ES2425115T3 - Método de cribado para la reacción de hipersensibilidad a un fármaco - Google Patents

Abstract

Un método de cribado de un sujeto humano como una ayuda para predecir la respuesta a la administración de abacavir, que comprende determinar si el sujeto tiene un alelo "A" en el sitio polimórfico G(-237)A de TNFα (SEQ ID NO:1), en el que la presencia de dicho genotipo de TNFα indica que el sujeto tiene mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir, comparado con el riesgo de individuos sin ese alelo.

Description

Método de cribado para la reacción de hipersensibilidad a un fármaco

Antecedentes

Las reacciones de hipersensibilidad (HSR) son reacciones inesperadas de tipo inmunológico (alergia) que aparecen en una minoría de pacientes tratados con terapia antirretrovírica. No se ha descubierto ningún síntoma ni ensayo de laboratorio que prediga o diagnostique dichos acontecimientos. Los síntomas habituales, que aparecen en combinaciones, incluyen fiebre, sarpullidos, reacciones gastrointestinales, fatiga severa y síntomas respiratorios. Estas reacciones de hipersensibilidad constituyen una entidad clínica diferenciada y no son los simples sarpullidos (sarpullidos suaves sin síntomas sistémicos) que son reacciones habituales a muchos fármacos. Las reacciones de hipersensibilidad se solucionan cuando se deja de tomar el fármaco causante, pero vuelven cuando se reinicia la toma. El mecanismo exacto de las reacciones de hipersensibilidad es desconocido.

La terapia antirretrovírica ha demostrado ser eficaz para el tratamiento de individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o diagnosticados con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La terapia con combinaciones de agentes antirretrovíricos puede prolongar la supervivencia y disminuir el riesgo de complicaciones de la infección por VIH-1. Pueden producirse reacciones adversas con cualquier agente antirretrovírico, algunas de las cuales con el potencial de provocar grave morbilidad y mortalidad (véase, por ejemplo, Samuel et al., Antiretroviral Therapy, 2000, Arch. Pharm. Res., 23:425 (2000); Carr et al., Lancet, 356:1423 (2000)). Las reacciones adversas habituales, y normalmente menos graves, incluyen náuseas, dolor de cabeza, fatiga, diarre, y sarpuliidos no severos en la piel. Las reacciones adversas menos habituales, pero a veces graves, frente a los agentes antirretrovíricos incluyen sarpullidos severos en la piel, pancreatitis, acidosis láctica, y reacciones de hipersensibilidad.

Se ha indicado que aparecen reacciones de hipersensibilidad al abacavir (Ziagen) en aproximadamente 5% de los pacientes que reciben este agente solo o en combinación con otros agentes antirretrovíricos (nótese que el Ziagen está indicado para el tratamiento de la infección por VIH-1 en combinación con otros agentes antirretrovíricos). El cese de la toma de abacavir conduce a la resolución de los síntomas de la reacción de hipersensibilidad. La administración continuada de abacavir ante una reacción en curso o la reintroducción de abacavir en pacientes con una historia anterior de reacción puede producir una reacción súbita, grave y potencialmente mortal.

Un ensayo de cribado para identificar los sujetos que tienen un mayor riesgo de presentar una reacción de hipersensibilidad frente a un compuesto farmacéutico sería útil en la medicina clínica.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la presente invención es un método para identificar genotipos que confieren una mayor o menor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir en sujetos humanos. En una población de sujetos de ensayo, cada sujeto se genotipifica para detectar polimorfismos en un gen candidato, tal como el gen TNFalfa (TNFα), MICA, MICB y/or los genes HLA. Se administra un régimen terapéutico de abacavir a cada sujeto (antes, al mismo tiempo o después de la genotipificación del sujeto), y se identifican los sujetos de ensayo que muestran (o mostraron) señales clínicas de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. Los genotipos de los sujetos de ensayo en los sitios polimórficos en los genes candidatos se correlacionan con la aparición de señales clínicas de reacción de hipersensibilidad, para determinar cuáles son los genotipos asociados con un mayor o menor riesgo de una reacción de hipersensibilidad (comparado con otros genotipos o con una población general que no haya sido estratificada según el genotipo).

Otro aspecto de la presente invención es un método para determinar si un individuo tiene un mayor riesgo de sufrir una reacción de hipersensibilidad al abacavir, determinando si el individuo tiene un genotipo que está asociado con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad, comparado con el riesgo en sujetos con otros genotipos.

Otro aspecto de la presente invención es un método para determinar si un individuo tiene un menor riesgo de sufrir una reacción de hipersensibilidad al abacavir, determinando si el individuo tiene un genotipo que está asociado con un menor riesgo de una reacción de hipersensibilidad, comparado con el riesgo en sujetos con otros genotipos.

Otro aspecto de la presente invención es un método de cribado de un sujeto humano como ayuda para evaluar la idoneidad de la administración de abacavir, determinando si el sujeto tiene un genotipo de TNFα que ha sido asociado con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad frente al abacavir, comparado con el riesgo en sujetos con otros genotipos de TNFα. La presencia de dicho genotipo de TNFα indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir.

Otro aspecto de la presente invención es un método de cribado de un sujeto humano como ayuda para evaluar la idoneidad de la administración de abacavir, determinando si el sujeto tiene un genotipo de HLA que ha sido asociado con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad frente al abacavir, comparado con el riesgo en sujetos con otros genotipos de HLA. La presencia de dicho genotipo de HLA indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir.

También se describe un método para tratar a un sujeto humano con abacavir, genotipificando en primer lugar el sujeto para detectar la presencia o la ausencia del alelo HLA-B57, y después administrando abacavir si no se detecta el alelo HLA-B57.

Otro aspecto de la presente invención es un método de cribado de un sujeto humano, como ayuda para predecir el riesgo del sujeto de sufrir una reacción de hipersensibilidad a un régimen terapéutico de abacavir, genotipificando una muestra de ADN del sujeto para determinar la presencia de un polimorfismo en el gen TNFα, en el que el polimorfismo ha sido previamente asociado con un mayor riesgo de HSR al abacavir, comparado con el riesgo de HSR asociado con otros polimorfismos de TNFα. La detección de la presencia de un genotipo de TNFα que se ha asociado con una mayor incidencia de reacciones de hipersensibilidad al abacavir (comparado con la incidencia de HSR al abacavir asociada a otros genotipos de TNFα) indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir.

Otro aspecto de la presente invención es un método de cribado de un sujeto humano, como ayuda para predecir el riesgo del sujeto de sufrir una reacción de hipersensibilidad a un régimen terapéutico de abacavir, genotipificando una muestra de ADN del sujeto para determinar la presencia de un polimorfismo en un gen HLA, en el que el polimorfismo ha sido previamente asociado con un mayor riesgo de HSR al abacavir, comparado con el riesgo de HSR asociado con otros polimorfismos. La presencia de un genotipo de HLA que se ha asociado con una mayor incidencia de reacciones de hipersensibilidad al abacavir (comparado con la incidencia de HSR al abacavir asociada a otros genotipos de HLA) indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir.

También se describe un método para identificar genotipos humanos asociados con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir, mediante la genotipificación de cada miembro de una población de sujetos de ensayo para al menos un polimorfismo en el gen TNFα, la administración de un régimen terapéutico de abacavir a cada sujeto de ensayo, y la identificación de los sujetos de ensayo que muestran señales clínicas de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. La correlación de los genotipos de TNFα con la aparición de señales clínicas de una reacción de hipersensibildiad determinará cuáles son los genotipos asociados con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir (comparado con los otros genotipos detectados).

También se describe un método para identificar genotipos humanos asociados con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir, mediante la genotipificación de cada miembro de una población de sujetos de ensayo para al menos un polimorfismo en el gen HLA, la administración de un régimen terapéutico de abacavir a cada sujeto de ensayo, y la identificación de los sujetos de ensayo que muestran señales clínicas de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. La correlación de los genotipos de HLA con la aparición de señales clínicas de una reacción de hipersensibildiad determinará cuáles son los genotipos asociados con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir (comparado con los otros genotipos detectados).

Otro aspecto de la presente descripción es un método para administrar o recetar abacavir para reducir la aparición de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. El método comprende seleccionar, basándose en el estado del genotipo, una población de tratamiento a partir de una población de sujetos inicial mayor que tienen un trastorno adecuado para un tratamiento con abacavir. La población de tratamiento se selecciona para aumentar el porcentaje de sujetos en la población de tratamiento que tienen un genotipo que se ha asociado con un menor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir (el mayor porcentaje de sujetos en la población de tratamiento es con relación al porcentaje de sujetos en la población inicial). Como alternativa, la población de tratamiento se selecciona para disminuir el porcentaje de sujetos en la población de tratamiento que tienen un genotipo que se ha asociado con un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. Entonces el abacavir se administra a la población de tratamiento seleccionada, reduciendo con ello la incidencia de HSR al abacavir en la población tratada, comparado con la incidencia que se habría esperado que se produjese si el abacavir hubiera sido administrado en la población inicial mayor. El "cribado" puede producirse mediante cualquier proceso adecuado, como será evidente para los expertos en la técnica. Los ejemplos de métodos de cribado adecuados incluyen el cribado genética de los individuos de la población inicial, o clasificando de otra forma los sujetos según el genotipo (por ejemplo, cuando se conoce el genotipo de un sujeto, no es necesario repetir el ensayo genético); o regular de otra forma el acceso al abacavir para disminuir el número de sujetos en la población de tratamiento que tienen genotipos que se han asociado con un mayor riesgo de HSR al abacavir. Uno de estos genotipos es el alelo HLA-B57, con el que la población de tratamiento se seleccionará para minimizar la aparición del alelo HLA-B57 en la población de tratamiento. Como alternativa, el genotipo de interés puede ser el polimorfismo TNF G(-237)A, con lo que la población de tratamiento se seleccionará para minimizar la aparición del alelo A.

Análisis detallado

La terapia antirretrovírica en pacientes infectados con VIH a menudo comprende el uso de múltiples tipos de agentes antirretrovíricos, incluyendo inhibidores de proteasas, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos (NNRTI) e inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos (NRTI). El abacavir es un análogo de nucleósido de purina que está disponible en el mercado como sulfato de abacavir (ZIAGEN®, GlaxoSmithKline), y se usa en combinación con otros agentes antirretrovíricos para tratar a sujetos infectados por VIH. El abacavir es un inhibidor de la transcriptasa inversa del VIH-1 (NRTI) que contiene un anillo de ciclopenteno insaturado en lugar del 2'desoxirribósido de los desoxinucleósidos naturales, y contiene un grupo ciclopropilamino. El nombre químico del sulfato de abacavir es sulfato de (cis)-4-[2-amino-6-(ciclopropilamino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenten-1-metanol (sal) (2:1).

