AT405053B - Hepatitis-c-diagnosemittel und -impfstoffe - Google Patents

Description

AT 405 053 B

Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, abgeleitet von der cDNA einer neuen Type des Hepatitis C Virus (KHCV), sowie zugehörige Vektoren und Wirtszellen, Polypeptide, die darin codiert sind und Antikörper, die gegen die Polypeptide gerichtet sind; und weiters Diagnosemittel und Impfstoffe, bei denen diese Stoffe nämlich die Polynucleotide, Polypeptide und Antikörper als aktive Bestandteile ange-5 wendet werden.

Im allgemeinen ist bekannt, daß virusinduzierte Hepatitis durch verschiedene Hepatitisviren einschließlich dem Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus und Hepatitis Delta Virus sowie Hepatitis E Virus, Cytomegalo Virus und Epstein-Barr Virus verursacht werden kann. Die Genotypen der Viren werden seit 1980 entdeckt, wodurch die Entwicklung von Diagnosemitteln, Impfstoffen und therapeutischen Mitteln erleichtert wurde. io Weiters wurde entdeckt, daß ein neuer Hepatitistyp, allgemein gennant non-A, non-B oder C Hepatitis für 80 bis 90% der Hepatitis verantwortlich ist, die durch Bluttransfusion verursacht wird (Lancet, 2, 838-841 (1975)). Solche Hepatitis nach Tranfusionen führen häufig zu Zirrhose oder hepatozellulärem Carzinom bis zu etwa 50%.

Die Zahl an Hepatitis C Virus (HCV) im Blut des Patienten ist üblicherweise sehr klein und die Identität 15 oder Spezifizität des Antigen- und Antikörpersystems in Verbindung mit HCV wird noch nicht völlig verstanden. Aus diesem Grund gibt es viele Schwierigkeiten bei der Entwicklung therapeutischer oder diagnostischer Agenzien.

Demzufolge wurde dem Studium von HCV großes Augermerk zahlreicher Forscher zugewendet (siehe z.B. Alter, H. J. et al., Lancet, 459-463 (1978); Tabor, E. et al., Lancet, 463-466 (1978); Hollinger, F. B. et al., 20 Intervirology, 10 60-68 (1978); Wyke, R. J. et al., Lancet, 520-524 (1979); Bradley, D. W. et al., J. Med. Virol., 9, 253-269 (1979)).

Bradley et al, wie in Gastroenterology 88, 773-779 (1985) beschrieben, konnte die biochemischen und biophysikalischen Merkmale von HCV folgendermaßen bestimmen: Infektion eines Schimpansen mit dem Serum eines Hepatitis C Patienten; die Abnahme von bestimmten Mengen eines Serums daraus; Extraktion 25 von HCV aus dem Serum; und Analyse und Studium des HCV.

Danach wurden viele Studien mit den HCV Viren gemacht, die unter Anwendung der Bradley Methode isoliert worden waren, um Mittel für die Diagnose, zur Vorbeugung und zur Behandlung von Hepatitis C zu entwickeln.

Choo et al. klonte ein partielles cDNA Fragment von HCV, das aus dem Serum eines Schimpansen 30 extrahiert worden war, der mit dem Serum eines Hepatits C Patienten infiziert worden war. Er wies nach, daß das Protein, das durch Expression des cDNA Fragmentes in E. coli und Hefezellen hergestellt worden war, immunologisch reaktiv mit den Antikörpern war, die aus dem Serum des Hepatitis C Patienten gewonnen wurden (Science 244, 359-362 (1989)).

Kuo et al. offenbarte in Science 244, 362-364 (1989) daß C100-3 Protein, hergestellt durch Expression 35 eines partiellen HCV cDNA Fragmentes, welches von Chiron Co. in dem USA identifiziert worden war, und mit Superoxid Dismutase (SOD) Gen in Hefe fusionierte, mit dem Serum des Hepatitis C Patienten immunoreaktiv war und mit 70% des Serums von jenen Partienten, die eine Hepatitis im Gefolge einer Transfusion hatten.

Weiters beschrieb Houghton et al. die Nützlichkeit von HCV Antigenen, insbesondere C100-3, die in 40 HCV Genomsequenzen kodiert sind, die von einem Schimpansen isoliert worden waren, der mit Hepatitis C (im folgenden als "Amerikanische HCV" bezeichnet) infiziert worden war, für die Herstellung von Impfstoffen und diagnostischen Mitteln, die fähig sind, anti-HCV Antikörper zu entdecken (PCT WO 89/04669; WO 90/11089). Weiters wurde ein Diagnoseverfahren entwickelt, bei dem eine Enzym-Immunoreaktion met den genanntem Antigenen i. e. C100-3 angewendet wurde. 45 Auf Basis der oben genannten Erfindung entwickelte und vertrieb Ortho Diagnostic Systems Inc., USA, Diagnoseagenzien zum Aufspüren von Anti-HCV Antikörper im Jahre 1990. Allerdings reagiert dieses C100-3 Antigen als aktiver Bestandteil für die Diagnosemittel nur mit den Antikörpern von Patienten mit chronischer Hepatitis C, nicht aber mit jenen von Patienten mit akuter Hepatitis C, insbesondere während eines frühen Stadium der Krankheit. Weiters zeigte es oft falsche positive Resultate infolge Reaktion des so fusionierten Proteins SOD (Shimizu Y. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 6441 (1990)).

Andererseits wurden partielle HCV cDNA Klone hergestellt, in denen das gleiche Verfahren wie bei Houghton et al. angewendet wurde, wobei von HCV ausgegangen wurde, die von einem Serum herstammten, das von einem japanischen Hepatitis C Patienten gewonnen wurde, einschließlich 5’ - Terminalabschnitt und strukturelle Gene, die das Kernprotein und das Hüllprotein kodieren. Die Nucleotidsequenz der cDNA 55 Klone wurde bestimmt, wobei entdeckt wurde, daß die Sequenz um etwa 10 - 15% verschieden von jener der HCV der amerikanischen Type ist, wodurch die Existenz einer neuen Type HCV unter Beweis gestellt war, die als japanische Type bezeichnet wird (Kubo Y. et al., Nucl. Acid. Res., 17, 10367-10372 (1989); Kato, N. et al., Proc, Japan. Acad., 65, 219-223 (1990); Kaneko, S. et al., Lancet, 335 976 (1990); Takeuchi, 2

AT 405 053 B K. et al., Gene, 91, 287-291 (1990); Takamuzawa; A. et al„ J. Virol., 65, 1105-1113 (1991)). Die Spezifität des Antigens, welches von HCV der japanischen Type zur Herstellung von Impfstoffen und diagnostischen Mitteln abgeleitet war, gegenüber dem HCV der japanischen Type wurde von Okamoto, H. et al. in Japan. J. Exp. Med., 60, 167-177 (1990) beschrieben.

Harada et al. berichtete weiters in J. Virol. 65, 3015 (1991), daß dann, wenn das Kernprotein, das im 5'-terminalen Abschnitt des strukturellen Gens kodiert ist, als Antigen verwendet wurde, um anti-HCV Antikörper zu diagnostizieren, die in Proben enthalten sein können, die von mutmaßlichen Patienten stammten, konnten die Antikörper 6 bis 8 Wochen früher entdeckt werden, als im Falle der Verwendung von C100-3 Protein, bezogen auf die Infektionsziet.

Lesniewski et al. veröffentlichte ein verbessertes Diagnoseverfahren unter Verwendung multipler Antigene, wobei dieses Verfahren sensitiver und spezifischer war als das Verfahren mit der Verwendung von C100-3 Antigenen allein. Wang beschrieb in der EP-Nr. 442394 (1991) ein anderes Diagnoseverfahren, wobei Polypeptide, die aus 15-65 Aminosäuren mit Epitop(en) bestanden, die aus 10 verschiedenen HCV Epitopen ausgewählt waren, als Antigene zur Entdeckung der anti-HCV Antikörper angewendet worden wa

Die genannten Offenbarungen zeigen, daß die Diagnose von HCV verbessert werden kann, indem eine Mischung aus Polypeptiden mit verschiedenen Epitopen angewendet wird, anstatt der Verwendung nur einer Art von Antigen.

Weiters sind Hüllproteine, die an der Oberfläche von Viren in Form von Glycoproteinen Vorkommen, oberflächlich behandelt worden, um als mögliches Mittel für die Entwicklung von Impfstoffen wie auch als Diagnosemittel zu dienen. Im Fall des Flavivirus, der sehr ähnlich zu HCV ist, ist es bekannt geworden, daß Hüllproteine und nicht strukturelle Proteine 1 (NS 1) eine wichtige Rolle bei der Induktion einer Immunreaktion einer Wirtzelle und beim Anbinden an die Rezeptoren der Wirtzelle spielen (F. Preugschart, J. Virol., 65, 4749-4758 (1991)). Zusätzlich wurde berichtet, daß die Bildung von Antikörpern gegen Hüllproteine eng mit der Heilung von Hepatitis C verbunden ist (Lesniewski, R. et al., p59, Watanabe et al., p82, The 3rd International HCV Symposium, Strasbourg, France (1991)).

Weiters schlug Houghton et al. die Möglichkeit vor, daß das Hüllpro-tein 2 (E2) ein wichtiges Antigen für die Herstellung von Hepatitis C Impfstoffen deswegen sein könnte, weil beim genannten E2 Protein angenommen wird, daß es eine nahe Verwandtschaft mit Immunoreaktionsmechanisrnen haben könne, da die endständige Aminoregion des E2 Proteins eine auffallende Heterogenität in der Spezies ausübt (The 3rd International HCV Symposium, p20, Strasbourg, France, 1991). Ein Vergleich der Nucleotidsequenzen zwischen dem HCV Genom der japanischen Type und des HCV Genoms der amerikansichen Type hat ergeben, daß diese kodierenden Hüllproteine eine Homologie von etwa 74% aufweisen, wohingenen die Nucleotidsequenzen, die die Kernproteine kodieren, eine Homologie von etwa 91% aufweisen (Takeuchi, K. et al., J. Gen. Vir., 71,3027-3033 (1990)).

Wie oben gezeigt können HCVs, die in verschiedenen Ländern entdeckt wurden, Heterogenitäten in verschiedenen Bereichen ausüben. Und diese Heterogenität kann ein kritischer Faktor bei der Wirksamkeit von Impfstoffen und bei der Sensitivität und Genauigkeit von Diagnosemitteln

Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung und Charakterisierung einer neuen HCV Type, die von koreanischen Hepatitis C Patienten (KHCV) isoliert wurden und die verschieden von den bereits entdeckten HCVs sind enschließlich der amerikansichen und der japani

Spezieller werden demäß vorliegender Erfindung eine voll sequenzierte cDNA des KHCV und partiell sequenzierte cDNAs veschiedener HCV Varianten vorgesehen. Abschnitte der vom KHCV abgeleiteten cDNA Sequenzen sind als Sonden oder Primer nützlich, um die Gegenwart des Virus in verdächtigen Proben zu diagnostizieren. Diagnosekits und Verfahren unter Verwendung solcher Nucleotidsequenzen bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.

Zusätzlich sieht die vorliegende Erfindung Polypeptide vor, die in der oben genannten cDNA kodiert sind und die als Reagenzien für Diagnosetests und/oder als Bestandteile von Impfstoffen nützlich sind.

Die genannten Polypeptide umfassen verschiedene Polypeptide, die KHCV Epitope umfassen einschließlich rekombinante Polypeptide wie z. B. fusionerte Polypeptide mit einen nicht-HCV Protein und gereinigte Formen daraus.

Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung liegt in einem rekombinanten Expressionsvektor, der einen offenen Leseraster (ORF) der KHCV cDNA umfaßt, wobei der genannte ORF (open reading frame) wirksam mit einer Regulationssequenz verbunden ist, die mit einen gewünschten Wirtsorganismus verträglich ist und dieser Vektor kann umfassen; eine Nucleotidsequenz, die ein night-KHCV Protein kodiert, für die Herstellung eines fusionerten Polypeptides eines Polypeptides, welches von KHCV und anderen Typen des Proteins oder Polypeptides abgeleitet ist; eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist; und ein daraus hergestelltes Polypeptid. 3

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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt im Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, das KHCV Epitope enthält und folgendes umfaßt: Kultivierung von Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der eine Sequenz enthält, der ein Polypeptid kodiert, welches ein KHCV Epitop enthält; und ein Polypeptid, welches ein dadurch erzeugte KHCV Epitop enthält. 5 Ein anderer Aspekt der Erfindung umfaßt einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein KHCV Epitop gerichtet ist.

Noch ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung betrifft eine Hybridoma-Zelle, die einen solchen monoklonalen Antikörper erzeugt.

Noch weitere Aspekt der Erfindung liegen in einem Diagnosemittel, das ein oder mehrere Polypeptide io enthält, die ein oder mehrere KHCV Epitope als (eine) aktive Komponente(n) enthält, um anti-KHCV Antiboden in verdächtigen Proben zu entdecken; und einen Diagnosekit, der ein solches Mittel enthält.

Noch andere Aspekte der Erfindung liegen in einem Diagnosemittel mit ein oder mehreren monoklonalen gegen das KHCV Antigen gerichteten Antikörpern, als (eine) aktive Komponente(n), um HCV Antigene in verdächtigen Proben zu entdecken; und ein Diagnosekit, der solches Mittel enthält, rs Weiters liegt ein Aspekt der Erfindung in einem Impfstoff für die Behandling und/oder zur Vorbeugung vor HCV Infektion, der ein Polypeptid enthält, das ein KHCV Epitop aufweist, und eine inaktivierte oder attenuierte HCV umfaßt.

Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen leichter verstanden werden: Fig. 1 zeigt die relativen Stellungen der verschieden KHCV cDNA Klone auf KHCV-LBC 1. 20 Fig. 2-1 bis 2-16 zeigen die Nucleotidsequenzen von KHCV-LBC1 und die Aminosäuresequenzen der darin kodierten Polypeptide.

Fig. 3 zeigt für jeden cDNA Klon auf KHCV-LBC1 die Nucleotidstartzahl und die Nucleotidendzahl.

Fig. 4 zeigt die vergleichende Analyse der Nucleotidsequenzen von kHCV-LBCl und von Genomen des HCV vom amerikanischen Typ und HCV vom 25 Fig. 5 zeigt die vergleichende Analyse des Aminosäuresequenzen kodiert durch die KHCV-LBC1, den HCV vom amerikanischen Typ und HCV vom japanishen Typ.

Fig. 6 zeigt die vergleichende Analyse der Nucleotidsequenzen der 5'-terminalen Region des KHCV-LBCl und Genome der HCV vom amerikanischen Typ und HCV vom japanischen Typ.

Fig. 7 zeigt die Nucleotidsequenz der cDNA Fragmente NS2-LBC2 und die Aminosäuresequenzen der 30 dadurch kodierten Polypeptide.

Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz der cDNA Fragmente NS2-LBC3 und die Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die darin kodiert sind.

Fig. 9 zeigt die Nucleotidsequenz des cDNA Fragmentes NS2-LBC20 und die Aminosäuresequenzen des darin kodierten Polypeptides. 35 Rg. 10 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäuresequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC21 und die dadurch kodierten Fig. 11 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC23 und die dadurch kodierten 40 Fig. 12 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Pofypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC25 und die dadurch kodierten Fig. 13 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC26 und die dadurch kodierten Rg. 14 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC27 und die dadurch kodierten 45 Fig. 15 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. CDNA Fragmentes NS2-LBC28 und die dadurch kodierten Fig. 16 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC29 und die dadurch kodierten SO Rg. 17 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC30 und die dadurch kodierten Fig. 18 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC31 und die dadurch kodierten Fig. 19 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS2-LBC32 und die dadurch kodierten 55 Rg. 20 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS5-LBC20 und die dadurch kodierten Rg. 21 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides. cDNA Fragmentes NS5-LBC21 und die dadurch kodierten 4

AT 405 053 B cDNA Fragmentes NS5-LBC23 und die dadurch kodierten cDNA Fragmentes NS5-LBC25 und die dadurch kodierten

Fig. 22 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides.

Fig. 23 zeigt die Nucleotidsequenz des Aminosäurensequenzen des Polypeptides.

Hg. 24 zeigt die Nucleotidsequenz des cDNA Fragmentes NS5-LBC27 und die dadurch kodierten Aminosäurensequenzen des Polypeptides.

Fig. 25 zeigt die Nucleotidsequenz des cDNA Fragmentes NS5-LBC28 und die dadurch kodierten Aminosäurensequenzen des Polypeptides.

Fig. 26 zeigt die vergleichende Analyse der Aminosäurensequenzen von Polypeptiden, die in der NS2 Region der cDNA von KHCV Varianten kodiert sind, die von den Subtypen KHCV-L1 oder KHCV-L2 umfaßt sind.

Fig. 27 zeigt die vergleichende Analyse der Nucleotidsequenzen der NS2 Region der cDNA von KHCV Varianten, die in der Subtype KHCV-L1 enthalten sind.

Fig. 28 zeigt die verleichende Analyse der Nucleotidsequenzen der NS2 Region der cDNA von KHCV Varianten, die in der Subtype KHCV-L2 enthalten sind.

Hg. 29 zeigt die vergleichende Studie der Nucleotidsequenzen der NS5 Region der cDNA von KHCV Varianten, die in der Subtype KHCV-L1 bzw. KHCV-L2 enhalten sind.

Fig. 30 zeigt einen Expressionvektor, der für den Zweck der Expression eines KHCV cDNA Fragmentes in Hefezellen gebildet wurde.

Fig. 31 A zeigt das Resultat der SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) nach der Expression eines KHCV cDNA Fragmentes in Hefezellen und Fig. 31 B zeigt das Resultat der Western Blotting Analyse mit dem Gel der Fig. 31 A.

Fig. 32 zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE (Fig. 31 A) und der Western Blotting Analyse (Fig. 31B), wobei die Erzeugung der KHCV E2N und E2C Polypeptide in Hefezellen vorgenommen wurde.

Fig. 33 zeigt die Nucleotidsequenz eines chemisch synthetisierten ubiquitin Genes.

Fig. 34 zeigt den Expressionsvektor, der einen Trp Promotor für die Expression eines KHCV cDNA Fragmentes in E. coli Zellen aufweist.

Fig. 35 zeigt den Expressionsvektor, der den Tac Promotor für die Expression eines KHCV cDNA Fragmentes in E. coli Zellen aufweist.

Die Fig. 36 bis 38 zeigen die Resultate von SDS-PAGE nach der Expression eines KHCV cDNA Fragmentes in E. coli Zellen.

Die Fig. 39 bis 41 zeigen die Resultate der Western Blotting Analysen mit den Gelen der Hg. 36 bis 38. Fig. 42 zeigt das Resultat der SDS-PAGE nach der Expression eines KHCV cDNA Fragmentes, welches mit einem MBP Gen unter Steuerung durch den Tac Promotor in E. coli Zellen fusioniert wurde.

Fig. 43 zeigt das Resultat der Western Blotting Analyse mit dem Gel gemäß Hg. 42.

Fig. 44 zeigt Standardkurven für eine Enzymimmunoprobe (EIA), variiert mit der Konzentration des (der) KHCV Antingene(s), verwendet für das Aufspüren der anti-HCV Antikörper in den Proben, und Fig. 45 zeigt eine Standardkurve für EIA mit monoklonalen Antikörpern als Funktion der Konzentration von KHCV Antigen in den Proben.

Alle hier angeführten Referenzen gehören in ihrer Gesamtheit zur Offenbarung.

Die nachstehenden Ausdrücke haben hier folgende Bedeutungen:

Der Ausdruck "Hepatitis C Virus" bezeichnet einen Virus, der eine nicht-A, nicht-B Hepatitis oder C Hepatitis verursacht. Die Ausdrücke HCV und NANBV und die Ausdrücke NANB Hepatitis (NANBH) und Hepatitis C werden hier austauschbar verwendet.

Der Ausdruck "Hepatitis C Virus vom koreanischen Typ" oder "KHCV" bezieht sich auf eine neue Type des HCV, die von koreanischen Hepatitis C Patienten isoliert wurde und deren cDNA ein offenes Leseraster einer Nucleotidsequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuren mit den Nummern 842, 849 und 853 Phenylalanin, Leucin und Threonin bedeuten, oder jeweils Leucin, Phenylalanin und Alanin.

Der Ausdruck "Epitop" bedeutet einen antigenen Determinanten eines Polypeptides, der fähig ist, eine Immunantwort in einem immumologisch kompetenten Wirtsorganismus hervorzurufen und/oder befähigt ist, sich selbst an einen komplementären Antikörper zu binden. Ein Epitop der vorliegenden Erfindung besteht generell aus wenigstens 6 Aminosäuren, bevorzugt aus 7 oder 8 Aminosäuren.

Der Ausdruck "Fragment" bedeutet ein Polynucleotid oder Polypeptid, welches eine Subsequenz einer der cDNAs oder Proteine gemäß Erfindung, umfaßt. Solche Fragmente Können durch enzymatische Spaltung größerer Moleküle hergestellt werden, wo Restriktionsendonukleasen für die DNA und Proteasen für die Proteine verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Fragmente sind jedoch nicht auf Produkte beschränkt, die von irgendeiner besonderen Form der enzymatischen Spaltung herstammen und können 5

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Subsequenzen umfassen, deren Termini nicht irgendeinem enzymatischen spaltungspunkt entsprechen. Solche Fragmente können z. B. durch chemische Syntesen unter Verwendung der hier vorgelegten Sequenzdaten hergestellt werden. Proteinfragmente können auch durch die Expression von DNA Fragmenten hergestellt werden, die die Proteinfragmente kodieren. Solche Proteinfragmente können bei der 5 vorleigenden Erfindung nützlich sein, wenn sie eine genügende Anzahl an Aminosäureresten enthalten, um eine immunoreaktive und/oder antingene Determinante bilden.

Der Ausdruck "Offenes Leseraster" (open reading frame) bezieht sich auf eine Region einer Polynu-cleotidsequenz, in der aufeinanderfolgende Nucleotidtriplets als Kodons gelesen werden können, die Aminosäure zur Kodierung eines Polypeptides spezifizieren. 10 Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezeichnet ein Hilfsmittel zum Klo-nen, das dazu bestimmt ist, die Expression von Polynucleotidinserts zu fördern.

Der Ausdruck "Regulatorsequenz" bedeutet eine DNA Sequenz, die damit befaßt ist, die Expression einer Polynucleotidsequenz zu steuern und umfaßt beispielsweise den Promotor, den ribosomalen Bindungsort und den Terminator. 15 Der Ausdruck "rekombinantes KHCV Polypeptid" bezeichnet ein Polypeptid, welches zumindest eine Sequenz aus 6 Aminosäuren enthält die in KHCV cDNAs der Fig. 2-1 bis 2-16 und den Fig. 7 bis 25 kodiert sind, und ist an (eine) Aminosäure(n) gebunden, die verschieden von jenen ist (sind), die mit den Polypeptiden verbunden sind, die in den KHCV cDNAs kodiert sind.

Der Ausdruck "gereinigtes KHCV Polypeptid" bezeichnet ein KHCV Polypeptid oder ein Fragment 20 davon, welches im wesentlichen rein und homogen ist und von zellularen Komponenten getrennt ist, die von Natur aus vorhanden sind. Generell umfaßt ein gereinigtes KHCV Polypeptide über etwa 70 bis 90% Polypeptide und insbesondere wenigstens 95% Polypeptide.

Die anderen hier verwendeten Ausdrücke sind in der üblichen und konventionellen Bedeutung gemäß Stand der Technik verwendet. 25 Im folgenden wird die vorliegende Erfindung spezieller ausgeführt.

Klonierung von KHCV cDNA

Eine KHCV cDNA Bibliothek wird wie folgt hergestellt: 30 HCV Partikel werden aus Seren koreanischer Hepatitis C Patienten durch deren Abscheidung mittels einer Ultrazentrifuge isoliert. Die HCV RNA wird von den HCV Partikeln extrahiert. Von der HCV RNA werden doppelstränglge cDNAs mit einem Random Primer oder Oligo d(T) Primer und umgekehrter Transcriptase synthetisiert. Die cDNA Fragmente werden entweder nach Vermehrung durch Anwendung von PCR oder direkt an einem UNI-ZAPXR Vektor kloniert (Stratagene Co. 11099 N. Torrey, Pines Road., 35 CA, USA), nachdem daran ein Eco RI Adaptor angehängt worden war, und der Vektor wird in Viruspartikein eingeführt, um eine cDNA Bibliothek herzustellen (Saiki, P. K. et al., Science, 230,1350 (1985)).

Generell können Hepatitis Viruspartikel aus dem Serum oder der Leber von Patienten oder von Schimpansen isoliert werden, die mit Hepatitis infiziert sind. Bei der vorliegenden Erfindung werden die HCV Partikel aus Seren von Hepatitis C Patienten isoliert, und die gesamte RNA des HCV wird von den 40 HCV Partikeln extrahiert, die mittels Ultrazentrifugation abgeschieden wurden, gefolgt von einer Phenolex-traktion und einer Ethanolfällung.

Danach wird die gesamte RNA des HCV als Matrize für die Herstellung von cDNA in der Reaktion verwendet, bei der ein Zap-cDNA Synthese Kit verwendet wird (Cat. No. 200400, Strategene Co., 11099 N. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037, USA). 45 Diese cDNA wird durch Reaktion von Reverser Transcriptase unter Verwendung der gesamten RNA und eines Random Primer RANPSHCV oder eines Oligo d(T) Primer synthetisiert, wobei der Primer RANPSHCV (5'-TTTTTCATGATTGGTGGTGGAACTGGACOGTCTOGAGNNNNN-3'; N bezeichnet A. G. T oder C) und der Oligo d(T) Primer (5-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTOGAG(T)18-3') 6 Random Nucleotide (Primer RANPSHCV) oder 18 T (Oligo d(T) Primer) in jeder 3'-Endregion und einen Erkennungs- 50 ort der Restrictionsendonuclease Xho I umfassen. Für die Einführung eines Erkennungsortes des Eco RI (5'- GAATTC-3') in die synthetisierte cDNA zum Zwecke der Klonierung wird ein Eco RI Adaptor (5’- CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3') (3'- GGGGGGCTTAAGCCGTGCTC-5’) 55 an die synthetisierten cDNA Fragmente angelagert. Und danach werden die cDNA Fragmente mittels PCR mit dem Primer PSHCV (5'-ι ι ι i CATGATTGGTGGTGGA-3') und den Reo RI Primer (dem oberen Strang des Eco RI Adaptors) vermehrt. Die cDNA Fragmente werden partiell mittels Restrictionsendonucleasen Eco RI und Xho I abgebaut. Die abgebaute cDNA wird an einen UNI-ZAPXR Vektor gehängt, einer Variante des 6

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Lambda gt 11, abgebaut mit Eco RI und Xho I, und die sich ergebende DNA wird in Vitro intro in Teilchen des Lambda Phagen mit einem Gigapack II Gold Packaging Kit (Cat. No. 200214, Stratagene Co., USA) eingeführt, gefolgt von einer Verstärkung mittels Infektion der Partikel in E. coli Zellen, um die cDNA Bibliothek herzustellen.

Die cDNA Bibliothek ist auf den E. coli Zellen aufgelagert, um Phagenauflagen zu bilden, die dann mittels einer immunologischen Methode, wie von Huynh (DNA Kloning: A Practical Approach, Vol. 1, pp.49-78, IRL Press, UK (1985)) beschrieben, durchsucht werden, um die klonierten Phagen auszuwählen, die mit dem Antikörper in dem Serum der Hepatitis C Patienten zu reagieren und von denen man annimmt, daß sie von der KHCV cDNA abgeleitete Polypeptide erzeugen können.

Andererseits kann der UNI-ZAPXR Vektor in E. coli ausgeführt werden, um ein Phagemid pBluescript herzustellen, das KHCV cDNA Fragmente enthält (Short et al., Nucl. Acid. Res., 16, 7583-7600 (1988)) welches leichter zu behandeln ist, als ein normales Plasmid. Weiters kann pBluescript wahlweise entweder als Einzelstrang oder als Doppelstrang erhalten werden, da es entweder von einer f1 Replikation oder aber von Col E1 abstammen kann.

Dollepstrang pBluescript DNA, isoliert von E. coli, infiziert mit positiver Plaque, wird mittels Restriktions-endonucleasen Eco RI und Xho I aufgespalten, um die Existenz und die Länge des KHCV cDNA Fragmentes, das zwischen den Eco RI und dem Xho I Erkennungsorten eingesetzt ist, mittels Gelelektrophorese zu bestätigen. Die Nucleotidsequenz des cDNA Fragmentes wird unter Anwendung der Sanger's Methode bestimmt (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463 (1977)).

Danach werden neue Oligonucieotidproben auf Basis der bestimmten Nucleotidsequenz des cDNA Klons syntethisiert, um die cDNA Bibliothek zu durchsuchen, um die verbleibende Region einer vollen KHCV cDNA zu erhalten. Daraufhin werden die neuen so erhaltenen cDNA Klone wieder zum Durchsuchen verwendet, um weiters KHCV cDNA zu erhalten. Es kann auch mittels PCR ein Teil KHCV cDNA erhalten werden, indem die Primers verwendet werden, die auf Basis der vorher bestimmten Nucleotidsequenzen der KHCV cDNA synthetisiert werden.

Die überlappenden cDNA Fragmente Können verbunden werden, um die volle Sequenz der KHCV cDNA zu bestimmen, und ein offenes Leseraster ist daraus abzuleiten.

Eine KHCV cDNA, die die so erhaltene volle cDNA Sequenz besitzt, wird als KHCV-LBC1 bezeichnet, der bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 14. Mai 1991 mit der Zugriffsnummer ATCC 75008 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt worden war.

Die volle Nucleotidsequenz des KHCV-LBC1 und die Aminosäurensequenz, die darin kodiert ist, sind in den Figuren 2-1 bis 2-11 dargestellt. Die Position jedes cDNA Klons auf der KHCV-LBC1 Sequenz ist in den Fig. 1 und 3 geoffenbart. Der KHCV-LBC1 besitzt einen langen offenen Leseraster, der aus 9030 Nucleotiden besteht und vom 343igten Nucleotid (A) bis zum 9372igten Nucleotid (G) reicht, gezählt vom 5'-Ende.

Die Identifikationsnummer einer gegebenen Aminosäure wird im folgenden in Abhängigkeit von der Position der Aminosäure in dem Polypeptid zugeordnet, das durch die obigen 9030 Nucleotide, in Richtung vom 5'-zum 3'-Ende kodiert ist.

In der 5'-Endregion des KHCV-LBC1, welches nach der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, existieren 13 Nucleotide mehr als beim HCV vom japanischen Typ (Kato, N. etla., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 95224 (1990)). Wie in Fig. 6 beschrieben, wurde im Vergleich zum HCV vom amerikanischen Typ ein Nucleotid mehr entdeckt und 3 Nucleotide unter den 22 Nucleotiden, die eine Haarnadelstruktur der 5'-Endregion bilden, wurden als verschieden gefunden. Die 5'- Endregion spielt generell eine wichtige Rolle bei der Expression eines viralen Gens und dessen Regulierung. Eine Haarnadelstruktur, die aus 22 Nucleotiden besteht, wird für einen Erkennungsort für Replikase und Kernprotein gehalten. Daher kann sogar eine kleine strukturelle Differenz in dieser Region signifikante und beträchtliche Unterschiede in seiner Rolle oder Spezifität hervorrufen.

Gleicherweise werden die volle Nucleotidsequenz des KHCV-LBC1 und der darin kodierten Aminosäuresequenz verglichen mit jenen der HCV vom amerikanischen Typ und der HCV vom japanischen Typ mit folgendem Resultat: Im Fall des amerikanischen Types ist die Nucleotidsequenz des KHCV-LBC1 homolog bis zu einem Niveau von etwa 78, 3% und die darin kodierte Aminosäuresequenz weist eine Homologie von etwa 84,2% auf. Im Fall des japanischen Types besitzt die Nucleotidsequenz eine Homologie von 90, 9% und die Aminosäuresequenz eine von 93% (siehe Fig. 4 bis 6). Die obigen Resultate zeigen deutlich, daß die KHCV-LBC1 eine cDNA eines neuen Typs von HCV ist, die deutlich unterschiedlich von den bereits identifizierten HCVs ist. 7

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Herstellung von partiellen cDNA Fragmenten von KHCV Varianten KHCV RNA wird von dem genannten KHCV extrahiert, der von Seren von Hepatitis C Patienten jeweils isoliert wurde. Und mittels PCR wird von jeder KHCV RNA die cDNA synthetisiert, um cDNA Fragmente entsprechend der NS2 Region oder NS5 Region zu erhalten. Die Länge jedes so erhaltenen cDNA Fragmentes liegt bei 340 bp bei NS2 und 320 bp bei NS5.

Die cDNA Fragmente werden in M13mp18 und M13mp19 eingeführt (New England Biolabs, 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, USA) um ihre Nucleotidsequenzen zu bestimmen (siehe Fig. 7 bis 25).

Die Nucleotidsequenzen der NS2 Region weisen eine Homologie von 91 bis 94% auf (siehe Fig. 27 und 28). Die NS5 Region Zeigt eine Homologie von 96 bis 99% (Fig. 29) während die in den NS2 und NS5 Regionen kodierten Aminosäurensequenzen jeweils eine Homologie von 90 bis 94% bzw. 93 bis 99% aufweisen (siehe Fig. 26). Überdies wurde auch entdeckt, daß die KHCVs in zwei Subtypen, nämlich KHCV-L1 und KHCV-L2 unterteilt werden können, abhängig von den Aminosäuren mit den jeweiligen Nummern 842, 849 und 853, die in der NS2 Region kodiert sind. Die cDNAs der KHCV, die im KHCV-L1 enthalten sind, kodieren Phenylalanin, Leucin und Threonin als Aminosäuren mit ihren jeweiligen Identifikationsnummern 842, 849 und 853. Die von KHCV-L2 unfaßten cDNAs kodieren hingegen Leucin, Phenylalanin und Alanin. Als Subtype KHCV-L1 sind umfaßt: KHCV-LBC1, KHCV-LBC20, KHCV-LBC23, KHCV-LBC26 und KHCV-LBC32. Demgegenüber umfaßt die Subtype KHCV-L2: KHCV-LBC2, KHCV-LBC3, KHCV-LBC21, KHCV-LBC25, KHCV-LBC27, KHCV-LBC28, KHCV-LBC29, KHCV-LBC30 und KHCV-LBC31.

