JP2005510251A - サルコイドーシスの評価法と予後判定法 - Google Patents
サルコイドーシスの評価法と予後判定法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005510251A JP2005510251A JP2003547966A JP2003547966A JP2005510251A JP 2005510251 A JP2005510251 A JP 2005510251A JP 2003547966 A JP2003547966 A JP 2003547966A JP 2003547966 A JP2003547966 A JP 2003547966A JP 2005510251 A JP2005510251 A JP 2005510251A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sarcoidosis
- gene
- subject
- expression level
- value
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 title claims abstract description 219
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 218
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 263
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 216
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 140
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 137
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 83
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 83
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 117
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 61
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 36
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 35
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 claims description 34
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 29
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 18
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 claims description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 17
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 16
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 claims description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 12
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 claims description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 7
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 7
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 7
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 7
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 7
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 7
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 claims description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000002726 cyst fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 claims description 5
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 claims description 5
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 4
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 4
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 4
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 3
- 101150028299 CD69 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101710082744 T-cell receptor alpha chain C region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 108010092574 CD69 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 2
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 claims description 2
- 108010031154 Transcription Factor RelA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000047410 human NFKB1 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims 7
- 102000005228 Cyclic AMP Response Element Modulator Human genes 0.000 claims 2
- 108010056281 Cyclic AMP Response Element Modulator Proteins 0.000 claims 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 2
- 102000005747 Transcription Factor RelA Human genes 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 46
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 46
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 45
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 15
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 13
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000003491 array Methods 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 201000003651 pulmonary sarcoidosis Diseases 0.000 description 8
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 5
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 5
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 101000919269 Homo sapiens cAMP-responsive element modulator Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 102100029387 cAMP-responsive element modulator Human genes 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010001889 Alveolitis Diseases 0.000 description 2
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 2
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 2
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAOUXYZOSPAOH-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(diethylamino)ethoxy]furo[3,2-g]chromen-7-one;hydrochloride Chemical compound [Cl-].O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC=CC1=C2OCC[NH+](CC)CC DWAOUXYZOSPAOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101001069913 Bos taurus Growth-regulated protein homolog beta Proteins 0.000 description 1
- 206010006049 Bovine Tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100025074 C-C chemokine receptor-like 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010015226 Erythema nodosum Diseases 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010059024 Gastrointestinal toxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010046732 HLA-DR4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020094 Hilar lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101001055145 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001502974 Human gammaherpesvirus 8 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102000000510 Integrin alpha3 Human genes 0.000 description 1
- 108010041357 Integrin alpha3 Proteins 0.000 description 1
- 102100033010 Integrin beta-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100039065 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 206010025102 Lung infiltration Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000017943 Ninjurin Human genes 0.000 description 1
- 108050007017 Ninjurin Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241001655324 Propionibacteriales Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- 208000035286 Spontaneous Remission Diseases 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010043275 Teratogenicity Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010005246 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000005876 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 102100035100 Transcription factor p65 Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000013228 adenopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000011256 aggressive treatment Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010516 arginylation Effects 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000007435 diagnostic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007120 differential activation Effects 0.000 description 1
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002982 epithelioid histocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 231100000414 gastrointestinal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 231100000226 haematotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 108010021518 integrin beta5 Proteins 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000013123 lung function test Methods 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 210000001370 mediastinum Anatomy 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011328 necessary treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100000211 teratogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000004992 toluidines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明では、サルコイドーシス患者の診断情報および予後情報を提供するバイオマーカーとして使用し得る遺伝子およびその遺伝子の発現産物であるmRNAとポリペプチドを同定する。これらのバイオマーカーはサルコイドーシスの重篤度および進行度のモニター、および当該疾患の処置に有用な薬物の同定に使用することもできる。
Description
発明の背景
本発明はサルコイドーシスのモニター法、予後判定法および処置法に関する。より詳しくは、本発明はサルコイドーシスのタイプ、予後および処置の必要性を判定するための、遺伝子発現分析の使用または遺伝子発現産物の測定に関する。
本発明はサルコイドーシスのモニター法、予後判定法および処置法に関する。より詳しくは、本発明はサルコイドーシスのタイプ、予後および処置の必要性を判定するための、遺伝子発現分析の使用または遺伝子発現産物の測定に関する。
関連技術の記載
サルコイドーシスは原因不明の疾患である。該疾患は1種以上の臓器系において非乾酪化肉芽腫の存在することを特徴とする。最も共通する関連部位は、肺および縦隔と肺門域のリンパ節である。しかしながら、サルコイドーシスは全身性疾患であり、様々な臓器系または組織が原発性または随伴性の臨床的発症および発症率の起源であり得る。サルコイドーシスの臨床経過は非常に多様であり、緩和なまたは無症候でさえある自発消散性の疾患から、慢性進行性で臓器系不全に至る疾患にまで及び、症例の1〜5%が死に至る。参照:Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (pages 433-436)。
サルコイドーシスは原因不明の疾患である。該疾患は1種以上の臓器系において非乾酪化肉芽腫の存在することを特徴とする。最も共通する関連部位は、肺および縦隔と肺門域のリンパ節である。しかしながら、サルコイドーシスは全身性疾患であり、様々な臓器系または組織が原発性または随伴性の臨床的発症および発症率の起源であり得る。サルコイドーシスの臨床経過は非常に多様であり、緩和なまたは無症候でさえある自発消散性の疾患から、慢性進行性で臓器系不全に至る疾患にまで及び、症例の1〜5%が死に至る。参照:Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (pages 433-436)。
サルコイドーシスは北ヨーロッパ、北アメリカおよび日本で比較的よく起こる。米国の場合、サルコイドーシスは白人よりも黒人に頻度が高く、年齢調整年間発症数はそれぞれ100,000人につき10人および35.5人と報告されている。サルコイドーシス発症ピークの年齢は20歳代と30歳代にあり、男性よりも女性でやや罹患率が高い。
サルコイドーシスの原因は不明である。しかし、情報の実体は、免疫メカニズムが疾患の病因に重要であることを示唆しており、また仮説として、様々な外来因子が、感染性、非感染性を含め、可能のあるサルコイドーシスの原因であるとされている。これらの因子はミコバクテリア、真菌類、スピロヘータ、およびホウイップル病関連因子である。
サルコイドーシスの病原性には、TH1表現型のCD4リンパ球のオリゴクローナル拡張の始動が、IL−2およびIFN−γの産生と共に関与している。IL−2はさらなるCD4細胞の増殖を引き起こし、それがマクロファージを肉芽腫形成に取り込むサイトカインを生成する。
サルコイドーシスはその多様な臨床上の発現および様々な予測し得ない経過がとりわけ顕著である。この疾患は臓器系に影響を及ぼし、この疾患の臨床的提示と発達病歴は、一定の臓器系においてさえ、非常に多様である。呼吸器系は最も共通して影響を受けやすく、患者の約90%が胸部ラジオグラフ上、胸腔内の関りを示す。患者では胸腔外の疾患が発症している場合もしていない場合もあるが、いずれも無症状であるか、あるいは臨床像の顕著な構成部分となり得る。共通の影響を受ける肺以外の臓器系は、皮膚、眼、心臓、肝臓、および中枢神経系である。
サルコイドーシスの診断評価は臨床医に幾つかの問題を突きつける。診断は1ケ所以上の罹患臓器系または組織に明瞭な形の非乾酪化肉芽腫を見出すことにより確認し得るが、他の原因の肉芽腫、初期感染性疾患を排除するためにさらに適切な検討を行うことが必要である。診断ではしばしば胸部ラジオグラフを最初に実施する。さらに、コンピュータートモグラフィー(CT)または核磁気共鳴画像(MRI)が補助手段となり得る。肺または他の組織の組織生検は不定数のリンパ球の縁取りに囲まれた上皮様組織球からなる典型的な非乾酪化肉芽腫を示す。
胸部ラジオグラフは胸腔内サルコイドーシスの段階を判定するために使用される。一般的に使用される方法は肺門のアデノパシーと実質病、例えば、肺浸潤または線維症の有無にしたがって0〜4の病期を割り振ることである。したがって、胸腔内変化には5つのレントゲン像上の段階またはタイプがある(表1参照)。参照:Silzbach, L.E. (1967) Med. Clin. N. Am. 51:483; Hunninghake, G.W. (1999) サルコイドーシス、脈管炎および瀰漫性肺疾患;16:149-173 and Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L, Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (Pages 433-436)。
しかし、すでに検討したように非常に多様なサルコイドーシスの発達病歴を予言し得る簡単な試験法は存在しない。本疾患は自発的に解消するか、または持続性かつ慢性的であり、ステロイドまたは他の強力かつ毒性の高い免疫抑制剤による広範囲の処置を必要とする。この疾患が臨床的に余りに多様であるため、それが治療を始めるべきか、何時始めるべきかを決めることを非常に難しくしている。サルコイドーシス患者の3分の2は自然軽快するが、20%までが慢性的機能欠損となり、疾患の1〜5%が死に至る。一部患者において、臨床的表徴とラジオグラフの病期分類は一部予後の判定を可能とする。しかしながら、感度のよい予測法と疾患活性度のマーカーがなく、自然軽快の割合が高いことと相俟って、何時処置をし、どのくらいの期間とすべきか、また有意な数の患者の発症可能性を知ることは難しい。
サルコイドーシスの発症に至らしめる環境要因と遺伝子因子の確認には多くの関心が向けられている。肉芽腫形成が抵抗性の細胞内抗原、例えば、ミコバクテリアまたはベリリウムに対する身体の遺伝子応答であると思われる限りにおいて、抗原が原因の可能性もあると思われる。さらに、肺エフェクター細胞上のHLAクラスII分子の密度が増大することも示されている。参照:Spurzem, J.R., et al. 1989:サルコイドーシス患者の肺胞マクロファージにおけるHLAクラスII遺伝子の発現。Am. Rev. Respir. Dis. 140:89-94; Haslem, P.L. et al. 1990:サルコイドーシスにおける肺胞マクロファージ上でのHLA−DQ、DP、DRおよびトランスフェリンレセプターの増大およびアレルギー性肺胞炎と線維化肺胞炎との比較、Chest 97:651-661; およびT−細胞レセプター(TCR)は最新の抗原刺激の証拠を示す;参照:Du Bois, R.M. et al., 1992:サルコイドーシスの肺に蓄積するT−リンパ球はT−細胞抗原レセプターの最新の刺激の証拠をもつ;Am. Rev. Rev. Respir. Dis. 145:1205-1211。
多くの感染性および非感染性作用因子がサルコイドーシスの原因として提案されているが、その罹患患者からそれと一致するものは単離されていない。参照:Saboor, S.A., et al. 1992:サルコイドーシスおよび結核におけるポリメラーゼ連鎖反応によるミコバクテリアDNAの検出:Lancet 339:1012-1015;Almenoft, P.L. et al. 1996:サルコイドーシス患者の血液からの抗酸菌L型の増殖:Thorax 51:530-533; Di Alberti, L., et al. 1997:サルコイド組織におけるヒトヘルペスウイルス8変異体、Lancet 350: 1655-1661;Ishigi, I., et al. 1999:日本人サルコイドーシス患者のリンパ節におけるミコバクテリアおよびプロピオニバクテリアDNAの定量的PCR:Lancet 354:120-123。繰返しとなるが、HLA−クラスIIアレル(対立遺伝子)、とりわけHLA−DRアレルはサルコイドーシスに感染し易い遺伝子であると主張されている;参照:Kunikane, H., et al., 1987:サルコイドーシスの日本人患者におけるHLA−DR抗原の役割;Am. Rev. Respir. Dis. 135:688-691; Shousake, A., E. et al., 1987;HLA−DRとサルコイドーシスとの関連:Chest 92:488-490; Martinetti, M., C. et al. 1995:ヨーロッパ2カ国における臨床免疫遺伝学知見の共同調査;Am. J. Respir Crit Care. Med. 152:557-564; Berlin, M., A. et al. 1997:HLA−DRはスカンジナビアのサルコイドーシス患者における予後を予告する;Am. J. Respir Crit. Care Med. 156:1601-1605。これらの知見および家族事例の一群についての多くの報告はサルコイドーシス発症における遺伝的背景の重要な役割を強調している。参照:Headings, V.E., et al., 1976:7家族に多発して存在する家族性サルコイドーシス:遺伝性の可能なメカニズム;Ann. N.Y. Acad. Sci. 278:377-385; Harrington, D.W., et al., 1993:家族性サルコイドーシス;91家族の分析:Sarcoidosis 11:210-243;および人種間の広がりと表現型における差;参照:Luisetti, M., et al., 2000: サルコイドーシスの遺伝的側面;Eur. Respir. J. 16:768-780。
