JP4421889B2 - 慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子多型を利用することにより慢性関節リウマチの発症危険度を判定する方法、およびそのための試薬またはキットに関する。

慢性関節リウマチ（ＲＡ）は関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。ＲＡは、初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。症状の経過は、関節炎の寛解・再燃を繰り返し、完治する例や急速に進行する例など多彩であるが、早期発見と早期治療がＲＡ患者の生活の質を改良する上からも重要である。

ＲＡは病態的には関節に達した未知の抗原に対する特異的な免疫応答に始まり、関節に浸潤した血中リンパ球、マクロファージ、好中球による慢性炎症と滑膜増殖を生じ、その結果、炎症性肉芽組織由来の破骨細胞やプロテアーゼによる骨・軟骨破壊が起きる。ＲＡの病因は不明であるが、遺伝的要因と微生物感染などの環境要因の両者が関与していると考えられている。

ＲＡの診断は主に症状によってなされるが、早期診断にはＲＡ患者の血中に見出される自己抗体の検出が今のところ有用である。そのような自己抗体としては、例えば、リウマトイド因子、抗Sa蛋白抗体、抗perinuclear factor抗体、抗ケラチン抗体、抗フィラグリン抗体、抗シトルリン化ペプチド抗体などが知られている(例えば、非特許文献１参照)。

抗シトルリン化ペプチド抗体はＲＡ患者血清の約７６％から検出されるが、リウマチ様症状を呈するがＲＡとは判定されない患者血清からは約４％しか検出されない、ＲＡに極めて特異性の高い自己抗体である(例えば、非特許文献２および３参照)。また、ＲＡ患者の滑膜にはシトルリン化されたタンパクが検出されることから、シトルリンを含むエピトープのＲＡの病原性への関与が指摘されている（例えば、非特許文献４および５参照）。

ペプチジルシトルリンはタンパク内のアルギニン残基がペプチジルアルギニン・デイミナーゼ（以下、「ＰＡＤＩ」という。）で変換されて生ずるアミノ酸である。げっ歯類においては、現在まで４つのサブタイプのＰＡＤIが知られており、タイプIは表皮や子宮で、タイプIIは筋肉、子宮、唾液腺、膵臓など様々な組織で、タイプIIIは表皮や毛根嚢胞で、タイプIVは様々な組織で発現している（例えば、非特許文献６参照）。ヒトにおいては、げっ歯類のタイプＩ、II、III、ＩＶに最も相同性が高い遺伝子としてそれぞれタイプＩ、II、III、Ｖの遺伝子が遺伝子情報データベースＧｅｎＢａｎｋ上に登録されていたが、タイプIII（例えば、非特許文献７参照）およびタイプＶ（例えば、非特許文献８参照）以外については詳細な報告はなされていない。

ヒトのＰＡＤIのタイプIIIはげっ歯類と同じく毛根嚢胞部分で（例えば、非特許文献９参照）、タイプＶは好中球や好酸球で（例えば、非特許文献１０参照）それぞれ発現していることが報告されているが、ＰＡＤIとＲＡの直接の関連は不明である。

なお、本願基礎出願時においてタイプＶと言われていた遺伝子は、その後マウスタイプＩＶのオーソログであることが確認されたため、本明細書中においては、ヒトＰＡＤIのタイプＶをタイプＩＶと呼ぶこととする。

個人の体質を規定する大きな要因として遺伝子多型がある。最近のファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬物の効果、あるいは副作用との関係が解明され、当該薬物の効果、あるいは副作用を遺伝子診断を用いて投与前に予測することが可能になりつつある。また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつある。

前者の例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型が挙げられる。例えば、多型に関連して活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素として、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。

後者の例としては、多型解析研究により見出された疾患原因遺伝子が挙げられる。例えば、(1)潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、(2)慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、(3)アルツハイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、(4)精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、(5)躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、(6)アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、(7)心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子ＶＩＩ、(8)肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが知られている（例えば、非特許文献１２参照）。

