CN101684465B - 一种具有增强免疫功能的有机分子肽乳及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有增强免疫功能的有机分子肽乳及其制备方法，本发明通过构建CpG ODN-pUC质粒，在大肠杆菌中大量扩增含CpG ODN基因的质粒，提取并纯化质粒，然后将CpG ODN-pUC质粒皮下注射入有机农业系统的高产奶牛体内，激发了非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答，诱导其分泌各种细胞因子，通过对牛奶进行细胞因子的检测，发现奶牛的乳汁中也含有各种细胞因子，并且经过免疫后牛奶中各细胞因子的含量是普通牛奶中的2—10倍，最后把其乳汁收集包装生产成“有机分子肽乳”。饮用有机分子肽乳，就能够提高机体免疫力，抗肿瘤，预防疾病增强体质的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有增强免疫功能的有机分子肽乳及其制备方法。
背景技术
分子免疫佐剂是指本身就具有免疫刺激效应的DNA(即CpG DNA)和可在体内表达各种免疫相关分子的重组质粒DNA。这些免疫相关分子包括细胞因子、免疫共刺激分子、免疫刺激调节分子、及其新型分子佐剂补体C3d等。
CpG DNA，即含CpG基序的DNA或寡核苷酸(ODN)，统称为CpG ODN。目前研究表明，含CpG基序的细菌DNA和ODN可以激活多种免疫细胞，诱导其分泌不同的细胞因子及免疫球蛋白。在激发非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型(Th1及Th2型)等方面发挥重要作用。CpGODN能引起B细胞分化，直接刺激B细胞分泌IL-6、IL-10等细胞因子和免疫球蛋白，诱导B细胞表面共刺激分子的表达，包括MHC II、B7-1和B7-2等。CpGODN能直接激活抗原提呈细胞(APC)，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导其产生IL-12、TNF-α等Th1型为主的细胞因子，并可上调MHC和共刺激分子的表达。CpG ODN能与APC分泌的IL-12和IL-18协同刺激NK细胞分泌IFN-γ，提高其溶菌活性，IFN-γ反过来又可以激活APC。CpG ODN现已应用于诱导天然保护性免疫，预防感染，作为Th1极化佐剂、核酸疫苗以及基因治疗中。
细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物活性的异质性肽类调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。近年来人们发现多种细胞因子(如GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12)具有免疫佐剂作用，可不同程度的增强DNA疫苗的免疫效果，并可引导机体免疫朝有利的方向转化。共刺激分子和免疫刺激调节因子的质粒也能够加强机体的免疫应答。在天然免疫应答及获得性免疫应答过程中，细胞因子表现出重要的功能，可以维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生。
有机农业包括所有能促进环境、社会和经济良性发展的农业生产系统。这些系统将农地土壤肥力作为成功生产的关键。通过尊重植物、动物和景观的自然能力，达到使农业和环境各方面质量都最完善的目标。有机农业利用强有力的自然规律来增加农业产量和抗病能力。有机食品是以有机农业生产体系为前提，在其生产和加工过程中禁止使用农药、化肥、激素等人工合成物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有增强免疫功能的有机分子肽乳；本发明的另一目的在于提供一种有机分子肽乳的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明具有增强免疫功能的有机分子肽乳，通过接种CpG ODN-pUC质粒的免疫奶牛所产牛奶制得，其中构建CpG ODN-pUC质粒添加的CpG基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明有机分子肽乳的制备还包括如下步聚：
1、构建CpG ODN-pUC质粒：
采用pUC质粒，将CpG基因克隆到pUC载体，构建成重组CpG ODN-pUC质粒，CpG基因序列为：
5’GCGCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTGACGTTAGATCTCCGG3’，如SEQ ID NO：1所示；
