KR20120092876A

KR20120092876A - Ｖｐｒｅｂ１ 유전자의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20120092876A
Application number: KR1020110012768A
Authority: KR
Inventors: 정연준
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2012-08-22

Abstract

본 발명은 VPREB1 유전자의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 VPREB1 유전자의 복제수 변이를 이용한 만성 관절 류마티즘의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, VPREB1 유전자의 복제수 변이를 측정함으로써 만성 관절 류마티즘의 발증 또는 그 발증 가능성을 고정밀도로 간편하고 확실하게 수행할 수 있으며, 만성 관절 류마티즘의 새로운 예방법 및 치료법으로 사용 가능하다.

Description

ＶＰＲＥＢ１ 유전자의 신규한 용도{Novel use of VPREB1 gene}

본 발명은 VPREB1 유전자의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 VPREB1 유전자의 복제수 변이를 이용한 만성 관절 류마티즘의 진단방법에 관한 것이다.

사람은 유전적으로 서로 다르며, 다양한 유전체 변이를 가지고 있다. 사람마다 가지고 있는 고유한 유전체 변이는 혈액형부터 키, 몸무게 같은 다양한 형질뿐만 아니라 악성종양, 고혈압, 당뇨병과 같은 복잡 유전자 질환의(complex disease) 이환 감수성에 영향을 미친다. 따라서 개인의 유전체 변이를 발굴하고 데이터베이스화하며 형질과의 관련성을 찾는 것은 유전체 정보로부터 무병 장수의 꿈을 이루고자 하는 유전체학의 궁극적인 목표이다.

2000년대 초중반 인간 유전체의 대표적인 변이로 알려진 것은 뉴클레오티드의 변화, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism) 이었다. 하지만 2004년 두 편의 논문에 의해 유전자 복제수 변이, 즉 CNV(copy number variation)의 존재가 알려지고(Iafrate AJ et al., (2004) Detection of large-scale variation in the human genome. Nature Genetics 36 (9), 949-951.; Sebat J et al., (2004) Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science 305 (5683), 525-528), 이 변이가 사람의 유전체에 광범위하게 존재한다는 사실이 밝혀지기 시작하면서(Redon R et al., (2006) Global variation in copy number in the human genome. Nature 444 (7118), 444-454), 유전체학 분야에서 CNV에 대한 관심이 급격히 높아지게 되었다.

CNV는 수백 bp 이상 - 약 1 Mb에 이르는 염기 서열이 결실되거나 증폭되는 변이로서 이 변이에 의하여 유전체의 특정 유전자의 숫자가 사람마다 달라지게 된다.

만성 관절 류마티즘(rheumatoid arthritis, 이하 "RA"라고 한다)은 다발하는 미란성 관절염을 주 특징으로 하는데, 동시에 여러 장기에 장해를 입히는 원인불명의 전신성 염증질환이다. RA는 호전과 악화를 반복하면서 만성으로 진행되고, 치료하지 않고 방치하면 관절의 파괴나 변형을 초래하며, 운동기의 기능장해로 발전되며, 때로는 생명까지도 위협한다. 따라서, RA 환자는 평생동안 신체적으로도 육체적으로도 큰 고통을 겪게 된다.

RA는 그 발증 방법도 매우 다양한데, 그 진단에는 미국 류머티즘학회의 진단기준이 널리 이용되고 있다.

그러나 RA의 발증은 통상적으로 더디게 몇주에서 몇개월에 걸쳐 진행되는데, 미국 류머티즘학회에 의해 채택된 진단기준에서 객관적인 지표로서 사용되는 류마토이드 인자의 존재는 그 양성율이 3개월 이내에서는 33%, 12개월 이상에서도 88% 정도(치료, 제73권, 제3호, 제23?27쪽, 1991년)로 RA라고 확실하게 진단하기에는 이르다.