Las reacciones de hipersensibilidad son acontecimientos idiosincráticos de una supuesta naturaleza inmunológica que aparecen con una amplia gama de compuestos farmacológicos. En el contexto de la administración de abacavir, las reacciones de hipersensibildad al abacavir pueden ser graves y avanzar hasta poner en riesgo la vida (Clay et al., Ann. Pharmacotherapy, 34(2):247 (2000); Staszewski et al., AIDS, 12:F197 (1998)). En ensayos clínicos, la hipersensibilidad al abacavir se ha producido en aproximadamente 5% de los sujetos. Las señales y los síntomas de una reacción de hipersensibilidad al abacavir incluyen, pero no se limitan a fiebre, sarpullidos en la piel, fatiga, síntomas gastrointestinales (que incluyen náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal), y síntomas respiratorios (que incluyen faringitis, dispnea y tos). Otras señales y síntomas incluyen malestar, mialgia, miolisis, artralgia, edema, dolor de cabeza y parestesia. Los resultados físicos incluyen linfadenopatía, lesiones en membranas mucosas (conjuntivitis y úlceras bucales). El sarpullido asociado con la reacción de hipersensibilidad normalmente tiene un aspecto maculopapular o urticarial, pero el aspecto puede ser variable; hasta 30% de las reacciones de hipersensibilidad han aparecido sin sarpullido. Las anomalías de laboratorio incluyen ensayos de la función hepática de resultados elevados, mayor creatina fosfoquinasa o creatinina, y linfopenia. Véase el inserto en el envase de Ziagen (sulfato de abacavir), Glaxo Wellcome, Research Triangle Park, NC (1998); Clay et al., Management Protocol for Abacavir-related Hypersensitivity Reaction, Ann. Pharmacotherapy, 34(2):247 (2000). Clay et al. indican que solo la presencia de sarpullido no justifica el abandono del abacavir, a menos que aparezcan otros síntomas sistémicos de una reacción de hipersensibilidad.

TNFalfa

Se sabe que la molécula efectora inmunológica factor de necrosis tumoral-alfa (TNFα) es polimórfica, y se ha indicado una serie de polimorfismos en la región del promotor de TNFα. Algunos informes indican que dichos polimorfismos de promotor influyen en la enfermedad inmunológica (Bouma et al., Scand. J. Immunol., 43:456 (1996); Allen et al., Mol. Immunology, 36:1017 (1999)), mientras que otros sugieren que las asociaciones observadas entre polimorfismos de TNFα y aparición de la enfermedad no son debidas a los efectos funcionales del TNFα, sino al desequilibrio de ligamiento del TNFα con alelos de HLA seleccionables (Uglialoro et al., Tissue Antigens, 52:359 (1998)). Una lista de polimorfismos de promotor de TNFα es proporcionada por Allen et al., Mol. Immunology, 36:1017 (1999). La numeración de los polimorfismos de TNFα varía entre autories, debido a la variación en las secuencias indicadas para la región del promotor de TNFα; en la presente, la numeración se refiere a la siguiente secuencia consenso proporcionada en Allen et al. (1999):

El sitio de inicio de la transcripción (+1) se indica mediante negrita y subrayado; los polimorfismos G(-237)A y G(308)A se indican con negrita y subrayado doble. Debido a la variación en las secuencias y la numeración indicadas, el polimorfismo G(-237)A también se ha denominado G-238A, y el polimorfismo G(-308)A está localizado en la posición -307 de la anterior secuencia. Otro polimorfismo, C(-5,100)G, investigado en la presente investigación, es un polimorfismo de C/G en la región no traducida 5' del TNFα:

N = C/G

Allen et al. (supra) advierten que el número de polimorfismos de promotor de TNFα observados hasta la fecha son

10 polimorfismos de G/A agrupados en la región de -375 a -162 pp; que algunos de estos polimorfismos se encuentran dentro de un motivo común; y sugieren que el motivo puede ser un sitio de unión consenso para un regulador transcripcional o que puede influir en la estructura del ADN. Se ha indicado que el polimorfismo de G/A en -237 afecta a la curvatura del ADN (D'Alfonso et al., Immunogenetics, 39:150 (1994)). Huizinga et al. (J. Neuroimmunology, 72:149, 1997) indican una producción de TNFα significativamente menor en células estimuladas

15 con LPS en individuos heterocigóticos (G/A) en -237 (comparado con individuos G/G); sin embargo, otro estudio no observó estos efectos (Pociot et al., Scand. J. Immunol., 42:501, 1995). También se ha indicado que el polimorfismo G(-237)A afecta a enfermedades autoinmunológicas (Brinkman et al., Br. J. Rheumatol., 36:516 ,1997 (artritis reumatoide); Huizinga et al., J. Neuroimmunology, 72:149, 1997 (esclerosis múltiple); Vinasco et al., Tissue Antigens, 49:74, 1997 (artritis reumatoide)) y enfermedades infecciosas (Hohler et al., Clin. Exp. Immunol., 111:579,

20 1998 (hepatitis B); Hohler et al., J. Med. Virol., 54:173, 1998 (hepatitis C)).

Se sabe que las secuencias genéticas, de nucleótidos y de aminoácidos obtenidas de diferentes fuentes para el mismo gen pueden variar tanto en el esquema de numeración como en la secuencia precisa. Estas diferencias pueden ser debidas a la variabilidad de secuencia inherente dentro del gen y/o a errores de secuenciación. Por consiguiente, los expertos en la técnica entenderán que la referencia en la presente a un sitio polimórfico concreto

25 con un número (por ejemplo, TNFα G-238A) incluye los sitios polimórficos que se corresponden en secuencia y localización dentro del gen, incluso si se emplean diferentes esquemas de numeración/nomenclatura para describirlos.

HLA

El complejo HLA de seres humanos (complejo de histocompatibilidad mayor o MHC) es una agrupación de genes

30 relacionados localizada sobre el cromosoma 6 (los loci de TNFα y HLA B están muy cerca sobre el cromosoma 6). El complejo de HLA se clasifica en tres regiones: regiones de clase I, II, y III (Klein J., en: Gotze D, ed., The Major Histocompatibility System in Man and Animals, Nueva York, Springer-Verlag, 1976:339-378). Los HLA de clase I comprenden la proteína transmembrana (cadena pesada) y una molécula de microglobulina beta-2. Las proteínas transmembrana de clase I son codificadas por los loci HLA-A, HLA-B y HLA-C. La función de las moléculas de HLA

35 de clase I es presentar péptidos antigénicos (incluyendo antígenos de proteínas víricas) a células T. Se reconocen tres isoformas de moléculas MHC de clase II, denominadas HLA-DR, -DQ, y -DP. Las moléculas de MHC de clase II son heterodímeros compuestos por una cadena alfa y una cadena beta; diferentes cadenas alfa y beta son codificadas por subconjuntos de genes A y genes B, respectivamente. Se han reconocido diversos haplotipos de HLA-DR, y se diferencian en la organización y el número de genes DRB presentes sobre cada haplotipo DR; se han

40 descrito múltiples genes DRB (Bodmer et al., Eur. J. Immunogenetics, 24:105 (1997); Andersson, Frontiers in Bioscience, 3:739 (1998)).

El MHC muestra un alto polimorfismo; se han indicado más de 200 alelos genotípicos de HLA-B. Véase, por ejemplo, Schreuder et al., Human Immunology, 60:1157-1181 (1999); Bodmer et al., European Journal of Immunogenetics, 26:81-116 (1999). A pesar del número de alelos en los loci HLA-A, HLA-B y HLA-C, el número de haplotipos observado en poblaciones es menor que lo que se esperaría de modo matemático. Ciertos alelos tienden a aparecer juntos sobre el mismo haplotipo, en lugar de segregarse aleatoriamente. Esto se denomina desequilibrio de ligamiento ("linkage disequilibrium", LD) y puede ser cuantificado por métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Devlin y Risch, Genomics, 29:311 (1995); BS Weir, Genetic Data Analysis II, Sinauer Associates, Sunderland, MD (1996)).

Los productos codificados por los loci de HLA polimórficos habitualmente se tipifican por métodos serológicos para el ensayo de histocompatibilidad de transplantes y transfusiones, y la terapia con componentes sanguíneos. La tipificación serológica se basa en reacciones entre sueros caracterizados y productos génicos de HLA. Las técnicas conocidas para el ensayo de la histocompatibilidad incluyen microlinfocitotoxicidad y citometría de flujo. La microlinfocitotoxicidad habitual para la tipificación de antígenos de HLA determina el perfil de antígenos HLA de los linfocitos de un sujeto, utilizando un panel de antisueros HLA bien caracterizados. El alelo HLA-B57 está bien caracterizado, y son conocidos los métodos serológicos para detectar HLA-B57. Véase, por ejemplo, ASHI Laboratory Manual, 4ª edición, American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (2000); Hurley et al., Tissue Antigens, 50:401 (1997).

Más recientemente, se han desarrollado métodos para el análisis de polimorfismos de HLA a nivel genético. Los métodos de tipificación de HLA no serológicos incluyen el uso del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción de ADN (RFLP; véase, por ejemplo, Erlich, patente de EEUU n.º 4.582.788 (1986)), u oligonucleótidos marcados, para identificar secuencias de ADN de HLA específicas. Estos métodos pueden detectar polimorfismos localizados en la secuencia codificadora o no codificadora del genoma. Véase, por ejemplo, Bidwell et al., Immunology Today, 9:18 (1988); Angelini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4489 (1986); Scharf et al., Science, 233:1076 (1986); Cox et al., Am. J. Hum. Gen., 43:954 (1988); Tiercy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:198 (1988); y Tiercy et al., Hum. Immunol., 24:1 (1989). El proceso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase patente de EEUU n.º 4.683.202, 1987) permite la amplificación de ADN genómico y ahora se utiliza para procedimientos de tipificación de HLA. Véase, Saiki et al., Nature, 324:163 (1986); Bugawan et al., J. Immunol., 141:4024 (1988); Gyllensten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7652 (1988). Véase también, por ejemplo, Ennis et al., PNAS USA, 87:2833 (1990); Petersdorf et al., Tissue Antigens, 46:77 (1995); Girdlestone et al., Nucleic Acids Research, 18:6702 (1990); Marcos et al., Tissue Antigens, 50:665 (1997); Steiner et al., Tissue Antigens, 57:481 (2001); Madrigal et al., J. Immunology, 149:3411 (1992).

Tal como se emplea en la presente, "genotipificar" un locus HLA se refiere a métodos que identifican la presencia o la ausencia de un alelo concreto, o de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos; las variaciones de secuencia pueden detectarse de modo directo (mediante secuenciación) o indirecto (por ejemplo, mediante análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos, o detección de la hibridación de una sonda de secuencia conocida, o polimorfismo de conformación de hebra de referencia). Los alelos de HLA puede detectarse de modo serológico, tal como se conoce en la técnica.

