CN1976946A - 诱导抗hcv有效ctl应答的超型表位、其编码寡核苷酸及其应用 - Google Patents

诱导抗hcv有效ctl应答的超型表位、其编码寡核苷酸及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有效诱导细胞介导免疫应答的超型表位及其应用，具体是，有效诱导HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞并且来自于HCV多蛋白保守区域的超型表位，包含编码所述超型表位的寡核苷酸的表达载体，包含所述超型表位或者所述表达载体的疫苗组合物及其治疗丙型肝炎的应用。本发明的HCV超型表位可以施加到不同的个体，因为其可结合不同的HLA分子并且能够诱导抗原特异性免疫应答，可用于开发由丙型肝炎病毒引起的丙型肝炎的治疗剂和与此相关的肝脏疾病的疫苗作为强而有效的工具，包含编码HCV超型表位的寡核苷酸和包含它的DNA疫苗的表达载体，可作为强而有效的工具用于与之相关的免疫应答受抑制的肝炎和肝脏疾病。

Description

诱导抗HCV有效CTL应答的超型表位、其编码寡核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及一种有效地诱导细胞介导免疫应答的HCV超型表位(supertypeepitope)及其应用，更准确地说，一种有效地诱导由HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫应答的超型表位，并且其起源于HCV多蛋白的保守区域，和编码它的寡核苷酸及其在预防和治疗丙型肝炎中的应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝脏疾病、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。超过一半感染HCV的患者正变成慢性肝炎，然后他们中的大多数发展为致死性硬化或者肝细胞瘤。据信约1.7亿人，超过全球总人口的3％，感染HCV(Millerand Purcell，Proc.Natl.Acad.sci.USA，87，2057-2061，2000)。对于HCV患者，常规治疗方法是施用干扰素(α-干扰素)或者三氮唑核苷。然而，仅大约50％的这些患者对于扰素有阳性反应，他们中的50％再发展为丙型肝炎(Hino et al.，J.Med.Virol.42(3)：299-305，1994；Tsubota et al.，Hepatology.19(5)：1088-94，1994)。治疗干扰素的其他问题是高价格和住院治疗。尽管三氮唑核苷，一种核酸衍生物，对40-70％的急性肝炎患者有效，但是它对HCV慢性肝炎患者无效。
对于HCV或者由HCV引起的慢性肝脏疾病，尚未开发出任何成功的疫苗或治疗方法。因此，依然强烈需要开发一种HCV特异性抗病毒剂。
丙型肝炎病毒(HCV)属于引起非甲型非乙型肝炎的黄病毒科。HCV基因组由表达多蛋白的单链RNA组成，所述多蛋白由3010个氨基酸组成(Choo etal.，Science，244：359-362，1989)。通过病毒和宿主细胞的蛋白酶将由HCV表达的多蛋白切成10种功能不同的蛋白质。HCV由一排基因组成，即NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH(Steven Rosenberg，J.MoI.Biol.，313：451-464，2001)。所述蛋白质分成两组，一组是包括C(核心)、E1、E2和p7的结构蛋白，和另一组是包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B的非结构蛋白。
HCV的C(核心)蛋白质被认为提供HCV基因组RNA的衣壳化，并且通过调节宿主细胞的基因转录、生长和增殖在肝细胞瘤发展中发挥重要作用。E1和E2蛋白质是1型跨膜蛋白和病毒包膜蛋白，已知其主要参与细胞感染。已经不再关注E1蛋白质，因为它没有能力诱导中和抗体。然而，近来Innogenetics，Co，Belgium开发E1作为一种治疗疫苗，其在黑猩猩中成功完成了I期试验后现正在II期临床试验中。令人鼓舞的是，E1蛋白质能够有效地用于治疗1b型HCV感染，其尚不能用α-干扰素成功治疗。E2蛋白质，病毒的关键包膜蛋白之一，已知是多功能蛋白质，其与假定的细胞受体CD81结合，能够从宿主细胞的免疫系统和干扰素介导的抗病毒反应中逃脱，并且引起肿瘤发生或者自身免疫性肝脏疾病。因此，E2不仅是HCV疫苗开发的重要抗原，而且是开发抗-HCV剂的主要靶标。P7蛋白质的功能还没有被公开。NS2蛋白质是金属蛋白酶的部分，NS3在其N端携带病毒的丝氨酸蛋白酶和在其C端携带RNA解旋酶结构域。NS4A是病毒蛋白酶的辅因子，并且本发明人已经确定NS4B具有致瘤的潜力。NS5A具有赋予HCV抵抗干扰素和抗凋亡的功能。NS5B作为病毒RNA依耐性RNA聚合酶起作用。包括NS2-NS5B的非结构蛋白已经成为开发抑制病毒复制的抗病毒剂的主要靶标。
同时，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在清除感染个体中的病毒中发挥重要作用。一旦感染HBV，患者发生急性肝炎。然而，在大多数急性乙型肝炎患者中，引起强有力的多克隆CTL应答，导致该疾病的自然治愈。相反，在慢性乙型肝炎患者中不诱导CTL应答。
尽管在HCV患者的肝脏和外周血中出现病毒特异性CTL应答，即使遭受持续慢性感染，CTL应答也是太弱以致不能有效地清除病毒。然而，病毒效价的研究暗示HCV特异性CTL应答能够控制HCV感染，提示可以从增强HCV特异性CTL应答中开发有效的抗病毒治疗。
基于诱导CTL应答的表位的疫苗，能够引起非常有效的预防和治疗疾病的细胞免疫应答。使用抗原特异性表位或者编码该表位的DNA构建体的疫苗，比常规疫苗具有更多优点。第一，它是安全的。第二，很少有机会因使用全病毒或者蛋白质抗原本身产生的突变而引起免疫应答降低。第三，它容易产生。并且最后，通过在疫苗组合物中包括起源于病原体的多个抗原的表位，它可被改造用于多价疫苗。
然而，使用所述表位的疫苗和/或治疗方法的应用受到限制，这是因为HLA结合表位的多样化以及HLA自身的多态性。到目前为止，在病毒的抗原特异性CD8+T细胞应答的大多数研究中已经在HLA-A2阳性患者中进行了分析，并且评估也已经限于在HLA-A2中发现的病毒表位。
为了诱导细胞介导的免疫应答，当与主要组织相容性复合物(MHC)形成复合物时，表位肽将被暴露在抗原呈递细胞(APC)复合物的表面上。直到T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别MHC-肽复合物的结构，抗原识别才传到T-细胞内部。CD40和CD40L的结合活化T细胞，CD40L是抗原呈递细胞表面的CD40配体。经CD40-CD40L的信号转导连续刺激抗原呈递细胞，导致共刺激分子如B7-1和B7-2的表达。作为结果，T细胞能够作为具有活性分子如CD28、4-1BB和CD25的效应T细胞起作用。
在慢性肝炎患者中，已经报道了一些免疫抑制。已知促进细胞介导免疫应答的共刺激分子的表达被降低，已知作为抗原呈递细胞的树突细胞不发育成熟，并且自然杀伤细胞的功能和数量被减少。从而，发现通过施用这种共刺激分子而增强细胞免疫的方法可以是高效的。本发明人旨在通过使用这样的辅因子如CD40LT、4-1BBL、IL-15和FLT-3L、B7-1和B7-2、以及HSP(热休克蛋白)而增强细胞免疫，其中CD40LT是已知诱导树突细胞成熟的CD40L三聚体形式，4-1BBL增加CD8+T细胞密度并且促进记忆T细胞的功能，IL-15和FLT-3L诱导树突细胞的成熟并且促进在HCV患者中尤其不足的自然杀伤细胞的功能，B7-1和B7-2在识别表位抗原中发挥重要作用，和HSP改善表位呈递过程。
尽管使用肽作为抗原比使用全蛋白质抗原更安全且更有效，但是它有一些局限。肽合成和纯化的成本很高，并且需要特异性抗原递送系统。外源性肽抗原不能反映从内源性抗原如肿瘤抗原或病毒抗原中产生表位的全部过程。其抗原性取决于肽的物理特性。相反，DNA抗原具有超过肽抗原的优点，例如生产成本低，易于操作，并且它反映细胞内表位产生、肿瘤抗原或病毒抗原的呈递和识别的过程，而无任何特殊的抗原呈递系统。已经证实当将抗原以寡核苷酸的形式插入到真核表达载体中时，表位抗原诱导足够满意的细胞介导免疫应答(Cara C Wilson et al.J.Immunol，，171：5611-5623，2003)。
