JP4503531B2 - ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプｉｖの利用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶを利用した、慢性関節リウマチ治療薬の効果を評価する方法、および慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法に関する。
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。ＲＡは、初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。症状の経過は、関節炎の寛解・再燃を繰り返し、完治する例や急速に進行する例など多彩であるが、早期発見と早期治療がＲＡ患者の生活の質を改良する上からも重要である。
ＲＡは病態的には関節に達した未知の抗原に対する特異的な免疫応答に始まり、関節に浸潤した血中リンパ球、マクロファージ、好中球による慢性炎症と滑膜増殖を生じ、その結果、炎症性肉芽組織由来の破骨細胞やプロテアーゼによる骨・軟骨破壊が起きる。ＲＡの病因は不明であるが、遺伝的要因と微生物感染などの環境要因の両者が関与していると考えられている。
ＲＡの診断は主に症状によってなされるが、早期診断にはＲＡ患者の血中に見出される自己抗体の検出が今のところ有用である。そのような自己抗体としては、例えば、リウマトイド因子、抗Ｓａ蛋白抗体、抗ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗シトルリン化ペプチド抗体などが知られている（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ａ．Ｍ．ｖａｎ Ｂｏｅｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）４（２），ｐ８７−９３）。
抗シトルリン化ペプチド抗体はＲＡ患者血清の約７６％から検出されるが、リウマチ様症状を呈するがＲＡとは判定されない患者血清からは約４％しか検出されない、ＲＡに極めて特異性の高い自己抗体である（Ｇｅｒａｒｄ Ａ．Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９８）１０１（１），２７３−２８１；ＺｈｉＪｉｅ Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉ−Ａｎｄｒｅ Ｍｅｎａｒｄ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００２）１４（３），ｐ２５０−２５３）。また、ＲＡ患者の滑膜にはシトルリン化されたタンパクが検出されることから、シトルリンを含むエピトープのＲＡの病原性への関与が指摘されている（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ ｖａｎ Ｖｅｎｒｏｏｉｊ ａｎｄ Ｇｅｒ Ｊ．Ｍ．Ｐｒｕｉｊｎ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）２（４），ｐ２４９−２５１；Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍａｓｓｏｎ−Ｂｅｓｓｉ□ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）１６６（６），ｐ４１７７−４１８４）。
ペプチジルシトルリンはタンパク内のアルギニン残基がペプチジルアルギニン・デイミナーゼ（以下、「ＰＡＤＩ」という。）で変換されて生ずるアミノ酸である。げっ歯類においては、現在まで４つのサブタイプのＰＡＤＩが知られており、タイプＩは表皮や子宮で、タイプＩＩは筋肉、子宮、唾液腺、膵臓など様々な組織で、タイプＩＩＩは表皮や毛根嚢胞で、タイプＩＶは様々な組織で発現している（Ａｈｍｅｄ Ａｂｕ Ｒｕｓ’ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）２５９（３），ｐ６６０−６６９）。ヒトにおいては、げっ歯類のタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶに最も相同性が高い遺伝子としてそれぞれタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖの遺伝子が遺伝子情報データベースＧｅｎＢａｎｋ上に登録されていたが、タイプＩＩＩ（Ｔａｋｕｙａ Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）１１５（５），ｐ８１３−８２３）およびタイプＶ（Ｋａｔｓｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）２７４（３９），ｐ２７７８６−２７７９２）以外については詳細な報告はなされていない。ヒトのＰＡＤＩのタイプＩＩＩはげっ歯類と同じく毛根嚢胞部分で（Ｔａｋｕｙａ Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）１１５（５），ｐ８１３−８２３）、タイプＶは好中球や好酸球で（Ｈｉｒｏａｋｉ Ａｓａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）７０（１），ｐ４６−５１）それぞれ発現していることが報告されているが、ＰＡＤＩとＲＡの直接の関連は不明である。
なお、本願基礎出願時においてタイプＶと言われていた遺伝子は、その後マウスタイプＩＶのオーソログであることが確認されたため、本明細書中においては、ヒトＰＡＤＩのタイプＶをタイプＩＶと呼ぶこととする。
個人の体質を規定する大きな要因として遺伝子多型がある。最近のファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬物の効果、あるいは副作用との関係が解明され、当該薬物の効果、あるいは副作用を遺伝子診断を用いて投与前に予測することが可能になりつつある。また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつある。
前者の例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型が挙げられる。例えば、多型に関連して活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素として、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（中村祐輔編，「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」，（２０００），中山書店，東京）。
後者の例としては、多型解析研究により見出された疾患原因遺伝子が挙げられる。例えば、（１）潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、（２）慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、（３）アルツハイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、（４）精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、（５）躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、（６）アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、（７）心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子ＶＩＩ、（８）肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが知られている（Ｌ．Ｋｒｕｇｌｙａｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２（２），ｐ１３９−１４４）。
一方、ＴＮＦ−αは、各種炎症性疾患の病態形成に関与する重要な物質と考えられているが、最近、ＴＮＦ−α遺伝子の５’末端側上流域にＴＮＦ−α遺伝子の発現を亢進する多型が見出された（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９８）５１（６），ｐ６０５−６１２）。これらの多型は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を亢進させるものであるため、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、糖尿病などのＴＮＦ−αが関与する疾患の診断マーカーになりうるものと考えられている。
ＲＡは病態的には関節に達した未知の抗原に対する特異的な免疫応答に始まり、関節に浸潤した血中リンパ球、マクロファージ、好中球による慢性炎症と滑膜増殖を生じ、その結果、炎症性肉芽組織由来の破骨細胞やプロテアーゼによる骨・軟骨破壊が起きる。ＲＡの病因は不明であるが、遺伝的要因と微生物感染などの環境要因の両者が関与していると考えられている。
ＲＡの診断は主に症状によってなされるが、早期診断にはＲＡ患者の血中に見出される自己抗体の検出が今のところ有用である。そのような自己抗体としては、例えば、リウマトイド因子、抗Ｓａ蛋白抗体、抗ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗シトルリン化ペプチド抗体などが知られている（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ａ．Ｍ．ｖａｎ Ｂｏｅｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）４（２），ｐ８７−９３）。
抗シトルリン化ペプチド抗体はＲＡ患者血清の約７６％から検出されるが、リウマチ様症状を呈するがＲＡとは判定されない患者血清からは約４％しか検出されない、ＲＡに極めて特異性の高い自己抗体である（Ｇｅｒａｒｄ Ａ．Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９８）１０１（１），２７３−２８１；ＺｈｉＪｉｅ Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉ−Ａｎｄｒｅ Ｍｅｎａｒｄ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００２）１４（３），ｐ２５０−２５３）。また、ＲＡ患者の滑膜にはシトルリン化されたタンパクが検出されることから、シトルリンを含むエピトープのＲＡの病原性への関与が指摘されている（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ ｖａｎ Ｖｅｎｒｏｏｉｊ ａｎｄ Ｇｅｒ Ｊ．Ｍ．Ｐｒｕｉｊｎ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）２（４），ｐ２４９−２５１；Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍａｓｓｏｎ−Ｂｅｓｓｉ□ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）１６６（６），ｐ４１７７−４１８４）。
ペプチジルシトルリンはタンパク内のアルギニン残基がペプチジルアルギニン・デイミナーゼ（以下、「ＰＡＤＩ」という。）で変換されて生ずるアミノ酸である。げっ歯類においては、現在まで４つのサブタイプのＰＡＤＩが知られており、タイプＩは表皮や子宮で、タイプＩＩは筋肉、子宮、唾液腺、膵臓など様々な組織で、タイプＩＩＩは表皮や毛根嚢胞で、タイプＩＶは様々な組織で発現している（Ａｈｍｅｄ Ａｂｕ Ｒｕｓ’ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）２５９（３），ｐ６６０−６６９）。ヒトにおいては、げっ歯類のタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶに最も相同性が高い遺伝子としてそれぞれタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖの遺伝子が遺伝子情報データベースＧｅｎＢａｎｋ上に登録されていたが、タイプＩＩＩ（Ｔａｋｕｙａ Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）１１５（５），ｐ８１３−８２３）およびタイプＶ（Ｋａｔｓｕｈｉｋｏ Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）２７４（３９），ｐ２７７８６−２７７９２）以外については詳細な報告はなされていない。ヒトのＰＡＤＩのタイプＩＩＩはげっ歯類と同じく毛根嚢胞部分で（Ｔａｋｕｙａ Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）１１５（５），ｐ８１３−８２３）、タイプＶは好中球や好酸球で（Ｈｉｒｏａｋｉ Ａｓａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）７０（１），ｐ４６−５１）それぞれ発現していることが報告されているが、ＰＡＤＩとＲＡの直接の関連は不明である。
なお、本願基礎出願時においてタイプＶと言われていた遺伝子は、その後マウスタイプＩＶのオーソログであることが確認されたため、本明細書中においては、ヒトＰＡＤＩのタイプＶをタイプＩＶと呼ぶこととする。
個人の体質を規定する大きな要因として遺伝子多型がある。最近のファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬物の効果、あるいは副作用との関係が解明され、当該薬物の効果、あるいは副作用を遺伝子診断を用いて投与前に予測することが可能になりつつある。また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつある。
前者の例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型が挙げられる。例えば、多型に関連して活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素として、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（中村祐輔編，「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」，（２０００），中山書店，東京）。
後者の例としては、多型解析研究により見出された疾患原因遺伝子が挙げられる。例えば、（１）潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、（２）慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、（３）アルツハイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、（４）精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、（５）躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、（６）アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、（７）心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子ＶＩＩ、（８）肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが知られている（Ｌ．Ｋｒｕｇｌｙａｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２（２），ｐ１３９−１４４）。
一方、ＴＮＦ−αは、各種炎症性疾患の病態形成に関与する重要な物質と考えられているが、最近、ＴＮＦ−α遺伝子の５’末端側上流域にＴＮＦ−α遺伝子の発現を亢進する多型が見出された（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９８）５１（６），ｐ６０５−６１２）。これらの多型は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を亢進させるものであるため、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、糖尿病などのＴＮＦ−αが関与する疾患の診断マーカーになりうるものと考えられている。
本発明は、慢性関節リウマチ治療薬の効果あるいは慢性関節リウマチの発症危険度を評価するための新規な方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らはＲＡ患者の病変部位特異的に、ＰＡＤＩ４タンパクやそのｍＲＮＡが高発現すること、そしてこのＰＡＤＩ４の高発現がシトルリン化タンパクのレベルを亢進させ、ＲＡ発症の一因となりうることを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＰＡＤＩ４タンパクまたはそのｍＲＮＡの発現量や活性に対する阻害効果を指標として、慢性関節リウマチ治療薬の評価が可能であると考えた。
すなわち、本発明は、ＰＡＤＩ４遺伝子若しくはそのオーソログ遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法に関する。
ある実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中におけるＰＡＤＩ４遺伝子またはそのオーソログ遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、遺伝子の発現量は、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
別な実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中において、ＰＡＤＩ４遺伝子またはそのオーソログ遺伝子にコードされる蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、蛋白質の発現量は、例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
本発明の評価方法で用いられる細胞としては、血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。また、本発明の評価方法で用いられる動物としては、マウスが好ましく、この場合、検出対象は、ＰＡＤＩ４遺伝子のマウスオーソログ：マウスＰＡＤＩ４遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質であることが好ましい。
さらに別な実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、ＰＡＤＩ４蛋白質を加える。
２）上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、例えば、蛋白質の活性は、蛍光法または吸光法を用いた反応生成物の定量によって測定されることが好ましい。またＰＡＤＩ４蛋白質はヒト由来のＰＡＤＩ４蛋白質であることが好ましい。
さらに、本発明者らはＰＡＤＩ４遺伝子上にＲＡ患者に高い頻度で現れるハプロタイプが存在することを見出した。そしてこのハプロタイプは、正常型ＰＡＤＩ４蛋白質とはアミノ酸配列や酵素活性が異なる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質をコードし、この違いがＲＡの発症と深い関連を有することを見出した。これらの知見から、本発明者らは、変異型ＰＡＤＩ４タンパク質やその遺伝子を利用すれば、ＲＡの発症危険度の予測やＲＡに対する治療効果の評価が可能であると考えた。
すなわち、本発明は、検体中の配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質、またはその遺伝子（配列番号２０）の発現量に基づいて、該検体を提供した被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法を提供する。
ある実施態様において、本発明の予測方法は以下の工程を含む：
１）被験者および正常人から単離された各検体より全ＲＮＡを調製する；
２）上記全ＲＮＡ中における変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する；
３）被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、遺伝子の発現量は、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
別な実施態様において、本発明の予測方法は以下の工程を含む：
１）被験者および正常人から単離された検体中における、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合しうる抗体を用いて検出する；
２）被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、該被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、蛋白質の発現量は、例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
また、本発明は、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む、慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキットを提供する。
ａ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
さらに、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、例えば、以下の工程を含む：
１）アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を加える；
２）上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する；
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
さらにまた、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を提供する。該蛋白質は慢性関節リウマチの発症危険度を予測するための予測用マーカーとして有用である。
本発明によれば、慢性関節リウマチ治療薬の簡便なスクリーニングが可能となる。また、本発明にかかる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質および該遺伝子の発現量を指標を検出することにより、被験者が慢性関節リウマチを発症する危険度を早期に判定することができる。
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らはＲＡ患者の病変部位特異的に、ＰＡＤＩ４タンパクやそのｍＲＮＡが高発現すること、そしてこのＰＡＤＩ４の高発現がシトルリン化タンパクのレベルを亢進させ、ＲＡ発症の一因となりうることを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＰＡＤＩ４タンパクまたはそのｍＲＮＡの発現量や活性に対する阻害効果を指標として、慢性関節リウマチ治療薬の評価が可能であると考えた。
すなわち、本発明は、ＰＡＤＩ４遺伝子若しくはそのオーソログ遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法に関する。
ある実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中におけるＰＡＤＩ４遺伝子またはそのオーソログ遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、遺伝子の発現量は、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
別な実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中において、ＰＡＤＩ４遺伝子またはそのオーソログ遺伝子にコードされる蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、蛋白質の発現量は、例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
本発明の評価方法で用いられる細胞としては、血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。また、本発明の評価方法で用いられる動物としては、マウスが好ましく、この場合、検出対象は、ＰＡＤＩ４遺伝子のマウスオーソログ：マウスＰＡＤＩ４遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質であることが好ましい。
さらに別な実施態様において、本発明の評価方法は下記の工程を含む：
１）アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、ＰＡＤＩ４蛋白質を加える。
２）上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、例えば、蛋白質の活性は、蛍光法または吸光法を用いた反応生成物の定量によって測定されることが好ましい。またＰＡＤＩ４蛋白質はヒト由来のＰＡＤＩ４蛋白質であることが好ましい。
さらに、本発明者らはＰＡＤＩ４遺伝子上にＲＡ患者に高い頻度で現れるハプロタイプが存在することを見出した。そしてこのハプロタイプは、正常型ＰＡＤＩ４蛋白質とはアミノ酸配列や酵素活性が異なる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質をコードし、この違いがＲＡの発症と深い関連を有することを見出した。これらの知見から、本発明者らは、変異型ＰＡＤＩ４タンパク質やその遺伝子を利用すれば、ＲＡの発症危険度の予測やＲＡに対する治療効果の評価が可能であると考えた。
すなわち、本発明は、検体中の配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質、またはその遺伝子（配列番号２０）の発現量に基づいて、該検体を提供した被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法を提供する。
ある実施態様において、本発明の予測方法は以下の工程を含む：
１）被験者および正常人から単離された各検体より全ＲＮＡを調製する；
２）上記全ＲＮＡ中における変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する；
３）被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、遺伝子の発現量は、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
別な実施態様において、本発明の予測方法は以下の工程を含む：
１）被験者および正常人から単離された検体中における、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合しうる抗体を用いて検出する；
