FI107620B - Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö - Google Patents

Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI107620B
FI107620B FI20001390A FI20001390A FI107620B FI 107620 B FI107620 B FI 107620B FI 20001390 A FI20001390 A FI 20001390A FI 20001390 A FI20001390 A FI 20001390A FI 107620 B FI107620 B FI 107620B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
hcv
cdna
clone
polynucleotide
sequence
Prior art date
Application number
FI20001390A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20001390A (fi
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27557988&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI107620(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of FI20001390A publication Critical patent/FI20001390A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107620B publication Critical patent/FI107620B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Description

107620
Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö (Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 893447) 5 Keksintö koskee materiaaleja ja metodologiaa hepatitisvirus-tartunnan, joka ei ole tyyppiä A tai B (NANBV), levinneisyyden ^ selvittämiseksi. Tarkemmin se koskee diagnostisia DNA- ja RNA- fragmentteja NANB-hepatitiksen, s.o. hepatitis C-viruksen etiologista ainetta varten, niitä sisältäviä välinepakkauksia 10 ja niiden käyttöä.
Selityksessä viitataan seuraaviin julkaisuihin Barr et ai. (1986), Biotechniques 4:428.
Botstein (1979), Gene JB:17.
15 Brinton, M.A. (1986), julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 327-374.
Broach (1981) julkaisussa Molecular Biology of the Yeast 20 Saccharomyces, Vol.l, s.445, Cold Spring Harbor Press.
Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.
···. Chang et al. (1977), Nature 198:1056.
• · //•m Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18 :5294 .
♦ · ♦ /.. Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162 :156.
♦ · · : \ 25 Clewe11 et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.
* *’ Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.
«·· ...........
Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110.
• · · ·...· Cousens et al. (1987), Gene 61:265.
De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.
~30 Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.
♦’**: Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med.
• · · . *. 311:185.
··· ·;;; Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.) *·;·* Fiers et al. (1978), Nature 273 :113 .
35 Gerety, R.J. et al. julkaisussa VIRAL HEPATITIS AND LIVER
··· DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., • » toim., Grune and Stratton, Inc., 1984) ss. 23-47.
Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. {3:4057.
2 107620
Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.
Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.
Grych et al. (1985), Nature 316:74.
5 Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263. ',
Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL
HYBRIDOMAS.
Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 7:149.
Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929.
10 Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.
Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.
Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.
Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:247.
Hunyh, T.V. et al. (1985), julkaisussa DNA CLONING TECHNIQUES; 15 A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, toim., IRL Press, Oxford, U.K.), ss. 49-78.
Immun. Rev. (1982) 62:185.
Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.
Kenneth et al. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.
20 Laemmli (1970), Nature 227, 680.
Lee et al. (1988), Science 239:1288.
...# Maniatis, T. et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY
• · MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
• · *
Mayer and Walker, toim. (1987) , IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL
• · · • ·* 25 AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).
• * Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.
• · · *...· MacNamara et al. (1984), Science 226 :1325 .
• · ·
Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.
Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.
3 0 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press) . - -
Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis.
Monath (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND
• · · FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, • · *·..* painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum :***· 35 Press), ss. 375-440.
···
Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.
Neurath et al. (1984), Science 224:392.
Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397- 406.
3 107620
Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.
Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.
Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.
5 Peleg (1969), Nature 221:193.
Pferrerkorn and Shapiro (1974), julkaisussa COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol.2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, toim., Plenum, N.Y.) v ss. 171-230.
Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.
10 Rice et al. (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND
FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), ss. 279-328.
Roehrig (1986) julkaisussa THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND 15 FLAVIRIDAE (Sarjan toimittaja Fraenkel-Conrat and Wagner, painosten toimittaja Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press).
Sadler et al. (1980), Gene _8, 279.
Saiki et al. (1986), Nature 324:163.
20 Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463. Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 60:1153.
...# Schreier, M., et al. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.
Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, • · 1 ';1/ SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).
♦ ·’ 25 Shimatake et al. (1981), Nature 292:128.
• — · Steimer et al. (1986), J.Virol. 58:9.
4 107620 RECOMBINANT DNA, Part E.
Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol. 155, RECOMBINANT DNA, osa F.
Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.
5
Viitataan myös seuraaviin US-patentteihin: 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890.
10 Hepatitis, joka ei ole tyyppiä A eikä B (NANBH) on tarttuva tauti tai tautiperhe, jonka uskotaan olevan viruksen aiheuttama ja joka on erotettavissa muista viruksen aiheuttamista maksasairauksien muodoista, mukaanlukien sen, jonka aiheuttavat tunnetut hepatitisvirukset, s.o. hepatitis-A-virus (HAV), 15 hepatitis-B-virus (HBV) ja deltahepatitisvirus (HDV), samoin kuin cytomegaloviruksen (CMV) ja Epstein-Barr-viruksen (EBV) aiheuttamat hepatitikset. NANBH tunnistettiin ensin verensiirtopotilaissa. Tarttuminen ihmisestä simpanssiin ja massatartunta simpanssien joukossa antoivat todisteita, että 20 NANBH:n syy on siirtyvä infektioaiheuttaja tai -aiheuttajat. Kuitenkin NANBH:n aiheuttavaa siirtyvää aiheuttajaa ei ole ... vieläkään määritetty ja taudin aiheuttavien aineiden lukumäärä on tuntematon.
• · · • · · « • · · • · · • ·* 25 Epidemiologisista todisteista voidaan tehdä ehdotelmia, että ' * voi olla kolmentyyppistä NANBH:a: vedessä syntynyt epideeminen • · · tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja satunnaisesti • · · esiintyvä (yhteisön hankkima = community acquired) tyyppi.
Kuitenkin niiden aineiden lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa •j··» 3 0 NANBH:n on tuntematon. — - • · · • · • · ·
Kliininen NANBH:n diagnoosi ja tunnistus on tehty etupäässä •••ί sulkemalla pois muut virusmerkkiaineet. Niiden menetelmien *...· joukossa, joita käytetään havaitsemaan oletettuja NANBV- ;***. 35 antigeenejä ja vasta-aineita ovat agargeelidiffuusio, vas- • · · : taimmunoelektroforeesi, immunof luoresenssimikroskopia, im- munoelektronimikroskopia, radioimmunologinen analyysi ja entsyymiin kytketty immunosorbenttianalyysi. Kuitenkaan mikään 5 107620 näistä analyyseistä ei ole osoittautunut olevan riittävän herkkä, spesifinen ja toistettava käytettäväksi NANBH:n diagnostisena kokeena.
5 Tähän mennessä ei ole ollut selvyyttä eikä sopimusta NANBH:n aiheuttajiin liittyvien antigeeni-vasta-ainejärjestelmien identtisyyden tai spesifisyyden suhteen. Tämä johtuu ainakin osittain siitä, että henkilöillä on ennalta tai samanaikaisesti NANBV:n kanssa saatu HBV-tartunta ja liukoisten ja 10 partikkelimuotoisten HBV:een liittyvien antigeenien tunnetusta monimutkaisuudesta ja myös HBV:n DNA:n integraatiosta maksasolujen genomiin. Lisäksi on mahdollisuus, että NANBH:n aiheuttaa useampi kuin yksi infektoiva aine, minkä lisäksi on mahdollista, että NANBH on diagnosoitu väärin. Edelleen on 15 epäselvää, mitä serologiset analyysit havaitsevat NANBH- potilaiden seerumista. On väitetty, että agargeelidiffuusio-ja vastaimmunoelektroforeesianalyysit havaitsevat autoimmuuni vasteita tai epäspesifisiä proteiinien keskinäisiä reaktioita, joita esiintyy seeruminäytteiden välillä ja että ne 20 eivät edusta spesifisiä NANBV-antigeeni-vasta-ainereaktioita. Immunofluoresenssi ja entsyymin kytketty immunosorbentti ja ... radioimmunologiset analyysit näyttävät havaitsevan alhaisia • · Γ** reumatekijän kaltaisen materiaalin tasoja, jota on tavantakaa • · · läsnä sellaisten potilaiden seerumissa, joilla on NANBH, samoin • ♦ · ; ·* 25 kuin myös potilaissa, joilla on muita maksasairauksia tai • * maksaan liittymättömiä sairauksia. Jonkin verran havaittua • · · ·...·* reaktiivisuutta voi edustaa vasta-ainetta isännän määrittämille ϊ#β : sytoplasmisille antigeeneille.
30 .···. On olemassa lukumäärä NANBV-ehdokkaita. Katso esimerkiksi m ** selontekoja Prince (1983), Feinstone ja Hoofnagle (1984) ja ♦·.: Overby (1985, 1986, 1987) ja Iwarsonin (1987) artikkelia.
• ··
Kuitenkaan ei ole mitään todistetta, että mikään näistä .**·. 35 ehdokkaista edustaisi NANBV:n etiologista aiheuttajaa.
♦ ·· • ♦ • · · • ♦ ·
Vaatimus herkistä, spesifisistä menetelmistä NANBV:n kantajien ja NANBV:n saastuttaman veren tai verituotteiden seulomiseksi 6 107620 tai tunnistamiseksi on huomattava. Verensiirron jälkeinen hepatitis (Post Transfusion Hepatitits PTH) esiintyy noin 10 %:Ha verensiirron saaneista potilaista ja NANBH:n aiheuttamia näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääongelma tässä taudissa on 5 sen tavanomainen eteneminen kroonisiksi maksavaurioiksi (25-55 %) .
Potilashuolto sekä NANBH:n tarttumisen estäminen veren tai verituotteiden tai läheisen henkilökohtaisen kontaktin väli-10 tyksellä vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä NANBV:hen liittyvien nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden havaitsemiseksi.
Keksintö liittyy vastikään keksityn NANBH:n etiologisen ai-15 heuttajan, hepatitis C-viruksen (HCV), eristämiseen ja kuvaamiseen. Tarkemmin keksintö antaa HCV-genomin osien cDNA-kopi-oiden perheen. Nämä cDNA-kopiot eristettiin tekniikalla, joka sisälsi uuden vaiheen, jossa seulottiin ekspressiotuotteita cDNA-kirjastoista, jotka oli luotu hiukkasmaisesta aiheut-20 tajasta kudoksesta, joka oli tartutettu NANBV-potilaiden seerumilla sellaisten vastasyntetisoitujen antigeenien ···. havaitsemiseksi, jotka ovat peräisin tähän asti eristämättömän * m 'IV. tai kuvaamattoman virusaiheuttajan genomista ja sellaisten • · · .* . kloonien valitsemiseksi, jotka tuottavat tuotteita, jotka • · · * ·* 25 reagoivat immunologisesta vain tartutettujen yksilöiden seeru mien kanssa, verrattuna tartuttamattomiin yksilöihin.
··· • · « i • · ♦ • *·
Tutkimukset HCV.-n genomin luonteesta käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin HCV:n cDNA:sta, ehdottavat, että HCV on ·;··; 3 0 Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. - -* ·***. HCV: stä peräisin olevien cDNA-sekvenssien osat ovat hyödyllisiä • · ♦ \ koettimia viruksen näytteissäolon diagnosoimiseksi ja luon- ·>· •ly nollisesti esiintyvien viruksen muunnoksien eristämiseksi. Nämä • · *···* cDNA:t tuovat myös saataville HCV-genomiin koodattujen HCV- 35 antigeenien polypeptidisekvenssit ja sallivat sellaisten : polypeptidien tuottamisen, jotka ovat hyödyllisiä standardeina • · tai reagensseina diagnostisissa testeissä. Vasta-aineet, sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset, jotka on kohdistettu HCV- 7 107620 epitooppeja vastaan, jotka sisältyvät näihin polypepti-disekvensseihin, ovat myös hyödyllisiä diagnostisia testejä varten, virustenvastaisien aineitten seulomiseen ja sellaisen NANBV-aiheuttajan eristämiseksi, josta nämä cDNA:t ovat 5 peräisin. Lisäksi käyttämällä näistä cDNA:oista johdettuja koettimia, on mahdollista eristää ja sekventoida muita HCV-genomin osia, edistäen näin lisäkoettimien ja polypeptidien saamista, jotka ovat hyödyllisiä NANBH:n diagnoosissa.
10 Niinpä polynukleotidien suhteen joitakin keksinnön näkökohtia ovat: puhdistettu HCV-polynukleotidi; yhdistelmä-HCV-polynuk-leotidi; yhdistelmäpolynukleotidi, joka käsittää sekvenssin joka on peräisin HCV-genomista tai HCV-cDNA:sta; yhdistelmäpolynukleotidi, joka koodaa HCV:n epitooppia; yhdistelmävek-15 tori, joka sisältää minkä tahansa edellisistä yhdistelmäpo-lynukleotideistä ja isäntäsolun, joka on transformoitu millä tahansa näistä vektoreista.
Vielä eräs keksinnön seikka on HCV:tä varten oleva polynuk-20 leotidikoetin.
...# Ne keksinnön seikat, jotka koskevat välinesarjoja, ovat • · seuraavia: näytteiden analysointi sellaisten polynukleotidien • » t läsnäolon osoittamiseksi, jotka ovat peräisin HCV:stä, joka • · · • ·* 25 käsittää polynukleotidikoettimen, joka sisältää noin 8:n tai • lukuisampien nukleotidien HCV:n nukleotidisekvenssin sopivassa ··· astiassa; näytteiden analysointi sellaisen HCV-antigeenin • ·· osoittamiseksi, joka on suunnattu havaittavaa HCV-antigeeniä vastaan, sopivassa astiassa; näytteiden analysointi sellaisten 3 0 vasta-aineiden osoittamiseksi, jotka on suunnattu HCV- .*·*. antigeeniä vastaan, joka käsittää polypeptidin, joka sisältää ··» HCV-antigeenissä läsnäolevan HCV-epitoopin, sopivassa M· ···! säiliössä.
·*** *...· Muita keksintöön liittyviä seikkoja ovat: polypeptidi, joka .***. 35 muodostuu HCV-epitoopista kiinnittyneenä kiinteään kantajaan; • · · ja HCV-epitoopin vasta-aine kiinnittyneenä kiinteään kantajaan.
• ·
Keksintö sisältää myös menetelmän HCV-nukleiinihappojen 8 107620 havaitsemiseksi näytteessä, käsittäen sen, että annetaan näytteen nukleiinihappojen reagoida HCV-polynukleotidia varten olevan koettimen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat polynukleotididupleksin muodostumisen koettimen ja näytteestä 5 tulevan HCV-nukleiinihapon välille; ja osoitetaan koettimen sisältävä polynukleotidi.
Keksintöön sisältyy myös immunologisia analyysejä. Nämä sisältävät immunologisen analyysin HCV-antigeenin osoittami-10 seksi, käsittäen sen, että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän HCV-antigeeniä, koettimen kanssa, joka on suunnattu osoitettavaa HCV-antigeenia vastaan olosuhteissa, jotka sallivat antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen; ja sen että osoitetaan koettimen vasta-aineen sisältävä antigeeni-15 vasta-ainekompleksi. Immunologinen analyysi HCV-antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden osoittamiseksi käsittää sen että inkuboidaan näytettä, jonka epäillään sisältävän anti-HCV-vasta-aineita yhdessä koetinpolypeptidin kanssa, joka sisältää HCV:n epitoopin, olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aine-anti-20 geenikompleksin muodostumisen; ja sen että osoitetaan koetinantigeenin sisältävä vasta-aine-antigeenikompleksi.
• · · • · ··’· Vielä eräs keksinnön seikka on menetelmä cDNA:n eristämiseksi, • · ♦ ' • · · . joka cDNA on peräisin tunnistamattoman tartunnan aiheuttajan • · * *, 25 genomista, joka menetelmä käsittää sen, että: (a) varustetaan *# ‘ isäntäsoluja, jotka on transformoitu ekspressiovektoreilla, • · *···* jotka sisältävät cDNA-kirjaston, joka on valmistettu • · · *...· nukleiinihapoista, jotka on eristetty kudoksesta, joka on infektoitu aineella ja viljellään sanottuja isäntäsoluja ·;·*: 3 0 olosuhteissa, jotka sallivat cDNA:han koodattujen polypeptidien ·"*: ekspression; (b) saatetaan reagoimaan cDNAm ekspressiotuotteet • · · *. mainitulla infektoivalla aineella infektoidun yksilön ruumiin ··· *^· komponentin sisältävän vasta-aineen kanssa olosuhteissa, jotka • · *···* sallivat immunoreaktion ja osoitetaan reaktion tuloksena :***: 35 muodostuneet vasta-aine-antigeenikompleksit; (c) viljellään :*·.· isäntäsoluja, jotka ekspressoivat polypeptidejä, jotka • · muodostavat vasta-aine-antigeenikomplekseja vaiheessa (b), olosuhteissa, jotka sallivat niiden kasvamisen yksittäisinä 9 107620 klooneina ja eristetään kloonit; (d) viljellään kohdan (c) klooneista soluja olosuhteissa, jotka sallivat cDNAihan koodattujen polypeptidien ekspression ja saatetaan reagoimaan toistensa kanssa ekspressiotuotteet ja vasta-aineen sisältävät 5 ruumiin komponentit yksilöistä, jotka ovat muita kuin vaiheen (a) yksilö, joka oli infektoitu infektoivalla aineella ja aineella infektoimattomien vertailuyksilöiden kanssa; (e) viljellään isäntäsoluja, jotka ekspressoivat polypeptidejä, jotka muodostavat vasta-aine-antigeenikomplekseja vasta-aineen 10 kanssa, joka sisältää ruumiin komponentteja infektoiduista yksilöistä ja yksilöistä, joiden epäillään saaneen tartunnan, muttei vertailuyksilöiden komponenttien kanssa, olosuhteissa, jotka sallivat niiden kasvun yksittäisinä klooneina ja eristetään kloonit; ja (f) eristetään cDNA kohdan (e) 15 isäntäsoluklooneista.
Kuvio 1 esittää kloonissa 5-1-1 olevan HCV:n cDNA-insertin kaksoiskierteisen nukleotidisekvenssin ja siihen koodatun polypeptidin oletetun aminohapposekvenssin.
20
Kuvio 2 esittää HCV:n cDNA-sekvenssien homologien päällek- ···, käisyyttä klooneissa 5-1-1, 81, 1-2 ja 91.
• « • · · ··· • · · • · · .* . Kuvio 3 esittää päällekkäisistä klooneista 81, 1-2 ja 91 • · · * ·[ 25 peäisin olevaa HCV:n cDNA:n yhdistelmäsekvenssiä ja siihen koodattua aminohapposekvenssiä.
• · · • · • « ··· • · ·
Kuvio 4 esittää HCV:n kloonissa 81 olevan cDNA-insertin kaksoiskierteellistä nukleotidisekvenssiä ja sinne koodatun 3 0 polypeptidin oletettua aminohapposekvenssiä.
• · « • · ·«· ·, Kuvio 5 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 36, segmenttiä, i<» •;*j joka menee päällekkäin NANBV:n cDNA:n kanssa kloonissa 81 ja • · *···' klooniin 3 6 koodattua polypeptidisekvenssiä.
35 ··· :\i Kuvio 6 esittää yhdistettyä avointa lukurakennetta HCV:n • ♦ cDNA:öistä klooneissa 36 ja 81 ja siihen koodattua polypep-tidiä.
5 10 107620
Kuvio 7 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 32, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 81 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.
Kuvio 8 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 35, segmenttiä, joka menee päällekäin kloonin 36 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.
10 Kuvio 9 esittää HCV:n cDNA:oiden yhdistettyä avointa lukura-kennetta klooneissa 35, 36, 81 ja 32 ja siihen koodattua polypeptidiä.
Kuvio 10 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 37b, seg-15 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 35 kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.
Kuvio 11 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 33b, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 32 kanssa ja siihen 20 koodattua polypeptidiä.
·**. Kuvio 12 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 40b, seg- • · ··· ,*·*β menttia, joka menee päällekkäin kloonin 37b kanssa ja siihen * « · M » koodattua polypeptidiä.
♦ * · * *. 25
Kuvio 13 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 25c, seg- * · *···* menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33b kanssa ja siihen koodattua polypeptidiä.
*:**: 30 Kuvio 14 esittää avoimen lukurakenteen, joka ulottuu HCV:n ·**’: cDNA:oiden kautta klooneissa 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b ja ·♦· *. 25c, nukleotidisekvenssiä ja siihen koodattua polypeptidiä.
» «·· • « *·;** Kuvio 15 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissä 33c, seg- : : 35 menttiä, joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 33c kanssa ja ·’·.· siihen koodattuja aminohappoja.
• *
Kuvio 16 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 8h, seg- 11 107620 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
Kuvio 17 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 7e, seg-, 5 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8h kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
Kuvio 18 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 14c, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 25c kanssa ja siihen 10 koodattuja aminohappoja.
Kuvio 19 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 8f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
15
Kuvio 20 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 33f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 8f kanssa ja siihen kooda t tuj a aminohappo j a.
20 Kuvio 21 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 33g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33f kanssa ja siihen ... koodattuja aminohappoja.
• · • · · ··· *.* * Kuvio 22 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 7f, seg- ·· · : *.· 25 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 7e kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
• · · • » • · • · ·
Kuvio 23 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 11b, seg- • · · menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 7f kanssa ja siihen 3 0 koodattuja aminohappoja.
• · ··· • « T* Kuvio 24 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 14i, seg- menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 11b kanssa ja siihen • · · Σ...Σ koodattuja aminohappoja.
35 • · I’’. Kuvio 25 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 3 9c, seg- * · # ’ *, menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 33g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
12 107620
Kuvio 26 esittää HCV:n yhdistelmä-cDNA-sekvenssiä, joka on peräisin kohdakkain olevista cDNA:öistä klooneissa 14i, llb, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 5 33f ja 33g; esitettynä on myös sieltä peräisin olevassa sekvenssissä olevaan laajennettuun avoimeen lukurakenteeseen koodatun polypeptidin aminohapposekvenssi.
Kuvio 27 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 12f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 14i kanssa ja siihen 10 koodattuja aminohappoja.
Kuvio 28 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 35f, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 39c kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
15
Kuvio 29 esittää HCV-.n cDNA-sekvenssiä kloonissa 19g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 35f kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
20 Kuvio 30 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 26g, segmenttiä, joka menee päällekkäin kloonin 19g kanssa ja siihen ... koodattuja aminohappoja.
• · • · 0 ♦ *· ♦ · · *.* ' Kuvio 31 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa 15e, seg- ♦ · · • 25 menttiä, joka menee päällekkäin kloonin 26g kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
• · · • · ♦ · • · · :***; Kuvio 32 esittää yhdistelmä-cDNA:n sekvenssiä, joka on peräisin ··· kohdakkain olevista klooneista 12f - 15e suunnassa 5' -3'; se ....: 3 0 esittää myös ORF:ään koodattuja aminohappoja.
• · * « *Γ* Kuvio 33 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5-1-1 ..*·' Western-blotteja BB-NANB:llä, HAV.-llä ja HBV:llä infektoitujen • · * simpanssien seerumin kanssa.
.···. 35 • ·
Kuvio 34 esittää valokuvaa fuusioproteiinin SOD-NANB5-1-1 * * Western-bloteista NANBV:llä, HAV:llä ja HBV:llä infektoitujen ihmisten ja kontrolli-ihmisten seerumin kanssa.
13 107620
Kuvio 35 on kartta, joka esittää vektorin pAB24 merkittävät piirteet.
5 Kuvio 36 esittää fuusiopolypeptidin C100-3 karboksipään oletetusta aminohapposekvenssistä ja sitä koodaavaa nukleo-tidisekvenssiä.
Kuvio 37A on valokuva coomassiesinisellä värjätystä polyak-ryyliamidigeelistä, joka identifioi hiivassa ekspressoitua 10 C100-3:a.
Kuvio 37B esittää C100-3:n Western-blottia NANBV:llä tartutetun ihmisen seerumin kanssa.
15 Kuvio 38 esittää autoradiografin Northern-blotista RNAille, joka on eristetty BB-NANBV-tartutetun simpanssin maksasta ja jossa koettimena on kloonin 81 BB-NANBV:n cDNA.
Kuvio 39 esittää autoradiografin NANBV-nukleiinihaposta, jota 20 on käsitelty ribonukleaasi A:11a tai deoksinukleaasi I:llä ja jossa koettimena on klooni 81:n NANBV:n cDNA.
• · · ’···1 Kuvio 40 esittää autoradiograf in nukleiinihapoista, jotka on · ·· *.· 1 uutettu NANBV-partikkeleista, jotka on saatu infektoidusta • · · : 25 plasmasta anti-NANB5-1-1:11a ja jossa koettimena on 32P-leimattu ’!**: kloonin 81 NANBV:n cDNA.
• · · • · • · • · ·
Kuvio 41 esittää autoradiografeja suodattimista, jotka sisäl- • · · tävät eristettyjä NANBV-nukleiinihappoja, joissa koettimena on 30 32P-leimattuja plus- ja - kierteisiä DNA-koettimia, jotka ovat • · t...t peräisin kloonin 81 NANBV:n cDNA:sta.
• · ·
Kuvio 42 esittää HCV:n cDNA:ssa koodattujen polypeptidien ja : Dengue - f laviviruksen NS-proteiinin väliset homologit.
•I. 35 • · • ·
Kuvio 43 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta 1 satunnaisissa näytteissä määritettynä ELISA-seulonnalla.
14 107620
Kuvio 44 esittää histogrammin HCV-infektion jakaantumisesta satunnaisissa näytteissä käyttäen kahta immunoglobuliini-entsyymikonjugaatin konfiguraatiota ELISA-analyysissä.
5 Kuvio 45 esittää primeriseoksen sekvenssejä, jotka ovat peräisin säilyvistä sekvensseistä flaviviruksien NSl:ssä.
Kuvio 46 esittää HCV:n cDNA-sekvenssiä kloonissa k9-l, segmenttiä, joka menee päällekkäin kuviossa 26 esitetyn cDNA:n 10 kanssa ja siihen koodattuja aminohappoja.
Kuvio 47 esittää sekvenssiä yhdistelmä-cDNA:ssa, joka on peräisin asettamalla kohdakkain kloonit k9-l-15e suunnassa 5' -3'; se esittää myös ORFiään koodatut aminohapot.
15 I. Määritelmät
Termi "hepatitis-C-virus" on varattu alalla tähän asti tuntemattomalle NANBV:n etiologiselle aiheuttajalle. Niinpä tässä 20 käytettynä "hepatititis-C-virus" (HCV) viittaa NANBV:n syynä olevaan aiheuttajaan, johon aikaisemmin viitattiin NANBV:nä ja/tai BB-NANBV:nä. Termejä HCV, NANBV ja BB-NANBV käytetään '··.* tässä keskenään vaihdellen. Tämän terminologian jatkona • · · '.· · kutsutaan HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikaisemmin • · · : 25 kutsuttiin NANB-hepatitikseksi (NANBH), hepatitis-C:ksi.
*:**: Termejä NANBH ja hepatitis-C käytetään tässä keskenään vaih- :***: dellen.
··« • · · • · • · • · ·
Termi "HCV" merkitsee tässä käytettynä viruslajia, joka 3 0 aiheuttaa NANBH:n ja siitä johdettuja heikennettyjä kantoja tai • · ... puutteellisia häiritseviä partikkeleita. Kuten esitetään • · *;·’ myöhemmin, HCV-genomi muodostuu RNA:sta. Tiedetään, että ..*·* viruksia sisältävällä RNA: 11a on suhteellisen korkea spon- taanien mutaatioiden nopeus, s.o. on raportoitu suuruusluokkaa y..' 35 10"3 - 10'4 nukleotidia kohti olevista nopeuksista (Fields & • · '**. Knipe (1986)). Siksi alla kuvatun HCV-lajin joukossa on monia * · i ’· ** kantoja. Tässä kuvatut koostumukset ja menetelmät tekevät mahdolliseksi eri sukulaiskantojen lisääntymisen, 15 107620 määrittämisen, osoittamisen ja eristämisen. Edelleen ne myös sallivat diagnostisten välineiden ja rokotteiden valmistamisen eri kantoja varten ja niillä on käyttöä seulontamenetelmissä antiviraalisia aineita varten farmakologiseen käyttöön siinä, 5 että ne estävät HCV:n replikaation.
Tässä annettu tieto, vaikkakin se on peräisin yhdestä HCV-kannasta, johon tästä lähtien viitataan nimellä CDC/HCV1, on riittävä virustaksonomeille salliakseen muidenkin kantojen 10 identifioinnin, jotka ovat lajin sisällä. Kuten tässä kuvataan, olemme keksineet, että HCV on Flavivirus tai Flavi-tyyppinen virus. Flaviviruksen morfologia ja koostumus ovat tunnettuja ja niistä keskustellaan Brintonin (1986) julkaisussa. Yleisesti morfologian suhteen, Flavivirukset sisältävät keskeisen 15 ydinkapsidin, jota ympäröi kaksikerroksinen lipidi. Virionit ovat pallomaisia ja niiden halkaisija on noin 40-50 nm. Niiden ytimet ovat noin 25-30 nm halkaisijaltaan. Pitkin virionikuoren ulkopintaa on ulokkeita, jotka ovat noin 5-10 nm pitkiä ja niiden päässä olevat nupit ovat noin 2 nm halkaisijaltaan.
20 HCV koodaa epitooppia, joka on immunologisesti identifioita- ... vissa sen epitoopin kanssa HCV-genomissa, josta tässä kuvatut *“;* cDNA:t ovat peräisin; mielellään epitooppi on koodattu tässä • · · j·* * kuvatussa cDNA:ssa. Epitooppi on vain HCVissa esiintyvä, kun : 25 sitä verrataan muihin tunnettuihin Flaviviruksiin. Epitoopin ainutkertaisuus voidaan määrittää sen immunologisella • · « i"/· reaktiivisuudella HCV:n kanssa ja immunologisen reaktivisuuden puuttumisena muiden Flaviviruslajien kanssa. Menetelmät immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi ovat tunnettuja 30 alalla, esimerkiksi radioimmunologinen analyysi, ELISA-ana-,·♦·. lyysi, hemoagglutinaatio ja tässä annetaan lukuisia esimerkkejä sopivista tekniikoista analyysejä varten.
• · · ♦ • · ·
Edellisen lisäksi voidaan käyttää seuraavia parametrejä, joko .··*. 35 yksin tai yhdistelmänä, kannan identifioimiseksi HCVrksi. Koska • · · ; HCV-kannat ovat kehityksensä suhteen sukulaisia, odotetaan että ♦ ·♦ genomien kokonaishomologia nukleotiditasolla on noin 40 % tai enemmän, mieluummin noin 60 % tai enemmän ja vielä mieluummin 16 107620 noin 80 % tai enemmän; ja lisäksi että niissä on vastaavia viereisiä ainakin noin 13 nukleotidin sekvenssejä. Oletetun HCV-kannan genomisekvenssin ja CDC/CH1 HCVm cDNA-sekvenssin välinen vastaavuus voidaan määrittää alalla tunnetuilla 5 tekniikoilla. Esimerkiksi ne voidaan määrittää vertaamalla suoraan oletetun HCV:n polynukleotidin sekvenssitietoa ja tässä kuvattuja HCV:n cDNA-sekvenssejä. Esimerkiksi myös ne voidaan määrittää hybridisoimalla polynukleotideja olosuhteissa, jotka muodostavat stabiileja duplekseja homologisten alueiden välille 10 (esimerkiksi niiden alueiden, joita käytettäisiin ennen Si- pätkimistä), mitä seuraa pätkiminen yksisäikeisillä erityisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pätkittyjen fragmenttien koon määritys.
15 HCV-kantojen kehitykseen liittyvän suhteen takia voidaan oletetut HCV-kannat tunnistaa niiden polypeptiditasolla vallitsevan homologiansa avulla. Yleisesti HCV-kannat ovat enemmän kuin noin 40 % homologisia, mieluummin enemmän kuin noin 60 % homologisia ja vielä mieluummin enemmän kuin 80 % 20 homologisia polypeptiditasolla. Tekniikat aminohapposekvenssien homologian määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla. Esimerkiksi aminohapposekvenssi voidaan määrittää suoraan ja sitä voidaan • · · verrata tässä annettuihin sekvensseihin. Myös esimerkiksi • · · ; oletetun HCV:n genomimateriaalin nukleotidisekvenssi voidaan • **: 25 määrittää (tavallisesti cDNA-välituotteen kautta) ; siinä ·:··· koodattu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia ·*'*. alueita voidaan verrata.
• ♦ • · · • ·· ♦ t • · Tässä käytettynä polynukleotidi, joka "on peräisin" annetusta 30 sekvenssistä, esimerkiksi HCV:n cDNA, erityisesti kuvioissa 1- • · ... 32 esimerkkeinä annetut, tai HCV-genomista johdettu, viittaa • ♦ ·;·* polynukleotidisekvenssiin, joka muodostuu arviolta noin 6 •J* nukleotidin sekvenssistä, joka on mieluummin ainakin noin 8 nukleotidin, vielä mieluummin ainakin noin 10-12 nukleotidin ja ··« .1. 35 vieläkin mieluummin vastaavasti ainakin noin 15-20 nukleotidin • « ·**. pituinen, s .o. homologinen tai komplementaarinen annetun • · · *· *♦ nukleotidi sekvenssin alueen kanssa. Mieluummin alueen sekvenssi, josta polynukleotidi on peräisin, on homologinen tai 17 107620 komplementaarinen sekvenssille, joka on ainutkertainen HCV-genomille. olipa sekvenssi ainutkertainen HCV-genomille tai ei, se voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alan ammattilaiselle tunnettuja. Esimerkiksi sekvenssiä voidaan 5 verrata tietopankkien, esimerkiksi Genebank'in sekvensseihin sen määrittämiseksi, onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muussa organismissa. Sekvenssiä voidaan myös verrata muiden virusaineiden tunnettuihin sekvensseihin, sisältäen ne aineet, jotka ovat tunnettuja hepatitiksen aiheuttajia, 10 esimerkiksi HAV, HBV ja HDV ja muihin Flaviviridae-perheen jäseniin. Vastaavuus tai vastaamattomuus johdetun sekvenssin ja muiden sekvenssien välillä voidaan määrittää myös hydri-disaation avulla sopivissa tiukoissa olosuhteissa. Hybri-disaatiotekniikat nukleiinihapposekvenssien komplementaari-15 suuden määrittämiseksi ovat tunnettuja alalla ja niistä keskustellaan myöhemmin. Katso myös esimerkiksi julkaisua Maniatis et ai. (1982). Lisäksi hybridisaatiolla muodostuneiden dupleksipolynukleotidien sopimattomuus voidaan määrittää tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi pätkimisen 20 nukleaasilla, kuten Sl:llä, joka spesifisesti katkoo yksisäikeisiä alueita polynukleotideissa. Alueet, joista ···, tyypillisiä DNA-sekvenssejä voidaan "johtaa", sisältävät, • * mutteivät ne ole niihin rajoitettuja, esimerkiksi alueet, jotka • · · /m\' koodaavat erityisiä epitooppeja ja lisäksi ei-transkriptoituja * · · : ·* 25 ja/tai ei-transloituja alueita.
• » ««· ·...· Johdettu polynukleotidi ei ole välttämättä fysikaalisesti peräisin esitetystä nukleotidisekvenssistä, mutta se voidaan luoda millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen 30 synteesin tai DNA:n replikoimisen tai käänteisen transkription .***, tai transkription, jotka perustuvat siihen tietoon, jonka antaa •t emässekvenssi alueilla, joista polynukleotidi on peräisin.
··· ···* Lisäksi niiden alueiden yhdistelmiä, jotka vastaavat annetun sekvenssin alueita, voidaan muokata tavoilla, joiden tiedetään ·***; 35 alalla vastaavan aiottua käyttöä.
• · ♦ · · • ##
Samoin polypeptidi- tai aminohapposekvenssi, joka on peräisin annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1- 18 107620 32 sekvensseistä, tai HCV-genomista, viittaa polypeptidiin, jossa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen sen polypeptidin aminohapposekvenssin kanssa, joka on koodattu sekvenssiin tai sen osaan, jossa osa käsittää ainakin 3-5 5 aminohappoa ja mieluummin ainakin 8-10 aminohappoa ja vielä mieluummin ainakin 11-15 aminohappoa tai joka on immunolo-gisesti tunnistettavissa sekvenssiin koodatun polypeptidin avulla.
10 Yhdistelmä- tai johdettu polypeptidi ei ole välttämättä transloitu annetusta nukleiinihapposekvenssistä, esimerkiksi kuvioiden 1-26 sekvensseistä tai HCV-genomista; se voi olla luotu millä tahansa tavalla, sisältäen esimerkiksi kemiallisen synteesin tai yhdistelmäekspressiojärjestelmän ekspression tai 15 eristämisen mutatoituneesta HCVrstä.
Termi "yhdistelmäpolynukleotidi" käytettynä tässä merkitsee polynukleotidia, joka on peräisin genomista, cDNAtsta, se on semisynteettistä tai synteettistä alkuperää, joka alkuperänsä 20 tai manipulaationsa takia: (1) ei liity kaikkiin niihin poly- nukleotideihin tai niiden osaan, joihin se liittyy luonnossa ···. tai kirjaston muodossa; ja/tai (2) on kytketty polynuk- • · leotidiin, joka on muu kuin se, johon se on kytketty luonnossa.
• · ·· · • · · • ·#* 25 Termi "polynukleotidi" tässä käytettynä viittaa minkä tahansa * pituisten nukleotidien, joko ribonukleotidien tai deoksiri- ··· • · ‘...* bonukleotidien, polymeeriseen muotoon. Tämä termi viittaa vain ··· molekyylin ensisijaiseen rakenteeseen. Täten tämä termi sisältää kaksi- ja yksisäikeistä DNA:ta ja lisäksi kaksi- ja *:·*: 30 yksisäikeistä RNA:ta. Se sisältää myös modifioituja, esimer- ·***. kiksi metyloimalla ja/tai kapseloimalla ja modifioimat tornia * · · *. polynukleotidin muotoja.
• ·· ···· • · · • · *···* Tässä käytettynä termi "HCV, joka sisältää sekvenssin, joka 35 vastaa cDNA:ta" merkitsee, että HCV sisältää polynukleotidi-
• M
;\j sekvenssin, joka on homologinen tai komplementaarinen sek- • · venssille annetussa DNArssa; homologia-asteen tai komplemen-taarisuusasteen ollessa suurin piirtein 50 % tai enemmän, on 19 107620 mieluummin ainakin noin 70 % ja vielä mieluummin se on ainakin noin 90 %. Sekvenssit, jotka vastaavat toisiaan ovat ainakin noin 70 nukleotidia ja vielä mieluummin ainakin noin 90 nukleotidia pitkiä. HCV-sekvenssin ja cDNA:n välinen vastaavuus 5 voidaan määrittää tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, sisältäen esimerkiksi sekventoidun materiaalin suoran vertailun cDNA:t kuvattuna tai hybridisaation ja pilkkomisen yksisäikeisillä nukleaaseilla, mitä seuraa pilkottujen fragmenttien koon määrittäminen.
10
Termi "puhdistettu viruspolynukleotidistä" viittaa HCV-genomiin tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen puhdas, s.o. se sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % polypeptidejä, 15 joihin viruspolynukleotidi luonnollisesti liittyy. Tekniikat viruspolynukleotidien puhdistamiseksi viruspartikkeleista ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi partikklein katkaisun kaotrooppisella aineella ja polynukleotidien ja polypeptidien erottamisen joninvaihtokromatografian, 20 affiniteettikromatografiän ja sedimentoimisen avulla tiheyden mukaan.
♦ ·* » • ·
Termi "puhdistettu viruspolypeptidi" viittaa HCV-polypeptidiin • * * tai sen fragmenttiin, joka on olennaisen vapaa, s.o. se #11 ; ·* 25 sisältää vähemmän kuin noin 50 %, mieluummin vähemmän kuin noin ^ · * * 70 % ja vielä mieluummin vähemmän kuin noin 90 % solu- • ·· ·...* komponentteja, joihin viruspolypeptidi luonnollisesti liittyy.
Tekniikat viruspolypeptidien puhdistamiseksi ovat alalla tunnettuja ja näiden tekniikoiden esimerkeistä keskustellaan ····· 30 alla.
• « •e "Yhdistelmäisäntäsolut", isäntäsolut", "solut", "solulinjat", • · · ···· "soluviljelmät" ja muut sellaiset termit, jotka merkitsevät *...· mikro-organismeja tai korkeampia eukarioottisolulinjoja, joita ·***. 35 viljellään yksisoluisina kokonaisuuksina viittaavat soluihin, ··· : joita voidaan käyttää tai on voitu käyttää yhdistelmävektorin • · tai muun siirto-DNA:n vastaanottajana ja jotka sisältävät sen alkuperäisen solun perimän, johon siirros on tehty.
20 107620
Ymmärretään, että yksittäisen emäsolun perimä ei välttämättä ole täysin identtinen morfologialtaan tai genomiltaan tai ole täysi DNA-komplementti alkuperäisenä vanhempana onnettomuuden seurauksena tapahtuneen tai tarkoitetun mutaation seurauksena.
5 Emäsolun perimä, mikä on riittävän samanlainen asiaan kuuluvalta ominaisuudeltaan, kuten haluttua peptidiä koodaavan nukleotidisekvenssin läsnäolon suhteen, määritettävän emäsolun kanssa, sisältyy tähän määritelmään aiottuun perimään ja ylläolevat termit kattavat ne.
10 "Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti, esimerkiksi plasmidi, kromosomi, virus, joka käyttäytyy autonomisena polynukleotidin replikaation yksikkönä solun sisällä; s.o. se pystyy replikoitumaan oman kontrollinsa alaisena.
15 "Vektori" on replikoni, johon on kiinnittynyt toinen polynuk-leotidisegmentti tuodakseen mukaan kiinnittyneen segmentin replikaation ja/tai ekspression.
20 "Säätösekvenssi" viittaa polynukleotidisekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä niiden koodaussekvenssien, joihin ne ovat sitoutuneet, ekspression aikaansaamiseen. Sellaisten ···. säätösekvenssien luonne eroaa isäntäorganismin mukaan; pro- kariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti • · · . 25 promoottorin, ribosomin sidoskohdan ja terminaattoreita; • · ’ *. eukariooteissa sellaiset säätösekvenssit sisältävät yleisesti • · · · · promoottoreita, terminaattoreita ja joissakin tapauksissa • · '···’ vahvistajia. Termi "säätösekvenssit" on aiottu sisältämään ·*· minimissään kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämä- 30 töntä ekspressiota varten ja ne voivat myös sisältää lisäkom- *:·*: ponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi joh- ·***: tosekvenssejä.
• · · ··» ”” "Toiminnallisesti kytketty" viittaa rinnakkainasetteluun, jossa • · *·;·* 35 niin kuvatut komponentit ovat sellaisessa suhteessa, joka sallii niiden toiminnan aiotulla tavalla. Säätösekvenssi, joka :*·.· on "toiminnallisesti kytketty" koodaus sekvenssi in, on sidottu sellaisella tavalla, että koodaussekvenssin ekspressio saadaan 21 107620 aikaan olosuhteissa, jotka ovat yhteensopivia säätösekvenssien kanssa.
"Avoin lukurakenne" (Open reading frame ORF) on polynukleo-, 5 tidisekvenssin alue, joka koodaa polypeptidiä; tämä alue voi edustaa koodaussekvenssin osaa tai kokonaista koodaussek-venssiä.
"Koodaussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka on 10 transkriptoitu mRNA:han ja/tai transloitu polypeptidiin, kun se on pantu sopivien säätävien sekvenssien kontrolliin. Koodaussekvenssin rajat määrittävät translaation aloittava kodoni 5'-päässä ja translaation lopettava kodoni 3'-päässä. Koodaussekvenssi voi sisältää, muttei se ole rajoitettu niihin, 15 mRNArn, cDNA:n ja yhdistelmäpolynukleotidisekvenssejä.
"Immunologisesti tunnistettavissa jollakin/jonakin" viittaa sellaisten epitooppien ja polypeptidien läsnäoloon, jotka ovat myös läsnä ja ovat ainutkertaisia annetuille polypeptideille, 20 tavallisesti HCV-proteiineille. Immunologisen identiteetin voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen ja/tai kilpailu sitoutumisessa; nämä tekniikat ovat tunnettuja alan keskitason ···. ammattilaiselle ja niitä kuvataan myös alla. Epitoopin « · #’|*# ainutkertaisuus voidaan myös määrittää tietokonehaulla « « * .1. 25 tunnetuissa tietopankeissa, esimerkiksi Genebank1ssa, epi- • · * *. tooppia koodaavien polynukleotidisekvenssien löytämiseksi ja ····· " ' vertaamalla aminohapposekvenssiä muihin tunnettuihin • » *···* proteiineihin.
• · · • · • « • ·· 30 Tässä käytettynä "epitooppi" viittaa polypeptidin antigeeniseen *:**: polypeptidin determinanttiin; epitooppi voisi käsittää kolme , ·***: aminohappoa epitoopille ainutkertaisessa avaruuskonfor- ··· *. maatiossa, yleisesti epitooppi käsittää ainakin viisi sellaista ·»· *“j aminohappoa ja tavallisemmin se käsittää ainakin 8-10 sellaista • · ’···* 35 aminohappoa. Aminohappojen avaruuskonformaation :***: määrittämismenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät ·»· magneettisen resonanssin.
:*·.· esimerkiksi röntgenkristallografiän ja kaksiulotteisen ydin- • » 22 107620
Polypeptidi on "immunologisesti reaktiivinen" vasta-aineen kanssa, kun se sitoutuu vasta-aineeseen siten, että se tunnistaa tietyn polypeptidin sisältämän epitoopin. Immunologisen 5 reaktiivisuuden voi määrittää vasta-aineen sitoutuminen, erityisemmin vasta-aineen sitoutumisen kinetiikka ja/tai kilpailu sitoutumisessa käyttäen kilpailijoina tunnettuja polypeptidejä, jotka sisältävät epitoopin, jota vastaan vasta-aine on suunnattu. Tekniikat sen määrittämiseksi onko 10 polypeptidi immunologisesti reaktiivinen vasta-aineen kanssa vai ei, ovat alalla tunnettuja.
Tässä käytettynä termi "HCV-epitoopin sisältävä immunogeeninen polypeptidi" sisältää luonnollisesti esiintyviä HCV-15 polypeptidejä tai niiden fragmentteja ja myös polypeptidejä, jotka on valmistettu muilla tavoin, esimerkiksi kemiallisella synteesillä tai ekspressoimalla polypeptidi yhdistelmäor-ganismissa.
20 Termi "polypeptidi" viittaa aminohappojen molekyyliketjuun, eikä viittaa tuotteen erityiseen pituuteen; täten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit sisältyvät polypeptidin määritel-··*. mään. Tämä termi ei myöskään viittaa polypeptidien ekspression jälkeisiin muunnoksiin, esimerkiksi glykosylaatioihin, « ♦ « .1 . 25 asetylaatioihin, fosforylaatioihin ja sen kaltaisiin.
« · · • · * ··*·» "Transformaatio" tässä käytettynä viittaa ulkopuolisen poly- • · * nukleotidin panemiseen isäntäsoluun, riippumatta panemiseen • · ♦ käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora otto, transduktio 30 tai f-liitto. Ulkoinen polynukleotidi voidaan pitää integroi- ·:··· mattomana vektorina, esimerkiksi plasmidina tai vaihtoeh- .***; toisesti se voidaan integroida isäntägenomiin.
• · # • · · •••j "Yksilö" tässä käytettynä viittaa selkärankaisiin, erityisesti • · *♦··' 35 imettäväisiäjin jäseniin ja sisältää, muttei ole niihin rajoitettu, kotieläimet, urheilueläimet, kädelliset ja ihmiset.
»·· • · • » « ......
• ·« • · 23 107620 Tässä käytettynä nukleiinihapon "plussäie" sisältää sekvensin, joka koodaa polypeptidiä. "Miinussäie" sisältää sekvenssin, joka on plussäikeelle komplementaarinen.
5 Tässä käytettynä viruksen "positiivisen säikeen genomi" on sellainen, jossa genomi, joko RNA tai DNA, on yksisäikeinen ja joka koodaa viruspolypeptidejä. Esimerkkejä positiivisen säikeen RNA-viruksista ovat Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, ja Caliciviridae. Mukaan sisäl-10 tyvät myös Flaviviridae, joka aikaisemmin luokiteltiin kuulumaan lajiin Togaviridae. Katso Fields & Knipe (1986) .
Tässä käytettynä "vasta-aineen sisältävä ruumiin osa" viittaa yksilön ruumiin osaan,joka on kyseessä olevien vasta-aineiden 15 lähde. Vasta-aineita sisältävät ruumiin osat ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi plasman, seerumin, selkäydinnesteen, imunesteen, hengitysteiden, ruuansulatuskanavan ja sukupuoli-virtsakanavan ulko-osat, kyyneleet, syljen, maidon, veren valkosolut ja myeloomat.