为了克服基于免疫治疗的表位的局限和诱导完全的HCV特异性CTL应答，本发明人通过基序搜索设计了来自HCV多蛋白保守区域的超型表位，并且进一步证实本发明的超型表位通过不仅与HLA-A2型而且也与其他HLA-A和HLA-B型结合来诱导抗原特异性免疫应答。本发明人也通过降编码本发明超型表位的寡核苷酸插入到真核表达载体中而生产了DNA疫苗。本发明人通过证实该DNA疫苗增强表位抗原特异性细胞介导的免疫应答而最终完成了本发明。
公开
技术问题
本发明的一个目的是提供一种超型表位，该超型表位来自HCV多蛋白的保守区域，并且对多种HLA型诱导HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫应答。本发明的另一个目的是提供一种通过使用编码所述超型表位的表达载体来预防和治疗丙型肝炎和其他肝脏疾病的方法。
技术方案
术语
本发明所用术语的定义显示如下。
表位：结合抗体、T细胞受体或主要组织相容性复合物的特异性区域。也被称为“抗原决定簇”。
超型表位：不管HLA的亚型，诱导大规模免疫应答的表位，意味着它不是一种HLA亚型特异性表位。
外周血单个核细胞(PBMC)：血流中具有一个细胞核的细胞，例如淋巴细胞和巨噬细胞。
ELISPOT：基于ELISA(酶联免疫吸附测定)的免疫测试。然而两者间存在差异。ELISA是一种通过使用抗蛋白质的抗体定量该蛋白质的方法。ELISPOT是一种计数分泌细胞因子的细胞数的方法，其通过在包被细胞因子特异性抗体的硝酸纤维素孔上培养细胞，并且染色从细胞分泌的在孔底的细胞因子，然后计数分泌细胞因子的细胞的斑点数。ELISPOT主要用于测量在从免疫动物获得的脾样本中活化的抗原特异性细胞毒性T细胞。
树突细胞：专门的抗原呈递细胞，其特征为具有类似神经细胞的树突形态并有效地为T细胞呈递抗原。其实例为在皮肤中发现的朗格汉斯细胞和在淋巴结发现的颗粒树突细胞。
抗原呈递细胞(APC)：呈递外来抗原的细胞。它们介导先天免疫和适应免疫。通过抗原呈递细胞的主要组织相容性复合物(MHC)实现抗原的呈递。APC包括巨噬细胞、B细胞、树突细胞、和角质形成细胞。
荧光活化细胞分选(FACS)：也被称为流式细胞术。这是一种在荧光材料标记细胞流期间测量荧光流的方法，其可以精确计数发射特异性荧光波长的细胞，导致精确计算特异性细胞对总细胞的比率。
细胞内细胞因子染色(ICS)：一种分析在抗特异性刺激的反应中T细胞产生细胞因子能力的方法。阻断通用细胞因子分泌途径，然后通过细胞内染色和FACS分析测量细胞中细胞因子的累积。
蛋白酶体：能够通过ATP反应将蛋白质切成短多肽和氨基酸的多蛋白复合物，其具有一个腔，用于切割蛋白质的有包膜空间和用于靶蛋白质在两端进入的入口。
抗原加工相关的转运蛋白(TAP)：将由蛋白酶体切割的抗原肽从细胞溶胶转移到ER的跨膜蛋白。在通过TAP迁移到ER后，该抗原肽结合I型MHC分子。
TAP工具：一种预测TAP相关加工的工具。更准确地说，一种预测特异性抗原加工的结果及其所呈递表位的序列的工具。作为基于由统计分析所产生的算法的计算机软件利用TAP工具，其广义上包括TAP结合预测工具、蛋白酶体相关加工预测工具，和在ER预测工具中由氨肽酶完成，并且在狭义上，它指蛋白酶体相关加工预测工具。在本发明中，该工具指蛋白酶体相关加工预测工具和TAP结合预测工具。
免疫有效量：为诱导对HCV的细胞介导免疫应答的量，准确地说，该量能够根除患者中的HCV感染或者预防敏感个体中的HCV感染。
发明内容
为了实现本发明上述的目标，本发明提供一种HCV超型表位，其通过与不同的HLA-A和HLA-B超型相互作用来诱导细胞介导的免疫应答。
本发明也提供HCV肽表位在预防和治疗丙型肝炎中的应用。
本发明还提供对于感染HCV患者的治疗方法或者对于HCV感染的预防方法，其包括向患者施用有效剂量的超型表位的步骤。
本发明也提供编码HCV表位的寡核苷酸序列和包含该序列的表达载体。
本发明也提供表达编码HCV表位的寡核苷酸的表达载体用于预防和治疗丙型肝炎的应用。
本发明也提供对感染HCV患者的治疗方法或者对HCV感染的预防方法，其包括施用免疫有效量的上述表达载体的步骤。
具体实施方式
本发明将在下文中详细描述。
本发明提供一种HCV超型表位，其通过与不同的HLA-A和HLA-B超型相互作用有效地诱导细胞介导的免疫应答。
本发明也提供由SEQ.ID.No 1-No 16代表的HCV超型表位。
本发明也提供由SEQ.ID.No 17-No 32代表的编码HCV超型表位的基因。
本发明也提供包含上述基因的DNA表达载体。
为了克服与常规表位相关的免疫治疗的局限并诱导HCV特异性细胞毒性T细胞(CTL)介导的免疫应答，本发明人通过基序搜索从HCV多蛋白的保守区域中制备了超型表位。为了开发能工业利用并应用于人的广谱疫苗，应用超型表位是关键的，因为它们能结合不同的多态性HLA分子。
在开发使用具有广谱作用的表位用于免疫治疗的药剂中，最大的障碍是HLA分子的多态性。作为有效的免疫治疗用药剂，表位应当能特异性结合不同的HLA分子，并且具有对不同种族群体有作用。为了开发用于免疫治疗的药剂，不得不使用大量的表位。为了解决这个问题，本发明人开发了一种结合多种HLA抗原分子的超型表位，其可用于开发表位疫苗。如果使用表位的疫苗结合多样的HLA分子，那么疫苗的作用将更广和更强。并且，本发明的超型表位能够结合不同的HLA分子，使得其在大多数目标群体中诱导完全的免疫应答。
关于CTL识别由结合在MHC的8-11个氨基酸组成的短肽的事实，本发明的超型表位由SEQ.ID.No 1-No 16代表的16种表位组成，它们分别由9个氨基酸组成，能增强抗HCV细胞介导免疫应答。
本发明的超型表位来源于HCV多蛋白的保守区域，并且具有对HLA-A分子如A1、A2、A24、A26和A3、以及对HLA-B分子如B7、B8、B15、B27、B44和B51的优异结合能力。
由SEQ.ID.No 1-No 16代表的本发明的超型表位通过SEQ.ID.No 17-No 32代表的基因所编码。
通过ELISPOT分析证实本发明的超型表位在PBMC中诱导细胞毒性T细胞介导的免疫应答。
通常，通过复杂的调节系统，活化的T-细胞分泌很多种细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、或干扰素-γ(IFN-γ)。近来已经通过ELISPOT测试(酶联免疫斑点测定)分析单个细胞中的细胞因子分泌进行了抗特异性抗原的细胞毒性T淋巴细胞应答的研究，所述ELISPOT测试在灵敏度和特异性方面是最公认的方法之一。本发明应用分析促进细胞因子IFN-γ分泌的细胞介导免疫的ELISPOT测试，以分析肽特异性T-细胞介导的免疫应答。
在本发明中，通过使用本发明的超型表位实施FLISPOT试验，以分析促进细胞因子IFN-γ分泌的肽特异性T-细胞介导的免疫应答。准确说，检查从对照组健康人中提取的2×105个PBMC。作为结果，阳性应答的平均值是12。本发明人确定阳性应答的截取值为30，其通过将平均值(12)加倍并考虑标准偏差来计算(见图1)。
通过分析抗HCV的CTL活化，证实了CTL应答由表位诱导，这提示CTL介导的免疫应答也能够被表位诱导。在ELISPOT的情况中，活化程度通常通过减去没有经表位处理的对照组的值来计算。然而，活化免疫应答的这种计算可能不正确，因为对照组的值在患者之间存在差异。为了更准确地计算由表位诱导的CTL介导免疫应答，本发明人通过分别从表位存在情况下的值减去不存在表位情况下的值，测量了活化水平。HCV患者中的活化水平与正常人的活化水平进行比较。实施ELISOPT试验，并且用所得的值作为进一步测量免疫应答活化的对照(Heiner Wedemeyer et al.，J.Immunol.169；3447-3458，2002)。计算对照组中的平均值，并且通过将平均值加倍并考虑标准偏差来确定阳性应答的截取值。
99名HCV患者参加试验。基于上述计算，54名患者对本发明的至少一种超型表位显示阳性反应(见图1)。
总之，由SEQ.ID.No 1-No 16代表的本发明的超型表位结合不同的MHC，在多种患者中诱导免疫应答，并且所得的免疫应答对治疗HCV患者必须足够有效。
本发明也提供HCV超型表位在预防和治疗丙型肝炎中的应用。
本发明还提供包含一种或多种超型表位的疫苗组合物，其选自由SEQ.ID.No 1-No 16代表的超型表位。
与DNA疫苗、治疗性蛋白质、重组病毒疫苗和树突细胞相组合，通过强效地诱导适当的免疫应答，本发明的超型表位能够有效地用于开发丙型肝炎和由该病毒引起的其他肝脏疾病的治疗剂。
表1显示通过本发明的16种超型表位疫苗所诱导的阳性免疫应答对总患者的比率。
表1
  超型表位诱导的免疫应答(n＝99)％
  L1   L2   L4   L6   L7   L8   L10   C1   C2   C3   C4   C5   C7   C8   C9   C10   Ave.
