JPH05507296A - 非ａ非ｂ肝炎のアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非Ａ非Ｂ肝炎のアッセイ 発明の背景 Ｂ型肝炎の原因因子の発見は、提供された血液中の該因子の検出のための高感度 のアッセイの開発と相俟って、血液供給からのこのウィルスの迅速な実質的除去 をもたらした。しかしながら、輸血関連肝炎の他のウィルス形態が間もなく明ら かとなり、一般的に非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と命名された。チンパンジー中 での感染血液の継代接種を伴う研究から、ＮＡＮＢＨを引き起こす感染因子は１ 種より多く存在することが明らかである（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、　ｅｔａｌ 、、Ｊ、　ｔｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１４８：　２５４　（１９８３）を参 照）。血液中におけるその存在は、感染の急性相においてさえも１ｍｌ当たり感 染性単位が僅かｔｏｏｏ個台に過ぎないことから、純粋なウィルスの単離が極度 に困難であろうことも初期の研究から明らかである。

初期における単離の失敗にもかかわらず、該ウィルスは多くの基準によって予備 的に特徴づけられた。クロロホルムによる該因子の不活性化は、エンベロープウ ィルスを示唆した（Ｈｏｔｔａ　＆　Ｅｖａｎｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　２： 　７７３　（１９８５））　、種々のポアサイズの膜を通したＮＡＮＢＨ因子の 濾過は、３０乃至６０ｎ、ｍのサイズ範囲を示した。更に１．２４ｇ／ｍｉのブ イヨン密度てＮＡＮＢＨ因子が約２０Ｏ８で沈降したことが測定された。最後に 、該因子は電子顕微鏡法で可視化された（Ｃａｂｒａｌ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇ ａ５ｔｒｏｅｎｔ、、　８１：　１２０　（１９８１））　ｏデータの全てが、 ＮＡＮＢＨ因子がトガ若しくはフラビウイルスであり、又はトガ若しくはフラビ ウィルスと密接に関係した群であるという結論と矛盾しない。

ＮＡＮＢＨ研究において突破口がおとずれたのは、汚染された精製第Ｖ［［Ｉ因 子から得られたＮＡＮＢＨウィルスのチンパンジーによる継代接種の途上におい てであった。Ｂｒａｄｌｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｅｍ１ｎａｒｓｉｎ　Ｌｉ ｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　６：　５６　（１９８６）は、ある特定のチンパン ジーにおけるＮＡＮＢＨ感染性単位のタイターが通常観察されるタイターより１ ０００倍大きいことを発見した。このＮＡＮＢＨ因子の豊富な源は、Ｙｏｕｎｇ 　＆　Ｄａｖｉｓ、　ＰＮＡＳ、　８０：　１１９４　（１９８３）によって考 案されたλｇｔｌｌシステムを利用した、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、に よるｃＤＮＡの作成及びスクリーニングを許容した（ＥＰ　０３１８２１６）。

ＥＰ　０３１８２１６は、大きな開いた読み取りフレームドメインを開示してお り、それはＮＡＮＢＨの診断のための市販のイムノアッセイにおける標的抗原で あるＣ−１００ポリペプチドを含む。この開示は、推定上の構造蛋白質をコード しているウィルス性ゲノムの５′末端におそらく対応している、ポリペプチドの かなりの部分を表す更なる配列を開示している第２のヨーロッパ特許出願（ＥＰ 　Ｏ３８８２３２）において、補足されている。

他の最近の外国出願には、ＮＡＮＢＨに罹った患者の肝臓切片からクローン化さ れた更なる配列を開示している、ＷＯ９０，０２２０６（ＳｅｔＯ）が含まれる 。ＷＯ９０１００５９７（Ｎｅｅｌｅｙ）は、活性ＮＡＮＢＨウィルス産生性の 不死化したヒト肝細胞からウィルスを産生ずる方法を提示している。ウィルス抗 原を製造するための代わりの方法の一つは、ＥＰ　０１９０９７２　（Ｙｏｈｋ ｏ）に開示されており、感染チンパンジーの肝臓組織から導かれた蛋白質のショ 糖勾配上での遠心手順を含む。９７２においては、ＮＡＮＢＨに感染したヒト又 はチンパンジーからのリンパ球をＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスで形質転換 し、そして勾配精製された抗原に対して特異的である抗体を分泌しているクロー ンをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体もまた得られた。

上記ＮＡＮＢＨポリペプチド配列は診断的アッセイに有用であるといわれている 。

追加のＮＡＮＢＨの配列かＥＰ　０３６３０２５　（Ａｒｉｍａ）に提示されて いる。この配列は、ＮＡＮＢＨ患者からの血漿約１００Ａから濃縮されたウィル スより抽出されたＲＮＡより得られた。配列はλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリ ーのイムノスクリーニングによって同定された。

スクリーニング陽性のクローンのうち、そのようなりローンの１つは、ＥＰ　０ ３６３０２５　（Ａｒｉｍａ）中の請求項２の式ＩＩＩに記載されたアミノ酸配 列を有するクローン１８ペプチドを含んでいた。

