JP2005192552A - 免疫調節能力の増加されたＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド変形体 - Google Patents

Abstract

【課題】脾臓細胞、大食細胞、末梢血液単核細胞などの免疫活性を向上させて、Ｂ型肝炎などの疾病に対する予防及び治療用ワクチン補助剤または抗癌剤として使用できる有用なＣＰＧ
ＯＤＮ変形体及びこの用途を提供する。
【解決手段】免疫調節機能を有するＣＰＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＯＤＮ）の３′末端にデオキシリボチミン（ｄＴ）の連続配列を結合させる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、免疫調節能力の増加されたＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド変形体に関するものであって、さらに詳細には、免疫調節能力を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＯＤＮ）の３′末端にデオキシリボチミン（ｄＴ）の連続配列を結合することにより、脾臓細胞、大食細胞、末梢血液単核細胞などの免疫活性を向上させて、Ｂ型肝炎などの疾病に対する予防及び治療用ワクチン補助剤または抗癌剤として有用に使用できる、ＣｐＧ
ＯＤＮ変形体及びこの用途に関するものである。

脊椎動物は、自分のＤＮＡ配列でＣｐＧジヌクレオチドの発現を抑制するか、発現されたＣｐＧジヌクレオチドのサイトシンをメチル化した（非特許文献１）。その反面、微生物のＤＮＡでは、ＣｐＧジヌクレオチドは正常的な比率で発現されてメチル化されていないため、脊椎動物ではこのような差異を利用し微生物の感染を認知することができる。
Ｋｒｉｅｇ, Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２００２, ２０, ７０９; ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ & Ｉｖａｒｉｅ, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１９８２, ２３, 78

このような微生物のＤＮＡは、形態認識収容体（ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の一つであるｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９（ＴＬＲ９）を経由してこれを発現する樹状細胞やＢ細胞で認識をすることになり、究極的に宿主の固有免疫体系（ｉｎｎａｔｅ
ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）を活性化させる。固有免疫体系は、微生物や寄生虫などの感染に対する重要な防衛機制を有しているだけではなく、癌細胞の除去できる機能も有しているため、ＣｐＧ
ＯＤＮを適切にデザインすることにより、免疫系の抗癌性を誘発できる抗癌性免疫補助剤を開発することができる。

ＣｐＧ ＯＤＮを利用した免疫体系の活性化に関する研究は、最近の数年間に集中的になされた。ＣｐＧ
ＯＤＮは、ＣｐＧジヌクレオチドを中心に５′末端と３′末端に少なくとも４個以上の塩基配列を有するが、この塩基配列によりＣｐＧ ＯＤＮの免疫活性の特徴が決定される。これを大きくＫ型ＯＤＮとＤ型ＯＤＮとに区分するが、Ｋ型ＯＤＮは、単核球とＢ細胞を刺激し増殖させるか、免疫グロブリンＭまたはＩＬ−６を分泌させる（非特許文献２）。Ｄ型ＯＤＮは、単核球を活性化して成熟した樹状細胞に分化させるか、ナチュラルキラー細胞を刺激しＩＬ−６を分泌させる（非特許文献３）（非特許文献４）。また、D型ODNは、Ｂ２２０^＋樹状細胞がＩＦＮ−αを生産するようにして、ＴＬＲ９^＋ Ｂ２２０^＋樹状細胞がＩＬ−１２を生産するようにする。このような結果から、ＣｐＧ
ＯＤＮが免疫細胞を刺激して免疫増進効果を奏する過程には、いくつかの経路が存在すると判断されている（非特許文献５）（非特許文献６）。
Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ., ２００２, ８９７−９０１ Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２００２, ３２, ２６１７−２２ Ｇｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｌｅｕｋｏｃ. Ｂｉｏｌ., ７１, ８１３−２０, ２００２。 Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３, １７０, ３０５９−３０６４; Ｋｅｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２００３, １７０, ４４６５−４４７４。

多くの研究チームが多様な形態のＣｐＧ ＯＤＮをデザインし免疫活性能力を試験した。これは主に、感染に対する免疫活性能力の活性化程度と抗癌免疫活性化程度に関するものである。ＣｐＧ
ＯＤＮを用いた抗癌免疫に関する研究は、細胞性免疫と体液性免疫とに区分できて、細胞性免疫は、次の二つの方法により行われている。

第１の方法は、樹状細胞の活性化を経由する免疫増進法である。癌細胞は、宿主の免疫監視体系を回避するために抗原提示能力を低める。そうすると、細胞毒性Ｔ細胞は、これが認知できなくなり癌細胞を除去することができない。これを克服するために、癌抗原の免疫原性の強い部分のペプチドを宿主に免疫させるが、この際、ＣｐＧ
ＯＤＮを免疫補助剤と共に使用する方法である。この方法を使用することにより、抗原提示能力の優れた樹状細胞は、癌抗原のペプチドを受け入れて、ＣｐＧ ＯＤＮにより活性化されることにより、細胞毒性Ｔ細胞を活性化させることができる。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は、効率的に癌細胞を除去することができる。この方法により、マウスからＲＭＡ（非特許文献７）を除去する結果が得られた。このような免疫反応では、ＩＦＮ−γなどが重要な作用をした。樹状細胞の活性化を経由する場合ではないが、ＯＤＮ ２００６がＢ細胞に直接作用し、Ｂ細胞の抗原提示機能と、Ｔ細胞との相互作用のできる補助刺激因子の発現とを増進させることにより、樹状細胞の作用と同様な原理で抗癌免疫を活性化させることもできる（非特許文献８）。
Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２, １６８, ６０９９−６１０５ Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ. Ｂｉｏｌ., ２００１, ６９, ８１−８８