2、在大肠杆菌中扩增CpG ODN：
将含有上述方法构建的CpG ODN-pUC质粒转化到非致病性大肠杆菌(E.coli)中，挑一个单菌落接种于含琼脂、氨苄青霉素的LB培养基中，其中每1000ml LB培养基中含有1ml氨苄青霉素和15-20g的琼脂，于37℃下培养24-36小时，至饱和状态；
3、用碱裂解法提取CpG ODN-pUC质粒，或采用商用质粒提取试剂盒提取；
4、用聚乙二醇沉淀法对提取的CpG ODN-pUC质粒进行纯化；
5、电泳检测CpG ODN-pUC质粒的分子量，大于pUC载体100bp，并采用紫外分光光度法测定CpG ODN-pUC质粒的含量，含有CpG ODN-pUC质粒不少于1毫克，于-20℃保存备用；
6、免疫接种奶牛：
选取有机农业系统喂养的奶牛，于分娩前一个月进行免疫注射；注射方法为：取保存备用CpG ODN-pUC质粒，对奶牛进行皮下注射，注射剂量为0.1-10.0mg/头，第14天加强一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
7、每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒测定细胞因子IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ，TNF-α的含量，牛奶内各细胞因子的含量是未免疫奶牛所产牛奶的2-10倍，若细胞因子含量达不到此水平，则再加强免疫接种一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
8、上述含有多种细胞因子的牛奶即为本发明有机分子肽乳；或者在有机分子肽乳中加入常规辅料制备成其他饮品。
本发明通过构建CpG ODN-pUC质粒，在大肠杆菌中大量扩增含CpG ODN基因的质粒，提取并纯化质粒，然后将CpG ODN-pUC质粒皮下注射入有机农业系统的高产奶牛体内，激发了非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答，诱导其分泌各种细胞因子，通过对牛奶进行细胞因子的检测，发现奶牛的乳汁中也含有各种细胞因子，最后把其乳汁收集包装生产成“有机分子肽乳”。饮用有机分子肽乳，就能够提高机体免疫力，抗肿瘤，预防疾病增强体质的功效。本发明的创新点在于采用CpG ODN等分子佐剂，对有机农业系统中的奶牛进行免疫接种，使其牛奶中含有多种对人体有益的细胞因子并制成有机分子肽乳制品用于人类的保健，同时，免疫奶牛能够自身提高免疫力，增加常规免疫疫苗的应答水平，进一步提高奶牛的抗病防病能力，具有重要的理论意义和应用前景。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1本发明所述CpG ODN质粒对奶牛细胞因子的影响。
用实施例1的方法免疫乳牛，收集乳牛分娩后15天的牛乳5-10ml(每24小时收集一次)，将收集到的乳样于4℃5000rpm离心15min，除去脂肪及沉淀，于水浴锅中升温至35℃，添加0.02％的凝乳酶(酶效价为50,000)，35℃保温凝乳40min，凝乳后于5000rpm4℃离心20min，收集乳清并分装，-20℃保存备用。
采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒，测定采集牛奶IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ等含量，掌握免疫后细胞因子分泌的规律。
试验结果如表1，每头含CpG ODN质粒1mg和每头含CpG ODN质粒2mg的注射奶牛，均可显著提高奶牛血清、牛奶中细胞因子含量。
表1 CpG ODN质粒对牛奶中细胞因子含量的影响
结果表明，本发明所述的注射了CpG ODN质粒的奶牛产出的牛奶与普通牛奶相比，其中IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ等细胞因子的含量均有明显增长。
实验例2 本发明实施例1方法制得的肽奶的功能鉴定实验
将本发明实施例1所述的免疫牛分泌的牛奶经138℃超高温灭菌处理2s；取SPF级昆明小鼠90只，4～6周龄，雌雄各半，随机分为3组，每组30只；A组给予有机分子肽乳1.0ml/天灌胃；B组给予纯牛奶1.0ml/天灌胃，C组给予生理盐水1.0ml/天灌胃；连续灌胃15天后，调整初始细胞数约0.7×106/ml，以细胞计数法观察小鼠淋巴细胞转化试验；连续灌胃30天后，以MTT法观察小鼠淋细胞转化试验；连续灌胃90天后，以MTT法观察小鼠淋巴细胞转化试验，结果如表2。
表2 本发明肽乳对小鼠淋巴细胞增殖活力的影响