発明の概要 ＮＡＮＢＨ因子に対する患者血清中に含まれた抗体の検出のためのアッセイの定 式化においては、アミノ酸配列ＱＥＫＫＧＥＡＳＮＧＥＡＥＮＤＴＨＫＫＱ　Ｒ ＲＹＫＥ　ＫＥＫＴＡＴＮＮＰＧＫＮＫＫＰＲＶＧＲｒＫＮＷＮＲＥＧＲＫＤＡ ＹＱ　Ｉ　ＲＫＲＲを有する、ＥＰ　０３６３０２５中にＡｒｉｍａによって記 述された特定のＮＡＮＢＨ血清と免疫反応性であることが知られている６３個の アミノ酸よりなるポリペプチドが、該分子のアミノ末端から段階的に配列を短く していくことによって修飾された。本発明の改良されたアッセイは、残基２１か ら２６までの配列内に含まれるアミノ酸よりなる群より選ばれたアミノ酸残基か ら順次実質的にカルボキシ末端のアルギニンまで延びているポリペプチドの部分 と実質的に相同である、短縮されたフラグメントを利用する。

本発明の別の面において、該ペプチドフラグメントは（ＮＡＮＢＨに罹患した個 体から得られた）血清に対して反応性である少な（とも１つのエピトープ含むが 、イムノアッセイにおいて非特異的結合、高いバックグラウンド及び偽の陽性シ グナルに寄与することの見出されている、該６３アミノ酸ポリペプチドの残基２ １乃至２１３のアミノ酸残基のいずれかからＮ末端まで延びる部分をも除去して いる。これらのペプチドは、ワクチンとしても及び診断又はスクリーニングアッ セイにおいても有用性を存する。

本発明のペプチドを利用する改良されたアッセイの具体例の一つにおいては、標 的ペプチドフラグメントは固体のマトリクス上に被覆され、そしてアッセイは、 該ペプチドに指向性の抗体を含有するサンプルとともにインキュベートして抗体 ペプチド複合体を形成させ、前記固体マトリクス上に固定化された該複合体から 未反応のサンプルを分離し、検出手段によって該複合体中の抗体の量を定量する ことによって実施される。

該改良されたアッセイの別の具体例の一つにおいては、標的フラグメントを蛍光 団と接合させ、アッセイは、それを該ペプチドに対する抗体を含むサンプルとと もにインキュベートして抗体ペプチド複合体を形成させ、溶液中の複合体の蛍光 分極を測定することによって実施される。こうして、このような均一相アッセイ によって、複合体形成の程度が相分離段階なしに測定できる。

図面の簡単な説明 図１は、該６３アミノ酸ポリペプチド配列及びそれから誘導される種々のペプチ ドフラグメントを描いたダイアグラムである。１位のアミノ酸がグルタミンに始 まることに注意。

図２は、アッセイバックグラウンド値に対する、該ポリペプチドのアミノ末端か らの最初の２０個のアミノ酸の除去の効果を示す棒グラフである。

好ましい具体例の詳細な説明 本発明の改良されたアッセイにおいて利用されるペプチドフラグメントは、ＮＡ ＮＢＨからの回復期にある又は罹患している患者からの血清に対して抗原抗体反 応特異性を示すポリペプチドから誘導される。該特異的なポリペプチドの核酸配 列は、ＥＰ　０３６３０２５　（Ａｒｉｍａ）に公表されており、その中におい て（請求項２の式ＩＩＩとして）同定されている。該クローンの免疫反応性は、 λｇｔｌｌライブラリーの作成後にイムノスクリーニング技術により確認された 。核酸配列に対応するペプチド配列は図１のペプチドＡに示され、カルボキシ末 端にアルギニンをそしてアミノ末端にグルタミンを有する６３個のアミノ酸より なるポリペプチドを構成する。この配列を有する合成的ポリペプチドを調製する に際しては、樹脂からのペプチドの切離しの際しにおける末端グルタミンの環化 を阻止するために、Ｎ末端に追加のフェニルアラニンが加えられる。

この６３アミノ酸ポリペプチドから誘導される全てのペプチドフラグメントは（ 並びに完全サイズのポリペプチド対照も）、フルオレニルメトキシカルボニル（ ＦＭＯＣ）アミノ基保護法及び１．３−ジイソプロピルカルボジイミドカップリ ング化学を用いて、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９６００型ペプチ ド合成装置によりアミドの形で合成された。該配列のアミド形は、遊離酸の形よ りも一層緊密に生物学的活性類縁体を模擬すると期待できたため、採用した。活 性化されたアミノ酸は、２，４−ジメトキシベンズヒドリルアミン樹脂に結合さ せた。ペプチド合成は、イサチン試験を実施したプロリンを除き、全てニンヒド リン分析によってモニターした。合成されたペプチドは、トリフルオロ酢酸、チ オアニソール、エタンジチオール及びアニソールの体積比９０：５：３＋２より なる試薬Ｒにより樹脂から切離された。

樹脂から切り離されたペプチドを、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） により精製し、正確な配列を確認するためＰｏｒｔｏｎ　Ｐ［２０９０Ｅ　Ｉｎ ｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｍｉｃｒｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍにより特 徴記述を行った。純度は、０．１％トリフルオロ酢酸中５乃至４０％のアセトニ トリルの３５分間かけた線形勾配を用いて逆相カラム上ＨＰＬＣにより確認した 。吸光度は２３０ｎｍにて測定した。

