JP7411988B2 - Ｈａｍ／ｔｓｐ発症リスク判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法に関する。
ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ；ＨＴＬＶ－１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）又は熱帯性痙性麻痺（ＴＳＰ；Ｔｒｏｐｉｃａｌ ｓｐａｓｔｉｃ ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）（ＨＡＭ／ＴＳＰ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）の感染に伴い脊髄に慢性的な炎症が起こる指定難病の一つである。このＨＴＬＶ－１感染者は日本国内に少なくとも１００万人以上存在すると推測されるが、ＨＡＭ／ＴＳＰの生涯発症率は０．２５％程度である。ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患は、ＨＡＭ／ＴＳＰ以外にも成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ、生涯発症率５％）等様々存在するが、何故一部の人のみＨＡＭ／ＴＳＰを発症するかの機序の詳細は未解明である。
近年、ＨＡＭ患者を対象としたヒト化抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体（モガムリズマブ）の第１／２ａ相試験により、モガムリズマブ投与によるＨＴＬＶ－１感染細胞の減少及び運動障害の改善効果が認められた（非特許文献１：Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１８参照）。特に、発症早期（１０年以内）にモガムリズマブを投与することで、それ以後に投与する群に比べて運動障害の改善効果が高く、早期の治療開始が重要であることが分かった。しかし、ＨＡＭ／ＴＳＰは診断による疾患の特定そのものが難しく、疾患を深く理解した専門医による診察を必要とするため、発症から診断にいたるまでに平均で７．６年もの長い期間を要することが日本全国を対象にした疫学調査により判明している（非特許文献２：Ｃｏｌｅｒ－Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．，２０１６参照）。また、４０代での発症が多いというように、ウイルスが感染してから長い潜伏期間を要することも経過観測を困難にしている原因である。これらがＨＡＭ／ＴＳＰの治療開始を遅らせる要因となり、治療薬の効果が低減してしまうという問題が生じている。そのため、より早期にＨＡＭ／ＴＳＰの発症を正確かつ迅速に診断することが強く望まれている。
一方、免疫制御機構の異常が関与するＨＡＭ／ＴＳＰでは、免疫応答に関わる重要な遺伝子であるＨＬＡが発症の感受性遺伝子として知られている。そして、感受性ＨＬＡアレルの存在は報告されていたが（非特許文献３：Ｕｓｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． １９８８参照）、検体数の少ない疫学調査による結果しか得られていない。また、旧来型の血清学的ＨＬＡタイピング技術を用いているため、アレル同定精度が低い上、遺伝子の塩基配列が得られないため、疾患発症リスクに関連する変異の同定が不可能であった。変異の同定には、ＤＮＡタイピング法とよばれる遺伝子配列を決定してＨＬＡをタイピングする方法が必要とされる。しかしながら、現在商用タイピングサービスで主流な手法としてＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ（ＰＣＲ－ＳＳＯＰ）法が用いられているが、この手法は遺伝子配列の一部しかわからない上非常に高コストとなるという不都合がある。
Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１８
Ｃｏｌｅｒ－Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．，２０１６
Ｕｓｕｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．，１９８８
このようなＨＬＡ解析の難しさがある中、本発明は、ＨＴＬＶ－１感染者におけるＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクの迅速かつ正確な推定手法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明者らは、大規模な検体における無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者の主要ＨＬＡ遺伝子配列を解析し、遺伝子上の感受性変異を同定できれば、正確なＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクを推定でき、迅速な診断への応用が期待できると考え、研究を進めた。その結果、無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者の主要ＨＬＡ遺伝子の配列を決定し、発症・無症候性との間で比較解析することで、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症において感受性及び抵抗性（防御性）のアミノ酸残基を同定することに成功した。同定したこれらのアミノ酸残基と発症との関連性は、従来から発症リスクの一つとされてきた末梢血単核細胞中のＨＴＬＶ－１感染率（プロウイルス量）には依存せず、上記アミノ酸残基は、新たな発症リスクの要因として有益なバイオマーカーとなり得ることが明らかとなった。特に、感受性アミノ酸残基のホモ接合体保有者における発症オッズ比は、ヘテロ接合体と比べて極めて高いため、多段階の発症リスク予測も可能となった。
さらに、本発明においては、京都大学で開発された主要ＨＬＡ遺伝子配列決定用のＰＣＲプライマー（特開２０１８－１３００３６号公報）とタイピングアルゴリズム（特開２０１８－１０８０４２号公報）を用いることで、ＨＬＡの配列を迅速にシークエンスし高精度にタイピングすることで本発明の同定精度を向上している。即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］ＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［２］ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする、［１］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［３］ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする、［２］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［４］ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する、［３］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［５］ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する、［３］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［６］さらにＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量を同時に指標とすることを特徴とする、［１］から［５］のいずれかに記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［７］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を特定する工程を含む、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［８］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基を特定する工程を含む、［７］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［９］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程を含む、［８］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［１０］さらに、（Ｂ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定し、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する工程を含む、［９］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［１１］さらに、（Ｃ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンもしくはロイシンであるかの情報に加えてプロウイルス量の値をもとに、ＨＡＭ／ＴＳＰの発症リスクの高低を判定する工程を含む、［１０］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［２］ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする、［１］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［３］ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする、［２］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［４］ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する、［３］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［５］ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する、［３］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［６］さらにＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量を同時に指標とすることを特徴とする、［１］から［５］のいずれかに記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［７］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を特定する工程を含む、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［８］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基を特定する工程を含む、［７］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［９］（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程を含む、［８］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［１０］さらに、（Ｂ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定し、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する工程を含む、［９］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
［１１］さらに、（Ｃ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンもしくはロイシンであるかの情報に加えてプロウイルス量の値をもとに、ＨＡＭ／ＴＳＰの発症リスクの高低を判定する工程を含む、［１０］に記載のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法。
本発明によると、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクの判定が可能となった。それにより、ＨＡＭ／ＴＳＰの高発症リスク群を特定できるため、発症の迅速かつ正確な予測、専門医の紹介や定期診断といったヘルスケアに活用することができ、早期治療開始が可能となる。また、本発明は、別の発症リスクマーカーであるプロウイルス量の測定結果と組み合わせることでさらに高精度な発症リスク測定法へと拡張することも可能である。
以下、本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法について詳細に説明する。なお、本明細書における分子生物学的実験は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
＜ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法＞
本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法は、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする。このような特定の位置のアミノ酸残基としては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基であることが好ましく、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基であることがより好ましい。具体的には、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定し、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定することができる。本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法は、さらにＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量を指標とすることにより、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法の確度を向上させることができる。
本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法は、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とする。このような特定の位置のアミノ酸残基としては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基であることが好ましく、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基であることがより好ましい。具体的には、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定し、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定することができる。本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法は、さらにＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量を指標とすることにより、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法の確度を向上させることができる。
［ＨＴＬＶ－１感染者］
ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）は、ヒトのリンパ球に潜在感染し、授乳や性交渉等を介して伝搬する。ＨＴＬＶ－１の感染者は日本全国に約１００万人いるといわれており、その大多数はＨＴＬＶ－１感染に伴う病気を発症することなく、生涯を過ごすが、一部の人では、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ；ＨＴＬＶ－１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）又は熱帯性痙性麻痺（ＴＳＰ；Ｔｒｏｐｉｃａｌ ｓｐａｓｔｉｃ ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）（ＨＡＭ／ＴＳＰ）を発症する。本発明においてＨＴＬＶ－１感染者とは、血液検査等でＨＴＬＶ－１陽性と判定された被験者をいう。ＨＴＬＶ－１に感染すると、生体中に、抗ＨＴＬＶ－１抗体が生成されるため、抗ＨＴＬＶ－１抗体の有無を確認することによりＨＴＬＶ－１感染の有無を判定することができる。抗ＨＴＬＶ－１抗体を測定する方法としては、免疫学的手法を用いた測定方法が挙げられ、例えばゼラチン粒子凝集法（ＰＡ法）、蛍光抗体法（ＦＡ法）、間接蛍光抗体法（ＩＦ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ウエスタンブロット法（ＷＢ法）等が用いられる。ＨＴＬＶ－１キャリア指導の手引き（厚生労働省研究班「本邦におけるＨＴＬＶ－１感染及び関連疾患の実態調査と総合対策」、２０１１年）によると、一般医療機関ではスクリーニング検査としてＰＡ法やＣＬＥＩＡ法が用いられ、スクリーニング検査で陽性と判断された場合、ＷＢ法による確認検査が実施される。さらに、ＷＢ法による確認検査で判定保留となった場合、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて末梢血細胞ゲノム中のＨＴＬＶ－１プロウイルスを検出する検査が実施される。
ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）は、ヒトのリンパ球に潜在感染し、授乳や性交渉等を介して伝搬する。ＨＴＬＶ－１の感染者は日本全国に約１００万人いるといわれており、その大多数はＨＴＬＶ－１感染に伴う病気を発症することなく、生涯を過ごすが、一部の人では、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ；ＨＴＬＶ－１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）又は熱帯性痙性麻痺（ＴＳＰ；Ｔｒｏｐｉｃａｌ ｓｐａｓｔｉｃ ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）（ＨＡＭ／ＴＳＰ）を発症する。本発明においてＨＴＬＶ－１感染者とは、血液検査等でＨＴＬＶ－１陽性と判定された被験者をいう。ＨＴＬＶ－１に感染すると、生体中に、抗ＨＴＬＶ－１抗体が生成されるため、抗ＨＴＬＶ－１抗体の有無を確認することによりＨＴＬＶ－１感染の有無を判定することができる。抗ＨＴＬＶ－１抗体を測定する方法としては、免疫学的手法を用いた測定方法が挙げられ、例えばゼラチン粒子凝集法（ＰＡ法）、蛍光抗体法（ＦＡ法）、間接蛍光抗体法（ＩＦ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ウエスタンブロット法（ＷＢ法）等が用いられる。ＨＴＬＶ－１キャリア指導の手引き（厚生労働省研究班「本邦におけるＨＴＬＶ－１感染及び関連疾患の実態調査と総合対策」、２０１１年）によると、一般医療機関ではスクリーニング検査としてＰＡ法やＣＬＥＩＡ法が用いられ、スクリーニング検査で陽性と判断された場合、ＷＢ法による確認検査が実施される。さらに、ＷＢ法による確認検査で判定保留となった場合、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて末梢血細胞ゲノム中のＨＴＬＶ－１プロウイルスを検出する検査が実施される。
［ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク］
上述のとおり、血液検査でＨＴＬＶ－１陽性と判定された人、すなわちＨＴＬＶ－１に感染している人がＨＡＭ／ＴＳＰを発症するが、ＨＴＬＶ－１に感染している全ての人が発症するわけではない。１９８７－１９８８年に実施された全国調査をもとに計算された、ＨＴＬＶ－１感染者が生涯にＨＡＭ／ＴＳＰを発症する可能性は０．２５％、すなわち４００人に１人と極めて低い確率である。男女比はおよそ１：２－３と女性に多く、複数の遺伝的要因や感染しているＨＴＬＶ－１のウイルスのタイプにより、発症頻度に差がある可能性が報告されている。また、多くは中年以降にＨＡＭ／ＴＳＰを発症するが、１０代又はそれ以前に発症する患者も存在する。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者は、体内のＨＴＬＶ－１ウイルス量（プロウイルス量）が増加しており、プロウイルス量が多い人はＨＡＭ／ＴＳＰになりやすいとも考えられている。このように血液検査でＨＴＬＶ－１陽性と判定された人であっても、それぞれＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクは異なると考えられる。
上述のとおり、血液検査でＨＴＬＶ－１陽性と判定された人、すなわちＨＴＬＶ－１に感染している人がＨＡＭ／ＴＳＰを発症するが、ＨＴＬＶ－１に感染している全ての人が発症するわけではない。１９８７－１９８８年に実施された全国調査をもとに計算された、ＨＴＬＶ－１感染者が生涯にＨＡＭ／ＴＳＰを発症する可能性は０．２５％、すなわち４００人に１人と極めて低い確率である。男女比はおよそ１：２－３と女性に多く、複数の遺伝的要因や感染しているＨＴＬＶ－１のウイルスのタイプにより、発症頻度に差がある可能性が報告されている。また、多くは中年以降にＨＡＭ／ＴＳＰを発症するが、１０代又はそれ以前に発症する患者も存在する。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者は、体内のＨＴＬＶ－１ウイルス量（プロウイルス量）が増加しており、プロウイルス量が多い人はＨＡＭ／ＴＳＰになりやすいとも考えられている。このように血液検査でＨＴＬＶ－１陽性と判定された人であっても、それぞれＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクは異なると考えられる。
本発明においてＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクとは、ＨＴＬＶ－１感染者が、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ；ＨＴＬＶ－１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）又は熱帯性痙性麻痺（ＴＳＰ；Ｔｒｏｐｉｃａｌ ｓｐａｓｔｉｃ ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ）を発症するリスクのことをいう。ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクが高いとは、統計的に推定した発症確率が有意に通常の０．２５％を上回り、ＨＴＬＶ－１感染者が生涯にＨＡＭ／ＴＳＰを発症する可能性が高くなることをいう。また、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクが低いとは、統計的に推定した発症確率が有意に通常の０．２５％を下回り、ＨＴＬＶ－１感染者が生涯にＨＡＭを発症する可能性が低くなることをいう。
［ＨＬＡ－ＤＲＢ１］
免疫制御機構の異常が関与するＨＡＭ／ＴＳＰでは、免疫応答に関わる重要な遺伝子であるＨＬＡが発症の感受性遺伝子と知られていた。そこで、本発明者らは、無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者のゲノムを解析し、ＨＬＡ上の感受性変異を同定できれば正確な発症リスクを推定できるため、迅速な診断への応用が期待できると考えた。そこで、無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者それぞれの主要ＨＬＡ遺伝子の配列を決定し、比較解析することで、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症において感受性及び抵抗性（防御性）のアミノ酸残基を同定した。ここで見つかってきたのが、ＨＬＡ‐ＤＲＢ－１における特定の位置のアミノ酸残基であり、具体的には、Ｇ‐ＢＥＴＡ領域の７番目のアミノ酸残基（この番号は免疫遺伝学情報の国際的リファレンスをまとめているＩＭＧＴによって付されたものに対応する。この位置を「ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７」と簡略化する）である。ＨＡＭ／ＴＳＰ発症者においては、この位置のアミノ酸残基にロイシンを持つ比率が高いことから、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７の位置にロイシンを持つＨＴＬＶ－１感染者は、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する。一方、ＨＴＬＶ－１感染者においては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基にプロリンを持つ比率が高いことから、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７の位置にプロリンを持つＨＴＬＶ－１感染者は、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する。
免疫制御機構の異常が関与するＨＡＭ／ＴＳＰでは、免疫応答に関わる重要な遺伝子であるＨＬＡが発症の感受性遺伝子と知られていた。そこで、本発明者らは、無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者のゲノムを解析し、ＨＬＡ上の感受性変異を同定できれば正確な発症リスクを推定できるため、迅速な診断への応用が期待できると考えた。そこで、無症候性ＨＴＬＶ－１感染者及びＨＡＭ／ＴＳＰ発症者それぞれの主要ＨＬＡ遺伝子の配列を決定し、比較解析することで、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症において感受性及び抵抗性（防御性）のアミノ酸残基を同定した。ここで見つかってきたのが、ＨＬＡ‐ＤＲＢ－１における特定の位置のアミノ酸残基であり、具体的には、Ｇ‐ＢＥＴＡ領域の７番目のアミノ酸残基（この番号は免疫遺伝学情報の国際的リファレンスをまとめているＩＭＧＴによって付されたものに対応する。この位置を「ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７」と簡略化する）である。ＨＡＭ／ＴＳＰ発症者においては、この位置のアミノ酸残基にロイシンを持つ比率が高いことから、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７の位置にロイシンを持つＨＴＬＶ－１感染者は、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する。一方、ＨＴＬＶ－１感染者においては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基にプロリンを持つ比率が高いことから、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７の位置にプロリンを持つＨＴＬＶ－１感染者は、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する。
［プロウイルス量］
プロウイルス（ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ）とは、ＲＮＡウイルスであるＨＴＬＶ－１が逆転写酵素によりＤＮＡに変換されて、宿主Ｔ細胞のヒトゲノムに組み込まれたＤＮＡであり、ＨＴＬＶ－１感染の診断には、この配列をＴ細胞のゲノムから検出することで行われる。このプロウイルス配列には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐＸ領域が存在し、ｐＸ領域にはｔａｘ遺伝子、ＨＢＺ遺伝子が存在する。プロウイルス（ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ）を検出し、その量（細胞中の感染率）を計測する方法として、上記ｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子を標的としたリアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法においては、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７のアミノ酸を指標とする方法に加えて、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を指標とする方法を組み入れることで、判定の確度を向上させることができる。
