーバーラップする800塩基対
の HCV cDNAを有する。クローン33cにおいては，他の5
つのオーバーラップしているクローンと同様に，789番
目のヌクレオチドはGである。しかし，クローン37bにお
いては（IV.A.11. 節を参照のこと），対応するヌクレ
オチドは Aである。この配列の違いは，該配列でそれぞ
れ Gまたは Aに対してコードされるアミノ酸は，CYSま
たはTYRのいずれかであるという明らかな異質性をもた
らす。この異質性は，タンパクの折りたたみに関する重
要な分枝を有し得る。
【０２１７】クローン8hのHCV cDNAの2番目のヌクレオ
チド残基はTである。しかし，以下に示すように，クロ
ーン7eの対応する残基はAであり；さらに，この位置のA
は，他の３つのオーバーラップしている単離クローンで
も見い出される。このように，クローン8hの T残基は，
クローニングの人工的な変化を意味し得る。それゆえ，
第29〜34図では，この位置の残基は Aとされる。
【０２１８】クローン8fのHCV cDNAの3'末端ヌクレオチ
ドは Gである。しかし，クローン33fおよび他の2つのオ
ーバーラップするクローンの対応する残基は Tである。
それゆえ，第29〜34図では，この位置の残基はTとされ
る。
【０２１９】クローン33fの HCV cDNAの3'末端配列はTT
GCである。しかし，クローン33gおよび他の2つのオーバ
ーラップするクローンの対応する配列はATTCである。そ
れゆえ，第29〜34図では，対応する領域はATTCで示され
る。
【０２２０】クローン33gの HCV cDNAの４番目のヌクレ
オチド残基は Tである。しかし，クローン33fおよび他
の2つのオーバーラップするクローンの対応する残基は
Aである。それゆえ，第29〜34図では，対応する残基は
Aで示される。
【０２２１】クローン14i の3'末端はAAである。しか
し，クローン11bおよび他の3つのクローンの対応するジ
ヌクレオチドはTAである。それゆえ，第29〜34図では，
TA残基が示されている。
【０２２２】他の配列の異質性の解明については，前述
で考察している。
【０２２３】複合 HCV cDNAを調べると，該cDNAが一つ
の大きなORFを有することが示される。このことは，ウ
イルスのゲノムが，翻訳と同時に，またはその後プロセ
ッシングされる大きなポリペプチドに翻訳されるという
ことを示唆する。
【０２２４】IV.A.19. クローン 12f，35f，19g，26g，
および15eの HCV cDNAの単離およびヌクレオチド配列 クローン 12f，35f，19g，26g，および15eのHCV cDNA
を，本質的にIV.A.17.節に記述した方法により単離し
た。ただし，プローブは以下に示すようであった。クロ
ーンがこのプローブとハイブリダイズする頻度は，それ
ぞれの場合で約50,000個につき１個であった。これらの
クローンのHCV cDNAのヌクレオチド配列は，本質的に I
V.A.2.節に記述したようにして決定した。ただし，クロ
ーン5-1-1 から単離したcDNAの代わりに，指示したクロ
ーン由来のcDNAを用いた。
【０２２５】第29〜34図の HCV cDNAの上流のcDNAを有
するクローン12fの単離は，クローン14i のヌクレオチ
ド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用
いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次の
ようであった： 5' TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3'。
【０２２６】クローン12fのHCV cDNA配列，該配列のク
ローン14iとのオーバーラップ，および該配列でコード
されるアミノ酸を，第35図に示す。
【０２２７】第29〜34図の HCV cDNA下流のcDNAを有す
るクローン35fの単離は，クローン39c のヌクレオチド
配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用い
て行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のよ
うであった： 5' AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3'。
【０２２８】クローン35fの配列，該配列のクローン39c
の配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされ
るアミノ酸を，第36図に示す。
【０２２９】クローン19gの単離は，クローン35fの3'配
列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて
行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のよう
であった： 5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3'。
【０２３０】クローン19GのHCV cDNA配列，該配列のク
ローン35fの配列とのオーバーラップ，および該配列で
コードされるアミノ酸を，第37図に示す。
【０２３１】クローン26gの単離は，クローン19gの3'配
列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて
行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のよう
であった： 5' TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'。
【０２３２】クローン26gのHCV cDNA配列，該配列のク
ローン19gの配列とのオーバーラップ，および該配列で
コードされるアミノ酸を，第38図に示す。
【０２３３】クローン15eは，クローン26gの3'配列に基
づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて単離し
た。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであ
った： 5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3'。
【０２３４】クローン15eのHCV cDNA配列，該配列のク
ローン26gの配列とのオーバーラップ，および該配列で
コードされるアミノ酸を，第39図に示す。
【０２３５】この節で記述したクローンは，ＩＩ.A. 節
で記述した期間および条件でATCCに寄託されており，以
下の受託番号が授与されている。
【０２３６】λ−gt11 ATCC番号 寄託日 クローン12f クローン35f クローン15e 前述の単離クローンのHCV cDNA配列は，複合HCV cDNA配
列を作成するのに並べられている。5'から3'の方向に並
べられた単離クローンは：12f，14i，7f，7e，8h，33
c，40b，37b，35，36，81，32，33b，25c，14c，8f，33
f，33g，39c，35f，19g，26g，および15eである。
【０２３７】単離クローン由来の複合HCV cDNA配列，お
よび該配列でコードされるアミノ酸を，第40〜46図に示
す。
【０２３８】IV.A.20. クローン12fのHCV cDNA配列上流
のcDNA配列を単離する別の方法 上流の配列の逆転写を開始させるために，クローン12f
のHCV cDNA 由来の第40〜46図の5'HCV配列のほとんどに
基づいて，逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチド
プライマーを合成し，HCVゲノムRNA中の対応する配列に
結合させるのに用いる。プライマー配列はクローン12f
の既知の5'末端配列に近いが，プライマー配列上流のプ
ローブ配列の設計を許容するのに十分に下流である。プ
ライミングおよびクローニングの公知の標準法が用いら
れる。得られたcDNAライブラリーは，プライミング部位
（クローン12f の明らかにされた配列から推定される）
の上流の配列を用いてスクリーニングされる。HCVゲノ
ムRNA は，NANBHのチンパンジー由来の血漿または肝臓
試料，または NANBHのヒト由来の類似の試料のいずれか
から得られる。
【０２３９】IV.A.21. HCVゲノムの5'末端領域から配列
を単離するための，尾部付加(tailing)を利用した別の
方法 HCV RNA ゲノムの5'最末端配列を単離するために，逆転
写の初回cDNA生成物（これは，鋳型RNAにより二本鎖と
される）を，オリゴCで尾部付加処理する。これは，こ
の生成物をCTP存在下でターミナルトランスフェラーゼ
とインキュベートすることにより行われる。cDNAの第一
鎖の相補鎖を生成させる第２回のcDNA合成は，逆転写酵
素反応のプライマーとしてオリゴGを用いて行われる。
ゲノム HCVRNAの材料源は，IV.A.20. 節で記述したのと
同様である。ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾
部付加処理，および逆転写酵素反応のための方法は，Ma
niatisら（1982）と同様である。次いで，cDNA生成物を
クローン化し，スクリーニングし，そして配列決定す
る。
【０２４０】IV.A.22. HCVゲノムの3'末端領域から配列
を単離するための，尾部付加を利用した別の方法 この方法は，フラビウイルスのRNAのcDNAをクローニン
グするために以前に使用された方法に基づいている。こ
の方法では，RNA は，3'末端の二次構造を除去するため
に変性条件に置かれる。そして，その後 rATPを基質と
して用い，ポリAポリメラーゼで尾部付加処理される。
ポリA を尾部付加処理した RNAの逆転写は，オリゴdTを
プライマーとして用い，逆転写酵素により触媒される。
cDNAの第２鎖を合成し，cDNA生成物をクローン化し，ス
クリーニングし，そして配列決定する。
【０２４１】IV.A.23 大きなcDNAインサートを有するλ
−gt11 HCV cDNAライブラリーの作成 λ−gt11ライブラリーを作成し，スクリーニングするの
に用いた方法は，IV.A.1. 節に記述したのと本質的に同
様である。ただし，ライブラリーはセファロースCL-4B
カラムから溶出した大きなサイズのcDNAのプールから作
成した。
【０２４２】IV.A.24. プライマーとして合成オリゴマ
ーを用いた HCVcDNAライブラリーの作成 新しいHCV cDNAライブラリーは，IV.A.1.節に記述した
感染チンパンジーの血漿プール由来のRNAから，ならび
にこの感染動物の肝臓由来のポリA+RNA画分から調製さ
れている。cDNAは，GublerおよびHoffman（1983）によ
り記述されているのと本質的に同様にして構築した。た
だし，最初のcDNA鎖合成のためのプライマーは，前述の
HCVゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであ
った。クローン11bおよび7eの配列に基づいたプライマ
ーは，それぞれ， 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' および 5' AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3' であった。得られたcDNAは，λバクテリオファージベク
ターにクローン化し，配列が第40〜46図の HCV配列に基
づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてスクリーニン
グした。
【０２４３】IV.B. HCV cDNAでコードされるポリペプチ
ドの発現および発現された生成物のHCV誘導抗原として
の同定 IV.B.1. クローン5-1-1においてコードされるポリペプ
チドの発現 クローン5-1-1 においてコードされる HCVポリペプチド
（IV.A.2.節を参照のこと，前出）を，スーパーオキシ
ドジスムターゼ（SOD）との融合ポリペプチドとして発
現させた。これは，以下のように，クローン5-1-1のcDN
Aインサートを発現ベクターpSODcf1（Steimerら（198
6））にサブクローン化することにより行った。
【０２４４】まず，pSODcf1から単離したDNAをBamHＩお
よびEcoRＩで処理し，これらの制限酵素により作られる
直線状の DNAに以下のリンカーを結合させた： 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3' 3' GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5' クローニングの後，インサートを有するプラスミドを単
離した。
【０２４５】インサートを有するプラスミドを，EcoRＩ
で切断した。クローン5-1-1 のHCVcDNAインサートをEco
RＩで切断し，このEcoRＩ直線化プラスミドDNAに連結し
た。このDNA混合物を，E. coli D1210 株（Sadlerら(19
80)）を形質転換するのに用いた。第１図に示した， OR
Fの発現について正しい方向性を有する5-1-1 cDNAでの
組換え体は，制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド
配列決定により同定した。
【０２４６】IPTGの存在下で細菌を生育させることによ
り，１個のクローン由来の組換え体細菌が， SOD-NANB
5-1-1ポリペプチドを発現するように誘導された。
【０２４７】IV.B.2. クローン81においてコードされる
ポリペプチドの発現 クローン81に含まれるHCV cDNAを，SOD-NANB81融合ポリ
ペプチドとして発現させた。この融合ポリペプチドをコ
ードするベクターを調製するための方法は，SOD-NANB
5-1-1 をコードするベクターを作製するのに用いたのと
類似の方法であった。ただし，HCV cDNAの材料源はクロ
ーン81であり，これはIV.A.3 節で記述したように単離
され，cDNA配列がIV.A.4 節で記述したように決定され
たものである。クローン81のHCV cDNAのヌクレオチド配
列，および該配列でコードされるポリペプチドの推定ア
ミノ酸配列を，第4図に示す。
【０２４８】クローン81のHCV cDNAインサートをEcoRＩ
で切断し，リンカー（IV.B.1.節を参照のこと）を有
し，かつ EcoRＩでの処理により直線化されたpSODcf1に
連結した。このDNA混合物を，E. coli D1210株を形質転
換するのに用いた。第4図に示されるORFの発現について
正しい方向でクローン81 HCV cDNAを有する組換え体
を，制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定
により同定した。
【０２４９】IPTGの存在下で細菌を生育させることによ
り，1個のクローンからの組換え体細菌が，SOD-NANB81
ポリペプチドを発現するように誘導された。
【０２５０】IV.B.3. クローン5-1-1においてHCVおよび
NANBH関連抗原としてコードされるポリペプチドの同定 クローン5-1-1の HCV cDNA内にコードされるポリペプチ
ドを，NANBH に感染したチンパンジーおよびヒトの血清
が融合ポリペプチド SOD-NANB5-1-1と免疫学的に反応す
ることを証明することにより，NANBH関連抗原として同
定した。このSOD-NANB5-1-1は，その N末端にスーパー
オキサイドジスムターゼを，そしてそのC末端にフレー
ム内（in-frame）の5-1-1抗原を有する。この同定は，
以下のような“ウェスタン”ブロッティング法（Towbin
ら(1979)）により行った。
【０２５１】IV.B.I.節で記述した，SOD-NANB5-1-1をコ
ードする発現ベクターで形質転換した細菌の組換え体株
を，IPTGの存在下で生育させることにより融合ポリペプ
チドを発現するように誘導した。全部の細菌溶解物を，
Laemmli(1970)に従って，SDS存在下でポリアクリルアミ