Se han asociado alelos de HLA diferenciados con un mayor o menor riesgo de avance de la enfermedad del VIH. Se han asociado los alelos HLA-B57 y HLA-B14 con la infección por VIH no progresiva, mientras que se han asociado HLA-A29 y HLA-B22 con la progresión rápida (Goulder et al., J. Virology, 74:5291 (2000); Hendel et al., J. Immunology, 162:6942 (1999)). Carrington et al. han indicado que la frecuencia del alelo HLA-B57 en cohortes de pacientes infectados por VIH es 4,40% en caucásicos y 5,7% en afroamericanos (Carrington et al., Science, 283:1748 (1999)).

MICA y MICB

El gen A relacionado con la cadena de MHC de clase I (HLA) (MICA) y el gen B relacionado con la cadena de MHC de clase I (HLA) (MICB) pertenecen a una familia de genes de múltiples copias localizados en la región del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I cerca del gen HLA-B. Están localizados dentro de una región de enlace sobre el cromosoma 6p alrededor de HLA-B y TNFalfa. Las moléculas de MHC de clase I codificadas son inducidas por factores de estrés, tales como infección y choque térmico, y son expresadas sobre el epitelio gastrointestinal.

Se ha indicado que MICA es altamente polimórfico. La aparición de polimorfismos de un único nucleótido de MICA en diversos grupos étnicos ha sido indicada por Powell et al., Mutation Research, 432:47 (2001). Se ha indicado que los polimorfismos en MICA están asociados con diversas enfermedades, aunque en algunos casos la asociación ha sido atribuida a un desequilibrio de ligamiento con los genes HLA. Véase, por ejemplo, Salvarani et al., J. Rheumatol., 28:1867 (2001); Gonzalez et al., Hum. Immunol., 62:632 (2001); Seki et al., Tissue Antigens, 58:71 (2001).

Se han indicado diversas formas polimórficas de MICB (véase, por ejemplo, Visser et al., Tissue Antigens, 51:649 (1998); Kimura et al., Hum. Immunol., 59:500 (1998); Ando et al., Immunogenetics, 46:499 (1997); Fischer et al., Eur.

J. Immunogenet., 26:399 (1999)).

A continuación, se proporciona una secuencia parcial para el gen MICA de Homo sapiens, que incluye los exones 2 y 3 (GenBank, referencia AJ295250).

En el presente estudio se han investigado diversos polimorfismos de MICA. Los polimorfismos de MICA en el exón 2 (T/G; rs1063630 en la base de datos de the National Center for Biotechnology Information SNP (dbSNP)) y el exón 3 (A/G; rs1051792) se muestran arriba en negrita y subrayado doble. Otro polimorfismo de MICA investigado en el presente estudio (rs1052416) se localiza aproximadamente -9,263 bases 5' al sitio de inicio de la transcripción:

MICA (-9,263)

10 Un cds completo para el gen MICB humano se proporciona en SEQ ID NO:4 (GenBank, registro U65416). Los polimorfismos de MICB investigados en el presente estudio incluyen uno en el exón 2 (rs1065075) y otro en el exón 3 (rs1051788):

MICB - (rs1065075) N = A/G GTGGGCAGAAGATGTCCTGGGAGCTNAGACCTGGGACACAGAGACCGAGGA, SEQ ID NO:5

15 MICB (rs1051788) N = A/G CAGGGGCTCCCGGCATTTCTACTACNATGGGGAGCTCTTCCTCTCCCAAAA, SEQ ID NO:6

ARN helicasa p47 dependiente de ATP

La proteína codificada por este gen es un miembro de la familia de ARN helicasas dependientes de ATP, y también se denomina transcripción 1 asociada a HLA-B 1 (BAT1) (véase, por ejemplo GenBank, n.º de registro AF029061). 20 Se ha localizado un agrupamiento de genes conocido como BAT1-BAT5 cerca de TNF y de los genes TNF. De han identificado diversos polimorfismos en la ARN helicasa p47 dependiente de ATP, que incluyen:

N = A/T

RS929138; N = C/T CTTTGGCAATTCTATATGGTGAGCTNTAAAGGTGGGCTCCAGGTAGGGATG, SEQ ID NO:8

25 Definiciones

Se sabe que las secuencias genéticas, de nucleótidos y de aminoácidos obtenidas de diferentes fuentes para el mismo gen pueden variar tanto en el esquema de numeración como en la secuencia precisa. Estas diferencias pueden ser debidas a los esquemas de numeración, a la variabilidad de secuencia inherente dentro del gen y/o a errores de secuenciación. Por consiguiente, los expertos en la técnica entenderán que la referencia en la presente a 30 un sitio polimórfico concreto con un número (por ejemplo, TNFα G-238A) incluye los sitios polimórficos que se

corresponden en secuencia y localización dentro del gen, incluso si se emplean diferentes esquemas de numeración/nomenclatura para describirlos.

Tal como se emplea en la presente, una "reacción de hipersensibilidad" (HSR) a un fármaco se refiere al desarrollo de una respuesta de tipo inmunológica a una molécula de un fármaco o a un metabolito del fármaco. Esta respuesta generalmente se caracteriza por múltiples síntomas y es coherente con las descripciones clínicas de estos síndromes (Knowles et al., Lancet, 356:1587 (2000); Carr et al., Lancet, 356:1423, (2000)). La reacción inmunológica comparte características, pero no es necesariamente idéntica, con los tipos presentes en el sistema de Gell y Coombs. Véase, Sullivan, T.J., Drug allergy, en Middleton et al. (eds.), Allergy: Principles and Practice, 4ª ed., St. Louis, Mosby, 1993, p. 1730. Las HSR al abacavir pueden caracterizarse por la aparición de múltiples síntomas o de síntomas individuales, y puede establecerse el diagnóstico clínico de HSR al abacavir o HSR probable al abacavir basándose en la presencia de una o más señales y síntomas clínicos, descubrimientos físicos, con o sin anomalías de laboratorio, como será evidente para los expertos en la técnica.

La administración de abacavir a un sujeto (o "tratar" un sujeto con abacavir) comprende métodos y vías de administración conocidos en la técnica. Los regímenes terapéuticos recomendados (cantidades de dosificación y programación, concentraciones plasmáticas) del abacavir son conocidos en la técnica. Tal como se emplea en la presente, la administración de abacavir no se limita al tratamiento de la enfermedad relacionada con VIH o SIDA, sino que incluye su uso médico para otros trastornos que pueden tratarse con abacavir.

Tal como se emplea en la presente, la administración de un inhibidor de la transcriptasa inversa farmacéutico a un sujeto comprende la administración de una cantidad eficaz del agente farmacéutico al sujeto que lo necesita. La dosis de un agente farmacéutico puede determinarse según métodos conocidos y aceptados en las técnicas farmacéuticas, y puede ser determinada por los expertos en la técnica. Los inhibidores de la transcriptasa inversa (NRTI y NNRTI) son conocidos para el tratamiento de la enfermedad del VIH y/o SIDA.

Tal como se emplea en la presente, el "alelo HLA-B57" se refiere a un alelo HLA-B que se caracteriza serológicamente como el alelo HLA-B57, tal como se conoce en la técnica. Se reconocerá que los alelos HLA-B57 serológicamente caracterizados comprenden variantes de secuencia que pueden ser detectados a nivel de la secuencia del ácido nucleico (por ejemplo, HLA-B*5701, HLA-B*5702; véase, por ejemplo, Schreuder et al., Human Immunology, 60:1157-1181 (1999)).

Tal como se emplea en la presente, "genotipificar" un sujeto (o una muestra de ADN) para un alelo polimórfico de un gen o genes significa detectar qué forma o formas alélicas o polimórficas del gen o genes están presentes en un sujeto (o una muestra). Tal como se conoce en la técnica, un individuo puede ser heterocigótico u homocigótico para un alelo concreto. Pueden existir más de dos formas alélicas, por lo que pueden ser posibles más de tres genotipos. Para los objetivos de la presente invención, "genotipificación" incluye la determinación de los alelos de HLA utilizando técnicas serológicas adecuadas, según se conoce en la técnica. Tal como se emplea en la presente, un alelo puede ser "detectado" cuando otros posibles variantes alélicos se hayan descartado; por ejemplo, cuando se descubre que una posición especificada en un ácido nucleico no es adenina (A), timina (T) ni citosina (C), puede concluirse que está presente guanina (G) en esa posición (es decir, se "detecta" G).

Tal como se emplea en la presente, un "subconjunto genético" de una población consiste en los miembros de la población que tienen un genotipo concreto. En el caso de un polimorfismo bialélico, una población puede dividirse potencialmente en tres subconjuntos: homocigóticos para el alelo 1 (1,1), heterocigóticos (1,2), y homocigóticos para el alelo 2 (2,2). Una "población" de sujetos puede definirse utilizado diversos criterios, por ejemplo, los individuos que se están tratando con abacavir, los individuos infectados por VIH, los individuos con unos antecedentes étnicos concretos. Se sabe que la frecuencia de un alelo concreto puede diferir entre poblaciones de diferentes antecedentes étnicos. Por ejemplo, se ha indicado que la frecuencia alélica de HLA-B57 es aproximadamente 4% entre negros y caucásicos (por consiguiente, aproximadamente 8% de esta población porta al menos una copia del alelo HLA-B57), pero entre los japoneses, se ha indicado que la frecuencia es 0,3% (Cao et al., Human Immunology, 62:1009 (2001)). La distribución de subtipos de HLA-B57 también varía con la etnicidad, siendo >90% de los caucásicos HLA-B57-positivos para el subtipo HLA-B5701, comparado con aproximadamente 60% de los afroamericanos (Williams et al., Human Immunology, 62:645 (2001)).

Tal como se emplea en la presente, un sujeto que está "predispuesto" o "tiene un mayor riesgo" a una respuesta fenotípica concreta, basándose en la genotipificación, será más probable que muestre este fenotipo que un individuo con un genotipo diferente al del locus (o loci) polimórfico diana . Cuando la respuesta fenotípica se basa en un polimorfismo multialélico, o en la genotipificación de más de un gen, el riesgo relativo puede diferir entre los múltiples genotipos posibles.

Un "ensayo genético" (también denominado cribado genético), tal como se emplea en la presente, se refiere al ensayo de una muestra biológica procedente de un sujeto para determinar el genotipo del sujeto, y puede utilizarse para determinar si el genotipo del sujeto comprende alelos que provocan, o que aumentan la susceptibilidad a un fenotipo concreto (o que están en desequilibrio de ligamiento con un alelo o alelos que provocan o aumentan la susceptibilidad a este fenotipo).