  HLA-AA2A24A26A3 11,58,3010,0 15,312,5013,9 15,316,6010,0 15,38,9010,0 18,212,5010,0 26,920,810010,0 34,820,8018,8 11,51,18010,0 26,933,3023,3 23,025,0033,3 26,623,1023,5 23,022,1036,6 15,316,6013,3 30,729,1023,3 34,829,1033,3 42,325,0033,3 23,2620,06,2618,36
  HLA-BB7B15B27B44B51 11，70033,310,0 5,822,225,011,120,0 23,50022,230,0 11,711,1011,130,0 17,522,225,011,120,0 17,511，125,022,220,0 23,511,1011,120,0 11,10022,220,0 11,544,4022,230,0 25,455,5022,240,0 25,144,4022,250,1 25,433,3044,460,0 11,611,1011,140,0 35,222,225,022,250,0 23,533,325,022,270,0 23,533,325,011,150,0 20,5422,23,3720,135,8
用16种表位治疗99名患者。作为结果，23.26％的HLA-A2型患者、20.0％的HLA-A24型患者、6.25％的HLA-A26型患者、和19.35％的HLA-A3型患者显示阳性反应。在HLA-B型患者的情况中，20.54％的HLA-B7型患者、22.2％的HLA-B15型患者、9.7％的HLA-B27型患者、20.1％的HLA-B27型患者、和35.6％的B51型患者是阳性的。上述结果指示在具有多种不同HLA型的不同患者组中，本发明的每种超型表位能够诱导上述比率(％)的阳性免疫应答。
此外，上述结果指示本发明的超型表位在具有不同HLA型的患者中能够诱导HCV特异性细胞免疫，使得它们能够用于治疗不同的HLA型，所述不同的HLA型已经从使用HLA-A2型特异性表位的治疗中被排除。
作为包含多拷贝的同聚物或者包含不同肽的异聚物，本发明的超型表位能够单独地包括在疫苗组合物中。聚合物增加免疫应答并诱导抗病原生物的抗原决定簇或者与该免疫应答相关靶表位的CTL应答。可以从抗原的天然产生领域或者从重组或化学合成来制备该疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可另外包括辅因子。所述辅因子没有具体限制，但是优选CD40LT、4-1BBL、IL-15和FLT-3L、B7-1和B7-2以及HSP(热休克蛋白)，其中CD40LT是CD40L的三聚体已知可加速树突细胞的成熟，已知4-1BBL增加CD8+T细胞数并且尤其加速树记忆T细胞的功能，IL-15和FLT-3L增强树突细胞的成熟和在HCV患者中缺失的自然杀伤细胞的功能，B7-1和B7-2在识别表位抗原中发挥重要作用，以及HSP增强表位呈递过程。
通常所用的载体，例如甲状腺球蛋白、人血清白蛋白、破伤风毒素、聚氨基酸例如聚-L-赖氨酸和聚-L-谷氨酸，可用于本发明的疫苗。该疫苗另外可包含生理接受的稀释剂，例如水或盐水，或者优选磷酸盐缓冲液。该疫苗也可包括公知的佐剂，例如弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或者明矾。
通过经不同途径如皮内、皮外、皮下、腹膜内、肌肉注射、口服接种(inorculation)、经鼻接种(inorculation)等施用本发明的表位疫苗组合物，宿主免疫系统产生巨量的抗原特异性CTL。因此，该宿主获得了预防感染和发生慢性感染的免疫应答。
本发明的疫苗可包括树突细胞(DC)作为表位载体。首先，用编码本发明表位的DNA转染树突细胞，或者用每种表位肽脉冲处理树突细胞。然后，向患者施用负载抗原的树突细胞以诱导体内免疫应答。
通过施用含DNA或肽的疫苗组合物，体内加载树突细胞也是可能的。
本发明的疫苗组合物能够与免疫调节物质一起使用，例如IFN-γ或者用于慢性病毒感染的其他治疗剂。
包含编码本发明超型表位的寡核苷酸的本发明疫苗，也能够提供诱导细胞介导免疫应答的抗原。当以寡核苷酸提供抗原时，细胞中合成的多肽应当加工成本发明中设计的表位形式。在细胞质中合成的多肽通过蛋白酶复合物“蛋白酶体”被切成由8-11个氨基酸组成的小肽。该小肽由暴露在细胞表面的主要组织相容性复合物携带，然后被用作表位。当通过寡核苷酸体内合成一种或多种表位时，为了确保正确的细胞内加工，一或多个编码氨基酸的密码子被插入到5’端，并可以通过以下网站提供的预测程序预测成功的切割：
NetChop：http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/
ParProc： http：//www.paproc2.de/paprocl/paprocl.html
FragPredict：ttp：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/expertquery.html
通过插入到真核表达载体中，编码一种或者多种表位的寡核苷酸能够用作细胞内抗原。对于基因表达，公知的真核生物表达载体是可用的，并且CMV启动子、Pff-1α启动子或者SV40启动子能够被用作启动子。已经证实成功地诱导了作为表达载体一部分插入到动物中的每种表位的单个免疫应答(Cara C.Wilson et al.，J.Immunol.，171；5611-5623，2003)。
本发明的表达载体能另外包括编码辅因子的基因。本发明的辅因子优选CD40LT、4-1BBL、IL-15和FLT-3L、B7-1和B7-2以及HSP(热休克蛋白)，其中CD40LT是CD40L的三聚体已知可加速树突细胞的成熟，已知4-1BBL增加CD8+T细胞数并且尤其加速树记忆T细胞的功能，IL-15和FLT-3L增强树突细胞的成熟和在HCV患者中缺失的自然杀伤细胞的功能，B7-1和B7-2在识别表位抗原中发挥重要作用，以及HSP增强表位呈递过程。编码上述辅因子的基因能够被插入到包含编码超型表位的寡核苷酸的表达载体中，还可以通过另一个单独的表达载体共同接种。
通过免疫有效的施用能够给患者施用本发明的疫苗。准确地说，可以一次或多次施用该疫苗，并且超型表位优选包括在1-250μg的一次剂量中，并且更优选包括在5-50μg。同时，当以包含编码超型表位的寡核苷酸的表达载体施用该超型表位时，包括有效剂量100ng-100μg的该表位，并且更优选1-50μg。
附图说明
图1是一组显示ELISPOT试验结果的图形，所述试验分析在正常和HCV患者中，本发明超型表位对促进细胞因子IFN-γ分泌的肽特异性T细胞活化的作用。
图2是一组显示ICS试验结果的图形，所述试验分析在正常和HCV患者中，所述超型表位对促进细胞因子IFN-γ分泌的肽特异性记忆T细胞活化的作用。
图3是示意图，其显示本发明的表达载体，其中编码所述超型表位的各种寡核苷酸序列和辅因子被导入。
图4是显示ELISPOT试验结果的图形，所述试验通过提供用图3的表达载体转染从患者血样中分离的树突细胞而制备的表位抗原，分析在患者中促进细胞因子IFN-γ分泌的肽特异性T细胞活化。
图5是显示ELISPOT试验结果的图形，通过比较脾细胞中分泌的IFN-γ水平，分析在用A2.1转染的小鼠中，通过插入由图3表达载体所诱导的免疫应答水平。
最佳方式
本发明可行的和当前优选的实施方案，举例说明显示于以下的实施例中。
然而，应当理解本领域技术人员，通过考虑本公开内容，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：制备促进细胞介导免疫应答的HCV超型表位
基于CTL识别由与MHC结合的8-11个氨基酸组成的短肽的事实，本发明人用16种肽制备了超型表位，所述每种肽由9个氨基酸组成，以促进抗HCV的细胞介导免疫应答。
准确地说，基于公知的MHC结合基序，制备了由SEQ.ID.No 1-No 16代表的16种表位，其来源于HCV多蛋白的保守区域，并且对5种HLA-A分子，A1、A2、A24、A26、和A3，和6种HLA-B分子，B7、B8、B15、B27、B44、和B51，显示特别高的结合能力。上述每种肽的氨基酸序列与HCV1a和b亚型的序列一致，由Peptron Inc.，Korea合成。合成肽经反相HPLC纯化至95％，并以20mg/ml的浓度溶于100％DMSO。然后通过使用RPMI 1640培养基，将该溶液稀释直至浓度达到1mg/ml用于进一步细胞培养。
本发明人也分析和鉴定了由编码上述HCV肽表位的SEQ.ID.No 17-No32代表的基因序列。
实施例2：HCV患者中超型表位对不同MHC型的结合能力
在提供抗原的细胞表面上，肽和HLA分子间的结合对于活化T细胞是必需的。为了确定上述实施例1中产生的16种肽是否能够通过结合不同的MNC诱导免疫应答，在韩国首尔Yonsei大学医学中心对99名HCV患者实施试验。所有的这些患者遭受持续的HCV感染。通过HCV ELISA测试系统确定了患者的含抗HCV抗体的血清转变，并通过RT-PCR检测了HCV RNA。这些感染患者的ALT(丙氨酸氨基转移酶)活性高6倍，并排除具有由其他原因引起的可能的慢性肝脏疾病的患者。取自8名没有感染HCV或HBV患者的血样作为对照。通过SSP HLA DNA分型盘(One Lamda)，实施所有试验和对照组的I类HLA分型。
血样取自HCV患者，通过使用Ficoll-Histopaque密度梯度方法(Sigma，St.Louis，Mo)分离外周血单个核细胞(PBMC)，用HBSS(Life technologies，GrandIsland，NY)将分离的细胞洗三次，供直接使用或者在加入90％FCS(Lifetechnologies)和10％DMSO(Sigma)后放入液氮罐中保存。
本发明人通过使用HCV患者的上述外周血单个核细胞，分析了本发明的超型表位与HLA-A和HLA-B分子间的结合(表2)。
表2
感染HCV的患者的PBMC和显示阳性应答的肽表位的频率
  显示阳性应答的患者数/具有特异性MHC类型的患者数
  I.D.   序列 HCV蛋白质   区域   HLA-A分子   HLA-B分子
  A2   A1   A24   A26   A3   B7   B8   B15   B27   B44   B51