ドゲルに通して電気泳動を行った。分離されたペプチド
は，ニトロセルロースフィルターに移した（Towbinら(1
979)）。次いで，このフィルターを細片に切断し，この
細片を異なるチンパンジーおよびヒトの血清と個々にイ
ンキュベートした。結合した抗体は，IV.A.1. 節に記述
したように，125I−標識ヒツジ抗ヒトIgと共にさらにイ
ンキュベートすることにより検出した。ウェスタンブロ
ットに用いたチンパンジー血清の特徴付け，およびオー
トラジオグラフィーを行った細片の写真に示される結果
を，第47〜48図に示す。ポリペプチドを含むニトロセル
ロース細片を，急性NANBH（ハッチンソン株）感染（レ
ーン1−16），A型肝炎感染（レーン17−24），およびB
型肝炎感染（レーン34−44）の間の異なった時期におけ
るチンパンジーから得た血清とインキュベートした。レ
ーン25および45は，陽性の対照を示す。該対照では，免
疫ブロットを，λ−gt11 cDNAライブラリーのオリジナ
ルスクリーニングにおいて組換え体クローン5-1-1を同
定するのに用いた（IV.A.1.節を参照のこと）患者由来
の血清とインキュベートした。
【０２５２】第48図の対照レーン25および45における目
視しうるバンドは，抗体がSOD融合ポリペプチドのNANB
5-1-1部分に結合していることを示す。これらの抗体
は，単独の SODとの結合を示さない。なぜならば，単独
の SODもこれらの試料における陰性の対照として含まれ
ており， SOD-NANB5-1-1融合ポリペプチドよりも有意に
速く移動するバンドとして現れるからである。
【０２５３】第47〜48図のレーン1−16は，4匹のチンパ
ンジーの血清試料中の抗体の結合を示し；この血清は，
NANBHに感染する直前およびその後の急性感染の期間中
に得たものである。図からわかるように，SOD-NANB
5-1-1 ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体は，感染
性の HCV接種材料の投与前および感染の急性期の早い時
期に得た血清試料には存在しなかった。ところが，４匹
の動物は全て，急性期後期またはその後の時期に，最終
的にこのポリペプチドに対する循環抗体を誘導した。番
号3および4のチンパンジーの場合の免疫ブロットで観察
される付加的なバンドは，宿主の細菌タンパクに結合し
たバックグラウンドによるものであった。
【０２５４】NANBH に感染したチンパンジー由来の血清
で得られた結果とは対照的に，融合ポリペプチドの NAN
B5-1-1部分に対する抗体の発生は，HAVに感染した４匹
のチンパンジーまたはHBVに感染した３匹のチンパンジ
ーでは観察されなかった。これらの場合における唯一の
結合は， HCVに感染した試料でも生じる，宿主の細菌タ
ンパクに結合したバックグラウンドであった。
【０２５５】ウェスタンブロットに用いたヒト血清の特
徴付け，およびオートラジオグラフを行った細片の写真
に示される結果を，第49〜50図に示す。ポリペプチドを
含むニトロセルロース細片を，NANBH（レーン1-21），H
AV（レーン33-40），およびHBV（レーン41-49）に感染
している間の異なった時期におけるヒトから得た血清と
インキュベートした。レーン25および50は，陽性の対照
を示す。該対照では，免疫ブロットを，前述のλ−gt11
ライブラリーのオリジナルスクリーニングで用いた患者
由来の血清とインキュベートした。レーン22−24および
26−32は，血清を“正常な”血液提供者から得た，“非
感染の”対照を示す。
【０２５６】第49〜50図からわかるように，λ−gt11ラ
イブラリーをスクリーニングするのに用いた血清を含む
9人のNANBH患者由来の血清は，融合ポリペプチドの NAN
B5-1-1部分に対する抗体を含有していた。NANBHの3人の
患者由来の血清は，これらの抗体を含有しなかった。こ
れらの患者に抗 NANB5-1-1抗体が将来発生する可能性は
ある。異なった NANBV因子に起因するこの反応の欠如
が，非反応血清を採取した個体に病気を引き起こし得る
こともまた，可能である。
【０２５７】第49〜50図はまた，HAVおよびHBVに感染し
た多くの患者由来の血清が抗 NANB5-1-1抗体を含有して
いないこと，およびこれらの抗体は“正常な”対照由来
の血清にも存在しないことも示す。あるHAV患者（レー
ン36）は抗NANB5-1-1抗体を有するように見えるが，こ
の患者は以前に HCVに感染していたということが可能で
ある。なぜならば， NANBHの発生率は非常に高く，しば
しば潜在性であるからである。
【０２５８】これらの血清学的な研究は，BB-NANBVに感
染した患者および動物由来の血清により特異的に認識さ
れるエピトープを，クローン5-1-1 のcDNAがコードする
ことを示している。さらに，cDNAは霊長類のゲノム由来
ではないらしい。クローン5-1-1 またはクローン81から
作製されたハイブリダイゼーションプローブは，唯一の
シングルコピー遺伝子が検出され得る条件下で，非感染
個体由来の対照のヒトおよびチンパンジーのゲノムDNA
の“サザン”ブロットにハイブリダイズしなかった。こ
れらのプローブはまた，対照のウシのゲノムDNA のサザ
ンブロットにもハイブリダイズしなかった。
【０２５９】IV.B.4.クローン36，81および32の複合HCV
cDNAにおいてコードされるポリペプチドの発現 クローン36，81および32にわたるORFでコードされるHCV
ポリペプチドを，SODとの融合ポリペプチドとして発現
させた。これは，複合cDNAであるC100をヒトのスーパー
オキサイドジスムターゼ遺伝子を有する発現カセットに
挿入すること，発現カセットを酵母の発現ベクターに挿
入すること，および酵母でポリペプチドを発現させるこ
とにより行った。
【０２６０】クローン36，81および32由来の複合 C100
cDNAを有する発現カセットを，約1270bpの EcoRＩフラ
グメントをベクターpS3-56（pS356 とも呼ばれる）のEc
oRＩ部位に挿入することにより構築し，プラスミドpS3-
56C100を作製した。C100の構築は，前述のIV.A.16節に
記述されている。
【０２６１】pBR322の誘導体であるベクターpS3-56は，
ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子上流のAD
H2/GAPDHハイブリッド酵母プロモーター，および下流の
GAPDH転写終結信号を含む発現カセットを有する。これ
らの制御要素およびスーパーオキサイドジスムターゼ遺
伝子を有する同様のカセットは，Cousens ら（1987），
および本発明の出願人による同時係属のヨーロッパ特許
出願第196,056号（1986年10月1日公開）に記載されてい
る。しかしながら，pS3-56のカセットはCousensら（198
7）のカセットとは異なる。pS3-56のカセットには，異
種のプロインシュリン遺伝子および免疫グロブリンのヒ
ンジが欠失しており，かつスーパーオキサイドジスムタ
ーゼのgln154にEcoRＩ部位を有するアダプター配列が続
いている。このアダプターの配列は次のようである：
【０２６２】EcoRＩ部位は，カセットを有するベクター
から発現する場合には，次のアミノ酸配列を有するオリ
ゴペプチドリンカーを介してスーパーオキサイドジスム
ターゼに融合するポリペプチドを生じる，異種配列の挿
入を可能にしている：-asn-leu-gly-ile-arg-。
【０２６３】pS356の試料は，ブタペスト条約のもとに1
988年4月29日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（ATCC），12301 Parklawn Dr.，Rockville，Marylan
d 20853 に寄託されており，受託番号第 67683号が与え
られている。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入
手方法，ならびに寄託物の保持については，NANBV-cDNA
を有する株についてＩＩ.A.節で明記したのと同様であ
る。この寄託は便宜のみを意図しており，本明細書の記
述により本発明を実施するためのものではない。この寄
託物を，参照としてここに引用する。
【０２６４】正しい方向で C100 cDNAインサートを有す
る組換え体を単離した後，C100 cDNAを有する発現カセ
ットを pS3-56C100からBamHＩで切り出し，このカセッ
トを有する約3400bpのフラグメントを単離・精製した。
次いで，このフラグメントを酵母ベクターpAB24のBamH
Ｉ部位に挿入した。
【０２６５】重要な特徴を第51図に示すプラスミド pAB
24は，複製のための完全な2μ配列［Broach（1981）］
および pBR322配列を有する酵母シャトルベクターであ
る。
【０２６６】このプラスミドは，プラスミドYEp24［Bot
steinら（1979）］由来の酵母 URA3遺伝子，およびプラ
スミドpC1/1由来の酵母LEU2d遺伝子も有する。EPO公開
第116,201号公報。プラスミドpAB24は，部分的な2μ配
列を除去するために YEp24をEcoRＩで消化し，このベク
ターを再連結することにより構築した。得られたプラス
ミドYEP24deltaRIを，ClaＩで切断することにより直線
化し，ClaＩで直線化されている完全な２μプラスミド
と連結した。次いで，得られたプラスミドpCBou を Xba
Ｉで切断し，8605bpのベクターフラグメントをゲルで単
離した。この単離されたXbaＩフラグメントを， pC1/1
から単離されたLEU2d遺伝子を有する4460bpのXbaＩフラ
グメントと連結した。このLEU2d遺伝子の方向は，URA3
遺伝子と同じ方向である。発現の挿入は，pBR322配列の
唯一のBamHＩ部位であった。従って，テトラサイクリン
に対する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻止してい
る。
【０２６７】SOD-C100発現カセットを有する組換え体プ
ラスミドpAB24C100-3を，酵母JSC 308株およびその他の
株に導入した。細胞をHinnenら（1978）により記載され
ているように形質転換し，ura−選択プレートにプレー
ティングした。単一のコロニーをleu−選択培地に接種
し，飽和状態となるまで増殖させた。この培養物は，1
％グルコースを含有するYEPで生育させることにより，S
OD-C100ポリペプチド（C100-3と呼ぶ）を発現するよう
に誘導された。
【０２６８】JSC 308株は，ADR1遺伝子座に組み込まれ
ている遺伝子型がMAT @，leu2，ura3（del）DM15（GAP/
ADR1)である。JSC 308においては，正の活性化遺伝子産
物ADR1の過剰な発現は，発現された異種タンパクがADH2
UAS調節システムにより合成される場合には，過度の抑
制解除（ hyperderepression ）（ ADR1野生型対照に関
連する）と，そのようなタンパクの非常に高い収量とを
もたらす。酵母 JSC 308株の構築は，係属中の米国特許
出願番号（代理人Docket No.2300−0229）に開示されて
おり，この特許出願を本願と同時に出願し，これを参照
文献としてここに引用する。JSC 308 の試料は，ブタペ
スト条約の下に1988年５月５日に，ATCCに寄託されてお
り，受託番号第 20879号が与えられている。寄託物を入
手し得る期間および寄託物の入手方法，ならびに寄託物
の保持については， HCV cDNA を有する株についてＩ
Ｉ.A.節で明記したのと同じである。
【０２６９】pAB24C100-3でコードされる完全な C100-3
融合ポリペプチドは，アミノ末端にヒトSOD の 154個の
アミノ酸と，EcoRＩ部位を有する合成アダプター由来の
５個のアミノ酸残基と，C100 cDNA由来の363個のアミノ
酸残基と，クローン32のHCVcDNAに隣接した MS2ヌクレ
オチド配列由来の５個のカルボキシ末端アミノ酸とを有
するはずである。（IV.A.7. 節を参照のこと）。SODの
最後から２つ目のAla残基で始まる，このポリペプチド
のカルボキシ末端の推定アミノ酸配列を，第52〜53図に
示す。このポリペプチドのこの部分をコードするヌクレ
オチド配列も同様に示す。
【０２７０】IV.B.5. C100内にコードされるポリペプチ
ドのNANBH関連抗原としての同定 酵母 JSC 308株内のプラスミドpAB24C100-3 から発現す
るC100-3融合ポリペプチドを，サイズについて特徴付け
した。そして，C100 内にコードされるポリペプチド
を，その慢性 NANBHのヒト由来の血清との免疫学的反応
性によりNANBH−関連抗原として同定した。
【０２７１】IV.B.4.節で記述したように発現する C100
-3ポリペプチドは，以下のようにして分析した。酵母JS
C 308細胞をpAB24またはpAB24C100-3で形質転換し，外
来プラスミドがコードするポリペプチドを発現するよう
に誘導した。培養物（OD650nmが約20）1ml中の誘導酵母
細胞を10,000rpmで1分間遠心分離することによりペレッ
トとし，それらを2容量の溶液および1容量のガラスビー
ズ（直径0.2ミリミクロン）とともに激しく渦巻攪拌（1
0×1 分）することにより細胞溶解させた。この溶液
は，50mM トリス−HCl（pH 8.0），1mM EDTA，1mM フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF），および1μg
／mlペプスタチンを含有していた。C100-3ポリペプチド
を含有する細胞溶解物中の不溶性物質を，遠心分離（1
0,000rpm，5分間）により集め，Laemmliの SDS試料緩衝
液中で5分間煮沸することにより溶解させた。〔Laemmli
（1970）を参照のこと〕。誘導された酵母培養物0.3ml
中の量に相当する量のポリペプチドを，Laemmli（197
0）に従い，SDS存在下で10％ポリアクリルアミドゲルに
より電気泳動を行った。タンパク標準物質を一緒にゲル
電気泳動した。発現されたポリペプチドを含有するゲル
は，クマシーブリリアントブルーで染色するか，または
pAB24およびpAB24C100-3から発現されたポリペプチドの
免疫学的反応性を決定するために慢性NANBHの患者由来
の血清を用いて，IV.B.2.節で記述したような“ウェス
タン”ブロットに供した。
【０２７２】結果を第54図に示す。第54図Aでは，ポリ
ペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した。pA
B24で形質転換したJSC308由来の不溶性ポリペプチド，
およびpAB24C100-3で形質転換したJSCの異なる二つのコ
ロニー由来の不溶性ポリペプチドを，それぞれレーン1
（pAB24），ならびにレーン2および3に示す。レーン2お
よび3とレーン1との比較は，pAB24C100-3で形質転換し
たJSC 308由来の分子量が約54,000ダルトンに相当する
ポリペプチドの，誘導された発現を示す。このポリペプ
チドは，pAB24で形質転換したJSC 308では誘導されな
い。このポリペプチドを矢印で示す。
【０２７３】第54図(b)は，pAB24（レーン1）またはpAB
24C100-3（レーン2）で形質転換したJSC 308で発現され
る，不溶性ポリペプチドのウェスタンブロットの結果を
示す。 pAB24から発現されるポリペプチドは，NANBH の
ヒト由来の血清と免疫学的な反応性を示さなかった。し
かしながら，矢印で示したように，pAB24C100-3で形質
転換した JSC 308は，ヒトNANBH血清と免疫学的に反応
する約54,000ダルトンのポリペプチドを発現した。レー
ン２の，免疫学的に反応性のあるその他のポリペプチド
は，この約54,000ダルトンのポリペプチドの分解産物お
よび／または凝集物であり得る。
【０２７４】IV.B.6. 融合ポリペプチドC100-3の精製 N末端にSOD を，そしてC末端にフレーム内（in-frame）
のC100 HCV−ポリペプチドを有する融合ポリペプチドC1