代わりに、組換えペプチドは、プロモーター、リポソーム結合部位および翻訳終 始部位の操作によって、クローン中で生物学的に産生させることもできる。

本発明のペプチドは、蛋白質標的を利用するいかなるアッセイシステムにおいて も便利に使用できる。好ましい具体例においては、標的ペプチドフラグメントは 、常磁性の微粒子のような固体マトリクス上に受動的な又は共有結合的な被覆方 法にて被覆される。抗ＮＡＮＢＨ抗体の存在下におけるインキュベーション段階 に続いて、結合した抗体ペプチド複合体は、磁気的分離によっていかなる未反応 の抗体からも分離され、そして該抗体ペプチド複合体中の抗体量が定量される。

簡便には、複合体形成した抗ＮＡＮＢＨ抗体の検出は、更に該複合体を酵素の取 り付けられた抗ヒト抗血清と反応させることによって実施することができる。磁 気的分離及び洗浄により、常磁性体粒子上の標識を付した複合体が分離されると 、蛍光発生性の酵素基質が加えられる。測定された蛍光量は、こうしてサンプル 中に存在する抗ＮＡＮＢＨ抗体の量に直接比例する。

代わりの具体例の一つにおいては、本発明のペプチドは、古典的な酵素免疫抗体 法（ＥＬＩＳＡ）においてミクロタイタープレートウェル上に被覆され、サンプ ルとともにインキュベートされ、吸引され、、そして酵素を接合させた抗ヒト抗 血清が加えられる。検出は、簡便には、適当な基質／色素原を加え、得られる生 成物を測定することによって実施される。ＥＬＩＳＡの一般的議論については、 Ｌａｎｇｏｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ、　Ｐａｒｔ　Ｄ、　ｒｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｐ、　８４　（１９８２）を参照のこと。

本ペプチドに応用し得る更なる代わりのアッセイ方式は、Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌ ｏｔ、Ｔｏｗｂｉｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ７６：　４３５０　（１９７９）；　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ　（ Ｒ［Ａ）、　Ｗａｌｓｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　１ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、 。

２１：　５５０　（１９７０）；　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ａｓ５ａｙｓ、　 Ｄｉａｍａｎｄｉｓ、　Ｃｌ１ｎ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２１：　１３９　 （１９８８）：　Ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ａｓ５ａｙｓ、　Ｃｒｏｏｋ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４６：　２９　（１９ ８０）；　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、　Ｔｏｊｏ、　ｅｔａｔ 、、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅａｐ、３４：　２４２３　（１９８８）　ａｎｄ　Ｄｏｔ 　Ｂｌｏｔｓ、Ｊａｈｎ、ｅｔ　ａｌ。

、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　８１：　１６８４　（１９８ ４）；　ＰＣＦＩＡ、　Ｊｏｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　６７：　２１　（１９８４）。

特に利益のあるのは、蛍光分極に基づく均一相アッセイである。

このアッセイにおいては、標的ペプチドフラグメントは、フルオレッセインのよ うな蛍光団へ接合させられ、抗体ペプチド複合体を形成するために抗ＮＡＮＢＨ 抗体を含有するサンプルとインキュベートされ、続いて増大した蛍光分極の測定 が行われる。これは、相分離段階が不要であり且つ結果が最初の反応混合物から 直接に読み取れる点で、他のアッセイに対する魅力的な代替法である。

本発明のペプチドはまた、ＮＡＮＢＨ感染の治療におけるワクチンとしても有用 である。６３残基ポリペプチドのエピトープがいずれも、Ｎ末端の非特異的結合 配列の除去されたペプチドフラグメント群に含まれることから、各フラグメント は、ワクチンとして使用される場合、いずれも抗原決定基の全てを保持する。後 に提示する連続的採血データは、多くの患者血清について、現在市場にあるアッ セイにより検出されるよりも早期の採血において検出がされることから、これら のペプチドが少なくとも１つの主要エピトープを備えていることを示唆している 。

図１を参照して、本発明のペプチドは、Ａｒｉｍａによって記述された６３（６ ４）残基ペプチド（ペプチドＡ）の、実質的に残基番号６３からアミノ末端にお ける残基約２１まで延びる、カルボキシ−４３残基ペプチドに包含されるペプチ ド群よりなる。

配列における僅かな変化、例えばアミノ酸の置換、追加又は除去等が、アッセイ 性能に対して評価し得るほどには影響を与えないということは強調されなければ ならない。こうして、構造におけるそのような僅かな変化を有するペプチドは、 元々のポリペプチドの配列に厳密な相同性を有するペプチドの均等物と考えられ る。

図１においては、多くの垂直の列をなして、全配列のアミノ酸配列が水平に提示 されており、それらの間に上記に概括したプロトコールに従って合成された個々 のペプチドフラグメントの対応する程度を示す直線を伴っている。こうして例え ば、図１における水平に延びる第２のそのような直線は１２残基から６３残基を 構成するぺブチドを定義し、そして水平に延びる第３のそのような直線は２Ｉ残 基から６３残基までを構成するペプチドを定義する等である。

本発明のペプチドは、上述のように、そして以下の実施例において一層完全に記 述されるように、常磁性体微粒子または被覆ウェルＥＬＩＳＡ方式のいずれかの 形で、抗ＮＡＮＢＨ抗体アッセイにおける探的として利用された。結果は、実質 的にカルボキシ末端のアルギニンからおよそ残基２６から２１までの配列中のい ずれかの残基まで延びるペプチド残基を作り出すようアミノ末端残基が除去され たときに、アッセイ性能が有意に改善したことを示す。