プロウイルス（ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ）とは、ＲＮＡウイルスであるＨＴＬＶ－１が逆転写酵素によりＤＮＡに変換されて、宿主Ｔ細胞のヒトゲノムに組み込まれたＤＮＡであり、ＨＴＬＶ－１感染の診断には、この配列をＴ細胞のゲノムから検出することで行われる。このプロウイルス配列には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐＸ領域が存在し、ｐＸ領域にはｔａｘ遺伝子、ＨＢＺ遺伝子が存在する。プロウイルス（ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡ）を検出し、その量（細胞中の感染率）を計測する方法として、上記ｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子を標的としたリアルタイムＰＣＲ法等が挙げられる。本発明のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法においては、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７のアミノ酸を指標とする方法に加えて、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量を指標とする方法を組み入れることで、判定の確度を向上させることができる。
［判定方法］
本発明のＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法としては、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を指標にする工程を含んでいれば、その他は特に限定されない。上記特定の位置のアミノ酸残基としては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基であることが好ましく、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基であることがより好ましい。ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基の特定には、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、被験者のＤＮＡ試料を用いて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸を含む領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、シークエンスすることによりＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸を同定することができる。その結果、被験者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定し、被験者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する。
本発明のＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法としては、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を指標にする工程を含んでいれば、その他は特に限定されない。上記特定の位置のアミノ酸残基としては、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基であることが好ましく、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基であることがより好ましい。ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基の特定には、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、被験者のＤＮＡ試料を用いて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸を含む領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、シークエンスすることによりＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸を同定することができる。その結果、被験者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定し、被験者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定する。
以下に具体的な、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法を各工程に分けて説明する。
本発明のＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定方法は、（Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基を特定する工程、好ましくはＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基を特定する工程、より好ましくはＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程を含む。また、（Ａ）工程が、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程である場合、（Ｂ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定し、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する工程を含むことが好ましい。さらに、（Ｃ）ＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定工程を加えることで発症率をより細かく判定することが可能となる。
［工程（Ａ）］
本工程は、被験者のＤＮＡ試料を用いて、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基、好ましくはＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基、より好ましくは、はＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程である。ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸残基の特定には、当業者に公知の方法を用いることができる。
本工程は、被験者のＤＮＡ試料を用いて、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１の特定の位置のアミノ酸残基、好ましくはＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧＢ領域のアミノ酸残基、より好ましくは、はＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程である。ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸残基の特定には、当業者に公知の方法を用いることができる。
被験者のＤＮＡ試料としては、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定のアミノ酸残基を特定できる試料であれば特に限定されないが、例えばＨＴＬＶ－１感染者の血液、尿、唾液、乳汁、鼻汁、脳脊髄液、骨髄液、リンパ組織（脾臓、胸腺、リンパ節等）等が挙げられる。これらのうち、免疫細胞多く含むこと、採取が容易であること等の理由から、血液が好ましい。上記血液としては、例えば全血、血球、血清、血漿等が挙げられ、中でも血球が好ましい。上記血球としては、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が好ましい試料として挙げられる。
ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸残基を特定する工程は、例えば以下のような工程を含むことができる
（１）ＨＴＬＶ－１感染者である被検者から検体（ＤＮＡ試料）を採取し、上記採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸を含む領域をコードする遺伝子を標的として、この領域を増幅させるためのＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程、
（３）工程（２）で得られた増幅断片をシークエンスする工程。
（１）ＨＴＬＶ－１感染者である被検者から検体（ＤＮＡ試料）を採取し、上記採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸を含む領域をコードする遺伝子を標的として、この領域を増幅させるためのＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程、
（３）工程（２）で得られた増幅断片をシークエンスする工程。
工程（１）は、被検者から採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程であり、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）等を用いて調製することができる。被検者より採取された検体としては、上述の検体が挙げられる。なお、工程（１）において、被検者から採取された検体から調製されるＤＮＡを含有する試料としては、被検者から採取された検体そのものであっても、被検者から採取された検体から抽出されたＤＮＡであってもよい。被験者のＤＮＡ試料を用いて、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸を含む領域をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、シークエンスすることによりＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸を同定することができる。