２）被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、該被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、蛋白質の発現量は、例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出される。
また、本発明は、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む、慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキットを提供する。
ａ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
さらに、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、例えば、以下の工程を含む：
１）アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を加える；
２）上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する；
３）被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
さらにまた、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を提供する。該蛋白質は慢性関節リウマチの発症危険度を予測するための予測用マーカーとして有用である。
本発明によれば、慢性関節リウマチ治療薬の簡便なスクリーニングが可能となる。また、本発明にかかる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質および該遺伝子の発現量を指標を検出することにより、被験者が慢性関節リウマチを発症する危険度を早期に判定することができる。
図１は、ヒトＰＡＤＩ４の２つのハプロタイプ：Ｖ９とＶ１８の各ｍＲＮＡ安定性（分解度）を比較したグラフである。
図２は、（Ａ）蛍光法によるＰＡＤＩ４酵素活性測定の結果を示すグラフ、および（Ｂ）吸光法によるＰＡＤＩ４酵素活性測定の結果を示すグラフである。
図３は、ＰＡＤＩ４の２つのハプロタイプ：Ｖ９およびＶ１８の酵素活性を吸光法により比較した結果を示すグラフである。
図４は、ＲＡ患者滑膜組織におけるＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡ発現をみたＩｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図中右の２つは陰性対照である。
図５は、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）群と正常（ｎｏｒｍａｌ）群における滑膜組織および脾臓組織におけるｍＰＡＤＩ４遺伝子発現量を示すグラフである。
図６は、（Ａ）抗ＰＡＤＩ４抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）ＰＡＤＩ４を特異的に認識する抗体とＰＡＤＩの全てのサブタイプを認識する抗体の両者を用いたＯＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。
図７は、（Ａ）抗ＰＡＤＩ４抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）抗シトルリン化タンパク質抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。
図８は、ヒトＰＡＤＩ４ Ｖ９とＰＡＤＩ４ Ｖ１８のｍＲＮＡの安定性を比較したグラフである。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−１２７３８号および特願２００３−１２７７４号の明細書に記載された内容を包含する。
図２は、（Ａ）蛍光法によるＰＡＤＩ４酵素活性測定の結果を示すグラフ、および（Ｂ）吸光法によるＰＡＤＩ４酵素活性測定の結果を示すグラフである。
図３は、ＰＡＤＩ４の２つのハプロタイプ：Ｖ９およびＶ１８の酵素活性を吸光法により比較した結果を示すグラフである。
図４は、ＲＡ患者滑膜組織におけるＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡ発現をみたＩｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。図中右の２つは陰性対照である。
図５は、マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）群と正常（ｎｏｒｍａｌ）群における滑膜組織および脾臓組織におけるｍＰＡＤＩ４遺伝子発現量を示すグラフである。
図６は、（Ａ）抗ＰＡＤＩ４抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）ＰＡＤＩ４を特異的に認識する抗体とＰＡＤＩの全てのサブタイプを認識する抗体の両者を用いたＯＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。
図７は、（Ａ）抗ＰＡＤＩ４抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）抗シトルリン化タンパク質抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。
図８は、ヒトＰＡＤＩ４ Ｖ９とＰＡＤＩ４ Ｖ１８のｍＲＮＡの安定性を比較したグラフである。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−１２７３８号および特願２００３−１２７７４号の明細書に記載された内容を包含する。
１． ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ
１．１ ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ＰＡＤＩ４）
ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ（以下、「ＰＡＤＩ」と記載する。）は、蛋白質内のアルギニン残基をシトルリンに変換し、ペプチジルシトルリンを生成させる酵素である。ＰＡＤＩには複数のサブタイプが存在し、ヒトではタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖの４つのサブタイプ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ上に登録されているが、その詳細な機能は不明である。マウスでは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの４つのサブタイプが報告されており、このうちタイプＩＶはヒトＰＡＤＩ４のマウスオーソログである。
本発明者らは、ＲＡ患者の病変組織においてＰＡＤＩ４蛋白質やＰＡＤＩ４遺伝子（ｍＲＮＡ）が特異的に高発現し、シトルリン化ペプチドが高レベルで検出されることを確認した。シトルリン化ペプチドは自己抗体（抗シトルリン化ペプチド抗体）の産生を介して、ＲＡ病変の原因となりうるものである。したがって、ＰＡＤＩ４蛋白質またはその遺伝子の発現量や活性に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価することが可能となる。
（１）本発明のＰＡＤＩ４遺伝子
本発明の評価方法で用いられる遺伝子には、ＰＡＤＩ４遺伝子のほか、そのオーソログ遺伝子も含まれる。「オーソログ遺伝子」とは、「共通の祖先の遺伝子から進化した、同じ機能を有する、異なる種の遺伝子」であって、例えば、ＰＡＤＩ４のオーソログとしては、マウスＰＡＤＩ４等が挙げられる。以下、ＰＡＤＩ４遺伝子とそのオーソログ遺伝子をまとめて、「本発明のＰＡＤＩ４遺伝子」という。
前記遺伝子の由来は特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、霊長類、ゲッ歯動物由来のものがより好ましい。特に、最も好適な例として、ヒトＰＡＤＩ４遺伝子およびマウスＰＡＤＩ４遺伝子を挙げることができる。
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子のうち、ヒトＰＡＤＩ４をコードするｃＤＮＡの配列を配列番号１６に示すが、この配列に限定されず、ヒトＰＡＤＩ４をコードする限り、その遺伝子はヒトＰＡＤＩ４遺伝子に含まれるものとする。例えば、本発明者らは、ヒトＰＡＤＩ４には複数のハプロタイプが存在することを確認したが、これらハプロタイプもヒトＰＡＤＩ４遺伝子に含まれる。同様に、本発明にかかるオーソログ遺伝子のうち、マウスＰＡＤＩ４をコードするｃＤＮＡの配列を配列番号１８に示すが、この配列に限定されず、マウスＰＡＤＩ４をコードする限り、その遺伝子はマウスＰＡＤＩ４遺伝子に含まれるものとする。
なお本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＲＮＡの全てが含まれる。また、配列表の塩基配列はすべてＤＮＡ配列として記載するが、該配列がＲＮＡを示す場合は、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。
（２）本発明のＰＡＤＩ４蛋白質
本発明の評価方法で用いられる蛋白質（ＰＡＤＩ４蛋白質）には、ＰＡＤＩ４遺伝子によってコードされるＰＡＤＩ４蛋白質のほか、前記オーソログ遺伝子によってコードされる蛋白質も含まれる。以下、これらの蛋白質をまとめて、「本発明のＰＡＤＩ４蛋白質」という。
前記蛋白質の由来は特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、霊長類、ゲッ歯動物由来のものがより好ましい。特に、本発明における最も好適な例として、ヒトＰＡＤＩ４蛋白質およびマウスＰＡＤＩ４蛋白質を挙げることができる。
本発明の蛋白質のうち、ヒトＰＡＤＩ４のアミノ酸配列を配列番号１７に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもヒトＰＡＤＩ４としての機能を有する限り、ヒトＰＡＤＩ４蛋白質に含まれるものとする。同様に、マウスＰＡＤＩ４のアミノ酸配列を配列番号１８に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもマウスＰＡＤＩ４としての機能を有する限り、マウスＰＡＤＩ４蛋白質に含まれるものとする。
１．２ 変異型ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ
本発明者らは、ヒトＰＡＤＩ４遺伝子上に慢性関節リウマチ患者に高い頻度で現れる複数の遺伝子多型が存在し、これらがほぼ完全連鎖（９８．９〜１００％）の関係にあって、一つのハプロタイプを構成することを確認した。さらに、このハプロタイプは、正常なＰＡＤＩ４蛋白質とはアミノ酸配列や酵素活性が異なる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質をコードし、その違いがＲＡの発症と深い関連を有することを確認した。
すなわち、本発明にかかる「変異型ＰＡＤＩ４蛋白質」とは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質であって、正常なＰＡＤＩ４のアミノ酸配列（配列番号１７）とは、第５５番アミノ酸（ＳｅｒからＧｌｙに置換）、第８２番アミノ酸（ＡｌａからＶａｌに置換）、第１１２番アミノ酸（ＡｌａからＧｌｙに置換）が異なっている。この違いにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は、正常なＰＡＤＩ４蛋白質よりも酵素活性が高く、ＲＡ病変の一因となるシトルリン化蛋白質の生成を亢進させる。
また、本発明にかかる「変異型ＰＡＤＩ４遺伝子」とは、配列番号２０で示されるｃＤＮＡ配列を有し、正常なＰＡＤＩ４遺伝子とは、ゲノム配列上、第３イントロンの２１３６番目の塩基（シトシンからチミンに置換）、第２エクソンの７１番目の塩基（アデニンからグアニンに置換）、第２エクソンの１５３番目の塩基（シトシンからチミンに置換）、第３エクソンの６２番目の塩基（シトシンからグアニンに置換）、および第４エクソンの９番目の塩基（シトシンからチミンに置換：この置換はアミノ酸置換を伴わない）が異なっている。この違いにより、変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡは、正常なＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡよりも安定性が高く、ＲＡ病変の一因となるシトルリン化蛋白質の生成を亢進させる可能性がある。
２ 被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法
本発明は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、１つの被験物質について、その投与（添加）および非投与条件下における、阻害効果を比較評価するものであってもよいし、２つ以上の被験物質についての同様な比較評価であってもよい。あるいは、前記遺伝子や蛋白質の発現量や活性とＲＡ治療効果との相関関係が経験的に確立されれば、その関係に基づいて、比較対照なしに絶対評価するものであってもよい。
本発明の評価方法において、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標として評価してもよいし、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の活性（安定性含む）を指標として評価しても良い。また、評価系はｉｎ ｖｉｖｏ系であってもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系であってもよい。以下、本発明の評価方法の具体的な実施方法について説明する。
２．１ 本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした評価方法
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標としたｉｎ ｖｉｖｏにおける評価方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：動物の飼育
本発明の評価方法で用いられる「動物」は特に限定されないが、ＲＡ病態を呈するモデル動物が好ましい。そのような動物は市販のものであっても、公知の方法にしたがって作製されたものでもよい。そのようなＲＡ病態を呈するモデルとしては、例えば、自然発症関節炎モデルである、ＭＲＬマウス関節炎、ＮＺＢ／ＫＮマウス関節炎、ＳＫＧマウス関節炎；誘導性関節炎モデルである、ラットアジュバント関節炎、ラット・マウスコラーゲン関節炎（ＣＩＡラット・マウス）、プリスタン関節炎、ＳＣＩＤ細胞移入関節炎、ＳＣＩＤマウス組織移植関節炎；および、ＨＴＬＶ−１トランスジェニックマウス、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストＫＯマウス等を挙げることができる（関節炎モデル 日本医学館、監修・京極方久、編集・安倍千之、澤井高志 参照）。なかでも一般的なのは、ＲＬマウス関節炎、ラットアジュバント関節炎、ラット・マウスコラーゲン関節炎、およびプリスタン関節炎である。
前記動物は、被験物質の投与または非投与条件下で適当な期間飼育を行う。動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重に合わせて、適宜用量を設定すればよい。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて、適宜その投与経路と投与期間を設定すればよい。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下で飼育された動物から血液または細胞を単離し、該血液または細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。
検出対象とする細胞としては、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子が高発現している細胞が好ましく、したがって、好中球や好酸球等の血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出方法としては、例えば、単離された血液または細胞からまず全ＲＮＡを抽出し、該全ＲＮＡ中におけるｍＲＮＡの発現量を検出する方法を挙げることができる。
（１）全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡの抽出は、公知の方法にしたがい、単離された血液または細胞よりＲＮＡ抽出用溶媒を用いて抽出する。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの（例えば、ＴＲＩｚｏｌ試薬：ギブコ・ビーアールエル社製等）が好ましい。ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず、抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。この方法のほか、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
（２）本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下における、全ＲＮＡ中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。遺伝子の発現量は、得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識化合物でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。以下、遺伝子の発現量の検出方法について、ｉ）固相化試料を用いた解析方法、ｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｉｉ）その他の解析方法に分けて、具体的に説明する。
ｉ）固相化試料を用いた解析方法
公知の遺伝子を固定した固相化試料に、投与または非投与条件下における標識したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ（以下、「標識プローブ」と記載する。）を、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。前記標識プローブは、本発明のＰＡＤＩ４のｍＲＮＡクローンでも、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものでもよい。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることがより好ましい。以下、各種固相化試料を用いた解析方法について説明する。
ａ）遺伝子チップ：
本発明で用いられる遺伝子チップは、検出対象である遺伝子が固相化されているものであれば、市販のものであっても、公知の方法（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）に基づき作製されたものであってもよい。遺伝子チップによる検出は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールにしたがい、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールにしたがいハイブリダイゼーションを行い、アビジンによる発光を検出、解析すれば遺伝子の発現量を求めることができる。
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、検出対象である遺伝子が固相化されているものであれば、市販のもの（例えば、インテリジーン（宝酒造社製）、フィルター製マイクロアレイ アトラスシステム（クローンテック社製等））であっても、公知の方法に基づいて作製されたものであってもよい。固相化される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を用いる。
アレイを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。被験物質の投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡと被験物質の非投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡはそれぞれ異なる色素で標識し、両者を混合してハイブリダイズさせ、蛍光シグナル検出器を用いて検出する。得られる蛍光シグナルは投与および非投与条件下における遺伝子発現量の相対比を示す（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
メンブレンフィルターを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。市販のフィルター製マイクロアレイである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
ｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）
ＲＴ−ＰＣＲ法やその１つであるリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法は微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の評価方法に好適である。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法では、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
ｉｉｉ）その他の解析方法
上記以外に、遺伝子発現量を解析する方法としては、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０９３７、Ｗａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ．，Ｓａｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｃｅｌｌ（１９７９）１６，４４３−４５２）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等を挙げることができる。
ａ）サブトラクションクローニング法：
特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社（１９９３）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｎａ，Ｙ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｍ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，Ｙ．（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５５，４−１０）等が挙げられる。
具体的には、まず被験物質の投与または非投与条件下の検体それぞれについてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを精製し、投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを生成する。この一本鎖ｃＤＮＡと、非投与条件下の検体から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性より安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。すなわち、非投与条件下でも発現しているｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、投与条件下でのみ特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
Ｌｉａｎｇらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７，９６７−９７１）に準じ、例えば、以下のように実施できる。まず比較する２つの試料（本発明の場合は被験物質の投与または非投与条件下の検体）からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）およびアービトラリープライマー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒ）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）ｎＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかの検体で特異的に発現している遺伝子（本発明のＰＡＤＩ４遺伝子）を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
目的の組織から精製した全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まず非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、該非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に、被験物質投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型に３２Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、非投与条件下の検体から作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、投与または非投与条件下のｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選ぶことにより、被験物質の投与条件下で特異的に発現する遺伝子をクローニングすることができる。
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
被験物質の投与または非投与条件下の検体のいずれかに由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンをプローブとして、それぞれの検体に由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、投与または非投与条件下の検体の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行い、選択した遺伝子の全ＲＮＡが、投与条件下で特異的に発現していることを確認できる。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の投与または非投与における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．２ 本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした評価方法
本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標としたｉｎ ｖｉｖｏにおける評価方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：動物の飼育
動物は、前項２．１に記載した方法にしたがい、被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出