00-3を，ポリペプチドが発現された宿主酵母細胞抽出物
の不溶性画分を分別抽出することにより精製した。
【０２７５】融合ポリペプチドC100-3を，IV.B.4.節に
記述したように，pAB24C100-3で形質転換した酵母JSC 3
08株で発現させた。次いで，酵母細胞をホモジナイズす
ることにより溶解させ，溶解物中の不溶性物質を pH 1
2.0で抽出した。そして，残った不溶性画分中の C100-3
を，SDSを含有する緩衝液に可溶化した。
【０２７６】酵母溶解物を，本質的にNagahumaら（198
4）に従って調製した。20mM トリスHCl（pH 8.0），1mM
ジチオスレイトール，および1mM フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（PMSF）を含有する溶液（緩衝液A）
中に，33％細胞（v／v）の割合で，酵母細胞懸濁液を調
製した。この懸濁液の所定量（15ml）を等量のガラスビ
ーズ（直径0.45−0.50mm）と混合し，この混合物を Sup
er Mixer（Lab Line Instruments, Inc.）の最高速度で
８分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよびガラスビ
ーズを分離し，もとの細胞沈澱物と同様に，ガラスビー
ズを等量の緩衝液Aで3回洗浄した。洗浄液とホモジネー
トとを合わせた後，ホモジネートを7,000×gで15分間，
４℃で遠心分離し，ペレットをもとの細胞沈澱物の２倍
量に相当する量の緩衝液Aに再懸濁し，7,000×g で15分
間遠心分離して物質を再びペレットとすることにより，
溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を3回繰り
返した。
【０２７７】溶解物からの不溶性物質は，以下のように
してpH 12.0 で抽出した。ペレットを0.5M NaCl，1mM E
DTA を含有する緩衝液に懸濁した。ここで，懸濁液の容
量は，もとの細胞沈澱物の 1.8倍量に相当した。懸濁液
のpHは，0.2容量の0.4M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 1
2.0）を添加することにより調整した。混合した後，懸
濁液を7,000×gで15分間，４℃で遠心分離し，上清を除
去した。この抽出を２回繰り返した。抽出したペレット
は，もとの細胞沈澱物の２倍量に相当する懸濁液量を用
い，該ペレットを 0.5M NaCl，1mM EDTAに懸濁し，次い
で7,000×gで15分間，４℃で遠心分離することにより洗
浄した。
【０２７８】ペレット抽出物中の C100-3ポリペプチド
は，SDSで処理することにより可溶化した。このペレッ
トをもとの細胞沈澱物の容量の 0.9容量に相当する量の
緩衝液Aに懸濁し，0.1容量の2％SDSを添加した。懸濁液
を混合した後，7,000×gで15分間，４℃で遠心分離し
た。得られたペレットをSDSで3回以上抽出した。C100-3
を含有する，得られた上清をプールした。
【０２７９】この工程により，C100-3は酵母ホモジネー
トの不溶性画分から10倍以上精製され，ポリペプチドの
回収率は50％以上を越える。
【０２８０】融合ポリペプチドの精製調製物は，Laemml
i（1970）に従い，ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。この分析に基づくと，ポリペプチドはそ
の純度が80％を越え，見かけの分子量約54,000ダルトン
を有していた。
【０２８１】IV.C. HCV cDNAにハイブリダイズする，感
染個体のRNAの同定 IV.C.1. HCV cDNAにハイブリダイズする，NANBHのチン
パンジーの肝臓内のRNAの同定 以下のように，NANBHのチンパンジーの肝臓由来のRNA
は，ノーザンブロットによりクローン81に含有されるHC
V cDNAとハイブリダイズする種類のRNAを含有すること
が示された。
【０２８２】RNA を，高力価の血漿が得られたチンパン
ジーの肝臓の生検材料から単離した（IV.A.1.節を参照
のこと）。これには，哺乳動物細胞からの全RNAの単
離，ならびに該RNAのポリA+画分およびポリA-画分への
分離についてManiatisら（1982）に記載された技術を用
いた。これらの RNA画分を，ホルムアルデヒド／アガロ
ースゲル（１％ w/v）での電気泳動に供し，ニトロセル
ロース膜に移した。（Maniatisら(1982)）。ニトロセル
ロースフィルターを，クローン81 由来の放射性標識 HC
V cDNA（インサートのヌクレオチド配列については，第
４図を参照のこと）とハイブリダイズさせた。放射性標
識プローブを調製するために，クローン81から単離した
HCV cDNAインサートを， DNAポリメラーゼＩを用いたニ
ックトランスレーション（Maniatisら(1982)）により32
Pで放射性標識した。ハイブリダイゼーションは，10％
（w/v）デキストランスルフェート，50％（w/v）脱イオ
ン化ホルムアミド，750mM NaCl，75mM クエン酸ナトリ
ウム，20mM Na2HPO4（pH 6.5），0.1％SDS，0.02％（w/
v）ウシ血清アルブミン（BSA），0.02％（w/v）フィコ
ール−400，0.02％（w/v）ポリビニルピロリドン，100
μg／mlの超音波処理および変性処理によりせん断した
サケ精子DNA，および 106CPM／mlのニックトランスレー
ションしたcDNAプローブを含有する溶液中で18時間，42
℃で行った。
【０２８３】プローブで処理したフィルターのオートラ
ジオグラフを，第55図に示す。レーン1は，32P−標識し
た制限フラグメントマーカーを含有する。レーン2−4
は，以下のようなチンパンジー肝臓のRNA を含有する：
レーン2は，30μgの全RNA を含有し；レーン3は，30μg
のポリA-RNA を含有し；そしてレーン4は，20μgのポリ
A+RNAを含有する。第55図に示すように，NANBHのチンパ
ンジーの肝臓は，HCV cDNA プローブにハイブリダイズ
し，かつ約5000ヌクレオチドから約11,000ヌクレオチド
の大きさと考えられる，ポリA+RNA 分子関連の異種集団
を含有する。HCVcDNA にハイブリダイズするこのRNA
は，細菌ゲノムおよび／または細菌ゲノムの特異的転写
物を意味し得る。
【０２８４】以下のIV.C.2.節に記述した実験は，HCVは
一つの RNAゲノムを有するという示唆と一致する。
【０２８５】IV.C.2. 感染個体から得た血清中のHCV由
来RNAの同定 IV.A.1. 節で記述したように，核酸を，高力価のチンパ
ンジーNANBH 血漿から単離した粒子から抽出した。単離
した核酸の一定量（もとの血漿の1mlに相当する）を，2
0μlの50mMHepes（pH 7.5），1mm EDTA および16μg／m
l酵母可溶性RNAに再懸濁した。試料は，５分間煮沸した
後，直ちに凍結することにより変性させ，RNase A（5μ
l；25mM EDTA溶液，40mMHepes(pH 7.5)に0.1mg/ml RNas
e Aを含有する）またはDNaseＩ（5μl； 10mM MgCl2，2
5mM Hepes(pH 7.5)中に１単位の DNaseＩを含有する）
で処理した。対照の試料は，酵素なしでインキュベート
した。インキュベーションの後，2μg／ml酵母可溶性RN
Aを含有する230μlの氷冷2×SSCを添加し，試料をニト
ロセルロースフィルターで濾過した。このフィルター
を，ニックトランスレーションにより 32P−標識したク
ローン81由来のcDNAプローブとハイブリダイズさせた。
第56図は，このフィルターのオートラジオグラフを示
す。ハイブリダイゼーションのシグナルは， DNase処理
試料および対照試料（それぞれ，レーン2および1）で検
出されたが， RNaseで処理した試料（レーン3）では検
出されなかった。このように，RNase A 処理により粒子
から単離した核酸が分解され，DNase 処理は何の影響も
なかったので，この証拠により，HCVゲノムがRNAにより
構成されるということが強く示唆される。
【０２８６】IV．Ｃ．３．NANBH を有するチンパンジー
から得られる肝臓および血漿試料におけるHCV 核酸配列
由来の増幅HCV 核酸配列の検出 NANBH を有するチンパンジーの肝臓および血漿中に存在
するHCV核酸，および対照のチンパンジーにおけるHCV核
酸は， 基本的にSaiki ら（1986）が記述したポリメラ
ーゼ鎖反応（PCR ）の手法を用いて増幅された。このプ
ライマーオリゴヌクレオチドは，クローン81，あるいは
クローン36および37におけるHCV cDNA由来であった。こ
の増幅された配列は，適当なcDNAオリゴマー（これは，
２つのプライマーの間の領域を有するが２つのプライマ
ーを含まない）をプローブとして用い，ゲル電気泳動お
よびサザンブロッティングによって検出された。
【０２８７】増幅系によって調べられるHCV配列を含むR
NA試料は，NANBHを保有する３匹のチンパンジーおよび
２匹の対照のチンパンジーの肝臓の生体試料から単離さ
れた。RNA 画分の単離は，IV．Ｃ．１節に記載したグア
ニジウムチオシアネート法により行なった。
【０２８８】増幅系によって調べられるべきRNA試料も
また，２匹のNANBH保有チンパンジーおよび１匹の対照
チンパンジー，さらに対照のチンパンジーから得られる
貯留した血漿から単離された。１匹の感染チンパンジー
は，106 と同等かそれを越えるCID ／mlを有し，他の感
染チンパンジーは，105 と同等かそれを越えるCID ／ml
を有する。
【０２８９】この核酸は，次のようにして血漿から抽出
した。血漿の0.1 mlのもしくは0.01mlを10μg ／mlのポ
リアデニル酸を含有するTENB／プロティナーゼＫ／SDS
溶液（0.05Ｍ Tris-HCl，pH8.0 ，0.001 M EDTA，0.1
Ｍ NaCl，１mg／mlプロテイナーゼＫ，および0.5 ％ S
DS ）で最終体積が1.0 mlになるように希釈し，37℃に
て60分間インキュベートした。このプロテイナーゼＫに
よる分解の後，フェノール飽和TE（10.0mM Tris-HCl，
pH8.0 ，１mM EDTA）を用いた抽出により，脱タンパク
した。遠心分離によりフェノール層を分離し，0.1 ％の
SDS を含むTENBで再抽出した。それぞれの抽出で得られ
る水相をプールし，等容量のフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール〔１：１（99：２）〕溶液で２
度抽出し，その後等容量のクロロホルム／イソアミルア
ルコール（99：１）の混液を用いて，２度抽出した。遠
心分離により相分離し，水相を，酢酸ナトリウムの最終
濃度が0.2 Ｍとなるようにし，エタノールを２倍量添加
することにより核酸を沈澱させた。沈澱した核酸は，SW
41のローターで38Ｋにて４℃で60分間超遠心分離を行な
うことにより回収した。
【０２９０】上記に加えて，高力価のチンパンジーの血
漿およびプールされた対照の血漿のどちらか一方を，Ch
omcyzskiおよびSacchi（1987）の方法により，50μg の
ポリＡ担体を用いて抽出した。この方法では，酸グアニ
ジウムチオシアナート（acidguanidinium thiocyanate
）抽出を使用する。RNA を，エッペンドルフ マイ，
クロフュージ中で，４℃にて10分間，10,000RPM にて遠
心分離することにより，回収した。
【０２９１】２つの場合においては，PCR 反応における
cDNAの合成に先立って，プロテイナーゼＫ／SDS ／フェ
ノール法によって血漿から抽出された核酸は，さらにＳ
およびＳエルチップ−Ｒ（S Elutip-R）カラムに結合さ
せ，このカラムから溶出させることにより精製した。そ
れに続く工程は製造者の指示により行なった。
【０２９２】PCR 反応の鋳型として用いられたcDNAは，
上述のように調製された核酸（全核酸または全RNA ）か
ら誘導された。エタノール沈澱に続き，沈澱した核酸を
乾燥し，蒸留水処理したDEPCに再懸濁した。核酸の２次
構造を，試料を65℃にて10分間加温することによって引
き離し，そして，速やかに試料を氷で冷却した。cDNA
は，肝臓，あるいは10〜100 μl の血漿から抽出された
核酸（あるいはRNA ）から得られる総チンパンジーRNA
１〜３μg を用いて合成された。この合成は逆転写酵素
を利用し，製造者BRL によって詳細に述べられているプ
ロトコールを用い，25μl の反応液中で行われた。cDNA
合成用のプライマーは，後述のPCR 反応でもまた利用さ
れているプライマーであった。cDNA合成のすべての反応
混合物には，RNAase阻害剤であるRNASINTM（Fisher/Pro
mega）を23Ｕ含有していた。cDNA合成に続き，この反応
混合物を水で希釈し，10分間煮沸し，氷上ですばやく冷
却した。
【０２９３】このPCR 反応は，１μg のRNase A の添加
を除いては，製造者（Cetus-Perkin-Elmer）の指示に従
って行なった。この反応は，最終容量が100μl となる
ように行なわれた。このPCRは，37℃，72℃，および94
℃の条件下で，35サイクルにわたって行なわれた。
【０２９４】cDNA合成用プライマーおよびPCR 反応プラ
イマーは，クローン81，クローン36，あるいはクローン
37ｂのいずれかにおけるHCV cDNA配列から得られた。
（クローン81，36および37ｂのHCV cDNA配列は，第４
図，第５図および第11図にそれぞれ示されている。）ク
ローン81由来の２個の16量体プライマーの配列は次のと
おりである： 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' および 5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'。
【０２９５】クローン36から得られるプライマーの配列
は次のとおりである： 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'。
【０２９６】クローン37b から得られるプライマーの配
列は次のとおりである： 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'。
【０２９７】このPCR 反応において，このプライマーの
対は，クローン81由来の２つの16量体プライマー対；あ
るいはクローン36由来の16量体プライマーとクローン37
ｂ由来の16量体プライマーとの対のいずれによっても構
成される。
【０２９８】このPCR 反応生産物は，該生産物をアルカ
リゲル電気泳動にかけサザンブロッティングを行い，プ
ライマーと重複しないHCV cDNA領域由来の32Ｐ標識内部
のオリゴヌクレオチドプローブにより増幅されたHCV-cD
NA配列を検出することによって分析された。このPCR 反
応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し，核酸
を，塩およびエタノールを用いて水相から沈澱さた。沈
澱させた核酸を遠心分離で回収し，蒸留水に溶解させ
た。試料の一部は，1.8 ％アルカリアガロースゲルで電
気泳動を行った。60， 108および161 のヌクレオチド長
の一本鎖DNA を，分子量マーカーとして，同時に電気泳
動にかけた。電気泳動後，このゲル中のDNAを，Biorad
Zeta Probe TM紙に移した。プレハイブリダイゼーシ
ョンおよびハイブリダイゼーション，および洗浄条件
は，製造者（Biorad）によって規定される条件に従っ
た。
【０２９９】増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼ
ーション検出に用いられたプローブは次のとおりであ
る。PCR プライマーの対がクローン81由来であるときに
は，２つのプライマーの配列の間の領域に位置する配列
に対応する配列を有する108 量体であった。このPCR プ
ライマー対がクローン36および37ｂ由来であるとき，こ