结果表明，灌胃15天时给予有机分子肽乳的A组小鼠与其他两组小鼠相比，淋巴细胞计数明显增多，灌胃30天和90天时给予有机分子肽乳的A组小鼠与其他两组小鼠相比，以MTT法观察小鼠淋巴细胞的OD值差异明显，由此可见，本发明有机分子肽乳对小鼠淋巴细胞的增值活力有显著增强的作用。
下述实施例均能实现本发明所述实验例的有益效果。
具体实施方式
实施例1：本发明有机分子肽乳的制备工艺
1、构建CpG ODN-pUC质粒：
采用pUC质粒，将CpG基因克隆到pUC载体，构建成重组CpG ODN-pUC质粒，CpG基因序列为：
5’GCGCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTGACGTTAGATCTCCGG3’，如SEQ ID NO：1所示；
2、在大肠杆菌中扩增CpG ODN：
将含有上述方法构建的CpG ODN-pUC质粒转化到非致病性大肠杆菌(E.coli)中，挑一个单菌落接种于含琼脂、氨苄青霉素的LB培养基中，其中每1000ml LB培养基中含有1ml氨苄青霉素和19g的琼脂，于37℃下培养35小时，至饱和状态；
3、用碱裂解法提取CpG ODN-pUC质粒；
4、用聚乙二醇沉淀法对提取的CpG ODN-pUC质粒进行纯化；
5、电泳检测CpG ODN-pUC质粒的分子量，大于pUC载体100bp，并采用紫外分光光度法测定CpG ODN-pUC质粒的含量，含有CpG ODN-pUC质粒不少于1毫克，于-20℃保存备用；
6、免疫接种奶牛：
选取有机农业系统喂养的奶牛，于分娩前一个月进行免疫注射；注射方法为：取保存备用CpG ODN-pUC质粒，对奶牛进行皮下注射，注射剂量为1.0-3.0mg/头，第14天加强一次，剂量为1.0-3.0mg/头；
7、每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒测定细胞因子IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ等含量，牛奶内各细胞因子的含量是未免疫奶牛所产牛奶的2-10倍，若细胞因子含量达不到此水平，则再加强免疫接种一次，剂量为1.0-3.0mg/头；
8、上述含有多种细胞因子的牛奶即为本发明有机分子肽乳。
实施例2：本发明有机分子肽乳的制备工艺
1、构建CpG ODN-pUC质粒：
采用pUC质粒，将CpG基因克隆到pUC载体，构建成重组CpG ODN-pUC质粒，CpG基因序列为：
5’GCGCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTGACGTTAGATCTCCGG3’，如SEQ ID NO：1所示；
2、在大肠杆菌中扩增CpG ODN：
将含有上述方法构建的CpG ODN-pUC质粒转化到非致病性大肠杆菌(E.coli)中，挑一个单菌落接种于含琼脂、氨苄青霉素的LB培养基中，其中每1000ml LB培养基中含有1ml氨苄青霉素和16g的琼脂，于37℃下培养25小时，至饱和状态；
3、采用商用质粒提取试剂盒提取CpG ODN-pUC质粒；
4、用聚乙二醇沉淀法对提取的CpG ODN-pUC质粒进行纯化；
5、电泳检测CpG ODN-pUC质粒的分子量，大于pUC载体100bp，并采用紫外分光光度法测定CpG ODN-pUC质粒的含量，含有CpG ODN-pUC质粒不少于1毫克，于-20℃保存备用；
6、免疫接种奶牛：
选取有机农业系统喂养的奶牛，于分娩前一个月进行免疫注射；注射方法为：取保存备用CpG ODN-pUC质粒，对奶牛进行皮下注射，注射剂量为6.0-9.0mg/头，第14天加强一次，剂量为6.0-9.0mg/头；
7、每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒测定细胞因子IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ等含量，牛奶内各细胞因子的含量是未免疫奶牛所产牛奶的2-10倍，若细胞因子含量达不到此水平，则再加强免疫接种一次，剂量为6.0-9.0mg/头；
8、在上述含有多种细胞因子的牛奶中加入常规辅料制备成其他饮品。
Claims (6)
1.一种含CpG基因序列的寡核苷酸CpG ODN，其中含有的CpG基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种具有增强免疫功能的有机分子肽乳，通过接种CpG ODN-pUC质粒的免疫奶牛所产牛奶制得，其特征在于构建CpG ODN-pUC质粒添加的Cp6基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求2所述的有机分子肽乳，其特征在于该肽乳由如下方法制成：