最近、サルコイドーシスの病因について理解には多くの進歩がなされている。マクロファージの蓄積、そしてとりわけCD4陽性Tリンパ球が疾患の活性部位に存在し、後に集塊して肉芽腫を形成する。参照:Hunninghake, G.W., and R.G. Crystal, 1981:疾患活性部位での過剰なヘルパーT−リンパ球活性により成立する疾病;N. Engl. J. Med. 305:429-434;Hunninghake, G.W., et al. 1981:間質性肺疾患患者の肺実質における炎症性および免疫エフェクター細胞の特性化;Am. Rev. Respir. Dis. 123:407-412。この細胞性拡張に寄与する現在判明しているメカニズムは:(1)MIP−1、MCP−1、ランテスおよびIL−8などの強力な走化性因子の影響下に血液からのCD4陽性Tリンパ球と単球の活性な移行;参照:J. Immunol. 151(5): 2852-2863; Car, B.D. et al. 1994;特発性肺線維症と肺サルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄液中のIL−8およびMCP−1の上昇;Am. J. Respir. Crit Care Med. 149:655-659; Girgis, R., et al. 1995:活性肺サルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン;Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152:71; Lida, K. et al. 1997:肺サルコイドーシス患者におけるT細胞サブセットとβケモカインの分析;Thorax 52:431-437; Kodoma, N., et al. 1998:非喫煙間質性肺疾患個体における気管支肺胞洗浄細胞によるランテスの発現;Am. J. Respir. Cell Col. Biol. 18:526-531; Ziegenhagen, M.W., et al. 1998:進行性間質性肺線維症およびサルコイドーシス患者の気管支肺胞洗浄細胞における炎症前サイトカインの発現増加;J. Invest. Med. 46:223-231; および(2)リンパ球の組織中増殖(IL−2介在);参照:Hunginghake, G.W et al. 1983:活性肺サルコイドーシスにおける肺T−細胞によるインターロイキン−2放出の役割;Am. Rev. Respir. Dis. 128:634-638; Pinkston, P. et al. 1983:活性肺サルコイドーシスにおける肺T−リンパ球によるインターロイキン−2の自発放出;N. Engl. J. Med. 308:793-800; Semenzato, G., et al. 1984 Clin. Exp. Immunol. 57:331-337; Muller-Quernheim, J. et al. 1989:肺サルコイドーシスにおける気管支肺胞洗浄リンパ球によるインターロイキン−2レセプター遺伝子発現;Am. Rev. Respir. Dis. 140:82-88。サルコイドーシスには疾患活性部位にインターロイキン2レセプターを保持する細胞(可能性としてマクロファージ)の証拠がある。参照:Agostini, C., et al. 1987:サルコイドーシスと過敏性間質性肺炎患者からの肺胞マクロファージ:モノクローナル抗体による特性化;J. Clin. Immunol. 7:64-70。
自己制限疾患における炎症と進行性疾患における慢性化と線維化の封じ込めに導く因子は未だ説明されていない。参照:Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (esp. pages 433-436)。
今日まで、サルコイドーシスの研究はPCRを利用する比較的少数の遺伝子の実験に限られていた。しかしながら、現在ではサルコイドーシスにおける抗原のプロセシング/提示および認識、T−リンパ球とエフェクター細胞の活性化、免疫調節と組織改造作用の重要な領域に光を当てる高処理能力アレイと確認技術を使用することが可能である。サルコイドーシスに対する家族集団についての多くの報告が遺伝的罹病性を強く支持している。参照:Headings, V.E., D. Weston, R.C. Young, and R.L. Hackney, 1976:7家族に多発する家族性サルコイドーシス:可能性のある遺伝メカニズム;Ann. N.Y. Acad. Sci. 278:377-385; Harrington, D.W., et al. 1993:家族性サルコイドーシス:91家族の分析:Sarcoidosis 11:210-243; および人種間の広がりと表現型における差; Luisetti, M., et al., 2000: サルコイドーシスの遺伝的側面;Eur. Respir. J. 16:768-780。
シューマン(Schuman)はMHC領域に隣接し、それに及ぶ7種の多型についてドイツの55家族から122人の罹患姉妹細胞を遺伝子型分類し、その全領域に有意な多点非要因のつながりを見出した。参照:Schuman, M., et al. 2000:家族性サルコイドーシスは主要組織適合性遺伝子複合体につながりがある;Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(3 pt 1):861-864。
本発明において、進行型サルコイドーシスとHLA−DRB1*1502遺伝子の発現とのつながりを新たに見出したことは、MHC複合体に関る他の研究に、またしたがって、サルコイドーシスにおける抗原提示、罹患性および疾患の結果に関る研究に重みを加える。近年、HLAクラスII分子は、サルコイドーシスの病因において鍵となる細胞であるCD−4陽性T−リンパ球の外来抗原提示と選択的活性化において重要な役割をもつという観点で最も注目を集めている。日本の研究では、HLA−DR5J(HLA−DRB1*11/12)は疾患の非自発性軽快と有意に関連性があった。参照:Shousake, A., et al., 1987:HLA−DRとサルコイドーシスとの関連性;Chest 92:488-490; Kunikane, H. et al., 1987:日本人サルコイドーシス患者におけるHLA−DRの役割;Am. Rev. Respir. Dis. 135:688-691。
イタリア−チェコの研究において、HLA−DR4(HLA−DRB1*04)はIII型ラジオグラフ病と有意に関連する。参照:Martinetti, M., et al., 1995:“サルコイドーシス・マップ”:ヨーロッパ2カ国における臨床的免疫遺伝学的知見の共同調査;Am. J. Respir Crit Care. Med. 152:557-564。興味深いことに、スカンジナビアでの研究では、HLA−DRB1*1501が、対照群と比較してサルコイド集団に有意に過剰な提示のない一方、慢性疾患とは有意に関連していた;慢性とはその疾患が2年以上活性であったと診断される場合と定義する(60%に対し対照対象で30%、p<0.001)。参照:Berlin, M., et al., 1997:HLA−DRはスカンジナビア人サルコイドーシス患者の予後を予言する;Am. J. Respir Crit. Care Med. 156:1601-1605。このグループはHLA−DRB1*1401との同様の関連性も記載している。
このHLA−DR分子の重要な役割についての可能なメカニズムは幾つか存在する。HLA−DRB1*1502は誇張されたT−細胞活性化と自己永続的炎症カスケードを刺激する非常に効率的な抗原提示分子であり得る。あるいは、HLA−DRB1*1502が不適切に抗原を提示し、結果として抗原不寛容となる無効な最初の免疫応答に導き得る、したがって疾患慢性となり得る。この後者の仮説は、抗原不寛容が慢性的免疫応答を維持するために必要であるために最も可能性が高いが、一方で高効率抗原提示は有効な免疫応答と抗原クリアランス/トレランスに導く可能性がある。
サルコイドーシスと関連する予後の不確定性は臨床医にとって深刻な問題であったが、その理由は唯一有効な既知の処置がまったく良好でないからである。これらの処置は、高投与量のコルチコステロイドまたは細胞毒性作用物質、例えば、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドなど、または他の免疫抑制療法である。これらの作用物質は有意な有害作用、例えば、血液学的および胃腸毒性、催奇形性および発癌性を有する。
したがって、わずかな処置で、あるいは処置なして自然軽快を示すサルコイドーシス患者と、該疾患のより重症の慢性型に進展する患者とを識別し得る方法が強く要望されている。後者のグループでは、関連する臓器へ拡大すること、重症化することを最小とするために、攻撃的な早期の処置が必要とされる。
発明の要約
本発明は、サルコイドーシス患者の末梢血単核細胞(PBMC)に発現される複数の遺伝子を同定することにより、該疾患の予測される重症度と慢性度を判定する現在利用可能な方法の欠陥を克服する。これら遺伝子の発現レベルを利用してサルコイドーシスの診断を確認するか、または予後を判定することが可能であり、したがって、サルコイドーシス患者の処置の必要性を判定することができる。これらの遺伝子に対応するmRNA転写物およびタンパク質は、例えば、疾患の予後および必要な処置の代替マーカーまたはインジケーターとしての用途を有する。
本発明は、サルコイドーシス患者の末梢血単核細胞(PBMC)に発現される複数の遺伝子を同定することにより、該疾患の予測される重症度と慢性度を判定する現在利用可能な方法の欠陥を克服する。これら遺伝子の発現レベルを利用してサルコイドーシスの診断を確認するか、または予後を判定することが可能であり、したがって、サルコイドーシス患者の処置の必要性を判定することができる。これらの遺伝子に対応するmRNA転写物およびタンパク質は、例えば、疾患の予後および必要な処置の代替マーカーまたはインジケーターとしての用途を有する。
したがって、本発明の一側面は、サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から生体サンプルを採取すること、当該サンプル中の遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、および該遺伝子HLA−DRB1*1502が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければI型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればII&III型サルコイドーシスであると同定することを特徴とする方法にある。
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から生体サンプルを採取すること、当該サンプル中の遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するポリペプチド産物の発現レベルを検出すること、および該遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するポリペプチド産物が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければI型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればII&III型サルコイドーシスであると同定することを特徴とする方法にある。
上記方法のいずれにおいても、生体サンプルとして、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、CSF、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択されるサンプルおよび多様な試薬類を使用することができる。
本発明のもう一つの側面は、患者のサルコイドーシスがI型であるかまたはII&III型であるかの判定に使用するテストキットであって、該生体サンプルとの接触に適した容器中に上記の試薬を含んでなるテストキットにある。
もう一つの側面において、本発明はサルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、表2、3、4または5に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、対象から1種以上の投与後サンプルを採取すること、投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、投与前サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルとを比較すること、およびそれに応じて作用物質の投与を調節することを特徴とする方法を提供する。
もう一つの側面において、本発明はサルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、表2または4に記載した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、対象から1種以上の投与後サンプルを採取すること、投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、投与前サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較すること、およびそれに応じて作用物質の投与を調節することを特徴とする方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスの処置に使用する作用物質の同定方法であって、サルコイドーシスの疑いのある対象から採取した生体サンプルを候補作用物質と接触させること、該サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、その場合の遺伝子が表2、3、4または5に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子であること、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較し、その場合に、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルに比例して、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが変化し、それがサルコイドーシスの処置に有用な作用物質を示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法にある。
さらに、本発明はサルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
本発明のもう一つの側面は、サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらなる態様において、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであることを特徴とする方法を提供する。
さらなる態様において、本発明はサルコイドーシスの処置方法であって、かかる処置の必要な対象に、表1、2、3または4に示した遺伝子の1種以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物を投与し、サルコイドーシスの少なくとも1つの症候を改善することを特徴とする方法を提供する。該化合物は、アンチセンス分子、二本鎖RNA、リボザイム、小型分子化合物、抗体または抗体フラグメントからなる群より選択し得る。
さらに、本発明はサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2または4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法を提供する。
本発明はまたサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2または4に示した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも1つの遺伝子のmRNAの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法を提供する。
さらなる側面において、本発明はサルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患した疑いのある患者の処置方法であって、該患者から採取した生体サンプル中の表2または表3に示した遺伝子から選択される1種以上の遺伝子の遺伝子発現に対応するmRNAの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること;このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること;およびその結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがII&III型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置することを特徴とする方法を提供する。
発明の詳細な記載
本発明はサルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子の対照群と比較しての同定、およびI型サルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子のII&III型サルコイドーシス患者と比較しての同定に関する。
本発明はサルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子の対照群と比較しての同定、およびI型サルコイドーシス患者において個別的に発現される遺伝子のII&III型サルコイドーシス患者と比較しての同定に関する。
本出願に開示された特定の遺伝子はすべて、特にHLA−DRB1*1502としての遺伝子および表2、3、4、および5の遺伝子は、本発明の意味する範囲内で、自然界に存在するその多型変異体を含む。表2、3、4、および5に具体的に開示した遺伝子は好適な態様の代表である。
本明細書にて使用する場合、“疾患の型”という用語は、サルコイドーシス患者との関連で使用するとき、これらの用語について下に定義するように、該疾患が“I型”と分類するかまたは“II&III型”と分類するかを意味するものとする。
本明細書にて使用する場合、“I型”サルコイドーシスとはサルコイドーシスの症候を示す患者の胸部ラジオグラフがシルズバッハ(Silzbach)の分類にしたがい0または1の病期とされた患者をいう;また、本明細書にて使用する場合、“II&III型”サルコイドーシスとはサルコイドーシスの症候を示す患者の胸部ラジオグラフがシルズバッハの分類にしたがいII、IIIまたはIVの病期とされた患者をいう。参照:Silzbach, L.E. (1967) Med. Clin. N. Am. 51:483;Hunninghake, G.W. (1999):サルコイドーシス、脈管炎および彌慢性肺疾患;16:149-173 and Cecil Textbook of Medicine, 21st Edition, Goldman L., Bennett, J.C. Editors, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2000 (esp. pages 433-436)。
表2および3に示した遺伝子、すなわち、ヒトMHCクラスII HLA−DR2−Dw12mRNA DQw1−ベータ(HLA−DRB1*1502)、ヒトNF−カッパ−B転写因子p65サブユニット(NFKB)、ヒトサイクリックAMP−応答要素モジュレーターmRNA(CREM)、ヒトCD69遺伝子(CD69)、ヒトT−細胞レセプターアルファ鎖C領域(TRA@)およびヒトインターロイキン10レセプターmRNA−(IL10RA)などの遺伝子の発現度合い間に、また病型、すなわち、I型またはII&III型の間に、したがって、サルコイドーシス患者の予後と処置の必要性の間に、統計的に有意な高い相関が見出された。
II&III型サルコイドーシスの患者はI型サルコイドーシス患者よりも予後が悪く、また非常に慢性疾患に進行し易い。さらに、I型サルコイドーシス患者では、通常、疾患が自己制限的であり、処置を必要としない。対して、II&III型病患者では、該疾患の有害な長期作用を最少化するために、免疫抑制剤での早期の介入を要求するのが適当である。
したがって、これら遺伝子の発現度とその発現産物のレベルは、サルコイドーシスの患者またはその危険のある患者の管理、予後予測および処置に使用することができる。これらの遺伝子を表2および3に具体的に示す。これら遺伝子の完全な配列は、表2および3に示したユニジーンクラスター(Unigene Cluster)発現番号とジェンバンク寄託番号により利用可能である。
ポリペプチドまたはmRNA発現の異常に低下または上昇したレベルの検出は、本発明疾患対象の罹病性の診断または判定にも使用することが可能である。mRNAの発現レベルを検出する方法は技術上周知である。発現の低下または上昇は、ポリヌクレオチド定量の技術的に既知の方法のいずれか、例えば、核酸増幅法、例えば、PCR、RT−PCR、実時間定量PCR、RNアーゼ、ノーザンブロット法および他のハイブリッド形成法などによりRNAレベルで測定し得る。
開示した遺伝子の1種以上から得られるmRNA転写物のレベルを検出する特に有用な方法は、オリゴヌクレオチドの定序配列に標識化mRNAをハイブリッド形成させることである。かかる方法では遺伝子発現のプロフィールまたはパターンを生成させるために、これら複数の遺伝子の転写レベルを同時に決定することを可能とする。対象から採取したサンプル由来の遺伝子発現プロフィールは、もう一つの態様において、未罹患対象から採取したサンプル由来の遺伝子発現プロフィールと比較することが可能であり、それによって対象がサルコイドーシスに罹患しているか、またはその危険状態にあるかを判定することができる。
したがって、本発明は異なるタイプのサルコイドーシス患者に別々に発現される複数の遺伝子を提供する。これら遺伝子のいずれか、少なくとも一つを選択し、該疾患のタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして利用することができる。ある有用な態様においては、これら複数の遺伝子を選択し、そのmRNA発現を同時にモニターして種々の局面で有用な発現プロフィールを提供することができる。特に好適な態様において、遺伝子HLA−DRB1*1502(ヒトMHCクラスII HLA−DR2−Dw12mRNA DQw1−ベータ;ジェンバンク寄託番号M16276)を測定し、サルコイドーシスのタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして使用することができる。もう一つの好適な態様において、遺伝子HLA−DRB1*1502のタンパク発現産物のレベルを、サルコイドーシス患者からの生体サンプルにて測定し、このレベルを該疾患のタイプと予後の判定に、バイオマーカーとして使用する。
さらに、正常対照と比較して、サルコイドーシス患者での遺伝子発現のレベル間には統計的に有意な相関が見出されている。すべてのタイプのサルコイドーシス患者で発現レベルの上昇する遺伝子を、対照と比較して、表4に示す。対照に比較してすべてのタイプのサルコイドーシス患者で発現レベルの低下する遺伝子を表5に示す。これら遺伝子の完全な配列は、表4および5に示したユニジーンクラスター(Unigene Cluster)発現番号とジェンバンク寄託番号により利用可能である。
したがって、もう一つの態様において、本発明は遺伝子の発現レベルが、特にサルコイドーシス患者で、正常個体におけるよりも有意に高いかまたは低い複数の遺伝子を提供する。これら遺伝子のいずれか、少なくとも一つを選択し、サルコイドーシスの診断バイオマーカーとして利用することができる。さらに、該疾患過程に関係するこれら遺伝子の発現の差を使用して、該疾患を処置し得る作用物質を同定することが可能であり、また該疾患の範囲または進行をモニターするために使用することができる。ある有用な態様においては、これら複数の遺伝子を選択し、そのmRNA発現(またはポリペプチド発現産物)を同時にモニターして種々の局面で有用な発現プロフィールを提供することができる。
本発明のさらなる態様において、遺伝子発現産物(タンパク質またはポリペプチド)はサルコイドーシスに罹患したまたはその疑いのある患者からの生体サンプルおよび正常対照者からのサンプル中でモニターすることができる。
本明細書にて使用する場合、“生体サンプル”という用語は組織、細胞もしくは生物学的液体のサンプルまたはその単離物であって、試験対象者から取り出せるもの、ならびに対象内の組織、細胞もしくは生物学的液体のサンプルまたはその単離物を意味する。これらは限定されるものではないが、あらゆる種類の生検サンプル、かかるサンプルの無細胞溶解物および体液、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、CSF、のう胞液、腹水、尿、糞便および胆汁などである。宿主由来のサンプル中のタンパク質、例えば、本発明のポリペプチドのレベルを決めるために使用し得るアッセイ技法は当業者周知である。かかるアッセイ法とは、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などである。