次に、上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
抗体を利用した蛋白質の検出方法は特に限定されないが、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一の方法であることが好ましい。以下、これらの検出方法について、試料の調製から検出までを具体的に説明する。
（１）試料の調製
検体としては、血液または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質が高発現している細胞が好ましく、したがって好中球や好酸球等の血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。これらの血液または細胞（細胞抽出液として使用する）は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
（２）試料の固相化
上記方法では、まず、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質が含まれる試料中のポリペプチドをメンブレンあるいは９６穴プレートのウェル内底面等に固相化する。
メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）と、直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる方法（ドットブロット法やスロットブロット法）を挙げることができる。用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等を挙げることができる。また、ブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記 ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ 参照）等を挙げることができる。
一方、９６穴プレートに固相化する方法としては、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）等を挙げることができる。固相化は、例えば、前記９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％ アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と記載する。）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置して、ウエル底面にポリペプチドを吸着させればよい。
（３）本発明のＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合する抗体
本工程で用いられる「本発明のＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合する抗体（以下、「抗ＰＡＤＩ４抗体」と記載する。）」は、公知の方法にしたがって調製してもよいし、市販のものを用いてもよい。
前記抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となる本発明のＰＡＤＩ４蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐ．３６５−３６７，１９８０，Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）にしたがって、抗ＰＡＤＩ４抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
抗体作製用の抗原としては、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体（例えば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。
前記抗原ポリペプチドは、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３，１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）やＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４）等が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．ｉ：３９１−３９６）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパクのプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，ｉ．Ｍ．ａｎｄ Ｖ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２０，１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７９，１６７−１７４）。
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，１−５）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，Ｌ．Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，１２５−１３１）。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法にしたがい培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」と記載する）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とする本発明のＰＡＤＩ４タンパクは、以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
（４）検出
上記（３）記載の方法で得られる抗ＰＡＤＩ４抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は１２５Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
（５）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％ スキムミルク、０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
次に、メンブレンを０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」と記載する）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に抗ＰＡＤＩ４抗体を一定時間浸して、メンブレン上の抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、前記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
ｂ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
次に、ウェル内を０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」と記載する）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、洗浄液で適宜希釈した抗ＰＡＤＩ４抗体を分注して一定時間インキュベーションし、抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を標識しておく。標識しなかった方の抗体は、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の投与または非投与条件下における、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも上記蛋白質の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．３ ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を指標とした評価方法
ＰＡＤＩ４活性を指標としたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、ＰＡＤＩ４蛋白質を加える。
工程２：上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。
工程３：被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
工程１：反応液の調製
本方法で用いられる反応液は適当な緩衝液中にＰＡＤＩ４蛋白質の酵素基質となりうるアルギニン含有化合物を含むものである。アルギニン含有化合物とは、例えば、ＢＡＥＥ（Ｎ−α−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、Ｎ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｄａｎｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ等のアルギニンを含む化合物であれば特に限定されない。また、反応液中に添加する被験物質の量や添加方法も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて適宜設定すればよい。ＰＡＤＩ４と基質は２５〜５０℃付近で、１〜２時間程度反応させることが好ましい。
工程２：
次に、上記基質中のアルギニン残基がＰＡＤＩ４によってシトルリンに変換されて生じる反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。ここで「反応生成物」は、酵素反応によって基質から直接生じる反応生成物のほか、副次的に生じる反応生成物であってもよい。以下に、本方法で用いられる好適な測定方法として、蛍光法および吸光法の２つの方法について説明するが、これらに限定されず、他の公知の方法：例えば、蛍光標識されたＤａｎｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを用いてその酵素反応生成物をＨＰＬＣを用いて定量的に調べる方法（Ｔ．Ｃｈｉｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５，ｐ２３０−２３４，（２０００））等を任意に用いることができる。
（１）蛍光法
反応液として、例えば、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液に、基質として１０ｍＭ ＢＡＥＥまたはＮ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−１−ａｒｇｉｎｉｎｅを加えた溶液を調製する。この反応液に、適当量のＰＡＤＩ４蛋白質を加え、例えば、３７℃で１〜２時間程度反応させる。反応後、適当量のＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて励起波長４１３ｎｍ、蛍光波長４７６ｎｍの各波長を測定する。測定結果は、ＰＡＤＩ４蛋白質を含まない反応液での測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用硫酸アンモニウムを添加した反応液での測定値から検量線を描くことにより、生成したアンモニウムイオンの濃度を求める。このアンモニウムイオンイオン濃度を指標としてＰＡＤＩ４蛋白質の活性を評価する。
（２）吸光法
反応液として、例えば、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液に、基質として１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）を加えた溶液を調製する。この反応液に、適当量のＰＡＤＩ４蛋白質を加え、例えば、３７℃で１〜２時間程度反応させる。反応後、８０ｍＭ Ｄｉａｃｅｔｙｌ ｍｏｎｏｘｉｍｅ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ ２−ｂｕｔａｎｅ）、２ｍＭ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅを含むＡ液と、３Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６Ｍ Ｈ２ＳＯ４、２ｍＭ ＮＨ４Ｆｅ（ＳＯ４）２を含むＢ液を１：３の比率で混合した溶液を適当量添加し、サーマルサイクラー（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等）を使用して、例えば、９５℃１５分次いで室温で１０分、反応させる。反応後、吸光度計（例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）等）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定する。測定結果は、酵素を含まない反応液での測定値をバックグラウンドとして差し引き、さらに検量線作成用シトルリンを添加した反応液での測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したシトルリンの濃度を求める。このシトルリン濃度を指標としてＰＡＤＩ４蛋白質の活性を評価する。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の添加または非添加条件下における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の活性の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の添加条件下で非添加条件下よりも前記遺伝子または蛋白質の活性が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の添加または非添加条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．４ 培養細胞を用いた評価方法
培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する方法は、例えば下記の工程を含む。
評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
工程１：細胞を被検物質の添加または非添加条件下で培養する。
工程２：上記細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出するか、または、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被検物質の添加または非添加条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：細胞の培養
本発明の評価方法で用いられる細胞は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を高発現する哺乳動物細胞であれば特に限定されない。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞であって、特に血液、滑膜組織、脾臓組織に由来する培養細胞（好ましくは、初代培養細胞）が好ましい。前記哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。また、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、該遺伝子を高発現するように組換えた細胞など、人為的に形質転換された細胞を使用してもよい。
細胞は、被検物質の添加または非添加条件下で培養する。培養方法は特に限定されず、当該細胞に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養細胞への被検物質の添加方法や添加量も特に限定されず、上記細胞の培養前あるいは培養期間中の適当な時点で、被検物質を培養培地に添加し一定期間培養する。被験物質添加後の培養期間も特に限定されないが、好ましくは３０分〜２４時間である。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出
次に、被検物質の添加または非添加条件下における、上記細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量の相違を検出するか、または、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
遺伝子の検出は、基本的に２．１に記載した方法にしたがって行えばよい。また、抗体を用いた検出は、２．２に記載した方法にしたがって行えばよい。
上記方法のほか、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」と記載する。）を利用して、間接的に本発明のＰＡＤＩ４遺伝子や本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
（１）レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなる蛋白質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似の蛋白質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされる蛋白質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下の蛋白質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
ｅ）緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
（２）レポーター遺伝子の導入
公知の方法に従い、レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを作製し、これらを細胞に同時トランスフェクションする。ベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等を好適に用いることができるが、これらに限定されない。
細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７，Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３）等を挙げることができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
（３）評価
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の転写産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
（４）その他（形質転換細胞株の樹立）
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、および本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。形質転換細胞の作出においては、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれ、継代を重ねても宿主細胞に安定的に保持されることが望ましい。そのように形質転換された細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、もしくは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
こうして得られた細胞株を、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、本発明のＰＡＤＩ４の発現量が評価できる。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の添加または非添加条件下における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の添加条件下で非添加条件下よりも前記遺伝子または蛋白質の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の添加または非添加条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．５ 被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価するためのキット
本発明の評価方法を実施するためのキットとして、例えば、以下のａ）〜ｆ）の少なくとも一つ以上を含むキットを挙げることができる。
ａ）ヒトＰＡＤＩ４遺伝子（配列番号１６）またはマウスＰＡＤＩ４遺伝子（配列番号１７）を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）ヒトＰＡＤＩ４遺伝子またはマウスＰＡＤＩ４遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）ヒトＰＡＤＩ４蛋白質（配列番号１７）またはマウスＰＡＤＩ４蛋白質（配列番号１８）に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
ｆ）ヒトＰＡＤＩ４蛋白質
前記ａ）記載のプライマーは、上記遺伝子の塩基配列（配列番号１６または１７）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーの例としては、例えば、配列番号７〜１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
前記ｂ）記載のプローブは、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐシステムであれば２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。このようなプローブの例としては、例えば配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。これらのプローブや前述のプライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体やｆ）の蛋白質は、２．２に記載した方法により作製することができる。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
前記キットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、あるいはラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素基質等、本発明の評価方法の実施に必要な、その他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
３． 変異型ＰＡＤＩ４を利用した慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法
本発明は、検体中の配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質、またはその遺伝子（配列番号２０）の発現量に基づいて、該検体を提供した被験者の慢性関節リウマチ（以下、「ＲＡ」と記載する。）の発症危険度を予測する方法を提供する。
前記方法において用いられる「検体」とは、被験者から単離された、血液、体液、組織または排泄物等のすべての試料を意味するが、血液（血液由来細胞）、滑膜組織（滑膜細胞）、脾臓組織（脾臓細胞）、腹腔浸潤細胞を含むものが好ましく、特に血球（好中球、好酸球）、滑膜組織（滑膜細胞）がより好ましい。また、発症危険度の予測は、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標として行ってもよいし、変異型ＰＡＤＩ４遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を指標として行ってもよい。
３．１ 変異型ＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした方法
ＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした予測方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：被験者および正常人から単離された各検体より全ＲＮＡを調製する；
工程２：上記全ＲＮＡ中における変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する；
工程３：被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、全ＲＮＡの抽出および変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量の検出と解析は、２．１の記載にしたがって実施することができる。その結果、被験者において変異型ＰＡＤＩ４のｍＲＮＡの発現量が正常人に比較して有意に高い場合、該被験者はＲＡを発症する危険度が高いと評価できる。ここで、「有意に高い」とは、例えば、被験者と正常人の間で変異型ＰＡＤＩ４のｍＲＮＡの発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。なお、前述したように、評価は変異型ＰＡＤＩ４遺伝子と検体内の適当なコントロール遺伝子（例えば、βアクチン遺伝子やリボゾーマルＲＮＡ等）との発現量比として、上記解析に供してもよい。
３．２ 変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした評価方法
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：被験者および正常人から単離された検体中における、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合しうる抗体を用いて検出する；
工程２：被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、該被験者のＲＡの発症危険度を予測する。
前記方法において、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出と解析は、２．２の記載にしたがって実施することができる。その結果、被験者において変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量が正常人に比較して有意に高い場合、該被験者はＲＡを発症する危険度が高いと評価できる。ここで、「有意に高い」とは、例えば、被験者と正常人の間で変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
３．３ 慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキット
本発明はまた、慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキットを提供する。該キットは、例えば、以下のａ）〜ｅ）の少なくとも一つ以上を含む。
ａ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