이에, 조환(組換) 항원과 반응하는 환자 혈청중의 류머티즘성 관절염 관련 항체인 IgM항체를 검출하여 류머티즘성 관절염을 진단하려는 시도 등이 이루어지고 있다(특개평10-513257호 참조). 또한, RA의 치료는 RA 병태의 진행과정에 따라 선택되는 치료수단이 서로 다른 것이 일반적이다. 통상적으로, 확정진단을 내릴 수 없는 초기에는 비스테로이드항염증약(NSAID)을 투여하고, 확정진단이 내려진 경우에는 NSAID와 함께 질환 수식성(修飾性) 류머티즘약(DMARD)을 투여한다. 특히, RA발증의 초기에는 확정 진단을 내리기 곤란하여 현재의 상태에서는 NSAID를 투여하고, 경과를 신중하게 관찰하면서 교원병을 포함하는 다른 류머티즘 질환과의 감별을 동시에 수행한다. 아울러, 증상이 진행된 경우에는 스테로이드약의 투여를 수행하는 경우도 있으며, 동통을 위한 약물요법과 함께 관절기능의 유지회복을 위한 이학 요법장구(裝具) 요법을 수행한다.

또한, 관절파괴로 인해 일상생활이 부자유스러워진 경우에는 수술요법을 수행하는 경우도 있다.

RA의 원인인 관절염과 관절파괴의 양상, 특히 이들의 병리과정은 여러가지 연구를 통해 차츰 밝혀지고 있는데, RA는 생활환경을 포함한 다수의 원인인자가 중합되어 비로소 질환으로 발전 및 악화되는 질환이다. 따라서, 질환의 올바른 해명과 적절한 치료를 수행하려면 다인자 상호작용의 본체 자체를 명확하게 하여야 한다. RA는 세계적으로 이환율(prevalence rate) 1% 이하의 질환이지만{뉴 잉글랜드 저널 오브 메디신(N.Engl.J.Med), 제322권, 제1277?1289쪽, 1990년), 환자의 가족에게는 약 8% 이상이 발병한다는(Cell, 제85권, 제311?318쪽, 1996년)점에서 그 원인인자로 어떠한 유전적 요인이 생각된다. 또한, 환경이 원인인자의 하나로 생각된다는 점에서, 미리 발증 가능성을 알아내면 일상생활에서 예를 들면 식이, 바이러스 감염 및 스트레스 등에 주의하는 것으로 발증을 지연시키거나 방지할 수 있다. 아울러, 진단을 앞당겨 조기에 적절한 치료를 수행라면 RA의 진행을 늦출 수 있어 예후의 개선이 기대된다.

RA의 직접적인 원인의 하나에는 아포토시스(apoptosis)의 과잉억제가 있다. 이에 관하여 이하와 같은 보고가 있다. RA환자의 활막(滑膜) 세포에서는 in vitro에서 항Fas 항체에 의해 아포토시스가 유도된다{아트라이티스 앤드 류머티즘(Arthritis rheum.), 38권, 제485?491쪽, 1995년}. 또한, RA의 모델 동물인 휴먼 I형 T세포 백혈병 바이러스(HTLV-I) tax 트랜스제닉 마우스에 항Fas 항체를 투여하면 관절의 부종 및 관절염이 억제되고{저널 오브 클리니컬 인베스티게이션(J.Clin.Invest.), 98권, 제271?278쪽, 1996년), 나아가 SCID 마우스의 배부(背

部)에 이식된 RA의 활막조직은 항Fas 항체의 투여에 의해 소실된다는 보고가 있다{아트라이티스 앤드 류머티즘(Arthritis rheum.), 41권, 제1251?1257쪽, 1998년}.

국제공개 W098/51791호에는 마이크로세터라이트(microsatellite) 마커를 이용한 연쇄분석을 RA환자 및 그 혈연자에 대하여 실시함으로써, 만성 관절 류마티즘의 질환유전자가 위치하는 3군데의 유전자 자리를 특정하고, 이하의 질환유전자를 동정(同定)한 것이 개시되어 있다.

(1) 휴먼 제1 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D1S214 및/또는 D1S253이 하이브리다이즈(hybridized)되는 DNA 서열로부터 ±1센티모르간(centimorgan) 이내에 위치하는 만성 관절 류마티즘의 질환유전자.

(2) 휴먼 제8 염색체의 마이크로세터라이트 마커 D8S556이 하이브리다이즈(hypridized)되는 DNA 서열로부터 ± 1센티모르간 이내에 위치하는 만성 관절 류마티즘의 질환유전자.