20 Tässä käytettynä "puhdistettu HCV" viittaa HCV-valmisteeseen, joka on eristetty soluosasista, joihin virus tavallisesti liittyy ja muista virustyypeistä, jotka voivat olla läsnä « · · infektoituneessa kudoksessa. Tekniikat virusten eristämiseksi • · · 25 ovat tunnettuja alan ammattilaisille ja sisältävät esimerkiksi sentrifugoinnin ja af f initeettikromatograf iän; menetelmästä • · ... puhdistetun HCV:n valmistamiseksi keskustellaan alla.
• · • « • · · 24 107620
HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins toim. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney toim. 1986); IMMOBOLIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); sarja, METHODS IN ENZYMOLOGY 5 (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN
CELLS (J.H. Miller ja M.P.Calos toim. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, toim.), Mayer ja Walker, toim. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY 10 (Academis Press, Lontoo), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Toinen painos (Springer-Verlag, N.Y.), ja HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.Weir ja C.C. Blackwell toim. 1986) .
15 Kaikki patentit, patenttihakemukset ja julkaisut, jotka tässä on mainittu, sekä yllä että alla, liitetään tähän mukaan käsitelväksi viitejulkaisuina.
Tämän keksinnön hyödylliset materiaalit ja menetelmät tekee 20 mahdolliseksi läheisesti homologisten nukleotidisekvenssien, jotka on eristetty cDNA-kirjastosta, joka on peräisin HCV- infektoituneen simpanssin plasmassa olevista nukleiinihap- ·*·. posekvensseistä, aikaansaaminen. Tämä nukleotidisekvenssien « · · perhe ei ole peräisin ihmisestä tai simpanssista, koska se ei • · · # 25 hybridisoidu infektoitumattomista yksilöistä peräisin olevan • · * *. ihmisen eikä simpanssin genomin DNA:n kanssa, koska sekvenssien ····· tämän perheen nukleotidit ovat läsnä vain simpanssien maksassa • · *···* ja plasmassa HCV-infektion myötä ja koska sekvenssi ei ole « · · *...· läsnä Genebank' issa. Lisäksi sekvenssien perhe ei osoita mitään 30 merkittävää homologiaa HBV-genomiin sisältyvien sekvenssien *:*·: kanssa.
• · · • · • · · *. Yhden perheen jäsenen sekvenssissä, joka jäsen sisältyy **” klooniin 5-1-1, on jatkuva avoin lukualue (ORF), joka koodaa • · ‘•y* 35 arviolta 50 aminohapon polypeptidiä. HCV-infektoituneen ihmisen :***: seerumi sisältää vasta-aineita, jotka sitoutuvat tähän • · · :*·.· polypeptidiin, kun taas infektoitumattomien ihmisten seerumi ei * · sisällä tämän polypeptidin vasta-aineita. Lopulta 25 107620 infektoitumattomien simpanssien seerumi ei sisällä tämän polypeptidin vasta-aineita, vasta-aineet syntyvät simpansseihin seuraten akuuttia NANBH-infektiota. Edelleen tämän polypeptidin vasta-aineita ei havaita simpansseissa tai ihmisissä, joilla on 5 HAV- tai HBV-infektio. Näillä perusteilla sekvenssi on cDNA virussekvenssille, jossa virus aiheuttaa NANBH:n tai liittyy NANBH:hon; tämä cDNA-sekvenssi esitetään kuviossa 1. Kuten keskustellaan seuraavassa, kloonin 5-1-1 cDNA-sekvenssi eroaa toisten eristettyjen cDNAroiden sekvensseistä siinä, että se 10 sisältää 28 ylimääräistä emäsparia.
Muiden tunnistettujen cDNA-perheen jäsenien yhdistelmä, jotka jäsenet eristettiin käyttäen koettimena synteettistä sekvenssiä, joka oli samanlainen kuin kloonissa 5-1-1 oleva cDNA:n 15 fragmentti, esitetään kuviossa 3. cDNA-perheen jäsen, joka eristettiin käyttäen synteettistä sekvenssiä, joka on peräisin kloonin 81 cDNAista, esitetään kuviossa 5 ja tämän sekvenssin yhdistelmä kloonin 81 sekvenssin kanssa esitetään kuviossa 6. Muita cDNA-perheen jäseniä, mukaanlukien ne, jotka ovat 20 klooneissa 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f ja 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e, kuvataan osassa IV.A.. Näissä klooneissa olevien ... cDNA-.aiden yhdistelmää kuvataan osassa IV.A. 19 ja se esitetään *·“* kuviossa 32. cDNArjen yhdistelmä osoittaa, että se sisältää ’·* * 25 yhden jatkuvan ORFm ja täten se koodaa polyproteiinia. Tämä • *.· tieto on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, josta keskustellaan seuraavassa, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus.
• · · • · • · • · ·
Vain tämän kuvioissa 1-32 esitetyn cDNA-perheen saatavuus ··» 30 sallii sellaisten DNA-koettimien ja polypeptidien rakentamisen, jotka ovat hyödyllisiä HCV-infektion seurauksena syntyneen • · NANBH:n diagnosoimisessa ja seulottaessa verenluovuttajia ja * · *!* myös luovutettua verta ja verituotteita infektion suhteen.
..*·* Esimerkiksi sekvensseistä on mahdollista syntetisoida DNA- • · · :...: 35 oligomeereja, joissa on noin 8-10 nukleotidia tai suurempia, .···, jotka ovat hyödyllisiä hybridi saat iokoettimina virusgenomin I’*. osoittamiseksi esimerkiksi sellaisten kohteiden seerumissa, • · · * • · · ’ * joiden epäillään kantavan virusta tai luovutetun veren 26 107620 seulomiseksi viruksen läsnäolon varalta. cDNA-sekvenssien perhe sallii myös HCV-spesifisten polypeptidien suunnittelemisen ja tuottamisen, jotka polypeptidit ovat hyödyllisiä diagnostisina reagensseina NANBH:n aikana syntyvien vasta-aineiden läsnäolon 5 toteamiseksi. cDNA:sta peräisin olevien puhdistettujen polypeptidien vasta-aineita voidaan myös käyttää virusantigeenien osoittamiseksi infektoituneissa yksilöissä ja veressä.
Lisäksi cDNA-sekvenssien perhe tekee mahdolliseksi HCV-genomin 10 lisäkuvaamisen. Näistä sekvensseistä peräisin olevia polynuk-leotidikoettimia voidaan käyttää seulomaan cDNA-kirjastoja sellaisten lisä-cDNA-sekvenssien varalta, jotka menevät päällekkäin niiden kanssa, joita vuorostaan voidaan käyttää päällekkäin menevien sekvenssien lisän saamiseen. Ellei genomi 15 ole segmentoitu, eikä segmenteillä ole yhteisiä sekvenssejä, tätä tekniikkaa voidaan käyttää koko genomin sekvenssin saamiseksi. Kuitenkin jos genomi on segmentoitu, muita genomin segmenttejä voidaan saada toistamalla lambda-gtll-serologinen seulontamenettely, jota käytetään tässä kuvattujen cDNA-20 kloonien eristämiseksi tai vaihtoehtoisesti eristämällä genomi puhdistetuista HCV-partikkeleista.
·*·. cDNA-sekvenssien perhe ja polypeptidit, jotka ovat peräisin • · · näistä sekvensseistä ja myös vasta-aineet, jotka on suunnattu 25 näitä polypeptidejä vastaan, ovat myös hyödyllisiä BB-NANBV-aineiden eristämisessä ja tunnistamisessa. Esimerkiksi vasta- • · aineita, jotka ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, jotka φ · *···* sisältyvät polypeptideihin, jotka ovat peräisin cDNA:sta, • · voidaan käyttää menetelmissä, jotka perustuvat af f initeettik- 30 romatografiaan viruksen eristämiseksi. Vaihtoehtoisesti vasta- *ϊ**ί aineita voidaan käyttää tunnistamaan viruspartikkeleita, jotka ·*’*: on eristetty muilla tekniikoilla. Virusantigeenit ja \ genomimateriaali eristetyissä viruspartikkeleissa voidaan *”* sitten edelleen määrittää.
* * • · ' — 35 «
Tieto, joka saadaan sekventoimalla HCV-genomeita edelleen, :*·.· samoin kuin myös HCV-antigeenejä edelleen karakterisoimalla ja « · genomia karakterisoimalla tekee mahdolliseksi lisäkoettimien ja i 27 107620 polypeptidien ja vasta-aineiden suunnittelun ja synteesin, joita aineita voidaan käyttää HCV:n aiheuttaman NANBHm diagnoosiin, estämiseen ja hoitoon ja infektoituneen veren ja vereen liittyvien tuotteiden seulomiseen.
5 HCV-koettimien saatavuus, sisältäen antigeenit ja vasta-aineet ja polynukleotidit, jotka ovat peräisin genomista, josta cDNA-perhe on peräisin, sallii myös kudosten viljelyjärjestelmien kehittämisen, jotka järjestelmät ovat suuresti käytössä HCV:n 10 biologiaa selvitettäessä. Tämä vuorostaan voi johtaa uusien hoito-ohjeiden kehittymiseen, jotka perustuvat antiviraalisiin yhdisteisiin, jotka etupäässä estävät HCV:n replikaation tai sen tarttumisen.
15 Menetelmä, jota käytetään NANBHm etiologisen aiheuttajan tunnistamiseen ja eristämiseen, on uusi ja se voi olla käyttökelpoinen tätä ennen karakterisoimattomien aineiden, jotka sisältävät genomin, tunnistamiseen ja/tai eristämiseen, ja jotka liittyvät lukuisiin tauteihin, mukaan lukien ne, jotka 20 aiheutuvat viruksista, viroideista, bakteereista, sienistä ja loisista. Tässä menetelmässä luotiin cDNA-kirjasto nukleiinihapoista, jotka olivat läsnä infektoituneen yksilön .***. infektoituneessa kudoksessa. Kirjasto luotiin vektoriin, joka ··· salli sellaisten polypeptidien ekspression, jotka olivat • · · :·... 25 koodattuna cDNA-.ssa. Isäntäsolujen klooneja, jotka sisälsivät • · vektorin, joka ekspressoi immunologisesti reaktiivisen etio- • · ... logisen aiheuttajan polypeptidin fragmenttia, valittiin kir- • · *·;·’ jaston ekspressiotuotteiden immunologisella seulonnalla vasta- *···* aineen sisältävän ruumiin komponentin kanssa toisesta yksilös- 30 tä, joka oli aikaisemmin infektoitu oletetulla aiheuttajalla.
Immunologisen seulontatekniikan vaiheet käsittivät cDNAm sisältävien vektoreiden saattamisen reagoimaan vasta-aineen sisältävän, toisen infektoidun yksilön ruumiin komponentin *1” kanssa ja antigeeni-vasta-ainekompleksin syntymisen *·* 35 osoittamisen ekspressiotuotteiden ja toisen infektoidun yksilön • · · ϊ.,,ί vasta-aineiden välille. Eristetyt kloonit seulotaan edelleen immunologisesti saattamalla niiden ekspressiotuotteet reagoimaan vasta-aineen sisältävän, oletetulla aiheuttajalla 28 107620 infektoitujen toisten yksilöiden ruumiin komponenttien kanssa ja vertailuyksilöiden kanssa, joita yksilöitä ei ole infektoitu oletetulla aiheuttajalla ja osoittamalla antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostuminen infektoiduista yksilöistä olevien 5 vasta-aineiden kanssa; ja eristetään cDNA:n sisältävät vektorit, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka reagoivat immunologisesti vasta-aineiden kanssa, jotka ovat peräisin infektoiduista yksilöistä ja yksilöistä, joiden epäillään olevan aiheuttajan infektoimia, mutta jotka eivät reagoi 10 kontrolliyksilöiden kanssa. Infektoitujen yksilöiden, joita käytetään cDNA-kirjaston rakentamiseen ja immunologiseen seulontaan, ei tarvitse olla samaa lajia.
Tämän menetelmän tuloksena eristetyt cDNArt ja niiden eks-15 pressiotuotteet ja ekspressiotuotteita vastaan suunnatut vasta-aineet, ovat hyödyllisiä etiologisen aiheuttajan tunnistamisessa ja/tai löytämisessä. Kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin alla, tätä menetelmää on käytetty menestyksellisesti eristämään HCV-genomista peräisin olevan cDNA-kirjaston eristä-20 miseen.
II.A. cDNA sekvenssin valmistaminen • » .···, Varastoitua seerumia simpanssista, jolla oli krooninen HCV- • · . 25 infektio ja mikä sisälsi korkean virustiitterin, s.o. ainakin * *. 106 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ml), käytettiin virus- *···· partikkeleiden eristämiseen; näistä partikkeleista eristettyjä • · *···* nukleiinihappoja käytettiin mallina rakennettaessa cDNA- • · · kirjastoa virusgenomille. Menetelmistä oletettujen HCV-par- 30 tikkeleiden eristämiseksi ja cDNA-kirjaston rakentamiseksi *:*·: lambda-gtll:een keskustellaan osassa IV.A.l. Lambda-gtll on ·***: vektori, joka on kehitetty erityisesti ekspressoimaan soluun • · · *. liitettyjä cDNA:ja fuusiopolypetideinä beta-galaktosidaasin •“I kanssa ja seulomaan suuria joukkoja yhdistelmäfaageja erityi- ♦ * *···* 35 sellä antiseerumilla, joka syntyy annettua antigeeniä vastaan.
:***: Vektoriin lambda-gtll tehtyä cDNA-kirjastoa, joka oli luotu :*♦.· cDNA-varastosta, joka sisälsi arviolta 200 .emäsparin • · keskimääräisen kokoista cDNA:ta, seulottiin koodattujen epi- 29 107620 tooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaista, joilla oli aikaisemmin ollut NANB-hepatitis. Huynh, T.V. et ai. (1985). Seulottiin arviolta 106 faagia ja viisi positiivista faagia tunnistettiin, 5 puhdistettiin ja sitten testattiin spesifisyyden suhteen sitoutua eri ihmisistä ja simpansseista, jotka olivat aikaisemmin infektoituneet HCV-aiheuttajalla, peräisin olevaan seerumiin. Yksi faageista, 5-1-1, sitoutui viiteen kahdeksasta kokeillusta ihmisseerumista. Tämä sitoutuminen tapahtui 10 selektiivisesti sellaiseen seerumiin, joka oli otettu potilaista, joilla oli ollut aikaisemmin NANB-hepatitisinfektio, sillä seitsemän normaalin verenluovuttajan seerumit eivät osoittaneet sellaista sitoutumista.
15 Yhdistelmäfaagissa 5-1-1 olevan cDNA:n sekvenssi määritettiin ja se nähdään kuviossa 1. Tämän kloonatun cDNA:n koodaama polypeptidi, joka on samalla translaatioalueella kuin fuusio-polypeptidin N-pään betagalaktosidaasipuolisko, esitetään nukleotidisekvenssin yläpuolella. Tämä translaatio-ORF koodaa 20 sen vuoksi epitooppia, jonka tunnistaa spesifisesti niiden potilaiden seerumi, joilla on NANB-hepatitisinfektioita.
cDNA:n saatavuus yhdistelmäfaagissa 5-1-1 on sallinut eristää ··· muitakin klooneja, jotka sisältävät cDNA:n lisäsegmenttejä 25 ja/tai vaihtoehtoisia segmenttejä virusgenomiin. Lambda- • · gtll:ssä oleva cDNA-kirjasto, jota kuvattiin yllä, seulottiin • · ... käyttäen synteettistä polynukleotidia, joka oli peräisin • · ···* kloonatun 5-1-1 :n cDNA:n sekvenssistä. Tämä seulonta antoi • ·· • · *···* tuloksena kolme muuta kloonia, joiden tunnistettiin olevan 81, 30 1-2 ja 91; näiden kloonien sisältämät cDNA:t sekventoitiin.
9
Katso osia IV.A.3. ja IV.A.4. Neljän itsenäisen kloonin väliset homologiat esitetään kuviossa 2, jossa homologiat on merkitty ]·. pystyviivoilla. Nukleotidisekvenssit, jotka ovat läsnä ainutkertaisesta klooneissa 5-1-1, 81 ja 91, on merkitty • · *!* 35 pienillä kirjaimilla.
··· • · « · • · ·
Yhdistelmäfaageissa klooneissa 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 läsnä olevat kloonatut cDNA:t ovat hyvin homologisia ja eroavat vain 30 107620 kahdella alueella. Ensiksi nukleotidi numero 67 kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät tässä asemassa sytidiinijäännöksen. Tämä korvaus ei kuitenkaan muuta koodatun aminohapon luonnetta.
5
Toinen ero kloonien välillä on, että klooni 5-1-1 sisältää 28 emäsparia 5'-päässä, jotka parit eivät ole läsnä muissa klooneissa. Ylimääräinen sekvenssi voi olla 51-päätä kloonaava tekotuote; 51-päätä kloonaavia tekotuotteita huomataan usein 10 cDNA-menetelmien tuotteissa.
HCV:n cDNA:n synteettisiä sekvenssejä, jotka olivat peräisin 5'-alueelta ja 3'-alueelta, käytettiin seulomaan ja eristämään lambda-gtll:ssä olevia NANBV:n cDNA-kirjaston cDNA:ta, jotka 15 menivät päällekkäin kloonin 81 cDNA:n kanssa (Osa IV.A.5.).
Tuloksena olevien cDNA:jen sekvenssit, jotka ovat kloonissa 36 ja vastaavasti kloonissa 32, esitetään kuviossa 5 ja kuviossa 7.
20 Samoin synteettistä polynukleotidia, joka perustui kloonin 36 51-alueeseen, käytettiin seulomaan ja eristämään lambda- gtll: ssä olevan NANBVrn cDNA-kirjaston cDNA:oja, jotka menivät **·. päällekkäin kloonin 36 cDNAtn kanssa (osa IV.A.8:) .
• « ·
Yhdistelmäfaagin sisältävän cDNA:n puhdistettu klooni, joka • · · 25 hybridisoitui synteettiseen polynukleotidikoettimeen, nimettiin • * * klooniksi 33 ja tämän kloonin sisältämä NANBV:n cDNA-sekvenssi »·*·· esitetään kuviossa 8.
• · · • · • · • * · ··« Käyttäen tekniikkaa eristää päällekkäin meneviä cDNA-sek- 30 venssejä on saatu lisäsekvenssejä HCV:n cDNA:sta ylävirtaan ja *:*·: alavirtaan. Näiden kloonien eristämistä kuvataan alla osassa ·**': IV.A.
• · · • · ·
Eristettyihin klooneihin koodattujen HCV:n cDNA:ojen nuk- • ·
·...* 35 leotidisekvenssien analyysi osoittaa, että yhdistelmä-cDNA
··· ti sisältää yhden pitkän, jatkuvan ORF:n. Kuvio 26 esittää näistä klooneista peräisin olevan yhdistelmä-cDNA:n sekvenssin yhdessä « · siihen koodatun oletetun HCV-polypeptidin kanssa.
31 107620
Menetelmän kuvaus cDNA-sekvenssien saamiseksi on enimmäkseen historiallisesti mielenkiintoista. Tuloksena olevat sekvenssit (ja niiden komplementit) annetaan tässä ja sekvenssit tai 5 niiden osat voitaisiin valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmiä saaden osittaisia sekvenssejä käyttäen menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin ne joita kuvataan tässä. Lambda-gt11-kannat, jotka on replikoitu HCV:n cDNA-kirjastosta ja klooneista 5-1-1, 81, 10 1-2 ja 91, on talletettu Budapest Treaty'n mukaisesti American
Type Culture Collection1 iin (ATCC), osoitteessa 12310 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852 ja niille on annettu seuraavat talletusnumerot.
15 Lambda-gt11 ATCC No Talletupäivä HCV:n cDNA-kirjasto 40394 1.12.1987 klooni 81 40388 17.11.1987 klooni 91 40389 17.11.1987 klooni 1-2 40390 17.11.1987 20 klooni 5-1-1 40391 18.11.1987
Kun tätä vastaava hakemus on mennyt patentiksi USA:ssa, kaikki ,***· rajoitukset näiden tallenteiden saatavuuden suhteen tullaan .•J*. poistamaan peruuttamattomasti; ja pääsy mainittuihin ··.·. 25 tallenteisiin on mahdollinen yllämainitun US-hakemuksen ♦ · käsittelyn aikana sille, jonka "Commissioner" siihen valtuuttaa • ψ ... säännösten 37 CFR 1.14 ja 35 USC 1.22 nojalla. Lisäksi « ♦ *·;** mainittuja tallenteita ylläpidetään kolmenkymmenen vuoden ajan • · *···* talletuspäivästä lukien tai viiden vuoden ajan siitä, kun joku 30 on viimeksi tallenteita kysellyt; tai US-patentin v · ***** voimassaoloajan, mikä tahansa edellämainituista aikarajoista onkin pitempi. Nämä tallenteet ja tässä mainitut muut tal- )·. letetut materiaalit ovat tarkoitetut ainoastaan mukavuutta ♦ varten, eikä niitä vaadita tämän keksinnön käytäntöön sovel- • · *1* 35 tamisessa tässä annetun kuvauksen valossa. Kaikessa tallete- ··· tussa materiaalissa olevat HCV:n cDNA-sekvenssit liitetään tähän viittauksena.
* · 32 107620
Yllä oleva kuvaus genomin "kävelystä" eristämällä päällekkäin menevät cDNA-sekvenssit HCV:n lambda-gtll-kirjastosta aikaansaa yhden menetelmän, jolla voidaan eristää cDNA:t, jotka vastaavat koko HCV-genomia. Kuitenkin, kun tässä annettu tieto on 5 hallussa, muut menetelmät näiden cDNA:ojen eristämiseksi ovat ilmeisiä alan ammattilaiselle. Muutamia näistä menetelmistä kuvataan osassa IV.A. alla.
II.B. Viruspolypeptidien ja -fragmenttien valmistus 10 cDNA-sekvenssien saatavuus, joko niiden, jotka on eristetty käyttäen kuvioiden 1-32 cDNA-sekvenssejä ja myös näissä kuvioissa esitettyjen cDNA-sekvenssien, sallii sellaisten ekspressiovektoreiden rakentamisen, jotka koodaavat jompaan 15 kumpaan säikeeseen koodatun polypeptidin antigeenisesti aktiivisia alueita. Nämä antigeenisesti aktiiviset alueet voidaan johtaa päällys- tai kuoriantigeeneistä tai ydinanti-geeneistä, sisältäen esimerkiksi polynukleotidia sitovat proteiinit, polynukleotidipolymeraasit ja muut virusproteiinit, 20 joita vaaditaan viruspartikkelin replikaatiota ja/tai kokoonpanoa varten. Fragmentit, jotka koodaavat haluttua polypeptidiä, johdetaan cDNA-klooneista käyttäen tavanomaista ···. restriktiopilkkomista tai synteettisillä menetelmillä ja ne « · V/. liitetään vektoreihin, jotka voivat esimerkiksi sisältää osia • · · • · · .* , 25 fuusiosekvensseistä, kuten betagalaktosidaasista tai • · · • ·] superoksididismutaasista (SOD), mieluummin SOD:sta. Menetelmiä ««··« ja vektoreita, jotka ovat hyödyllisiä sellaisten polypeptidien • · « ·...* tuottamiseksi, jotka sisältävät SOD:n fuusiosekvenssejä, • · · kuvataan EP-julkaisussa numero 0196056, joka on julkaistu 30 lokakuun 1 päivänä, 1986. Vektoreita, jotka koodaavat SOD:n ·;··· fuusiopolypeptidejä ja HCV-polypeptidejä, s.o.
·’**· NANBs-x-i, NANBei, ja C100-3, joka on koodattu HCV:n cDNArojen • · · ·. yhdistelmässä, kuvataan osissa IV.B.l., IV.B.2. ja vastaavasti ··· ·*·* IV.B.4.. Mikä tahansa HCV:n cDNA:n osa, joka sisältää avoimen • · · ' -* • · *·.·* 3 5 lukualueen, kummassa tahansa säikeessä, voidaan saada yhdistelmäpolypeptidinä, kuten maturaattina tai • · · • *·tj fuusioproteiinina; vaihtoehtoisesti cDNA:hän koodattu • · polypeptidi voidaan saada aikaan kemiallisella synteesillä.
33 107620
Haluttua polypeptidiä koodaava DNA, joko fuusioidussa tai maturoidussa muodossa ja sisältäen signaalisekvenssin salliakseen erityksen tai ollen sisältämättä, voidaan liittää 5 ekspressiovektoreihin, jotka ovat sopivia mitä tahansa sopivia isäntiä varten. Sekä eukariootti- että prokariootti-isän-täjärjestelmiä käytetään nykyään muodostettaessa yhdistelmä-polypeptidejä ja tiivistelmä muutamista yleisemmin käytetyistä säätöjärjestelmistä ja isäntäsolulinjöistä on annettu osassa 10 III.A. alla. Polypeptidi eristetään sitten hajotetuista soluista tai viljelyväliaineesta ja puhdistetaan siinä määrin kuin tarvitaan sen aiottua käyttöä varten. Puhdistus voidaan tehdä tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi suolafraktioinnilla, ioninvaihtohartseilla kromatografoimalla, 15 affiniteettikromatografiällä, linkoamalla ja sen kaltaisilla.
Katso esimerkiksi: Methods in Enzymology lukuisia proteiinien puhdistusmenetelmiä varten. Sellaisia polypeptidejä voidaan käyttää diagnostisina välineinä tai niitä, jotka neutraloivat vasta-aineita, voidaan muodostaa rokotteiksi. Näitä polypepti-20 dejä vastaan syntyneitä vasta-aineita voidaan myös käyttää diagnostiikassa ja passiivisessa immunoterapiassa. Lisäksi, kuten keskustellaan osassa II.J. alla, näiden polypeptidien vasta-aineet ovat hyödyllisiä HCV-partikkeleiden eristämisessä ja tunnistamisessa.
:*·*: 25 • · HCV-antigeenejä voidaan eristää myös HCV-virioneista. Virioneja .♦··. voidaan kasvattaa HCV-infektoiduissa soluissa kudosviljelmässä • »
Hl tai infektoidussa isännässä.
• · • · • · · 30 II.C. Antigeenisten polypeptidien valmistaminen ia konjugaatio * * kantajan kanssa • · · • · ··· .i. Polypeptidin antigeeninen alue on yleensä suhteellisen pieni - ·«·» .·♦·. tyypillisesti pituudeltaan 8-10 aminohappoa tai vähemmän.
• · [·] 35 Niinkin vähästä kuin 5 aminohaposta koostuvat fragmentit voivat • · karakterisoida antigeenisen alueen. Nämä segmentit voivat • ♦ ·.**: vastata HCV-antigeenin alueita. Niinpä, käyttäen HCV:n cDNA:oita pohjana, DNA:ja koodaavia HCV-polypeptidien lyhyitä 34 107620 segmenttejä voidaan ekspressoida yhdistelmänä joko fuusiopro-teiineina tai eristettyinä polypeptideinä. Lisäksi lyhyitä aminohapposekvenssejä voidaan saada sopivasti kemiallisella synteesillä. Esimerkiksi missä syntetisoitu polypeptidi on 5 muotoiltu oikein saadakseen aikaan oikean epitoopin, mutta on liian pieni ollakseen immunogeeninen, polypeptidi voidaan liittää sopivaan kantajaan.
Lukuisia tekniikoita sellaisen liitoksen saamiseksi on tunnettu 10 alalla, mukaanlukien disulfidiliitoksien muodostamisen käyttäen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)propionaattia (SPDP) ja sukkinimidyyli 4-(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-1-karboksylaattia (SMCC), joita saadaan Pierce Company'sta, Rockford, Illinois (jos peptidissä ei ole sulfhydryyliryhmää, 15 se voidaan varustaa lisäämällä kysteiinijäännös). Nämä reagenssit luovat disulfidiliitoksen itsensä ja peptidin kysteiini jäännöksen välille yhdessä proteiinissa ja amidiliitoksen lysiinin epsilonaminon kautta tai muun vapaan, toisessa ryhmässä olevan aminoryhmän kautta. Tunnetaan lukuisia 20 sellaisia disulfidi/amidin muodostavia aineita. Katso esimerkiksi Immun. Rev. (1982) 62:185. Muut kaksitoimiset kytkentäaineet muodostavat pikemminkin tioeetteri- kuin disulfidikytkentöjä. Monet näistä tioeettereitä muodostavista aineista ovat kaupallisesti saatavia ja sisältävät 6-maleiini-25 imidokaproiinihapon, 2-bromietikkahapon, 2-jodietikkahapon, 4- • · (N-maleiini-imidometyyli) sykloheksaani-1-karboksyylihapon ja sellaisten reaktiiviset esterit. Karboksyyliryhmät voidaan ”1 aktivoida yhdistämällä ne sukkinimidin tai l-hydroksyyli-2- ***** nitro-4-sulfonihapon natriumsuolan kanssa. Edellisen listan ei 30 ole tarkoitettu olevan tyhjentävä ja nimettyjen yhdisteiden ***** muunnoksia voidaan vapaasti käyttää.
• · · • · • · ·
Voidaan käyttää mitä tahansa kantajaa, joka ei itse aiheuta [··*. isännälle haitallisten vastaaineiden tuotantoa. Sopivat • · *!* 35 kantajat ovat tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia • · · ·...· makromolekyylejä, kuten proteiineja; polysakkarideja, kuten « · :/♦· lateksilla funktionalisoitua sefaroosia, agaroosia, selluloo saa, selluloosapalloja ja sen kaltaisia; polymeerisiä amino- 35 107620 happoja, kuten polyglutaamihappo, polylysiini ja sen kaltaiset; aminohappokopolymeerejä; ja inaktiivisia viruspartikkeleita, katso esimerkiksi osaa II.D. Erityisen hyödyllisiä proteiinikantajia ovat seerumialbumiinit, "keyhole limpet"-5 hemosyaniini, immunoglobuliinimolekyylit, tyroglobuliini, ovalbumiini, jäykkäkouristustoksoidi, ja muut proteiinit, jotka ovat hyvin tunnettuja alan ammattilaiselle.
II.D. HCV-epitooppeja sisältävien hybridipartikkeli-immuno-10 geenien valmistaminen HCV:n epitooppien immunogeenisyyttä voidaan myös vahvistaa valmistamalla ne imettäväis- tai hiivajärjestelmässä, jotka on fuusioitu tai asennettu siten, että niissä on partikkeleita 15 muodostavia proteiineja, kuten esimerkiksi se, joka liittyy hepatitis-B:n pinta-antigeeniin. Rakenteet, joissa NANBV-epitooppi on liitetty suoraan partikkeleita muodostavaa proteiinia koodaaviin sekvensseihin, tuottavat hybridejä, jotka ovat immunogeenisiä HCV-epitoopin suhteen. Lisäksi kaikki 20 valmistetut vektorit sisältävät HBV:lle spesifisiä epitooppeja, joissa on vaihteleva määrä immunogeenisyyttä, kuten esimerkiksi pre-S-peptidi (pre surface protein). Täten partikkeleita ···. muodostavista proteiineista rakennetut partikkelit, jotka proteiinit sisältävät HCV-sekvenssejä, ovat immunogeenisiä .1 . 25 H CV: n ja HBV:n suhteen.
• · · « · • · ♦ · · · ·
Hepatitiksen pinta-antigeenien (HBSAg) on osoitettu muodostuvan ja liittyvän S. cerevisiae:n partikkeleihin (Valenzuela et ai.
• « « (1982)) ja myös esimerkiksi imettäväissoluihin (Valenzuela, P., 30 et ai. (1984)). Sellaisten partikkeleiden muodostumisen on *:*·: osoitettu vahvistavan monomeerialayksikön immunogeenisyyttä.
·***· Rakenteet voivat myös sisältää hepatitiksen pinta-antigeenin ·♦· *. immunodominantin epitoopin, joka käsittää ennen pintaa (pre-S) • t · ·;;; olevan alueen 55 aminohappoa. Neurath et ai. (1984). Ennen • · *”·* 35 pintaa olevia hepatitiksen pinta-antigeenipartikkeita, jotka ovat ekspressoitavissa hiivassa, esitetään EP-julkaisussa ··» ·*•>j 174,444, joka on julkaistu 19.03.1986; hybridejä, jotka • · sisältävät heterologisia virussekvenssejä hiivaekspressiota 36 107620 varten, on esitetty EP-julkaisussa 175,261, joka on julkaistu 26.03.1986. Molemmat julkaisut ovat tämän julkaisun hakijan nimissä ja niihin viitataan tässä. Rakenteet voivat olla ekspressoituja imettäväissoluissa, kuten kiinalaisen hamsterin 5 munararjasoluissa (CHO) käyttäen SV40-dihydrofolaatti-reduk-taasivektoria (Michelle et ai. (1984)).
Lisäksi osia partikkeleita muodostavaa proteiinia koodaavasta sekvenssistä voidaan vaihtaa kodoneihin, jotka koodaavat HCV-10 epitooppia. Tässä vaihdossa alueet, joita ei vaadita välittämään yksiköiden yhdistämistä immunogeenisien partik-keleiden muodostamiseksi hiivoissa tai imettäväisissä, voidaan poistaa välttäen täten ylimääräisten HBV-antigeenipaikkojen kilpailu HCV-epitoopin kanssa.
15 II.E. poistettu II.F. poistettu 20 II.G. Vasta-aineiden valmistaminen HCV-epitooppeja vastaan
Immunogeenisiä polypeptidejä, jotka on valmistettu yllä kuvatusti, käytetään tuottamaan vasta-aineita, sekä polyk- • · · lonaalisia että monoklonaalisia. Jos halutaan polyklonaalisia 25 vasta-aineita, valittu imettäväinen (esimerkiksi hiiri, kani, • · vuohi, hevonen jne.) immunoidaan immunogeenisellä polypep- • · ... tidillä, joka kantaa HCV-epitooppeja. Seerumia immunoidusta • · l” eläimestä kerätään ja sitä käsitellään tunnetuilla menet- • · telytavoilla. Jos seerumi, joka sisältää polyklonaalisia vasta- 30 aineita HCV-epitoopille, sisältää vasta-aineita muille antigee- *’ : neille, polyklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa • · « immunoaffiniteettikromatografiällä. Tekniikat polyklonaalisen antiseerumin tuottamiseksi ja käsittelemiseksi ovat alalla [···. tunnettuja, katso esimerkiksi Mayer ja Walker (1987) .
• · *:* 35 ·...· Vaihtoehtoisesti polyklonaaliset vasta-aineet voidaan eristää • · J.’*: imettäväisestä, joka on aikaisemmin infektoitu HCVrllä.
Esimerkki HCV-epitooppien vasta-aineiden puhdistusmenetelmästä 37 107620 infektoidun yksilön seerumista, perustuen affiniteettik-romatografiaan ja käyttäen SOD:n fuusiopolypeptidiä ja poly-peptidiä, joka on koodattu kloonin 5-1-1 cDNA:ssa, on esitetty osassa V.E.
5
Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HCV-epi-tooppeja vastaan, voi myös tuottaa helposti alan ammattimies. Yleiset menetelmät monoklonaalisten vasta-aineiden tekemiseksi hybridoomien kautta ovat hyvin tunnettuja. Kuolemattomia vasta-10 aineita tuottavia solulinjoja voidaan luoda solufuusiolla ja myös muilla tekniikoilla, kuten suoralla B-lymfosyyttien transformaatiolla onkogeenisellä DNA:11a tai Epstein-Barr-viruksen avulla tehtävällä transfektiolla. Katso esimerkiksi M.Schreier et ai. (1980); Hammerling et ai. (1981); Kennett et 15 ai. (1980); katso myös US-patentteja numerot 4,371,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444, 887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 ja 4,493,890. HCV-epitooppeja vastaan tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden sarjoja voidaan seuloa eri ominaisuuksien suhteen; s.o. isotyypin, epitoopin affiniteetin 20 jne. suhteen.
Vasta-aineet, sekä monoklonaaliset että polyklonaaliset, jotka ·*·. ovat suunnattuja HCV-epitooppeja vastaan, ovat erityisen hyödyllisiä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää • · · .1'.t 25 erityisesti synnyttämään anti-idiotyypin vasta-aineita.
• · • ·
Anti-idiotyypin vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, joissa on • · *···* "sisäinen kuva" infektoivan aineen, jota vastaan suojaa »** halutaan, antigeenistä. Katso esimerkiksi Nisonoff, A., et ai. 30 (1981) ja Dreesman et ai. (1985) .
• · ·*'*: Tekniikat anti-idiotyypin vasta-aineiden synnyttämiseksi ovat ·· · alalla tunnettuja. Katso esimerkiksi Grzych (1985), MacNamara et ai. (1984), ja Uytdehaag et ai. (1985). Nämä anti-idiotyypin • · *···* 35 vasta-aineet voivat olla myös hyödyllisiä NANBH:n hoidossa ja myös HCV-antigeenien immunogeenisten alueiden selventämisessä.
• · • · · • · · • · 38 107620 II.H. Diagnostiset oligonukleotidikoettimet ja välinesarjat Käyttäen eristettyjä HCV:n cDNA:ojen esitettyjä osia, mukaanlukien ne, jotka on esitetty kuvioissa 1-32, pohjana, voidaan 5 valmistaa oligomeerejä, joissa on noin 8 nukleotidia tai enemmän, joko pätkimällä tai synteettisesti, jotka oligomeerit hybridisoituvat HCV-genomin kanssa ja ovat hyödyllisiä virusaineiden tunnistamisessa, virusgenomien lisäkarak-terisoinnissa ja myös virusten havaitsemisessa sairaissa 10 yksilöissä. HCV-polynukleotidejä varten olevien koettimien (joko luonnollisten tai johdettujen) pituudet ovat sellaisia, että ne sallivat ainutkertaisten virussekvenssien osoittamisen hybridisaation avulla. Kun 6-8 nukleotidia voi olla toimiva pituus, pidetään 10-12 nukleotidin sekvenssejä parempana ja 15 noin 20 nukleotidia näyttää olevan optimi. Mieluummin nämä sekvenssit ovat peräisin alueilta, joissa ei ole heterogeenisyyttä. Nämä koettimet voidaan valmistaa käyttäen rutiinimenetelmiä, sisältäen automatisoidut oligonukleotidin synteettiset menetelmät. Hyödyllisten koettimien joukossa ovat 20 esimerkiksi klooni 5-1-1 ja muut tässä esitetyt kloonit ja myös eri oligomeerit, jotka ovat hyödyllisiä cDNA-kirjastoja tutkittaessa, ja joita on kuvattu alla. Minkä tahansa HCV-geno- ... min ainutkertaisen osan komplementti on myös tyydyttävä. Käy- • · **' tettäväksi koettimina on täydellinen komplementaarisuus • · · ·''* 25 toivottavaa, vaikka se voi olla tarpeetonta, kun fragmentin • · · J .* pituus kasvaa.
• · · · « • · ·
Sellaisten koettimien käyttämiseksi diagnostiikassa, biologista analysoitavaa näytettä, kuten verta tai seerumia, käsitellään 30 haluttaessa sen sisältämien nukleiinihappojen uuttamiseksi.
Näytteestä tuloksena olevat nukleiinihapot voidaan alistaa .···. geelielektroforeesiin tai johonkin muuhun koon mukaan ♦ • erottelevaan tekniikkaan; vaihtoehtoisesti nukleiinihapponäyte voidaan pisteblotata ilman kokoerottelua. Koettimet leimataan ··· 35 sitten. Sopivat leimat ja koettimien leimausmenetelmät ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi radioaktiiviset ··· .·. : leimat, jotka on liitetty nicktranslaation tai kinaasion • ♦ · avulla, biotiinin, fluoresoivat koettimet ja kemiluminisoivat 39 107620 koettimet. Näytteestä uutettuja mukleiinihappoja käsitellään sitten leimatulla koettimella sopivan tiukoissa hybridisaatio-olosuhteissa.
5 Koettimet voidaan tehdä täysin komplementaarisiksi HCV-geno-mille. Siksi hyvin tiukat olosuhteet ovat toivottavia väärien positiivisten estämiseksi. Kuitenkin hyvin tiukkoja olosuhteita tulisi käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia sellaiselle virusgenomin alueelle, jossa ei ole hete-10 rogeenisyyttä. Hybridisäätiön tiukkuuden määrittävät lukuisat hybridisaation aikaiset ja pesumenettelyn aikaiset tekijät, mukaanlukien lämpötila, ionivahvuus, ajan pituus ja formamidin pitoisuus. Näitä tekijöitä on hahmotellut esimerkiksi Maniatis, T. (1982) .
15
Yleisesti on odotettavissa, että HCV-genomia on läsnä infektoituneiden yksilöiden seerumissa suhteellisen alhaisina tasoina, s.o. tasolla noin 102-103 sekvenssiä ml:aa kohti. Tämä taso voi vaatia, että hybridisaatioanalyysissä käytetään 20 amplifikaatiotekniikkaa. Sellaiset tekniikat ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporation'in "Bio-Bridge"-järjestelmä käyttää terminaalista deoksinukleotidi-.***: transferaasia modifioimat toman 3 '-poly-dT-häntien lisäämiseksi • t· ·*·*; DNA-koettimeen. Poly dT-häntäinen koetin hybridi soidaan • 25 kohdenukleotidisekvenssiin ja sitten biotiinimodifioituun poly-A:hän. PCT-hakemus 84/03250 ja EP-julkaisu 124221 kuvaavat DNA- • « ...# hybridisaatioanalyysiä, jossa: (1) analyytti lämpökäsitellään • · yksisäikeiseksi DNA-koettimeksi, joka on komplementaarinen • · *···* entsyymileimatulle olinukleotidille; ja (2) tuloksena oleva 30 hännällinen dupleksi hybridisoidaan entsyymileimattuun *:**· oligonukleotidiin. EP-julkaisu 204510 kuvaa DNA-hybridisaatio- «·· analyysiä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen kanssa, jolla on häntä, kuten poly- dT-häntä, [·**. amplifikaatiosäie, jossa on sekvenssi, joka hybridisoituu • · Ί* 35 koettimen häntään, kuten poly-A-sekvenssi, ja joka voi sitoa ··· useita leimattuja säikeitä. Erityisen haluttava tekniikka voi • · :/·· ensin käsittää seerumissa kohteena olevien HCV-sekvenssien amplifikaation noin 10000-kertaiseksi, s.o. noin 106 40 107620 sekvenssiin/ml. Tämä voidaan tehdä esimerkiksi tekniikalla, jonka esitti Saiki et ai. (1986). Amplifioidut sekvenssit voidaan sitten osoittaa käyttäen hybridisaatioanalyysiä, jota on kuvattu vireillä olevassa US-hakemuksessa, joka jätettiin 5 15.10.1987, asiamiehen numero 2300-0171, ja joka on saman hakijan nimissä kuin tämäkin keksintö ja johon viitataan tässä. Tämä hybridisaatioanalyysi, jonka tulisi havaita sekvenssit tasolla 106/ml, käyttää nukleiinihappomultimeerejä, jotka sitoutuvat yksisäikeiseen analyyttinukleiinihappoon ja jotka 10 sitoutuvat myös moniin yksisäikeisiin leimattuihin oligonukleotideihin. Sopivaa liuosmuotoista sandwich-analyysiä, jota voidaan käyttää leimattujen polynuk-leotidikoettimien kanssa ja menetelmiä koettimien valmistamiseksi on kuvattu EP-julkaisussa 225,807, joka on julkaistu 15 16.6.1987, jonka hakija on sama kuin tämän keksinnön hakija ja johon tässä viitataan.
Koettimet voidaan pakata diagnostisiksi välinesarjoiksi.
Diagnostiset välinesarjät sisältävät koetin-DNA:n, joka voi 20 olla leimattu; vaihtoehtoisesti koetin-DNA voi olla leimaamaton ja leimaamistarvikkeet voivat sisältyä välinesarjaan.
Välinesarja voi myös sisältää muita sopivasti pakattuja ... reagensseja ja materiaaleja, joita tarvitaan tiettyä hybri- ’”· disaatiotoimintatapaa varten, esimerkiksi standardeja ja myös • · « ·* 25 ohjeet kokeen suorittamiseksi.
• · · t · · • · • · II. I. Immunologinen analyysi ia diagnostiset välinesarjat • · · • · • · ·*·
Sekä polypeptidit, jotka reagoivat immunologisesti HCV-vasta-30 aineita sisältävän seerumin kanssa, esimerkiksi ne, jotka ovat peräisin osassa IV.A. kuvatuista klooneista tai jotka ovat .···. niissä koodattuja ja niiden kompositiot (ks. osa IV.A.) ja *·' vasta-aineet, jotka ovat syntyneet näissä polypeptide is sä olevia HCV-spesifisiä epitooppeja vastaan, ks. esimerkiksi osa ··· . :...* 35 IV.E., ovat hyödyllisiä immunologisissa analyyseissä HCV-vasta- .*·*, aineiden läsnäolon osoittamiseksi tai viruksen ja/tai • * .·, ; virusantigeenien osoittamiseksi biologisissa näytteissä, • · · sisältäen esimerkiksi veri- ja seeruminäytteet. Immunologisten 41 107620 analyysien suunnittelu on suuren vaihtelun kohde ja näitä tunnetaan alalla lukuisia. Esimerkiksi immunologinen analyysi voi käyttää yhtä virusantigeeniä, esimerkiksi polypeptidiä, joka on peräisin mistä tahansa kloonista, joka sisältää HCV:n 5 cDNA:ta, jota kuvataan osassa IV.A. tai yhdistelmä-cDNA:öistä, jotka ovat peräisin näissä klooneissa olevasta cDNA:sta tai HCV-genomista, josta näiden kloonien cDNA on peräisin; vaihtoehtoisesti immunologinen analyysi voi käyttää virusantigee-nien yhdistelmää, jotka antigeenit ovat peräisin näistä lähiö teistä. Se voi käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta- ainetta, joka on suunnattu virusepitooppeja vastaan, monok-lonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää, joka on suunnattu yhtä virusantigeeniä vastaan, monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnatut erilaisia virusantigeenejä vastaan, 15 polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu samaa virusantigeeniä vastaan tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja eri virusantigeenejä vastaan. Toimintatavat voivat perustua esimerkiksi kilpailuun, tai suoraan reaktioon tai sandwich-tyyppiseen analyysiin. Toimintatavat 20 voivat myös käyttää esimerkiksi kiinteitä kantajia tai ne voivat käyttää immunosaostusta. Useimmat analyysit käsittävät leimatun vasta-aineen tai polypeptidin käytön; leimat voivat /*’· olla esimerkiksi fluoresoivia, kemiluminisoivia, radioak- • · · tiivisia tai värillisiä molekyylejä. Analyysit, jotka vahvis- ··.·. 25 tavat koettimelta tulevat signaalit, ovat myös tunnettuja; • ♦ joista esimerkkejä ovat analyysit, jotka käyttävät biotiinia ja • · ... avidiinia ja entsyymileimattuja ja entsyymivälitteisiä • * immunologisia analyysejä, kuten ELISA-analyysiä.
• · • · • ·· 30 Flavivirusmalli HCV:tä varten sallii ennustamiset koskien diagnostisten epitooppien todennäköistä sijaintia virionin *e]]s rakenteellisia proteiineja varten. C-, pre-M-, M- ja E-alueet )·, sisältävät kaikki todennäköisesti merkittävän voimakkaita « epitooppeja virusantigeenien osoittamiseksi ja erityisesti ‘Γ 35 diagnoosia varten. Samoin odotetaan ei-rakenneproteiinien ··· :...: alueiden sisältävän tärkeitä diagnostisia epitooppeja (esi- merkiksi NS5, joka koodaa oletettua polymeraasia; ja NS1, joka koodaa oletettua komplementtia sitovaa antigeeniä).
42 107620
Yhdistelmäpolypeptidit tai viruspolypeptidit, jotka sisältävät epitooppeja näiltä erityisiltä alueilta, voivat olla hyödyllisiä virusvasta-aineiden osoittamiseksi sairaista verenluovuttajista ja sairaista potilaista.
5
Lisäksi vasta-aineita, jotka ovat suunnatut E- ja/tai M-proteiineja vastaan, voidaan käyttää immunologisissa analyyseissä virusantigeenien osoittamiseksi potilaissa, joilla on HCV:n aiheuttama NANBH ja sairaissa verenluovuttajissa. Vielä 10 nämä vasta-aineet ovat äärimmäisen hyödyllisiä akuutin vaiheen luovuttajien ja potilaiden havaitsemisessa.
Välinesarjat, jotka ovat sopivia immunologisia diagnooseja varten ja jotka sisältävät sopivasti leimattuja reagensseja, 15 ovat rakennetut pakkaamalla sopivat materiaalit mukaanlukien keksinnön polypeptidit, jotka sisältävät HCV-epitooppeja tai HCV-epitooppeja vastaan suunnattuja vasta-aineita sopivissa astioissa yhdessä niiden muiden reagenssien ja materiaalien kanssa, joita vaaditaan analyysin suorittamiseksi ja myös 20 sopivat analyysiohjeet.