本明細書にて使用する場合、“類似の生体サンプル”という用語は一人の患者のサンプルであって、別の患者のサンプルと同じ全身起源または部位からのサンプルを意味する。例えば、両者のサンプルが同じ臓器または身体領域からの血液、血清、血漿または生検サンプルである。
この発現産物のレベルは遺伝子発現の程度を示すために使用することが可能であり、したがって、サルコイドーシスの予後を判定するための、または対象の疾患のタイプと応答性および免疫抑制処置の必要性を判定するための簡単かつ簡便な試験法を提供する。さらに、これら発現産物のレベルは当該疾患の処置に有効たり得る薬物の同定に使用可能であり、また個々の患者の疾患の重症度または進行度をモニターするためにも使用し得る。
さらに、これら遺伝子の一つまたは複数の発現プロフィールは、サルコイドーシスの経過と予後における多様性を分子レベルで試験するための価値ある分子的手段、またサルコイドーシスを処置する薬物の有効性を評価するための分子的手段を提供する。細胞を種々変化させた条件にさらすこと、例えば、薬物または他の活性分子と接触させることの間に、発現プロフィールがベースラインのプロフィールからどのくらい変化するかは、このような効果の指標として使用することができる。
したがって、本発明は異なる臨床型のサルコイドーシスにおいて、また正常対照者と比較した該疾患患者において別々に発現する遺伝子の同定法を提供する。これら遺伝子の差別的発現手段によって、これらの遺伝子および/またはその発現産物を利用して、診断の確度を上げること、該疾患の重症度または進行度をモニターすること、または特定患者の予後を判定すること、またその患者が免疫抑制療法もしくは他の療法を必要としているかどうかを判定すること、およびサルコイドーシスに対する有用な新規処置法を同定することが可能である。これらの遺伝子を表2、3、4、および5に掲載する。開示した遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現に対応するmRNAまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質を測定することにより検出することができる。該ポリペプチドは何らかの生体サンプル、例えば、生検標本において、または簡便な体液、例えば、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、CSF、のう胞液、腹水、尿、糞便および胆汁などで測定し得る。
したがって、本発明はサルコイドーシスを有する対象をスクリーニングする方法であって、該対象の疾患が自然軽快するか、または慢性となって攻撃的な処置、例えば、これに限定されるものではないが、免疫抑制療法、例えば、高用量のコルチコステロイドまたは細胞毒剤(メトトレキセート、シクロスポリン、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドなど)による処置などを必要とするか、その可能性を判定する方法を提供する。
さらに、本発明はサルコイドーシスに罹患しているか、またはその疑いのある患者の処置方法を提供する。この方法は:1)該患者から採取した生体サンプル中の本明細書に開示した遺伝子の1種以上の遺伝子発現に対応するmRNAの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること;2)このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること;および3)その結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがII&III型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置すること;を特徴とする方法である。好適な態様において、本発明はサルコイドーシスに罹患しているか、またはその疑いのある患者からの生体サンプル中に、遺伝子HLA−DRB1*1502(ヒトMHCクラスII HLA−DR2−Dw12mRNA DQw1−ベータ;ジェンバンク寄託番号M16276)のmRNAまたはタンパク質発現産物のレベルを測定すること、2)このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること;および3)該患者のレベルまたはレベルのパターンがII&III型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置することからなる。この免疫療法は限定されるものではないが、高用量のコルチコステロイドまたは細胞毒剤、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、もしくはシクロホスファミド、または他の免疫抑制療法による処置である。好適な態様において、この処置はシクロスポリンにより、1〜100mg/kg/日の範囲の用量で、より好ましくは2〜50mg/kg/日の用量で、最も好ましくは3〜20mg/kg/日の範囲の用量で処置することからなる。
さらに、本発明は純粋に臨床的根拠に基づいてなされた診断を確認するために、対象をスクリーニングしてサルコイドーシスのバイオマーカーが存在するか否かを判断する方法を提供する。本発明はまた個々人における該疾患の重症度または進行度をモニターする方法およびサルコイドーシスの新規有用な処置の確認法を提供する。
[転写状態測定]
転写状態の測定は、好ましくは、転写物アレイへのハイブリッド形成により実施するが、これについてはこのサブセクションに記載する。一部他の転写状態測定法についてはこのサブセクションの後半に記載する。
転写状態の測定は、好ましくは、転写物アレイへのハイブリッド形成により実施するが、これについてはこのサブセクションに記載する。一部他の転写状態測定法についてはこのサブセクションの後半に記載する。
転写物アレイ一般
好適な態様において、本発明では“転写物アレイ”(本明細書では“マイクロアレイ”とも呼ぶ)を使用する。転写物アレイは細胞の転写状態の解析に、また癌または他の疾患細胞の転写状態の測定に採用することができる。
好適な態様において、本発明では“転写物アレイ”(本明細書では“マイクロアレイ”とも呼ぶ)を使用する。転写物アレイは細胞の転写状態の解析に、また癌または他の疾患細胞の転写状態の測定に採用することができる。
一態様において、転写物アレイは細胞中に存在するmRNA転写物を提示する検出可能に標識したポリヌクレオチド(例えば、全細胞mRNAから合成される蛍光標識cDNA)をマイクロアレイにハイブリッド形成させることにより製造する。マイクロアレイは細胞または生体のゲノム中の遺伝子の多く、好ましくは遺伝子のほとんどまたはほとんどすべての産物の結合(例えば、ハイブリダイゼーション)部位の規則的な配列の面である。マイクロアレイは多くの方法で調製し得るが、その幾つかについて以下に記載する。どのように調製した場合にも、マイクロアレイはある特性を共有する:配列は再現性があり、調製すべき所定の配列の多数コピーが可能であり、互いに容易に比較し得るものとする。好ましくは、マイクロアレイは小型で、通常、5cm2未満であり、結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)条件下に安定な材料から造る。マイクロアレイの所定の結合部位または結合部位のユニークセットは、細胞中の単一遺伝子の産物に特異的に結合する。そこには特異的mRNAあたり1つ以上の結合部位(以下、“部位”)が存在するが、明確にするために、以下の考察では単一の部位が存在すると仮定する。具体的態様において、各位置に既知配列の付着核酸を含むその位置を追跡し得るアレイを使用する。
認識すべきは、細胞のRNAに相補的なcDNAを造り、それを適切なハイブリダイゼーション条件下にマイクロアレイにハイブリッド形成させる場合、特定の遺伝子に対応する配列において当該部位にハイブリッド形成するレベルは、当該遺伝子から転写されるmRNAの細胞における優先性を反映していることである。例えば、検出可能に標識化(例えば、発蛍光団により)した全細胞mRNAに相補的なcDNAをマイクロアレイにハイブリッド形成させるとき、該細胞中で転写されていない遺伝子(すなわち、遺伝子産物に特異的に結合し得る)に対応する配列上の部位は、ほとんどまたはまったくシグナル(例えば、蛍光シグナル)を発せず、エンコードされたmRNAが優勢である遺伝子では比較的強いシグナルを発する。
マイクロアレイの調製
マイクロアレイは技術的に既知であり、配列が遺伝子産物(例えば、cDNA、mRNA、cRNA、ポリペプチド、およびそのフラグメント)に対応するプローブが、既知の位置で特異的にハイブリッド形成するか、または結合することの可能な表面から構成される。一態様において、マイクロアレイは遺伝子がコードする産物(例えば、タンパク質またはRNA)に対し個別的な結合部位を各位置で提示する配列(すなわち、マトリックス)であり、その結合部位が生体のゲノムにおける遺伝子のほとんどまたはほとんどすべての産物に対して存在する配列である。好適な態様において、“結合部位”(以下“部位”)は核酸または核酸類似体であり、それに対して特定の同族cDNAは特異的にハイブリッド形成することができる。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、全長のcDNA,全長未満のcDNA、または遺伝子フラグメントであり得る。
マイクロアレイは技術的に既知であり、配列が遺伝子産物(例えば、cDNA、mRNA、cRNA、ポリペプチド、およびそのフラグメント)に対応するプローブが、既知の位置で特異的にハイブリッド形成するか、または結合することの可能な表面から構成される。一態様において、マイクロアレイは遺伝子がコードする産物(例えば、タンパク質またはRNA)に対し個別的な結合部位を各位置で提示する配列(すなわち、マトリックス)であり、その結合部位が生体のゲノムにおける遺伝子のほとんどまたはほとんどすべての産物に対して存在する配列である。好適な態様において、“結合部位”(以下“部位”)は核酸または核酸類似体であり、それに対して特定の同族cDNAは特異的にハイブリッド形成することができる。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、全長のcDNA,全長未満のcDNA、または遺伝子フラグメントであり得る。
好適な態様において、マイクロアレイは標的生体ゲノムのすべてのまたはほとんどすべての遺伝子産物に対して結合部位を有するが、このような包括力は必ずしも必要ではない。通常、マイクロアレイは少なくとも約50%のゲノム遺伝子、多くの場合少なくとも約75%、より多くの場合少なくとも約85%、さらにより多くの場合約90%以上、そして最も多くの場合少なくとも約99%に対応する結合部位を有する。好ましくは、該マイクロアレイは対象の生物学的ネットワークモデルのテストおよび確認に関連する遺伝子に対する結合部位をもつ。“遺伝子”は、好ましくは、少なくとも50、75、または99個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)として同定されるが、ここからメッセンジャーRNAが生物体(例えば、単一の細胞であるなら)にて、または多細胞生物体のある細胞において転写される。ゲノム中の遺伝子数は生物体により発現されるmRNAの数から、またはゲノムのよくキャラクタリゼーションされた部位からの外挿法によって推定される。対象生物体のゲノムが配列決定されている場合には、DNA配列の解析によりORFの数を決定し、mRNAコード領域を同定することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は完全に配列決定がなされており、99アミノ酸よりも長い約6275オープンリーディングフレーム(ORF)を有すると報告されている。これらのORFの解析ではタンパク質産物を特定すると思われる5885のORFが存在することを示している(Goffeau et al., 1996, 6000の遺伝子をもつ生命、Science 274:546-567(すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)。対照的に、ヒトのゲノムはおおよそ105個の遺伝子を含むと予測される。
マイクロアレイ用核酸の調製
上記のように、特定の同族cDNAが特異的にハイブリッド形成する“結合部位”は、通常、その結合部位に付着した核酸または核酸類似体である。一態様において、マイクロアレイの結合部位は生物体ゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部に対応するDNAポリヌクレオチドである。これらのDNAは、例えば、ゲノムcDNA、cDNA(例えば、RT−PCTにより)、またはクローン化配列からの遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により入手し得る。PCRプライマーは遺伝子またはcDNAの既知配列に基づき選択し、それがユニークフラグメント(すなわち、マイクロアレイ上の他のいずれのフラグメントとも10塩基を超えて隣接する同一の配列を共有しないフラグメント)の増幅に至る。コンピュータープログラムは必要とされる特異性と最適増幅性をもつプライマーの設計に有用である。参照:例えば、Origo pl バージョン5.0(ナショナルバイオサイエンス)。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、遺伝子の3’末端に近いセグメントを増幅することが場合によっては望ましく、それによってオリゴ−dT感作cDNAがマイクロアレイにハイブリッド形成するとき、完全長未満の長さのプローブが効率的に結合する。典型的に、マイクロアレイ上の各フラグメントは約50bpと2000bpの間、より典型的には約100bpと約1000bpの間にあり、通常、約300bpと約800bpとの間である。PCR法は周知であり、例えば、Innis et al. eds., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(PCRプロトコール:方法と応用の手引き)、Academic Press Inc. San Diego, Calif.(すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)に記載がある。コンピューター制御ロボットシステムは核酸を単離・増幅するために有用であることは明らかである。
上記のように、特定の同族cDNAが特異的にハイブリッド形成する“結合部位”は、通常、その結合部位に付着した核酸または核酸類似体である。一態様において、マイクロアレイの結合部位は生物体ゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部に対応するDNAポリヌクレオチドである。これらのDNAは、例えば、ゲノムcDNA、cDNA(例えば、RT−PCTにより)、またはクローン化配列からの遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により入手し得る。PCRプライマーは遺伝子またはcDNAの既知配列に基づき選択し、それがユニークフラグメント(すなわち、マイクロアレイ上の他のいずれのフラグメントとも10塩基を超えて隣接する同一の配列を共有しないフラグメント)の増幅に至る。コンピュータープログラムは必要とされる特異性と最適増幅性をもつプライマーの設計に有用である。参照:例えば、Origo pl バージョン5.0(ナショナルバイオサイエンス)。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、遺伝子の3’末端に近いセグメントを増幅することが場合によっては望ましく、それによってオリゴ−dT感作cDNAがマイクロアレイにハイブリッド形成するとき、完全長未満の長さのプローブが効率的に結合する。典型的に、マイクロアレイ上の各フラグメントは約50bpと2000bpの間、より典型的には約100bpと約1000bpの間にあり、通常、約300bpと約800bpとの間である。PCR法は周知であり、例えば、Innis et al. eds., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(PCRプロトコール:方法と応用の手引き)、Academic Press Inc. San Diego, Calif.(すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)に記載がある。コンピューター制御ロボットシステムは核酸を単離・増幅するために有用であることは明らかである。
マイクロアレイ用の核酸を生成させる代替手段は、N−ホスホネートまたはホスホロアミダイト化学を用いる合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものである(Froehier et al., 1986, Nucleic Acid Res 14:5399-5407; McBride et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:245-248)。合成配列は鎖中の約15と約500塩基間に、より典型的には約20と約50塩基間にある。一部態様において、合成核酸とは非天然塩基、例えば、イノシンなどである。上記のように、核酸類似体をハイブリダイゼーションの結合部位として使用することができる。適切な核酸類似体はペプチド核酸である(参照:例えば、Egholm et al., 1993, PNAはワトソン−クリック水素結合規則にしたがい相補性オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成する;Nature 365:566-568; 米国特許第5,539,083号公報も参照)。
代わり得る態様において、結合(ハイブリダイゼーション)部位は遺伝子のプラスミドもしくはファージクローン、cDNA(例えば、発現配列タグ)、またはその挿入物から調製する(Nguyen et al., 1995, 配列したcDNAクローンの定量的ハイブリダイゼーションにより検定したマウス胸腺内での差別的遺伝子発現;Genomics 29:207-209)。さらに他の態様において、結合部位のポリヌクレオチドはRNAである。
固体表面に対する核酸の付着
核酸または類似体は固体支持体に付着するが、該支持体はガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製し得る。核酸を表面に付着させる好適な方法はガラスプレート上にプリントすることによる(一般的記載例:Schena et al., 1995, 相補性DNAマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニター;Science 270:467-470)。この方法はcDNAのマイクロアレイの調製に特に有用である。参照例:DeRisi et al., 1996, ヒト癌における遺伝子発現パターンを解析するためのcDNAマイクロアレイの使用;Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, 二色蛍光プローブハイブリダイゼーションによる複雑なDNAサンプルの解析用DNAマイクロアレイシステム;Genome Res. 6:639-645; および Schena et al., 1995, 平行ヒトゲノム解析;1000遺伝子のマイクロアレイに基づく発現;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10539-11286。上記の文献はそれぞれ、すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする。
核酸または類似体は固体支持体に付着するが、該支持体はガラス、プラスチック(例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、または他の材料から作製し得る。核酸を表面に付着させる好適な方法はガラスプレート上にプリントすることによる(一般的記載例:Schena et al., 1995, 相補性DNAマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニター;Science 270:467-470)。この方法はcDNAのマイクロアレイの調製に特に有用である。参照例:DeRisi et al., 1996, ヒト癌における遺伝子発現パターンを解析するためのcDNAマイクロアレイの使用;Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, 二色蛍光プローブハイブリダイゼーションによる複雑なDNAサンプルの解析用DNAマイクロアレイシステム;Genome Res. 6:639-645; および Schena et al., 1995, 平行ヒトゲノム解析;1000遺伝子のマイクロアレイに基づく発現;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10539-11286。上記の文献はそれぞれ、すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする。
マイクロアレイを作製する第二の好適な方法は、高密度オリゴヌクレオチド配列を作製することによる。面上の定まった位置に原位置合成写真平板技法により、定まった配列に相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含むアレイを製造する技法は既知であり(参照:Fodor et al., 1991, 光指向空間的接近平行化学合成;Science 251:767-773; Pease et al., 1994, 迅速DNA配列分析用光指向オリゴヌクレオチドアレイ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションによる発現モニター;Nature Biotech 14:1675; 米国特許第5,578,832号、第5,556,752号および第5,510,270号公報;これらの文献はそれぞれ、すべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)、また定まったオリゴヌクレオチドの他の迅速合成沈着法も既知である(Blanchard et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチドアレイ;Biosensors & Bioelectronics 11:687-90)。これらの方法を使用する場合、既知配列のオリゴヌクレオチド(例えば、20マー)は誘導化したガラススライドなどの表面に直接合成する。通常、調製した配列はRNA1個あたり数個のオリゴヌクレオチド分子と重複している。オリゴヌクレオチドプローブは選択的にスプライスしたmRNAを検出するために選択することができる。
マイクロアレイの他の作製法、例えば、マスキング法(Maskos and Southern, 1992, Nuc. Acids Res. 20:1679-1684)も使用可能である。原則として、いずれのタイプのアレイも、例えば、ナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット(参照:Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)も使用し得るが、当業者が認識しているように、ハイブリダイゼーション容積が小さいために、極小のアレイが好適である。
標識プローブの生成
全長およびポリ(A)+RNAの調製法は周知であり、上記の Sambrook et al.上記に一般的な記載がある。一態様において、RNAは本発明対象の種々の種類の細胞から、チオシアン酸グアニジニウム溶解を用いて抽出し、次いで、CsCl遠心分離に付す(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299)。ポリ(A)+RNAはオリゴdT−セルロースによる選択により選択する(参照:Sambrook et al., 上記)。対象の細胞は、野生型細胞、薬物接触野生型細胞、修飾/摂動細胞性成分をもつ細胞、および薬物接触細胞である。
全長およびポリ(A)+RNAの調製法は周知であり、上記の Sambrook et al.上記に一般的な記載がある。一態様において、RNAは本発明対象の種々の種類の細胞から、チオシアン酸グアニジニウム溶解を用いて抽出し、次いで、CsCl遠心分離に付す(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299)。ポリ(A)+RNAはオリゴdT−セルロースによる選択により選択する(参照:Sambrook et al., 上記)。対象の細胞は、野生型細胞、薬物接触野生型細胞、修飾/摂動細胞性成分をもつ細胞、および薬物接触細胞である。
標識化cDNAはオリゴdT−感作またはランダム感作逆転写から調製するが、両方ともに技術的に周知である(参照:例えば、Klug and Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:316-325)。逆転写は検出可能な標識に結合したdNTP(最も好ましいのは蛍光標識dNTP)の存在下に実施し得る。別法として、標識したdNTPの存在下に、単離したmRNAは二本鎖cDNAのインビトロ転写により合成した標識アンチセンスRNAに変換し得る(Lockhart et al., 1996, 高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによる発現のモニター;Nature Biotech. 14:1675; 本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)。別途態様において、cDNAまたはRNAプローブは検出可能標識の不在下に合成し、次いで、ビオチニル化dNTPまたはrNTP、あるいはある種同様の手段(例えば、ビオチンのプソラレン誘導体をRNAに光架橋すること)を取り込ませることにより標識し、さらに標識化ストレプトアビジン(例えば、フィコエリスリン接合ストレプトアビジン)またはその等価物を添加することができる。