(3) 휴먼 X염색체의 마이크로세터라이트 마커 DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227 및/또는 DXS1232가 하이브리다이즈(hybridized)되는 DNA 서열로부터 ±1센티모르간 이내에 위치하는 만성 관절 류마티즘의 질환유전자.

또한, 류머티즘, 제39호, 제2호, 제444쪽 및 제445쪽에서는 상기 질환유전자중 상기 (1)의 질환유전자에 관계되는 마커 D1S214 및 D1S253의 질환유전자로서 데쓰 리셉터3(death receptor3; DR3)를 들고 있으며, 정상인과 RA환자간의 DR3의 제한단편장다형(制限斷片長多型)을 확인하여 DR3가 RA에 있어서의 질환 감수성 유전자일 가능성을 시사하고 있다.

그러나, 여전히 만성 관절 류마티즘(RA)에 대한 새로운 진단 및 치료방법이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 만성 관절 류마티즘(RA)을 진단하고 예방하며 치료할 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, VPREB1 유전자의 복제수 변이(CNV) 및 RA 사이의 관계를 규명함으로써 만성 관절 류마티즘에 있어서 VPREB1 유전자의 신규한 용도를 밝히고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 만성 관절 류마티즘의 발병을 예측할 수 있는 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VPREB1는 22q11.2 염색체 상에 있는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 만성 관절 류마티즘은 VPREB1 유전자의 복제수가 2 미만일 경우, 만성 관절 류마티즘이 발병할 위험이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 복제수는 qPCR을 수행 후, Ct 값의 측정을 통해 계산되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 계산하는 단계를 더 추가할 수 있다.

또한, 본 발명은 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VPREB1 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 계산하는 단계를 더 추가할 수 있다.

또한, 본 발명은,

VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 검체 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및

상기 수행된 PCR 결과에 대해 Ct 값을 측정하고 검체 DNA 내에서 VPREB1 유전자의 복제수를 측정하는 단계를 포함하는 만성 관절 류마티즘 환자의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 VPREB1 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 그 값이 2 미만일 때, 만성 관절 류마티즘이 발병할 위험이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 따르면, VPREB1 유전자의 복제수 변이를 측정함으로써 만성 관절 류마티즘의 발병 또는 그 발병 가능성을 고정밀도로 간편하고 확실하게 수행할 수 있으며, 만성 관절 류마티즘의 새로운 예방법 또는 치료법으로 사용가능하다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 만성 관절 류마티즘 환자 및 정상군 내의 VPREB1 유전자의 복제수 및 승산비(OR)를 나타내는 그래프이다((a) VPREB1 유전자의 복제수 분포 패턴; (b) VPREB1 유전자의 승산비(OR)).
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 만성 관절 류마티즘 환자 및 정상군의 말초 혈액 내의 전이 및 기억 B 세포의 프로파일을 나타내는 2차원 점 그래프이다((a) CD19 마커가 발현되는 B 세포; (b) CD21 및 CD23 마커의 발현을 기초로 동정될 수 있는 B 세포의 하위집단; (c) CD21-CD23- B 세포를 분리하여 CD27 및 CD38의 마커로 발현시킴; 및 (d) CD21+CD23+ B 세포를 분리하여 CD27 및 CD38의 마커로 발현시킴)
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 만성 관절 류마티즘 환자 및 정상군의 말초 혈액 내의 CD19+ B 세포를 분리하여 유동세포분석법으로 측정한 결과를 나타내는 점 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 만성 관절 류마티즘 환자 및 정상군의 말초 혈액 내의 CD21 및 CD23 마커의 발현을 나타내는 점 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 만성 관절 류마티즘 환자 및 정상군의 말초 혈액 내의 전이/미성숙 B 세포(CD21+CD23+) 및 기억 B 세포(CD21-CD23-)의 분율을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 정상군 및 류마티즘 환자 내의 B 세포 내에서 본 발명에 따른 VPREB1 유전자의 복제수 변이를 측정한 결과, 정상군에서는 VPREB1 유전자의 복제수가 2 이상인 경우가 대부분으로 나타났고, 류마티즘 환자 내에서는 VPREB1 유전자의 복제수가 2 미만인 경우가 대부분인 것으로 나타났다(도 1 참조).