のプローブはクローン35由来の，ニック翻訳されたHCV
cDNA挿入物であった。このプライマーはクローン37挿入
物の155 〜170 ヌクレオチドおよびクローン36挿入物の
206 〜268 ヌクレオチド由来である。クローン35におけ
るHCV cDNA挿入物の3'末端は，クローン36の挿入物の１
〜186 のヌクレオチドと重複しており，そして，クロー
ン35挿入物の5'末端はクローン37ｂの挿入物の207 〜26
9 ヌクレオチドと重複する。（第５，第８，および第11
図を比較されたい。）このように，クローン35中のcDNA
の挿入物は，クローン36および37ｂ由来のプライマーの
配列間の領域部分にまでおよび，これらプライマーを含
む増幅配列のためのプローブとして有用である。
【０３００】肝臓試料由来のRNA の分析は，プライマー
およびプローブの両セットを利用する上記方法に従って
行なった。３匹のNANBH 保有チンパンジーの肝臓由来の
RNAは，予期されるサイズの増幅配列（81および36およ
び37ｂにおいて，それぞれ161 および586 ヌクレオチ
ド）については，ハイブリダイゼーションの結果が陽性
であり，他方，対照のチンパンジーについては，ハイブ
リダイゼーションの結果が陰性であった。この実験を３
回繰りかえしたところ同じ結果が得られた。
【０３０１】血漿から得られる核酸およびRNA の分析も
また，クローン81由来のプライマーおよびプローブを利
用する上記方法により行なわれた。この血漿は，２匹の
NANBH 保有チンパンジー由来の血漿，対照のチンパンジ
ー由来の血漿，そして対照のチンパンジーから得られる
プールされた血漿である。両NANBH 血漿は，核酸／RNA
を有し，PCR 増幅アッセイで陽性の結果が得られ，他
方，両対照血漿は陰性の結果が得られた。これらの結果
は数回繰り返して得られた。
【０３０２】IV．Ｄ．感染個体由来の血清中のHCV 抗体
を検出するためのラジオイムノアッセイ HCV 抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノアッ
セイは，Tsu およびHerzenberg（1980）の方法を基にし
て開発された。マイクロタイタープレート（Immulon
２，Removawellstrips）をHCV エピトープを有する精製
ポリペプチドで被覆する。この被覆プレートは，HCV エ
ピトープに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試
料，あるいは適当な対照試料とともにインキュベートさ
れる。インキュベートを行なう間に，抗体が存在するの
であれば，該抗体は固相抗原に免疫学的に結合する。非
結合物質を除去し，そしてこのマイクロタイタープレー
トを洗浄後，ヒト抗体−NANBV 抗原複合体は，125Ｉ 標
識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベート
することによって検出される。結合しなかった標識抗体
を吸引によって除去し，そしてプレートを洗浄する。個
々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト抗HCV 抗体
の量はウェル中の放射能に比例する。
【０３０３】IV．Ｄ．１. 融合ポリペプチドSOD-NANB
5-1-1の精製 IV．Ｂ．１. 節に記載の組換え体細菌中で発現する融合
ポリペプチドSOD-NANB5-1-1 は，組換え体E. coliか
ら，尿素で細胞抽出物を分画抽出することによって，次
いで，次のように陰イオンおよび陽イオン交換カラムで
のクロマトグラフィーにかけることによって精製され
た。
【０３０４】１リッターの培養物から得られる溶解細胞
を，0.01Ｍ トリス−HCl ，pH8.0，を含有する10mlの2
0％（ W/V）シュークロース中に再懸濁し，0.4ml の0.5
ＭEDTA，pH8.0 ，を添加した。０℃にて５分後，この
混合物を4,000 ×ｇにて10分間遠心分離した。得られた
ペレットを0.05Ｍ トリス−HCL, pH 8.0 ，１mMフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）およびペプス
タチンＡ １μｇを含有する10mlの25％( W/V ）シュー
クロース液に懸濁させ，次いで，0.5 mlのリゾチーム(1
0mg ／ml）を添加し，０℃で10分間インキュベートし
た。0.05Ｍ トリス−HCl ，pH8.0 ，１mM EDTA 中に１
％(V/V) のトリトンX-100 を含む溶液10mlを添加後，こ
の混合液を，時々振盪しながらひきつづき０℃にて10分
間インキュベートした。得られた粘稠な溶液を，20ゲー
ジの滅菌皮下注射針を６回通すことにより，ホモジナイ
ズし，13,000×ｇにて25分間遠心分離した。ペレット化
した物質を，0.01Ｍ トリス− HCl （pH8.0 ）５mlに
懸濁させ，この懸濁液を，4,000×ｇにて10分間遠心分
離した。SOD-NANB5-1-1 融合タンパクを含有するペレッ
トを，0.02Ｍ トリス−HCl （pH8.0 ），１mMジチオス
レイトール（緩衝液Ａ）中に６Ｍ尿素を含む溶液５mlに
溶解させ，緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロースファ
ースト フローカラムにかけた。ポリペプチドは，緩衝
液ＡのNaCl中0.0 〜0.3Ｍのリニアグラジエントで溶出
した。溶出後，各画分を，SOD の存在下，ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけて分析し，SOD-NANB5-1-1 の
含量を決定した。このポリペプチドを含有する画分をプ
ールし，0.02Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0 ），１
mMジオチスレイトール，に６Ｍ尿素を含む緩衝液（緩衝
液Ｂ）に対して透析した。この透析試料を，緩衝液Ｂで
平衡化したＳ−セファロースファースト フローカラム
にかけ，ポリペプチドを緩衝液Ｂ中でNaCl 0.0〜0.3Ｍ
のリニアグラジエントで溶出させた。この画分を，ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析し，SOD-NANB5-1-1
の存在を調べ，適当な画分をプールした。 このSOD-NA
NB5-1-1 ポリペプチドの最終調製物を，SDS の存在下
で，ポリアクリルアミド電気泳動にかけて調べた。この
分析によれば，この調製物は，80％を越える純度であっ
た。
【０３０５】IV．Ｄ．２ 融合ポリペプチドSOD-NANB81
の精製 IV．Ｂ．２．節で記載の組換え体細菌中で発現した融合
ポリペプチドSOD-NANB81は，組換え体E. coliから，尿
素を用いた細胞抽出物の分画抽出により，次いで，融合
ポリペプチドSOD-NANB5-1-1 を単離するために記載され
た工程（IV．Ｄ．１．節を参照されたい）を用いて，陰
イオンおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを
行なうことにより精製された。
【０３０６】SOD-NANB81ポリペプチドの最終調製物は，
SDS の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て調べられた。この分析によれば，この調製物は50％を
越える純度であった。
【０３０７】IV．Ｄ．３．固相ラジオイムノアッセイに
よるHCV エピトープに対する抗体の検出 NANBH を有すると診断された32人の患者から得られる血
清試料を，ラジオイムノアッセイ（RIA ）によって分析
し，融合ポリペプチドSOD-NANB5-1-1 およびSOD-NANB81
中に存在するHCV エピトープに対する抗体が検出される
か否か決定した。
【０３０８】マイクロタイタープレートをSOD-NANB
5-1-1 あるいはSOD-NANB81（それぞれ，IV．Ｄ．１節お
よびIV．Ｄ．２節に従って，部分精製されている）で被
覆した。この分析は，次のようにして行なわれた。
【０３０９】0.125 Ｍホウ酸緩衝液，pH8.3 ，0.075 Ｍ
NaCl（BBS）中 に0.1 〜0.5 μgのSOD-NANB5-1-1 あ
るいはSOD-NANB81を含む100 μl を，マイクロタイター
プレート（Dynatech Immulon 2 Removawell Strips ）
の各ウェルに添加した。このプレートを湿潤チャンバー
内で４℃にて一晩インキュベートし，その後，このタン
パク溶液を除去し，0.02％ トリトンX-100 を含有する
BBS （BBST）で３度このウェルを洗浄した。非特異的な
結合を防ぐために，このウェルを牛血清アルブミン（BS
A ）で被覆した。この操作は，BSA を５mg／mlの割合で
BBS に溶解させた溶液100 μl 添加し，次いで，室温で
１時間インキュベートすることによって行なった。この
インキュベートの後，BSA 溶液を除去した。被覆された
ウェル中のポリペプチドを血清と反応させ，該血清含有
ウェルを37℃にて１時間インキュベートした。上記血清
との反応は，10mg／ml BSA を含有する含0.01Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液，pH7.2 0.15M NaCl (PBS)中に１：
100 の割合に希釈された血清試料100 μl を添加するこ
とにより行なった。インキュベートの後，この血清試料
を吸引除去し，このウェルをBBSTで５回洗浄した。この
融合ポリペプチドに結合した抗NANB5-1-1 およびNANB81
は， 125Ｉ標識Ｆ’（ab）2 ヒツジ抗ヒトIgG をこの被
覆ウェルに結合させることにより，決定された。標識プ
ローブ（比活性５〜20μCi／μg ）100 μl を各ウェル
に添加し，このプレートを，37℃にて１時間インキュベ
ートした。次いで，過剰のプローブを吸引除去し，BBST
で５回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量を，γ
線を検出するカウンターでカウントし決定した。
【０３１０】NANBH 保有個体における抗NANB5-1-1 およ
び抗NANB81の検出結果を，表１および表２に示す。
【０３１１】
【表１】
【０３１２】
【表２】
【０３１３】表１および表２からわかるように，NANBH
を保有していると診断された患者から得られた32の血清
のうち19が，SOD-NANB5-1-1 およびSOD-NANB81に存在す
るHCV エピトープに対する抗体について陽性であった。
【０３１４】しかし，陽性であった血清試料は，SOD-NA
NB5-1-1 およびSOD-NANB81と同様に免疫学的に反応性を
有しているわけではなかった。No.1の患者から得られた
血清試料は，SOD-NANB81に対しては陽性であったがSOD-
NANB5-1-1 に対しては陽性ではなかった。No.10,15およ
び17の患者から得られた血清試料はSOD-NANB5-1-1 に対
しては陽性であったが，SOD-NANB81に対しては陽性では
なかった。No.3, ８，11および12の患者から得られた血
清試料はSOD-NANB5-1-1 およびSOD-NANB81の両融合ポリ
ペプチドと同程度に反応するが，これに対してNo.2，
４，７および９の患者から得られる血清試料において
は，SOD-NANB81に対するよりもSOD-NANB5-1-1 に対する
反応の方が，２〜３倍反応性が高かった。これらの結果
によりNANB5-1-1 およびNANB81が少なくとも３個の異な
るエピトープを有し得ることが示唆される。つまり，各
ポリペプチドが少なくとも１個の独特のエピトープを有
し，そして，２個のポリペプチドが少なくとも１個のエ
ピトープを共有していることが可能である。
【０３１５】IV. Ｄ．４．NANBH についての固相RIA の
特異性 NANBH についての固相RIA の特異性は，HAV あるいはHB
V に感染した患者から得られる血清および対照個体から
得られる血清の分析を行なうことにより試験された。部
分精製されたSOD-NANB5-1-1 およびSOD-NANB81を使用す
る分析は，実施例IV．Ｄ．３節に記載した方法により行
なわれた。但し，血清は，HAV あるいはHBV を有してい
るとあらかじめ診断された患者から得られた血清である
か，あるいは血液バンクの提血者である個体から得られ
た血清である。HAV およびHBV 感染患者からの血清につ
いての結果を表１および表２に示す。HAV 感染患者から
得られた11個の血清試料，およびHBV 感染患者から得ら
れた20個の血清試料を用いて，RIA により試験が行なわ
れた。表１および表２に示すように，これら血清のいず
れもがBB-NANBVエピトープを有する融合ポリペプチドと
の陽性の免疫反応を行わなかった。
【０３１６】NANB5-1-1 抗原を用いたRIA が，対照個体
から得られる血清の免疫学的反応性を決定するために用
いられた。正常血液提供者集団から得られる230 個の血
清検体のかち，２個だけがRIA において陽性反応を示し
た（データは示されていない）。これら血清サンプルの
源である２人の血液提供者は，以前にHCV にさらされた
可能性がある。
【０３１７】IV．Ｄ．５．NANBH感染進行中におけるNAN
B5-1-1の反応性 ２人の患者および４匹のチンパンジーのNANBH 感染進行
中における抗NANB5-1-1 抗体の存在が，IV．Ｄ．３節に
記載されたRIA 法を用いて追跡された。さらに，感染チ
ンパンジーにおいて，HAV およびHBV の感染進行中にお
ける抗NANB5-1-1 抗体の有無を決定するためにRIA が用
いられた。
【０３１８】その結果を表３および表４に示す。この結
果により，チンパンジーおよびヒトにおいては，抗NANB
5-1-1 抗体は，NANBH 感染の急性症状の発現に従って検
出された。抗NANB5-1-1抗体は，HAV あるいはHBV に感
染したチンパンジーから得られる血清試料では検出され
なかった。このように，抗NANB5-1-1 抗体は，個体がHC
V にさらされたことを示すマーカーとしての働きを有す
る。
【０３１９】
【表３】
【０３２０】
【表４】
【０３２１】IV.E. NANB5-1-1 に対するポリクローナル
血清抗体の精製 SOD-NANB5-1-1 ポリペプチドと，NANBH の患者由来の血
清試料中の抗体との特異的な免疫学的反応性に基づい
て，NANB5-1-1 中のエピトープと免疫学的に反応する血
清抗体の精製法が開発された。この方法はアフィニティ
ークロマトグラフィーを利用する方法である。精製され
たSOD-NANB5-1-1 ポリペプチド（IV.D.1.節参照）を，
不溶性の支持体に結合させたが，その結合は，固定され
たポリペプチドが，NANB5-1-1 に対する抗体の親和性を
保持するような結合である。血清試料中の抗体は，マト
リックスに結合したポリペプチドに吸収される。洗浄し
て，非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した
後，pHの変更および／またはカオトロピック試薬（例え
ば尿素）によって，結合した抗体を，これが結合してい
るSOD-HCV ポリペプチドから脱離させる。
【０３２２】結合SOD-NANB5-1-1 を含有するニトロセル
ロース膜を下記のようにして調製した。ニトロセルロー
スの膜〔2.1 cmのザルトリウス（Sartorius), 微細孔の
径：0.2 μm 〕を，BBS で３分間ずつ３回洗浄した。精
製した製剤を，BBS 中，室温で２時間かまたは４℃で一
夜インキュベートすることによってSOD-NANB5-1-1 を上
記の膜に結合させた。未結合の抗原を含有する溶液を除
去し，フィルターをBBS で３分間ずつ３回洗浄した。膜
に残っている活性部位を，５mg／mlのBSA 溶液とともに
30分間インキュベートすることにより，BSA でブロック
した。得られた膜を，BBS で５回，蒸留水で３回洗浄し
て，過剰のBSA を除去した。ウイルス抗原とBSA を含有
する膜を，次に，0.05M の塩酸グリシン（pH 2.5）, 0.
