JP2655205B2 - 非a非b肝炎のアッセイ - Google Patents
非a非b肝炎のアッセイInfo
- Publication number
- JP2655205B2 JP2655205B2 JP4509995A JP50999592A JP2655205B2 JP 2655205 B2 JP2655205 B2 JP 2655205B2 JP 4509995 A JP4509995 A JP 4509995A JP 50999592 A JP50999592 A JP 50999592A JP 2655205 B2 JP2655205 B2 JP 2655205B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- assay
- antibody
- complex
- amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 48
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 title claims description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 33
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 24
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 18
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-DZQJYWQESA-N 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- YHXISWVBGDMDLQ-UHFFFAOYSA-N moclobemide Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(=O)NCCN1CCOCC1 YHXISWVBGDMDLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 4
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003263 homogeneous phase assay Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N isatin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NC2=C1 JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IMEJKJODGOOFNC-UHFFFAOYSA-N (2,4-dimethoxyphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 IMEJKJODGOOFNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYUGPLUDRALHKJ-UHFFFAOYSA-N 1-(cyclohexylamino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCC(S(O)(=O)=O)NC1CCCCC1 LYUGPLUDRALHKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229960000555 fenyramidol Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010091718 peptide L Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010004093 retinal S antigen peptide M Proteins 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 B型肝炎の原因因子の発見は、提供された血液中の該
因子の検出のための高感度のアッセイの開発と相俟っ
て、血液供給からのこのウイルスの迅速な実質的除去を
もたらした。しかしながら、輸血関連肝炎の他のウイル
ス形態が間もなく明らかとなり、一般的に非A非B肝炎
(NANBH)と命名された。チンパンジー中での感染血液
の継代接種を伴う研究から、NANBHを引き起こす感染因
子は1種より多く存在することが明らかである(例え
ば、Bradley,et al.,J.Infect.Dis.,148:254(1983)を
参照)。血液中におけるその存在は、感染の急性相にお
いてさえも1ml当たり感染性単位が僅か1000個台に過ぎ
ないことから、純粋なウイルスの単離が極度に困難であ
ろうことも初期の研究から明らかである。
因子の検出のための高感度のアッセイの開発と相俟っ
て、血液供給からのこのウイルスの迅速な実質的除去を
もたらした。しかしながら、輸血関連肝炎の他のウイル
ス形態が間もなく明らかとなり、一般的に非A非B肝炎
(NANBH)と命名された。チンパンジー中での感染血液
の継代接種を伴う研究から、NANBHを引き起こす感染因
子は1種より多く存在することが明らかである(例え
ば、Bradley,et al.,J.Infect.Dis.,148:254(1983)を
参照)。血液中におけるその存在は、感染の急性相にお
いてさえも1ml当たり感染性単位が僅か1000個台に過ぎ
ないことから、純粋なウイルスの単離が極度に困難であ
ろうことも初期の研究から明らかである。
初期における単離の失敗にもかかわらず、該ウイルス
は多くの基準によって予備的に特徴づけられた。クロロ
ホルムによる該因子の不活性化は、エンベロープウイル
スを示唆した(Hotta & Evans,Virology,2:773(198
5))。種々のポアサイズの膜を通したNANBH因子の濾過
は、30乃至60nmのサイズ範囲を示した。更に1.24g/mlの
ブイヨン密度でNANBH因子が約200Sで沈降したことが測
定された。最後に、該因子は電子顕微鏡法で可視化され
た(Cabral,et al.,Gastroent.,81:120(1981))。デ
ータの全てが、NANBH因子がトガ若しくはフラビウイル
スであり、又はトガ若しくはフラビウイルスと密接に関
係した群であるという結論の矛盾しない。
は多くの基準によって予備的に特徴づけられた。クロロ
ホルムによる該因子の不活性化は、エンベロープウイル
スを示唆した(Hotta & Evans,Virology,2:773(198
5))。種々のポアサイズの膜を通したNANBH因子の濾過
は、30乃至60nmのサイズ範囲を示した。更に1.24g/mlの
ブイヨン密度でNANBH因子が約200Sで沈降したことが測
定された。最後に、該因子は電子顕微鏡法で可視化され
た(Cabral,et al.,Gastroent.,81:120(1981))。デ
ータの全てが、NANBH因子がトガ若しくはフラビウイル
スであり、又はトガ若しくはフラビウイルスと密接に関
係した群であるという結論の矛盾しない。
NANBH研究において突破口がおとずれたのは、汚染さ
れた精製第VIII因子から得られたNANBHウイルスのチン
パンジーによる継代接種の途上においてであった。Brad
ley,et al.,Seminars in Liver Diease,6:56(1986)
は、ある特定のチンパンジーにおけるNANBH感染性単位
のタイターが通常観察されるタイターより1000倍大きい
ことを発見した。このNANBH因子の豊富な源は、Young
& Davis,PNAS,80:1194(1983)によって考案されたλg
tllシステムを利用した、Houghton,et al.によるcDNAの
作成及びスクリーニングを許容した(EP 0 318 216)。
EP 0318216は、大きな開いた読み取りフレームドメイン
を開示しており、それはNANBHの診断のための市販のイ
ムノアッセイにおける標的抗原であるC−100ポリペプ
チドを含む。この開示は、推定上の構造蛋白質をコード
しているウイルス性ゲノムの5′末端におそらく対応し
ている、ポリペプチドのかなりの部分を表す更なる配列
を開示している第2のヨーロッパ特許出願(EP 0 388 2
32)において、補足されている。
れた精製第VIII因子から得られたNANBHウイルスのチン
パンジーによる継代接種の途上においてであった。Brad
ley,et al.,Seminars in Liver Diease,6:56(1986)
は、ある特定のチンパンジーにおけるNANBH感染性単位
のタイターが通常観察されるタイターより1000倍大きい
ことを発見した。このNANBH因子の豊富な源は、Young
& Davis,PNAS,80:1194(1983)によって考案されたλg
tllシステムを利用した、Houghton,et al.によるcDNAの
作成及びスクリーニングを許容した(EP 0 318 216)。