II.J. HCV-genomin, virionien ja virusantigeenien lisäkarak- .***· terisointi käyttäen koettimia, jotka ovat peräisin virusgenomin ··· cDNA: s ta • » ·· · 25 % » « » · * \ HCV:n cDNA-sekvenssitietoa klooneissa, joita kuvataan osassa • · ... IV.A. , kuten on esitetty kuvioissa 1-32, voidaan käyttää • · *“·’ saamaan lisää tietoa HCV-genomin sekvenssistä ja tunnistamaan • · *···’ ja eristämään HCV-aine ja täten se auttaa karakterisoinnissaan 30 sisältäen genomin luonteen, viruspartikkelin rakenteen ja niiden antigeenien luonteen, joista se koostuu. Tämä tieto
• M
vuorostaan voi johtaa lisämäärään polynukleotidikoettimia, polypeptidejä, jotka ovat peräisin HCV-genomista ja vasta- *\\\ aineita HCV-epitooppeja vastaan, jotka voisivat olla hyödyl- • * *;* 35 lisiä HCV:n aiheuttaman NANBH:n diagnoosissa ja/tai hoidossa.
• · · • « • · *·· !**.: Yllämainittujen kloonien..cDNA-sekvenssitieto on hyödyllinen suunniteltaessa koettimia lisä-cDNA-sekvenssien erottamiseksi, 43 107620 jotka ovat peräisin HCV-genomien vielä tunnistamattomilta alueilta, joista genomeista cDNA:t osassa IV.A. kuvatuissa klooneissa ovat peräisin. Esimerkiksi leimattuja koettimia, jotka sisältävät noin 8 tai enemmän nukleotidin sekvenssin ja 5 mieluummin 20 tai enenmmän nukleotidin sekvenssin, jotka nukleotidit ovat peräisin alueilta, jotka ovat lähellä kuvioissa 1, 3, 6, 9, 14 ja 32 esitettyjen HCV:n cDNA-sekvenssien perheen 5'-päätä tai 3'-päätä, voidaan käyttää eristämään päällekkäin meneviä cDNA-sekvenssejä HCV:n cDNA-kirjastoista.
10 Näitä sekvenssejä, jotka menevät päällekkäin yllämainituissa klooneissa olevien cDNA:ojen kanssa, mutta jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka ovat peräisin genomin alueilta, joista cDNA yllämainituissa klooneissa ei ole peräisin, voidaan sitten käyttää koettimien syntetisoimiseen muiden päällekkäin menevien 15 fragmenttien tunnistamiseen, jotka fragmentit eivät välttämättä mene päällekkäin osassa IV.A. kuvattujen kloonien cDNA:ojen kanssa. Ellei HCV-genomi ole segmentoitu ja segmenteillä ei ole yhteisiä sekvenssejä, on mahdollista sekventoida koko virusgenomit käyttäen virusgenomista johdettujen päällekkäin 20 menevien cDNA:ojen eristystekniikkaa. Vaikkakin on epätodennäköistä, jos genomi on segmentoitu genomi, jossa ei ole yhteisiä sekvenssejä, genomin sekvenssi voidaan määrittää seulomalla serologisesti lambda-gtll:ssä olevia HCV:n cDNA- • ♦ · kirjastoja, kuten käytettiin kloonin 5-1-1 eristämiseen, » · · 25 sekventoimalla cDNA-eristeitä ja käyttämällä eristettyjä • · cDNA:oja päällekkäin menevien fragmenttien eristämiseen • · ... käyttäen tekniikkaa, jota kuvattiin osassa IV.A. kuvattujen • · ’···* kloonien eristämiseen ja sekventointiin. Vaihtoehtoisesti • · *···* genomi segmenttien karakterisointi voitaisiin tehdä virus- 30 genomeista, jotka on eristetty puhdistetuista HCV-partik- t keleistä. Menetelmiä HCV-partikkeleiden puhdistamiseksi ja niiden osoittamiseksi puhdistusmenettelyn aikana kuvataan tässä alla. Menettelyt polynukleotidigenomien eristämiseksi viruspartikkelista ovat tunnettuja alalla ja eräs käyttökel- *;* 35 poinen menetelmä on esitetty Esimerkissä IV.A.l. Eristetyt • · · Σ...Σ genomi segment it voitaisiin sitten kloonata ja sekventoida.
Täten tässä annetun tiedon nojalla on mahdollista kloonata ja sekventoida HCV-genomeita niiden luonteesta riippumatta.
44 107620
Menetelmät cDNA-kirjastojen luomiseksi ovat alalla tunnettuja ja niistä keskustellaan ylempänä ja alempana; menetelmästä HCV:n cDNA-kirjaston luomiseksi lambda-gtll-vektoriin, kes-5 kustellaan alla osassa IV.A. Kuitenkin cDNA-kirjastoja, jotka ovat käyttökelpoisia nukleiinihappokoettimilla seulomiseen, voidaan myös rakentaa muilla alalla tunnetuilla vektoreilla, esimerkiksi lambda-gtlO:llä (Huynh et ai. (1985)). HCV:Stä peräisin oleva cDNA, jonka kuvioiden 1-32 cDNA:sta ja näistä 10 cDNA:sta johdetuista polynukleotideista syntetisoiduista koettimista peräisin olevat koettimet havaitsevat, voidaan eristää kloonista katkomalla eristetty polynukleotidi sopivilla restriktioentsyymeillä ja sekventoimalla. Katso esimerkiksi osista IV.A.3. ja IV.A.4. tekniikoita, joita käytetään sen 15 HCV-.n cDNA:n eristämiseen ja sekventointiin, mikä menee päällekkäin kloonin 5-1-1 HCV:n cDNA:n kanssa, osista IV.A.5. -IV.A.7. sen HCV:n cDNA:n eristystä ja sekventointia, mikä menee päällekkäin kloonin 81 cDNA:n kanssa ja osista IV.A.8. ja IV.A.9. sen kloonin eristämistä ja sekventoimista, mikä menee 20 päällekkäin toisen kloonin kanssa (klooni 36), mikä menee päällekkäin kloonin 81 kanssa.
Näistä päällekkäin menevistä HCV:n cDNA:sta johdettu sek-venssitieto on hyödyllinen määritettäessä homologia- ja • 25 heterogeenisyysalueita virusgenomeissa, jotka voisivat merkitä • · genomin erilaisen kannan läsnäoloa ja/tai viallisten • · partikkeleiden populaatioiden läsnäoloa. Hybridisaatiokoet- • · V.‘. timien suunnittelulle on myös hyödyllistä havaita HCV ja HCV- • · *·** antigeenit tai HCV-nukleiinihapot biologisissa näytteissä ja 30 HCV:n eristämisen aikana (mistä keskustellaan alla), käyttäen * * osassa II.G. kuvattua tekniikkaa. Vielä päällekkäin meneviä ··· *...· cDNA-.oita voidaan käyttää luomaan ekspressiovektoreita polypeptideille, jotka ovat peräisin HCV-genomeista, jotka myös • · · · .···. koodaavat polypeptidejä, jotka on koodattu klooneissa 5-1-1, • · ’·* 35 36, 81 ja 1-2 ja muissa osassa IV.A. kuvatuissa klooneissa.
Tekniikat näiden polypeptidien, jotka sisältävät HCV- » · epitooppeja, ja sellaisten vasta-aineiden luomiseksi, jotka ovat suunnatut niihin sisältyviä HCV-epitooppeja vastaan ja 45 107620 myös niiden käytöt ovat analogisia niille, joita kuvattiin polypeptidejä varten, jotka ovat peräisin NANBV:n cDNA-sekvensseistä, jotka sisältyivät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 1-2, 81 ja 91, joista on keskusteltu yllä ja alla.
5 cDNA-sekvenssien perheeseen, jotka sekvenssit sisältyvät klooneihin 5-1-1, 32, 35, 36, 81, 91, 1-2 ja muihin osassa IV.A. kuvattuihin klooneihin, koodattuna on antigeenejä, jotka sisältävät epitooppeja, jotka näyttävät olevan ainutkertaisia 10 HCV:lie; s.o. vasta-aineet, jotka ovat suunnatut näitä antigeenejä vastaan ovat poissa yksilöistä, joilla on HAV- tai HBV-tartunta ja yksilöistä, joilla ei ole HCV-tartuntaa (ks. osassa IV.B. esitettyä serologista tietoa). Lisäksi näiden cDNA:ojen sekvenssitiedon vertailu HAVm, HBV:n, HDV.-n ja 15 Genebank'in genomisekvenssien kanssa osoittaa, että näiden cDNA:ojen ja noiden lähteiden polynukleotidisekvenssien välillä vallitsee minimaalinen homologia. Täten vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä antigeenejä vastaan, jotka ovat koodatut näiden kloonien cDNA:ssa, voidaan käyttää BB-NANBV-20 partikkeleiden tunnistamiseen, jotka ovat eristettyjä sairaista yksilöistä. Lisäksi ne ovat myös hyödyllisiä NANBHm aiheuttajien eristämisessä.
♦ · · • # ««· HCV-partikkelit voidaan eristää seerumista, joka on peräisin :·.·. 25 yksilöistä, joilla on BB-NANBV-tartunta tai soluviljelmistä, « · millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, sisältäen • · ... esimerkiksi tekniikat, jotka perustuvat koon valintaan, kuten • · *“·* saostamis- tai poissulkemismenetelmät tai tekniikat, jotka • · *···* perustuvat tiheyteen, kuten ultralinkous tiheysgradienteissa 30 tai saostus aineilla, kuten polyetyleeniglykoli tai kromato-grafia lukuisilla materiaaleilla, kuten anionin- tai katio- • · · ninvaihtomateriaaleilla ja materiaaleilla, jotka sitoutuvat hydrofobisuuden takia ja myös af f initeteettipyl väillä. Eris-tystä suoritettaessa voidaan HCV:n läsnäolo havaita uutetun • » *1* 35 genomin hybridisaatioanalyysillä käyttäen koettimia, jotka ovat • · · :...: peräisin yllä kuvatuista HCV:n cDNA:öistä tai immunologisella analyysillä (ks. osa II.I.) käyttäen koettimina vasta-aineita, jotka ovat suunnatut niitä HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat 46 107620 koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cDNA-sekvenssien perheessä ja jotka ovat myös suunnattuja niitä HCV-antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja yllä keskustelluissa päällekkäin menevissä HCV:n cDNA-sekvensseissä. Vasta-aineet voivat olla 5 monoklonaalisia tai polyklonaalisia ja voi olla toivottavaa puhdistaa vasta-aineet ennen niiden käyttöä immunologisessa analyysissä. Puhdistusmenettelyä polyklonaalisia vasta-aineita varten, jotka ovat suunnattuja sellaisia antigeenejä vastaan, jotka on koodattu kloonissa 5-1-1, kuvataan osassa IV. E; 10 analogisia puhdistusmenettelyjä voidaan käyttää sellaisia vasta-aineita varten, jotka ovat suunnattuja muita HCV-antigeenejä vastaan.
Vasta-aineet, jotka ovat suunnattuja HCV-antigeenejä vastaan, 15 jotka ovat koodattuja kuvioissa 1-32 esitettyjen cDNArojen perheessä ja myös niitä vastaan, jotka ovat koodattuja päällekkäin menevissä HCV:n cDNAroissa, jotka ovat kiinnitettyjä kiinteisiin kantajiin, ovat hyödyllisiä HCV:n eristämiseksi immunoaffiniteettikromatografiällä. Tekniikat immunoaffini-20 teettikromatografiaa varten ovat alalla tunnettuja ja sisäl tävät tekniikat vasta-aineiden kiinnittämiseksi kiinteisiin kantajiin niin, että ne säilyttävät immunoselektiivisen • · · • aktiivisuutensa; tekniikat voivat olla niitä, joissa vasta-aineet adsorboidaan kantajaan (ks. esimerkiksi Kurstak • 25 julkaisussa ENZYME IMMUNODIAGNOSIS, sivut 31-37), ja myös • · niitä, joissa vasta-aineet ovat kantajaan kovalenttisesti • · .♦··. kiinnitettyjä. Yleisesti tekniikat ovat samanlaisia kuin ne, • ·
Hl joita käytetään antigeenien kovalenttiseksi kiinnittämiseksi • · “* kiinteään kantajaan ja joita kuvataan yleisesti osassa II.C.,· 30 kuitenkin kaksitoimisiin kytkentäaineisiin voidaan sisällyttää * ' väliryhmiä niin, että vasta-aineen antigeenin sitoutumispaikka ...* jää saataville.
• · · «·*· .··♦. Puhdistusmenettelyn aikana HCV:n läsnäolo voidaan havaita • · ]*’ 35 ja/tai todentaa nukleiinihappohybridisaation avulla, käyttäen • » *·..* koettimina polynukleotideja, jotka ovat peräisin kuvioissa 1-32 • · esitettyjen HCV:n cDNA-sekvenssien perheestä ja myös-. ..... päällekkäin menevistä HCV:n cDNA-sekvensseistä, joita on 47 107620 kuvattu yllä. Tässä tapauksessa fraktioita käsitellään olosuhteissa, jotka aiheuttaisivat viruspartikkeleidn katkeamisen, esimerkiksi pesuaineilla kelatoivien aineiden läsnäollessa ja virusnukleiinihapon läsnäolo määritetään hybridisaa-5 tietekniikoilla, joita kuvataan osassa II.H. Lisävahvistusta sille, että eristetyt partikkelit ovat aineita, jotka indusoivat HCV:a, voidaan saada infektoimalla simpansseja eristetyillä viruspartikkeleilla, mitä seuraa sen määrittäminen, seuraako tartuttamista NANBH:n oireita vai ei.
10
Viruspartikkelit puhdistetuista valmisteista voidaan sitten karakterisoida edelleen. Genominukleiinihappo on puhdistettu. Perustuen sen herkkyyteen ribonukleaasille, muttei ribonuk-leaasi I:lle, havaitaan, että virus muodostuu RNA-genomista.
15 Katso esimerkki IV.C.2. alla. Säikeettömyys ja ympyränmuotoi-suus tai se, ettei se ole ympyränmuotoinen, voidaan määrittää alalla tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi sen tekemisen näkyväksi elektronimikroskoopin avulla, sen jakaantumisen tiheysgradientteihin ja sen saostumisominaisuudet.
20 Siepatun HCV-genomin hybridisäätiöön HCV:n cDNA:ojen negatiivisiin säikeisiin perustuen käy ilmi, että HCV voi muodostua positiivisista säikeistä koostuvasta RNA-genomista (ks. osa .***: IV.H. 1). Tekniikoita, kuten tässä esitettyjä, kuvataan esi- :*·*: merkiksi julkaisussa METHODS IN ENZYMOLOGY. Lisäksi puhdistettu 25 nukleiinihappo voidaan kloonata ja sekventoida tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen käänteistranskription, koska genomi- • · ·.. materiaali on RNA:ta. Katso esimerkiksi Maniat is (1982) ja • · I" Glover (1985). Käyttäen viruspartikkeleista peräisin olevaa • « ’*··* nukleiinihappoa on mahdollista sekventoida koko genomi riip- 30 pumatta siitä onko se segmentoitu vai ei.
• ·
Yhdistettyjen kloonien 14i-39c (ks. kuvio 26) jatkuvaan * lukualueeseen (ORF) koodattujen polypeptidien homologian .···. tutkiminen osoittaa, että HCV-polypeptidi sisältää homologia- • · *·* 35 alueita f 1 aviviruksien säilyneiden alueiden vastaavien pro- • t · *...· teiinien kanssa. Esimerkki tästä on kuvattu osassa IV.H.3.
• · :.*·· Tällä löydöksellä, on.monta tärkeää seuraamusta. Ensiksi tämä todiste, yhdessä niiden tuloksien kanssa, jotka osoittavat, 48 107620 että HCV sisältää positiivisesti säikeisen genomin, jonka koko on noin 10000 nukleotidia, on yhtäpitävä sen ehdotuksen kanssa, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus. Yleisesti flaviviruksien virioneissa ja niiden genomeissa on suhteellisen 5 yhtäpitävä rakenne ja järjestys, jotka ovat tunnettuja. Katso Rice et ai. (1986) ja Brinton, M.A. (1988). Täten polypeptidejä C, pre-M/M ja E koodaavat rakenteelliset geenit voidaan paikallistaa kloonista 14i ylävirtaan olevan genomin 5'-päähän. Lisäksi käyttäen vertailua muihin flaviviruksiin, voidaan tehdä 10 ennusteita näitä proteiineja koodaavien sekvenssien tarkasta paikasta.
Niiden sekvenssien eristäminen, jotka ovat ylävirtaan päin kloonin 14i sekvensseistä, voidaan täydentää lukuisilla 15 tavoilla, jotka tässä annetun tiedon kanssa olisivat ilmeisiä alan ammattilaiselle. Esimerkiksi genomin "kävelytys"-tekniikkaa voidaan käyttää eristämään muita sekvenssejä, jotka ovat 5'-asemassa kloonin 14i sekvensseihin nähden, mutta jotka menevät päällekkäin tuon kloonin kanssa; tämä vuorostaan johtaa 20 lisäsekvenssien eristämiseen. Tätä tekniikkaa on havainnollistettu kunnolla alla osassa IV.A.. On esimerkiksi myös tunnettua, että flaviviruksissa on säilyviä epitooppeja ja säilyvien nukleiinihapposekvenssien alueita. Polynukleotideja, :*·*: jotka sisältävät säilyviä sekvenssejä, voidaan käyttää 25 koettimina, jotka sitovat HCV-genomin sallien täten sen • · eristämisen. Lisäksi näitä säilyviä sekvenssejä, yhdessä niiden • · kanssa, jotka ovat peräisin kuviossa 22 esitetyistä HCV:n • · .11' cDNA:öistä, voidaan käyttää primereiden suunnitteluun, **** käytettäväksi järjestelmissä, jotka amplifioivat niitä geno- 30 misekvenssejä, jotka sijaitsevat ylävirtaan kloonin 14i * * sekvensseistä, käyttäen polymeraasi-ketjureaktioteknologiaa.
···
Esimerkki tästä on kuvattu alla.
··· • · · · .···. HCV:n rakenne voidan myös määrittää ja sen komponentit eristää.
• · *·* 35 Morfologia ja koko voidaan määrittää esimerkiksi elek- • · · tronimikroskoopilla. Tiettyjen viruspolypeptidiantigeenien, • · ·.*·♦ kuten päällys- tai kuoriantigeenien tai sisäisten antigeenien, kuten nukleiinihappoa sitovat proteiinit, ydinantigeenit ja 49 107620 polynukleotidipolymeraasit, tunnistus ja sijainti voidaan määrittää esimerkiksi määrittämällä, ovatko antigeenit läsnä pääviruskomponentteina vai vähemmistökomponentteina ja myös käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat suunnattuja erityisiä 5 antigeenejä vastaan, jotka ovat koodattuja eristetyissä cDNA:oissa koettimina.
II.K. Soluviljelyjärjestelmät ja eläinmallijärjestelmät HCV-replikaatiota varten 10
Ehdotus, että HCV on flavivirus tai flavityyppinen virus, antaa myös tietoa HCV:n kasvatusmenetelmistä. Termi "flavityyppinen" merkitsee, että viruksessa on merkittävä määrä homologiaa flaviviruksien tunnettujen säilyvien alueiden kanssa ja että 15 suurin osa genomista on yksinkertaista avointa lukualuetta (ORF). Menetelmät flaviviruksien viljelemiseksi ovat tunnettuja alan ammattilaisille (katso esimerkiksi katsauksia Brinton (1986) ja Stollar, V. (1980)). Yleisesti sopivat solut tai solulinjat HCV:n viljelemiseksi voivat sisältää ne, joiden 20 tiedetään tukevan Flaviviruksien replikaatiota, esimerkiksi seuraavat: apinan munuaissoluiinjät (esim. MK2, VERO); sian munuaissolulinjat (esim. PS); nuoren hamsterin munuaissolulinjat (esim. BHK); hiiren makrofaagisolulinjat • · · (esim. P388D1, MK1, Mml); ihmisen makrof aagisolulinjat (esim.
• 25 U-937) ; ihmisen perifeerisen veren leukosyytit; ihmisen kiinnittyvät monosyytit; hepatosyytit tai hepatosyyt- • · tisolulinjat (esim. HUH7, HEPG2) ; sikiöt tai sikiösolut (esim.
• · *” kananpojan sikiön fibroblastit); tai solulinjat, jotka ovat • · *···* peräisin selkärangattomista, mieluummin hyönteisistä (esim.
30 drosophila-soluiinjät), tai vielä mieluummin niveljalkaisista, ♦ *·**· esimerkiksi moskiiton solulinjat (esim. A. Albopictus, Aedes ··· aegypti, Cutex tritaeniorhynchus) tai punkin solulinj öistä (esim. RML-14 Dermacentor parumapertus) .
• · · · ··· • · • · *1* 35 On mahdollista, että primäärisiä hepatosyyttejä voidaan ··· ·...· viljellä ja sitten tartuttaa HCV.-llä; tai vaihtoehtoisesti • · :.*·· hepatosyyttiviljelmät voisivat olla peräisin sairaiden yksi löiden (esim. ihmisten tai simpanssien) maksoista. Jälkimmäinen 50 107620 tapaus on esimerkki solusta, joka on infektoitu in vivo ja siirretään sitten in vitro. Lisäksi voidaan käyttää erilaisia menetelmiä solujen säilyttämiseksi hengissä hepatosyyttivil-jelmistä peräisin olevien solulinjojen saamiseksi. Esimerkiksi 5 primäärisiä maksaviljelmiä (ennen ja jälkeen hepatosyyt- tisolujen rikastamisen) voidaan fuusioida eri soluihin stabii-lisuuden ylläpitämiseksi. Esimerkiksi viljelmiä voidaan infektoida myös transformoivilla viruksilla tai transfektoida transformoivilla geeneillä pysyvien tai puolipysyvien solulin-10 jojen luomiseksi. Lisäksi esimerkiksi maksaviljelmien soluja voidaan fuusioida pysyviin solulinjoihin (esim. HepG2). Solufuusiomenetelmät ovat alalla tunnettuja, esimerkiksi fuusioaineiden, kuten polyetyleeniglykolin, Sendai-viruksen ja Epstein-Barr-viruksen käyttö on tunnettua.
15
Kuten keskusteltiin yllä, HCV on Flavivirus tai Flavityyppinen virus. Siksi on luultavaa, että solulinjojen HCV-infektio voidaan suorittaa tekniikoilla, jotka ovat alalla tunnettuja solujen infektoimiseksi Flaviviruksilla. Nämä sisältävät 20 esimerkiksi solujen inkuboinnin virusvalmisteen kanssa olosuhteissa, jotka sallivat viruksen siirtymisen soluvin. Lisäksi voi olla mahdollista saada virustuotantoa transfektoimalla ·♦· solut eristetyillä viruspolynukleotideilla. On tunnettua, että
Togaviruksien ja Flaviviruksien RNA:t ovat infektoivia lukui- ·*·*. 25 sissa selkärankaisten solulinjoissa (Pfefferkorn ja Shapiro • · (1974)), ja moskiiton solulinjassa (Peleg (1969)). Menetelmät .*··. kudosvilj elmän solujen transf ektoimiseksi RNA-duplekseilla, • « positiivisen kierteen RNA:oilla ja DNAroilla (sisältäen cDNA:t) • · **’ ovat tunnettuja alalla ja sisältävät esimerkiksi tekniikat, 30 jotka käyttävät elektroporaatiota ja saostusta DEAE- * * dekstraanilla tai kalsiumfosfaatilla. Runsas HCV:n RNA:n lähde ··· voidaan saada suorittamalla in vitro transkriptio HCV:n cDNA:lle, joka vastaa koko genomia. Transfektion tällä materi- .···, aalilla tai kloonatulla HCV:n cDNA-.lla tulisi antaa tuloksena • # ·] 35 viruksen replikaatio ja viruksen in vitro lisääntyminen.
• · • · * » · • ·
Viljeltyjen solujen lisäksi voidaan käyttää eläinmallijärjes-telmiä viruksien replikaatioon; eläinjärjestelmät, joissa 51 107620 käytetään Flaviviruksia, ovat alan ammattilaisille tunnettuja (katso esimerkiksi Monath'in (1986) katsausta). Täten HCV-replikaatio voi tapahtua, ei vain simpansseissa, mutta myös esimerkiksi silkkiapinoissa ja imevissä hiirissä.
5 II.L. HCV:ta vastaan suunnattujen antiviraalisten aineiden seulonta
Soluviljelmä- ja eläinmallijärjelmien saatavuus HCV:tä varten 10 tekee myös mahdolliseksi HCV:n replikaation estävien viruk-senvastaisten aineiden seulonnan ja erityisesti sellaisten aineiden seulonnan, jotka etupäässä sallivat solujen kasvun ja monistumisen, mutta estävät virusten replikaation. Nämä seulontamenetelmät ovat tunnettuja alan ammattilaisille.
15 Yleisesti virusten vastaisia aineita testataan lukuisilla pitoisuuksilla niiden tehon suhteen estää viruksen replikaatio solunviljelyjärjestelmissä, jotka tukevat viruksen rep-likaatiota ja sitten viruspatogeenin infektiivisyyden eston suhteen (ja alhaisen tason myrkyllisyyden suhteen) eläinmal-20 lijärjestelmässä.
Nämä menetelmät ja koostumukset, jotka tässä annetaan HCV- ·*· antigeenien ja HCV-polynukleotidien havaitsemiseksi, ovat : hyödyllisiä virusten vastaisten aineiden seulonnassa siinä, 25 että antavat vaihtoehdon ja ehkä herkemmän välineen aineen • « •j··· tehon hava is emi seen virusreplikaation suhteen, kuin soluplak- .*··. kianalyysi tai ID5o - analyysi. Esimerkiksi tässä kuvattuja HCV- .···. polynukleotidikoettimia voidaan käyttää soluviljelmässä • · tuotetun virusnukleiinihapon määrän selvittämisessä. Tämä 30 voitaisiin tehdä esimerkiksi infektoitujen solunukleiinihap-pojen hybridisaation tai kompetitiohybridisäätiön avulla • · „ ···* leimatun HCV-polynukleotidikoettimen kanssa. Esimerkiksi myös ··· anti-HCV-vasta-aineita voidaan käyttää soluviljelmässä olevien ♦ · · · ;***; HCV-antigeenien tunnistamiseen ja niiden määrän selvittämiseen ·· · 35 käyttäen tässä kuvattuja immunologisia analyysejä. Lisäksi, • · *···* koska voi olla toivottavaa selvittää HCV-antigeenien määrä • · · " infektoidussa soluviljelmässä kompetitioanalyysillä, tässä kuvattuihin HCV:n cDNA:oihin koodatut polypeptidit ovat 52 107620 hyödyllisiä näissä kompetitioanalyyseissä. Yleisesti yhdistel-mä-HCV-polypeptidi, joka on peräisin HCV m cDNA:sta, voisi olla leimattu ja tämän leimatun polypeptidin sitoutumisen estoa HCV-polypeptidiin soluviljelmäjärjestelmässä tuotetun antigeenin 5 takia, tarkkailtaisiin. Lisäksi nämä tekniikat ovat erityisen hyödyllisiä tapauksissa, joissa HCV voi kyetä replikoitumaan solulinjassa aiheuttamatta solukuolemaa.
II.M. Heikennettyjen HCV-kantojen valmistaminen 10
Edellisen lisäksi, käyttäen kudosviljelyjärjestelmiä ja/tai eläinmallijärjestelmiä, voi olla mahdollista eristää heikennettyjä HCV-kantoja. Nämä kannat olisivat sopivia rokotteita varten tai virusantigeenien eristämistä varten. Heikennetyt 15 kannat ovat eristettävissä käytyään monia kertoja soluviljelmässä ja/tai eläinmallissa. Heikentyneen kannan havaitseminen infektoidussa solussa tai yksilössä voidaan saada aikaan alalla tunnetuilla tekniikoilla ja voisi sisältää esimerkiksi vasta-aineiden käytön yhtä tai useampaa epitooppia 20 vastaan, joka on koodattu HCV:ssa, koettimena tai sellaisen polynukleotidin käytön, joka sisältää HCV-sekvenssin, jossa on ainakin noin 8 nukleotidia, koettimena. Vaihtoehtoisesti tai sen lisäksi heikentynyt kanta voidaan rakentaa käyttäen tässä ··· annettua HCV:n genomitietoa ja käyttäen yhdistelmätekniikkaa.
25 Yleisesti voitaisiin yrittää poistaa sellainen genomin alue, • · ...]· joka koodaa esimerkiksi polypeptidiä, joka liittyy #... patogeenisyyteen, mutta joka sallii virusreplikaation. Lisäksi *** genomin rakenne voisi sallia sellaisen epitoopin ekspression, • · *···* joka synnyttää neutraloivia vasta-aineita HCV:lie. Muutettua 30 genomia voitaisiin sitten käyttää transformoimaan soluja, jotka sallivat replikaation ja soluja, jotka on kasvatettu ·*· ’.,,ϊ olosuhteissa, jotka sallivat virusreplikaation. Heikentyneet HCV-kannat ovat hyödyllisiä, ei vain rokotetarkoituksiin, mutta myös virusantigeenien kaupallisen tuotannon lähteinä, koska • · • *1* 35 näiden viruksien käsittely vaatisi vähemmän ankaria suojaustoimenpiteitä työntekijöille, jotka toimivat • · ί *.ί virustuotannossa η a/tax virustuotteiden tuotannossa.
• ♦ -s* 53 107620 III. Yleisiä menetelmiä
Yleiset tekniikat, joita käytetään genomin uuttamiseen viruksesta, cDNA-kirjaston valmistamiseen ja testaamiseen, kloonien 5 sekventoimiseen, ekspressiovektoreiden rakentamiseen, solujen transformoimiseen, immunologisten analyysien, kuten radioimmunologiset analyysit ja ELISA-analyysit, suorittamiseen, solujen kasvattamiseen viljelmässä ja sen kaltaisiin, ovat alalla tunnettuja ja laboratoriokäsikirjoja, jotka 10 kuvaavat näitä tekniikoita, on saatavana. Kuitenkin yleisenä ohjeena seuraava asettaa esiin muutamia lähteitä, jotka ovat nykyään saatavilla sellaisia menettelyjä varten ja materiaaleja varten, jotka ovat hyödyllisiä niiden suorittamiseksi.
15 III.A. Isännät ja ekspression säätösekvenssit
Sekä prokariootti- että eukariootti-isäntäsoluja voidaan käyttää haluttujen koodaussekvenssien ekspressiota varten, kun käytetään sopivia säätösekvenssejä, jotka ovat yhteensopivia 20 aiotun isännän kanssa. Prokariootti-isäntien joukosta käytetään useimmiten E. Coli'a. Ekspression säätösekvenssit proka-rioottisoluja varten sisältävät promoottoreita, jotka sisältävät mahdollisesti operaattoriosia, ja ribosomin sitoutumis- *···’ paikkoja. Siirtovektorit, jotka ovat yhteensopivia prokarioot- • ·· V * 25 ti-isäntien kanssa, ovat yleensä peräisin esimerkiksi ·« · • V pBR322:sta, plasmidista, joka sisältää operoneja, jotka *:**: anatavat ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin ja eri- laisia pUC-vektoreita, jotka myös sisältävät sekvenssejä, jotka • · · .·**. antavat antibioottiresistenssimarkkereita. Näitä markkereita • · • · · 30 voidaan käyttää saamaan onnistuneita transformantteja valinnan kautta. Yleisesti käytetyt prokarioottisäätösekvenssit • · ... sisältävät betalaktamaasi- (penisillinaasi) ja lak- -- · · ”* toosipromoottorijärjestelmiä (Chang et ai. (1977)), tryp- #t*j* tofaanipromoottorijärjestelmän (trp) (Goeddel et ai. (1980)) ja 3 5 lambda johdetun PL-promoottorin ja N-geenin ribosomin sitou- tumispaikan (Shimatake et ai. (1981)) ja hybridin tac-promoot- • · torin (De Boer et ai. (1983))., joka on peräisin trp-ja lac-UV5-’* promoottoreiden sekvensseistä. Edelläolevat järjestelmät ovat 54 107620 erityisen yhteensopivia E. Coli:n kanssa; haluttaessa voidaan käyttää muita prokariootti-isäntiä, kuten Bacillus- tai Pseudomonas-kantoja voidaan käyttää vastaavien säätösekvenssien kanssa.
5
Eukariootti-isännät sisältävät hiiva- ja nisäkässolut viljelyjärjestelmissä. Saccharomyces cerevisiae ja Saccharomyces carlsbergensis ovat yleisimmin käytettyjä hiivaisäntiä ja ne ovat mukavia sieni-isäntiä. Hiivaan sopivat vektorit omaavat 10 markkereita, jotka sallivat onnistuneiden transformanttien valinnan anatamalla prototrofian auksotrooppisille mutanteille tai resistenssin raskaille metalleille villityyppisillä kannoilla. Hiivojen kanssa yhteensopivat vektorit voivat käyttää 2 ym:n replikaatioalkua (Broach et ai. (1983)), CEN3:n 15 ja ARSl:n yhdistelmää tai muita välineitä replikaation varmistamiseksi, kuten sekvenssejä, jotka aikaansaavat sopivan fragmentin liittymisen isäntäsolun genomiin. Säätösekvenssit hiivavektoreita varten ovat tunnettuja alalla ja sisältävät promoottoreita glykolyyttisten entsyymien synteesiä varten 20 (Hess et ai. (1968); Holland et ai. (1978)), sisältäen promoottorin 3-fosfoglyseraattikinaasia varten (Hitzeman (1980)). Terminaattoreita voidaan myös sisällyttää, kuten niitä, jotka ovat peräisin enolaasigeenistä (Holland (1981)) . Erityisen • · · hyödyllisiä säätöjärjestelmiä ovat ne, jotka käsittävät • · · : 25 glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasipromoottorin (GAPDH) • · · • tai alkoholidehydrogenaasin (ADH) säädettävän promoottorin, *:**: terminaattoreita, jotka ovat peräisin myös GAPDH:sta ja jos :***: halutaan eritystä, johtosekvenssit hiivan alfatekijästä.
·«· .***. Lisäksi transkriptiota säätävä alue ja transkription aloittava ··« 30 alue, jotka ovat toiminnallisesti liitettyjä toisiinsa, voivat olla sellaisia, että ne eivät luonnostaan liity villi tyyppisiin • 1 ... organismeihin. Näitä järjestelmiä kuvataan yksityiskohtaisesti EP-julkaisuissa 120,551, julkaistu 3.10.1984; 116,201, julkaistu 22.8.1984 ja 164,556, julkaistu 18.12.1985, jotka 35 ovat kaikki tämän keksinnön hakijan omistuksessa ja joihin • · · tässä viitataan.
• · • · · « 1 · • · · • · 55 107620
Imettäväissolulinjat, jotka ovat saatavissa isäntinä ekspressiota varten, ovat tunnettuja alalla ja sisältävät monia elossa pidettyjä solulinjoja, jotka ovat saatavilla American Type Culture Collection'ista (ATCC), sisältäen HeLa-solut, 5 kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO), hamsterinpoikasen munuaissolut (BHK) ja lukuisia muita solulinjoja. Alalla tunnetaan myös sopivia promoottoreita imettäväissoluja varten ja ne sisältävät viruspromoottoreita, kuten ne jotka ovat peräisin Ihmisapinaviruksesta 40 (SV40) (Piers (1978)), Rous'n 10 sarkoomaviruksesta (RSV), adenoviruksesta (ADV) ja härän papilloomaviruksesta (BPV). Imettäväissolut voivat myös vaatia terminaattorisekvenssejä ja poly-A-additiosekvenssejä; vahvis-tussekvenssejä, jotka lisäävät ekspressiota voidaan myös sisällyttää ja sekvenssit, jotka aiheuttavat geenin amplifi- 15 kaation, voivat olla myös haluttavia. Nämä sekvenssit ovat alalla tunnettuja. Imettäväissoluissa tapahtuvaa replikaatiota varten sopivat vektorit voivat sisältää virusreplikoneja tai sekvenssejä, jotka varmistavat sopivien NANBV-epitooppeja koodaavien sekvenssien integraation isäntägenomiin.
20 III.B. Transformaatiot ... Transformaatio voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä polynukleotidien viemiseksi isäntäsoluun, sisäl- • · · 25 täen esimerkiksi polynukleotidin pakkaamisen virukseen ja • · · : V isäntäsolun muuntamisen viruksella tai polynukleotidin suoralla otolla. Käytetty transformaatiomenettely riippuu tras-formoitavasta isännästä. Esimerkiksi E. Coli-isäntäsolujen transformaatiosta BB-NANBV-sekvenssejä sisältävällä lambda- • · · 30 gtll-vektorilla keskustellaan esimerkkiosassa alla. Baktee- ....: ritransformaatio suoralla otolla yleensä käyttää käsittelyä • ♦ .···, kalsium- tai rubidiumkloridilla (Cohen (1972) ; Maniatis ”* (1982)). Hiivatransformaatio suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen Hinnen et ai. (1978) menetelmää. Imettäväis- ··( 35 transformaatio suoralla otolla voidaan suorittaa käyttäen .···. kalsiumfosfaattisaostusta, jonka ovat esittäneet Graham ja Van • · der Eb (1978). tai sen erilaisia tunnettuja muunnoksia.
• ·· • · 56 107620 III.C. Vektorin rakentaminen
Vektorin rakentaminen käyttää tekniikoita, jotka ovat alalla tunnettuja. Paikkaspesifinen DNA-lohkaisu suoritetaan käsit-5 telemällä sopivilla restriktioentsyymeillä olosuhteissa, jotka on yleensä määritellyt näiden kaupallisesti saatavien entsyymien valmistaja. Yleensä noin 1 pg plasmidia tai DNA-sekvenssiä lohkaistaan 1 yksiköllä entsyymiä noin 20 μ1:η puskuriliuoksessa inkuboimalla 1-2 tuntia 37°C lämpötilassa. Restrik-10 tioentsyymillä inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan fenoli/kloroformiuutoksella ja DNA palautetaan saostamalla etanolilla. Lohjenneet fragmentit voidaan erottaa käyttäen polyakryyliamidi- tai agaroosigeelielektroforeesitekniikoita niiden yleisten menettelytapojen mukaan, jotka löydetään 15 julkaisusta Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.
Tarttuvapäisiä lohkaisufragmentteja voidaan typistää päästään käyttäen E.Coli'n DNA-polymeraasi I:tä /Klenow) sopivien deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) ollessa läsnä seoksessa. 20 Käsittelyä Sl-nukleaasilla voidaan myös käyttää, mistä tulee tulokseksi minkä tahansa yksisäikeisen DNA-osan hydrolyysi.
Liittämiset suoritetaan käyttäen standardeja puskuri- ja *··.* lämpötilaolosuhteita käyttäen T4-DNA-ligaasia ja ATP:tä; «·· V · 25 tarttuvapäiset liittämiset vaativat vähemmän ATP:tä ja vähemmän I* · • ligaasia kuin tylppäpäiset liitokset. Kun vektorif ragmenttej a *:**: käytetään osana liitosseosta, vektorifragmenttia käsitellään usein bakteerisella alkaalifosfataasilla (BAP) tai vasikan • · · suolen alkaalifosfataasilla 5'-fosfaatin poistamiseksi ja täten · · 30 vektorin uudelleen liittymisen estämiseksi; vaihtoehtoisesti haluamattomien fragmenttien restriktioentsyymikatkominen • · ... voidaan suorittaa liittymisen estämiseksi.
• · »«· ,,!·* Liittymisseokset transformoidaan sopiviin kloonausisäntiin, 35 kuten E.Coli'in ja onnistuneet transformantit valitaan esi- • · · merkiksi antibioottiresistenssin perusteella ja ne seulotaan • · oikean rakenteen löytämiseksi.
• · · • · · • · 57 107620 III.D. Haluttujen DNA-sekvenssien rakenne
Synteettisiä oligonukleotideja voidaan valmistaa käyttäen automatisoituja oligonukleotidisyntetisoijia, kuten Warner 5 (1984) kuvaa. Haluttaessa synteettiset säikeet voidaan leimata fosfori-32:11a käsittelemällä polynukleotidikinaasilla 32P-ATP:n läsnäollessa käyttäen standardeja reaktio-olosuhteita.
DNA-sekvenssejä, mukaanlukien ne, jotka on eristetty cDNA-10 kirjastoista, voidaan muokata tunnetuilla tekniikoilla, sisältäen esimerkiksi paikkasuunnatun mutagenoinnin, jota on kuvannut Zoller (1982) . Lyhyesti muokattava DNA pakataan faagiin yksisäikeisenä sekvenssinä ja se muutetaan kaksi-säikeiseksi DNA:ksi DNA-polymeraasilla käyttäen primerinä 15 synteettistä oligonukleotidia, joka on komplementaarinen DNA:n muokattavalle osalle ja jossa on haluttu modifikaatio sisältyvänä omaan sekvenssiinsä. Tuloksena oleva kaksisäikeinen DNA transformoidaan faagiin, joka kantaa isäntäbakteeria. Transformoidun bakteerin viljelmät, jotka sisältävät faagin kunkin 20 säikeen replikaatioita, pinnoitetaan agarilla plakkien saamiseksi. Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää faagin, jossa on mutaattisekvenssi ja jäljellä olevassa 50 %:ssa on ... alkuperäinen sekvenssi. Plakkien replikaatit hybridisoidaan leimattuihin synteettisiin koettimiin lämpötiloissa ja olosuh- • · · '·* ’ 25 teissä, jotka sallivat hybridisaation oikean säikeen kanssa, • · · : mutta ei modifioimattoman sekvenssin kanssa. Sekvenssit, jotka ’·*** on tunnistettu hybridisaation avulla, palautetaan ja kloona- • · · • : taan.
• · · • · * • m • · • ·· 30 III.E. Hybridisaatio koettimen kanssa • ♦ .··♦. DNA-kirjastoja voidaan seuloa koettimilla käyttäen Grunsteinin *** ja Hognessin (1975) menetelmää. Lyhyesti tässä menettelyssä tutkittava DNA immobi li soidaan nitroselluloosaf ilttereille, • · · :...: 35 denaturoidaan ja esihybridisoidaan puskurin kanssa, joka .*··. sisältää 0 - 50 % formamidia, 0,75 M NaCl:a, 75 mM Na-sitraat- • · .·**; tia, 0,02 % (w/v) häränseerumialbumiinia, polyvinyylipyrroli- • ·» donia ja Fricoll'ia kutakin, 50 mM Na-fosfaattia (pH 6,5), 0,1 58 107620 % SDS:a ja 100 pg/ml kantajadenaturoitua DNA:ta. Formamidin prosenttimäärä puskurissa ja myös esihybridisaatio- ja sen jälkeisen hybridisaatiovaiheiden aika- ja lämpötilaolosuhteet riippuvat vaadittavasta ankaruudesta. Oligomeerikoettimia, 5 jotka vaativat alhaisemman ankarat olosuhteet, käytetään yleisesti alhaisten formamidimäärien, alhaisempien lämpötilojen ja pitempien hybridisaatioaikojen kanssa. Koettimet, jotka sisältävät enemmän kuin 30 tai 40 nukleotidia, kuten ne, jotka ovat peräisin cDNA:sta tai genomisekvensseistä käyttävät 10 yleensä korkeampia lämpötiloja, esim. noin 40-42°C ja korkeaa formamidipitoisuutta, esim. 50 %. Seuraten esihybridisaatiota 5 1 -32P-leimattu oligonukleotidikoetin lisätään puskuriin ja filttereitä inkuboidaan tässä seoksessa hybridisaatio-olosuh-teissa. Pesun jälkeen käsitellyt filtterit autoradiografoidaan 15 hybridisoidun koettimen paikan osoittamiseksi; DNA:ta vastaavissa paikoissa alkuperäisillä agarlevyillä käytetään halutun DNA:n lähteenä.
III.F. Rakenteen ja sekventoimisen toteennäyttäminen 20
Rutiineja vektorirakenteita varten liitosseokset transformoidaan E.Coli-kantaan HB101 tai muuhun sopivaan isäntään ja ... onnistuneet trans formant it valitaan antibioottiresistenssin tai muiden markkereiden avulla. Sitten valmistetaan plasmideja • · · 25 transformanteista Clewell et ai. (1969) esittämän menetelmän : ·1 mukaisesti, tavallisesti seuraten klooriamfenikoliamplifikaa- * ‘ tiota (Clewell (1972)). DNA eristetään ja analysoidaan taval- lisesti restriktioentsyymianalyysin ja/tai sekventoimisen • · avulla. Sekventoiminen voidaan tehdä dideoksimenetelmällä, 30 jonka on esittänyt Sanger et ai. (1977) ja jota on edelleen ·;··· kuvannut Messing et ai. (1981) tai menetelmällä, jonka on .2·. kuvannut Maxam et ai. (1980). Ongelmat, jotka liittyivät • · · nauhojen kokoonpuristumiseen, mitä huomataan joskus GC-rik- • · · ···· käillä alueilla, voitettiin käyttämällä T-deatsoguanosiinia • 1 · 35 Barr et ai. (1986) mukaisesti.
• · • · • · · · • · · 2 • · · 59 107620 III. G. Entsyyminliittävä immunosorbentti analyysi
Entsyyminliittävää immunosorbenttia analyysiä (ELISA) voidaan käyttää mittaamaan joko antigeeni- tai vasta-ainepitoisuuksia.
5 Tämä menetelmä riippuu entsyymin liittymisestä joko antigeeniin tai vasta-aineeseen ja se käyttää sidotun entsyymin aktiivisuutta kvantitatiivisena leimana. Vasta-aineen mittaamiseksi tunnettu antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin (esim. mikrolevyyn tai muovikuppiin), sitä inkuboidaan 10 tutkittavan seerumin laimennoksilla, pestään, inkuboidaan entsyymillä leimatun anti-immunoglobuliinin kanssa ja pestään taas. Leimaukseen sopivat entsyymit ovat alalla tunnettuja ja sisältävät esimerkiksi piparjuuriperoksidaasin. Kiinteään faasin sidottu entsyymiaktiivisuus mitataan lisäämällä 15 spesifistä substraattia ja määrittämällä tuotteen muodostuminen tai substraatin käyttö kolorimetrisesti. Sidottu entsyymiaktiivisuus on suora sidotun vasta-aineen määrän funktio.
20 Antigeenin mittaamiseksi kiinnitetään tunnettu spesifinen vasta-aine kiinteään faasiin, lisätään tutkittava materiaali, joka sisältää antigeenin, inkuboinnin jälkeen kiinteä faasi ... pestään ja lisätään toinen entsyymileimattu vasta-aine. Pesun ’♦··* jälkeen lisätään substraatti ja entsyymiaktiivisuus arvioidaan • · ♦ *·* * 25 kolorimetrisesti ja se suhteutetaan antigeenipitoisuuteen.
φ · · ♦ · · • · • · IV. Esimerkit • # ♦ • · • · *«« :***; Alla on kuvattu tämän keksinnön esimerkkejä, jotka on annettu 30 vain kuvaamistarkoituksessa, eikä rajoittamaan tämän keksinnön piiriä. Tämän selvityksen valossa lukuisat suoritusmuodot • · φ·..# vaatimusten suojapiirissä ovat ilmeisiä alan keskitason ämmät- T timiehille. Esitettyjä menettelytapoja, esimerkiksi osassa IV.A. olevia, voidaan haluttaessa toistaa, muttei siihen ole • · · ϊ...ί 35 tarvetta, koska saatavailla on tekniikoita haluttujen nukle- .···. otidisekvenssien rakentamiseksi perustuen keksinnön antamaan • ♦ ***. tietoon. Ekspressio on valaistu esimerkein E.Coli'ssa; kuiten- • · · ’ * kin muitakin järjestelmiä on saatavilla, kuten on täydellisem- 60 107620 min kuvattu osassa III.A. Voidaan tuottaa myös lisäepitooppeja, jotka ovat peräisin genomirakenteesta ja niitä voidaan käyttää vasta-aineiden synnyttämiseen, kuten on esitetty alla.
5 IV.A. HCV:n cDNA:n valmistus, eristys ja sekventoiminen IV.A.l. HCV:n cDNA:n valmistus NANB-aiheuttajan lähde oli plasmavarasto, joka oli peräisin 10 simpanssista, jolla oli krooninen NANBH. Simpanssi oli kokeellisesti tartutettu toisen simpanssin verellä, jolla simpanssilla oli krooninen NANBH, joka oli tulos HCV-infektiosta ihmisen varastoidun seerumin tekijä-8-rikasteen kontaminoituneesta erästä. Simpanssin plasman varasto tehtiin yhdistä-15 mällä monia yksittäisiä plasmaeriä, jotka sisälsivät korkeita alaniiniaminotransferaasiaktiivisuuden tasoja; tämä aktiivisuus on tulos HCV-infektion aiheuttamasta maksavauriosta. Koska 1 ml laimennosta 10"6 tästä varastoidusta seerumista annettuna suonensisäisesti aiheutti NANBH:n toisessa simpanssissa, sen 2 0 CID oli ainakin 106/ml, s.o. sen infektiotiitteri oli korkea.