蛍光標識プローブを使用する場合、多くの適切な発蛍光団、例えば、フルオレセイン、リサミン、フィコエリスリン、ローダミン(パーキンエルマー・シータス)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(アマシャム)、その他が既知である(参照:例えば、Kricka, 1992, 非同位体DNAプローブ技法、Academic Press San Diego, Calif.)。発蛍光団の対は両者が容易に識別し得るように別個の発光スペクトルを選ぶのがよい。
もう一つの態様においては、蛍光標識以外の標識を用いる。例えば、放射活性標識、または一対の別個の放射スペクトルを有する放射活性標識を使用することができる(参照:Zhao et al., 1995, 高密度cDNAフィルター分析:遺伝子発現の大規模定量分析の新規方法;Gene 156:207; Pietu et al., 1996;高密度cDNAアレイの定量的ハイブリダイゼーションにより明らかとなったヒト筋肉に優先的に発現される新規遺伝子転写物;Genome Res. 6:492)。しかしながら、放射活性粒子の散乱があり、その結果広範な空間的結合部位を必要とするために、放射性同位体の使用は余り好ましい態様ではない。
一態様において、標識cDNAは0.5mMのdGTP、dATPおよびdCTPプラス0.1mM−dTTPプラス蛍光デオキシリボヌクレオチド(例えば、0.1mMローダミン110UTP(パーキンエルマー・シータス)または0.1mM−Cy3dUTP(アマシャム)を含む混合物を逆転写酵素(例えば、スーパースクリプトTM.II、LTI Inc.)と42℃で60分間インキュベートすることにより合成する。
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸のハイブリダイゼーションと洗浄条件は、プローブが特定の配列部位に“特異的に結合する”かまたは“特異的にハイブリッド形成する”ように、すなわち、プローブが相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位にハイブリッド形成、二重鎖形成または結合するが、非相補的核酸配列をもつ部位にはハイブリッド形成しないように選択する。本明細書にて使用する場合、一つのポリヌクレオチド配列は、もしそのポリヌクレオチドの短い方が25塩基以下であるならば塩基対合規則を用いることにミスマッチはなく、またはもしポリヌクレオチドの短い方が25塩基よりも長いならばミスマッチは5%を超えないとする場合、もう一方に対して相補性であるとする。好ましくは、該ポリヌクレオチドは完全に相補的(ミスマッチなし)である。特異的なハイブリダイゼーション条件が、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することで、結果として特異的なハイブリダイゼーションに至ることを証明するのは容易である(参照:例えば、Shalon et al., 上記、およびChee et al., 上記)。
核酸のハイブリダイゼーションと洗浄条件は、プローブが特定の配列部位に“特異的に結合する”かまたは“特異的にハイブリッド形成する”ように、すなわち、プローブが相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位にハイブリッド形成、二重鎖形成または結合するが、非相補的核酸配列をもつ部位にはハイブリッド形成しないように選択する。本明細書にて使用する場合、一つのポリヌクレオチド配列は、もしそのポリヌクレオチドの短い方が25塩基以下であるならば塩基対合規則を用いることにミスマッチはなく、またはもしポリヌクレオチドの短い方が25塩基よりも長いならばミスマッチは5%を超えないとする場合、もう一方に対して相補性であるとする。好ましくは、該ポリヌクレオチドは完全に相補的(ミスマッチなし)である。特異的なハイブリダイゼーション条件が、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することで、結果として特異的なハイブリダイゼーションに至ることを証明するのは容易である(参照:例えば、Shalon et al., 上記、およびChee et al., 上記)。
最適なハイブリダイゼーション条件は標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、200塩基以上のポリヌクレオチドに対するオリゴマー)とタイプ(例えば、RNA、DNA、PNA)に左右される。核酸についての特異的(すなわち、ストリンジェント)ハイブリダイゼーション条件の一般的パラメータについては上記文献(Sambrook et al.)および以下の文献:Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(本文献はすべての目的のためにその全文を参照により本明細書の一部とする)に記載がある。シェナら(Schena et al.)のcDNAマイクロアレイを使用する場合、代表的なハイブリダイゼーション条件は、5×SSCプラス0.2%SDS中、65℃、4時間のハイブリダイゼーションと、引き続く低ストリンジェント性洗浄バッファー(1×SSCプラス0.2%SDS)による25℃での洗浄と高ストリンジェント洗浄バッファー(0.1×SSCプラス0.2%SDS)による25℃、10分間の洗浄である(Shena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614)。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V. and Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif, にも提供されている。
シグナル検出およびデータ解析
蛍光標識したプローブを用いる場合、転写物アレイの各部位での蛍光発光は、好ましくは、走査共焦点レーザーマイクロスコープ法により検出し得る。一態様において、個別の走査は、適切な励起光を用いて、使用する2種の発蛍光団のそれぞれについて実施する。あるいは使用した発蛍光団に特異の波長での標本照射を可能とするレーザーを用い、発蛍光団からの発光を分析する。好適な態様において、該アレイはコンピューター制御X−Yステージと顕微対物レンズをもつレーザー蛍光スキャナーで走査する。発蛍光団の連続励起は多重線混合ガスレーザーにより実施し、放出される光は波長によって分かれ、光増幅管によって検出する。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639-645 および本明細書に引用した他の文献に記載がある。あるいは、線維光学束 (Ferguson et al., 1996, Nature Biotech. 14:1681-1684) を使用して、多数の部位で同時にmRNAの存在量レベルをモニターすることもできる。
蛍光標識したプローブを用いる場合、転写物アレイの各部位での蛍光発光は、好ましくは、走査共焦点レーザーマイクロスコープ法により検出し得る。一態様において、個別の走査は、適切な励起光を用いて、使用する2種の発蛍光団のそれぞれについて実施する。あるいは使用した発蛍光団に特異の波長での標本照射を可能とするレーザーを用い、発蛍光団からの発光を分析する。好適な態様において、該アレイはコンピューター制御X−Yステージと顕微対物レンズをもつレーザー蛍光スキャナーで走査する。発蛍光団の連続励起は多重線混合ガスレーザーにより実施し、放出される光は波長によって分かれ、光増幅管によって検出する。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al., 1996, Genome Res. 6:639-645 および本明細書に引用した他の文献に記載がある。あるいは、線維光学束 (Ferguson et al., 1996, Nature Biotech. 14:1681-1684) を使用して、多数の部位で同時にmRNAの存在量レベルをモニターすることもできる。
シグナルを記録し、好適な態様では、コンピューターにより、例えば、12ビットのアナログ/デジタルボードを用いて解析する。一態様において、走査像はグラフィックプログラム(例、ハイジャーク(Hijaak)グラフィックスーツ)を用いて干渉模様を除き、次いで各部位で各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを生じる画像格子プログラムを用いて解析する。
要すれば、2つの蛍光体用チャンネル間の“クロストーク”(またはオーバーラップ)は、実験的に決定し補正し得る。転写物アレイ上のいずれかの特定のハイブリダイゼーション部位については、2つの発蛍光団の発光比は好適に計算される。この比は同族体遺伝子の絶対的発現レベルからは独立しているが、その発現が薬物投与、遺伝子欠失、または何らかの他の試験事象により有意に調節される遺伝子にとっては有用である。
好ましくは、摂動を陽性または陰性と確認することに加えて、摂動の大きさを決定することが有利である。これは当業者にとって容易に明らかとなる方法により実施し得る。
転写状態測定の他の方法
細胞の転写状態は技術上既知の他の遺伝子技法により測定し得る。
細胞の転写状態は技術上既知の他の遺伝子技法により測定し得る。
タックマン(TAQMANTM)に基づくmRNAレベルの解析
RT−PCR(実時間定量PCR)アッセイでは、mRNA鎖などのRNA鎖からDNA鎖する合成する触媒、RNA逆転写酵素を利用する。得られるDNAは特異的に検出・定量可能であり、この工程を使用してmRNAの具体的種のレベルを定量することができる。これを実施するための一方法はタックマン(TAQMAN)(PEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア)の商標で知られいるが、この方法はPCR反応に際し、プローブの特異形状を切断するために、アンプリタック・ゴールド(AMPLITAQ GOLDTM)DNAポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性を利用する。これはタックマン(TAQMANTM)プローブという。参照:Luthra R, et al., 濾胞性リンパ腫患者におけるt(14;18)(q32;q21)検出のための新規5’エキソヌクレアーゼに基づく実時間PCRアッセイ;Am J Pathol., Vol 153, (1998), pp:63-68。このプローブは5’−レポーター色素と3’−消光色素をもつオリゴヌクレオチド(通常〜20マー)からなる。FAM(6−カルボキシフルオレセイン)などの蛍光レポーター色素はオリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合している。レポーターは3’末端に位置するリンカーの腕を介して付着するTAMRA(6−カルボキシ−N,N,N’,N’−テトラメチルローダミン)により消光する。参照:Kuimelis RG, et al., 実時間定量PCR用タックマンプローブの構造類似体;Nucleic Acids Symp Ser., Vol 37, (1997), pp:255-256; and Mullah B, et al., 二重色素標識オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの効率的合成と実時間PCRアッセイにおけるその応用;Nucleic Acids Res., Vol 15, (1998), pp:1026-1031。この反応に際し、プローブの切断がレポーター色素と消光色素を分断し、レポーターの蛍光を増大させる。
RT−PCR(実時間定量PCR)アッセイでは、mRNA鎖などのRNA鎖からDNA鎖する合成する触媒、RNA逆転写酵素を利用する。得られるDNAは特異的に検出・定量可能であり、この工程を使用してmRNAの具体的種のレベルを定量することができる。これを実施するための一方法はタックマン(TAQMAN)(PEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア)の商標で知られいるが、この方法はPCR反応に際し、プローブの特異形状を切断するために、アンプリタック・ゴールド(AMPLITAQ GOLDTM)DNAポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性を利用する。これはタックマン(TAQMANTM)プローブという。参照:Luthra R, et al., 濾胞性リンパ腫患者におけるt(14;18)(q32;q21)検出のための新規5’エキソヌクレアーゼに基づく実時間PCRアッセイ;Am J Pathol., Vol 153, (1998), pp:63-68。このプローブは5’−レポーター色素と3’−消光色素をもつオリゴヌクレオチド(通常〜20マー)からなる。FAM(6−カルボキシフルオレセイン)などの蛍光レポーター色素はオリゴヌクレオチドの5’末端に共有結合している。レポーターは3’末端に位置するリンカーの腕を介して付着するTAMRA(6−カルボキシ−N,N,N’,N’−テトラメチルローダミン)により消光する。参照:Kuimelis RG, et al., 実時間定量PCR用タックマンプローブの構造類似体;Nucleic Acids Symp Ser., Vol 37, (1997), pp:255-256; and Mullah B, et al., 二重色素標識オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの効率的合成と実時間PCRアッセイにおけるその応用;Nucleic Acids Res., Vol 15, (1998), pp:1026-1031。この反応に際し、プローブの切断がレポーター色素と消光色素を分断し、レポーターの蛍光を増大させる。
PCR産物の蓄積はレポーター色素の蛍光増大をモニターすることにより直接検出する。参照:Heid CA, et al., 実時間定量PCR:Genome Res., Vol 6, (1996), pp:986-994。反応は、PCR産物の増幅が所定サイクル数後に蓄積したPCR産物の量よりも、むしろ先に検出されるサイクルの時点が特徴である。核酸標的の開始コピー数の高い方が、蛍光の有意な増加がより早期に観察される。参照:Gibson UE, et al., 実時間定量RT−PCRの新規方法;Genome Res., Vol 6, (1996), pp:995-1001。
プローブが未変化である場合、レポーター色素が消光色素に近接していると、主としてフォースター(Forster)型エネルギー転移によりレポーター蛍光の抑制が起こる。参照:Lakowicz JR, et al., タンパク質におけるチロシン残基の酸素消光と蛍光脱分極;J Biol Chem., Vol 258, (1983), pp:4794-4801。PCRに際し、もし対象の標的が存在するならば、プローブは前進および逆向きプライマー部位の間に特異的にアニールする。アンプリタック・ゴールド(AMPLITAQ GOLDTM)DNAポリメラーゼの5’−3’核開裂活性は、プローブが標的にハイブリッド形成する場合にのみ、レポーターと消光剤間でプローブを切断する。プローブフラグメントは次いで標的から置換わり、鎖のポリマー化が継続する。この工程はすべてのサイクルで起こり、産物の対数的蓄積を阻害しない。プローブの3’末端はブロックされてPCRに際してのプローブの伸張を妨げる。
受動対照標準はタックマンTMバッファーに含まれる色素であり、5’ヌクレアーゼアッセイには関与していない。受動対照標準は内部基準を提供するが、この基準に対してレポーター色素シグナルは解析に際し標準化される。標準化は濃度または容積の変化による蛍光のゆらぎを補正するために必要である。
標準化はレポーター色素の発光強度を受動対照標準の発光強度で割って、所定の反応チューブに対するRnn(標準化レポーター)と定義する比を得ることにより実施する。
閾値サイクルまたはCt値は、統計的に有意な増加ΔRnが最初に検出されるサイクルである。Rn対サイクル数のグラフ上、閾値サイクルは、配列検出適用がPCR産物の対数増加と関連したシグナルの増大を検出することで始まるときに起こる。
定量測定を遂行するために、cRNA(標準)の段階希釈を各実験に含め、正確で素早いmRNA定量に必要な標準曲線を作成する。この技法の再現性を評価するために、同じcRNAサンプルの増幅を数回実施してもよい。
細胞の転写状態を測定する他の技法では、電気泳動分析のために限度はあるが複雑な制限フラグメントのプールを生じる;例えば、二重制限酵素消化とフェージングプライマーとを組み合わせる方法(参照:例えば、欧州特許第0 534858A1公報;1992年9月24日出願;Zabeau et al.)、または限定されたmRNA末端に最も近接する部位をもつ制限フラグメントを選択する方法(参照:例えば、Prashar et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:659-663)などである。他の方法では統計的にcDNAプールを試験する;例えば、多数のcDNAのそれぞれの十分な塩基(例えば、20〜50塩基)の配列を決定するか、または限定されたmRNA末端(参照:例えば、Velculescu, 1995, Science 270:484-487)経路パターンに比例して既知位置に生成する短いタグ(例えば、9〜10塩基)の配列を決定する。
他の状況の測定
本発明の様々な態様において、転写状態以外の生物学的状態の状況、例えば、翻訳状態、活性状態、または混合状況などは、薬物応答および経路応答を得るために測定し得る。これらの態様の詳細をこのセクションで記載する。
本発明の様々な態様において、転写状態以外の生物学的状態の状況、例えば、翻訳状態、活性状態、または混合状況などは、薬物応答および経路応答を得るために測定し得る。これらの態様の詳細をこのセクションで記載する。
翻訳状態測定
遺伝子がコードするタンパク質の発現は、検出可能に標識したプローブまたは後に続いて標識し得るプローブにより検出し得る。一般に、該プローブは発現されたタンパク質を認識する抗体である。
遺伝子がコードするタンパク質の発現は、検出可能に標識したプローブまたは後に続いて標識し得るプローブにより検出し得る。一般に、該プローブは発現されたタンパク質を認識する抗体である。
本明細書にて使用する場合、抗体という用語は、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、および抗体フラグメントのタンパク質に対する結合に十分な生物学的に機能する抗体フラグメントを包含する。
開示した遺伝子の一つがコードするタンパク質に対する抗体を製造するには、種々の宿主動物にポリペプチドまたはその一部分を注射して免疫する。かかる宿主動物は、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、およびラットなど、ほんの一部ではあるが例示される。免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントを使用し得る;これは宿主の種により、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(無菌化ウシ型結核菌)やコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどであるが、これらに限定されるものではない。
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物などの抗原またはその抗原性機能誘導体により免疫した動物の血清から由来する不均一な抗体分子の集団である。ポリクローナル抗体の産生には、上記のような宿主動物にエンコードタンパク質またはその一部分を上記のアジュバントと共に注射し、免疫する。
モノクローナル抗体(mAb)は特定の抗原に対する抗体の均一な集団であり、連続細胞株の培養による抗体分子の生産に供されるいずれの技法によっても入手し得る。これらの方法は、制限されるものではないが、コーラーとミルシュタインのハイブリドーマ技法(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); および米国特許第4,376,110号公報);コスボールらのヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983); およびEBV−ハイブリドーマ技法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985); などである。かかる抗体は免疫グロブリンクラスのもので、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDなどとそのサブクラスを包含する。本発明のmAb産生ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養し得る。高力価のmAbをインビボで生産することが現在の好適な生産方法である。
さらに、“キメラ抗体”生産用に開発された技法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takdea et al., Nature, 314:452-454 (1985) は、適切な抗原特異性をもつマウスの抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とをつなぎ合わせるもので、これらの技法も使用し得る。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種由来の分子であり、マウスmAb由来の可変もしくは超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とをもつ抗体である。
別法として、一本鎖抗体生産について記載した技法(米国特許第4,946,778号公報;Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature, 334:544-546 (1989))は、別個に発現された遺伝子−一本鎖抗体を生産するために適合する。一本鎖抗体はFv領域の重鎖と軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介してつなぎ、一本鎖ポリペプチドとすることにより形成する。
より好ましくは、“ヒト化抗体”の生産に有用な技法がタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体に対する抗体を生産するのに適合させ得る。かかる技法は以下の米国特許に記載されている:5,932,448;5,693,762;5,693,761;5,585,089;5,530,101;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,661,016;および5,770,429。
抗体フラグメントは特定のエピトープを認識するものであり、既知技法により生成させることができる。例えば、かかるフラグメントは限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造し得るF(ab'ab’)2フラグメント、F(ab'ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成させ得るFababフラグメントなどである。あるいは、Fabab発現ライブラリーを構築し(Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989))、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定し得るようにしてもよい。
次に、既知タンパク質がサンプル中に発現されている程度を、上記の抗体を利用するイムノアッセイ法により定量する。かかるイムノアッセイ法は限定されるものではないが、ドットブロット法、ウエスタンブロット法、競合・非競合タンパク結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーター(FACS)、およびその他の一般的に使用され、科学文献および特許文献に広く記載され、かつ商業的に採用される多くの方法を含む。
検出が容易であるという点で特に好適なのはサンドイッチELISAであり、これについては多くの変法があるが、本発明ではそのすべてを包含するものとする。例えば、典型的なフォワードアッセイ法では、未標識抗体を固体基板に固相化し、適当な時間インキュベーションした後に、テストするサンプルを結合した分子と十分な時間接触させて、抗体−抗原二元複合体を形成させる。この時点で、検出可能なシグナルを誘発し得るレポーター分子で標識した第二抗体を加えてインキュベートし、十分な時間を掛けて抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させる。未反応物質はすべて洗い流し、抗原の存在をシグナル観察により判定するか、または既知量の抗原を含む対照サンプルを比較することにより定量し得る。フォワードアッセイの変法は同時アッセイも含み、その場合、サンプルと抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する;逆進アッセイでは標識した抗体と試験するサンプルを最初に組合せ、インキュベートした後に、未標識表面結合抗体に加える。これらの技法は当業者周知であり、わずかな変更の可能性は容易に明らかとなる。本明細書にて使用する場合、“サンドイッチ”アッセイとは基本的な2つの部位による技法に関するすべての変法を包含するものとする。本発明のイムノアッセイにとって、唯一の制限因子は標識抗体が対象とする遺伝子の発現するタンパク質に特異的な抗体でなければならないということである。