前記ａ）記載のプライマーは、上記遺伝子の塩基配列（配列番号２０または２１）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。また、前記ｂ）記載のプローブは、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐシステムであれば２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に変異型ＰＡＤＩ４遺伝子の配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。このようなプローブの例としては、例えば配列番号４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。これらのプローブや前述のプライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、２．２に記載した方法により作製することができる。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
前記キットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、あるいはラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液等、本発明の方法の実施に必要な、その他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
３．４ ＲＡ診断用マーカー
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子は、本発明者らによって新規に見出されたものであり、これら変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子と正常型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子との機能的な違いは、ＲＡ発症と深い関連を有する。すなわち、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や、配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子は、ＲＡの診断用マーカーとして（例えば、抗変異型ＰＡＤＩ４抗体作製のための抗原として）有用である。本発明はそのような変異型ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ診断用マーカーも提供する。
４． 変異型ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ治療薬のスクリーニング方法
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は正常型ＰＡＤＩ４蛋白質に比較して酵素活性が高く、シトルリン化ペプチド生成の亢進を介して、ＲＡ発症の一つの原因となりうる。したがって、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する特異的な阻害効果を指標とすることにより、ＲＡ治療薬のスクリーニングも可能となる。
すなわち、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
例えば、前記方法は下記の工程を含む。
工程１：アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を加える；
工程２：上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する；
工程３：被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は、２．２の記載にしたがって調製することができ、工程１〜３は２．３の記載にしたがって実施することができる。
５． その他
５．１ ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ病態の予測方法
ヒトＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質は、ＲＡ患者の病変組織（例えば、滑膜組織）で特異的に高発現し、シトルリン化タンパク質の生成を通じてＲＡの原因となりうる。したがって、前述した変異型ＰＡＤＩ４のみならず、被験者から単離された検体中の、ＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を測定すれば、該被験者のＲＡ病態を予測することもできると考えられる。
５．２ ＲＡモデル動物
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子や変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を人為的に高発現させることにより、ＲＡ病態を呈する動物（例えば、マウス等）を作製することも可能である。例えば、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を適当なベクターに組み込んで、動物に導入し、ヒトＲＡに代表される炎症症状等の表現的変化が現れれば、該動物を利用してＲＡの病態やその治療薬の研究を行うことができる。同様に、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質または変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を直接動物に導入することによって、ＲＡ病態を呈するモデル動物を作製することも可能と考えられる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 ＰＡＤＩ４第３イントロン中の一塩基多型とＲＡ罹患とのアソシエーション解析
１． 解析対象患者の選択
日本各地の臨床施設より８４６人のＲＡ患者と６５８人の非患者とからゲノムＤＮＡ抽出用の血液を採取した。すべての検体提供者は日本人である。提供者からは、理化学研究遺伝子多型研究センター倫理委員会によるインフォームドコンセントに対する同意を得た。ＲＡ患者については、Ｔｈｅ ｒｅｖｉｓｅｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓの以下の７つの基準のうち少なくとも３項目に該当する者をＲＡ患者群として選択した。
（１）朝のこわばり
（２）３領域以上の関節炎
（３）手関節炎
（４）対称性関節炎
（５）リウマトイド結節
（６）リウマトイド因子
（７）Ｘ線所見
非患者群については、日本人一般集団から患者とは独立に選抜した。ＲＡの診断の有無以外ではＲＡ患者群、非患者群の間に差がないようにサンプリングした。
２． ゲノムＤＮＡの調製
ＲＡ患者および非患者の末梢血から分離した白血球を出発材料とし、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出にあたっては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ入り採血菅（ベノジェクト）に採血し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。得られた各試料の２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、調製したＤＮＡは、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、使用するまで、−８０℃で保存した。
３． 第３イントロン中の一塩基多型の検出
以下に示す３種のプローブを用いて、ＰＡＤＩ４の第３イントロンの２１３６（−１５）番目の位置（配列番号１の６１７７番目）における塩基がシトシンであるかチミンであるかの検出を行った。
インベーダープローブ：
シトシン検出用ＦＡＭプローブ：
チミン検出用ＶＩＣプローブ：
各プローブはＴｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．に委託して設計・合成後、試薬として混合されたものを使用した。インベーダーアッセイは、９６ウェル（日本ジェネティックス）か３８４ウェルプレート（ＡＢＩ）に、ＰＣＲ反応液の４倍希釈液２μｌおよび上記の３種のプローブの入ったインベーダー反応液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を３μｌ加え、９５℃にて５分間インキュベートした後、６３℃にて２０分から８０分、シグナルが分離するまで反応させた。９６ウェルの場合はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、３８４ウェルの場合はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使ってシグナルを検出した。
４． 統計解析
ケース群（ＲＡ患者群）８４６人とコントロール群（非患者群）６５８人を対象とし、第３イントロン２１３６番目の塩基の１塩基多型についてケース・コントロール関連検定を行った。検定は２群間のアレル頻度分布比較・優性遺伝形式モデルによるジェノタイプ分布比較・劣性遺伝形式モデルによるジェノタイプ頻度比較にて行った。検定方法は２Ｘ２分割表χ２検定を用いた。解析結果を表１に示す。
以上のとおり、ＰＡＤＩ４遺伝子の第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の位置の遺伝子多型と慢性関節リウマチ罹患との間に統計的に有意な相関が認められた。
〔実施例２〕 ＰＡＤＩ４遺伝子中の新規エクソン−塩基多型の検出
１．検出方法
ＧｅｎＢａｎｋのアクセション番号：ＮＴ＿０３０５８４．２に示されるゲノム配列の第４１５，０８５塩基から第４７０，６００塩基に存在する、ＰＡＤＩ４遺伝子上の新規遺伝子多型の検出を以下の方法により試みた。
まず、該遺伝子の全エクソン、およびエクソン近傍イントロン、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域を約５００塩基対ごとに分割して増幅領域と設定し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌ）ソフトウェアを用いてデザインした。ＰＣＲ条件はＤＭＳＯの濃度と、アニール温度を変えることで最適化した。
ＰＣＲは９６ウェルＰＣＲプレートで行い、各ウェルに４ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡを２μｌずつ使用した。反応は２６．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，７．２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），３．２ｍＭ Ｍｇ２＋，１．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．６ｍＭ ｂ−Ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ，１０％ ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯを用いない場合には、Ｈ２Ｏにて代用），１μＭ ｐｒｉｍｅｒｓ，２．０Ｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）），０．０４μＭ Ｔａｑ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の溶液条件で行った。反応時間および反応温度の条件として、９４℃にて２分間変性させた後、９４℃１５秒、反応ごとに最適化したアニール温度で４５秒，７２℃にて１あるいは３分の伸張反応を３７サイクル、ＡＢＩ９７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。増幅されたＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＲＲ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使って反応を行い、ＡＢＩ ３７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて塩基配列を決定した。
２．結果
各々の領域につき４８人分の塩基配列を比較し、多型性の認められた塩基を１塩基多型とみなした。この結果、アミノ酸の置換を伴う以下の３種の新規エクソン一塩基多型とアミノ酸の置換を伴わない１種の新規エクソン多型が見出された。
１）第５５番アミノ酸の置換（Ｓｅｒ／Ｇｌｙ）を伴う多型：
第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基がアデニンまたはグアニンである一塩基多型
２）第８２番アミノ酸の置換（Ａｌａ／Ｖａｌ）を伴う多型：
第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型
３）第１１２番アミノ酸の置換（Ａｌａ／Ｇｌｙ）を伴う多型：
第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基がシトシンまたはグアニンである一塩基多型
４）第１１７番アミノ酸（Ｌｅｕ）における、アミノ酸の置換を伴わない多型：
第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型
〔実施例３〕 ＰＡＤＩ４遺伝子上の各一塩基多型の連鎖解析
１．解析方法
ＲＡと強い関連が認められたＰＡＤＩ４第３イントロン２１３６番目（−１５番目）のヌクレオチドの一塩基多型（以下、「ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃ」と示す。）とＰＡＤＩ４上の４つの新規一塩基多型とのＰａｉｒｗｉｓｅ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｉｎｄｅｘ（Ｄ’）をＥＭアルゴリズムを用いて算出した。
２．結果
その結果、４つの一塩基多型は相互にほぼ完全連鎖（９８．９〜１００％）の関係にあり、かつＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃともほぼ完全連鎖の関係にあることが、ＥＭアルゴリズムによるハプロタイプ解析によって確認された。一方、ＰＡＤＩ４近傍のＰＡＤＩ２、ＰＡＤＩ１遺伝子内の公知の一塩基多型とＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃについては、ほとんど連鎖平衡に達していた。
つまり、日本人集団では、ＲＡ患者群と非患者群の両群において、５５（Ｓｅｒ）−８２（Ａｌａ）−１１２（Ａｌａ）タイプと５５（Ｇｌｙ）−８２（Ｖａｌ）−１１２（Ｇｌｙ）タイプの２ペプチドタイプのみが存在し、このうち後者のタイプとＲＡとの間に、ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃと同様のアソシエーションがあることが確認された。以下、前者を「ＰＡＤＩ４ Ｖ１８」（あるいは単に「Ｖ１８」）、後者を「ＰＡＤＩ４ Ｖ９」（あるいは単に「Ｖ９」）と記載する。Ｖ１８のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号１６に、アミノ酸配列は同配列番号１７に記載した。また、Ｖ９のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号２０に、アミノ酸配列は同配列番号２１に記載した。
以上より、ＰＡＤＩ４遺伝子のジェノタイプとＲＡ発症との間には関連があり、その関連はＰＡＤＩ４遺伝子に存在する２つのハプロタイプに由来するものと考えられた。そして、ＲＡの発症に関連するハプロタイプはＶ９であり、ＲＡの発症と関連がないハプロタイプはＶ１８であると考えられた。
〔実施例４〕 ヒトＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡの安定性比較
１．分解度の測定
２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプをコードする遺伝子は以下の方法で調製した。
まず、Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により合成したｃＤＮＡをｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。得られたｃＤＮＡを、さらにＴ７プロモーターを含むｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にリクローニングし、それぞれｐＶ１８−Ｔ７およびｐＶ９−Ｔ７ベクターを作製し、それらについてシークエンシングを行った。次いで、ｐＶ１８−Ｔ７およびｐＶ９−Ｔ７ベクターをＣｌａＩで消化し、ＲｉｂｏＭａｘＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い、Ｖ９、およびＶ１８のｍＲＮＡを作製した。
Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔを調製するために、ＨＬ−６０細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．５％ ＮＰ−４０；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０；２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｖ／ｖ）；４００ｍＭ ＮａＣｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ；１％ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ））に懸濁した。氷上で３０分インキュベーションした後、４℃で遠心し、上清を８０℃で保存した。
Ｖ９、およびＶ１８の各ｍＲＮＡ ５μｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎに１０００倍希釈した前述のＷｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ ３μｌを混ぜ、室温でインキュベートした。０，５，１０分反応後、ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｄｙｅを加えて反応を止め、６８℃で１０分間加熱し、氷冷した。転写産物はノザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。スキャニングはＤｏｃｕＣｅｎｔｒｅ ｃｏｌｏｒ ５００ｃｐ（Ｆｕｊｉ−Ｘｅｒｏｘ社）を用いて行い、シグナル強度はＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ６．０（Ａｄｏｂｅ社）により測定した。
結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＲＡ病変に関連したＶ９のｍＲＮＡはＲＡ病変に関連しないＶ１８のｍＲＮＡに比べて有意に分解し難い傾向にあることがわかった。（＊Ｔ検定より５分後でｐ＝０．０４８，１０分後でｐ＝０．０１３）。
〔実施例５〕 ヒトＰＡＤＩ４タンパクの調製
１．大腸菌によるＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＡＤＩ４タンパク質の発現
Ｈｉｓ−ｔａｇを付加した２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプ断片：ＲＧＳ６−ＨｉｓＶ１８（配列番号５）、またはＲＧＳ６−ＨｉｓＶ９（配列番号６）がｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩへ挿入された発現プラスミドを作製した。このプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ｃｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）とクロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＬＢ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に接種し、３７℃で一晩培養した。１０ｍＬの培養液を１Ｌの２％グルコース（和光純薬）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）を添加した２倍濃度のＬＢ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加し、６００ｎｍ波長の吸光度が０．９になるまで３７℃で培養した。終濃度０．１ｍＭになるようにイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ：和光純薬）を添加し、２０℃で４時間培養した。培養液を６０００×ｇで１０分遠心して、菌体を回収した。菌体を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、１００ｍＭ塩化ナトリウム（和光純薬）、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ：和光純薬）、規定量の完全蛋白分解酵素阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含む溶解用緩衝液へ懸濁して、４℃で超音波破砕し、９７０００×ｇで３０分遠心して上清を回収した。さらにこの上清をＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ（ミリポア社）フィルターにかけた。
２．Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＰＡＤＩ４タンパク質の精製
前項で調製した上清を予めバッファーＡ｛５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、１ｍＭエチレンヂアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ：同仁化学）｝で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、０．１Ｍの塩酸ナトリウムが入ったバッファーＡで分画した。活性が認められた画分をバッファーＡで予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、０．１Ｍの塩酸ナトリウムが入ったバッファーＡで洗浄した後、バッファーＡへ添加した塩酸ナトリウム濃度を０．１Ｍから０．２Ｍへ徐々に変化させて溶出し、分画した。活性が認められた画分に三倍量のバッファーＢ｛５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、０．１Ｍ塩化ナトリウム（和光純薬）、０．１％トライトンＸ−１００｝を加え、Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（ＱＩＡＧＥＮ社）に供した。カラムを２０ｍＭのイミダゾールが入ったバッファーＢで洗浄し、２００ｍＭのイミダゾールが入ったバッファーＢで溶出した。活性が認められた画分をバッファーＣ｛１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（和光純薬）、２ｍＭ ＤＴＴ（和光純薬）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（同仁化学）｝で透析し、濃縮後、終濃度１０％になるようにグリセロール（Ｓｉｇｍａ社）を添加して、−８０℃に保存した。
〔実施例６〕 ヒトＰＡＤＩ４タンパクの活性測定
１．ＰＡＤＩ４活性の測定方法（蛍光法）
酵素反応用の緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）またはＮ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−１−ａｒｇｉｎｉｎｅ（東京化成）を含む溶液を調製した。この緩衝液４０μｌと、実施例５で調整したＶ１８酵素原液（１１３μｇ／ｍｌ）の希釈列１０μｌをＰＣＲ反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）内にて混合し、３７℃で２時間反応させた。反応後、１０μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止した。このうち５０μｌ分をｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（日本ジェネティクス社）に移した。なお同時に、検量線作成のため、０−５０ｎＭの硫酸アンモニウム溶液も別のウェルへ添加した。さらにこれらのウェルへ、５０ｍＭホウ酸を１ｍｌ、および５０ｍＭ ｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅと５０ｍＭ ＤＴＴの等量混合溶液を５０μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。反応溶液は２００μｌ分を白色プレート（コースター・コーニング社）に移し、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて励起波長４１３ｎｍ、蛍光波長４７６ｎｍの各波長を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用硫酸アンモニウムを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したアンモニウムイオンの濃度を求めた（図２Ａ）。
２．ＰＡＤＩ４活性の測定方法（吸光法）
酵素反応用の緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液を調製した。この緩衝液４０μｌと、１１３μｇ／ｍｌの実施例５で調整したＶ１８酵素原液（１１３μｇ／ｍｌ）の希釈列１０μｌをＰＣＲ反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）内にて混合し、５０℃もしくは３７℃で２時間反応させた。反応後、Ａ液（８０ｍＭ Ｄｉａｃｅｔｙｌ ｍｏｎｏｘｉｍｅ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ ２−ｂｕｔａｎｅ）、２ｍＭ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を含む）とＢ液（３Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６Ｍ Ｈ２ＳＯ４、２ｍＭ ＮＨ４Ｆｅ（ＳＯ４）２を含む）を１：３の比率で混合した溶液を１５０μｌずつ添加した。なお同時に、検量線作成のため、０−４００μＭのＬ−シトルリン溶液も別のウェルへ添加し、同様にＡ液とＢ液の混合溶液を添加した。混合溶液は、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して９５℃１５分の後室温で１０分反応させた。反応後の溶液は１５０μｌ分を９６ウェルプレート（コーニング社）に移し、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用シトルリンを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したシトルリンの濃度を求めた（図２Ｂ）。
３．ヒトＰＡＤＩ４ハプロタイプＶ９およびＶ１８の酵素活性