EP 0318216は、大きな開いた読み取りフレームドメイン
を開示しており、それはNANBHの診断のための市販のイ
ムノアッセイにおける標的抗原であるC−100ポリペプ
チドを含む。この開示は、推定上の構造蛋白質をコード
しているウイルス性ゲノムの5′末端におそらく対応し
ている、ポリペプチドのかなりの部分を表す更なる配列
を開示している第2のヨーロッパ特許出願(EP 0 388 2
32)において、補足されている。
他の最近の外国出願には、NANBHに罹った患者の肝臓
切片からクローン化された更なる配列を開示している、
WO 90,02206(Seto)が含まれる。WO 90/00597(Neele
y)は、活性NANBHウイルス産生性の不死化したヒト肝細
胞からウイルスを産生する方法を提示している。ウイル
ス抗原を製造するための代わりの方法の一つは、EP 0 1
90 972(Yohko)に開示されており、感染チンパンジー
の肝臓組織から導かれた蛋白質のショ糖勾配上での遠心
手順を含む。'972においては、NANBHに感染したヒト又
はチンパンジーからのリンパ球をEpstein−Barrウイル
スで形質転換し、そして勾配精製された抗原に対して特
異的である抗体を分泌しているクローンをスクリーニン
グすることによって、モノクローナル抗体もまた得られ
た。上記NANBHポリペプチド配列は診断時アッセイに有
用であるといわれている。
切片からクローン化された更なる配列を開示している、
WO 90,02206(Seto)が含まれる。WO 90/00597(Neele
y)は、活性NANBHウイルス産生性の不死化したヒト肝細
胞からウイルスを産生する方法を提示している。ウイル
ス抗原を製造するための代わりの方法の一つは、EP 0 1
90 972(Yohko)に開示されており、感染チンパンジー
の肝臓組織から導かれた蛋白質のショ糖勾配上での遠心
手順を含む。'972においては、NANBHに感染したヒト又
はチンパンジーからのリンパ球をEpstein−Barrウイル
スで形質転換し、そして勾配精製された抗原に対して特
異的である抗体を分泌しているクローンをスクリーニン
グすることによって、モノクローナル抗体もまた得られ
た。上記NANBHポリペプチド配列は診断時アッセイに有
用であるといわれている。
追加のNANBHの配列がEP 0 363 025(Arima)に提示さ
れている。この配列は、NANBH患者からの血漿約100か
ら濃縮されたウイルスより抽出されたRNAより得られ
た。配列はλgtll cDNAライブラリーのイムノスクリー
ニングによって同定された。スクリーニング陽性のクロ
ーンのうち、そのようなクローンの1つは、EP 0 363 0
25(Arima)中の請求項2の式IIIに記載されたアミノ酸
配列を有するクローン18ペプチドを含んでいた。
れている。この配列は、NANBH患者からの血漿約100か
ら濃縮されたウイルスより抽出されたRNAより得られ
た。配列はλgtll cDNAライブラリーのイムノスクリー
ニングによって同定された。スクリーニング陽性のクロ
ーンのうち、そのようなクローンの1つは、EP 0 363 0
25(Arima)中の請求項2の式IIIに記載されたアミノ酸
配列を有するクローン18ペプチドを含んでいた。
発明の概要 NANBH因子に対する患者血清中に含まれた抗体の検出
のためのアッセイの定式化においては、アミノ酸配列QE
KKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNPGKNKKPRVGRIKNWNREG
RKDAYQIRKRRを有する、EP 0363 025中にArimaによって
記述された特定のNANBH血清と免疫反応性であることが
知られている63個のアミノ酸よりなるポリペプチドが、
該分子のアミノ末端から段階的に配列を短くしていくこ
とによって修飾された。本発明の改良されたアッセイ
は、残基21から26までの配列内に含まれるアミノ酸より
なる群より選ばれたアミノ酸残基から順次実質的にカル
ボキシ末端のアルギニンまで延びているポリペプチドの
部分と実質的に相同である、短縮されたフラグメントを
利用する。
のためのアッセイの定式化においては、アミノ酸配列QE
KKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNPGKNKKPRVGRIKNWNREG
RKDAYQIRKRRを有する、EP 0363 025中にArimaによって
記述された特定のNANBH血清と免疫反応性であることが
知られている63個のアミノ酸よりなるポリペプチドが、
該分子のアミノ末端から段階的に配列を短くしていくこ
とによって修飾された。本発明の改良されたアッセイ
は、残基21から26までの配列内に含まれるアミノ酸より
なる群より選ばれたアミノ酸残基から順次実質的にカル
ボキシ末端のアルギニンまで延びているポリペプチドの
部分と実質的に相同である、短縮されたフラグメントを
利用する。
本発明の別の面において、該ペプチドフラグメントは
(NANBHに罹患した個体から得られた)血清に対して反
応性である少なくとも1つのエピトープ含むが、イムノ
アッセイにおいて非特異的結合、高いバックグラウンド
及び偽の陽性シグナルに寄与することの見出されてい
る、該63アミノ酸ポリペプチドの残基21乃至26のアミノ
酸残基のいずれかからN末端まで延びる部分をも除去し
ている。これらのペプチドは、ワクチンとしても及び診
断又はスクリーニングアッセイにおいても有用性を有す
る。
(NANBHに罹患した個体から得られた)血清に対して反
応性である少なくとも1つのエピトープ含むが、イムノ
アッセイにおいて非特異的結合、高いバックグラウンド
及び偽の陽性シグナルに寄与することの見出されてい
る、該63アミノ酸ポリペプチドの残基21乃至26のアミノ
酸残基のいずれかからN末端まで延びる部分をも除去し
ている。これらのペプチドは、ワクチンとしても及び診
断又はスクリーニングアッセイにおいても有用性を有す
る。
本発明のペプチドを利用する改良されたアッセイの具
体例の一つにおいては、標的ペプチドフラグメントは固
体のマトリクス上に被覆され、そしてアッセイは、該ペ
プチドに指向性の抗体を含有するサンプルとともにイン
キュベートして抗体ペプチド複合体を形成させ、前記固
体マトリクス上に固定化された該複合体から未反応のサ
ンプルを分離し、検出手段によって該複合体中の抗体の
量を定量することによって実施される。
体例の一つにおいては、標的ペプチドフラグメントは固
体のマトリクス上に被覆され、そしてアッセイは、該ペ
プチドに指向性の抗体を含有するサンプルとともにイン
キュベートして抗体ペプチド複合体を形成させ、前記固
体マトリクス上に固定化された該複合体から未反応のサ
ンプルを分離し、検出手段によって該複合体中の抗体の
量を定量することによって実施される。
該改良されたアッセイの別の具体例の一つにおいて
は、標的フラグメント蛍光団と接合させ、アッセイは、
それを該ペプチドに対する抗体を含むサンプルとともに
インキュベートして抗体ペプチド複合体を形成させ、溶
液中の複合体の蛍光分極を測定することによって実施さ
れる。こうして、このような均一相アッセイによって、
複合体形成の程度が相分離段階なしに測定できる。
は、標的フラグメント蛍光団と接合させ、アッセイは、
それを該ペプチドに対する抗体を含むサンプルとともに
インキュベートして抗体ペプチド複合体を形成させ、溶
液中の複合体の蛍光分極を測定することによって実施さ
れる。こうして、このような均一相アッセイによって、
複合体形成の程度が相分離段階なしに測定できる。
図面の簡単な説明 図1は、該63アミノ酸ポリペプチド配列及びそれから
誘導される種々のペプチドフラグメントを描いたダイア
グラムである。1位のアミノ酸がグルタミンに始まるこ
とに注意。
誘導される種々のペプチドフラグメントを描いたダイア
グラムである。1位のアミノ酸がグルタミンに始まるこ
とに注意。
図2は、アッセイバックグラウンド値に対する、該ポ
リペプチドのアミノ末端からの最初の20個のアミノ酸の
除去の効果を示す棒グラフである。
リペプチドのアミノ末端からの最初の20個のアミノ酸の
除去の効果を示す棒グラフである。
好ましい具体例の詳細な説明 本発明の改良されたアッセイにおいて利用されるペプ
チドフラグメントは、NANBHからの回復期にある又は罹
患している患者からの血清に対して抗原抗体反応特異性
を示すポリペプチドから誘導される。該特異的なポリペ
プチドの核酸配列は、EP 0 363 025(Arima)に公表さ
れており、その中において(請求項2の式IIIとして)
同定されている。該クローンの免疫反応性は、λgtllラ
イブラリーの作成後にイムノスクリーニング技術により
確認された。核酸配列に対応するペプチド配列は図1の
ペプチドAに示され、カルボキシ末端にアルギニンをそ
してアミノ末端にグルタミンを有する63個のアミノ酸よ
りなるポリペプチドを構成する。この配列を有する合成
的ポリペプチドを調製するに際しては、樹脂からのペプ
チドの切離しの際における末端グルタミンの環化を阻止
するために、N末端に追加のフェニルアラニンが加えら
れる。