Luotiin cDNA-kirjasto korkean tiitterin plasmavarastosta seuraavasti. Ensiksi eristettiin viruspartikkelit plasmasta; 90 • »
*** ml:n erä laimennettiin 310 ml :11a liuosta, joka sisälsi 50 mM
• · · .·*/ 25 Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl. Haluamaton aines • » ·
: ·* poistettiin linkoamalla 20 minuuttia nopeudella 15000 x g 20°C
• •1*1 * * lämpötilassa. Tuloksena olevassa nesteessä olevat viruspartik- • · · kelit pelletoitiin linkoamalla Beckman SW28-roottorissa 28000 ··· kierr/min 5 tuntia 2 0°C:ssa. Virusgenomin vapauttamiseksi 30 partikklelit rikottiin suspendoimalla pelletit 15 ml:aan ·;··· liuosta, joka sisälsi 1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS) , 10 .*··. mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ja myös 2 mg/ml proteinaasi ··· • k:ta, mitä seurasi 90 minuutin inkubaatio 45°C:ssa. Nukle- • · · *··ϊ iinihapot eristettiin lisäämällä 0,8 pg MS2-bakteriofaagi- • · · 35 RNA:ta kantajana ja uuttamalla seosta neljä kertaa l:l-seok-
·**’· sella fenolia ja kloroformia (fenoli oli kyllästetty 0,5 M
• « · : Tris-HCl:llä, pH 7,5, 0,1 % (v/v) betamerkaptoetanoli, 0,1 % • · · (w/v) hydroksikinoloni, mitä seurasi uuttaminen kaksi kertaa 61 107620 kloroformilla. Vesifaasi konsentroitiin 1-butanolin kanssa ennen saostamista 2,5 kertaisella tilavuudella absoluuttista etanolia yli yön -20°C:ssa. Nukleiinihappo palautettiin linkoamalla Beckman SW41-roottorissa 40000 kierr/min 90 5 minuutin ajan 4°C:ssa ja se liuotettiin veteen, jota oli käsitelty 0,05 % (v/v) dietyylipyrokarbonaatilla ja auto-klaavikäsiteltiin.
Ylläolevalla menettelyllä saatu nukleiinihappo (<2 μς) dena-10 turoitiin 17,5 mM CHaHgOHrlla; cDNA syntetisoitiin käyttäen tätä denaturoitua nukleiinihappoa mallineena ja se kloonattiin EcoRI-kohtaan faagissa lambda-gtll käyttäen menetelmiä, jotka on kuvannut Huynh (1985), paitsi että satunnaisprimerit korvasivat oligo(dT)-12-18:n ensimmäisen cDNA-kierteen syn-15 teesin aikana käänteistranskriptaasilla (Taylor et ai. (1976)). Tuloksena olevat kaksoiskierteelliset cDNA:t fraktioitiin koon mukaan Sepharose CL-4B-kolonnissa; keskikooltaan noin 400, 300, 200 ja 100 emäsparia oleva eluoitu materiaali varastoitiin cDNA-varastoihin 1, 2, 3 ja vastaavasti 4. Lambda-gtll-cDNA-20 kirjasto luotiin varaston 3 cDNA:sta.
Varastosta 3 luotu lambda-gtll-cDNA-kirjasto seulottiin sellaisten epitooppien suhteen, jotka voisivat sitoutua • «
Hl spesifisesti seerumiin, joka on peräisin potilaasta, jolla oli • ♦ · 25 aikaisemmin ollut NANBH. Noin 106 faagia seulottiin potilas- • · « • ·* seerumilla käyttäen Huynh et ai. (1985) menetelmiä, lukuunot- 9 ····« • * tamatta sitä, että sidottu ihmisen vasta-aine osoitettiin 11« lampaan anti-ihmis-Ig-antiseerumilla, joka oli radioleimattu 1:11a. Viisi positiivista faagia tunnistettiin ja puhdistet- 30 tiin. Nämä viisi positiivista faagia tutkittiin sitten spesi- f isyyden suhteen sitoutua kahdeksan eri ihmisen, joilla oli .·**. aikaisemmin ollut NANBH, seerumiin käyttäen samaa menetelmää.
··· • Neljä faageista koodasi polypeptidiä, joka reagoi immunologi- • · · ···! sesti vain yhden ihmisseerumin kanssa, s.o. sen yhden kanssa, • · · :...· 35 jota käytettiin faagikirjaston alkuseulontaan. Viides faagi (5- 9 .***· 1-1) koodasi polypeptidiä, joka reagoi immunologi sesti viiden M· .·. : kanssa kahdeksasta tutkitusta seerumista. Lisäksi tämä • ·· polypeptidi ei reagoinut immunologisesti seitsemän normaalin 62 107620 verenluovuttajan seerumien kanssa. Siksi näyttää siltä, että klooni 5-1-1 koodaa polypeptidiä, jonka spesifisesti tunnistaa immunologisesti NANB-potilaiden seerumi.
5 IV.A.2. HCV:n cDNA-sekvenssit yhdistelmäfaagissa 5-1-1 ja polypeptidisekvenssit, jotka on koodattu em. sekvenssiin
Yhdistelmäfaagissa 5-1-1 oleva cDNA sekventoitiin Sanger'in et ai. (1977) menetelmällä. Olennaista oli, että cDNA poistettiin 10 EcoRI:lla ja eristettiin koon mukaan fraktioimalla käyttäen geelielektroforeesia. EcoRI-restriktiofragmentit alikloonattiin M13-vektoreihin mpl8 ja mpl9 (Messing (1983)) ja ne sekventoitiin käyttäen dideoksiketjun Sanger'in et ai. (1977) terminaatiomenetelmää. Saatu sekvenssi on esitetty kuviossa 1. 15
Kuviossa 1 koodattu polypeptidi, joka on koodattu HCV:n cDNA:ssa, on sama translaatioalue kuin N-pään betagalaktosi-daasipuolisko, johon se on fuusioitu. Kuten esitetään osassa IV.A. 5-1-1:n translaation avoin lukualue (ORF) koodaa epi-20 tooppeja, jotka sellaisten potilaiden ja simpanssien seerumi, joilla on NANBH-infektio, spesifisesti tunnistaa.
...# IV.A.3. HCV:n cDNA:n ja kloonin 5-1-1 cDNA:n päällekkäisten • · osien eristäminen « · « • · · _ 25 ·· · • · · • ·* HCV:n cDNA:n ja kloonin 5-1-1 cDNA:n päällekkäisyys saatiin * * seulomalla samaa lambda-gtll-kirjastoa, joka luotiin osassa • · · ·...· IV.A.l. kuvatusti, synteettisellä polynukleotidilla, joka oli • ·* peräisin HCV:n cDNA:n sekvenssistä klooneissa 5-1-1, kuten 30 esitetään kuviossa 1. Seulomiseen käytetyn polynukleotidin ·...: sekvenssi oli: • · • · · • ·
’·’ 5 ' -TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA
» TCT CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT-31.
··· 35 .**·. Lambda-gtll-kirjasto seulottiin tällä koettimella käyttäen • · · .·. ; menetelmää, jonka on kuvannut Huynh (1985) . Arviolta yksi 50000 • · · kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Kolme kloonia, jotka 63 107620 sisälsivät cDNA:oita, jotka hybridisoituivat synteettisen koettimen kanssa, on numeroitu 81, 1-2 ja 91.
IV.A.4. HCV;n cDNA:n ja kloonin 5-1-1 cDNA:n päällekkäisten 5 osien nukleotidisekvenssit
Klooneissa 81, 1-2 ja 91 olevien kolmen cDNA:n nukleotidisek-venssit määritettiin olennaisesti osan IV.A.2. tavalla. Näiden kloonien sekvenssit suhteessa HCV:n cDNA-sekvenssiin faagissa 10 5-1-1 on esitetty kuviossa 2, joka esittää säikeen, joka koodaa havaittua HCV-epitooppia ja missä nukleotidisekvensseissä olevat homologiat on merkitty sekvenssien välisillä pystyviivoilla.
15 Kloonatun HCV:n cDNA:iden sekvenssit ovat erittäin homologisia päällekkäin menevillä elueilla (ks. kuvio 2). Kuitenkin eroja on kahdella alueella. Nukleotidi 67 kloonissa 1-2 on tymidiini, kun taas kolme muuta kloonia sisältävät sytidiinijäännöksen tässä asemassa. On huomattava, kuitenkin, että sama aminohappo 20 on koodattu, kun joko C tai T on tässä asemassa.
Toinen ero on, että klooni 5-1-1 sisältää 28 emäsparia, joita ei ole kolmessa muussa kloonissa. Nämä emäsparit esiintyvät 5-
«M
1-1:n cDNA-sekvenssin alussa ja niitä merkitään pienillä ··.·. 25 kirjaimilla. Perustuen radioimmunologisen analyysin tietoihin • · on mahdollista, että HCV-epitooppi voi olla koodattuna tähän 28 • · ... emäsparin alueeseen.
• · • » • · · • · · • · ’·♦·* 5-1-1 :n 28 emäsparin puuttuminen klooneista 81, 2-1 ja 91 voi 30 tarkoittaa, että näiden kloonien cDNA on peräisin viallisista HCV-genomeista; vaihtoehtoisesti 28 emäsparin alue voisi olla • I» *φφ#ί päätetekotuote kloonissa 5-1-1.
m • · *
Pienten kirjaimien sekvenssit kloonien 81 ja 91 nukleotidisek- • · Ί* 35 vensseissä merkitsevät yksinkertaisesti sitä, että näitä ·»· ·...· sekvenssejä ei ole löydetty muista cDNA:ista, koska cDNA:itä, • · */·· jotka menevät päällekkäin näiden alueiden kanssa, ei ollut vielä eristetty.
64 107620 HCV:n cDNA-sekvenssiyhdistelmä, joka oli peräisin kloonien 5-1-1, 81, 1-2 ja 91 päällekkäin menevistä cDNA-.ista, on esitetty kuviossa 3. Kuitenkin tässä kuviossa on jätetty esittämättä 5 kloonin 5-1-1 ainutkertaiset 28 emäsparia. Kuvio esittää myös sen polypeptidin sekvenssin, joka on koodattu HCV:n cDNA-yhdistelmän ORF:ään.
IV.A.5. HCV:n cDNA.iden ja kloonin 81 cDNA;n päällekkäin 10 menevien osien eristäminen HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan päin kloonin 81 cDNA:sta ja menevät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin seuraavasti. Lambda-gtll-kirjasto, joka oli 15 valmistettu, kuten kuvattiin osassa IV.A.1., seulottiin hydridisoimalla synteettisellä polynukleotidikoettimella, joka oli homologinen kloonin 81 5'-pään kanssa. Kloonin 81 sekvenssi on esitetty kuviossa 4. Seulomiseen käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 20 5' CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3'.
···, Menetelmät olivat olennaisesti samat kuin ne, jotka Huynh • · (1985) oli kuvannut, paitsi että kirjastofiltterit pestiin « · * . 25 kahdesti ankarissa olosuhteissa, s.o. pesut suoritettiin 5 x * · « * \ SSC, 0,1 % SDS 55°C kukin 30 minuuttia. Arviolta 1 50000:sta M··· ] * kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. Positiivinen yhdis- telmäfaagi, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui sekvenssin ··» kanssa, eristettiin ja puhdistettiin. Tämä faagi on numeroitu 30 klooniksi 36.
« · ·***: Alavirtaan päin olevat cDNA-sekvenssit, jotka menevät pääl- ·· · *, lekkäin kloonin 81 cDNA:n karboksyylipäisien sekvenssien »·· kanssa, eristettiin käyttäen menettelytapaa, joka oli saman- • u ’···’ 35 lainen kuin se, joka käytettiin ylävirtaan olevien cDNA- sekvenssien eristämiseen, paitsi että valmistettiin synteet- ·· » tinen oligonukleotidikoetin, joka oli homologinen kloonin 81 * * 3'-pään sekvenssin kanssa. Seulomiseen käytetyn synteettisen 65 107620 polynukleotidin sekvenssi oli: 5' TTT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'.
5 Positiivinen yhdistelmäfaagi, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui jälkimmäisen sekvenssin kanssa, eristettiin ja puhdistettiin ja se on numeroitu klooniksi 32.
IV.A.6. HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 36 10 cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 36 määritettiin olennaisesti samoin kuin on kuvattu osassa IV.A.2. Tämän cDNA:n kaksisäikeinen sekvenssi, sen kloonin 81 HCV:n cDNA:n kanssa päällekkäinen alue ja ORF:n koodaama polypeptidi on esitetty 15 kuviossa 5.
Kloonin 36 ORF on samassa translaatioalueessa kuin klooniin 81 koodattu HCV-antigeeni. Täten, yhdistelmänä, kloonien 36 ja 81 ORF:t koodaavat polypeptidiä, joka edustaa osaa suuresta HCV-20 antigeenistä. Tämän oletetun HCV-polypeptidin sekvenssi ja sitä koodaava kaksisäikeinen DNA-sekvenssi, joka on peräisin kloonien 36 ja 81 HCV:n cDNA:iden yhdistetyistä ORF:ista, on esitetty kuviossa 6.
• · ··« * · 4 V : 25 IV.A.7. HCV:n cDNA;n nukleotidisekvenssit kloonissa 32 •« * • · · • · • · *:··: cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 32 määritettiin olen- naisesti kuten kuvattiin osassa IV.A.2. kloonin 5-1-1 sek- • · · .***. venssiä varten. Sekvenssitieto merkitsi, että kloonin 32 • · · 30 yhdistelmäfaagin cDNA oli peräisin kahdesta eri lähteestä.
,.##j cDNA:n yksi fragmentti muodostui 418 nukleotidista, jotka • · ... olivat peräisin HCV-genomista; toinen fragmentti muodostui 172 "* nukleotidista, jotka olivat peräisin bakteriofaagin MS2 » genomista, jota oli käytetty kantajana plasman lambda-gtll-35 cDNA-kirjaston valmistuksessa.
·«* • · Γ*. Kloonin 32 cDNA:n sekvenssi vastasi kuviossa 7 esitetyn HCV- • · · *· genomin sekvenssiä. Se sekvenssialue, joka menee päällekkäin 66 107620 kloonin 81 kanssa ja ORF:n koodaama polypeptidi on myös esitety kuviossa. Tämä sekvenssi sisältää yhden jatkuvan ORF:n, joka on samalla translaatioalueella kuin kloonin 81 koodaama HCV-antigeeni.
5 IV.A.8. HCV:n cDNA:n ja kloonin 36 cDNA:n päällekkäin menevän alueen eristäminen HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka olivat ylävirtaan kloonin 36 10 cDNA-sekvenssistä ja menivät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten kuvattiin osassa IV.A.5. kloonin 81 cDNA:n sekvenssin kanssa päällekkäin menevän sekvenssin yhteydessä, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 36 5'-alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen 15 polynukleotidin sekvenssi oli: 5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'.
Arviolta 1 50000:sta kloonista hybridisoitui koettimen kanssa. 20 Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klooni, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin, nimettiin klooniksi 35.
• · · • · • · · IV.A.9. HCV: n cDNA: n nukleotidi sekvenssi kloonissa 35 25 • · ♦ · cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 3 5 määritettiin olen- • · ... naisesti samoin kuin kuvattiin osassa IV. A. 2. Sekvenssi, sen * ♦ * • ♦ lii päällekkäin menevä alue kloonin 36 cDNA:n sekvenssin kanssa ja ♦ · ·*** siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 8.
30 * * Klooni 35 sisältää ilmeisesti yksinkertaisen jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä samassa translaatioalueessa kuin se, jota koodaavat kloonit 36, 81 ja 32. Kuvio 9 esittää pitkän .···. jatkuvan ORF:n sekvenssin, joka ulottuu kloonien 35, 36, 81 32 • · *** 35 läpi siihen koodattua oletettua HCV-polypeptidiä pitkin. Tämä ·»· • « *...· yhdistetty sekvenssi on vahvistettu käyttäen muita riippumat- • · tornia cDNA-klooneja, jotka ovat peräisin samasta lambda-gtll-kirjastosta.
67 107620 IV.A.10. HCV:n cDNA:n ja kloonin 35 cDNA:n päällekkäisten osien eristäminen 5 HCV:n cDNA-sekvenssien, jotka ovat ylävirtaan kloonin 35 cDNA:sta ja menevät päällekkäin sen kanssa, eristäminen suoritettiin kuten on kuvattu osassa IV. A. 8. niitä sekvenssejä varten, jotka menevät päällekkäin kloonin 36 cDNA:n kanssa, paitsi että synteettinen polynukleotidi perustui kloonin 35 5'-10 alueeseen. Seulontaan käytetyn synteettisen polynukleotidin sekvenssi oli: 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3'.
15 Arviolta 1 klooni 50000:sta hybridisoitui koettimen kanssa. Eristetty, puhdistettu yhdistelmäfaagin klooni, joka sisälsi cDNA:ta, joka hybridisoitui tähän sekvenssiin, nimettiin klooniksi 37b.
20 IV.A.11. HCV:n nukleotidisekvenssi kloonissa 37b cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 37b määritettiin olen-··♦. naisesti kuten osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen päällekkäin menevä alue kloonin 35 cDNA:n kanssa ja siihen koodattu oletettu • · · 25 polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 10.
• · • ·
Kloonin 35 51-pään nukleotidi on T, kun taas vastaava nuk- • · *··’ leotidi kloonissa 37b on A. cDNA:t kolmesta muusta riippumat- • · · tomasta kloonista, jotka eristettiin kloonin 37b eristämis- 30 menettelyn aikana, jota kuvattiin osassa IV.A.10., on myös sekventoitu. Näistä klooneista olevat cDNA: t sisältävät myös .·***: A:n tässä asemassa. Täten 5 1-pään T kloonissa 35 voi olla ··· \ kloonausmenettelystä syntynyt tekotuote. On tunnettua, että ”” tekotuotteita syntyy usein cDNA-molekyylien 5'-päissä.
*·”* 35
Klooni 37b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka koodaa polypeptidiä, joka on jatko sille polypeptidi lie, joka » · 68 107620 on koodattu siihen 0RF:ään, joka ulottuu päällekäin menevien kloonien 35, 36, 81 ja 32 läpi.
IV.A.12. HCV:n cDNA:n ja kloonin 32 cDNA:n päällekkäisten osien 5 eristäminen
Kloonista 32 alavirtaan päin olevan HCV.-n cDNAm eristäminen suoritettiin seuraavasti. Ensiksi klooni cla eristettiin käyttäen synteettistä hybridisaatiokoetinta, joka perustui 10 kloonin 32 HCV:n cDNAm nukleotidisekvenssiin. Menetelmä oli olennaisesti sama kuin kuvattiin osassa IV.A.5., paitsi että synteettisen koettimen sekvenssi oli: 5' AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'.
15 Käyttäen kloonista cla saatua nukleotidisekvenssiä, syntetisoitiin toinen synteettinen nukleotidi, jonka sekvenssi oli: 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3'.
20
Lambda-gtll-kirjaston seulominen käyttäen kloonista cla peräisin olevaa sekvenssiä koettimena antoi arviolta 1 posi-tiivisen osuman 50000:sta. Eristetty, puhdistettu klooni, joka :*·*: hybridisoitui tämän koettimen kanssa, nimettiin klooniksi 33b.
25
• I
• · ....: IV.A. 13. H CV: n cDNA: n nukleotidisekvenssi kloonissa 33b • · · • · • · !!! cDNA:n nukleotidisekvenssi kloonissa 33b määritettiin olen- * · *·* naisesti kuten on kuvattu osassa IV.A.2. Sekvenssi, sen kloonin 30 32 cDNA:n kanssa päällekkäin menevä alue ja siihen koodattu ’ * oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 11.
• · · • · • · ·
Klooni 33b sisältää ilmeisesti yhden jatkuvan ORF:n, joka on ·»·· .···. pidentymä päällekkäin menevien kloonien 37b, 35, 36, 81 ja 32 • · '·* 3 5 ORF:lie. Klooniin 33b koodattu polypeptidi on samassa trans- • · laatioalueessa kuin se, mikä on koodattu näiden päällekkäin • · menevien kloonien pidennettyyn ORF:ään.
69 107620 IV.A.14. HCV:n cDNA:iden, jotka menevät päällekkäin kloonin 37b cDNA:n kanssa ia kloonin 33b cDNA:n kanssa, eristäminen HCV:n cDNA:iden, jotka menevät päällekkäin kloonien 37b ja 33b 5 cDNA:iden kanssa, eristämiseksi käytettiin seuraavia synteettisiä oligonukleotidikoettimia, jotka ovat peräisin kloonien cDNA:ista, seulomaan lambda-gtll-kirjastoa käyttäen olennaisesti samaa menetelmää kuin kuvattiin osassa IV.A.3. Käytetyt koettimet olivat: 10 5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3' ja 5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3' 15 havaitsemaan sellaisia HCV:n cDNA-sekvenssejä sisältäviä pesäkkeitä, jotka sekvenssit menevät päällekkäin kloonin 37b ja vastaavat! 33b sekvenssien kanssa. Arviolta 1 pesäke 50000:sta havaittiin kullakin koettimella. Klooni, joka sisälsi cDNA:ta, joka oli ylävirtaan päin kloonin 37b cDNA:sta ja meni 20 päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 40b. Klooni, joka sisälsi cDNA:ta alavirtaan kloonin 33b cDNA:sta ja meni päällekkäin sen kanssa, nimettiin klooniksi 25c.
• · .•j·, IV.A.15. HCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssit kloonissa 40b ja ♦ · · .1 . 25 kloonissa 25c t · • * • »
Kloonissa 40b ja kloonissa 25c olevat cDNA:iden nukleotidi- • · · • « ’···* sekvenssit määritettiin olennaisesti kuten kuvattiin osassa • · · IV.A.2. 40b:n ja 25c:n sekvenssit, niiden päällekkäin menevät 30 alueet kloonien 37b ja 33b cDNA:iden kanssa ja niihin koodatut *:**: oletetut polypeptidit on esitetty kuviossa 12 (klooni 40b) ja ·**’: kuviossa 13 (klooni 25c) .
·♦· « « ♦ ·· **” Kloonin 40b 5'-pään nukleotidi on G. Kuitenkin myös viiden muun • · ’•y* 35 riippumattoman kloonin, jotka eristettiin menettelyn aikana, : jossa klooni 40b eristettiin, kuten on kuvattu osassa IV.A. 14, • ·· :*·.· cDNA: t on myös sekventoitu. Näiden kloonien cDNA: t sisältävät • · 70 107620 myös T:n tässä asemassa. Täten G voi edustaa kloonaustekotuotetta (ks. keskustelua osassa IV.A.11).
Kloonin 25c 5’-pää on ACT, mutta tämän alueen sekvenssi 5 kloonissa cla (sekvenssiä ei ole esitetty) ja kloonissa 33b on TCA. Tämä ero voi myös edustaa kloonaustekotuotetta, kuten voivat 28 ylimääräistä 5'-pään nukleotidia kloonissa 5-1-1.
Kumpikin klooneista 40b ja 25c ilmeisesti sisältää ORF:n, joka 10 on aikaisemmin sekventoitujen kloonien jatkuvan 0RF:n pidentymä. Kloonien 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b ja 25c kautta ulottuvan ORF:n nukleotidisekvenssi ja siihen koodattu oletettu polypeptidi ovat esitetyt kuviossa 14. Kuviossa on todennäköiset tekotuotteet poistettu sekvenssistä ja sen sijaan monien 15 päällekkäin menevien kloonien vastaavat sekvenssit alueilla, jotka eivät ole 5'-päässä, on esitetty.
IV.A.16. Yhdistelmä-HCV:n cDNA:n valmistaminen kloonien 36, 81 ja 32 cDNA:ista 20
Yhdistelmä-HCV:n cDNA, C100, rakennettiin seuraavasti. Ensiksi kloonien 36, 81 ja 32 cDNA:t pilkottiin EcoRI:11a. Kustakin ···. kloonista tuleva cDNA:n EcoRI-fragmentti kloonattiin • * yksilöllisesti vektorin pGEM3-sininen (Promega Biotec) EcoRI- • · .1 , 25 kohtaan.Tuloksena olevat yhdistelmävektorit, jotka sisälsivät · · ' ·[ kloonien 36, 81 ja 32 cDNArt, nimettiin pGEM3-sininen/36:ksi, pGEM3 -sininen/81 :ksi ja vastaavasti pGEM3-sininen/32 -.ksi .
• · ·
Sopivasti orientoitunut yhdistelmä pGEM3-sininen/81 pilkottiin • · ·
Nael:llä ja Narl:llä ja suuri (-2850 emäsparia) fragmentti 30 puhdistettiin ja liitettiin pieneen (-570 emäsparia) Nael/Narl- *:*·: puhdistettuun pGEM3-sininen/3 6-restriktiofragmenttiin. Tätä ·**’; kloonien 3 6 ja 81 cDNA:iden yhdistelmää käytettiin toisen • · · *. pGEM3-sininen-vektorin luomiseen, joka sisälsi jatkuvan HCV:n • · · ORF:n näiden kloonien kanssa päällekkäin menevässä cDNA:ssa.
• · *·.·’ 35 Tämä uusi plasmidi pilkottiin sitten PvuII:lla ja EcoRI :11a noin 680 emäsparin fragmentin vapauttamiseksi, mikä sitten • · · ;\J kiinnitettiin pieneen (580 emäsparia) PvuII/EcoRI-fragmenttiin, • · joka oli eristetty sopivasti orientoituneesta pGEM3-sininen/32- 71 107620 plasmidista ja kloonien 36, 81 ja 32 yhdistelmä-cDNA kiinnitettiin EcoRIrlla linearisoituun vektoriin pSODcfl, jota kuvataan osassa IV.B.l, ja jota käytettiin kloonin 5-1-1 ekspressoimiseen bakteereissa. Valittiin yhdistelmät, jotka 5 sisälsivät yhdistelmä-HCV:n cDNA:n -1270 emäsparin EcoRI-fragmentin ja plasmidien cDNA pilkottiin EcoRI.lla ja puhdistettiin.
IV.A.17. Kloonien 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33q 10 ja 39c eristäminen ja niiden HCV;n cDNA:iden nukleotidi-sekvenssit
Kloonien 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n cDNA:t eristettiin tekniikalla, jolla eristettiin HCV:n 15 cNDAriden lambda-gtll-kirjaston päällekkäin meneviä cDNA- fragmentteja, kuten kuvattiin osassa IV.A.1.. Käytetty tekniikka oli olennaisesti sama, jota kuvattiin osassa IV.A.3., paitsi että käytetyt koettimet olivat peräisin viimeksi eristettyjen kloonien nukleotidisekvenssien yhdistelmä-HCV- 20 sekvensenssien 5'- ja 3'-päistä. Hybridisointitaajuus klooneille, jotka hybridisoituivat alla kuvattujen koettimien kanssa, oli noin 1 50000:sta kussakin tapauksessa. Kloonien ... 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c HCV:n ’;*** cDNA:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti samoin • · · »Y 25 kuin on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että näistä faageista : .* pilkotulla cDNA:11a korvattiin kloonista 5-1-1 eristetty cDNA.
• · • · ·
Klooni 33c eristettiin käyttäen hybridisaatiokoetinta, joka perustui kloonin 40b nukleotidien sekvenssiin. Kloonin 40b 30 nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 12. Kloonin 33c eristämisen käytetyn koettimen nukleotidisekvenssi oli: • · · • · 51 ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3' ··<* ···· ··· :...: 35 Kloonin 33c HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin .···. 40b sekvenssin kanssa on esitetty kuviossa 15, joka esittää .*!*: myös siihen koodatut aminohapot.
• · · • *
Klooni 8h eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 33c nukleotidisekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 72 107620 5' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3' 5
Kloonin 8h HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 33c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot ovat esitetyt kuviossa 16.
10 Klooni 7e eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8h nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5' TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3' 15 Kloonin 7e HCV:n cDNA-sekvenssi ja päällekkäin meno kloonin 8h kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 17.
Klooni 14c eristettiin koettimellä, joka perustui kloonin 25c nukleotidien sekvenssiin. Kloonin 25c sekvenssi on esitetty 20 kuviossa 13. Kloonin 14c eristämiseen käytetyn koettimen sekvenssi oli: ·***·* 5' ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3' «·« • · · • · » 25 Kloonin 14c HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin • · ·...: 25c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty .···, kuviossa 18.
• · ·**
Mt • » • ·
Klooni 8f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin , 30 14c nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: ··# • · ··· ··. 5' TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3' ···· • ·· • · • · ··* 35 Kloonin 8f HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin • · ’···* 14c sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty *. *J kuviossa 19.
Klooni 33f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui kloonin 8f nukleotidisekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 73 107620 5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3' 5
Kloonin 33f HCV:n cDNA-sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 8f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 20.
10 Klooni 33g eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 33f. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5» GCG ACA ATA CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3 ' 15
Kloonin 33f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 21.
20 Klooni 7f eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa le. Koettimen nukleotidisek- ... venssi oli: • · **« • · · : 5 ' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3 ' • · · i * · : .· 25
Kloonin 7f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin ·»· le sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 22.
• · · 3 0 Klooni llb eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui ,···. nukleotidien sekvenssiin kloonissa 7f. Koettimen nukleotidi- sekvenssi oli: • · · φ · · · ·[[/· 5 ' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3 ' 35 • ·
Kloonin llb HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno « · · kloonin 7f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot , on esitetty kuviossa 23.
5
Klooni 14i eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 11b. Koettimen nukleoti- disekvenssi oli: 74 107620 5 ' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3 1
Kloonin 14i HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 11b sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on 10 esitetty kuviossa 24.
Klooni 39c eristettiin käyttäen koetinta, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 33g. Koettimen nukleoti-disekvenssi oli: 15 5' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 31
Kloonin 39c HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 33g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on 20 esitetty kuviossa 25.
IV.A.18. Yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, joka on peräisin ’···’ H CV: n cDNA: ta sisältävistä eristetyistä klooneista • · · • · · • · · • · · : V 25 HCV:n cDNA-sekvenssit ylläkuvatuissa eristetyissä klooneissa ”**: ovat kohdakkain yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssin luomiseksi.
Eristeyt kloonit, jotka ovat kohdakkain suunnassa 5':sta 3':een • · · ;··*; ovat : 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g ja 39c.
30 ·
Yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, joka on peräisin eristetyistä ”* klooneista ja siihen koodattu aminohapposekvenssi on esitetty ..*·* kuviossa 26.
• · · • · • · • · · ··· 3 5 Yhdistelmäsekvenssien luomisessa on havaittu seuraavia sek- • · • « I‘*. venssiheterogeenisyyksiä. Klooni 33c sisältää 800 emäsparin • · · ‘ * HCV:n sDNA:ta/ joka menee päällekkäin kloonien 40b ja 37c cDNA:iden kanssa. Kloonissa 33c ja myös viidessä muussa 75 107620 päällekkäin menevässä kloonissa nukleotidi #789 on G. Kuitenkin kloonissa 37b (ks. osa IV.A.11.) vastaava nukleotidi on A. Tämä sekvenssiero luo ilmeisen heterogeenisyyden siihen koodattuihin aminohappoihin, joka olisi joko CYS tai TYR G:lie tai 5 vastaavasti A:lie. Tällä heterogeenisyydellä voi olla tärkeitä seuraamuksia proteiinien muodostumisessa.
Kloonin 8f HCV:n cDNA:n nukleotidijäännös #2 on T. Kuiten kuten osoitetaan alla, vastaava jäännös kloonissa 7e on A; lisäksi A 10 tässä asemassa löydetään myös kolmesta muusta eristetystä päällekkäin menevästä kloonista. Täten T-jäännös kloonissa 8h voi edustaa kloonaustekotuotetta. Siksi kuviossa 26 merkitään tässä asemassa olevaa jäännöstä A:11a.
15 Kloonin 8f HCV:n cDNArn 31-pään nukleotidi on G. Kuitenkin vastaava kloonin 33f jäännös ja kahden muun päällekkäin menevän kloonin jäännös on T. Siksi kuviossa 26 tässä asemassa olevaa jäännöstä merkitään T:llä.
20 Kloonin 33f HCV:n cDNA:n 3'-pään sekvenssi on TTGC. Kuitenkin vastaava sekvenssi kloonissa 33g ja kahdessa muussa päällekkäin ,***· menevässä kloonissa on ATTC. Siksi kuviossa 26 vastaavaa • · · aluetta merkitään ATTC:llä.
• · · » • · · • · · • · 25 Kloonin 33g HCV:n cDNA.n nukleotidi jäännös #4 on T. Kuitenkin • · ... kloonissa 33f ja kahdessa muussa päällekkäin menevässä kloo- • · ’···' nissa vastaava jäännös on A. Siksi kuviossa 26 vastaavaa • · *···* jäännöstä merkitään A: 11a.
30 Kloonin 14i 3 1-pää on AA, kun taas vastaava dinukleotidi ··· kloonissa 11b ja kolmessa muussa kloonissa on TA. Siksi kuviossa 2 6 päätä merkitään TA: 11a.
·« t · • · · • · • » ‘1’ Muiden sekvenssiheterogeenisyyksien analysoinnista keskustel- • · · :...: 35 laan yllä.
• ♦ * * · • · · • ·
Yhdistemä-HCV:n cDNAm tutkiminen merkit see,...että se sisältää yhden suuren ORF:n. Tämä ehdottaa, että virusgenomi on trans- 76 107620 loitusuureen polypeptidiin, jota käsitellään samanaikaisesti translaation kanssa tai sen jälkeen.
IV.A.19. Kloonien 12f, 35f, 19q, 26g ia 15e eristäminen ja 5 niiden nukleotidisekvenssit
Kloonien 12f, 35f, 19g, 26g ja 15e HCV:n cDNA:t eristettiin olennaisesti osassa IV.A.17 kuvatulla tekniikalla, paitsi että koettimet olivat sellaisia kuin on merkitty alla. Koettimien 10 kanssa hybridisoituvien kloonien frekvenssi oli noin 1 50000:sta kussakin tapauksessa. Näiden kloonien HCV:n cDNA:iden nukleotidisekvenssit määritettiin olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.A.2., paitsi että merkittyjen kloonien cDNA:11a korvattiin kloonista 5-1-1 eristetty cDNA.
15
Kloonin 12f, joka sisältää cDNA:ta ylävirtaan kuvion 26 HCV:n cDNA:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatiokoe-tinta, joka perustui kloonin 14i nukleotidien sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 20 5' TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3' • ♦ · • · • » ·
Kloonin 12f HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno :*·*: kloonin 14i sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on • · 25 esitetty kuviossa 27.
• · · • · ··· Kloonin 35f, joka sisältää cDNA:ta alavirtaan kuvion 26 HCV:n • · cDNA:sta, eristäminen suoritettiin käyttäen koetintä, joka perustui nukleotidien sekvenssiin kloonissa 39c. Koettimen 30 nukleotidisekvenssi oli: • · · « · • · · ·;· 5 ' AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3 ' • · · · • · · • · • · ·· ·
Kloonin 35f sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 3 9c • · *···* 35 sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty • · · *. *: kuviossa 28.
77 107620
Kloonin I9g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatio-koetinta, joka perustui kloonin 35f 3'-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 5 5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3'
Kloonin 19g HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 35f sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 29.
10
Kloonin 26g eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatio-koetinta, joka perustui kloonin 19g 31-sekvenssiin. Koettimen nukleotidisekvenssi oli: 15 51 TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'
Kloonin 26g HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno kloonin 19g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 30.
20
Kloonin 15e eristäminen suoritettiin käyttäen hybridisaatio- **·. koetinta, joka perustui kloonin 26g 3'-sekvenssiin. Koettimen • · · nukleotidisekvenssi oli: • · · •» · • · · \ 25 5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3' ···«» • « • · · ’···’ Kloonin 15e HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäin meno *...1 2 kloonin 26g sekvenssin kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 31.
·:··: 30 ·3: Tässä osassa kuvatut kloonit on talletettu osassa II.A.
«1· kuvatuilla ehdoilla ja niissä olosuhteissa ja niille on annettu • i» ^ seuraavat talletusnumerot.
• m • · «·· 35 • · · · • 1 · 2 * 1 · 3 • 1 78 107620 lambda-gtll ATCC No. Talletuspäivä klooni 12f 40514 10.11.1988 klooni 35f 40511 10.11.1988 klooni 15e 40513 10.11.1988 5 klooni K9-1 40512 10.11.1988
Eristettyjen kloonien ylläkuvatut HCV:n cDNA-sekvenssit on asetettu kohdakkain yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssin luomiseksi. Eristetyt kloonit, jotka ovat kohdakkain suunnassa 10 5':sta 3':uun ovat: 12f, 14i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g ja 15e.
Eristetyistä klooneista peräisin oleva yhdistelmä-HCV:n cDNA-15 sekvenssi ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 32 .
IV.A.20. Vaihtoehtoinen menetelmä kloonin 12f HCV:n cDNA-sekvenssistä ylävirtaan olevien cDNA-sekvenssien eristämiseksi 20
Perustuen useimpiin 5'-HCV:n sekvensseihin kuviossa 32, jotka **\ ovat peräisin kloonin 12f HCV:n cDNA:sta, syntetisoitiin • · · käänteistranskriptaasin pieniä synteettisiä oligonukleotidi- ♦ · · primereitä ja niitä käytettiin sitoutumaan vastaaviin sek- • « 25 vensseihin HCV:n genomin RNA:han ylävirtaan olevien sekvenssien ... käänteistranskription aloittamiseksi. Primerisekvenssit ovat • · **··* lähinnä kloonin 12f tunnettua 5 '-pään sekvenssiä, mutta siitä • « *.·.· riittävästi alavirtaan salliakseen sellaisten koetinsekvenssien suunnittelun, jotka ovat ylävirtaan primerisekvensseistä.
*:·*: 3 0 Tunnettuja standardimenetelmiä käytetään aloitukseen ja ·**’: kloonaukseen. Tuloksena olevia cDNA-kirjastoja seulotaan aloituspaikoista ylävirtaan olevilla sekvensseillä **" (vähennettynä selvitetystä kloonin 12f sekvenssistä). HCV:n • · ***** genomin RNA saadaan joko plasma- tai maksanäytteistä sim- ··· 35 pansseista, joilla on NANBH tai vastaavista näytteistä ih- :**.♦ misistä, joilla on NANBH.
• · 79 107620 IV.A.21. Vaihtoehtoinen menetelmä, joka käyttää hännän lisäämistä, sekvenssien eristämiseksi HCV:n genomin 51-pään alueelta Äärimmäisten 5'-pään sekvenssien eristämiseksi HCV:n RNA-5 genomista ensimmäisen käänteistranskriptiokierroksen cDNA- tuotteeseen, joka on dupleksoitu malli-RNA:11a, lisätään oligo C-häntä. Tämä suoritetaan inkuboimalla tuotetta ter-minaalitransferaasin kanssa CPT:n läsnäollessa. cDNA-synteesin toinen kierros, joka tuottaa ensimmäisen cDNA-säikeen 10 komplementin, suoritetaan käyttäen oligo-G:tä primerinä käänteistranskriptaasireaktiota varten. Genomi-HCV-RNA:n lähteet ovat samoja, joita on kuvattu osassa IV.A.20. Menetelmät hännän lisäämiseksi terminaalitramsferaasilla ja käänteistranskriptaasireaktioita varten ovat niitä, jotka on 15 kuvannut Maniatis et ai. (1982). cDNA_tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan sitten.
IV.A.22. Vaihtoehtoinen menetelmä, joka käyttää hännän lisäämistä, sekvenssien eristämiseksi HCV:n genomin 31-pään alueelta 20 Tämä menetelmä perustuu aikaisemmin käytettyihin menetelmiin . : Flaviviruksen RNA:n cDNA:n klooaamiseksi. Tässä menetelmässä • · · :*·*: RNA alistetaan denaturointiolosuhteisiin sekundääristen !*.*. rakenteiden poistamiseksi 3 ' -päästä ja sitten siihen lisätään • · 25 häntä käyttäen Poly-A-polymeraasia käyttäen rATPrtä subs- • · .···. traattina. Poly-A-hännällä varustetun RNA:n käänteistrans- • · I” kriptiota katalysoi käänteistranskriptaasi käyttäen oligo-dT:tä • · *** primerinä. cDNArn toiset säikeet syntetosoidaan, cDNA-tuotteet kloonataan, seulotaan ja sekventoidaan.
. 30 • · · *...· IV.A.23. Suurempia cDNA-inserttejä sisältävien lambda-gtll: ssä olevien HCV:n cDNA-kirjastojen luominen • ·· · • · · • · • · ]·’ Menetelmä, jota käytetään luomaan ja seulomaan lambda-gtll- • · 35 kirjastoja, on olennaisesti sama kuin se, jota on kuvattu osassa IV.A.l., paitsi että kirjasto luodaan Sepharose CL-4B-pylväästä eluoidun suuremman koon cDNA:iden varastosta.
80 107620 IV.A.24. HCV:n cDNA-kirjastoien luominen käyttäen synteettisiä oligomeerejä primereinä
Uusia HCV:n cDNA-kirjastoja on valmistettu RNA:sta, joka on 5 peräisin tautia kantavan simpanssin plasmavarastosta, jota kuvattiin osassa IV.A. 1., ja poly-A+-RNA-fraktiosta, joka on peräisin tämän tautia kantavan eläimen maksasta. cDNA rakennettiin olennaisesti, kuten ovat kuvanneet Gubler ja Hoffman (1983), paitsi että ensimmäisien cDNA-säikeiden 10 synteesiä varten olevat primerit olivat kaksi synteettistä oligomeeriä, jotka perustuivat yllä kuvattuun HCV:n genomin sekvenssiin.Primerit, jotka perustuivat kloonien 11b ja 7e sekvens s i in 1ivat: 15 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' ja 51 AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3'
Tuloksena olevat cDNA:t kloonattiin lambda-bakteriofaagivek-toreihin ja niitä seulottiin eri synteettisillä oligomeereillä, 20 joiden sekvenssit perustuivat kuvion 32 HCV:n sekvenssiin.
... IV.B. HCV:n cDNA:issa koodattujen polypeptidien ekspressio ia *··♦1 ekspressoitujen tuotteiden tunnistaminen HCV:n indusoimina ♦ ♦♦ - ' ' —' " — — 1 " .2 ’ antigeeneinä ·· ♦ : V 25 IV.B.l. Klooniin 5-1-1 koodatun polypeptidin ekspressio • · • · • ·· ;3; Klooniin 5-1-1 koodattu HCV-polypeptidi (ks. osa IV.A.2., yllä) ··· ekspressoitiin fuusiopolypeptidinä superoksididismutaasilla.
30 Tämä tehtiin alikloonaamalla kloonin 5-1-1 cDNA-insertti • · < ekspressiovektoriin pSODcfl (Steimer et ai. (1986)) Γ1 seuraavasti.
2 • · · 3 • · · ·
Ensiksi pSODcfl:stä eristettyä DNA:ta käsiteltiin BamHIrlla ja .···. 35 EcoRI:lla ja seuraava linkkeri liitettiin lineaariseen DNA:han, • ♦ joka luotiin restriktioentsyymeillä: ’1 5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3 ' 3' GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5' 81 107620
Kloonauksen jälkeen eristettiin insertin sisältävä plasmidi.
Insertin sisältävä plasmidi restriktoitiin EcoRI:lla. HCV:n 5 cDNA-insertti kloonissa 5-1-1 pilkottiin EcoRI;llä ja se liitettiin tähän EcoRIrllä linearisoituun plasmidi-DNA:hän. DNA-seosta käytettiin transformoimaan E.Coli-kantaa D1210 (Sadler et ai. (1980)). Kloonin 5-1-1 cDNA:n kanssa oikeassa orientaatiossa ORF:n ekspressiota varten olevat rekombinantit, 10 jotka on esitetty kuviossa 1, tunnistettiin restriktiokartoituksen ja nukleotidien sekventoimisen avulla.
Yhden kloonin rekombinanttibakteerit saatetiin ekspressoimaaan SOD-NANB5-i-i-polypeptidiä kasvattamalla bakteeria IPTG:n 15 läsnäollessa.
IV.B.2. Klooniin 81 koodatun polypeptidin ekspressio
Kloonin 81 sisältämä HCV:n cDNA ekspressoitiin SOD-NANB8i-20 fuusiopolypeptidinä. Tätä fuusiopolypeptidiä koodaavan vektorin valmistusmenetelmä oli analoginen sen kanssa, mitä käytettiin • · · ·...: SOD-NANB5-1-1 koodaavan vektorin luomiseen, paitsi että HCV:n cDNA:n lähde oli klooni 81, joka eristettiin osassa IV.A.3.
·*·*· kuvatulla tavalla ja jota varten cDNA_sekvenssi määritettiin • · 25 kuten kuvattiin osassa IV.A.4.. Kloonissa 81 oleva HCV:n cDNA- • · .···. nukleotidisekvenssi ja siihen koodatun polypeptidin oletettu • · aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 4.
• · • · · HCV:n cDNA-insertti kloonissa 81 pilkottiin EcoRI:lla ja ] ^ 30 liitettiin pSODcfl.-een, joka sisälsi linkkerin (ks. IV.B.l.) ja joka linearisoitiin EcoRI:lla. DNA-seosta käytettiin sitten ··· transformoimaan E. Coli-kantaa D1210. Rekombinantit kloonin 81 '···· .**·. H CV: n cDNA: n kanssa oikeassa orientaatiossa kuviossa 4 esitetyn ORF:n ekspressiota varten, tunnistettiin restriktiokartoituksen • · **··* 35 ja nukleotidin sekventoimisen avulla.
• · • · · » · · • · 82 107620
Yhdestä kloonista tulleet rekombinanttibakteeria saatettiin ekspressoimaan SOD-ΝΑΝΒβι: ta kasvattamalla bakteereita IPTG:n läsnäollessa.
5 IV.B.3. Klooniin 5-1-1 koodatun polypeptidin tunnistaminen HCV:nä ja NANBH:hon liittyvänä antigeeninä.
Kloonin 5-1-1 HCV:n cDNA:han koodattu polypeptidi tunnistettiin NANBH:hon liittyväksi antigeeniksi toteamalla kokeellisesti, 10 että NANBH-infektoituneiden simpanssien ja ihmisten seerumi reagoi immunologisesti fuusiopolypeptidin SOD-NANB5-i-i, kanssa, joka muodostuu superoksididismutaasista sen N-päässä ja 5-1-1-antigeenistä sen C-päässä. Tämä suoritettiin Western-blottauksen avulla (Towbin et ai. (1979)) 15 seuraavasti.
Rekombinantti bakteerikanta, joka oli transformoitu ekspres-siovektorilla, joka koodasi osassa IV.B.l. kuvattua SOD-NANB5-1-1 -polypeptidiä saatettiin ekspressoimaan fuusiopolypeptidiä 20 kasvattamalla IPTG:n läsnäollessa. Koko bakteeriliuos saatettiin elektroforeesiin polyakryyliamidigeelien läpi SDS:n läsnäollessa Laemmlin (1970) mukaan. Erotetut polypeptidit ·*·*: siirrettiin nitroselluloosafilttereille (Towbin et ai (1979) ) .
Filtterit leikattiin sitten ohuiksi kaistaleiksi ja kaistaleita • · 25 inkuboitiin yksilöllisesti eri simpanssin ja ihmisen seerumin .··*. kanssa. Sidotut vasta-aineet osoitettiin lisäinkubaatiolla 125i- « · lii leimatun lampaan anti-ihmis-Ig:n kanssa, kuten kuvattiin osassa *···’ IV.A.1.
* ' * 30 Western-blottausta varten käytetyn simpanssin seerumin karak- *...· terisointi ja tulokset, jotka ovat esitetyt autoradiografoi- tujen kaistaleiden valokuvassa, on esitetty kuviossa 33.
.···. Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptidejä, • · ·’ inkuboitiin simpanssien seerumin kanssa eri aikoina akuutin • · 35 NANBH:n (Hutchinson-kanta) aikana (kaistat 1 - 16) , hepatitis- • · ·.*·» A-infektioiden aikana (kaistat 17 - 24 ja 26 - 33) ja hepatitis-B-infektion aikana (kaistat 34 - 44). Kaistat 25 ja 45 esittävät positiivisiä kontrolleja, joissa immunoblotteja 83 107620 inkuboitiin seerumin kanssa potilaasta, jota käytettiin rekombinanttikloonin 5-1-1 tunnistamiseen alkuperäisessä lambda-gtll:ssa olevan cDNA-kirjaston seulomisessa (ks. osa IV.A.l.).
5
Kontrollikaistoilla 25 ja 45, kuviossa 23 näkyvä nauha heijastaa vasta-aineiden sitoutumista SOD-fuusiopolypeptidin NANB5-l-i-puoliskoon. Nämä vasta-aineet eivät sitoudu yksin SODrhen, koska tämä on sisällytetty negatiivisena kontrollina näihin 10 näytteisiin, ja se olisi ilmaantunut nauhana, joka liikkuu huomattavasti nopeammin kuin SOD-NANB5-i-i-fuusiopolypeptidi.