第２の方法は、ナチュラルキラー細胞の活性化を経由する免疫増進法である。癌抗原を外部から注入することにより樹状細胞が活性化され細胞毒性Ｔ細胞を活性化させることができるが、細胞毒性Ｔ細胞が細胞毒性を示すためには、癌細胞の表面のＭＨＣ
ｃｌａｓｓ Ｉ 分子上に癌抗原の提示を必須とする。しかし、多くの場合、癌細胞の表面に癌抗原の提示の水準が、細胞毒性Ｔ細胞が細胞毒性を示すに十分な水準ではないため、樹状細胞の活性化による癌細胞除去方法は効率的ではない場合がある。この場合、細胞表面の癌抗原提示と無関係に細胞毒性を示すナチュラルキラー細胞の活性化は、この限界を克服できる方法となる。また、活性化されたナチュラルキラー細胞は、単核球または大食細胞を活性化させて、抗原非依存性抗免疫体系を活性化させる。この方法により、マウスで、ＯＤＮ １５８４はＢ１６.Ｆ１黒色腫を、ＯＤＮ １８２６はＥＬ４リンパ腫を軽減させた（非特許文献９）。また、マウスに、Ｃ２６大腸癌を誘発してＯＤＮ １８２６を癌部位に直接注射した時、癌組織を軽減させたが、この場合は、ナチュラルキラー細胞の作用と共に他の免疫作用も必要な場合である（非特許文献１０）。マウスから誘発された３８Ｃ１３
Ｂ細胞リンパ腫は、ＣｐＧ ＯＤＮを単独処理した時誘発される免疫反応によっては除去できないが、３８Ｃ１３リンパ腫細胞の特異抗原に対する単クローン抗体を共に処理する場合は、ナチュラルキラー細胞が抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を発揮し、３８Ｃ１３リンパ腫を除去することができる（非特許文献１１）。
Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２００１, １６７, ４８７８−４８８６ Ｈｅｃｋｅｌｓｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２００２, １６９, ３８９２−３８９９ Ｗｏｏｄｒｉｄｇｅ ａｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ， １９９７, ８９，２９９４−２９９８

体液性免疫は、抗原またはこれに相応する物質と共にＣｐＧ ＯＤＮを免疫増進剤として使用することにより誘導できる。Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂとｒｉｔｕｘｉｍａｂは、各々ＨＥＲ−２タンパク質を過発現する癌細胞と非ホキンスＢ細胞リンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｋｉｎｓ
Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）に対し効果を示す商品化された単一クローン抗体であるが、最近、ＣｐＧ ＯＤＮと組合した時抗癌性免疫反応を増進させるかに対する臨床研究が進行中であり、この結果は、数年後報告できると予想される（非特許文献１２）。
Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒら,Ｓｅｍ. Ｏｎｃｏｌ., ２００３, ３０, ４７６−４８２

ＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧジヌクレオチドを含む５′末端と３′末端の塩基配列によりその免疫活性能力を示すが、ＣｐＧ
ＯＤＮ自体は、生体に存在するＤＮＡ分子と構造上の差のない天然構造であるため、細胞毒性を示さない長所がある。しかし、天然構造であるため、生体内で分解されやすく、免疫活性能力の半減期が短い欠点がある。これを克服するために、一回投与量を増やす方法があるが、これは経済的に好ましい方法ではない。従って、ＣｐＧ
ＯＤＮを合成する時、ＤＮＡ分子の骨格であるフォスフォジエステル結合をフォスフォロチオエート結合に変形すると、ＣｐＧ ＯＤＮの免疫活性効果が１０〜１００倍増加する（非特許文献１３）。しかし、この方法は、天然構造ではないことから現れる細胞毒性、骨格変形により、本来のＣｐＧ
ＯＤＮの免疫活性能力の変化と免疫細胞の収容速度の変化を誘発する可能性があるため、全てのＣｐＧ ＯＤＮに適用できる方法であるかは、まだ確認されていない状態である。
Ｓｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., ２０００, １６５, ４１６５−４１７３

ＣｐＧ ＯＤＮは、種特異性があるため、実験動物を利用した研究で優れた免疫活性効果を奏したＣｐＧ
ＯＤＮがヒトにおいても対等な効果を示したとの報告はまだない。また、ＣｐＧ ＯＤＮの作用機制はまだ知られていないため、免疫活性能力の優れたＣｐＧ ＯＤＮの開発に多くの困難がある。従って、まだ臨床実験段階まで至ったＣｐＧ
ＯＤＮはなくて、既存のＣｐＧ ＯＤＮより免疫刺激能力が優秀であるか、相対的に副作用のないＣｐＧ ＯＤＮの開発が必要である。