또한, 만성 관절 류마티즘 환자 및 대조군의 말초 혈액 내의 전이/미성숙 B 세포(CD21+CD23+) 및 기억 B 세포(CD21-CD23-)의 분율을 유동세포분석법으로 측정한 결과, CD21-CD23- B 세포는 만성 관절 류마티즘에서 상당히 높게 나타났으며, CD21+CD23+ B 세포는 만성 관절 류마티즘에서 상당히 낮게 나타났다. 만성 관절 류마티즘 및 대조군 대상 사이의 전체 말초 B 세포의 수에는 유의적 차이가 없었다(도 5 참조).

따라서 본 발명에 따른 VPREB1 유전자의 복제수를 측정할 경우, 만성 관절 류마티즘의 발병위험을 진단할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 상기 프로브 또는 프라이머는 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 특징이 있으며, 본 발명에서 언급한 VPREB1 유전자의 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

상기 진단은 병리 상태를 확인하는 것을 나타내는 용어로서, 본 발명에서의 진단은 VPREB1 유전자의 복제수를 확인하여 만성 관절 류마티즘의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 진단용 조성물은 본 발명의 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머 이외에도 상기 프로브 또는 프라이머의 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함할 수 있으며, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환 수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함될 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

본 명세서에서, 상보적(complementary)이라는 용어는 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 본 발명의 VPREB1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 상보적이라는 용어는 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 VPREB1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서, 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아졸릴-, 이미다졸릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아졸릴-, 이미다졸릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 VPREB1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

상기 진단용 키트에 포함되는 프로브 또는 프라이머용어에 대해서는 앞서 기술된 바와 같으며, 바람직하게 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프러이머쌍 또는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 만성 관절 류마티즘 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할2수 있으며, 본 발명의 만성 관절 류마티즘 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징(packaging) 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

나아가, 본 발명은 VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머는 혼성화 어레이 요소(hybridizable arrayelement)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기체 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)되고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

나아가 본 발명은 VPREB1 유전자의 변이수를 측정하여 만성 관절 류마티즘의 발병여부를 진단할 수 있는 정보 제공 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게는, VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 검체 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 수행된 PCR 결과에 대해 Ct 값을 측정하고 검체 DNA 내에서 VPREB1 유전자의 복제수를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 상기 VPREB1 유전자의 복제수가 2 미만일 때, 만성 관절 류마티즘이 발병된 것으로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

VPREB1 유전자의 복제수 변이( CNV )와 만성 관절 류마티즘의 관계 규명

(1) 연구 대상

CNV 분석을 위하여, 미국 류머티스학 대학의 기준에 따라 만성 관절 류마티즘(RA)으로 진단받은 240명의 한국인 환자(남자: 41명, 여자: 199명, 평균연령: 53.1±12.2세)를 을지대학병원으로부터 모집하였다. 류마티스 인자(RF)는 히타치 7170S 키트(Hitachi Co, Tokyo, Japan)을 이용한 라텍스 고정반응 검사를 이용하여 측정하였다. 항-사이클릭 시트룰린화된 펩티드 항체(anti-CCP)는 Diastat anti-CCP 키트(MBL Co., Nagoya, Japan)를 적용하여 효소면역측정법(ELISA)으로 측정하여 자동화 EIA 분석기(CODA, Bio-Rad Co., Japan)상에서 분석하였다. 또한, 정상 대조군으로서 233명의 대상자(남자: 30명, 여자: 203명, 평균연령: 54.6±17.3세)를 모집하였다. 이 연구는 가톨릭대 의과대학 및 을지대학 병원의 임상시험 심사위원회의 승인 하에서 수행하였다.

(2) B 세포의 분리 및 FACS 분석

B 임파구는 제조사의 프로토콜(MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA)에 따라 자기 비드를 사용하여 인간 말초 혈액으로부터 분리하였다. Ficoll-Paque(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)에 의해 전체 혈액으로부터 분리된 단핵세포는 먼저 원하지 않는 세포를 타겟팅하는 MagCellect Antibody Cocktail과 함께 배양시켰다. 다음으로, 세포들을 Anti-Biotin MicroBead와 배양시킨 후, 2회 세척하였다. 표지된 세포는 MS 컬럼을 이용하여 분리하였고, 표지되지 않은 B 세포들은 컬럼을 통과하여 수집되었다.