工程（２）においては、工程（１）で調製した試料に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置のアミノ酸を含む領域をコードする遺伝子を特異的に増幅可能なＰＣＲプライマー対を用いたＰＣＲを行う（特開２０１８－１３００３６号公報参照）。
工程（３）においては、工程（２）で得られた増幅断片をシークエンスし、シークエンス結果をデータ解析することでＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７等の特定の位置の塩基配列からアミノ酸を同定する。上記シークエンスは、当業者に公知の方法にて行うことができる。
［工程（Ｂ）］
本工程は、上記工程（Ａ）において特定されたＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定し、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する工程である。
本工程は、上記工程（Ａ）において特定されたＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いと判定し、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いと判定する工程である。
上記工程（Ａ）において特定されたＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリン、ロイシン以外のアミノ酸である場合には、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクは中程度であり、生涯においてＨＡＭ／ＴＳＰを発症する可能性は０．２５％程度であると判断される。
上記工程（Ａ）及び（Ｂ）に加えて工程（Ｃ）として、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定結果をリスクの判定に含むこともできる。工程（Ｃ）を含むことで、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスク判定の確度を向上させることができる。
［工程（Ｃ）］
本工程は、上記工程（Ｂ）に加えてＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定結果を加えることで発症率をより細かく判定する工程である。プロウイルス量の測定には、例えばＭｉｙａｚａｔｏ Ｐ， ｅｔ ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（２１）：１０６８３～１０６９１， ２００６に記載の方法を用いることができるが、本発明に用いるプロウイルス量のデータはこの方法で得られたものに限定されない。
本工程は、上記工程（Ｂ）に加えてＨＴＬＶ－１プロウイルス量の測定結果を加えることで発症率をより細かく判定する工程である。プロウイルス量の測定には、例えばＭｉｙａｚａｔｏ Ｐ， ｅｔ ａｌ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（２１）：１０６８３～１０６９１， ２００６に記載の方法を用いることができるが、本発明に用いるプロウイルス量のデータはこの方法で得られたものに限定されない。
（１）ＨＴＬＶ－１感染者である被検者から検体（ＤＮＡ試料）を採取し、上記採取された検体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合するプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程、
（３）工程（２）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
（２）工程（１）で調製した試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合するプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程、
（３）工程（２）で得られる増幅断片の量を測定する工程。
上記工程（１）については、工程（Ａ）における工程（１）の説明を適用できる。
工程（２）は、工程（１）で調製したＤＮＡを含む試料に対して、ｔａｘ遺伝子を標的として結合するプライマー対を用いてＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、当業者に工程の常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡが含まれている場合には、ｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。より具体的には、被検者のゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＨＴＬＶ－１のｐＸ領域におけるｔａｘ遺伝子に対応する増幅断片が得られる。
本発明におけるプライマー対としては、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマー対であれば特に制限はないが、１５塩基以上５０塩基以下、好ましくは１５塩基以上３５塩基以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基以下のオリゴヌクレオチドからなるプライマーが好ましい。
ＰＣＲの反応条件は、ＨＴＬＶ－１プロウイルスＤＮＡにおけるｐＸ領域内のｔａｘ遺伝子を増幅可能な条件であれば特に限定されず、ＤＮＡ試料、設計したプライマー対等に合わせて、適宜選択することができる。
工程（３）は、工程（２）の増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の量を測定する工程である。ＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法としては、例えば電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法、プローブを用いてＰＣＲ増幅断片の量を測定する方法等が挙げられる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（被験者）
本研究では、九州地域を中心に収集したＨＡＭ／ＴＳＰ患者（発症者）７５３人、及び対照群として無症候性ＨＴＬＶ－１感染者（キャリア）８９９人を用いた。ＨＡＭ／ＴＳＰの診断は、世界保健機関（ＷＨＯ）の診断基準に基づいて行われた。また、本試験は、ヘルシンキ宣言に従って、各施設の倫理委員会により審査され、承認されたものである。さらに、全被験者には、本試験の目的及び手順を十分に説明し、各被験者から文書による同意を得ている。
本研究では、九州地域を中心に収集したＨＡＭ／ＴＳＰ患者（発症者）７５３人、及び対照群として無症候性ＨＴＬＶ－１感染者（キャリア）８９９人を用いた。ＨＡＭ／ＴＳＰの診断は、世界保健機関（ＷＨＯ）の診断基準に基づいて行われた。また、本試験は、ヘルシンキ宣言に従って、各施設の倫理委員会により審査され、承認されたものである。さらに、全被験者には、本試験の目的及び手順を十分に説明し、各被験者から文書による同意を得ている。
（ゲノムワイド関連解析（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ：ＧＷＡＳ））
合計で７５３例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＤＮＡ試料、及び対照として８９９例の無症候性ＨＴＬＶ－１感染者のＤＮＡ試料について網羅的ＳＮＰ解析を実施した。このうち４３６例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者、及び５２３例のキャリアのＤＮＡ試料については、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ６１０－Ｑｕａｄ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて遺伝子型タイピングを行った。残りの３１７例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者、及び３７６例のキャリアについては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＣｏｒｅＥｘｏｍｅ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイを用いた。なお、上記網羅的ＳＮＰ解析は、それぞれの製造業者のプロトコルに従って実施した。得られた、ＳＮＰマーカーのうち両アレイで共通する合計１４１，１９２個を選択した。
合計で７５３例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＤＮＡ試料、及び対照として８９９例の無症候性ＨＴＬＶ－１感染者のＤＮＡ試料について網羅的ＳＮＰ解析を実施した。このうち４３６例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者、及び５２３例のキャリアのＤＮＡ試料については、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ６１０－Ｑｕａｄ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて遺伝子型タイピングを行った。残りの３１７例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者、及び３７６例のキャリアについては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＣｏｒｅＥｘｏｍｅ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイを用いた。なお、上記網羅的ＳＮＰ解析は、それぞれの製造業者のプロトコルに従って実施した。得られた、ＳＮＰマーカーのうち両アレイで共通する合計１４１，１９２個を選択した。