Kaistat 1-16 kuviossa 33 esittävät vasta-aineiden sitoutumista neljän simpanssin seeruminäytteisiin; seerumit saatiin 15 juuri ennen NANBH-infektiota ja jaksoittain akuutin infektion aikana. Kuten kuviosta nähdään, koska vasta-aineet, jotka reagoivat immunologi s es ti SOD-NANB5-i-i-polypeptidin kanssa, eivät olleet läsnä seeruminäytteissä, jotka saatiin ennen infektoivan HCV-istutteen antamista ja infektion aikaisen 20 akuutin vaiheen aikana, kaikki neljä eläintä lopulta synnyttivät kiertäviä vasta-aineita tälle polypeptidille akuuttia « · · ·...· vaihetta seuranneen myöhäisemmän vaiheen aikana. Lisänauhat, ··· ’.ί ί joita huomattiin immunobloteissa simpanssien numerot 3 ja 4 tapauksissa, johtuivat taustasitoutumisesta isäntäbakteeri- ···«· 25 proteiineihin.
··· • · • ·
• M
.···. Vastakohtana tuloksille, jotka saatiin NANBH-infektion omaavien • · simpanssien seerumista, vasta-aineiden kehittymistä . fuusiopolypeptidin NANBs-i-i-puoliskolle ei huomattu neljässä 30 simpanssissa, jotka oli infektoitu HAVrllä tai kolmessa • « ·”' simpanssissa, jotka oli infektoitu HBV:llä. Ainoa sitoutuminen *:· näissä tapauksissa oli taustasitoutuminen isäntäbaktee-
'MM
·*”· riproteiineihin, mitä tapahtui myös HCV-infektoiduissa näyt-
• M
,1. teissä.
v·: 35 • · · *· *· Ihmis seerumin, jota käytettiin Western-blottausta varten karakterisointi ja tulokset, jotka nähdään autoradiografoitujen kaistaleiden valokuvassa, ovat esitetyt kuviossa 34.
84 107620
Nitroselluloosakaistaleita, jotka sisälsivät polypeptideitä, inkuboitiin seerumin kanssa, joka oli peräisin ihmisistä eri aikoina NANBH-infektion aikana (kaistat 1 -21), HAV-infektion aikana (kaistat 33 - 40) ja HBV-infektion aikana (kaistat 41 -5 49). Kaistat 25 ja 50 esittävät positiivisia kontrolleja, joissa immunoblotteja inkuboitiin sen potilaan seerumin kanssa, jota käytettiin lambda-gtll-kirjaston alkuperäisessä seulonnassa, jota on kuvattu yllä. Kaistat 22 - 24 ja 26 - 32 esittävät infektoitumattomia kontrolleja, joissa seerumi oli 10 peräisin normaaleista verenluovuttajista.
Kuten nähdään kuviosta 34, yhdeksän NANBH-potilaan seerumit, mukaanlukien seerumi, jota käytettiin lambda-gtll-kirjaston seulomiseen, sisälsivät vasta-aineita fuusiopolypeptidin NANB5-15 l-i-puoliskolle. Kolmen NANBH-potilaan seerumi ei sisältänyt näitä vasta-aineita. On mahdollista, että tulevaisuudessa näihin potilaisiin kehittyy anti-NANB5-i-i-vasta-aineita. On myös mahdollista, että tämä reaktion puuttuminen johtui erilaisesta NANBV-aineesta, joka aiheuttaa taudin yksilöissä, joista 20 otettiin se seerumi, joak ei aiheuttanut vastetta.
• · ·
Kuvio 34 esittää myös, että seerumit monista HAV- ja HBV- «·· ϊ.ί : infektoiduista potilaista eivät sisältäneet anti-NANBe-i-i-vasta- Γ1 2: aineita ja että nämä vasta-aineet eivät olleet myöskään läsnä ·;··· 25 normaalien kontrollien seerumissa. Vaikka yksi HAV-potilas .·3·. näyttääkin sisältävän anti-NANB5_i-i-vasta-aineita, on ··♦ .*··, mahdollista, että tällä potilaalla oli ollut aikaisemmin HCV- • « infektio, koska NANBH:n mahdollisuus on hyvin korkea ja koska . se on usein oireeton.
• ♦ 30 • « ···* Nämä serologiset tutkimukset merkitsevät, että kloonin 5-1-1 ··· cDNA koodaa epitooppeja, jotka tunnistetaan erityisesti ···» 4 sellaisten potilaiden ja eläimien seerumista, joilla on BB-• · · NANBV-infektio. Lisäksi cDNA ei näytä olevan peräisin kädel- • · *···] 35 listen genomista. Kloonista 5-1-1 tai kloonista 81 tehty • » « 2 '· hybridisaatiokoetin ei hybridi soi tunut kontrolli-ihmisten tai - 3 simpanssien infektoitumattomien yksilöiden genomi-DNA:n 4 "Southern"-blotteihin olosuhteissa, joissa ainutkertaisia, 85 107620 yksittäiskopiogeenejä havaitaan. Nämä koettimet eivät myöskään hybridisoituneet kontrollina käytettyyn härän genomi-DNA:n Southern blotteihin.
5 IV.B.4. Kloonien 36, 81 ja 32 HCV:n CDNAiiden yhdistelmään koodaattujen polypeptidien ekspressio HCV-polypeptidi, joka oli koodattu ORF:ään, joka ulottui kloonien 36, 81 ja 32 kautta, ekspressoitiin fuusiopolypep-10 tidinä SOD:n kanssa. Tämä suoritettiin liittämällä yhdistelmä-cDNA, C100, ekspressiokasettiin, joka sisälsi ihmisen superoksididismutaasigeenin, liittämällä ekspressiokasetti hiivan ekspressiovektoriin ja ekspressoimalla polypeptidi hiivassa.
15
Ekspressiokasetti, joka sisälsi ClOO-yhdistelmä-cDNA:ta, joka oli peräisin klooneista 36, 81 ja 32, rakennettiin liittämällä ~1270 emäsparin EcoRI-fragmenttivektorin pS3-56 (myös kutsuttu pS356 :ksi) EcoRI-paikkaan, mistä on tuloksena pS3-56cioo-20 plasmidi. C100:n rakennetta on kuvattu osassa IV.A.16 yllä.
Vektori pS3-56, joka on pBR322:n johdannainen, sisältää *···' ekspressiokasetin, joka muodostuu ihmisen superoksididis- • ·· : mutaasigeenistä ylävirtaan olevan ADH2/GAPDH-hybridihiiva- • · ♦ : V 25 promoottorin ja alavirtaan olevan GAPDH-transkriptiotermi- naattorin. Samanlaista kasettia, joka sisältää nämä kontrol- :***: lielementit ja superoksididismutaasigeenin, on kuvannut Cousens ··· ;***; et ai. (1987) ja sitä kuvataan myös EP-julkaisussa 196,056, • · · joka on julkaistu 1.10.1986 ja joka on tämän keksinnön hakijan 3 0 nimissä. Kasetti vektorissa pS3-56 eroaa kuitenkin Cousens et • « ai. (1987) kasetista siinä, että heterologinen . proinsuliinigeeni ja immunoglobuliinisarana on poistettu ja että superoksididismutaasin gln154:a seuraa sovi tus sekvenssi, mikä sisältää EcoRI-paikan. Sovittimen sekvenssi on: 35 • · 5 1 -AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3' • * ·
AC. CCT. TAA GGT ATT ACT CAG CT
86.
107620
EcoRI-paikka sallii hetrologisen sekvenssin liittämisen, joka sekvenssi, kun se ekspressoidaan kasetin sisältävästä vektorista, antaa polypeptidejä, jotka ovat fuusioituja superoksididismutaasiin oligopeptidilinkkerin kautta, joka 5 sisältää aminohapposekvenssin: -asn-leu-gly-ile-arg-.
pS356-näyte on talletettu 29.4.1988 Budapest Treaty'n ehtojen 10 mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20853 ja sille on annettu talletusnumero 67683. Ehdot ja olosuhteet talletuksen saatavuutta ja siihen käsiksipääsyä ja talletuksen ylläpitoa varten ovat samat kuin osassa II.A. määritellyt NANBV-cDNA:oita varten 15 määritellyt ehdot ja olosuhteet. Tämä talletus on tarkoitettu vain mukavuudeksi, eikä sitä vaadita tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa tässä esitetyn selityksen valossa. Talletettu materiaali liitetään tässä mukaan viitteeksi.
20 Sen jälkeen, kun rekombinantit, jotka sisältävät C100 cDNA-insertin oikeassa orientaatiossa, oli eristetty, ekspres-siokasetti, joka sisälsi C100 cDNA:n pilkottiin pS3-56Cioo:sta BamHI:lla ja -3400 emäsparin fragmentti, joka sisälsi kasetin
IM
V · eristettiin ja puhdistettiin. Tämä fragmentti liitettiin sitten M « • *t: 25 hiivavektorin pAB24:n BamHI-paikkaan.
:***: Plasmidi pAB24, jonka merkittävät piirteet on esitetty kuviossa • · · .*··. 35, on hiivan sukkulavektori, joka sisältää täydellisen 2 pm:n • · · sekvenssin replikaatiota varten (Broach (1981)) ja pBR322-sekvenssit. Se sisältää myös hiivan URA3-geenin, joka on • · ... peräisin plasmidista YEp24 (Botstein et ai. (1979)) ja hiivan • ·
I A J
"· LEU -geenin, joka on peräisin plasmidista pCl/1. EP-julkaisu 116,2 01. Plasmidi pAB24 rakennettiin pilkkomalla YEp24 :***: EcoRI :11a ja religoimalla vektori poistamaan osittaiset 2 um:n • · « .1.^ 35 sekvenssit. Tuloksena oleva plasmidi, YEP24deltaRI, • » Γ*. linearisoitiin pilkkomalla Clal:lla ja liitettiin täydelliseen ’· ** 2 pm: n plasmidiin, joka oli linearisoitu Clal:lla. Tuloksena oleva plasmidi pCBou pilkottiin sitten Xbal:lla ja 8605 87 107620 emäsparin vektorifragmentti geelieristettiin. Tämä eristetty Xbal-fragmentti liitettiin 4460 emäsparin Xbal-fragmenttiin, joka sisälsi LEU2d-geenin, joka oli eristetty pCl/l:stä; LEU2d-geenin orientaatio on samassa suunnassa kuin URA3-geenin.
5 Ekspression liittäminen oli ainutkertaisessa pBR322-sekvenssin BamBI-paikassa, mikä täten katkaisi geenin bakteeriresistenssiä varten tetrasykliinille.
Yhdistelmäplasmidi, joka sisälsi S0S-C100-ekspressiokasetin, 10 pAB24C100-3, transformoitiinhiivakantaan JSC 308 ja myös muihin hiivakantoihin. Solut transformoitiin, kuten on kuvannut Hinnen et ai. (1978) ja ne siirrettiin ura-selektiivisille levyille. Yksittäisiä pesäkkeitä istutettiin leu-selektiiviseen väliaineeseen ja niitä kasvatettiin kyllästymiseen asti.
15 Viljelmä saatettiin ekspressoimaan SOD-ClOO-polypeptidiä (jota kutsutaan C100-3:ksi) kasvattamalla YEP:ssä, joka sisälsi 1 % glukoosia.
Kanta JSC 308 on genotyyppiä MAT leu2, ura3(del) DM15 20 (GAP/ADR1), joka on liitetty ADR1-paikkaan.JSC 308:ssa positiivisen aktivaattorigeenituotteen, ADR1, yliekspressio aikaansaa ylimääräisen tukahduttamisen eston (ADRl-villityypin *···* säädön suhteen) ja kspressoitujen heterologisten proteiinien • · · ; merkittävästi paremman saannon, kun sellaisia proteiineja • · · • 25 syntetisoidaan ADH2 UAS-säätöjärjestelmän kautta. Hiivakannan *ϊ**: JSC 3 08 rakenne on selvitetty yhdessä tämän hakemuksen kanssa :***: jätetyssä US-patenttihakemuksessa, jonka asiamiehen viitenumero • · · on 2300-0229 ja johon tässä viitataan. Näyte JSC 308:sta on • · · talletettu 5.5.1988 ATCCrhen Budapest Treaty1n ehtojen .....: 30 mukaisesti ja sille on annettu talletusnumero 20879. Ehdot ja ... olosuhteet talletuksen saatavuudeksi ja siihen käsiksi * · ^ pääsemiseksi ja talletuksen ylläpitämiseksi ovat samat kuin ne, jotka on määritetty osassa II.A. kannoille, jotka, sisältävät HCV:n cDNA:ita.
* · · 35 * · * · Γ*. Täydellisen C100-3-fuusiopolypeptidin, joka on koodattu * · pAB24C100-3:ssa, tulisi sisältää ihmisen SOD:n 154 aminohappoa aminopäässä, joista viisi aminohappoa on peräisin syn- 88 107620 teettisestä sovittimesta, joka sisältää EcoRI-paikan, 363 aminohappotähdettä, jotka ovat peräisin C100:n cDNA:sta ja viisi karboksipään aminohappoa, jotka ovat peräisin MS2-nukleotidisekvenssistä, joka liittyy HCV:n cDNA-sekvenssiin 5 kloonissa 32. (Ks. osa IV.A.7.). Tämän polypeptidin karboksipään oletettu aminohapposekvenssi, alkaen SOD:n viimeistä edellisestä Ala-tähteestä, on esitetty kuviossa 36; esitettynä on myös nukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidin tätä osaa.
10 IV.B.5. ClOOtaan koodatun polypeptidin tunnistaminen NANBH:hon liittyvänä antigeeninä C100-3-fuusiopolypeptidi, joka on ekspressoitu plasmidista 15 pAB24C100-3 hiivakannassa JSC 308 karakterisoitiin koon suhteen ja C100:aan koodattu polypeptidi tunnistettiin NANBH:hon liittyvänä antigeeninä sen immunologisen reaktiivisuuden mukaan kroonista NANBH:a sairastavan ihmisen seerumin kanssa.
20 C100-3-polypeptidi, joka oli ekspressoitu, kuten kuvattiin osassa IV.B.4, analysoitiin seuraavasti. Hiivan JSC 308 solut ·*·, transformoitiin pAB24:llä tai pAB24C100-3:11a ja ne saatettiin • · • · · ,·;·# ekspressoimaan heterologista plasmidikoodattua polypeptidiä.
• · · . Tuottamaan saatetut hiivasolut 1 ml:ssa elatusainetta (OD65o nm • · · • · * *. 25 ~20) pelletoitiin linkoamalla 10000 kierroksella minuutissa yhden minuutin ajan ja ne liuotettiin pyörteistämällä niitä • · *···' voimakkaasti (10 x 1 min) kahden tilavuusosan kanssa liuosta ja • · · '...· yhden tilavuusosan kanssa lasihelmiä (0,2 nm halkaisijaltaan) .
Liuos sisälsi 50 mM Tris-HCl:a, pH 8,0, 1 nM EDTA, 1 mM *:*·: 30 fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 pg/ml pepstatiinia.Liukenematon materiaali liuoksesta, sisältäen • · · *. C100-3-polypeptidin, kerättiin linkoamalla (10000 kierr./min 5 • · · **” minuuttia) ja se liuotettiin keittämällä 5 minuutin ajan • · *···’ Laemmli SDS-näytepuskurissa. (ks. Laemmli (1970)). Sellainen :]**: 3 5 polypeptidimäärä, joka vastasi 0,3 ml: aa hiivavil jelmää, :*·.· saatettiin elektroforeesiin 10 % : sten polyakryyliamidigeelien » · läpi SDS:n läsnäollessa Laemmlin (1970) mukaisesti. Proteiinis-tandardeja elktroforoitiin samalla geeleillä. Geelit jotka 89 107620 sisälsivät ekspressoituja polypeptidejä joko värjättiin Coomassie-loistavan sinisellä tai ne Western-blotattiin, kuten on esitetty osassa IV.B.2., käyttäen kroonista NANBH:a potevan potilaan seerumia pAB24:stä tai pAB24C100-3:sta ekspressoitujen 5 polypeptidien immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi.
Tulokset esitetään kuviossa 37. Kuviossa 37A polypeptidit värjättiin Coomassie-loistavan sinisellä. pAB24:llä transformoidusta JSC 308:sta ja kahdesta eri JSC-pesäkkeestä, joka JSC 10 oli transformoitu pAB24C100-3:11a peräisin olevat liukenemattomat polypeptidit on esitetty kaistalla 1 (pAB24), ja vastaavasti kaistoilla 2 ja 3. Kaistojen 2 ja 3 vertailu kaistan 1 kanssa osoittaa sen polypeptidin aiheutettua ekspressiota, joka vastaa pAB24C100-3:11a transformoidun JSC 308:n 15 -54000 daltonin molekyylipainoa, mutta jota ekspressiota ei synny pAB24:llä transformoidulla JSC 308:11a. Tätä polypeptidiä on merkitty nuolella.
Kuvio 37B esittää pAB24:llä (kaista 1) tai pAB24C100-3:11a 20 (kaista 2) transformoidussa JSC 308:ssa ekspressoitujen liukenemattomien polypeptidien Western-blotteja. pAB24:stä ... exspressoidut polypeptidit eivät olleet immunologisesti • ·
Hl reaktiivisia NANBH:a sairastavan ihmisen seerumin kanssa.
• · * ]·*/ Kuitenkin, kuten on merkitty nuolella, pAB24C100-3 :11a trans- • ·' 25 formoitu JSC 308 ekspressoi molekyylipainoltaan -54000 daltonin • ’ polypeptidiä, joka reagoi immonologisesti ihmisen NANBH- «·· ·...· seerumin kanssa. Muut immunologisesti reaktiiviset polypeptidit • · · kaistalla 2 saattavat olla tämän -54000 daltonin polypeptidin hajaantumistuotteita tai kasaantumistuotteita.
.·:·>· 30 .·**. IV.B.6. Fuusiopolypeptidin C100-3 puhdistus • · · «
• M
Fuusiopolypeptidi C100-3, joka muodostuu S0D:sta N-päässä ja * · · in-frame C100:n HCV-popypeptidistä C-päässä, puhdistettiin m 35 uutettujen isäntähiivasolujen, joissa polypetidi oli ekspres- • · * .·. : soitu, liukenemattoman fraktion differentiaaliuuttamisen • · · avulla.
90 107620
Fuusiopolypeptidi C100-3 oli ekspressoitu hiivakannassa JSC 308, joka oli transformoitu pAB24C100-3:11a, kuten on kuvattu osassa IV.B.4.. Hiivasolut liuotettiin sitten homogenoimalla, liuoksen liukenematonta materiaalia uutettiin pH:ssa 12 ja C100 5 jäljelle jäävässä liukenemattomassa fraktiossa tehtiin liukenevaksi SDS:ää sisältävässä puskurissa.
Hiivaliuos valmistettiin olennaisesti Nagahuma et ai. (1984) mukaan. Hiivasolususpensio valmistettiin, jossa oli 33 % soluja 10 (v/v) suspendoituna liuokseen (Puskuri A), joka sisälsi 20 mM
Tris-HCl:a, pH 8,0, 1 raM ditiotreitolia ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Suspensionäyte (15 ml) sekoitettiin samanlaiseen tilavuuteen lasehelmiä (0,45 -0,50 mm halkaisijaltaan) ja seosta pyörteistettiin 15 huippunopeudella Super Mixer-laitteessa (Lab line Instruments, Inc.) 8 minuutin ajan. Homogenaatti ja lasihelmet erotettiin toisistaan ja lasihelmiä pestiin kolme kertaa samalla tilavuudella puskuri A:ta, kuin alkuperäisiä solujakin. Pesunesteiden ja homogenaatin yhdistämisen jälkeen liuoksen 20 liukenematon materiaali saatiin linkoamalla homogenaattia 7000 x g:n voimalla 15 minuutin ajan 4°C lämpötilassa, suspendoimalla pelletit uudelleen puskuriin A, jonka tilavuus oli kaksi kertaa se, mitä käytettiin alkuperäisiä soluja varten • · · *.* * ja materiaali pelletoitiin uudelleen linkomalla 15 minuuttia • · · • *.· 25 7000 x g:n voimalla. Tämä pesutapahtuma toistettiin kolme *!**.* kertaa.
«·» • « • · • · · :***; Liuoksen liukenematonta materiaalia uutettiin pH:ssa 12 • · * seuraavasti. Pelletit suspendoitiin puskuriin,joka sisälsi 0,5 30 M NaCl, 1 mM EDTA, jossa suspendointitilavuus oli sama kuin 1,8 • · kertaa se tilavuus, jota käytettiin alkuperäisiä soluja varten.
*" Suspension pH säädettiin lisäämällä 0,2 tilavuusosaa Na- fosfaattipuskurin, pH 12,0. Sekoituksen jälkeen suspensio lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C lämpötilassa ja .··. 35 neste poistettiin. Uuttaminen toistettiin kaksi kertaa. Uutetut • · pelletit pestiin suspendoimalla ne 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA ja ♦ « · * *, käyttäen kaksinkertaista tilavuutta alkuperäisiä soluja varten 91 107620 käytettyyn verrattuna, mitä seurasi linkous 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C:ssa.
Uutetuissa pelleteissä oleva C100-3-polypeptidi tehtiin 5 liukenevaksi käsittelemällä SDS:llä. Pelletit suspendoitiin puskuriin A, jonka tilavuus oli 0,9 kertaa alkuperäisiä soluja varten käytetty tilavuus ja 0,1 tilavuusosaa 2 % SDS:ää lisättiin. Kun suspensiota oli sekoitettu, se lingottiin 7000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4°C:ssa.Tuloksena olevia pellettejä 10 uutettiin vielä kolme kertaa SDStllä. Tuloksena olleet nesteet, jotka sisälsivät C100-3:n, yhdistettiin.
Tämä menettely puhdistaa C100-3:n enemmän kuin 10-kertaiseksi hiivahomogenaatin liukenemattomasta fraktiosta ja polypeptidiä 15 saadaan talteen enemmän kuin 50 %.
Fuusiopolypeptidin puhdistettu valmiste analysoitiin polyak-ryyliamidigeelillä elektroforeesilla Laemmlin (1970) mukaan. Tähän analyysiin perustuen polypeptidi oli enemmän kuin 80 % 20 puhdasta ja sen ilmeinen molekyylipaino oli ~54000 daltonia.
... IV.C. RNA:n, joka hybridisoituu HCV:n cDNA:n kanssa, tunnis- • « *** taminen infektoituneissa yksilöissä • · · • · · ♦ · · • · ♦ : 25 IV.C.1. RNA:n, joka hybridisoituu HCV:n cDNA:n kanssa, tun- **** ni s taminen simpanssin, jolla on NANBH, maksassa • · · • · • · ♦ ♦♦ NANBH:ta sairastavan simpanssin maksasta peräisin olevan RNA:n esitettiin sisältävän sellaisia RNA-lajeja, jotka ..·;··· 30 hybridisoituivat HCV:n cDNArn kanssa, joka sisältyi klooniin 81 .*··. Northern-blottauksen avulla seuraavasti.
• · · • · · ···: RNA eristettiin simpanssin maksabiopsiasta, josta oli peräisin • · · korkean tiitterin plasma (ks. osa IV.A.1.) käyttäen tekniikkaa, .**. 35 jonka on kuvannut Maniatis et ai. (1982) kokonais-RNA:n .·. : eristämiseksi imettäväissoluista ja sen erottamiseksi poly-A+- • · · ja poly-A"fraktioihin. Näille RNA-fraktioille suoritettiin elektroforeesi formaldehydi/agaroosigeelillä (1 % w/v), ja ne 92 107620 siirrettiin nitroselluloosalle. (Maniatis et ai. (1982)). Nitroselluloosafiltterit hybridisoitiin radioleimatun kloonin 81 HCVtn cDNA:n kanssa (ks. kuvio 4 insertin nukleotidisekvenssiä). Radioleimatun koettimen valmistamiseksi 5 kloonista 81 eristetty HCV:n cDNA-insertti radioleimattiin 32P:llä nicktranslaation avulla käyttäen DNA-polymeraasi I:tä (Maniatis et ai. (1982)). Hybridisaatiota suoritettiin 18 tuntia 42°C lämpötilassa liuoksessa, joka sisälsi 10 % (w/v) dekstraanisulfaattia, 50 % (w/v) deionisoitua formamidia, 750 10 mM NaCl, 75 mM Na-sitraattia, 20 mM Na2HP04, pH 6,5, 0,1 % SDS, 0,02 % (w/v) härän seerumialbumiinia (BSA), 0,02 % (w/v) Ficoll-400, 0,02 % (w/v) polyvinyylipyrrolidonia, 100 pg/ml lohen sperma-DNA:ta, joka oli rikottu ääniaaltojen avulla ja denaturoitu ja 106 cpm/ml nicktransloitua cDNA-koetinta.
15
Autoradiografi koetetusta filtteristä esitetään kuviossa 38. Kaista 1 sisältää 32P-leimattua restriktiofragmenttimarkkeria. Kaistat 2-4 sisältävät simpanssin maksan RNA:ta seuraavasti: kaista 2 sisältää 30 pg kokonais-RNA:ta; kaista 3 sisältää 30 20 pg poly-A-RNA:ta; ja kaista 4 sisältää 20 pg poly-A+-RNA:ta. Kuten on esitetty kuviossa 38 NANBH:ta sairastavan simpanssin maksa sisältää toistensa suhteen sukulaisia olevien poly-A+- • · · ·...* RNA-molekyylien heterogeenisen populaation, mikä hybridisoituu HCV:n cDNA-koettimeen ja mikä näyttää olevan kooltaan noin 5000 ;*·*; 25 nukleotidia - noin 11000 nukleotidia. Tämä RNA, mikä • · hybridisoituu HCV:n cDNA:han, voisi edustaa virusgenomeita .···. ja/tai virusgenomin erityisiä transkriptioita.
• · • · · • · ♦ • · ♦ ·
Osassa IV.C.2. alla kuvattu koe on yhtäpitävä sen ehdotuksen 30 kanssa, että HCV sisältää RNA-genomin.
• · • · · • » ...* IV.C.2. HCVistä peräisin olevan RNA:n tunnistaminen sairaiden 1 yksilöiden seerumista • · · · • · · • » » · i·· 35 Nukleiinihapot uutettiin partikkelista, jotka oli eristetty • · *···’ korkean tiitterin simpanssin NANBH-plasmasta, kuten kuvattiin osassa IV.A. 1.. Eristettyjen nukleiinihappojen näytteitä (vastaten 1 ml:aa alkuperäistä plasmaa) suspendoitiin uudestaan 93 107620 20 vitaan Hepes:ä, pH 7,5, 1 mM EDTA:aan, ja 16 pg/ml hiivan liukoista RNA:ta. Näytteet denaturoitiin keittämällä 5 minuuttia, mitä seurasi välittömästi pakastus ja niitä käsiteltiin ribonukleaasi A:11a (5 μΐ, joka sisälsi 0,1 mg/ml 5 ribonukleaasi A:ta 25 mM:ssa EDTA:ssa, 40 mM Hepes, pH 7,5) tai deoksinukleaasi I:llä ( 5 μΐ, joka sisälsi 1 yksikön deoksinukleaasi I:tä 10 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,5); vertailunäytteitä inkuboitiin ilman entsyymiä. Inkubaation jälkeen lisättiin 230 μΐ jääkylmää 2XSSC:tä, joka sisälsi 2 10 pg/ml hiivan liukoista RNA:ta ja näytteetsuodatettiin nitro-selluloosafilttereillä. Filtterit hybridisoitiin cDNA-koet-timella, joka oli peräisin kloonista 81 ja joka oli nick-translaation avulla 32P-leimattu. Kuvio 39 esittää filtterin autoradiografin. Hybridisaatiosignaaleita havaittiin deok-15 sinukleaasikäsitellyissä ja vertailunäytteissä (kaistat 2 ja vastaavasti 1), mutta niitä ei havaittu ribonukleaasikä-sitellyssä näytteessä (kaista 3). Täten koska ribonukleaasi-A-käsittely tuhosi nukleiinihapot, jotka oli eristetty partikkeleista ja deoksinukleaasi-I-käsittelyllä ei ollut vai-20 kutusta, todisteet ehdottavat vakavasti, että HCV:n genomi koostuu RNA:sta.
• · · • · Y.'. IV.C.3. Amplifioitujen HCV:n mukleiinihapposkvenssien, jotka • · · .* . ovat peräisin HCV:n nukleiinihapposekvensseistä NANBH:ta • · · • ·* 25 sairastavan simpanssin maksa- ja plasmanäytteistä, osoittaminen • · ·...· NANBH:ta sairastavien simpanssien ja vertailusimpanssien maksa- ··· :...ς ja plasmanäytteissä läsnäolevia HCV:n nukleiinihappoja amplifioitiin käyttäen olennaisesti polymeraasiketjureaktio-. *:··· 30 (PCR)-tekniikkaa, jonka on kuvannut Saiki et ai. (1986).
.1. Primerioligonukleotidit olivat peräisin kloonin 81 tai • · · kloonien 36 ja 37 HCV:n cDNA-sekvensseistä. Amplifioidut ··· •••j sekvenssit osoitettiin geelielektroforeesin ja Southern- *...* blottauksen avulla käyttäen koettimina sopivaa cDNA-oligomee- ·1· 35 riä, jonka sekvenssi oli kahden primerin väliseltä alueelta, ··· i mutta ei sisältynyt niihin.
• · 94 107620
Amplifikaatiojärjestelmän avulla tutkittavat RNA-näytteet, jotka sisälsivät HCV-sekvenssejä, eristettiin kolmen NANBH:ta sairastavan simpanssin ja kahden vertailusimpanssin maksa-biopsioista. RNA-fraktion eristäminen tehtiin gaunidiinitio-5 syanaattimenettelyllä, jota kuvattiin osassa IV.C.l..
Amplifikaatiojärjestelmällä tutkittavat RNA-näytteet eristettiin myös kahden NANBH:ta sairastavan simpanssin ja yhden vertailusimpanssin plasmasta ja myös vertailusimpanssien 10 plasmojen varastosta. Yhden sairaan simpanssin CID/ml oli 106 tai enemmän ja toisen sairaan simpanssin arvo oli 105 tai enemmän.
Nukleiinihapot uutettiin plasmasta seuraavasti. Joko 0,1 ml tai 15 0,01 ml plasmaa laimennettiin lopulliseen 1,0 ml:n tilavuuteen TENB/proteinaasi K/SDS-liuoksella (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml proteinaasi K:ta ja 0,5 % SDS) sisältäen 10 pg/ml polyadenyylihappoa ja sitä inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa. Tämän proteinaasi-K-pilkkomisen jälkeen 20 tuloksena olevat plasmafraktiot deproteinisoitiin uuttamalla TE:llä (10,0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) kyllästetyllä fenolilla. Fenolifaasi erotettiin linkoamalla ja sitä uutettiin • · uudelleen TENBrllä, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Kustakin • ♦ · uutoksesta tuloksena olevat vesifaasit yhdistettiin ja niitä • · · ; ·* 25 uutettiin kahdesti samalla tilavuudella 99:1-seoksella * * kloroformi/isoamyylialkoholia. Linkoamalla tapahtuneen faasin ·«· *...· erottamisen jälkeen vesif aasi saatettiin lopulliseen 0,2 M Na- asetaattipitoisuuteen ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta etanolia. Saostetut nukleiinihapot ♦.··· 30 palautettiin ultralinkouksen avulla SW 41-roottorissa 38000 .···. kierr./min 60 minuutin ajan 4°C:ssa.
« · · • · · · • ··
Edellisen lisäksi korkean tiitterin simpanssin plasmaa ja * 35 varastoitua vertailuplasmaa uutettiin vuoronperään 50 pgrlla • · · .·. : poly-A-kantajaa menettelyllä, jota ovat kuvanneet Chomcyzski ja • · ·
Sacchi (198-7-) . -Tämä menettely käyttää hapanta guanidiini-tiosyanattiuutosta. RNA palautettiin linkoamalla 10000 95 107620 kierr./min 10 minuutin ajan 4°C:ssa Eppendorf microfuge-laitteessa.
Kahdessa tapauksessa, ennen cDNA:n synteesiä PCR-reaktiossa, 5 nukleiinihapot, jotka oli uutettu plasmasta proteinaasi K/SDS/fenoli-menetelmällä, puhdistetiin edelleen sitomalla ne S- ha S Elutip-R-kolonneihin ja eluoimalla ne sieltä. Seurattu menettely oli valmistajan ohjeiden mukainen.
10 PCR-reaktiota varten mallina käytetty cDNA oli peräisin nukleiinihapoista (joko kokonaisnukleiinihapoista tai RNArsta), jotka oli valmistettu yllä kuvatueti. Etanolisaostuksen jälkeen saostuneet nukleiinihapot kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen DEPCrllä käsiteltyyn tislattuun veteen. Nukleiinihappojen 15 sekundääriset rakenteet rikottiin kuumentamalla 65°C:ssa 10 minuutin ajan ja näytteet jäähdytettiin välittömästi jäissä. cDNA syntetisoitiin käyttäen 1 - 3 pg simpanssin kokonais-RNA:ta maksasta tai nukleiinihapoista (tai RNA:sta), jotka oli uutettu 10 - 100 pirsta plasmaa. Synteesi käytti 20 käänteistranskriptaasia ja tapahtui 25 μ1:η reaktiossa käyttäen valmistajan, BRL, määrittelemää toimintaohjetta. cDNA-synteesiin käytetyt primerit olivat niitä, joita käytettiin • · · myös alla kuvatussa PCR-reaktiossa. cDNA-synteesiä varten ·*· :.Σ ί olevat kaikki reaktioseokset sisälsivät 23 yksikköä i**|: 25 ribonukelaasi-inhibiittoria, RNASIN™ (Fisher/Promega) . cDNA- ·;··· synteesin jälkeen reaktioseokset laimennettiin vedellä, niitä .***. .keitettiin 10 minuuttia ja jäähdytettiin nopeasti jäissä.
··· ··· • · • · PCR-reaktiot suoritettiin olennaisesti valmistajan (Cetus- 30 Perkin-Elmer) ohjeiden mukaisesti, paitsi että lisättiin 1 pg *..* ribonukleaasi A:ta. Reaktiot suoritettiin 100 μ1:η lopullisessa • · ···* tilavuudessa. PCR suoritettiin 35 syklin ajan käyttäen ·:· lämpötiloina 37°C, 72°C ja 94°C.
* · · · • · · « · • · • · · 35 cDNA-synteesiä ja PCR-reaktioita varten olevat primerit olivat • · peräisin joko kloonin 81, kloonin 36 tai kloonin 37b HCV:n *· cDNA-sekvensseistä. (Kloonien 81, 3.6 ja 37b HCV:n cDNA- sekvenssit on esitetty kuvioissa 4, 5 ja vastaavasti 10).
96 107620
Kahden 16-meerin primerin sekvenssit, jotka olivat peräisin kloonista 81 olivat: 5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' 5 j a 5' GAT AAC CTC TGC CTG A3'
Kloonista 36 peräisin olevan primerin sekvenssi oli: 5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.
10
Kloonista 37b peräisin olevan primerin sekvenssi oli: 5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.
15 PCR-reaktioissa primeriparit koostuivat joko kloonista 81 peräisin olevista kahdesta 16-meeristä tai 16-meeristä kloonista 36 ja 16-meeristä kloonista 37b.
PCR-reaktion tuotteet analysoitiin erottamalla tuotteet 20 alkaalisella geelielektroforeesilla, mitä seurasi Southern- blottaus ja amplifioituneiden HCV:n cDNA-sekvenssien osoit- ···, taminen 32P-leimatulla sisäisellä oligonukleotidikoettimella, • · joka oli peräisin siltä HCV:n cDNA:n alueelta, mikä ei mene t · · *· • · · ,* , päällekkäin primereiden kanssa. PCR-reaktioseoksia uutettiin • · · * ·] 25 fenoli/kloroformilla ja nukleiinihapot saostettiin vesifaasista ‘ * suolalla ja etanolilla. Saostuneet nukleiinihapot kerättiin • · · *...· linkoamalla ja ne liuotettiin tislattuun veteen. Näyte-erille • · · :,..ί tehtiin elektroforeesi 1,8 % alkaalisella agaroosigeeleillä.
60, 108 ja 161 nukleotidin pituista yksisäikeistä DNA:ta ·:*·· 3 0 saatettiin samanaikaisesti elektroforeesiin geeleillä ·***. molekyylipainon merkkeinä. Elektroforeesin jälkeen geelillä
··· TM
·. olevat DNA:t siirrettiin Biorad Zeta Probe -paperille.
··· ··*! Esihybridisointi- ja hybridisointi- ja pesuolosuhteet olivat • · valmistajan (Biorad) ohjeiden mukaisia.
:***: 35 • · · ί Amplif ioituj en HCV:n cDNA-sekvenssien hybridi säätiöön ja • · osoittamiseen käytetyt koettimet olivat seuraavia. Kun PCR-primeripari johdettiin kloonista 81, koetin oli 108-meeri, 97 107620 jonka sekvenssi vastasi sitä, mikä sijaitsee kahden primerin sekvenssien välisellä alueella. Kun PCR-primeripari oli peräisin klooneista 36 ja 37b, koetin oli kloonista 35 peräisin oleva nicktransloitu HCV:n cDNA-insertti. Primerit ovat 5 peräisin kloonin 37b insertin nukleotideista 155 - 170 ja kloonin 36 insertin nukleotideista 206 -268. HCV:n cDNA-insertin 3'-pää kloonissa 35 menee päällekkäin kloonin 36 insertin nukleotidien 1 - 186 kanssa; ja kloonin 35 insertin 5'-pää menee päällekkäin kloonin 37b insertin nukleotidien 207 10 -269 kanssa. (Vrt. kuviot 5, 8 ja 10). Täten kloonin 35 cDNA- insertti ulottuu osan alueen yli klooneista 36 ja 37b peräisin olevien primereiden sekvenssien välissä ja se on hyödyllinen koetin nämä primerit sisältäviä amplifioituja sekvenssejä varten.
15
Maksanäytteistä peräisin olevan RNA:n analyysi tehtiin ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen molempia primereiden ja koettimien sarjoja. Kolmen NANBH:ta sairastavan simpanssin maksasta saatu RNA antoi positiivisia hybridisaatiotuloksia 20 odotetun kokoisille amplifikaatiosekvensseille (161 ja 586 nukleotidia klooneille 81 ja 36 ja vastaavasti 37b), kun taas ... vertailusimpanssit antoivat negatiivisia hybridisaatiotuloksia.
*”·1 2 Samoja tuloksia saatiin, kun kokeet toistettiin kolme kertaa.
• · a • · · • · · • · ♦ : 25 Plasmasta peräisin olevien nukleiinihappojen ja RNA:n analyysi ***** tehtiin myös ylläolevan menettelyn mukaisesti käyttäen t·· kloonista 81 saatuja primereita ja koetinta. Plasmat olivat ;3: NANBH:ta sairastavista simpansseista, vertailusimpanssista, ja ·«· vertailusimpanssien varastoiduista plasmoista. Molemmat NANBH-30 plasmat sisälsivät nukleiinihappoja/RNA:ta, joka antoi .···. positiivisia tuloksia PCR-amplifioidussa analyysissä, kun taas . 1l1 molemmat vertailuplasmat antoivat negatiivisisa tuloksia. Näitä tuloksia on saatu toistuvasti useita kertoja.
• ·· • 1 • · ·1· ' 35 • m ··· · 2 m · 1 • · · 3 • ♦ 98 107620 IV.D. Radioimmunologinen analyysi HCV-vasta-aineiden osoittamiseksi infektoituneiden yksiöiden seerumissa
Kehitettiin kiinteän faasin radioimmunologisia analyysejä 5 vasta-aineiden havaitsemiseksi HCV-antigeeneille perustuen Tsu'n ja Herzenberg1 in julkaisuun (1980). Mikrotiitterilevyt (Immulon 2, Removawell-kaistaleet) päällystetään puhdistetuilla polypeptideillä, jotka sisältävät HCV-epitooppeja. Päällystettyjä levyjä inkuboidaan joko ihmisen seeruminäyt-10 teiden, joiden epäillään sisältävän vasta-aineita HCV-epitoo-peille, kanssa tai sopivien vertailujen kanssa. Inkubaation aikana vasta-aine, jos sellainen on läsnä, sitoutuu immuno-logisesti kiinteän faasin antigeeniin. Sitoutumattoman materiaalin poistamisen jälkeen ja mikrotiitterilevyjen pesun 15 jälkeen osoitetaan ihmisen vasta-aine-NANBV-antigeenikompleksit inkuboimalla 125I-leimatun lampaan ei-ihmisimmunoglobuliinin kanssa. Sitoutumaton leimattu vasta-aine poistetaan imun avulla ja levyt pestään. Yksittäisten kuoppien radioaktiivisuus määritetään; sidotun ihmisen anti-HCV-vasta-aineen määrä on 20 verrannollinen kuopan radioaktiivisuuteen.
... IV.D.l. Fuusiopolypeptidin SOD-NANB5-1-1 puhdistaminen « · • · · « · · • · · ·* ‘ Fuusiopolypeptidi SOD-NANB5-1-1, joka on ekspressoitu yhdis- «* · : *.· 25 telmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.l., puhdistet- t tiin yhdistelmä-E. Colista differentiaaliuuttamalla solu-uutteita urealla, mitä seurasi kromatografia anionin- ja kationinvaihtopylväissä seuraavasti.
··« ....: 30 l litran viljelmän sulatetut solut suspendoitiin uudestaan 10 • «
.···, ml:aan 20 % (w/v) sukroosia, joka sisälsi 0,01 M Tris-HCl, pH
8,0, ja 0,4 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 lisättiin. Viiden minuutin ..ΙΓ kuluttua 0°C:ssa seos lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuuttia.
»«·
Tuloksena oleva pelletti suspendoitiin 10 ml:aan 25 % (w/v)
.···. 35 suksroosia, joka sisälsi 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM
• · ,***; fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 ug/ml pepstatiini * · · A:ta, mitä seurasi 0,5 ml:n lisäys-lysotsyymiä (10 mg/ml) ja 10 minuutin inkubaatio 0°C:ssa. Sen jälkeen kun oli lisätty 10 ml 99 107620 1 % (v/v) Triton X-100 0,06 H Tris-HCl:ssä, pH 8,0, 1 mM EDTA, seosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia 0°C:ssa silloin tällöin ravistaen. Tuloksena oleva viskoosi liuos homogenoitiin kuljettamalla se kuusi kertaa kooltaan 20 gauge'n 5 injektioneulan läpi ja sitä lingottiin 13000 x g:ssä 25 minuutin ajan. Pelletoitu materiaali suspendoitiin 5 ml:aan 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0, ja suspensiota lingottiin 4000 x g:ssä 10 minuutin ajan. Pelletti, joka sisälsi SOD-NANB5-1-1- fuusioproteiinin, liuotettiin 5 ml:aan 6 M ureaa 0,02 M Tris- 10 HCl:ssä, pH 8,0, 1 mM ditiotreitolia (puskuri A) ja se pantiin Q-Sepharose Fast Flow-merkkiseen pylvääseen, joka oli tasapainotettu puskuri A:11a. Polypeptidit eluoitiin 0,0 - 0,3 M NaCl:n puskuri A:ssa olevalla lineaarisella gradientilla.
Eluoinnin jälkeen fraktiot analysoitiin polyakryyyliamidigee- 15 lielektroforeesilla SDS:n läsnäollessa niiden SOD-NANB5-1-1- pitoisuuden määrittämiseksi. Fraktiot, jotka sisälsivät tätä polypeptidiä, yhdistettiin ja dialysoitiin 6 M ureaa vastaan
0,02 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,0, 1 mM
ditiotreitolissa (puskuri B). Dialysoitu näyte pantiin puskuri 20 B:llä tasapainotettuun S-Sepharose Fast Flow-pylvääseen ja polypeptidit eluoitiin 0,0 - 0,3 M NaCl:n puskuri B:ssä ... olevalla lineaarisella gradientilla. Fraktiot analysoitiin ·*·* polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla SOD-NANB5-i-i:n ♦ » · ]·* * läsnäolon selvillesaamiseksi ja sopivat fraktiot yhdistettiin.
* · · : .* 25 *·**· SOD-NANB5-i-i-polypeptidin lopullinen valmiste tutkittiin ··· elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läs-Γ**: näollessa. Tähän analyysiin perustuen valmiste oli yli 80 % puhdas.
3 0 V · · .···, IV.D. 2. Fuusiopolypeptidin SOD-NANBbi puhdistaminen ··« ♦ ..ΙΓ Fuusiopolypeptidi SOD-ΝΑΝΒβι, joka on ekspressoitu yhdis- «·» i.#,: telmäbakteerissa, kuten on kuvattu osassa IV.B.2., puhdistet- ,···. 3 5 tiin yhdistelmä-E.Colista solu-uutteiden differentiaaliuut- ,·]*; tamisen avulla urealla, mitä seurasikromatografia anionin- ja • ·· kationinvaihtopylväissäkäyttäen menettelyä, jota on kuvattu 100 107620 fuusiopolypeptidin SOD-NANB5-1-1 eristämisen yhteydessä (ks. osa IV.D.l.).
Lopullinen SOD-NANBsi-polypeptidin valmiste tutkittiin e-5 lektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeleillä SDS:n läsnäollessa. Perustuen tähän analyysiin valmiste oli yli 50 % puhdas.
IV.D.3. HCV-epitooppien vasta-aineiden osoittaminen kiinteän 10 faasin radioimmunologisella analyysillä
Seeruminäytteet 32 potilaasta, joiden oli diagnosoitu sairastavan NANBH.-a, analysoitiin radioimmunologisella analyysillä (RIA) sen määrittämiseksi, havaitaanko vasta-aineita HCV-15 epitoopeille, jotka ovat läsnä fuusiopolypeptideissä SOD-NANB5-1-1 ja SOD-NANBsi.
Mikrotiitterilevyt päällystettiin SOD-NANB5-1-1:11a tai SOD-NANB8i:llä, jotka oli osittain puhdistettu osien IV.D.l. ja 20 vastaavasti IV.D.2. mukaisesti. Analyysit suoritettiin seuraavasti .
/’*: 100 μΐ näytteitä, jotka sisälsivät 0,1 - 0,5 pg SOD- NANB5-1-1:a tai SOD-NANB8i:a 0,125 M Na-boraattipuskurissa, pH 25 8,3, 0,075 M NaClrssa (BBS) lisättiin mikrotiitterilevyn • · (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips) kuhunkin kuoppaan. Levyä • · inkuboitiin 4°C:ssa yli yön kosteassa kammiossa, minkä jälkeen • ·
Hl proteiiniliuos poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa • · *·*’ BBS:llä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST) . Ei-spesifisen 30 sitoutumisen estämiseksi kuopat peitettiin härän seerumin * * albumiinilla (BSA) lisäämällä 100 μΐ 5 mg/ml:n BSA-liuosta • · · *...· BBS:ssä, mitä seurasi 1 tunnin inkubaatio huoneenlämpötilassa; tämän inkubaation jälkeen liuos poistettiin. Päällystetyissä ···· .···. kuopissa olevat polypeptidit saatettiin reagoimaan seerumin • · ’·* 35 kanssa lisäämällä 100 μΐ seeruminäytteitä, jotka oli
laimennettu 1:100 0,01 M Na-fosfaattipuskuriin, pH 7,2, 0,15 M
• · :.*·· NaCl (PBS) sisältäen 10 mg/ml BSA:ta ja inkuboitiin seerumia sisältäviä kuoppia 1 tunti 37°C:ssa. Inkubaation jälkeen 101 107620 seeruminäytteet poistettiin imulla ja kuopat pestiin 5 kertaa BBST:llä. Anti-NANBs-i-i ja anti-ΝΑΝΒβι, jotka olivat sitoutuneet fuusiopolypeptideihin, määritettiin kiinnittämällä 125I-leimattua F' (ab)2-lampaan anti-ihmis IgG:tä päällystettyihin 5 kuoppiin. 100 μ1:η näytteitä leimattua koetinta (spesifinen aktiivisuus 5-20 pCi/pg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja 5 pesua BBST:llä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin 10 laskemalla laskurissa, joka havaitsee gammasäteilyn.
Anti-NANB5-1-1:n ja anti-NANBsi:n havaitsemisen tulokset yksilöistä, joilla oli NANBH, on esitetty taulukossa 1.
15 • · · ··· ··♦ • ♦ · • ♦ · ♦ ·♦ ♦ « · · « · • « • · • · · • · • · ♦ · 9 ♦ ♦♦ • · • · ««· • ♦ • · · • « « ·· · » • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · ♦ · • · · • · · • · 102 107620
Taulukko 1
Anti-5-l-l:n ja anti-81:n osoittaminen NANB-, HAV- ja HBV-potilaiden seerumista 5
Potilas
viite- S/N
numero Diagnoosi Anti-5-1-1 Anti-81 10 1. 281 Kroon. NANB, IVD2 0,77 4,20
Kroon. NANB, IVD 1,14 5,14
Kroon. NANB, IVD 2,11 4,05 2. 291 AVH3, NANB, ajoitt. 1,09 1,05 15 Kroon. NANB 33,89 11,39
Kroon. NANB 36,22 13,67 3. 3 01 AVH, NANB, IVD 1,90 1,54
Kroon. NANB, IVD 34,17 30,28 20 Kroon. NANB, IVD 32,45 30,84 4. 31 Kroon. NANB, PT4 16,09 8,05 5. 321 Myöh. AVH, NANB, IVD 0,69 0,94 25 Myöh. AVH, NANB, IVD 0,73 0,68 6. 3 31 AVH, NANB, IVD 1,66 1,96 AVH, NANB, IVD 1,53 0,56 30 7. 341 Kroon. NANB, PT 34,40 7,55
Kroon. NANB, PT 45,55 13,11
Kroon. NANB, PT 41,58 13,45
Kroon. NANB, PT 44,20 15,48 ··· 35 8. 351 AVH, NANB, IVD 31,92 31,95 "terve" äskett.