  L1L2L4L6L7L8L10C1C2C3C4C5C7C8C9C10   NLGKVIOTLYVGGVEHRLYAAOGYKVLKVRMYVGGVELIFGITKLALPORAYAMLLLAILGPLTAGARLVVLKCDELAAKLAOGYKVLVLAILGPLMVFTILGIGTVLYVOMALMKLMALNKLAALAASCGGRVFFVGLRLLTL   CoreE2NS3E2NS2E2NS2NS3NS3NS3NS2NS3NS2NS2NS2NS2   11863212446288838028911338139912468941325933936815823   3/264/264/264/265/267/269/263/267/266/267/266/264/268/269/2611/26   2/243/244/242/243/245/245/241/248/246/247/247/244/247/247/246/24   0/10/10/10/10/11/10/10/10/10/10/10/10/10/10/10/1   3/304/303/303/303/303/305/303/307/3010/307/3011/304/307/3010/3010/30   2/171/174//72/173/173/174/172/173/175/175/175/173/176/174/174/17   0/92/90/91/92/91/91/90/94/95/94/93/91/92/93/93/9   0/41/40/40/41141/40/40/40/40/40/40/40/41/41/41/4   3/91/92/91/91/92/91/92/92/92/92/94/91/92/92/91/9   1/102/103/103/102/102/102/102/103/104/105/106/104/105/107/106/10
MHC稳定性测试是当今最广泛使用的测试之一，进行该测试以测量表位和HLA分子间的结合。准确地说，为了分析表位和HLA-A2间的结合，本发明的超型表位与T2和RMA-s细胞系在27℃下处理超过12小时，导致表位和MHC分子间结合的稳定化。然后，在37℃下，诱导进一步的反应3个小时。作为结果，本发明表位与MHC分子间的结合，在用超型表位处理的试验组中比在对照组中稳定得多。但是，当表位没有经处理或者处理具有弱结合能力的表位时，与MHC分子的结合很快被破坏。通过使用识别表位和MHC分子的完全复合物的抗体实施FACS分析。作为结果，具有高结合能力的本发明表位，被判定通过结合HLA分子诱导免疫应答。
对5种HLA-A分子，A1、A2、A24、A26、和A3，和6种HLA-B分子，B7、B8、B15、B27、B44、和B51，显示高免疫诱导能力的表位，被选为本发明的超型表位。然而，当分析上面99名患者的MHC类型时，即没有发现A1也没有发现B8型。在9种MHC型中，由SEQ.ID.No 1代表的L1对7种MHC型呈阳性；由SEQ.ID.No 2代表的L2对8种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 3代表的L4对6种MHC呈阳性；SEQ.ID.No 4代表的L6对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 5代表的L7对8种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 6代表的L8对8种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 7代表的L10对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 8代表的C1对6种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 9代表的C2对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 10代表的C3对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 11代表的C4对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 12代表的C5对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 13代表的C7对7种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 14代表的C8对8种MHC呈阳性；由SEQ.ID.No 15代表的C9对8种MHC呈阳性；和由SEQ.ID.No 16代表的C10对8种MHC型呈阳性。考虑到在患者中存在至少2-4种不同HLA型的事实，超型表位对不同HLA型在体内的反应频率远高于仅对一种特异性MHC型反应的表位的频率。
上述结果指示本发明的超型表位能够与不同类型的MHC结合，使得它能在不同HCV感染患者中诱导细胞介导的免疫应答。
实施例3：使用PBMC通过ELISPOT试验分析T细胞免疫应答
通常，活化的T细胞通过复杂控制系统诱导多种细胞因子的分泌。通过酶联免疫斑点测试(ELISPOT)监测对特异性抗原的CTL应答，这是测量单个细胞中产生细胞因子的最灵敏和专门化的方法。在本发明中应用测量促进细胞因子干扰素γ(IFN-γ)分泌的细胞免疫的ELISPOT试验，以分析肽特异性T细胞免疫应答。
具体地说，按上述实施例2中所述的相同方法分离后保存的PBMC，经解冻，然后在37℃下放置于R-10培养基中(RPMI 1640培养基，含10％FCS、2mM L-谷胺酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素)过夜。51μg/ml重组人抗IFN-γ抗体(BDpharmingen)加到96孔硝酸纤维素板(Millipore，USA)的表面，接着在4℃下用PBS(磷酸盐缓冲液)处理过夜。用PBS洗涤该板，并且在每个孔中加入含5％FCS的PBS，然后在室温下封闭2小时。用R-10培养基稀释本发明的超型表位，以调整最终体积到10μg/ml，然后以100μl分配到每个孔。PBMC以2×106个细胞/ml浓度重悬在R-10基质中，同样以100μl分配到每个孔。在37℃下保温该板24小时，然后用含0.05％吐温20的PBS洗涤。以3μg/ml的浓度向每个孔加入100μl人IFN-γ(BDPharmingen)特异性偶联生物素的mAb，然后在室温下放置该板2小时。再次洗涤该板，在用链亲合素-过氧化物酶复合物(Kirkegaard & Perry Laboratories)处理后，放置于室温。完成反应后，使用AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)底物溶液诱导显色。当观察到适当的斑点时，用自来水终止显色。在室温下干燥该96孔板，在显微镜下计数分泌IFN-γ的细胞数。在用ELISPOT阅读器(AID)计数细胞前，干燥该板过夜。通过从总数中减去对照IFN-γ的斑点数，确定肽特异性IFN-γ的斑点数。每个实验进行三次。
从分析促进细胞因子IFN-γ分泌的肽特异性T细胞活性的ELISPOT试验中，证实在健康对照组中显示阳性应答的平均值是12。本发明人确定截取值为30，这是通过将平均值(12)加倍并考虑标准偏差(图1)而计算的。例如，当用2×105个PBMC进行ELISPOT试验时，显示超过30个SFC(产生斑点的细胞)的结果被认为是阳性。
如图1所示，参加该试验的所有患者是99名。所有患者中54名对本发明的至少一种超型表位显示阳性反应。图1A显示在正常对照组中对每种超型表位的应答。图1B显示在79名患者中，对每种表位类型的阳性免疫应答。
实施例4：使用PBMC通过ICS(细胞内细胞因子染色)试验分析记忆性T细胞免疫应答
一般难以测量慢性病毒疾病患者血液中的活动T细胞的活性。因此，超型表位是否能在患者血液中诱导记忆T细胞应答，这是非常重要的问题。从而，本发明人测量记忆T细胞对超型表位的活性。
具体地说，按上面实施例2中所述的相同方法分离后储存的PBMC，经解冻，然后重悬于R-10培养基(RPMI 1640培养基，含10％FCS、2mM L-谷胺酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素)。以5×105个细胞/100μl的密度将细胞分配到96孔板(Millipore)。在R-10培养基中稀释本发明的超型表位以调整最终浓度到20μg/ml，以100μl分配到每个孔中。以每个孔10ng/ml加入重组IL-15(重组人IL-15，R&D)。在37℃下保温该板5天，然后对其用分泌抑制剂(Golgi-Stop，BD Pharmingen)处理最后6个小时以抑制细胞中的IFN-γ。加入超型表位进一步培养。人CD8特异性和偶联FITC(荧光素异硫氰酸酯)的抗体在含1％FBS(Gibco)的磷酸盐缓冲液中稀释100倍，其在4℃下与收集的细胞反应30分钟。完成该反应后，用上述缓冲溶液洗涤细胞，然后在4℃下用含甲醛的固定剂(Cytofix/Cytoperm，BD Pharmingen)固定30分钟。用洗涤缓冲液(Perm/Wash缓冲液，BD Pharmingen)洗涤细胞两次。将人IFN-γ(BDPharmingen)特异性和偶联R-PE(R-pycoerythrin)的单克隆抗体稀释200倍，然后以100μl分配入每个孔，接着在4℃下悬浮30分钟。完成反应后，洗涤细胞，然后使用FACS caliber流式细胞仪(Becton Dnckinson)测量30,000个细胞，然后用软件(CellQuest，Becton Dnckinson)分析。对于对照组，使用常规所用的肽分析健康血液中的记忆CTL应答(图2)。
如图2所示，实施ICS试验以分析促进记忆T细胞分泌IFN-γ的肽特异性T细胞的活化。作为结果，在对照组的CD8+细胞中，分泌IFN-γ的细胞平均是0.47％，本发明人确定截取值为1％，这是通过将平均值(0.47％)加倍并考虑标准偏差而计算的。
从上述结果中，证实了本发明的超型表位能够比常规HCV特异性表位更有效地活化记忆T细胞。
实施例5：构建编码超型表位的表达载体
由SEQ.ID.No 17-No 32代表的超型表位的寡核苷酸序列中，通过使用蛋白酶体(ParProc： http：//www.paproc2.de/paprocl/paprocl.html)和TAP工具(TAPPred，http：//www.imtech.res.in/raghava/tappred/)选择10种序列以确定加工顺序。作为结果，固定的加工顺序显示于图3。为了从细胞中切出表位，本发明人插入编码一对氨基酸的密码子到5’端，如图3所示。基于确定的抗原序列，通过PTDS(基于PCR的两步DNA合成)合成寡核苷酸。同时，根据图3所示的顺序合成10种寡核苷酸(SEQ.ID.No 33-No 42)，然后各40pmole的第一正向寡核苷酸(SEQ.ID.No 33)和第五反向寡核苷酸(SEQ.ID.No 42)与各1pmole的其余8种寡核苷酸(SEQ.ID.No 34-No 41)混合，加入MgSO4(2mM)、dNTP(各0.2mM)、10x PCR缓冲液(1x)和2U platinum Taq聚合酶(Gibco-BRL)，接着进行PCR。按以下实施PCR：在94℃下预变性2分钟，在94℃下变性15秒，在50℃下退火30秒，在68℃下聚合1分钟，从变性到聚合进行29个循环，并且在68℃下最后延伸5分钟。PCR产物保存在4℃。1μl双链PCR产物和由SEQ.ID.No 33代表的第一正向引物和由SEQ.ID.No 42代表的第五反向引物的引物组，被用于第二轮PCR。更准确地说，正如第一轮PCR，40pmole的每种引物和MgSO4，、dNTP、platinum Taq聚合酶混合。按以下实施第二轮PCR：在94℃下预变性2分钟，在94℃下变性15秒，在55℃下退火30秒，在68℃下聚合1分钟，从变性到聚合进行24个循环，并且在68℃下最后延伸5分钟。PCR产物保存在4℃。从DNA测序证实了最终PCR产物具有显示于图3的序列(SEQ.ID.No 43)。PCR产物被克隆入pcDNA3.1/V5-HisTOPO表达载体。在下面的表3中，显示用于合成的寡核苷酸序列。