１４１，１９２個のＳＮＰマーカーに対してクオリティチェックを行った。その結果、コール率が０．９５未満のＨＡＭ／ＴＳＰ患者４例及びキャリア６例、ＳＮＰデータの分布が日本人集団から外れたＨＡＭ／ＴＳＰ患者３例及びキャリア１例、さらに血縁関係を示すＨＡＭ／ＴＳＰ患者１５例及びキャリア４６例を除外した。この工程で残った、７３１例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者及びキャリア８４６例をゲノムワイド関連解析に用いた。また、コール率が０．９９未満の４，２５５個のＳＮＰ、０．０１未満のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有する１０，５１５個のＳＮＰ、及びハーディ・ワインベルグ平衡（ｐ＜１．０×１０－６）から逸脱した２８個のＳＮＰを除外し、結果的に、計１２６，３９４個のＳＮＰについて解析が行われた。ゲノムワイド関連解析には、地域間等の集団構造による影響を除外するため、主成分分析による第１０主成分までの値を変数項とした用いた補正を行った。
（ＨＬＡ対立遺伝子の決定）
ゲノムワイド関連解析に用いた検体のうち長鎖のＰＣＲに品質要件を満たした、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者６５９例及びキャリア８２１例に対して、ＨＬＡ遺伝子群の中でもとりわけ多形性が高く、様々な免疫関連疾患との関連が知られている６つの主要なＨＬＡ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１、－ＤＰＢ１の遺伝子全長を、ＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を断片化した後、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑにより配列を決定した。これには、特許文献１の特許技術を用いて行われた。次に、読まれた断片配列のデータを用いて、各検体の６遺伝子のＨＬＡアレルをＨＬＡ－ＨＤ（特開２０１８－１０８０４２号公報）により６桁まで決定した。タイピングを実施した検体のうち、６遺伝子全てのアレルが決定した、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者６５１例及び無症候性対照８０４例について解析を行った。
ゲノムワイド関連解析に用いた検体のうち長鎖のＰＣＲに品質要件を満たした、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者６５９例及びキャリア８２１例に対して、ＨＬＡ遺伝子群の中でもとりわけ多形性が高く、様々な免疫関連疾患との関連が知られている６つの主要なＨＬＡ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１、－ＤＰＢ１の遺伝子全長を、ＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を断片化した後、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑにより配列を決定した。これには、特許文献１の特許技術を用いて行われた。次に、読まれた断片配列のデータを用いて、各検体の６遺伝子のＨＬＡアレルをＨＬＡ－ＨＤ（特開２０１８－１０８０４２号公報）により６桁まで決定した。タイピングを実施した検体のうち、６遺伝子全てのアレルが決定した、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者６５１例及び無症候性対照８０４例について解析を行った。
（ＨＡＭ／ＴＳＰと、ＨＬＡアレル及びアミノ酸配列との関連解析）
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者と無症候性ＨＴＬＶ－１感染者の間における、感受性又は抵抗性のＨＬＡアレルを見出すために、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定法による検定を行った。アミノ酸残基の違いにおける比較解析するために、６桁でタイピングされたＨＬＡアレルの頻度を４桁の解像度で統合した。４桁の解像度では計２４７の異なったアレルが同定されたため、ボンフェローニ補正を施した有意水準はｐ＝２．０２×１０－４に設定された。次に、６つの遺伝子の抗原提示ドメイン（クラスＩのＨＬＡ遺伝子については第２エクソン：Ｇ－ＡＬＰＨＡ１及び第３エクソン：Ｇ－ＡＬＰＨＡ２ドメイン、クラスＩＩのＨＬＡ遺伝子については第２エクソン：Ｇ－ＢＥＴＡドメイン）におけるアミノ酸残基の位置毎に、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連性を評価するために、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースのデータを用いて各ＨＬＡアレルのアミノ酸配列をアライメントし、逐次的ロジスティック回帰分析を実施した。解析検体においてアミノ酸残基の種類が複数ある座位は２０６箇所存在したため、ボンフェローニ補正を施した有意水準はｐ＝２．４３×１０－４に設定した。検出された有意に関連するアミノ酸残基位置における各アミノ酸残基のオッズ比を多重ロジスティック回帰により推定した。
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者と無症候性ＨＴＬＶ－１感染者の間における、感受性又は抵抗性のＨＬＡアレルを見出すために、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定法による検定を行った。アミノ酸残基の違いにおける比較解析するために、６桁でタイピングされたＨＬＡアレルの頻度を４桁の解像度で統合した。４桁の解像度では計２４７の異なったアレルが同定されたため、ボンフェローニ補正を施した有意水準はｐ＝２．０２×１０－４に設定された。次に、６つの遺伝子の抗原提示ドメイン（クラスＩのＨＬＡ遺伝子については第２エクソン：Ｇ－ＡＬＰＨＡ１及び第３エクソン：Ｇ－ＡＬＰＨＡ２ドメイン、クラスＩＩのＨＬＡ遺伝子については第２エクソン：Ｇ－ＢＥＴＡドメイン）におけるアミノ酸残基の位置毎に、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連性を評価するために、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベースのデータを用いて各ＨＬＡアレルのアミノ酸配列をアライメントし、逐次的ロジスティック回帰分析を実施した。解析検体においてアミノ酸残基の種類が複数ある座位は２０６箇所存在したため、ボンフェローニ補正を施した有意水準はｐ＝２．４３×１０－４に設定した。検出された有意に関連するアミノ酸残基位置における各アミノ酸残基のオッズ比を多重ロジスティック回帰により推定した。
（プロウイルス量の測定と解析）
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者４４３例及びキャリア５９２例を対象に、リアルタイムＰＣＲ法によりプロウイルス量を測定した。そのうち、６遺伝子のＨＬＡアレルのタイピングが完了したＨＡＭ／ＴＳＰ患者３５３例と、キャリア５３６例の測定結果を統計解析に用いた。解析データをＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧ－ＢＥＴＡドメインにおける第７アミノ酸残基の遺伝子型に従って、各アミノ酸のプロウイルス量を含めたＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連性を二項ロジスティック回帰モデルで計算した。
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者４４３例及びキャリア５９２例を対象に、リアルタイムＰＣＲ法によりプロウイルス量を測定した。そのうち、６遺伝子のＨＬＡアレルのタイピングが完了したＨＡＭ／ＴＳＰ患者３５３例と、キャリア５３６例の測定結果を統計解析に用いた。解析データをＨＬＡ－ＤＲＢ１のＧ－ＢＥＴＡドメインにおける第７アミノ酸残基の遺伝子型に従って、各アミノ酸のプロウイルス量を含めたＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連性を二項ロジスティック回帰モデルで計算した。
以下に上記解析の結果を示す。
（ＨＡＭ／ＴＳＰ患者、無症候性ＨＴＬＶ－１キャリアのゲノムワイド関連解析）
１２６，３９４個のＳＮＰマーカーについて、７３１人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者及び８４６人の無症候性ＨＴＬＶ－１感染者のＤＮＡ試料を用いてＧＷＡ研究を実施した。第６染色体上のＨＬＡ遺伝子座に有意な関連ピークが観察された（図１）。
１２６，３９４個のＳＮＰマーカーについて、７３１人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者及び８４６人の無症候性ＨＴＬＶ－１感染者のＤＮＡ試料を用いてＧＷＡ研究を実施した。第６染色体上のＨＬＡ遺伝子座に有意な関連ピークが観察された（図１）。
（ＨＬＡアレルの遺伝子型タイピングとＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連解析）