(1)构建CpG ODN-pUC质粒：
采用pUC质粒，将CpG基因克隆到pUC载体，构建成重组CpG ODN-pUC质粒，CpG基因序列为：
5’GCGCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3’，如SEQ ID NO：1所示；
(2)在大肠杆菌中扩增CpG ODN：
将含有上述方法构建的CpG ODN-pUC质粒转化到非致病性大肠杆菌(E.coli)中，挑一个单菌落接种于含琼脂、氨苄青霉素的LB培养基中，其中每1000ml LB培养基中含有1ml氨苄青霉素和15-20g的琼脂，于37℃下培养24-36小时，至饱和状态；
(3)用碱裂解法提取CpG ODN-pUC质粒，或采用商用质粒提取试剂盒提取；
(4)用聚乙二醇沉淀法对提取的CpG ODN-pUC质粒进行纯化；
(5)电泳检测CpG ODN-pUC质粒的分子量，大于pUC载体100bp，并采用紫外分光光度法测定CpG ODN-pUC质粒的含量，含有CpG ODN-pUC质粒不少于1毫克，于-20℃保存备用；
(6)免疫接种奶牛：
选取有机农业系统喂养的奶牛，于分娩前一个月进行免疫注射；注射方法为：取保存备用CpG ODN-pUC质粒，对奶牛进行皮下注射，注射剂量为0.1-10.0mg/头，第14天加强一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
(7)每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒测定细胞因子IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ，TNF-α的含量，牛奶内各细胞因子的含量是未免疫奶牛所产牛奶的2-10倍，若细胞因子含量达不到此水平，则再加强免疫接种一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
(8)上述含有多种细胞因子的牛奶即为有机分子肽乳。
4.如权利要求2或3所述的有机分子肽乳的制备方法，该有机分子肽乳是由免疫了CpG ODN-pUC质粒的奶牛所产牛奶制得，其特征在于该方法中免疫过程中构建CpG ODN-pUC质粒添加的CpG基因序列如SEQ ID NO：1所示。
5.如权利要求2或3所述的有机分子肽乳的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)构建CpG ODN-pUC质粒：
采用pUC质粒，将CpG基因克隆到pUC载体，构建成重组CpG ODN-pUC质粒，CpG基因序列为：
5’GCGCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3’，如SEQ ID NO：1所示；
(2)在大肠杆菌中扩增CpG ODN：
将含有上述方法构建的CpG ODN-pUC质粒转化到非致病性大肠杆菌(E.coli)中，挑一个单菌落接种于含琼脂、氨苄青霉素的LB培养基中，其中每1000ml LB培养基中含有1ml氨苄青霉素和15-20g的琼脂，于37℃下培养24-36小时，至饱和状态；
(3)用碱裂解法提取CpG ODN-pUC质粒，或采用商用质粒提取试剂盒提取；
(4)用聚乙二醇沉淀法对提取的CpG ODN-pUC质粒进行纯化；
(5)电泳检测CpG ODN-pUC质粒的分子量，大于pUC载体100bp，并采用紫外分光光度法测定CpG ODN-pUC质粒的含量，含有CpG ODN-pUC质粒不少于1毫克，于-20℃保存备用；
(6)免疫接种奶牛：
选取有机农业系统喂养的奶牛，于分娩前一个月进行免疫注射；注射方法为：取保存备用CpG ODN-pUC质粒，对奶牛进行皮下注射，注射剂量为0.1-10.0mg/头，第14天加强一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
(7)每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用检测细胞因子的商用酶联免疫试剂盒测定细胞因子IL-2，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ，TNF-α的含量，牛奶内各细胞因子的含量是未免疫奶牛所产牛奶的2-10倍，若细胞因子含量达不到此水平，则再加强免疫接种一次，剂量为0.1-10.0mg/头；
(8)上述含有多种细胞因子的牛奶即为有机分子肽乳。
6.如权利要求2或3所述的有机分子肽乳在制备具有增强免疫功能饮品中的应用。
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