チドフラグメントは、NANBHからの回復期にある又は罹
患している患者からの血清に対して抗原抗体反応特異性
を示すポリペプチドから誘導される。該特異的なポリペ
プチドの核酸配列は、EP 0 363 025(Arima)に公表さ
れており、その中において(請求項2の式IIIとして)
同定されている。該クローンの免疫反応性は、λgtllラ
イブラリーの作成後にイムノスクリーニング技術により
確認された。核酸配列に対応するペプチド配列は図1の
ペプチドAに示され、カルボキシ末端にアルギニンをそ
してアミノ末端にグルタミンを有する63個のアミノ酸よ
りなるポリペプチドを構成する。この配列を有する合成
的ポリペプチドを調製するに際しては、樹脂からのペプ
チドの切離しの際における末端グルタミンの環化を阻止
するために、N末端に追加のフェニルアラニンが加えら
れる。
この63アミノ酸ポリペプチドから誘導される全てのペ
プチドフラグメントは(並びに完全サイズのポリペプチ
ド対照も)、フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)
アミノ基保護法及び1,3−ジイソプロピルカルボジイミ
ドカップリング化学を用いて、Milligen−Biosearch 96
00型ペプチド合成装置によりアミドの形で合成された。
該配列のアミド形は、遊離酸の形よりも一層緊密に生物
学的活性類縁体を模擬すると期待できたため、採用し
た。活性化されたアミノ酸は、2,4−ジメトキシベンズ
ヒドリルアミン樹脂に結合させた。ペプチド合成は、イ
サチン試験を実施したプロリンを除き、全てニンヒドリ
ン分析によってモニターした。合成されたペプチドは、
トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジチオール
及びアニソールの体積比90:5:3:2よりなる試薬Rにより
樹脂から切離された。
プチドフラグメントは(並びに完全サイズのポリペプチ
ド対照も)、フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)
アミノ基保護法及び1,3−ジイソプロピルカルボジイミ
ドカップリング化学を用いて、Milligen−Biosearch 96
00型ペプチド合成装置によりアミドの形で合成された。
該配列のアミド形は、遊離酸の形よりも一層緊密に生物
学的活性類縁体を模擬すると期待できたため、採用し
た。活性化されたアミノ酸は、2,4−ジメトキシベンズ
ヒドリルアミン樹脂に結合させた。ペプチド合成は、イ
サチン試験を実施したプロリンを除き、全てニンヒドリ
ン分析によってモニターした。合成されたペプチドは、
トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジチオール
及びアニソールの体積比90:5:3:2よりなる試薬Rにより
樹脂から切離された。
樹脂から切り離されたペプチドを、高性能液体クロマ
トグラフィー(HPLC)により精製し、正確な配列を確認
するためPorton PI 20 90 E Integrated Micro−Sequen
cing Systemにより特徴記述を行った。純度は、0.1%ト
リフルオロ酢酸中5乃至40%のアセトニトリルの35分間
かけた線形勾配を用いて逆相カラム上HPLCにより確認し
た。吸光度は230nmにて測定した。
トグラフィー(HPLC)により精製し、正確な配列を確認
するためPorton PI 20 90 E Integrated Micro−Sequen
cing Systemにより特徴記述を行った。純度は、0.1%ト
リフルオロ酢酸中5乃至40%のアセトニトリルの35分間
かけた線形勾配を用いて逆相カラム上HPLCにより確認し
た。吸光度は230nmにて測定した。
代わりに、組換えペプチドは、プロモーター、リボソ
ーム結合部位および翻訳終始部位の操作によって、クロ
ーン中で生物学的に産生させることもできる。
ーム結合部位および翻訳終始部位の操作によって、クロ
ーン中で生物学的に産生させることもできる。
本発明のペプチドは、蛋白質標的を利用するいかなる
アッセイシステムにおいても便利に使用できる。好まし
い具体例においては、標的ペプチドフラグメントは、常
磁性の微粒子のような固体マトリクス上に受動的な又は
共有結合的な被覆方法にて被覆される。抗NANBH抗体の
存在下におけるインキュベーション段階に続いて、結合
した抗体ペプチド複合体は、磁気的分離によっていかな
る未反応の抗体からも分離され、そして該抗体ペプチド
複合体中の抗体量が定量される。
アッセイシステムにおいても便利に使用できる。好まし
い具体例においては、標的ペプチドフラグメントは、常
磁性の微粒子のような固体マトリクス上に受動的な又は
共有結合的な被覆方法にて被覆される。抗NANBH抗体の
存在下におけるインキュベーション段階に続いて、結合
した抗体ペプチド複合体は、磁気的分離によっていかな
る未反応の抗体からも分離され、そして該抗体ペプチド
複合体中の抗体量が定量される。
簡便には、複合体形成した抗NANBH抗体の検出は、更
に該複合体を酵素の取り付けられた抗ヒト抗血清と反応
させることによって実施することができる。磁気的分離
及び洗浄により、常磁性体粒子上の標識を付した複合体
が分離されると、蛍光発生性の酵素基質が加えられる。
測定された蛍光量は、こうしてサンプル中に存在する抗
NANBH抗体の量に直接比例する。
に該複合体を酵素の取り付けられた抗ヒト抗血清と反応
させることによって実施することができる。磁気的分離
及び洗浄により、常磁性体粒子上の標識を付した複合体
が分離されると、蛍光発生性の酵素基質が加えられる。
測定された蛍光量は、こうしてサンプル中に存在する抗
NANBH抗体の量に直接比例する。
代わりの具体例の一つにおいては、本発明のペプチド
は、古典的な酵素免疫抗体法(ELISA)においてミクロ
タイタープレートウェル上に被覆され、サンプルととも
にインキュベートされ、吸引され、そして酵素を接合さ
せた抗ヒト抗血清が加えられる。検出は、簡便には、適
当な基質/色素原を加え、得られる生成物を測定するこ
とによって実施される。ELISAの一般的議論について
は、Langone,et al.,Immunological Techniques,Part
D,Immunoassays,Methods in Enzymology,p.84(1982)
を参照のこと。
は、古典的な酵素免疫抗体法(ELISA)においてミクロ
タイタープレートウェル上に被覆され、サンプルととも
にインキュベートされ、吸引され、そして酵素を接合さ
せた抗ヒト抗血清が加えられる。検出は、簡便には、適
当な基質/色素原を加え、得られる生成物を測定するこ
とによって実施される。ELISAの一般的議論について
は、Langone,et al.,Immunological Techniques,Part
D,Immunoassays,Methods in Enzymology,p.84(1982)
を参照のこと。
本ペプチドに応用し得る更なる代わりのアッセイ方式
は、Western Blot,Towbin,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,
76:4350(1979);Radioimmuno Assay(RIA),Walsh,et
al.,J.Infect.Dis.,21:550(1970);Competitive Assay
s,Diamandis,Clin.,Biochem.,21:139(1988);Noncompe
titive Assays,Crook,et al.,J.Gen.Virol.,46:29(198
0);Immunoprecipitation,Tojo,et al.,Clin.Chem.34:2
423(1988)and Dot Blots,Jahn,et al.,Proc.Natl Aca
d Sci,81:1684(1984);PCFIA,Jolley et al.,J.Immuno
l.Meth.,67:21(1984)。
は、Western Blot,Towbin,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,
76:4350(1979);Radioimmuno Assay(RIA),Walsh,et
al.,J.Infect.Dis.,21:550(1970);Competitive Assay
s,Diamandis,Clin.,Biochem.,21:139(1988);Noncompe
titive Assays,Crook,et al.,J.Gen.Virol.,46:29(198
0);Immunoprecipitation,Tojo,et al.,Clin.Chem.34:2
423(1988)and Dot Blots,Jahn,et al.,Proc.Natl Aca
d Sci,81:1684(1984);PCFIA,Jolley et al.,J.Immuno
l.Meth.,67:21(1984)。
特に利益のあるのは、蛍光分極に基づく均一相アッセ
イである。このアッセイにおいては、標的ペプチドフラ