吸光度法を用いてヒトＰＡＤＩ４ハプロタイプＶ９およびＶ１８の酵素活性を測定し、比較した（図３）。図３から明らかなように、Ｖ９はＶ１８に比べて有意に酵素活性が高いことが確認された（Ｐ＜０．０１）。以上より、ＲＡ病変に関連したＰＡＤＩ４タイプ（Ｖ９）は正常ＰＡＤＩ４タイプ（Ｖ１８）よりもその酵素活性が高く、こうした酵素活性の違いがＲＡ発症と何らかの関連を有することが推測された。
〔実施例７〕 ＲＡ患者のＰＡＤＩ４ジェノタイプと抗シトルリン化フィラグリン抗体価との関連
１．抗シトルリン化ペプチド抗体価の測定方法
ＲＡ患者血清の抗シトルリン化ペプチド抗体価をＭＥＳＡＣＵＰ ＡＣＦテストは、医学生物学研究所（名古屋）委託して作製したキットを用いて行った。ＭＥＳＡＣＵＰ ＡＣＦテストとは、リコンビナント ヒトフィラグリンペプチドをＰＡＤによりシトルリン化した、シトルリン化フィラグリンを抗原として、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する方法である。
まず、患者末梢血より血清を調製し、１０μｌを反応用緩衝液１ｍＬに加えて１０１倍希釈した。抗フィラグリン抗体標準血清２、標準血清１および希釈した検体を１５０μＬずつ一次反応準備用マイクロプレートに実際と同じように添加した。その後、抗原感作マイクロカップにマルチピペットを用い１００μＬずつ移した。室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させた後、洗浄液で４回洗浄し、酵素標識抗体をマルチピペットで１００μＬずつ添加した。その後、室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させ、反応停止液をマルチピペットで１００μＬずつ添加した。
各反応後のサンプルを分光吸光度計を用いてＯＤ４５０を測定し、Ｉｎｄｅｘ値を下式を用いて算出した。
２．ＰＡＤＩ４ジェノタイプと抗シトルリン化フィラグリン抗体価との関連
ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃジェノタイプの決められた、ＲＡ患者５７人につき、血清中の抗合成シトルリン化フィラグリン抗体価を測定した。
カットオフ値１０にて、分割表検定を行ったところ、下表２のようになった。
罹患ホモ接合体（ＴＴ）のジェノタイプと他のジェノタイプとの間の比較をＦｉｓｈｅｒ’ｓ正確検定（Ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）にて行ったところ、ｐ＝０．０２８４を得た。すなわち、ＲＡ患者内において、罹患ホモ接合体（ＴＴ）のジェノタイプを有する患者では抗シトルリン化フィラグリン抗体価が他のジェノタイプを有する患者に比較して有意に高いことが示された。この結果と実施例４、６の結果より、ＰＡＤＩ４ジェノタイプの違いは、ｍＲＮＡの安定性や酵素活性といったＰＡＤＩ４フェノタイプの変化をもたらし、シトルリン化タンパクのレベルの亢進につながる可能性が高いことが推測された。
〔実施例８〕 ＲＡ患者滑膜組織におけるＰＡＤＩ４発現量の検討
１．Ｉｎ ｓｉｔｕ−ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＡ患者の滑膜組織から調整した組織片にＰｒｏ ＳＴＡＲ ＨＦ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社）を添加し、以下の条件でＯｎｅ ｓｔｅｐ Ｉｎ ｓｉｔｕ−ＲＴ−ＰＣＲをＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ（Ｈｙｂａｉｄ Ｌｔｄ．，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）上にて実施した。
（１）４２℃ ３０分
（２）９４℃ ２分，５５℃ ４５秒，６８℃ ２分
（３）９４℃ ４５秒，５５℃ ４５秒，６８℃ ２分、２５サイクル
ＰＣＲ反応後のスライドグラスはＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄した。
ｈＰＡＤＩ４ Ｖ１８のｃＤＮＡ（配列番号１６）を鋳型に、以下のＰＡＤＩ４増幅用プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた３３５塩基長の増幅産物をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識して、ＰＡＤＩ４検出用プローブとした。
なお、ＤＩＧ標識はＰＣＲ ＤＩＧ ｐｒｏｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて行った。
逆転写後のサンプルに、前述のプライマーを最終濃度０．３４μＭとなるように加え、スライドグラスを被せて３７℃１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、９４℃で５分間変性させたＤＩＧ標識プローブを加え、３７℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。反応後のスライドを洗浄し、ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてＰＡＤＩ４遺伝子の検出を行った。陰性対照として、プライマー非添加、反応酵素非添加の条件で同様に検出を行った。
２．結果
結果を図４に示した。ＰＡＤＩ４の転写産物はＲＡ患者滑膜組織の表層（ｌｉｎｉｎｇ）と滑膜表層下（ｓｕｂ−ｌｉｎｉｎｇ ｌａｙｅｒ）付近に局在していた。また、シグナルは繊維芽細胞様細胞や血管周囲の球状核細胞（ｒｏｕｎｄ−ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）中で観察された。
〔実施例９〕 マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるＰＡＤＩ４遺伝子発現量の検討
マウスにコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を誘導し、その滑膜組織および脾臓組織における、マウス ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ｍＰＡＤＩ４）遺伝子の発現量について検討した。なお、ｍＰＡＤＩ４は、ヒトペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ｈＰＡＤＩ４）のマウスオーソログである。ｍＰＡＤＩ４のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列表の配列番号１８および配列番号１９に記載した。
１． マウスＣＩＡモデルの作製
ＤＢＡ／１Ｊマウス（５週齢の雌、日本チャールスリバー（株）より購入）は、ＣＩＡ群（Ｎ＝１１）と健常群（Ｎ＝１１）に分けた。ＣＩＡ群は訓化後、タイプＩＩコラーゲン２ｍｇ／ｍｌ（コラーゲン技術研修会）およびＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ（ＤＩＦＣＯ）を等量の割合で混ぜ、超音波によりエマルジョン化したものを、１匹あたり１００μｌ、一週間の間隔をおいて計２回尾根部に皮内投与した。最終的に、ＣＩＡ群は発症が見られた５匹７肢を、健常群は１１匹２２肢を以下の実験に供した。
２．滑膜組織および脾臓組織における、ｍＰＡＤＩ４遺伝子発現量の測定
マウスは２回目の投与後７週目に断頭放血により致死させ、滑膜組織および脾臓組織をハサミおよびピンセットで摘出した。摘出した組織より、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔまたはＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡより、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲＴＭ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ）を用いて、添付プロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。
ｍＰＡＤＩ４遺伝子の発現は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより検討した。用いたｍＰＡＤＩ４遺伝子増幅用プライマー、およびｍＰＡＤＩ４遺伝子検出用プローブは以下のとおりである。
なお、ｍＰＡＤＩ４遺伝子発現量は、内部標準として用いたマウスβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｍＧＵＳ）遺伝子の発現量で補正した。ＭＧＵＳ４遺伝子増幅用プライマー、およびＭＧＵＳ４遺伝子検出用プローブの配列は以下のとおりである。
３． 結果
結果を図５に示した。ＣＩＡ群滑膜組織では健常群滑膜組織に比べｍＰＡＤＩ４の発現量は１９．５倍に上昇していた。また、ＣＩＡ群脾臓組織では健常群脾臓組織に比べｍＰＡＤＩ４の発現量は３倍に上昇していた。以上よりＣＩＡ群では、滑膜組織および脾臓組織においてｍＰＡＤＩ４遺伝子発現が著しく上昇することが確認された。
〔実施例１０〕 抗ＰＡＤＩ４抗体（抗ＰＡＤＩ４ペプチド抗血清）の調製
ヒトＰＡＤＩ４由来のペプチド配列（ＰＡＫＫＫＳＴＧＳＳＴＷＰ−Ｃｙｓ：配列番号１５）を合成し（オリエンタル酵母北山ラベス，ペプチド合成機：アプライドバイオシステムズジャパン株式会社，Ｐｉｏｎｅｅｒ，合成法：Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた固相合成）、ＫＨＬ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）をＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ）法を用いてコンジュゲーションした。
免疫動物はウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ，オス，週齢：リタイア）を使用し、初回免疫において、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント，ＤＩＦＣＯ）と抗原との等量混合液を背部皮下に注射した。初回免疫はこの抗原を６００μｇペプチド／匹用いて行った。２回目以降はＦＩＡ（フロイントの不完全アジュバント，ＤＩＦＣＯ）と抗原との等量混合液を２週間おきに３回背部皮下に注射した。２次免疫以降はこの抗原を３００μｇペプチド／匹用いて行った。最終免疫から２週間後に全採血し、３０００ｒｐｍにて２０分間、遠心し、血清を分離回収したのち、ＮａＮ３（和光純薬）を０．０５％（ｗ／ｖ）添加し、４℃（冷蔵）にて保存した。
〔実施例１１〕 ＲＡ患者関節滑膜組織片の免疫染色
１．関節滑膜組織切片の調製
人工膝関節置換術に際して得られた切離組織より、関節滑膜組織片を得た。得られた滑膜組織片は即座に液体窒素中に漬け、スライドグラス上薄層切片作製まで−８０℃で保存した。薄層切片化に際し、凍結組織片を１０％中和緩衝ホルマリンにて固定し、７０％エタノール、８５％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール（１００％エタノールの場合に限り２回）にて各１時間脱水処理し、ついで、５０％エタノール５０％パラフィン溶液で３０分間にて１回、１００％パラフィン溶液で３０分間にて２回、処理し、組織片をパラフィン化した。その後、組織片をパラフィン中に包埋した。パラフィン包埋組織片はライカミクロトームＲＭ２１６５で４μｍの厚さにスライスし、スライドグラスに固定した。
２．免疫染色
免疫染色に先立ち、前項で調製したパラフィン包埋切片をキシレンに３分間ずつ２回つけ、脱パラフィン化した後、１００％エタノールに１分間ずつ２回、９５％エタノールに１分間ずつ２回、さらにＰＢＳ（０．１３Ｍ ＮａＣｌ，８．６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）に３分間ずつ２回つけ、再水和した。３０％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で３分間処理し、内在性ビオチンを除去した。ＰＢＳにて５分間ずつ２回、洗浄し、１０００倍希釈したそれぞれの抗体：抗シトルリン化タンパク質抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）と実施例１０で調製した抗ＰＡＤＩ４抗体とを加えて４℃にて１２時間反応させた。反応後、ＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄し、ＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎ ＭＡＸ−ＰＯ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）を１スライドにつき１００μｌずつ加え、２５℃にて３０分間反応させた。その後、ＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄を行った。基質として、ＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎ ＡＥＣ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）を１スライドにつき１００μｌずつ加え、シグナルが検出されるまで５分から２０分反応させた。反応は超純水につけて停止させた。
３．結果
結果を図６および図７に示す。ＲＡ患者の滑膜組織ではＰＡＤＩ４を特異的に認識する抗体による反応（Ａの枠で囲った箇所の赤い部分）が認められたが、関節リウマチの陰性対照である変形性関節症（ＯＡ）患者の滑膜組織にはＰＡＤＩ４を認識する抗体による反応は認められなかった（図６Ｂ）。また、ＲＡ患者の滑膜組織では、ＰＡＤＩ４とほぼ同じような部分にシトルリン化タンパク質が認められた（図７）
〔実施例１２〕 ヒトＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡの安定性比較
１．ｍＲＮＡの調製
２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプのｍＲＮＡは、以下の方法で調製した。
Ｖ９もしくはＶ１８をコードする遺伝子をＣＭＶプロモーターの下流につないだプラスミドを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、添付のプロトコールに従ってヒトＫ５６２細胞への遺伝子導入を行った。３７℃で４時間培養した後、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。４０時間培養した後、アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加し、０、２、４時間後にそれぞれ細胞を回収した。
次いで、全ＲＮＡ抽出用試薬（ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉおよびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ ｓｅｔ：ＱＩＡＧＥＮ社）を添付のプロトコールに従って用いることにより、全ＲＮＡを抽出した。なお、回収した全ＲＮＡは−８０℃に保存した。残存したヒトＰＡＤＩ４ Ｖ９もしくはＶ１８のｍＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、指定のプロトコールに従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。なお、得られたデータはリボゾーマルＲＮＡ（１８Ｓ）の値を用いて補正した。
２．結果
図８に示すように、ＰＡＤＩ４ Ｖ９のｍＲＮＡは、ＰＡＤＩ４ Ｖ１８に比べて有意に分解し難い傾向にあることが分かった（Ｔ検定より、４時間後でｐ＝０．０３）
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
１．１ ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ＰＡＤＩ４）
ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ（以下、「ＰＡＤＩ」と記載する。）は、蛋白質内のアルギニン残基をシトルリンに変換し、ペプチジルシトルリンを生成させる酵素である。ＰＡＤＩには複数のサブタイプが存在し、ヒトではタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖの４つのサブタイプ遺伝子がＧｅｎＢａｎｋ上に登録されているが、その詳細な機能は不明である。マウスでは、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの４つのサブタイプが報告されており、このうちタイプＩＶはヒトＰＡＤＩ４のマウスオーソログである。
本発明者らは、ＲＡ患者の病変組織においてＰＡＤＩ４蛋白質やＰＡＤＩ４遺伝子（ｍＲＮＡ）が特異的に高発現し、シトルリン化ペプチドが高レベルで検出されることを確認した。シトルリン化ペプチドは自己抗体（抗シトルリン化ペプチド抗体）の産生を介して、ＲＡ病変の原因となりうるものである。したがって、ＰＡＤＩ４蛋白質またはその遺伝子の発現量や活性に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価することが可能となる。
（１）本発明のＰＡＤＩ４遺伝子
本発明の評価方法で用いられる遺伝子には、ＰＡＤＩ４遺伝子のほか、そのオーソログ遺伝子も含まれる。「オーソログ遺伝子」とは、「共通の祖先の遺伝子から進化した、同じ機能を有する、異なる種の遺伝子」であって、例えば、ＰＡＤＩ４のオーソログとしては、マウスＰＡＤＩ４等が挙げられる。以下、ＰＡＤＩ４遺伝子とそのオーソログ遺伝子をまとめて、「本発明のＰＡＤＩ４遺伝子」という。
前記遺伝子の由来は特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、霊長類、ゲッ歯動物由来のものがより好ましい。特に、最も好適な例として、ヒトＰＡＤＩ４遺伝子およびマウスＰＡＤＩ４遺伝子を挙げることができる。
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子のうち、ヒトＰＡＤＩ４をコードするｃＤＮＡの配列を配列番号１６に示すが、この配列に限定されず、ヒトＰＡＤＩ４をコードする限り、その遺伝子はヒトＰＡＤＩ４遺伝子に含まれるものとする。例えば、本発明者らは、ヒトＰＡＤＩ４には複数のハプロタイプが存在することを確認したが、これらハプロタイプもヒトＰＡＤＩ４遺伝子に含まれる。同様に、本発明にかかるオーソログ遺伝子のうち、マウスＰＡＤＩ４をコードするｃＤＮＡの配列を配列番号１８に示すが、この配列に限定されず、マウスＰＡＤＩ４をコードする限り、その遺伝子はマウスＰＡＤＩ４遺伝子に含まれるものとする。
なお本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＲＮＡの全てが含まれる。また、配列表の塩基配列はすべてＤＮＡ配列として記載するが、該配列がＲＮＡを示す場合は、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。
（２）本発明のＰＡＤＩ４蛋白質
本発明の評価方法で用いられる蛋白質（ＰＡＤＩ４蛋白質）には、ＰＡＤＩ４遺伝子によってコードされるＰＡＤＩ４蛋白質のほか、前記オーソログ遺伝子によってコードされる蛋白質も含まれる。以下、これらの蛋白質をまとめて、「本発明のＰＡＤＩ４蛋白質」という。
前記蛋白質の由来は特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、霊長類、ゲッ歯動物由来のものがより好ましい。特に、本発明における最も好適な例として、ヒトＰＡＤＩ４蛋白質およびマウスＰＡＤＩ４蛋白質を挙げることができる。
本発明の蛋白質のうち、ヒトＰＡＤＩ４のアミノ酸配列を配列番号１７に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもヒトＰＡＤＩ４としての機能を有する限り、ヒトＰＡＤＩ４蛋白質に含まれるものとする。同様に、マウスＰＡＤＩ４のアミノ酸配列を配列番号１８に示すが、この配列に限定されず、該配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列で示されるペプチドもマウスＰＡＤＩ４としての機能を有する限り、マウスＰＡＤＩ４蛋白質に含まれるものとする。
１．２ 変異型ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ
本発明者らは、ヒトＰＡＤＩ４遺伝子上に慢性関節リウマチ患者に高い頻度で現れる複数の遺伝子多型が存在し、これらがほぼ完全連鎖（９８．９〜１００％）の関係にあって、一つのハプロタイプを構成することを確認した。さらに、このハプロタイプは、正常なＰＡＤＩ４蛋白質とはアミノ酸配列や酵素活性が異なる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質をコードし、その違いがＲＡの発症と深い関連を有することを確認した。
すなわち、本発明にかかる「変異型ＰＡＤＩ４蛋白質」とは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質であって、正常なＰＡＤＩ４のアミノ酸配列（配列番号１７）とは、第５５番アミノ酸（ＳｅｒからＧｌｙに置換）、第８２番アミノ酸（ＡｌａからＶａｌに置換）、第１１２番アミノ酸（ＡｌａからＧｌｙに置換）が異なっている。この違いにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は、正常なＰＡＤＩ４蛋白質よりも酵素活性が高く、ＲＡ病変の一因となるシトルリン化蛋白質の生成を亢進させる。
また、本発明にかかる「変異型ＰＡＤＩ４遺伝子」とは、配列番号２０で示されるｃＤＮＡ配列を有し、正常なＰＡＤＩ４遺伝子とは、ゲノム配列上、第３イントロンの２１３６番目の塩基（シトシンからチミンに置換）、第２エクソンの７１番目の塩基（アデニンからグアニンに置換）、第２エクソンの１５３番目の塩基（シトシンからチミンに置換）、第３エクソンの６２番目の塩基（シトシンからグアニンに置換）、および第４エクソンの９番目の塩基（シトシンからチミンに置換：この置換はアミノ酸置換を伴わない）が異なっている。この違いにより、変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡは、正常なＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡよりも安定性が高く、ＲＡ病変の一因となるシトルリン化蛋白質の生成を亢進させる可能性がある。
２ 被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法
本発明は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子、または該遺伝子にコードされる蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
前記方法は、１つの被験物質について、その投与（添加）および非投与条件下における、阻害効果を比較評価するものであってもよいし、２つ以上の被験物質についての同様な比較評価であってもよい。あるいは、前記遺伝子や蛋白質の発現量や活性とＲＡ治療効果との相関関係が経験的に確立されれば、その関係に基づいて、比較対照なしに絶対評価するものであってもよい。
本発明の評価方法において、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標として評価してもよいし、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の活性（安定性含む）を指標として評価しても良い。また、評価系はｉｎ ｖｉｖｏ系であってもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系であってもよい。以下、本発明の評価方法の具体的な実施方法について説明する。
２．１ 本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした評価方法
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標としたｉｎ ｖｉｖｏにおける評価方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：動物の飼育
本発明の評価方法で用いられる「動物」は特に限定されないが、ＲＡ病態を呈するモデル動物が好ましい。そのような動物は市販のものであっても、公知の方法にしたがって作製されたものでもよい。そのようなＲＡ病態を呈するモデルとしては、例えば、自然発症関節炎モデルである、ＭＲＬマウス関節炎、ＮＺＢ／ＫＮマウス関節炎、ＳＫＧマウス関節炎；誘導性関節炎モデルである、ラットアジュバント関節炎、ラット・マウスコラーゲン関節炎（ＣＩＡラット・マウス）、プリスタン関節炎、ＳＣＩＤ細胞移入関節炎、ＳＣＩＤマウス組織移植関節炎；および、ＨＴＬＶ−１トランスジェニックマウス、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストＫＯマウス等を挙げることができる（関節炎モデル 日本医学館、監修・京極方久、編集・安倍千之、澤井高志 参照）。なかでも一般的なのは、ＲＬマウス関節炎、ラットアジュバント関節炎、ラット・マウスコラーゲン関節炎、およびプリスタン関節炎である。
前記動物は、被験物質の投与または非投与条件下で適当な期間飼育を行う。動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重に合わせて、適宜用量を設定すればよい。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて、適宜その投与経路と投与期間を設定すればよい。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下で飼育された動物から血液または細胞を単離し、該血液または細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。
検出対象とする細胞としては、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子が高発現している細胞が好ましく、したがって、好中球や好酸球等の血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出方法としては、例えば、単離された血液または細胞からまず全ＲＮＡを抽出し、該全ＲＮＡ中におけるｍＲＮＡの発現量を検出する方法を挙げることができる。
（１）全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡの抽出は、公知の方法にしたがい、単離された血液または細胞よりＲＮＡ抽出用溶媒を用いて抽出する。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの（例えば、ＴＲＩｚｏｌ試薬：ギブコ・ビーアールエル社製等）が好ましい。ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず、抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。この方法のほか、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