表3
用于合成编码超型表位的寡核苷酸的引物
  寡核苷酸的编号 序列 长度
1(第1正向)   5’-gtttaaacgccgccaccatgggaatgcaggtgcagatccagagcctgtttctgctcctcctg-3’ SEQ.ID.No 33
2(第1反向)   5’-gggcaggaaggcggcctttcctctggacccgggcacccacaggaggagcagaaacaggc-3’ SEQ.ID.No 34
3(第2正向)   5’-gaaaggccgccttcctgccctccgacttcttccccagcgtgaaggcccagggctacaaggtgctggtgctgaagctg-3’ SEQ.ID.No 35
4(第2反向)   5’-cagcttggcggccagctcgtcgcacttggcgttcagggggcccaggatggccagcagcagcttcagcaccagcacct-3’ SEQ.ID.No 36
5(第3正向)   5’-acgagctggccgccaagctgaacatggccctgatgaagctggccgcccttgaacttcgtgggcctggccctgctgacc-3’ SEQ.ID.No 37
6(第3反向)   5’-caccttgtagccctgggcggcgtatgtcatggcgtaggccctggggggcagggccttcagggtcagcagggccaggccca-3’ SEQ.ID.No 38
7(第4正向)   5’-ccgcccagggctacaaggtgctgaacgccgcctcctgcggcggcgccgtgttcaaggccgcctacgtgcagatggcc-3’ SEQ.ID.No 39
8(第4反向)   5’-cagggaggccttcagcacggtgccgatgcccaggatggtggccttcagcttcatcagggccatctgcacgtaggcgg-3’ SEQ.ID.No 40
9(第5正向)   5’-accgtgctgaaggcctccctgatggccttcaccgccgccgtgaaggacctgatgggctacatccccctggtgacgcgttgagtttaaac-3’ SEQ.ID.No 41
  10(第5反向)   5’-gtttaaactcaacgcgtcaccag-3’   SEQ.ID.No 42
在慢性肝炎患者中细胞介导的免疫应答本身太弱以致不能杀死病毒而引起持续感染。在这些慢性肝炎患者中，已知促进细胞介导免疫应答的辅因子表达非常低，这是作为抗原呈递细胞的树突细胞不成熟的原因之一。在这些患者中，自然杀伤细胞数也少，并且所述细胞的功能被抑制。因此，已经进行了通过用编码辅因子的另外基因转染细胞来增强细胞介导免疫的方法。因此，在本发明中，使用CD40LT、4-1BBL、IL-15和FLT-3L、B7-1和B7-2以及HSP(热休克蛋白)作为辅因子，其中CD40LT是CD40L的三聚体已知可加速树突细胞的成熟，已知4-1BBL增加CD8+T细胞数并且尤其加速树记忆T细胞的功能，IL-15和FLT-3L增强树突细胞的成熟和在HCV患者中缺失的自然杀伤细胞的功能，B7-1和B7-2在识别表位抗原中发挥重要作用，以及HSP增强表位呈递过程。编码上述辅因子的基因和合成DNA片段各自插入真核表达载体“pcDNA3.1”，并且所得产物经大量生产和纯化用于进一步试验(图3)。为了克隆这些辅因子，从小鼠树突细胞和小鼠脾细胞中提取RNA，其被用作模板用于使用所述引物组的RT-PCR。具体地说，各40pmole的正向引物和反向引物、2μg cDNA、2μl 50mM MgSO4(最终浓度2mM)、1μl的10mM dNTP(各0.2mM)、0.4μl的5U/μl platinum Taq聚合酶(2U)和蒸馏水经混合制成最终体积50μl。按以下实施所有PCR：在94℃下预变性2分钟，在94℃下变性15秒，在表4所示温度退火30秒，在68℃下聚合1分钟，从变性到聚合进行29个循环，并且在68℃下最后延伸5分钟。PCR产物保存在4℃。
表4
用于克隆辅因子的引物和退火温度
辅因子 引物 引物序列   退火温度
FLT3L   正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatgacagtgctggcgccagcctggagc-3’ 55℃
  反向   5’-tcgtttaaacttacctgggccgaggctctgggagctccg-3’
4-1BBL   正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatggaccagcacacacttgatgtggagg-3’ 50℃
  反向   5’-tcgtttaaactcattcccatgggttgtcgggtttcaca-3’
IL-15   正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatgaaaattttgaaaccatatatgaggaata-3’ 50℃
  反向   5’-tcgtttaaactcaggacgtgttgatgaacatttggacaa-3’
CD80   正向   5’gagtttaaacgccgccaccatggcttgcaattgtcagttgatgcagg-3’ 55℃
  反向   5’-tcgtttaaacctaaaggaagacggtctgttcagctaatg-3’
由连续4轮PCR克隆了CD40L三聚体。如表5所示，实施第一轮PCR以克隆全CD40L进入pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体，其用作第二轮PCR的模板，该第二轮PCR用于克隆对应细胞外结构域的氨基酸111-260。为了产生三聚体，通过第三轮PCR克隆具有IL-7前导序列和亮氨酸拉链基序的序列。并且实施第四轮PCR以组合第二轮PCR产物和第三轮PCR产物。应用的PCR条件与克隆上述辅因子是相同的，并且仅仅根据引物对调整引物浓度和退火温度。PCR产物被克隆入pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体，并且由DNA测序鉴定序列。
表5
用于克隆CD40三聚体的引物
寡核苷酸的编号   序列   长度
  1(第1正向)   5’gagtttaaacgccgccaccatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactga-3’   65mer
2(第1反向)   5’-gtcgctgctggtagatgatgtgacaggcagcagaacaaggatcagtggaggaattccaaagatatatcta-3’ 70mer
3(第2正向)   5’-gtcacatcatctaccagcagcgacaggatgaagcagatcgaggacaagatcgaggagatcctgagcaag-3’ 69mer
4(第2反向)   5’-gccgatcagcttcttgatcctggcgatctcgttctcgatgtggtagatcttgctcaggatctcctcgatctt-3’ 72mer
  5(第3正向)   5’-gccaggatcaagaagctgatcggcgagaggctgctggaaatgcaaagaggtgatgaggatcctcaa-3’ 66mer
  6(第3反向)   5’-tcgtttaaacctagagtttgagtaagccaaaagatgagaagcc-3’   43mer
7(第4正向)   5’-gagtttaaacgccgccaccatgatagaaacatacagccaaccttcc-3’ 46mer
表6
CD40LT的PCR条件
  序列   引物浓度   退火温度
  第1次PCR   第4正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatgatagaaacatacagccaaccttcc-3’   50pmole 55℃
  第3反向   5’-tcgtttaaacctagagtttgaggtaagccaaaagatgagaagcc-3’   50pmole
第2次PCR 第3正向   5’-gccaggatcaagaagctgatcggcgagaggctgctggaaatgcaaagaggtgatgaggatcctcaa-3’   20pmole 60℃
  第3反向   5’-tcgtttaaacctagagtttgagtaagccaaaagatgagaagcc-3’   20pmole
  第3次PCR   第1正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactga-3’   40pmole 60℃
  第1反向   5’-gtcgctgctggtagatgatgtgacaggcagcagaacaaggatcagtggaggaattccaaagatatatcta-3’   1pmole
  第2正向   5’-gtcacatcatctaccagcagcgacaggatgaagcagatcgaggacaagatcgaggagatcctgagcaag-3’   1pmole
  第2反向   5’-gccgatcagcttcttgatcctggcgatctcgttctcgatgtggtagatcttgctcaggatctcctcgatctt-3’   40pmole
第4次PCR 第1正向   5’-gagtttaaacgccgccaccatgttccatgtttcttttagatatatctttggaattcctccactga-3’   20pmole 60℃
第3反向   5’-tcgtttaaacctagagtttgagtaagccaaaagatgagaagcc-3’   20pmole