グメントは、フルオレッセインのような蛍光団へ接合さ
せられ、抗体ペプチド複合体を形成するために抗NANBH
抗体を含有するサンプルとインキュベートされ、続いて
増大した蛍光分極の測定が行われる。これは、相分離段
階が不要であり且つ結果が最初の反応混合物から直接に
読み取れる点で、他のアッセイに対する魅力的な代替法
である。
イである。このアッセイにおいては、標的ペプチドフラ
グメントは、フルオレッセインのような蛍光団へ接合さ
せられ、抗体ペプチド複合体を形成するために抗NANBH
抗体を含有するサンプルとインキュベートされ、続いて
増大した蛍光分極の測定が行われる。これは、相分離段
階が不要であり且つ結果が最初の反応混合物から直接に
読み取れる点で、他のアッセイに対する魅力的な代替法
である。
本発明のペプチドはまた、NANBH感染の治療における
ワクチンとしても有用である。63残基ポリペプチドのエ
ピトープがいずれも、N末端の非特異的結合配列の除去
されたペプチドフラグメント群に含まれることから、各
フラグメントは、ワクチンとして使用される場合、いず
れも抗原決定基の全てを保持する。後に提示する連続的
採血データは、多くの患者血清について、現在市場にあ
るアッセイにより検出されるよりも早期の採血において
検出がされることから、これらのペプチドが少なくとも
1つの主要エピトープを備えていることを示唆してい
る。
ワクチンとしても有用である。63残基ポリペプチドのエ
ピトープがいずれも、N末端の非特異的結合配列の除去
されたペプチドフラグメント群に含まれることから、各
フラグメントは、ワクチンとして使用される場合、いず
れも抗原決定基の全てを保持する。後に提示する連続的
採血データは、多くの患者血清について、現在市場にあ
るアッセイにより検出されるよりも早期の採血において
検出がされることから、これらのペプチドが少なくとも
1つの主要エピトープを備えていることを示唆してい
る。
図1を参照して、本発明のペプチドは、Arimaによっ
て記述された63(64)残基ペプチド(ペプチドA)の、
実質的に残基番号63からアミノ末端における残基約21ま
で延びる、カルボキシ−43残基ペプチドに包含されるペ
プチド群よりなる。
て記述された63(64)残基ペプチド(ペプチドA)の、
実質的に残基番号63からアミノ末端における残基約21ま
で延びる、カルボキシ−43残基ペプチドに包含されるペ
プチド群よりなる。
配列における僅かな変化、例えばアミノ酸の置換、追
加又は除去等が、アッセイ性能に対して評価し得るほど
には影響を与えないということは強調されなければなら
ない。こうして、構造におけるそのような僅かな変化を
有するペプチドは、元々のポリペプチドの配列に厳密な
相同性を有するペプチドの均等物と考えられる。
加又は除去等が、アッセイ性能に対して評価し得るほど
には影響を与えないということは強調されなければなら
ない。こうして、構造におけるそのような僅かな変化を
有するペプチドは、元々のポリペプチドの配列に厳密な
相同性を有するペプチドの均等物と考えられる。
図1においては、多くの垂直の列をなして、全配列の
アミノ酸配列が水平に提示されており、それらの間に上
記に概括したプロトコールに従って合成された個々のペ
プチドフラグメントの対応する程度を示す直線を伴って
いる。こうして例えば、図1における水平に延びる第2
のそのような直線は12残基から63残基を構成するペプチ
ドを定義し、そして水平に延びる第3のそのような直線
は21残基から63残基までを構成するペプチドを定義する
等である。
アミノ酸配列が水平に提示されており、それらの間に上
記に概括したプロトコールに従って合成された個々のペ
プチドフラグメントの対応する程度を示す直線を伴って
いる。こうして例えば、図1における水平に延びる第2
のそのような直線は12残基から63残基を構成するペプチ
ドを定義し、そして水平に延びる第3のそのような直線
は21残基から63残基までを構成するペプチドを定義する
等である。
本発明のペプチドは、上述のように、そして以下の実
施例において一層完全に記述されるように、常磁性対微
粒子または被覆ウェルELISA方式のいずれかの形で、抗N
ANBH抗体アッセイにおける標的として利用された。結果
は、実質的にカルボキシ末端のアルギニンからおよそ残
基26から21までの配列中のいずれかの残基まで延びるペ
プチド残基を作り出すようアミノ末端残基が除去された
ときに、アッセイ性能が優位に改善したことを示す。
施例において一層完全に記述されるように、常磁性対微
粒子または被覆ウェルELISA方式のいずれかの形で、抗N
ANBH抗体アッセイにおける標的として利用された。結果
は、実質的にカルボキシ末端のアルギニンからおよそ残
基26から21までの配列中のいずれかの残基まで延びるペ
プチド残基を作り出すようアミノ末端残基が除去された
ときに、アッセイ性能が優位に改善したことを示す。
アッセイ性能におけるこの劇的な改善は、シグナルの
利得を同時に伴う有意なバックグラウンド(非特異的結
合)消失の結果である。
利得を同時に伴う有意なバックグラウンド(非特異的結
合)消失の結果である。
実施例1 上記のようにして、図1に描いた配列に対応するペプ
チドが調製された。ペプチドは次いで、次の手順で受動
的に常磁性微粒子(サイズ0.1−10μm)上に被覆され
た: 250μの5%重量/体積の4.0μm常磁性微粒子
をマイクロフュージ中にて5000rpmにて5分間ペレット
化した。上澄を除去し粒子ペレットを500μの70%エ
タノールで15分間再懸濁した。粒子を次いで前のように
ペレット化し、上澄を除去した。粒子をpH=11.0の0.1M
のCAPS((3−シクロヘキシルアミノ)−1−プロパン
スルホン酸)緩衝液500μに再懸濁した。粒子を前の
ようにペレット化し上澄を除去した。
チドが調製された。ペプチドは次いで、次の手順で受動
的に常磁性微粒子(サイズ0.1−10μm)上に被覆され
た: 250μの5%重量/体積の4.0μm常磁性微粒子
をマイクロフュージ中にて5000rpmにて5分間ペレット
化した。上澄を除去し粒子ペレットを500μの70%エ
タノールで15分間再懸濁した。粒子を次いで前のように
ペレット化し、上澄を除去した。粒子をpH=11.0の0.1M
のCAPS((3−シクロヘキシルアミノ)−1−プロパン
スルホン酸)緩衝液500μに再懸濁した。粒子を前の
ようにペレット化し上澄を除去した。
凍結乾燥ペプチドを秤取し、無菌濾過(0.22μm)水
に再懸濁してペプチド濃度を10mg/mlとし、室温にて30
分間溶解させて溶液とした。溶解したペプチドをpH11.0
の0.1MのCAPS緩衝液で更に500μg/mlに希釈し、室温に
て20分間安定化させた。このペプチド溶液の250μを
次いで洗浄済み粒子ペレットに移した。粒子を再懸濁し
次いで室温にて12乃至16時間回転した。
に再懸濁してペプチド濃度を10mg/mlとし、室温にて30
分間溶解させて溶液とした。溶解したペプチドをpH11.0
の0.1MのCAPS緩衝液で更に500μg/mlに希釈し、室温に
て20分間安定化させた。このペプチド溶液の250μを
次いで洗浄済み粒子ペレットに移した。粒子を再懸濁し
次いで室温にて12乃至16時間回転した。
ペプチドが受動的に吸収された粒子を次いで5000rpm
で3.5分間ペレット化し、上澄を除去し、そして粒子を
0.05%のTween 20界面活性剤を含む等張緩衝化食塩水で
2回再懸濁した。粒子を更にペレット化し、そして等張
緩衝化食塩水に3回再懸濁した。被覆された粒子を次い
で等張緩衝化食塩水で0.025w/v%の最終粒子濃度に再懸
濁した。
で3.5分間ペレット化し、上澄を除去し、そして粒子を
0.05%のTween 20界面活性剤を含む等張緩衝化食塩水で
2回再懸濁した。粒子を更にペレット化し、そして等張
緩衝化食塩水に3回再懸濁した。被覆された粒子を次い
で等張緩衝化食塩水で0.025w/v%の最終粒子濃度に再懸
濁した。
実施例2 図1に記載したペプチドフラグメントを被覆した粒子
を用いた常磁性粒子アッセイは、次のようにした実施し
た: ヒト血清又は血漿を、ウェル緩衝液(0.103Mトリ
ス−HC1、pH7.4、1.05M塩化ナトリウム、0.33%NP−4
0、0.09%ナトリウムアジド、及び15%の新生牛血清)
で1:100に希釈した。
を用いた常磁性粒子アッセイは、次のようにした実施し
た: ヒト血清又は血漿を、ウェル緩衝液(0.103Mトリ
ス−HC1、pH7.4、1.05M塩化ナトリウム、0.33%NP−4
0、0.09%ナトリウムアジド、及び15%の新生牛血清)
で1:100に希釈した。
この希釈したサンプルの50μを、Pandex黒色ミクロ
タイタープレートの各ウェルに加えた。サンプルは、少
なくとも2つ以上の複製を作って試験した。実施例1に
記述したようにしてペプチドで被覆した常磁性粒子を、
各ウェルに加えた(20μ)。プレートを次いで37℃に
30分間置いた。
タイタープレートの各ウェルに加えた。サンプルは、少
なくとも2つ以上の複製を作って試験した。実施例1に
記述したようにしてペプチドで被覆した常磁性粒子を、
各ウェルに加えた(20μ)。プレートを次いで37℃に
30分間置いた。