次に、ＨＬＡ－ＨＤを用いて決定された６つのＨＬＡ遺伝子のアレルの頻度からＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連解析を行った。その結果、ＨＬＡ‐Ｃ＊０７：０２（ｐ＝２．６１×１０－５）、ＨＬＡ‐Ｂ＊０７：０２（ｐ＝４．９７×１０－４）、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１：０１（ｐ＝１．１５×１０－９）、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０５：０１（ｐ＝２．３０×１０－９）が、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症と有意に関連する感受性アレルとして得られた（表１）。一方、ＨＬＡ‐Ｂ＊４０：０６（ｐ＝３．０３×１０－５）、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊１５：０１（ｐ＝１．０６×１０－５）及びＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０６：０２（ｐ＝１．７８×１０－６）がＨＡＭ／ＴＳＰ発症と有意に関連する抵抗性アレルとして得られた（表１）。ハプロタイプ解析により、感受性アレルであるＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＤＲＢ１＊０１：０１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１は、連鎖不平衡の状態にあるハプロタイプであることが示された。同様に、抵抗性アレルであるＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０２とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１は連鎖不平衡の状態にあるハプロタイプであった。
次に、ＨＬＡ－ＨＤを用いて決定された６つのＨＬＡ遺伝子のアレルの頻度からＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連解析を行った。その結果、ＨＬＡ‐Ｃ＊０７：０２（ｐ＝２．６１×１０－５）、ＨＬＡ‐Ｂ＊０７：０２（ｐ＝４．９７×１０－４）、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１：０１（ｐ＝１．１５×１０－９）、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０５：０１（ｐ＝２．３０×１０－９）が、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症と有意に関連する感受性アレルとして得られた（表１）。一方、ＨＬＡ‐Ｂ＊４０：０６（ｐ＝３．０３×１０－５）、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊１５：０１（ｐ＝１．０６×１０－５）及びＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０６：０２（ｐ＝１．７８×１０－６）がＨＡＭ／ＴＳＰ発症と有意に関連する抵抗性アレルとして得られた（表１）。ハプロタイプ解析により、感受性アレルであるＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＤＲＢ１＊０１：０１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１は、連鎖不平衡の状態にあるハプロタイプであることが示された。同様に、抵抗性アレルであるＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０２とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１は連鎖不平衡の状態にあるハプロタイプであった。
次に、抗原提示ドメインのアミノ酸残基について逐次的ロジスティック回帰解析を行った。その結果、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１におけるＧ‐ＢＥＴＡドメインのアミノ酸残基の７番目（以下、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７）が最も強い相関を示した（ｐ＝９．５２×１０－１０）（図２ａ）。ＤＲＢ１－ＧＢ－７を帰無仮説の変数に加えて、ロジスティック回帰を再度行った結果、有意な差のあるアミノ酸残基位置（ｐ＞２．４３×１０－４、図２ｂ）は得られなかった。ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７はペプチド結合溝のβシートドメインに位置する（図２ｃ）。
さらに、多重ロジスティック回帰分析により、ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７にあるアミノ酸残基とＨＡＭ／ＴＳＰ発症との関連を調べた。結果を表２に示す。ＤＲＢ１‐ＧＢ‐７におけるロイシン（ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕ）はＨＡＭ／ＴＳＰ発症と正に相関し（ｐ＝６．４７×１０－７、ＯＲ＝２．１１、９５％ＣＩ：１．５７－２．８３）、一方プロリン（ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｐｒｏ）は負に相関する（ｐ＝６．５５×１０－５、ＯＲ＝０．６５、９５％ＣＩ：０．５３－０．８）ことを見出した。注目すべきことに、感受性アレルであったＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１はＤＲＢ１－ＧＢ－７の位置でロイシンへと翻訳され、抵抗性アレルであったＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１はＤＲＢ１－ＧＢ－７の位置でプロリンに翻訳される。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１６：０２もＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｐｒｏを有しているが、本研究ではアレル単体としてはＨＡＭ／ＴＳＰ発症との有意な関連は示されなかった。
（ＤＲＢ１－ＧＢ－７とプロウイルス量がＨＡＭのリスクに及ぼす複合効果）
以前の研究では、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、キャリアよりもＨＡＭ／ＴＳＰ患者で有意に高いことが報告されていた。ＨＴＬＶ－１プロウイルス量をＨＡＭ／ＴＳＰ患者４４３例とキャリア５９２例の間で比較したところ、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者ではキャリアよりも有意に高かった（ｐ＝４．７×１０－４２）。そのうち、６遺伝子のＨＬＡアレルのタイピングも行った３５３例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者と、キャリア５３６例を用いて、プロウイルス量を考慮した上でＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基の各遺伝子型がＨＡＭ／ＴＳＰ発症と関連しているかどうかを調べた。その結果、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕ及びＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｐｒｏはいずれもプロウイルス量の影響とは別にＨＡＭ／ＴＳＰの発症と有意に関連していることが示された（表３）。特に、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕについてホモ接合体は、ヘテロ接合体と比較して、顕著に高いオッズ比（ＯＲ＝９．５７、９５％ＣＩ＝２．４９－６３．５９）を示した。
以前の研究では、ＨＴＬＶ－１プロウイルス量は、キャリアよりもＨＡＭ／ＴＳＰ患者で有意に高いことが報告されていた。ＨＴＬＶ－１プロウイルス量をＨＡＭ／ＴＳＰ患者４４３例とキャリア５９２例の間で比較したところ、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者ではキャリアよりも有意に高かった（ｐ＝４．７×１０－４２）。そのうち、６遺伝子のＨＬＡアレルのタイピングも行った３５３例のＨＡＭ／ＴＳＰ患者と、キャリア５３６例を用いて、プロウイルス量を考慮した上でＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基の各遺伝子型がＨＡＭ／ＴＳＰ発症と関連しているかどうかを調べた。その結果、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕ及びＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｐｒｏはいずれもプロウイルス量の影響とは別にＨＡＭ／ＴＳＰの発症と有意に関連していることが示された（表３）。特に、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕについてホモ接合体は、ヘテロ接合体と比較して、顕著に高いオッズ比（ＯＲ＝９．５７、９５％ＣＩ＝２．４９－６３．５９）を示した。
（ＤＲＢ１－ＧＢ－７とプロウイルス量の混合モデルによるＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクの推定）
図３では、ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸の違いによるＨＡＭ／ＴＳＰ発症率と発症相対リスクをプロウイルス量の変化とともに二項ロジスティック回帰モデルで推定した。相対リスクの基準値は、日本のＨＴＬＶ－１感染者におけるＨＡＭ／ＴＳＰの発症率とされる０．２５％とした。その結果、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕのホモ接合体の場合、ＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量の中央値１．４４％では、推定発症率が１．６５％（９５％信頼区間＝０．３５％―７．６８％）で相対リスクが６．３倍からＨＡＭ／ＴＳＰ発症者の中央値６．２６％では、推定発症率が３．５５％（９５％信頼区間＝０．７６％―１６．５％）で相対リスクが１４．２倍と２倍以上の差があることが判明した。