このタイプのアッセイに最も共通に使用されるレポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、酵素は第二抗体に、通常、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により接合させる。しかし、容易に分かるように、多様な連結反応法が存在することが、当業者周知である。一般的に使用される酵素としては、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。特定の酵素と共に使用すべき基質は、一般に、対応する酵素による加水分解により、検出可能な色調変化を生ずるように選択する。例えば、p−ニトロフェニルリン酸エステルはアルカリホスファターゼ接合体との使用に適しており、ペルオキシダーゼ接合体には1,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンが共通して使用される。発蛍光基質を採用することも可能であり、その場合は上記の色素原基質よりもむしろ蛍光性産物を生じる。適切な基質を含有する溶液を次いで三級複合体に加える。この基質を第二抗体に連接した酵素と反応させて、定量的可視シグナルを生じさせ、このシグナルを通常分光光度法によりさらに定量して、血清サンプル中に存在するタンパク質量を評価する。
フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光化合物を、その結合能力を変化させることなく交互に抗体に化学的に共役させる。特定波長の光の照射により活性化した場合、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子に励起状態を誘発し、次いで特徴的な長波長にて光を放出する。放出光は光学顕微鏡により可視的に検出し得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光とEIA技法は共に技術的によく確立されており、とりわけ本発明では好適である。しかし、放射性同位体、化学発光または生物発光分子などの他のレポーター分子も採用し得る。必要な用途に合致させるために手法をどのように変更するかは当業者にとって容易に明らかである。
翻訳状態の測定もまた幾つかのさらなる方法にしたがって実施し得る。例えば、タンパク質についての全ゲノムのモニター(すなわち、“プロテオーム”、Goffeau et al., 上記)は、その結合部位が細胞ゲノムのコードする複数のタンパク質種に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体からなるマイクロアレイを構築することにより実施し得る。好ましくは、抗体はエンコードされたタンパク質の実質的な画分に対し、または少なくとも対象の生物学的ネットワークモデルのテストまたは確認に関連するタンパク質に対し存在する。モノクローナル抗体の作製方法は周知である(参照:例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; すべての目的のためにその全文を一部とする)。一態様において、モノクローナル抗体は細胞のゲノム配列に基づいて設計した合成ペプチドフラグメントに対して起こす。かかる抗体アレイにより、細胞からのタンパク質はアレイに接触させ、その結合を技術上既知のアッセイ法によりアッセイする。
別法として、タンパク質は二次元ゲル電気泳動システムにより分離することができる。二次元ゲル電気泳動法は技術上周知であり、典型的には第一の次元に沿う等電点電気泳動と引き続く第二の次元に沿うSDS−PAGE電気泳動からなる。参照:例えば、Hames et al., 1990, タンパク質のゲル電気泳動:実用法;IRL Press, New York; Shevchenko et al., 1996, Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:1440-1445; Sagliocco et al., 1996, Yeast 12:1519-1533; Lander, 1996, Science 274:536-539。得られる電気泳動図は幾つかの技法、例えば、質量スペクトル技法、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法および免疫ブロット解析、および内部およびN−末端ミクロ配列決定法などにより解析し得る。これらの技法を用い、所定の生理的条件下、例えば、薬物に接触した細胞、または例えば、特定遺伝子の欠失または過剰発現により修飾された細胞などで産生されたすべてのタンパク質の実質的画分を同定することが可能である。
生物学的状態の他の観点に基づく態様
mRNAの存在量以外の細胞構成成分のモニターは、mRNAのモニターに際しては遭遇することのなかったある種の技術的難しさが現在存在するが、当業者にとって、細胞機能の特性化に関連するタンパク質の活性を測定し得る本発明の使用、すなわち、本発明の態様がかかる測定に基づくものであることは明らかである。活性の測定は特性化すべき特定の活性に適切な機能的、生物化学的、または物理的手段により実施し得る。その活性が化学的形質転換に関る場合、細胞性タンパク質を天然の基質と接触させ、その形質転換率を測定する。その活性が多重合単位における会合、例えば、DNAとの活性化DNA結合複合体の会合に関る場合、会合したタンパク質の量または会合の二次的結果、例えば、転写されたmRNAの量を測定する。また、機能的活性のみが判明している場合、例えば、細胞サイクル制御における機能など、その機能の仕事能力を観察し得る。それが既知であり測定されていたとしても、タンパク質活性の変化は本発明の前記方法により解析された応答データを形成する。
mRNAの存在量以外の細胞構成成分のモニターは、mRNAのモニターに際しては遭遇することのなかったある種の技術的難しさが現在存在するが、当業者にとって、細胞機能の特性化に関連するタンパク質の活性を測定し得る本発明の使用、すなわち、本発明の態様がかかる測定に基づくものであることは明らかである。活性の測定は特性化すべき特定の活性に適切な機能的、生物化学的、または物理的手段により実施し得る。その活性が化学的形質転換に関る場合、細胞性タンパク質を天然の基質と接触させ、その形質転換率を測定する。その活性が多重合単位における会合、例えば、DNAとの活性化DNA結合複合体の会合に関る場合、会合したタンパク質の量または会合の二次的結果、例えば、転写されたmRNAの量を測定する。また、機能的活性のみが判明している場合、例えば、細胞サイクル制御における機能など、その機能の仕事能力を観察し得る。それが既知であり測定されていたとしても、タンパク質活性の変化は本発明の前記方法により解析された応答データを形成する。
別の制限のない態様において、応答データは細胞の生物学的状態の混じりあった側面から形成されることもある。応答データは、例えば、あるmRNAの存在量の変化、あるタンパク質存在量の変化、およびあるタンパク質活性の変化から構成し得る。
マーカーとしての核酸およびタンパク質の検出
特定の態様において、マーカーに対応するmRNAのレベルは、技術上既知の方法を用い生体サンプル中にインシトゥ形式およびインビトロ形式の両方により決定し得る。“生体サンプル”という用語は、対象から採取した組織、細胞、生体液およびその分離株、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。多くの発現検出法で単離したRNAを使用する。インビトロ法では、RNA単離技法としてmRNAの単離に反しない方法を選択し、細胞からのRNA精製に使用することができる(参照:例えば、Ausubel, et al., Ed., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1987-1999)。さらに、大量の組織サンプルは当業者周知の技法、例えば、チョムチンスキーの一工程RNA単離方法(Chomczynski, 米国特許第4,843,155号公報(1989))により容易に処理加工し得る。
特定の態様において、マーカーに対応するmRNAのレベルは、技術上既知の方法を用い生体サンプル中にインシトゥ形式およびインビトロ形式の両方により決定し得る。“生体サンプル”という用語は、対象から採取した組織、細胞、生体液およびその分離株、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。多くの発現検出法で単離したRNAを使用する。インビトロ法では、RNA単離技法としてmRNAの単離に反しない方法を選択し、細胞からのRNA精製に使用することができる(参照:例えば、Ausubel, et al., Ed., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1987-1999)。さらに、大量の組織サンプルは当業者周知の技法、例えば、チョムチンスキーの一工程RNA単離方法(Chomczynski, 米国特許第4,843,155号公報(1989))により容易に処理加工し得る。
単離したmRNAはハイブリダイゼーションまたは増殖アッセイ、例えば、限定されるものではないが、サザンもしくはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイなどに使用し得る。mRNAレベルの一つの好適な診断検出法は、検出すべき遺伝子がコードするmRNAにハイブリッド形成し得る核酸分子(プローブ)と該単離mRNAとを接触させることからなる。核酸プローブは、例えば、全長cDNAまたはその一部分、例えば、長さが少なくとも7、15、30、50、100、250または500ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、本発明のマーカーをコードするmRNAまたはゲノムDNAにストリンジェント条件下で特異的にハイブリッド形成するのに十分なものである。本発明の診断アッセイに使用する他の適切なプローブを本明細書に記載する。mRNAとプローブとのハイブリダイゼーションは問題のマーカーが発現していることを示すものである。
一形式において、mRNAは固体面に固定し、例えば、単離mRNAをアガロースゲル上走行させ、次いでゲルからニトロセルロースなどの膜にmRNAを移動させることによりプローブと接触させる。代替の形式では、プローブを固体面に固定し、mRNAとプローブとを、例えば、アフィメトリックス(Affymetrix)遺伝子チップアレイにて接触させる。当業者は本発明のマーカーがコードするmRNAのレベル検出に使用する既知のmRNA検出法を適合させることができる。
サンプル中本発明のマーカーに対応するmRNAレベルを決定する代替法は、核酸増幅法、例えば、RT−PCRによる方法である(実験態様については以下参照:Mullis, 米国特許第4,683,202号公報;リガーゼ連鎖反応、Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193 (1991); 自己持続性配列複製;Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878 (1990); 転写増幅システム;Kwoh et al., Proc. Natl. Ac. Sci. USA, 86:1173-1177 (1989); Q−ベータレプリカーゼ;Lizardi et al., Bio/Technology, 6:1197 (1988); 回転環式複製;Lizardi et al., 米国特許第5,854,033号公報(1988);または他の核酸増幅法とそれに続く当業者周知の技法による増幅分子の検出)。これらの検出工程図は核酸分子の検出のために、かかる分子が非常に低い分子数で存在する場合にとりわけ有用である。本明細書にて使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子の5’または3’領域(それぞれプラス鎖とマイナス鎖、またはその逆)にアニールし、かつその間に短い領域を含み得る一対の核酸分子と定義する。一般に、増幅プライマーは長さが約10ないし30個のヌクレオチドからなり、長さ約50ないし200個のヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下、適切な試薬類により、かかるプライマーは該プライマーが隣接するヌクレオチド配列からなる核酸分子の増幅を可能とする。
インシトゥ法の場合、mRNAは検出に先立って細胞から単離する必要がない。かかる方法において、細胞または組織サンプルは既知の組織学的方法を用い、調製/処理加工する。次いで、サンプルを支持体、一般にはガラススライドに固定化し、次いで該マーカーをコードするmRNAにハイブリッド形成し得るプローブと接触させる。
マーカーの絶対的発現レベルに基づき判定する代替法としては、該マーカーの標準化発現レベルに基づいて判定を下してもよい。発現レベルは、その発現と、マーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現する自家保有の遺伝子の発現とを比較することによりマーカーの絶対的発現レベルを補正して標準化する。標準化に適した遺伝子はアクチン遺伝子などの自家保有遺伝子または表皮細胞特異遺伝子である。この標準化は一サンプル、例えば、患者のサンプルの発現レベルと別のサンプルとの比較、または異なる起源からのサンプル間の比較を可能とする。
あるいは、発現レベルは相対的発現レベルとして提供し得る。マーカーの相対的発現レベルの決定のために、正常サンプルと疾患生体サンプルからの10以上のサンプル、好ましくは50以上のサンプルにつき、問題サンプルの発現レベル決定前に、マーカーの発現レベルを決定する。大量のサンプルにてアッセイした遺伝子それぞれの平均発現レベルを決定し、それをマーカーの発現レベルのベースラインとして使用する。次いで、テストサンプルについて決定されたマーカーの発現レベル(絶対的発現レベル)をそのマーカーについて得られた平均発現値で割る。これが相対的発現レベルとなる。
好ましくは、ベースライン決定に使用したサンプルはサルコイドーシスに罹患していない患者からのものである。細胞源の選択は相対的発現レベルの使用に依存する。平均発現スコアとして正常組織に見出される発現を使用することは、アッセイしたマーカーが特異的である(正常細胞に対して)か否かを確認する上での助けとなる。さらに、より多くのデータが蓄積された場合には、平均発現値を改正し、蓄積データに基づく改善相対発現値とする。
ポリペプチドの検出
本発明のもう一つの態様においては、マーカーに対応するポリペプチドを検出する。本発明のポリペプチドを検出する好適な作用物質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合し得る抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルでもよいし、より好ましくはモノクローナル抗体である。未処理抗体、またはそのフラグメント(例えば、FabまたはF(ab')2)を使用し得る。プローブまたは抗体に関連して“標識化”という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を接合(すなわち、物理的連結)させることによるプローブまたは抗体の直接標識化、ならびに直接標識したもう一つの作用物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含するものとする。間接的標識化の例は、蛍光標識した第二抗体による第一抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出し得るようにDNAプローブをビオチンで標識することである。
本発明のもう一つの態様においては、マーカーに対応するポリペプチドを検出する。本発明のポリペプチドを検出する好適な作用物質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合し得る抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルでもよいし、より好ましくはモノクローナル抗体である。未処理抗体、またはそのフラグメント(例えば、FabまたはF(ab')2)を使用し得る。プローブまたは抗体に関連して“標識化”という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を接合(すなわち、物理的連結)させることによるプローブまたは抗体の直接標識化、ならびに直接標識したもう一つの作用物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含するものとする。間接的標識化の例は、蛍光標識した第二抗体による第一抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出し得るようにDNAプローブをビオチンで標識することである。
サルコイドーシス患者からのタンパク質は、当業者周知の技法を用いて単離することができる。採用されるタンパク質単離方法は、例えば、以下に記載がある:Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)。
サンプルが所定の抗体に結合するタンパク質を含んでいるかどうかを判断するためには様々な方式を採用し得る。かかる方式の例は、限定されるものではないが、酵素イムノアッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ウエスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などである。当業者は細胞が本発明のマーカーを発現するかどうかの判定に使用し得るように、既知のタンパク質/抗体検出法を容易に改造し得る。
一方式において、抗体または抗体フラグメントは発現したタンパク質検出のために、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光技法などの方法に使用し得る。かかる使用において、固体支持体上に抗体またはタンパク質のいずれかを固定化することが一般に好ましい。適当な固相支持体または担体は抗原または抗体を結合し得る支持体である。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱である。
当業者は抗体または抗原を結合する多くの他の適切な担体を知っていようし、本発明で使用し得るようにかかる支持体を改造することも可能である。例えば、患者細胞から単離されるタンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動上で走行させ、ニトロセルロースなどの固相支持体に固定化することができる。次いで、支持体は適当なバッファーで洗浄し、検出可能に標識した抗体で処理する。固相支持体は、次いでバッファーで二度目の洗浄を行い、未結合抗体を除去する。固体支持体上に結合した標識の量は次いで常套手段で検出し得る。
本発明ではまた生体サンプル(例えば、肺関連体液、血清、血漿、リンパ液、のう胞液、尿、糞便、csf、腹水、または血液)中の本発明マーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の存在を検出するキットをも包含する。かかるキットは対象がサルコイドーシスに罹患している場合、その予後を判定するために使用し得る。例えば、該キットは生体サンプル中本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたはポリペプチドをコードするmRNAを検出し得る標識化合物または作用物質、および該サンプル中のポリペプチドまたはmRNAの量を決定する手段(例えば、該ポリペプチドに結合する抗体または該ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ)を含んでなる。キットはまたキットを使用して得られる結果の解釈についての指示書を含む。
抗体ベースのキットの場合、該キットは、例えば、1)本発明マーカーに対応するポリペプチドに結合する第一抗体(例えば、固体支持体に付着);および選択肢として2)該ポリペプチドまたは第一抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識に接合する第二の異なる抗体;を含有してなる。
オリゴヌクレオチドベースのキットの場合、該キットは、例えば、1)本発明マーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識したオリゴヌクレオチド;または2)本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマー;を含んでなる。該キットはまた、例えば、バッファー試薬、保存剤、またはタンパク質安定化剤を含んでなる。該キットはさらに検出可能な標識を検出するために必要な成分(例えば、酵素または基質)をさらに含んでなる。該キットはまた一つの対照サンプルまたは一連の対照サンプルであって、これをアッセイして試験サンプルと比較するためのサンプルを含み得る。該キットの各成分は個々の容器に納め得るものであり、その容器はすべて本キットを使用して実施したアッセイの結果を解釈するための指示書と共にひとつのパッケージに収め得る。
細胞への抗体導入
抗体はいろいろな様式で、例えば、抗体のマイクロインジェクション(Morgan et al., 1988, Immunology Today 9:84-86)または所望の抗体をコードするmRNAによるハイブリドーマの形質転換(Burke et al., 1984, Cell 36:847-858)などにより、細胞中に導入することができる。さらなる技法において、組換え抗体を設計し、広範な非リンパ球細胞型中で異所性に発現させて、標的タンパク質に結合させること、また標的タンパク質の活性を遮断することができる(Biocca et al., 1995, Trends in Cell Biology 5:248-252)。該抗体の発現は、好ましくは、Tetプロモーターなどの制御可能プロモーター、または構成的に活性なプロモーター(摂動を飽和させる産生用)の制御下にある。第一工程では標的タンパク質に適切な特異性をもつ特定のモノクローナル抗体を選択する(下記参照)。選択した抗体の可変領域をコードする配列は、様々に設計した抗体方式、例えば、全抗体、FabFabフラグメント、Fvフラグメント、一本鎖Fvフラグメント(ペプチドリンカーにより結合させたVHとVL領域)(“ScFv”フラグメント)、ジアボディ(diabodies)(異なる特異性をもつ2つ会合したScFvフラグメント)などにクローン化することができる(Hayden et al., 1997, Current Opinion in Immunology 9:210-212)。細胞内に発現される様々な方式の抗体は種々の既知細胞内リーダー配列との融合体として発現し、細胞性区画(例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなど)を標的とすることができる(Bradbury et al., 1995, Antibody Engineering (vol.2)(Borrebaeck ed.), pp.295-361, IRL Press)。特に、ScFv方式が細胞質標的化にとりわけ適していると思われる。
抗体はいろいろな様式で、例えば、抗体のマイクロインジェクション(Morgan et al., 1988, Immunology Today 9:84-86)または所望の抗体をコードするmRNAによるハイブリドーマの形質転換(Burke et al., 1984, Cell 36:847-858)などにより、細胞中に導入することができる。さらなる技法において、組換え抗体を設計し、広範な非リンパ球細胞型中で異所性に発現させて、標的タンパク質に結合させること、また標的タンパク質の活性を遮断することができる(Biocca et al., 1995, Trends in Cell Biology 5:248-252)。該抗体の発現は、好ましくは、Tetプロモーターなどの制御可能プロモーター、または構成的に活性なプロモーター(摂動を飽和させる産生用)の制御下にある。第一工程では標的タンパク質に適切な特異性をもつ特定のモノクローナル抗体を選択する(下記参照)。選択した抗体の可変領域をコードする配列は、様々に設計した抗体方式、例えば、全抗体、FabFabフラグメント、Fvフラグメント、一本鎖Fvフラグメント(ペプチドリンカーにより結合させたVHとVL領域)(“ScFv”フラグメント)、ジアボディ(diabodies)(異なる特異性をもつ2つ会合したScFvフラグメント)などにクローン化することができる(Hayden et al., 1997, Current Opinion in Immunology 9:210-212)。細胞内に発現される様々な方式の抗体は種々の既知細胞内リーダー配列との融合体として発現し、細胞性区画(例えば、細胞質、核、ミトコンドリアなど)を標的とすることができる(Bradbury et al., 1995, Antibody Engineering (vol.2)(Borrebaeck ed.), pp.295-361, IRL Press)。特に、ScFv方式が細胞質標的化にとりわけ適していると思われる。
有用な抗体型の多様性
抗体のタイプは、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーである。標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生には技術上既知の種々の手法が使用し得る。抗体を生産するには、種々の宿主動物に標的タンパク質を注射して免疫するが、かかる宿主動物としては限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどである。宿主の種類に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫応答を上昇させることができるが、アジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、および無菌化ウシ型結核菌(BCG)やコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどである。