10M NaCl（Gly HCl）で15分間処理し，次いでPBS で３
分間ずつ３回洗浄した。
【０３２３】NANBH に感染した個体由来の血清との融合
ポリペプチドを含有する膜を，２時間インキュベートす
ることによって，ポリクローナル抗NANB5-1-1 抗体を単
離した。インキュベーション後，フィルターをBBS で５
回, 蒸留水で２回洗浄した。次いで結合している抗体
を，各フィルターから，GlyHClを５回，３分間ずつ用い
て溶離した。各溶離液を，2.0MトリスHCl 緩衝液（pH
8.0）の入っている試験管に集めて，溶離液のpHを8.0
に調整した。アフィニティークロマトグラフィーで処理
した後の抗NANB5-1-1 抗体の回収率は約50％である。
【０３２４】結合ウイルス抗原を含有するニトロセルロ
ース膜は，結合容量はそれほど減少することなしに数回
使用することができる。膜を再使用するには，抗体を溶
離した後，膜をBBS で３回３分間ずつ洗浄する。次いで
BBS 中，４℃で貯蔵する。
【０３２５】IV.F. 精製ヒトポリクローナル抗-HCV抗体
を用いて感染血漿からHCV粒子を捕獲する方法；捕獲さ
れた粒子中の核酸のHCV cDNAへのハイブリダイゼーシ
ョン IV.F.1. ヒトポリクローナル抗-HCV抗体を用いて感染血
漿からHCV 粒子を捕獲する方法 NANBH に感染したチンパンジーの感染性血漿中に存在す
るタンパク−核酸複合体を，ポリスチレンビーズに結合
させた精製ヒトポリクローナル抗HCV 抗体を用いて精製
した。
【０３２６】ポリクローナル抗NANB5-1-1 抗体は，クロ
ーン5-1-1 にコードされたSOD-HCVポリペプチドを用い
て，NANBH に感染したヒト由来の血清から精製した。精
製法はIV.E. 節に記載の方法を用いた。
【０３２７】精製抗NANB5-1-1 抗体を，ポリスチレンビ
ーズ（直径1/4"， 鏡面仕上げ, Precision Plastic Ba
ll Co., シカゴ, イリノイ）に，各々，室温で一夜，１
mlの抗体〔ホウ酸緩衝食塩水（pH 8.5）中１μg ／ml〕
とともにインキュベートすることによって結合させた。
一夜インキュベーションした後に，ビーズを，TBST（50
mMトリスHCl pH8.0 緩衝液，150mM NaCl, 0.05％(V/V)
Tween 20）で１回洗浄し，次に10mg／ml BSAを含有する
リン酸緩衝食塩水(PBS）で洗浄した。
【０３２８】精製抗NANB5-1-1 抗体を全ヒト免疫グロブ
リンと取替えること以外は，同様にして対照のビーズを
調製した。
【０３２９】ビーズに結合させた抗NANB5-1-1 抗体を用
いて，NANBH に感染したチンパンジーの血漿から，HCV
を次のようにして捕獲した。使用した，NANBH に感染し
たチンパンジーの血漿についてはIV.A.1. 節に記載して
ある。NANBV に感染したチンパンジーの血漿の一部（１
ml）を，抗NANB5-1-1 抗体または対照の免疫グロブリン
でコートした５個のビーズの各々と，37℃で３時間イン
キュベートした。得られたビーズをTBSTで３回洗浄し
た。
【０３３０】IV.F.2. 捕獲された粒子中の核酸のNANBV-
cDNAへのハイブリダイゼーション 抗NANB5-1-1 抗体によって捕獲された粒子から遊離した
核酸成分を，クローン81由来のHCV cDNAとハイブダイゼ
ーションさせて分析した。
【０３３１】IV.F.1. 節に記載したのと同様にして，HC
V 粒子をNANBH に感染したチンパンジーの血清から捕獲
した。該粒子から核酸を遊離させるために，洗浄したビ
ーズを，プロテイナーゼK(１mg／ml），10mMトリスHCl
pH7.5 緩衝液，10mM EDTA,0.25％(W/V)SDS, 10μg ／ml
の可溶性酵母RNA を含有する溶液の 0.2ml／ビーズとと
もに，37℃で60分間インキュベートし，次いで上澄み溶
液を取出した。この上澄み液をフェノールとクロロホル
ムで抽出し，次いで核酸をエタノールで，一夜−20℃に
て沈殿させた。この核酸の沈殿を，遠心分離して集め，
乾燥し，50mM Hepes, pH7.5 に溶解させた。抗NANB
5-1-1 抗体でコートされたビーズから得た試料および全
ヒト免疫グロブリンを含有する対照ビーズで得た試料か
らの可溶性核酸の二つの部分をニトロセルロースフィル
ターに吸い取らせた。これらのフィルターを，クローン
81中の精製HCV cDNA断片で作製した，32P で標識し，ニ
ックトランスレーションを行ったプローブとハイブッド
させた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション
法は，IV.C.1. 節に記載してある。
【０３３２】抗NANB5-1-1 抗体を含有するビーズによっ
て捕獲された粒子由来の核酸を含有するプローブされた
フィルターのオートラジオグラフを第57図に示す。抗NA
NB5- 1-1 抗体を用いて得た抽出物（A , A ）から，対照
の抗体抽出物（A , A ）および対照の酵母 RNA（B , B
）に比べて明確なハイブリダイゼーションシグナルを
得た。精製クローン81 cDNA断片の１pg, ５pgおよび10
pgからなる標準物をそれぞれC1-3に示す。
【０３３３】これらの結果は，抗NANB5-1-1 抗体によっ
てNANBH 血漿から捕獲された粒子が，クローン81内のHC
V cDNAとハイブリダイゼーションする核酸を含有するこ
とを示し，その結果これらのクローン中のcDNAは，NANB
H の病原体から誘導されるという別の証拠を提供してい
る。
【０３３４】IV.G. C100-3と精製抗NANB5-1-1 抗体との
免疫学的反応性 C100-3融合ポリペプチドと抗NANB5-1-1 抗体との免疫学
的反応性を，放射性免疫検定法によって測定したが，こ
の検定法では，固相に結合した抗原が，精製抗NANB
5-1-1 抗体に投与され，生成した抗原抗体複合物が，12
Iで標識したヒツジ抗ヒト抗体で検出された。C100-3ポ
リペプチドの免疫学的反応性を，SOD-NANB5-1-1 抗原の
それと比較した。
【０３３５】融合ポリペプチドC100-3を，IV.B.5. 節と
IV.B.6. 節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精
製した。融合ポリペプチドSOD-NANB5-1-1 をIV.B.1. 節
とIV.D.1. 節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し
精製した。精製抗NANB5-1-1抗体を，IV.E. 節に記載し
たのと同様にして得た。
【０３３６】0.125Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.
3）, 0.075M NaCl (BBS) 中，種々の量の精製C100-3抗
原を含有する 100μl のアリコットを，マイクロタイタ
ープレート（Dynatech Immulon2 Removawell Strips )
の各ウェルに添加した。このプレートを加湿チャンバー
内で，一夜４℃にてインキュペートした。次いでタンパ
ク溶液を除き，ウェルを 0.02 ％のTriton X-100含有の
BBS(BBST) で３回洗浄した。非特異的結合を防止するた
めに，５mg／mlのBSA を含有するBBS 溶液を100 μl 添
加することによって，ウェルをBSA でコートし，次いで
室温で１時間インキュベートした後，過剰のBSA 溶液を
除去した。ウェル当り１μg の抗体を添加することによ
って，コートされたウェル内のポリペプチドを，精製抗
NANB5-1-1 抗体と反応させ，次いでその試料を37℃で１
時間インキュベートした。インキュベートした後，過剰
の溶液を吸引によって除去し，ウェルをBBSTで５回洗浄
した。12 Iで標識したF'(ab)2 ヒツジ抗ヒトIgG を，コ
ートされたウェルに結合させることによって，融合ポリ
ペプチドに結合した抗NANB5-1-1 を測定した。標識した
プローブ（比放射能：５〜20μCi／mg）の100 μl ずつ
を各ウェルに添加し，そのプローブを37℃で１時間イン
キュベートし，過剰のプローブを吸引で除去し，BBSTで
５回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量は，γ線
を検出するカウンターで計数することによって測定し
た。
【０３３７】C100の精製抗NANB5-1-1との免疫学的反応
性を，NANB5-1-1 の精製抗体との免疫学的反応性と比
較した結果を表５に示す。
【０３３８】
【表５】
【０３３９】表５の結果は，抗NANB5-1-1 が， C100-3
ポリペプチドのC100の部分内のエピトープを認識すると
いうことを示している。したがってNANB5-1-1 とC100は
共通のエピトープをもっている。これらの結果は，この
NANBV エピトープをコードするcDNA配列が，クローン5-
1-1 とクローン81の両者に存在する配列であるというこ
とを示唆している。
【０３４０】IV.H. HCV の特性決定 IV.H.1. HCV ゲノムのストランドの状態（strandednes
s）の特性決定 抗NANB5-1-1 抗体でコートしたポリスチレンビーズに捕
獲された粒子から核酸の画分を単離し，次に単離した核
酸が，HCV cDNAの正鎖および／または負鎖とハイブリダ
イゼーションするか否かを測定することによって，HCV
ゲノムをそのストランドの状態について特性決定した。
【０３４１】IV.F.1. 節に記載したようにして，免疫学
的に精製した抗NANB5-1-1 抗体でコートしたポリスチレ
ンビーズを用いて，HCV に感染したチンパンジーの血漿
から，粒子を捕獲した。粒子の核酸成分を，IV.F.2. 節
に記載した方法を用いて遊離させた。３mlの高力価血漿
と当量の単離されたゲノム核酸のアリコットを，ニトロ
セルロースフィルターに吸い取らせた。対照として，ク
ローン81由来の変性HCV cDNA（２pg）のアリコットを同
じフィルターに吸い取らせた。そのフィルターを, HCV
cDNAからクローン化された一本鎖DNA の，正鎖または負
鎖の32P で標識した混合物でプローブした。なお該cDNA
は，クローン40ｂ, 81および25ｃから切り出されたもの
である。
【０３４２】EcoRI でクローン81, 40ｂおよび25ｃから
HCV cDNAを切り出し，そのcDNA断片をM13 ベクターのmp
18とmp19内でクローン化することによって，一本鎖のプ
ローブを得た〔メシング（Messing ）1983年〕。そのM1
3 クローンの塩基配列を決定し，そのクローンがHCV cD
NA由来のDNA の正鎖もしくは負鎖をもっているかどうか
を決定した。塩基配列の決定は，サンガーら（Sanger e
t al）（1977年）のジデオキシチェーンターミネーショ
ン法で行った。
【０３４３】捕獲された粒子から単離されたHCV ゲノム
の一部を含有する二重のフィルターの各セットを，HCV
cDNA由来の正鎖または負鎖のプローブとハイブリダイゼ
ーションさせた。第58〜60図は，NANBV ゲノムを，クロ
ーン81, 40ｂおよび25ｃ由来のプローブの混合物でプロ
ーブして得たオートラジオグラフを示す。この混合物
は，ハイブリダイゼーション検定法の感度を増大させる
ために用いた。パネルＩの試料を，正鎖プローブの混合
物とハイブリダイゼーションさせた。パネルIIの試料
を，負鎖のプローブ混合物でハイブリダイゼーションさ
せることによってプローブした。免疫ブロット法に付し
たパネルの試料を表６に示す。
【０３４４】
【表６】
【０３４５】第58〜60図の結果から分かるように，負鎖
のDNA プローブだけが，単離されたHCV ゲノムとハイブ
リダイゼーションする。この結果は，ゲノムがRNase に
は感受性であるがDNase には感受性でないという結果
（IV.C.2.節参照）と併せて，NANBV のゲノムが正鎖の
RNA であることを示唆している。
【０３４６】これらのデータと，推定上のNANBV の物理
化学的性質に関する他の実験室のデータは，HCV がフラ
ビウイルス科に属する可能性があることを示している。
しかし，HCV が，新種のウイルス因子に相当する可能性
も無視できなかった。
【０３４７】IV．Ｈ．２．PCR で増幅された場合，クロ
ーン81由来のHCV cDNAとハイブリダイゼーションする捕
獲粒子の塩基配列の検出法 捕獲粒子のRNA を，IV．Ｈ．１. 節に記載したのと同様
にして得た。クローン81由来のHCV cDNAとハイブリダイ
ゼーションする塩基配列の分析を，第IV．Ｃ．３節に記
載したのと同様にしてPCR 増幅法を利用して行ったが，
ハイブリダイゼーションプローブはクローン81 cDNA塩
基配列由来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレオチ
ドを用いた。試験結果は，増幅された塩基配列がクロー
ン81由来のHCV cDNAプローブとハイブリダイゼーション