FACS 분석을 위해, APC-컨쥬게이트된 항-CD19 항체(eBioscience, San Diego, CA, USA), FITC-컨쥬게이트된 항-CD21 및 PE-컨쥬게이트된 항-CD23 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)가 사용되었다.

1× 10⁶ 세포들은 표지된 항체들과 4 ℃에서 30분간 배양되었다. 이후 PBS로 2회 세척한 다음 시료들을 FACScan 유량 사이토미터로 분석하고 데이터는 Cell Quest 소프트웨어(버젼: 5.2.1; Becton Dickson, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

(3) VPREB1 유전자 복제수의 결정

VPREB1 유전자 복제수의 결정을 위해 유전적 DNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 이용하여 전체 혈액 중에서부터 추출된 유전적 DNA를 대상으로 qPCR를 수행하였다.

유전적 qPCR은 Mx3000P qPCR 시스템(Stratagene, La Jola, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 이때 유전적 qPCR을 위한 2배체 내부 참조 유전자(diploid internal reference gene)로는 유전자 복제수가 2로 알려져 있는 RNase P를 사용하였다. 또한, 코카시안 메일 B 세포(Coriell, Camden NJ. USA)로부터 이루어진 GM10851 세포주로부터 나온 NA1085 DNA가 측정기(calibrator)로서 사용되었다.

또한, 유전적 qPCR의 방법이 단일 복제 간의 차이를 구별할 수 있는지를 증명하기 위하여, X 크로모섬(X chromosome)의 다양한 복제수 변이를 갖는 것으로 알려진 5개의 다른 세포주(GM10851(1회 복제), GM15510(2회 복제), GM04626(3회 복제), GM01416(4회 복제) 및 GM06061(5회 복제)(Coriell, Camden, NJ, USA))로부터 X 크로모섬(Xq22.3)을 타겟팅하는 qPCR을 수행하였다. 그 결과, 복제수 차이는 유전적 qPCR 방법에 의해 정확하게 검출된다는 사실을 알 수 있었다.

이후, 이들 유전적 qPCR 조건 하에서, 2배체로서 정상 대조군(2.06, 범위:1-7)에서 VPREB1 qPCR 비율의 중간값을 설정하였다.

구체적으로, 20 ng의 유전적 DNA, SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ(TaKaRa Bio, Shiga, Japan), 1× ROX(TaKaRa Bio, Shiga, Japn) 및 10 pmol의 프라이머를 포함하는 20 ㎕의 반응 혼합물을 95 ℃에서 30초 간 한번 반응 시키고, 이후 95 ℃에서 5초, 55 ℃에서 10초, 및 72 ℃에서 30초의 반응을 45회 반복 수행하였다. 이와 같은 PCR 반응 완료 후, 특정 증폭을 확인하기 위하여 융해곡선분석(melting curve analysis)을 수행하였으며, 상기 qPCR 반응에 사용한 프라이머 서열은 하기 기재된 바와 같다.

프라이머 서열

VPREB1 정방향 프라이머: 5'-AGCCTGAGGACGAGGCTATGTATT-3'[서열번호 2]

VPREB1 역방향 프라이머: 5'-TGGGTTCCATTTCTTCCTCCCACT-3'[서열번호 3]

RNaseP 정방향 프라이머: 5'-CGCTACCACCACACCAAGCAG-3'[서열번호 4]

RNaseP 역방향 프라이머: 5'-CCACCTGGCTGTTGTAGTCCTC-3'[서열번호 5]

이때, 모든 qPCR 실험은 2번 반복하였고, 타겟 및 내부 참조 유전자(RNase P)의 증폭 효율을 평가하였다. 기준 곡선 너머 시리얼 1:5 희석을 사용하여 효율에 접근하기 위해 Ct 값이 사용되었고, 상기 Ct 값은 참조 유전자가 기준 곡선의 한계점에 접근하기 위해 참조 유전자의 증폭에 요구되는 사이클 수로서 정의된다.