Es ist zu bemerken, daß die obigen Merkmale im Fall des HCV vom amerikanischen Typ night gefunden werden können, bei dem die Aminosäuren Cystein, Phenylalamin und Valin sind. Andererseits hat der japanische Typ die gleichen Merkmale wie KHCV-L2, d. h. nämlich die Aminosäuren in den obigen Positionen sind Leucin, Phenylalanin und Alanin.

Die M13 Phagengruppe (M13mp18-NS2L1), die die M13mp18 Phage enthält, und jede der cDNAs umfaßt, die in KHCV-L1 enthaltend ist, ausgenommen KHCV-LBC1, nämlich KHCV-LBC20, KHCV-LBC23, KHCV-LBC26 und KHCV-LBC32, wurde bei der American Type Culture Collection am 13. März 1992 unter der Zugriffsnummer ATCC 75211 hinterlegt und die M13 Phagengruppe (M13mpl8-NS2L2), die M13mp Phagen enthält, welch jeweils cDNAs umfassen, die in KHCV-L2 enthalten sind, nämlich KHCV-LBC2, KHCV-LBC3, KHCV-LBC21, KHCV-LBC25, KHCV-LBC27, KHCV-LBC28, KHCV-LBC29, KHCV-LBC30 und KHCV-LBC31 wurden bei der ATCC am gleichen Tag unter der Zugriffsnummer ATCC 75212 hinterlegt.

Die erfindungsgemäßen cDNAs können zusätzlich zu den in den obigen Beispielen genannten Methoden chemisch synthetisiert werden, wobei die Nucleotidsequenz Informationen demäß den Fig. 2-1 bis 2-16 und den Fig. 7 bis 25 verwendet werden. Solche chemischen Synthesen können mittels bekannter Verfahren durchgeführt werden wie die Phosphoamidite Solin Support Methode von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)).

Weiters ist zu beachten, daß infolge der Entartung des genetischen Codes viele potentzielle Nucleotidsequenzen existieren, die für die in den Fig. 2-1 bis 2-16 und den Fig. 7 bis 25 gezeigten Aminosäuresequenz kodieren können.

Aufbau eines Expressionsvektors und Herstellung des Proteins damit

Verschiedene Expressionssysteme können verwendet werden, um einen Expressionsvektor herzustellen, der ein KHCV cDNA Fragment gemäß vorliegender Erfindung enthält, einschließlich einen Vektor, der fähig ist, die Produktion eines fusionierten Proteins mit anderen Polypeptiden zu steuern, als das eine, welches vom KHCV stammt.

Zum Beispiel kann ein solches Vektorsystem durch Anwendung eines ubiquitinen Expressionssystems ausgebildet werden. In Hefe kann Ubiquitin mittels Ubiqultinase am exakten Sitz unmittelbar neben Arg-Gly-Gly herausgeschnitten werden (Ozkaynak et al., Nature, 312, 663-666 (1987)). Bachmair berichtete in Science, 234, 178-186 (1986), daß ein mit Ubiquitin fusioniertes fremdes Protein ebenfalls am Ort neben ArgGly-Gly des Ubiquitins herausgeschnitten werden kann.

Demgemäß kann ein gewünschtes KHCV Protein erhalten werden, indem ein fusionertes Polynucleotid eines KHCV cDNA Fragmentes und ein ubiquitines Gen In Hefe Exprimiert wird, da dann das fusionierte Protein herausgeschnitten werden, um das Ubiquitin mittels Ubiquitinase einer Hefezelle zu entfernen, sodaß als Resultat das KHCV Protein alleine übrigbleibt.

Weiters würde das fusionierte Protein, welches Ubiquitin enthält, erhalten werden, wenn das fusionierte Polynucleotid, welches ein KHCV cDNA Fragment und ein Ubiquitin-Gen enthält, in E. coli exprimiert wird. Jedoch kann das Ubiquitin in vitro mittels Ubiquitinase herausgeschnitten werden und das, von Ubiquitinase 8

AT 405 053 B freie KHCV Protein kann erhalten werden. Das fusionierte Protein per se kann natürlich für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden. Und dies gilt auch für das KHCV Protein per se, so lange es die notwendigen Merkmale des KHCV Proteins behält, nämlich die Antigenizatät des KHCV.

Das obige Expressionssystem kann wirksam angewendet werden, wo das gewünschte Protein unstabil ist und leight mittels Protease in einer Wirtszelle abgebaut werden kann, da das Ubiquitin das gewünschte Protein gegenüber dem Proteaseangriff schützen oder es stabilisieren kann.

Ein Expressionsvektor, der das Ubiquitinsystem verwendet, kann durch Einführung eines KHCV cDNA Fragmentes in einen Expressionsvector hergestellt werden, der ein Ubiquitin-Gen enthält. Andererseits kann ein fusionierter Expressionsvektor, der ein Malto sebindungsprotein (MBP) System als erfindungsgemäßer Expressionsvektor verwendet werden. In diesem System wird das KHCV cDNA Fragment nach dem Mal E1 Gen angehängt, das MBP kodiert. Dadurch wird das fusionierte Protein von MBP und KHCV Protein hergestellt (Guam et al., Gene, 67, 21-30 (1987); Maina et al., Gene 74, 369-373 (1988); Amann et al., Gene 40, 183-190 (1985); Duplay et al., J. Biol. Chem., 259, 10606-10613 (1984)).

Das obige MBP Expressionssystem ist deshalb geeignet, da das fusionierte Protein, welches MBP enthält, leicht unter Ausnutzung der Affinität des MBP zu Maltose gereinigt werden kann. Weiters hat MBP einen herausschneidbaren Sitz durch den Protease faktor Xa in der C-terminalen Region, wodurch das KHCV Protein von dem MBP befreit werden kann.

Um ein gewünschtes KHCV Protein zu erhalten wird eine kompatible Wirtszelle mit einem Expressionsvektor transformiert, der ein KHCV cDNA Fragment enthält. Die transformierte Zelle wird unter Bedingungen, die die Expression erlauben, kultiviert.

Ein zu exprimirendes KHCV cDNA Fragment kann durch Anwendung einer Restriktionsendonuclease oder einer Nuclease mit einem größeren Fragment oder KHCV-LBC1, und durch Ausführung von PCR mit Primern und KHCV-LBC1 oder deren Fragmente als Matrize hergestellt werden. Die Länge und die Nucleotidsequenz jedes Primers kann nach der Stellung und Länge des KHCV cDNA Fragmentes, das exprimiert werden soll, bestimmt werden. Der Primer kann komplett oder partiell komplementär zu jedem Strang der doppelstrangigen KHCV cDNA sein.

Sobald es hergestellt und isoliert ist, wird das KHCV cDNA Fragment gemäß Erfindung in ein entsprechendes Expressionswerkzeug eingefügt, welches die notwendigen Elemente zur Transcription und Translation der eingefügten Gensequenzen aufweist. Nützliche Klonierungswerkzeuge können aus Segmenten anderer nicht-KHCV Polynucleotide bestehen, einschließlich syntetischer DNA Sequenzen wie z. B. verschiedene bekannte bakterielle Plasmide, Phagen DNA, Kombinationen von Plasmiden, die zur Verwendung von Phagen DNA modifiziert wurden, oder andere Expressionskontrollsequenzen oder Hefeplasmide.

Die Auswahl eines geeigneten Wirtsorganismus wird von einer Anzahl von Faktoren bestimmt, wie es Stand der Technik ist. Diese Faktoren umfassen beispielsweise Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, Toxizität des Proteins, welches vom rekombinanten Plasmid Kodiert wird, leichte Gewinnung des gewünschten Proteins, Proteinmerkmale, biologische Sicherheit und Kosten. Es muß eine Ausgewogenheit dieser Faktoren bedacht werden und man muß verstehen, daß nicht alle Wirte gleich wirksam in der Expression eines bestimmten rekombinanten DNA Moleküles sind.

Passende Wirtsorganismen, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, können ohne eine Einschränkung zu geben, beispielsweise Pflanzen-, Säugetier- und Insektenzellen oder Hefezellen und Bakterien wie z. B. Escherichia coli umfassen.

Die von der KHCV cDNA abgeleiteten Polypeptide umfassen alle Kernproteine, nicht strukturelle Proteine und Hüllproteine und einen Abschnitt davon, der für die Herstellung diagnostischer Mittel oder von Impfstoffen in Form von Mischungen daraus oder alleine verwendet werden könnte. Die in einer Wirtszelle hergestellten Polypeptide können durch kombinierte Verwendung herkömmlicher Methoden isoliert und gereinigt werden, z. B. durch Zellauflösung, Zentrifugation, Dialyse, Aussalzen, Chromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese und Elektroeluation.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch aus KHCV Partikeln isoliert oder chemisch synthetisiert werden, wobei entsprechende Methoden Angewandt werden wie z. B. exklusive Solid Phase Synthese, partielle Solid Phase Methode, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese. Solid Phase Synthesen werden bevorzugt, wie von Merrifield (j. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)) beschrieben.

Andererseits können Aminosäuresubstitutionen in Proteinen auftreten, die die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht stark verändern, und z. B. beschrieben wurden von Neurath et al., in "The Proteins", Academic Press, New York (1979), insbesondere gemäß Fig. 6 auf Seite 14. Die am häufigsten beobachteten Aminosäuresubstitutionen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly. Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, und umgekehrt. 9

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Solche funktionell equivalenten Aminosäuresubstitutionen der beispielsweisen Ausführungen dieser Erfindung liegen innerhalb des Bereiches der Erfindung, solange die resultierenden Proteine ein oder mehrere antigene Determinanten der KHCV behalten.

In dieser Beschreibung werden standargemäße Einzelbuchstaben- oder Dreibuchstaben-Abkürzungen 5 verwendet, um Nucleotide und Aminosäuren zu bezeichnen. Die Bedeutungen dieser Abkürzungen können in den standardgemäßen Biochemiebüchern gefunden werden wie z. B. Lehninger, Principles of Biochemistry, Worth Publishers Inc., New York, pp 96, 798 (1984).

In vitro Diagnoseverfahren für Hepatitis C under Verwendung von KHCV Antigenpolypeptiden für die w Bestimmung von KHCV Antikörpern

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Diagnoseverfahren, bei dem ein Diagnosemittel mit Gehalt an KHCV Polypeptiden mit einem oder mehreren KHCV Epitopen Verwendung finden. Das Diagnoseverfahren unter Verwendung von KHCV Polypeptid(en) ist spezifisch und genau für das Bestimmen von KHCV is Antikörpern im Serum von Hepatitis C Patienten verglichen mit irgendeiner der existierenden Methoden.

Das neue diagnoseverfahren umfaßt die folgenden Schritte:

Zuerst wird ein Diagnosemittel mit Gehalt an einem oder mehreren KHCV Polypeptiden auf einen festen Träger gegeben z. B. in die Öffnung (well) einer Microtiterplatte,, sodaß dieses KHCV Antigen von der' Oberfläche der Öffnung adsorbiert wird. 20 Zweitens wird eine verdächtige Probe, die mit einem Verdünnungsmittel verdünnt wurde, in die mit Antigen bedeckte Öffnung gegeben, wo der Antigen-Antikörperkomplex gebildet wird, wenn anti-KHCV Antikörper im Serum vorliegen.

Drittens, ein Enzym wie z. B. HRP (horseradish peroxidase) konjugiertes anti-human-IgG wird der Öffnung zugegeben, sodaß das anti-human IgG-HRP die Antikörper des gemäß Stufe zwei gebildeten 25 Komplexes binden kann und

Schließlich werden Substrate für das Enzym z. B. O-Phenylendiamindihydrochlorsäure (OPD) und Wasserstoffperoxyd zur Peroxydase der Öffnung zugegeben, um eine Farbreaktion hervorzurufen. Wenn das verdächtige Serum anti-KHCV antikörper enthält, entsteht als Resultat der Reaktion des Enzyms mit den Substraten eine Farbe. Die Farbreaktion wird durch Zugabe verdünnter schwefeliger Säure gestoppt. 30 Die Farbintensität kann mit einem Mikroöffnungslesegerät (microwell reader) gemessen werden. Die Existenz von anti-HCV Antikörpern kann auf Basis des Ergebnisses bestimmt werden. Der feste Träger für diese Diagnosemethode kann ein Polystyrolband oder ein Nitrozellulosestreifen sein.

Weiters sieht die vorliegende Erfindung einen Hepatitis C Diagnosekit vor, der die notwendigen Mittel enthält, um das obige Verfahren auszuführen, und im wesentlichen aus einem Diagnosemittel besteht, das 35 die KHCV Polypeptide(e) enthält, die ein oder mehrere KHCV Epitope tragen.

Herstellung der Antikörper

Die vorliegende Erfindung sieht Antikörper vor, die gegen Polypeptid(e) gerichtet sind, die von der 40 KHCV cDNA abgeleitet sind. Kurz gesagt werden geeignete Tiere ausgewählt und es wird dem gewünschten Immunisierungsprotokoll gefolgt. Nach einer entsprechenden Zeitperiode munisierungsprotokoll gefolgt. Nach einer entsprechenden Zeitperiode wurde die Milz dieser Tiere herausgenommen und einzelne Milzzellen wurden typischerweise mit Myelomezellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusionert (fused). Danach wurden die Zellen klonisch seperiert und der Überschuß jedes Klons wurde auf seine 45 Herstellung eines geeigneten Antikörpers getestet, der für die gewünschte Region des Angeeigneten Antikörpers getestet, der für die gewünschte Region des Antigens spezifisch ist.

Ein Tier, wie z. B. eine Maus, kann immunisiert werden, indem eine herkömmliche Methode angewendet wird, wie folgt:

Ein im wesentlichen gereinigtes Antigen wird der Maus intramuskulär, intraperitoneal, intradermal oder 50 intravenös injiziert und zwar mehrfach mit Intervallen von 14 bis 21 Tagen mit einer Gesamtmenge von 100 bis 200ug pro Maus. Notwendigenfalls kann ein herkömmliches Adjuvans wie z. B. ein Freund'sches Komplettadjuvans oder ein unvollständiger Adjuvans zusammen verwendet werden. Drei Tage nach der letzten Injektion werden Milzzeflen der Maus entnommen um sie mit Myelomezellen von Mäusen zu fusionieren, deren Überlebensrate über 95% liegen und sich 55 Die Fusion der Zellen kann mittels einer herkömmlichen Methode durchgeführt werden wie sie z. B. von Lovberg in Monoclonal antibodies: Production & Maintenance, William Heinemann, Medical Books Ltd. (1982) beschrieben ist. 10

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Die so erhaltenen fusionerten Zellen werden seriell verdünnt, gemäß Stand der Technik wie z. B. in Current Protocols in Immunology, Wiley Intersience (1991) beschrieben, um einen Klon zu entdecken, der die gewünschten Antikörper enthält.

Ein gewünschter Klon kann nach bekannter Methode herausgesucht werden wie z. B. durch Enzym Immuno Assay, Plaque Methode, Spot Methode, Ouchterlony Methode und Radioimmunoassay, wie beschrieben in Hybridoma Methods & Monoclonal Antibodies, Research and Development Press, pp30-53 (1982).

Die gewünschten monoklonalen Antikörper können vom Fachmann leicht erhalten werden, wobei die klonierte Antikörper-produzierende Zelllinie verwendet wird. Weiters erfolgt eine Reinigung durch Anwendung einer konventionellen Methode wie z. B. der Affinitätschromatographie.

Die Antikörper sind für die Reinigung von KHCV Antigenen und für die Entwicklung einer verbesserten Diagnosemethode zur Entdeckung von KHCV Antigenen in verdächten Proben nützlich.

Herstellung der diagnostischen Oligonucleotidsonde und Kit

Auf Basis der determinierten Nucleotidsequenz der KHCV cDNAs gemäß den Fig. 2-1 bis 2-11 und den Fig. 7 bis 25 können wenigstens 8 Nucleotide komplementär zu einem der KHCV cDNA Stränge mittels Ausschneiden oder synthetisch hergestellt werden. Die Oligonucleotide können als Sonden für die Hybridisierung nach dem Markieren z. B. mit radioaktiven Markern oder als Primer für PCR mit KHCV cDNAs als Matrize für das Aufspüren von KHCV in Serumproben verwendet werden.

Die Oligonucleotide können entweder vollständig oder partiell zu einem KHCV cDNA Strang komplementär sein, in Abhängigkeit von den Umständen.

Die Oligonucleotide sollen wenigsten 8 Nucleotide bevorzugt 10 bis 12 Nucleotide und noch bevorzugter etwa 20 Nucleotide enthalten.

Herstellung von Impfstoffen und deren Anwendung

Inaktivierte oder attenuierte KHCV, hergestellt durch Anwendung einer bekannten Methode wie auch eine oder mehrere der Polypeptide die in den KHCV cDNA Fragmenten gemäß Erfindung kodiert sind, können gemeinsam mit physiologisch akzeptablen Trägern als Impfstoffe formuliert

Passende Träger umfassen z. B. 0,01 bis 0,1 M Phosphatpuffer mit pH-neutraler oder physiologischer Salzlösung.

Eine verstärke Immunität gegen HCV kann hervorgerufen werden, indem der Impflösung ein Adjuvans oder ein Immunopotentiator zugegeben wird oder indem die Polypeptide in einer größeren Form vorgesehen werden, entweder als quervernetzter (cross-linked) Komplex oder mit einer Trägerform konjugiert.

Geeignete Adjuvansien für das Impfen können zum Beispiel und ohne Einschränkung enthalten: Adjuvans 65 (enthaltend Erdnußöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat), Mineralgele wie Aluminiumhydroxyd, Aluminiumphosphat und Alaun, Oberflächermittel wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysole-cithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid. N,N-Dioctadecyl-N’,N'-bis(2-Hydroxymethyl) Propandiamin, Methoxyhexadecylglycerol und Pluronicpolyole; Polyanionen wie Pyran, Dextransulfat, Poly IC, Polyacrylsäure und Carbopol; Peptide wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin und Tuftsin; und Ölemulsionen. Die Proteine gemäß vorliegender Erfindung können auch nach ihrer Inkorporierung in Liposome oder anderen Mikroträgern angewendet werden.

Die Immunogenizität der erfindungsgemäßen Proteine und insbesondere ihrer kleineren Fragmente kann mittels Cross-Iinking oder durch Kopplung an ein immunogenes Trägermolekül verstärkt werden (d. h. ein Makromolekül, das die Eigenschaft hat, unabhängig eine immunologische Antwort in einem Wirtstier hervorzurufen und mit dem die Proteine und die Proteinfragmente gemäß Erfindung kovalent gebunden werden können).

Cross-Iinking oder eine Konjugation mit einem Trägermolekül kann erforderlich sein, da kleine Proteinfragmente manchmal als Haptens agieren können (Moleküle, die sich spezifisch an einen Antikörper binden können aber nicht fähig sind, eine Antikörper-Produktion hervorzurufen, d.h. die nicht immunogen sind). Die Konjugation solcher Fragmente mit einem immungenen Trägermolekül macht die Fragmente immunogen, und zwar durch das, was man allgemein den "Carrier Effekt" (Trägereffekt) nennt.

Geeignete Trägermoleküle umfassen z. B. Proteine und natürlich oder synthetische Polymerverbindungen wie Polypeptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, etc. Einer der nützlichen Träger ist ein Glycosid mit dem Namen Quil A, geoffenbart von Morein et al. (Nature, 308, 457 (1984)). Proteinträgermoleküle sind besonders bevorzugt, einschließlich aber nicht beschränkt auf Säugetierserenproteine, wie z. B. als Keyhole Limpet Hemocyanin, menschliches Gammaglobulin oder Rindergammaglobulin, Albumin von Human-, 11

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Rinder- oder Hasenserum, oder methylierte oder andere Abwandlungen solcher Proteine. Andere nützliche Proteinträger werden dem Fachmann geläufig sein.

Das kovalente Koppeln mit einem Trägermolekül kann unter Verwendung vershiedener Verfahren, die bekannt sind, durchgeführt werden. Die genaue Auswahl kann z. B. durch die Natur des verwendeten Trägermoleküls vorgeschrieben sein. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können die Proteine oder Fragmente gemäß der Erfindung mit diesem Trägerprotein durch wasserlösliche Carbodiimi-de wie z. B. Dlcyclohexylcarbodiimid oder Glutaraldehyd gekoppelt werden.

Koppler wie diese können auch verwendet werden, um die Proteine und deren Fragmente mit sich selbst querzuvernetzen, um so die Verwendung eines getrennten Trägermoleküls zu vermeiden. Solches Cross-Iinking zwischen den Proteinen oder ihren Fragmentaggregaten kann ebenfalls die Immunogenizität erhöhen.

Das Inkorporieren in Liposome oder andere Mikroträger kann den Effekt mit sich bringen, daß die Impfstoffe über eine verlängerte Zeitspanne abgegeben werden.

Die Impfstoffe können als Einzeldosis verabreicht werden oder bevorzugter Weise als Mehrfachdosis. Eine wirksame Dosis der im Impfstoff gegenwärtigen Polypeptide kann in einem Bereich zwischen 5 bis etwa 200ug liegen, abhängig vom Körpergewicht des zu immunisierenden Subjektes, der Kapazität des Immunsystems des Subjektes bei der Bildung der Antikörper und abhängig vom gewünschten Immunitätsgrad. Erstmalige Impfungen werden bevorzugt von Booster Impfungen gefolgt, die ein oder mehrere Monate später verabreicht werden. Vielfache Boosters können verabreicht werden. Für die Verabreichung können die herkömmlichen Wege beschritten werden wie subkutan, intradermal, intramuskulär oder intravenös.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne den Schutzbereich einzuschränken. Die experimentellen Methoden, die in den Beispielen angewendet wurden, wurden gemäß den nachfolgenden Referenzbeispielen durchgeführt, soferne es nicht anders beschrieben ist.

Weiters sind, soferne nicht anders ausgeführt, die Prozentsätze für Mischungen Feststoff/Feststoff, Flüssigkeiten/Flüssigkeiten und Feststoffe in Flüssigkeiten jeweils auf der Basis Gewicht/Gewicht, Volu-men/Volumen und Gewicht/Volumen angegeben.

Referenzbeispiel 1: Abbau der DNA mittels Restriktionsendonuclease

Die Restriktionsenzyme und Reaktionspuffer wurden von NEB (New England Biolabs, Jolla, MA USA) gekauft.

Die Reaktion wurde generell in einer sterilisierten Eppendorf Röhre mit einem Reaktionsvolumen durchgeführt, das zwischen 50 und 100ul betrug, und bei einer Temperatur von 37* C für 1 bis 2 Stunden. Danach wurde die Reaktionsmischung mit 65‘C für 15 Minuten hitzebehandelt (oder mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt im Falle einer hitzebeständigen Endonuclease) um die Restriktionsendonuclease zu deaktivieren. 10 x Reaktionspuffer für die Reaktion einer Restriktionsendonuclease weist die folgende Zusammensetzung auf: 10 x NEB Reaktionspuffer 1: 10 x NEB Reaktionspuffer 2: 10 x NEB Reaktionspuffer 3: 10 x NEB Reaktionspuffer 4 100mM bis Trispropan HCl, 100mM MgCl2 10mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,0 100mM Tris-HCI, 100mM MgCI2, 500mM NaCI, 10mM DTT, pH 7,0 100mM Tris-HCI, 100mM MgCI2, 1000mM NaCI, 10 mM DTT, pH 7,0 : 200mM Trisacetat, 100mM Magnesiumacetat, 50mM Caliumacetat, 10mM DTT, pH 7,0.

Referenzbeispiel 2: Phenolextraktion und Fällung mit Ethanol

Nach dem Ablauf der Enzymreaktion wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert, um die Enzyme zu desaktivieren oder die DNA in der Reaktionsmischung zu gewinnen, wobei Phenol, vorher in Gleichgewicht gebracht mit einem Puffer, der 10mM Tris-HCI )pH 8,0) und 1mM EDTA enthielt, verwendet wurde. Die Phenolextraktion wurde durchgeführt, indem gleiche Volumina der Probe und des Phenols unter heftigem Schütteln vermischt wurden. Die Mischung wurde bei 15.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde in ein neues Röhrchen transferiert. Die beschriebene Prozedur wurde 2 oder 3 mal wiederholt.

Dann wurde die wässrige Schicht mit gleichem Volumen Chloroform (Chloroform: Isoamylalkohol = 24:1) extrahiert und die wässrige Schicht wurde wiederrum abgetrennt. 0,1 Volumenteile 3M Natriumacetat und 2,5 Volumenteile Ethanol wurden zugegeben. Darauf wurde die Mischung bei 15.000 rpm und 4*C für 12

AT 405 053 B 20 Minuten zentrifugiert, nachdem sie bei -70’C für 30 Minuten oder bei -20'C für 12 Stunden stehengelassen wurde, um die Nucleinsäure zu gewinnen.

Referenzbeispiel 3: Ligationsreaktion

Die Ligationsreaktion der DNA wurde durchgeführt, indem T* DNA Ligase und 10x Ligationsreaktions-puffer (0,5M Tris-HCI, 0,1 M MgCb, 0,2 M DTT, 10mM ATP, 0,5mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)) gekauft von NEB, angewendet wurde. Das Reaktionsvolumen betrug generell 20ul und 10 Units der T* Ligase wurden zur Ligation der klebrigen Enden der DNA verwendet, während 100 Einheiten für die Ligation der glatten Enden von DNAs verwendet wurden.

Die Reaktion wurde bei 16*C für 5 Stunden durchgeführt oder bei 4*C für über 14 Stunden. Nach Ablauf der Reaktion wurde die Reaktionsmischung erhitzt auf 65-C für 15 Minuten, um die T4 DNA Ligase zu deaktivieren.

Referenzbeispiel 4: Transformation von E. coli

Die für die folgenden Beispiele verwendeten E.coli Stämme umfaßten E.coli HB101 (ATCC 33694), E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli JM101 (ATCC 33876) und E. coli JM105 (ATCC 47016). Die Transformation der E. coli wurde durchgeführt, indem eine bekannte Methode angewendet wurde, nämlich wie von Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1982) oder von Cohen in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972) beschrieben wurde.

Referenzbeispiel 5: Transformation von Hefe

Die Hefetransformation wurde nach einer Methode durchgeführt, die von Beggs in Nature, 275, 104 (1978) oder von Hinnen et al., in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929 (1978) beschrieben worden war.

Referenzbeispiel 6: Synthese der Oligonucleotide

Die Oligonucleotide wurden synthetisiert, indem ein DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc.m 380B, USA) unter Anwendung der Automatic Solid Phase Phosphoamidite-Chemie angewendet wurde.

Die synthetisierten Oligonucleotide wurden unter Verwendung von denaturierendem Polyacrylamidgel (2M Harnstoff, 12% Acrylamid und Bis (29:1), 50mM Tris, 50mM Broic Acid, 1mM EDTA)Elekirophorese und SEP-PAK (Waters Inc., USA) Säulenchtomatographie gereinigt. Die Menge wurde mittels Messung O.D. bis 260nm bestimmt.

Referenzbeispiel 7: Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zu einer Mischung von bis 100ng einer Matrizen DNA, 10ul 10x Taq Polymerasereaktionspuffer (10mM Tris-HCI, 500 mM KCl, 15mM MgClj, 0,1%(w/v) Gelatine, pH 8,3), 10ul einer Mischung aus dNTP's (jeweils 2mM von dGTP, dATH, dTTP und dCTP), 2ug jedes Primers (generell wurden für die Reaktion zwei Primer verwendet, und im Fall von drei Primern wurde der mittlere Primer in einer Menge von 0,02 u.g verwendet) und 0,5ul Ampli Taq DNA Polymerase (Perkin Eimer Cetus, USA) wurde destilliertes Wasser in einer Menge zugegeben, daß ein Gesamtvolumen von 10Ou.1 erhalten wurde. Weiters wurden 50ul Mineralöl hinzugefügt, um die Reaktionsmischung vor dem Verdampfen zu schützen.

Die PCR wurde in einem thermal cycler (Perkin Eimer Cetus, USA) durchgeführt. Der thermische Zyklus wurde so programmiert, daß er 25mal oder öfters den folgenden Zyklus wiederholte: 95 *C für eine Minute - 55 *C für eine Minute - 72 *C für zwei Minuten, und letztendlich wurde die Reaktion bei 72 *C für 10 Minuten ausgeführt.

Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung mit Phenol extrahiert, und die PCR-Produkte wurden mittels Äthanolfällung gewonnen. Das Precipitat wurde in 20ttl einer TE-Pufferlösung gelöst (lOmM Tris-HCI, 1mM EDTA, pH 7,5). 13

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Beispiel 1: Herstellung von KHCV cDNA KHCV-LBC1 (1-A): Isolierung des HCV vom Serum von koreanischen Hepatitis C-Patienten und Extraktion der viralge-nomischen RNA daraus 50ul Serum von koreanischen Patienten mit chronischer Hepatitis, die als Nicht-A-, Nicht-B-Hepatitis diagnostiziert worden war (ALT < 60IU: Das Serum wurde vom Korea University Hospital und dem Catholic University Hospital in Korea geliefert), wurden ultrazentrifugiert, um die HCV-Partikel nach einer Methode zu fällen, die von Bradley, D.W. et al in Gastroenterology, 88, 773(1985) vorgeschlagen worden war. 50ml des Serum wurde 6-fach mit einer TENB-Pufferlösung verdünnt (0,05M Tris, pH 8,0, 0,001 M EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure), 0,1 M NaCI) und bei 28 000 rpm, Raumtemperatur für 6 Stunden ultrazentrifugiert, wobei ein Beckman Rotor SW28 verwendet wurde (Beckman Inc., Model L8-80M).

Die Extraktion der viralen genomischen RNA von den gefällten viralen Partikeln wurde durchgeführt, indem die Methode nach Cholozynski, P. und Sacchi, N. in Anal. Biochem. 162, S. 156-159 (1987) angewendet wurde. Die gefällten viralen Partikel wurden in 8ml einer RNA-Extraktionslösung suspendiert (4M Guanidinthiocyanat, 24mM Nacitrat, pH 7,0, 0,5% Sarcosyl, 0,1 M 2-Mercaptoäthanol). 0,8ml 2M-Natriumacetat (pH 4,0), 8ml Phenol (BRL Inc. USA; gesättigt mit destilliertem Wasser) und 1,6ml Chloroform-Isoamylalkohol (49:1, v/v) wurden zugegeben und die resultierende Mischung dann bei 12 000 x g, 4*C und 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Teströhrchen gegossen. Das gleiche Volumen Isopropanol und Glycogen (2ug/ml Überstand) als Träger wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde in einem Kühler bei - 20"C für eine Stunde gehalten und dann bei 12 000 x g, 4*C für 20 Minuten zentrifugiert, um den RNA-Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 75% Ethanol suspendiert, wie zuvor zentrifugiert und dann 10 Minuten im Vakuum getrocknet. Der virale RNA-Niederschlag wurde in 400ul TE-Pufferlösung (10mM Tris, pH 7,5, 1mM EDTA) gelöst und in der nächsten Stufe verwendet. Die virale RNA-Lösung kann für eine spätere Verwendung bei -70 · C gehalten werden. (1-B): Herstellung der KHCV cDNA Bibliothek

(1-B-1): Herstellung der KHCV cDNA Für die Herstellung der cDNA, wurde ein Zap-cDNA-Synthesekit (Stratagene Inc. USA) verwendet. Die in Beispiel (1-A) herstellte Hepatitis C virale RNA wurde als Matrize für die reverse Transkriptase verwendet. Es wurden ein Oligo-d(T)-Primer mit der Nucleotidsequenz 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)i8-3’ und ein Randomprimer mit der Nucleotidsequenz S'-TTTTTCATGATTGGTGGTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN-a' verwendet, wobei Ns gleich oder verschieden sein können und jeweils A,T,C oder G ist (im nachfolgenden jeweils als "RANPSHCV" bezeichnet) und wobei die Synthetisierung unter Verwendung eines DNA-Synthesizers erfolgte (Applied Biosystems Inc., USA, Modell 380 B).

Ein erster cDNA-Strang wurde wie folgt hergestellt: 18ul der hepatitisviralen RNA-Lösung gemäG Beispiel (1-A) wurde mit 2ul 0.1M CHsHgOH gemischt, und die Mischung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Sekundäarstruktur von RNA auffalten zu lassen. 2ul von 1M ß-Mercaptoäthanol wurde zugegeben, und die Mischung wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu der behandelten RNA-Lösung wurden 5ul reverse Transkriptase-Reaktionspufferlösung gegeben (500mM Tris-HCI, pH 8,3, 750mM KCl, 30mM MgCfe, 10mM Dithiothreitol (DDT)), 2,5ul 10mM von jeweils dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP, 2ul Oligo-d(T)-Primer (1,4ug/ul) oder 2ul RANPSHCV (1,0ug/ul), 15ul destilliertes Wasser, das mit Diäthylpyrocarbonat (DEPC) behandelt worden war und 1,0ul RNase-Inhibitor (1 Unit/ul, Promega Inc., USA) in dieser Reihefolge zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen (Primers, Matrize). Dann wurden 2,5ul MMLV reverse Transkriptase (18 Units/ul, Superscript RNase H- reverse Transkriptase, BRL Inc., Cat. No. 8853SA) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 37 · C inkubiert, um den ersten Strang der cDNA zu synthetisieren.