El "desequilibrio de ligamiento" se refiere a la tendencia de alelos específicos en diferentes localizaciones genómicas a aparecer juntos con más frecuencia que la esperada por el azar. Los alelos en unos loci concretos están en equilibrio completo si la frecuencia de cualquier conjunto concreto de alelos (o haplotipo) es el producto de sus frecuencias en la población individuales. Una medición del desequilibrio de ligamiento que se emplea habitualmente es r:

nr2 tiene una distribución chi-cuadrado aproximada con 1 grado de libertad para marcadores bialélicos. Se considera que los loci que muestran un r tal que nr2 es mayor que 3,84, que se corresponde con una estadística de chicuadrado significativa al nivel 0,05, están en desequilibrio de ligamiento (B.S. Weir, 1996, Genetic Data Analysis II Sinauer Associates, Sunderland, MD).

Como alternativa, una medición normalizada del desequilibrio de ligamiento puede definirse como:

El valor de D' tiene un intervalo de -1,0 a 1,0. Cuando el valor D' absoluto estadísticamente significativo para dos marcadores no es menor que 0,3, se considera que están en desequilibrio de ligamiento.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "un genotipo HLA-B57" se refiere a un genotipo que incluye el alelo HLA-B57. Un genotipo HLA-B57 puede identificarse detectando la presencia de un alelo HLA-B57, o detectando un marcador genético conocido por estar en desequilibrio de ligamiento con HLA-B57.

Tal como se emplea en la presente, la determinación de un genotipo "multilocus" se refiere a la detección, dentro de un individuo, de los alelos presentes en más de un locus. Un sujeto puede ser genéticamente seleccionado para determinar la presencia o la ausencia de un alelo HLA (por ejemplo, el alelo HLA-B57) y un alelo TNFα (por ejemplo, en el locus TNFα G(-237)A).

Tal como se emplea en la presente, el proceso de detectar un alelo o un polimorfismo incluye, pero no se limita a métodos serológicos y genéticos. El alelo o el polimorfismo detectado puede estar funcionalmente implicado en afectar al fenotipo de un individuo, o puede ser un alelo o un polimorfismo que esté en desequilibrio de ligamiento con un polimorfismo/alelo funcional. Los polimorfismos/alelos se manifiestan en el ADN genómico de un sujeto, pero también pueden detectarse en ARN, ADNc o secuencias de proteínas transcritas o traducidas a partir de esta región, tal como será evidente para los expertos en la técnica.

Los alelos, polimorfismos o marcadores genéticos que están "asociados" con HSR a un NRTI, tal como abacavir, están sobrerrepresentados en frecuencia en sujetos tratados que sufren HSR, comparado con sujetos tratados que no sufren HSR, o comparados con la población general.

Según los presentes métodos, los sujetos que se están tratando con abacavir, o que están considerando un tratamiento con abacavir, pueden seleccionarse como ayuda para predecir su riesgo de sufrir una reacción de hipersensibilidad al abacavir. El cribado comprende obtener una muestra biológica del sujeto y analizarla para determinar el genotipo de los genes TNFα y/o HLA, es decir, para determinar la presencia o la ausencia de polimorfismos en uno o ambos genes, que están asociados con un mayor riesgo de HSR al abacavir (comparado con el riesgo asociado con otros polimorfismos).

Los presentes inventores han establecido que existe una correlación entre el genotipo de HLA de un individuo (en particular, de clase I, y más en particular HLA-B) y/o el genotipo de TNFα, y el riesgo de sufrir una reacción de hipersensibilidad a la administración de abacavir. Por consiguiente, un método para evaluar el riesgo relativo de un individuo de HSR al abacavir implica genotipificar ese individuo en el gen TNFα o los genes HLA para determinar si el genotipo del individuo lo expone a un mayor riesgo de HSR al abacavir. Los individuos que poseen un genotipo TNFα o HLA que previamente se han asociado a una mayor incidencia de HSR al abacavir (comparado con la incidencia de HSR en sujetos con otros genotipos) tienen mayor riesgo de HSR.

Los presentes métodos de cribado comprenden genotipificar un sujeto en los genes HLA, en particular los genes HLA de clase I, más en particular el gen HLA-B, que incluye detectar la presencia o la ausencia del alelo HLA-B57 (según se define en la presente).

Los presentes métodos de cribado comprenden también genotipificar un sujeto en el gen TNFα, y más en particular detectar el genotipo en el sitio polimórfico de TNFα G(-237)A (según se define en la presente), en los que la detección de un alelo A indica un mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad, comparado con la detección de un genotipo G/G.

A la vista de la presente descripción, será evidente para los expertos en la técnica cómo determinar otros genotipos de TNFα y/o HLA que están asociados con un mayor riesgo de HSR al abacavir. Se conocen diversas formas alélicas de los genes TNFα y HLA, y en la técnica se conocen métodos para tipificar los genes TNFα y HLA. A medida que se detecten otros polimorfismos en genes TNFα y HLA humanos, la tipificación de dichos polimorfismos puede basarse en métodos conocidos. Por consiguiente, se puede tipificar una población de sujetos que han recibido abacavir, y correlacionar el genotipo de TNFα y/o HLA con la aparición de HSR. En un método alternativo, se pueden genotipificar solo los sujetos que han sufrido HSR y, cuando se conozca la prevalencia de un alelo de TNFα o HLA en una población control concordante (no HSR), determinar si el alelo está sobrerrepresentado en la población HSR, lo cual indica que está asociado con HSR. Tal como será evidente para los expertos en la técnica, la detección de un alelo TNFα o HLA puede realizarse mediante la tipificación de marcadores genéticos que se sepa que están en desequilibrio de ligamiento con el alelo/polimorfismo de TNFα o HLA diana. Preferiblemente, estos marcadores están en desequilibrio de ligamiento sustancial, más preferiblemente los marcadores están en desequilibrio de ligamiento completo.

La presente invención también proporciona un método para evaluar el riesgo relativo de un individuo a sufrir HSR al abacavir, determinando el genotipo de ambos genes TNFα y HLA, para determinar si el genotipo del individuo lo expone a un mayor riesgo de HSR al abacavir. Los individuos que poseen un genotipo TNFα/HLA combinado que esté asociado a una mayor incidencia de HSR al abacavir (comparado con la incidencia de HSR en sujetos con otros genotipos) tienen mayor riesgo de HSR. En particular, los presentes métodos pueden comprender detectar la forma alélica del polimorfismo de TNFα G(-237)A y la presencia o la ausencia del alelo HLA-B57 (y/o marcadores en desequilibrio de ligamiento con estos).

Puesto que existen múltiples genotipos de TNFα y HLA, será evidente para los expertos en la técnica que el riesgo relativo de HSR al abacavir puede variar entre los múltiples genotipos. Por ejemplo, en un método de cribado de multilocus en el que se encuentran más de dos genotipos, puede determinarse que el riesgo relativo sea mayor para un genotipo, menor para otro, e intermedio en otros. Puede considerarse un "mayor riesgo" cuando se compara con el riesgo en una población que no haya sido estratificada según el genotipo (una población general), o puede ser mayor cuando se compara con el riesgo esperado en otro genotipo definido.

Por tanto, la presencia de un genotipo predeterminado particular que esté asociado con un mayor riesgo de HSR indica una mayor probabilidad de que el individuo muestre el fenotipo asociado (reacción HSR) con relación a sujetos con otros genotipos. El genotipo raramente será absolutamente predictivo, es decir, cuando una población con un cierto genotipo muestra una alta incidencia de un fenotipo asociado, no todos los individuos con ese genotipo mostrarán el fenotipo. De forma similar, algunos individuos con un genotipo diferente pueden mostrar el mismo fenotipo. Sin embargo, será evidente para los expertos en la técnica que la genotipificación de un sujeto según se describe en la presente será una ayuda para predecir el riesgo de un sujeto a HSR frente a un tratamiento con abacavir, y así ayudará a tomar decisiones de tratamiento. Los presentes métodos pueden comprender también administrar abacavir a sujetos depués de un cribado, en sujetos en los que se considera que el riesgo de HSR es aceptable; la decisión final del tratamiento se basará en otros factores además del ensayo genético (tal como será evidente para los expertos en la técnica), que incluyen el estado de salud global del sujeto y el resultado esperado del tratamiento.

Será evidente para los expertos en la técnica que los presentes métodos también pueden aplicarse cuando se producen reacciones de hipersensibilidad en respuesta a análogos de nucleósidos sintéticos que no sean abacavir, y en particular NRTI. En particular, estos compuestos incluyen análogos de nucleósidos de purina, análogos de nucleósidos de purina que contienen un anillo de carbono insaturado en lugar del 2'-desoxirribósido de los desoxinucleósidos naturales, y análogos de nucleósidos de purina que contienen un anillo de ciclopenteno insaturado en lugar del 2'-desoxirribósido de los desoxinucleósidos naturales . Además, los presentes métodos son

aplicables cuando aparece HSR en respuesta a NNRTI, tales como efavirenz (SUSTIVA™, Dupont Pharmaceuticals)

y nevirapina (VIRAMUNE®, Boerhinger Ingelheim/Roxane).

Según los presentes métodos, un compuesto (tal como un NRTI o NNRTI) puede seleccionarse para la variación en la incidencia de HSR entre subpoblaciones genéticas de sujetos. Estos métodos incluyen administrar el compuesto a una población de sujetos, obtener muestras biológicas de los sujetos (que puede realizarse antes o después de la administración del compuesto), genotipificar los sitios alélicos polimórficos en el gen TNFα y/o los genes HLA de clase I (en particular, el gen HLA-B), y correlacionar el genotipo de los sujetos con su respuesta fenotípica (por ejemplo, la ausencia de una reacción de hipersensibilidad frente a la presencia de una reacción de hipersensibilidad presunta o confirmada). Tal como será evidente para los expertos en la técnica, debido a la naturaleza grave de HSR, puede ser necesario detener la administración de un compuesto farmacéutico cuando se sospeche una reacción de hipersensibilidad debido a la presencia de sarpullidos y/u otros síntomas compatibles con el síndrome clínico. La correlación de ciertos genotipos con una mayor proporción de HSR (tanto si se ha confirmado como si se existe sospecha clínica de HSR), comparado con la incidencia de HSR en sujetos con otros genotipos, indica que la incidencia de HSR varía entre subpoblaciones genéticas.

Dicho de otro modo, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para determinar la correlación de un alelo polimórfico (tales como los que se encuentran en los alelos TNFα y/o HLA), con la incidencia de una reacción de hipersensibilidad a un compuesto farmacéutico, en particular un NRTI. Los sujetos se estratifican según el genotipo y se evalúa su respuesta al agente terapéutico (de forma prospectiva o retrospectiva) y se comparan los genotipos. De esta forma, pueden identificarse los genotipos que están asociados con una tasa mayor (o menor) de HSR. La mayor o menor tasa de HSR se compara con las tasas entre otros genotipos, o con una población como un todo (es decir, la incidencia en una población que no está estratificada según el genotipo).