本発明者らは、前記のような点を勘案し鋭意研究した結果、免疫調節能力を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＯＤＮ）の３′末端にデオキシリボチミン（ｄＴ）の連続配列を結合させることにより、脾臓細胞、大食細胞、末梢血液単核細胞などの免疫活性を向上させて、Ｂ型肝炎などの疾病に対する予防及び治療用のワクチン補助剤または抗癌剤として使用できる有用なＣｐＧ
ＯＤＮ変形体を開発し、本発明を完成した。

従って、本発明は、免疫調節機能を有するＣｐＧ ＯＤＮ変形体を提供することにその目的がある。

また、本発明の他の目的は、前記ＣｐＧ ＯＤＮ変形体を有効成分として含有するワクチン補助剤または抗癌剤を提供することにある。

本発明は、免疫活性を示し、ＣｐＧモチーフを有するフォスフォジエステルオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）において、ＯＤＮの３′末端にデオキシリボチミン（ｄＴ）の連続配列が結合されたＯＤＮ変形体をその特徴とする。

また、本発明は、前記ｄＴの連続配列が結合されたＣｐＧ ＯＤＮをワクチン補助剤または抗癌剤として使用する用途を提供する

以下、このような本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、免疫調節能力を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＯＤＮ）の３′末端にデオキシリボチミン（ｄＴ）の連続配列を結合させることにより、脾臓細胞、大食細胞、末梢血液単核細胞などの免疫活性を向上させて、Ｂ型肝炎などの疾病に対する予防及び治療用のワクチン補助剤または抗癌剤として使用できる有用なＣｐＧ
ＯＤＮ変形体及びこの用途に関するものである。

本明細書で用語「ＯＤＮ」は、免疫反応を活性化することのできる１１〜２６ヌクレオチド長さのオリゴデオキシヌクレオチドを意味し、特に、用語「ＣｐＧ
ＯＤＮ」は、免疫調節機能を示すＣｐＧモチーフ（５′−ｐｕｒｉｎｅ ｐｕｒｉｎｅ ＣｐＧ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−３′)を有するオリゴデオキシヌクレオチドを意味する。用語「ｄＴの連続配列」は、デオキシリボチミンが少なくとも4個以上連続的にフォスフォジエステル結合によりＣｐＧ
ＯＤＮに連結された形態を意味する。

本発明で使用したＣｐＧ ＯＤＮは、ＭｅｔａＢｉｏｎ社（ドイツ）に依頼して合成したが、塩基間の全てのフォスフォジエステル結合は、フォスフォロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合により代替された。高性能液体クロマトグラフィーとＮＡＰ精製過程を経て純度を最大に維持した後、凍結乾燥された状態で供給を受けた。本発明で使用したＣｐＧ
ＯＤＮの塩基配列を次の表１に示す。

ＯＤＮの骨格は、天然のフォスフォジエステル結合をする場合、生体内の核酸分解酵素の攻撃を受けて分解されやすい。抗癌免疫活性能力を有するＣｐＧ
ＯＤＮが生体内で適切な免疫学的効果を奏するためには、その投与量を増やすか、核酸分解酵素の攻撃が避けられる構造を有していなければならない。本発明が提供するＣｐＧ
ＯＤＮは、骨格構造をフォスフォロチオエート結合にすることにより、核酸分解酵素の攻撃を避けて生体内での半減期を延長した。しかし、フォスフォロチオエート結合自体による非特異的免疫反応の誘発により、安全性に多くの問題を有している。これに対し、本発明者らがフォスフォロチオエート結合を有する５０μｇのＯＤＮをアルミニウムヒドロキシドで処理して、ＣＨＯ細胞由来の抗原
ｇＤＥ２ｔと共にマウスに注射してみた結果、注射部位から肉芽腫及び壊死などの異常所見が発見されず、その安定性を確認することができた。

本発明が提供するＣｐＧ ＯＤＮは、単核球を活性化してサイトカインを分泌し、究極的に抗癌免疫を活性化させる。抗癌免疫活性化ＣｐＧ
ＯＤＮ候補が、Ｕ−９３７、ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ−１などのリンパ腫細胞株を利用する一次スクリーニングによって選択された。細胞株は、実質的に本発明が提供しようとするＣｐＧ
ＯＤＮが目標とする一次細胞と異なる免疫反応を示す可能性があるため、これを確認するために、再びマウス脾臓細胞とマウス腹腔大食細胞をどのくらい活性化させるかを確認した。その結果、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ
ｍＲＮＡ発現が他のＣｐＧ ＯＤＮに比べ最も多く増加して、大食細胞表面のＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩとＢ７．２タンパク質の発現が増加する様相を示した。これにより、最終的にマウスの脾臓細胞とヒトの末梢血液単核球に含まれているナチュラルキラー細胞の活性から、抗癌免疫活性化能力が優秀であることを確認することができた。