상대적인 복제수는 문헌[Yim et al., 2010]에서 기재된 Ct 값을 사용하는 △△Ct 법에 의해 계산하였는데, VPREB1의 복제수는 2^-△△ ^Ct로서 정의하였고, 이때 △Ct는 참조유전자(RNase P)에 대해 표준화고, NA10851 DNA(개체/NA10851)에 의해 얻은 값에 상대적으로 발현되는 미지 시료에 대한 한계 사이클의 차이이다.

VPREB1 복제수 결정의 조절을 위해 GM 10851 세포주에서 VPREB1 자리(22q11.22) 및 동일한 크로모좀 팔(22q13.1)의 2배체 대조군 자리를 타겟으로 하는 형광동소보합법(Fluorescent In Situ Hybridization, FISH) 분석을 수행하였다. GM10851은 단일 VPREB1 신호를 나타내는 반면, 2배체 신호는 22q13.1에 나타났다. 상기 FISH 데이터를 기초로 하여 VPREB1 qPCR 비율 데이터(개별적/NA10851)은 문헌[Fanciulli et al., 2007; Gonzalez et al., 2005; Hollox et al., 2008]에 개시된 바와 같이 거의 정수로 전환되었다.

측정 결과를 도 1a에 나타내었다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 2 미만의 VPREB1 유전자 복제수를 갖는 개체의 분율은 환자 내에서 대조군일 때보다 상당히 높았다(환자: 12.9%(31/240) vs. 대조군: 0.9%(2/223), p<0.0001), 반면에 2를 초과하는 복제수를 갖는 개체의 분율은 각각 대조군에 비해 환자들이 상당히 낮았다(1.7%(4/240) vs. 18.9%(44/233), p<0.0001)

따라서 VPREB1 유전자 복제수를 측정함으로써 만성 관절 류마티즘을 진단할 수 있음을 알 수 있었고, 특히, 환자의 경우 정상에 비해 복제수가 2미만을 갖는 확률이 높다는 것을 알 수 있었다. 또한, 여기서 상기 복제수가 2미만이라고 판단하는 것은 이미 복제수가 2라고 알려져 있는 RNase P의 값을 기준으로 하여 이와 비교하였을 경우의 복제수를 의미하는 것이다.

(4) VPREB1 유전자 복제수의 승산비 ( OR ) 측정

만성 관절 류마티즘의 승산비(OR)를 측정하기 위하여, 우리는 참조 포인트로서 2배체 복제수 그룹을 선택하였다. 회귀 분석에 의해 성별 및 연령의 효과를 조정한 후에, 각 개체에 대한 승산비를 측정하여 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타낸 바와 같이, 2 복제수 미만을 갖는 개체에 대한 승산비를 측정한 결과는 2 복제를 갖는 이들의 개별적 승산비와 비교할 때 상당히 높았다(OR=12.1, 95% 신뢰구간(CI) 2.8-51.6, p=0.002). 마찬가지로 2 초과의 복제를 갖는 개체에 대한 승산비는 참조 그룹보다 상당히 낮았다(OR=0.09. 95% CI 0.03-0.3, p=0.001). VPREB1 DNA 복제수 군의 각각에 대한 승산비는 관련 투여량이었다(R²=0.999, p<0.0002)

(5) VPREB1 유전자 주위의 복제수 패턴 관찰

유전적 qPCR에 의해 동정된 VPREB1 유전자의 복제수 차이를 추가적으로 입증하기 위하여, 우리는 Affymetrix Human SNP Array 5.0을 이용하여 VPREB1 유전자의 ≥2 복제를 갖는 10개의 정상 개체(qPCR에서 >2 복제(6개) 및 2 복제(4개)) 및 <2 복제를 나타내는 10개의 만성 관절 류마티즘인 경우 유전자형을 대상으로 VPREB1 유전자 주위의 복제수 패턴을 관찰하였다. 필수적으로 모든 qPCR 결과는 배열 분석 결과와 일치하였다.

< 실시예 2>

VPREB1 복제수 및 다양한 표현형( phenotype ) 간의 상관관계 규명

VPREB1 복제수 및 mRNA 발현 정도 사이의 관계를 알아보기 위하여 21개의 개체(13개 경우 및 8개 대조군)로부터 분리된 RNA를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 총 RNA는 13명의 만성 관절 류마티즘 경우 및 8개의 대조군의 혈액 시료로부터 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출되었다.