Pueden detectarse alelos polimórficos determinando la secuencia polinucleotídica del ADN, o detectando la correspondiente secuencia en transcripciones de ARN a partir del gen polimórfico, o cuando el polimorfismo de ácido nucleico produzca un cambio en una proteína codificada, mediante la detección de dichos cambios en la secuencia de aminoácidos en las proteínas codificadas, utilizando cualquier técnica adecuada según se conoce en la técnica. Los polinucleótidos utilizados para la tipificación son generalmente de ADN genómico, o un fragmento de polinucleótido procedente de una secuencia polinucleotídica genómica, tal como en un banco preparado utilizando material genómico del individuo (por ejemplo, un banco de ADNc). El polimorfismo puede detectarse con un método que comprende poner en contacto una muestra de polinucleótido o de proteína procedente de un individuo, con un agente de unión específica para el polimorfismo, y determinar si el agente se une al polinucleótido o la proteína, indicando la unión que el polimorfismo está presente. El agente de unión también puede unirse a los nucleótidos y aminoácidos flanqueantes en uno o ambos lados del polimorfismo, por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 15 o más nucleótidos o aminoácidos flanqueantes en total o en cada lado. En el caso en que la presencia del polimorfismo se esté determinando en un polinucleótido, este puede detectarse en la forma bicatenaria, pero generalmente se detecta en la forma monocatenaria.

El agente de unión puede ser un polinucleótido (mono-o bicatenario) generalmente con una longitud de al menos 10 nucleótidos, por ejemplo al menos 15, 20, 30, o más nucleótidos. Un agente polinucleotídico que se emplee en el método generalmente se unirá al polimorfismo de interés, y a la secuencia flanqueante, de una manera específica de secuencia (por ejemplo, se hibrida según el apareamiento de bases de Watson-Crick) y, así, generalmente tiene una secuencia que es total o parcialmente complementaria con la secuencia del polimorfismo y la región flanqueante. El agente de unión puede ser una molécula que sea estructuralmente similar a los polinucleótidos que comprenden unidades (tales como análogos de purina o pirimidina, ácidos nucleicos peptídicos, o derivados de ARN, tales como ácido nucleicos bloqueados (LNA)) capaces de participar en un apareamiento de bases de Watson-Crick. El agente puede ser una proteína, generalmente con una longitud de al menos 10 aminoácidos, tal como al menos 20, 30, 50,

o 100 o más aminoácidos. El agente puede ser un anticuerpo (incluyendo un fragmento de dicho anticuerpo que es capaz de unirse al polimorfismo).

En una realización de los presentes métodos, se emplea un agente de unión como una sonda. La sonda puede estar marcada o ser capaz de ser marcada de modo indirecto. Puede utilizarse la detección del marcador para detectar la presencia de la sonda (unida) sobre el polinucleótido o la proteína del individuo. La unión de la sonda al polinucleótido o la proteína puede utilizarse para inmovilizar la sonda o el polinucleótido o la proteína (y así separarlo de una composición o disolución).

En otra realización de los presentes métodos, el polinucleótido o la proteína del individuo se inmoviliza sobre un soporte sólido y después se pone en contacto con la sonda. La presencia de la sonda inmovilizada sobre el soporte sólido (a través de su unión al polimorfismo) entonces se detecta, directamente detectando un marcador sobre la sonda, o indirectamente poniendo en contacto la sonda con un resto que se una a la sonda. En el caso de detectar un polimorfismo de polinucleótido, el soporte sólido en general está fabricado de nitrocelulosa o nailon. En el caso de un polimorfismo de proteína, el método puede basarse en un sistema ELISA.

Los presentes métodos pueden basarse en un ensayo de acoplamiento de oligonucleótidos, en el que se emplean dos sondas oligonucleotídicas. Estas sondas se unen a áreas adyacentes sobre el polinucleótido que contiene el polimorfismo, permitiendo (después de la unión) que las dos sonda se acoplen entre sí mediante una enzima ligasa apropiada. Sin embargo, las dos sondas sólo se unirán (de una manera que permita el acoplamiento) a un polinucleótido que contenga el polimorfismo, y por tanto, la detección del producto acoplado puede utilizarse para determinar la presencia del polimorfismo.

En una realización, la sonda se emplea en un sistema basado en el análisis de heterodúplex para detectar polimorfismos. En este sistema, cuando una sonda se une a una secuencia polinucleótidica que contiene el polimorfismo, forma un heterodúplex en el sitio en el que aparece el polimorfismo (es decir, no forma una estructura bicatenaria). Esta estructura de heterodúplex puede detectarse utilizando una enzima que sea específica de una cadena sencilla o doble. Generalmente, la sonda es una sonda de ARN, y la enzima utilizada es una ARNasa H que rompe la región de heterodúplex, permitiendo así detectar el polimorfismo mediante la detección de los productos de la ruptura.

El método puede basarse en un análisis de desapareamiento de ruptura química fluorescente, que se describe, por ejemplo, en PCR Methods and Applications, 3:268-271 (1994), y en Proc. Natl. Acad. Sci., 85:4397-4441 (1998).

En una realización, el agente polinucleotídico es capaz de actuar como cebador para una reacción de PCR solo si se une a un polinucleótido que contenga el polimorfismo (es decir, un sistema de PCR específico de secuencia o de alelo). Así, solo se producirá un producto de la PCR si el polimorfismo está presente en el polinucleótido del individuo, y la presencia del polimorfismo se determina mediante la detección del producto de la PCR. Preferiblemente, la región del cebador que es complementaria con el polimorfismo está en la región 3' final del cebador o cerca de esta. En una realización de este sistema, el polinucleótido y el agente se unirán a la secuencia de tipo salvaje pero no actúan como cebador para una reección de PCR.

El método puede ser un sistema basado en el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Esto puede utilizarse si la presencia del polimorfismo en el polinucleótido crea o destruye un sitio de restricción que es reconocido por una enzima de restricción. Así, el tratamiento de un polinucleótido que tiene este polimorfismo conducirá a diferentes productos producidos, comparado con la correspondiente secuencia de tipo salvaje. Así, la detección de la presencia de productos de digestión de restricción concretos puede utilizarse para determinar la presencia del polimorfismo.

La presencia del polimorfismo puede determinarse basándose en el cambio que la presencia del polimorfismo produce sobre la movilidad del polinucleótido o la proteína durante una electroforesis en gel. En el caso de un polinucleótido, puede utilizarse el análisis del polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP). Este mide la movilidad del polinucleótido monocatenario sobre un gel desnaturalizante, comparado con el correspondiente polinucleótido de tipo salvaje, indicando la detección de una diferencia en la movilidad la presencia del polimorfismo. Una electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (DGGE) es un sistema similar, en el que el polinucleótido se somete a electroforesis a través de un gel con un gradiente desnaturalizante, indicando una diferencia en la movilidad, comparado con el correspondiente polinucleótido de tipo salvaje, la presencia del polimorfismo.

La presencia del polimorfismo puede determinarse utilizando un tinte fluorescente y un ensayo de PCR basado en un agente de extinción, tal como el sistema de detección de PCR TAQMAN™. En otro método para detectar el polimorfismo, un polinucleótido que comprende la región polimórfica se secuencia a través de la región que contiene el polimorfismo para determinar la presencia del polimorfismo.

Serán evidentes diversas otras técnicas de detección, adecuadas para su uso en los presentes métodos, para los familiarizados con los métodos de detección, identificación y/o distinción de polimorfismo. Estas técnicas de detección incluyen, pero no se limitan a la secuenciación directa, el uso de "balizas moleculares" (sondas oligonucleotídicas que fluorescen tras la hibridación, útiles en la PCR de fluorescencia a tiempo real; véase, por ejemplo, Marras et al., Genet. Anal., 14:151 (1999)); detección electroquímica (reducción u oxidación de azúcares o bases del ADN; véase la patente de EEUU n.º 5.871.918 de Thorp et al.); amplificación de círculo rodante (véase, por ejemplo, Gusev et al., Am. J. Pathol., 159:63 (2001)); el método de detección no basado en PCR de Third Wave Technologies (Madison WI) INVADER® (véase, por ejemplo, Lieder, Advance for Laboratory Managers, 70 (2000)).

Por consiguiente, cualquier técnica de detección adecuada según se conoce en la técnica puede utilizarse en los presentes métodos.

Tal como se emplea en la presente, "determinar" el genotipo de un sujeto no requiere realizar una técnica de genotipificación cuando el sujeto ya ha sido genotipificado, y los resultados del ensayo genético previo están disponibles; por consiguiente, determinar el genotipo de un sujeto incluyen remitirse a análisis genéticos previamente completados.

También se describe un ensayo o kit de ensayo predictivo (cuidado del paciente). Este ensayo ayudará al uso terapéutico de compuestos farmacéuticos, que incluyen NRTI, tales como abacavir, basándose en asociaciones predeterminadas entre genotipo y respuesta fenotípica al compuesto terapéutico. Este ensayo puede tomar diferentes formatos, que incluyen:

(a) un ensayo que analiza el ADN o ARN para determinar la presencia de alelos y/o polimorfismos predeterminados. Un kit de ensayo apropiado puede incluir uno o más de los siguientes reactivos o instrumentos: una enzima capaz de actuar sobre un polinucleótido (generalmente una polimerasa o una enzima de restricción), tampones adecuados para los reactivos enzimáticos, cebadores de PCR que se unen a regiones que flanquean el polimorfismo, un control positivo o negativo (o ambos), y un aparato de electroforesis en gel. El producto puede utilizar una de las tecnologías de chip descritas en la técnica. El kit de ensayo incluirá instrucciones impresas o legibles mediante una máquina que ofrezcan la correlación entre la presencia de un genotipo específico y la probabilidad de que un sujeto tratado con un compuesto farmacéutico específico sufra una reacción de hipersensibilidad;

(b) un ensayo que analice materiales procedentes del cuerpo de un sujeto, tales como proteínas o metabolitos, que indican la presencia de un polimorfismo o un alelo predeterminado. Un kit de ensayo apropiado puede 5 comprender una molécula, un aptámero, un péptido o un anticuerpo (incluyendo un fragmento de anticuerpo) que se une específicamente con una región polimórfica predeterminada (o una región específica que flanquea el polimorfismo). El kit puede comprender también uno o más reactivos o instrumentos adicionales (según se conoce en la técnica). El kit de ensayo incluirá también instrucciones impresas o legibles mediante una máquina que ofrezcan la correlación entre la presencia de un polimorfismo o un genotipo específico y la probabilidad de

10 que un sujeto tratado con un análogo de nucleósido sintético específico sufra una reacción de hipersensibilidad;

Los especímenes biológicos adecuados para el ensayo son aquellos que comprenden células y ADN e incluyen, pero no se limitan a sangre o componentes sanguíneos, manchas de sangre seca, orina, hisopos bucales y saliva. Las muestras adecuadas para el ensayo serológico de HLA son muy conocidas en la técnica.