従って、本発明により製造されたＣｐＧ ＯＤＮは、ワクチン補助剤として有用に使用でき、特にＢ型肝炎などの疾病に対する予防及び治療用ワクチン補助剤として利用できる。この際、免疫反応を誘導しようとする抗原と前記ＯＤＮは、ｋｇ当たり５０〜５，０００μｇの量を２〜４週の間隔で２〜３回投与することが好ましい。また、抗原に対するＯＤＮの比率は、５：１〜４：１であることが好ましい。抗原は、ヒトに使用できるワクチン補助剤であるアルミニウムヒドロキシドと共に、または単独で免疫できて、筋肉注射または皮下注射の方法により投与できる。

以上説明したように、本発明によるｄＴの連続配列が３′末端に結合された変形されたフォスフォジエステルＣｐＧ
ＯＤＮは、高いＴｈ−１免疫反応誘導活性を示すと共に、生体内で毒性を示さないた安定性に優れており、効果的なワクチン補助剤として使用することができる。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ｄＴの連続配列が３′末端に結合されたＣｐＧ ＯＤＮの製造
本発明で使用したＣｐＧ ＯＤＮは、ＭｅｔａＢｉｏｎ社（ドイツ）に依頼して合成したが、塩基間の全てのフォスフォジエステル結合は、フォスフォロチオエート結合により置換された。高性能液体クロマトグラフィーとＮＡＰ精製過程を経て純度を最大に維持した後、凍結乾燥された状態で供給を受けた。本発明で使用したＣｐＧ
ＯＤＮの塩基配列は、前記表１に示した。

実施例２：ＣｐＧ ＯＤＮがマウス脾臓細胞と大食細胞の増殖に及ぼす影響
本実験は、細胞株を利用した免疫活性化実験を通じて抗癌免疫活性化能力があると期待されるＣｐＧ
ＯＤＮと、既に免疫活性能力が報告されているＣｐＧ ＯＤＮとを、各々マウスの脾臓細胞と腹腔大食細胞に処理した時、これら細胞の増殖を誘発するかどうかを確認するために、次のように実験した。

Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に１．５ｍｌの３％チオグリコレートを注射した。三日後、マウス腹腔を２％牛胎児血清の含まれたリン酸塩緩衝液で洗滌して集めた。ＨＢＳＳ緩衝液で２回洗滌した後、１０%の牛胎児血清の含まれたＤＭＥＭ培地にマウス腹腔大食細胞を用意した。

Ｂａｌｂ／ｃマウスから脾臓を摘出して単細胞単位に解体した後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層液を捨てて沈殿物に０．８４%アンモニウムクロライドを加えて赤血球を溶解させた後、ＲＰＭＩ １６４０で２回洗滌して脾臓細胞を用意した。

用意した脾臓細胞と大食細胞から５×１０^４ 個の細胞を取って、ＫＳＫ−１、ＫＳＫ−２、ＫＳＫ−７、ＫＳＫ−１２及びＫＳＫ−１３を各々０．６μｇ／ｍｌずつ、そしてＬＰＳを０．１μｇ／ｍｌずつ２４、４８、７２時間処理した後、これを再び[³H]チミジンが存在するＲＰＭＩ １６４０培地に６時間培養した。活性化された脾臓細胞は、増殖を通して［^３Ｈ］チミジンを培地から得た。培地を捨てて脾臓細胞を［^３Ｈ］チミジンのない培地で洗滌した後、放射能測定器を利用し、脾臓細胞によって得た［^３Ｈ］チミジンの量を測定した。

図１の（Ａ）では、大食細胞の増殖を誘導するためにＣｐＧ ＯＤＮを７２時間処理しなければならなかった。この中でＫＳＫ−１３は、マウスの免疫活性を最もよく誘導すると知られているＫＳＫ−２を含む他のＣｐＧ
ＯＤＮに比べ、高い増殖誘導能力を示し、対照群（非処理群）や非ＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１に比べ、統計的に有意な増殖誘導能力を示した。

また、図１の（Ｂ）に示すように、マウス脾臓細胞に対する増殖誘導効果は、大食細胞に対する他のＣｐＧ
ＯＤＮの効果に比べ、目立つ結果を示した。脾臓細胞の増殖を誘導するためには、ＣｐＧ ＯＤＮを４８時間処理しなければならなかった。７２時間 ＣｐＧ ＯＤＮを処理した時は、増殖の程度が減少した。ＫＳＫ−１３の脾臓細胞増殖誘導能力は、マウスに効果的なＫＳＫ−２に比べ、平均値は多少低かったが、統計的に有意な差ではなかった。

実施例３：ＣｐＧ ＯＤＮがマウス腹腔大食細胞のＴｈ１型サイトカインｍＲＮＡ発現に及ぼす効果
本実施例では、マウス腹腔大食細胞の増殖を誘導することが確認されたＫＳＫ−１３が、これら細胞で抗癌免疫に係わるサイトカインの分泌をどのくらい誘導するかを調べるために、次のような実験を行った。

マウスの腹腔大食細胞は、前記実施例２と同様な方法により用意した。１×１０^６ 個の大食細胞を０．６μｇ／ｍｌ
ＣｐＧ ＯＤＮで１２時間処理した。処理された細胞からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）を使用しトータルＲＮＡを分離して、吸光度を測定しトータルＲＮＡの濃度を決定した。この中で１μｇを鋳型ＲＮＡとして、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社、アメリカ）を使用しｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、次の表２のＰＣＲ条件によりＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２そしてＩＦＮ−γＰＣＲを行った。