抗体のタイプは、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーである。標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生には技術上既知の種々の手法が使用し得る。抗体を生産するには、種々の宿主動物に標的タンパク質を注射して免疫するが、かかる宿主動物としては限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどである。宿主の種類に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫応答を上昇させることができるが、アジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、および無菌化ウシ型結核菌(BCG)やコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどである。
モノクローナル抗体
標的タンパク質に向けてのモノクローナル抗体の調製には、培養連続細胞株による抗体分子の製造技法が使用し得る。かかる技法は、制限されるものではないが、コーラーとミルシュタインが最初に開発したハイブリドーマ技法(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975));トリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72); およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBV−ハイブリドーマ技法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96); などである。本発明のさらなる態様において、モノクローナル抗体は最新の技法を利用して無菌動物で製造することができる(PCT/US90/02545)。本発明によると、ヒト抗体が使用可能で、ヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)またはEBVウイルスによりインビトロでヒトB細胞を形質転換することにより(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)入手し得る。事実、本発明によると、標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とを繋ぐことによる“キメラ抗体”の製造のために開発された技法を使用し得る(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454); かかる抗体は本発明の範囲内にある。
標的タンパク質に向けてのモノクローナル抗体の調製には、培養連続細胞株による抗体分子の製造技法が使用し得る。かかる技法は、制限されるものではないが、コーラーとミルシュタインが最初に開発したハイブリドーマ技法(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975));トリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72); およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBV−ハイブリドーマ技法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96); などである。本発明のさらなる態様において、モノクローナル抗体は最新の技法を利用して無菌動物で製造することができる(PCT/US90/02545)。本発明によると、ヒト抗体が使用可能で、ヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)またはEBVウイルスによりインビトロでヒトB細胞を形質転換することにより(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)入手し得る。事実、本発明によると、標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とを繋ぐことによる“キメラ抗体”の製造のために開発された技法を使用し得る(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454); かかる抗体は本発明の範囲内にある。
さらに、モノクローナル抗体が有利な場合、ファージディスプレイ技法を用いて大型の抗体ライブラリーから二者択一的に選択し得る(Marks et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:16007-16010)。この技法を使用し、1012までの異なる抗体のライブラリーはfd繊維状ファージの表面に発現され、モノクローナル抗体の選択に利用し得る抗体の“シングルポット”インビトロ免疫系を生じる(Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13:3245-3260)。かかるライブラリーから抗体を選択するには、技術上既知の技法にしたがい、例えば、ファージと固定化標的タンパク質とを接触させること、標的に結合したファージを選択しクローニングすること、および抗体可変領域をコードする配列を、所望の抗体フォーマットを発現する適切なベクターへサブクローニングすることにより実施する。
本発明によると、一本鎖抗体の製造について記載した技法(米国特許第4,946,778号公報)を標的タンパク質に特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることができる。本発明のさらなる態様では、Fab発現ライブラリーの構築について記載した技法(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)を利用して、標的タンパク質に対し所望の特異性をもつモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
抗体フラグメントが標的タンパク質のイディオタイプを含む場合には技術上既知の技法により生成させ得る。例えば、かかるフラグメントは限定されるものではないが以下のとおりである:抗体分子のペプシン消化により製造し得るF(ab')2フラグメント;F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成させ得るFab’フラグメント;抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより生成させ得るFabフラグメント;およびFvフラグメント。
抗体製造において、所望の抗体のスクリーニングは技術上既知の技法、例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)により実施し得る。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するためには、標的タンパク質に結合する抗体について生成したハイブリドーマまたはファージディスプレイ抗体ライブラリーをアッセイし得る。
用語集および定義
以下の定義は本明細書にてしばしば使用される正確な用語の理解を容易にするために提供するものである。
“有意なレベル”:本明細書にて使用する場合、特定の対立遺伝子(例えば、HLA−DRB1*1502)からのmRNAまたはポリペプチド産物の発現レベルに関連して、問題の対立遺伝子が存在したと当業者が信じるに足る発現レベルを意味する。
以下の定義は本明細書にてしばしば使用される正確な用語の理解を容易にするために提供するものである。
“有意なレベル”:本明細書にて使用する場合、特定の対立遺伝子(例えば、HLA−DRB1*1502)からのmRNAまたはポリペプチド産物の発現レベルに関連して、問題の対立遺伝子が存在したと当業者が信じるに足る発現レベルを意味する。
“抗体”:本明細書にて使用する場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、ならびにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントを包含する。
“単離した”:自然状態からヒトの手で変化させたことを意味する。すなわち、それが自然界に存在する場合、その当初の環境から変化したか、または取り出されたか、またはその両方である。例えば、生物体に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは“単離した”ものではなく、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドであっても、その自然状態の共存する物質から分離されたものは“単離した”ものであり、本明細書ではこの用語を採用する。さらに、形質転換、遺伝子操作または他の組換え方法により生物に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえそれが当該生物(生きていてもいなくてもよい)になお存在していたとしても、“単離した”ものである。
“ポリヌクレオチド”:一般的にはポリリボヌクレオチド(RNA)またはポリデオキシヌクレオチド(DNA)をいい、未修飾または修飾したRNAまたはDNAであってもよい。“ポリヌクレオチド”には制限がなく、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合したDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖および二本鎖領域の混合したRNA、DNAとRNAからなる混成分子であって一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の混合物でもよい混成分子などである。さらに、“ポリヌクレオチド”はRNAまたはDNAからなるか、またはRNAとDNAの両方からなる三本鎖領域をいう。“ポリヌクレオチド”という用語は1種以上の塩基を含むDNAまたはRNA、および安定化またはその他の理由で修飾したバックボーンを有するDNAまたはRNAをも包含する。
“修飾した”塩基とは、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの特殊な塩基である。DNAおよびRNAに対しては様々な修飾がなし得る;したがって、“ポリヌクレオチド”とは自然界に一般に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾した形状のもの、ならびにウイルスや細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形状のものを包含する。“ポリヌクレオチド”はまた比較的短いポリヌクレオチド、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ぶヌクレオチドも包含する。
“ポリペプチド”:2個以上のアミノ酸がペプチド結合または修飾ペプチド結合(すなわち、ペプチドアイソスター)により互いに結合しているポリペプチドをいう。“ポリペプチド”は短鎖のもの(一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという)、および長鎖のもの(一般的にタンパク質という)の両者をいう。ポリペプチドは20個の遺伝子エンコードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。“ポリペプチド”は自然の工程、例えば、翻訳後プロセシングなどにより、または技術上周知の化学的修飾技法により修飾したアミノ酸配列も含む。かかる修飾については基礎的教科書およびより詳細な研究論文、ならびに膨大な数の研究文献に記載されている。修飾はポリペプチドのどの場所にも、例えば、ペプチドバックボーン、アミノ酸の側鎖、およびアミノまたはカルボキシ末端でも起こり得る。
同じタイプの修飾が所定のポリペプチドの数ヶ所に同じ程度にまたは様々な程度で存在し得ることは認識し得る。また、所定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐し得るものであり、分枝をもち得る環状であってもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後の自然過程で生じ得るし、あるいは合成方法により調製してもよい。修飾とは、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーRNAが介在するアルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化などである(参照:例えば、タンパク質−構造と分子特性、2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., 翻訳後タンパク質の修飾:展望と慨観、翻訳後タンパク質の共有結合修飾1−12、B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al.,“タンパク質修飾と非タンパク補助因子の分析”、Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, and Rattan et al., “タンパク質合成:翻訳後修飾と加齢”、Ann NY Acad Sci. 663, 48-62, 1992)。
“フラグメント”:ポリペプチド配列のフラグメントは、基準の配列よりも短いが、実質的に基準ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチド配列をいう。
“変異体”:基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その実質的な性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの代表的変異体は基準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列における変化は基準のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を変えるものであってもなくてもよい。ヌクレオチドの変化は以下に考察するように、基準配列がコードするポリペプチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断を生じる。ポリペプチドの代表的変異体はそのアミノ酸配列が基準ポリペプチドと異なる。一般に、変更は、基準ポリペプチドと変異体の配列が全体として密接に類似しており、多くの領域で一致するように制限される。変異体と基準ポリペプチドは1つ以上の置換、挿入、欠失、その組合せによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は遺伝子コードがコードするものであってもなくてもよい。典型的な保存置換はGly、Ala;Val、lie、Leu;Asp、Glu:Asn、Gln−I Ser、Thr;Lys、Arg;およびPheとTyrである。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子などの天然産でもよく、または自然界に存在することの不明な変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然産変異体は変異誘発技法により、または直接合成により調製してもよい。さらに変異体としては、1種以上の翻訳後修飾、例えば、糖鎖形成、リン酸化、メチル化、ADPリボシル化などを有するポリペプチドを包含する。その態様はN末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびスレオニンのリン酸化、およびC末端グリシンの修飾である。
“対立遺伝子(アレル)”:ゲノムの所定の遺伝子座に存在する遺伝子の2種以上の代替形状の一つをいう。
“多型性”:集団内のゲノムの所定位置におけるヌクレオチド配列(およびもし関連するならエンコードされるポリペプチド)の変化をいう。
“多型性”:集団内のゲノムの所定位置におけるヌクレオチド配列(およびもし関連するならエンコードされるポリペプチド)の変化をいう。
“単一ヌクレオチド多型性”(SNP):集団内のゲノムの単一ヌクレオチドの位置におけるヌクレオチドの可変性の発生をいう。SNPは遺伝子内に、またはゲノムの遺伝子間に発生し得る。SNPはアレル特異増幅(ASA)によりアッセイすることができる。この方法には、少なくとも3種のプライマーが必要である。共通のプライマーはアッセイすべき多型性に対して逆の補体として用いる。この共通のプライマーは多型性塩基からの50〜1500bpである。他の2つ(またはそれ以上)のプライマーは互いに同一であるが、ただし、最終3’塩基は多型性を構成する2つ(またはそれ以上)のアレルに対合するようにゆらぐ。2つ(またはそれ以上)のPCR反応は次いでサンプルDNA上で実施し、それぞれ共通のプライマーおよびアレル特異プライマーの一つを使用する。
“スプライスバリアント”:本明細書にて使用する場合、同じゲノムDNA配列から最初に転写されたRNAから産生されるcDNA分子であるが、別のRNAのスプライシングを受けている分子をいう。別のRNAスプライシングは一次RNA転写がスプライシングを受けるときに起こるが、一般にはイントロンの除去のために起こり、結果としてそれぞれが異なるアミノ酸配列をエンコードし得る1つを超えるmRNA分子の産生に至る。スプライスバリアントという用語は上記のcDNA分子がコードするタンパク質をいう。
“同一性”:2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映し、該配列の比較により決定される。一般に、同一性は比較すべき2つのポリヌクレオチド配列または2つのポリペプチド配列につき、その配列の全長にわたって、ヌクレオチドからヌクレオチドまたはアミノ酸からアミノ酸それぞれを正確に対応させることをいう。
“%同一性”:正確な対応のない配列については、“%同一性”を決定し得る。一般に、比較すべき2つの配列を整列させ、配列間に最大の相関が得られるようにする。この場合、整列の度合いを上げるために、一方または両方の配列に“ギャップ”を挿入することがある。%同一性は比較すべき23の配列(いわゆる、グローバルアラインメント)のそれぞれ全長にわたり決定し得るが、これは特に同一のまたは非常に類似している長さの配列にとって適している;またより短い明確な長さ(いわゆる、ローカルアラインメント)についても決定可能であり、これは長さの等しくない配列により適している。
“類似性”:類似性は2つのポリペプチド間の関係性のさらにより複雑な基準である。一般に、“類似性”とは2つのポリペプチド鎖の残基ごとのアミノ酸間の比較を意味するが、(同一性に関して)比較すべき配列のそれぞれ1つについての残基間の対の間の正確な対応のみならず、正確な対応がない場合には、進化に基づき、1つの残基を可能性のある他のものに置換えてみることも考慮すべきである。可能性は関連のある“スコア”を有し、そのスコアから2つの配列の“%同一性”を決定し得る。
2つ以上の配列の同一性と類似性を比較する方法は技術上周知である。したがって、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン9.1にて利用可能なプログラム(Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984; Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA から入手可能)、例えば、プログラム・ベストフィットとギャップ(BESTFIT and GAP)が2つのポリヌクレオチド間の%同一性および2つのポリペプチド配列間の%類似性の決定に使用し得る。ベストフィットはスミスとウオーターマンの“局所相同性”アルゴリズム(Smith and Waterman, J Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981)を使用し、2つの配列間の最良の単一類似性領域を見出す。ベストフィットは長さの異なる2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチドを比較するのに適しており、このプログラムでは短い方の配列が長い方の一部を表すもの推定する。比較に際し、ギャップ(GAP)は2つの配列を整列し、ネードルマンとブンシュのアルゴリズム(Neddleman and Wunsch, J Mol Biol, 48, 443-453, 1970)にしたがって“最大類似性”を見出す。ギャップは略同じ長さの配列を比較するのにより適しており、整列させると全長におよぶことが期待される。
好ましくは、各プログラムに使用するパラメータ“ギャップウエイト”および“長さウエイト”はポリヌクレオチド配列についてはそれぞれ50および3、またポリペプチド配列については12および4である。好ましくは、%同一性および類似性は、比較すべき2つの配列が最適に整列したときに決定される。
配列間の同一性および/または類似性を決定する他のプログラムもまた技術上既知であり、例えば、ブラスト(BLAST)系統のプログラム(Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997; 国立生物工学情報センター(NCBI)(ベセスダ、メリーランド、米国)から入手可能であり、NCBIのホームページ、www.ncbi.nlm.nih.gov、からアクセス可能)およびファスタ(FASTA)(Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 1988, ウィスコンシン配列解析パッケージの一部として入手可能)がある。
好ましくは、ブロサム(BLOSUM)62アミノ酸置換マトリックス(Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992)をポリペプチド配列比較に使用するが、ヌクレオチド配列については、比較の前に先ずアミノ酸配列に翻訳する。
好ましくは、プログラム・ベストフィットは基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の%同一性を決定するために使用する;問題の配列および基準配列は、すでに記載したように、最適に整列させ、プログラムのパラメータはデフォルト値にセットする。
“同一性指標”:候補配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)と基準配列を比較するために使用し得る配列関連性の基準である。したがって、例えば、基準のポリヌクレオチド配列と比較して、0.95の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が基準配列の各100個のヌクレオチド当たり平均5個までの差異を含む点を除き基準配列と同一である。かかる差異は少なくとも1個のヌクレオチドの欠失、置換(転移と転換を含む)、または挿入からなる群より選択される。これらの差異は基準ポリヌクレオチド配列の5’または3’末端位置に、またはこれら末端位置間のいずれかの位置に生じ、基準配列のヌクレオチド内に個々に散在するか、または基準配列内の1個以上の相接する群に散在する。換言すると、基準ポリヌクレオチド配列に比較して、0.95の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、基準配列内の100個のヌクレオチドのいずれについても平均5個までの上記のような欠失、置換もしくは挿入、またはその組合せがあってもよい。同様のことが他の同一性指標の値、例えば、0.96、0.97、0.98および0.99についても必要な変更を加えて適用される。
同様に、ポリペプチドについては、例えば、基準ポリペプチド配列に比較して0.95の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が基準配列の各100個のアミノ酸当たり平均5個までの差異を含み得る点を除き、基準配列と同一である。かかる差異は少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換(保存および非保存置換を含む)、または挿入からなる群より選択される。これらの差異は基準ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に、またはこれら末端位置間のいずれかの位置に生じ、基準配列のアミノ酸内に個々に散在するか、または基準配列内の1個以上の相接する群に散在する。換言すると、基準ポリペプチド配列に比較して、0.95の同一性指標を有するポリペプチド配列を得るためには、基準配列内の100個のアミノ酸のいずれについても平均5個までの上記のような欠失、置換もしくは挿入、またはその組合せがあってもよい。同様のことが他の同一性指標の値、例えば、0.96、0.97、0.98および0.99についても必要な変更を加えて適用される。
ヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数と同一性指標との間の関係は以下の等式にて表すことができる:
na≦Xa−(Xa・I)
ただし、式中、
naはヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数である;
Xaは配列番号1または配列番号3または配列番号2または配列番号4それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である;
Iは同一性指標である;
・は掛け算の記号であり、XaとIの積が非整数であれば、Xaから引き算する前に最も近い整数に切り下げる。
na≦Xa−(Xa・I)
ただし、式中、
naはヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数である;
Xaは配列番号1または配列番号3または配列番号2または配列番号4それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である;
Iは同一性指標である;
・は掛け算の記号であり、XaとIの積が非整数であれば、Xaから引き算する前に最も近い整数に切り下げる。