インキュベーションが終了すると、ウェル内の粒子を
100μのPBS−Tween−20(1当たり、2.06gのリン酸
二ナトリウム、0.318gのリン酸一ナトリウム、0.5mlのT
ween−20、8.76gの塩化ナトリウム、及び1.0gのナトリ
ウムアジド;pH7.4)で洗浄した。洗浄段階の間、常磁性
粒子を微細濾過プレートウェル内に、該プレートの底に
かけた磁場を介して保持した。粒子をこの仕方で5回洗
浄した。
100μのPBS−Tween−20(1当たり、2.06gのリン酸
二ナトリウム、0.318gのリン酸一ナトリウム、0.5mlのT
ween−20、8.76gの塩化ナトリウム、及び1.0gのナトリ
ウムアジド;pH7.4)で洗浄した。洗浄段階の間、常磁性
粒子を微細濾過プレートウェル内に、該プレートの底に
かけた磁場を介して保持した。粒子をこの仕方で5回洗
浄した。
各ウェル内の粒子を、30μの粒子再懸濁緩衝液(1
中、4.346gのリン酸二ナトリウム、0.524gのリン酸一
ナトリウム、8.76gの塩化ナトリウム、及び1gのナトリ
ウムアジド;pH7.4)に再懸濁した。β−ガラクトシダー
ゼを接合させ接合体希釈緩衝液(0.1Mトリス−HC1、pH
7.5、0.5M塩化ナトリウム、5%グリセロール、2.3mM塩
化マグネシウム、0.1%ナトリウムアジド及び20%新生
牛血清)で1:1000に希釈したヤギ抗ヒドIgG(H+L)
(接合体)の20μを、次いでウェルに加えた。
中、4.346gのリン酸二ナトリウム、0.524gのリン酸一
ナトリウム、8.76gの塩化ナトリウム、及び1gのナトリ
ウムアジド;pH7.4)に再懸濁した。β−ガラクトシダー
ゼを接合させ接合体希釈緩衝液(0.1Mトリス−HC1、pH
7.5、0.5M塩化ナトリウム、5%グリセロール、2.3mM塩
化マグネシウム、0.1%ナトリウムアジド及び20%新生
牛血清)で1:1000に希釈したヤギ抗ヒドIgG(H+L)
(接合体)の20μを、次いでウェルに加えた。
粒子に結合させたいかなるヒトIgG又はIgMも、接合体
によって認識され結合された。この接合体溶液は最大の
液体安定性及び反応性を与えるよう設計された。特に、
新生牛血清は牛血清より好ましい。接合体と共に37℃に
て15分間インキュベーションした後、非結合の接合体の
実質的に全てを除去するためにウェル内の粒子をPBS−T
ween−20で上述のように5回洗浄した。洗浄液中のTwee
n−20は、洗浄工程を高めて非特異的に結合した接合体
を除去した。
によって認識され結合された。この接合体溶液は最大の
液体安定性及び反応性を与えるよう設計された。特に、
新生牛血清は牛血清より好ましい。接合体と共に37℃に
て15分間インキュベーションした後、非結合の接合体の
実質的に全てを除去するためにウェル内の粒子をPBS−T
ween−20で上述のように5回洗浄した。洗浄液中のTwee
n−20は、洗浄工程を高めて非特異的に結合した接合体
を除去した。
最後に、4−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガ
ラクトシド(MUG)よりなる50μの基質溶液(1当
たり、0.178gの4−メチル−ウンベリフェリル−β−D
−ガラクトピラノシド、3.58gのトリシン(tricine)、
5.1mlのジメチルスルホキシド、30mlのメチルアルコー
ル、0.20gのナトリウムアジド、0.5mlのTween−20;pH8.
5)を各ウェルに加えた。ウェル内のβ−ガラクトシダ
ーゼ(すなわち接合体)の存在がMUGの切離しを引き起
こし蛍光性のクマリン生成物を産生した。この試薬及び
接合体は、敏感な検出システムとして使用された。蛍光
(励起波長400nm/放射波長450nm)は、MUG添加後2つの
時間間隔にて(すなわち2及び14分)測定された。これ
ら2つの値の差は蛍光性生成物産生の動力学的測度であ
り、粒子に結合した接合体とヒトIgG/IgMの直接の測度
である。蛍光値は、標準極線を確立するためのクマリン
自身の種々の濃度とその結果として得られる蛍光とを用
いて、クマリンのnM値に変換された。
ラクトシド(MUG)よりなる50μの基質溶液(1当
たり、0.178gの4−メチル−ウンベリフェリル−β−D
−ガラクトピラノシド、3.58gのトリシン(tricine)、
5.1mlのジメチルスルホキシド、30mlのメチルアルコー
ル、0.20gのナトリウムアジド、0.5mlのTween−20;pH8.
5)を各ウェルに加えた。ウェル内のβ−ガラクトシダ
ーゼ(すなわち接合体)の存在がMUGの切離しを引き起
こし蛍光性のクマリン生成物を産生した。この試薬及び
接合体は、敏感な検出システムとして使用された。蛍光
(励起波長400nm/放射波長450nm)は、MUG添加後2つの
時間間隔にて(すなわち2及び14分)測定された。これ
ら2つの値の差は蛍光性生成物産生の動力学的測度であ
り、粒子に結合した接合体とヒトIgG/IgMの直接の測度
である。蛍光値は、標準極線を確立するためのクマリン
自身の種々の濃度とその結果として得られる蛍光とを用
いて、クマリンのnM値に変換された。
実施例3 NANBH血清と正常供血者血清とを用いた常磁性粒子ア
ッセイは、実施例2に記載のようにして実施した。表1A
は、ペプチドフラグメントB、C、D、E、F及びG
(図1にて詳述した通り)の比較結果の要約である。
ッセイは、実施例2に記載のようにして実施した。表1A
は、ペプチドフラグメントB、C、D、E、F及びG
(図1にて詳述した通り)の比較結果の要約である。
4種のNANBH患者血清の反応性についての結果をシグ
ナル/ノイズとして表すが、次の計算によって決定され
たものである: NANBH陽性標本蛍光÷3つの異なる正
常標本の平均蛍光。
ナル/ノイズとして表すが、次の計算によって決定され
たものである: NANBH陽性標本蛍光÷3つの異なる正
常標本の平均蛍光。
表1Bは、個々の陽性サンプルの位置する、3つの正常
サンプルの平均からの(3つの正常サンプルから得られ
た)標準偏差の個数を示す。両群のデータは、フラグメ
ントCが、最高のシグナル/ノイズ比が得られるという
点及び、加えて、陽性の位置する、陰性からの標準偏差
の個数が最大となるという点において、最良のアッセイ
性能を与えることを示している。
サンプルの平均からの(3つの正常サンプルから得られ
た)標準偏差の個数を示す。両群のデータは、フラグメ
ントCが、最高のシグナル/ノイズ比が得られるという
点及び、加えて、陽性の位置する、陰性からの標準偏差
の個数が最大となるという点において、最良のアッセイ
性能を与えることを示している。
実施例4 図2にグラフで示した実験は、実施例2に記述した常
磁性粒子アッセイを用いてペプチドA、すなわち完全長
配列の性能(図2A)をペプチドフラグメントC(図2B)
と比較している。13個のサンプルがX軸上にプロットさ
れておりそれらの各アッセイ蛍光値(nMクマリン)がY
軸上にプロットされている。
磁性粒子アッセイを用いてペプチドA、すなわち完全長
配列の性能(図2A)をペプチドフラグメントC(図2B)
と比較している。13個のサンプルがX軸上にプロットさ
れておりそれらの各アッセイ蛍光値(nMクマリン)がY
軸上にプロットされている。
サンプル番号1はNANBH個体からのものであり、サン
プル番号2乃至12は正常供血者からのものであり、そし
てサンプル13はサンプル希釈緩衝液対照である。
プル番号2乃至12は正常供血者からのものであり、そし
てサンプル13はサンプル希釈緩衝液対照である。
データはペプチドのアミノ末端からの20個のアミノ酸
(1から20まで)の除去は、NANBH標本の反応性を減少
しないがしかし陰性血清の非特異的結合反応性(バック
グラウンド)を劇的に低下させることを実証している。
(1から20まで)の除去は、NANBH標本の反応性を減少
しないがしかし陰性血清の非特異的結合反応性(バック
グラウンド)を劇的に低下させることを実証している。
実施例5 常磁性粒子アッセイは、粒子上に別々に被覆されたペ
プチドフラグメントA、B、及びCを用いて、実施例2
に従って実施された。10名の異なるNANBH個体及び1名
の正常供血者が試験され、その結果はシグナル/ノイズ
として表2に示されている。シグナル/ノイズは前に詳
述した(実施例3)通りに計算した。
プチドフラグメントA、B、及びCを用いて、実施例2
に従って実施された。10名の異なるNANBH個体及び1名
の正常供血者が試験され、その結果はシグナル/ノイズ
として表2に示されている。シグナル/ノイズは前に詳
述した(実施例3)通りに計算した。
データは、ペプチドのアミノ末端からの11個のアミノ
酸(1から11まで)の除去(ペプチドB)が、いかなる
陽性サンプルについても完全長ペプチド(エプチドA)
に比して反応性の損失なしに、陽性NANBH患者血漿サン
プルと正常血漿サンプルとの識別の増大をもたらすこと
を明瞭に実証している。
酸(1から11まで)の除去(ペプチドB)が、いかなる
陽性サンプルについても完全長ペプチド(エプチドA)
に比して反応性の損失なしに、陽性NANBH患者血漿サン
プルと正常血漿サンプルとの識別の増大をもたらすこと
を明瞭に実証している。