实施例6：通过使用携带编码表位的DNA的树突细胞分析T细胞的免疫应答
抗原呈递细胞(APC)在体内通过T细胞识别外来抗原中发挥重要作用。B细胞、巨噬细胞和树突细胞能够作为抗原呈递细胞起作用。具体地说，已知树突细胞作为最具代表性的专职抗原呈递细胞。在本发明中，在体外产生成熟的树突细胞。表位表达载体在E.coli中扩增，并且使用无内毒素试剂盒(Qiagene)纯化，为进一步实验其浓度调整至1μg/μl。
通过使用磁珠从感染病毒的患者血液中分离CD14阳性单核细胞。所分离的单核细胞以1×106个细胞/孔的浓度加载到6孔板。加入重组人IL-4(1000U/ml)和重组人GM-CSF(1000U/ml)，接着在37℃下培养8天。在第3天，50％的细胞培养液与细胞因子一起被更换。在第6天加入含细胞因子的单核细胞条件化的培养基，以诱导树突细胞的成熟。在第8天，收集一些细胞，并且在用于试验前确认成熟树突细胞的表型(CD14-，CD80+，CD86+，CD83+，CD1a+，Class Ihigh，Class IIhigh)。
通过分光光度计确定用于基因转染的表位表达载体被高度纯化，其中A260/A280的比率高于1.6。通过使用电穿孔仪(NucleofectorTM，amaxa)用4μg表达载体转染1×106个细胞，并且通过计数表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞计算产率，导致大于60％的产率，所述GFP与载体一起被引入细胞。
用上述表位表达载体转染的树突细胞与从同一患者中分离的PBMC按1∶10的比率混合，然后在37℃下培养。5天后，收集细胞并且通过ELISPOT试验测量其中的T细胞免疫(图4)。一旦以多肽的形式在细胞质中表达DNA，其通过TAP被切成单个表位肽。并且抗原呈递细胞识别每个表位肽。从而，呈递单个表位的靶细胞对于通过测量每个表位的免疫活性是非常有用的，即使在通过总DNA体外接种所得血液中。
实施例7：动物模型中辅因子的免疫增强
为了确认当辅因子与本发明的超型表位一起引入动物时细胞介导的免疫应答是否增加，在HLA-A2.1转基因小鼠中实施DNA免疫。在上述实施例5中构建的超型表位表达载体和辅因子表达载体以50∶50的比率、1μg/μl的浓度重新悬浮在磷酸盐缓冲液中。在8周时，将10μM/100μl心脏毒素(cardiotoxin)注射到小鼠的胫骨前肌以增加免疫。两天后，通过以50∶50的比率混合超型表位表达载体和辅因子表达载体的DNA混合物在相同区域处注射100μg。7天后，以相同量的DNA进行加强。在DNA加强14天后，从每个接种的小鼠中分离脾细胞，其以1×107个细胞/孔的浓度被放入12孔板中，然后在RPMI-10培养基中培养。加入10μg/ml的各种表位肽到各孔中。在培养的第3天，加入10ng/ml的重组小鼠IL-2(calbiochem，German)。在培养的第5天，收集所有细胞，并且以1×105个细胞/100μl浓度重新悬浮在RPMI-10培养基中，其被分配到每个包被抗小鼠IFN-γ抗体的96孔板的孔中。用3000rad照射来自A2.1转基因小鼠的小鼠脾细胞，然后用50μg/ml的每种超型表位在37℃下脉冲1小时。所得的细胞以3×105个细胞被分配到每个孔。如实施例3所述的相同方法实施ELISPOT试验。此时用于包被孔的抗体是大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(BDPharmingen，CA)，并且另外使用生物素化大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(BDPharmingen，CA)和链亲合素-HRPO(BD Pharmingen，CA)。
如图5所示，当表位DNA和辅因子一起注射时比单独注射表位DNA时，细胞介导免疫应答要大得多。具体来说，与CD40LT、IL-15、4-1BBL、和CD80等的共免疫导致免疫应答的极大增加。
总之，由SEQ.ID.No 1-No 16代表的本发明超型表位能够在不同患者分组中通过结合不同的MHC诱导免疫应答，并且也能够诱导以寡核苷酸形式提供的足够的免疫应答。由本发明超型表位诱导的免疫应答经证实足够有效地治疗HCV感染患者。
工业实用性
如本文前面所解释的，本发明涉及一种诱导细胞免疫应答的超型表位，并且来源于HCV多蛋白的保守区域，其中所述细胞免疫应答由HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导。本发明的超型表位能够有效地用于具有多态性HLA型的不同患者分组，因为它能通过结合不同的HLA分子诱导抗原特异性免疫应答。此外，编码所述表位的表达载体也能够诱导细胞介导的免疫应答。因此，本发明的超型表位及其编码的表达载体能够有效地用于开发治疗剂，其包括用于HCV感染和HCV相关肝脏疾病的疫苗。
序列表文本
SEQ.ID.No 1-No 16分别是L1、L2、L4、L6、L7、L8、L10、C1、C2、C3、C4、C5、C7、C8、C9、和C10的肽序列；
SEQ.ID.No 17-No 32分别是L1、L2、L4、L6、L7、L8、L10、C1、C2、C3、C4、C5、C7、C8、C9、和C10的DNA序列；
SEQ.ID.No 33-No 42是用于合成编码超型表位的寡核苷酸的引物序列；
SEQ.ID.No 43是超型表位的一种序列；
SEQ.ID.No 44-No 51是用于克隆辅因子的引物序列；
SEQ.ID.No 52-No 58是用于克隆CD40L三聚体的引物序列；
SEQ.ID.No 59-No 68是用于克隆CD40LT的引物序列。
本领域中的技术人员将理解，前面说明中公开的概念和具体实施方案可以被作为修改或者设计其他实施方案的基础，所述其他实施方案用于实施本发明的相同目的。本领域中的技术人员也将理解这种等价实施方案没有偏离本发明的精神和范围，正如附属权利要求所阐明的。
                              序列表
<110>财团法人牧岩生命工学研究所
<120>诱导抗HCV有效CTL应答的超型表位、其编码寡核苷酸及其应用
<160>68
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L1的肽序列
<400>1
Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu
  1               5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L2的肽序列
<400>2
Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu
  1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L4的肽序列
<400>3
Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu
  1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L6的肽序列
<400>4
Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val
  1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L7的肽序列
<400>5
 Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr Lys Leu
   1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L8的肽序列
<400>6
Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala Met
  1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L10的肽序列
<400>7
Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu
  1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C1的肽序列
<400>8
Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu
  1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C2的肽序列
<400>9
Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu
  1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C3的肽序列
<400>10
Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu
  1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C4的肽序列
<400>11
Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Phe
  1               5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C5的肽序列
<400>12
Thr Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu
  1               5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C7的肽序列
<400>13
Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Lys Leu
  1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C8的肽序列
<400>14
Met Ala Leu Met Lys Leu Ala Ala Leu
  1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C9的肽序列
<400>15
Ala Ala Ser Gys Gly Gly Ala Val Phe
  1               5
<210>16
<211>9
<212>RRT
<213>人工序列
<220>
<223>C10的肽序列
<400>16
Phe Val Gly Leu Ala Leu Leu Thr Leu
  1               5