図３では、ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸の違いによるＨＡＭ／ＴＳＰ発症率と発症相対リスクをプロウイルス量の変化とともに二項ロジスティック回帰モデルで推定した。相対リスクの基準値は、日本のＨＴＬＶ－１感染者におけるＨＡＭ／ＴＳＰの発症率とされる０．２５％とした。その結果、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕのホモ接合体の場合、ＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量の中央値１．４４％では、推定発症率が１．６５％（９５％信頼区間＝０．３５％―７．６８％）で相対リスクが６．３倍からＨＡＭ／ＴＳＰ発症者の中央値６．２６％では、推定発症率が３．５５％（９５％信頼区間＝０．７６％―１６．５％）で相対リスクが１４．２倍と２倍以上の差があることが判明した。
解析ではＨＡＭ／ＴＳＰ発症に関連する複数のＨＬＡアレル：ＨＬＡ‐Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ‐Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０５：０１及びＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１：０１を、感受性アレルとして同定した一方で、ＨＬＡ‐Ｂ＊４０：０６、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１＊０６：０２及びＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊１５：０１を、抵抗性アレルとして同定した。ＨＬＡタンパク質のＧ－ＤＯＭＡＩＮ中のアミノ酸残基の分析により、ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基がＨＡＭ／ＴＳＰ発症と最も有意に相関しており、ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｌｅｕが感受性アミノ酸残基であった。ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１：０１はＤＲＢ１‐ＧＢ‐７でロイシンを翻訳することから、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１は、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０１：０１と連鎖不平衡の状態にあることからＨＡＭ／ＴＳＰ発症の感受性アレルとなっている可能性が高い。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１は抵抗性アミノ酸残基ＤＲＢ１－ＧＢ－７－Ｐｒｏを有するため、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０２は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１との連鎖不平衡の状態にある関係からＨＡＭ／ＴＳＰ発症の抵抗性アレルとなっている可能性が高い。ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０６が抵抗性アレルであることの説明はできていない。
日本におけるＨＡＭ／ＴＳＰの全国疫学調査によると、診断から発症までの期間は７．６年であり、その主な原因は、希少難病であることや診断の困難さからＨＡＭ／ＴＳＰの診断には専門医を要することである。一方、最近の臨床試験では、モガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）がＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＯＭＤＳを改善し、特に早期（罹患期間１０年未満、ＯＭＤＳ＜５）に登録した患者で最も改善が顕著であったことが報告されている。ＨＡＭ／ＴＳＰ高リスク発症者群の同定は早期診断に繋がるため、治療成績の改善と患者のＱＯＬに極めて重要である。ＨＴＬＶ－１プロウイルス量はＨＡＭ／ＴＳＰの古典的リスクマーカーとして用いられている。プロウイルス量は感染者間で異なるものの、初回感染後数年以内に安定し、それぞれの感染者において比較的一定のままである。本研究では、関連解析により、ＤＲＢ１－ＧＢ－７上の感受性及び防御性アミノ酸残基がＨＡＭ／ＴＳＰの発症に影響を及ぼし、プロウイルス量による予測とは異なることが示された。これらのアミノ酸残基は、高いプロウイルス量が存在しなくても、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクを予測するのに有効なバイオマーカーであろう。ＤＲＢ１－ＧＢ－７を有する他の対立遺伝子の中で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１の対立遺伝子頻度は、カリブ海地域、アフリカ、又は南米などの他のＨＴＬＶ－１流行地域全体を通じて同等に高く、したがって、このバイオマーカーは、世界中で役立つ可能性がある。
本発明によると、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症の迅速かつ正確な予測、すなわちＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクの判定が可能となった。それにより、ＨＡＭ／ＴＳＰの高発症リスク群を推定することができるため、専門医の紹介や定期診断といったヘルスケアに活用することができ、また早期治療開始も可能となる。また、本発明は、別の発症リスクマーカーであるプロウイルス量の測定結果と組み合わせることでさらに高精度な発症リスク測定法へと拡張することも可能である。
Claims (4)
- ＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を指標とすることを特徴とし、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いことが示され、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いことが示される、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクを判定するための方法。
- さらにＨＴＬＶ－１感染者のプロウイルス量を指標とすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- （Ａ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基を特定する工程、及び
（Ｂ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、ロイシンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが高いことが示され、プロリンである場合に、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症するリスクが低いことが示される工程を含む、ＨＴＬＶ－１感染者のＨＡＭ／ＴＳＰ発症リスクを判定するための方法。 - さらに、（Ｃ）ＨＴＬＶ－１感染者のＨＬＡ－ＤＲＢ１－ＧＢ－７のアミノ酸残基が、プロリンもしくはロイシンであるかの情報に加えてプロウイルス量の値をもとに、ＨＡＭ／ＴＳＰの発症リスクの高低が示される工程を含む、請求項３に記載の方法。
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Citations (2)
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
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| Koichiro Usuku，Association of a particular amino acid sequence of the HLA-DRB1 chain with HTLV-I-associated myelopathy，Eur. J. Immunol.，1990年，20，pp.1603-1606 |
| Maria Fernanda Rios Grassi，Human T Cell Lymphotropic Virus Type 1 (HTLV-1) Proviral Load of HTLV-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP) Patients According to New Diagnostic Criteria of HAM/TSP，Journal of Medical Virology，2011年，83，pp.1269-1274 |
| Mineki Saito，Association Between HTLV-1 Genotypes and Risk of HAM/TSP，Frontiers in Microbiology，2019年05月15日，Vol.10 Article 1101，pp.1-8，doi: 10.3389/fmicb.2019.01101 |
| 京都大学，指定難病IgG4関連疾患とHLA-DRB1、FRGR2B遺伝子との関連を解明 －疾患の感受性遺伝子を網羅的に探索－，京都大学，2019年09月11日，https://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research-news/2019-09-11-0 |
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