フラグメントCを製造するための更に多くのアミノ酸
(すなわち、20個のアミノ酸)の除去でも、更に一層良
いアッセイ識別をもたらす。
(すなわち、20個のアミノ酸)の除去でも、更に一層良
いアッセイ識別をもたらす。
実施例6 バックグラウンド及び陽性シグナルに寄与するフラグ
メントAのN末端アミノ酸を更に明確にするため、実施
例2に記述した常磁性粒子アッセイをペプチドフラグメ
ントH乃至Lを用いて実施した。これらのペプチドは次
の通りであった: 22個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドH) 23個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドI) 25個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドJ) 28個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドK) 30個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドL) この実験の結果を、8つの異なる陽性NANBH血漿を11
の正常供血者血漿の平均で除したシグナル/ノイズとし
て、表3に示してある。
メントAのN末端アミノ酸を更に明確にするため、実施
例2に記述した常磁性粒子アッセイをペプチドフラグメ
ントH乃至Lを用いて実施した。これらのペプチドは次
の通りであった: 22個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドH) 23個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドI) 25個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドJ) 28個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドK) 30個のアミノ酸をペプチドAのアミノ末端から除去
(ペプチドL) この実験の結果を、8つの異なる陽性NANBH血漿を11
の正常供血者血漿の平均で除したシグナル/ノイズとし
て、表3に示してある。
ペプチドH、I及びJは強い殆ど等価の性能を示す。
ペプチドK及びLは、8つの陽性血清のうち5つで劇的
に減少した反応性をそして残る3つの陽性血清で部分的
に減少した反応性を示す。減少したシグナル/ノイズ
は、陽性シグナルの減少のためであり、正常供血者との
反応性(すなわちバックグラウンド)の増大のためでは
ない。このことは、これらペプチド中のNANBH血漿の免
疫反応性に寄与する領域を明確に規定する。更に、これ
らのデータは、当該領域の除去(すなわちフラグメント
Kのように)が陽性シグナルを減少させることが認めら
れるということから、免疫反応性領域がアミノ酸23乃至
29の間、特にアミノ酸26乃至29の間に、存在することを
示している。
ペプチドK及びLは、8つの陽性血清のうち5つで劇的
に減少した反応性をそして残る3つの陽性血清で部分的
に減少した反応性を示す。減少したシグナル/ノイズ
は、陽性シグナルの減少のためであり、正常供血者との
反応性(すなわちバックグラウンド)の増大のためでは
ない。このことは、これらペプチド中のNANBH血漿の免
疫反応性に寄与する領域を明確に規定する。更に、これ
らのデータは、当該領域の除去(すなわちフラグメント
Kのように)が陽性シグナルを減少させることが認めら
れるということから、免疫反応性領域がアミノ酸23乃至
29の間、特にアミノ酸26乃至29の間に、存在することを
示している。
実施例7 表4は、ペプチドAの性能を、アミノ末端からアミノ
酸の除去された全てのペプチドフラグメント(ペプチド
フラグメントB、C、H、I、J、K及びL)と比較し
ている。加えて、第9乃至第45までのアミノ酸よりなる
ペプチドMも、実施例2の常磁性粒子アッセイを用いて
試験された。
酸の除去された全てのペプチドフラグメント(ペプチド
フラグメントB、C、H、I、J、K及びL)と比較し
ている。加えて、第9乃至第45までのアミノ酸よりなる
ペプチドMも、実施例2の常磁性粒子アッセイを用いて
試験された。
各ペプチドの性能は、各陽性サンプルの位置する、陰
性サンプルの平均から標準偏差の個数を用いて判定し、
表4に記載したようにして計算した。
性サンプルの平均から標準偏差の個数を用いて判定し、
表4に記載したようにして計算した。
データは、フラグメントAのアミノ末端からアミノ酸
が除去されると、アッセイ性能が改善され、BはAより
良く、CはBより良く、そしてHはCより良いことを示
している。H、I及びJについては全体的なアッセイ性
能は同等であった。フラグメントK、L及びMは、減少
したNANBH陽性シグナル反応性のためである乏しいアッ
セイ性能した有しない。フラグメントMは、実施例6に
おいて記述したようにアミノ酸23と29の間の免疫反応性
領域を含むが、しかも陽性サンプルに対して乏しい反応
性しか示さない。フラグメントMは、フラグメントA,B,
C,H,I,J,K又はLの7個のカルボキシ末端アミノ酸を含
まず、従って、これらのカルボキシ末端アミノ酸はアミ
ノ酸23乃至29と組み合わさって、NANBH陽性サンプル反
応及び良好なアッセイ性能に必要である。
が除去されると、アッセイ性能が改善され、BはAより
良く、CはBより良く、そしてHはCより良いことを示
している。H、I及びJについては全体的なアッセイ性
能は同等であった。フラグメントK、L及びMは、減少
したNANBH陽性シグナル反応性のためである乏しいアッ
セイ性能した有しない。フラグメントMは、実施例6に
おいて記述したようにアミノ酸23と29の間の免疫反応性
領域を含むが、しかも陽性サンプルに対して乏しい反応
性しか示さない。フラグメントMは、フラグメントA,B,
C,H,I,J,K又はLの7個のカルボキシ末端アミノ酸を含
まず、従って、これらのカルボキシ末端アミノ酸はアミ
ノ酸23乃至29と組み合わさって、NANBH陽性サンプル反
応及び良好なアッセイ性能に必要である。
実施例8 表5に提示したデータは、ペプチドフラグメントHの
カルボキシ末端から7個のアミノ酸を除してフラグメン
トNとすることの影響を実証する。結果は、実施例2に
おいて記述した常磁性粒子アッセイによって得られ、シ
グナル/ノイズ値として提示されている。
カルボキシ末端から7個のアミノ酸を除してフラグメン
トNとすることの影響を実証する。結果は、実施例2に
おいて記述した常磁性粒子アッセイによって得られ、シ
グナル/ノイズ値として提示されている。
NANBH血漿サンプル番号2、5及び6についてのシグ
ナル/ノイズにおける劇的な減少は、最良のアッセイ性
能を達成するためにはフラグメント中にアミノ酸56乃至
63の特定のアミノ酸残基が含まれなければならないこと
を明瞭に実証している。
ナル/ノイズにおける劇的な減少は、最良のアッセイ性
能を達成するためにはフラグメント中にアミノ酸56乃至
63の特定のアミノ酸残基が含まれなければならないこと
を明瞭に実証している。
実施例9 図1に示したペプチドフラグメントは、ELISA被覆ウ
ェルミクロタイター方式を用いて試験された。アッセイ
は次のように実施した: ペプチドAを0.1MのCAPS緩衝
液(pH11.0)に75μg/mlになるように希釈し、この溶液
50μlを適当に標識したウェル(Costar 96 EIA Plate
のうちの48個のウェル)に添加し、ペプチドを室温にて
終夜吸収させた。同様に、残りの48ウェルに50μのフ
ラグメントH溶液をピペットで入れて吸収させた。
ェルミクロタイター方式を用いて試験された。アッセイ
は次のように実施した: ペプチドAを0.1MのCAPS緩衝
液(pH11.0)に75μg/mlになるように希釈し、この溶液
50μlを適当に標識したウェル(Costar 96 EIA Plate
のうちの48個のウェル)に添加し、ペプチドを室温にて
終夜吸収させた。同様に、残りの48ウェルに50μのフ
ラグメントH溶液をピペットで入れて吸収させた。
ウェルを100μの0.05Tween−20を含有するリン酸緩
衝化食塩水(PBS)で5回そして100μのPBSで更に5
回洗浄した。被覆されたプレートを次いで、標準的なミ
クロタイタープレートアッセイ方式を用いて試験した。
接合体、洗浄緩衝液及び基質は、Ortho ELISA試験シス
テムからのものである。
衝化食塩水(PBS)で5回そして100μのPBSで更に5
回洗浄した。被覆されたプレートを次いで、標準的なミ
クロタイタープレートアッセイ方式を用いて試験した。
接合体、洗浄緩衝液及び基質は、Ortho ELISA試験シス
テムからのものである。
200μの標本希釈液を各ウェルに添加し、次いで20
μの各標本(血清又は血漿)をウェルに添加した。プ
レートを10秒間穏やかに混合し、次いで37℃にて1時間
おいた。PBS−Tweenでプレートを5回洗浄し、次いで20
0μの抗ヒトIgセイヨウワサビパーオキシダーゼ接合
体を全てのウェルに添加しそして37℃にて1時間インキ