ＰＣＲ産物を１%アガロースゲル電気泳動を行って、各条件の反応で各々のサイトカインｍＲＮＡの発現を比較した。

構造的発現タンパク質（ｃｏｎｓｔｉｔｕｉｔｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるβ-アクチンＰＣＲを行った時、全ての場合において一定な量のＰＣＲ産物が増幅されることを確認して、本実施例で表れる各サイトカインＰＣＲ産物の濃さの差異は、ｃＤＮＡ準備過程で生じる差異ではないことを確認した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスの免疫細胞をよく活性化させるＫＳＫ−２と、ＫＳＫ−１３とは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２
ｍＲＮＡの発現を増加させた（図２）。このような差異は、ｉｎ ｖｉｖｏでさらに大きいが、これは、ＫＳＫ−１３が生体内条件でさらにその効果を発揮するとの証拠となる（図３）。

実施例４：ＣｐＧ ＯＤＮがマウス脾臓細胞のＴｈ１型サイトカインｍＲＮＡ発現に及ぼす効果
本実施例では、マウス脾臓細胞の増殖を誘導することが確認されたＫＳＫ−１３が、これら細胞で抗癌免疫に係わるサイトカインの分泌をどのくらい誘導するかを調べるために、次のような実験を行った。

マウスの脾臓細胞は、前記実施例２と同様な方法により用意した。１×１０⁶個の脾臓細胞を０．６μｇ／ｍｌ ＣｐＧ ＯＤＮで１２時間処理した。処理された細胞からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、アメリカ）を使用しトータルＲＮＡを分離して、吸光度を測定しトータルＲＮＡノ濃度を決定した。この中の１μｇを鋳型ＲＮＡとして、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社、アメリカ）を使用しｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、上記表２のＰＣＲ条件によりＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２そしてＩＦＮ−γＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１%アガロースゲル電気泳動に付して、各条件の反応で各々のサイトカインｍＲＮＡの発現を比較した。

構造的発現タンパク質であるβ-アクチンＰＣＲを行った時、全ての場合において一定な量のＰＣＲ産物が増幅されることを確認して、本実施例で表れる各サイトカインＰＣＲ産物の濃さの差異は、ｃＤＮＡ準備過程で生じる差異ではないことを確認した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスの免疫細胞をよく活性化させるＫＳＫ−２と、ＫＳＫ−１３とは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｍＲＮＡの発現を増加させた(図４)。このような差異は、ｉｎ ｖｉｖｏでさらに大きいが、これは、ＫＳＫ−１３が生体条件でさらにその効果を発揮するとの証拠となる（図５）。

実施例５：ＣｐＧ ＯＤＮがマウス腹腔大食細胞の信号伝達分子の発現に及ぼす効果
本実施例では、試験管内でマウス腹腔大食細胞を活性化させることが確認されたＫＳＫ−１３が、生体内でも腹腔大食細胞を活性化させるかを確認するために、次のような実験を行った。

ＣｐＧ ＯＤＮを３%チオグリコレートと共にＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。４８時間後、前記実施例２と同様な方法により腹腔大食細胞を分離した。細胞をＦＩＴＣが標識された抗Ｂ７．２単クローン抗体または抗ＭＨＣ
ｃｌａｓｓ ＩＩ単クローン抗体で標識して、細胞分析機により分析した。図６及び７で、対照群は非処理群を示し、ＫＳＫ−１、ＫＳＫ−２、ＫＳＫ−７、ＫＳＫ−１２、ＫＳＫ−１３は各々０．６μｇ／ｍｌを処理したことを示し、ＬＰＳは、０．１μｇ／ｍｌを処理したことを示す。

Ｂ７．２分子は、大食細胞が活性化される時発現量が増加する補助刺激分子である。非処理群の場合、腹腔大食細胞のＢ７．２分子の発現は、基準範囲内で２．８%を示したが、本発明で提示するＫＳＫ−１３は、１４．２%を示した。この数値は、典型的なマウスＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−２の１６．３%や、ヒトＣｐＧ
ＯＤＮであるＫＳＫ−１２の１７．３%に近接した活性化比率であり、非ＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１の５．１%とは確実な差のある数値である（図６）。

ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、大食細胞が抗原提示をするとき核心的な役割をする分子であり、Ｂ７．２分子と共に大食細胞が活性化されると発現量が増加した。非処理群の場合、腹腔大食細胞のＭＨＣ
ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の発現は、基準範囲内で２６．５%を示したが、本発明の提示するＫＳＫ−１３は、３３．７%を示した。この数値は、典型的なマウスＣｐＧ
ＯＤＮであるＫＳＫ−２の３５．８%や、ヒトＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１２の３０．２%に類似した活性化比率であり、非ＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１の２５．０%とは確実な差のある数値である（図７）。