Ejemplos

15 Ejemplo 1

Diseño del estudio

Se realizó un estudio retrospectivo de casos-controles con sujetos infectados por VIH adultos (>18 años de edad) que participaron en un programa de desarrollo clínico de abacavir de Glaxo Wellcome. Los sujetos se clasificaron como sujetos "caso" o "control" basándose en lo siguiente. Los sujetos caso habían sufrido un episodio de 20 hipersensibilidad presunto o confirmado al abacavir; los sujetos control habían recibido abacavir durante al menos seis semanas, pero no habían sufrido un episodio de HSR presunto o confirmado. Se eligió el periodo de tratamiento de seis semanas basándose en el conocimiento de que la mayoría de los acontecimientos de HSR se producen dentro de las primeras seis semanas de tratamiento. Se recogieron las narraciones de los casos en el momento, o cerca de este, de la reacción de hipersensibilidad presunta o confirmada. Los sujetos control se hicieron concordar

25 para el estudio (si era posible) de la etnicidad, el género, el recuento de células CD4+ (si está disponible; cuatro intervalos de CD4+: <50, 50-200, 201-500, >500 células/mm3); y la edad (más o menos 5 años). Cuando fue posible, también se hizo concordar el régimen de tratamiento ("no expuesto a tratamiento" frente a sometido a tratamiento).

La recogida de los datos incluyó la demografía (edad, género, raza, clasificación CDC para la infección por VIH);

30 historia de alergias a medicinas y alimentos, sarpullidos por fármacos, asma, eccema, fiebre del heno, etc.; terapia antirretrovírica (ART) y medicaciones concomitantes tomadas en el momento de HSR (o, para los controles, durante las primeras seis semanas de tratamiento con abacavir).

El estado de casos-controles, la demografía y la historia de alergias se proporcionan en las tablas 1, 2 y 3.

Tabla 1- Estados de casos-controles (N = 123)

Estado de casos-controles

n.º de concordantes n.º de sujetos

1 caso - 2 controles

16 48 (39%)

1 caso - 1 control

14 28 (23%)

1 caso - 3 controles

1 4 (3%)

1 caso - 0 controles

14 14 (11%)

0 casos - 1 control

15 15 (12%)

0 casos - 2 controles

7 14 (11%)

Tabla 2 – Demografía

Casos (N = 45)

Controles (N = 78)

Edad, media (intervalo)

42 (29-63) 40 (30-62)

Edad (años)

18-35

15 (34%) 27 (35%)

35-54

25 (57%) 49 (63%)

>54

4 (9%) 2 (3%)

Género

Hombre

40 (89%) 70 (90%)

Mujer

5 (11%) 8 (10%)

Tabla 3 - Historia de alergias

Casos (N = 45)

Controles (N = 78)

Cualquer alergia

33 (73%) 46 (59%)

Alergia a sulfa-fármacos

14 (31%) 14 (18%)

Cualquier alergia a NNRTI*

9 (20)% 4 (5%)

Historia de sarpullido porfármacos

otros 13 (29%) 14 (18%)

Se estudiaron los polimorfismos en una serie de genes candidatos. Los polimorfismos estudiados en el gen TNFα incluyen G(-237)A. También se estudió la presencia o la ausencia del alelo HLA-B57.

Ejemplo 2

5 Cribado de TNFα

Puede determinarse la presencia del polimorfismo de TNFα G(-237A) utilizando un tinte fluorescente y un ensayo de PCR basado en un agente de extición, tal como la forma de discriminación de alelos del ensayo de la 5' nucleasa (Lee y Bloch, Nucleic Acids Research, 21:3761 (1993)). Brevemente, este ensayo emplea dos sondas específicas de alelo marcadas de forma diferente con tintes "indicadores" fluorescentes en los extremos 5' y con el mismo agente

10 de extición en los extremos 3'. Normalmente, la fluorescencia de cada tinte indicador es extinguida por el agente de extinción cuando está presente en la misma molécula olignucleotídica. Las sondas específicas de alelo se utilizan junto con dos cebadores, uno de los cuales se hibrida con el molde 5' de las sondas específicas de alelo, mientras que el otro se hibrida con el molde 3' de dichas sondas.

Se determinó la presencia de polimorfismos de TNFα G(-237)A mediante el método de discriminación alélica,

15 utilizando el ensayo de la 5'-nucleasa. Se emplearon dos sondas específicas de alelo con un tinte fluorescente diferente en los extremos 5', pero con el mismo agente de extinción en los extremos 3':

TNFα G(-237)A - G : FAM-CCTGCTCCGATTC (MGB) (SEQ ID NO:9)

TNFα G(-237)A - A: VIC-CCCTGCTCTGATTC (MGB) (SEQ ID NO:10)

Ambas sondas tenían un grupo fosfato 3', de modo que la polimerasa termoestable AmpliTaq Gold™ polimerasa no

20 les podía añadir nucleótidos. Las dos sondas específicas de alelo se diseñaron utilizando un programa informático especializado, tal como se conoce en la técnica, de modo que se hicieron concordar ciertas propiedades (temperatura de fusión, contenido en GC, posición de la base polimórfica, localización dentro del amplicón) en la medida de lo posible, permitiendo solo una hibridación completa al ADN molde cuando la base polimórfica específica de alelo está presente.

25 Las sondas específicas de alelo se utilizaron junto con dos cebadores, uno de los cuales se hibrida con el molde 5' de las dos sondas específicas de alelo, mientras que el otro se hibrida con el molde 3' de las dos sondas.

TNFα G(-237)A directo: ATCAGTCAGTGGCCCAGAAGAC (SEQ ID NO:11)

TNFα G(-237)A inverso: GGGACACACAAGCATCAAGGATA (SEQ ID NO:12)

Si está presente el alelo que corresponde a una de las sondas específicas, la sonda específica se hibrida

30 prefectamente con la secuencia diana derivada del molde. La polimerasa termoestable, que extiende el cebador en la dirección 5' a 3' hacia la sonda específica de alelo, elimina los nucleótidos de la sonda específica, liberando el tinte fluorescente y el agente de extinción. Esto produce un aumento en la fluorescencia desde el tinte indicador, que ya no está cerca del agente de extinción.

Si la sonda específica de alelo se hibrida con el otro alelo, el apareamiento incorrecto en el sitio polimórfico inhibe la 35 actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa termoestable y, así, evita la liberación del tinte indicador fluorescente.

Al final de los ciclos térmicos de la PCR, se emplea el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™7700 para medir el aumento en la fluorescencia desde cada tinte específico directamente en recipientes de reacción de PCR. Entonces se analiza la información de las reacciones. Si un individuo es homocigótico para un alelo concreto, se libera la fluorescencia correspondiente solo al tinte de esta sonda específica, pero si el individuo es heterocigótico, entonce aumenta la fluorescencia de ambos tintes.

Los resultados del cribado del polimorfismo de TNFα G(-237) se muestran en la tabla 4.

Tabla 4

Genotipo

Casos (N = 44) Controles (N = 76) valor de p

1,1 (G/G)

22 (50%) 71 (93%) <0,0001

1,2 (G/A)

20 (45%) 4 (5%) <0,0001

2,2 (A/A)

2 (5%) 1 (1%) 0,1573

La distribución de TNFα G(-237)A según diversos grupos étnicos se muestra en la tabla 5 (basándose en el Cribado genético de una población genética disponible en el mercado).

10 Tabla 5

G/G (1,1) N

A/G (1,2) N A/A (2,2) N Frecuencia alélica para G Frecuencia alélica para A

Caucásicos (N = 88)

83 4 1 96,6% 3,4%

Afroamericanos (N = 86)

73 13 0 92,44% 7,56%

Hispanos (N = 50)

45 5 0 95,0% 5,0%

Asiáticos (N = 30)

28 2 0 96,7% 3,3%

Nativos americados del SO (N = 8)

5 3 0 81,24% 18,75%

En el anterior estudio, en la mayoría de los casos se observa la presencia de un alelo "A" (genotipo A/A o A/G), comparado con los controles. El genotipo G/G aparece con menos frecuencia en los casos, comparado con los controles.

Ejemplo 3

15 Cribado de HLA-B57

Se realizó la genotipificación del gen HLA-B en muestras de 120 sujetos (44 casos y 76 controles) en los laboratorios de investigación de the Anthony Nolan Bone Marrow Trust (Royal Free Hospital, Londres, Reino Unido). La tipificación se realizó principalmente utilizando el análisis de la conformación mediado por la cadena de referencia ("Reference Strand-mediated Conformation Analysis" (RSCA); véase, por ejemplo, Pel-Freez® Clinical Systems,

20 LLC), tal como se conoce en la técnica (Arguello et al., Reviews in Immunogenetics, 1:209 (1999); Arguello et al., Tissue Antigens, 52:57 (1998)). Se emplearon técnicas de secuenciación de ADN y de sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia (SSOP) (véase, por ejemplo, Yoshida et al., Hum. Immunol., 34:257 (1992); Smith et al., Hum. Immunol., 55:74 (1997)) cuando fue necesario, como técnicas de respaldo para determinar el genotipo de HLA.

25 De todos los casos, se descubrió qu 25/44 (57%) tenían el alelo HLA-B57 (es decir, eran heterocigóticos u homocigóticos para el alelo HLA-B57), mientras que sólo 3/76 (4%) de los controles tenían el alelo HLA-B57 (cada uno era heterocigótico para el alelo HLA-B57).

Tabla 6 - Frecuencia alélica - HLA-B57

Casos (N = 44)

Controles (N = 76) valor de p

HLA-B57 presente

25 (57%) 3 (4%) <0,0001

En los sujetos que tienen al menos un alelo HLA-B57 (casos (n = 25) y controles (n = 3)), se muestra el subtipo de HLA-B57 en la tabla 7. El alelo más común es B*5701 (24/25 o 96% de los casos portaban al menos una copia, así como 1/3 o 33,3% de los controles).

En el presente estudio, el genotipo HLA-B57 se encontró con más frecuencia en los casos que en los controles.