ュベートした。次いでウェルを前のように洗浄し、そし
て200μのOPD(o−フェニレンジアミン2HCl)/基質
を各ウェルに加えた。暗所、室温にて30分後、50μの
4N硫酸を各ウェルに添加した。光学濃度を490nmにてBio
tekプレートリーダー中で測定した。
μの各標本(血清又は血漿)をウェルに添加した。プ
レートを10秒間穏やかに混合し、次いで37℃にて1時間
おいた。PBS−Tweenでプレートを5回洗浄し、次いで20
0μの抗ヒトIgセイヨウワサビパーオキシダーゼ接合
体を全てのウェルに添加しそして37℃にて1時間インキ
ュベートした。次いでウェルを前のように洗浄し、そし
て200μのOPD(o−フェニレンジアミン2HCl)/基質
を各ウェルに加えた。暗所、室温にて30分後、50μの
4N硫酸を各ウェルに添加した。光学濃度を490nmにてBio
tekプレートリーダー中で測定した。
表6A及び6Bの結果は、9例のNANBH患者血清及び12例
の正常血清を用いて、ペプチドHに対しペプチドAの反
応性を比較している。常磁性粒子アッセイで見られるよ
うに、改良されたペプチドフラグメント(フラグメント
H)を利用するELISAシステムは、正常患者血清のレベ
ルからの陽性NANBH患者血清のレベルを識別するための
高められた性能を示す。表6Aは、シグナル/ノイズとし
て結果を提示し、そして表6Bは陽性NANBH患者血清の位
置する、陰性(正常)集団平均からの標準偏差の個数と
して結果を提示する。
の正常血清を用いて、ペプチドHに対しペプチドAの反
応性を比較している。常磁性粒子アッセイで見られるよ
うに、改良されたペプチドフラグメント(フラグメント
H)を利用するELISAシステムは、正常患者血清のレベ
ルからの陽性NANBH患者血清のレベルを識別するための
高められた性能を示す。表6Aは、シグナル/ノイズとし
て結果を提示し、そして表6Bは陽性NANBH患者血清の位
置する、陰性(正常)集団平均からの標準偏差の個数と
して結果を提示する。
実施例10 NANBH感染を有する2例の患者の6回の連続的採血か
らの血漿が、フラグメントH及び実施例2に記述した常
磁性粒子アッセイを用いてアッセイされた。表7に要約
したデータは、本発明のペプチドが、Ortho Diagnostic
s Inc.によって製造されている市販の(Ortho HCV ELIS
A Test System)試験に比して近似の又はより早期の採
血日において陽性標本を検出することができるというこ
とを示している。
らの血漿が、フラグメントH及び実施例2に記述した常
磁性粒子アッセイを用いてアッセイされた。表7に要約
したデータは、本発明のペプチドが、Ortho Diagnostic
s Inc.によって製造されている市販の(Ortho HCV ELIS
A Test System)試験に比して近似の又はより早期の採
血日において陽性標本を検出することができるというこ
とを示している。
配列表 (1)一般情報 (i)出願人: Leahy,David C Todd,John A Jolley,Michael E Shah,Dinesh O Bethell,Delia R Arima,Terukatsu (ii)発明の名称: IMPROVED ASSAY FOR NON−A NON
−B HEPATITIS (iii)配列の数: 2 (iv)連絡住所: (A)名宛人: Baxter Diagnostics Inc. (B)ストリート: One Baxter Parkway,DF2−2E (C)市: Deerfield (D)州: Illinois (E)国: USA (F)ZIPコード: 60015 (V)コンピュータ読み取り可能形式: (A)媒体タイプ: フロッピーディスク (B)コンピュータ: IBM PC コンパチブル (C)オペレーティングシステム: PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, version #1.25 (vi)現行出願データ: (A)出願番号: US 7/675,233 (B)出願日: 1991年3月26日 (C)分類: (viii)代理人情報: (A)氏名: Barta,Kent (B)登録番号: 29,042 (C)参照/ドケット番号: PA−4084 (ix)テレコミュニケーション情報: (A)電話: 708/948−3308 (B)テレファックス: 708/948−2642 (2)配列番号1についての情報: (i)配列の特徴: (A)長さ: アミノ酸63個 (B)型: アミノ酸 (C)鎖の数: 未知 (D)トポロジー: 未知 (ii)分子の種類: ペプチド (xi)配列の記述: 配列番号1 (2)配列番号2についての情報: (i)配列の特徴: (A)長さ: アミノ酸64個 (B)型: アミノ酸 (C)鎖の数: 未知 (D)トポロジー: 未知 (ii)分子の種類: ペプチド (xi)配列の記述: 配列番号2
−B HEPATITIS (iii)配列の数: 2 (iv)連絡住所: (A)名宛人: Baxter Diagnostics Inc. (B)ストリート: One Baxter Parkway,DF2−2E (C)市: Deerfield (D)州: Illinois (E)国: USA (F)ZIPコード: 60015 (V)コンピュータ読み取り可能形式: (A)媒体タイプ: フロッピーディスク (B)コンピュータ: IBM PC コンパチブル (C)オペレーティングシステム: PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, version #1.25 (vi)現行出願データ: (A)出願番号: US 7/675,233 (B)出願日: 1991年3月26日 (C)分類: (viii)代理人情報: (A)氏名: Barta,Kent (B)登録番号: 29,042 (C)参照/ドケット番号: PA−4084 (ix)テレコミュニケーション情報: (A)電話: 708/948−3308 (B)テレファックス: 708/948−2642 (2)配列番号1についての情報: (i)配列の特徴: (A)長さ: アミノ酸63個 (B)型: アミノ酸 (C)鎖の数: 未知 (D)トポロジー: 未知 (ii)分子の種類: ペプチド (xi)配列の記述: 配列番号1 (2)配列番号2についての情報: (i)配列の特徴: (A)長さ: アミノ酸64個 (B)型: アミノ酸 (C)鎖の数: 未知 (D)トポロジー: 未知 (ii)分子の種類: ペプチド (xi)配列の記述: 配列番号2
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トッド,ジョン,エー アメリカ合衆国94596カリフォルニア、 ウォルナットクリーク、サントスレーン 2955,ナンバー 307 (72)発明者 ジョリー,マイケル,イー アメリカ合衆国60073イリノイ、ラウン ドレイク、ノースサークルドライブ 34469 (72)発明者 シャー,ダイネシュ,オー アメリカ合衆国60061イリノイ、バーノ ンヒルス、アレクサンドリアドライブ 235 (72)発明者 ベッセル,デリア,アール アメリカ合衆国60091イリノイ、ウィル メット、ハートマンレーン 552 (72)発明者 有馬 暉勝 鹿児島県鹿児島市平之町5―1―403 (56)参考文献 特開 平5−262792(JP,A) 特開 平4−36185(JP,A) 特開 平5−222094(JP,A) 欧州公開363025(EP,A1)
Claims (4)
- 【請求項1】QEKKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNPGKNK
KPRVGRIKNWNREGRKDAYQIRKRRなるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを利用して非A非B肝炎を診断するための
アッセイであって、実質的にアミノ末端における残基21
から26までの配列に含まれるアミノ酸よりなる群より選
ばれるアミノ酸残基から、実質的にカルボキシ末端のア
ルギニンまで延びる、その標的ペプチドフラグメントを
用いるものであり、該標的ペプチドフラグメントが蛍光
団に接合されており、且つ該アッセイが、前記ペプチド
に対する抗体を含有するサンプルと共にインキュベート
して抗体ペプチド複合体を形成し、そして前記複合体の
蛍光分極を測定することにより行われるものである、改
良されたアッセイ。 - 【請求項2】QEKKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNPGKNK
KPRVGRIKNWNREGRKDAYQIRKRRなるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを利用して非A非B肝炎を診断するための
アッセイであって、実質的にアミノ末端における残基21
から26までの配列に含まれるアミノ酸よりなる群より選
ばれるアミノ酸残基から、実質的にカルボキシ末端のア
ルギニンまで延びる、その標的ペプチドフラグメントを
用いるものであり、該標的ペプチドフラグメントが約0.