“相同体”:ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が基準配列に対して高程度の配列関連性を有することを示す技術上使用される一般的用語である。かかる関連性はすでに定義したように、2つの配列間の同一性および/または類似性の程度を決定することにより定量化し得る。この一般用語に入る用語は、“オルソログ”および“パラログ”である。“オルソログ”はポリヌクレオチドまたはポリペプチドが他の種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物をいう。“パラログ”とは機能的に類似である同じ種内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
“融合タンパク質”:2種の無関係の融合遺伝子またはそのフラグメントがコードするタンパク質をいう。例は米国特許第5,541,087および5,726,044号公報(両特許をすべての目的のために参照により本明細書の一部とする)に開示されている。Fc−PGPCR−3の場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンFc領域を採用することが、Fc−PGPCR−3またはPGPCR−3のフラグメントの機能的発現を遂行して、治療に使用する場合のかかる融合タンパク質の薬物動態特性を改善するために、また二量体のFc−PGPCR−3を生成させるために有利である。Fc−PGPCR−3DNA構築物は5’から3’方向に、分泌カセット、すなわち、哺乳動物細胞からの放出の引き金を引くシグナル配列、融合パートナーとしての免疫グロブリンFc領域フラグメントをコードするDNA、およびFc−PGPCR−3またはそのフラグメントをコードするDNAを含有してなる。一部用途において、機能的なFc側を変異させ、一方、融合タンパク質の残り部分には手を着けないか、または発現後にFc部分を完全に除去することにより、固有の機能的性質(相補的結合、Fc−レセプター結合)を変え得るようにすることが望ましい。
方法
1999年8月から2000年8月までの間に発病した急性サルコイドーシスを示す12名の継続性ステロイド感受性症候患者を本潜在研究に含めた。患者と12名の健常対照者は年齢と性別を合わせ、非喫煙者、非アトピー性とし、悪性腫瘍、慢性炎症性疾患またはコルチコステロイドによる処置の前歴のない者とした。参加した対象はすべてアイルランド西部出身ケルト族起源のコーカサス白人種とした。非アトピー状態はその病歴と、ハウスダストダニ、草花粉、ネコとイヌの鱗屑などに対する皮膚プリック誘発に陰性であることにより確認した。無機ダストとの接触、カビおよびミコバクテリア感染を排除した後に、サルコイドーシスの診断は、9名の患者では気管支経由肺生検により、また結節性紅斑と両側肺門リンパ節症を示す3名の患者では気管支肺胞洗浄CD4/CD8比>3.5により組織学的に確認した。Costabel, U. 1992、サルコイドーシスにおけるBAL知見の感受性と特異性、Sarcoidosis 9 (Suppl.1): 211-214; Winterbauer, R., et al. 1993, サルコイドーシスの診断における気管支肺胞洗浄細胞集団、Chest 104:352-361。
1999年8月から2000年8月までの間に発病した急性サルコイドーシスを示す12名の継続性ステロイド感受性症候患者を本潜在研究に含めた。患者と12名の健常対照者は年齢と性別を合わせ、非喫煙者、非アトピー性とし、悪性腫瘍、慢性炎症性疾患またはコルチコステロイドによる処置の前歴のない者とした。参加した対象はすべてアイルランド西部出身ケルト族起源のコーカサス白人種とした。非アトピー状態はその病歴と、ハウスダストダニ、草花粉、ネコとイヌの鱗屑などに対する皮膚プリック誘発に陰性であることにより確認した。無機ダストとの接触、カビおよびミコバクテリア感染を排除した後に、サルコイドーシスの診断は、9名の患者では気管支経由肺生検により、また結節性紅斑と両側肺門リンパ節症を示す3名の患者では気管支肺胞洗浄CD4/CD8比>3.5により組織学的に確認した。Costabel, U. 1992、サルコイドーシスにおけるBAL知見の感受性と特異性、Sarcoidosis 9 (Suppl.1): 211-214; Winterbauer, R., et al. 1993, サルコイドーシスの診断における気管支肺胞洗浄細胞集団、Chest 104:352-361。
すべての患者が6ヶ月目に胸部放射線撮影と肺機能試験などの臨床追跡を受けた。胸部放射線図はシルツバッハ(Silzbach)の分類にしたがって階層化した。参照:Silzbach, L.E. 1967, サルコイドーシス:臨床上の特徴と管理、Med. Clin. N. Am. 51:483。肺気量と拡散能力をセンサーメディックスVmax22シリーズにより測定した。
末梢血単核細胞(PBMC)は基準来診時に採血したヘパリン化全血50mLから勾配遠心分離(フィコールパック(Ficoll Paque; コピーライト)、ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)により分離した。白血球層を注意深く回収し、培地(例えば、市販品として入手可能な商標名AIM Vとして販売されている培地;ライルテクノロジー・ペイスレイ(Paisley)、英国)中で3回洗浄した。細胞ペレットを凍結し、−80℃で保存した。
プローブアレイ・ハイブリダイゼーション実験のために、市販品として入手可能なプローブアレイ(商標名ジェネチップ(GENECHIP;登録商標)プローブアレイとして販売;参照:Duggan, D.J., et al. 1999, cDNAミクロアレイを用いる発現プロフィール、Nature Genetics 21 (Suppl.1): 10-14; DeRisi, J.L. et al. 1996, ヒト癌における遺伝子発現パターンを解析するためのcDNAミクロアレイの使用、Nature Genetics 14:457-460; DeRisi, J.L., et al. 1997, ゲノムスケールでの遺伝子発現の代謝と遺伝子制御の探求、Science 278:680-686: Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーおよび喘息におけるアポトーシスシグナル、Clin Exp Immunol 123(2): 181-187; Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーおよび喘息におけるB細胞イソタイプ制御、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280(4): L627-637)を使用し、PBMCから抽出したRNAを、例えば、商標名スーパースクリプト(SUPERSCRIPT; コピーライト)チョイスシステム(ライフテクノロジー、米国)として販売されている市販品として入手可能なキットを用い、逆転写した。次いで、cDNAをインビトロで転写した;その際、商標名バイオアレイ(登録商標)ハイイールド(BIOARRAY High Yield)RNA転写物標識キット(エンゾー(Enzo)米国)として販売されている市販品として入手可能なキットを用い、ビオチン標識cRNAを形成した。市販品として入手可能な商標名ジェネチップ(GENECHIP;登録商標)プローブアレイ(12.6kアフィメトリックス(Affymetrix))として販売されているプローブアレイに対するプローブハイブリダイゼーション、洗浄、染色および走査は、製造業者(アフィメトリックス(Affymetrix))の指示書にしたがって実施した。発現の変化した特異遺伝子の確認検査のために、確認検査実験を実時間RT−PCRにより実施した;その際、商標名タックマン(TAQMAN; 登録商標)として販売されている市販品として入手可能なキット(タックマン(TaqMan)逆転写試薬キットPEアプライドバイオシステムズ;フォスターシティ、カナダ)を使用した。
クラスII HLA−DR分子に対するタンパク質レベルでのHLAハプロタイプの確認検査実験は、生検で証明されたか、または臨床放射線学的特徴をもつ103人の患者と105人の健常対照者について、潜在症例−制御関連研究において実施した。末梢血4mlを、3.2%クエン酸を容れたチューブに引き抜いた。血清学的分類は標準的リンパ球毒性技法、例えば、商標名HLAクラスIIダイナビーズ(Dynabeads; 登録商標)(210.03ダイナル(Dynal)AS、オスロ、ノルウェー)およびHLA−DRトレイ(ゲン・トラック・インク(Gen Trak. Inc.)、リバティ、ノースカロライナ、米国)として販売されている市販品として入手可能なキットを採用して実施した。
データ解析と探索のために、我々は商標名ジーンスプリング(GENE SPRINGTM)(バージョン4.0.0、シリコンジェネティックス)およびSPSS(登録商標)(v10.02、SPSSインク)として販売されている市販品として入手可能なデータ解析ソフトウエアパッケージを使用した。サルコイドーシス患者と健常対照者間の2群の遺伝子発現比較はマン−ホットニー(Mann-Whitney)Uテストを使用して実施した。Clin Exp Immunol 123(2): 181-187; Brutsche, M.H., et al. 2001, アトピーと喘息におけるB細胞イソタイプ制御、Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280(4): L627-637。p値<0.05の場合のみ、3群、すなわち、健常対照、I型サルコイドーシスおよびII&III型サルコイドーシス患者についての比較、また他の2群、すなわち、2つの表現型間の比較を実施した。肺機能パラメータ(DLCO、FEV1、FVC)と遺伝子発現の相関はスピーマン(Speaman)ランク相関により解析した。ジーンチップ(登録商標)実験とタックマン(登録商標)による試験結果の相関はピアソン(Pearson)相関により実施した。簡便な有意水準を0.05としたが、有意試験が多数に及んだため、慎重な解釈が必要であった。
結果
患者の臨床上の特徴を表6に示す。
患者の臨床上の特徴を表6に示す。
I型サルコイドーシスと結節性紅斑を示す7人の患者については、すべてが追跡で完全に疾患の退行した自己限定性疾患であった。当初間質性肺疾患(II&III型)を示した5人の患者については、すべてが免疫抑制療法を必要とし、当初評価で2人、また追跡で3人が進行性疾患によるものであった。
12’626の遺伝子と発現した試験配列タグの内、4’152(32.8%)は、20%を超えるプローブに発現されることが判明した。遺伝子発現は表現型間でよく相関した(R2乗0.97、p<0.001)。サルコイドーシス患者と対照間の有意差のある発現レベルは、それぞれ1’860(14.9%)および729(5.8%)の遺伝子産物について、p=0.05およびp=0.01のレベルで確認された。
サルコイドーシスの病因に関連する介在経路における遺伝子の発現結果を以下に要約する。
HLAクラスII分子に対する抗原プロセシング:我々は対照に比較して、患者でのカテプシン遺伝子L、SおよびZの一貫したアップレギュレーションを見出した。
抗原提示:健常対照対象の8/12(67%)がHLA−DRB1*1502陽性であった。自己限定性疾患患者はいずれもHLA−DRB1*1502陽性ではなかったが、持続性疾患の患者はすべて陽性であった。対照に比較し、II&III型疾患の患者におけるT−細胞レセプターアルファ鎖C領域の発現には有意なダウンレギュレーションがあった。
HLAクラスII分子に対する抗原プロセシング:我々は対照に比較して、患者でのカテプシン遺伝子L、SおよびZの一貫したアップレギュレーションを見出した。
抗原提示:健常対照対象の8/12(67%)がHLA−DRB1*1502陽性であった。自己限定性疾患患者はいずれもHLA−DRB1*1502陽性ではなかったが、持続性疾患の患者はすべて陽性であった。対照に比較し、II&III型疾患の患者におけるT−細胞レセプターアルファ鎖C領域の発現には有意なダウンレギュレーションがあった。
共刺激:共刺激遺伝子CD40Lの発現は対照に比較し患者で有意にダウンレギュレーションを受けた。共刺激分子CD28、CD80およびCD86の発現に差はなかった。
T−細胞活性化:CD71(トランスフェリンレセプター)は最新のT−細胞活性化と矛盾なくすべての患者でアップレギュレーションを受けていた。より強いT−細胞活性化が持続性疾患の患者に見出され、CD69がこれらの患者においてアップレギュレーションを受けていた。CD27遺伝子は対照に比較し、すべての患者でダウンレギュレーションを受けていた。INF−ガンマ、IL2およびIL2RB鎖レセプター遺伝子の発現に差はなかった。
T−細胞活性化:CD71(トランスフェリンレセプター)は最新のT−細胞活性化と矛盾なくすべての患者でアップレギュレーションを受けていた。より強いT−細胞活性化が持続性疾患の患者に見出され、CD69がこれらの患者においてアップレギュレーションを受けていた。CD27遺伝子は対照に比較し、すべての患者でダウンレギュレーションを受けていた。INF−ガンマ、IL2およびIL2RB鎖レセプター遺伝子の発現に差はなかった。
転写因子:NFKBとCREMの発現はII&III型疾患の患者で有意にアップレギュレーションを受けていた。
エフェクター細胞活性化:単球およびマクロファージが主に発現分泌するIL1およびIL8遺伝子の発現は、サルコイドーシス患者において首尾一貫してアップレギュレーションを受けていた。同様に、TNF−アルファ発現はII&III型サルコイドーシス患者でアップレギュレーションを受けていた。B−細胞由来免疫グロブリン遺伝子の発現は、アップレギュレーションを受けた免疫グロブリン−GとFc−ガンマ−レセプター、およびダウンレギュレーションを受けた免疫グロブリン−Eと高親和性Fc−イプシロンRIレセプターを示し、IgG1 B−細胞イソタイプが優位にあることを暗示していた。
エフェクター細胞活性化:単球およびマクロファージが主に発現分泌するIL1およびIL8遺伝子の発現は、サルコイドーシス患者において首尾一貫してアップレギュレーションを受けていた。同様に、TNF−アルファ発現はII&III型サルコイドーシス患者でアップレギュレーションを受けていた。B−細胞由来免疫グロブリン遺伝子の発現は、アップレギュレーションを受けた免疫グロブリン−GとFc−ガンマ−レセプター、およびダウンレギュレーションを受けた免疫グロブリン−Eと高親和性Fc−イプシロンRIレセプターを示し、IgG1 B−細胞イソタイプが優位にあることを暗示していた。
細胞転移と接着:ケモカインレセプター遺伝子複合体CCR2/CCR5/CCR6およびGROベータとガンマ遺伝子は有意に、特にI型疾患患者でアップレギュレーションを受けていた。II&III型疾患においてはより高い発現可変性のために、GROベータとガンマ遺伝子のアップレギュレーションが統計的な有意性に達しなかった。ケモカインMCPの発現は対照と比較して変化がなかった。測定した接着分子の中、ニンジュリン、インテグリンベータ−5およびアルファ−3、ならびにCD11b(CCR3)はアップレギュレーションを受けた。
増殖因子:エンドセリン−1、血小板由来増殖因子−1およびメタロプロティナーゼ組織インヒビター(TIMP1)−1遺伝子の発現は、I型疾患の患者で有意にアップレギュレーションを受けていたが、II&III型疾患においてはその傾向があるのみであった。ヘパリン結合エンドセリン増殖因子と血管エンドセリン増殖因子は高レベルで発現するのみならず、肺機能で測定した疾患の重症度と相関した。
免疫応答に関るメカニズム:アポトーシス阻害遺伝子Bcl−2およびBfl−1はアップレギュレーションを受けており、アポトーシス死前ドメイン・レセプター−3と抗Fas誘導アポトーシス遺伝子はダウンレギュレーションを受けていた。この一群は正味の抗アポトーシスの状況と矛盾しない。制御サイトカインIL10とTGF−ベータの発現は対照と比較してもサルコイドーシス患者で変わりがなかった。TGF−ベータレセプター遺伝子の発現はすべての患者で有意に減少しており、IL10レセプター遺伝子の発現はII&III型疾患患者で減少していた。
確認検査実験TAQMAN(登録商標)
潜在症例−制御クラスII HLA−DRアレルの関連性研究(データは下記表8に示す):患者103名の内の46名(45%)、および対照105名の内の28名(27%)はHLA DR2(HLA DRB1*15/16)陽性であった。HLA DR2(HLA DRB1*15/16)は予後不良と関連があった。診断の2年以内に疾患の退行のあった6名の患者(21%)のみ、診断後2年以上疾患が活性の患者22名(47%)に比較して、HLA DR2(HLA DRB1*15/16)陽性であった。
潜在症例−制御クラスII HLA−DRアレルの関連性研究(データは下記表8に示す):患者103名の内の46名(45%)、および対照105名の内の28名(27%)はHLA DR2(HLA DRB1*15/16)陽性であった。HLA DR2(HLA DRB1*15/16)は予後不良と関連があった。診断の2年以内に疾患の退行のあった6名の患者(21%)のみ、診断後2年以上疾患が活性の患者22名(47%)に比較して、HLA DR2(HLA DRB1*15/16)陽性であった。
[表8]
RNAレベルをRT−PCRにより測定した。RNAの最初の量に標準化するために、ベータアクチンを基線として用いた(ベータアクチンのRNAレベルが一定であるという仮定に基づく)。比はサンプル中ベータアクチンに対して報告されたHLA−DR2−Dw12の量を表す。ND:検出されず。
RNAレベルをRT−PCRにより測定した。RNAの最初の量に標準化するために、ベータアクチンを基線として用いた(ベータアクチンのRNAレベルが一定であるという仮定に基づく)。比はサンプル中ベータアクチンに対して報告されたHLA−DR2−Dw12の量を表す。ND:検出されず。
考察
末梢血についてのこの高密度遺伝子アレイ法により、健常個体と急性発症肺サルコイドーシス患者との間の遺伝子発現に明瞭な差異のあることが証明できる。この知見は抗原−プロセシング/提示、T−リンパ球の活性化、エフェクター細胞(Bリンパ球、単球)の活性化、細胞転移と組織改造作用などの増大を、炎症関与メカニズムの変化と共に示すものである。
末梢血についてのこの高密度遺伝子アレイ法により、健常個体と急性発症肺サルコイドーシス患者との間の遺伝子発現に明瞭な差異のあることが証明できる。この知見は抗原−プロセシング/提示、T−リンパ球の活性化、エフェクター細胞(Bリンパ球、単球)の活性化、細胞転移と組織改造作用などの増大を、炎症関与メカニズムの変化と共に示すものである。
さらに、これらの結果は自己制限疾患型の患者に比較して、進行性のサルコイドーシス患者間に特別の差があることを証明している。とりわけ、HLA−DRB1*1502陽性は、慢性かつより重症の疾患、免疫抑制療法の必要性、および予後不良と関連があった。逆に、HLA−DRB1*1502を発現しない患者はすべて6〜12ヶ月以内に完全な自発的疾患退行を示したが、このことは抗原提示の差が免疫応答を変え得ること、いずれも急性期に発赤を生じさせ、HLA−DRB1*1502の存在しない場合には自発的に応答が鎮まるか、または存在する場合には免疫応答がより低く慢性型となることを示唆している。103名のサルコイドーシス患者による潜在関連研究において、疾患の罹病性における、また成果の乏しい予測因子としてのHLA−DR2(HLA−DRB1*15/16)の重要性が確認された。
自己制限サルコイドーシス患者における免疫系の差別的活性化の存在を強調するもにはI型疾患におけるより顕著にアップレギュレーションを受けたIL1Bおよびケモカイン/レセプター(GRO−ベータ/−ガンマ、CCR2/5/6),ならびにII&III型サルコイドーシス患者におけるT−リンパ球活性化のより明白なマーカーおよびアップレギュレーションを受けた転写因子NFKBとCREMがある。ノックアウトマウスモデルはTh1−特異的遅延型過敏性反応に対するNFKBの重要性を示している;参照:Aronica M.A., et al. 1999, 1型にはあるが、2型にはないT細胞依存性インビボ免疫応答におけるNF−カッパB/ReIシグナル伝達に対する優先的役割、J. Immunol. 63:5116-5124; サルコイドーシスに観察される場合。これらの知見は抗原除去のための免疫応答に対応し、I型疾患ではそれがよりエフェクター細胞に基づいており、一方、II&III型疾患はT−ヘルパーリンパ球の活性化により依存し、より顕著な慢性的遅延型過敏性反応を示す。
引用文献
すべての出版物および参照文献は、限定されるものではないが、本明細書に引用された出版物、特許、特許出願、ジェンバンク寄託番号、ユニジーン・クラスター番号およびタンパク質寄託番号を含め、これら全文を参照により本明細書の一部とする。それぞれの出版物または参照文献は具体的かつ個々にそれが発表された完全なものとして参照により本明細書の一部とすることを示していたものとする。本出願が優先権を要求するいずれの特許出願も、出版物および参照文献について上に記載した様式同様に、その全文を参照により本明細書の一部とする。
すべての出版物および参照文献は、限定されるものではないが、本明細書に引用された出版物、特許、特許出願、ジェンバンク寄託番号、ユニジーン・クラスター番号およびタンパク質寄託番号を含め、これら全文を参照により本明細書の一部とする。それぞれの出版物または参照文献は具体的かつ個々にそれが発表された完全なものとして参照により本明細書の一部とすることを示していたものとする。本出願が優先権を要求するいずれの特許出願も、出版物および参照文献について上に記載した様式同様に、その全文を参照により本明細書の一部とする。
本発明は本明細書に記載した特定態様の用語に限定されるものではなく、本発明の個々の側面の単なる説明を意図したものである。本発明の多くの修飾および変更は当業者に自明のようにその精神と範囲を逸脱せずに実施し得るものである。本発明の範囲内において機能的に等価の方法および装置類は、本明細書に列挙したものに加えて、本明細書の記載とその添付の図面から当業者には自明である。かかる修飾および変更も添付の請求項の範囲に包含されるものとする。本発明は添付の請求項によってのみ制限されるものであり、かかる請求項はその等価の全範囲についても権利を有する。
Claims (70)
- サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から生体サンプルを採取すること、
(b)当該サンプル中の遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、
(c)該遺伝子HLA−DRB1*1502が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければI型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればII&III型サルコイドーシスであると同定する、
ことを特徴とする方法。 - サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から生体サンプルを採取すること、
(b)当該サンプル中の遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するポリペプチド産物の発現レベルを検出すること、
(c)該遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するポリペプチド産物が当該生体サンプル中に有意のレベルで発現されているかを判定し、その場合に、当該遺伝子の有意なレベルでの発現がなければI型サルコイドーシスであると同定し、当該遺伝子の有意なレベルでの発現があればII&III型サルコイドーシスであると同定する、
ことを特徴とする方法。 - 生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、CSF、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項1または2記載の方法。
- 生体サンプルが、組織生検細胞サンプルまたはその培養細胞である請求項3記載の方法。
- サンプルが当該細胞サンプルの溶解液である請求項4記載の方法。
- ポリペプチドの存在を該ポリペプチドと特異的に結合する試薬により検出する請求項2記載の方法。
- 試薬が、抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントからなる群より選択される請求項6記載の方法。
- 患者のサルコイドーシスがI型であるかまたはII&III型であるかの判定に使用するテストキットであって、該生体サンプルとの接触に適した容器中に請求項6または7記載の試薬を含んでなるテストキット。
- 試薬が抗体を含んでなり、その場合に該抗体が請求項2記載の遺伝子発現産物に対応するポリペプチドと特異的に結合するものである請求項8記載のテストキット。
- 遺伝子HLA−DRB1*1502がコードするポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項2記載の方法。
- 標識化プローブが抗体である請求項10記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項11記載の方法。
- mRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、実時間定量PCR、RNアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項1記載の方法。
- サルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、
(a)該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、
(b)表2、3、4または5に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、
(c)対象から1種以上の投与後サンプルを採取すること、
(d)投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出すること、
(e)投与前サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルとを比較すること、および
(f)それに応じて作用物質の投与を調節すること、
を特徴とする方法。 - サルコイドーシスを有する対象またはサルコイドーシスの発症する危険のある対象の作用物質による処置の有効性をモニターする方法であって、