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L1的DNA序列
<400>17
aacctgggca aggtgatcga caccctg                                        27
<210>18
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L2的DNA序列
<400>18
tacgtgggcg gcgtggagca caggctg                                        27
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L4的DNA序列
<400>19
tacgccgccc agggctacaa ggtgctg                                        27
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L6的DNA序列
<400>20
aaggtgagga tgtacgtggg cggcgtg                                        27
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L7的DNA序列
<400>21
gagctgatct tcgacatcac caagctg                                        27
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L8的DNA序列
<400>22
gccctgcccc ccagggccta cgccatg                                        27
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位L10的DNA序列
<400>23
ctgctgctgg ccatcctggg ccccctg                                        27
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C1的DNA序列
<400>24
accgccggcg ccaggctggt ggtgctg                                        27
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C2的DNA序列
<400>25
aagtgcgacg agctggccgc caagctg                                        27
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C3的DNA序列
<400>26
gcccagggct acaaggtgct ggtgctg                                        27
<210>27
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C4的DNA序列
<400>27
gccatcctgg gccccctgat ggtgttc                                        27
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C5的DNA序列
<400>28
accatcctgg gcatcggcac cgtgctg                                        27
<210>2g
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C7的DNA序列
<400>29
tacgtgcaga tggccctgat gaagctg                                        27
<210>30
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C8的DNA序列
<400>30
atggccctga tgaagctggc cgccctg                                        27
<210>31
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C9的DNA序列
<400>31
gccgcctcct gcggcggcgc cgtgttc                                        27
<210>32
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表位C10的DNA序列
<400>32
ttcgtgggcc tggccctgct gaccctg                                        27
<210>33
<211>62
<212>DNA
<213>引物
<400>33
gtttaaacgc cgccaccatg ggaatgcagg tgcagatcca gagcctgttt ctgctcctcc    60
tg                                                                   62
<210>34
<211>59
<212>DNA
<213>引物
<400>34
gggcaggaag gcggcctt tcctctggaccc gggcacccac aggaggagca gaaacaggc     59
<210>35
<211>77
<212>DNA
<213>引物
<400>35
gaaaggccgc cttcctgccc tccgacttct tccccagcgt gaaggcccag ggctacaagg    60
tgctggtgct gaagctg                                                   77
<210>36
<211>77
<212>DNA
<213>引物
<400>36
cagcttggcg gccagctcgt cgcacttggc gttcaggggg cccaggatgg ccagcagcag    60
cttcagcacc agcacct                                                   77
<210>37
<211>77
<212>DNA
<213>引物
<400>37
acgagctggc cgccaagctg aacatggccc tgatcaagct ggccgccctg aacttcgtgg    60
gcctggccct gctgacc                                                   77
<210>38
<211>80
<212>DNA
<213>引物
<400>38
caccttgtag ccctgggcgg cgtagttcat ggcgtaggcc ctggggggca gggccttcag    60
ggtcagcagg gccaggccca                                                80
<210>39
<211>77
<212>DNA
<213>引物
<400>3g
ccgcccaggg ctacaaggtg ctgaacgccg cctcctgcggc ggcgccgtgt tcaaggccg    60
cctacgtgca gatggcc                                                   77
<210>40
<211>77
<212>DNA
<213>引物
<400>40
cagggaggcc ttcagcacgg tgccgatgcc caggatggtg gccttcagct tcatcagggc    60
catctgcacg taggcgg                                                   77
<210>41
<211>89
<212>DNA
<213>引物
<400>41
accgtgctga aggcctccct gatggccttc accgccgccg tgaaggacct gatgggctac    60
atccccctgg tgacgcgttg agtttaaac                                      89
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>42
gtttaaactc aacgcgtcac cag                                            23
<210>43
<211>514
<212>DNA
<213>超型表位
<400>43
gtttaaacgc cgccaccatg ggaatgcagg tgcagatcca gagcctgttt ctgctcctcc     60
tgtgggtgcc cgggtccaga ggaaaggccg ccttcctgcc ctccgacttc ttccccagcg    120
tgaaggccca gggctacaag gtgctggtgc tgaagctgct gctggccatc ctgggccccc    180
tgaacgccaa gtgcgacgag ctggccgcca agctgaacat ggccctgatg aagctggccg    240
ccctgaactt cgtgggcctg gccctgctga ccctgaaggc cctgcccccc agggcctacg    300
ccatgaacta cgccgcccag ggctacaagg tgctgaacgc cgcctcctgc ggcggcgccg    360
tgttcaaggc cgcctacgtg cagatggccc tg8tgaagct gaaggccacc atcctgggca    420
tcggcaccgt gctgaaggcc tccctgatgg ccttcaccgc cgccgtgaag gacctgatgg    480
gctacatccc cctggtgacg cgttgagttt aaac                                514