Ein zweiter Strang der cDNA wurde wie folgt hergestellt: Zu 45ul der erhaltenen ersten Stranglösung wurden 40ul der 10 x zweiten Strangpufferlösung (188mM Tris-HCI, pH 6,9, 906mM KCl, 46mM MgCl2, 1,5mM /8-NAD(Nikotinamidadenindinucleotid), 100mM (NH*)2SO*, 6,0ul 10mM dNTP's-Mischung (jeweils 10mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP) und 298 ul destilliertes Wasser in dieser Reihenfolge hinzugefügt und 1,0ul RNase H(4 Units/ul) und 10,0ul DNA-Polymerase I (11 Units/ul) wurden dann entlang der Wand des Teströhrchens getropft. Nach sofortigem Mischen wurde die Reaktionsmischung für 2,5 Stunden bei 16 *C inkubiert. 14

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Die Reaktionslösung wurde einer Extraktion mit gleichem Volumen Phenolchloroform unterzogen (1:1-(v/v), wobei das Phenol bereits nmit 0,5M Tris-HCI (pH 7,5) und 0,1% (v/v) 0-Mercaptoethanol) gesättigt war, und dies erfolgte dreimal. Die obere wäßrige Phase wurde abgenommen und mit 0,1 Volumsteil 3M Natriumacetat und dem zweifachen Volumsteil 100% Ethanol vermischt. Die Mischung wurde bei -20 *C über Nacht stehengelassen und bei 12 000 x g, 4*C für 20 Minuten zentrifugiert, um den cDNA-Niederschlag zu erhalten. 1-B-2: Herstellung der cDNA Bibliothek

Um die in Beispiel 1-B-1 hergestellte doppelsträngige cDNA in eine stumpfendige umzuwandeln, wurde der cDNA Niederschlag in 43,5ul destilliertem Wasser gelöst. 39u.l der cDNA Lösung wurden genommen und mit 5,0ul T4 DNA Polymerasereaktionslösung (670 mM Tris-HCI, pH 8,8 166mM (NH*)2SO*, 67mM MgCl2, 100mM 0-mercaptoethanol, 67 u.M EDTA), 2,5u.l einer 2,5mM dNTP's Mischung und 3,5u.l T4 DNA Polymerase (2,9 units/ul) vermischt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 37 ’C stehengelassen und das resultierende Produkt wurde mit Phenolchloroform extrahiert und mit Ethanol auf die gleiche Weise ausgefällt, wie im Beispiel 1-B-1.

Um für das Restriktionsenzym Eco RI beim 5'-Ende eine Erkennungsstelle einzuführen, wurde die stumpfendige doppelsträngige cDNA wie folgt behandelt: Zu der stumpfendigen cDNA wurden 7,0ul Eco RI Adaptor (Stratagene Inc., Zap-cDNA Synthesis Kit Cat. No. 200400, CA, USA), l,0ul 10 x Ligationspufferlö-sung, 1,0u.l T4 DNA Ligase (1000 units/ul) und 1,0ul 10mM ATP gegeben und über Nacht bei 4*C stehengelassen. Die sich ergebende Mischung wurde dann auf 70 *C für 10 Minuten erhitzt, um die Ligase zu deaktivieren.

Die so erhaltene cDNA kann direkt der Klonierung unterworfen werden. Im vorliegenden Fall jedoch wurde die cDNA amplifiziert und dann im Klonierungsvorgang verwendet. Für die Amplifikation der cDNA wurde deren PCR wie folgt durchgeführt: Zu der zuvor hergestellten cDNA Lösung wurden 10ul 10 x PCR Pufferlösung (200mM Tris-HCI. pH 8,3, 15mM MgCI2, 250mM KCl, 0,5 % Tween 20, 1mg/ml Gelatine), 10ul 2mM dNTP's Mischung, 5ul Primer, PSHCV mit der Nucleotidse-quenz 5'-1 l l I ICATGATTGGTGGTGGA-3' und 5ul des oberen Stranges (5'-CCCCCCGAATTCGGCAC-GAG-3') des Eco RI Adaptors, 1 ul (2,5 units) der Taq DNA Polymerase (Perkin Elmer-Cetus Inc., 761 Main Avenue, Norwalk, CT 06859-0010, USA) und 69ul destilliertes Wasser gegeben. Darauf wurde die PCR unter Verwendung eines thermal cycler (Perkin Elmer-Cetus Inc., USA) durchgeführt, der so programmiert war, daß er folgenden Zyklus 25 mal wiederholte: 95 *C für 30 Sekunden - 55 *C für 30 Sekunden - 72 *C für 2 Minuten. Nach Ablauf der Reaktion wurden die überzähligen Primers und dNTPs unter Verwendung von Centricon 100 (Amicon Inc., Cat. No. 4200, P O. Box 91954, Chicago, IL 60693, USA) entfernt. Das so erhaltene Produkt wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert und wie zuvor mit Ethanol gefällt und dann in 16ul TE Pufferlösung aufgelöst.

Zu der resultierenden Lösung wurden 2ul 10 x Pufferlösung (0,5M NaCI, 0,5M Tris-HCI, 50mM MgCh 5mM DTT, pH 7,9) und je lul Eco RI und Xho I hinzugefügt (New England Biolaps Inc., 30 Tozer Rd., Berverly, MA, USA). Dann wurde die Reaktionsmischung für 10 Minuten bei 37 *C stehengelassen, um die cDNA partiell abzubauen. Die cDNA Fragmente wurden wie zuvor mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt und dann mit 10ul TE Pufferlösung aufgelöst.

Das somit erhaltene cDNA Fragment wurde folgendermaßen in den Vektor UNI-ZAPXR geklont. Zu 10ul der mittels Eco Rl-Xho I abgebauten cDNA Fragmentlösung, wie zuvor erhalten, wurden 2,0ul 10 x Ligationspufferlösung, 2,0ul 10mM ATP, 4,0ul der Vektor UNI-ZAPXR Lösung (1ug/u.l), bereits behandelt mit Eco Rl/Xho I und 2,0ul T4 DNA Ligase (4 Weiss units/ul) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann für 10 Stunden bei 16 *C inkubiert. 1-B-3: In vitro Verpacken des die cDNA enthaltenden Vektors in Phagen und Amplifizierung der cDNA Bibliothek

Um die ligierte DNA gemäß Beispiel 1-B-2 in Phagen zu verpacken, wurden 10ul der zuletzt in Beispiel 1-B-2 erhaltenen Lösung zu einem Gigapack II Gold Packaging Extract (Stratagene Inc., USA) gegeben und die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

Zu der resultierenden Mischung wurden 500ul einer phagenverdünnenden Lösung (5,8g NaCI, 2,0g MgSO* x 7 H2O, 50ml 1M Tris-HCI, pH 7,5, 5ml einer 2%igen Gelatine pro Liter) und 20ul Chloroform gegeben (siehe Kretz et al., Nucl. Add. Res., 17, 5409 (1989)).

Die Infektion und Amplifizierung wurden wie folgt durchgeführt. PLK-P (Stratagene Inc., Zap-cDNA Synthesis Kit Cat. No. 200400) und E. coli merA-, merB- Stamm wurden in einem LB Medium kultiviert (10g 15

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Bactotrypton, 5g Hefeextrakte, 10g NaCL pro Liter) bis O.D.600 (Optische Dichte bei 600nm) den Wert 0,5 erreichte. Die kultivierten Zellen wurden ausgefällt und in 10mM MgSO* gelöst, wobei die O.D.600 auf 1,0 eingestellt wurde. 600ul der Lösung wurden mit 200ul der Packungsmischung gemischt. Die Reaktionsmischung wurde dann für 15 Minuten bei 37 *C stehengelassen, um den Phagen die Infektion der E. coli zu 5 erlauben. Zu den daraus entstehenden E. coli wurden 6,5ml 0,7% NZY Agar (7g NZ Amine, 5g NaCI, 2g MgSO* x 7 H20, 5g Hefeextrakte, 7g Bactoagar pro Liter) hinzugefügt, geschmolzen und auf 48 *C gehalten. Die Mischung wurde auf eine 150mm Durchmesser NZY Agar Platte aufgetragen (7g NZ Amine, 5g NaCI, 2g MgSO* x 7 H20, 5g Hefeextrakte, 16g Bacto-agar pro Liter) und dann für 5 bis 8 Stunden bei 37 "C inkubiert, um Phagenplaques auszubilden. io 10ml einer phagen-verdünnenden Lösung wurden auf die Platte gegossen. Die Platte wurde leicht während 15 Stunden bei 4 * C geschüttelt, um die Phagen aufzulösen. Die daraus resultierende Mischung wurde bei 4.000 x g zentrifugiert, um die E. coli Zellen abzuscheiden, die dann entfernt wurden. Zu der so erhaltenen HCV cDNA Bibliothekslösung wurden 0,3% Volumen Chloroform zugegeben. Der Titer der cDNA Bibliothek wurde mit etwa 101° bis 1013 PFU (plaque forming units) /ml bestimmt. Es wurde 100%ige DMSO 15 (Dimethyl Sulfoxid) hinzugefügt, um eine Konzentration von 7% (v/v) herzustellen. Die cDNA Bibliothek wurde bei -70 * C gehalten. 1-C: Durchsuchen der cDNA Bibliothek mittels Immunoassay und Bestimmung der cDNA Sequenz 20 Die cDNA Bibliothek wurde mittels der Immunoscreeningmethode durchsucht, die von Huynh, T. V. et al., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach (D. M. Glover, ed.), pp 49-78, IRL Press, Oxford (1985) geoffenbart wurde, wobei die HCV Antikörper verwendet wurden, die vom Übersuch nach dem Zentrifugieren des 6-fach verdünnten Serums, hergestellt in Beispiel 1-A, mittels Protein G Affinitäts-Säulenchromatographie gereinigt worden waren (Genex Inc., USA). 25 Die cDNA Bibliothekslösung, hergestellt in Beispiel 1-B-3, wurde auf 50.000 PFU pro 150mm-Durchmesser der Platte verdünnt. Die verdünnte cDNA Bibliothekslösung wurde mit 600ul E. coli XL-1 blue (Strategene Inc., USA, Zap-cDNA Synthesis Kit Cat. No. 200400), der Kultur (O.D.600 = 0,5) hergestellt, nach der gleichen Methode wie in Beispiel 1-B-2 vermischt, und 6,5ml eines 0,7% NYZ Agars wurden zugegeben. Jede Mischung wurde auf eine 40 NZY Agarplatte aufgetragen und für 12 Stunden bei 37 *C 30 kultiviert, um 2 x 106 Phagenplaques herzustellen.

Danach wurden Membrane zum Abheben der Plaques aus Nylonfiltern (Bio-Rad Ind., Cat. No. 162-163, USA) mit einem Durchmesser von 137mm mit 10mM IPTG (isogropyl-/9-D-thiogalactopyranoside) Lösung imprägniert und auf einem Whatman 3MM Fiter getrocknet (blot-dried). Jeder Filter wurde auf dem Agar in einer Platte angeordnet und für 3,5 Stunden bei 37 *C inkubiert. Jeder der Filter, die die Recken aus 35 Phageplaques aufwiesen, wurde dann mit 15ml einer Waschlösung (10mM Tris-HCI, pH 8,0, 150mM NaCI, 0,05% Tween 20) gewaschen. Zu den Filtern wurde 15ml einer Blockierungslösung (1% Rinderserumalbumin, 20mM Tris-HCI, pH 7,5, 150mM NaCI) hinzugefügt. Unter leichtem Schütteln wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurde jeder der Filter 5 mal gewaschen, indem er mit 15ml einer TBST Pufferlösung (20mM Tris-HCI, pH 7,5, 150mM NaCI, 0,05% (v/v) Tween-20) für 5 Minuten bei 40 Raumtemperatur leicht geschwenkt wurde. Die Filter wurden in 15ml der Lösung gegeben, die durch Verdünnen des gereinigten HCV Antikörpers (Proteinendkonzentration: 8,2mg/ml) auf den Wert 1:200 mit TBS Pufferlösung (20mM Tris-HCL, pH 7,5, 150mM NaCI), die 1% (w/v) FBS (fetal bovine serum) enthielt, wobei für 1 Stunde bei Raumtemperatur leicht geschüttelt wurde. Dann wurde 5 mal unter leichtem Schütteln in TBST Pufferlösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur jeweils gewaschen. Jeder der Filter 45 wurde in eine 15ml Lösung gegeben, die durch Verdünnung eines biotinylierten-goat antihuman IgG und avidin konjugiert-alkalische Phosphatase (Pierce Inc., USA. Cat. Nos. 31770C, 21321C) auf den Wert 1:2000 mit einer TBS Pufferlösung, die 1% (w/v) FBS enthielt hergestellt worden war, wobei für eine Stunde bei Raumtemperatur leicht geschüttelt wurde. Und dann wurde unter leichtem Schwenken 5 x in 15ml TBST Pufferlösung für 5 Minuten bei Raumtemperarur gewaschen. Jeder der Rlter wurde dann auf einem so Whatman 3MM Filter getrocknet (blot-dried). Für die Färbereaktion wurde jeder der Rlter in 15ml einer Färbelösung (100mM Tris-HCL, pH 9,5, 100mM NaCI, 5mM MgCI2, 5mg Nitro-blue-tetrazolium, 2,5mg 5-Brom-4-chlor-3-indolyl phosphat) in einem dunklen Raum bei Raumtemperatur für 30 Minuten zur Reaktion gebracht. Die purpurfarbigen positiven Phageplaques wurden mit den Augen festgestellt, von denen erwartet werden konnte, daß sie die cDNA 55 ausdrücken, die ein rekombinantes HCV Antigen kodieren. Jeder der Rlter wurde mit einer TBS Pufferlösung einmal gewaschen. Eine Färbestopplösung (20mM Tris-HCI, pH 2,9, 1mM EDTA) wurde zugegeben, um den Färbeprozess zu stoppen. Jeder der Filter wurde bei Raumtemperatur getrocknet und dann mittels Polaroidfilm aufgezeichnet. 16

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Positive Plaques wurden isoliert und in 1ml einer phagenverdünnenden Lösung (10mM Tris-HCL, pH 7,5, 10mM MgCfe) für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der zuvor beschriebene Immunos-creeningassay wurde wiederholt, um die Klone einer einzelnen Phageplaque zu erhalten.

Jeder der Phageplaques, bei dem bestätigt werden konnte, daß er das rekombinante HCV Gen enthält, wurde in eine sterilisierte Microfuge-Röhre gegeben, die 500ul einer SM Pufferlösung (5,8g NaCI, 2,0g MgSO*. 50ul 1M Tris-HCI, pH 7,5, 5ml einer 2%igen Gelatine pro Liter) enthält 20ul Chloroform wurden zugegeben. Dann wurden die Inhalte der Röhrchen unter Schütteln für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur kultiviert. 200ul (> 1 x 105 Phagenpartikelchen) der so erhaltenen Lösung, 1ul Heifer-phagen R408 (> 1 x 106 PFU/ml, Stratagene Inc., USA) und 20ul E. coli XL-1 Zellsuspension (O.D.600 = 1,0) wurden miteinander vermischt und dann wurde die Mischung bei 37 *C für 15 Minuten inkubiert. Zu der resultierenden Kultur wurden 5ml 2 x YT Medium (10g NaCI, 10g Hefeextrakt, 16g Bacto-trytone pro Liter) hinzugefügt, wonach sie mit Schüttelm während 3 Stunden bei 37 · C kultiviert und dann auf 70 · C für 20 Minuten erhitzt wurde. Die resultierende Kultur wurde auf 1:100 verdünnt und 200ul der verdünnten Kultur wurden mit 200ul E. coli XL1-Blue cell (O.D.600 0 1,0) vermischt. Nach Inkubation bei 37 *C für 1 Stunde wurden 10Ou.1 der resultierenden Kultur auf LB Platten aufgetragen, die Ampicillin (50ug/ml) enthielten. Daraufhin wurde bei 37 *C für 10 Stunden inkubiert, um pBluescript-phagemid Kolonien zu erhalten, die doppelsträngige cDNA umfassen.

Um einzelsträngige DNA herzustellen, wurden die zuvor erhaltenen pBluescriptkolonien in einem LB Agar Medium inkubiert, welches das antibiotische Tetracycline (12,5ug/ml) enthielt, und durchsucht (scree-ned), um wieder die positiven Kolonien zu erhalten. Die positiven Einzelkolonien, die erhalten wurden, wurden in Tetracycline* LB broth Medium (2 bis 3ml) über Nacht inkubiert. Die Kultur wurde dann in 0,3ml eines super liquid Mediums (35g Bacto-tryptone, 20g Hefeextrakt, 5g NaCI, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH) inkubiert und unter Schütteln bei 37 *C kultiviert. Die Kultur wurde mit den Helferphagen R408 infiziert und die Kultivierung wurde für 8 Stunden durchgeführt, bis die O.D.600 den Wert 0,3 erreichte.

Bei der Durchführung der Infektion hängt das Verhältnis Phage:Zelle weitgehend von der Type der cDNA ab, die in pBluescript vorhanden ist, und kann 20:1, 10:1, 1:1 oder 1:10 betragen. Die einzelsträngi-gen DNAs wurden aus dem überschüssigen Teil der oben erhaltenen Kultur extrahiert.

Die Isolierung und Reinigung doppelsträngiger Phagemide und einzelsträngiger Phagemide wurde nach einer Methode durchgeführt, die von Sambrook, J. et al. in Molecular Cloning, 1, 2.73-2.81, Cold Spring Habor, N.Y. (1989) vorgeschlagen worden war.

Die Länge des in jedem Klon enthaltenen cDNA Fragmentes wurde festgestellt, indem das doppelsträngige Phagemid mittels Restriktionsendonuclease Eco RI und Xho I abgebaut wurde. 3 Klone mit cDNA Fragmenten verschiedener Länge wurden erhalten.

Die Nucleotidsequenzen der 3 rekombinanten cDNAs wurden bestimmt, wobei ein gereinigtes einzel-strängiges rekombinantes pBluescript Phagemid oder das doppelsträngege pBluescript-Phagemid als Matritze eingesetzt wurde und M13-20mer, Primer T7, Primer KS, Primer SK oder Prime T3 (Stratagene Inc., USA) in Übereinstimmung mit der Sanger'schen Methode (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5405 (1977)) verwendet wurde, wobei die sich ergebenden cDNA Fragmente die Namen KHCV 426, KHCV 652 und KHCV 403 erhalten haben (siehe Fig. 1 bis 3). 1-D: Durchsuchen der rekombinanten Phagen, die KHCV cDNA enthalten, wobei Oligonucleotidsonden verwendet werden, und Bestimmung der Nucleinsäuresequenz 1-D-1: Isolierung der cDNA Klone, die mit KHCV 652 überlappen

Um jene rekombinanten Phagen mit Gehalt an HCV cDNA zu durchsuchen, die nicht durch die oben stehende Immunoscreening Methode durchsucht worden waren wurde eine Plaque Hybridisierung nach einer Methode durchgeführt, die von Benton, W. D. et al., Science, 196, 180 (1977); Connor, B. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80. 278 (1983) und Jacob, K. et al., Nature, 313, 805 (1985) beschrieben wurde. Als Sonden wurden Oligonucleotide P652a (5'-TTCATACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACT-3') und P652b (5'-GCCATTCCAAGAAGAAGTGTGACGAACTCG-3') verwendet, deren Nucleotidsequenzen aus der Nucleo-tidsequenz des cDNA KHCV 652 ausgewählt wurde, die in Beispiel 1 -C bestimmt worden war.

Die cDNA Bibliotheklösung, die in Beispiel 1-B in einer Menge enthaltend 50.000 PFU hergestellt worden war, wurde aufgenommen und dann mit 600ul E. coli XL1-biue (verdünnt auf O.D.600 *0,5) vermischt, gemäß Herstellung in Beispiel 1-B-3 und weiters mit 0,7 NZY Agar vermischt. Die Mischung wurde auf eine 150mm NZY Platte gegossen und bei 37 *C für 12 Stunden inkubiert. Von insgesamt 30 Platten wurden 1,5 X 106 Phagenplaques erhalten. 17

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Danach wurden 137mm Durchmesser Nylonfilter jeweils sorgfältig auf die Platten aufgelegt, um die Plaques auf die Filter aufzutragen. Die Nylonfilter wurden dann entfernt und an Luft getrocknet.

Jeder der getrockneten Filter wurde für 1 bis 2 Minuten auf Whatman 3MM Papier gelegt, welches mit 0,2M Na OH/1,5m NaCI gesättigt war. Weiters wurden die Filter für 1 bis 2 Minuten auf Whatman 3MM 5 Papier gelegt, welches mit 0,4M Tris-HCI, pH 7,6 und 2 x SSC (SSC: 17,53g NaCI, 8,82g Natriumcitrat, pH 7,0 pro Liter) gesättigt war. Dann wurde in einem Vakuumofen bei 80 * C für 2 Stunden getrocknet.

Nach dem Trocknen wurden die Filter mit 500ml 3 x SSC/0,1% SDS Lösung bei Raumtemperatur 3 bis 4 x gewaschen. Mit der gleichen Lösung wurde bei 65 *C 2 Stunden lang gewaschen. Jeder der Filter wurde in 500ml Prehybridisierungslösung prehybridisiert (6 x SSC, 5X Denhardt Lösung (0,2g Ficoll, 0,2g io Polyvinylpyrrolidon, 0,2g BSA pro Liter), 0,05% Natriumpyrophosphat, 100wg/ml DNA aus gekochtem Heringsperma, 0,5% SDS) für 1 Stunde bei 37 *C. Die Filter wurden in eine Hydridisierungslösung (6 x SSC, Denhart Lösung, 100ug/ml Hefe tRNA, 0,05% Natriumpyrophosphat) gegeben und 30ng von jeweils P652a und P652b, markiert mit 32P, wurden zugegeben. Die Hybridisierungsreaktion wurde für 24 Stunden bei 48’C durchgeführt. 15 Die oben eingesetzten Sonden wurden wie folgt markiert. Zu einer Mischung von 32ng Sonde, 7,5ul 10 x T4 Kination-buffer-Lösung (0,5M Tris-HCI, pH 7,5, 0,1M MgCl2, 50mM DTT, 0,5mg/ml BSA), 10OM-Ci (gamma- 32P) ATP und 50 units T4 Nucleotidkinase wurde destilliertes Wasser auf ein Gesantvolumen von 75ul zugefügt. Die kination-Reaktion wurde für 30 Minuten bei 37 *C durchgeführt.

Nach Vervollständigung der Hybridisierung wurden die Filter 5x mit 6 x SSC/0,05% Natriumphosphatlö-20 sung für 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und noch einmal mit der gleichen Lösung für 30 Minuten bei 60"C. Das Waschen wurde weiterdurchgeführt, während die Temperatur um 2*C über 15 Minuten angehoben wurde, bis der Filter komplett ausgewaschen war, was mit einem Geigerzähler (Ludlum Model 13) überprüft wurde. Die gewaschenen Filter wurden auf einen Röntgenstrahlenfilm (Kodak X-Omat AR) für 24 bis 48 Stunden bei -70 * C gelegt. 25 Die Plaques, die sich als positiv bestätigten, wurden ausgetestet wie oben beschrieben, um die Plaques als Plaques einer einzigen Phage zu erhalten.

Von den so erhaltenen positiven Plaques wurden das doppelsträngige Phagemid und das einzelsträngi-ge Phagemid hergestellt und die Nucleotidsequenz wurde nach der gleichen Methode bestimmt, wie in Beispiel 1-C beschrieben. 30 Die cDNA Klone, die mit KHCV 652 überlappen, wurden als KHCV 752 und KHCV 675 bezeichnet. Ihre Länge, Stellung, Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz, die dadurch kodiert ist, sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-2: Isolierung der cDNA die mit KHCV 426 überlappt 35

Es wurden Oligonucleotide P426a (5’-ACGAGACCTCCCGGGGCACTCGCAAGCACC-3’) und P426b (5’-CGTAATTTGGGTAAGGTCATCGACACCCTC-3'), die auf Basis der Nucleotidsequenz der in beispiel 1-C erhaltenen KHCV 426 cDNA modelliert worden waren, synthetisiert. Unter Verwendung der Olgionucleotide P426a und P426b als Sonden wurde die Plaquehydridisierung in der gleichen Weise ausgeführt wie in 40 Beispiel 1-D-1. Der cDNA Klon, der mit KHCV 426 überlappt wurde auf die gleichen Methode aufgespürt wie in Beispiel 1-C beschrieben, und als KHCV 240 bezeichnet. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz sowie die darin kodierte Aminosäuresequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-3: Isolierung der cDNA, die mit KHCV 240 überlappt 45

Es wurde das Oligonucleotid P240b (5'-GTCCGGGTGCTGGAGGACGGCGTGAACTA-3'), welches auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 240 gemäß Beispiel 1-D-2 modelliert worden war, hergestellt, Unter Verwendung des Oligonucleotids P240b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die gleich Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der so erhaltene cDNA Klon, der etwa 110 Nucleotide so enthielt, die mit KHCV 240 überlappten wurde als KHCV 513 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 513 und die darin kodierte Aminosäuresequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-4: Isolierung der cDNA, die mit KHCV 513 überlappt

Es wurde das Oligonucleotid P513b (5'-CGCATGGCCTGGGATATGATGATGAACTGG3'), welches auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 513 gemäß Beispiel 1-D-3 modelliert worden war, hergestelit. Unter Verwendung des Oligonucleotids P513b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die 18 55

AT 405 053 B gleiche Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der cDNA Klon mit 810bp, der etwa 130bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 513 überlappten, wurde als KHCV 810 bezeichnet und die Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 810 und die darin kodierte Aminosäuresequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-5: Isolierung der cDNA, die mit KHCV 810 überlappt

Es wurde das Oligonucleotid P810b (5'-AAATGAGACGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3'), welches auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 810 gemäß Beispiel 1-D-4 modelliert worden war, hergestellt. Unter Verwendung des Oligonucleotids P810b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die gleiche Weise durhcsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der so erhaltene cDNA Klon, der etwa 65bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 810 überlappten, wurde als KHCV 798 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 798 und die darin kodierte Aminosäuresequenz des KHCV 798 sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-6: Isolierung der cDNA die mit KHCV 403 überlappt

Es wurden Oligonucleotide P403A (5'-GTGAAGAATTCGGGGGCCGGAACCTGGCAT-3') und P403B (5'-GCTGACCTCATTGAGGCCAACCTCTTGT-3'), welche auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 403 gemäß Beispiel 1-D-5 modelliert worden waren, hergestellt. Unter Verwendung der Oligonucleotide P403A und P403B als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die gleiche Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1.

Der so erhaltene cDNA Klon, der etwa 160bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 403 überlappten, wurde als KHCV 932 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 932 und die darin kodierte Aminosäuresequenz des KHCV 932 sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-7: Isolierung der cDNA, die mit KHCV 932 überlappt

Es wurde das Oligonucleotid P932b (5'-CCGGGACGTGCTTAAGGAGATGAAGGCGAA-3'), welches auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 932 gemäß Beispiel 1-D-6 modelliert worden war, hergestellt. Unter Verwendung des Oligonucleotides P932b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die gleiche Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der so erhaltene cDNA Klon, der etwa 185bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 932 überlappten, wurde als KHCV 496 bezeichnet. Deren Nucleotidesequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 496 und die darin kodierte Aminosäuresequenz des KHCV 496 sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-8: Isolierung der cDNA, die nit KHCV 496 überlappt

Es wurde das Oligonucleotid P496b (5-CGTGTATGCGAGAAGATGGCCCI I IATGAC-3'), welches auf Basis der Nucleotidsequenz der KHCV 496 gemäß Beispiel 1-D-7 modelliert worden war, hergestellt. Unter Verwendung des Oligonuceotides P496b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1 -B auf die gleiche Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der so erhaltene cDNA Klon von 847bp, der etwa 160bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 496 überlappten, wurde als KHCV 847 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt. Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 847 und die darin kodierte Aminosäuresequenz des KHCV 847 sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-D-9: Isolierung der cDNA, die mit KHCV 847 überlappt

Es wurde das Oligonucleotid P847b (5'-TGCGTGGGAGACAGCTAGACACACTCCAG-3’), welches auf Basis der Nucleotidsequenz am 3'-Ende des KHCV 847 gemäß Beispiel 1-D-8 modelliert worden war, hergestellt. Unter Verwendung des Oligonucleotides P847b als Sonde wurde die cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B auf die gleiche Weise durchsucht wie in Beispiel 1-D-1. Der so erhaltene cDNA Klon von 494bp, der etwa 94bp Nucleotide enthielt, die mit KHCV 847 überlappten, wurde als KHCV 494 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz wurde nach der Sanger'schen Methode bestimmt.

Die Länge, Stellung und Nucleotidsequenz des KHCV 494 und die darin kodierte Aminosäurensequenz des KHCV 494 sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 19

AT 405 053 B

1-E: Herstellung von cDNA mittels PCR 1-E-1: Herstellung der KHCV cDNA zwischen KHCV 798 und KHCV 752

Um die HCV cDNA zwischen dem 3'-Ende des KHCV 798 und 5'-Ende des KHCV 752 zu klonieren, wurden die Primer P798b (5'-CTGGTTCCCGGAGCGGCATAC-3'), ausgebildet auf Basis der Nucleotidse-quenz am 3'-Ende der KHCV 798, und P752a (5'-CCAGGTGATGACTTTGGTCTCCAT-3’), ausgebildet auf Basis der Nucleotidsequenz am 5-Ende des KHCV 752, synthetisiert. Unter Verwendung des Primers P798b und P752a und der cDNA Bibliothek gemäß Beispiel 1-B-1 und unter Verwendung des Primers von RANPSHCV, wurde die Polymerasekettenreaktion gemäß Referenzbeispiel 7 ausgeführt. Nach Vollendung der Reaktion wurde eine Menge der sich ergebenden Mischung 5% Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) unterworfen, um die Amplifizierung der cDNA zu bestätigen. Zur verbleibenden Mischung wurden 10 units eines Klenow Fragmentes hinzugefügt, eine DNA Polymerase. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten bei 37 *C inkubiert, um beide Enden stumpf zu machen. Die Reaktionsmischung wurde der PAGE unterworfen und die DNA wurde elektrisch eluiert, um die reine DNA zu isolieren. Das gereinigte DNA Fragment wurde in eine Phage-M13mp18 kloniert und dessen Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Die so erhaltene DNA wurde als KHCV 570 bezeichnet. Deren Nucleotidsequenz und die darin kodierte Aminosäurensequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt.

Das in Beispiel 1-D-2 hergestellte KHCV 240 und in Beispiel 1-D-3 hergestellte KHCV 513, in Beispiel 1-D-4 hergestellte KHCV 810, in Beispiel 1-D-5 hergestellte KHCV 798 und das zuvor beschriebene KHCV 570 überlappen einander teilweise. Somit wurden sie in einen langen offeinen Leseraster miteinander verbunden, der KHCV 2661 genannt wurde. 1-E-2: Herstellung der KHCV cDNA zwischen KHCV 403 und KHCV 675

Um das HCV cDNA Fragment zu kionieren, welches zwischen dem KHCV 403 gemäß Beispiel 1-C und dem KHCV 675 gemäß Beispiel 1-D-1 liegt, wurden die Primer P675b (5'-TCGATTCTTCGGTCCTGTGT-GAGTGT-3') und P675b2 (5'-AAAAAGAATTCGGATCCATGACGCGGGTTGTGCGTGGTAC-3') auf Basis der Nucleotidsequnez auf der Seite des 3'-Endes des KHCV 675 ausgebildet, und P403a2 (5’-CCCCCTCA-GAGTCGACTCACTTCACGTTGTCAGTGGTCAT-3'), ausgebildet auf Basis der Nucleotidsequenz auf des Seite des 5'-Endes der KHCV 403 synthetisiert. Unter Verwendung der Primer P675b, P675t>2 and P403a2, wie zuvor hergestellt, und P4Q3a gemäß Beispiel 1-D-6 wurde die PCR wie folgt durchgeführt.

Zue einer Mischung von 0,2ug P674b, 0,2ug von P403a, 2ul von cDNA gemäß Beispiel 1-B-1 unter Verwendung des Ramdom Primers RANPSHCV, 10ul 10 x PCR Pufferlösung, 10ul von 2mM dNTP's Mischung und 2,5 units der Taq Polymerase wurde destilliertes Wasser hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 100 ul einzustellen. Die Mischung wurde einer ersten PCR unterworfen, indem der folgende Zyklus 10x wiederholt wurde: 95* für 2 Minuten - 55* C für 2 Minuten - 72* C für 3 Minuten. Nach Zugabe von 2ug P675t>2 und 2ug P403a2 zur resultierenden Mischung, wurde die zweite PCR ausgeführt, indem der obige thermische Zyklus 20x wiederholt wurde.

Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Amplifizierung der cDNA bestätigt. Die Sequenz der cDNA wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1-E-1 bestimmt. Die so erhaltene cDNA wurde KHCV 1774 genannt und deren Nucleotidsequenz und die darin kodierte Aminosäurensequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. 1-E-3: Klonierung des 3'-Endbereiches der KHCV cDNA und Bestimmung der entsprechenden Nucleotidsequenz

Um die cDNA entsprechend der 3’-Endregion des HCV Genoms zu klonieren, wurde die PCR unter Verwendung der Primers RANPSHCV und DA17PSHCV (5'-TGGTGGTGGAACTGGACCGTA, ,3') wie folgt durchgeführt.