アッセイ性能におけるこの劇的な改善は、シグナルの利得を同時に伴う有意なバ ックグラウンド（非特異的結合）消失の結果である上記のようにして、図１に描 いた配列に対応するペプチドが調製された。ペプチドは次いで、次の手順で受動 的に常磁性微粒子（サイズ０．１−１．０μｍ）上に被覆された：　２５０μｌ の５％重量／体積の４，０μｍ常磁性微粒子をマイクロフユージ中にて５００Ｏ ｒｐｍにて５分間ペレット化した。上澄を除去し粒子ペレットを５００μ！の７ ０％エタノールで１５分間再懸濁した。粒子を次いで前のようにペレット化し、 上澄を除去した。粒子をｐＨ＝１１゜０の０．１ＭのＣＡＰＳ　（（３−シクロ へキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）緩衝液５００μｍに再懸濁した。

粒子を前のようにペレット化し上澄を除去した。

凍結乾燥ペプチドを秤取し、無菌濾過（０，２２μｍ）水に再懸濁してペプチド 濃度をｌ０ｍｇ／ｍｊ７とし、室温にて３０分間溶解させて溶液とした。溶解し たペプチドをｐＨ１１，０の０．１ＭのＣＡＰＳ緩衝液で更に５００Ｍｇ　／　 ｍ　ｌに希釈し、室温にて２０分間安定化させた。このペプチド溶液の２５０μ ｌを次いで洗浄済み粒子ベレットに移した。粒子を再懸濁し次いで室温にて１２ 乃至１６時間回転した。

ペプチドが受動的に吸収された粒子を次いで５０００ｒｐｍで３．５分間ペレッ ト化し、上澄を除去し、そして粒子を０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０界面活性剤 を含む等張緩衝化食塩水で２回再懸濁した。粒子を更にペレット化し、モして等 張緩衝化食塩水に３回再懸濁した。被覆された粒子を次いで等張緩衝化食塩水で ０．０２５ｗ／ｖ％の最終粒子濃度に再懸濁した。

実施例２ 図１に記載したペプチドフラグメントを被覆した粒子を用いた常磁性粒子アッセ イは、次のようにした実施した：　ヒト血清又は血漿を、ウェル緩衝液（０，１ ０３Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．３３％Ｎ Ｐ−４０，０，０９％ナトリウムアジド、及び１５％の新生牛血清）でｌ：１０ ０に希釈した。

この希釈したサンプルの５０μｌを、Ｐａｎｄｅｘ黒色ミクロタイタープレート の各ウェルに加えた。サンプルは、少なくとも２つ以上の複製を作って試験した 。実施例１に記述したようにしてペプチドで被覆した常磁性粒子を、各ウェルに 加えた（２０μｌ）。プレートを次いで３７°Ｃに３０分分間−た。

インキュベーションが終了すると、ウェル内の粒子を１００μ！のＰ　Ｂ　Ｓ　 −Ｔｗｅｅｎ−２０（１１当たり、２．０６ｇのリン酸二ナトリウム、０．３１ ８ｇのリン酸−ナトリウム、０．　５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０，８，７６ｇの塩 化ナトリウム、及び１．０ｇのナトリウムアジド；ｐＨ７，４）で洗浄した。洗 浄段階の間、常磁性粒子を微細濾過プレートウェル内に、該プレートの底にかけ た磁場を介して保持した。粒子をこの仕方で５回洗浄した。

各ウェル内の粒子を、３０μｌの粒子再懸濁緩衝液（Ｉｆ中、４．３４６ｇのリ ン酸二ナトリウム、０．５２４ｇのリン酸−ナトリウム、８．７６ｇの塩化ナト リウム、及び１ｇのナトリウムアジド、ｐＨ７，４）に再懸濁した。β−ガラク トシダーゼを接合させ接合体希釈緩衝液（０，１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５ ，０，５Ｍ塩化ナトリウム、５％グリセロール、２．３ｍＭ塩化マグネシウム、 ０．１％ナトリウムアジド及び２０％新生牛血清）で１　＋　１０００に希釈し たヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）（接合体）の２０μｌを、次いでウェルに加え た。

粒子に結合させたいかなるヒトＩｇＧ又はＩｇＭも、接合体によって認識され結 合された。この接合体溶液は最大の液体安定性及び反応性を与えるよう設計され た。特に、新生牛血清は牛血溝より好ましい。接合体と共に３７°Ｃにて１５分 間インキュベーションした後、非結合の接合体の実質的に全てを除去するために ウェル内の粒子をＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ−２０で上述のように５回洗浄した 。洗浄液中のＴｗｅｅｎ−２０は、洗浄工程を高めて非特異的に結合した接合体 を除去した最後に、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｍ ＵＧ）よりなる５０μ！の基質溶液（１ｊ７当たり、０．１７８ｇの４−メチル −ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３．５８ｇのトリシン（ｔ ｒｉｃｉｎｅ）、５．１ｍ、ｆのジメチルスルホキシド ジド、０．５ｒｒｌのＴｗｅｅｎ−２０　：　ｐ　Ｈ　８　、５　）を各ウェル に加えた。