(a)該作用物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取すること、
(b)表2または4に記載した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、
(c)対象から1種以上の投与後サンプルを採取すること、
(d)投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、
(e)投与前サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと投与後サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較すること、および
(f)それに応じて作用物質の投与を調節すること、
を特徴とする方法。 - サルコイドーシスの処置に使用する作用物質の同定方法であって、
(a)サルコイドーシスの疑いのある対象から採取した生体サンプルを候補作用物質と接触させること、
(b)該サンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出すること、その場合の遺伝子が表2、3、4または5に記載した遺伝子からなる群より選択される遺伝子であること、
(c)候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルと、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルとを比較し、その場合に、候補作用物質不存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルに比例して、候補作用物質存在下のサンプル中の少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが変化し、それがサルコイドーシスの処置に有用な作用物質を示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項16記載の方法。
- 標識化プローブが抗体である請求項17記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項18記載の方法。
- 作用物質が小型分子からなる群から選択される請求項16記載の方法。
- サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、CSF、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項21記載の方法。
- 工程(a)および(b)におけるmRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、実時間定量PCR、RNアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項21記載の方法。
- サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 生体サンプルが、組織生検、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、のう胞液、尿、CSF、喀痰、または気管支吸引物からなる群より選択される請求項24記載の方法。
- 工程(a)および(b)におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項24記載の方法。
- プローブが抗体である請求項24記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項27記載の方法。
- サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるmRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、および実時間定量PCRからなる群より選択される技法により検出する請求項29記載の方法。
- サルコイドーシスの対象またはサルコイドーシスの発症の危険のある対象をスクリーニングする方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表5に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がサルコイドーシスに罹患しているか、サルコイドーシスを発症する危険のあることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項31記載の方法。
- プローブが抗体である請求項32記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項33記載の方法。
- サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるmRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、および実時間定量PCRからなる群より選択される技法により検出する請求項35記載の方法。
- サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表2に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が大きい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項37記載の方法。
- プローブが抗体である請求項38記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項39記載の方法。
- サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるmRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、および実時間定量PCRからなる群より選択される技法により検出する請求項41記載の方法。
- サルコイドーシスを有する対象の疾患タイプを判定するスクリーニング方法であって、
(a)該対象から採取した生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第一値を得ること、
(b)未罹患対象から採取した同様の生体サンプル中の表3に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出して、第二値を得ること、および
(c)第一値と第二値とを比較し、その場合に第二値に比例して第一値が小さい場合、該対象がII&III型サルコイドーシスに罹患していることを示唆するものであること、
を特徴とする方法。 - 工程(a)および(b)におけるポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項43記載の方法。
- プローブが抗体である請求項44記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項45記載の方法。
- サルコイドーシスの処置方法であって、かかる処置の必要な対象に、表1、2、3または4に示した遺伝子の1種以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物を投与し、サルコイドーシスの少なくとも1つの症候を改善することを特徴とする方法。
- 化合物が、アンチセンス分子、二本鎖RNA、リボザイム、小型分子化合物、抗体または抗体フラグメントからなる群より選択される請求項20記載の方法。
- サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2または4に示した少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも1つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法。
- サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患する危険のある対象のサルコイドーシスの進行状況をモニターする方法であって、該対象から採取した生体サンプル中の表2または4に示した遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを経時的に測定することからなり、その場合に、少なくとも1つの遺伝子のmRNAの発現レベルが経時的に上昇しているならば、該対象のサルコイドーシスが進行していることを示唆するものであるとすることを特徴とする方法。
- mRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、実時間定量PCR、RNアーゼ保護アッセイおよびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項50記載の方法。
- 少なくとも一つの遺伝子が、ヒトNF−カッパ−B転写因子p65サブユニット(NFKB)、ヒトサイクリックAMP−応答要素モジュレーターmRNA(CREM)、ヒトサイクリックAMP−応答要素モジュレーター・ベータイソタイプS68134(CREM、ベータイソタイプ)、ヒトCD69遺伝子(CD69)からなる群より選択される請求項50記載の方法。
- 少なくとも一つの遺伝子が、ヒトT−細胞レセプター・アルファ鎖C領域およびヒトインターロイキン−10レセプターmRNAからなる群より選択される請求項50記載の方法。
- サルコイドーシスに罹患しているかまたは罹患した疑いのある患者の処置方法であって:1)該患者から採取した生体サンプル中の表2または表3に示した遺伝子から選択される1種以上の遺伝子の遺伝子発現に対応するmRNAの発現レベルまたは該遺伝子がコードするポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを定量すること;2)このレベルまたはレベルのパターンと、正常対照者または既知タイプの疾患患者のレベルとを比較すること;および3)その結果、該患者のレベルまたはレベルのパターンがII&III型サルコイドーシスであるとされた患者を免疫抑制療法により処置すること;を特徴とする方法。
- 遺伝子がHLA−DRB1*1502(ヒトMHCクラスII HLA−DR2−Dw12mRNA DQw1−ベータ;ジェンバンク寄託番号M16276)である請求項54記載の方法。
- 免疫抑制療法が、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリン、クロランブシル、またはシクロホスファミドからなる群より選択される請求項55記載の方法。
- 免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、1〜100mg/kg/日の範囲の投与量で処置することからなる請求項56記載の方法。
- 免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、2〜50mg/kg/日の範囲の投与量で処置することからなる請求項56記載の方法。
- 免疫抑制療法が、シクロスポリンにより、3〜20mg/kg/日の範囲の投与量で処置することからなる請求項56記載の方法。
- 遺伝子HLA−DRB1*1502に対応するmRNAの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
- 表2、3、4または5に示された少なくとも一つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
- サルコイドーシス患者がI型であるかまたはII&III型であるかを同定するためのキットであって、表2または3に示された少なくとも一つの遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを検出するための手段を含有してなるキット。
- mRNAの発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写PCR、実時間定量PCR、RNアーゼ保護およびミクロアレイからなる群より選択される技法により検出する請求項60ないし62記載の方法。
- 遺伝子HLA−DRB1*1502がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
- 表2、3、4または5に示された少なくとも一つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるサルコイドーシス患者同定用キット。
- サルコイドーシス患者がI型であるかまたはII&III型であるかを同定するためのキットであって、表2または3に示された少なくとも一つの遺伝子がコードするポリペプチドの発現レベルを検出するための手段を含有してなるキット。
- ポリペプチドの発現レベルを、該ポリペプチドに特異的な標識化プローブの利用により、ウエスタンブロッティングを介して検出する請求項64または66記載のキット。
- 標識化プローブが抗体である請求項67記載のキット。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項68記載のキット。
- さらに対象から生体サンプルを採取する手段を含有してなる請求項60ないし69記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33426401P | 2001-11-29 | 2001-11-29 | |
PCT/EP2002/013448 WO2003046578A2 (en) | 2001-11-29 | 2002-11-28 | Method for the assessment and prognosis of sarcoidosis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005510251A true JP2005510251A (ja) | 2005-04-21 |
JP2005510251A5 JP2005510251A5 (ja) | 2006-01-19 |
Family
ID=23306395
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003547966A Pending JP2005510251A (ja) | 2001-11-29 | 2002-11-28 | サルコイドーシスの評価法と予後判定法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050032062A1 (ja) |
EP (1) | EP1454145A2 (ja) |
JP (1) | JP2005510251A (ja) |
AU (1) | AU2002364277A1 (ja) |
WO (1) | WO2003046578A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006292595A (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-26 | Chiba Univ | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
JP2010175544A (ja) * | 2010-02-15 | 2010-08-12 | Chiba Univ | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ577564A (en) * | 2003-12-05 | 2010-04-30 | Bioinvent Int Ab | Angiogenesis affecting polypeptides, proteins, and compositions, and methods of use thereof |
WO2006017156A2 (en) * | 2004-07-09 | 2006-02-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for identifying a candidate for treatment of obesity |
WO2010151599A1 (en) * | 2009-06-23 | 2010-12-29 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Human leukocyte antigen alleles associated with advanced lung diseases |
WO2011044508A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-04-14 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Biomarkers for prognoses of pulmonary diseases |
EP2600901B1 (en) | 2010-08-06 | 2019-03-27 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
CN104531671A (zh) | 2010-10-01 | 2015-04-22 | 现代治疗公司 | 设计核酸及其使用方法 |
CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
EP3682905B1 (en) | 2011-10-03 | 2021-12-01 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
ES2923757T3 (es) | 2011-12-16 | 2022-09-30 | Modernatx Inc | Composiciones de ARNm modificado |
AU2013243953A1 (en) | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
JP5574348B2 (ja) * | 2012-05-31 | 2014-08-20 | 国立大学法人 千葉大学 | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
DK2922554T3 (en) | 2012-11-26 | 2022-05-23 | Modernatx Inc | Terminalt modificeret rna |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
WO2015051214A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
US10781489B2 (en) | 2015-03-04 | 2020-09-22 | Wayne State University | Systems and methods to diagnose sarcoidosis and identify markers of the condition |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994014067A1 (en) * | 1992-12-14 | 1994-06-23 | T Cell Sciences, Inc. | Diagnosis and therapy of sarcoidosis |
-
2002
- 2002-11-28 EP EP02799048A patent/EP1454145A2/en not_active Withdrawn
- 2002-11-28 AU AU2002364277A patent/AU2002364277A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-28 JP JP2003547966A patent/JP2005510251A/ja active Pending
- 2002-11-28 WO PCT/EP2002/013448 patent/WO2003046578A2/en active Application Filing
- 2002-11-28 US US10/497,349 patent/US20050032062A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006292595A (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-26 | Chiba Univ | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
JP4512828B2 (ja) * | 2005-04-12 | 2010-07-28 | 国立大学法人 千葉大学 | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
JP2010175544A (ja) * | 2010-02-15 | 2010-08-12 | Chiba Univ | 肺サルコイドーシスおよび眼サルコイドーシスの検出マーカー及び検出キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002364277A8 (en) | 2003-06-10 |
AU2002364277A1 (en) | 2003-06-10 |
WO2003046578A3 (en) | 2004-03-25 |
EP1454145A2 (en) | 2004-09-08 |
US20050032062A1 (en) | 2005-02-10 |
WO2003046578A2 (en) | 2003-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005510251A (ja) | サルコイドーシスの評価法と予後判定法 | |
US11578367B2 (en) | Diagnosis of sepsis | |
Suzuki et al. | Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis | |
JP5912097B2 (ja) | 自己免疫性疾患を検出するための方法及び組成物 | |
Prots et al. | Association of the IL4R single‐nucleotide polymorphism I50V with rapidly erosive rheumatoid arthritis | |
US20030064385A1 (en) | Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets | |
KR20110057188A (ko) | 바이오마커 프로파일 측정 시스템 및 방법 | |
PT2327792E (pt) | Métodos e composições para a detecção de distúrbios autoimunes | |
JP2005510251A5 (ja) | ||
CN111876478A (zh) | 肺结节诊断标志物及应用 | |
Juuti-Uusitalo et al. | cDNA microarray analysis of gene expression in coeliac disease jejunal biopsy samples | |
US20080286876A1 (en) | GENES ASSOCIATED WITH ALZHEIMER'S DISEASE - Hltdip | |
Sombekke et al. | Analysis of multiple candidate genes in association with phenotypes of multiple sclerosis | |
Gillett et al. | Interleukin 18 receptor 1 expression distinguishes patients with multiple sclerosis | |
US20070141618A1 (en) | Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets | |
JP2006524803A (ja) | カルシウムタンパク質の測定に基づく骨転移の発生見込みの評価方法 | |
CN101525658B (zh) | 强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒 | |
JP4503531B2 (ja) | ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプivの利用方法 | |
JP7411988B2 (ja) | Ham/tsp発症リスク判定方法 | |
JP2010261920A (ja) | 2型糖尿病診断剤 | |
US20150191786A1 (en) | Genetic Polymorphisms Associated With Advanced Lung Diseases | |
JP2007082458A (ja) | 2型糖尿病の診断方法 | |
Mescheriakova et al. | Genetics of multiple sclerosis | |
JP2008228646A (ja) | 2型糖尿病診断剤 | |
WO2023060245A1 (en) | Methods for predicting drug responsiveness in heart failure subjects |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051128 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080902 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090224 |