Der Primer PSHCVSL, 5'-AAAAGT CG ACT GGTGGT GG AACTGG ACCGT-3' enthält 21 fixe Nucleotide des Primers RANPSHCV oder DA17PSHCV des Beispiels 1-B-1 und eine Sal I Erkennungsstelle (5'-GTCGAC-3'). Demgegenüber enthält der KHCVR60 Primer 5'-GTGTCCGCGCTAAGCTACTGTCC-3', jene Nucleotide, die von der Nucleotidsequenz der 3'-Endregion der KHCV 494 gemäß Beispiel 1-D-9 vorgezeichnet ist. Unter Verwendung der Primers PSHCV und KHCVR60 wurde eine erste PCR auf gleiche Weise ausgeführt, wie in Referenzbeispiel 7.

In einer zweiten PCR wurde der Primer KHCVR61 (5'-TGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGG-3') synthetisiert. KHCVR61 besteht aus einer Sequenz komplementär zur Nucleotidsequenz der 3'-Endregion der 20

AT 405 053 B KHCV 494 und leigt näher zum 3'-Ende als KHCVR60. 10ul der KHCVR61 wurden der Mischung zugefügt, die der ersten PCR entstammte und dann wurde die zweite PCR nach dem gleichen Verfahren durchgeführt, wie in Referenzbeispiel 7.

Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Amplifizierung der cDNA bestätigt und deren Nucleo-tidsequenz wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1-E-1 bestimmt. Die so erhaltene cDNA mit 266 Nucleotiden wurde KHCV 266 genannt. Die Lage und Nucleotidsequenz der KHCV 266 und der darin kodierten Aminosäurensequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt. In der Nucleotidsequenz der KHCV 266 wurden 2 Terminatorkodons gefunden, obwohl ein Poly (A)+ tail nicht gefunden wurde. 1- E-4: Klonierung der 5'-Endregion der KHCV cDNA und Bestimmung der Nucleotidsequenz

Unter Verwendung des Primers KHCVL69 (5'-GTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTACG-3') ausgebildet auf Basis des Nucleotides an der 5'-endigen Seite der KHCV 426 gemäß Beispiel 1-C, wurde eine einzelsträngige cDNA in gleicher Weise hergestellt, wie in Beispiel 1-B-1. 50u.l der oben erhaltenen Mischung wurden mit 1ml TE Pufferlösung (10mM Tris-HCI, pH 7,5, 1mm EDTA) verdünnt. Die verdünnte Mischung wurde auf 10ul unter Verwendung eines Zentrikon 100 konzentriert (Amicon Inc., USA, # 4200), um die restlichen Primer und dNTPs zu entfernen.

Um eine Poly d(t) tailed cDNA oder Poly d(g) tailed cDNA herzustellen, wurden 10ul des so erhaltenen cDNA Lösung 4ul einer 5 x tailing Pufferlösung (0,5M Kaliumkakodylate, pH 7,2, 10mM C0CI2, imM DTT), 4ul 1mM dTTP (oder 4ul 1mM dGTP) und 10 units der terminalen Deoxynucleotidtransferase (BRL Inc., USA, # 80085B) hinzugefügt. Destilliertes Wasser wurde zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50ul einzustellen. Die Reaktionsmischung wurde für 30 Minuten bei 37 *C stehengelassen und dann auf 65* für 5 Minuten erhitzt.

Die so erhaltene Poly d(T)+ tailed cDNA (oder die Poly d(G) tailed cDNA) wurde mittels PCR unter Verwendung der Primers KHCVL70 (5'-TTGAGGi 1 1AGGATTCGTGCTCAT-3’) (oder dCl2R1RO; 5'-AAGG ATCCGTCG ACATCGATAATACG ACTCACTAGGGA(C)i 2 -3'), dH 7R1RP (5'- AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA(T)i7-3'),RO (5'-AAGGATCCGTCGACATC-3') und R1 (5'-GACATCGATAATACGACTCAC-3') erhalten aus der Nucleotidsequenz der KHCV 426 gemäß Beispiel 1-C mittels PCR amplifiziert.

Zu 2u.l der cDNA Lösung wurden 5ul 10 x Taq Polymerase Pufferlösung (100mM Tris-HCI, pH 8,3, 500mM KCl, 15mM MgCfe, 0,1% Gelatin) 5ul einer 1,5mM dNTPS Mischung, 2,2ug KHCVL69 und 2,0ug dTl7R1RO hinzugefügt. Destilliertes Wasser wurde zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50ul einzustellen. Die Mischung wurden auf 95 *C für 7 Minuten erhitzt und dann auf 75 *C abgekühlt. 2,5 unts der Taq DNA Polymerase wurden zugegeben. 30ul Mineralöl wurden dann zugegeben, um die Verdampfung zu verhindern. Die Reaktionsmischung wurde auf 45* C für 2 Minuten gekühlt, um es den Primers zu gestatten, die einzelsträngige cDNA komplementär zu binden, und dann wurde die Reaktion bei 72 *C für 22 Minuten weitergeführt. Eine erste PCR wurde durchgeführt, indem 30x der folgende Zyklus wiederholt wurde: 95 * C für 45 Sekunden - 50 *C für 25 Sedunden - 72* C für 2 Minuten; und endlich bei 72 ’C für 15 Minuten. 2ug des Primers RO (oder R1) und 2ug KHCVL70 wurden zu 10ul der Mischung gegeben, die sich aus dem Obenstehenden ergab. Eine zweite PCR wurde ausgeführt, indem 30x der gleiche Zyklus wie zuvor wiederholt wurde. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Amplifizierung der cDNA, die 380bp aufwies, bestätigt und deren Nucleotidsequenz wurde auf gleiche Weise bestimmt, wie in Beispiel 1-E-1. Der so erhaltene cDNA Klon wurde KHCV 366 genannt und die Lage und Nucleotidsequenz der KHCV 366 und der darin kodierten Aminosäurensequenz sind in den Fig. 1 bis 3 dargestellt.

Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen KHCV cDNA Klone, verbunden zu einer KHCV cDNA mit voller Länge mit 9372 Nucleotiden, wobei die cDNA mit voller Länge genannt wurde KHCV-LBC1, wurde bei der ATCC am 14. Mai 1991 umter der Zugriffsnummer 75008 hinterlegt.

Beispiel 2: Herstellung der HCV Subtype cDNA

2- A: Extraktion der RNA

Zu 100ul jeden Serums, gesammelt von 13 koereanischen Hepatitis C Patienten (Proben #2, #3, #20, #21, #23, #25, #26, #27, #28, #29, #30, #31 und #32) wurden 300/xl eines die Zellerände aufbrechenden Mittels mit der Bezeichnung RNAzol B (Cinna/Biotecx, P.O. Box 1421, Friendwood, Texas, USA) hinzugefügt. Dann wurden die KHCV RNAs auf gleiche Weise extrahiert, wie in Beispiel 1-A. Die aus diesen 13 Proben extrahierten KHCV RNAs erhielten die Namen LBC2, LBC3, LBC20, LBC21, LBC23, LBC25, LBC26, LBC27, LBC28, LBC29, LBC30, LBC31 und LBC32. 21

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2-B: Herstellung der cDNA

Unter Verwendung der HCV RNAs gemäß Beispiel 2-A als Masken und Random Primers (5'-NNNNNN-3', wobei Ns gleich oder vershieden sein und G, A, T oder C mit dem gleichen Verhältnis sein können) als Primer für die reverse Transcriptase, wurden die HCV cDNAs in der gleichen Weise hergestellt, wie in Beispiel 1-B-1. Die so erhaltenen cDNAs wurden wie folgt bezeichnet: KHCV-LBC2 cDNA, KHCV-LBC3 cDNA, KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA und KHCV-LBC32 cDNA.

2-C: Amplifizierung der KHCV cDNA mittels PCR 2-C-1: Design der Primer

Die Primer für die Amplifizierung der NS2 und NS5 Regionen der HCV cDNAs wurden nach den Gebieten ausgebildet, die relativ allgemein in den Nucleotidsequenzen des japanischen Typs vorhanden sind, über den Kato et al-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 9524-9528 (1990) und Takamizawa et al., J. Virol., 65, 1105-1113 (1991) berichtete. Weiters vom amerikanischen Typ, berichtet in Choo et al., Sicence, 244, 359-363 (1989) und von der KHCV-LBC1 gemäß Beispiel 1. Die Stellungen der Nucleotidsequenzen, die zuvor hergestellt worden waren, wurden auf Basis der Nucleotidsequenzen der KHCV-LBC1 nummeriert.

Primer für die Amplifizierung der NS2 Region der HCV cDNA NS2S1 (5'-CGGGAGATGGCCGCATCGTG-3’) korrespondierte mit dem Strang des Fragmentes vom 2776igsten bis zum 2795igsten Nucleotid in KHCV-LBC1. NS2N1 (5'-ACCT GCTAGTGCGGCC AGCTT CAT -3') korrespondierte mit dem komplementären Strang des Fragmentes vom 3180igsten bis zum 3157igsten Nucleotid der KHCV-LBC1, der dazu verwendet wurde, die erste PCR für die Amplifizierung der NS2 Region der HCV cDNA auszuführen. NS2S2 (5'-1 I Π GGATCCGCGG ι ι l l l GTAGGTCTGGT-3’) korrespondierte mit dem Strang des Fragmentes von dem 2803 zum 2822 Nucleotid im KHCV-LBC1, der eine BamH I Erkennungsstelle für die Angemessenheit der Klonierung aufwies. Und NS2N2 (5'-AAAGTCGACATGAA-GACCATTTGGAC-3') korrespondierte mit dem komplementären Strang vom 3159igsten bis zum 3142igsten Nucleotid im KHCV-LBC1, der eine Sal I Erkennungsstelle bei seinem 5'-Ende für die Angemessenheit der Klonierung aufwies. NS2S2 und NSS2N2 wurden für das Durchführen der zweiten PCR verwendet.

Primer für die Amplifizierung der NS5 Region der HCV cDNA NS5S1 (5'-ATGGGGATCCATATGACACCCGCTG(T/C)TTTGA-3\ worin T/C Thymin und Cytosin bedeutet, gemischt im Verhältnis 1:1) die Nucleotidsequenz vom 10 Nucleotid (gezählt vom 5'-Ende der NS5S1) bis zum 3'-Ende, korrespondierte mit der Nucleotidsequenz des Fragmentes vom 8252igsten bis zum 8273igsten Nucleotid in KHCV-LBC1. Im NS5N1 (5'-CCCCGTCGACCTAGTCATAGCCTCCGTGAA-3') korrespondierte die Nucleotidsequenz vom 9 Nucleotid zum 3'-Ende mit dem Komplementärstrang des Fragmentes vom 8635igsten bis zum 8614 Nucleotid im KHCV-LBC1. Der Primer NS5N1 wurde dazu verwendet, eine erste PCR für die Amplifizierung der NS5 Region durchzuführen.

In NS5S2 (5'-TTTGAGGATCCACGGTCACTGAGAA(T/C)GACAT-3\ wobei T/C die gleiche Bedeutung wie oben hatte), korrespondierte die Nucleotidsequenz vom 12 Nucleotid bis zum 3'-Ende mit dem Strang des Fragmentes vom 8278igsten bis zum 8297igsten Nucleotid im KHCV-LBC1, und NS5S2 hatte eine BamH I Erkennungsstelle am 5’-Ende. Der Primer NS5S2 wurde beim Ausführen der zweiten PCR werwendet.

Die obigen Primer wurden synthetisiert, indem DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Model 380 B, USA) verwendet wurden, bei dem automized solid phase phosphoamidite Chemistry Verwendung fand. Die synthetisierten Primer wurden mittels Elektrophoresis isoliert, wobei denaturierendes Polyacrylamidgel Verwendung fand (2M Harnstoff, 12% Acrylamid und bis-Acrylamid (29:1, w/w) in 50mM Tris, 50mM Borsäure, 1mM EDTA-Na2), und gereinigt wurde durch C18 Chromatographiersäulen, (SE-PAK; WATERS INC., USA), wobei eine Mischung aus Acetonitril-Wasser (50:50, v/v) als Eluationsmittel verwendet wurde. Die Konzentration jedes Primers wurde durch einen O.D. Wert bei 260nm bestimmt. 22

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2-C-2: PCR für die Amplifizierung der NS2 Region von KHCV cDNA

Eine erste PCR wurde wie folgt durchgeführt. Zu 5ul jeder KHCV-LBC2 cDNA, KHCV-LBC3 cDNA, KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA, KHCV-LBC32 cDNA, hergestellt in Beispiel 2-B, wurden 10uI 10 x Taq Polymerase Pufferlösung (10mM Tris-HCI, pH 8,3, 500mM HCl, 15mM MgCfe, 0,1% (w/v) Gelatine), 10ul einer 2mM dNTP's Mischung, 0,2ug NS2S1, 0,2ug NS2N1 und 0,5ul AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin elmer-Cetus, USA) zugegeben. Destilliertes Wasser wurde hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 100ul einzustellen. Zu jeder dieser Lösungen wurden 50ul Mineralöl zugegeben, um die Verdampfung zu vermeiden. Die erste PCR wurde ausgeführt, indem der folgende Termozyklus 40x wiederholt wurde: 95 *C für 2 Minuten - 55 *C für 2 Minuten - 72· C für 3 Minuten. Die zweite PCR wurde ausgeführt, indem 1ml des ersten PCR Produktes und 2ug des NS2S2/NS2N2 Primer sets verwendet und 25x wiederholt wurde.

Jede der resultierenden Mischungen wurde mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform gemischt und dann zentrifugiert, um die übrigen Enzyme zu entfernen. Zu jedem der Rückstände wurden 0,1 Volumen 3M Natriumacetat und das 2,5fache Volumen absoluten Ethanols hinzugefügt. Die resulteriende Mischung wurde dann zentrifugiert, wobei 340bp einer doppelsträngigen DNA Vorlagen.

Die DNA Fragmente von den 13 verschiedenen Masken wurden folgendermaßen genannt: NS2-LBC2, NS2-LBC3, NS2-LBC20, NS2-LBC21, NS2-LBC23, NS2-LBC25, NS2-LBC26, NS2-LBC27, NS2-LBC28, NS2-LBC29, NS2-LBC30, NS2-LBC31 und NS2-LBC32.

2- C-3: PCR für die Amplifizierung der NS5 Region der HCV cDNA

Die Primer NS5S1 und NS5N1 wurden verwendet, um eine ersts PCR auszuführen und die Primer NS5S2 und NS5N1 fanden für die Durchführung einer zweiten PCR auf die gleiche Weise Verwendung, wie in Beispiel 2-C-2, um 320bp der DNA Segmente zu erhalten.

Die resultierenden DNA Fragmente, amplifiziert von KHCV-LBC20 cDNA, KHCV-LBC21 cDNA, KHCV-LBC23 cDNA, KHCV-LBC25 cDNA, KHCV-LBC26 cDNA, KHCV-LBC27 cDNA, KHCV-LBC28 cDNA, KHCV-LBC29 cDNA, KHCV-LBC30 cDNA, KHCV-LBC31 cDNA, KHCV-LBC32 cDNA wurden wie folgt genannt: NS5-LBC20, NS5-LBC21, NS5-LBC23, NS5-LBC25, NS5-LBC27, NS5-LBC28, NS5-LBC29, NS5-LBC30, NS5-LBC31 und NS5-LBC32.

Jedes der Fragmente wurde mit Sal I und BamH I abgebaut. Die abgebauten Fragmente wurden in M13mp19 kloniert. Deren Nucleotidsequenzen wurden unter Verwendung der Sanger'schen Methode bestimmt. Jede der Nucleotidsequenzen ist in den Fig. 7 bis 26 dargestellt.

Beispiel 3: Herstellung des Vektors für die Expression des KHCV cDNA Fragmentes in Hefe 3- A: Amplifizierung der KHCV cDNA Fragmente 3-A-1: Herstellung der Fragmente K384, K510, K573, K897, K403, und K590 <Stufe 1>

Um an jedes der KHCV cDNA Fragmente, die in den Beispielen 1-C, 1-D und 1-E geklont worden waren, ein ubiquitines Gen anzuhängen (im folgenden werden die Gene, hergestellt durch Anhängen oder Verbinden des ubiquitinen Gens an die KHCV cDNA Fragmente als UB-KHCV bezeichnet) und um das UB-KHCV in einen Expressionsvektor für Hefen zu klonieren, wurden die folgenden Primers synthetisiert.

Primer PCOREUBI (5’-CTT GGT GTT GAG ACT CCGCGGT GGTAT G AGC ACG AAT CCT AAACC-3') enhält 25 Nucleotide in der 5'-Endregion, überlappend mit der 3'-Endregion des Ubiquitingens und die anderen Nucleotide korrespondieren mit der Region vom 343igsten bis zum 360igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer PSALCORE14 (5'-GGGGTCG ACT ATT AGCAT GT G AGGGT GT GG AT G AC-3') enthält ein stop codon, um die Translation genau nach dem 726igsten Nucleotid zu stoppen, und eine Erkennungsstelle von Sal I.

Der Primer PSALCOREI17 (5'-GGGGTCGACTATTAGGGCAGATTCCCTGTTGCATA-3') enthält ein stop codon zur Beendignung der Translation direkt nach dem 852igsten Nucleotid und eine Erkennungsstelle von Sal I.

Der Primer PSALCORE22 (5’-GGGGTCGACTATTAAGCGGAACTGGGGATGGTCAA-3') enthält ein stop codon für das Stoppen der Translation direkt nach dem 915 Nucleotid und eine Erkennungsstelle von Sal I. 23

AT 405 053 B

Der Primer PK403UBI (5’-CTT GGTGTT GAG ACT CCGGT GGT ACGGGC ATG ACC ACT G ACAA-3’) enthält 25 Nucleotide an der 5’-Endregion, die die gleiche ist wie jene von PCOREBUI. Die anderen Nucleotide sind dafür bestimmt, die Translation vom 6649igsten Nucleotid der KHCV-LBC1 einzuleiten.

Der Primer PK573UBI (5’-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTACATGGACAGGCGCCCTGA-3') enthält 25 Nucleotide in der 5'-Endregion, die gleich ist mit jener der POOREUBI. Die anderen Nucleotide sind dafür bestimmt, die Translation vom 7612 Nucleotid der KHCV-LBC1 einzuleiten.

Der Primer PK403SAL (5’-GACTGGTCGACTATTACTCTTGCCGCCACAAGAGGTT-3') ist dafür bestimmt, die Translation direkt nach dem 7050igsten Nucleotid der KHCV-LBC1 zu stoppen und besitzt eine Erkennungsstelle des Sal I und 2 stop codons (TAATAG).

Der Primer PK897UBI (5’-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG-3') enthält 25 Nucleotide in der 5'-Endregion, die gleich ist mit jener des PCOREUBI und die anderen Nucleotide sind dazu ansgebildet, die Translation vom 3916 Nucleotid des KHCV-LBC1 einzuleiten.

Der Primer PK897SAL (5'-G ACT GGT CG ACT ATT AACACGT ATT AC AGT CG AT C AC-3') ist dazu bestimmt, die Translation direkt nach dem 4713. Nucleotid der KHCV-LBC1 zu stoppen und weist eine Erkennungsstelle des Sal I und 2 stop codons (TAATAG) auf.

Der Primer PK573SAL (5’-GACTGGTCGACTATTAGTACTGGAATCCGTATGAGGAG-3') ist dazu ausgebildet, die Translation direkt nach dem 8184igsten Nucleotid der KHCV-LBC1 zu stoppen und weist eine Erkennungsstelle von Sal I und 2 stop codons (TAATAG) an der 3'-Endstelle auf.

Der Primer P426B (5’-GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG-3') besteht aus der Region vom 616 bis zum 636igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer P240B (5'-CCTGTTGCATAGTTCACGCCGT-3') besteht aus der Region vom 842igsten bis zum 821igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer P652B (5'-GTCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCTGCAAAG-3') besteht aus der Region vom 4523igsten bis zum 4560igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer P403B (5’-GCTGACCTCATTGAGGCCAACCTCTTGT-3') besteht aus der Region vom 7012. bis zum 7039igsten Nucleotid der KHCV-LBC1. < Stufe 2>

Ein einzelnes cDNA Fragment wurde aus 3 Klonen hergeteilt, nämlich aus KHCV426. KHCV240 und KHCV513, die einander überlappen, wie folgt. Zu einer Mischung von 2,0ug PCOREUBI, 0,02ug P426B, 2ug P240B und 50ng KHCV-LBC1 NA wurden 10ul 10 x Taq Polymerase-Pufferlösung, 10ul 10mM dNTP's Mischung und 2,5 units der Taq Polymerase zugegeben. Destilliertes Wasser wurde hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 100ul einzustellen. Eine erste PCR wurde dann durchgeführt, indem 25x der thermische Zyklus des Referenzbeispieles 7 wiederholt wurde. Die resultierende Mischung wurde einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, um 500bp des PCR Produktes zu isolieren (im folgenden als PCR Produkt A bezeichnet). Danach wurde unter Verwendung von 50ng des PCR Produktes A und 50ng der KHCV-LBC1 DNA als Matritzen und 2ug PCOREUBI und 2ug PSALCORE22 als Primer eine zweite PCR durchgeführt, wobei die gleichen Bedingungen herrschten wie bei der ersten PCR. Die resultierende Mischung wurde einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, um 580bp des Endproduktes zu isolieren (im folgenden als PCR Produkt B bezeichnet), welches sodann in 50ul der TE Pufferlösung gelöst wurde. < Stufe 3>

Um weitere PCRs durchzuführen, bei denen das PCR Produkt B gemäß Stufe 2 als Matritze verwendet wurden, wurden 3 verschiedene Teströhrchen vorbereitet, nämlich Röhrchen A enthaltend 2ug PCOREUBI und 2ug PSALCORE14, Röhrchen B enthaltend 2ug PCOREUBI und 2ug PSALCORE17 und Röhrchen C enthaltend 2ug PCOREUBI und 2ug PSALCORE22, die zusätzlich zu 50ng des PCR Produktes B zu jedem der Röhrchen hinzugefügt wurden.

Andererseits wurden für PCRs, bei denen KHCV-LBC1 DNA als Matritze verwendet wurden, 3 andere verschiedene Teströhrchen vorbereitet, nämlich Röhrchen D enthaltend 2ug PK897SAL, 0,02ug P652B und 2ug PK897UBI, Röhrchen E enthaltend 2ug PK403SAL und 2ug PK403UBI und Röhrchen F enthaltend 2ug PK573SAL und 0,022ng P403Bb und 2ug PK573UBI, zu denen jeweils 50ng des KHCV-LBC1 zugefügt wurden.

Danach wurden zujedem der Röhrchen A bis F lOu.1 10 x Taq Polymerase-Pufferlösung, 10ul 10mM dNTP's Mischung und 25 units der Taq Polymerase zugegeben. Destilliertes Wasser wurde aut ein Gesamtvolumen von jeweils 100U.I hinzugefügt. Die PCRs wurden unter den gleichen Bedingungen 24

AT 405 053 B durchgeführt, wie in Stufe 2. < Stufe 4>

Die in Stufe 3 erhaltenen PCR Produkte wurden einer 5% Polyacrylamidgelelektrophoreseunterworfen. Als Resultat wurde bestätigt, daß 384bp der DNA Fragment in Röhrchen A hergesteilt wurde, 510bp der DNA in Röhrchen B, 573bp der DNA in Röhrchen C, 798bp der DNA in Röhrchen D, 402bp der DNA in Röhrchen E und 573bp der DNA in Röhrchen F amplifiziert wurden. Die DNA Fragmente wurden mittels der gleichen Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt wie zuvor. Die erhielten die Namen Fragment K384, Fragment K510, Fragment K573, Fragment K897, Fragment K403 und Fragment K590. 3-A-2: Herstellung des cDNA Fragmentes, welches das KHCV Hüllprotein kodiert <Stufe 1>

Um das synthetisierte ubiquitine Gen mit jedem der E 2N Gene und E 2C Gene, die mit der Region vom 1510 bis zum 2010 Nucleotid und der Region vom 2011 bis 2529igsten Nucleotid der KHCV-LBC1 korrespondiert, zu verbinden, und um jedes zu einem Expressionsvektor von Hefen zu klonieren, wurden die folgenden Primer synthetisiert.

Der Primer PE2NUBI (5’-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT-3') enthält 25 Nucleotide in der 5’-Endregion, die mit der 3'-Endregion des ubiquitinen Gens überlappt. Die anderen Nucleotide entsprechen der Region vom 1510 bis zum I530igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer PE2NSAL (5’-G ACT GG ACT ATT AATTC ATCCAGGT ACAACCGAACCA-3') enthält ein stop codon, um die Translation direkt nach dem 2010 Nucleotid der KHCV-LBC1 zu stoppen, und eine Erkennungsstelle der Sal I.

Der Primer PE2CUBI (5'-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA-3') enthält 25 Nucleotide in der 5'-Region, die Mit den 25 Nucleotiden der 3'-Endregion des Ubiquitingens überlappen. Die anderen Nucleotide entsprechen der Region vom 2011 bis zum 2031 igsten Nucleotid der KHCV-LBC1.

Der Primer PE2CSAL (5'-GACTGGACTATTACGCGTCCGCCAGAAGAAGGAAGAG-3') enthält ein stop codon, um die Translation direkt nach dem 2529igsten Nucleotid des KHCV-LBC1 zu stoppen, und eine Erkennungsstelle der Sal I. <Stuffe 2>

Das Röhrchen A wurde mit je 2ug PE2NUBI und PE2NSAL und das Röhrchen B jeweils mit 2ug PE2CUBI und PE2CSAL versehen. Zu jedem der Röhrchen A und B wurden 50ug KHCV-LBC1, 10ul 10 x Polymerase Pufferlösung, 10ul 10mM dNTP's Mischung und 2,5 units Taq Polymerase zugegeben. Destilliertes Wasser wurde hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 100ml einzustellen. Die PCRs wurden durchgeführt, indem 15x der gleich thermische Zyklus durchgeführt wurde, wie in Referenzbeispiel 7. < Stufe 3>

Die in Stufe 2 erhaltenen PCR Produkt wurden einer 5% Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Als Resltat wurde bestätigt, daß 501 bp der DNA in Röhrchen A und 5l9bp der DNA in Röhrchen B amplifiziert worden waren. Die DNAs wurden durch die gleich Polyacrylamidgelelektrophorese wie zuvor gereinigt und als Segment E2N und E2C bezeichnet. 3-B: Herstellung des Expressionsvektors für Hefe 3-B-1: Herstellung von pYLBC-A/G-UB-CORE14, pULBC-A/G-UB-CORE17, pYLBC-A/G-UB-CORE22, PYLBC-A/G-UB-KHCV897, pYLBC-A/G-UB-KHCV403 und pYLBC-A/G-UB-KHCV573 2ug des Plamides pYLBC-A/G-UB-HGH (ATCC74071) wurden mit Pst I und Sal I in NEB Pufferlösung 3 komplett abgebaut, während 2ug des gleichen Plasmides mit Pstl und Sac II in NEB Pufferlösung 4 komplett abgebaut wurden, auf die in Referenzbeispiel 1 hingewiesen ist. Die resultierenden Mischungen wurden einer 0,7% Agarosegelelektrophorese unterworfen, um ein 9,8kb Fragment und ein 3,4kb Fragment zu isolieren, welches Fragment PL2 und PT2 genannt wurden. 25

AT 405 053 B

Unter den Fragmenten der K384, K510, K573, K987, K403 und K590, die in Beispiel 3-A-1 hergestellt worden waren, wurden die Fragmente K897, K403 und K590 mit Sal I und Sac II in einer NEB Pufferlösung 3 vollständig abgebaut. Die Fragmente K384, K510 und K573 wurden mit Sal I in NEB Pufferlösung 3 vollständig abgebaut. Die Produkte wurden mit Phenol/Chioroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Auflösung erfolgte mit 20ul TE Pufferlösung. Die Fragmente K384, K510 und K573 wurden weiters partiell abgebaut mit Sac II in NBE Pufferlösung 4 für 10 Minuten. Die Produkte wurden mit Phenol/Chioroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Mit 20u.l TE Pufferlösung wurden die Produkte aufgelöst.

Die obigen Fragmente wurden wie folgt zur Ligation verwendet. Das Ligationsröhrchen A wurde mit 100ng des Fragmentes K384 versehen. Das Ligationsröhrchen B wurde mit 100ng des Fragmentes K510 versehen. Das Ligationsröhrchen C wurde mit 100ng des Fragmentes K573 versehen. Das Ligationsröhrchen D wurde mit 100ng des Fragmentes K897 versehen. Das Ligationsröhrchen E wurde mit 100ng des Fragmentes K403 und das Ligationsröhrchen F mit 100ng des Fragmentes K573 versehen. Zu jedem der Röhrchen wurden 100ng des Fragmentes PL2, lOOng des Fragmentes PT2, 2ul 10 x Ligationspufferlösung und 10 units der T4 DNA Ligase zugegeben. Mit destilliertem Wasser wurde ein Gesamtvolumen von 20ul eingestellt. Die Ligation wurde für 12 Stunden bei 16 *C durchgeführt. E. coli HB101 (ATCC 33694) wurde jeweils mit jedem der ligierten Vektoren transformiert.

Der das K384 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-CORE14 genannt. Der das K510 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-CORE17genannt. Der das K573 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-CORE22 genannt. Der das K897 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-KHCV897 genannt. Der das K403 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-KHCV403 genannt. Und der das K590 enthaltende Vektor wurde isoliert und pYLBC-A/G-UB-KHCV573 genannt (siehe Fig. 30).

3-B-2: Herstellung von pYLBC-A/G-UB-E2N und pYLBC-A/G-UB-E2C 2ug des Plasmides pYLBC-A/G-UB-HGH (ATCC 74071) wurden mit Pst I und Sal I in NEB Pufferlösung 3 komplett abgebaut und 2ug des gleichen Plasmides wurden mit Pst I Sac II in NEB Pufferlösung 4 vollständig abgebaut. Die resultierenden Mischungen wurden einer 0,7% Agarosegeleledtrophorese unterworfen, um 9,8kb und 3,4kb Fragmente zu erhalten, die Fragment PL2 und Fragment PT2 genannt wurden.

Jedes der Fragmente E2N und E2C gemäß Beispiel 3-A-2 wurde vollständig mit Sac II in NEB Pufferlösung 4 und weiters partiell mit Sal I in NEB Pufferlösung 3 abgebaut (digested). Jedes der Produkte wurde mit Phenol/Chioroform abgebaut und mit Ethanol gefällt. Mit 20ul einer TE Pufferlösung wurde aufgelöst. Die Fragmente erhielten die Namen Fragment E2N-T2/L und Fragment E2C-T2/L.

Das Ligationsröhrchen G wurde mit lOOng der E2N-T2/L und das Ligationsröhrchen F mit 100ng der E2C-T2/L versehen. Zu jenem der Röhrchen wurden 100ng PL2, 100ng PT2, 2ul 10 x Ligationspufferlösung und 10 units der T4 DNA Ligase hinzugefügt. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolumen auf 20ul eingestellt. Die Reaktion wurde für 12 Stunden bei 16 *C ausgeführt E. coli HB101 (ATCC 33694) wurde mit jedem der Ligationsvektoren transformiert. Der das Fragment E2N-T2/L enthaltende Vektor erhielt den Namen pYLBC-A/G-UB-E2N und der das Fragment E2C-T2/L enthaltende Vektor wurde pYLBC-A/G-UB-E2C genannt (siehe Fig. 30). 3-C: Transformation der Hefe und Proteinherstellung

Die Hefen wurden mit den in Beispiel 3-B-2 hergestellten Expressionsvektoren transformiert, und zwar nach der gleichen Methode wie in Referenzbeispiel 5. Von den transformierten Hefen wurde die mit pYLBC-A/G-UB-KHCV403 transformierte Saccharomyces cerevisiae DC 04 (S. cerevisiae pYLBC-A/G-UB-KHCV 403) unter der Zugriffsnummer ATCC 74079 am 27. Juni 1991 hinterlegt. Die mit pYLBC-A/G-UB-COREl4 transformierte Saccharomyces cerevisiae DC 04 (S. cerevisiae DC 04-UB-CORE 14) wurde unter der Zugriffsnummer ATCC 74081 am 1. Juli 1991 hinterlegt. Und die Saccharomyces cerevisiae DC 04, transformiert mit pYLBC-A/G-UB-E2C (S. cerevisiae DC 04-UB-E2C) wurde unter der Zugriffsnummer TCC 74117 am 11. Dezember 1991 bei der American Type Culture Collection unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck der Patenterteilung hinterlegt.

Neben den transformierten Hefen wurde Saccharomyces cervisiae DC 04-UB-KHCV403 in 3ml eines leucin-defizienten Mediums (6,7g der HefeNitrogenbase ohne Aminosäuren (Difco Inc., USA), 2,5g Aminosäuremischung ohne Leucin pro Liter und 5% Glusose) bei 30’C über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde in 100ml YEPD Medium transferiert (2% Pepton, 1% Hefeextrakte, 2% Glucose) und bei 30 *C über Nacht kultiviert, um das KHCV Protein herzustellen. Die resultierende Kultur hatte einen O.D. Wert bei 650nm von 26

AT 405 053 B etwa 25. Die anderen transformierten Hefen wurden auf gleiche Weise kultiviert, um die KHCV Proteine zu erzeugen.

Jede der Kulturen wurde geerntet, wobei die Menge einem O.D. 650 Wert von 10 entsprach, und zentrifugiert. Jeder der Niederschläge wurde in 400ul einer Pufferlösung (10mM Tris-HCI, pH 7,5, ImM EDTA, 2mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl-fluoride), 8M Harnstoff suspendiert. Dann wurden mit dem gleichen Volumen Glaskugeln (Durchmesser 0,4mm) stark geschüttelt, um die Zellwände zu zerstören. Die so erhaltenen Hefeextrakte wurden mit 15% Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) behandelt, wobei die Laemmlis Methode angewandt wurde (Laemmli et a., Nature, 277, 680 (1970)). Das Gel wurde mit Coomassie brilliant blue R250 gefärbt, um die Bildung des KHCV Proteins zu betätigen (siehe Fig. 31-A).