この実験結果から、ＫＳＫ−１３は、マウス生体内で腹腔大食細胞を活性化するということが確認できた。ＭＨＣ
ｃｌａｓｓ ＩＩ分子とＢ７．２分子の発現増加は、腹腔大食細胞が抗原提示能力を活性化させたということを意味するため、ＫＳＫ−１３の免疫増強剤としての効力を立証する結果である。

実施例６：マウス脾臓細胞の信号伝達分子の発現に及ぼすＣｐＧ ＯＤＮの効果
本実施例では、試験管内でマウス脾臓細胞を活性化させることが確認されたＫＳＫ−１３が、生体内で脾臓細胞を活性化させるかを確認するために、次のような実験を行った。

ＣｐＧ ＯＤＮをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。４８時間後、前記実施例２と同様な方法により脾臓細胞を分離した。細胞をＦＩＴＣの標識された抗Ｂ７．２単クローン抗体または抗ＭＨＣ
ｃｌａｓｓ ＩＩ単クローン抗体で標識して、細胞分析器により分析した。

非処理群の場合、脾臓細胞のＢ７．２分子の発現は、基準範囲内で２．８%を示したが、本発明の提示するＫＳＫ−１３は、８．６%を示した。この数値は、典型的なマウスＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−２の１２．１３%よりは低い数値であるが、ヒトＣｐＧ
ＯＤＮであるＫＳＫ−１２の６．８５%よりは高い数値であって、非ＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１の３．３１%とは確実な差のある数値である（図８）。

また、非処理群の場合、脾臓細胞のＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の発現は、基準範囲内で１５．５%を示したが、本発明の提示するＫＳＫ−１３は、２２．８%を示した。この数値は、典型的なマウスＣｐＧ ＯＤＮであるKSK−２の２３．６%に近接した数値であり、ヒトＣｐＧ
ＯＤＮであるＫＳＫ−１２の１８．６%よりは高い活性化比率であって、非ＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１の１７．５%とは確実な差のある数値である（図９）。

この実験結果から、ＫＳＫ−１３はマウス生体内で脾臓細胞を活性化するということが確認できた。ＭＨＣ
ｃｌａｓｓ ＩＩ分子とＢ７．２分子の発現増加は、脾臓細胞中のＢ細胞などの抗原提示能力を活性化させたということを意味するため、ＫＳＫ−１３の免疫増強剤としての効力を立証する結果である。

実施例７：マウスにＢ型肝炎表面抗原を免疫させる時のＣｐＧ ＯＤＮの効果
本実施例では、マウス脾臓細胞と腹腔大食細胞を活性化させることが確認されたＫＳＫ−１３が、マウスにＢ型肝炎表面抗原を免疫させる時ワクチン補助剤としての効能を有するかを確認するために、次のような実験を行った。

１３個の実験群を構成して、各実験群当たり７匹のＢａｌｂ／ｃマウスを割り当てた。各実験群のマウスは、２．５μｇのＢ型肝炎表面抗原と次の表３に示したワクチン補助剤とを混合して下腹部に皮下注射した。一週間隔で２回、同じ方法で注射し、血液を採取した。採取した血液を使用し、間接酵素免疫測定法により抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体の閾値を測定して、次の表３に示した。

Ｂ型肝炎表面抗原のみを単独で免疫した場合、閾値が８００であったが、ＫＳＫ−１、ＫＳＫ−１２そしてＫＳＫ−１３をワクチン補助剤として使用した場合は、閾値が１２，８００であって、１６倍増加した。現在、臨床で使用しているａｌｕｍと共に使用した場合、ＫＳＫ−１３の効果は、ＫＳＫ−１２より４倍高くて、ＫＳＫ−２より６４倍高かった。ＫＳＫ−１３のワクチン補助剤としての効果は、ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）を使用した場合と同一な閾値を示した。この結果から、ＫＳＫ−１３はワクチン補助剤として効果的であることが分かる。

実施例８：マウス脾臓細胞の抗癌能力に及ぼすＣｐＧ ＯＤＮの効果
本実施例では、マウス脾臓細胞と腹腔大食細胞を活性化させることが確認されたＫＳＫ−１３が、脾臓細胞に含まれたナチュラルキラー細胞の癌細胞除去能力を活性化させるかを確認するために、次のような実験を行った

Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔にリン酸塩等張液（対照群）または１０μｇのＫＳＫ−２、ＫＳＫ−１２またはＫＳＫ−１３を注射してから１８時間後、マウスから脾臓を摘出して脾臓細胞を用意した。脾臓細胞を２時間培養容器で培養し吸着性細胞が培養容器に吸着されるようにした後、吸着されなかった細胞を新しい培養容器に移した。細胞をさらに１．０μｇ／ｍｌの同じ種類のＣｐＧ
ＯＤＮで２時間処理した後、５×１０³個の⁵¹Ｃｒ標識されたＹＡＣ−１細胞と共に図１０及び１１に示した比率で培養した。上層液を取ってガンマ計数器を使用し、溶出された⁵¹Ｃｒの量を測定した。