することを示した。
【０３４８】IV．Ｈ．３ デング熱フラビウイルス（MN
WWVD1 ）の非構造タンパクと，39Ｃに結合されたクロー
ン14i のORF によってコードされるHCV ポリペプチドと
の間の相同性 39Ｃによって結合されたクローン14i のHCV cDNAは，第
29〜34図に示すように一つの連続ORF を含有している。
これにコードされたポリペプチドを，デング熱フラビウ
イルス（MNWVD1）の非構造ポリペプチドの領域との配列
相同性について分析した。この分析は，デイホッフ（Da
yhoff ）のタンパクデータベースを用い，コンピュータ
で行った。結果を第61図に示すが，図中，記号（：）は
厳密な相同性を示し，記号（．）は塩基配列が若干置換
されていることを示し，ダッシュ記号は，最大の相同性
を得るため塩基配列中に挿入されたスペースを示す。こ
の図から分かるように，HCV cDNAにコードされた塩基配
列と，デング熱フラビウイルス非構造タンパクとの間に
は有意な相同性がある。第61図に示す相同性に加えて，
cDNAの3'末端の領域にコードされたポリペプチドセグメ
ントには，分析した結果，デング熱ポリメラーゼの塩基
配列と相同性の塩基配列が含まれていた。RNA 依存性RN
A ポリメラーゼに対して必須であると考えられる標準的
なGly-Asp-Asp （GDD ）配列が，HCV cDNAにコードされ
たポリペプチドに含まれ，その位置がデング熱２ウイル
ス内の位置と一致しているということは重要なことであ
る（データは記載していない）。
【０３４９】IV．Ｈ．４．HCV-DNA は，NANBH に感染し
た組織内には検出できない ２種の研究結果は，HCV-DNA が，NANBH に感染した個体
由来の組織内には検出できないことを示唆している。こ
れらの結果は，IV．Ｃ．とIV．Ｈ．１. とIV．Ｈ．２．
の各節に記載した結果と併せて，HCV がDNA を含有する
ウイルスではなく，その複製にはcDNAを含まないという
証拠を提供している。
【０３５０】IV．Ｈ．４．ａ．サザンブロット法 NANBH に感染したチンパンジーの肝臓が，検出可能なHC
V-DNA （もしくはHCV-cDNA）を含有しているか否かを決
定するために，この起源から単離したDNA の制限酵素に
よる断片をサザンブロット法に付して，ブロット物を32
P で標識したHCV cDNAでプローブした。上記の標識した
HCV cDNAは，感染チンパンジーの肝臓由来のブロットさ
れたDNA とハイブリダイゼーションをしないという結果
を示した。また同じ標識HCV cDNAは，正常なチンパンジ
ーの肝臓由来の対照のブロットされたDNA ともハイブリ
ダイゼーションをしなかった。これに対して，陽性対照
においては，β−インターフェロン遺伝子の標識したプ
ローブが，制御酵素で切断したヒト胎盤DNA のサザンブ
ロット法に付したものと強くハイブリダイゼーションし
た。これらの系は，標識したプローブで検出すべき遺伝
子の単一コピーを検出するために設計された。
【０３５１】NANBH に感染した２頭のチンパンジーの肝
臓からDNA を単離した。対照のDNAを，未感染のチンパ
ンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。DNA の抽出は，基
本的にはマニアティスら（1982年）の方法によって行
い，そのDNA 試料は，単離工程中，RNAse で処理した。
【０３５２】各DNA 試料は，メーカーの説明書に従っ
て，EcoRI ，MboIまたはHincII（12μg ）で処理した。
切断したDNA を１％中性寒天ゲルで電気泳動し，ニトロ
セルロース上にサザンブロットし，次いでブロットされ
た物質は，適当なニックトランスレーションされたプロ
ーブcDNAとハイブリダイゼーションした（３×10 cpm／
mlのハイブリダイゼーションミックス）。感染チンパン
ジーの肝臓と正常な肝臓由来のDNA は，クローン36と81
由来の32P で標識したHCV cDNAとハイブリダイゼーショ
ンし，またヒト胎盤由来のDNA はβ−インターフェロン
遺伝子由来の32Pで標識したDNA とハイブリダイゼーシ
ョンした。ハイブリダイゼーション後，ブロットしたも
のを，厳密条件下，すなわち，0.1 ×SSC と0.1 ％SDS
を含む溶液を用い65℃で洗浄した。
【０３５３】β−インターフェロン遺伝子DNA を，ホー
トンら（Houghton et al）（1981年）が記述しているの
と同様にして調製した。
【０３５４】IV．Ｈ．４．ｂ．PCR 法による増幅 HCV-DNA が，NANBH に感染したチンパンジーの肝臓内に
検出できるか否かを決定するために，DNA をその組織か
ら単離し，プライマーとクローン81のHCV cDNA由来のプ
ローブポリヌクレオチドを用いて，PCR 増幅検出法に付
した。陰性対照は，未感染HepG2 組織の培養細胞と，未
感染と思われるヒト胎盤とから単離したDNA 試料を用い
た。陽性対照は，陰性対照にクローン81由来のHCV cDNA
挿入物の比較的少ない既知量（250 分子）を添加した試
料を用いた。
【０３５５】さらに，NANBH に感染したチンパンジーの
同じ肝臓から単離したRNA 画分が，HCV-cDNAプローブに
対して相補的な配列をもっていることを確認するため
に，PCR 増幅検出法を，単離したRNA 試料にも用いた。
【０３５６】この研究では，DNA はIV．Ｈ．４．ａ節に
記載の方法で単離し，RNA は，チャーギンら（Chirgwin
et al）（1981年）が記述しているのと同様にして抽出
した。
【０３５７】DNA の試料を，２頭の感染チンパンジーの
肝臓，未感染のHepG2 細胞およびヒト胎盤から単離し
た。各DNA の１μg をメーカーの説明書にしたがってHi
ndIIIで切断した。逆転写酵素工程を省略したことを除
いて，IV．Ｃ．３節に記載と基本的に同様にして，上記
の切断試料を，PCR 増幅法に付し，増幅したHCV cDNAを
検出した。PCR プライマーとプローブは，HCV cDNAクロ
ーン81由来のものであり，IV．Ｃ．３．節に記載されて
いる。増幅する前に，陽性対照については，各DNA の
試料１μg は，クローン81から単離したHCV cDNA挿入物
の250 分子を添加することによって「スパイク」され
た。
【０３５８】HCV 配列が，NANBH に感染したチンパンジ
ーの肝臓から単離したRNA に存在しているか否かを決定
するために，0.4 μg の全RNA を含有する試料を，陰性
対照試料のいくつかから逆転写酵素の工程を省略するこ
と以外は，IV．Ｃ．３．節に記載したのと同様の増幅法
に付した。PCR プライマーとプローブは，上記の記載と
同様に，HCV cDNAクローン81由来のものであった。
【０３５９】その結果，HCV cDNAプローブに相補的な増
幅された配列は，感染チンパンジーの肝臓由来のDNA 中
には検出できず，また陰性対照にも検出できなかった。
これとは異なり，感染チンパンジーの肝臓由来のDNA を
含む試料が増幅される前にHCV cDNAでスパイクされた場
合，クローン81の配列がすべての陽性対照の試料に検出
された。さらに，RNA の研究では，増幅されたHCV cDNA
クローン81の配列が，逆転写酵素を用いた時にのみ検出
されたが，これは，この結果がDNA 汚染が原因でないこ
とを強く示唆している。
【０３６０】これらの結果は，NANBH に感染したチンパ
ンジー由来の肝細胞が，HCV DNA を全く含有しないか，
または検出不可能な濃度で含有していることを示してい
る。スパイク法の研究によれば，HCV DNA が存在する場
合，それは0.06コピー／肝細胞よりはるかに低い濃度で
ある。これに対し，同じ肝臓試料由来の全RNA のHCV配
列は，PCR 法によって容易に検出された。
【０３６１】IV．Ｉ．試験抗原としてHCV c100-3を用い
る，HCV 感染のELISA 法による決定 全試料を，HCV c100-3 ELISA法を用いて検定した。この
検定法は，HCV c100-3抗原（IV．Ｂ．５節に記載したの
と同様にして合成し精製した）と，マウスモノクローナ
ル抗ヒトIgG のホースラディッシュペルオキシダーゼ
（HRP ）複合体とを利用する。
【０３６２】HCV c100-3 抗原でコートしたプレートを
次のようにして調製した。コーティング緩衝液（50mM
ホウ酸ナトリウム，pH9.0 ）の21ml／プレート，BSA
（25μg／ml）およびc100-3（2.50μg ／ml）を含有す
る溶液を，Removeawell ImmulonＩプレート（Dynatech
Corp.）に添加する直前に調製した。５分間混合後，上
記溶液0.2 ml／ウェルをプレートに添加した。プレート
をカバーし２時間37℃でインキュベートし，次いで溶液
を吸引して除去した。ウェルを400 μl の洗浄緩衝液
〔100 mMリン酸ナトリウム（pH7.4 ），140 mM塩化ナト
リウム，0.1 ％(W/V)カゼイン，１％(W/V) Triton X-10
0，0.01％(W/V) Thimerosal〕で１回洗浄した。洗浄液
を除いた後，後コート溶液200 μl／ウェル〔10mMリン
酸ナトリウム（pH7.2 ），150 mM塩化ナトリウム，0.1
％(W/V) カゼインおよび２mMフッ化フェニルメチルスル
ホニル（PMSF）〕を添加し，プレートをゆるくカバーし
て蒸発を防止し，室温で30分間放置した。次にウェルか
ら吸引して溶液を除き，保存加熱せずに一夜凍結乾燥し
た。得られたプレートを，密封したアルミニウムパウチ
内に２〜８℃で貯蔵する。
【０３６３】ELISA 法で決定するために，20μl の血清
試料または対照試料を，200 μl の試料希釈剤〔100 mM
リン酸ナトリウム（pH7.4 ），500 mM塩化ナトリウム，
１mMEDTA ，0.1 ％(W/V) カゼイン，0.015％(W/V) Ther
osal），１％(W/V) TritonX- 100 ，100 μg ／ml 酵
母エキス〕の入ったウェルに添加した。プレートを密封
し，37℃で２時間インキュベートし，その後溶液を吸引
して除き，400 μlの洗浄緩衝液〔0.05％のTween 20を
含有するリン酸緩衝食塩水(PBS) 〕でウェルを洗浄し
た。洗浄したウェルを，200μl のマウス抗ヒトIgG-HRP
複合体を含有する，オルト複合体希釈剤〔10mMリン酸
ナトリウム（pH7.2 ），150 mM塩化ナトリウム，50％(V
/V) 胎仔ウシ血清，１％(V/V) 熱処理ウマ血清，１mM K
3Fe(CN)60.05％(W/V) Tween 20，0.02％(W/V) Thimeros
al〕の溶液で処理した。37℃で１時間処理を行い，溶液
を吸引によって除去し，ウェルを洗浄緩衝液で洗い，緩
衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合体の量を測定
するために，200 μl の基質溶液（10mgの0-フェニレン
ジアミン二塩酸塩／５mlの展開剤溶液）を添加した。展
開剤溶液は，リン酸によってpH5.1 に調節された50mMの
クエン酸ナトリウムと，0.6μl ／mlの30％H2O2 を含有
している。基質溶液が入ったプレートを，暗所内で，30
分間室温でインキュベートし，反応は50μl ／mlの４Ｎ
硫酸を添加して停止させ，ODを測定した。
【０３６４】下記の実施例は，HCV C100-3抗原を利用す
るマイクロタイタープレートのスクリーニング ELISA法
が高い特異性を有することを示す。このことは，初期反
応率が約１％で，反復反応率が任意のドナーについて約
0.5 ％であることによって証明されている。この検定法
は，感染の急性期後および疾患の慢性期の両方における
免疫応答を検出することができる。さらに，この検定法
は，NANBH に対する代理試験についてマイナスの評価を
されているいくつかの試料を検出することができる。な
おこれらの試料は，NANBH の病歴を持つ個体またはNANB
H 伝染に関係があるドナー由来のものである。
【０３６５】以下の実施例では，次の略号が用いられ
る。
【０３６６】 ALT アラニンアミノ転移酵素 抗-HBc HBcに対する抗体 抗-HBsAg HBsAgに対する抗体 HBc Ｂ型肝炎コア抗原 ABsAg Ｂ型肝炎表面抗原 IgG 免疫グロブリンＧ IgM 免疫グロブリンＭ IU/L 国際単位／l NA 入手不能 NT 試験せず N 試料の大きさ Neg 陰性 OD 光学密度 Pos 陽性 S/CO シグナル／カットオフ SD 標準偏差 x 平均値 WNL 標準限界内。
【０３６７】IV．Ｉ．１. 任意のドナー集団におけるHC
V の感染 任意のドナーから得た1,056試料（新鮮な血清）を，Irw
in Memorial Blood Band （米国，カリフォルニア州，
サンフランシスコ）から得た。これらの試料によって得
た試験結果を，OD値の分布を示すヒストグラムにまとめ
る。（第62図）。第62図から分かるように，４試料が３
より大きい値を示し，１試料が１と３の間，５試料が0.