ウェル内のβ−ガラクトシダーゼ（すなわち接合体）の存在がＭＵＧの切離しを 引き起こし蛍光性のクマリン生成物を産生した。この試薬及び接合体は、敏感な 検出システムとして使用された。蛍光（励起波長４　０　０　ｎｍ／放射波長４ ５０ｎｍ）は、ＭＵＧ添加後２つの時間間隔にて（すなわち２及び１４分）測定 された。これら２つの値の差は蛍光性生成物産生の動力学的測度であり、粒子に 結合した接合体とヒトＩｇＧ／ＩｇＭの直接の測度である。蛍光値は、標準極線 を確立するためのクマリン自身の種々の濃度とその結果として得られる蛍光とを 用いて、クマリンのｎＭ値に変換された。

実施例３ ＮＡＮＢＨ血清と正常供血者血清とを用いた常磁性粒子ア・ソセイは、実施例２ に記載のようにして実施した。表ＩＡは、ペプチドフラグメントＢＳＣ，Ｄ，Ｅ ，Ｆ及びＧ（図１にて詳述した通り）の比較結果の要約である。

４種のＮＡＮＢＨ患者血清の反応性についての結果をシグナル／ノイズとして表 すが、次の計算によって決定されたものである：ＮＡＮＢＨ陽性標本蛍光＋３つ の異なる正常標本の平均蛍光。

表ＩＢは、個々の陽性サンプルの位置する、３つの正常サンプルの平均からの（ ３つの正常サンプルから得られた）標準偏差の個数を示す。両群のデータは、フ ラグメントＣが、最高のシグナル／ノイズ比が得られるという点及び、加えて、 陽性の位置する、陰性からの標準偏差の個数が最大となるという点において、最 良のアツセイ性能を与えることを示している。

実施例４ 図２にグラフで示した実験は、実施例２に記述した常磁性粒子アッセイを用いて ペプチドＡ、すなわち完全長配列の性能（図２Ａ）をペプチドフラグメントＣ（ 図２Ｂ）と比較している。１３個のサンプルがＸ軸上にプロットされておりそれ らの各アッセイ蛍光値（ｎＭクマリン）がＹ軸上にプロットされている。

サンプル番号１はＮＡＮＢＨ個体からのものであり、サンプル番号２乃至１２は 正常供血者からのものであり、そしてサンプル１３はサンプル希釈緩衝液対照で ある。

データはペプチドのアミノ末端からの２０個のアミノ酸（ｌから２０まで）の除 去は、ＮＡＮＢＨ標本の反応性を減少しないがしかし陰性血清の非特異的結合反 応性（バックグラウンド）を劇的に低下させることを実証している。

実施例５ 常磁性粒子アッセイは、粒子上に別々に被覆されたペプチドフラグメントＡ、Ｂ 、及びＣを用いて、実施例２に従って実施された。

１０名の異なるＮＡＮＢＨ個体及び１名の正常供血者が試験され、その結果はシ グナル／ノイズとして表２に示されている。シグナル／ノイズは前に詳述した（ 実施例３）通りに計算した。

データは、ペプチドのアミノ末端からの１１個のアミノ酸（１から１１まで）の 除去（ペプチドＢ）が、いかなる陽性サンプルについても完全長ペプチド（ペプ チドＡ）に比して反応性の損失なしに、陽性ＮＡＮＢＨ患者血漿サンプルと正常 血漿サンプルとの識別の増大をもたらすことを明瞭に実証している。

フラグメントＣを製造するための更に多くのアミノ酸（すなわち、２０個のアミ ノ酸）の除去でも、更に一層良いアッセイ識別をもバックグラウンド及び陽性シ グナルに寄与するフラグメントＡのＮ末端アミノ酸を更に明確にするため、実施 例２に記述した常磁性粒子アッセイをペプチドフラグメントＨ乃至りを用いて実 施した。

これらのペプチドは次の通りであった：２２個のアミノ酸をペプチドＡのアミノ 末端から除去（ペプチドＨ） ２３個のアミノ酸をペプチドＡのアミノ末端から除去（ペプチドＩ） ２５個のアミノ酸をペプチドへのアミノ末端から除去（ペプチドＪ） ２８個のアミノ酸をペプチドＡのアミノ末端から除去（ペプチドＫ） ３０個のアミノ酸をペプチドＡのアミノ末端から除去（ペプチドし） この実験の結果を、８つの異なる陽性ＮＡＮＢＨ血漿を１１の正常供血者血漿の 平均で除したシグナル／ノイズとして、表３に示しである。

ペプチドＨ１■及びＪは強い殆ど等価の性能を示す。ペプチドＫ及びＬは、８つ の陽性血清のうち５つで劇的に減少した反応性をそして残る３つの陽性血清で部 分的に減少した反応性を示す。減少したシグナル／ノイズは、陽性シグナルの減 少のためであり、正常供血者との反応性（すなわちバックグラウンド）の増大の ためではない。このことは、これらペプチド中のＮＡＮＢＨ血漿の免疫反応性に 寄与する領域を明確に規定する。更に、これらのデータは、当該領域の除去（す なわちフラグメントにのように）が陽性シグナルを減少させることが認められる ということから、免疫反応性領域がアミノ酸２３乃至２９の間、特にアミノ酸２ ６乃至２９の間に、存在することを示している。

実施例７ 表４は、ペプチドへの性能を、アミノ末端からアミノ酸の除去された全てのペプ チドフラグメント（ペプチドフラグメントＢ、Ｃ。

Ｈ，Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬ）と比較している。加えて、第９乃至第４５までのアミノ 酸よりなるペプチドＭも、実施例２の常磁性粒子アッセイを用いて試験された。