一方、ＴＮＦ−αは、各種炎症性疾患の病態形成に関与する重要な物質と考えられているが、最近、ＴＮＦ−α遺伝子の５’末端側上流域にＴＮＦ−α遺伝子の発現を亢進する多型が見出された（例えば、非特許文献１３参照）。これらの多型は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を亢進させるものであるため、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、糖尿病などのＴＮＦ−αが関与する疾患の診断マーカーになりうるものと考えられている。

Martinus A.M. van Boekel, Erik R. Vossenaar, Frank H.J. van den Hoogen and Walter J. van Venrooij. "Autoantibody System in Rheumatoid Arthritis: Specificity, Sensitivity and Diagnostic Value." Arthritis Research (2002) 4(2), p87-93 Gerard A. Schellekens, Ben A.W. de Jong, Frank H.J. van den Hoogen, Leo B.A. van de Putte, and Walter J. van Venrooij. "Citrulline is an Essential Constituent of Antidenis Deteminants Recognized by Rheumatoid Arthritis-Specific Autoantibodies." The Journal of Clinical Investigation (1998) 101(1), 273-281 ZhiJie Zhou, and Henri-Andre Menard, "Autoantigenic posttranslational modifications of proteins: does it apply to rheumatoid arthritis?" Current Opinion in Rheumatology (2002) 14(3), p250-253 Walter J van Venrooij and Ger J.M. Pruijn, "Citrullination: A Small Change for a Protein with Great Consequences for Rheumatoid Arthritis." Arthritis Research (2000) 2(4), p249-251 Christine Masson-Bessie, Mireille Sebbag, Elisabeth Girbal-Neuhauser, Leonor Nogueira, Christian Vincent, Tatsuo Senshu, and Guy Serre, "The Majour Synovial Targets of the The Rheumatoid Arthritis-Specific Antifilagrrin Autoantibodies Are Deiminated Forms of the α- and β-Chains of Fibrin." Journal of Immunology (2001) 166(6), p4177-4184 Ahmed Abu Rus'd, Yasuko Ikejiri, Hiroyuki Ono, Toshihiro Yonekawa, Masakazu Shiraiwa, Akira Kawada, and Hidenari Takahara, "Molecular Cloning of cDNAs of Mouse Peptidylarginine Deiminase Type I, Type III and Type IV, and the expression Pattern of Type I in Mouse." European Journal of Biochemistry (1999) 259(3), p660-669 Takuya Kanno, Akira Kawada, Jun Yamanouchi, Chikako Yoshida-Noro, Atsushi Yoshiki, Masakazu Shiraiwa, Moriaki Kusakabe, Motomu Manabe, Tadashi Tezuka, and Hidenari Takahara, "Human Peptidylarginine Deiminase Type III: Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the cDNA, Properties of the Recombinant Enzyme, and Immunohistochemical Localization in Human Skin." Journal of Investigative Dermatology (2000) 115(5), p813-823 Katsuihiko Nakashima, Teruki Hagiwara, Akihito Ishigami, Saburo Nagata, Hiroaki Asaga, Masashi Kuramoto, Tatsuo Senshu, and Michiyuki Yamada. "Molecular Characterization of Peptidylarginine Deiminase in HL-60 Cells Induced by Retinoic Acid and 1α,25-Dihydroxyvitamine D3." Journal ob Biological Chemistry (1999) 274(39), p27786-27792 Takuya Kanno, Akira Kawada, Jun Yamanouchi, Chikako Yoshida-Noro, Atsushi Yoshiki, Masakazu Shiraiwa, Moriaki Kusakabe, Motomu Manabe, Tadashi Tezuka, and Hidenari Takahara, "Human Peptidylarginine Deiminase Type III: Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the cDNA, Properties of the Recombinant Enzyme, and Immunohistochemical Localization in Human Skin." Journal of Investigative Dermatology (2000) 115(5), p813-823 Hiroaki Asaga, Katsuhiko Nakashima, Tatsuo Senshu, Akihito Ishigami, and Michiyuki Yamada, "Immunocytochemical Localization of Peptidylarginine Deiminase in Human Eosinophils and Neutrophils." Journal of Leukocyte Biology (2001) 70(1), p46-51 中村祐輔編,「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」, (2000), 中山書店, 東京 L Kruglyak, "Prospect for Whole-Genome Linkage Disequilibrium Mapping of Common Disease Genes." Nature Genetics (1999) 22(2), p139-144 T.Higuchi, N.Seki, S.Kamizono, A.Yamada, Akimura, "Polymorphism of the 5’-Fkanking Region of Human Tumor Necrosis Factor (TNF)-alpha gene in Japanese." Tissue Antigens (1998) 51(6), p605-612