4 と１の間，および残りの1,046 試料が0.4 より小さい
値を示し，これらの試料の90％以上が0.1 より小さい。
【０３６８】反応性であった任意試料についての試験結
果を表７に示す。平均値＋５標準偏差に等しいカットオ
フ値を用いた場合，1,056 試料中の10試料（0.95％）が
最初反応性であった。これらの試料中５試料（0.47％）
は，前記の ELISA法を用いて２回目の検定を行ったとこ
ろ繰り返し反応性を示した。また表７は，繰り返し反応
性を示した各試料に対してALT および抗HBd 状態を示し
ている。特に興味深いのは，繰り返し反応性であった５
試料全部が，NANBH に対する両代理試験で陰性であり，
一方HCV ELISA法法では陽性であったということであ
る。
【０３６９】
【表７】
【０３７０】IV.I.2. チンパンジー血清試料 11匹のチンパンジーから得た血清試料を，HCV c100-3を
用いた ELISA法により試験した。これらのチンパンジー
のうち４匹には，疾患管理センター（the Centers fo
r DiseaseControl ）のDaniel Bradley博士と共同して
確立された方法に従って，第VIII因子の汚染バッチに由
来する NANBH（お くは，ハッチンソン(Hutchinson)
株であると推測される）を感染させた。対照として，他
の４匹のチンパンジーにはHAV を，そして３匹にはHBV
を感染させた。血清試料は，感染後の様々な時期に採取
した。
【０３７１】これらの結果は，表８および表９に要約さ
れているが，ハッチンソン株のNANBH に感染させたすべ
てのチンパンジーにおいて実証された抗体の血清転換を
示している。感染の急性期（ALT レベルが有意に上昇
し，続いて正常レベルに戻ることから示される）の後
は，HCV c100-3に対する抗体がNANBH に感染させた４匹
のチンパンジーのうち４匹の血清中で検出し得るように
なった。これら試料は，すでにIV.B.3節で考察したよう
に，ウェスタン（Western）分析および放射性免疫検定
法（RIA） により陽性であることが示されている。こ
れとは対照的に，HAVまたはHBV に感染させた対照のチ
ンパンジーはELISA 法における反応性を示した。
【０３７２】
【表８】
【０３７３】
【表９】
【０３７４】IV.I.3. パネル１：慢性ヒトNANBH キャリ
アから得られた保証感染性血清 コードされたパネルは，22個の独自の試料から構成され
ていた。ただし，これらの試料は，各々につき二重検定
を行うので，合計で44個であった。これらの試料は，慢
性NANBH キャリアから得た保証感染性血清，関係供血者
から得た感染性血清，および急性NANBH 患者から得た感
染性血清からのものであった。さらに，非常に由来が明
確な陰性対照群，および他の疾患対照群からも試料を得
た。このパネルは，国立衛生研究所（National Institu
tes of Health, Bethesda, Mary-land) のHealth and H
uman Service部のH. Alter博士から提供された。このパ
ネルは，数年前にAlter 博士により構築され，推定NANB
H 検定の適合パネルとして，Alter 博士により使用され
てきた。
【０３７５】上記の全パネルをELISA 法で２度分析し，
その結果を評価するためにAlter 博士に送付した。評価
の結果を表10に示す。この表には，二重検定の一方の組
の結果が示されているが，二重検定試料の各々について
同じ値が得られた。
【０３７６】表10に示すように，チンパンジーモデルに
おいて感染性であると証明された６個の血清は非常に陽
性であった。７番目の感染性血清は，急性NANBH の場合
の試料に対応しており，このELISA において反応性では
なかった。正常 ALTレベルを有し，かつチンパンジーで
の研究結果が不明確であった関係供血者から得た試料
は，上記の分析において反応性ではなかった。急性NANB
H の１個体から得た３個の他の一連の試料も反応性では
なかった。非常に由来が明確な陰性対照群からの全ての
試料は，少なくとも10回の献血で肝炎の疑いがなかった
供血者から得たものであるが，上記のELISA において反
応性ではなかった。最後に，検査試料のうち４個は，他
人により開発された推定NANBH 検定において陽性である
と以前は評価されていたが，これらの分析では確定でき
なかった。これらの４個の試料は上記のHCV ELISA 法で
は陰性と判定された。
【０３７７】
【表１０】
【０３７８】IV.I.4. パネル２：供血者／受血者のNANB
H 前記のコードされたパネルは，輸血に関連するNANBH に
ついて供血者および受血者が明確な10事例からなり，試
料の合計は188 であった。各事例は，受血者に対する数
人またはすべての供血者の試料，およびこの受血者から
得た（輸血後，３ヵ月，６ヵ月, および12ヵ月目に採血
した）一連の試料からなるものであった。また，輸血前
に予め受血者から採血された血液試料も含まれていた。
コードされたパネルは，NIH のH. Alter博士により提供
されたものであり，結果は評価を行うために同博士へ送
付した。
【０３７９】これらの結果は，表11に要約したが，ELIS
A 法により，輸血に関連するNANBHの10事例のうち９事
例において，抗体血清転換が検出されたことを示してい
る。事例４の試料（血清転換が全く検出されなかった）
は，前記ELISA 法において，一貫して反応性に乏しかっ
た。10個の受血者試料のうち２個は，輸血後３ヵ月で反
応性があった。12ヵ月では，事例４を除いて，すべての
試料が反応性であった。さらに，少なくとも１人の抗体
陽性供血者が10事例のうち７事例に見い出され，事例10
には２人の陽性供血者が存在した。また，事例10では，
輸血前に採血した受血者の血液はHCV 抗体について陽性
であった。この受血者から得た１ヵ月目の採血試料は反
応性レベルの境界線まで低下したが，４ヵ月および10ヵ
月目の採血試料では陽性レベルにまで上昇した。一般
に，S/COが0.4 であれば，陽性であると考えられる。従
って，この事例では，個体が事前にHCV 感染していたこ
とを示している。
【０３８０】反応性である（すなわち，陽性である）す
べての試料に対するALT およびHBcの状態を表12に要約
する。この表から明らかなように，供血者試料の1/8
は，代理マーカーに対しては陰性であったが，HCV 抗体
ELISA 法では反応性であった。他方，受血者試料（輸血
後12ヵ月まで引き続き採血された）は，高いALT を有す
るか，または抗HBc が陽性であるか，あるいはその両方
であった。
【０３８１】
【表１１】
【０３８２】
【表１２】
【０３８３】IV.I.5. 高危険率グループの試料における
HCV 感染の決定 高危険率グループから得られた試料は，HCV c100-3抗原
に対する反応性を決定するELISA 法を用いてモニターさ
れた。これらの試料は，Gary Tegtmeier博士（Communit
y Blood Bank, Kansas City ）から得られた。結果を
表13に要約する。
【０３８４】この表に示されているように，反応性の最
も高い試料は，血友病者から得られる（76％）。さら
に，ALT が上昇し，抗HBc について陽性の個体から得ら
れた試料は，51％が反応性であると評価されたが，この
値は，臨床データから予想される値と一致しており，こ
のグループ内にはNANBH が流行していた。HCV に対する
抗体の発生率は，ALT が高いだけの供血者, Ｂ型肝炎コ
アに対する抗体について陽性であるだけの供血者，そし
て任意の志願供血者に比べてALT が高いか，あるいは抗
コア抗体を有するということ以外の理由で拒否された供
血者においても高かった。
【０３８５】
【表１３】
【０３８６】IV.I.6. HCV c100-3 ELISA法における第２
抗体として抗IgG または抗IgM モノクローナル抗体ある
いはポリクローナル抗体を用いた比較研究 抗IgG モノクローナル複合体を用いたELISA 法の測定感
度は，抗IgM モノクローナル複合体を用いるか，あるい
はこれら両者をＨ鎖およびＬ鎖の両方に特異的であると
報告されたポリクローナル抗血清で置き換えることによ
り得られる測定感度と比較された。以下の研究が行われ
た。
【０３８７】IV.I.6.a. 血清転換者から得られた一連の
試料 NANB血清転換者の３つの事例から得られた一連の試料
を，HCV c100-3 ELISA法で研究した。このELISA 法で
は，酵素複合体に抗IgG モノクローナル抗体だけを用い
るか，または抗IgM モノクローナル抗体と組合わせて用
いるか，あるいはポリクローナル抗血清を用いた。これ
らの試料は，Cladd Stevens 博士（N.Y. Blood Center,
N.Y.C., N.Y.）により提供された。試料の歴史を表14
に示す。
【０３８８】抗IgG モノクローナル抗体−酵素複合体を
用いて得られた結果を表15に示す。これらのデータは，
事例１，２，および３の各試料1-4, 2-8, および3-5 に
おいて，最初に強い反応性が検出されることを示してい
る。
【０３８９】抗IgG モノクローナル複合体および抗IgM
複合体の組合わせを用いて得られた結果を表16に示す。
抗IgMに対する抗IgG の３つの異なる割合で試験した；
抗IgG の希釈率１：10,000は終始一定であった。抗IgM
モノクローナル複合体の試験された希釈率は，１：30,0
00，１：60,000，および１：120,000 であった。これら
のデータは，抗IgG だけを用いた研究と同様に，試料1-
4, 2-8, および3-5 において，最初の強い反応性が検出
されることを示している。
【０３９０】抗IgG モノクローナル複合体（希釈率１：
10,000），またはTagoポリクローナル複合体（希釈率
１：80,000），あるいはJackson ポリクローナル複合体
（希釈率１：80,000）を用いたELISA 法で得られた結果
を表17に示す。これらのデータは，３種類の形態をすべ
て用いると，試料1-4, 2-8, および3-5 において，最初
の強い反応性が検出されることを示している：Tagoのポ
リクローナル抗体は最も低いシグナルを与えた。
【０３９１】上に与えた結果は，(ALT上昇により明らか
となる）疾患の急性期後の同時期に，３種類の形態によ
り，反応性の試料が検出されることを示している。ま
た，これらの結果は，抗IgG モノクローナル−酵素複合
体を用いたHCV c100-3 ELISA法の感度が，該酵素複合体
について試験された他の形態と同等またはそれ以上であ
ることを示している。
【０３９２】
【表１４】
【０３９３】
【表１５】
【０３９４】
【表１６】
【０３９５】
【表１７】
【０３９６】IV.I.6.b. 任意抽出の供血者から得られた
試料 任意抽出の供血者から得られた試料（IV.I.1.節参照）
を, HCV 感染について，HCV c100-3 ELISA法によりス
クリーニングした。このとき，抗体−酵素複合体は，抗
IgG モノクローム複合体またはポリクローナル複合体の
いずれかであった。スクリーニングされた試料の総数
は，ポリクローナル複合体およびモノクローナル複合体
に対して，それぞれ1077個および1056個であった。スク
リーニング結果の要約を表18に示す。また，試料の分布
を第63図のヒストグラムに示す。
【０３９７】平均値および標準偏差の計算は，シグナル
が1.5 を超えるような試料を除いて行った。すなわち，
ポリクローナル複合体を利用した場合の計算には1073個
のOD値を用い，抗IgG モノクローナル複合体を利用した
場合の計算には1051個のOD値を用いた。表15から明らか
なように，ポリクローナル複合体を用いた場合には，平
均値が0.0493から0.0931にシフトし，標準偏差は0.074
から0.0933に増加した。また，これらの結果は，x ＋５
SDという基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれ
ば，ELISA 法におけるポリクローナル酵素複合体の形態
が，より高いカットオフ値を必要とすることを示してい
る。このことは，モノクローナル系に比べて分析特異性
が低いことを示している。さらに，第63図のヒストグラ
ムから明らかなように，抗IgG モノクローナル複合体を
用いたELISA 法で任意抽出の供血者をスクリーニングし
た場合には，市販のポリクローナル標識を用いた分析に
比べて，陰性および陽性の結果の分布間が大きく分離す
る。
【０３９８】
【表１８】
【０３９９】IV.J. 様々な地域のNANBH患者におけるHCV
血清転換の検出 高いALT 値に基づくとNANBH 保持の疑いがあるが，HAV
およびHBV 試験においては陰性である患者から得られた
血清を，HCV c100-3抗原をマイクロタイタープレートの
スクリーニング抗原として用いたこと以外は実質的にI
V.D. 節で述べたように，RIA 法を用いてスクリーニン
グした。表19に示された結果から明らかなように，RIA
により，陽性試料が高い割合で検出された。
【０４００】
【表１９】
【０４０１】IV.K. 「集団獲得型」NANBHの患者におけ
るHCV血清転換の検出 明白でない（すなわち，輸血，静脈注射による薬剤使
用，乱婚などが危険因子として同定されない）100 人の
NANBH 患者から得た血清は，M. Alter博士（theCenter
for Disease Control）およびJ. Dieustag 博士（Harva
rd University）から提供された。これらの試料を，HCV
c100-3抗原をマイクロタイタープレートに付着させる
スクリーニング用抗原として用いたこと以外は実質的に
IV.D. 節で述べたように，RIA 法を用いてスクリーニン
グした。得られた結果は，100 個の血清試料のうち55個
の試料が，HCV c100-3抗原と免疫学的に反応する抗体を
有することを示した。
【０４０２】上述の結果は，「集団獲得型」NANBH もま
た，HCV により引き起こされることを示唆している。ま
た，HCV がフラビウィルス属（その大部分は節足動物に
より伝染する）と関係のあることがここで示されている
ので，「集団獲得型」の場合におけるHCV の伝染もま
た，節足動物による伝染に起因することが示唆される。 IV.L. NANBH の伝染に関係のある供血者のHCV 抗体およ
び代用マーカーの発生率の比較 NANBH 陽性の疑いのある供血者から輸血され，NANBH と
なった受血者が，抗HCV 抗体陽性に血清転換するかどう
かを決定し得る見込みがある研究を実施した。NANBH 感
染のマーカーとして現在使われている代用マーカー（す
なわち，高いALT 値および抗コア抗体の存在）の異常に
ついて供血者を試験した。さらに，抗HCV 抗体の存在に
ついても供血者を試験した。抗HCV 抗体の存在は，IV.