各ペプチドの性能は、各陽性サンプルの位置する、陰性サンプルの平均からの漂 準偏差の個数を用いて判定し、表４に記載したようにして計算した。

データは、フラグメントＡのアミノ末端からアミノ酸が除去されると、アッセイ 性能が改善され、ＢはＡより良く、ＣはＢより良く、そしてＨはＣより良いこと を示している。Ｈ１■及びＪについては全体的なアッセイ性能は同等であった。

フラグメントに、Ｌ及びＭは、減少したＮＡＮＢＨ陽性シグナル反応性のためで ある乏しいアッセイ性能しか有しない。フラグメントＭは、実施例６において記 述したようにアミノ酸２３と２９の間の免疫反応性領域を含むが、しかも陽性サ ンプルに対して乏しい反応性しか示さない。フラグメントＭは、フラグメントＡ 、　Ｂ、　Ｃ，Ｈ，Ｌ　Ｊ、　Ｋ又はＬの７個のカルボキシ末端アミノ酸を含ま ず、従って、これらのカルボキシ末端アミノ酸はアミノ酸２３乃至２９と組み合 わさって、ＮＡＮＢＨ陽性サンプル反応及び良好なアッセイ性能に必要である。

実施例８ 表５に提示したデータは、ペプチドフラグメントＨのカルボキシ末端から７個の アミノ酸を除してフラグメントＮとすることの影響を実証する。結果は、実施例 ２において記述した常磁性粒子アッセイによって得られ、シグナル／ノイズ値と して提示されている。

ＮＡＮＢＨ血漿サンプル番号２．５及び６についてのシグナル／ノイズにおける 劇的な減少は、最良のアッセイ性能を達成するためにはフラグメント中にアミノ 酸５６乃至６３の特定のアミノ酸残基が含まれなければならないことを明瞭に実 証している。

実施例９ 図１に示したペプチドフラグメントは、ＥＬＩＳＡ被覆ウェルミクロタイタ一方 式を用いて試験された。アッセイは次のように実施した：　ペプチドＡを０．１ ＭのＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨＩ　’ｘ、０）に７５μｇ／ｍｌになるよう希釈し、 この溶液５０μ！を適当に標識したウェル（Ｃｏｓｔａｒ　９６　Ｆ！ＥＡ　Ｐ ｌａｔｅのうちの４８個のウェル）に添加し、ペプチドを室温にて終夜吸収させ た。同様に、残りの４８ウエルに５０μ！のフラグメントＨ溶液をピペットで入 れて吸収させた。

ウェルをＩＯθμ！の０　、　０５　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝化 食塩水（ＰＢＳ）で５回そして１００μ！のＰＢＳで更に５回洗浄した。被覆さ れたプレートを次いで、標準的なミクロタイターブレートアッセイ方式を用いて 試験した。接合体、洗浄緩衝液及び基質は、０ｒｔｈｏ　ＥＬ［ＳＡ試験システ ムからのものである。

２００μ！の標本希釈液を各ウェルに添加し、次いで２０μｌの各標本（血清又 は血漿）をウェルに添加した。プレートを１０秒秒間中かに混合し、次いで３７ ℃にて１時間おいた。Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎでプレートを５回洗浄し、次い で２００μｌの抗ヒトＩｇセイヨウワサビパーオキシダーゼ接合体を全てのウェ ルに添加しそして３７′　℃にて１時間インキュベートした。次いでウェルを前 のように洗浄し、そして２００μｌのＯＰＤ　（ｏ−フェニレンジアミン２ＨＣ １）／基質を各ウェルに加えた。暗所、室温にて３０分後、５０μｌの４Ｎ硫酸 を各ウェルに添加した。光学濃度を４９０ｎｍにてＢｉｏｔｅｋプレートリーダ ー中で測定した。

表６Ａ及び６Ｂの結果は、９例のＮＡＮＢＨ患者血清及び１２例の正常血清を用 いて、ペプチドＨに対しペプチドＡの反応性を比較している。常磁性粒子アッセ イで見られるように、改良されたペプチドフラグメント（フラグメントＨ）を利 用するＥＬＩＳＡシステムは、正常患者血清のレベルからの陽性ＮＡＮＢＨ患者 血清のレベルを識別するための高められた性能を示す。表６Ａは、シグナル／ノ イズとして結果を提示し、そして表６Ｂは陽性ＮＡＮＢＨ患者血清の位置する、 陰性（正常）集団平均からの標準偏差の個数として結果を提示する。

実施例１Ｏ ＮＡＮＢＨ感染を有する２例の患者の６回の連続的採血からの血漿が、フラグメ ントＨ及び実施例２に記述した常磁性粒子アッセイを用いてアッセイされた。表 ７に要約したデータは、本発明のペプチドが、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ　Ｉｎｃ、によって製造されている市販の（Ｏｒｔｈｏ　ＨＣＶ　ＥＬＩＳ Ａ　Ｔｅ５ｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）試験に比して近似の又はより早期の採血日におい て陽性標本を検出することができるということを示しペプチドフラグメントに対 するＮＡＮＢＨ血漿標本の反応性ＮＡＮＢＨ“　フラグメント サンプル　Ｂ　ＣＤ ｌ　６．７　４２．８　１．４ ２　１２．７　７９．９　０．６ ３　７、７　４６．１　２．１ ４　１．３　１０．３　１．４ ＮＡＮＢＨフラグメント サンプル　Ｅ　Ｆ　Ｇ １　２、９　０．１　０．３ ２　２、８　０．１　０．２ ３０．５　０．２　５４．６ ４　１．２　０．１　６．１ 本結果は、次の通りにして決定したシグナル／ノイズ（バックグラウンド）を提 示する。