Die im Gel getrennten Proteine wurden auf einen Nitrozellulosefilter aufgetragen. Der Filter wurde in PBS (10mM Phosphat, pH 7,0, 0,15 M NaCI) mit einem Gehalt an 0,2% Tween 20 gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, um die nicht spezifische Bindung von IgG an die Proteine zu blockieren. Der Filter wurde in eine IgG Lösung gegeben, die durch Verdünnen von IgG (8,2mg/ml), affinitätsgereinigt von koreanischen HCV Patienten, mit dem 200fachen Volumen von PBS verdünnt hergestellt worden war, welches 0,5% Gelatine und 0,05% Tween 20 enthielt. Dann wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur leicht geschüttelt, um das Protein und das IgG reagieren zu lassen. Der Filter wurde dann mit PBS enthaltend 0,2% Tween 20 für 5 Minuten gewaschen und dies 4x. Der Filter wurde in eine antihuman IgG Lösung gegeben, die durch Verdünnen von anti-human IgG-HRP, markiert mit horseradish-Peroxidase (Bio-Rad Lab., USA, goat anti-human IgG-HRP) mit dem 200 fachen Volumen PBS, enthaltend 0,5% Gelatin und 0,05% Tween 20, verdünnt wurde und für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Der Filter wurde mit PBS enthaltend 0,2% Tween 20 für 5 Minuten 4x gewaschen und mit 50mM Tris Pufferlösung (pH 7,0) wurde 2x gewaschen.

Zu dem Filter wurden 50mM Tris Pufferlösung mit einem Gehalt von 400ug/ml 4-chlor-l-naphthol und 0,03% Hydrogenperoxid gegeben, um eine Farbreaktion zu entwickeln. Die Ergebnisse der obigen Western Blotting Reaktion sind in Fig. 31-B gezeigt. In Fig. 31-B zeigt die Strecke 2 das Resultat des Extraktes der Hefe, die mit pYLBC-A/G-UB-CORE 14 transformiert war. Die Stecke 3 zeigt das Ergebnis der Extrakte der Hefe, transformiert mit pYLBC-A/G-UB-KHCV 897. Die Strecke 5 zeigt das Resultat der Extrakte der mit pYLBC-A/G-UB-KHCV 403 transformierten Hefe. Die Strecke 6 zeigt das Resultat der Extrakte der mit pYLBC-A/G-UB-KHCV 573 transformierten Hefe. Die Strecken 1 und 4 zeigen die Resultate des Extraktes der Hefen ohne KHCV Expressionsvektor. Und die Strecke M representiert den Standard protein molecular size marker (unit: kilodaton).

Die Fig. 32 zeigt SPS-PAGE und Western Blotting Resultate, um die Bilding der E2N und E2C Proteine zu bestätigen. In Fig. 32 zeigt die Strecke 1 die Extrakte der Hefe, transformiert mit einem Plasmid ohne KHCV-Gen. Die Strecke 2 zeigt die Extrakte der Hefe, transformiert mit pYLBC-A/G-UB-E2N, die Strecken 3 bis 5 zeigen die Extrakte der Hefe, transformiert mit pYLBC-A/G-UB-E2N und die Strecke 6 zeigt die Standard molecular size markers, nämlich 200, 97, 72, 43, 29, 18 und 14 kilodaltons vom oberen Rand des Gels.

Beispiel 4: Herstellung des Vektors, der in E. coli KHCV cDNA Fragmente exprimiert 4-A: Herstellung des den trp Promotor enthaltenden Expressionsvektors 4-A-1: Herstellung der KHCV cDNA Fragmente

Die Fragmente K384, K510, K573, K879, E2N und E2C, hergestellt in den Beispielen 3-A-1 und 3-A-2 wurden verwendet.

Das Hüllfragmemt 1(E1), welches vom 916 bis zum 1509 Nucleotid der KHCV-LBC1 angeordnet ist, wurde mittels PCR auf die gleiche Weise hergestellt, wie in Beispiel 3-A-1 und wobei die folgenden Primer verwendet wurden:

Primer PEIUBI (5’-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC-3') enthaltend 25 Nucleotide in der 5'-Endregion, die mit dem Ubiquitin-Gen überlappen: Region des 916 bis zum 936igsten Nucleotides der KHCV-LBC1.

Primer PEISAL (5'-GACT GG ACT ATTACCCT GT CACGTGGGTGGTGGTT CC-3') enthält ein codon um die Translation nach dem 1509 Nucleotid des KHCV-LBC1 zu terminieren; und eine Erkennungsstelle der Sal I. 27

AT 405 053 B 4-A-2: Herstellung des Ubiquitingens < Stufe 1> * 3 verschiedene Oligonucleotide wie unten geoffenbart wurden gemäß der Information auf dem Ubiqui-tingen hergestellt, wie von Ozkaynak et al., EMBO. J. 6, 1429-1439 (1987) berichtet, wobei unter Verwendung eines DNA-Synthesizers folgendes synthetisiert wurde: UBI1: 5'- QOOCÄIATCCÄAATITIO3rcAAAACTCiaACM3GGAA3ÄCIMÄAGOCr UBI2: 5 ’ -TAL?ntXTIÄCCAGCAAAAATC3VATCICItXni3AIOCX3GAGGGÄ!iaCCIT CnTÄTCTnGAATlTI^rriTGAaJrilJIXÄAIfiGI'CTC-S1 UBI3: 5' -ACCACOSCaaGICrcAACAOCAAGIGAMAGI^^ TCJBVI[CAGACAAßCnTCTACX3\3X^TCT^UU^'riÄ3C?ßCaAAAA--3'

Das UBI1 wurde so gebildet, daß es eine Erkennungsstelle Nde l (5'-CATATG-3') am 5'-Ende und etwa 20 Nucleotide aufweist, die mit UBI2 überlappen. Und UBI3 ist so ausgebildet, daß es eine Erkennungsstelle des Sac II (5’-CCGCGG-3’) aufweist, ohne irgendeinen Wechsel in der darin kodierten Aminosäuresequenz (siehe Fig. 33). < Stufe 2>

Zu einer Mischung von 2ug UBI1, 0,02ug UBI2 und 2ug UBI3 wurden 10ul 10 x PCR-Pufferlösung, 10ul 2mM dNTP's-Mischung und 0,5u,l Taq-Polymerase zugegeben. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolumen auf 100ul eingestellt. Die PCR wurde auf gleiche Weise durchgeführt wie im Referenzbeispiel 7. Die resultierende Mischung wurde einer 5% Polyacrylamidgelektrophorese unterworfen, um 240bp der DNA zu isolieren, die als Fragment Ub bezeichnet wird. Das isolierte Fragment wurde in 20ul TE-Pufferlösung aufgelöst.

(4-A-3): Ligation des Ubiquitin-Gens an die KHCV cDNA

Jedes der in Beispeil (4-A-1) hergesteliten Fragmente wurde an das Fragment Ub mittels PCR folgt ligiert.

Als Primer für die PCR wurden jene Primers verwendet, die in Stufe 1 des Beispiels (3-A-1) und Stufe 1 des Beispiels (4-A-1) hergestellt worden waren. 7 verschiedene Teströhrchen wurden wie folgt vorbereitet: Röhrchen A wurde mit 50ng Fragmentes K384, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug Primers PSALCORE14 versehen. Röhrchen B wurde mit 50ng des Fragmentes K510, des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PSALCORE17 versehen. Röhrchen C wurde mit 50ng des Fragmentes K573, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PSALCORE22 versehen. Röhrchen D wurde mit 50ng des Fragmentes K897, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PKHCV897SAL versehen. Röhrchen E wurde mit 50ng des Fragmentes E2N, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PE2NSAL versehen. Röhrchen F wurde mit 50ng des Fragmentes E2C, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PE2CSAL versehen. Rörchen G wurde mit 50ng des Fragmentes E1, 50ng des Fragmentes Ub, 2ug des Primers UBI1 und 2ug des Primers PE1SAL versehen.

Zu jedem der Röhrchen wurden 10ul der 10 x Polymerase-Reaktionspufferlösung, 10ul 2mM dNTP's-Mischung und 0,5ul der Taq-Polymerase hinzugefügt. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolumen auf I00ul eingestellt. Die PCRs wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wie in Referenzbeispiel 7. Jedes der PCR-Produkte wurde mit Ndel und Sal I in NEB-Pufferlösung 3 abgebaut. Die in den Rörchen A bis g erhaltenen Fragmente erhielten folgende Fragmentnamen: UBCORE14, UBCORE17, UBCORE22, UBKHCV897, UBE2N, UBE2C und UBE1. 28

AT 405 053 B (4-A-4): Herstellung des Expressionsvektors < Stufe 1>

Zug des ptrp 332-HGH (siehe horeanische Patentveröffentlichung Nr. 91-457, KFCC-10667) wurden vollständig mit Pst I und Sal I abgebaut und 2ug des Plasmids wurden vollständig mit Pst I und Nde I in NEB-Pufferlösung 4 abgebaut. Die Produkte wurden mittels 0,7% Agarosegel getrennt, wovon 1,5kb und 0,8Kb Fragment isoliert wurden. Diese Fragmente erhielten die Namen Fragmente PB und PS. < Stufe 2>

Unter Verwendung der in Stufe 1 und Beispiel (4-A-3) hergestellten Fragmente wurde die Ligation wie folgt durchgeführt:

Ligationsröhrchen A wurde mit 100ng UBCORE14 versehen. Ligationsröhrchen B wurde mit 100ng UBCORE17 versehen. Ligationsröhrchen C wurde mit lOOng UBCORE22 versehen. Ligationsröhrchen D wurde mit 100ng UBKHCV897 versehen. Ligationsröhrchen E wurde mit 100ng UBE2N versehen. Ligationsröhrchen F wurde mit 100ng UBE2C versehen. Ligationsröhrchen G wurde mit 100ng UBE1 versehen. Zu jedem der Rörchen wurden 100 ng PB, 100ng PS, 2ul 10 x Ligationspufferlösung und 10 unites T4 DNA Ligase hinzugefügt. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolument jeweils auf 20ul eingestellt.. Die Reaktion wurde für 12 Stunden bei 16'C durchgeführt. Jeder der ligierten Vektoren isoliert. Mit jedem der Vektoren wurde E. coli HB101 (ATCC 33694) transformiert. Der das Fragment UBCORE14 enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-CORE14 benannt. Der das Fragment UBCORE17 enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-CORE17 benannt. Der das Fragment UBCORE22 enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-CORE22 bennant. Der das Fragment UBKHCV 897 enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-KHCV897 benannt. Der das Fragment UBE2N enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-E2C benannt. Der das Fragment UBE2C enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-E2C benannt. Der das Fragment UBE1 enthaltende Vektor wurde isoliert und ptrpH-UB-El benannt (siehe Fig. 34). (4-B): Herstellung des Vektors pMAL-KHCV, der den Tac-Promotor enthält (4-B-1): Amplifi2ierung der KHCV cDNA Fragmente < Stufe 1>

Um die KHCV cDNA Fragmente in die MBP-fusionierten Proteine in E. coli unter Verwendung des Tac-Promotors zu emprimieren, wurden unter Verwendung eines dNA-Synthesizers die im folgenden beschrie benen Primer synthetisiert: Primer PK426R : Primer PK426X : Primer PSALCORE17 : Primer P426B : Primer PK513R : Primer PK513X : Primer PK810R : Primer PK810X : Primer PK798R : Primer PK798X : Primer PK754R : Primer PK754X: 5'-CTCCGAATTCGGTGCTTGCGAGTGCCCC-3’ 5'-CACGCT CG AGGCAT GT G AGGGT GT CG AT G AC-3' 5'-GGGGT CGACT ATT AGGGCAG ATT CCCTGTT GC-3' 5'-GGGT GGGC AGG ATGGCT CCTG-3’ 5'-CT CCG AATT CGGCACG AGGCTGG AGG ACGGCGT G AACT-3' 5’-CACGCT CG AGAGGCG ACCAGTTCAT CAT CAT-3’ 5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGGTTTCCCAGCTGTTCACCTT-3' 5'-CACGCT CG AG ATT CAGCCAT GTACAACCG AACC-3’ 5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3’ 5’-CACGCTCGAGCAGAAGCAGCGGCCATACGCC-3’ 5'-AAAAAGAATTCGGCACGAGGCTGCGAGATTGGGCTCACACG-3' S'-AAAAACT CG AGCCGCAT AGT AGTTT CCAT AG ACT CAACGGG-T AT G AATT- 3’

Primer PK652R : Primer PK652X: Primer PK403R : Primer PK403X: Primer PK271R : Primer PK271X : Primer PK495R : Primer PK495X : 5'-AAAAAG AATT CGGCACG AGGTT CAT ACCCGTT G AGT CT AT G-G AA-3' 5'-ATTATT GTCG ACTAT CTAT CT ACT CG AGT C ACAGCTTTGC-AGCGAGCTCGT-3' 5’-AAAAAG AATTCACGGGCAT G ACC ACT G AC-3' 5'-ATTATT CTCG AGTAT C ACT CTTGCCGCCAC AAGAG-3' 5'-AAAAAG AATT CACTAGCCTT ACAGGCCGG-3* 5'-CACGCT CG AGT CACGT G ACCAGGT AAAGGT C-3' 5’-CCCCCGAATTCGGCACGAGCGCTGCGGAGGAAAGCAAGTT-3' 5’-AAAAACT CG AGG ACCACGT CATAAAGGCCA-3' 29

AT 405 053 B

Primer PK494R : 5' -AAAAGAATTCGGCACGAGCGATGCATCTGGTAAAAGGGT-3'

Primer PK494X : 5'-AAAACTCGAGATTGGAGTGAGTTTGAGCTT-3' < Stufe 2> 11 verschiedene Teströchen wurden hergestellt, die die folgenden Primer enthielten (Tube = Röhrchen):

Tube A : Primer PK426R 2ug, Primer PK426X 2ug

Tube B : Primer PK426R 2ug, Primer PK426B 20ng, PSALCORE17 20u.g

Tube C : Primer PK513R 2ug, Primer PK513X 2ug

Tube D : Primer PK810R 2ug, Primer PK810X 2ug

Tube E : Primer PK798R 2ug, Primer PK798X 2ug

Tube F : Primer PK754R 2ug, Primer PK754X 2ug

Tube G : Primer PK652R 2ug, Primer PK652X 2ug

Tube H : Primer PK403R 2ug, Primer PK403X 2ug

Tube I : Primer PK271R 2ug, Primer PK271X 2ug

Tube J : Primer PK495R 2ug, Primer PK495X 2ug

Tube K : Primer PK494R 2ug, Primer PK494X 2ug

Zu jedem der Röhrchen wurden 10ng KHCV-LCB1 (ATCC 75008), 10ul 10 x Polymerase-Pufferlösung, 10ul 10mM dNTP's-Mischung und 0,5ul (2 Units) der Taq-Polymerase hinzugefügt. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolumen auf jeweils 100ul eingestellt.

Zu jeder der Peaktionsmisch wurden 50ul Mineralöl zur Verhinderung der Verdampfung hinzugefügt. Die PCRs wurden auf die gleiche Weise ausgeführt wie in Referenzbeispiel 7. (4-B-2): Herstellung des Expressionsvektors 2ug des pMAL-CRl (New England Biolabs Inc., Cat.No. 800, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, USA) wurden vollständig mit Eco RI und Sal I in NEB-Pufferlösung 3 abgebaaut. Das Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Fällung wurde in 40ul TE-Pufferlösung aufgelöst.

Die PCR-Produkte gemäß stufe 2 des Beispiels (4-B-1) wurden mit Eco RI und Xho I wie folgt abgebaut: 1ug jedes PCR-Produktes in den Röhrchen A und C bis F, H und J bis M wurden mit Eco RI und Xho I komplett abgebaut. 3ug jedes der PCR-Produkte in den Röhrchen G und I wurden komplett mittels Xho I und dann partiell mittels Eco RI abgebaut. Und 1ug des Produktes in Röhrchen C wurde vollständig mit Eco RI und Sal I abgebaut. Die Eco Rl-Xho I und Exo Rl-Sal I Fragmente, die somit erhalten worden waren, wurden isoliert und in TE-Pufferlösung auf gleiche Weise aufgelöst wie im Referenzbeispiel 1.

Zu 5ul von jedem der oben genannten cDNA-Fragmente, die mit Eco Rl-Xho I und Eco RI und Sal l abgebaut worden waren, wurden 2ul 10 x Ligationspufferlösung, 1 <xl (50ng) pMAL-CRl, behandelt mit Eco RI und Sal I, und 10 Units T4 DNA Ligase hinzugefügt. Mit destilliertem Wasser wurde das Gesamtvolumen auf 20u.l eingestellt. Die Reaktion wurde für 12 Stunden bei 16 *C durchgeführt.

Jeder der ligierten Vektoren wurde isoliert. E. coli HB101 (ATCC 33694) wurde mit jeder der rekombinanten Vektoren transformiert. Die Vektoren in den Röhrchen A bis K wurden folgendermaßen benannt: pMAL-KHCV426, pMAL-KHCV555, pMAL-KHCV513, pMAL-KHCV810, pMAL-KHCV798, pMAL-KHCV754, pMAL-KHCV652, pMAL-KHCV403, pMAL-KHCV271, pMAL-KHCV495 und pMAL-KHCV494.

Der für den oben genannten rekombinanten Vektor verwendete Vektor pMAL-CR1 ist in Fig. 35 beschrieben. (4-C): Expression der KHCV cDNA Fragmente in E. coli (4-C-1): Expression der KHCV cDNA Fragmente durch einen Vektor, der trp-Promotor enthält < Stufe 1> E. coli W3110(ATCC 38335) wurde mit jedem der Plasmide aus dem Beispiel (4-A) transformiert. Davon wurde E. coli W3110, transformiert mit ptrpH-UB-KHCV897 (E.coli W3110 ptrpH-UB-KHCV 897), unter der Zugriffsnummer ATCC 69640 am 27. Juni 1991 hinterlegt. E. coli W3110, transformiert mit ptrpH-UB-CORE17 (E. coli W3110 ptrpH-UB-COR 17), wurde unter der Zugriffsnummer ATCC 68641 am 27. Juni 30

AT 405 053 B 1991 hinterlegt. E. coli W3119, transformiert mit ptrpH-UB-CORE14 (E.coli W3110 ptrpH-UB-CORE 14), wurde unter der Zugriffsnummer ATCC 686442 am 1. Juli 1991 hinterlegt. E. coli W3119, transformiert mit ptrpH-UB-El (E.coli W3110 ptrpH-UB-E 1), wurde unter der Zugriffsnummer ATCC 68878 am 11. Dezember 1991 hinterlegt. E. coli W3110, transformiert mit ptrpH-UB-E2N (E. coli W3110 ptrpH-UB-E2N), wurde unter der Zugriffsnummer ATCC 68966 am 22. April 1992 hinterlegt, wobei die Hinterlegung bei der American Type Culture Collection unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck der Patenterteilung erfolgte.

Der mit ptrpH-UB-COREl4 transformierte E. coli wurde unter Schütteln in liquid LB-Medium kultiviert (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakte, 1% Nacl), welches 50ug/ml Ampicillin enthielt, bei 37* für 12 Stunden. 5ml der Kultur wurden in 11 M9-Medium transferiert <40mM Κ2ΗΡ04, 22mM KH2P04, 8,5mM NaCI, l8,7mM NH4CI, 1% Glukose, 0,1 mM MgS04, 01 mM CaCI2, 0,4% Casaminosäure, 1ul/ml Vit. B^ 40ug/ml Ampicillin). Es wurde unter Schütteln für 3 bis 4 Stunden bei 37 *C kultiviert. Sobald dessen O.D.-Wert bei 650nm den Wert 0,5 erreichte, wurde Indolacrylsäure (IAA) der Kultur zugegeben, um die Endkon2entration auf 1,4mM einzustellen. Nach 5 Stunden wurde die resultierende Kultur bei 3000 rpm für 25 Minuten zentrifugiert, um den E. coli Zellenniederschlag zu sammeln.

Die anderen rekombinanten E. coli-Zeilen wurden auf die gleiche Weise kultiviert, um die KHCV-Proteine herzustellen. < Stufe 2>

Jede der Zellen wurde in der Pufferlösung suspendiert und dann einer 15% SDS-PAGE unter Anwendung der Laemmli's Methode unterworfen (Nature 227, 680 (1970)) , um die Expression des Ubiquitin-KHCV Proteins zu bestätigen. Die Resultate sind in den Fig. 36 bis 38 gezeigt.

In Fig. 36 stellt die Strecke M den Standard Molecular Size Marker dar, nämlich 72, 43, 29 und 18 Kilodaltons vom oberen Rand her. Die Strecke 1 zeigt die Produkte von E. coli mit Plasmid ohne KHCV-Gen. Die Strecke 2 zeigt die Produkte von E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-CORE14, wobei 23kd Protein gebildet worden war. Die Strecke 3 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-CORE17, wobei 27kd Protein gebildet worden war. Die Strecke 4 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-CORE22, wobei 29kd Protein gebildet worden war. Die Strecke 5 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-KHCV 897, wobei 40kd Protein gebildet worden war und die Strecke 6 zeigt das gereinigte KHCV 897 Protein.

In Fig. 37 zeigt die Strecke 1 die Produkte von E. coli mit Plasmid ohne KHCV-Gen. Die Strecken 2 bis 5 zeigen die Produkte von E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-El, geerntet jeweils nach 2, 4, 6 und 12 Stunden nach der Zugabezeit von IAA und die Strecke 6 stellt die Standard Molecular Size Markers dar, nämlich 72, 43, 29, 18 und 14 Kilodaltons vom oberen Rand her.

In Fig. 38 zeigt die Strecke 1 die Produkte von E. coli mit Plasmid ohne KHCV-Gen. Die Strecke 2 zeigt die Produkte von E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-E2C und die Strecke 3 zeigt die Produkte von E. coli, transformiert mit ptrpH-UB-E2N.

Western Blotting wurde auf die gleich Weise durchgeführt, wie in Beispiel 3-C, um zu bestätigen, daß die in rekombinanten E. coli gebildeten Proteine spezifisch an den KHCV-Antikörper gebunden sind. Die Resultate sind in den Fig. 39 bis 41 dargestellt. 4-C-2: Expression der KHCV cDNA mittels eines Vektors, der einen Tac-Promotor enthält <Stufe 1> E. coli D1210 (ATCC 27325) wurde mit jedem der in Beispiel 4-B hergestellten Plasmide auf die gleiche Weise transformiert, wie in Referenzbeispiel 4. Unter diesen wurde das E. coli D1210 mit pMAL-KHCV 555 transformiert (E. coli D1210 pMAL-KHCV 555) und wurde unter der Zugriffsnummer 68639 am 27. Juni 1991 bei der American Type Culture Collection nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.

Der transformierte E. coli wurde in flüssigem LB Medium kultiviert, welches 50ul/ml Ampicillin enthielt wobei für 12 Stunden geschüttelt wurde 5ml der Kultur wurden in II des M9 Mediums (6g Na2HPO*, 3g KH2PO*. 0,5g NaCI, 1g NH* CI, 2ul 1M MgSO* 100u.l 20% Glucose, 0,1ml CaCI2 pro Liter) transferiert und für 3 bis 4 Stunden bei 37 *C unter Schütteln kultiviert. Sobald der O.D. Wert bei 650nm den Wert 0,5 erreichte, wurde IPTG zur Kultur hinzugefügt, um deren Konzentration auf 0,2mN einzustellen, Nach 5 Stunden wurde die resultierende Kultur bei 3000rpm für 25 Minuten zentrifugiert, um den E. coli Zellniederschlag zu sammeln. 31

AT 405 053 B < Stufe 2>

Der Zellniederschlag wurde in einer Pufferlösung suspendiert und dann einer 15% SDS-PAGE unter Anwendung der Laemmli's Methode unterworfen (Nature 227, 680 (1970)), um die Expression des KHCV-Proteins zu bestätigen. Die Resultate sind in Fig. 40 dargestellt. In Fig. 42 bedeutet die Strecke M den Standard Molecular Size Marker. Die Strecke 1 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-CRl, wobei 40kd Protein hergestellt worden war. Die Strecke 2 zeigt die Produkte von E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 426, wobei 65kd Protein (MBP-KHCV 426 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 3 zeigt die Produkte von E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 555, wobei 70kd Protein (MBP-KHCV 555 Protein) hergestellt worden war. Die Stecke 4 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 513, wobei 65kd Protein (MBP-KHCV 513 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 5 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 810, wobei 75kd Protein (MBP-KHCV 810 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 6 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV798, wobei 72kd Protein (MBP-KHCV 798 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 7 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 27, wobei 50kd Protein (MBP-KHCV 271 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 8 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 754, wobei 72kd Protein (MBP-KHCV 754 Protein) hergestellt worden war.

Die Strecke 9 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 652, wobei 70kd Protein (MBP-KHCV 652 Protein) hergesteilt worden war. Die Strecke 10 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 403, wobei 65kd Protein (MBP-KHCV 403 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 11 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 495, wobei 70kd Protein (MBP-KHCV 495 Protein) hergestellt worden war. Die Strecke 12 zeigt die Produkte des E. coli, transformiert mit pMAL-KHCV 494, wobei 70kd Protein (MBP-KHCV 494 Protein) hergestellt worden war.

Western Blotting wurde auf die gleiche Weise ausgeführt wie in Beispiel 3-C, um zu bestätigen, daß die obigen Proteine spezifisch mit dem KHCV -Antikörper verbunden sind. Die Resultate sind in Fig. 43 dargestellt. 4-C-3: Abbau des MBP vom fusionierten Protein

Jedes der MBP-fusionierten Proteine wurde zu einer Faktor Xa Pufferlösung (20mM Tris-HCI, pH 8,0, 100mM NaCI, 2mM CaCb, ImM Azid) für 24 Stunden dialysiert. 0,2ug jedes dialysierten Proteins (1mg/ml) wurde dann mit 0,2ug des Faktor Xa vermischt (New England Biolabs Ines., Cat. #800-10L). Die Reaktionsmischung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

Jede der resultierenden Mischungen wurde auf 100*C für 5 Minuten erhitzt. Die Produkte wurden der SDS-PAGE auf gleiche Weise unterworfen, wie in Beispiel 1-C, um zu bestätigen, daß die MBPs von ihren fusionierten Proteinen entfernt worden waren. Die MBP-entfernten Proteine wurden wie folgt bekannt: KHCV 426 Protein, KHCV 555 Protein, KHCV 513 Protein, KHCV 810 Protein, KHCV 798 Protein, KHCV 271 Protein, KHCV 754 Protein, KHCV 652 Protein, KHCV 403 Protein, KHCV 495 Protein und KHCV 494 Protein.

Wie oben beschrieben, könnten verschiedene Längen und Sequenzen der KHCV cDNAs für die Herstellung von Expressionsvektoren mittels PCR Methode unter Verwendung verschiedener Kombinationen der Primer hergestellt werden. Daher ist es offensichtlich, daß auf Basis der oben stehenden Offenbarung vom Fachmann andere ähnliche KHCV cDNA Fragmente leicht synthetisiert werden können. Es ist weiters offensichtlich, daß durch den Fachmann auf Basis der obigen Offenbarung andere KHCV-Antigen-Proteine leicht synthetisiert werden können, da solche KHCV-Antigen-Proteine von der KHCV cDNA abhängig sind. Weiters ist es offensichtlich, daß für die Herstellung der KHCV cDNAs und KHCV-Antigen-Proteine nicht nur die in den Beispielen verwendeten Enzyme, Linker und andere Materialien eingesetzt werden können, sondern auf deren Äquivalente.

Beispiel 5: Reinigung des KHCV-Proteins, exprimiert in Hefezellen 5-A: Reinigung des KHCV 403 Proteins

Stufe 1: Kultur rekombinanter Hefezellen

Saccharomyces cerevisiae DC04-UB-KHCV 403, transformiert mit einem Vektor (pYLBC-A/G-UB-KHCV 403), enthaltend ein KHCV 403 cDNA Fragment und ein Ubiquitin-Gen wurde in 10ml eines Mediums mit Mangel an Leucin (0,67% Hefestickstoffbase ohne Aminosäure, 5% Glucose und 0,25% einer Mischung von 32

AT 405 053 B

Aminosäuren ohne Leucin) bei 30 *C für 12 Stunden kultiviert. Dann wurde die Kultur in 100ml YEPD Medium transferiert, welches 5% Glucose (2% Pepton, 1 % Hefeextrakt, 5% Glucose) enthielt und es wurde unter Schütteln bei einer Temperatur von 30 *C für etwa 6 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde in 11 YEPD Medium transferiert, welches 5% Glucose enthielt, und bei 30 · C für 6 Stunden kultiviert, um eine Impfkultur für die Fermentation zu erhalten. 101 YEPD Medium, enthaltend 2% Glucose wurde in einen 141 Fermenter eingefüllt (Bench Top Fermentor: NBS Company, USA). Die Impfkultur wurde zugeführt und unter Schütteln bei einer Geschwindigkeit von 250rpm und bei 30 * C für etwa 48 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde bei einer Geschwindigkeit von 2500rpm für 20 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J-6B, Rotor JS 4.2) zentrifugiert, um einen Schlamm mit rekombinanten Hefezellen zu erhalten.

Stufe 2: Aufbrechen der Hefezellen

Die in Stufe 1 erhaltenen rekombinanten Hefezellen wurden in 500ml Puffer suspendiert (50mM Tris, pH 8,5, 5mM EDTA, 10mM ß-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfiuorid, 1ug/ml Pepstatin A) und Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,4mm wurden in einer Menge zugegeben, die äquivalent 50% (v/v) zum totalen Volumen war. Das Ergebnis wurde bei 4 · C für 5 Minuten mit einen Homogenisator homogenisiert (Bead Beater, Biospec Product, USA), um die Zellmembranen aufzubrechen. Die aufgebrochenen Zellen wurden unter Verwendung eines Filters (Whatman, 3MM, USA) filtriert, um die Glasperlen zu entfernen und das Hefehomogenisat zu erhalten.

Stufe 3: Identifikation des spezifischen Antigen-Proteins

Eine kleine Menge des Hefehomogenisats der Stufe 2 wurde einer 15% SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Das Resultat zeigte, daß die Ubiquitine in den Zellen ausgeschnitten (excised) waren und die von der KHCV 403 cDNA exprimierten Proteine (im folgenden bezeichnet als KHCV 403 Protein) wurden mit einen Molekulargewicht von etwa 17.000 Dalton hergestellt.

Die auf dem Gel getrennten Proteine wurden auf einen Nitrozellulosefilter übertragen (blotted). Dann wurde der Filter in eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS: 10mM Phosphat, 0,15M NaCI, pH 7,0) gegeben, die 0,5% Tween-20 in einer Schale enthielt, wobei bei Raumtemperatur für 2 Stunden leicht gerührt wurde, um die nichtspezifische Bindung des Immunoglobulins G zu blockieren. Daraufhin wurde Immunoglobulin G (8,2mg/ml), welches vom Serum eines Patienten mit koreanischer Hepatitis C affinitätsgereinigt worden war, in einen Verhältnis von 1/200 (v/v) mit PBS verdünnt, welches 0,5% Gelatine und 0,05% Tween 20 enthielt. 10ml des verdünnten IgG wurden dem Filter hinzugefügt. Die Schale wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde leicht geschüttelt. Der Filter wurde 4x für 5 Minuten jeweils mit PBS gewaschen, welches 0,05% Tween-20 enthielt. Ein anti-human Immunoglobulin G markiert mit horseradish Peroxidase (Bio Rad Lab, Goat Anti-Human IgG-HRP) wurde mit PBS, welches 0,5% Gelatine und 0,05% Tween-20 enthielt, in einem Verhältnis von 1/200 (V/V) verdünnt und dem Filter zugegeben. Der Filter wurde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen. Der Filter wurde 4x für 5 Minuten jeweils mit PBS gewaschen welches 0,05% Tween-20 enthielt und dann 2x mit 50mM Tris Puffer (pH 7,0). Zu dem Filter wurde ein 50mM Tris Puffer (pH 7,0) hinzugefügt, der 400ug/ml 4-chlor-1-naphtol enthielt, und 0,03% Wasserstoffperoxyd zur Entwicklung der Farbreaktion. Das Resultat zeigte, daß das KHCV 403 Protein eines gesamten Hefehomogenisats alleine immunologisch mit dem Serum des Patienten mit Hepatitis C reagierte, um ein sichtbares Band auszubilden. Daher ist dieses KHCV 403 Protein alleine ein immunoreaktives Protein, welches sie mit Antikörpern gegen KHCV binden kann.

Stufe 4: Entfernung des gelösten Proteins

Das in Stufe 2 erhaltene Hefehomogenisat wurde bei 11 OOOrpm mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu erhalten, der das KHCV 403 Protein enthält.

Stufe 5: Auflösung und Fraktionierung des Niederschlages mit Harnstoff

Der in Stufe 4 erhaltene Niederschlag wurde in 750ml eines Puffers (50mM Tris. pH 8,5, 5mM EDTA 10mM /S-mercaptoethanol, imM Phenylmethylsulfonylfiuorid, 1 ag/ml Pepstatin A), der 8M Harnstoff enthielt, gelöst. Die Lösung wurde zentrifugiert, um die ungelösten Niederschläge zu entfernen und den Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde mit einem Puffer (10mM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 5mM /3-mercaptoet- 33

AT 405 053 B hanol) mit einen Gehalt an 2M Harnstoff dialysiert und zentrifugiert, um die Niederschläge zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, der das KHCV 403 Protein enthielt.