（２）本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下における、全ＲＮＡ中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出する。遺伝子の発現量は、得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識化合物でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。以下、遺伝子の発現量の検出方法について、ｉ）固相化試料を用いた解析方法、ｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｉｉ）その他の解析方法に分けて、具体的に説明する。
ｉ）固相化試料を用いた解析方法
公知の遺伝子を固定した固相化試料に、投与または非投与条件下における標識したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ（以下、「標識プローブ」と記載する。）を、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。前記標識プローブは、本発明のＰＡＤＩ４のｍＲＮＡクローンでも、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものでもよい。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることがより好ましい。以下、各種固相化試料を用いた解析方法について説明する。
ａ）遺伝子チップ：
本発明で用いられる遺伝子チップは、検出対象である遺伝子が固相化されているものであれば、市販のものであっても、公知の方法（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）に基づき作製されたものであってもよい。遺伝子チップによる検出は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールにしたがい、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールにしたがいハイブリダイゼーションを行い、アビジンによる発光を検出、解析すれば遺伝子の発現量を求めることができる。
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、検出対象である遺伝子が固相化されているものであれば、市販のもの（例えば、インテリジーン（宝酒造社製）、フィルター製マイクロアレイ アトラスシステム（クローンテック社製等））であっても、公知の方法に基づいて作製されたものであってもよい。固相化される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を用いる。
アレイを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。被験物質の投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡと被験物質の非投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡはそれぞれ異なる色素で標識し、両者を混合してハイブリダイズさせ、蛍光シグナル検出器を用いて検出する。得られる蛍光シグナルは投与および非投与条件下における遺伝子発現量の相対比を示す（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔ．２１，ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
メンブレンフィルターを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。市販のフィルター製マイクロアレイである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
ｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）
ＲＴ−ＰＣＲ法やその１つであるリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法は微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の評価方法に好適である。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ）法では、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
ｉｉｉ）その他の解析方法
上記以外に、遺伝子発現量を解析する方法としては、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０９３７、Ｗａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｄ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，Ｐ．，Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，Ｋ．，Ｓａｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２，６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｓｔ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｃｅｌｌ（１９７９）１６，４４３−４５２）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）等を挙げることができる。
ａ）サブトラクションクローニング法：
特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社（１９９３）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｎａ，Ｙ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｍ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，Ｙ．（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５５，４−１０）等が挙げられる。
具体的には、まず被験物質の投与または非投与条件下の検体それぞれについてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを精製し、投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを生成する。この一本鎖ｃＤＮＡと、非投与条件下の検体から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性より安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。すなわち、非投与条件下でも発現しているｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、投与条件下でのみ特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
Ｌｉａｎｇらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７，９６７−９７１）に準じ、例えば、以下のように実施できる。まず比較する２つの試料（本発明の場合は被験物質の投与または非投与条件下の検体）からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）およびアービトラリープライマー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒ）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）ｎＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかの検体で特異的に発現している遺伝子（本発明のＰＡＤＩ４遺伝子）を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
目的の組織から精製した全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まず非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、該非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に、被験物質投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型に３２Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、非投与条件下の検体から作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、投与または非投与条件下のｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選ぶことにより、被験物質の投与条件下で特異的に発現する遺伝子をクローニングすることができる。
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
被験物質の投与または非投与条件下の検体のいずれかに由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンをプローブとして、それぞれの検体に由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、投与または非投与条件下の検体の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行い、選択した遺伝子の全ＲＮＡが、投与条件下で特異的に発現していることを確認できる。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の投与または非投与における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．２ 本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした評価方法
本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標としたｉｎ ｖｉｖｏにおける評価方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被験物質の投与または非投与における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：動物の飼育
動物は、前項２．１に記載した方法にしたがい、被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出
次に、上記動物の血液または細胞中における本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
抗体を利用した蛋白質の検出方法は特に限定されないが、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一の方法であることが好ましい。以下、これらの検出方法について、試料の調製から検出までを具体的に説明する。
（１）試料の調製
検体としては、血液または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質が高発現している細胞が好ましく、したがって好中球や好酸球等の血液由来細胞、滑膜細胞、脾臓細胞、および腹腔浸潤細胞が好ましい。これらの血液または細胞（細胞抽出液として使用する）は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
（２）試料の固相化
上記方法では、まず、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質が含まれる試料中のポリペプチドをメンブレンあるいは９６穴プレートのウェル内底面等に固相化する。
メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）と、直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる方法（ドットブロット法やスロットブロット法）を挙げることができる。用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等を挙げることができる。また、ブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記 ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｕｍｅ ２ 参照）等を挙げることができる。
一方、９６穴プレートに固相化する方法としては、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）等を挙げることができる。固相化は、例えば、前記９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％ アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と記載する。）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置して、ウエル底面にポリペプチドを吸着させればよい。
（３）本発明のＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合する抗体
本工程で用いられる「本発明のＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合する抗体（以下、「抗ＰＡＤＩ４抗体」と記載する。）」は、公知の方法にしたがって調製してもよいし、市販のものを用いてもよい。
前記抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となる本発明のＰＡＤＩ４蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐ．３６５−３６７，１９８０，Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）にしたがって、抗ＰＡＤＩ４抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
抗体作製用の抗原としては、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体（例えば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。
前記抗原ポリペプチドは、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３，１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）やＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４−８６４）等が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．ｉ：３９１−３９６）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパクのプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，ｉ．Ｍ．ａｎｄ Ｖ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２０，１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７９，１６７−１７４）。
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｂ．Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，１−５）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，Ｌ．Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，１２５−１３１）。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法にしたがい培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」と記載する）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とする本発明のＰＡＤＩ４タンパクは、以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
（４）検出
上記（３）記載の方法で得られる抗ＰＡＤＩ４抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は１２５Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
（５）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％ スキムミルク、０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
次に、メンブレンを０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」と記載する）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に抗ＰＡＤＩ４抗体を一定時間浸して、メンブレン上の抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、前記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
ｂ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
次に、ウェル内を０．０５〜０．１％ ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」と記載する）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、洗浄液で適宜希釈した抗ＰＡＤＩ４抗体を分注して一定時間インキュベーションし、抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を標識しておく。標識しなかった方の抗体は、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の投与または非投与条件下における、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも上記蛋白質の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．３ ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を指標とした評価方法
ＰＡＤＩ４活性を指標としたｉｎ ｖｉｔｒｏにおける被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、ＰＡＤＩ４蛋白質を加える。
工程２：上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。
工程３：被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
工程１：反応液の調製
本方法で用いられる反応液は適当な緩衝液中にＰＡＤＩ４蛋白質の酵素基質となりうるアルギニン含有化合物を含むものである。アルギニン含有化合物とは、例えば、ＢＡＥＥ（Ｎ−α−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、Ｎ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｄａｎｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ等のアルギニンを含む化合物であれば特に限定されない。また、反応液中に添加する被験物質の量や添加方法も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて適宜設定すればよい。ＰＡＤＩ４と基質は２５〜５０℃付近で、１〜２時間程度反応させることが好ましい。
工程２：
次に、上記基質中のアルギニン残基がＰＡＤＩ４によってシトルリンに変換されて生じる反応生成物の量を定量することにより、ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する。ここで「反応生成物」は、酵素反応によって基質から直接生じる反応生成物のほか、副次的に生じる反応生成物であってもよい。以下に、本方法で用いられる好適な測定方法として、蛍光法および吸光法の２つの方法について説明するが、これらに限定されず、他の公知の方法：例えば、蛍光標識されたＤａｎｓｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを用いてその酵素反応生成物をＨＰＬＣを用いて定量的に調べる方法（Ｔ．Ｃｈｉｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５，ｐ２３０−２３４，（２０００））等を任意に用いることができる。
（１）蛍光法
反応液として、例えば、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液に、基質として１０ｍＭ ＢＡＥＥまたはＮ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−１−ａｒｇｉｎｉｎｅを加えた溶液を調製する。この反応液に、適当量のＰＡＤＩ４蛋白質を加え、例えば、３７℃で１〜２時間程度反応させる。反応後、適当量のＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて励起波長４１３ｎｍ、蛍光波長４７６ｎｍの各波長を測定する。測定結果は、ＰＡＤＩ４蛋白質を含まない反応液での測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用硫酸アンモニウムを添加した反応液での測定値から検量線を描くことにより、生成したアンモニウムイオンの濃度を求める。このアンモニウムイオンイオン濃度を指標としてＰＡＤＩ４蛋白質の活性を評価する。
（２）吸光法
反応液として、例えば、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液に、基質として１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）を加えた溶液を調製する。この反応液に、適当量のＰＡＤＩ４蛋白質を加え、例えば、３７℃で１〜２時間程度反応させる。反応後、８０ｍＭ Ｄｉａｃｅｔｙｌ ｍｏｎｏｘｉｍｅ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ ２−ｂｕｔａｎｅ）、２ｍＭ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅを含むＡ液と、３Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６Ｍ Ｈ２ＳＯ４、２ｍＭ ＮＨ４Ｆｅ（ＳＯ４）２を含むＢ液を１：３の比率で混合した溶液を適当量添加し、サーマルサイクラー（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等）を使用して、例えば、９５℃１５分次いで室温で１０分、反応させる。反応後、吸光度計（例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）等）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定する。測定結果は、酵素を含まない反応液での測定値をバックグラウンドとして差し引き、さらに検量線作成用シトルリンを添加した反応液での測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したシトルリンの濃度を求める。このシトルリン濃度を指標としてＰＡＤＩ４蛋白質の活性を評価する。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の添加または非添加条件下における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の活性の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の添加条件下で非添加条件下よりも前記遺伝子または蛋白質の活性が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の添加または非添加条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．４ 培養細胞を用いた評価方法
培養細胞を用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する方法は、例えば下記の工程を含む。
評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
工程１：細胞を被検物質の添加または非添加条件下で培養する。
工程２：上記細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を検出するか、または、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被検物質の添加または非添加条件下における、上記発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
工程１：細胞の培養
本発明の評価方法で用いられる細胞は、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を高発現する哺乳動物細胞であれば特に限定されない。好ましくは哺乳動物由来の培養細胞であって、特に血液、滑膜組織、脾臓組織に由来する培養細胞（好ましくは、初代培養細胞）が好ましい。前記哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。また、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入し、該遺伝子を高発現するように組換えた細胞など、人為的に形質転換された細胞を使用してもよい。
細胞は、被検物質の添加または非添加条件下で培養する。培養方法は特に限定されず、当該細胞に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養細胞への被検物質の添加方法や添加量も特に限定されず、上記細胞の培養前あるいは培養期間中の適当な時点で、被検物質を培養培地に添加し一定期間培養する。被験物質添加後の培養期間も特に限定されないが、好ましくは３０分〜２４時間である。
工程２：本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出