陽性標本の蛍光　÷　３つの異なる正常標本の平均性：シグナル／ノイズ比〉１ ．０は、ペプチド配列がＮＡＮＢＨ陰性患者血漿よりもＮＡＮＢＨ陽性患者血漿 と一層反応することを示す。

陽性ＮＡＮＢＨ血漿標本の反応性を正常（陰性）血漿標本の反応性から遠ざけて いる標準偏差の個数３陽性ＮＡＮＢＨフラグメント 陽性ＮＡＮＢＨフラグメント 零結果は、サンプルが陰性平均から離れている標準偏差の個数を表し、次のよう にして計算される：　（陽性ＮＡＮＢＨサンプル値−３個の陰性サンプルの平均 値）　＋　３個の陰性サンプルの平均値の標準偏差 表２ ペプチドフラグメントのシグナル／ノイズ比較０陽性ＮＡＮＢＨフラグメント サンプル　Ａ　Ｂ　Ｃ 本結果は、シグナル／ノイズ（バックグラウンド）を表し、次のようにして決定 される： 陰性標本の蛍光　＋　陰性標本の蛍光 シグナル／ノイズ比＞ｉ、ｏは、ペプチド配列が、ＮＡＮＢＨ陰性患者血清より ＮＡＮＢＨ陽性患者血清と一層反応することを示すペプチドフラグメントに対す るＮＡＮＢＨ血漿標本の反応性１陽性ＮＡＮＢＨフラグメント サンプル　ＨＩＪＫＬ １　５．４　５．３　４．７　０．３　０．８２　１１０．０　１４０．５　１ ０２．４　０．２　０．６３　１８．８　２０．８　２７．１　１５．３　１６ ．８４　３２．４　２９．７　２５．３　０．１　０．３５　７５．０　９２． ０　８９．７　０．３　０．４６　１５．５　１５．５　１３．５　８．４　２ ．５７　４０．３　３９．９　３２．７　２０．９　４．８８　３３．２　２５ ．５　２０．１　０．６　０．７本結果は、シグナル／ノイズ（バックグラウン ド）を表し、次のようにして決定される： 陽性標本の蛍光　＋　１１の異なる陰性標本の平均蛍光シグナル／ノイズ比〉■ 、０は、ペプチド配列が、ＮＡＮＢＨ陰性患者血清よりＮＡＮＢＨ陽性患者血清 と一層反応することを示す陽性ＮＡＮＢＨ血漿の標本反応性を正常（陰性）血漿 標本の反応性から遠ざけている標準偏差の個数８ＮＡＮＢＨフラグメント ＮＡＮ　Ｂ　Ｈフラグメント 本結果は、サンプルが陰性平均から離れている標準偏差の個数を表し、次のよう にして計算される：　（サンプル値　−１１個の陰性サンプルの平均値）　÷　 １１個の陰性サンプルの平均値の標準偏差。

表５ Ｃ末端から８個のアミノ酸を除去することの効果“陽性ＮＡＮＢＨフラグメント 末結果は、シグナル／ノイズ（バックグラウンド）を表し、次のようにして決定 した。

陽性標本の蛍光　＋　１１個の異なる陰性標本の平均蛍光シグナル／ノイズ比〉 １．０は、ペプチド配列が、ＮＡＮＢＨ陰性患者血清よりＮＡＮＢＨ陽性患者血 清と一層反応することを示す被覆ウェルＥＩＡ・　ペプチドフラグメントの比較 ペプチドフラグメントのシグナル／ノイズ比較ＡＮＢＨ ４１６，８６１，４ ５１９，６５５，２ ８１０，９２７，８ ９１０，２４１，８ 本結果は、シグナル／ノイズ（バックグラウンド）を表し、次のようにして決定 される： 陽性標本の光学濃度　＋　１２個の異なる陰性標本の平均光学濃度 シグナル／ノイズ比〉１．０は、ペプチド配列が、ＮＡＮＢＨ陰性患者血清より ＮＡＮＢＨ陽性患者血清と一層反応することを示す被覆ウェルＥＩＡアッセイ： 　ペプチドフラグメント比較陽性ＮＡＮＢＨ血漿標本の反応性を正常（陰性）血 漿標本の反応性から遠ざけている標準偏差の個数１ＮＡＮ　Ｂ　Ｈフラグメント ５　１Ｂ、　５１　５２．７８ ６　７、５３　２８．８５ 本結果は、サンプルが陰性平均から離れている標準偏差の個数を表し、次のよう にして計算される。