*·* * NANB, AVH 6,87 4,45 • · · • · · • · 9. 36 Myöh. AVH, NANB, PT 11,84 5,79 40 10. 37 AVH, NANB, IVD 6,52 1,33 • · • · « 11. 38 Myöh. AVH, NANB, PT 39,44 39,18 45 12. 39 Kroon. NANB, PT 42,22 37,54 • · · · · 13. 40 AVH, NANB, PT 1,35 1,17 • · ’·* 14. 41 Kroon. NANB?, PT 0,35 0,28 ·:· 50 *::: 15. 42 avh, nanb, ivd 6,25 2,34 • · • · • · · 16. 43 Kroon. NANB, PT 0,74 0,61 • * • · .·!*: 55 17. 44 AVH, NANB, PT 5,40 1,83 • · · • · 18. 45 Kroon. NANB, PT 0,52 0,32 5 103 107620
Potilas
viite- S/N
numero Diagnoosi Anti-5-1-1 Anti-81 19. 46 AVH, NANB 23,35 4,45 20. 47 AVD, tyyppi A 1,60 1,35 10 21. 4 8 AVH, tyyppi A 1,30 0,66 22. 49 AVH, tyyppi A 1,44 0,74
23. 50 Päätt. äskett. AVH
15 tyyppi A 0,48 0,56 24. 51 AVH, tyyppi A 0,68 0,64 Päätt. AVH, tyyppi A 0,80 0,65
20 25. 52 Päätt. äskett. AVH
tyyppi A 1,38 1,04
Päätt. äskett. AVH
tyyppi A 0,80 o,65 25 26. 53 AVH, tyyppi A 1,85 1,16
Päätt. äskett. AVH
tyyppi A 1,02 0,88 27. 54 AVH, tyyppi A 1,35 0,74 30 28. 55 Myöh. AVH, HBV 0,58 0,55 29. 56 Kroon. HBV 0,84 1,06 ·”]: 35 30. 57 Myöh. AVH, HBV 3,20 1,60 • · · * 31. 58 Kroon. HBV 0,47 0,46 • · * • · · ! \ 32. 591 AVH, HBV 0,73 0,60 4 0 terveht. AVH, HBV 0,43 0,44 • · « *···: 33. 601 AVH, HBV 1,06 0,92 terveht. AVH, HBV 0,75 0,68 • · · 45 34. 611 AVH, HBV 1,66 0,61 terveht. AVH, HBV 0,63 0,36 • · .·***: 35. 621 AVH, HBV 1,02 0,73 terveht. AVH, HBV 0,41 0,42 ··· 50 *::: 36. 631 AVH, HBV 1,24 1,31 terveht. AVH, HBV 1,55 0,45 i*'i 37. 641 AVH, HBV 0,82 0,79 55 terveht. AVH, HBV 0,53 0,37 • · · • · 38. 651 AVH, HBV 0,95 0,92 terveht. AVH. HBV 0.70 0.50 104 107620 39. 661 AVH, HBV 1,03 0,68 terveht. AVH, HBV 1,71 1,39 5 1 jaksottaisia seeruminäytteitä saatavissa näistä potilaista 2 IVD = Intravenous Drug User = suonensisäisten lääkkeiden käyttäj ä 3 AVH = Acute Viral Hepatitis = akuutti virushepatiitti 4 PT = Post transfusion = verensiirron jälkeinen.
10
Kuten nähdään taulukosta 1, 19 32:sta seerumista potilaista, joilla oli diagnosoitu olevan NANBH, oli positiivisia SOD-NANB5-1-1:ssä ja SOD-NANBsi:ssä läsnä olevia HCV-epitooppeja vastaan suunnattujen vasta-aineiden suhteen.
15
Kuitenkaan seeruminäytteet, jotka olivat positiivisisa, eivät olleet samalla tavalla reaktiivisia SOD-NANB5-1-1 :n ja SOD- NANBsitn kanssa. Potilaasta No. 1 otetut seeruminäytteet olivat positiivisia S0D-NANB81:n suhteen , mutteivät SOD-NANB5-1-1 :n 20 suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 10, 15 ja 17 olivat positiivisia SOD-NANBs-i-i:n suhteen, mutteivät SOD-NANBsi:n suhteen. Seeruminäytteet potilaista numerot 3, 8, 11 ja 12 reagoivat samalla tavalla molempien fuusiopolypeptidien kanssa, kun taas seeruminäytteet potilaista numerot 2, 4, 7 ja 9 olivat 25 2 - 3 kertaa korkeampia reaktiossaan SOD-NANB5.1-1 :n kanssa kuin ·*·. SOD-NANBsi :n kanssa. Nämä tulokset ehdottavat, että NANB5-1-1 ja • ·
• M
NANBsi voivat sisältää ainakin kolme erilaista epitooppia; s.o.
* » 1 on mahdollista, että kukin polyppetidi sisältää ainakin yhden • · ainutkertaisen epitoopinja että näillä kahdella polypeptidillä 30 on ainakin yksi yhteinen epitooppi.
• · * · • · · ··· IV.D.4. Kiinteän faasin RIA;n spesifisyys NANBH: lie *:**: Kiinteän faasin NANBH:ta varten olevien RlA:iden spesifisyys ·***: 35 kokeiltiin käyttäen analyysiä sellaisten potilaiden seerumiin, ·· · \ joilla oli HAV tai HBV ja vertailuyksilöiden seerumiin. An- **** alyysit käyttäen osittain puhdistettua SOD-NANB5-1-1:a ja SOD- • · *···’ NANBsi:a suoritettiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.D.3., paitsi että seerumi oli peräisin potilaista, joilla 40 oli aikaisemmin diagnosoitu joko HAV tai HBV tai yksilöistä, • ·
jotka olivat veripankkiluovuttajia. Tulokset HAV- tai HBV-sairaiden notilaiden seerumista on esitetty taulukossa 1. RIA
105 107620 suoritettiin käyttäen 11 seeruminäytettä HAV-sairaista potilaista ja 20 seeruminäytettä HBV-sairaista potilaista.
Kuten nähdään taulukosta 1, mikään näistä seerumeista ei antanut positiivista immunologista reaktiota BB-NANBV-5 epitooppeja sisältävien fuusiopolypeptidien kanssa.
Suoritettiin RIA käyttäen NANB5-i-i-antigeeniä vertailuyksilöiden seerumin immunologisen reaktiivisuuden määrittämiseksi. 230:stä seeruminäytteestä, jotka saatiin normaalista verenluovuttajalo väestöstä, saatiin vain kaksi positiivista reaktiota RIA:ssa (tietoja ei ole esitetty). On mahdollista, että kaksi verenluovuttajaa, joista seeruminäytteet olivat peräisin, olivat aikaisemmin altistuneet HCV:lle.
15 IV.D. 5. NANBs-i-i:n reaktiivisuus NANBH-infektion aikana
Anti-NANB5-1-1-vasta-aineiden läsnäoloa NANBH-infektion aikana 2 potilaassa ja 4 simpanssissa seurattiin käyttäen RIA:aa, kuten on kuvattu osassa IV.D.3. Lisäksi RIA:aa käytettiin 20 määrittämään anti-NANB5_i-i-vasta-aineiden läsnäoloa tai poissaoloa HAV- tai HBV-infektion aikana sairaissa simpansseissa .
• · · • · t·· ··· V1 Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 2, osoittavat että :1·[: 25 simpansseissa ja ihmisissä havaittiin anti-NANBs-i-i-vasta- ·;··: aineita NANBH-infektion akuutin vaiheen puhkeamisen jälkeen.
Anti-NANBs-i-i-vasta-aineita ei havaittu joko HAV- tai HBV- ··» .2·. infektoituneiden simpanssien seeruminäytteissä. Täten anti- NANB5-1-1 -vasta-aineet toimivat markkereina yksilön joutumiselle 30 HCV:n hyökkäyksen kohteeksi.
• 1 • · · • ·
• «M
• · · ···♦ ··· • · • · • · ·
• · I
« · « · ··· · • · » • ·♦ 2 • · 106 107620
Taulukko 2
Seerumin muuttuminen jaksottaisissa seeruminäytteissä hepa-titispotilaissa ja -simpansseissa käyttäen 5-1-1-antigeeniä 5
Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (ιημ/ml) 10 Potilas 29 T# NANB 1,09 1180 T+180 33,89 425 T+208 36,22
Potilas 30 T NANB 1,90 1830 15 T+307 34,17 290 T+799 32,45 276
Simp. 1 0 NANB 0,87 9 76 0,93 71 20 118 23,67 19 154 32,41
Simp. 2 0 NANB 1,00 5 21 1,08 58 25 73 4,64 13 138 25,01
Simp. 3 0 NANB 1,08 8 43 1,44 205 30 53 1,82 14 159 11,87 6
Simp. 4 -3 NANB 1,12 11 ’···* 35 55 1,25 132 83 6,60 - . 140 17,51 * · · * ♦
Simp. 5 0 HAV 1,50 4 * ‘ 40 25 2,39 147 40 1,92 18 ::: 268 1,53 5 • * • · ··*
Simp. 6 -8 HAV 0,85 45 15 - 106 ·:··: 4i o,8i io ... 129 1,33- • * ··*
Simp. 7 0 HAV 1,17 50 22 1,60 83 .···, 115 1,55 5 '»·' 139 1,60 ···
Simp. 8 0 HAV 0,77 15 55 26 1,98 130 * ‘ 74 1,77 8 205 1,27 5 107 .
107620
Potilas/ Näytepv (pv) Hepatitis- Anti-5-1-1 ALT
simpanssi (o=tart.pv.) virukset (S/N) (mp/ml) 5 Simp. 9 -290 HBV 1,74 379 3,29 9 435 2,77 6 simp. 10 0 HBV 2,35 8 10 111-118 (var.) 2,74 96-155 (var.) 205 2,05 9 240 1,78 13
Simp. 11 0 HBV 1,82 11 15 28-56 (var.) 1,26 8-100 (var.) 169 - 9 223 0,52 10 #T = alkuperäisen näytteen päivä 20 IV. E. NANB5-1-1: a vastaan olevien polyklonaalisten seerumi vasta-aineiden puhdistaminen
Perustuen SOD-NANB5-i-i-polypeptidin spesifiseen immunologiseen 25 reaktiivisuuteen NANBH-potilaiden seeruminäytteiden vasta- aineiden kanssa kehitettiin menetelmä sellaisten seerumivasta- aineiden puhdistamiseksi, jotka reagoivat immunologisesti NANB5.
1-1:ssä olevien epitooppien kanssa. Tämä menetelmä käyttää ...# affiniteettikromatografiaa. Puhdistettu SOD-NANB5-i-i-polypeptidi • · ’.'.l 3 0 (ks. osa IV.D.l.) kiinnitettiin liukenemattomalle kantajalle; ,* kiinnitys on sellainen, että immobilisoitu polypeptidi • · « • ·* säilyttää affinitetttinsa ····· ' * NANB5-1-1:n vasta-aineelle. Seeruminäytteiden vasta-aine absorboidaan matriisiin sidottuun polypeptidiin. Kun on • · · ί,,.ί 35 suoritettu pesu epäspesifisesti sitoutuneiden materiaalien poistamiseksi, sitoutunut vasta-aine vapautetaan sitoutuneesta ····· SOD-HCV-polyppetidistä pH:n muutoksella ja/tai kaotrooppisilla .·**. reagensseilla, esimerkiksi urealla.
*·· #·· 40 Nitroselluloosakalvoja, jotka sisälsivät sitoutunutta SOD-NANB5- ··· i_i:a, valmistettiin seuraavasti. Nitroselluloosakalvoa, 2,1 > cm:n Sartoriusta, jonka huokoskoko oli 0,2 μπι, pestiin kolme • ·· : minuuttia kolme kertaa BBS:llä. SOD-NANB5-1-1 kiinnitettiin
• M
kalvoon inkuboimalla puhdistettua valmistetta BBS:ssä huoneen 45 lämnötilassa 2 tuntia: vaihtoehtoisesti sitä inkuboitiin 108 107620 4°C:ssa yli yön. Liuos, joka sisälsi sitoutumatonta antigeeniä, poistettiin ja suodatin pestiin kolme kertaa BBS:llä kolme minuuttia pesua kohti. Jäljelle jääneet aktiiviset paikat kalvossa blokattiin BSA:11a inkuboimalla 5 mg/ml:n BSA-5 liuoksella 30 minuuttia. Ylimääräinen BSA poistettiin pesemällä kalvoa viisi kertaa BBS:llä ja kolme kertaa tislatulla vedellä. Kalvoa, joka sisälsi virusantigeenin ja BSA:n, käsiteltiin sitten 0,05 M glysiinihydrokloridilla, pH 2,5, 0,10 M NaCl (GlyHCl) 15 minuutin ajan, mitä seurasi kolme kolmen minuutin 10 pesua PBS:llä.
Polyklonaaliset anti-NANB5-i-i-vasta-aineet eristettiin inkuboimalla kalvoja, jotka sisälsivät fuusiopolypeptidin seerumin kanssa yksilöstä, jolla oli NANBH, kaksi tuntia.
15 Inkubaation jälkeen suodattimia pestiin viisi kertaa BBSrllä ja kahdesti tislatulla vedellä. Sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin sitten kustakin suodattimesta viidellä eluoinnilla GlyHCl:llä, kolme minuuttia per eluointi. Eluaattien pH säädettiin pH 8,0:aan keräämällä kukin eluaatti koeputkeen, joka sisälsi 2,0 20 M Tris-HCl, pH 8,0. Anti-NANBs-i-x-vasta-aineen palautus affiniteettikromatografiän jälkeen on suurin piirtein 50 %.
«·« *···* Nitroselluloosakalvoja, jotka sisältävät sidotun virusanti- ··· *.* * geenin, voidaan käyttää useita kertoja ilman, että niiden • · · : V 25 sitomiskyky merkittävästi alentuu. Kalvojen uudelleen käyt- *:**: tämiseksi sen jälkeen, kun vasta-aineet on eluoitu, kalvot :***; pestään BBSrllä kolme kertaa kolmen minuutin ajan. Niitä • ·· * ;***; säilytetään sitten BBS:ssä 4°C:ssa.
• · · 30 IV.F. HCV-partikkeleiden sieppaaminen infektoituneesta plas- • ♦ masta käyttäen puhdistettuja ihmisen polyklonaalisia anti-HCV-T* vasta-aineita; siepatuissa partikkeleissa olevien nuk- leiinihappojen hybridisaatio HCV:n cDNA:han ♦ ·· • · » · • ♦ * .···, 35 IV.F.1. HCV-partikkeleiden sieppaus infektoituneesta plasmasta • · ·**· käyttäen ihmisen polyklonaalisia anti-HCV-vasta-aineita • · · • · NANBH:ta sairastavan simpanssin infektoituneessa plasmassa 109 107620 olevat proteiini-nukleiinihappokompleksit eristettiin käyttäen puhdistettuja ihmisen polyklonaalisia anti-HCV-vasta-aineita, jotka kiinnitettiin polystyreenihelmiin.
5 Polyklonaaliset anti-NANB5-i-i-vasta-aineet puhdistettiin NANBH:ta sairastavan ihmisen seerumista käyttäen SOD-HCV-polypeptidiä, joka on koodattu klooniin 5-1-1. Puhdistus-menetelmä oli sama, joka on kuvattu osassa IV.E.
10 Puhdistetut anti-NANB5-i-i-vasta-aineet kiinnitettiin polys-tyreenipallosiin (halkaisijaltaan 6,35 mm, peilipinta,
Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois, USA) inkuboi-malla kutakin huoneen lämpötilassa yli yön 1 ml:n kanssa vasta-aineita (1 μς/ιηΐ boraattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 15 8,5). Yli yön tapahtuneen inkubaation jälkeen, palloset pestiin kerran TBST:llä (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20) ja sitten fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 10 mg/ml BSA:ta.
20 Vertailupalloset valmistettiin identtisellä tavalla, paitsi että puhdistettu anti-NANB5-i-x-vasta-aineet korvattiin ihmisen • · ·. kokona i s immunog1obuliinilla.
• · • · · • · · • · · • · · HCV:n sieppaaminen NANBH:ta sairastavan simpanssin plasmasta * \ 25 käyttäen anti-NANBs-i-i-vasta-aineita, jotka oli kiinnitetty pallosiin, suoritettiin seuraavasti. NANBH:ta sairastavan ··· * · *···* simpanssin plasmaa on kuvattu osassa IV.A. 1.. NANBV-infek- • ·♦ *...· toituneen simpanssin plasman erää (1 ml) inkuboitiin 3 tuntia 37°C:ssa kunkin viidestä pallosesta kanssa, jotka olivat -*:*·: 30 peitettyjä joko anti-NANB5-i-i-vasta-aineilla tai vertailuim- ·***: munoglobuliineilla. Palloset pestiin kolme kertaa TBST:llä.
·«· »·» IV.F.2. Siepatuissa partikkeleissa olevien nukleiinihappojen • · *···* hybridisaatio NANBV-cDNA:han • “ 1 I I “ ' " .......
• · ♦ : : 35 • * · :*·.· Nukleiinihappokomponentti, joka oli vapautettu partikkeleista, • · jotka oli siepattu antijrNANBs-i-i-vasta-aineilla, analysoitiin 110 107620 kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cDNA:n hybridisaation suhteen.
HCV-partikkelit siepattiin NANBH-infektoituneen simpanssin 5 plasmasta, kuten on kuvattu osassa IV.F.1.. Nukleiinihappojen vapauttamiseksi partikkelista pestyjä pallosia inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa 0,2 ml:n kanssa per pallonen liuosta, joka sisälsi proteinaasi k:ta (1 mg/ml), 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,5, 10 mM EDTA:aa, 0,25 % (w/v) SDS:ää, 10 pg/ml liukoista hiivan 10 RNA:ta ja erottunut liuos poistettiin. Liuosta uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja nukleiinihapot saostettiin etanolilla yön aikana -20°C:ssa. Nukleiinihapposaostuma kerättiin linkoamalla, kuivattiin ja liuotettiin 50 mM Hepes- liuokseen pH:ssa 7,5. Kaksoiserät liukoisista nukleiinihapoista 15 näytteistä, jotka saatiin pallosista, jotka oli päällystetty anti-NANBs-i-i-vasta-aineilla ja vertailupallosista, jotka sisälsivät ihmisen kokonaisimmunoglobuliinia, suodatettiin nitroselluloosasuodattimille. Suodattimet hybridisoitiin 32P- leimatulla, nicktranloidulla koettimella, joka oli tehty 20 kloonin 81 puhdistetusta HCV:n cDNA-fragmentista. Menetelmiä koettimen valmistamiseksi ja hybridisoimiseksi on kuvattu ***. osassa IV.C.l..
• ♦ ·· · • · · • · · * · ♦
Koettimella hybridisoitujen suodattimien, jotka sisältävät • · . 25 nukleiinihapot partikkeleista, jotka on siepattu anti-NANB5-i-i- « · ... vasta-aineita sisältävistä pallosista, autoradiografit on • · **♦;’ esitetty kuviossa 40. Uutos, joka on saatu käyttäen anti-NANB5- *···* i-i-vasta-aineita (Ai,A2) , antoi selviä hybridisaatiosignaaleja verrattuna vertailuvasta-aineuutokseen (A3,A4) ja vertailuhiiva-30 RNA:hän (Bi,B2) . Standardit, jotka muodostuivat puhdistetun *#**: kloonin 81 cDNA-fragment in lpg:stä, 5pg:stä ja 10pg:stä, on esitetty kohdissa Cl - 3 vastaavasti.
···· ♦ ·· *!** Nämä tulokset osoittavat, että ΝΑΝΒΗ-plasmasta anti-NANBs-i-i- • l» 35 vasta-aineiden avulla siepatut partikkelit sisältävät nukleiinihappoja, jotka hybridisoituvat HCV:n cDNA:n kanssa kloonissa 81 ja täten antavat lisätodisteita, että näiden 111 107620 kloonien cDNA:t ovat peräisin NANBH:n etiologisesta aiheuttajasta.
IV.G. C100-3 :n immunologinen reaktiivisuus anti-NANB5-i-i-vasta-5 aineiden kanssa C100-3-fuusiopolypeptidin immunologinen reaktiivisuus anti-NANB5-i-i-vasta-aineiden kanssa määritettiin radioimmunologisella analyysillä, jossa antigeenit, jotka olivat kiinnitettyjä 10 kiinteään faasiin saatettiin kosketuksiin puhdistettujen anti-NANBs-i-i-vasta-aineiden kanssa ja antigeeni-vasta-ainekompleksi osoitettiin 125I-leimatuilla veren anti-ihmisvasta-aineilla. C100-3-polypeptidin immunologista reaktiivisuutta verrattiin SOD-NANB5-i-i-antigeenin vastaavaan arvoon.
15
Fuusiopolypeptidi C100-3 syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.5. ja vastaavasti osassa IV.B.6.. Fuusiopolypeptidi SOD-NANB5-1-1 syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten on kuvattu osassa IV.B.l. ja vastaavasti osassa IV.D.l.. 20 Puhdistetut anti-NANB5-1-1-vasta-aineet saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.E..
• · · • · I** 100 μ1:η eriä, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä puhdistettua • · « C100-3-antigeeniä 0,125 M Na-boraattipuskurissa, pH 8,3, 0,075 • · · ; 1' 25 M NaCl (BBS), lisättiin kuhunkin mikrotiitterilevyn (Dynatech · Immulon 2 Removawell Strips) kuoppaan. Levyä inkuboitiin yli • · · yön 4°:ssa kosteassa kammiossa, minkä jälkeen proteiiniliuos • · · poistettiin ja kuopat pestiin kolme kertaa BBS:llä, joka sisälsi 0,02 % Triton X-100 (BBST). Epäspesifisen sitoutumisen 30 estämiseksi kuopat peitettiin BSA:lla lisäämällä 100 μΐ 5 .···. mg/ml:n BSA:n liuosta BBSrssä, mitä seurasi inkubaatio • · · , huoneenlämpötilassa tunnin ajan, minkä jälkeen ylimääräinen • · · ···: BSA-liuos poistettiin.Polypeptidien päällystetyissä kuopissa • · · annettiin reagoida puhdistettujen anti-NANBs-i-i-vasta-aineiden 35 kanssa lisäämällä 1 pg vasta-ainetta kuoppaa kohti ja • · · : inkuboimalla näytteitä 1 tunti 37°C:ssa. Inkubaation jälkeen * · · ylimääräinen liuos poistettiin imulla ja kuopat pestiin viisi kertaa BBST:llä. Anti-NANB5.1-1, joka oli sitoutunut 112 107620 fuusiopolypeptideihin, määritettiin 125I-leimatun F'(ab)2-lampaan anti-ihmis-IgG:n sitoutumisena päällystettyihin kuoppiin. 100 μ1:η eriä leimattua koetinta (spesifinen aktiivisuus 5-20 pCi/pg) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja 5 levyjä inkuboitiin 370°C:ssa yksi tunti, mitä seurasi ylimääräisen koettimen poistaminen imulla ja viisi pesua BBST:llä. Kuhunkin kuoppaan sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin laskemalla laskurissa, joka tunnistaa gammasäteilyn.
10 C100:n immunologisen reaktiivisuuden tulokset anti-NANB5-i-i:n kanssa verrattuna NANBs-i-itn reaktiivisuuteen puhdistettujen vasta-aineiden kanssa on esitetty taulukossa 3.
15 Taulukko 3 C100-3:n immunologinen reaktiivisuus verrattuna NÄNB5-1-1:een määritettynä radioimmunologisella analyysillä 2 0 RIA (cpm/analyysi) AG(ng) 400 320 240 160 60 0 • · « ‘ill NANB5-1-1 7332 6732 4954 4050 3051 57 *’ C100-3 7450 6985 5920 5593 4096 67 : V 25
Taulukon 3 tulokset osoittavat että anti-NANB5-i-i tunnistaa C100-3-polypeptidin C100-puoliskon epitoopit. Täten NANB5-1-1: llä ja C100:lla on yhteisiä epitooppeja. Tulokset ehdottavat, että • · · tätä NANBV-epitooppia koodaava cDNA-sekvenssi on se, joka on 30 läsnä sekä kloonissa 5-1-1 että kloonissa 81.
• · • · · • · IV.H. HCV:n karakterisointi * * * • · · · • · · IV.H.1. HCV-genomin säikeettömyyden karakterisointi ’ .·*·. 35 • · HCV-genomi karakterisoitiin säikeettömyytensä suhteen eris- • · · tämällä nukleiinihappofraktio partikkelista, jotka oli siepattu anti-NANB5-i-i-vasta-aineella päällystetyille polys- 113 107620 tyreenipallosille ja määrittämällä, onko eristetty nukleiinihappo hydridisoitunut HCV:n cDNA:n plus- vai miinussäikei-seisiin.
5 Partikkelit siepattiin HCV-infektoituneen simpanssin plasmasta käyttäen polystyreenipallosia, jotka oli päällystetty immunopuhdistetulla anti-NANBs-i-i-vasta-aineella, kuten on kuvattu osassa IV.F.1. Partikkleiden nukleiinihappokomponentti vapautettiin käyttäen menetelmää, joka on kuvattu osassa 10 IV.F.2. Eristetyn genomin numleiinihaposta peräisin olevia näytteitä, jotka vastasivat 3 ml:aa korkean tiitterin plasmaa, blotattiin nitroselluloosasuodattimille. Vertailuna blotattiin samoille suodattimille näytteitä denaturoidusta HCV:n cDNArsta kloonista 81 (2 pg). Suodattimia tutkittiin 32P-leimatulla, 15 HCV:n cDNA:sta kloonatulla yksisäikeisen DNA:n plus- ja miinussäikeiden seoksella; cDNA:t leikattiin klooneista 40b, 81 ja 25c.
Yksisäikeiset koettimet saatiin leikkaamalla HCV:n cDNA:t 20 klooneista 81, 40b ja 25c EcoRI:lla ja kloonaamalla cDNA- frgamentit M13-vektoreihin mpl8 ja mpl9 (Messing (1983)) . M13- ... kloonit sekventoitiin sen määrittämiseksi, sisälsivätkö ne ♦ · **! HCV:n cDNA:sta peräisin olevia plus- vai miinnussäikeitä.
• · · /// Sekventointi suoritettiin Sanger et al.:n (1977) dedeoksiketjun • · · ; ·* 25 terminaatiomenetelmällä.
• m ···
Kukin kaksoissuodattimien sarjasta sisältäen näytteitä HCV- genomista, joka oli eristetty siepatuista partikkelista, hydridisoitiin joko plus- tai miinnussäikeisten, HCV:n cDNA:sta .-····· 30 peräisin olevien koettimien kanssa. Kuvio 41 esittää .“·. autoradiografit, jotka on saatu tutkimalla NANBV-genomia . klooneista 81, 40b ja 25c peräisin olevien koettimien seok- •••ϊ sella. Tätä seosta käytettiin lisäämään hybridisaatioanalyysin ♦ ·· :...: herkkyyttä. Levyllä I olevat näytteet hybridi soit iin 35 plussäikeisten koettimien seoksella. Levyllä II olevia näyt- ··· .·. : teiutä tutkittiin hydridisäätiöila miinussäikeisten koettimien seoksen kanssa. Levyillä olevien immunoblottien näytteiden koostumukset on esitetty taulukossa 4.
114 107620
Taulukko 4
kaista A B
1 HCV-genomi * 5 2 ---- * 3 * cDNA 81 4 ---- CDNA 81 * = kuvaamaton näyte.
10
Kuten nähdään kuvion 41 tuloksista, vain miinussäikeinen DNA-koetin hydridisoituu eristetyn HCV-genomin kanssa. Tämä tulos yhdessä sen tuloksen kanssa, joka osoittaa, että genomi on herkkä ribonukleaasille, muttei deoksinukleaasille (ks. osa 15 IV.C.2.), ehdottaa, että NANBV:n genomi on positiivissäikeistä RNA:ta.
Nämä tiedot ja tiedot muista laboratorioista, jotka koskevat oletetun NANBV:n fysikokemiallisia ominaisuuksia, ovat yhtä- 20 pitäviä sen mahdollisuuden kanssa, että HCV on Flaviviridaen jäsen. Kuitenkin mahdollisuutta, että HCV edustaisi uutta *··. virusten luokkaa, ei ole eliminoitu.
• · • · · • « · • · · ♦ · · IV.H.2. Sellaisten siepattujen partikkeleiden sekvenssien * · * *. 25 havaitseminen, jotka amplifikoituna PCR:llä hybridisoituvat kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cDNA:n kanssa • · • ♦ • · · ··· *...· Siepatuissa partikkeleissa oleva RNA saatiin, kuten on kuvattu osassa IV.H.l. Sellaisten sekvenssien analyysi, jotka 3 0 hybridisoituvat kloonista 81 peräisin olevan HCV .-n cDNA .-n ·*”; kanssa, suoritettiin käyttäen PCR-amplifikaatiomenettelyä, • · · \ kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi että hybridisaatio- **” koetin oli kinaasilla käsitelty oliginukleotidi, joka oli • « ***** peräisin kloonin 81 cDNA-sekvenssistä. Tulokset osoittivat, : 35 että amplifioitu sekvenssi hybridisoitui kloonista 81 peräisin olevan HCV:n cDNA-koettimen kanssa.
• · 115 107620 IV.H.3. Homologia ei-strukturaalisen Denguen Flaviviruksen (MNWWVD1) proteiinin ia kloonien 14i - 39c yhdistettyyn ORFiään koodattujen HCV-polypeptidien välillä 5 Kloonien 14i - 39c yhdistetyt HCV:n cDNA:t sisältävät yhden jatkuvan avoimen lukualueen, kuten on esitetty kuviossa 26. Siihen koodattu polypeptidi analysoitiin homologiasekvenssin löytämiseksi Denguen flaviviruksen (MNWVD1) ei-strukturaalisten polypeptidien alueen kanssa. Analyysi käytti Dayhoffin 10 proteiinitietokantaa ja se suoritettiin tietokoneella. Tulokset on esitetty kuviossa 42, jossa symboli (:) merkitsee tarkkaa homologiaa ja symboli (.) merkitsee vähäistä muutosta sekvenssissä; ajatusviivat merkitsevät välejä, jotka on tehty sekvenssiin suurimpien homologioiden aikaansaamiseksi. Kuten 15 kuvasta nähdään, HCV:n cDNA:hän koodatun ja Denguen viruksen ei-strukturaalisten polypeptidien välillä on merkittävää homologiaa. Kuviossa 42 esitetyn homologian lisäksi sisälsi cDNA:n 31-päähän koodattu polypeptidisekvenssi myös sekvenssejä, jotka ovat homologisia sekvenssien kanssa Denguen 20 polymeraasissa. Tämän löydöksen seurauksena on, että kanooninen Gly-Asp-Asp (GDD)- sekvenssi, jonka ajateltiin olevan olen- ···. nainen RNA-riippuville RNA-polymeraaseille, sisältyy HCV:n • · ,··*, CDNA:hän koodattuun polypeptidiin asemassa, joka on yhtäpitävä • · »
Dengue 2-viruksen vastaavan osan kanssa. (Tietoa ei ole * *. 25 esitetty) .
• » • · · IV.H.4. HCV-DNA:ta ei havaita NANBH-infektoituneessa kudoksessa • · · • · • · ···
Kahden tyyppiset tutkimukset antavat tuloksia, jotka ehdot- *:·*: 3 0 tavat, ettei HCV-DNA ole havaittavissa sellaisen yksilön ·***: kudoksessa, jolla on NANBH. Nämä tulokset yhdessä osissa IV.C.
··♦ \ ja IV.H.1. ja IV.H.2. saatujen tuloksien kanssa antavat *·*) todisteita siitä, ettei HCV ole DNA:ta sisältävä virus ja ettei • · *·"* sen replikaatio liity cDNA:han.
• · · : : 35 ·»· :*·.· IV.H.4.a. Southern Blottausmenettely ♦ ·
Sen määrittämiseksi, sisältääkö NANBH-infektoituneen simpanssin 116 107620 maksa havaittavaa HCV-DNA:ta (tai HCV-cDNA:ta), tästä lähteestä eristetyn DNA:n restriktioentsyymifragmentteja Southern-blotattiin ja blotteja tutkittiin 32P-leimatulla HCV:n cDNA:lla. Tulokset osoittivat, ettei leimattu HCV:n cDNA hybridisoitunut 5 infektoituneen simpanssin maksasta peräisin olevan blotatun DNA:n kanssa. Se ei myöskään hybridisoitunut normaalin simpanssin maksasta olevan vertailuna käytetyn blotatun DNA:n kanssa. Tälle vastakohtana positiivisessa vertailussa leimattu betainterferonigeenin koetin hybridisoitui voimakkaasti 10 restriktioentsyymillä pilkotun ihmisen istukka-DNA:n Southern-blotteihin. Nämä järjestelmät olivat suunniteltuja havaitsemaan sen geenin yksittäinen kopio, joka oli tarkoitettu tulla havaituksi leimatulla koettimella.
15 DNA:t eristettiin kahden NANBH-simpanssin maksasta. Vertailu-DNA:t eristettiin infektoitumattoman simpanssin maksasta ja ihmisen istukoista. DNA:n uuttamismenettely oli olennaisesti Maniatis et ai. (1982) mukainen ja DNA-näytteitä käsiteltiin ribonukleaasilla eristysmenettelyn aikana.
20
Kutakin DNA-näytettä käsiteltiin joko EcoRI:lla, MboI:lla tai ... Hindi:11a (12 pg) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut « *** DNA:t elektroforesoitiin l%:lle neutraalille agaroosigeeleille, • · ♦ *·* * ne Southern-blotattiin nitroselluloosalle ja blotattu • · ♦ ** ♦ · ♦ • .* 25 materiaali hybridisoitiin sopivalla nicktransloidulla koetin- ***** cDNA:lla (3 x 106 cpm/ml hybridisaatioseosta) . Infektoituneesta ·«« simpanssin maksasta ja normaalista maksasta peräisin oleva DNA ί#**ί hybridisoitiin 32P-leimatulla kloonien 36 ja 81 HCV:n cDNA:lla; ihmisen istukan DNA hybridisoitiin 32P-leimatulla ....: 30 betainterf eronigeenin DNA: 11a. Hybridisaation jälkeen blot it .··♦. pestiin ankarissa olosuhteissa, s.o. liuoksella, joka sisälsi 0,1 x SSC, 0,1 % SDS 65°C:ssa.
• · · · + ·· »·· ·...* Betainterferoningeenin DNA valmistettiin kuten on kuvannut 35 Houghton et ai. (1981) .
• · · • · • · · • · · • · 117 107620 IV.H.4.b. Amplifikaatio PR-tekniikalla
Sen määrittämiseksi, voidaanko HCV-DNA:ta havaita NANBHrta sairastavien simpanssien maksasta, DNA eristettiin kudoksesta 5 ja sille tehtiin PCR-amplifikaatio-määritys käyttäen primereita ja koetinpolynukleotideja, jotka olivat peräisin HCV:n cDNArsta kloonista 81. Negatiiviset vertailut olivat DNA-näytteitä, jotka oli eristetty infektoitumattomista HepG2-kudoksen viljelysoluista ja oletettavasti infektoitumattomasta ihmisen 10 istukasta. Positiiviset vertailut olivat negatiivisten vertailu-DNA:oitten näytteitä, joihin oli lisätty tunnettu, suhteellisen pieni määrä (250 molekyyliä) HCV:n cDNA-inserttiä kloonista 81.
15 Lisäksi sen varmistamiseksi, että NANBH:ta sairastavien simpanssien samoista maksoista eristetyt RNA-fraktiot sisälsivät sekvenssejä, jotka olivat kömpiementäärisiä HCV-cDNA-koettimelle, käytettiin PCR-amplifikaatio-määritysjärjestelmää myös eristettyihin RNA-näytteisiin.
20
Tutkimuksissa DNA:t eristettiin menetelmällä, jota on kuvattu ...^ osassa IV.H.4.a. ja RNA:t uutettiin olennaisesti siten, kuin on *** kuvannut Chirgwin et ai. (1981) .
« · · « · • · · « · · ί ·* 25 DNA-näytteet eristettiin kahden infektoituneen simpanssin **’* maksasta, infektoitumattomista HepG2-soluista ja ihmisen • · · istukasta. Yksi pg kutakin DNA:ta pilkottiin Hindlllrlla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pilkotut näytteet PCR-amp-lifikoitiin ja osoitettiin amplifioidusta HCV:n cDNAtsta 30 olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C.3., paitsi että .···, käänteistranskriptaasivaihe jätettiin pois. PCR-primerit ja - *·* koetin olivat HCV:n cDNArta kloonista 81 ja niitä on kuvattu M· ··.: osassa IV.C.3.. Ennen amplifiointia yhden mikrogramman näyt- • · · teeseen kutakin DNA:ta, positiivisia vertailuja varten, .···. 35 lisättiin 250 molekyyliä HCV:n cDNA-inserttiä, joka oli .·. : eristetty kloonista 81.
• M • · 118 107620
Sen määrittämiseksi, oliko läsnä HCV-sekvenssejä RNA:ssa, joka oli eristetty NANBH:ta sairastavien simpanssien maksoista, näytteitä, jotka sisälsivät 0,4 pg kokonais-RNA:ta amp-lifioitiin olennaisesti kuten on kuvattu osassa IV.C-3., paitsi 5 että käänteistranskriptaasi jätettiin pois joistakin näytteistä negatiivisena vertailuna. PCR-primerit ja koetin olivat peräisin kloonin 81 HCV:n cDNA:sta, kuten on kuvattu yllä.
Tulokset osoittivat, että HCV:n cDNA:lie komplementaarisia 10 amplifioituja sekvenssejä ei ollut havaittavissa infektoituneen simpanssin maksan DNA:oissa, eikä myöskään negatiivisissa vertailuissa. Vastakohtana tälle, kun näytteisiin, sisältäen infektoituneen simpanssin maksasta olevan DNA:n, lisättiin HCV:n cDNA:ta ennen amplifikaatiota, kloonin 81 sekvenssit 15 havaittiin kaikissa positiivisissa kontrollinäytteissä. Lisäksi RNA-tutkimuksissa amplifioitu kloonin 81 HCV:n cDNA-sekvenssit havaittiin vain, kun käänteistranskriptaasia käytettiin, mikä viittaa vahvasti siihen, että tulokset eivät johtuneet DNA-kontaminaatiosta.
20 Nämä tulokset osoittavat, että NANBH:ta sairastavien sim- • paussien maksasolut eivät sisällä HCV:n DNA:ta tai sisältävät » 0 niitä havaitemattoman määrän. Perustuen lisäystutkimukseen, jos • 1 2 3 · I « | ,1 , HCV:n cDNA:ta on läsnä, sitä on tasolla, joka on paljon alle t i · • 25 0,06 kopiota per maksasolu. Tälle vastakohtanasamoista 1 maksanäytteistä peräisin olevan kokonais-RNA:n HCV-sekvenssit 2 « · · havaittiin helposti PCR-tekniikalla.
3 « · • ♦ ♦ ♦♦ IV.I. HCV-infektion ELISA-määritys käyttäen HCV cl00-3:a ·:··· 30 koeant igeeninä • · · • i •t Kaikki näytteet analysoitiin käyttäen HCV cl00-3:a ELISA- •••5 menetelmällä. Tämä analyysi käyttää HCV cl00-3-antigeeniä (joka syntetisoitiin ja uhdistettiin, kuten on kuvattu osassa ·1”♦ 35 IV.B.5.) ja hiiren monoklonaalisen anti-ihmis-IgG:n piparjuu- • · · : riperoksidaasikonjugaattia (HRP) .
• 1· 119 107620
Valmistettiin levyjä, jotka oli päällystetty HCV cl00-3-antigeenillä seuraavasti. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 21 ml/levy päällystyspuskuria (50mM Na-boraatti, pH 9,0), BSA:ta (25 pg/ml), cl00-3:a (2,50 pg/ml) juuri ennen lisäämistä 5 Removeawell Immulon I-levyille (Dynatech Corp.).Sen jälkeen kun sitä oli sekoitettu 5 minuuttia lisättiin 0,2 ml/kuoppa liuosta , levyille, ne peitettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen liuos poistettiin imemällä. Kuopat pestiin kerran 400 pl:lla Wash Bufferia (100 mM natriumfosfaattia. pH 7,4, 140 10 mM natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 1 % (w/v) Triton x-100:aa, 0,01 % (w/v) Thimerosal'ia). Pesuliuoksen poistamisen jälkeen lisättiin 200 μΐ/kuoppa Postcoat-liuosta (10 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, 150 mM natriumkloridia, 0,1 % (w/v) kaseiinia ja 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF)), 15 levyt peitettiin löysästi haihtumisen estämiseksi ja niiden annettiin olla huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Kuopat imettiin sitten liuoksen poistamiseksi ja ne lyofilisoitiin kuivaksi yön yli ilman lämmitystä. Valmistetut levyt voidaan varastoida 2 - 8°C:ssa saumatuissa alumiinipusseissa.
20 ELISA-määrityksen suorittamiseksi lisättiin 20 μΐ seeruminäytettä tai vertailunäytettä kuoppaan, joka sisälsi 200 μΐ
···. näytteen laimenninta (100 mM natriumfosfaatti, pH 7,4, 500 mM
• » ,···. natriumkloridi, 1 mM EDTA, 0,1 % (w/v) kaseiinia, 0,015 % (w/v) • · · .! . 25 Therosol, 1 % (w/v) Triton X-100, 100 pg/ml hiivauutetta).
• · · • · * *. Levyt suljettiin ja niitä inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin 400 pltlla ♦ · *···* pesupuskuria (fosfaattipuskuroitu suola (PBS) , joka sisälsi • · m 0,05 % Tween 20:a). Pestyjä kuoppia käsiteltiin 200 pl:lla 30 hiiren anti-ihmis IgG-HRP-konjugaattia, joka oli Ortho'n *:·*: konjugaatinlaimenninliuoksessa (10 mM natriumfosfaatti, pH 7,2, -·’**: 150 mM natriumkloridi, 50 % (v/v) härän sikiöseerumia, 1 % ♦ ♦ · *. (v/v) lämpökäsitelty hevosseerumi, 1 mM K3Fe(CN)6, 0,05 % (w/v)
Tween 20, 0,02 % (w/v) Thimersal). Käsittelyä suoritettiin l • · *···* 3 5 tunti 3 7°C:ssa, liuos poistettiin imemällä ja kuopat pestiin pesupuskurilla, mikä myös poistettiin imemällä. Sidotun :*·.· entsyymikonjugaatin määrittämiseksi lisättiin 200 μΐ subst- • · raattiliuosta (10 mg O-fenyleenidiamiinidihydrokloridia/ 5 ml 120 107620
Developer-liuosta). Developer-liuos sisältää 50 mM natriumsitraattia säädettynä pH-arvoon 5,1 fosforihapolla ja 0,6 μΐ/ml 30% vetyperoksidia. Substraattiliuoksen sisältäviä levyjä inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, 5 reaktiot pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ/ml 4 N rikkihappoa ja OD:t määritettiin.
Alla esitetyt esimerkit osoittavat, että mikrotiitterilevy-seulonnalla ELISA-menetelmällä käyttäen HCV cl00-3-antigeeniä 10 on korkean luokan spesifisyys, minkä todistaa noin 1 %.-n alkuperäinen reaktiivisuusnopeus, jolla on noin 0,5 %:n toistettava reaktiivisuusnopeus sattumanvaraisilla luovuttajilla. Analyysillä voidaan havaita immunovaste sekä akuutin vaiheen ohittaneella infektiolle että taudin krooniselle 15 vaiheelle. Lisäksi analyysi voi havaita joitakin näytteitä, jotka antavat negatiivisen tuloksen NANBH:n korvaavissa kokeissa; nämä näytteet tulevat yksilöistä, joilla on olut NANBH tai luovuttajilta, jotka ovat mukana NANBH:n siirtymisessä.
20
Allakuvatuissa esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: ’·*. ALT alaniiniaminotransferaasi • · • « »
Anti-HBc HBc:n vastainen vasta-aine • · · 25 Anti-HBsAg HBsAg:n vastainen vasta-aine HBc hepatitis-B :n ydinantigeeni • * ... ABsAg hepatitis-B:n pinta-antigeeni • ·
*”;* IgG immunoglobuliini-G
IgM immunoglobuliini-M
30 IU/L kansainvälisiä yksiköitä/1 ”**! NA ei saatavissa * NT ei tutkittu • · · N näytteen koko
Neg negatiivinen • t ”** 35 OD optinen tiheys • · · ί.,.ί Pos positiivinen S/CO signaali/sulku • » SD standardipoikkeama 121 107620 x keskimääräinen tai keskiarvo WNL normaalien rajojen sisällä IV.1.1. HCV-infektio sattumanvaraisten verenluovuttajien 5 joukossa
Saatiin 1056:n näytteen ryhmä (tuoretta seerumia) sattumanvaraisista verenluovuttajista Irwin Memorial Blood Bank'stä San Francisco, California. Koetulokset, jotka on saatu näistä 10 näytteistä on esitetty histogrammissa, mikä esittää optisen tiheyden arvojen jakaantuman (kuvio 43). Kuten nähdään kuviosta 43, 4 näytettä on arvoltaan > 3, yksi näyte on välillä 1 ja 3, 5 näytettä on välillä 0,4 ja 1 ja loput 1046 näytettä ovat alle 0,4, joista näytteistä yli 90 % on arvoltaan alle 0,1.
15
Reaktiivisten sattumanvaraisten näytteiden tulokset on esitetty taulukossa 5. Käyttäen sulkuarvona keskimääräistä arvoa plus miinus 5 standardipoikkeamaa, 10 näytettä 1056:sta (0,95 %) oli alunperin reaktiivisia. Näistä viisi näytettä (0,47 %) olivat 20 toistuvasti reaktiivisia, kun ne analysoitiin toiseen kertaan käyttäen ELISA-menetelmää. Taulukko 5 esittää myös ALT- ja anti-HBd-tilanteen kullekin toistuvasti reaktiiviselle näytteelle. Erityisen mielenkiintoinen on se tosiasia, että • · 1“ kaikki viisi toistuvasti reaktiivista näytettä olivat
I I I
];1/ 25 negatiivisia molemmilla korvaavilla kokeilla tutkittaessa • · t ; ·1 NANBH:n varalle, kun taas ne olivat positiivisia HCV:n ELISA- * · kokeessa.
• · · « · * · • · · • · « • ♦ • · • · · « • · • « « ,· · * m 1 ··· ··»· • · · • · • · • · « • · 1 • · • · • · · · • · · • · · • · 122 107620
Taulukko 5
Reaktiivisten sattumanvaraisten näytteiden tulokset N-1051 5 x=0,049* SD=±0,074
Cut-off: x + 5SD = 0,419 (0,400 + negatiivinen vertailu) Näyte Alkuper. Uusinta- ALT** Anti-HBc*** 10 reaktiiv. reaktiiv. (IU/1) (opt.tih.) opt.tih. opt.tih.
4227 0,462 0,084 ΝΑ NA
6292 0,569 0,294 ΝΑ NA
15 6188 0,699 0,326 NA NA
6157 0,735 0,187 NA NA
6277 0,883 0,152 NA NA
6397 1,567 1,392 30,14 1,433 6019 >3,000 >3,000 46,48 1,057 20 6651 >3,000 >3,000 48,53 1,343 6669 >3,000 >3,000 60,53 1,165 4003 >3,000 3,000 WNL1 2 Neg.
10/1056 = 0,95 % 5/1056 = 0,47 % * arvoltaan >1,5 tuloksia ei otettu mukaan laskettaessa 25 keskiarvoja ja standardipoikkeamia ** ALT >68 IU/1 on normaaliarvojen yläpuolella *** anti-HBc < 0,535 (kilpaileva analyysi) pidetään positii- **·. visena • · • · * **** WNL: normaalirajojen sisällä.
• · · » . 30 • · · • · * *. IV.1.2. Simpanssin seeruminäytteet * i • · · • · '··’ Yhdestätoista simpanssista peräisin olevat seeruminäytteet ♦ · · *...· testattiin HCV cl00-3 ELISA-menetelmällä. Neljällä näistä 35 simpansseista oli NANBH-infektio kontaminoituneesta tekijä *:··: VHI-erästä (oletettavasti Hutchinson-kanta) , mitä seurasi ·**’; yhdessä tri Daniel Bradleyn kanssa luotu toimintamalli Centers * · · for Disease Control'ssa. Vertailuna tartutettiin neljä muuta • · · simpanssia HAV:lla ja kolme HBV:llä. Seeruminäytteet saatiin • · 2 40 eri aikoina infektion jälkeen.