Tabla 7 - Genotipo HLA-B de los casos y controles que tenían al menos un alelo HLA-B57

Genotipo HLA-B

n.º de sujetos Porcentaje

CONTROLES N = 3

B*0801,B*5701

1 33,3%

B*4501,B*57031

1 33,3%

B*4801,B*57031

1 33,3%

CASOS N = 25

B*0702, B*5701

4 16,0%

B*07021, B*5701

1 4,0%

B*1402 , B*5701

1 4,0%

B*1801, B*5701

1 4,0%

B*35011, B*5701

1 4,0%

B*3503, B*5701

1 4,0%

B*3701, B*5701

1 4,0%

B*3801, B*5701

3 12,0%

B*4001, B*5701

1 4,0%

B*4102, B*5701

1 4,0%

B*4402, B*5701

1 4,0%

B*44021, B*5701

1 4,0%

B*4403, B*5701

1 4,0%

B*44031, B*5701

1 4,0%

B*44031, B*5704

1 4,0%

B*4901, B*5701

1 4,0%

B*5501, B*5701

1 4,0%

B*5701, B*5701

2 8,0%

B*5701, B*57031

1 4,0%

Ejemplo 4

Los datos se obtuvieron de sujetos además de los indicados en los anteriores ejemplos. Los otros sujetos del estudio de casos-control retrospectivo descrito en el ejemplo 1 se seleccionaron para la presencia del polimorfismo de TNFα 10 G(-237)A y HLA-B57. Los datos acumulados (combinando los resultados proporcionados en los ejemplos previos y los datos adicionales) se indican en las tablas 8 y 9. El número total de sujetos fue 161; en cinco sujetos no había

datos disponibles para el estado de TNFα G(-237)A, y no había datos disponibles en tres sujetos para el estado de HLA B57.

Tabla 8 - TNFα G(-237)A

Genotipo

Casos (N = 57) Controles (N = 99) valor de p

1,1 (G/G)

32 (56%) 92 (93%)

1,2 (G/A)

23 (40%) 6 (6%) <0,0001*

2,2 (A/A)

2 (4%) 1 (1%)

* El valor de P procedente del ensayo de chi-cuadrado de Mantel Haenszel indica una diferencia estadísticamente significativa entre la tasa del alelo A presente en los casos frente a los controles.

Tabla 9 - Frecuencia alélica - HLA-B57

Casos (N = 59)

Controles (N = 99) valor de p

HLA-B57 presente

30 (51%) 3 (3%) <0,0001*

HLA-B5701 presente

28 (47%) 1 (1%) <0,0001

* El valor de P procedente del ensayo de chi-cuadrado de Mantel Haenszel indica una diferencia estadísticamente significativa entre la tasa de HLA B57 presente en los casos frente a los controles.

5 Los sujetos que tienen al menos un alelo HLA-B57 (casos = 30, y controles = 3) se ensayaron para determinar la aparición del subtipo HLA B*5701. En los casos, 28/30 (93%) tenían al menos un alelo B*5701; en los controles, 1/3 (33%) tenían al menos un alelo B*5701.

En el presente estudio, el genotipo HLA-B57 se encontró con más frecuencia en los casos que en los controles.

Ejemplo 5

10 Diseño del estudio

Se analizaron datos adicionales procedentes del estudio de casos-control retrospectivo descrito en el ejemplo 1, que incluye información de otros sujetos e información relacionada con otros genes candidatos. Los ejemplos 5 y 6 son acumulados e incluyen los resultados proporcionados en los ejemplos anteriores, así como datos adicionales. Los sujetos de los ejemplos anteriores son parte de la población mayor indicada en los ejemplos 5 y 6.

15 Se realizó un estudio de investigación de casos-control concordantes, retrospectivo y multicéntrico para identificar variantes de genes candidatos asociados con la hipersensibilidad al abacavir. Los sujetos eran individuos adultos (≥ 18 años de edad) infectados por VIH que participaron en un programa de desarrollo clínico de abacavir de GlaxoWellcome (ahora GlaxoSmithKline (GSK)). Se obtuvo el consentimiento informado. Los sujetos se clasificaron como "caso" o "control". Se emplearon los siguientes criterios para identificar los casos:

20 1. Sujetos que sufrieron síntomas coherentes con la hipersensibilidad al abacavir (véase n.º 2 siguiente); estos síntomas volvieron a las 12 horas de la reexposición al abacavir; se detuvo permanentemente el tratamiento con abacavir.

2. Sujetos que sufrieron dos o más de los siguientes síntomas en un intervalo de 2 días: fiebre, sarpullido,

síntomas gastrointestinales (que incluyen náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal) y que detuvieron 25 permanentemente el tratamiento con abacavir.

3. Sujetos que fueron diagnosticados por un médico que no pertenece a GSK que habían desarrollado "HSR", "reacción alérgica", o "anafilaxis" que se atribuyó al abacavir y que detuvieron permanentemente el tratamiento con abacavir.

Antes del cribado de un sujeto como "caso", el diagnóstico de la hipersensibilidad al abacavir fue evaluado por un 30 médico de GSK para determinar la coherencia con la presentación clínica de la hipersensibilidad.

Controles concordantes: Sujetos adultos infectados por VIH (18 años de edad) que participaron en el programa de desarrollo clínico de abacavir de GSK y que toleraron el abacavir durante al menos 6 semanas sin señales de una reacción de hipersensibilidad. Los sujetos control se hicieron concordar con un sujeto caso concreto en base a cinco criterios cuando fue posible: edad (más o meno 5 años), género, etnicidad, recuento de células CD4+, y régimen de

35 tratamiento. Cuando fue posible, se reclutaron dos controles concordantes para cada caso inscrito en el estudio.

Gestión y procesamiento de la muestra

Se recogieron muestras sanguíneas en tubos de recogida de sangre apropiados. La extracción del ADN fue realizada por DNA Sciences (Morrisville, NC), y el ADN extraído se envió a GSK para la genotipificación. Con la excepción de la genotipificación de HLA, los ensayos genéticos fueron realizados por GSK. La tipificación de HLA

5 fue realizada por the Anthony Nolan Bone Marrow Trust, Londres, Reino Unido. Los loci de HLA (A, B, y DR) fueron genotipificados mediante el método del análisis conformacional de cadena inversa (RSCA), utilizando secuenciación de ADN e hibridación de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) como respaldo (véase el ejemplo 3). Se genotipificaron marcadores polimórficos distintos de los loci de HLA utilizado la forma de discriminación alélica del ensayo de la 5' nucleasa (Applied Biosystems, Foster City, CA; véase el ejemplo 2).

10 Las muestras se analizaron para la presencia o la ausencia de 114 alelos polimórficos.

Sujetos de estudio

Se inscribieron un total de 229 sujetos y proporcionaron el consentimiento informado. Se excluyeron 29 sujetos (las muestra produjeron un ADN inadecuado y/o el sujeto retrospectivamente no cumplía los criterios de inclusión). Doscientos sujetos (85 de 100 casos, y 115 de 129 controles) tenían datos evaluables de al menos uno de los 114

15 marcadores genéticos. Un total de 157 muestras de los sujetos fueron evaluables para TNFα -237, y un total de 197 muestras de los sujetos fueron evaluables para HLA-B.

La población de estudio tenía una mediana de edad de 39,8 (24-65) años, y eran predominantemente hombres (92%) y caucásicos (74%). Las características demográficas y de línea de base fueron similares entre los casos y los controles concordantes. Veintisiete sujetos (14%) eran negros, y 21 (11%) eran hispanos (tabla 10).

20 Tabla 10

Resumen de las características demográficas y de línea de base según el estado de casos-controles

Característica

Casos N = 85 Controles N = 115 Total N = 200

Edada (años)

N

85 115 200

Mediana (intervalo)

40,3 (29-63) 39,8 (24-65) 39,8 (24-65)

18-35 años, n(%)

24 (28) 32 (28) 56 (28)

36-54 años, n(%)

55 (65) 78 (68) 133 (67)

≥55 años, n(%)

6 (7) 5 (4) 11 (6)

Sexo

N

85 115 200

Hombres, n(%)

79 (93) 105 (91) 184 (92)

Mujeres, n(%)

6 (7) 10 (9) 16 (8)

Etnicidad

N

85 115 200

Blancos, n(%)

66 (78) 82 (71) 148 (74)

Negros, n(%)

9 (11) 18 (16) 27 (14)

Asiáticos, n(%)

0 0 0

7 (8)

14 (12) 21 (11)

Hispanoamericanos, n(%) Otros, n(%)

3 (4) 1 (<1) 4 (2)

Clase CDCa N

85 114 199

A, n(%) B, n(%) C, n(%) Otros, n(%)

31 (36) 16 (19) 36 (42) 2 (2) 43 (38) 22 (19) 45 (39) 4 (4) 74 (37) 38 (19) 81 (41) 6 (3)

a En el momento de comenzar con el abacavir

Cincuenta de los 85 casos (59%) concordaban con al menos un control, y 41% de los casos no tenían control concordante (tabla 11). Las razones por las que carecen de controles incluyen: incapacidad para identificar un control concordante, y datos insuficientes. Para los 50 casos y sus 80 controles concordantes, 81% de los controles concordaban con un caso por la edad más o menos 5 años, 99% por género, 90% por la etnicidad, 4% por los recuentos de células CD4 (principalmente debido a datos insuficientes), y 94% por el régimen de tratamiento (o participación en el programa de acceso expandido de abacavir).

Tabla 11

Resumen del estado de casos-controles

Estado de casos HSR-controles

n.º de grupos concordantes n.º de sujetos N = 200 n(%)

1 caso HSR - 2 controles 1 caso HSR - 1 control 1 caso HSR - 3 controles 1 caso HSR - 0 controles 0 casos HSR - 1 control 0 casos HSR - 2 controles

28 21 1 35 17 9 84 (42,0) 42 (21,0) 4 (2,0) 35 (17,5) 17 (8,5) 18 (9,0)

Ejemplo 6

Resultados

10 Análisis univariante de la asociación genética con la hipersensibilidad

Para cada polimorfismo, se calcularon las frecuencias alélicas entre los casos y los controles utilizando análisis univariantes. Los polimorfismos (distintos de los polimorfismos de HLA) con frecuencias significativamente diferentes entre los casos y los controles (valor de p de 0,05 o menor) se identifican en la tabla 12 (ensayo exacto de Fisher o análisis de regresión logística condicional de la diferencia entre las tasas). El polimorfismo de TNF G(-237)A estaba

15 presente en 25 de 58 casos (43%), comparado con 7 de 99 (7%) de los controles.