（陽性ＮＡＮＢＨサンプルの値　−１２個の陰性サンプルの平均値）　＋　１２ 個の平均サンプルの平均値の標準偏差。

表７ 市販のＨＣＶ連続採血パネルを用いた、フラグメントＨの対０ＲＴＨＯＨＣＶ　 ＥＬＩＳＡアッセイ性能の比較採血臼： ０７／２Ｂ／８８　０．２　０．１ ０８／２２／８Ｂ　０．２　０．１ ０９１０８／８８　０．２　０．１ ０９／２Ｂ／８８　４９．９　３．８ １．２／１２／８９　７３．３　６．００１／１３／８９　５２．３　６．０ 採血日： ０７／１９／８８　２１．３　０．１ ０８／１９／８８　９．２　０．１ ０８／３０／８８　１１．４　０．１ ０９／２８／８８　２９．７　０．５ １１１０９／８８　２８．７　６．０ ０３／１．７／８９　１７４．６　６．０本シグナル／ノイズは次のようにシて 決定する：　陽性標本の蛍光÷陰性標本の蛍光 ネ＊シグナル／力・ットオフｉヨ次のよう（こして決定する：　陽性標本の光学 濃度　十　計算された力・ットオフの光学濃度配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：　Ｌｅａｈｙ、　Ｄａｖｉｄ　ＣＴｏｄｄ、　Ｊｏｈｎ　Ａ Ｊｏｌｌｅｙ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｅ Ｓｈａｈ、　Ｄｉｎｅｓｈ　Ｑ Ｂｅｔｈｅｌｌ、　Ｄｅｌｉａ　Ｒ Ａｒｉｍａ、　Ｔｅｒｕｋａｔｓｕ （ｉｉ）発明の名称：　ｒＭＰＲＯＶＥＤ　ＡＳＳＡＹ　ＦＯＲＮ０Ｎ−Ａ　Ｎ ０Ｎ−ＢＨＥＰＡＴＩＴＩＳ （ｉｉｉ）　配列の数：　２ （１ｖ）連絡住所： （Ａ）名宛人：　Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ。

（Ｂ）ストリート：　Ｏｎｅ　Ｂａｒｔｅｒ　Ｐａｒｋｗａｙ、　ＤＦ２−２Ｅ （Ｃ）市：　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ （Ｄ）州：　［ｌ１ｉｎｏｉｓ （Ｅ）国：　ＵＳＡ （Ｆ）　ＺＩＰ　：７−ド：　６００１５（Ｖ）コンピュータ読み取り可能形式 ：（Ａ）媒体タイプ：　フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　Ｐ ＣコンパチブノしくＣ）オベレーティングシステムコ　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−Ｄ ＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜Ｖ ｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５ （ｖｌ）現行出願データ： ４０　４５　５゜ Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　［ｌｅ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＡｒｇＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２Ａ サンプル番号 サンプル番号 要約書 ＮＡＮＢＨを診断するための、感染患者の血清中に存在する抗体に対して反応性 のポリペプチド抗原から誘導された新規ペプチドフラグメントを利用する新規の アッセイが開示されている。これらのペプチドを製造するに際し、高いバックグ ラウンドに寄与しているポリペプチド部分は除去され、それにより例外的に高い シグナル／バックグラウンド比を有するアッセイをもたらす。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．【配列があります】なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを利用してＮＡ ＮＢＨを診断するためのアッセイであって、改良点が、実質的にアミノ末端にお ける残基２１から２６までの配列に含まれるアミノ酸よりなる群より選ばれるア ミノ酸残基から、実質的にカルボキシ末端のアルギニンまで延びる、実質的に相 同なその標的ペプチドフラグメントよりなるものであるアッセイ。
2. ２．【配列があります】 なるアミノ酸配列のポリペプチドに実質的に相同の、ＮＡＮＢＨ陽性血清に反応 性の少なくとも１のエピトープを含み且つ残基２６から２１までの配列に含まれ るアミノ酸よりなる群より選ばれる残基からＮ末端まで延びる前記ポリペプチド の部分を除去したものである、ペプチドフラグメント。
3. ３．ＮＡＮＢＨ感染の治療のためのワクチンであって、【配列があります】なる アミノ酸配列のポリペプチドに実質的に相同の、ＮＡＮＢＨ陽性血清に対して反 応性のエピトープを含み且つ残基２６から２１までの配列に含まれるアミノ酸よ りなる群より選ばれるアミノ酸までＮ末端から延びる前記ポリペプチドの部分を 除去したものである、免疫原性ペプチドよりなるものであるワクチン。
4. ４．前記標的ペプチドフラグメントが固体マトリクス上に被覆されており、該ア ッセイが、前記ペプチドに指向性の抗体を含有するサンプルと共にインキュベー トして抗体ペプチド複合体を形成し、未反応の抗体を前記固体マトリクス上に固 定化された複合体から分離し、そして前記複合体中の抗体の量を検出手段により 定量することより行われるものである、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
5. ５．前記標的ペプチドフラグメントが蛍光団に接合されており、且つ該アッセイ が、前記ペプチドに対する抗体を含有するサンプルと共にインキュベートして抗 体ペプチド複合体を形成し、そして前記複合体の蛍光分極を測定するにより行わ れるものである、請求項１に記載の改良されたアッセイ。
6. ６．前記固体マトリクスが約０．１乃至１００μｍのサイズ範囲の粒子よりなる ものである、請求項４に記載のアッセイ。
7. ７．前記粒子が常磁性である請求項６に記載の粒子。
8. ８．固体マトリクスがミクロタイタープレートである、請求項４に記載のアッセ イ。
9. ９．該固体マトリクスが、受動的及び／又は共有結合的な結合のためのポリスチ レン又はカルボキシ若しくはアミノ官能基を有する常磁性粒子である、請求項４ に記載のアッセイ。