図１０は、マウスの脾臓細胞にあるナチュラルキラー細胞がＫＳＫ−１３を処理することにより細胞毒性が増進されて、ナチュラルキラー細胞に敏感なＹＡＣ−１細胞を溶解させる程度を示したものである。非吸着性脾臓細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＹＡＣ−１細胞（標的細胞、Ｔ）の細胞数の比を１００：１、５０：１、２５：１そして１２：１で混合して培養した。対照群の場合、標的細胞の数に対するエフェクター細胞の数を１２倍から１００倍まで増加させたが、目的細胞の溶解は有意に起こらなかった。反面、ＫＳＫ−１３の場合、エフェクター細胞の数の比率が増えるにつれて、標的細胞の溶解が約３．５%まで増加した。この数値は、典型的なマウスＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−２よりは低い数値であるが、ヒトＣｐＧ ＯＤＮであるＫＳＫ−１２よりは高い数値である。

図１１は、人間末梢血液単核細胞がＫＳＫ−１３を処理することにより細胞毒性が増進されて、ナチュラルキラー細胞に敏感なＫ５６２細胞を溶解させる程度を示したものである。ヒト末梢血液単核細胞は、次の方法により分離した。健康な志願者の血液をヘパリン処理された試験管に入れて、１，２００ｇで１０分間遠心分離した後、境界層部分を新しいチューブに回収した。同じ嵩の分離緩衝液（０．５%牛血清アルブミンと１ｍＭ ＥＤＴＡが含まれたリン酸緩衝食塩水）で希釈した。同じ嵩のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ社）を新しいチューブに入れて、その上に希釈された血液を慎重に載せた後、１，２００ｇで３０分間遠心分離した。境界層の末梢血液単核細胞を取って新しいチューブに入れて、分離緩衝液で再び懸濁し２１０ｇで５分間遠心分離して上層液を捨てた。この過程を３回繰り返した。

用意された末梢血液単核細胞（エフェクター細胞、Ｅ）とＫ５６２細胞（標的細胞、Ｔ）の細胞数の比を５０：１、２５：１そして１２：１で混合して培養した。対照群とＫＳＫ−１３の場合、２５：１の比率で混合して培養した時、ＫＳＫ−１３を処理した末梢血液単核細胞の中に含まれているナチュラルキラー細胞の細胞毒性は既に６５%に達したが、対照群の場合は約９%程度に過ぎなかった。混合比率を５０：１にしても２５：１の場合とあまり大きく変わらない理由は、２５：１の比率で既に十分な細胞毒性誘発効果を奏したからであると判断される。なお、図１０及び１１の結果から、ＫＳＫ−１３の免疫活性効率は、マウスだけではなく、ヒトにさらに効果的であることが分かる。

実施例９：抗癌効果確認
１）Ｂ１６黒色腫肺転移抑制効果
全てのＢ１６黒色腫細胞を熱で非活性化させた１０%の牛胎児血清の添加されたＲＰＭＩ
１６４０で培養した後、 ２×１０⁵ 黒色腫細胞（０．２ｍｌＰＢＳ）をマウスの側面尻尾静脈に注射した。Ｂ１６黒色腫細胞を転移させたマウス（無菌状態の生後７〜８週の雌マウスＣ５７ＢＬ／６）を治療するために、治療用ＣｐＧオリゴ核酸を各マウスに１０μgずつ腹腔内（Ｉ.Ｐ.）投与した（投与日：１、３、５、７、９日）（図１２）。

２）癌細胞の微小転移抑制効果によるマウスの生存延長
各群当たり６匹ずつのＣ５７ＢＬ／６マウスにＥＬ４（Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ, ２ｘ１０⁴）細胞を静脈注射し癌細胞を接種して、１、３、５、７、９日目、ＣｐＧ ＯＤＮ （１０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を腹腔注射した後、生存率を比較測定した。ＫＳＫ−１３のＣｐＧ
ＯＤＮの場合、６匹のマウス全部の生存率が延長し、特に２匹は、６０日以後にも死亡せず生き続けられた。

そして、ＫＳＫ−１３のＣｐＧ ＯＤＮのみを利用し、マウスの数を増やして再度確認してみた結果、生存率の有意な延長を確認した（図１３及び１４）。

３） ＣｐＧ ＯＤＮにより活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性能測定
ヒト末梢血液単核球細胞からネガティブセレクション（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により単核球を除いたＢ、Ｔ、ＮＫ
細胞のみを使用して、マウスの脾臓細胞からは、非吸着性（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）細胞のみを分離し、即ち、大食細胞を除いた細胞をエフェクター細胞として使用して、ＮＫ細胞に選択的に作用する、ヒト末梢血液単核球細胞ではK５２３腫瘍細胞を、マウスの脾臓細胞ではＹＡＣ−１を 標的細胞として使用し、ＮＫ 活性を^５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙにより測定して確認した（図１５）。

実施例１０:毒性試験
ＩＣＲマウス６匹に本発明のＫＳＫ−１３を０．５ｍｇずつ筋肉注射（大殿筋または三角筋）の方法により投与した。一匹のマウスには2週間隔で２回、他の一匹のマウスには２週間隔で２回投与した後、一ヶ月の間をおいてから再び２週間隔で３回の投与を実施した。