1乃至100μmのサイズ範囲の粒子よりなる固体マトリク
ス上に被覆されており、該アッセイが、前記ペプチドに
指向性の抗体を含有するサンプルと共にインキュベート
して抗体ペプチド複合体を形成し、未反応の抗体を前記
固体マトリクス上に固定化された複合体から分離し、そ
して前記複合体中の抗体の量を検出手段により定量する
ことにより行われるものである、改良されたアッセイ。 - 【請求項3】前記粒子が定磁性である請求項2に記載の
アッセイ。 - 【請求項4】QEKKGEASNGEAENDTHKKQRRYKEKEKTATNNPGKNK
KPRVGRIKNWNREGRKDAYQIRKRRなるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを利用して非A非B肝炎を診断するための
アッセイであって、実質的にアミノ末端における残基21
から26までの配列に含まれるアミノ酸よりなる群より選
ばれるアミノ酸残基から、実質的にカルボキシ末端のア
ルギニンまで延びる、その標的ペプチドフラグメントを
用いるものであり、該標的ペプチドフラグメントが受動
的及び/又は共有結合的な結合のためのポリスチレン又
はカルボキシ若しくはアミノ官能基を有する常磁性粒子
である固体マトリクス上に被覆されており、該アッセイ
が、前記ペプチドに指向性の抗体を含有するサンプルと
共にインキュベートして抗体ペプチド複合体を形成し、
未反応の抗体を前記固体マトリクス上に固定化された複
合体から分離し、そして前記複合体中の抗体の量を検出
手段により定量することにより行われるものである、改
良されたアッセイ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67523391A | 1991-03-26 | 1991-03-26 | |
US675.233 | 1991-03-26 | ||
PCT/US1992/002527 WO1992017612A1 (en) | 1991-03-26 | 1992-03-26 | Assay for non-a non-b hepatitis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05507296A JPH05507296A (ja) | 1993-10-21 |
JP2655205B2 true JP2655205B2 (ja) | 1997-09-17 |
Family
ID=24709596
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4509995A Expired - Lifetime JP2655205B2 (ja) | 1991-03-26 | 1992-03-26 | 非a非b肝炎のアッセイ |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5635346A (ja) |
EP (1) | EP0532746B1 (ja) |
JP (1) | JP2655205B2 (ja) |
AU (1) | AU640569B2 (ja) |
CA (1) | CA2082924A1 (ja) |
DE (1) | DE69216333T2 (ja) |
ES (1) | ES2098511T3 (ja) |
WO (1) | WO1992017612A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0573624A4 (en) * | 1991-11-07 | 1997-09-17 | Baxter Diagnostics Inc | Epitope mapping ot the c33c region of hcv |
EP1461078B1 (en) * | 2001-10-31 | 2011-12-21 | Diachemix LLC | A PEPTIDE-BASED FLUORESCENCE POLARIZATION ASSAY FOR DETECTION OF ANTIBODIES TO i MYCOBACTERIUM BOVIS /i |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61176856A (ja) * | 1985-02-01 | 1986-08-08 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 非a非b型肝炎抗原 |
HU220204B (hu) * | 1987-11-18 | 2001-11-28 | Chiron Corp. | HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet |
YU48038B (sh) * | 1987-11-18 | 1996-10-18 | Chiron Corp. | Postupak za dijagnostiku ne-a, ne-v hepatitisa |
WO1990000597A1 (en) * | 1988-07-06 | 1990-01-25 | Genelabs Incorporated | Post-transfusion, non-a, non-b hepatitis virus and antigens |
IL91371A0 (en) * | 1988-08-24 | 1990-04-29 | Us Commerce | Clones or vectors bearing dna sequences of non-a and non-b hepatitis and a method for detecting these materials in blood |
US5191064A (en) * | 1988-09-30 | 1993-03-02 | The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) | Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide |
HU225068B1 (en) * | 1989-03-17 | 2006-05-29 | Chiron Corp | Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh |
EP0445801A3 (en) | 1990-03-08 | 1992-07-01 | Kuraray Co., Ltd. | Peptide and its use |
JP3241057B2 (ja) * | 1990-03-08 | 2001-12-25 | 株式会社医学生物学研究所 | ペプチドおよびその用途 |
JPH0436185A (ja) * | 1990-03-28 | 1992-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 融合抗原ポリペプチド |
CA2047792C (en) * | 1990-07-26 | 2002-07-02 | Chang Y. Wang | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines |
-
1992
- 1992-03-26 EP EP92910998A patent/EP0532746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-26 ES ES92910998T patent/ES2098511T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-26 AU AU17785/92A patent/AU640569B2/en not_active Ceased
- 1992-03-26 JP JP4509995A patent/JP2655205B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-26 DE DE69216333T patent/DE69216333T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-26 CA CA002082924A patent/CA2082924A1/en not_active Abandoned
- 1992-03-26 WO PCT/US1992/002527 patent/WO1992017612A1/en active IP Right Grant
-
1995
- 1995-01-17 US US08/372,723 patent/US5635346A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2082924A1 (en) | 1992-09-27 |
AU1778592A (en) | 1992-11-02 |
WO1992017612A1 (en) | 1992-10-15 |
DE69216333T2 (de) | 1997-07-10 |
EP0532746B1 (en) | 1997-01-02 |
JPH05507296A (ja) | 1993-10-21 |
US5635346A (en) | 1997-06-03 |
EP0532746A1 (en) | 1993-03-24 |
EP0532746A4 (en) | 1993-07-21 |
DE69216333D1 (de) | 1997-02-13 |
ES2098511T3 (es) | 1997-05-01 |
AU640569B2 (en) | 1993-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6596476B1 (en) | Hepatitis C assay | |
US5712087A (en) | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens | |
US5683864A (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
JP4097162B2 (ja) | Hcv−特異的ペプチド、それらのための剤およびそれらの使用 | |
JP3188717B2 (ja) | C型肝炎アッセイ | |
EP0627000B1 (en) | Mammalian expression systems for hcv proteins | |
JP3350729B2 (ja) | 非a非b肝炎のためのイムノアッセイ | |
JP3114731B2 (ja) | C型肝炎ウイルス抗体検出用ペプチド抗原及びその使用方法 | |
EP0642666B2 (en) | Hepatitis c assay | |
US5843450A (en) | Hepatitis GB Virus synthetic peptides and uses thereof | |
JP2655205B2 (ja) | 非a非b肝炎のアッセイ | |
JP2813768B2 (ja) | 口蹄疫診断用ペプチドおよび当該ペプチドを含有する口蹄疫診断用抗原 | |
JP4283527B2 (ja) | Hcvコア・タンパク質配列 | |
AU660752B2 (en) | Immunoassay using synthetic HTLV-11 peptides | |
CA2079439A1 (en) | Non-a, non-b peptides | |
WO1993009252A1 (en) | Synthetic peptides corresponding to portions of hiv-2 virus and methods of using in an improved assay |