Stufe 5: Auflösung und Fraktionierung des Niederschlages mit Harnstoff

Der in Stufe 4 erhaltene Niederschlag wurde in 750ml eines Puffers (50mM Tris, pH 8,5, 5mM EDTA, 10mM /S-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin A), der 8M Harnstoff enthielt, gelöst. Die Lösung wurde zentrifugiert, um die ungelösten Niederschläge zu entfernen und den Überstand zu sammeln. Der Überstand wurde mit einen Puffer (10mM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 5mM /3-mercaptoetha-nol) mit einen Gehalt an 2M Harnstoff dialysiert und zentrifugiert, um die Niederschläge zu entfernen und einin Überstand zu erhalten, der das KHCV 403 Protein enthielt.

Stufe 6: Erste DEAE lonentausch-Chromatographie

Der in Stufe 5 erhaltene Überstand wurde über eine DEAE-Sepharosesäule (Pharmacia, FF, 5cm x 15cm, USA) geschickt, die mit einen Puffer (10mM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 5mM /S-mercaptoethanol) mit einem Gehalt von 2M Harnstoff äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden eluiert, indem 750ml eines Puffers (10mM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 5mM /S-mercaptoethanol) mit einem Gehalt an 0,2M Natriumchlorid hinzugefügt wurden.

Stufe 7: Zweite DEAE lonentausch-Chromatographie

Die Proteinfraktionen, die das KHCV 403 Protein enthielten, wurden gesammelt und mit einen Puffer (lOmM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 5mM /3-mercaptoethanol) dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen, und wurden dann über eine DEAE-Sepharosesäule geschickt, die mit diesem Puffer äquilibriert worden war. Ein Puffer (10mM Tris, pH 9,0, 2mM EDTA, 4mM /3-mercaptoethanol) enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, wurde augegeben, um das eluierte Protein abzutrennen. 500ml des Puffers mit einem Konzentrationsgradienten von 0,1M bis 0,2M Natriumchlorid wurden zugegeben, um die säule-gebundenen Proteine zu fraktionieren. Die Fraktionen wurden der SDS-PAGE unterworfen, um die Fraktionen zu sammeln, die hochgereinigtes KHCV 403 Protein enthalten.

Stufe 8: FPLC-phenyl Chromatographie

Die in Stufe 7 erhaltenen Fraktionen wurden mit einen Puffer (50mM Tris, pH 7,4, 2mM EDTA, 5mM ß-mercaptoethanol), der 1,5M Natriumchlorid enthielt, dialysiert und über eine FPLC-phenylsuperosesäule geschickt (Pharmacia, HR 10/10, 1cm x 8cm, USA), die mit dem genannten Puffer äquilibriert worden war. 160ml des Puffers, der einen Konzentrationsgradienten von 1,5 bis 0M Natriumchlorid enthielt, wurden zugegeben, um die Proteine zu fraktionieren. Die Fraktionen wurden der SDS-PAGE unterworfen, um die Reinheit zu identifizieren. Die Fraktionen mit einem Gehalt hochgereinigter KHCV 403 Proteine wurden separat gesammelt, um KHCV 403 Proteine mit einer Reinheit größer 95% zu erhalten. 5-B: Reinigung des KHCV CORE 14 Proteins

Stufe 1: Kultur rekombinanter Hefezellen

Saccharomyces cerevisiae DC04-UB-CORE 14, transformiert mit einem Vektor (pYLBC-A/G-UB-CORE14) und enthaltend ein cDNA Fragment, welches das KHCV CORE 14 Protein kodiert, und Ubiquitin-Gen wurden in einem Leucin freien Medium kultiviert, welches 5% Glusose enthielt, entsprechend dem Verfahren der Stufe 1 des Beispiels 5-A. 20ml der Kultur wurden in 100ml YEPD Medium transferiert, welches 4% Glucose enthielt, und es wurde unter Schütteln bei 30 · C für 6 Stunden kultiviert. Das Resultat wurde in 11 YEPD Medium mit 2% Glucose transferiert und bei 30 *C für 24 bis 48 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert, um den Zellenniederschlag zu sammeln.

Stufe 2: Aufbrechen der Hefezellen

Die rekombinanten Hefezellniederschläge gemäß Stufe 1 wurden in 30ml eines Puffers (50mM Tris, pH 7,5, 5mM EDTA, 10mM /3-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin) suspendiert und Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,4mm wurden in einer Menge zugegeben, die äquivalent 34

AT 405 053 B 50% des Gesamtvolumens war. Die resultierende Menge wurde für 5 Minuten bei 4"C mit einen Homogenisator (Bead Beater, Biospec Product, USA) 3x homogenisiert, um die Zellmembran aufzubrechen und ein Hefehomoginisat zu erhalten.

Stufe 3: Identifikation des spezifischen Antigen-Proteins

Eine kleine Menge des Hefehomogenisats der Stufe 2 wurde einer 15% SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und mit Coomassie brilliant blue gefärbt. Das Resultat zeigte, daß das Ubiquitin vom KHCV-Protein ausgeschnitten (excised) war, und das in der KHCV cDNA exprimierte Protein (im folgenden als KHCV CORE 14 Protein bezeichnet) wurde mit einem Molekulargewicht von etwa 16.000 Dalton gebildet.

Western Blotting wurde gemäß Stufe 3 des Beispieles 5-A durchgeführt. Das Resultat deutete darauf hin, daß das KHCV CORE 14 Protein alleine immunologisch reaktiv mit dem Serum des Patienten mit Hepatitis C war, um ein sichtbares Band zu zeigen.

Stufe 4: Entfernung des löslichen Proteins und Waschung des unlöslichen Niederschlages

Das in Stufe 2 erhaltene Hefehomogenisat wurde bei H.OOOrpm mit einer Zentrifuge zentrifugiert (Beckman J2-21, Rotor JA-14), um die gelösten Proteine zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu erhalten, der das KHCV CORE 14 Protein enthält. Der Niederschlag wurde in 0,5I PBS suspendiert, welches 1% Triton X-100, ImM EDTA und 10mM /S-mercaptoethanol enthielt, wobei für 10 Minuten gerührt und zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde einmal mit lOmM Phosphatlösung (pH 6,5) gewaschen.

Stufe 5: Auflösung des Niederschlages mit 8M Harnstoff

Der in Stufe 4 erhaltene unlösliche Niederschlag wurde in 10mM Natriumphosphatlösung (pH 6,5) suspendiert, die 8M Harnstoff, 1mM EDTA und 10mM /3-mercaptoethanol enthielt. Es wurde für 12 Stunden bei 4*C gerührt, um das KHCV CORE 14 Protein zu lösen. Die Lösung wurde für 20 Minuten bei 15.000rpm mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA20) zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten.

Stufe 6: CM-Ionentausch-Harz-Chromatographie

Die in Stufe 5 erhaltene Lösung mit dem KHCV CORE 14 Protein wurde mit einer Flußrate von 1ml/min über eine Säule (2,5cm x 10cm) mit 25ml CM (carboxymethyl)-Sepharoseharz (Pharmacia, Sweden) geschickt, die mit einem Puffer äquilibriert worden war (pH 6,5) der 6M Harnstoff, ImM EDTA, 10mM ß-mercaptoethanol und 10mM Phosphat enthielt. Die in der Säule in freier Form verbliebenden Materialien wurden mit der genannten äquilibrierenden Pufferlösung gründlich durchgewaschen. Die in der Säule adsorbierten Proteine wurden mit einer Flußrate von 3ml/min mit 500ml der genannten äquilibrierenden Pufferlösung mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5M Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde einer SDS Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen, wobei sich zeigte, daß das KHCV CORE 14 Protein bei etwa 0,3M Natriumchlorid eluiert wurde. Die das KHCV CORE 14 Protein enthaltenden Fraktionen wurden zur weiteren Verwendung in der nächsten Stufe gesammelt.

Stufe 7: S-200 Gelpermeations-Chromatographie

Die in Stufe 6 gewonnen Fraktionen wurden über eine YM5 Ultrafiltrationsmembran geschickt (Amicon, USA), um auf 10ml zu konzentrieren. Das Konzentrat wurde über eine S-200 Sephacryl Säule geschickt (Pharmacia, Sweden, 2,5cm x 100cm), die mit einer PBS Lösung äquilibriert worden war, die 6M Harnstoff, ImM EDTA und 10mM 0-mercaptoethanol enthielt, wobei eine Flußrate von 0,5ml/min eingehalten wurde, um eine Auftrennung nach dem Molekulargewicht vorzunehmen. Die gesammelten Proteinfraktionen wurden einer 15% SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Fraktionen mit hochgereinigtem KHCV CORE 14 Protein wurden gesammelt und mit PBS Puffer bei 4*C dialysiert, um Harnstoff zu entfernen, wobei 4mg des hochreinen KHCV CORE 14 Proteins erzielt wurden.

Es muß verstanden werden, daß die in anderen KHCV cDNA Fragmenten kodierten Proteine, die in Hefe exprimiert werden, ebenso durch andere, ähnlich dem zuvor beschriebenem Verfahren gereinigt werden können. 35

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Beispiel 6: Reinigung des KHCV-Proteins, exprimiert in E. coli 6-A: Reinigung des KHCV UB 897 Proteins Stufe 1: Kultur rekombinanter E. coli E. coli W3110 ptrpH-KHCV 897 (ATCC 68640), transformiert mit einem Vektor (ptrpH-UB-KHCV 897) umfassend ein KHCV 897 cDNA Fragment mit Ubiquitin-Gen, wurde unter Schütteln für 12 Stunden in einem LB Medium (10g Bactotriptone, 5g Hefeextrakt, 10g NaCI pro Liter) enthaltend 50ug/ml Ampizillin kultiviert. 5ml der Kultur wurden in 11 M9 Medium transferiert (40mM K2HPO*, 22mM KH2PO*, 8,5mM NaCI, 18,7mM NH*CI, 1% Glucose, 0,1mM MgSO«, 0,1mM CaCh, 04% Casaminosäure, 10ug/ml von Vit. Bi), welches 40ug/ml Ampizillin enthielt, und unter Schütteln für 3 bis 4 Stunden bei 37 *C kultiviert. Indolacrylsäure (IAA) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,14mM einzustellen und KHCV UB 897 Protein zu bilden, wenn der O.D. Wert der Kultur bei 650nm den Wert 0,5 erreichte. Etwa 5 Stunden nach Zugabe der IAA wurde die Zellkultur bei 2.500rpm für 20 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J-6B, Rotor JS 4,2) zentrifugiert, um einen Niederschlag von E. coli Zellen zu erhalten. Der Niederschlag wurde einmal mit Phosphat gepufferter Salzlösung (lOmM Phosphat, pH 7,0, 0,15M Natriumchlorid) gewaschen.

Stufe 2: Aufbrechen der Zellen 3g des E. coli Zellniederschlages der Stufe 1 wurden in 40ml eines Puffers (50mM Tris, pH 8,5, 5mM EDTA, 2mM jS-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin A) suspendiert. 0,3ml einer 50mg/ml Lysozymlösung wurden der Suspension zugegeben, bei 37 * C für 1 Stunde stehengelassen und auf Eis mit einem Ultraschallgerät (HEAT SYSTEMS-ULTRASONICS Inc., W225, USA) für 5 Minuten bei einer Ausbeute von 70% Ultraschallwellen unterworfen, um die Zellen aufzubrechen und ein Homogeni-sat von E. coli Zellen zu erhalten.

Stufe 3: Identifizierung des spezifischen Antigen-Proteins

Eine kleine Menge des Homogenisates von E. coli Zellen der Stufe 2 wurde einer 12% SDS-PAGE unterworfen. Das Resultat zeigte an, daß das von diesem Vektor exprimierte KHCV-Protein (nachfolgen bezeichnet als KHCV UB 897 Protein) ein Molekulargewicht von 39.000 Dalton aufwies.

Danach wurden auf Gel getrennte Proteine auf einen Nitrozellulosefilter transferiert und Western-blotting unterworfen, auf gleiche Art wie in der Stufe 3 des Beispiels 5-A. Das Resultat zeigte, daß nur das KHCV UB 897 Protein immunologisch mit dem Serum des Patienten mit Hepatitis C reagierte und ein sichtbares Band zeigte. Im Lichte dieses Resultates ist zu sehen, daß dieses exprimierte KHCV UB 897 Protein ein immunoreaktives Protein ist, welches sich an Antikörper gegen HCV binden kann.

Stufe 4: Entfernung des löslichen Proteins

Das in Stufe 2 erhaltenen Zellenhomogenisat wurden bei 11 .OOOrpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um gelöste Proteine zu entfernen und unlöslichen Niederschlag zu erhalten.

Stufe 5: Waschen des unlöslichen Niederschlages mit Triton X-100 und Tris Puffer

Der in Stufe 4 erhaltene Niederschlag wurde in 50ml eines Puffers (50mM Tris, pH 8,5, 5mM EDTA 2mM /S-mercaptethanol) suspendiert, der 1% Triton X-100 enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und mit 11 .OOOrpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu erhalten. Darauffolgend wurde der Niederschlag in 50ml eines Puffers (50mM Tris, pH 8,5, 5mM EDTA 2mM ß-mercaptoethanol) suspendiert. Die Suspension wurde gerührt und nochmals zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu erhalten.

Nur durch die zuvor beschriebene einfache Waschprozedur wurde ein KHCV UB 897 Protein erhalten, das zumindest eine Reinheit von 60% aufwies. 36

AT 405 053 B

Stufe 6: Auflösen des unlöslichen Niederschlages mit 8M Harnstoff

Der unlösliche Niederschlag, der das KHCV UB 897 Protein enthielt und in Stufe 5 erhalten worden war, wurde in 50ml eines Puffers suspendiert, der 8M Harnstoff enthielt (20mM Phosphat, pH 6,0, 2mM EDTA, 2mM £-mercaptoethanol). Die Suspension wurde bei Rauntemperatur für 1 Stunde gerührt und zentrifugiert, um den unlöslichen Niederschlag zu verwerfen und den Überstand zu erhalten.

Stufe 7: S-Sepharose lonentausch-Chromatographie

Der in Stufe 6 erhaltene Überstand wurde über eine S-Sepharosesäule geschickt (Pharmacia, FF, 2,5cm x 7cm, USA), die mit einem Puffer (20mM Phosphat, PH 6,0, 2mM EDTA, 2mM /3-mercaptoethanol), der 4M Harnstoff enthielt, äquilibriert worden war und die Säule wurde mit 600ml des Puffers eluiert, der einen Konzentrationgradienten von 0 bis 0,2M Natriumchlorid aufwies. Die Proteinfraktionen wurden der SDS-PAGE unterworfen, um die Fraktionen zu sammeln, die hochgereinigtes KHCV UB 897 Protein enthielten.

Stufe 8: Entfernung des Harnstoffes und FPLC-Mono Q lonentausch-Chromatographie

Die in Stufe 7 gesammelten Proteinfraktionen mit dem KHCV UB 897 Protein wurden gegen einen Puffer (10mM Tris, pH 8,5, 2mM EDTA, 2mM 0-mercaptoethanol) dialysiert, um Harnstoff zu entfernen, über eine FPLC-Mono-Q-Ionentauschharzsäule (Pharmacia, HR 5/5) geschickt, die mit diesem Puffer äquilibriert worden war und mit 40ml des Puffers eluiert, der einen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,4M Natriumchlorid aufwies. Die Fraktionen mit hochgereinigtem KHCV UB 897 Protein wurden gesammelt, um ein KHCV UB 897 Protein mit einer Reinheit von wenigstens 90% zu erhalten. 6-B: Reinigung des KHCV UB CORE 17 Proteins

Stufe 1: Kultur des rekombinanten E. coli E. coli W 3110 ptrpH*UB-CORE 17 (ATCC 68641), transformiert mit einem Vektor (ptrpH-UB-CORE 17) mit einer cDNA eines Hepatitis C Virus und Ubiquitin-Gen wurde in LB Medium kultiviert, welches 50ug/ml Ampizillin , I00ng/ml Trytophan enthielt, wobei die Kultivierung bei 37 *C für 12 Stunden durchgeführt wurde. 50ml der Kultur wurden in 11 M9 Medium transferiert und bei 37 *C für 6 bis 8 Stunden kultiviert. Ein Zellniederschlag wurde gesammelt, wie in Stufe 1 des Beispieles 6-A beschrieben.

Stufe 2: Aufbrechen der Zellen 3g des in Stufe 1 erhaltenen E. coli Zellenniederschlages wurden in 20ml einer Pufferlösung (50mM Tris, pH 7,5, 5mM EDTA, lOmM ß-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, lug/ml Pepstatin) bei 4 · C suspendiert. Es wurden 3mg Lysozym zur Suspension zugegeben und für 5 Minuten gerührt. Das resultierende Produkt wurde einer Ultraschallbehandlung für 20 Minuten in einem Eisbad mit einem Ultraschallgerät (Heat Systemas-Ultrasonics, Inc., W225, USA) unterworfen, um die Zellen aufzubrechen und ein Zellhomogenisat zu erhalten.

Stufe 3: Identifizierung des spezifischen Antigen-Proteins

Dieses in Stufe 2 erhaltene E. coli Zellhomogenisat wurde einer 15% SDS-Polyacrylamidgel-Elektropho-rese unterzogen und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Das Resultat zeigte an, daß das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 27.000 Dalton hergestellt worden war (im folgenden bezeichnet als KHCV UB CORE 17 Protein).

Nachfolgend wurden die auf Gel getrennten Proteine auf einen Nitrozellulosfilter transferiert, der Western-Blotting unterworfen wurde, wie bei dem gleichen Prozeß in Stufe 3 des Beispieles 5-A. Das Resultat zeigte, daß nur KHCV UB CORE 17 Protein im gesamten E. coli Zellhomogenisat immunologisch reagierte mit dem Serum des Patienten mit Hepatitis C unter Ausbildung eines sichtbaren Bandes.

Stufe 4: Behandlung mit Harnstoff

Das in Stufe 2 erhaltene Zellhomogenisat wurde mit 12.000rpm für 20 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA2) zentrifugiert, um die unlöslichen Materialien zu entfernen und den Überstand 37

AT 405 053 B zu erhalten. Zu dem Überstand wurden 9M Harnstofflösung bis auf eine Endkonzentration von 6M gegeben und bei 4‘C für 12 Stunden gerührt.

Stufe 5: Behandlung mit Säure

Zu der in Stufe 4 erhaltenen Lösung wurden 1M Natriumacetat (pH 4,5) bis zu einer Konzentration von 10mM hinzugefügt und 1M Essigsäure bis zu einem pH 5,0. Die Mischung wurde für 1 Stunde gerührt und bei 11.000rpm mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen und den Überstand zu erhalten.

Stufe 6: Mono-S Chromatographie

Der in Stufe 5 erhaltene Überstand wurde gereinigt, indem er durch eine FPLC Mono-S Säule (HR 5/5, Pharmacia, Sweden) geschickt wurde. Die UB-CORE 17 Proteinlösung wurde auf die Säule gegeben, die mit Puffer A (pH 5,0) äquilibriert worden war, der 8M Harnstoff, ImM EDTA, 1mM ß-mercaptoethanol und 10mM Essigsäure enthielt, wobei die Säule dann mit dem genannten Puffer A gewaschen wurde. Danach wurde ein Puffer B mit einem Gehalt an 8M Harnstoff, 1mM EDTA, 1mM /9-mercaptoethanol, 10mM Essigsäure und 1M Natriumchlorid schrittweise in einer Menge von 17,5% für die ersten 5 Minuten, 35% während der nächsten 55 Minuten und 100% für letzte 10 Minuten mit einer Rußrate von 0,8ml/min zugegeben, um das Protein zu eluieren. Das KHCV UB-CORE 17 Protein wurde eluiert, sobald die Menge des Puffers B 25% erreichte, das heißt, als die Konzentration des Natriumchlorides 0.25M betrug.

Stufe 7: S-200 Gel-Permeation-Chromatographie

Die in Stufe 6 erhaltene Proteinlösung wurde über eine S-200 Sephacryl Säule geschickt (Pharmacia, Sweden, 2,5cm x 100cm), äquilibriert mit einer PBS Lösung enthaltend 6M Harnstoff, ImM EDTA und ImM /S-mercaptoethanol, wobei eine Flußrate von 0,5ml/min eingestellt war, um eine Trennung nach dem Molekulargewicht vorzunehmen. Es wurden Proteinfraktionen gesammelt und der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen, um jene Fraktionen zu sammeln, die das KHCV UB-CORE 17 Protein enthielten. Die Fraktionen wurden gegen eine PBS Lösung bei 4*C dialysiert um 4mg KHCV UB-CORE 17 Protein mit einer Reinheit von wenigstens 90% zu erhalten. 6-C: Reinigung des UB-E1 Proteins

Stufe 1: Kultur rekombinanter Bakterienzellen E. voli W3110 ptrpH-UB-E1 (ATCC 68878), der fähig ist, ein fusioniertes Protein aus KHCV E1 Protein und Ubiquitin (UB) herzustellen, wurde kultiviert und gesammelt, gemäß dem gleichen Prozeß wie in Stufe 1 des Beispieles 6-A.

Stufe 2: Aufbrachen der Zellen

Der in Stufe 1 erhaltene Bakterienzellenniederschlag wurde in 50ml eines Puffers 1 (20mM Tris, pH 7,5, 1mM EDTA, 2mM 0-mercaptoethanol, ImM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin A) suspendiert. Eine Lysozymlösung wurde zur Suspension bis zu einer Endkonzentration von 0,2mg/ml zugegeben, bei 37’C für 30 Minuten kultiviert und einer Ultraschallbehandlung auf Eis unterworfen. Die Behandlung erfolgte mit einen Ultraschallgerät mit einer Ausbeute von 70% für 5 Minuten, um die Zellen aufzubrechen und das Homogenisat zu erhalten.

Stufe 3: Identifizierung der Expression des spezifischen Antigens

Das in Stufe 2 erhaltene Homogenisat wurde einer 15% SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, wobei sich ergab, daß mit dem Vektor Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 27.000 Dalton exprimiert worden waren (im folgenden als UB-E1 Protein bezeichnet).

Die auf dem Gel getrennten Proteine wurden auf einen Immobilon P Filter abgedrückt (MILLIPORE. Cat. No. IPUH 00010, Porengröße 0,45um) und auf die gleiche Weise wie in Stufe 3 des Beispieles 5-A dem Western-Blotting unterworfen. 38

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Das Resultat zeigte, daß nur das UB-E1 Protein im gesamten Zellhomogenisat immunologisch mit dem Serum des Patienten mit Hepatitis C reagiert hatte, um ein sichtbares Band zu erzeugen.

Stufe 4: Entfernung des löslichen Proteins 5

Das in Stufe 2 erhaltene Zellhomogenisat wurde bei H.OOOrpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA14) zentrifugiert, um die löslichen Proteine zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu erhalten. io Stufe 5: Waschen des unlöslichen Niederschlages

Der in Stufe 4 erhaltene Niederschlag wurde in 30ml eines Puffers 1 (20mM Tris, pH 7,5, ImM EDTA, 2mM ß-mercaptoethanol) suspendiert, der 1% Triton X-100 enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und mit 11.000rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor 15 JA 14) zentrifugiert, um die in 1% Triton X-100 löslichen Proteine zu entfernen und die gefällten Proteine Zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 30ml des Puffers 1 unter Rühren suspendiert und rezentrifugiert, um die unslöslichen Proteine zu er

Durch diese einfache Waschprozedur wurde das UB-E1 Protein mit einer Reinheit von wenigstens 60% erhalten. 20

Stufe 6: Auflösen und Fraktionieren des unlöslichen Niederschlages

Der in Stufe 5 erhaltene unlösliche Niederschlag mit den UB-E1 Proteinen wurde in 50ml eines Puffers 2 suspendiert, der 8M Guanidin HCl (50mM Tris, PH 9,0, 1mM EDTA, 2mM ß-mercaptoethanol) enthielt. Die 25 Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und mit H.OOOrpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge zentrifugiert, um den unlöslichen Niederschlag zu entfernen und den Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde mit Puffer 2 bis zu einer Endkonzentration von 0,5M Guanidin HCl verdünnt. Durch Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt und ein Niederschlag erhalten, der das UB-E1 Protein enthielt. 30 Stufe 7: Auflösen des unlöslichen Niederschlages

Der in Stufe 6 erhaltene unlösliche Niederschlag mit dem UB-E1 Protein wurde in 20ml eines Puffers 3 (50Mm Natriumcarbonat, pH 9,5, ImM EDTA, 2mM ß-mercaptoethanol), der 8M Harnstoff enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, um den unlöslichen Niederschlag zu 35 entfernen und mittels Zentrifugation bei H.OOOrpm für 25 Minuten (Beckman J2-21, Rotor JA14) den Überstand zu erhalten.

Stufe 8: Q-Sepharose lonentausch-Chromatographie 40 Der in Stufe 7 erhaltene Überstand wurde durch eine Q-Sepharosesäule geschickt (Pharmacia, FF, 1,2cm x 7cm), die mit dem genannten Puffer 3 äquilibriert worden war. Es wurden 100ml des Puffers mit einen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,4M Natriumchlorid zugegeben, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Die Proteinfraktion wurde einer Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, um eine Fraktion zu sammeln, die das UB-E1 Protein umfaßte, und man erhielt das UB-E1 Protein mit einer 45 Reinheit von wenigstens 90%. 6-D: Reinigung des KHCV UB-CQRE 14 Proteins

Stufe 1: Kultur der rekombinanten E. coli 50 E. coli W3110 ptrpH-UB-CORE 14 (ATCC 68642), transformiert mit einem Vektor (ptrpH-UB-CORE 14), enthaltend ein cDNA Fragment des KHCV und Ubiquitin-Gen, wurde in einem LM Medium kultiviert, welches 50ug/ml Ampizillin und 100ug/ml Tryptophan enthielt, und zwar bei 37 *C für 12 Stunden. 50ml der Kultur wurden in 11 M9 Medium transferiert und bei 37 *C für 6 bis 8 Stunden kultiviert. Der 55 Zellschlamm wurde gesammelt, wie im gleichen Prozeß der Stufe 1 des Beispieles 6-A. 39

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Stufe 2: Aufbrechen der Zellen 4g E. coli Zellen gemäß Stufe 1 wurden in 20ml eines Puffers (50mM Tris, pH 7,5, 5mM EDTA, 10mM ß-mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin) bei 4”C suspendiert. 4mg Lysozym wurden zur Suspension zugegeben, für 5 Minuten gerührt und einer Ultraschallbehandlung in einem Eisbad für 20 Minuten mittels eines Ultraschallgerätes unterworfen, um die Zellen aufzubrechen.

Stufe 3: Identifizierung des spezifischen Antigen-Proteins

Eine kleine Menge des in Stufe 2 erhaltenen Homogenisates wurde einer Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben, und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Das Ergebnis zeigte, daß Proteine mit etwa 23.000 Dalton exprimiert worden waren (nachfolgend als KHCV UB-CORE 14 Protein beschrieben).

Nachfolgend wurden die in dem obigen SDS-PAGE getrennten Proteine auf einen Nitrozellulosefilter übertragen. Der Filter wurde Western-Blotting unterworfen, wie beim gleichen Prozeß in Stufe 3 des Beispieles 5-A. Das Resultat zeigte, daß das KHCV UB-CORE 14 Protein im gesamten E. coli Homogenisat immunologisch mit dem Serum eines Hepatitis C Patienten unter Ausbildung eines sichtbaren Bandes reagiert hatte.

Stufe 4: Behandlung mit Harnstoff

Das in Stufe 2 erhaltene Homogenisat wurde mit 12.000rpm für 20 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA20) zentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen und den Überstand zu gewinnen. Zu dem Überstand wurden 9M Harnstoff zugegeben, um die Endkonzentration 8M zu erreichen und für 12 Stunden wurde bei Raumtemperatur gerührt.

Stufe 5: Behandlung mit Säure

Zu der in Stufe 4 erhaltenen Lösung wurde 1M Natriumacetat (pH 4,5) bis zur Endkonzentration von 10mM hinzugefügt, gefolgt durch eine Zugabe von 1M Essigsäure bis zu einem pH = 5,0, wobei 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Lösung wurde mit H.OOOrpm mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen und den Überstand zu gewinnen.

Stufe 6: CM-Ionentausch-Chromatographie

Die das KHCV UB-CORE 14 Protein enthaltende Lösung der Stufe 5 wurde in einer Flußrate von 1ml/min über eine Säule (2,5cm x 10cm) geschickt, die 25ml CM-Sepharoseharz enthielt (Pharmacia, Sweden), äquilibriert mit einen Puffer (pH 5,0) mit einem Gehalt an 8M Harnstoff, 1mM EDTA, 10mM ß-mercaptoethanol und 10mM Acetat. Die in der Säule zurückbleibenden Materialien in freier Form wurden sorgfältig mit der genannten äquilibrierenden Pufferlösung ausgewaschen. Die in der Säule gebendenen Proteine wurden in einer Flußrate von 3ml/min mit 500ml der genannten äquilibrierenden Pufferlösung, die einen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,5M Natriumchlorid aufwies, eluiert. Das Eluat wurde einer SDS-Polyacrylamdigel-Elektrophorese unterworfen, wobei sich zeigte, daß das KHCV UB-CORE 14 Protein bei etwa 0,3M eluiert wurde. Die das KHCV UB-CORE 14 enthaltenden Fraktionen wurden für die Verwendung in der nächsten Stufe gesammelt.

Stufe 7: S-200 Gel-Permeations-Chromatographie

Die in Stufe 6 gesammelten Fraktionen wurden über eine YM5 Ultrafiltrationsmembran geschickt (Amicon, USA), um eine Konzentration auf ein Volumen von 10ml herbeizuführen. Das Konzentrat wurde über eine S-200 Sephacrylsäule geschickt (2,5cm x 100cm, Pharmacia, Sweden), die mit einer PBS Lösung äquilibriert worden war, die 6M Harnstoff, 1mM EDTA und imM 0-mercaptoethanol enthielt, wobei eine Flußrate von 0,5ml/min eingehalten wurde, um die Proteine entsprechend ihres Molekulargewichtes aufzutrennen. Die Proteinfraktionen wurden der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Die Fraktionen mit dem KHCV UB-CORE 14 Protein wurden gesammelt. 40

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Stufe 8: Mono-S-Chromatographie

Die in Stufe 7 gewonnene Lösung des KHCV UB-CORE 14 Proteins wurde weiter gereinigt, indem sie über eine FPLC Mono-S-Säule geschickt wurde (HR 5/5, Pharmacia, Sweden). Die KHCV UB-CORE 14 Proteinlösung wurde mit dem gleichen Volumen Puffer A verdünnt und über die Säule geschickt, die mit Puffer A (pH 7) äquilibriert worden war, der 6M Harnstoff, 1mM EDTA, 1mM ß-mercaptoethanol und 10mM Phosphat enthielt, wobei die Säule dann mit dem genannten Puffer A gewaschen wurde. Danach wurde ein Puffer B, enthaltend 6M Harnstoff, 1mM EDTA, 1mM /S-mercaptoethanol, lOmM Phosphat und 0,5mM Natriumchlorid, schrittweise in einer Menge von 35% in den ersten 5 Minuten, 70% in den nächsten 55 Minuten und 100% in den letzten 10 Minuten mit einer Flußrate von 0,8ml/min zugegeben, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Das KHCV UB-CORE 14 Protein war eluiert, wenn die Menge des Puffers B 60% erreichte, das heißt, wenn die Konzentration des Natriumchlorides 0.25M betrug.

Die Fraktion wurde gegen PBS Lösung bei 4*C dialysiert, um 4mg des KHCV UB-CORE 14 Proteins mit einer Reinheit von wenigstens 90% zu erhalten. (6-E): Reinigung des UB-E2N-Proteins

Stufe 1: Kultur rekombinanter Bakterienzellen E. coli W3110 ptrpH-UB-E2N(ATCC 68966), der befähigt ist, ein fusioniertes Protein aus KHCV E2N-Protein und Ubiquitin zu bilden, wurde unter Schütteln für 12 Stunden in einem LB-Medium kultiviert, welches 50ug/ml Ampicillin enthielt. 10ml der Kultur wurden in 11 M9-Medium transferiert, welches 2% Casaminosäure und 10ug/ml Trytopan enthielt. Es wurde unter Schütteln bei 37 *C für etwa 3 Stunden kultiviert. Der Kultur wurde Indolacrylsäure (IAA) bis zu einer Endkonzentration von 50ug/ml zugegeben, wenn deren O.D. Wert bei 650nm 0,2 betrug, um die Produktion des rrekombinanten UB-E2N-Proteins zu induzieren. Etwa 5 Stunden nach der Zugabe des IAA wurde die Kultur mit 3500 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J-6B, Rotor JS4.2) zentrifugiert, um den Zellniederschlag zu sammeln. Der Niederschlag wurde einmal mit PBS gewaschen.

Stufe 2: Identifikation des spezifischen Antigens

Das Homegenisat wurde der Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen. Das Resultat zeigte, daß das UB-E2N-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 28000 Dalton exprimiert wurde.

Nachfolgend wurden die auf dem Gel getrennten Proteine auf einen Immobilone-P-Filter übertragen (Millipore, Cat.No. IPUH 00010, Porengröße 0,45um). Der Filter wurde in PBS gegeben (10mM Phosphat, pH 7,0, 0,15M Natriumchlorid), welches 0,5% Tween 20 enthielt, und es wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden geschüttelt, um eine nichtspezifische Bindung des Immunoglobulins G zu verhindern. 10ml des Serums eines Hepatytis-C-Patienten wurden, wie zuvor beschrieben, mit PBS verdünnt, welches 0,5% Gelatine enthielt, und 0,05% Tween wurde in einem Verhältnis 1:20 zugegeben. Die Mischung wurde unter mildem Schwenken bei Raumtemperatur für eine Stunde reagieren gelassen und 4mal je 5 Minuten mit PBS gewaschen welches 0,05% Tween 20 enthielt. Antihuman-Immunoglobulin G, markiert mit einer alkalischen Phosphatase (Boehringer Manheim. Cat.No. 605 415, Anti-Human IgG-ALP), wurde mit PBS verdünnt welches 0,5% Gelatine und 0,05% Tween 20 in einem Verhältnis von 1:1000 enthielt, und 10ml der verdünnten Lösung wurden dem Filter zugegeben. Das Ergebnis wurde bei Raumtemperatur unter Schütteln für eine Stunde reagieren gelassen und 4mal für jeweils 5 Minuten mit PBS gewaschen, welches 0,05% Tween 20 enthielt, und 2mal mit 100mM Tris-Puffer (pH 9,5, 5mM Magnesiumchlorid, 100mM Natriumchlorid).