• « · • · • · » · · ;*·.· Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 6, esittävät dokumen toidun vasta-aineen serokonversion kaikissa Hutchinson-kantaa 123 107620 olevilla NANBH:11a infektoiduilla simpansseilla. Akuutin infektiovaiheen jälkeen (mitä todisti ALT-tason merkittävä nousu ja sen jälkeinen palaaminen normaaliksi) voitiin havaita vasta-aineita HCV cl00-3:a vastaan kaikkien neljän NANBH-5 infektoidun simpanssin seerumissa. Näiden näytteiden oli aikaisemmin osoitettu, kuten on keskusteltu osassa IV.B.3., olevan positiivisia Viestern-analyysillä ja RIArlla. Tälle vastakohtana mikään vertailusimpansseista, jotka oli infektoitu HAVilla tai HBV:llä, ei osoittanut todisteita reaktiivisuudesta 10 ELISA-analyysissä.
Taulukko 6
Simpanssin seeruminäytteet 15
Opt. S/CO Istut. Näyte- ALT Virus tih. pv pv IU/1
Neg.vert 0,001 20 Pos.vert. 1,504 Raja-arvo 0,401
Simp 1 -0,007 0,00 24.5.84 24.5.84 9 NANB
0,003 0,01 7.8.84 71 25 >3,000 >7,48 18.9.84 19 >3,000 >7,48 24.10.84 ---
Simp 2 --- --- 7.6.84 --- --- NANB
-0,003 0,00 31.5.84 5 * —‘ 30 -0,005 0,00 28.6.84 52 0,945 2,36 20.8.84 13 >3,000 >7,48 24.10.84 -- • · ·
Simp 3 0,005 0,01 14.3.85 14.3.85 8 NANB
35 0,017 0,04 26.4.85 205 0,006 0,01 6.5.85 14 1,010 2,52 20.8.85 6 • · • · ·
Simp 4 -0,006 0,00 11.3.85 11.3.85 11 NANB
40 0,003 0,01 9.5.85 132 ·:··: 0,523 1,31 6.6.85 --- 1,574 3,93 1.8.85 --- „ · · * ' • * *
Simp 5 -0,006 0,00 21.11.80 21.11.80 4 HAV
45 0,001 0,00 16.12.80 147 .*·*. 0,003 0,01 30.12.80 18 *·;·* 0,006 0,01 29.7-21-8.81 5 • · · • · • · • · · • m • · * , • »· • · 124 107620
Opt. S/CO Istut. Näyte- ALT Virus tih. pv pv IU/1
Simp 6 --- --- 25.5.82 --- --- HAV
5 -0,005 0,00 17.5.82 --- 0,001 0,00 10.6.82 --- -0,004 0,00 6.7.82 106 0,290 0,72 1.10.82 --- 10
Simp 7 -0,008 0,00 25.5.82 25.5.82 7 HAV
-0,004 0,00 17.6.82 83 -0,006 0,00 16.9.82 5 0,005 0,01 9.10.82 --- 15
Simp 8 -0,007 0,00 21.11.80 21.11.80 15 HAV
0,000 0,00 16.12.80 130 0,004 0,01 3.2.81 8 0,000 0,00 3.6 - 10.6.81 4,5 20
Simp 9 --- --- 24.7.80 --- HBV
0,019 0,05 22.8-10.10.79 --- 11.3.81 57 0,015 0,04 1.7 - 5.8.81 9 25 0,008 0,02 1.10.81 6
Simp 10 --- --- 12.5.82 --- --- HBV
0,011 0,03 21.4-12.5.82 9 0,015 0,04 1.9-8.9.82 126 30 0,008 0,02 2.12.82 9 0,010 0,02 6.1.83 13
Simp 11 --- --- 12.5.82 --- --- HBV
... 0,000 0,00 6.1-12.5.82 11 ·...: 35 --- --- 23.6.82 100 .·:·. -0,003 0,00 9.6-7-7.82 --- -0,003 0,00 28.10.82 9 -0,003 ο,οο 20.12.82 10 • · • · .···. 40 IV.1.3. Levy 1: Ihmisistä peräisin oleva NANBH-kantaian ··» .···. todistetusti infektoitu seerumi • · • · · . Koodattu levy käsitti 22 erillistä näytettä, kukin niistä kahtena niin, että näytteitä oli 44 yhteensä. Näytteet olivat • » ...· 45 peräisin todistetusti infektoituneesta seerumista kroonisista ··· NANBH-kantajista, infektoituneesta seerumista todetuista ···· .*··. verenluovuttajista ja infektoituneesta seerumista akuutin • · · .1, vaiheen NANBH-potilaista. Lisäksi näytteitä oli varmoista • · *··*! negatiivisista vertailuista ja muista sairausvertailuista.
« · · *· ” 50 Levyn toimitti tri H. Alter, Department of Health and Human services, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland.
125 107620
Levyn on suunnitellut tri Alter useita vuosia sitten ja sitä on käyttänyt tri Alter oletettujen NANBH-analyysien osoituslevynä.
Koko levy analysoitiin kahdesti ELISA-analyysillä ja tulokset 5 lähetettiin tri Alterille arvioitavaksi. Arvioinnin tulokset on esitetty taulukossa 7. Vaikka taulukko antaakin tulokset vain toiselle kaksoisnäytteistä, samat arvot saatiin kussakin kaksoisnäytteessä.
10 Kuten on esitetty taulukossa 7, kuusi seerumia, jotka oli todettu infektoituneiksi simpanssimallissa, oli voimakkaasti positiivisia. Seitsemäs infektoitunut seerumi vastasi akuutin NANBH-tapauksen näytettä, eikä se ollut reaktiivinen tässä ELISA-analyysissä.Todetusta verenluovuttajasta oleva näyte, 15 jonka ALT-arvo oli normaali ja jonka simpanssitutkimuksessa saatu tulos oli epävarma, ei ollut reaktiivinen analyysissä.
Kolme muuta sarjanäytettä yhdestä yksilöstä, jolla oli akuutti NANBH, eivät myöskään olleet reaktiivisia. Kaikki näytteet, jotka tulivat varmoista negatiivisista vertailuista ja jotka 20 oli saatu verenluovuttajilta, joilla oli ainakin 10 veren luovutusta ilman todettua hepatitista, eivät olleet reaktiivisia ELISA:ssa. Lopulta neljä näytteistä, jotka oli /**. tutkittu aikaisemmin, oli arvioitu positiivisiksi oletetuissa • · · NANBH-analyyseissä muiden toimesta, muttei näitä analyysejä • ·
25 voitu varmistaa. Nämä näytteet arvioitiin negatiivisiksi HCV
• · ELISA :11a.
• · • · · • ·
Taulukko 7 :***: H.ALTER1 in lew 1: ··· .......
30 . Lew 1 .tulos 2. tulos todettu inf. simpanssimallilla : A. Kroon. NANB:Post-Tx *·* 35 JF + + ··· EB + + * * · · _ _ ·.. PG + +
·...· B. Todettu luov. kohonn.ALT
bc + + 40 JJ + + .*.: bb + + ’· “ C. Akuutti ΝΑΝΒ: Post-Tx WH - 126 107620
2) Epäselv. infekt. simpanssimallilla A. Todettu luov. normaali ALT
CC
3) Akuutti NANB: Post-Tx 5 JL viikko 1 - JL viikko 2 - JL viikko 3 - - 4) Sairausvertailut A. Primäärinen sappikirroosi 10 EK - - B. Toipumassa oleva alkoholihepatitis HB - - 5) Varmat neg. vertailut DM - - 15 DC - - LV - - ML - AH - - 6) Potent. NANB-"antigeenejä" 20 JS-80-01T-0 (Ishida)
Asterix (Trepo)
Zurtz (Arnold)
Becassdine (Trepo) 25 IV.1.4. Levy 2: Luovuttaja/vastaanottaja
Koodattu levy käsitti kymmenen epäselvää verensiirron luovut-taja-vastaanottajatapausta, joihin liittyi NANBH, kaikkiaan 188 näytettä. Kukin tapaus käsitti näytteitä joiltakin tai kaikilta 30 vastaanottajan luovuttajilta ja sarjanäytteitä (otettu 3, 6 ja • · · 12 kuukautta verensiirron jälkeen) vastaanottajasta.
♦ ♦♦ ·.* · Sisällytettynä oli myös verinäyte, joka oli otettu ·· · • \i vastaanottajasta ennen verensiirtoa. Koodatun levyn toimitti *:·*: tri H.Alter NIH:stä ja tulokset lähetettiin hänelle arvioi- 35 tavaksi.
• 4* «·· • · • · • · ·
Tulokset, jotka on annettu taulukossa 8, osoittavat, että ELISA
^ havaitsi vasta-aineen serokonversion yhdeksässä kymmenestä • · ... NANBH:hon liittyvästä verensiirtotapauksesta. Tapauksesta 4 • · **·* 4 0 oleva näyte (jossa ei havaittu serokonversiota) yhtäpitävästi #>*·* reagoi huonosti ELISA:ssa. Kaksi kymmenestä :[**: vastaanottajanäytteestä oli reaktiivista kolme kuukautta verensiirron jälkeen. Kuusi kuukautta verensiirron jälkeen
• 4 J
• · I’*. kahdeksan vastaanottajanäytettä oli reaktiivisia; ja 12 • · · *· *· 45 kuukautta jälkeen olivat kaikki näytteet reaktiivisia lukuun ottamatta tapausta 4. Lisäksi ainakin yksi vasta-ainepositii- 127 107620 vinen luovuttaja huomattiin 7:ssä kymmenestä tapauksesta, jolloin tapauksella 10 oli kaksi positiivista luovuttajaa. Tapauksessa 10 myös vastaanottajan ennen verenluovutusta otettu näyte oli positiivinen HCV-vasta-aineille. Tästä 5 vastaanottajasta otettu yhden kuukauden näyte putosi reaktiivisuuden rajatasolle, kun taas se kohosi positiiviseksi neljän ja kymmenen kuukauden näytteissä. Yleisesti suhdetta S/CO, joka on 0,4 pidetään positiivisena. Täten tämä tapaus voi edustaa yksilön aikaisempaa HCV-infektiota.
10 ALT- ja HBc-status kaikille reaktiivisille, s.o. positiivisille näytteille on esitetty taulukossa 9. Kuten taulukosta nähdään, 1/8 luovuttajanäytteistä oli negatiivinen korvaavilla markkereina ja reaktiivinen HCV-vasta-aine-ELISA:ssa.
15 Toisaalta vastaanottajanäytteet (joita seurattiin 12 kuukautta verensiirron jälkeen) olivat ALT-arvoltaan kohonneita, anti-HBc:n suhteen positiivisia tai molempia.
Taulukko 8 20
Luovuttaja/vastaanottaja - NANB-levy H.Alterin luovuttaja/vastaanottaja - NANB-levy 25 ··· •
Tapaus Luovuttaja Vast.ott.
·*:*: Opt.tih. S/CO näyte ennen verens.
.I. Opt.tih. S/CO
: V 30 _____ 1. --- --- 0,032 0,07 * * 2. --- --- 0,059 0,14 :***: 3. 0,403 0,94 0,049 0,11 IV. 4. --- --- 0,065 0,15 35 5. >3,000 >6,96 0,034 0,08 6. >3,000 >6,96 0,056 0,13 7. >3,000 >6,96 0,034 0,08 ·:··: 8. >3,000 >6,96 0,061 0,14 9. >3,000 >6,96 0,080 0,19 40 10. >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 *. >3,000 >6,96 ··· « • * *·;·* Tapaus Verens. jälkeen .···. 45 3 kk 6 kk 12 kk
·...* OT S/CO OT S/CO OT S/CO
♦ · • ♦ · — — — — — —----— — — —--—---— —---— — — — — — — — — —— — — — — — — — — — — — — — — —---- *· *; 1. 0,112 0,26 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 2. 0,050 0,12 1,681 3,90 >3,000 >6,96 128 107620 3. 0,057 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 4. 0,073 0,17 0,067 0,16 0,217 0,50 5. 0,096 0,22 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 6. 1,475 3,44 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 5 7. 0,056 0,13 >3,000 >6,96 >3,000 >6,96 8. 0,078 0,18 2,262 5,28 >3,000 >6,96 9. 0,127 0,30 0,055 0,13 >3,000 >6,96 10. 0,317* 0,74 >3,000** >6,96 >3,000*** >6,96 10 * 1 kk, ** 4 kk, *** 10 kk.
OT = optinen tiheys
Taulukko 9 15 ALT- jaHBc-status reaktiivisille näytteille H.Alterin levyssä 1 Näytteet Anti-ALT* HBc** 20
Luovuttajat tapaus 3 normaali neg.
tapaus 5 kohonnut pos.
25 tapaus 6 kohonnut pos.
tapaus 7 ei saatavilla neg.
tapaus 8 normaali pos.
tapaus 9 kohonnut ei saatav.
tapaus 10 normaali pos.
30 tapaus 10 normaali pos.
Vastaanottaj at ... tapaus 1 6 kk kohonnut pos.
·...* 35 12 kk kohonnut ei tutk.
tapaus 2 6 kk kohonnut neg.
·* 12 kk kohonnut ei tutk.
:*·*· tapaus 3 6 kk normaali ei tutk*** | *. 12 kk kohonnut ei tutk*** 4 0 tapaus 5 6 kk kohonnut ei tutk.
.···, 12 kk kohonnut ei tutk.
*···' tapaus 6 3 kk kohonnut neg.
:***; 6 kk kohonnut neg.
12 kk kohonnut ei tutk.
45 tapaus 7 6 kk kohonnut neg.
12 kk kohonnut neg.
tapaus 8 6 kk normaali pos.
**’*: 12 kk kohonnut ei tutk.
tapaus 9 12 kk kohonnut ei tutk.
··· 50 tapaus 10 4 kk kohonnut ei tutk.
*!** 10 kk kohonnut ei tutk.
• · • · ·· ♦ * ALT > 45 IU/1 on normaalirajojen yläpuolella *·»·* ** Anti-HBc < 50 % (kilpaileva analyysi) pidetään positiivisena :\j 55 *** ennen verensiirtoa otettu näyte ja 3 kk:n näyte olivat negatiivisia HBc:lie.
129 107620 IV.I.5. HCV-infektion määrittäminen suuren riskin ryhmän näytteistä Näytteitä suuren riskin ryhmistä tarkkailtiin käyttäen ELISA:aa 5 reaktiivisuuden määrittämiseksiHCV cl00-3-antigeenille. Nämä näytteet saatiin tri Gary Tegtmeieriltä, Community Blood Bank, Kansas City. Tulokset on esitetty taulukossa 10.
Kuten taulukosta nähdään, saatiin näytteet, joiden reaktii-10 visuus oli korkein verenvuototautia sairastavilta (76 %).
Lisäksi näytteet yksilöistä, joiden ALT oli koholla ja jotka olivat positiivisia anti-HBc:lie, arvioitiin 51 % reaktiivisiksi, arvo mikä on yhtäpitävä sen arvon kanssa, joka arvioidaan kliinisestä tiedosta ja NANBH:n levinneisyydestä tässä 15 ryhmässä. HCV:n vastaisen vasta-aineen esiintyminen oli myös yleisempää verenluovuttajissa, joilla oli vain kohonnut ALT, verenluovuttajilla, jotka olivat positiivisia vain hepatitis-B-kuoren vasta-aineiden suhteen ja verenluovuttajissa, jotka oli hylätty muista syistä kuin korkean ALT-arvon tai anti-kuori-20 vasta-aineen takia verrattuna sattumanvaraisiin vapaaehtoisiin luovuttaj iin.
Taulukko 10 ... 25 • · • · · NANBH:n suhteen suuren riskin ryhmän näytteet • · · 130 107620
Ryhmä N Jakaantuma % reakt.
N OT
5 Verenvuototautiset 50 31 >3,000 76,0 1 2,568 1 2,483 1 2,000 1 1,979 10 1 1,495 1 1,209 1 0,819 IV.I.6. Vertailututkimukset käyttäen Anti-IgG- tai Anti-IqM-15 monoklonaalisia vasta-aineita tai polyklonaalisia vasta-aineita toisena vasta-aineena HCV cl00-3 ELISA-analyysissä ELISA-määrityksen herkkyyttä käyttäen anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia verrattiin siihen, mikä saatiin käyttäen joko 20 anti-IgM-monoklonaalista konjugaattia tai korvaamalla molemmat polyklonaalisella antiseerumilla, jonka on ilmoitettu olevan spesifinen sekä raskaalle että kevyelle ketjulle, uoritettiin seuraavat tutkimukset.
25 IV.1.6.a. Sarianäytteet serokonvertoijista
Sarjanäytteitä kolmesta tapauksesta, jotka olivat NANB-sero- • · · • ..#ϊ konvertoijia, tutkittiin HCV cl00-3-ELISA-analyysillä käyttäen entsyymikonjugaatissa joko anti-IgG-monoklonaalista yksin tai 30 yhdistelmänä anti-IgM-monoklonaalisen kanssa tai käyttäen • · polyklonaalista antiseerumia. Näytteet toimitti tri Cladd .···. Stevens, N.Y. Blood Center, N.Y.C., N.Y. . Näytehistoria on • · • V.' esitetty taulukossa 11.
* · • · · 35 Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-IgG-monoklonaalista [ * vasta-aine-entsyymikonjugaattia, on esitetty taulukossa 12.
...* Tiedot osoittavat, että voimakas reaktiivisuus havaitaan ··· alunperin näytteissä 1-4, 2-8 ja 3-5 vastaavasti tapauksista 1, ·>·· .*··. 2 ja 3.
» I
*·* 40 • · · ’···* Tulokset, jotka saatiin käyttäen anti-IgG-monoklonaalista • · konjugaattia yhdessä anti-IgM-konjugaatin kanssa, on esitetty 131 107620 taulukossa 13. Kolme erilaista anti-IgG:n ja anti-IgM:n suhdetta tutkittiin, anti-IgG:n laimennos 1:10000 oli vakio koko ajan.Laimennokset, jotka tutkittiin anti-IgM-monoklonaa-liselle konjugaatille olivat 1:30000, 1:60000 ja 1:120000.
5 Tiedot osoittavat, että yhtäpitävästi yksin anti-IgG:llä saatujen tulosten kanssa, alkuperäinen voimakas reaktiivisuus havaittiin näytteissä 1-4, 2-8 ja 3-5.
Tulokset, jotka saatiin ELISA:11a käyttäen anti-IgG-monok-10 lonaalista konjugaattia (1:10000 laimennos) tai Tago-polyk-lonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos) tai Jackson-polyklonaalista konjugaattia (1:80000 laimennos), on esitetty taulukossa 14. Tiedot merkitsevät, että alkuperäinen voimaks reaktiivisuus havaitaan näytteissä 1-4, 2-8 ja 3-5 käyttäen 15 kaikkia kolmea järjestelmää; Tago-polyklonaaliset vasta-aineet antoivat alhaisimmat signaalit.
Yllä esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki kolme järjestelmää havaitsevat reaktiiviset näytteet samalla tavalla taudin 20 akuutin vaiheen jälkeen (minkä todistaa ALT:n nousu). Lisäksi tulokset merkitsevät, että HCV cl00-3-ELISA:n herkkyys käyttäen anti-IgG-monoklonaalista entsyymikonjugaattia on yhtä hyvä tai parempi kuin muiden tutkittujen entsyymikonjugaattien järjestelmien herkkyydet.
::: 25 V 1 Taulukko 11 • · · : ·1 Cladd Stevensin levyn näytteiden kuvaus • · ... 30 pvm HBsAg Anti- Anti- ALT Bili- ·...· HBs HBc rubin • 1 ____________________________ _ _ _ _ ____________________ _ _ • · *···1 Tapa us 1 . 35 1-1 5.8.81 1,0 91,7 12,9 40,0 -1,0 . — . 1-2 2.9.81 1,0 121,0 15,1 274,0 1,4 1-3 7.10.81 1,0 64,0 23,8 261,0 0,9 1-4 19.11.81 1,0 67,3 33,8 75,0 0,9 —: 40 1-5 15.12.81 1,0 50,5 27,6 71,0 1,0 • « · • ♦ • ♦ ♦ · · ··» • · • · · · • · · • · · • » 132 107620
Tapaus 2 2-1 19.10.82 1,0 1,0 116,2 17,0 -1,0 5 2-2 17.11.81 1,0 0,8 89,5 46,0 1,1 2-3 2.12.81 1,0 1,2 78,3 63,0 1,4 2-4 14.12.81 1,0 0,9 90.6 152,0 1,4 2-5 23.12.81 1,0 0,8 93,6 624,0 1,7 2-6 20.1.82 1,0 0,8 92,9 66,0 1,5 10 2-7 15.2.82 1,0 0,8 86,7 70,0 1,3 2-8 17.3.82 1,0 0,9 69,8 24,0 -1,0 2-9 21.4.82 1,0 0,9 67,1 53,0 1,5 2-10 19.5.82 1,0 0,5 74,8 95,0 1,6 2- 11 14.6.82 1,0 0,8 82,9 37,0 -1,0 15
Tapaus 3 3- 1 7.4.81 1,0 1,2 88,4 13,0 -1,0 20 3-2 12.5.81 1,0 1,1 126,2 236,0 0,4 3-3 30.5.81 1,0 0,7 99,9 471,0 0,2 3-4 9.6.81 1,0 1,2 110,8 315,0 0,4 3-5 6.7.81 1,0 1,1 89,9 273,0 0,4 3-6 10.8.81 1,0 1,0 118,2 158,0 0,4 25 3-7 8.9.81 1,0 1,0 112,3 84,0 0,3 3-8 14.10.81 1,0 0,9 102,5 180,0 0,5 3-9 11.11.81 1,0 1,0 84,6 154,0 0,3 * · • · • · · * 1 · * · · • · · • · · • φ m 9 • • · · • 9 • · « • · · • · • · * ♦ 1 • · • 9 ··· »«· • · · · ··» • · • · • · · « • · · • · • ♦ • · · · * · · • ·· • · 5 ELISA-tulokse, jotka on saatu käyttäen anti-IgG-monoklonalista konjugaattia
Taulukko 12 107620 133
Näyte Pvm ALT Opt.tih. S/CO
10 ----------------------------------------------------------
Neg. vertailu 0,076
Cutoff 0,476 PC (1:128) 1,390 15
Tapaus 1 1-1 5.8.81 40,0 0,178 0,37 1-2 2.9.81 274,0 0,154 0,32 20 1-3 7.10.81 261,0 0,129 0,27 1-4 19.11.81 75,0 0,937 1,97 1- 5 15.12.81 71,0 >3,000 >6,30
Tapaus 2 25 2- 1 19.10.82 17,0 0,058 0,12 2-2 17.11.81 46,0 0,050 0,11 2-3 2.12.81 63,0 0,047 0,10 2-4 14.12.81 152,0 0,059 0,12 30 2-5 23.12.81 624,0 0,070 0,15 2-6 20.1.82 66,0 0,051 0,11 2-7 15.2.82 70,0 0,139 0,29 2-8 17.3.82 24,0 1,867 3,92 2-9 21.4.82 53,0 >3,000 >6,3 35 2-10 19.5.82 95,0 >3,000 >6,30 2- 11 14.6.82 37,0 >3,000 >6,30 »»« ' ' ' • · · ·1 Tapaus 3 # · · • · · ; \ -40 3-1 7.4.81 13,0 0,090 0,19 *:2: 3-2 12.5.81 236,0 0,064 0,13 .···. 3-3 30.5.81 471,0 0,079 0,17 *...·1 3-4 9.6.81 315,0 0,211 0,44 3- 5 6.7.81 273,0 1,707 3,59 . 1··’ 45 3-6 10.8.81 158,0 >3,000 >6,30 3-7 8.9.81 84,0 >3,000 >6,30 3-8 14.10.81 180,0 >3,000 >6,30 * 3-9 11.11.81 154,0 >3,000 >6,30 • · · • · 5 0 • · · • · · · • 1 · • · • · · · · • · • · 2 • · · • · • · · • 2 • · ELISA-tulokset, jotka on saatu käyttäen anti-IgG- ja anti-IgM- 5 monoklonaalista koniugaattia
Taulukko 13 134 107620 NÄNB ELISA:t
Monokl. Monokl. Monokl.
IgG1 IgG1 IgG1 10 IgM2 IgM3 IgM4
Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO
Neg. vertailu 0,100 0,080 0,079
Cutoff 15 PC (1:128) 1,083 1,328 1,197
Tapaus 1 1-1 5.8.81 40,0 0,173 0,162 0,070 20 1-2 2.9.81 274,0 0,194 0,141 0,079 1-3 7.10.81 261,0 0,162 0,129 0,063 1-4 19.11.81 75,0 0,812 0,85 0,709 1- 5 15.12.81 71,0 >3,000 >3,000 >3,000 25 Tapaus 2 2- 1 19.10.82 17,0 0,442 0,045 0,085 2-2 17.11.81 46,0 0,102 0,029 0,030 2-3 2.12.81 63,0 0,059 0,036 0,027 30 2-4 14.12.81 152,0 0,065 0,041 0,025 2-5 23.12.81 624,0 0,082 0,033 0,032 2-6 20.1.82 66,0 0,102 0,042 0,027 2-7 15.2.82 70,0 0,188 0,068 0,096 2-8 17.3.82 24,0 1,728 1,668 1,541 ... 35 2-9 21.4.82 53,0 >3,000 2,443 >3,000 2- 10 19.5.82 95,0 >3,000 >3,000 >3,000 .·.1·. 2-11 14.6.82 37,0 >3,000 >3,000 >3,000
« · I
:1·1: Tapaus 3 • 40 3- 1 7.4.81 13,0 0,193 0,076 0,049 3-2 12.5.81 236,0 0,201 0,051 0,038 3-3 30.5.81 471,0 0,132 0,067 0,052 : 3-4 9.6.81 315,0 0,175 0,155 0,140 45 3-5 6.7.81 273,0 1,335 1,238 1,260 3-6 10.8.81 158,0 >3,00 >3,00 >3,00 3-7 8.9.81 84,0 >3,00 >3,00 >3,00 3-8 14.10.81 180,0 >3,00 >3,00 >3,00 • 2: 3-9 11.11.81 154,0 >3,00 >3,00 >3,00 *:1 so #>··· OT = optinen tiheys *111^ 1 = laimennos 1:10000, 2 = laimennos 1:30000, 3 = laimennos :...· 1:60000, 4 = laimennos 1:120000 • · · • · • ♦ · 2 • · · 3 • 1♦ 4 • ·
Taulukko 14 ELISA-tulokset, jotka on saatu käyttäen polyklonaalisia 5 koniuqaatteia 135 107620 NANB ELISA: t 10 Monokl. Tago Jackson
1:10000 1:80000 1:80000 Näyte Pvm ALT OT S/CO OT S/CO OT S/CO
Neg. vertailu 0,076 0,045 0,154 15 Cutoff 0,476 0,545 0,654 PC (1:128) 1,390 0,727 2.154
Tapaus 1 20 1-1 5.8.81 40 0,178 0,37 0,067 0,12 0,153 0,23 1-2 2.9.81 274 0,154 0,32 0,097 0,18 0,225 0,34 1-3 7.10.81 261 0,129 0,27 0,026 0,05 0,167 0,26 1-4 19.11.81 75 0,937 1,97 0,324 0,60 0,793 1,21 1- 5 15.12.81 71 >3,00 >6,30 1,778 3,27 >3,00 >4,59 25
Tapaus 2 2- 1 19.10.82 17 0,058 0,12 0,023 0,04 0,052 0,08 2-2 17.11.81 46 0,050 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 30 2-3 2.12.81 63 0,047 0,10 0,020 0,04 0,060 0,09 2-4 14.12.81 152 0,059 0,12 0,025 0,05 0,054 0,08 2-5 23.12.81 624 0,070 0,15 0,026 0,05 0,074 0,11 2-6 20.1.82 66 0,051 0,11 0,018 0,03 0,058 0,09 2-7 15.2.82 70 0,139 0,29 0,037 0,07 0,146 0,22 ... 35 2-8 17.3.82 24 1,867 3,92 0,355 0,65 1,429 2,19 *...·' 2-9 21.4.82 53 >3,00 >6,30 0,748 1,37 >3,00 >4,59 2- 10 19.5.82 95 >3,00 >6,30 1.025 1,88 >3,00 >4,59 ];V 2-11 14.6.82 37 >3,00 >6,30 0,917 1,68 >3,00 >4,59 • · · • · ! 1. 40 Tapaus 3 ····· - ~ • · .·'2·. 3-1 7.4.81 13 0,090 0,19 0,049 0,09 0,138 0,21 3- 2 12.5.81 236 0,064 0,13 0,040 0,07 0,094 0,14 S. .1 3-3 30.5.81 471 0,079 0,17 0,045 0,08 0,144 0,22 . 3 45 3-4 9.6.81 315 0,211 0,44 0,085 0,16 0,275 0,42 3-5 6.7.81 273 1,707 3,59 0,272 0,50 1,773 2,71 3-6 10.8.81 158 >3,00 >6,30 1,347 2,47 >3,00 >4,59 ... 3-7 8.9.81 84 >3,00 >6,30 2.294 4,21 >3,00 >4,59 3-8 14.10.81 180 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 50 3-9 11.11.81 154 >3,00 >6,30 >3,00 >5,50 >3,00 >4,59 ···· • · • · *·· ··· • · • · • · · · • · · 2 • ·· 3 • · 136 107620 IV.I.6.b. Näytteet sattumanvaraisista verenluovuttajista Näytteitä sattumanvaraisista verenluovuttajista (ks. osa IV.I.l.) seulottiin HCV-infektion suhteen käyttäen cl00-3-5 ELISA:aa, jossa vasta-aine-entsyymikonjugaatti oli joko anti-IgG-monoklonalinen konjugaatti tai polyklonaalinen konjugaatti. Seulottujen näytteiden kokonaismäärä oli 1077 polyklonaalisilla konjugaateilla ja vastaavasti 1056 monoklonaalisilla konjugaateilla. Seulonnan tulokset on esitetty taulukossa 15 ja 10 näytteiden jakaantuma on esitetty kuvion 44 histogrammissa.
Keskimääräisen ja standardipoikkeaman laskeminen suoritettiin sulkemalla pois näytteet, jotka antoivat yli 1,5 olevan signaalin, s.o. 1073 optisen tiheyden arvoa käytettiin las-15 kemisia varten käyttäen polyklonaalista konjugaattia ja 1051 käytettäessä anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia. Kuten nähdään taulukosta 15, kun käytettiin polyklonaalista konjugaattia, nousi keskiarvo 0,0493:sta 0,0931:een ja satndar-dipoikkeama lisääntyi 0,074:stä 0,0933:een. Lisäksi tulokset 20 osoittavat myös, että x + 5SD:n kriteeriä käytetään määrittämään analyysin cutoffia, polyklonaalisen konjugaatin järjestelmä vaatii ELISA:ssa korkeamman cutoff-arvon. Tämä merkitsee alentunutta analyysispesifisyyttä verrattuna monok- • · · ·„.ί lonaaliseen järjestelmään. Lisäksi, kuten on kuvattu kuvion 44 •T: 25 histogrammissa, suurempi tulosten erottuminen negatiivisten ja ·1·1; positiivisten jakaantumisien välillä tapahtuu, kun • · sattumanvaraisia verenluovuttajia seulotaan ELISA: 11a käyttäen .···. anti-IgG-monoklonaalista konjugaattia verrattuna analyysiin, • · ,···. joka käyttää kaupallista polyklonaalista leimaa.
***** 30 t • · • ·· • · ♦ ♦ ♦ « • · · ♦ ··· • »· • · ♦ · ·♦ · • · · • · ♦ · · • · ♦ • ♦♦ • « 137 107620
Taulukko 15
Kahden ELISA-järjestelmän vertailu tutkittaessa sattumanvaraisten verenluovuttajien näytteitä 5
Konjugaatti Polyklonaalinen Anti-IqG:n monoklon.
(Jackson) Näytteiden lkm 1073 1051
Keskiarvo (x) 0,0931 0,04926 10 Standardipoikk. 0,0933 0,07427 5 SD 0,4666 0,3714
Cutoff (5 SD+x) 0,5596 0,4206 IV.J. HCV-serokonversion havaitseminen NANBH-potilaissa eri 15 maantieteellisissä paikoissa
Seerumia potilaista, joiden epäiltiin sairastavan NANBH:a perustuen kohonneisiin ALT-tasoihin ja jotka olivat negatiivisia HAV- ja HBV-testeissä, seulottiin käyttäen RIA:aa 20 olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV clOO-3-antigeeniä käytettiin seulonta-antigeeninä mik-rotiitterilevyillä. Kuten nähdään taulukossa 16 esitetyistä tuloksista, RIA:n avulla havaittiin positiivisia näytteitä M· suuressa tapausten prosenttimäärässä.
··· ::: 25 :*·1: Taulukko 16 • · ·;··· Serokonversiotaaiuus eri maista peräisin olevien NANBH-poti- .*·1. laiden joukossa käyttäen anti-cl00-3 :a ··· * ·· • · • ♦ t 30 Maa Hollanti Italia Japani . Tutk.lkm 5 36 26
Positiivisia 3 29 19 ···
Posit. % 60 80 73 • · · ♦ ♦♦· .***. 35 IV.K. HCV-serokonversion havaitseminen potilaissa, joilla on
"yhteisöhankittu" NANBH
• » • ♦ • ·· ♦ · ♦ · ♦
Seerumia joka saatiin 100 potilaasta, joilla oli NANBH, ja 138 107620 joille ei ollut ilmeistä siirtymistietä (s.o. ei verensiirtoja, suonensisäistä lääkkeen käyttöä, vapaita sukupuolisuhteita jne. joita kysyttiin riskitekijöinä) toimitti tri M. Alter Center for Disease Controlista ja tri J. Dienstag Harvardin 5 yliopistosta. Nämä näytteet seulottiin käyttäen RIA:aa olennaisesti, kuten on kuvattu osassa IV.D., paitsi että HCV clOO-3-antigeeniä käytettiin seulonta-antigeeninä kiinnitettynä mikrotiitterilevyille. Tulokset osoittivat, että 100 seruminäytteestä 55 sisälsi vasta-aineita, jotka reagoivat 10 immunologisesti HCV clOO-3-antigeenin kanssa.
Ylläkuvatut tulokset ehdottavat, että "yhteisöhankittu" NÄNBH aiheutuu myös HCV:stä. Lisäksi, koska tässä on todistettu, että HCV on Flaviviruksien sukua, joista useimmat siirtyvät 15 niveljalkaisten välityksellä, herättää tämä ajatuksen, että HCV:n siirtyminen "yhteisöhankituissa" tapauksissa on myös tulosta siirtymisestä niveljalkaisten välityksellä.
IV.L. HCV-vasta-aineiden ja korvaavien markkereiden esiin-20 tymisen vertailu luovuttajissa, jotka liittyvät NANBH:n siirtymiseen
Tulevaisuutta kartoittava tutkimus suoritettiin sen määrit- • · · ·...: tämiseksi, serokonvertoituvatko sellaiset veren vastaanottajat, 25 jotka saavat verta epäillyistä NANBH-positiivisista luovuttajista, jotka kehittivät NANBH:n, anti-HCV-vasta- • · ainepositiivisiksi. Verenluovuttajat tutkittiin korvaavien .···. markkereiden epänormaalisuuksien suhteen, joita markkereita • · .···. käytetään nykyään NANBH-infektion markkereina, s.o. kohonneet • · 30 ALT-tasot ja antikuori-vasta-aneiden läsnäolo. Lisäksi luo vuttajat tutkittiin myös anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon varalta. Anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon määrittäminen »·· • * ··.' tehtiin käyttäen radioimmunologista analyysiä, kuten on kuvattu ··· osassa IV.K. Tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 17, ··· · .·*·. 35 mikä esittää: potilaiden lukumäärän (palsta 1); anti-HCV-vasta- • · # aineiden läsnäolon potilasseerumissa (palsta 2) ; potilaan • « *···’ saamien luovutusten lukumäärän, kunkin luovutuksen ollessa eri *. *; luovuttajalta (palsta 3) ; anti-HCV-vasta-aineiden läsnäolon 107620 13 9 luovuttajan seerumissa (palsta 4); ja luovuttajan korvaavan epänormaalisuuden (palsta 5) (NT tai --- merkitsee, ettei sitä ole tutkittu) (ALT on kohonnut transaminaasi ja anti-HBc on antikuori vasta-aine).
5
Taulukon 17 tulokset osoittavat, että HCV-vasta-ainekoe on tarkempi havaitsemaan infektoituneita verenluovuttajia kuin korvaavat markkerikokeet. Yhdeksän kymmenestä potilaasta, jotka kehittivät NANBH-oireita havaittiin positiivisiksianti-HCV-10 vasta-aineiden serokonversion suhteen. Yhdestätoista epäillystä luovuttajasta (potilas 6 sai luovutuksia kahdelta eri yksilöltä, joiden epäiltiin olevan NANBH-kantajia) yhdeksän oli positiivista anti-HCV-vasta-aineiden suhteen ja yksi oli rajatapaus positiivisena ja sen takia epävarma (potilaan 1 15 luovuttaja). Tälle vastakohtana, käyttäen kohonnutta ALT-koetta, kuusi kymmenestä luovuttajasta oli negatiivista ja käyttäen antikuori-vasta-ainekoetta, viisi kymmenestä luovuttajasta oli negatiivista. Suuremmasta merkityksestä on kuitenkin kolmessa tapauksessa (potilaiden 8, 9 ja 10 20 luovuttajat), että ALT-koe ja anti-HBc-koe antoivat tuloksena ristiriitaisia tuloksia.
Taulukko 17 ·1·. 25 Anti-HCV-vasta-aineiden kehittyminen potilaissa, jotka saivat *···’ verta luovuttajilta, joiden epäiltiin olevan NANBH-kantaj ia ··« • · · .2 . Anti-HCV- Luovut./ Anti-HCV- Korvaava • V serokonv. Luovutt. positiiv. epänorm.
30 Potilas potilaassa lkm luovutt. ALT Anti-HB
• · :3: 1 kyllä 18 epäselvä ei ei lii 2 kyllä 18 kyllä NT kyllä 3 kyllä 13 kyllä ei ei 35 4 ei 18 ei --- --- 5 kyllä 16 kyllä kyllä kyllä ·;·1: 6 kyllä 11 kyllä (1) ei ei kyllä kyllä *...· 7 kyllä 15 kyllä NT ei *. 40 8 kyllä 20 kyllä ei kyllä ..1·1 9 kyllä 5 kyllä kyllä ei .♦··. 10 kyllä 15 kyllä ei kyllä • · ··· s'··' 1 sama luovuttaja kuin anti-NANBH-positiivinen 45 · · 2 • ·· 3 • · 140 107620 IV.M. Amplifikaatio HCV:n cDNA-sekvenssien kloonaamiseksi käyttäen PCR:ää ia primereitä, jotka ovat peräisin Flaviviruksen genomisekvenssien säilyneistä alueista 5 Yllä esitetyt tulokset, jotka ehdottavat, että Hcv on flavi-virus tai flavityyppinen virus, sallii strategian karakteri-soimattomien HCV-.n cDNA-sekvenssien kloonaamiseksi käyttäen PCR-tekniikkaa ja primereitä, jotka ovat peräisin niiltä alueilta, jotka kodaavat säilyviä aminohapposekvenssejä 10 flaviviruksissa. Yleisesti yksi primereista on johdettu määritellystä HCV:n genomisekvenssistä ja toinen primeri, joka on sekventoimattoman HCV-polynukleotidin alueen vieressä, on peräisin flavivirusgenomin säilyvästä alueesta. Flaviviruksien genomien tiedetään sisältävän säilyviä sekvenssejä NS1- ja E-15 polypeptideissä, jotka ovat koodattuja flaviviruksen genomin 5'-alueella. Vastaavat näitä alueita koodaavat sekvenssit ovat kuviossa 26 esitetyistä HCV:n cDNA-sekvensseistä ylävirtaan päin. Täten tältä HCV:n genomin alueelta peräisin olevien sekvenssien eristämiseksi suunnitellaan ylävirran puolen 20 primereitä, jotka ovat peräisin näiden flaviviruspolypeptidien säilyvistä sekvensseistä. Alavirran puolen primerit ovat peräisin HCV:n cDNA:n tunnetun osan ylävirran puolen päästä.
··♦ *...· Koodin degeneroitumisen takia on luultavaa, että flavivirus- · 25 koettimien ja vastaavan HCV-genomin sekvenssin välillä on j***: sopimattomia alueita. Siksi käytetään strategiaa, joka saman- ·;··· lainen kuin se, minkä on kuvannut Lee (1988) . Leen menet- ;**·. telytapa käyttää sekaoligonukleotidiprimereita, jotka ovat ·♦» .··*. komplementaarisia aminohapposekvenssin käänteistranslaatio- 30 tuotteille; sekaprimereiden sekvenssit ottavat huomioon jokaisen kodonin degeneraation säilyvää aminohapposekvenssiä • *· ... varten.
• · ··· <#·:* On luotu kolme sarjaa primeriseoksia, jotka perustuvat useissa ·***: 35 f laviviruksissa havaittuihin aminohappohomologioihin, ·· » mukaanlukien Dengue-2,4 (D-2,4), japanilaisen enkefaliit- • · **\ tiviruksen (JEV), keltakuumeen (YF) ja Länsi-Niilin viruksen *· : (WN). Useimmista ylävirran säilyvistä sekvensseistä (5'-l) 141 107620 peräisin oleva primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin gly-trp-gly, mikä on osa säilyvästä sekvenssistä asp-arg-gly-trp-gly-aspN, joka on löydetty D-2:n, JEV:n, YF:n ja WN:n E-proteiinista. Seuraava primeriseos (5’-2) perustuu alavirran 5 säilyvään sekvenssiin E-proteiinissa, phe-asp--gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu ja se on peräisin phe-gly-asprsta; säilyvä sekvenssi on läsnä D-2:ssa, JEV:ssä, YF:ssä ja WN:ssä. Kolmas primeriseos perustuu aminohapposekvenssiin arg-ser-cys, joka on osa säilyvää sekvenssiä cys-cys-arg-ser-cys D-10 2:n, D-4:n, JEV:n, YF:n ja WN:n NSl-proteiinissa. Yksittäiset primerit, jotka muodostavat seoksen 5'-3:ssa on esitetty kuviossa 45. Säilyvästä alueesta peräisin olevien eri sekvenssien lisäksi kukin primeri kussakin seoksessa sisältää myös vakioalueen 5'-päässä, joka sisältää sekvenssin, joka 15 koodaa paikkoja restriktioentsyymejä Hindlll, Mbol ja EcoRI varten.
Alavirran puolen primeri, ssc5h20A on peräisinkloonin 5h nukleotidisekvenssistä, joka sisältää HCV:n cDNA:ta, jonka 20 sekvenssit menevät päällekkäin kloonien 14i ja 11b sekvenssien kanssa. ssc5h20A:n sekvenssi on 5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' ·«« * · • •m ·*·*· 25 Voidaan käyttää myös vaihtoehtoista primeria, ssc5h34A. Tämä primeri on peräisin kloonin 5h sekvenssistä ja se sisältää • · * lisäksi nukleotideja 5'-päässä, jotka luovat restriktioent- ♦ · ^...^ syymin paikan täten helpottaen kloonausta. ssc5h34A:n sekvenssi • » ««· _ _ ... on **··** 3 0 5 1 GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3' * · ' · * · PCR-reaktio, jota on alunperin kuvannut Saiki et ai. (1986), suoritetaan olennaisesti, kuten on kuvannut Lee et ai. (1988), ···* .···. 35 paitsi että cDNA:n malline on RNA, joka on eristetty • ♦ ’Γ HCV_infektoidun simpanssin maksasta, kuten on kuvattu osassa ··· ·...· IV.C.2., tai viruspartikkeleista, jotka on eristetty HCV- • · ·.**: infektoidun simpanssin seerumista, kuten on kuvattu osassa 142 107620 IV.A.l. Lisäksi olosuhteet ovat vähemmän ankarat amplifikaation ensimmäisellä kierroksella (0,6 M NaCl ja 25°C), koska primerin se osa, joka liittyy HCV-sekvenssiin on vain 9 nukleotidin pituinen ja siinä voi olla huonosti yhteensopivia osia.
5 Lisäksi, jos käytetään ssc5h34A:ta, lisäsekvenssit, jotka eivät ole peräisin HCV:n genomista ovat taipuvaisia destabiloimaan primeri-mallinehybridin. Amplifikaation ensimmäisen kierroksen jälkeen liitosolosuhteet voivat olla ankarammat (0,066 M NaCl ja 32 - 37°C) , koska amplifioidut sekvenssit sisältävät nyt 10 alueita, jotka ovat komplementaarisia primereille tai niiden kopioille. Lisäksi ensimmäiset kymmenen amplifikaatiosykliä suoritetaan Klenowin entsyymi I:llä tälle entsyymille sopivissa PCR-olosuhteissa. Syklien suorittamisen jälkeen näytteet uutetaan ja niihin käytetään Tag-polymeraasia pakkauksen 15 ohjeiden mukaisesti, kuten Cetus/Perkin Elmer on esittänyt.
Amplifikaation jälkeen amplifioidut HCV:n cDNA-sekvenssit osoitetaan hybridisaation avulla käyttäen kloonista 5h peräisin olevaa koetinta. Tämä koetin on peräisin sekvensseistä 20 ylävirtaan niistä, joita käytettiin primeria varten, ja joka ei mene päällekkäin kloonista 5h peräisin olevien primereiden sekvenssien kanssa. Koettimen sekvenssi on • · « • ·
*!! 5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC
• · · !:7 25 GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3' • · · • · • · IV.N.l. HCV:n cDNA kirjaston luominen infektoidun NÄNBH:ta • ·« "" “ - - 1 " — —— • · sairastavan simpanssin maksasta ♦ * · • · • · • · · 30 Luotiin HCV:n cDNA-kirjasto sellaisen simpanssin maksasta, ·:·*: josta oli luotu osan IV.A.l HCV:n cDNA-kirjasto. Tekniikka ·***; kirjaston luomiseksi oli samanlainen kuin se, jota käytettiin
• M
*. osassa IV.A.24., paitsi, että käytettiin tätä erilaista RNA-.n • · · lähdettä ja että primeri perustui kloonin 11b HCV:n cDNA- • * '···* 35 sekvenssiin. Primerin sekvenssi oli • · · • · • · • · · : 5 ’ CTG GCT TGA AGA ATC 3 1 • · * • · 143 107620 IV.N.2. Kloonissa k9-l olevan HCV:n cDNA:n kloonin 11b cDNA:n kanssa päällekkäin menevä nukleotidisekvenssi ia eristäminen
Klooni k9-l eristettiin HCV:n cDNA-kirjastosta, joka oli luotu 5 NANBH-infektoidun simpanssin maksasta, kuten kuvattiin osassa IV.A.25. Kirjasto seulottiin sellaisten kloonien suhteen, jotka menevät päällekkäin kloonin 11b sekvenssin kanssa käyttäen kloonia, joka menee päällekkäin kloonin 11b kanssa 5'-päässä, kloonia lie. Kloonin 11b sekvenssi on esitetty kuviossa 23.
10 Positiiviset kloonit eristettiin taajuudella 1 500000:sta. Yhtä eristettyä kloonia, k9-l, tutkittiin tarkemmin. Kloonin k9-l HCV:n cDNA:n päällekkäin menevä luonne kuvion 26 HCV:n cDNA:n 5’-pään kanssa varmistettiin tutkimalla kloonia kloonilla Alex46; jälkimmäinen klooni sisältää HCV:n cDNA-sekvenssin, 15 jossa on 30 emäsparia, jotka vastaavat niitä emäspareja ylläkuvatun kloonin 14i HCV:n cDNA:n 5'-päässä.
Kloonista k9-l eristetynHCV:n cDNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin käyttäen tekniikoita, joita kuvattiin yllä.
20 Kloonin k9-l HCV:n cDNA:n sekvenssi, sen päällekkäisyys kuvion 26 HCV:n cDNA:n kanssa ja siihen koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 46. Kloonin k9-l HCV:n cDNA-sekvenssi on /**. rinnakkainen niiden sekvenssien kanssa, jotka ovat klooneissa, • ·· joita on kuvattu osassa IV.A. 19. yhdistelmä-HCV:n cDNA-25 sekvenssin luomiseksi, jolloin k9-l-sekvenssi on asetettu • · ylävirtaan kuviossa 32 esitetystä sekvenssistä. Yhdistelmä-HCV:n cDNA-sekvenssi, joka sisältää k9-l-sekvenssin ja siihen • · *···* koodatut aminohapot on esitetty kuviossa 47.