K. 節で述べた放射性免疫検定法を用いて決定した。こ
の研究の結果を表20に示す。この表には以下の項目が示
されている：患者の番号（第１列）；患者の血清中にお
ける抗HCV 抗体の存在（第２列）；患者の輸血回数, 各
輸血は異なる供血者によるものである（第３列）；供血
者の血清中における抗HCV 抗体の存在（第４列）；そし
て，供血者の代用マーカーの異常（第５列）（NT, すな
わち…試験していないことを意味する）（ALT は高いト
ランスアミナーゼであり，抗HBc は抗コア抗体であ
る）。
【０４０３】表20の結果は，HCV 抗体試験が，感染供血
者を検出するのに，代用マーカー試験より正確であるこ
とを示している。NANBH の症状を示す10人の患者のうち
９人を試験したところ，抗HCV 抗体血清転換に関して陽
性であった。陽性の疑いのある11人の供血者のうち（NA
NBH キャリアである疑いのある２人の別々の個体から輸
血されたのは患者６であるが），９人は抗HCV 抗体に関
して陽性であり，１人は陽性の境界線上であり，（患者
１に対する供血者は）不明確であった。これに対し，高
ALT 試験を用いると，10人の供血者のうち６人が陰性で
あり，抗コア抗体試験を用いると，10人の供血者のうち
５人が陰性であった。しかしながら，非常に重要なこと
は，３つの場合（患者８，患者９，および患者10に対す
る供血者の場合）において，ALT 試験および抗HBc 試験
の結果が一致しなかったことである。
【０４０４】
【表２０】
【０４０５】IV.M. フラビウイルスのゲノム配列の保存
領域から誘導されたPCR およびプライマーを利用したHC
V cDNA配列のクローニングの増幅 HCV がフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであるこ
とを示唆している上記の結果は，PCR 技術と，フラビウ
イルスの保存アミノ酸配列をコードする領域から誘導さ
れたプライマーとを利用して，特徴付けられていないHC
V cDNA配列をクローニングすることを可能にする。一般
に，プライマーの一方は定義されたHCVゲノム配列から
誘導され，配列決定されていないHCV ポリヌクレオチド
領域に隣接する他方のプライマーはフラビウイルスゲノ
ムの保存領域から誘導される。フラビウイルスゲノム
は，フラビウイルスゲノムの５' 側領域にコードされる
NS1ポリペプチドおよびＥポリペプチド内に保存配列を
有することが知られている。これらの領域をコードする
対応配列は，第29〜34図に示すHCV cDNA配列の上流にあ
る。従って，HCV ゲノムのこの領域から誘導されたcDNA
配列を単離するには，これらのフラビウイルスポリペプ
チド内の保存配列から誘導される上流プライマーが設計
される。下流プライマーはHCV cDNAの既知部分の上流側
端部から誘導される。
【０４０６】コードが縮重しているので，フラビウイル
スプローブと，対応するHCV ゲノム配列との間には不一
致が存在し得る。従って，Lee(1988) により述べられた
方法と同様の方法を用いる。Lee の方法は，アミノ酸配
列の逆転写産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドプラ
イマーを利用する；混合プライマーの配列は保存アミノ
酸配列に関するすべてのコドン縮重を考慮したものであ
る。
【０４０７】３組のプライマー混合物は，デング熱-2,4
（D-2,4), 日本脳炎（JEV), 黄熱病（YF）, および西ナ
イルウイルス（WN）を包含する数種のフラビウイルスに
見い出されるアミノ酸相同性に基づいて生じたものであ
る。最も上流の保存配列から誘導されたプライマー混合
物（５'-１）はアミノ酸配列gly-trp-gly に基づいてお
り，このアミノ酸配列は，D-2P JEV, YE, およびWNのＥ
タンパク中に見い出される保存配列asp-arg-gly-trp-gl
y-aspNの一部である。次のプライマー混合物（５’-
２）はＥタンパク中にある下流保存配列phe-asp-gly-as
p-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileuに基づいて
おり，phe-gly-aspから誘導される；保存配列は，D-2,
JEV, YE, およびWNに存在する。第３のプライマー混合
物（５'-３）はアミノ酸配列arg-ser-cys に基づいてお
り，このアミノ酸配列は，D-2, D-4,JEV, YF, およびW
NのNS1 タンパク中にある保存配列cys-cys-arg-ser-cys
の一部である。５'-３中で混合物を形成する各プライ
マーを第64図に示す。保存領域から誘導された様々な配
列に加えて，各混合物中の各プライマーもまた，制限酵
素HindIII, Mbo Ｉ，およびEcoRＩに対す部位をコード
する配列を含む５'末端の定常領域を有する。
【０４０８】下流プライマーssc5h20Aはクローン5hのヌ
クレオチド配列から誘導されており，この配列はクロー
ン14i および11b の配列と重複する配列を有するHCV cD
NAを含む。ssc5h20Aの配列は， 5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' である。他方のプライマーssc5h34Aもまた，使用し得
る。このプライマーはクローン5hの配列から誘導され，
さらに制限酵素部位を形成する5'末端のヌクレオチドを
有する。従って, クローニングが容易になる。ssc5h34A
の配列は， 5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A
3' である。
【０４０９】Saikiら（1986）により最初に述べられたP
CR反応は，cDNA の鋳型が，IV.C.2．節で述べたように
HCV 感染したチンパンジーの肝臓から単離されたRNA で
あるか，あるいはIV.A節で述べたようにHCV 感染したチ
ンパンジー血清から単離されたウイルス粒子から単離さ
れたRNA であること以外は，実質的にLee ら（1988）が
述べたようにして行われる。さらに, アニール条件は第
１回目の増幅ではあまり厳密でなくてもよい（0.6M NaC
l, および25℃）。なぜなら，HCV 配列とアニールする
プライマー部分は，わずか９個のヌクレオチドであり，
不一致が存在し得るからである。また，ssc5h34Aを用い
た場合には，HCV ゲノムから誘導されなかった付加配列
はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化する傾向が
ある。第１回目の増幅後は，アニール条件は非常に厳密
である（0.066MNaCl, および32℃〜37℃）。なぜなら，
増幅される配列は，この段階では，プライマーに相補的
な領域またはプライマーの重複部分である領域を有する
からである。さらに，最初の10サイクルの増幅は，クレ
ノー酵素Ｉを用い，この酵素に適したPCR 条件下で実施
される。これらのサイクルが完了した後, 試料を抽出
し， Cetus／Perkin-Elmerにより供給されているキット
指示書に従って，Tag ポリメラーゼで処理する。
【０４１０】増幅後，増幅されたHCV cDNA配列は，クロ
ーン5hから誘導されたプローブを用いたハイブリダイゼ
ーションにより検出される。このプローブは，プライマ
ーを誘導するのに用いた配列の上流にある配列から誘導
されるが，プライマーを誘導したクローン5hの配列とは
重複しない。このプローブの配列は， 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3' である。
【０４１１】産業上の応用性 本発明は，ここに開示された様々な表現で，多くの産業
上の用途を有する。これらの用途のいくつかは次のとお
りである。HCV cDNAは，試料中のHCV 核酸を検出するた
めのプローブの設計に用いられる。cDNAから誘導された
プローブは，例えば化学的な合成反応においてHCV 核酸
を検出するのに用いられる。これらのプローブはまた，
培養細胞系または動物モデル系においてウイルスの複製
を阻害する際に抗ウイルス剤の効果を決定するためのス
クリーニングプログラムに用いられる。HCV ポリヌクレ
オチドプローブは，ヒトにおいてウイルス核酸を検出す
るのにも有用であり，従ってヒトにおけるHCV 感染の診
断薬の主成分として役立ち得る。
【０４１２】上記のことに加えて，ここで与えられるcD
NAは，HCV のエピトープを有するポリペプチドを合成す
るための情報および手段を提供する。これらのポリペプ
チドはHCV 抗原に対する抗体を検出するのに有用であ
る。HCV 感染に対する一連の免疫検定法は，HCV エピト
ープを有する組換え体ポリペプチドに基づくものであ
る。これらの免疫検定法は，ここで説明されており，NA
NBH を誘発するHCV を診断したり，HCV により引き起こ
される伝染性肝炎について血液銀行における供血者をス
クリーニングしたり，また伝染性の供血者に由来する汚
染された血液を検出したりする産業上の用途が見い出さ
れる。ウイルス抗原はまた，動物モデル系における抗ウ
イルス剤の効力をモニターするのにも有用である。さら
に，ここに開示されたHCV cDNAから誘導されたポリペプ
チドは，HCV 感染を処置するためのワクチンとして有用
である。
【０４１３】HCV cDNAから誘導されたポリペプチドは，
上述の用途の他にも，抗HCV 抗体を生じさせるのにも有
用である。従って，これらのペプチドは抗HCV ワクチン
に使用され得る。しかしながら，HCV ポリペプチドで免
疫した結果，生産される抗体もまた，試料中のウイルス
抗原の存在を検出するのに有用である。従って，これら
のペプチドは，化学系におけるHCV ポリペプチドの生産
を分析するために用いられ得る。抗HCV 抗体はまた，抗
ウイルス剤が組織培養系で試験されるスクリーニングプ
ログラムにおいて，これらの抗ウイルス剤の効力をモニ
ターするのに用いられる。これらの抗HCV 抗体はまた，
受動免疫療法や，供血者および受血者の両方においてウ
イルス抗原を検出することにより，NANBH を引き起こす
HCV を診断するのにも用いられる。抗HCV 抗体の他の重
要な用途には, ウイルスおよびウイルスポリペプチドを
精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにお
ける使用がある。精製されたウイルスおよびウイルスポ
リペプチドの調製物はワクチンに用いられ得る。しかし
ながら，精製されたウイルスはまた，HCV を複製する細
胞培養系の開発に有用である。
【０４１４】HCV に感染した細胞を有する細胞培養系は
多くの用途を有する。これらの細胞培養系は, 通常は力
価の低いウイルスであるHCV の比較的大規模な生産に用
いられ得る。これらの培養系はまた，このウイルスの分
子生物学的な解明にも有用であり，抗ウイルス剤の開発
をもたらす。これらの細胞培養系はまた，抗ウイルス剤
の効力をスクリーニングする際にも有用である。さら
に，HCV 許容性の細胞培養系は，弱毒化したHCV 株の生
産に有用である。
【０４１５】便宜的には，抗HCV 抗体およびHCV ポリペ
プチドは，天然物であっても組換え体であっても，キッ
トに組み込まれ得る。
【０４１６】HCV cDNAを単離するのに用いられる方法
は，個体の感染組織から誘導されたcDNAライブラリーを
発現ベクター中に調製すること，および非感染個体では
なく他の感染個体に由来する抗体含有身体構成成分中の
抗体と免疫学的に反応する発現産物を生産するクローン
を選択することを包含する。この方法は，ゲノム成分か
らなる，これまで特徴付けられていない他の疾患関連因
子から誘導されたcDNAの単離にも適用できる。この方法
により，次には，これらの因子が単離され，かつ特徴付
けられ，またこれらの他の疾患関連因子に対する診断用
の薬剤およびワクチンがもたらされ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン５−１−１におけるHCV cDNA挿入物の
二本鎖ヌクレオチド配列，およびこの配列内にコードさ
れたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図２】クローン５−１−１，81，１−２，および91の
重複HCV cDNA配列の相同性を示す。
【図３】重複するクローン81，１−２，および91に由来
するHCV cDNAの複合配列，およびこの配列内にコードさ
れたアミノ酸配列を示す。
【図４】クローン81におけるHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌ
クレオチド配列，およびこの配列内にコードされたポリ
ペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図５】その一部がクローン81のNANBV cDNAと重複する
クローン36のHCV cDNA配列，およびこの配列内にコード
されたポリペプチド配列を示す。
【図６】クローン36および81のHCV cDNAの結合ORF ，お
よびこのORF 内にコードされたポリペプチドを示す。
【図７】その一部がクローン81と重複するクローン32の
HCV cDNA配列，およびこの配列にコードされたポリペプ
チドを示す。
【図８】その一部がクローン36と重複するクローン35の
HCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされたポリペ
プチドを示す。
【図９】クローン35，36，81，および32のHCV cDNAの結
合ORF ，およびこのORF 内にコードされたポリペプチド
を示す。
【図１０】図９のつづき
【図１１】その一部がクローン35と重複するクローン37
ｂのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされたポ
リペプチドを示す。
【図１２】その一部がクローン32と重複するクローン33
ｂのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされたポ
リペプチドを示す。
【図１３】その一部がクローン37ｂと重複するクローン
40ｂのHCV 配列，およびこの配列内にコードされたポリ
ペプチドを示す。
【図１４】その一部がクローン33ｂと重複するクローン
25ｃのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
ポリペプチドを示す。
【図１５】クローン40ｂ，37ｂ，35，36，81，32，33
ｂ，および25ｃの広がるORF のヌクレオチド配列，およ
びこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１６】図１５のつづき
【図１７】図１６のつづき
【図１８】その一部がクローン40ｂおよび33ｃと重複す
るクローン33ｃのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。
【図１９】その一部がクローン33ｃと重複するクローン
８ｈのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２０】その一部がクローン８ｈと重複するクローン
７ｅのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２１】その一部がクローン25ｃと重複するクローン
14ｃのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２２】その一部がクローン14ｃと重複するクローン
８ｆのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２３】その一部がクローン８ｆと重複するクローン
33ｆのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２４】その一部がクローン33ｆと重複するクローン
33ｇのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２５】その一部がクローン７ｅと重複するクローン
７ｆのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２６】その一部がクローン７ｆと重複するクローン
11ｂのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２７】その一部がクローン11ｂと重複するクローン
14ｉのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２８】その一部がクローン33ｇと重複するクローン
39ｃのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図２９】クローン14ｉ，11ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，33
ｃ，40ｂ，37ｂ，35，36，81，32，33ｂ，25ｃ，14ｃ，
８ｆ，33ｆ，および33ｇの整列したcDNAに由来する複合
HCV cDNA配列を示す。さらに，この誘導された配列の拡
張ORF 内にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が
示されている。
【図３０】図２９のつづき
【図３１】図３０のつづき
【図３２】図３１のつづき
【図３３】図３２のつづき
【図３４】図３３のつづき
【図３５】その一部がクローン14ｉと重複するクローン
12ｆのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図３６】その一部がクローン39ｃと重複するクローン
35ｆのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図３７】その一部がクローン35ｆと重複するクローン
19ｇのHCV cDNA配列，およびこの配列内にコードされた
アミノ酸を示す。
【図３８】その一部がクローン19ｇと重複するクローン
26ｇの配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸
を示す。
【図３９】その一部がクローン26ｇと重複するクローン
15ｅの配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸
を示す。
【図４０】クローン12ｆから15ｅを5'から3'の方向に整
列させることにより誘導された複合cDNAの配列を示す；
さらに，この連続ORF 内にコードされたアミノ酸を示
す。
【図４１】図４０のつづき
【図４２】図４１のつづき
【図４３】図４２のつづき
【図４４】図４３のつづき
【図４５】図４４のつづき
【図４６】図４５のつづき
【図４７】BB-NANB ，HAV ，およびHBV に感染したチン
パンジー由来のチンパンジー血清を用いた融合タンパク
SOD-NANB5-1-1 のウェスタンブロットの写真である。
【図４８】図４７のつづき
【図４９】NANBV ，HAV ，HBV に感染したヒト由来の血
清，および対照のヒト由来の血清を用いた融合タンパク
SOD-NANB5-1-1 のウェスタンブロットの写真である。
【図５０】図４９のつづき
【図５１】ベクターpAB24 の有意な特徴を示す地図であ
る。
【図５２】融合ポリペプチドC100-3のカルボキシル末端
の推定アミノ酸配列，およびこの配列をコードするヌク
レオチドを示す。
【図５３】図５２のつづき
【図５４】Ａは，酵母内で発現されたC100-3を同定す
る，クーマシーブルーで染色されたポリアクリルアミド
ゲルの写真である。Ｂは，NANBV に感染したヒトに由来
する血清を用いたC100-3のウェスタンブロットを示す。
【図５５】BB-NANBVに感染したチンパンジーの肝臓から
単離され，クローン81のBB-NANBVcDNA でプローブされ
たRNA のノーザンブロットのオートラジオグラフを示
す。
【図５６】RNase A またはDNase I で処理され，クロー
ン81のBB-NANBV cDNA でプローブされたNANBV 核酸のオ
ートラジオグラフを示す。
【図５７】抗NANB5-1-1 を有する感染血漿から得たNANB
V 粒子から抽出され，クローン81由来の32P 標識化NANB
V cDNAでプローブされた核酸のオートラジオグラフを示
す。
【図５８】クローン81のNANBV cDNAから誘導された32P
標識化(+) 鎖および(-) 鎖DNA プローブでプローブされ
た，単離NANBV 核酸を有するフィルターのオートラジオ
グラフを示す。
【図５９】HCV cDNAにコードされたポリペプチドと，デ
ング熱フラビウイルス由来のNSタンパクとの相同性を示
す。
【図６０】図５９のつづき
【図６１】HCV cDNAにコードされたポリペプチドと，デ
ング熱フラビウイルス由来のNSタンパクとの相同性を示
す。
【図６２】ELISA スクリーニング法で決定される，任意
抽出試料におけるHCV 感染の分布ヒストグラムを示す。
【図６３】ELISA 検定法において免疫グロブリン−酵素
結合体の２つの形態を用いた，任意抽出試料におけるHC
V 感染の分布ヒストグラムを示す。
【図６４】フラビウイルスのNS1 における保存配列から
誘導されたプライマー混合物の配列を示す。
【図６５】図２９のcDNAと重複するセグメントである，
クローンk9-1中のHCVcDNA配列およびそれにコードされ
るアミノ酸を示す。
【図６６】図６５のつづき
【図６７】５’から３’の方向に，k9-1から15eにわた
る並列したクローンに由来する複合cDNAの配列，および
連続するORF中にコードされるアミノ配列を示す。
【図６８】図６７のつづき
【図６９】図６８のつづき
【図７０】図６９のつづき
【図７１】図７０のつづき
【図７２】図７１のつづき
【図７３】図７２のつづき
【図７４】図７３のつづき
フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９１２６３ (32)優先日 1988年５月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ２６３，５８４ (32)優先日 1988年10月26日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ２７１，４５０ (32)優先日 1988年11月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122 サンフランシスコ，シックスス アベニュー 1370 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも８個のアミノ酸の連続する配
    列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列：ここ
    で、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は少な
    くとも一つの部位を有し、該部位は、該少なくとも８個
    のアミノ酸の連続する配列からなる配列中においても該
    ポリペプチド中においてもＣ型肝炎ウイルスに対する抗
    体によって結合され得、そして、該少なくとも８個のア
    ミノ酸の連続する配列は以下のアミノ酸配列から得られ
    る： 【化１】 【化２】 【化３】
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