Dem Filter wurde 100mM Tris-Puffer zugegeben, der 125ug/ml Nitro-Blue-Tetrazorium (Pierce, NBT) und 25ug/ml Bromchlorindolphosphat (Pierce, BCIP) enthielt, um die Farbreaktion zu entwickeln. Als Ergebnis zeigte sich, daß das UB-E2N-Protein im gesamten Zellhomogenisat immunologisch mit dem Serum des Heptatitis-C-Patienten reagiert hatte, um ein sichtbares Band zu erzeugen.

Stufe 3: Aufbrechen der Zellen und Entfernung des löslichen Proteins

Etwa 3g des in Stufe 1 erhaltenen Zellniederschlags wurde in 50ml Puffer 1 suspendiert (20mM Tris, pH 7,5, 1mM EDTA, 2mM /8-Mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1ug/ml Pepstatin A), und eine Lysozymlösung wurde bis zu einer Endkomzentration von 0,2mg/ml augegeben. Die Reaktion wurde bei 37 *C für 30 Minuten durchgeführt, und es wurde eine Ultraschallbehandlung auf Eis mit einer Ausbeute 41

AT 405 053 B von 70% für 5 Minuten mittels eines Ultraschallgerätes durchgeführt, um die Zellen aufzubrechen und das Lysat zu erhalten. Das Homogenisat wurde mit 11000 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um die löslichen Proteine zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu gewinnen.

Stufe 4: Waschen des unlöslichen Niederschlags mit Tensid und Tris-Puffer

Der in Stufe 3 erhaltene Niederschlag wurde in 30ml Puffer 1 suspendiert (20mM Tris, pH 7,5, 1mM EDTA, 2mM /S-Mercaptoethanol), welcher 1% Tensid (Ethoxylat des 5-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenols) der Bezeichnung Triton X-100 der Firma Rohm und Haas enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und mit 11000 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA14) zentrifugiert, um lösliche Proteine zu entfernen und den Proteinniederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 30ml Puffer 1 suspendiert. Die Suspension wurde gerührt und nochmals zentrifugiert, um die unlöslichen Proteine zu erhalten.

Das UB-E2N-Protein wurde durch diese einfache Waschprozedur mit einer Reinheit von wenigstens 70% erhalten.

Stufe 5: Auflösen des unlöslichen Niederschlags mit 8M Harnstoff

Der aus Stufe 4 gewonnene unlösliche Niederschlag mit dem UB-E2N-Protein, wurde in 40ml Puffer 2 suspendiert (50mM Tris, pH 9,0, 1mM EDTA, 2mM j9-Mercaptoethanoi), der 8M Harnstoff enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt und zentrifugiert, un den unlöslichen Niederschlag zu entfernen und den Überstand zu erhalten.

Stufe 6: S-200-Gel-Permeationschromatographie 40ml einer 8M Harnstofflösung, die das in Stufe 5 erhaltene UB-E2N ehthielt, wurden auf ein Volumen von 5ml mittels einer YM10 Ultrafiltrationsmembran (Amicon) konzentriert und in einer Flußrate von 40ml/h über eine S-200 Harzsäule geschickt (2,5cm x 90cm, Pharmacia, USA), die mit dem Puffer 2 mit einem Gehalt von 4M Harnstoff äquilibriert worden war. Es wurden Fraktionen mit 2ml/Röhrchen gesammelt. Die Fraktionen wurden einer SDS Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen, um die Fraktionen mit dem UB-E2N-Protein zu sammeln.

Stufe 7: Q-Sepharose lonentauschchromatographie

Die das UB-E2N-Protein enthaltende Lösung gemäß Stufe 6 surde über eine Q-Sepharose-Säule geschickt (FF, 1,2cm x 7cm, Pharmacia, USA), die mit Puffer 2 equilibriert worden war, der 4M Harnstoff enthielt. 150ml des Puffers mit einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1,0M Natriumchlorid wurde zugegeben, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Die Fraktionen wurden der Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, um die Fraktionen des UB-E2N mit einer Reinheit von wenigstens 80% zu gewinnen.

Stufe 8: Entfernung des Harnstoffs und FPLC-Phenylchromatographie 4M Harnstofflösung mit UB-E2N-Protein, welches in Stufe 7 erhalten worden war, wurde auf ein Volumen von 8ml mittels YM 10 Ultrafiltrationsmembran (Amicon) konzentriert und gegen einen Puffer 3 dialysiert (20mM Tris, pH 9,0, 1mM EDTA, 2mM 0-Mercaptoethanol, 0,2M Natriumchlorid), wobei eine Dialysemembran (Spectrum Medical Industries, Inc., M.W. cut off 6000-8000) verwendet wurde, um den Harnstoff zu entfernen. Der Lösung wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1M zugegeben. Die Mischung wurde über eine FPLC-Phenylsepharose-Säule geschickt (Pharmacia, HR 5/5, 0,5cm x 5cm), und 40ml des Puffers mit einem Konzentrationsgradienten von 1,0M bis OM Natriumchlorid wurde zugege-gen, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Die Fraktionen wurden einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, um die Fraktionen zu sammeln, die das UB-E2N-Protein mit einer Reinheit von wenigstens 90% enthielten. 42

AT 405 053 B (6-F): Reinigung des UB-E2C-Proteins Stufe 1: Kultur rekombinanter Zellen E. coli W3110, der befähigt ist ein fusioniertes Protein aus KHCV E2C-Protein und Ubiquitin zu bilden, wurde unter Schütteln für 12 Stunden in einem LB-Medium kultiviert, welches 50ug/ml Ampizillin enthielt. 20ml der Kultur wurden in 11 M9-Medium transferiert, welches 2% Casaminosäure und 10ug/ml Tryptopan enthielt. Es wurde unter Schütteln bei 37 * C für etwa 2 Stunden kultiviert. Der Kultur wurde Indolacrylsäure (IAA) bis zu einer Endkonzentration von 50ug/ml zugegeben, wenn deren O.D. Wert bei 650nm 0,3 betrug, um die Produktion des rekombinanten UB-E2C-Proteins zu induzieren. Etwa 3 Stunden nach der Zugabe des IAA wurde die Kultur mit 3500 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J6, Rotor HS4) zentrifugiert, um den Zellniederschlag zu sammeln. Der Niederschlag wurde einmal mit PBA gewaschen.

Stufe 2: Identifizerung des spezifischen Antigens

Der Niederschlag wurde einer Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen. Das Resultat zeigte an, daß das UB-E2C-Protein in einem Molekulargewicht von etwa 25000 Dalton exprimiert worden war.

Nachfolgend wurden die auf dem Gel getrennten Proteine auf einen Immobilone-P-Filter (MILLIPORE, cat.#. IPUH 00010, Porengröße 0,45u.m) übertragen. Der Filter wurde in PBS gegeben, welches 0,5% Tween 20 enthielt, und bei Raumtemperatur für 2 Stunden geschüttelt, um eine nichtspezifische Bindung des Immunoglobulins G zu blockieren. 10ml des Serums eines Hepatitis*C-Patienten wurden mit PBS verdünnt, welches 0,5% Gelatine enthielt, und 0.05% Tween wurde in einem Verhältnis 1:20 zugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde mild geschwenkt und 4mal je 5 Minuten mit PBS gewaschen, welches 0,05% Tween 20 enthielt. Anithuman-Immunoglobulin G, markiert mit Horseradish-Peroxidase (Bio-Rad Lab. Anti-Human IgG-HRP) wurde mit PBS verdünnt, welches 0,5% Gelatine und 0,05% Tween 20 in einem Verhältnis 1:500 enthielt. 10ml der verdünnten Lösung wurde dem Fiter zugegeben. Das Ergebnis wurde unter Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde reagieren gelassen und 4mal mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, und 2mal mit 50mM Tris-Puffer (ph 7,0) für jeweils 5 Minuten gewaschen.

Dem Filter wurden 50mM Tri-Puffer zugegeben, der 400ug/ml 4-Chlor-1-Naphtol und 0,03% Wasserstoffperoxid enthielt, um die Farbreaktion zu entwickeln. Als Resultat ergab sich, daß das UB-E2C-Protein im gesamten Zellhomogenisat immunologisch mit dem Serum eines Hepatitis-C-Patienten reagiert hatte, um ein sichtbares Band zu zeigen.

Stufe 3: Aufbrechen der Zellen und Entfernung des löslichen Proteins

Etwa 1g des in Stufe 1 erhaltenen Zellniederschlags wurde in 50ml Lysispuffer suspendiert (20mM Tris, pH 7,5, ImM EDTA, 2mM tf-Mercaptoethanol, 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1ug/ml Pepstatin A), und eine Lysozymlösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5mg/ml zugegeben. Die Reaktion wurde bei 37 *C für 30 Minuten durchgeführt, und es wurde eine Ultraschallbehandlung auf Eis mit einer Ausbeute von 70% für 5 Minuten mittels eines Ultraschallgerätes durchgeführt, um die Zellen aufzubrechen und ein Homogenisat zu erhalten. Das Homogenisat wurde mit 11000 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckman J2-21, Rotor JA 14) zentrifugiert, um die löslichen Proteine zu entfernen und den unlöslichen Niederschlag zu gewinnen.

Stufe 4: Waschen des unlöslichen Niederschlags mit Tensid und Tris-Puffer

Der in Stufe 3 erhaltene Niederschlag wurde in 20ml Puffer 1 suspendiert (20mM Tris, pH 7,5, ImM EDTA, 2mM /S-Mercaptoethanol), welcher 1% Triton X-100, wie zuvor definiert, enthielt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und mit 11000 rpm für 25 Minuten mit einer Zentrifuge (Beckamn J2-21, Rotor JA14) zentrifugiert, um lösliche Proteine zu entfernen und den Proteinniederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 30ml Puffer 1 suspendiert. Die Suspension wurde gerührt und nochmals zentrifugiert, um die unlöslichen Proteine zu erhalten. 43

AT 405 053 B

Stufe 5: Auflösen des unlöslichen Niederschlags mit 8M Harnstoff

Der unlösliche Niederschlag, der das UB-E2C-Protein der Stufe 4 enthielt, wurde in 20ml Puffer 2 suspendiert (50mM Carbonat, pH 9,5, 1mM EDTA, 2mM 0-Mercaptoethanol), der 8M Harnstoff entheilt. Die 5 Suspension wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt und zentrifugiert, um den unlöslichen Niederschlag zu entfernen und den Überstand zu erhalten.

Stufe 6: FPLC-Mono-Q-Ionentauschchromatographie 70 Der in Stufe 5 erhaltene Überstand wurde über eine FPLC-Mono-Q-Säule geschickt (Pharmacia, HR 5/5, 0,5cm x 5cm, USA), die mit Puffer 2 equilibriert worden war, der 0,1 M Nautriumchlorid enthielt. 40ml des Puffers mit einem Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 1,4M Natriumchlorid wurde zugegeben, um die gebundenen Proteine zu eluieren. Die Fraktionen wurden der Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, um die Fraktionen mit einer Reinheit von wenigstens 80% zu gewinnen. 15

Stufe 7: Entfernung des Harnstoffs und FPLC-Phenylchromatographie 8M Harnstofflösung mit UB-E2C-Protein, welches in Stufe 6 erhalten worden war, würfe auf ein Volumen von 14ml mittels YM 10 Ultrafiltrationsmembran konzentriert und gegen einen Puffer 3 dialysiert 20 (20mM Tris, pH 9,0, 1mM EDTA, 2mM ß-Mercaptoethanol, 0,2M Natriumchlorid), wobei eine Dialysemem bran (Spectrum Medical Industries, Inc., M.W. cut off 6000-8000) verwendet wurde, um den Harnstoff zu entfernen. Der Lösung wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von· 1M zugegeben. Die Mischung wurde über eine FPLC-Phenylsepharose-Säule geschickt (Pharmacia, HR 5/5, 0,5cm x 5cm), und 40ml des Puffers mit einem Konzentrationsgradienten von 1,0M bis 0M Natriumchlorid wurde zugegeben, 25 um die gebundenen Proteine zu eluieren. Die Fraktionen wurden einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, um die Fraktionen zu sammeln, die das UB-E2C-Protein mit einer Reinheit von wenigstens 90% enthielten.

Beispiel 7: Ermittlung der anti-KHCV Antikörper gegenüber KHCV rekombinaten Proteinen 30 7-A: Reaktivität gemischt positiver und negativer Serenproben gegenüber der Antigenkonzentration

Jedes KHCV 403, KHCV 897 und KHCV UB-CORE 14 Protein wurde seriell in 2 Stufen mit 50mM Natriumboratpuffer (pH 9,0) von einer Konzentration 0,25ug/ml, 2,0ug/ml und 2,0ug/ml verdünnt. Die 35 verdünnten Proteinlösungen wurden in die Öffnungen einer Mikrontiterplatte (Dynatech, Immulon Typ 1 Mikrontiterplatte) in einer Menge von 200ul/Öffnung gegeben und bei 37 *C für 2 Stunden inkubiert, wobei die Platte mit einem Para-Film abgedeckt wurde, um ein Verdampfen der Lösung möglichst gering zu halten.

Die für 2 Stunden bedeckte Platte wurde einmal mit PBS gewaschen, die 0,05% (v/v) Tween-20 (pH 40 7,4, nachfolgend als Waschlösung bezeichnet) enthielt. Die PBS mit einem Gehalt an 0,1% Gelatine (v/v) wurde den Öffnungen in einer Menge von 210ul/öffnung zugegeben. Es wurde bei 37 *C für 2 Stunden inkubiert. Die Öffnungen wurden 2x mit 300ul der genannten Waschlösung gewaschen. Es wurden 190ul PBS mit 0,25% Gelatine, 1mM EDTA, 1,0% (v/v) Triton X-100 und 0,02% Thimerosal sowie 10ul einer positiven Serumprobe eines HCV Patienten oder eine negative Serumprobe zu jeder Öffnung zugegeben 45 und für einige Sekunden gemischt. Es wurde bei 37 *C für 1 Stunde inkubiert. Die positive Serumprobe eines HCV Patienten und die negative Probe wurden mittels eines Diagnosekits für Hepatitis C getestet, wobei ein C-100 Antigen Verwendung fand, das durch Ortho Diagnostic Systems, Raritan, N.J„ 88869, USA hergestellt worden war. Der Test wurde vor der Verwendung durchgeführt. Die Serumproben wurden vom Severance Hospital geliefert, das der Yonsei University in Korea angeschlossen ist. so Die Öffnungen (wells) wurden nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 37 *C 5x mit 300ul der Waschlösung gewaschen. Anti-human IgG gamma-Ketten Immunoglobulin, markiert mit Horseradish-Peroxi-dase (HRP) (Bio-Rad Company, Richmond, CA 94804, USA, 0,1mg Protein/ml) wurde 5000-fach mit PBS verdünnt, welches 10% fötales Rinderserum, 1% Ficoll (Sigma v/v), 0,02% Thimerosal und 0.05% Tween-20 enthielt. Die verdünnte Lösung wurde den Öffnungen in einer Menge von 200ul/öffnung zugegeben. Das 55 Ganze wurde bei 37 · C für 1 Stunde inkubiert, und 5x mit der genannten Waschlösung gewaschen. Danach wurde zu jeder Öffnung 200u.l O-Phenylendiamindihychlorsäure (OPD, Sigma, 10mg/ml), die in 50mM Citratpuffer aufgelöst und durch Zugabe von Phosphat auf pH 5,5 eingestellt worden war, zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten in Dunkelheit inkubiert. Zu der resultierenden Mischung wurden 50ul 44

AT 405 053 B 4N schwefelige Säure pro Öffnung zugegeben, um die Farnbentwicklung zu stoppen. Die O.D. jeder Öffnungen wurden bei einer Wellenlänge von 492nm mit einem Dynatech Microtiter Plade Reader bestimmt (siehe Fig. 19). 7-B: Herstellung eines Diagnosekits

Die Antigene gereinigten KHCV UB-CORE 14, KHCV 897 und KHCV 403 Proteins wurden zur Herstellung eines Diagnosekits verwendet. Die Antigene können auf eine optimale Konzentration mit 10mM Natriumkarbonatpuffer (pH 9,5) oder 50mM Natriumboratpuffer (pH 9,0) verdünnt werden.

Eine Menge von 150 bis 200ul/Öffnung kann auf eine Immulon Typ 1 Microtiterplatte aufgetragen werden, die 96 Öffnungen aufweist (Dynatech). Das Inkubieren erfolgt bei einer Temperatur von 4*C für 12 bis 18 Stunden, um dem Antigen die Adsorbtion an den Platenwänden zu erlauben.

Die optimalen Konzentrationen für jedes Antigen liegen bei 0,18 bis 0.75ug/ml für das KHCV UB-CORE 14 Protein, 0,06 bis 0,3ug/ml für das KHCV 897 Protein und 0,12 bis 0,5ug/ml für das KHCV 403 Protein. Bei diesem Beispiel wurden jeweils 0,3u.g/ml jedes Antigens verwendet.

Der Inhalt jeder Öffnung nach dem Bedecken wurde mit einem Sauger entfernt. Die Platte wurde mit PBS gewaschen (PBS, pH 7,4) die 0,05% (v/v) Tween-20 enthielt, und mit PBS (210ug/Öffnung) (pH 7,4) mit einem Gehalt an 0,1% (w/v) Gelatine für 2 Stunden bei 37 *C blockiert und 3x mit der Waschlösung gewaschen. Die in den Öffnungen zurückbleibende Feuchtigkeit wurde mit einem Absorptionsapparat entfernt.

Zu jeder Öffnung wurden 190ul eines Puffers (10mM Tris, pH 7,5, 150mM NaCI, 0,2% Triton X-100, 0,1 mM EDTA, 0.02% Thimefosal) mit Gehalt an 1% (v/v) Rinderserum und 10ul der zu testenden Probe hinzugefügt und bei 37 *C für 1 Stunde inkubiert, um eine Bindungsreaktion des HCV Antikörpers in einer Probe mit dem in den Öffnungen adsorbierten Antigen zu induzieren. Die Platte wurde 5x mit PBS (pH 7,4) gewaschen, die 0,05% (v/v) Tween-20 enthielt. Es wurden 200ul eines anti-human IgG-HRP (Goat antihuman IgG-HRP, Bio-Rad Lab., USA) hinzugefügt, welches mit einem Puffer (10mM Tris, pH 7,5, 150mM NaCI, 0,02% Thimerosal, 1% Ficoff) verdünnt worden war und 10% (v/v) Rinderserumalbumin enthielt. Es wurde bei 37’c für 1 Stunde inkubiert und danach mit PBS (pH 7,4) und einem Gehalt an 0,05% (v/v) Tween 20 gewaschen. 200ul OPD Lösung wurden zugegeben, um bei Raumtemperatur für 30 Minuten eine Farbreaktion zu entwickeln. Danach wurden pro Öffnung 50ul 4N schwefelige Säure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, worauf die O.D. bei einer Wellenlänge von 492nm bestimmt wurde. Der cut-off Wert, der ein Standardwert für die Bestimmung positiv oder negativ ist, wurde mit 0,4 plus der durchschnittlichen Absorbtion (O.D.) der negativen Probe festgestellt.

Die Resultate für jedes KHCV Protein und gemischte Antigen gemäß dem oben gesagten sind in Tabelle 1 dargestellt. Das Vergleichs HCV Diagnosereagenz war von Ortho Diagnostic Systems kommerziell erhältlich und nach den Herstelleranleitungen verdendet worden. 45

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Tabelle 1

Reaktivität der KHCV Proteine zu den Antikörpern gegenüber KHCV, bestimmt mittels Enzymimmunoassay Probe No. Antigen KHCV Antigen KHCV Antigen KHCV Mixed Antigen Ortho HCV 897 protein UB-CORE 14 protein 403 protein (von drei Proteininen) Diagnostic Kit 1 + + + + + - + + + + - 2 + + + + + + + + + + + + + + + 3 + - - + + - 4 + + - + + - 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 + + - - + + + - 7 + + + + + + + - + + + + + 8 - + + - + + + - 9 - - + + + + + + + - 10 - + + + - + + + + - 11 + + + - + + + - 12 + + + + + + + + + + + + + + + 13 + + - - + + -

Bemerkung: 1) + + + +: Cut off Wert + 1,5'S Absorption (O.D.) + + +: Cut off Wert + 1,0 £ Absorption < Cut off Wert + 1,5 + +: Cut off Wert + 0,5 £ Absorption < Cut Off Wert + 1,0 +: Cut off Wert £ Absorption < Cut off Wert + 0,5 Absorption < Cut off Wert 2) Der Cut off Wert war 0,32 für das KHCV 897 Protein, 0,27 für das KHCV UB-CORE 14 Protein, 0,35 für das KHCV 403 Protein, 0,483 für gemischte Antigene und 0,453 für den Ortho Diagnosekit. 3) Der Ortho HCV Diagnosekit war von Ortho Diagnose Systems, USA kommerziell erhältlich. 7-C: Genauigkeit der Diagnose

Um die Genauigkeit des Resultates der vorliegenden Diagnose zu demonstrieren, wurden 17 Serumproben, die bei Verwendung eines Diagnosekits für Hepatitis C, hergestellt und verkauft von Ortho Diagnostic Systems, als positiv diagnostiziert worden waren, nochmals einer Diagnose unterzogen, wobei der Diagnosekit der vorliegenden Erfindung angewendet wurde. Weiters wurde auch der Immunobiottingkit (Chiron RIBA HCV Test System, 2nd Generation, manufactured by Ortho Diagnostic Systems, USA, Product Code 933491) angewendet, der als Bestätigungstest empfohlen ist und 4 Antigene ausgenommen ein SOD Kontrollantigen umfaßt (siehe Van der Poel, C. L. et al., Lancet, 337, 317-319 (1991)). Diese Resultate sind in Tabelle 2 zusammengefaßt, die zeigen, daß das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren eine niederere Fehlerrate aufweist, als Ortho's Diagnosekit für Hepatitis C der Seite 138. 46

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Tabelle 2

Vergleich der Diagnosen mittels Ortho's 2nd Generation Immunoblotting-Kit und dem Diagnosekit gemäß Erfindung Proben No. Antigene der Ortho 2nd Generation Immunoblotting Kit Beurteilung' Diagnostic Kit**(7-B) 5-1-1 C100-3 C33c C22-3 SOD 1" + /- + /- - - - - - 2 + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + 3 + + /- + + + + + + + + - + + + + + 4 + + + + + + + + + + /- - + + + + + 5 - - - - - - - 6 - - - - - - - 7 - + /- - - - - - 8 - - - - - - - 9 - + /- - - - - - 10 - - - - - - - Positive Controlle + + + + + + + + + + + + " + + + + + Negative Controlle ' ' ' ’ Wenn bei einer Probe mehr als ein + gefunden wurden, das heißt, daß eine positive Reaktion bezüglich wenigstens 2 Antigenen ausgenommen das SOD Kontroll-Antigen vorlag, dann wurde die Probe als positiv beurteilt. ” Als Reaktionsmittel wurde ein gemischtes Antigen eingesetzt, das aus Beispiel 7-B erhalten wurde.

Beispiel 8: Bestimmung der Gegenwart von Hepatitis C Viren mit einer Sonde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion 8-A: Extraktion der RNA von Hepatitis C Viren

Zu 100dl eines zu untersuchenden Serum wurden 100dl einer TNE Lösung (100mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,2mM EDTA, 0,2M NaCI), 300dl einer RNAzol Lösung (TM Cinna Scientific, Inc., Texas 77546, USA) und 300U.I Chloroform zugegeben, wonach mittels starkem Schütteln gemischt wurde. Die Mischung wurde mit 15.000rpm bei einer Temperatur von 4*C für 5 Minuten mit einer Eppendorf Midronfuge zentrifugiert, um einen Niederschlag zu bilden. Der Überstand wurde gesammelt und mit 300ul Phenol und 300dl Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde ausgefäilt und die Fällung in 10ul TE Puffer gelöst (10mM Tris HCl. pH 8,0, 0,1 mM EDTA) und bei einer Temperatur von -70 *C gelagert. 8-B: Bestimmung der Gegenwart von Hepatitis C Viren mit Polymerase Kettenreaktion

Die oben extrahierte RNA wurde mit 4uI destilliertem Wasser und 1dl 0,1 M CH3HgOH gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehengelassen. 0,5ul 1M /3-mercaptoethanol, 10dl RNasin, 5ul 5X RT Puffer (BRL, Gaithersburg, MD 20877, USA). 1,25ul dNTP (10mM dGTP, dTTP, dCTP und dATP), 1ug Random Primer, 1,25dl (18 unit/u.l) Superscript H-Reversetranscriptase (BRL, USA) wurden zugegeben. Dann wurde destilliertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 25ul zugegeben und bei einer Temperatur von 42 *C für 1 Stunde reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gesamte auf eine Temperatur von 65 *C für 15 Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren, und für die Polymeraskettenreaktion verwendet.

Eine erste Polymerasekettenreaktion wurde wie folgt durchgeführt. 0,5dl Amplitaq DNA Polymerase (Perkin Eimer Cetus, USA) wurde mit 10dl 10X Taq Polymerasepuffer (10mM Tris-HCI, pH 8,3, 500mM KCl, 155mM MgClz, 0,1% (w/v) Gelatine), 10dl einer Mischung von 1,25mM dNTPs, 2ug Primer A 5'-CATAGTGGTCTGCGGAACCG-3', 2dg Primer B 5'TTGAGGTTT-AGGATTCGTGC-3'und 75dl destilliertem 47

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Wasser vermischt. 50u.l Mineralöl wurden zugegeben, um das Verdampfen der Lösung zu verhindern. Die erste PCR wurde ausgeführt, indem 40x der folgende thermische Zyklus durchlaufen wurde: 95 *C für 2 Minuten, 55 *C für 2 Minuten und 72 *C für 3 Minuten.

Eine zweite PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie die erste PCR durch 20-fache Widerho-lung durchgeführt, nachdem 1ul des Produktes der ersten PCR mit 1u1 des Primers C 5'-TA-CACCGGAATTGCCAGGAC-3’ und 1ul des Primers D 5'-TCATGGTGCACGGTCTACGAG-3' vermischt worden waren.

Etwa 5ul des Produktes aus der zweiten PCR wurden einer 7% Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen, um die Gegenwart von Hepatitis C Viren zu bestimmen, wobei die positive Probe ein DNA Band von 182bp zeigte.

Beispiel 9: Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen Hepatitis C Antigen des KHCV Proteins 9-A: Immunisierung

Das KHCV 897 Protein, in Salzlösung gelöst, wurde mit einer äquivalenten Menge Freund's complete adjuvant vermischt. 0,2ml einer Mischung mit 50ug des Proteins wurden einer etwa 10 Wochen alten Balb/c Maus intraperitoneal injiziert. 30ug des Proteins vermischt mit Freund's incomplete adjuvant wurden in Intervallen von 2 bis 3 Wochen injiziert. 2 Wochen nach der zweiten Injektion wurde eine kleine Menge des Blutes vom Schwanz der Maus abgenommen und einer Enzym Immunoassay unterworfen, un den Antikörper-Titer zu bestimmen. 50 bis 100u.g des Proteins in 0,5ml Salzlösung wurden weiters injiziert, wenn der Titer 10.000 erreichte. Der Antikörper-Titer wurd arbeitsmäßig als jene Verdünnung des Serums definiert, die einen 0,2 absorbance units background im ELISA Verfahren ergab. Nach 3 bis 4 Tagen wurden Milzzellen der Maus für die Herstellung einer Zelle verwendet, die einen monokolnalen Antikörper produziert. 9-B: Zellfusion

Immunisierte Milzzellen wurden mit P3 x 63 Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert, die eine Myelomzelie der Maus ist. 5 x 107 Milzzellen der immuniserten Maus wurden mit 2 x 107 P3 x 63-Ag8.653 gemischt und bei 300 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Zellniederschlag wurde mit IMDM Medium (Gibco, USA) gewaschen und zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und 1ml 50% PEG (Kodak, Molekulargewicht 1450 Dalton) Lösung wurde tropfenweise während 1 Minute dem Zellenniederschlag unter Rühren zugegeben. Weiters wurde bei 200 x 9 für 2 Minuten zentrifugiert. 5ml des IMDM Mediums wurden langsam über 3 Minuten zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5ml IMDM Medium, welches 10% fötales Rinderserum enthielt, über einen Zeitraum von 5 Minuten unter Rühren. IMDM Medium mit einem Gehalt von 10% fötalem Rinderserum wurde weiter zugegeben, bis zu einem Gesamtvolumen von 50ml und für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen. Ein IMDM-HAT Medium, hergestellt durch Zugabe von 10% fötalem Rinderserum, 100uM Hypoxanthin, 0,4/i.M Aminopterin und 16u.M Thymidin zu dem IMDM Medium, wurde hinzugefügt, um die Zellkonzentration auf 5 x 105 Zellen P3 x 63 Ag8.653 pro ml zu verdünnen. Das Produkt wurde auf eine Platte (95 Öffnungen) für Gewebskulturen in einer Menge von 0,1ml/öffnung gegeben. Den Öffnungen wurden jeweils 0,1ml IMDM-HAT Medium mit 1 x 105 Zellen/ml intraperitoneale Makrophagen zugeführt und einen Tag vor der Fusion kultiviert. Die myelomische Zelle und die nicht fusionierte Milzzelle können in dem HAT Medium nicht wachsen.

Demzufolge konnte von den in dem Medium gewachsenen Zellen angenommen werden, daß es sich um fusionierte Zellen handelt. Mit dem Überstand, von dem eine Probe gezogen worden war, wenn das Hybridoma auf einen Wert von 10 bis 50% gewachsen war, wurde ein Test auf Antikörperaktivität durchgeführt. 9-C: Untersuchung des Titers monoklonaler Antikörper

Eine Titration monoklonaler Antikörper, hergestellt in Stufe 9-B, wurde gemäß dem folgenden Enzymim-munotest (enzyme immunoassay) durchgeführt. 48

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Stufe 1 KHCV 897 Protein wurde in 50mM Natriumboratpuffer (pH 9,0) gelöst, bis eine Konzentration von 2ug/ml vorlag. 100uI der Lösung wurden zu jeder Öffnung einer Immulon Typ I plate (Dynatech) zugegeben und es wurde bei einer Temperatur von 37 *C für 2 Stunden inkubiert.

Stufe 2

Die Öffnungen wurden 1x mit PBS (pH 7,4) gewaschen, welche 0,05% Tween-20 (v/v) enthielt (im folgenden als Waschlösung bezeichnet). 200ul PBS mit einem Gehalt an 0,1% Gelatine (W/V) wurde zugegeben, um die Adsorbtionsstellen des Proteins zu blockieren, welche in der Öffnung bei einer Temperatur von 37 *C für 1 Stunde verblieben.

Stufe 3

Die Öffnungen der Stufe 2 wurden 2x mit der Waschlösung gewachsen. 50ul PBS mit einem Gehalt an 0,25% Gelatine (w/v), 1,0mM EDTA, 1% Triton X-100 (v/v) und 0,02% Thimerosal wurden zugegeben. 50ul des Überstandes, in dem fusionierte Zellen gewachsen waren, wurden zu jeder Öffnung zugegeben und bei einer Temperatur von 37 *C für 1 Stunde inkubiert.

Stufe 4

Die in Stufe 3 behandelten Öffnungen wurden 5x mit der Waschlösung gewaschen. Anti-Maus IgG-HRP (Boehringer Manheim, Cat. No. 605-250), markiert mit Horseradish-Peroxide (HRP) wurde mit PBS verdünnt, due 10% (v/v) fötales Rinderserum, 1% (v/v) Ficoll, 0,2% (v/v) Thimerosal und 0,05% (v/v) Tween-20 in einem Verhältnis von 1:5000 enthielt. Die verdünnte Lösung wurde zu den Öffnungen in einer Menge von 100ul/Öffnungen zugegeben und bei einer Temperatur von 37 “C für 1 Stunde inkubiert. Nach der Reacktion wurde die Platte 5x mit der Waschlösung gewaschen.

Stufe 5 100ul eines 50mM Citrat/Phosphatpuffers (pH 5,5) mit 10mg/5ml O.P.D. (Sigma Chemical Co.) wurden jeder Öffnung zugegeben und bei Raumtemperatur in Dunkeln für 30 Minuten reagieren gelassen. Um die Reaktion zu unterbrechen wurden 50ul 2N schwefeiige Säure zugegeben. Die Absorbtion wurde bei einer Wellenlänge von 492nm bestimmt. Das Hybridoma, welches die gewünschte Antikörperativität aufwies, wurde in eine Platte mit 6 oder 24 Öffnungen transferiert und dort wachsen gelassen, wobei nötigenfalls die peritonealen Makrophagen der Maus als Nährschicht Verwendung finden können, um den für das Wachstum der fusionierten Zellen notwendigen Wachstumsfaktor vorzusehen. 9-D: Herstellung der Antikörper

Es wurden 4 Zelllinien, nämlich Lucky 1.1, 1.2, 1.3 und 1.4 erhalten, die die gewänschten monoklonalen Antikörper produzierten.