· • · ··♦ 30 Kuviossa 47 esitetyn HCV:n cDNA:n 5'-alueeseen koodattujen aminohappojen sekvenssiä on verrattu yllä kuvattujen Dengue-viruskantojen vastaavaan alueeseen alueiden hydrofobisuuden ja hydrofiilisyyden suhteen. Tämä vertailu osoitti, että HCV:n ja tälle alueelle koodatun Dengue-viruksen, mikä vastaa NSl:tä • · *·;·* 3 5 (tai osaa siitä) koodaavaa aluetta, polypeptidit ovat hydrofobisuus-/hydrofiilisyysprofiileiltaan samanlaisia.
• t • « · • · · • ·
Alla annettu tieto sallii HCV-kantojen identifioinnin. Muiden 144 107620 HCV-kantojen eristäminen ja karakterisointi voidaan suorittaa eristämällä nukleiinihappoja ruumiin osista, jotka sisältävät viruspartikkeleita, luomalla cDNA-kirjastoja käyttäen poly-nukleotidikoettimia, jotka perustuvat alla kuvattuihin HCV:n 5 cDNA-koettimiin, seulomalla kirjastoja sellaisten kloonien varalta, jotka sisältävät alla kuvattuja HCV:n cDNA-sekvenssejä ja vertaamalla uusista eristetyistä osista olevia HCV:n cDNA:oita alla kuvattuihin cDNA:oihin. Niihin tai virusgenomiin koodattuja polypeptidejä voidaan tarkkaillaimmunologisen 10 ristireagoivuuden suhteen käyttäen yllä kuvattuja polypeptidejä ja vasta-aineita. Kannat, jotka sopivat HCV:n parametreihin, kuten on kuvattu yllä olevassa Määritelmät-osassa, voidaan identifioida helposti. Muut menetelmät HCV-kantojen identifioimiseksi ovat ilmeisiä alan ammattilaisille perustuen tässä 15 annettuun tietoon.
Keksinnöllä on, lukuisissa tässä esitetyissä ilmenemismuodoissaan, monia teollisia käyttöjä, joista muutamat ovat seuraavia. HCV:n cDNA:oita voidaan käyttää koettimien suun-20 nitteluun HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseeen näytteissä. cDNA:öistä peräisin olevia koettimia voidaan käyttää HCV:n nukleiinihappojen osoittamiseen esimerkiksi kemiallisissa ···. synteettisissä reaktioissa. Niitä voidaan käyttää myös seu- • · lontaohjelmissa antiviraalisia aineita varten, aineiden tehon • · · ,1 . 25 määrittämiseen estämään virusreplikaatiota soluviljelyjärjes- • · · * \ telmissä ja eläinmallijärjestelmissä. HCV-polynukleotidikoet- timet ovat myös hyödyllisiä virusnukleiinihappojen osoit- • · · tamisessa ihmisissä ja täten ne voivat toimia perusteena HCV- • · · infektion diagnosoimiseksi ihmisissä.
30 *:··; Yllä olevan lisäksi tässä esitetyt cDNArt antavat tietoa ja ·***· välineet HCV:n epitooppeja sisältävien polypeptidien syn- • · · *. tetisoimiseksi. Nämä polypeptidit ovat hyödyllisiä osoitet- ··♦ •••j taessa vasta-aineita HCV-antigeeneille. Tässä kuvataan sarja • » 35 immunologisia analyysejä HCV-infektiolle perustuen yhdis- :***: telmäpolypeptideihin, jotka sisältävät HCV-epitooppeja ja ne ··· ovat kaupallisesti käytettävissä diagnosoitaessa HCV:n ♦ · aiheuttamaa NANBH:a, seulottaessa veripankkien luovuttajia 145 107620 HCV:n aiheuttaman tarttuvan maksatulehduksen varalta ja myös osoittamaan saastunut veri, joka tulee tartuttavista verenluovuttajista. Virusantigeeneillä on myös käyttöä tarkkailtaessa antiviraalisien aineiden tehoa eläinmallijärjestelmissä. 5 HCV:n cDNA:öistä peräisin olevat polypeptidit ovat käyttökelpoisia, yllä kuvattujen käyttöjen lisäksi, anti-HCV-vasta-aineiden synnyttämiseksi. Kuitenkin vasta-aineet, jotka ovat syntyneet HCV-polypeptideillä tapahtuneen immunisoinnin 10 seurauksena, ovat myös käyttökelpoisia osoitettaessa virus-antigeenien läsnäolo näytteessä. Täten niitä voidaan käyttää HCV-polypeptidien tuotannon analysoimiseen kemiallisissa järjestelmissä. HCV:n vastaisia vasta-aineita voidaan käyttää myös tarkkailemaan virustenvastaisten aineiden tehoa seulon-15 taohjelmissa, joissa näitä aineita testataan kudosviljelyjär-jestelmissä. Niitä voidaan käyttää myös pasiiviseen immuno-terapiaan ja diagnosoimaan HCV:n aiheuttamaa NANBH:a sallimalla virusantigeenien osoittaminen sekä verenluovuttajissa että -vastaanottajissa. Toinen tärkeä käyttö HCV:n vastaisille vasta-20 aineille on affiniteettikromatografiässä viruksen ja viruspolypeptidien puhdistamiseksi. Puhdistettu virus voi olla myös hyödyllinen soluviljelyjärjestelmien kehittämisessä, /*·. joissa järjestelmissä HCV replikoituu.
· · * · · * · · • « » ;25 Soluviljelyjärjestelmällä, joka sisältää HCV-infektoituneita • · soluja, on monia käyttöjä. Niitä voidaan käyttää suhteellisen ...* laajamittaiseen HCV:n tuotantoon, mikä on normaalisti alhaisen • · *···’ tiitterin virus. Nämä järjestelmät ovat myös hyödyllisiä • · viruksen molekyylibiologian selvittämiseen ja ne voivat johtaa 30 virustenvastaisten aineiden kehittämiseen. Soluvil- “**: jelyjärjestelmät ovat myös hyödyllisiä virustenvastaisten .****: aineiden tehon seulonnassa. Lisäksi HCV:a sisältävät soluvil- • · · jelyjärjestelmät ovat hyödyllisiä heikennettyjen HCV-kantojen "" tuottamiseen.
• · • · _ 35 • · t Σ#<>! Mukavuuden vuoksiHCV:n vastaiset vasta-aineet ja HCV-polypep- tidit, joko luonnolliset tai yhdistelmät, voidaan pakata välinepakkauksiin.
146 107620
Menetelmä, jota käytetään HCV:n cDNA:n eristämiseen ja joka käsittää cDNA-kirjaston valmistamisen ollen peräisin yksilön infektoituneesta kudoksesta ekspressiovektoriin ja sellaisten 5 kloonien valitsemisen, jotka tuottavat ekspressiotuotteita, jotka reagoivat immunologisestivasta-aineiden kanssa vasta-aineita sisältävissä muiden infektoineiden yksilöiden , muttei infektoitumattomien yksilöiden, ruumiin osissa, voivat olla myös käyttökelpoisia cDNA:oitten eristämiseksi, jotka ovat 10 peräisin muista tähän asti tuntemattomista, sairauteen liittyvistä aineista, jotka muodostuvat genomiosista. Tämä voisi vuorostaan johtaa näiden aineiden eristämiseen ja karakterisointiin ja diagnostisiin reagensseihin näitä sairauksiin liittyviä aineita varten.
• · · • · • · · • · · • 1 ♦ • · · • 1 · • · • · • « • · · • · • · ··· • ·· • · • · ·»· ♦ • · • 1 · • · • · · » ···· • · · • · • ♦ ··· · · • ♦ • · ··♦ • · • · · • ♦♦ • ♦

Claims (25)

147 107620
1. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää jatkuvan, vähintään 10 nukleotidin sekvenssin kuviossa 47 esitetyn nukleotidisekvenssin 5 jommastakummastajuosteesta Jolloin mainittu polynukleotidi pystyy selektiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai sen komplementtiin.
2. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää jatkuvan, vähintään 10 nukleotidin sekvenssin kuviossa 14 esitetyn nukleotidisekvenssin jo jommastakummasta juosteesta, jolloin mainittu polynukleotidi pystyy selektiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai sen komplementtiin.
3. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää jatkuvan, vähintään 10 nukleotidin sekvenssin kuviossa 26 esitetyn nukleotidisekvenssin is jommastakummastajuosteesta, jolloin mainittu polynukleotidi pystyy selektiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai sen komplementtiin.
4. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää jatkuvan, vähintään 10 nukleotidin sekvenssin kuviossa 32 esitetyn nukleotidisekvenssin 20 jommastakummastajuosteesta, jolloin mainittu polynukleotidi pystyy selektiivisesti • · · *·♦·* hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai sen komplementtiin.
··· • · · • · · ·· · • · · • ·' 5. Olennaisesti eristetyssä muodossa oleva polynukleotidi, tunnettu siitä että se käsittää ... * jatkuvan, vähintään 10 nukleotidin sekvenssin American Type Culture Collectionriin (ATCC) * · ::: 25 viitenumerolla 40394 talletetun lambda-gtl 1 cDNA-kiijastossa koodatun « · nukleotidisekvenssin jommastakummasta juosteesta, jolloin mainittu polynukleotidi pystyy - _ . selektiivisesti hybridisoitumaan hepatiitti-C-viruksen (HCV) genomiin tai sen • · komplementtiin. - · · » ··· ·;;; 30
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1 -5 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että mainittu • · • · *: * jatkuva sekvenssi koostuu vähintään 15 nukleotidistä.
··· • · • · ··· • · ♦ · · *. *.* 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että mainittu jatkuva sekvenssi koostuu vähintään 20 nukleotidistä. 148 107620
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se on DNA-polynukleotidi.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se on RNA-polynukleotidi.
10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se on sidottuna kiinteään faasiin. 10
11. Koetin, tunnettu siitä että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1,5,8 tai 9 mukaisen polynukleotidin ja havaittavissa olevan merkkiosan.
12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä että se lisäksi käsittää is havaittavissa olevan merkkiosan.
13. Määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1-9 tai 10 mukaista polynukleotidia sopivassa astiassa. 20
14. Määritysmenetelmän välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen ··** 11 mukaistakoetinta sopivassa astiassa. • · · • · M · * · · « · ’ *.
15. Polymeraasiketjureaktion (PCR) välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää primer- • · ... . parin j oka pystyy käynnistämään cDNA-synteesin PCR-reaktiossa, jolioin kukin mainituista • · • · 25 primer'eista on jonkin patenttivaatimuksista 1-5, 8 tai 9 mukainen polynukleotidi. • · • # · „i>;
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen PCR-välinepakkaus, tunnettu siitä, että se lisäksi • · . · · ·. käsittää jonkin patenttivaatimuksista 1 -9 tai 11 mukaista polynukleotidikoetinta, joka • · · •, selektiivisesti pystyy hybridisoitumaan HCV-genomin alueeseen joka sijaitsee niiden HCV- • •e 'II! 30 sekvenssien välissä mistä primer’it on johdettu eikä sisällä näitä sekvenssejä.
• · • · • · · • · · • · ‘ · · · * 17. Polymeraasiketjureaktion (PCR) välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää primer- • · · parin joka pystyy käynnistämään cDNA-synteesin PCR-reaktiossa, jolloin kukin mainituista primer’eista on patenttivaatimuksen 6 mukainen polynukleotidi. 149 107620
18. Polymeraasiketjureaktion (PCR) välinepakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää piimer-parin joka pystyy käynnistämään cDNA-synteesin PCR-reaktiossa, jolloin kukin mainituista primer'eistä on patenttivaatimuksen 7 mukainen polynukleotidi. 5
19. Patenttivaatimuksen 11 mukaisen koettimen käyttö HCV-polynukleotidien läsnäolon tai puuttumisen toteamiseksi in vitro.
20. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5,8 tai 9 mukainen polynukleotidi käytettäväksi ίο polymeraasiketjureaktiossa (PCR), jolloin mainittu polynukleotidi kykenee panemaan alulle HCV:n cDNA-synteesin PCR-reaktiossa.
21. Patenttivaatimuksen 11 mukainen koetin käytettäväksi polymeraasiketjureaktiossa (PCR), tunnettu siitä että mainittu PCR-reaktio käsittää primer-parin joka kykenee panemaan alulle is HCV:n cDNA-synteesin PCR-reaktiossa, jolloin mainittu koetin selektiivisesti pystyy hybridisoitumaan HCV-genomin alueeseen joka sijaitsee niiden HCV-sekvenssien välissä mistä primer’it on johdettu eikä sisällä näitä sekvenssejä.
22. Patenttivaatimuksen 11 mukainen koetin käytettäväksi in v/tro-menetelmässä HCV-20 polynukleotidien läsnäolon tai puuttumisen toteamiseksi näytteestä, tunnettu siitä että a) näyte ja koetin saatetaan yhteen oloissa jotka mahdollistavat koettimen selektiivisen • · · hybridisoitumisen näytteessä olevaan HCV-polynukleotidiin tai sen komplementtiin; ja • * * * *. (b) todetaan, muodostuuko mainittua koetinta sisältäviä polynukleotididuplekseja. • « * * ® • · • ·
23. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polynukleotidi käytettäväksi polymeraasiketjureaktiossa • · (PCR), jolloin mainittu polynukleotidi kykenee panemaan alulle HCV:n cDNA-synteesin PCR-reaktiossa. • · • Il
· • · · •, 24. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen primer-parin käyttö primer’einä • · · 30 polymeraasiketjureaktiossa (PCR).
• « • · • · · • · · • · * · * · * 25. Patenttivaatimuksen 7 mukainen polynukleotidi käytettäväksi polymeraasiketjureaktiossa • · · ' · * · (PCR), j olioin mainittu polynukleotidi kykenee panemaan alulle HCV:n cDNA-synteesin PCR-reaktiossa. 150 107620
FI20001390A 1987-11-18 2000-06-12 Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö FI107620B (fi)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12271487A 1987-11-18 1987-11-18
US12271487 1987-11-18
US13988687A 1987-12-30 1987-12-30
US13988687 1987-12-30
US16107288A 1988-02-26 1988-02-26
US16107288 1988-02-26
US19126388A 1988-05-06 1988-05-06
US19126388 1988-05-06
US26358488A 1988-10-26 1988-10-26
US26358488 1988-10-26
US27145088A 1988-11-14 1988-11-14
US27145088 1988-11-14
PCT/US1988/004125 WO1989004669A1 (en) 1987-11-18 1988-11-18 Nanbv diagnostics and vaccines
US8804125 1988-11-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20001390A FI20001390A (fi) 2000-06-12
FI107620B true FI107620B (fi) 2001-09-14

Family

ID=27557988

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI893447A FI105652B (fi) 1987-11-18 1989-07-17 NANBV-polypeptidejä, immunologisia määritysmenetelmiä ja välineitä
FI981380A FI106564B (fi) 1987-11-18 1998-06-15 Menetelmä HCV-polypeptidien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä rekombinanttivektoreita
FI20001390A FI107620B (fi) 1987-11-18 2000-06-12 Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI893447A FI105652B (fi) 1987-11-18 1989-07-17 NANBV-polypeptidejä, immunologisia määritysmenetelmiä ja välineitä
FI981380A FI106564B (fi) 1987-11-18 1998-06-15 Menetelmä HCV-polypeptidien valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä rekombinanttivektoreita

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0318216B2 (fi)
JP (16) JPH02500880A (fi)
KR (2) KR0138776B1 (fi)
CN (5) CN1074422C (fi)
BR (1) BR8807310A (fi)
CA (1) CA1341629C (fi)
DE (2) DE318216T1 (fi)
ES (1) ES2012739T5 (fi)
FI (3) FI105652B (fi)
GR (1) GR900300069T1 (fi)
HK (3) HK38293A (fi)
HU (3) HU220204B (fi)
IE (1) IE62868B1 (fi)
LV (1) LV10726B (fi)
NO (1) NO304990B1 (fi)
NZ (1) NZ227011A (fi)
UA (1) UA42668C2 (fi)
WO (1) WO1989004669A1 (fi)

Families Citing this family (257)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US5714596A (en) * 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
US5712088A (en) * 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
CN1074422C (zh) * 1987-11-18 2001-11-07 希龙股份有限公司 制备含有hcv表位的分离多肽的方法
US5683864A (en) * 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US6861212B1 (en) 1987-11-18 2005-03-01 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
AU650038B2 (en) * 1988-03-11 1994-06-09 Abbott Laboratories CKS method of protein synthesis
US5191064A (en) * 1988-09-30 1993-03-02 The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide
JP2696116B2 (ja) * 1988-09-30 1998-01-14 財団法人阪大微生物病研究会 非ａ非ｂ肝炎患者の血清と抗原抗体反応するペプチド、及び該ペプチドをコードするｄｎａ
JPH02167081A (ja) * 1988-12-21 1990-06-27 Tetsuo Nakamura 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびウイルス抗原蛋白質
HU225068B1 (en) * 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
MC2188A1 (fr) * 1989-05-18 1992-09-16 Chiron Corp Diagnostic du nanbv:polynucleotides permettant de depister le virus de l'hepatite c
JPH0330676A (ja) * 1989-06-28 1991-02-08 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd 非ａ非ｂ型肝炎ウイルスのｄｎａ、そのクローン及びこれらの調製法
EP0416725A3 (en) * 1989-07-14 1991-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blood-borne non-a, non-b hepatitis specific protein, dna encoding it, and process for its production
ES2110411T3 (es) * 1989-08-25 1998-02-16 Chiron Corp Metodos para cultivar el virus de la hepatitis c (hcv) en lineas celulares de linfocitos b o t.
CA2065287C (en) * 1989-09-15 1999-12-21 Tatsuo Miyamura New hcv isolates
US5372928A (en) * 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
FR2654113A1 (fr) * 1989-11-09 1991-05-10 Pasteur Institut Procede de diagnostic de virus appartenant a la famille des flaviviridae.
ES2029171A6 (es) * 1989-12-18 1992-07-16 Wellcome Found Un procedimiento para preparar un polipeptido virico de hepatitis no a y no b post-transfusional (pt-nanbh)
US7166287B1 (en) 1989-12-18 2007-01-23 Glaxo Wellcome Inc. Viral agent
AU638304B2 (en) * 1989-12-22 1993-06-24 Abbott Laboratories Hepatitis c assay
US5308750A (en) * 1989-12-22 1994-05-03 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to putative HCV E2/NS1 proteins and methods for using same
EP0435229A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-03 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. DNA of non-A, non-B hepatitis virus gene, its clone and use thereof
CA2036022A1 (en) * 1990-02-09 1991-08-10 Tetsuo Nakamura Non-a, non-b hepatitis related nucleic acids, antigens, antibodies and their detection reagents
US5747239A (en) * 1990-02-16 1998-05-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and preventions thereof as vaccines
US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
US5582968A (en) * 1990-02-16 1996-12-10 United Biomedical, Inc. Branched hybrid and cluster peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
US5639594A (en) * 1990-02-16 1997-06-17 United Biomedical, Inc. Linear and branched peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
EP0445801A3 (en) * 1990-03-08 1992-07-01 Kuraray Co., Ltd. Peptide and its use
EP0447984A1 (en) * 1990-03-20 1991-09-25 Abbott Laboratories Hyperimmune globulin against hepatitis C virus and method for making same
WO1991014779A1 (en) * 1990-03-28 1991-10-03 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Diagnostic for hepatitis virus
JPH0436185A (ja) * 1990-03-28 1992-02-06 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 融合抗原ポリペプチド
US5371017A (en) * 1990-04-04 1994-12-06 Chiron Corporation Hepatitis C virus protease
US5712087A (en) * 1990-04-04 1998-01-27 Chiron Corporation Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens
PL172133B1 (pl) * 1990-04-04 1997-08-29 Chiron Corp Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV) PL PL PL PL PL PL
US6194140B1 (en) 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
EP1018558A3 (en) * 1990-04-06 2002-06-05 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis C Virus Epitopes
EP0461863A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-18 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-A, non-B hepatitis virus
JP3050395B2 (ja) * 1990-06-12 2000-06-12 国立感染症研究所長 Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法
US5747339A (en) * 1990-06-25 1998-05-05 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide
EP0464287A1 (en) * 1990-06-25 1992-01-08 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University Non-A, non-B hepatitis virus genomic cDNA and antigen polypeptide
FI913068A (fi) * 1990-06-25 1991-12-26 Univ Osaka Res Found Non-a-, non-b-hepatitisviruspartiklar.
JPH05508318A (ja) * 1990-06-30 1993-11-25 アクゾ・エヌ・ヴエー 非―ａ非―ｂ配列
KR0181517B1 (ko) * 1990-07-09 1999-04-01 나까하라 노부유끼 비-에이 비-비형 간염-특이 항원 및 간염 진단에서 그의 용도
ATE150086T1 (de) * 1990-07-11 1997-03-15 Shionogi & Co Cdns-sequenz und detektion des hepatitis c-virus
WO1992001714A1 (en) * 1990-07-24 1992-02-06 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Non-a non-b hepatitis virus antigen
CA2047792C (en) * 1990-07-26 2002-07-02 Chang Y. Wang Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines
US6172189B1 (en) * 1990-08-24 2001-01-09 Abbott Laboratories Hepatitis C assay utilizing recombinant antigens
CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
US7863008B2 (en) 1990-08-25 2011-01-04 Bioprocess Pty Ltd. Method for detecting NANBV associated seroconversion
WO1992003458A1 (en) * 1990-08-25 1992-03-05 New York Blood Center Non-a, non-b hepatitis virus antigen, diagnostic methods and vaccines
JPH06502075A (ja) * 1990-10-12 1994-03-10 アボット・ラボラトリーズ Ｃ型肝炎ウイルス抗体
JP3549201B2 (ja) * 1990-10-24 2004-08-04 中外製薬株式会社 非ａ非ｂ型肝炎特異的遺伝子の検出方法及び検出用試薬組成物
DE4120281C2 (de) * 1991-06-19 1999-11-25 Dade Behring Marburg Gmbh Immunchemisches Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von mehreren verschiedenen Antikörperspezifitäten, Peptidmischungen und Test dazu
DE4121431A1 (de) * 1991-06-28 1993-01-07 Behringwerke Ag Synthetische core-peptide zur bestimmung von hcv-antikoerpern und hcv-antigenen, mittel dazu und ihre verwendung in diesen nachweis-verfahren
DE59109221D1 (de) * 1990-11-03 2001-11-15 Dade Behring Marburg Gmbh HCV-spezifische Peptide, Mittel dazu und ihre Verwendung
DE4112743C2 (de) * 1991-04-19 2000-01-13 Dade Behring Marburg Gmbh Synthetische Core-Peptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren
DE4034982C2 (de) * 1990-11-03 1999-12-23 Dade Behring Marburg Gmbh Synthetische Polypeptide zur Bestimmung von HCV-Antikörpern und HCV-Antigenen, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesen Nachweis-Verfahren
DE69131046T2 (de) * 1990-11-07 1999-10-21 Abbott Lab Monoklonale antikörper gegen den hepatitis c-virus und verfahren diese zu benutzen
US5753430A (en) * 1990-11-07 1998-05-19 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies to hepatitis C virus and method for using same
US6274148B1 (en) 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
CA2055149A1 (en) * 1990-11-08 1992-05-09 Hiroaki Okamoto Non-a, non-b hepatitis virus related antigen, antibody, detection systems, polynucleotides and polypeptides
SK286106B6 (sk) * 1990-11-08 2008-03-05 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C
WO1992009634A1 (en) * 1990-11-29 1992-06-11 Toray Industries, Incorporated Non-a non-b hepatitis virus antigen protein
DE69131316T2 (de) * 1990-11-30 1999-11-11 Japan Immuno Inc Non-A, non-B hepatitisverwandte Nukleinsäuren, Antigene und Antikörper und ihre Feststellungsreagenzien
US6007982A (en) * 1990-12-14 1999-12-28 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
US5910404A (en) 1990-12-14 1999-06-08 Innogenetics N.V. Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus
DE69029092T2 (de) * 1990-12-14 1997-04-17 Innogenetics Nv Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus
KR930703613A (ko) * 1991-01-25 1993-11-30 챨스 엠. 브록 시료 희석물중 과산화물 디스뮤타제의 용도
DE69225960T2 (de) * 1991-01-31 1999-01-21 Abbott Lab Monoklonale antikörper gegen mögliche hcv-hüllregionen und methoden diese zu benutzen
DE69216333T2 (de) * 1991-03-26 1997-07-10 Dade Int Inc Nicht-a, nicht-b hepatitis test
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
EP0516270A3 (en) * 1991-04-10 1993-06-23 Immuno Japan Inc. Non-a, non-b hepatitis virus related antigen, antibody, detection systems, polynucleotides and polypeptides
WO1992018532A1 (en) * 1991-04-17 1992-10-29 Eisai Co., Ltd. Rna, dna and virus antigen protein of non-a non-b hepatitis virus
EP0510952A1 (en) * 1991-04-26 1992-10-28 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus
ES2207633T3 (es) * 1991-05-08 2004-06-01 Chiron Corporation Secuencias genomicas del vhc para diagnostico y tratamiento.
ES2040615B1 (es) * 1991-05-27 1994-05-16 Nebrda Fernando Javi Bartolome Procedimiento para el aislamiento y clonaje de cdnas derivados del virus c de la hepatitis.
FR2677372B1 (fr) * 1991-06-06 1994-11-10 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques.
TW360711B (en) * 1991-06-10 1999-06-11 Lucky Ltd CDNAs of Korean hepatitis C virus and polypeptides encoded thereby
CA2070952A1 (en) * 1991-06-11 1992-12-12 Makoto Seki Gene of hepatitis c virus or fragment thereof, polypeptide encoded by the same
JP3516681B2 (ja) * 1991-06-24 2004-04-05 カイロン コーポレイション Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド
DE4209215A1 (de) 1991-07-04 1993-01-07 Boehringer Mannheim Gmbh Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv
AU2492792A (en) * 1991-08-21 1993-03-16 Abbott Laboratories Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens from ns5 region
AU2513592A (en) * 1991-08-21 1993-03-16 Abbott Laboratories Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens to ns1
DE69227776T2 (de) * 1991-08-21 1999-07-01 Abbott Lab Monoklonale antikörper gegen mutmassliche hepatitis c-virus ns5-proteine und ihre anwendungsmethoden
ES2198514T3 (es) * 1991-08-27 2004-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c.
JPH06511149A (ja) * 1991-09-13 1994-12-15 カイロン　コーポレイション 免疫反応性ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド組成物
ZA927837B (en) * 1991-10-15 1994-03-11 Akzo Nv Monoclonal antibodiesto hepatitis C virus
CA2099883A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-08 John A. Kink Epitope mapping of the c33c region of hcv
JPH05130874A (ja) * 1991-11-07 1993-05-28 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ヒトＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ、そのクローン及びこれらの利用法
JP3688290B2 (ja) * 1991-11-21 2005-08-24 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス検査
DE69333269T2 (de) * 1992-01-31 2004-07-29 Abbott Laboratories, Abbott Park Expressionssystem in säugetieren für hcv-proteine
US6709828B1 (en) 1992-03-06 2004-03-23 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them
US6667387B1 (en) 1996-09-30 2003-12-23 N.V. Innogenetics S.A. HCV core peptides
US6620414B2 (en) 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
MA22842A1 (fr) * 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
US5866139A (en) * 1992-06-04 1999-02-02 Institut Pasteur Nucleotide and peptide sequences of a hepatitis C virus isolate, diagnostic and therapeutic applications
US5980899A (en) * 1992-06-10 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of peptides that stimulate hepatitis C virus specific cytotoxic T cells
UA39944C2 (uk) 1992-07-07 2001-07-16 Чірон Корпорейшн Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі
US5859230A (en) * 1992-07-30 1999-01-12 Genelabs Technologies, Inc. Non-A/non-B/non-C/non-D/non-E hepatitis agents and molecular cloning thereof
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
DE69330372T2 (de) 1992-09-10 2002-03-14 Isis Pharmaceuticals Inc ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN FüR DIE BEHANDLUNG VON MIT HEPATITIS C VIREN ASSOZIIERTEN KRANKHEITEN
US6391542B1 (en) 1992-09-10 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
US6174868B1 (en) 1992-09-10 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases
US6995146B2 (en) 1992-09-10 2006-02-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases
US6433159B1 (en) 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
US5922857A (en) * 1992-09-28 1999-07-13 Chiron Corporation Methods and compositions for controlling translation of HCV proteins
CN1059928C (zh) * 1992-09-29 2000-12-27 天津普生生物科技有限公司 利用大肠杆菌制备可用来检验c型肝炎之抗原蛋白的方法
EP0593291A3 (en) * 1992-10-16 1995-03-15 Evernew Biotech Inc Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit.
US6153378A (en) * 1992-10-16 2000-11-28 Bionova Corporation Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
JP2778886B2 (ja) * 1992-10-16 1998-07-23 エバーニュー バイオテック インコーポレイティド Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
JPH06153959A (ja) * 1992-10-16 1994-06-03 Evernew Biotec Inc Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット
WO1994013700A1 (en) * 1992-12-07 1994-06-23 Akzo Nobel N.V. Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv
CA2151128A1 (en) * 1992-12-07 1994-06-23 Winand Johannes Antonius Habets Hepatitis c virus (hcv) non-structural-3 peptides, antibodies thereto and methods for the detection of hcv
WO1994024565A1 (en) * 1993-04-22 1994-10-27 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis c virus immunodiagnostic antigens and antibodies
US6762024B2 (en) * 1993-04-27 2004-07-13 Innogenetics, S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
JP3751315B2 (ja) 1993-05-05 2006-03-01 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型
ES2232815T5 (es) 1993-05-10 2009-06-15 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Metodos de tipado del virus de la hepatitis c y reactivos para usar en los mismos.
EP0697888B1 (en) 1993-05-12 2003-09-17 Chiron Corporation Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region
US5885771A (en) * 1993-10-29 1999-03-23 Srl, Inc. Antigenic peptide compound and immunoassay
US5610009A (en) * 1994-01-28 1997-03-11 Abbott Laboratories Mammalian expression systems for hepatitis C virus envelope genes
US6051374A (en) * 1994-02-14 2000-04-18 Abbott Laboratories Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
US5843450A (en) * 1994-02-14 1998-12-01 Abbott Laboratories Hepatitis GB Virus synthetic peptides and uses thereof
US6720166B2 (en) 1994-02-14 2004-04-13 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
US6156495A (en) * 1994-02-14 2000-12-05 Abbott Laboratories Hepatitis GB virus recombinant proteins and uses thereof
US5981172A (en) * 1994-02-14 1999-11-09 Abbott Laboratories Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E Hepatitis reagents and methods for their use
US6558898B1 (en) 1994-02-14 2003-05-06 Abbott Laboratories Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
US6451578B1 (en) 1994-02-14 2002-09-17 Abbott Laboratories Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
US5874563A (en) * 1994-05-20 1999-02-23 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus and molecular cloning thereof
US5824507A (en) * 1994-05-20 1998-10-20 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus and molecular cloning thereof
JP3217600B2 (ja) 1994-07-12 2001-10-09 株式会社先端生命科学研究所 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ
WO1996004301A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Chiron Corporation Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same
CA2195312A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Mark Selby Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
US5955318A (en) * 1995-08-14 1999-09-21 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for controlling the translation of hepatitis GBV proteins
US5807670A (en) * 1995-08-14 1998-09-15 Abbott Laboratories Detection of hepatitis GB virus genotypes
US5709997A (en) * 1995-08-14 1998-01-20 Abbott Laboratories Nucleic acid detection of hepatitis GB virus
US6127116A (en) * 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
GB9517926D0 (en) 1995-09-01 1995-11-01 Biocine Spa Binding protein
US5851758A (en) * 1995-10-25 1998-12-22 Childrens Research Institute Cytopathic replication of hepatitis C virus in a new cell line
US5837442A (en) 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
US5851759A (en) * 1996-04-19 1998-12-22 Chiron Corporation Heteroduplex tracking assay (HTA) for genotyping HCV
JP3715027B2 (ja) 1996-05-07 2005-11-09 シスメックス株式会社 Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬
CU22642A1 (es) * 1996-12-12 2000-12-22 Ct Ingenieria Genetica Biotech Secuencia de adnc derivadas del genoma del virus de la hepatitis c y su uso
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
EP0980434B1 (en) 1997-05-06 2009-07-29 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Intracellular production of hepatitis c e2 truncated polypeptid
US6010848A (en) * 1997-07-02 2000-01-04 Smithkline Beecham Corporation Screening methods using an atpase protein from hepatitis C virus
US6153392A (en) * 1997-07-30 2000-11-28 Bionova Corporation Devices and methods comprising an HBcAg from hepatitis B virus
ATE449847T1 (de) 1997-10-06 2009-12-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Hepatitis c rezeptorprotein cd81
BR9813930A (pt) 1997-11-06 2006-12-19 Chiron Spa antìgeno neisserial
DE69838513T2 (de) 1997-12-11 2008-07-03 Smithkline Beecham Corp. Verkürztes hepatitis-c-virus protein nsb5 und methoden, um antivirale substanzen zu identifizieren
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
EP2261347A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
CA2689696C (en) 1999-02-26 2013-08-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
JP2002537355A (ja) 1999-02-26 2002-11-05 カイロン コーポレイション 抗原の粘膜送達のための生体接着剤およびアジュバントの使用
CN100392082C (zh) 1999-04-30 2008-06-04 启龙股份公司 保守的奈瑟球菌抗原
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
AU6226100A (en) * 1999-07-19 2001-04-24 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis c virus using peptide and nucleic acid compositions
ES2541830T3 (es) 1999-10-29 2015-07-27 Novartis Vaccines And Diagnositics S.R.L. Péptidos antigénicos de Neisseria
US7196066B1 (en) 1999-11-03 2007-03-27 Powderject Vaccines, Inc. DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens
ES2319727T3 (es) * 1999-12-01 2009-05-12 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Estimulacion de anticuerpos especificos de hcv.
PT1248647E (pt) 2000-01-17 2010-11-18 Novartis Vaccines & Diagnostics Srl Vacina de vesícula da membrana externa (omv) compreendendo proteínas de membrana externa de n. meningitidis do serogrupo b
ES2317900T3 (es) 2000-04-05 2009-05-01 Schering Corporation Inhibidores de serina proteasa ns3 macrociclicos del virus de la hepatitis c que comprenden fragmentos n-ciclicas p2.
NZ521456A (en) 2000-04-19 2004-07-30 Schering Corp Macrocyclic NS3-Serine protease inhibitors of hepatitis C virus comprising alkyl and aryl alanine P2 moieties
EP1829891B1 (en) * 2000-06-15 2012-12-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunoassays for Anti-HCV Antibodies
SI1354204T2 (sl) * 2000-06-15 2010-09-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Hcv antigen antitelo kombinacijska analiza
AR029851A1 (es) 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
US7012066B2 (en) 2000-07-21 2006-03-14 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
AU8063701A (en) 2000-07-21 2002-02-05 Schering Corp Novel peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
CA2419418A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
US6858590B2 (en) 2000-08-17 2005-02-22 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
EP2277895B1 (en) 2000-10-27 2013-08-14 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
HUP0303436A2 (hu) 2000-12-12 2004-01-28 Schering Corp. Diaril-peptidek mint a hepatitis C vírus NS3-szerin proteáz inhibitorai, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
CA2448066A1 (en) 2001-05-31 2002-12-12 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
US7196183B2 (en) 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
US20050106162A1 (en) 2001-12-12 2005-05-19 Guido Grandi Immunisation against chlamydia trachomatis
WO2003062228A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Schering Corporation Proline compounds as ns3-serine protease inhibitors for use in treatment of hepatites c virus infection
CA2476626A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
PT2014671E (pt) 2002-03-11 2010-06-16 Lab 21 Ltd Métodos e composições para identificar e caracterizar a hepatite c
US7598421B2 (en) 2002-05-08 2009-10-06 Ucl Biomedica Plc Materials for the delivery of biologically-active material to cells
CA2485829A1 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Peng Luan Methods and constructs for high yield expression of clostripain
EP1546414B1 (en) 2002-09-09 2008-10-08 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Hcv assay
US7115374B2 (en) 2002-10-16 2006-10-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting West Nile virus
US7927840B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Gen Probe Incorporated Method for detecting West Nile Virus nucleic acids in the 3′ non-coding region
WO2004060396A2 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
WO2004084936A2 (en) 2003-02-06 2004-10-07 Cerus Corporation Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
US7695725B2 (en) 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
ES2382332T3 (es) 2003-02-06 2012-06-07 Aduro Biotech Listeria atenuada para entrar en células no fagocíticas, vacunas que comprenden esta listeria y métodos de uso de las mismas
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US7449447B2 (en) 2003-08-26 2008-11-11 Schering Corporation Peptidomimetic NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
US8124747B2 (en) 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
CN102659922B (zh) 2003-09-22 2013-11-06 株式会社绿多肽 来源于c型肝炎病毒的肽
BRPI0414814A (pt) 2003-09-26 2006-11-14 Schering Corp inibidores macrocìclicos de protease de serina ns3 de vìrus de hepatite c
JP4584260B2 (ja) * 2003-10-14 2010-11-17 インターミューン・インコーポレーテッド Ｈｃｖ複製阻害剤としての大環状カルボン酸およびアシルスルホンアミド
US7253160B2 (en) 2003-11-20 2007-08-07 Schering Corporation Depeptidized inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
US7842289B2 (en) 2003-12-24 2010-11-30 Aduro Biotech Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof
ATE438622T1 (de) 2004-02-27 2009-08-15 Schering Corp 3,4-(cyclopentyl)kondensierte prolinverbindungen als inhibitoren der ns3-serinprotease des hepatitis-c-virus
EP1939213B1 (en) 2004-02-27 2010-08-25 Schering Corporation Novel compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
TW200602037A (en) 2004-02-27 2006-01-16 Schering Corp Novel compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
KR20060124725A (ko) 2004-02-27 2006-12-05 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스 ｎｓ3 프로테아제의 억제제
EP1773868B1 (en) 2004-05-20 2009-07-15 Schering Corporation Substituted prolines as inhibitors of hepatitis c virus ns3 serine protease
EP1784211A4 (en) 2004-07-29 2010-06-30 Novartis Vaccines & Diagnostic IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR GRAMPOSITIVE BACTERIA SUCH AS STREPTOCOCCUS AGALACTIAE
ES2377978T3 (es) 2004-08-27 2012-04-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mutantes de proteínas no estructurales de VHC y usos de los mismos
ATE513844T1 (de) 2004-08-27 2011-07-15 Schering Corp Acylsulfonamidverbindungen als inhibitoren der ns3-serinprotease des hepatitis-c-virus
DK2399893T3 (en) 2004-12-22 2018-10-08 Ambrx Inc COMPOSITIONS CONTAINING, INVOLVING PROCEDURES, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES
CA2605749C (en) 2005-04-26 2015-06-30 Eisai Co., Ltd. Compositions and methods for cancer immunotherapy
WO2007031867A2 (en) 2005-05-25 2007-03-22 Tripep Ab A hepatitis c virus non-stru tural ns3/4a fusion gene
PL1891089T3 (pl) 2005-06-02 2015-05-29 Merck Sharp & Dohme Inhibitory proteazy HCV w połączeniu z pokarmem
KR20080021634A (ko) 2005-06-02 2008-03-07 쉐링 코포레이션 약제학적 조성물 및 이를 사용한 치료 방법
WO2007053245A2 (en) 2005-09-20 2007-05-10 Immunivest Corporation Methods and composition to generate unique sequence dna probes, iabeling of dna probes and the use of these probes
WO2007135707A1 (ja) 2006-05-18 2007-11-29 Nichia Corporation 樹脂成形体及び表面実装型発光装置並びにそれらの製造方法
DK2054431T3 (da) 2006-06-09 2012-01-02 Novartis Ag Konformere af bakterielle adhæsiner
US8071561B2 (en) 2007-08-16 2011-12-06 Chrontech Pharma Ab Immunogen platform
SG10201605208QA (en) 2007-11-07 2016-08-30 Celldex Therapeutics Inc Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)
WO2009076158A1 (en) 2007-12-07 2009-06-18 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
NZ620606A (en) 2008-02-08 2015-08-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
WO2009130588A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
CN102076843A (zh) 2008-05-19 2011-05-25 艾杜罗生物科技公司 包含prfa*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法
KR101647164B1 (ko) 2008-09-26 2016-08-09 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도
TW201032801A (en) 2008-12-12 2010-09-16 Schering Corp Deuterated compounds as hepatitis C virus (HCV) inhibitors
WO2010103017A2 (en) 2009-03-09 2010-09-16 William Henry Hapten-carrier conjugates with bacterial toxins having a signal peptide as carrier and their use in immunogenic compositions
EP2435424B1 (en) 2009-05-29 2015-01-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Antiviral compounds composed of three linked aryl moieties to treat diseases such as hepatitis c
EP2451475A2 (en) 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
AU2010324871A1 (en) 2009-11-25 2012-06-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic compounds and derivatives thereof useful for the treatment of viral diseases
EP2333074A1 (en) 2009-12-14 2011-06-15 Robert Steinfeld Substances and methods for the treatment of lysosmal storage diseases
JP2013515068A (ja) 2009-12-22 2013-05-02 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション ウイルス性疾患の治療のための縮合三環式化合物およびその使用方法
PL2528922T3 (pl) 2010-01-27 2018-01-31 Ab Pharma Ltd Związki poliheterocykliczne jako inhibitory hcv
KR20130008040A (ko) 2010-03-09 2013-01-21 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 융합된 트리시클릭 실릴 화합물 및 바이러스성 질환의 치료를 위한 그의 사용 방법
JP6002659B2 (ja) 2010-04-13 2016-10-05 セルデックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド ヒトｃｄ２７に結合する抗体およびその使用
MX343410B (es) 2010-07-06 2016-11-04 Novartis Ag * Emulsiones cationicas de agua en aceite.
EP2598149A4 (en) 2010-07-26 2014-09-10 Merck Sharp & Dohme SUBSTITUTED BIPHENYLENE COMPOUNDS AND METHOD FOR USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF VIRUS DISEASES
EP2621279B1 (en) 2010-09-29 2018-04-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tetracycle derivatives and methods of use thereof for the treatment of viral diseases
BR112013026345A2 (pt) 2011-04-13 2019-04-24 Merck Sharp & Dohe Corp. composto, composição farmacêutica, uso de um composto, e, método para tratar um paciente infectado com hcv
US9156872B2 (en) 2011-04-13 2015-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. 2′-azido substituted nucleoside derivatives and methods of use thereof for the treatment of viral diseases
WO2012171332A1 (zh) 2011-06-16 2012-12-20 爱博新药研发(上海)有限公司 抑制丙型肝炎病毒的大环状杂环化合物及其制备和应用
JP6120839B2 (ja) 2011-07-06 2017-04-26 ノバルティス アーゲー カチオン性水中油型エマルジョン
EP3424495A1 (en) 2011-07-06 2019-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
EP2755981A4 (en) 2011-09-14 2015-03-25 Merck Sharp & Dohme HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING SILYL AND METHODS OF USING THE SAME FOR TREATING VIRAL DISEASES
BR112014008694A2 (pt) 2011-10-11 2017-06-20 Novartis Ag moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
DK3274478T3 (da) 2015-03-27 2020-11-23 Ortho Clinical Diagnostics K K Hcv-ns4a/modificerede ns3-polypeptider og anvendelser deraf
US10550379B2 (en) 2015-06-29 2020-02-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Degron fusion constructs and methods for controlling protein production
EA201892362A1 (ru) 2016-04-18 2019-04-30 Селлдекс Терапьютикс, Инк. Агонистические антитела, которые связываются с cd40 человека, и варианты их применения

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4464474A (en) * 1980-07-09 1984-08-07 Connaught Laboratories Limited Non-A, non-B hepatitis assay and vaccine
EP0071640B1 (en) * 1981-02-11 1986-06-04 Connaught Laboratories Incorporated Non-a, non-b hepatitis virus
US4702909A (en) * 1982-05-05 1987-10-27 Louisiana State University A & M Non-A, non-B hepatitis antigen, antigen compositions, vaccine and diagnostic reagent
US4673634A (en) * 1985-03-08 1987-06-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Purified antigen from non-A, non-B hepatitis causing factor
WO1987005930A1 (en) * 1986-04-01 1987-10-08 Genelabs Incorporated Immortalized virus-specific tissue cells
JPS6391328A (ja) * 1986-10-07 1988-04-22 Mitsubishi Kasei Corp 非ａ非ｂ型肝炎抗原
NZ222465A (en) * 1986-11-07 1992-11-25 Pasteur Institut Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen
DE3744242A1 (de) * 1987-02-20 1989-07-06 Seelig Renate Virusantigen, verfahren zu seiner gewinnung und anwendung in diagnose und therapie (impfstoff)
CN1074422C (zh) * 1987-11-18 2001-11-07 希龙股份有限公司 制备含有hcv表位的分离多肽的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO1989004669A1 (en) 1989-06-01
CN1129796C (zh) 2003-12-03
JPH02500880A (ja) 1990-03-29
KR0138776B1 (ko) 1998-05-15
CA1341629C (en) 2012-05-08
JP2006117681A (ja) 2006-05-11
JP2662358B2 (ja) 1997-10-08
JPH06128291A (ja) 1994-05-10
CN1035679A (zh) 1989-09-20
JPH06128290A (ja) 1994-05-10
HK38293A (en) 1993-04-30
KR890701126A (ko) 1989-12-19
CN1159584C (zh) 2004-07-28
HU220204B (hu) 2001-11-28
JPH10108674A (ja) 1998-04-28
BR8807310A (pt) 1990-03-13
LV10726B (en) 1995-12-20
HK1026023A1 (en) 2000-12-01
FI105652B (fi) 2000-09-29
JP2008007508A (ja) 2008-01-17
FI20001390A (fi) 2000-06-12
HUT53148A (en) 1990-09-28
CN1299973A (zh) 2001-06-20
JPH06128292A (ja) 1994-05-10
CN1285514A (zh) 2001-02-28
CN1049686C (zh) 2000-02-23
NZ227011A (en) 1992-03-26
JP2007197456A (ja) 2007-08-09
JPH06128293A (ja) 1994-05-10
JPH09173079A (ja) 1997-07-08
NO892931L (no) 1989-09-13
JPH10290697A (ja) 1998-11-04
CN1074422C (zh) 2001-11-07
JP2810022B2 (ja) 1998-10-15
IE62868B1 (en) 1995-03-08
JPH09184844A (ja) 1997-07-15
FI981380A (fi) 1998-06-15
EP0318216B2 (en) 2001-08-29
AU2796789A (en) 1989-06-14
DE3886363T3 (de) 2004-09-09
HK1033773A1 (en) 2001-09-21
FI893447A (fi) 1989-07-17
ES2012739T5 (es) 2001-12-01
HU9502949D0 (en) 1995-12-28
JP3171793B2 (ja) 2001-06-04
EP0318216A1 (en) 1989-05-31
UA42668C2 (uk) 2001-11-15
FI893447A0 (fi) 1989-07-17
DE3886363D1 (de) 1994-01-27
ES2012739A4 (es) 1990-04-16
JP2006104207A (ja) 2006-04-20
CN100397082C (zh) 2008-06-25
NO892931D0 (no) 1989-07-17
JPH0581600B1 (fi) 1993-11-15
JP2810032B2 (ja) 1998-10-15
CN1249433A (zh) 2000-04-05
KR19980701583A (ko) 1998-05-15
LV10726A (lv) 1995-06-20
IE883472L (en) 1989-05-18
JPH10290696A (ja) 1998-11-04
KR100216013B1 (ko) 1999-08-16
DE3886363T2 (de) 1994-05-19
FI106564B (fi) 2001-02-28
DE318216T1 (de) 1990-06-13
JP2000023683A (ja) 2000-01-25
HU216017B (hu) 1999-04-28
HU211905A9 (en) 1996-01-29
JP2662350B2 (ja) 1997-10-08
CN1073719A (zh) 1993-06-30
EP0318216B1 (en) 1993-12-15
NO304990B1 (no) 1999-03-15
ES2012739T3 (es) 1994-12-01
JP2662351B2 (ja) 1997-10-08
FI981380A0 (fi) 1988-11-18
GR900300069T1 (en) 1991-07-31
JP2532805B2 (ja) 1996-09-11
JP2809956B2 (ja) 1998-10-15
JPH06225797A (ja) 1994-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107620B (fi) Hepatiitti-C-virukseen hybridisoituvia polynukleotideja, niitä sisältäviä välinepakkauksia ja niiden käyttö
US6346375B1 (en) NANBV diagnostics and vaccines
US5698390A (en) Hepatitis C immunoassays
GB2212511A (en) Hepatitis C virus
DK175975B1 (da) NANBV-diagnostika og -vacciner
DK176280B1 (da) NANBV-diagnostika og -vacciner
RU2162894C2 (ru) Полипептид, обладающий антигенными свойствами вируса гепатита с и его фрагмент (варианты), диагностический реагент (варианты), набор для обнаружения антител (варианты), способ обнаружения антител (варианты)
AU624105C (en) NANBV diagnostics and vaccines
HRP940493A2 (en) Nanbv diagnostics and vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC.

Free format text: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC.

MA Patent expired