첫번째 기준 상보적 DNA(cDNA)는 올리고-dT 프라이머 및 슈퍼스트립스 Ⅱ 역방향 트랜스크립타아제(Invitrogen, Carls-bad, CA)를 사용하여 합성하였다.

실시간 qRT-PCR이 Mx3000P QPCR 시스템 및 소프트웨어 MxPro 버전 3.00(Stratragene, La, Jolla, CA)를 사용하여 수행하였다. 반응 혼합물은 1×SYBR Green Tbr plymerase Master Mix(FINNZYMES, Finland), 0.5×ROX, 20 pmol의 각 프라이머, 및 10 ng의 cDNA로 이루어져 있었다. 또한 상기 반응들에서 사용한 프라이머들은 다음과 같은 서열을 갖는 프라이머를 사용하였다.

프라이머 서열

VPREB1 정방향 프라이머: 5'-TTGTCTACTGCACAGGTTGTGGTC-3'[서열번호 6]

VPREB1 역방향 프라이머: 5'-TAGACGATGTACACACCGATGCA-3'[서열번호 7]

GAPDH 정방향 프라미어: 5'-GCGGGGCTCCAGAACATCAT-3'[서열번호 8]

GAPDH 역방향 프라미어: 5'-CCAGCCCCAGCGTCAAGGTG-3'[서열번호 9]

PCR 프로그램은 하기와 같다: 95 ℃에서 5분간 변성; 30초 동안 95 ℃, 30초 동안 60 ℃, 및 40초 동안 72 ℃의 의 40 사이클 이후 6분간 72 ℃ 연신 단계로 이루어진다. 상대적 정량화는 △△CT 법에 의해 수행되었다. 모든 실험은 3번씩 반복되었으며, 강도 비율의 평균값± SD로 플롯되었다.

측정 결과, 모든 대조군 및 7개의 경우는 2 복제를 가지고 있었으며, 6개의 경우 1 복제를 가졌다. 상기 2 복제 그룹은 mRNA 발현 정도가 1 복제 그룹에 비해 상당히 높은 것으로 나타났다(2 복제 그룹(n=15): 중간값 70.4; 1 복제 그룹(n=6): 19.8, p=0.03). 다음으로 만성 관절 류마티즘 경우의 mRNA 발현 정도를 조사하였다. 1 복제의 VPREB1 유전자를 갖는 환자들은 2 복제인 경우보다 mRNA 발현 정도가 낮은 것으로 나타났으나(중간값 19.8 대 23.1), 그 차이는 통계적으로 유의성 있지는 않았다.

다음으로, VPREB1 복제수 및 다른 임상적 표현형, 예를 들면 RF, 항-CCP 항체, 뼈의 기형, 관절 공간 좁아짐(joint space narrowing), 노화의 시작 및 질병의 지속간의 관련도를 조사하였다. 표현형 중에서 골 기형 및 골 침식은 VPREB1의 낮은 복제수와 상당한 관련이 있는 것으로 나타났다.

< 실시예 3>

만성 관절 류마티즘 환자 내의 전이 및 기억 B 세포의 변형된 발현

전이/미성숙 및 기억 B 세포를 판별하기 위하여, 우리는 먼저 CD19+ B 세포를 CD21+CD23+ 및 CD21-CD23- 하위집단으로 정렬하였다. 다음으로 각 하위집단을 CD38 및 CD27 마커의 발현으로 특징화시켰다.

그 결과, 도 2a-d에 나타낸 바와 같이, CD21+CD23+ B 세포의 대부분(83%)은 CD38+였으며, 이는 전이/미성숙 B 세포와 경쟁하는 표현형이다. 대조적으로 CD21-CD23- B 세포의 대부분(73%)는 CD38-CD27+였으며, 이는 기억 B 세포와 경쟁하는 표현형이다.