Die erfindungsgemäßen Antikörper waren entweder erhältlich vom Dberstand, in welchem die Klone mittels herkömmlicher Methode kultiviert worden waren, oder von der Aszitenflüssigkeit, die die Klone enthielt, die im Peritoneum einer Balb/C Maus gewachsen waren. 2,5 x 106 fusionierte Zellen wurden intraperitoneal in eine Balb/c Maus injiziert, die 7 bis 14 Tage zuvor mit 0,5ml Pristane (Sigma) vorbehandelt worden war. Nach 1 bis 2 Wochen wurde eine Seroperitoneumflüssigkeit erhalten. Daraus wurden Antiköper nach einer konventionellen Methode isoliert. 9-E: Bestimmung der Merkmale des monoklonalen Antikörpers

Die Merkmale der Antikörper, die von jedem in Beispiel 9-D erhaltenen Klon hergestellt worden waren, wurden wie folgt bestimmt. 49

5 ÄT 405 053 B

Stufe 1: Antikörper Subklasse

Die Subklasse der Maus-Antikörper wurde bestimmt, indem ein Hybridoma sub-lsotyping Kit (Calbio-chem, USA) verwendet wurde. Die Resultate sind in Tabelle 3 dargestellt.

Stufe 2: Enzymimmunoassay 200ul KHCV 897 Protein, aufgelöst in 50mM Natriumboratpuffer in einer Konzentration von 2ug/ml wurden jeder Öffnung einer Mikrotiterplatte (Dynatech Immunolon Typ 1) zugegeben und bei einer io Temperatur von 37 *C für 2 Stunden inkubiert. Die Platte wurde mit PBS gewaschen, die 0,05% Tween-20 (v/v) enthielt. Die von jedem Klon erhaltenen Antikörper wurden mittels herkömmlicher Methode gereinigt, auf eine Konzentration von 1mg/ml eingestellt und seriell in 2 Schritten mit PBS verdünnt, welches 0,25% Gelatine (v/v), 1,0% Triton X-100, 0,02% Thimerosal und 1mM EDTA entiheilt. 210ul PBS mit einem Gehalt an 0,1% Gelatine wurden jeder Öffnung zugegeben und bei einer Temperatur von 37 *C für 1 Stunde 15 inkubiert. Die Platte wurde mit der Waschlösung gewaschen. 200U.I der anti-Maus IgG (Boehringer Manheim, Cat. No. 605-250), markiert mit Horseradish-Peroxidase, gelöst in PBS mit 10% FBS (v/v), 1% Ficoll (v/v) und 0,05% (v/v) Tween-20, wurden zu jeder Öffnung zugegeben und bei einer Temperatur von 37'C für 1 Stunde inkubiert. Die Entwicklungsreaktion wurde auf die gleiche Weise ausgeführt, wie in Beispiel 9-C. Die EIA Wirksamkeit jedes Antikörpers wurde als 20 reziproke Zahl des Verdünnungsfaktors bestimmt, wenn der O.D. Wert bei 495nm größer als 1,0 war. Die Resultate sind in Tabelle 3 angegeben.

Stufe 3: Bestimmung des Molekulargewichtes 25 Jede Klon wurde in einer Platte oder dem Peritoneum einer Maus kultiviert. Der Überstand oder die aszite Flüssigkeit, die davon erhalten worden waren, wurden einer Protein-G-Sepharosesäulenaffinitätschro-matographie (Pharmacia) unterworfen, um IgG zu isolieren, welches dann einer SDS-PAGE unterworfen wurde, um das Molekulargewicht der schweren und der leichten Kette im zuvor erhaltenen Mäuse-Antikörper zu bestimmen. Die Resultate sind in Tabelle 3 dargestellt. 30

Stufe 4: Bestimmung des Epitops

Die Varianten, in denen ein Abschnitt der KHCV 897 cDNA verschieden ausgeschnitten wurde, wurden so ausgebildet, daß die folgenden Proteine kodiert waren. Die Reaktivität des Proteins zu jedem monoklona-35 len Antikörper wurde untersucht. (1) KHCV 897 Protein: (2) KHCV 290 Protein: (3) KHCV 430 Protein: (4) KHCV 570 Protein: (5) KHCV 652 Protein: (6) KHCV 150 Protein: (7) KHCV 257 Protein: (8) KHCV 518 Protein:

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1192 bis 1457 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist.

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1192 bis 1289 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist. 40 (3) khcv 430 Protein: Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1192 bis 1335 der Aminosäurese quenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist.

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1192 bis 1382 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist. 45

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1192 bis 1407 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist.

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1408 bis 1457 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist.

Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1371 bis 1457 der Aminosäuresequenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist. so (8) KHCV 518 Protein: Ein Protein, welches aus den Aminosäuren 1285 bis 1457 der Aminosäurese quenz bestand, die in KHCV-LBC1 kodiert ist. Für die SDS-PAGE wurde eine Probe hergestellt, indem ein Puffer (Laemmli, U.K., Nature 277, 680 (1970)) zu E. coli Zellen zugegeben wurde, due jedes KHCV cDNA Fragment exprimierten. Die Probe wurde bei einer Temperatur von 100*C 5 Minuten gekocht. Die Reaktivität der hergestellten Probe 55 gegenüber dem Antikörper wurde mittels der Immunoblotting-Methode untersucht (Towbin, H., J. Immunol. Methods 72, 313-340 (1984)). Die Resultate sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben.

Aus dem Ergebnis ersieht man, daß die von Lucky 1.1 erhaltenen Antikörper eine Erkennungsstelle für die Aminosäuren 1192 bis 1289 der Aminosäuresequenz der Hepatitis C besitzen. Lucky 1.2, 1.3 und 1.4 50

AT 405 053 B besitzen eine Erkennungsstelle für die Aminosäuren 1371 bis 1407. Zwei monoklonale Antikörper, deren Epitope voneinander verschieden sind, können dazu verwendet werden, einen Kit herzustellen, woduch die Antigene einer Serumprobe bestimmt werden können, indem ein Sandwich Enzym Immunoassay oder ähnliches verwendet wird.

Tabelle 3

Merkmale der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper Monoklonaler Antikörper Subklasse Molekular-Gewicht EIA Wirksamkeit Bindungsstelle Antikörper Aminosäuresequenz Lucky 1.1 igGi 162.000 x 51.200 1192-1289 Lucky 1.2 igGi 159.700 x 102.400 1371-1407 Lucky 1.3 IgGi 180.800 x 51.200 1371-1407 Lucky 1.4 IgGi 177.700 x 400 1371-1407

Tabelle 4 (mmunoreaktivität ausgeschnittener (excised) Mutanten mit Antikörpern Antigen Antikörper Lucky 1.1 Lucky 1.2 Lucky 1.3 Lucky 1.4 KHCV 897 + + + + KHCV 290 + - - - KHCV 430 + - - - KHCV 570 + - - - KHCV 652 + - - - KHCV 150 - - - - KHCV 257 - + + + KHCV 518 - + + + Negative Kontrolle _ • Erkennungsstelle der Aminosäuresequenz 1192-1289 1371-1407 1371-1407 1371-1407

Die Zelllinien Lucky 1.1 und Lucky 1.2 wurden am 18. Dezember 1991 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und erhielten die Zugriffsnummer 10949 und 10950.

Beispiel 10: Diagnosemittel mit einem Antikörper gegen KHCV Antigen

Stufe 1: Markieren des monoklonalen Antikörpers von Lucky 1.1 mit Horseradish-Peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)

In eine ersten Stufe wurde die genannte Lucky 1.1 Zelllinie mit Horseradisch-Peroxidase markiert, indem die bekannte Periodate Method (Nakane et al., J. Histochemcytochem., 22, 1084 (1974)) wie folgt angewendet wurde. 0,3ml 0,1 M Natriumperiodat in einem lOrnM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) wurde zu 1,2ml destilliertem Wasser zugegeben, in dem 5mg der Peroxidase gelöst war. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten reagieren gelassen. Das Produkt wurde gegen 1mM Natriumcetatpuffer für 16 Stunden dialysiert. 1,5ml der Peroxidaselösung wurden mit 1ml des zu markierenden Antikörpers gemischt, der vorher durch Auflösen in 20mM Natriumkarbonat (pH 9,5) in einer Konzentration von 10mg/ml hergestellt worden war. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden reagieren gelassen. Die überschüssige Schiff sehe Base wurde durch Addition von lOOul eines 4mg/ml Natriummonohydrids in destilliertem Wasser reduziert und damit entfernt. Das Produkt wurde gegen PBS (pH 7,4) über Nacht der Dialyse unterworfen und dann über eine Sephacryl S 300 Chromatographiersäule geschickt, um monoklonale Antikörper zu entfernen, die nicht markiert waren. 51

AT 405 053 B

Stufe 2: Adsorbtion des monoklonalen Antikörpers von Lucky 1.2 an der Mikrotiterplatte 200ul der 5ug/ml Lucky 1.2, verdünnt mit PBS, wurden in jede Öffnung (well) gegeben, um dessen Adsorbtion an der Wand der Öffnung bei 37 * C für 2 Stunden zu erlauben. 5

Stufe 3: Blockieren der nicht-spezifischen Bindung

Der in Stufe 2 vorbereitete Mikrotiter wurde einmal mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween-20 und 0,02% Thimerosal enthielt (nachfolgend als Waschlösung bezeichnet). 200ul der PBS mit 0,1% Gelatine 70 wurden jeder Öffnung zugeführt, um die Proteinadsorbtionsstelle über eine Stunde abzudecken. Die Platte wurde 2x mit der Waschlösung gewaschen.

Stufe 4: Diagnose der Gegenwart des Antigens

75 200ul des KHCV 897 Antigens, das aufeinanderfolgend in zwei Schritten von 200ng/ml mit PBS verdünnt worden war, welches 0,25% (w/v) Gelatine, 1,0% (v/v) Triton X-100, 1mM EDTA und 0,02% Thimerosal enthielt, wurden zu jeder Öffnung zugegeben. Zum Vergleich wurde KHCV Protein einer normalen Blutprobe mit einer Konzentration von 400ng/ml zugesetzt. Die das KHCV Antigen enthaltende normale Blutprobe wurde aufeinanderfolgend in zwei Stufen verdünnt. 100ul des verdünnten Blutes wurden 20 mit lOOul des genannten Puffers vermischt und zu jeder Öffnung zugegeben. Dies sollte zeigen, daß die Gegenwart eines Antigens von Hepatitis C in Blut mittels des Sandwich Enzym Immunoassay festgestellt werden kann, indem die erhaltenen Antikörper verwendet werden. Das normale Blut, dem das KHCV 897 Antigen nicht beigemengt worden war, wurde zur negativen Kontrolle verwendet. Die Platte wurde bei einer Temperatur von 37’C für 1 Stunde inkubiert und mit der Waschlösung 5x gewaschen. 25

Stufe 5: Untersuchung des Antigens mittels des mit Peroxidase markierten Lucky 1.1 200u.l Lucky 1.1, das auf eine Konzentration von 5ug/ml mit PBS, enthaltend 10%(v/v) fötales Rinderserum, 1% Ficoll, 0,05% Tween 20 und 0,02% Thimerosal, verdünnt worden war, wurde zu jeder 30 Öffnung zugegeben, und es wurde bei einer Temperatur von 37 *C für eine Stunde inkubiert.

Stufe 6: Farbentwicklungsreaktion

Die in Stufe 5 behandelte Platte wurde 5mal mit der Waschlösung gewaschen. 200ul des O.P.D.-35 Entwicklungsreagens, welches durch Zugabe von O-Phenylendiamin(Sigma) zu 50mM Citrat/Phosphatpuffer (pH 5,5) auf eine Konzentration von 2mg/ml hergestellt worden war, wurde zu jeder Öffnung zugegeben und be Raumtemperatur in Dunkelheit für 30 Minuten stehen gelassen, um eine Farbreaktion zu entwickeln. 50ul der 4N schwefeligen Säure wurden hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Deren Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 43 daagestellt. 40

Beispiel 11: Untersuchung des Antigens im Serum eines Hepatitis-C-Patienten mittels Sandwich-Enzym-Immunoassay (Immunotest) 100ul eines zu analysierenden Serums, welches mit 100ul des in Stufe 4 des Beispiels 10 verwendeten 45 Puffers vermischt worden war, wurden zu jeder Öffnung des Mikrotiters gegeben, der auf die gleiche Weise vorbereitet worden war, wie in Beispiel 10 beschrieben, und an dem der monoklonale Antikörper bereits adsorbiert worden war. Das Antigen in dem Serum wurde auf die gleiche Weise untersucht, wie in Beispiel 10. Die Resultate sind in Tabelle 5 angeführt. 220 von 231 Proben (220/231) zeigten den Absorptionswert (O.D.) bei 492nm von weniger als 0,15. Die 50 anderen 11 Proben zeigten Werte zwischen 0,15 und 0,8, die ebenfalls als positiv beurteilt wurden. In Übereinstimmung mit der Halbert'schen Methode (Halbert, S.P. et al., Clin, Chim. Acta 127, 69(1983)) wurde eine Absorption von 0,15 als Cutoff-Wert angenommen. Für 15 Proben wurde due gegen KHCV gerichteten Antikörper einschließlich der 11 positiven Proben untersucht, wie bei dem gleichen Verfahren in Beispiel 7. Die Resultate sind in Tabelle 6 dargestellt. Diese 55 Resultate legen nahe, daß der Sandwich ELISA for die Entdeckung von KHCV 897-Antigenen wertvoll ist und zur frühen Entdeckung einer KHCV-Infektion herangezogen werden kann. Gemeinsam mit EIA für das Aufspüren der Antikörper sollte ELISA für die Antigenuntersuchung für die Pflege und den Schutz von HCV-Patienten verwendet werden. 52

AT 405 053 B

Tataal i g 5« &bRnrption von Proben, hpgtimnit·.. mittels Sandwich-Enzy^-

ImrnLipragsav

Absorption Probennummer Prozentsatz11 >= 0-5 1 j 0.43 0.3 - 0.5 3 | 1.30 0.2 - 0.3 4 1.73 0.15 - 0.2 3 1.30 < 0.15 220 95.24 Total 231 100.00

Bemericung: ^Prozentsatz (%) =» der ^ntersuäiten Proben

Anzahl der gesamten Proben

Tabelle 6

Test auf Hepatitis-C-Antikörper und Antigen Probe Antikörper Hepatitis C Antigen Hepatitis C 1 - + 2 - + 3 - - 4 - + 5 - + 6 - + 7 - - 8 + - 9 - + 10 - + 11 - + 12 - + 13 - + 14 + + 15 - -

Bemerkung:11 Als Cutoff-Wert wurde ein Absorptionswert von 0,15 für die Antigendiagnose und 0,33 für die Antikörperdiagnose festgesetzt. 53

Claims (37)

1. AT 405 053 B Demzufolge sind die erfindungsgemäßen KHCV-Proteine, insbesondere bei Verwendung des gemischten Antigens mit drei Proteinen, reaktiver gegenüber den Antikörpern gegen KHCV, als der kommerziell HCV-Diagnosekit, wie dies in Tabelle 1 gezeigt ist. Der erfindungsgemäße Diagnosekit erzeugt genauere Testresultate als der kommerziell erhältliche Kit. Weiters ist er besser brauchbar und ökonomischer als der Referenzuntersuchungskit, wie in Tabelle 2 gezeigt ist. Während die Erfindung in Verbindung mit gewissen speziellen Ausführungsbeispielen beschieben worden ist, muß bemerkt werden, daß der Fachmann verschiedene Modifikationen und Abänderungen innerhalb der gegebständlichen Erfindung vornehmen kann, ohne den Schutzbereich der Ansprüche zu verlassen. Patentansprüche 1. KHCV cDNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Nucleotidsequenz aufweist: 10 20 30 40 50 50 ggccagcccccgattgggggcgacactccaccatagatcactcccctgtgaggaactact ccggtcgggggctaacccccgctgtgaggtggtatctagtgäggggacactccttgatga 70 80 90 100 110 120 GTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGA CAGAAGTGCGTCTTTCGCAGATCGGTACCGCAATCATACTCACAGCACGTCGGAGGTCCT 130 140 150 160 170 130 CCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCA GGGGGGGAGGGCCCTCTCGGTATCACCAGACGCCTTGGCCACTCATGTGGCCTTAACGGT 190 200 210 220 230 240 GGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCC CCTGCTGGCCCAGGAAAGAACCTAGTTGGGCGAGTTACGGACCTCTAAACCCGCACGGGG 250 260 270 280 290 300 CGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAG GCGCTCGGACGATCGGCTCATCACAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATC 310 320 330 340 350 360 GGTGCTGGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTÄAA CCACGAACGCTCACGGGGCCCTCCAGAGCATCTGGCACGTGGTACTCGTGCTTAGGATTT H S T N P R 370 380 390 400 410 420 CCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGATATTAAGTTCCCGGGC ggagtttctttttggtttgcattgtgg’ttggcggcgggtgtcctataattcaagggcccg PQRK TRRNTNRRPQDIXFPG 430 440 450 460 470 480 ggtggtcagatcgttggtggagtttacttgttgccgcgcaggggccccaggttgggtgtg ccaccagtctagcaaccacctcaaatgaacaacggcgcgtccccggggtccaacccacac G G Q I V G G V Y L L ? R R G ? R L G V 4S0 500 510 520 530 540 cgcgcgactaggaagacttccgagcggtcgcaaccg CGTGGAAGGCGACAGCC TATCCCC gcgcgctgatccttctgaaggctcgccagcgttggagcaccttccgctgtcggatagggg RATRXTSRRSQPHGR'r 'QPIP 550 560 57C 580 550 600 aaggctcgccggcccgagggcagggcctgggctcagcccgggtacccttggcccctctat ttccgagcggccgggctcccgtcccggacccgagtcgggcccatgggaaccggggagata :< A R R P Ξ G R A W A Q ? G Y P W ? L Y 54 AT 405 053 B 610 620 630 640 650 660 ggcaatgagggcttggggtgggcaggatggctcctgtcaccccgcggctcccggcctagt CCGTTACTCCCGAACCCCACCCGTCCTACCGAGGACAGTGGGGCGCCGAGGGCCGGATCA GNEGLGWAGWLLSPRGSRPS 670 680 690 700 710 720 TGGGGCCCCACGGACCCCCGGCGTAAGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGACACCCTC ACCCCGGGSTGCCTGGGGGCCGCATTCAGCGCATTAAACCCATTCCAGTAGCTGTGGGAG ? T D P R R K S R N L G X V I D T L 730 740 750 760 770 780 ACATGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTCGTCGGCGCCCCCCTAGGGGGC TGTACGCCGAAGCGGCTGGAGTACCCCATGTAAGGCGAGCAGCCGCGGGGGGATCCCCCG TCGFADLMGYIPLVGAPLGG 790 800 810 820 830 840 GTTGCCAGGGC C CTGGCAC ATGGTGTCCGGGTGCTGGAGGAC GGC GTGAACTATGCAACA CAACGGTCCCGGGACCGTGTACCACAGGCCCACGACCTCCTGCCGCACTTGATAGGTTG? VARALAFGVRVLEDGVNYAT 850 860 870 880 890 900 GGGAATCTGCCCGGTTGCTCTTTCTCTATCTTCCTCTTGGCTCTGCTGTCTTGTTTGACC CCCTTA.GACGGGCCAACGAGAAAGAGA7AGAAGGAGAACCGAGACGACAGAACAAACTGG GNLPGCSFS IFLLALLSCLT 910 920 930 940 950 960 ACCCCAGTTTCCGCTTATGAAGTGCGTAACGCGTCCGGGATGTACCATGTCACGAACGAC TGGGGTCAAAGGCGAATACTTCACGCATTGCGCAGGCCCTACATGGTACAGTGCTTGCTG TPVSAYSVRNASGMYHVTND 970 580 ' 990 1000 1010 1020 TGCTCCAACTCAAGCATTGTGTATGAGGCAGCGGACATGATCATGCACACTCCCGGGTGC ACGAGGTTGAGTTCGTAACACATACTCCGTCGCCTGTACTAGTACGTGTGAGGGCCCACG CSNSSIVYZAADHIMHTPGC 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GTGCCCTGCGTTCGGGAGGACAACTCCTCCCGTTGCTGGGTGGCACTTACTCCCACGCTC C AC GGGAC GC AAGCC CTCCTGTTGAGG AC-GGC AACGAC CCACC GTGAATGAGGGTGC GAG VPCVRSDNSSRCWVALTPTL 1090 1100 1110 —1120 - 1130 1140 GCGGCCAGGAATGCCAGCGTCCCCACTACGACATTGCGACGCCATGTCGACTTGCTCGTT CGCCGGTCCTTACGGTCGCAGGGGTGATGCTGTAACGCTGCGGTACAGCTGAACGAGCAA aarnasvptttlrrevdi.lv 1150 1150 1170 1180 1190 1200 GGGGTAGCTGCTTTCTGTTCCGCTATGTACG7GGGGGACCTCTGCGGATCTGTTTTCCTT CCCCATCGACGAAAGACAAGGCGATACATGCACCCCCTGGAGACGCCTAGACAAAAGGAA GVAAFCSAMYVGDLCGSVFL 55 AT 405 053 B 1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTTTCCCAGCTGTTCACCTTTTCGCCTCGCCGGCATGAGACGGTACAGGACTGCAACTGC CAAAGGGTC GACAAGTGGAAAAGC GGAGC GGC C GTAC7CTGC CATGTC CTGAC GTTGACG VSQLFTFSPRRHSTVQDCNC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 TCÄATCTATCCCGGCCGCGTATCAGGTCACCGCATGGCCTGGGATATGATGATGAACTGG AGTTAGATAGGGCCGGCGCATAGTCCAGTGGCGTACCGGACCCTATACTACTACTTGACC S IYPGRVSGHRHAWDHMKNW 1330 1340 1350 1360 1370 1380 TCGCCTACAACAGCCCTAGTGGTATCGCAGCTACTCCGGATCCCACAAGCTGTCGTGGAC AGCGGATGTTGTCGGGATCACCATAGCGTCGATGAGGCCTAGGGTGTTCGACAGCACCTG S ? TTALVV S QL L R I P QAVVD 1350 1400 1410 1420 1430 1440 ATGGTGACAGGGTCCCACTGGGGAATCCTGGCGGGCC'TTGCCTACTATTCCATGGTGGGG TACCACTGTCCCAGGGTGACCCCTTAGGACCGCCCGGAACGGATGATAAGGTACCACCCC HVTGSHWGILAGLAYYSMVG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 AACTGGGCTAAGGTCTTAATTGCGATGCTACTCTTTGCCGGCGTTGACGGAACCACCCAC TTGACCCGATTCCAGAATTAACGCTACGATGAGAAACGGCCGCAACTGCCTTGGTGGGTG NWAKVLIAHLL FAGVDGTTE 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GTGACAGGGGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCTAGCTCGCTAACGTCCCTCTTTAGCCCTGGG CACTGTCCCCCCCGCGTTCCAGCCCGGCGATCGAGCGATTGCAGGGAGAAATCGGGACCC VTGGAQGRAASSLTSLFSPG 1570 . 1580 1550 1600 1610 1620 CCGGTTCAGCACCTCCAGCTCATAAACACCAACGGCAGCTGGCATATCAACAGGACCGCC GGCCAAGTCGTGGAGGTCGAGTATTTGTGGTTGCCGTCGACCGTATAGTTGTCCTGGCGG PVQHLQLINTNGSWEINRTA 1630 1640 1650 1660 1670 1680 CTGAGCTGCAATGACTCCCTCAACACTGGGTTTGTTGCCGCGCTGTTCTACAAATACAGG GACTCGACGTTACTGAGGGÄGTTGTGACCCAAACAACGGCGCGACAAGATGTTTATGTCC LSCNDSLNTGFVAALFYKYR 169 0 17 00 1710 i-7 20 -1730 1740 TTCAACGCGTCCGGGTGCCCGGAGCGCTTGGCCACGTGCCGCCCCATTGATACATTCGCG AAGTTGCGCAGGCCCACGGGCCTCGCGAACCGGTGCACGGCGGGGTAACTATGTAAGCGC S A S G C P Ξ R L A T C R P IDT F A 1750 1760 1770 1780 1790 1800 •GGGTGGGG? 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2. 2. Polynucleotid, welches ein KHCV-Epitop kodiert, das aus der folgenden Gruppe von Nucleotidsequen-zen in einer KHCV cDNA voller Länge gemäß Anspruch 1 ausgewählt ist: 301.-726.; 301.-855.; 343.-726.; 343.-852.; 343.-915.; 814.-1326.; 916.-1509.; 1201.-2016.; 1510.-2010.; 1510.-2529.; 2011.-2529.; 1945.-2742.; 3208.-3960.; 3475.-3744.; 3916.-4713.; 3928.-4563.; 5422.-5547.; 6649.-7050.; 6649.-7824.; 7612.-8184.; 7642.-8136.; und 8722.-9216., oder eine Kombination von zwei oder mehreren derartigen Polynucleotiden, oder ein Fragment dieses Polynucieotids, welches ein Polypeptid kodiert, das eine genügend große Anzahl von Aminosäureresten kodiert, um eine immunoreaktive und/oder antigene Determinante zu bilden.
3. 3. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er einen offenen Leseraster umfaßt, der das Polynucleotid gemäß Anspruch 2 enthält, wobei der offene Leseraster wirksam mit einer Regulatorsequenz verbunden ist, die mit einem gewünschten Wirtsorganismus kompatibel ist.
4. 4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der offene Leseraster ein Polynucleotid enthält, das Ubiquitin kodiert, das mit dem Polynucleotid gemäß Anspruch 2 fusioniert ist.
5. 5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Hefe-Expressionsvektor aus der Gruppe pYLBC-A/G-UB-CORE 14, pYLBC-A/G-UB-CORE 17, pYLBC-A/G-UB-CORE 22, pYLBC-A/G-UB-KHCV 897, pYLBC-A/G-UB-KHCV 403, pYLBC-A/G-UB-KHCV 573, pYLBC-A/G-UB-E2N und pYLBC-A/G-UB-E2C ist. 69 AT 405 053 B
6. 6. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein E. coli-Expressionsvektor aus der Gruppe ptrpH-UB-CORE 14, ptrpH-UB-CORE 22, ptrpH-UB-KHCV 897, ptrpH-UB-E2N oder ptrpH-UB-E2C ist.
7. 7. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der offene Leseraster ein Polynucieotid enthält, das ein Maltose bindendes Protein kodiert, das mit dem Polynucieotid gemäß Anspruch 2 fusioniert ist.
8. 8. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er ein E. coli-Expressionsvektor aus der Gruppe pMAL-KHCV 426, pMAL-KHCV 555, pMAL-KHCV 513, pMAL-KHCV 810, pMAL-KHCV 798, pMAL-KHCV 754, pMAL-KHCV 652, pMAL-KHCV 403, pMAL-KHCV 271, pMAL-KHCV 495 und pMAL-KHCV 494 ist.
9. 9. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor gemäß Anspruch 3 transformiert ist.
10. 10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Hefezelle ist, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert ist.
11. 11. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformierte E.coli-Zelle ist.
12. 12. Wirtszeile nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 8 transformierte E.coli-Zelle ist.
13. 13. Polypeptid, welches immunologisch ident mit einem Epitop ist, das durch die KHCV-cDNA gemäß Anspruch 1 kodiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß es ein KHCV-Polypeptid umfaßt, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: 1.-128.; 1.-170.; 1.-191.; 158.-328.; 192.-389.; 287.-558.; 390.-556.; 390.-729.; 535.-1028.; 557.-729.; 956.-1206.; 1045.-1134.; 1192.-1457.; 1196.-1407.; 1694.-1735.; 2103.-2236.; 2103.-2494.; 2424.-2614.; 2434.-2598.; 2794.-2958.; und Polypeptiden mit 142 und 185 Aminosäuren, kodiert von den Nucleotiden 301.-726. und 301.-855. der KHCV-cDNA des Anspruch 1; sowie eine Kombination von zwei oder mehreren dieser Polypeptide oder ein Fragment davon, welches ein Polypeptid kodiert, das eine genügend große Anzahl von Aminosäureresten kodiert, um eine immunore-aktive und/oder antigene Determinante zu bilden.
14. 14. Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes KHCV-Polypeptid ist, welches mit einem ubiquitin- oder maltosebindenden Protein fusioniert ist.
15. 15. Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ein KHCV UB 897 Protein, KHCV 897 Protein, UB E1 Protein, KHCV 403 Protein, KHCV CORE 14 Protein, KHCV 573 Protein, KHVC UB CORE 17 Protein, E2N Protein, E2C Protein, UB-E2N Protein, UB-E2C Protein, KHCV 426 Protein, KHCV 555 Protein, KHCV 513 Protein, KHCV 810 Protein, KHCV 798 Protein, KHCV 271 Protein, KHCV 754 Protein, KHCV 652 Protein, KHCV 403 Protein, KHCV 495 Protein oder KHCV 494 Protein ist.
16. 16. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: Linken eines das Polypeptid kodierenden Polynucleotids an eine Regulatorsequenz eines Vektors; Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor; und Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression dieses Polypeptids erlauben.
17. 17. Diagnosemittel für das Aufspüren von Antikörpern gegen KHCV-Antigen in einer verdächtigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid gemäß Anspruch 13 als aktiven Bestandteil enthält.
18. 18. Diagnosemittel nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es zwei oder mehrere Polypeptide gemäß den Ansprüchen 13 bis 15 enthält.
19. 19. Diagnosemittel nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehrere Polypeptide enthält, die aus der Gruppe KHCV UB CORE 14 Protein, KHCV 897 Protein und KHCV 403 Protein ausgewählt sind. 70 AT 405 053 B
20. 20. Diagnosekit, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Diagnosennittel gemäß Anspruch 17 enthält.
21. 21. In vitro Diagnoseverfahren zum Aufspüren eines gegen KHVC-Antigen gerichteten Antikörpers in einer verdächtigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte vorgesehen sind: (a) Adsorption eines Polypeptids, welches im wesentlichen immunologisch identisch mit einem in KHCV enthaltenen Epitop ist, an einem festen Träger, (b) Zugabe einer zu untersuchenden Probe zum festen Träger, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden und die Menge des Komplexes zu bestimmen.
22. 22. Diagnoseverfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit gemäß Anspruch 20 in jeder dieser Stufen angewendet wird.
23. 23. Diagnoseverfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit ein Diagnosemittel nach Anspruch 19 umfaßt.
24. 24. Monoklonaler Antikörper, der gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 13 gerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer Hybridomazelle, hergestellt durch Fusionieren einer Spleen-Zelle einer rnit dem Polypeptid immunisierten Maus und einer Myeloma-Zelle erzeugt ist.
25. 25. Antikörper nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er in einer IgG-Subklasse eingeschlossen ist.
26. 26. Antikörper nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein KHCV 897 Protein gerichtet ist, das ein Polypeptid der 1192. bis 1457. Aminosäuresequenzen des gesamten Polypeptids, kodiert in der KHCV cDNA gemäß Anspruch 1 in voller Länge, ist.
27. 27. Antikörper nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der folgenden Aminosäuresequenz immunoreaktiv ist, die die 1192. bis 1289. Aminosäure des gesamten Polypeptids, kodiert in der KHCV cDNA voller Länge gemäß Anspruch 1, umfaßt: Ala Val Glu Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Pro Ser Pro Pro Ala Val Pro Gin Thr Phe Gin Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Leu Arg Thr Gly Val Ai*§ Thr Ile Thr Thr Gly Ala
28. 28. Antikörper nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der folgenden Aminosäuresequenz immunoreaktiv ist, die die 1371. bis 1407. Aminosäure im gesamten Polypeptid, kodiert in einer KHCV cDNA der vollen Länge gemäß Anspruch 1, umfaßt: 71 AT 405 053 B Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu.
29. 29. Verfahren zur Herstellung einer Zellinie, die einen gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 13 gerichteten Antikörper bildet, dadurch gekennzeichnet, daß eine Myeloma-Zelle und eine Spieen-Zelle, die diesen Antikörper bildet, fusioniert werden.
30. 30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie Lucky 1.1 (ATCC 10949) oder Lucky 1.2 (ATCC 10950) ist.
31. 31. Diagnosemittel für das Aufspüren eines KHCV-Epitops in einer zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß als ein aktiver Bestandteil der Antikörper gemäß Anspruch 24 enthalten ist.
32. 32. Verfahren zum Aufspüren eines KHCV-Epitops in einer zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnosemittel gemäß Anspruch 31 angewendet wird.
33. 33. Impfstoff zur Behandlung oder Vorbeugung vor KHCV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß er inaktiviertes gereinigtes KHVC mit der cDNA gemäß Anspruch 1 enthält.
34. 34. Impfstoff für die Behandlung oder Vorbeugung vor KHCV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß er als aktiven Bestandteil ein Polypeptid enthält, das nach dem Verfahren gemäß Anspruch 16 hergestellt ist.
35. 35. Impfstoff nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß er als aktiven Bestandteil E1 Protein, E2N Protein und/oder E2C Protein als aktiven Bestandteil enthält, wobei es sich um Polypeptide der Aminosäurenummern 916-1509, 390-556 und 557-729 des gesamten Polypeptids, kodiert in der KHCV-cDNA des Anspruchs 1 in voller Länge, handelt.
36. 36. Kit für das Aufspüren eines von KHCV abgeleiteten Polynucleotids in einer zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nucleotidsequenz von 8 oder mehr Nucleotiden umfaßt, die von einer KHCV cDNA gemäß Anspruch 1 abgeleitet ist.
37. 37. Verfahren zum Aufspüren eines von KHCV abgeleiteten Polynucleotids in einer zu untersuchenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit gemäß Anspruch 36 angewendet wird. Hiezu 59 Blatt Zeichnungen 72