Tabla 12

Gen (posición SNP)

Referencia (NCBI dbSNP o GenBank) Varianteb Casos Controles valor de p

TNFα (-237)

RS361525 A2 = A 25 (43%) 7 (7%) <0,0001

TNFα (-308)

RS1800629 A2 = A 5 (8%) 28 (28%) 0,0024

TNFα (-5.100)

A2 = G 8 (13%) 30 (31%) 0,0127

MICA (-9,263)

RS1052416 A1 = A A2 = G 48 (92%) 19 (37%) 64 (70%) 66 (72%) 0,0015 <,0001

MICA (exón 2)

RS1063630 A1 = T A2 = G 40 (83%) 38 (67%) 68 (96%) 47 (48%) 0,0391c 0,0297

MICA (exón 3)

RS1051792 A1 = G A2 = A 46 (77%) 49 (82%) 88 (90%) 57 (58%) 0,0384 0,0029

MICB (exón 2)

RS1065075 A1 = G A2 = A 23 (38%) 48 (100%) 56 (57%) 67 (92%) 0,0334 0,0423c

MICB (exón 3)

RS1051788 A1 = A A2 = G 23 (38%) 48 (100%) 56 (58%) 65 (93%) 0,0209 0,0858c

ARN helicasa p47 dependiente de

A2 = T 27 (45%) 63 (66%) 0,0130

Gen (posición SNP)

Referencia (NCBI dbSNP o GenBank) Varianteb Casos Controles valor de p

ATP

ARN helicasa p47 dependiente de ATP

RS929138 A1 = C A2 = T 39 (68%) 46 (81%) 37 (39%) 91 (96%) 0,0007 0,0040

Alcohol deshidrogenasa ADH7 (ADH7-C94T)

Nucleótido 403 en GenBank entrada M16286 (5'UTR) A1 = C A2 = T 3 (5%) 45 (96%) 16 (17%) 59 (84%) 0,0431 0,0606c

UDP-glucuronosiltransferasa (UGT1A6-A551C)

Nucleótido 765 en GenBank M84130 A1 = A 46 (77%) 59 (60%) 0,0377

a A menos que se indique lo contrario, el valor de p se basa en el ensayo exacto de Fisher. b A1 = alelo 1, A2 = alelo 2. c El valor de p se basa en una regresión logística condicional entre los casos y sus controles concordantes.

El análisis univariante de la tipificación de HLA muestra seis loci con frecuencias significativamente diferentes en los casos y los controles (p < 0,1, ensayo exacto de Fisher, tabla 13). De estos, la diferencia en la frecuencia de HLA-B57 era la más significativa (p < 0,0001). HLA-B57 estaba presente en 39 de 84 (46%) casos, frente a 4 de 113 (4%) controles.

Tabla 13

Resumen de los alelos HLA mediante el estado de casos-controles para los valores de p <0,1a

Alelo HLA

Casos N (%) Controles N (%) valor de p

HLA-A31

0 6 (6%) 0,0839

HLA-B08

4 (5%) 15 (13%) 0,0526

HLA-B57

39 (46%) 4 (4%) <,0001

HLA-DRB01

6 (10%) 21 (21%) 0,0826

HLA-DRB03

2 (3%) 18 (18%) 0,0060

HLA-DRB07

23 (38%) 21 (21%) 0,0277

a Ensayo exacto de Fisher.

Entre los polimorfismos que no son HLA, los dos polimorfismos con la mayor significancia estadística fueron TNFα(237) y MICA (-9263). Los genes HLA-B, MICA y TNFα están colocalizados muy cercanos entre sí sobre el cromosoma 6, y los resultados de la genotipificación fueron coherentes con la alta asociación alélica entre HLA-B57 y el alelo de TNFα G(-237)A.

10 HLA-B57 y TNFα están colocalizados muy cercanos entre sí sobre el cromosoma 6, y muestran una alta asociación alélica (tabla 14). En todos los casos, menos dos, las reacciones de hipersensibilidad con el alelo TNFα -238A también eran positivos a HLA-B57; cinco casos de hipersensibilidad que eran positivos a HLA-B57 carecían del alelo TNFα -238A.

Tabla 14

Resumen de la asociación de HLA-B57 y TNFα -237

HLA-B57

TNFα -237 Casos HSR N (%) Controles N (%)

Sujestos sin HLA-B57 N

Alelo A Sin alelo A 30 2 (7) 28 (93) 96 5 (5) 91 (95)

Sujetos con HLA-B57 presente N

Alelo A Sin alelo A 28 23 (82) 5 (18) 3 1 (33) 2 (67)

Análisis multivariante de la asociación genética con la hipersensibilidad

Se realizaron análisis multivariantes exploratorios para investigar las contribuciones de diferentes marcadores

5 genéticos. Se realizó una regresión logística condicional utilizando un subconjunto de casos que tienen al menos un control concordante (50 casos y 80 controles, véase la tabla 11). Se realizó un análisis secundario utilizando la regresión logística con el total de 85 casos y 115 controles, independiente de la concordancia. Estos análisis indican que HLA-B57 es el marcador más robusto de los marcadores estudiados para la hipersensibilidad.

Se empleó el reparto recursivo para investigar si las combinaciones de variables, incluyendo alelos marcadores,

10 podrían estar actuando para modificar significativamente el riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir. HLA-B57 fue el predictor más significativo sobre si un sujeto era un caso o un control (valor de p ajustado a Bonferroni < 0,0001) (tabla 15). De los 159 sujetos con datos suficientes para la inclusión en el análisis de reparto recursivo, 33 (21%) tenían HLA-B57; de estos, 30 (91%) eran casos. Entre los 33 sujetos positivos a HLA-B57, 31 eran negativos a DRB03; dentro de este grupo de 31 sujetos, 30 (97%) eran casos (valor de p ajustado a Bonferroni

15 = 0,001).

Tabla 15

Resumen de los datos de repart

o recursivo por HLA

Cases HSR N = 84

Controles N = 113

Sujetos con ≥1 alelo HLA-B57 presente, N(%) Sujetos sin alelo HLA-B57, N(%)

39 (46) 45 (54) 4 (4) 109 (96)

Se descubrió una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de HLA-B57 y una historia de hipersensibilidad al abacavir. También se descubrió una asociación entre la presencia del polimorfismo de TNF 237A y la hipersensibilidad al abacavir, pero esta asociación pueden justificarse casi por completo por la presencia

20 de HLA-B57. Un tercer polimorfismo en la misma región, MICA -9263G, también resultó significativo mediante el análisis univariante, pero no en el análisis multivariante.

Análisis de los subgrupos

A continuación se presentan unos análisis descriptivos de los subgrupos demográficos. La mayoría de los sujetos en este estudio eran hombres blancos. Tal como se muestra en la tabla 16, 53% de los casos de hombres blancos

25 tenían al menos un alelo HLA-B57, comparado con 3% de los controles de hombres blancos. Dos de nueve casos (22%) de hipersensibilidad entre hombres negros eran positivos a HLA-B57, comparado con 1 de 16 controles de hombres negros (6%). Entre los hispanos y otros grupos étnicos identificados, ninguno de los 9 casos eran positivos a HLA-B57, comparado con 1 de 13 controles.

Tabla 16

Resumen de los datos de HLA-B57 por etnicidad: Hombres

Hombres

Etnicidad Blancos Negros Otros Total

Casos HSR NHLA-B57, n(%)

60 9 9 32 (53) 2 (22) 0 78 34 (44)

Controles Nn (%)

74 16 13 2 (3) 1 (6) 1 (8) 103 4 (4)

La mayoría de los sujetos del estudio eran hombres. De los seis casos de mujeres inscritos, cinco eran blancas (tabla 17). Cuatro de los cinco casos de mujeres blancas eran positivos a HLA-B57, comparado con ninguno de los seis controles. Aunque la asociación no se ensayó estadísticamente, la tendencia se corresponde con la de los hombres blancos.

Tabla 17 LISTADO DE SECUENCIAS

Resumen de los datos de HLA-B57 por etnicidad: Mujeres

Mujer

Etnicidad Blancas Negras Otros Total

Casos HSR NHLA-B57, n(%)

5 0 1 4 (80) 0 1 (100) 6 5 (83)

Controles Nn (%)

6 2 2 0 0 0 10 0

<110> Glaxo Group Limited Seth Hetherington Arlene R. Hughes Eric Lai Michael Mosteller, Jr. Denise Shortino

<120> MÉTODO DE SELECCIÓN PARA LA REACCIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD A UN FÁRMACO

<130> PU4539WO 5 <150> 60/314.026

<151>

<150> 60/336.850

<151>

<160> 13 10 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1183

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15 <400> 1

<210> 2

<211> 817

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<400> 2

5

<210> 3 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 3

cactgggttt gttgcagtaa gccacytcga atgttgctgt agaattaaag t

51

10

<210> 4 <211> 12930 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> configuración variada

<222> 26

<223> n = A/G

<400> 5

gtgggcagaa gatgtcctgg gagctnagac ctgggacaca gagaccgagg a 51

<210> 6

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> configuración variada

<222> 26

<223> n = A/G/C

<400> 6

caggggctcc cggcatttct actacnatgg ggagctcttc 51 ctctcccaaa a

<210> 7

<211> 101

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> configuración variada

<222> 51

<223> n = A o T

<400> 7

<210> 8

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> configuración variada

<222> 26

<223> n = A/G

<400> 8

ctttggcaat tctatatggt gagctntaaa ggtgggctcc aggtagggat g

<210> 9

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 9

cctgctccga ttc 13

<210> 10 <211> 14 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

5

<220> <223> Homo sapiens

<400> 10

ccctgctctg attc

14

10

<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Homo sapiens

15

<400> 11

atcagtcagt ggcccagaag ac

22

20

<210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Homo sapiens

<400> 12

gggacacaca agcatcaagg ata

23

25

<210> 13 <211> 720 <212> ADN <213> Homo sapiens

30

<220> <221> configuración variada <222> 452 <223> n = C o G

<400> 13

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un método de cribado de un sujeto humano como una ayuda para predecir la respuesta a la administración de abacavir, que comprende determinar si el sujeto tiene un alelo "A" en el sitio polimórfico G(-237)A de TNFα (SEQ ID NO:1), en el que la presencia de dicho genotipo de TNFα indica que el sujeto tiene mayor riesgo de una reacción de

   5 hipersensibilidad al abacavir, comparado con el riesgo de individuos sin ese alelo.
2. 2.- Un método según la reivindicación 1, que comprende además determinar si el sujeto tiene una o dos copias de un alelo HLA-B57.
3. 3.- Un método de cribado de un sujeto humano como una ayuda para predecir la respuesta a la administración de abacavir, que comprende determinar si el sujeto tiene un alelo HLA-B57, en el que la presencia de dicho genotipo de

   10 HLA indica que el sujeto tiene mayor riesgo de una reacción de hipersensibilidad al abacavir, comparado con el riesgo de individuos sin dicho alelo.
4. 4.- Un método según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que dicho genotipo es un genotipo que incluye una o dos copias del alelo HLA-B*5701.
5. 5.- Un método según una cualquiera de las reivindicacioens 2 a 4, en el que dicho genotipo de HLA se determina 15 mediante un método que detecta la presencia o la ausencia de la secuencia de ADN alélica de HLA.
6. 6.- Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho sujeto no ha sido tratado previamente con abacavir.
7. 7.- Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sujeto ha sido tratado previamente con abacavir.

   20 8.- Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho sujeto ha sido diagnosticado con un trastorno seleccionado de una infección por VIH, enfermedad del VIH, SIDA, y complejo relacionado con SIDA.