最初免疫化してから６ヶ月間、疾病の有無、体重、体温などの身体検査、血液細胞の異常（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、排泄物の異常（ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ）を観察したが、全て正常値を示した。

製造例１：ワクチン製造
注射用水にＢ型肝炎表面抗原１ｍｇ、本発明のｄＴの修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド１０ｍｇ、アルミニウムヒドロキシド１ｍｇ、チメロサール０．０１ｗ／ｖ%、緩衝剤として適量のリン酸二水素カリウムとリン酸水素ナトリウム、適量の塩化ナトリウム、そして酸度調整のために塩酸を適量加えて、ワクチンを製造した。

本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがＢａｌｂ／ｃマウス大食細胞（Ａ）と脾臓細胞（Ｂ）の増殖を誘導するかどうかをｉｎｖｉｔｒｏで確認したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがＢａｌｂ／ｃマウス腹腔大食細胞のＴｈ１型サイトカインｍＲＮＡ発現を誘導するどうかをｉｎｖｉｔｒｏで確認したものである。［M：マーカー；１：ＣｐＧ ＯＤＮ非処理群；２：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１処理；３：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−２処理；４：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−７処理；５：０．６μｇ／ｍｌ ＫＳＫ−１２処理；６：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１３処理；７：０．１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理］ 本発明によるＣＰＧ ＯＤＮがＢａｌｂ／ｃマウス腹腔大食細胞のＴｈ1型サイトカインｍＲＮＡ発現を誘導するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏで確認したものである。［M：マーカー；１：ＣｐＧ ＯＤＮ非処理群；２：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１処理；３：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−２処理；４：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−７処理；５：０．６μｇ／ｍｌ ＫＳＫ−１２処理；６：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１３処理；７：０．１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理］ 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがＢａｌｂ／ｃマウス脾臓細胞のＴｈ1型サイトカインｍＲＮＡ発現を誘導するかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで確認したものである。［M：マーカー；１：ＣｐＧ ＯＤＮ非処理群；２：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１処理；３：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−２処理；４：０．６μｇ／ｍｌ処理；５：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１２処理；６：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１３処理；７：０．１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理］ 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがＢａｌｂ／ｃマウス脾臓細胞のＴｈ1型サイトカインｍＲＮＡ発現を誘導するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏで確認したものである。［M：マーカー；１：ＣｐＧ ＯＤＮ非処理群；２：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１処理；３：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−２処理；４：０．６μｇ／ｍｌ処理；５：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１２処理；６：０．６μｇ／ｍｌＫＳＫ−１３処理；７：０．１μｇ／ｍｌＬＰＳ処理］ 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがマウス腹腔大食細胞の信号伝達分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるＢ７．２分子の発現を誘導するかどうかを確認したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがマウス腹腔大食細胞の信号伝達分子であるＭＨＣ ＣｌａｓｓＩの発現を誘導するかどうかを確認したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがマウス脾臓細胞の信号伝達分子であるＢ７．２分子の発現を誘導するかどうかを確認したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮがマウス脾臓細胞の信号伝達分子であるＭＨＣ ＣｌａｓｓＩの発現を誘導するかを確認したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮでマウスの脾臓細胞を処理することにより、その中に含まれているナチュラルキラー細胞の細胞毒性が増進され、ナチュラルキラー細胞に敏感なＹＡＣ−１細胞を溶解させる程度を示したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮでヒト末梢血液単核細胞を処理することにより、その中に含まれているナチュラルキラー細胞の細胞毒性が増進され、ナチュラルキラー細胞に敏感なＫ５６２細胞を溶解させる程度を示したものである。 本発明によるＣｐＧ ＯＤＮのＢ１６黒色腫肺転移抑制効果を示したものである。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスで様々なＣｐＧ ＯＤＮを利用して生存延長比較実験を行った結果を示したものである。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスで様々なＣｐＧ ＯＤＮを利用して生存延長比較実験を行った結果を示したものである。 本発明によるＧｐＧ ＯＤＮにより活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性能の測定結果を示したものである。

Claims (8)

1. 免疫活性を示し、ＣｐＧモチーフを有するフォスフォジエステルオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）において、ＯＤＮの３′末端にデオキシリボチミン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｔｈｉｍｉｎｅ、ｄＴ）の連続配列が結合されることを特徴とする、ｄＴの修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド。
2. 前記ｄＴの連続配列が４〜１５個のヌクレオチド長さを有する、請求項１記載のｄＴの修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド。
3. 前記ＯＤＮが脾臓細胞、大食細胞または末梢血液単核細胞の免疫活性を増進させる、請求項１記載のｄＴの修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド。
4. 前記ＯＤＮが配列番号５で表される塩基配列である、請求項１乃至３のいずれか１項記載のｄＴの修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド。
5. 請求項１に記載のｄＴの修飾されたオリゴヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とするワクチン補助剤。
6. 他の抗原と共に追加的に使用される、請求項５記載のワクチン補助剤。
7. 前記ワクチンがＢ型肝炎の予防または治療用のものである、請求項５または６記載のワクチン補助剤。
8. 請求項１に記載のｄＴの修飾されたオリゴヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする抗癌剤。