이러한 표현형 특징 및 문헌(Melchers. 2005)을 기초로 하여, 만성 관절 류마티즘 환자 및 대조군의 말초 혈액 내의 전이/미성숙 B 세포(CD21+CD23+) 및 기억 B 세포(CD21-CD23-)의 분율을 유동세포분석법으로 측정하고 그 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다. 도 3에 있어서, 앞쪽 및 옆의 표식은 잔해 및 죽은 세포로 배제하고, B 세포의 분율은 전체 단일뉴클레어 세포 중 CD19+ 림프구의 백분율로 나타내었다

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CD21-CD23- B 세포는 만성 관절 류마티즘(11.89±8.02%)에서 대조군(5.65±2.45%; p=0.002)에 비해 상당히 높게 나타났다. 대조적으로, CD21+CD23+ B 세포는 만성 관절 류마티즘(26.17±14.40%)에서 대조군(34.87±16.54%; p=0.005)에 비해 상당히 낮게 나타났다. 만성 관절 류마티즘 및 대조군 대상 사이의 전체 말초 B 세포의 수에는 유의적 차이가 없었다.

따라서, 말초 혈액 내의 전이/미성숙 B 세포(CD21+CD23+) 및 기억 B 세포(CD21-CD23-)의 분율을 측정함으로써 만성 관절 류마티즘을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Novel use of VPREB1 gene <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 641 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPREB1 cDNA sequence <400> 1 gagtcagagc tctgcatgtc tgcaccatgt cctgggctcc tgtcctgctc atgctgtttg 60 tctactgcac aggttgtggt cctcagccgg tgctgcatca gccgccggcc atgtcctcgg 120 cccttggaac cacaatccgc ctcacctgca ccctgaggaa cgaccatgac atcggtgtgt 180 acagcgtcta ctggtaccag cagaggccgg gccaccctcc caggttcctg ctgagatatt 240 tctcacaatc agacaagagc cagggccccc aggtcccccc tcgcttctct ggatccaaag 300 atgtggccag gaacaggggg tatttgagca tctctgagct gcagcctgag gacgaggcta 360 tgtattactg tgctatgggg gcccgcagct cggagaagga ggagagggag agggagtggg 420 aggaagaaat ggaacccact gcagccagga cacgtgtccc ttgaactgaa gacagcagag 480 gcacgcatcc ccttggagag actgtcatgg aagagggtgg agccgccgcc cgaagcgccg 540 aggaggctga gccactcagc atctcctggt cctgcagtgt tgctgtaaat ccccattgga 600 gactgcatta gggaattaaa gctgcttgtc actttttgct g 641 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPREB1 F-primer <400> 2 agcctgagga cgaggctatg tatt 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPREB1 R-primer <400> 3 tgggttccat ttcttcctcc cact 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNaseP F-primer <400> 4 cgctaccacc acaccaagca g 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNaseP R-primer <400> 5 ccacctggct gttgtagtcc tc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPREB1 F-primer <400> 6 ttgtctactg cacaggttgt ggtc 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VPREB1 R-primer <400> 7 tagacgatgt acacaccgat gca 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F-primer <400> 8 gcggggctcc agaacatcat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R-primer <400> 9 ccagccccag cgtcaaggtg 20

Claims

VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 VPREB1는 22q11.2 염색체 상에 있는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 만성 관절 류마티즘은 VPREB1 유전자의 복제수가 2 미만일 경우, 만성 관절 류마티즘이 발병할 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 유전자의 복제수는 qPCR을 수행 후, Ct 값의 측정을 통해 계산되는 것 을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 계산하는 단 계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 조성물.
VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트.
제7항에 있어서,
상기 VPREB1는 22q11.2 염색체 상에 있는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트.
제8항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트.
제8항에 있어서,
상기 만성 관절 류마티즘은 VPREB1 유전자의 복제수가 2 미만일 경우, 만성 관절 류마티즘이 발병할 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트.
제10항에 있어서,
상기 VPREB1 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 계산하는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘의 진단용 키트.
VPREB1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 검체 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 수행된 PCR 결과에 대해 Ct 값을 측정하고 검체 DNA 내에서 VPREB1 유전자의 복제수를 측정하는 단계를 포함하는 만성 관절 류마티즘 환자의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 VPREB1 유전자의 복제수는 복제수가 2인 RNase P의 값과 비교하여 그 값이 2 미만일 때, 만성 관절 류마티즘이 발병할 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 만성 관절 류마티즘 환자의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.