<210>44
<211>46
<212>DNA
<213>FLT3L正向
<400>44
gagtttaaac gccgccacca tgacagtgct ggcgccagcc tggagc                   46
<210>45
<211>39
<212>DNA
<213>FLT3L反向
<400>45
tcgtttaaac ttacctgggc cgaggctctg ggagctccg                           39
<210>46
<211>47
<212>DNA
<213>4-1BBL正向
<400>46
gagtttaaac gccgccacca tggaccagca cacacttgat gtggagg                  47
<210>47
<211>38
<212>DNA
<213>4-1BBL反向
<400>47
tcgtttaaac tcattcccat gggttgtcgg gtttcaca                            38
<210>48
<211>50
<212>DNA
<213>IL-15正向
<400>48
gagtttaaac gccgccacca tgaaaatttt gaaaccatat atgaggaata               50
<210>49
<211>39
<212>DNA
<213>IL-15反向
<400>49
tcgtttaaac tcaggacgtg ttgatgaaca tttggacaa                           39
<210>50
<211>47
<212>DNA
<213>C080正向
<400>50
gagtttaaac gccgccacca tggcttgcaa ttgtcagttg atgcagg                  47
<210>51
<211>39
<212>DNA
<213>CD80反向
<400>51
tcgtttaaac ctaaaggaag acggtctgtt cagctaatg                           39
<210>52
<211>65
<212>DNA
<213>CD40引物
<400>52
gagtttaaac gccgccacca tgttccatgt ttcttttaga tatatctttg gaattcctcc    60
actga                                                                65
<210>53
<211>70
<212>DNA
<213>CD40引物
<400>53
gtcgctgctg gtagatgatg tgacaggcag cagaacaagg atcagtggag gaattccaaa    60
gatatatcta                                                           70
<210>54
<211>69
<212>DNA
<213>CD40引物
<400>54
gtcacatcat ctaccagcag cgacaggatg aagcagatcg aggacaagat cgaggagatc    60
ctgagcaag                                                            69
<210>55
<211>72
<212>DNA
<213>CD40引物
<400>55
gccgatcagc ttcttgatcc tggcgatctc gttctcgatg tggtagatct tgctcaggat    60
ctcctcgatc tt                                                        72
<210>56
<211>66
<212>DNA
<213>C040引物
<400>56
gccaggatca agaagctgat cggcgagagg ctgctggaaa tgcaaagagg tgatgaggat    60
cctcaa                                                               66
<210>57
<211>43
<212>DNA
<213>C040引物
<400>57
tcgtttaaac ctagagtttg agtaagccaa aagatgagaa gcc                      43
<210>58
<211>46
<212>DNA
<213>C040引物
<400>58
gagtttaaac gccgccacca tgatagaaac atacagccaa ccttcc                   46
<400>59
gagtttaaac gccgccacca tgatagaaac atacagccaa ccttcc                   46
<210>60
<211>43
<212>DNA
<213>C040LT引物
<400>60
tcgtttaaac ctagagtttg agtaagcca aaagatgagaa gcc                      43
<210>61
<211>66
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>61
gccaggatca agaagctgat cggcgagagg ctgctggaaa tgcaaagagg tgatgaggat    60
cctcaa                                                               66
<210>62
<211>43
<212>DNA
<213>C040LT引物
<400>62
tcgtttaaac ctagagtttg agtaagccaa aagatgagaa gcc                      43
<210>63
<211>65
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>63
gagtttaaac gccgccacca tgttccatgt ttcttttaga tatatctttg gaattcctcc    60
actga                                                                65
<210>64
<211>70
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>64
gtcgctgctg gtagatgatg tgacaggcag cagaacaagg atcagtggag gaattccaaa    60
gatatatcta                                                           70
<210>65
<211>69
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>65
gtcacatcat ctaccagcag cgacaggatg aagcagatcg aggacaagat cgaggagatc    60
ctgagcaag                                                            69
<210>66
<211>72
<212>DNA
<213>C040LT引物
<400>66
gccgatcagc ttcttgatcc tggcgatctc gttctcgatg tggtagatct tgctcaggat    60
ctcctcgatc tt                                                        72
<210>67
<211>65
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>67
gagtttaaac gccgccacca tgttccatgt ttcttttaga tatatctttg gaattcctcc    60
actga                                                                65
<210>68
<211>43
<212>DNA
<213>CD40LT引物
<400>68
tcgtttaaac ctagagtttg agtaagccaa aagatgagaa gcc                      43

Claims (16)

1.一种HCV超型表位，其通过与多种HLA-A和HLA-B超型反应而诱导细胞介导的免疫应答。
2.根据权利要求1的HCV超型表位，具有HCV多蛋白的保守序列。
3.根据权利要求2的HCV超型表位，其中所述保守序列具有选自由SEQ.ID.No 1-No 16所代表氨基酸序列的氨基酸序列。
4.一种疫苗组合物，其包含权利要求1的超型表位。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，其中所述组合物另外包括辅因子。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其中所述辅因子选自：CD40LT、4-1BBL、IL-15、FLT-3L、B7-1、B7-2和热休克蛋白。
7.一种预防和治疗丙型肝炎或与该病毒相关的肝脏疾病的方法，其包含施用权利要求1的超型表位的步骤。
8.一种寡核苷酸，其编码权利要求1的HCV超型表位。
9.根据权利要求8的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有选自由SEQ.ID.No 17-No 32所代表核苷酸序列的核苷酸序列。
10.一种疫苗组合物，其包含权利要求8的寡核苷酸。
11.一种预防和治疗丙型肝炎或与该病毒相关的肝脏疾病的方法，其包含施用权利要求8的寡核苷酸的步骤。
12.一种真核表达载体，其含有权利要求8的寡核苷酸。
13.根据权利要求12的真核表达载体，其中所述载体还包含编码辅因子的基因。
14.根据权利要求13的真核表达载体，其中所述辅因子选自：CD40LT、4-1BBL、IL-15、FLT-3L、B7-1、B7-2和热休克蛋白。
15.一种疫苗组合物，其包含权利要求12的表达载体。
16.一种预防和治疗丙型肝炎或与该病毒相关的肝脏疾病的方法，其包含施用权利要求12的表达载体的步骤。
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