次に、被検物質の添加または非添加条件下における、上記細胞中の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量の相違を検出するか、または、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する。
遺伝子の検出は、基本的に２．１に記載した方法にしたがって行えばよい。また、抗体を用いた検出は、２．２に記載した方法にしたがって行えばよい。
上記方法のほか、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」と記載する。）を利用して、間接的に本発明のＰＡＤＩ４遺伝子や本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
（１）レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなる蛋白質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似の蛋白質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされる蛋白質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下の蛋白質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
ｅ）緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
（２）レポーター遺伝子の導入
公知の方法に従い、レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明の本発明のＰＡＤＩ４遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを作製し、これらを細胞に同時トランスフェクションする。ベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等を好適に用いることができるが、これらに限定されない。
細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７，Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３）等を挙げることができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
（３）評価
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現量が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の転写産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
（４）その他（形質転換細胞株の樹立）
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、および本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。形質転換細胞の作出においては、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれ、継代を重ねても宿主細胞に安定的に保持されることが望ましい。そのように形質転換された細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、もしくは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
こうして得られた細胞株を、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、本発明のＰＡＤＩ４の発現量が評価できる。
工程３：被験物質の評価
最後に、被験物質の添加または非添加条件下における、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の相違に基づいて、該被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価する。
すなわち、被験物質の添加条件下で非添加条件下よりも前記遺伝子または蛋白質の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はＲＡ治療薬としての効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の添加または非添加条件下での本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または本発明のＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
２．５ 被験物質のＲＡ治療薬としての効果を評価するためのキット
本発明の評価方法を実施するためのキットとして、例えば、以下のａ）〜ｆ）の少なくとも一つ以上を含むキットを挙げることができる。
ａ）ヒトＰＡＤＩ４遺伝子（配列番号１６）またはマウスＰＡＤＩ４遺伝子（配列番号１７）を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）ヒトＰＡＤＩ４遺伝子またはマウスＰＡＤＩ４遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）ヒトＰＡＤＩ４蛋白質（配列番号１７）またはマウスＰＡＤＩ４蛋白質（配列番号１８）に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
ｆ）ヒトＰＡＤＩ４蛋白質
前記ａ）記載のプライマーは、上記遺伝子の塩基配列（配列番号１６または１７）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーの例としては、例えば、配列番号７〜１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
前記ｂ）記載のプローブは、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐシステムであれば２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明のＰＡＤＩ４遺伝子の配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。このようなプローブの例としては、例えば配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。これらのプローブや前述のプライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体やｆ）の蛋白質は、２．２に記載した方法により作製することができる。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
前記キットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、あるいはラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素基質等、本発明の評価方法の実施に必要な、その他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
３． 変異型ＰＡＤＩ４を利用した慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法
本発明は、検体中の配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質、またはその遺伝子（配列番号２０）の発現量に基づいて、該検体を提供した被験者の慢性関節リウマチ（以下、「ＲＡ」と記載する。）の発症危険度を予測する方法を提供する。
前記方法において用いられる「検体」とは、被験者から単離された、血液、体液、組織または排泄物等のすべての試料を意味するが、血液（血液由来細胞）、滑膜組織（滑膜細胞）、脾臓組織（脾臓細胞）、腹腔浸潤細胞を含むものが好ましく、特に血球（好中球、好酸球）、滑膜組織（滑膜細胞）がより好ましい。また、発症危険度の予測は、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標として行ってもよいし、変異型ＰＡＤＩ４遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を指標として行ってもよい。
３．１ 変異型ＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした方法
ＰＡＤＩ４遺伝子の発現量を指標とした予測方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：被験者および正常人から単離された各検体より全ＲＮＡを調製する；
工程２：上記全ＲＮＡ中における変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する；
工程３：被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。
前記方法において、全ＲＮＡの抽出および変異型ＰＡＤＩ４遺伝子のｍＲＮＡの発現量の検出と解析は、２．１の記載にしたがって実施することができる。その結果、被験者において変異型ＰＡＤＩ４のｍＲＮＡの発現量が正常人に比較して有意に高い場合、該被験者はＲＡを発症する危険度が高いと評価できる。ここで、「有意に高い」とは、例えば、被験者と正常人の間で変異型ＰＡＤＩ４のｍＲＮＡの発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。なお、前述したように、評価は変異型ＰＡＤＩ４遺伝子と検体内の適当なコントロール遺伝子（例えば、βアクチン遺伝子やリボゾーマルＲＮＡ等）との発現量比として、上記解析に供してもよい。
３．２ 変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした評価方法
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を指標とした方法は、例えば下記の工程を含む。
工程１：被験者および正常人から単離された検体中における、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合しうる抗体を用いて検出する；
工程２：被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、該被験者のＲＡの発症危険度を予測する。
前記方法において、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量の検出と解析は、２．２の記載にしたがって実施することができる。その結果、被験者において変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量が正常人に比較して有意に高い場合、該被験者はＲＡを発症する危険度が高いと評価できる。ここで、「有意に高い」とは、例えば、被験者と正常人の間で変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
３．３ 慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキット
本発明はまた、慢性関節リウマチの発症危険度を予測するためのキットを提供する。該キットは、例えば、以下のａ）〜ｅ）の少なくとも一つ以上を含む。
ａ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
前記ａ）記載のプライマーは、上記遺伝子の塩基配列（配列番号２０または２１）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。また、前記ｂ）記載のプローブは、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐシステムであれば２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に変異型ＰＡＤＩ４遺伝子の配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。このようなプローブの例としては、例えば配列番号４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。これらのプローブや前述のプライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、２．２に記載した方法により作製することができる。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
前記キットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、あるいはラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液等、本発明の方法の実施に必要な、その他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
３．４ ＲＡ診断用マーカー
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子は、本発明者らによって新規に見出されたものであり、これら変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子と正常型ＰＡＤＩ４蛋白質や該遺伝子との機能的な違いは、ＲＡ発症と深い関連を有する。すなわち、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質や、配列番号２０に示される塩基配列からなる変異型ＰＡＤＩ４遺伝子は、ＲＡの診断用マーカーとして（例えば、抗変異型ＰＡＤＩ４抗体作製のための抗原として）有用である。本発明はそのような変異型ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ診断用マーカーも提供する。
４． 変異型ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ治療薬のスクリーニング方法
変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は正常型ＰＡＤＩ４蛋白質に比較して酵素活性が高く、シトルリン化ペプチド生成の亢進を介して、ＲＡ発症の一つの原因となりうる。したがって、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する特異的な阻害効果を指標とすることにより、ＲＡ治療薬のスクリーニングも可能となる。
すなわち、本発明は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＰＡＤＩ４蛋白質に対する阻害効果を指標として、被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する方法を提供する。
例えば、前記方法は下記の工程を含む。
工程１：アルギニン含有化合物を含む反応液に、被験物質の添加または非添加条件下で、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を加える；
工程２：上記反応液中における反応生成物の量を定量することにより、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質の活性を測定する；
工程３：被験物質の添加または非添加条件下における、上記活性の相違に基づいて、該被験物質の慢性関節リウマチ治療薬としての効果を評価する。
前記方法において、変異型ＰＡＤＩ４蛋白質は、２．２の記載にしたがって調製することができ、工程１〜３は２．３の記載にしたがって実施することができる。
５． その他
５．１ ＰＡＤＩ４を利用したＲＡ病態の予測方法
ヒトＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質は、ＲＡ患者の病変組織（例えば、滑膜組織）で特異的に高発現し、シトルリン化タンパク質の生成を通じてＲＡの原因となりうる。したがって、前述した変異型ＰＡＤＩ４のみならず、被験者から単離された検体中の、ＰＡＤＩ４遺伝子やＰＡＤＩ４蛋白質の発現量を測定すれば、該被験者のＲＡ病態を予測することもできると考えられる。
５．２ ＲＡモデル動物
本発明のＰＡＤＩ４遺伝子や変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を人為的に高発現させることにより、ＲＡ病態を呈する動物（例えば、マウス等）を作製することも可能である。例えば、本発明のＰＡＤＩ４遺伝子または変異型ＰＡＤＩ４遺伝子を適当なベクターに組み込んで、動物に導入し、ヒトＲＡに代表される炎症症状等の表現的変化が現れれば、該動物を利用してＲＡの病態やその治療薬の研究を行うことができる。同様に、本発明のＰＡＤＩ４蛋白質または変異型ＰＡＤＩ４蛋白質を直接動物に導入することによって、ＲＡ病態を呈するモデル動物を作製することも可能と考えられる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 ＰＡＤＩ４第３イントロン中の一塩基多型とＲＡ罹患とのアソシエーション解析
１． 解析対象患者の選択
日本各地の臨床施設より８４６人のＲＡ患者と６５８人の非患者とからゲノムＤＮＡ抽出用の血液を採取した。すべての検体提供者は日本人である。提供者からは、理化学研究遺伝子多型研究センター倫理委員会によるインフォームドコンセントに対する同意を得た。ＲＡ患者については、Ｔｈｅ ｒｅｖｉｓｅｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓの以下の７つの基準のうち少なくとも３項目に該当する者をＲＡ患者群として選択した。
（１）朝のこわばり
（２）３領域以上の関節炎
（３）手関節炎
（４）対称性関節炎
（５）リウマトイド結節
（６）リウマトイド因子
（７）Ｘ線所見
非患者群については、日本人一般集団から患者とは独立に選抜した。ＲＡの診断の有無以外ではＲＡ患者群、非患者群の間に差がないようにサンプリングした。
２． ゲノムＤＮＡの調製
ＲＡ患者および非患者の末梢血から分離した白血球を出発材料とし、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出にあたっては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ入り採血菅（ベノジェクト）に採血し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。得られた各試料の２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、調製したＤＮＡは、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、使用するまで、−８０℃で保存した。
３． 第３イントロン中の一塩基多型の検出
以下に示す３種のプローブを用いて、ＰＡＤＩ４の第３イントロンの２１３６（−１５）番目の位置（配列番号１の６１７７番目）における塩基がシトシンであるかチミンであるかの検出を行った。
インベーダープローブ：
４． 統計解析
ケース群（ＲＡ患者群）８４６人とコントロール群（非患者群）６５８人を対象とし、第３イントロン２１３６番目の塩基の１塩基多型についてケース・コントロール関連検定を行った。検定は２群間のアレル頻度分布比較・優性遺伝形式モデルによるジェノタイプ分布比較・劣性遺伝形式モデルによるジェノタイプ頻度比較にて行った。検定方法は２Ｘ２分割表χ２検定を用いた。解析結果を表１に示す。
〔実施例２〕 ＰＡＤＩ４遺伝子中の新規エクソン−塩基多型の検出
１．検出方法
ＧｅｎＢａｎｋのアクセション番号：ＮＴ＿０３０５８４．２に示されるゲノム配列の第４１５，０８５塩基から第４７０，６００塩基に存在する、ＰＡＤＩ４遺伝子上の新規遺伝子多型の検出を以下の方法により試みた。
まず、該遺伝子の全エクソン、およびエクソン近傍イントロン、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域を約５００塩基対ごとに分割して増幅領域と設定し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ用のプライマーはＰｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌ）ソフトウェアを用いてデザインした。ＰＣＲ条件はＤＭＳＯの濃度と、アニール温度を変えることで最適化した。
ＰＣＲは９６ウェルＰＣＲプレートで行い、各ウェルに４ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡを２μｌずつ使用した。反応は２６．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，７．２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），３．２ｍＭ Ｍｇ２＋，１．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．６ｍＭ ｂ−Ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ，１０％ ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯを用いない場合には、Ｈ２Ｏにて代用），１μＭ ｐｒｉｍｅｒｓ，２．０Ｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）），０．０４μＭ Ｔａｑ Ｓｔａｒｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の溶液条件で行った。反応時間および反応温度の条件として、９４℃にて２分間変性させた後、９４℃１５秒、反応ごとに最適化したアニール温度で４５秒，７２℃にて１あるいは３分の伸張反応を３７サイクル、ＡＢＩ９７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。増幅されたＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＲＲ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使って反応を行い、ＡＢＩ ３７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて塩基配列を決定した。
２．結果
各々の領域につき４８人分の塩基配列を比較し、多型性の認められた塩基を１塩基多型とみなした。この結果、アミノ酸の置換を伴う以下の３種の新規エクソン一塩基多型とアミノ酸の置換を伴わない１種の新規エクソン多型が見出された。
１）第５５番アミノ酸の置換（Ｓｅｒ／Ｇｌｙ）を伴う多型：
第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基がアデニンまたはグアニンである一塩基多型
２）第８２番アミノ酸の置換（Ａｌａ／Ｖａｌ）を伴う多型：
第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型
３）第１１２番アミノ酸の置換（Ａｌａ／Ｇｌｙ）を伴う多型：
第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基がシトシンまたはグアニンである一塩基多型
４）第１１７番アミノ酸（Ｌｅｕ）における、アミノ酸の置換を伴わない多型：
第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型
〔実施例３〕 ＰＡＤＩ４遺伝子上の各一塩基多型の連鎖解析
１．解析方法
ＲＡと強い関連が認められたＰＡＤＩ４第３イントロン２１３６番目（−１５番目）のヌクレオチドの一塩基多型（以下、「ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃ」と示す。）とＰＡＤＩ４上の４つの新規一塩基多型とのＰａｉｒｗｉｓｅ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｉｎｄｅｘ（Ｄ’）をＥＭアルゴリズムを用いて算出した。
２．結果
その結果、４つの一塩基多型は相互にほぼ完全連鎖（９８．９〜１００％）の関係にあり、かつＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃともほぼ完全連鎖の関係にあることが、ＥＭアルゴリズムによるハプロタイプ解析によって確認された。一方、ＰＡＤＩ４近傍のＰＡＤＩ２、ＰＡＤＩ１遺伝子内の公知の一塩基多型とＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃについては、ほとんど連鎖平衡に達していた。
つまり、日本人集団では、ＲＡ患者群と非患者群の両群において、５５（Ｓｅｒ）−８２（Ａｌａ）−１１２（Ａｌａ）タイプと５５（Ｇｌｙ）−８２（Ｖａｌ）−１１２（Ｇｌｙ）タイプの２ペプチドタイプのみが存在し、このうち後者のタイプとＲＡとの間に、ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃと同様のアソシエーションがあることが確認された。以下、前者を「ＰＡＤＩ４ Ｖ１８」（あるいは単に「Ｖ１８」）、後者を「ＰＡＤＩ４ Ｖ９」（あるいは単に「Ｖ９」）と記載する。Ｖ１８のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号１６に、アミノ酸配列は同配列番号１７に記載した。また、Ｖ９のｃＤＮＡ配列は配列表の配列番号２０に、アミノ酸配列は同配列番号２１に記載した。
以上より、ＰＡＤＩ４遺伝子のジェノタイプとＲＡ発症との間には関連があり、その関連はＰＡＤＩ４遺伝子に存在する２つのハプロタイプに由来するものと考えられた。そして、ＲＡの発症に関連するハプロタイプはＶ９であり、ＲＡの発症と関連がないハプロタイプはＶ１８であると考えられた。
〔実施例４〕 ヒトＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡの安定性比較
１．分解度の測定
２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプをコードする遺伝子は以下の方法で調製した。
まず、Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により合成したｃＤＮＡをｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。得られたｃＤＮＡを、さらにＴ７プロモーターを含むｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にリクローニングし、それぞれｐＶ１８−Ｔ７およびｐＶ９−Ｔ７ベクターを作製し、それらについてシークエンシングを行った。次いで、ｐＶ１８−Ｔ７およびｐＶ９−Ｔ７ベクターをＣｌａＩで消化し、ＲｉｂｏＭａｘＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い、Ｖ９、およびＶ１８のｍＲＮＡを作製した。
Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔを調製するために、ＨＬ−６０細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．５％ ＮＰ−４０；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０；２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｖ／ｖ）；４００ｍＭ ＮａＣｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５ｍＭ ＤＴＴ；０．２ｍＭ ＥＤＴＡ；１％ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｃａｌａｉ））に懸濁した。氷上で３０分インキュベーションした後、４℃で遠心し、上清を８０℃で保存した。
Ｖ９、およびＶ１８の各ｍＲＮＡ ５μｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎに１０００倍希釈した前述のＷｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ ３μｌを混ぜ、室温でインキュベートした。０，５，１０分反応後、ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ｄｙｅを加えて反応を止め、６８℃で１０分間加熱し、氷冷した。転写産物はノザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。スキャニングはＤｏｃｕＣｅｎｔｒｅ ｃｏｌｏｒ ５００ｃｐ（Ｆｕｊｉ−Ｘｅｒｏｘ社）を用いて行い、シグナル強度はＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ６．０（Ａｄｏｂｅ社）により測定した。
結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＲＡ病変に関連したＶ９のｍＲＮＡはＲＡ病変に関連しないＶ１８のｍＲＮＡに比べて有意に分解し難い傾向にあることがわかった。（＊Ｔ検定より５分後でｐ＝０．０４８，１０分後でｐ＝０．０１３）。
〔実施例５〕 ヒトＰＡＤＩ４タンパクの調製
１．大腸菌によるＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＡＤＩ４タンパク質の発現
Ｈｉｓ−ｔａｇを付加した２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプ断片：ＲＧＳ６−ＨｉｓＶ１８（配列番号５）、またはＲＧＳ６−ＨｉｓＶ９（配列番号６）がｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩへ挿入された発現プラスミドを作製した。このプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１−ｃｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）とクロラムフェニコール５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＬＢ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に接種し、３７℃で一晩培養した。１０ｍＬの培養液を１Ｌの２％グルコース（和光純薬）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ社）を添加した２倍濃度のＬＢ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加し、６００ｎｍ波長の吸光度が０．９になるまで３７℃で培養した。終濃度０．１ｍＭになるようにイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ：和光純薬）を添加し、２０℃で４時間培養した。培養液を６０００×ｇで１０分遠心して、菌体を回収した。菌体を３０ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、１００ｍＭ塩化ナトリウム（和光純薬）、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ：和光純薬）、規定量の完全蛋白分解酵素阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含む溶解用緩衝液へ懸濁して、４℃で超音波破砕し、９７０００×ｇで３０分遠心して上清を回収した。さらにこの上清をＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ（ミリポア社）フィルターにかけた。
２．Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＰＡＤＩ４タンパク質の精製
前項で調製した上清を予めバッファーＡ｛５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、１ｍＭエチレンヂアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ：同仁化学）｝で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、０．１Ｍの塩酸ナトリウムが入ったバッファーＡで分画した。活性が認められた画分をバッファーＡで予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、０．１Ｍの塩酸ナトリウムが入ったバッファーＡで洗浄した後、バッファーＡへ添加した塩酸ナトリウム濃度を０．１Ｍから０．２Ｍへ徐々に変化させて溶出し、分画した。活性が認められた画分に三倍量のバッファーＢ｛５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、０．１Ｍ塩化ナトリウム（和光純薬）、０．１％トライトンＸ−１００｝を加え、Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（ＱＩＡＧＥＮ社）に供した。カラムを２０ｍＭのイミダゾールが入ったバッファーＢで洗浄し、２００ｍＭのイミダゾールが入ったバッファーＢで溶出した。活性が認められた画分をバッファーＣ｛１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）（和光純薬）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（和光純薬）、２ｍＭ ＤＴＴ（和光純薬）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（同仁化学）｝で透析し、濃縮後、終濃度１０％になるようにグリセロール（Ｓｉｇｍａ社）を添加して、−８０℃に保存した。
〔実施例６〕 ヒトＰＡＤＩ４タンパクの活性測定
１．ＰＡＤＩ４活性の測定方法（蛍光法）
酵素反応用の緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）またはＮ−α−Ｂｅｎｚｏｙｌ−１−ａｒｇｉｎｉｎｅ（東京化成）を含む溶液を調製した。この緩衝液４０μｌと、実施例５で調整したＶ１８酵素原液（１１３μｇ／ｍｌ）の希釈列１０μｌをＰＣＲ反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）内にて混合し、３７℃で２時間反応させた。反応後、１０μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止した。このうち５０μｌ分をｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（日本ジェネティクス社）に移した。なお同時に、検量線作成のため、０−５０ｎＭの硫酸アンモニウム溶液も別のウェルへ添加した。さらにこれらのウェルへ、５０ｍＭホウ酸を１ｍｌ、および５０ｍＭ ｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅと５０ｍＭ ＤＴＴの等量混合溶液を５０μｌずつ添加し、室温で２時間反応させた。反応溶液は２００μｌ分を白色プレート（コースター・コーニング社）に移し、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて励起波長４１３ｎｍ、蛍光波長４７６ｎｍの各波長を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用硫酸アンモニウムを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したアンモニウムイオンの濃度を求めた（図２Ａ）。
２．ＰＡＤＩ４活性の測定方法（吸光法）
酵素反応用の緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＢＡＥＥ（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液を調製した。この緩衝液４０μｌと、１１３μｇ／ｍｌの実施例５で調整したＶ１８酵素原液（１１３μｇ／ｍｌ）の希釈列１０μｌをＰＣＲ反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）内にて混合し、５０℃もしくは３７℃で２時間反応させた。反応後、Ａ液（８０ｍＭ Ｄｉａｃｅｔｙｌ ｍｏｎｏｘｉｍｅ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ ２−ｂｕｔａｎｅ）、２ｍＭ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を含む）とＢ液（３Ｍ Ｈ３ＰＯ４、６Ｍ Ｈ２ＳＯ４、２ｍＭ ＮＨ４Ｆｅ（ＳＯ４）２を含む）を１：３の比率で混合した溶液を１５０μｌずつ添加した。なお同時に、検量線作成のため、０−４００μＭのＬ−シトルリン溶液も別のウェルへ添加し、同様にＡ液とＢ液の混合溶液を添加した。混合溶液は、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して９５℃１５分の後室温で１０分反応させた。反応後の溶液は１５０μｌ分を９６ウェルプレート（コーニング社）に移し、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて５４０ｎｍの吸光度を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用シトルリンを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したシトルリンの濃度を求めた（図２Ｂ）。
３．ヒトＰＡＤＩ４ハプロタイプＶ９およびＶ１８の酵素活性
吸光度法を用いてヒトＰＡＤＩ４ハプロタイプＶ９およびＶ１８の酵素活性を測定し、比較した（図３）。図３から明らかなように、Ｖ９はＶ１８に比べて有意に酵素活性が高いことが確認された（Ｐ＜０．０１）。以上より、ＲＡ病変に関連したＰＡＤＩ４タイプ（Ｖ９）は正常ＰＡＤＩ４タイプ（Ｖ１８）よりもその酵素活性が高く、こうした酵素活性の違いがＲＡ発症と何らかの関連を有することが推測された。
〔実施例７〕 ＲＡ患者のＰＡＤＩ４ジェノタイプと抗シトルリン化フィラグリン抗体価との関連
１．抗シトルリン化ペプチド抗体価の測定方法
ＲＡ患者血清の抗シトルリン化ペプチド抗体価をＭＥＳＡＣＵＰ ＡＣＦテストは、医学生物学研究所（名古屋）委託して作製したキットを用いて行った。ＭＥＳＡＣＵＰ ＡＣＦテストとは、リコンビナント ヒトフィラグリンペプチドをＰＡＤによりシトルリン化した、シトルリン化フィラグリンを抗原として、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する方法である。
まず、患者末梢血より血清を調製し、１０μｌを反応用緩衝液１ｍＬに加えて１０１倍希釈した。抗フィラグリン抗体標準血清２、標準血清１および希釈した検体を１５０μＬずつ一次反応準備用マイクロプレートに実際と同じように添加した。その後、抗原感作マイクロカップにマルチピペットを用い１００μＬずつ移した。室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させた後、洗浄液で４回洗浄し、酵素標識抗体をマルチピペットで１００μＬずつ添加した。その後、室温（２０〜２５℃）で１時間静置反応させ、反応停止液をマルチピペットで１００μＬずつ添加した。
各反応後のサンプルを分光吸光度計を用いてＯＤ４５０を測定し、Ｉｎｄｅｘ値を下式を用いて算出した。
ＰＡＤＩ４ ｉｎｔｒｏｎ ３−１５ Ｔ／Ｃジェノタイプの決められた、ＲＡ患者５７人につき、血清中の抗合成シトルリン化フィラグリン抗体価を測定した。
カットオフ値１０にて、分割表検定を行ったところ、下表２のようになった。
〔実施例８〕 ＲＡ患者滑膜組織におけるＰＡＤＩ４発現量の検討
１．Ｉｎ ｓｉｔｕ−ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＡ患者の滑膜組織から調整した組織片にＰｒｏ ＳＴＡＲ ＨＦ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社）を添加し、以下の条件でＯｎｅ ｓｔｅｐ Ｉｎ ｓｉｔｕ−ＲＴ−ＰＣＲをＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ（Ｈｙｂａｉｄ Ｌｔｄ．，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）上にて実施した。
（１）４２℃ ３０分
（２）９４℃ ２分，５５℃ ４５秒，６８℃ ２分
（３）９４℃ ４５秒，５５℃ ４５秒，６８℃ ２分、２５サイクル
ＰＣＲ反応後のスライドグラスはＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄した。
ｈＰＡＤＩ４ Ｖ１８のｃＤＮＡ（配列番号１６）を鋳型に、以下のＰＡＤＩ４増幅用プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた３３５塩基長の増幅産物をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識して、ＰＡＤＩ４検出用プローブとした。
逆転写後のサンプルに、前述のプライマーを最終濃度０．３４μＭとなるように加え、スライドグラスを被せて３７℃１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、９４℃で５分間変性させたＤＩＧ標識プローブを加え、３７℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。反応後のスライドを洗浄し、ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてＰＡＤＩ４遺伝子の検出を行った。陰性対照として、プライマー非添加、反応酵素非添加の条件で同様に検出を行った。
２．結果
結果を図４に示した。ＰＡＤＩ４の転写産物はＲＡ患者滑膜組織の表層（ｌｉｎｉｎｇ）と滑膜表層下（ｓｕｂ−ｌｉｎｉｎｇ ｌａｙｅｒ）付近に局在していた。また、シグナルは繊維芽細胞様細胞や血管周囲の球状核細胞（ｒｏｕｎｄ−ｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）中で観察された。
〔実施例９〕 マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるＰＡＤＩ４遺伝子発現量の検討
マウスにコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を誘導し、その滑膜組織および脾臓組織における、マウス ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ｍＰＡＤＩ４）遺伝子の発現量について検討した。なお、ｍＰＡＤＩ４は、ヒトペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（ｈＰＡＤＩ４）のマウスオーソログである。ｍＰＡＤＩ４のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列表の配列番号１８および配列番号１９に記載した。
１． マウスＣＩＡモデルの作製
ＤＢＡ／１Ｊマウス（５週齢の雌、日本チャールスリバー（株）より購入）は、ＣＩＡ群（Ｎ＝１１）と健常群（Ｎ＝１１）に分けた。ＣＩＡ群は訓化後、タイプＩＩコラーゲン２ｍｇ／ｍｌ（コラーゲン技術研修会）およびＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ（ＤＩＦＣＯ）を等量の割合で混ぜ、超音波によりエマルジョン化したものを、１匹あたり１００μｌ、一週間の間隔をおいて計２回尾根部に皮内投与した。最終的に、ＣＩＡ群は発症が見られた５匹７肢を、健常群は１１匹２２肢を以下の実験に供した。
２．滑膜組織および脾臓組織における、ｍＰＡＤＩ４遺伝子発現量の測定
マウスは２回目の投与後７週目に断頭放血により致死させ、滑膜組織および脾臓組織をハサミおよびピンセットで摘出した。摘出した組織より、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔまたはＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡより、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲＴＭ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（ＴａＫａＲａ）を用いて、添付プロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。
ｍＰＡＤＩ４遺伝子の発現は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより検討した。用いたｍＰＡＤＩ４遺伝子増幅用プライマー、およびｍＰＡＤＩ４遺伝子検出用プローブは以下のとおりである。
結果を図５に示した。ＣＩＡ群滑膜組織では健常群滑膜組織に比べｍＰＡＤＩ４の発現量は１９．５倍に上昇していた。また、ＣＩＡ群脾臓組織では健常群脾臓組織に比べｍＰＡＤＩ４の発現量は３倍に上昇していた。以上よりＣＩＡ群では、滑膜組織および脾臓組織においてｍＰＡＤＩ４遺伝子発現が著しく上昇することが確認された。
〔実施例１０〕 抗ＰＡＤＩ４抗体（抗ＰＡＤＩ４ペプチド抗血清）の調製
ヒトＰＡＤＩ４由来のペプチド配列（ＰＡＫＫＫＳＴＧＳＳＴＷＰ−Ｃｙｓ：配列番号１５）を合成し（オリエンタル酵母北山ラベス，ペプチド合成機：アプライドバイオシステムズジャパン株式会社，Ｐｉｏｎｅｅｒ，合成法：Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた固相合成）、ＫＨＬ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）をＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ）法を用いてコンジュゲーションした。
免疫動物はウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ，オス，週齢：リタイア）を使用し、初回免疫において、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント，ＤＩＦＣＯ）と抗原との等量混合液を背部皮下に注射した。初回免疫はこの抗原を６００μｇペプチド／匹用いて行った。２回目以降はＦＩＡ（フロイントの不完全アジュバント，ＤＩＦＣＯ）と抗原との等量混合液を２週間おきに３回背部皮下に注射した。２次免疫以降はこの抗原を３００μｇペプチド／匹用いて行った。最終免疫から２週間後に全採血し、３０００ｒｐｍにて２０分間、遠心し、血清を分離回収したのち、ＮａＮ３（和光純薬）を０．０５％（ｗ／ｖ）添加し、４℃（冷蔵）にて保存した。
〔実施例１１〕 ＲＡ患者関節滑膜組織片の免疫染色
１．関節滑膜組織切片の調製
人工膝関節置換術に際して得られた切離組織より、関節滑膜組織片を得た。得られた滑膜組織片は即座に液体窒素中に漬け、スライドグラス上薄層切片作製まで−８０℃で保存した。薄層切片化に際し、凍結組織片を１０％中和緩衝ホルマリンにて固定し、７０％エタノール、８５％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール（１００％エタノールの場合に限り２回）にて各１時間脱水処理し、ついで、５０％エタノール５０％パラフィン溶液で３０分間にて１回、１００％パラフィン溶液で３０分間にて２回、処理し、組織片をパラフィン化した。その後、組織片をパラフィン中に包埋した。パラフィン包埋組織片はライカミクロトームＲＭ２１６５で４μｍの厚さにスライスし、スライドグラスに固定した。
２．免疫染色
免疫染色に先立ち、前項で調製したパラフィン包埋切片をキシレンに３分間ずつ２回つけ、脱パラフィン化した後、１００％エタノールに１分間ずつ２回、９５％エタノールに１分間ずつ２回、さらにＰＢＳ（０．１３Ｍ ＮａＣｌ，８．６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）に３分間ずつ２回つけ、再水和した。３０％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で３分間処理し、内在性ビオチンを除去した。ＰＢＳにて５分間ずつ２回、洗浄し、１０００倍希釈したそれぞれの抗体：抗シトルリン化タンパク質抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）と実施例１０で調製した抗ＰＡＤＩ４抗体とを加えて４℃にて１２時間反応させた。反応後、ＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄し、ＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎ ＭＡＸ−ＰＯ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）を１スライドにつき１００μｌずつ加え、２５℃にて３０分間反応させた。その後、ＰＢＳにて５分間ずつ２回洗浄を行った。基質として、ＳｉｍｐｌｅＳｔａｉｎ ＡＥＣ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）を１スライドにつき１００μｌずつ加え、シグナルが検出されるまで５分から２０分反応させた。反応は超純水につけて停止させた。
３．結果
結果を図６および図７に示す。ＲＡ患者の滑膜組織ではＰＡＤＩ４を特異的に認識する抗体による反応（Ａの枠で囲った箇所の赤い部分）が認められたが、関節リウマチの陰性対照である変形性関節症（ＯＡ）患者の滑膜組織にはＰＡＤＩ４を認識する抗体による反応は認められなかった（図６Ｂ）。また、ＲＡ患者の滑膜組織では、ＰＡＤＩ４とほぼ同じような部分にシトルリン化タンパク質が認められた（図７）
〔実施例１２〕 ヒトＰＡＤＩ４ ｍＲＮＡの安定性比較
１．ｍＲＮＡの調製
２つのＰＡＤＩ４ハプロタイプのｍＲＮＡは、以下の方法で調製した。
Ｖ９もしくはＶ１８をコードする遺伝子をＣＭＶプロモーターの下流につないだプラスミドを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、添付のプロトコールに従ってヒトＫ５６２細胞への遺伝子導入を行った。３７℃で４時間培養した後、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。４０時間培養した後、アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加し、０、２、４時間後にそれぞれ細胞を回収した。
次いで、全ＲＮＡ抽出用試薬（ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉおよびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ ｓｅｔ：ＱＩＡＧＥＮ社）を添付のプロトコールに従って用いることにより、全ＲＮＡを抽出した。なお、回収した全ＲＮＡは−８０℃に保存した。残存したヒトＰＡＤＩ４ Ｖ９もしくはＶ１８のｍＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、指定のプロトコールに従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。なお、得られたデータはリボゾーマルＲＮＡ（１８Ｓ）の値を用いて補正した。
２．結果
図８に示すように、ＰＡＤＩ４ Ｖ９のｍＲＮＡは、ＰＡＤＩ４ Ｖ１８に比べて有意に分解し難い傾向にあることが分かった（Ｔ検定より、４時間後でｐ＝０．０３）
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
本発明は、医薬開発において、慢性関節リウマチ治療薬のスクリーニングに利用できる。また、本発明は、医療の分野において、被験者が慢性関節リウマチを発症する潜在的危険度の早期判定に利用できる。
配列番号１−ヒトＰＡＤＩ４遺伝子断片（第１イントロン−１０００〜第４イントロン）
−変異の説明：（Ａ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
配列番号２−人工配列の説明：プローブ
配列番号３−人工配列の説明：プローブ
配列番号４−人工配列の説明：プローブ
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プローブ
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プローブ
配列番号１５−人工配列の説明：ヒトＰＡＤＩ４由来ペプチド
−変異の説明：（Ａ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
配列番号２−人工配列の説明：プローブ
配列番号３−人工配列の説明：プローブ
配列番号４−人工配列の説明：プローブ
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プローブ
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プローブ
配列番号１５−人工配列の説明：ヒトＰＡＤＩ４由来ペプチド
Claims (5)
- 検体中の配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ蛋白質、またはその遺伝子（配列番号２０）の発現量に基づいて、該検体を提供した被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法。
- 以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
１）被験者および正常人から単離された各検体より全ＲＮＡを調製する；
２）上記全ＲＮＡ中における変異型ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子（配列番号２０）のｍＲＮＡの発現量を検出する；
３）被験者と正常人における上記発現量の相違を解析し、被験者の慢性関節リウマチの発症危険度を予測する。 - 遺伝子の発現量が、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- 遺伝子の発現量が、ＲＴ−ＰＣＲ法によって検出されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
- 配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ蛋白質。
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