本発明の目的は、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するための新規な検査方法を提供することにある。

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らはペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（PADI4）遺伝子上にＲＡ患者に高い頻度で現れる複数の遺伝子多型が存在することを見出した。そして、該遺伝子多型を検査することにより、ＲＡを発症する潜在的な危険度を高い確率で判定できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の遺伝子多型を検出することにより、該試料を提供した被験者が慢性関節リウマチを発症する危険度を判定する方法を提供する。

前記方法において、検出する遺伝子多型としては、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれかのペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の一塩基多型、またはその二つ以上の組合せからなるハプロタイプを挙げることができる。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基に存在する一塩基多型
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基に存在する一塩基多型
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基に存在する一塩基多型
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基に存在する一塩基多型
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基に存在する一塩基多型

本発明の方法では、例えば、ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の遺伝子多型において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上が検出された場合に、被験者は慢性関節リウマチを発症する危険度が高いと判定する。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基のアデニンからグアニンへの置換
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基のシトシンからグアニンへの置換
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換

本発明の方法において、遺伝子多型の検出は、例えば、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法からなる群より選択される一つまたは二つ以上の方法を用いて行われる。

本発明はまた、前記方法に用いられるプローブを提供する。そのようなプローブは、配列番号１で示されるペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子断片上において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む、１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド、またはその標識物として設計される。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする）

さらに、本発明は前記方法に用いられるプライマーを提供する。そのようなプライマーは、配列番号１で示されるペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子断片上において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む、１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物として設計される。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする）

さらに、本発明は前記ポリヌクレオチドプローブを固定した固相化試料を提供する。
さらにまた、本発明は、前記プローブ、プライマー、および固相化試料から選ばれるの少なくとも一つ以上を含む、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するための試薬またはキットを提供する。

本発明によれば、被験者が慢性関節リウマチを発症する潜在的な危険度を早期に、しかも簡便に判定することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（以下、「PADI4」とも記載する。）遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、該試料を提供した被験者が慢性関節リウマチを発症する危険度を判定する方法である。

本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、および連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１または複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、または当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。

本発明にかかるPADI4のゲノムＤＮＡの塩基配列は、公共データベースであるＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号：XM_017315.3として、またｃＤＮＡの塩基配列はアクセッション番号：NM_012387.1として登録されている。本明細書中においては、便宜上PADI4遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列の一部（第１イントロンの−１０００番目の塩基〜第４イントロンまでの塩基からなる断片）を配列表の配列番号１に示し、該配列に基づいて本発明を説明することとする。なお、前述したように、本願基礎出願時においてペプチジルアルギニン・タイプＶと言われていたヒト遺伝子は、その後マウスタイプＩＶのオーソログであることが確認されたため、本明細書中においては、ヒトＰＡＤIのタイプＶを現行の名称に合わせてタイプＩＶ（PADI4）と呼ぶ。

本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＲＮＡの全てが含まれる。また、配列表の塩基配列はすべてＤＮＡ配列として記載するが、該配列がＲＮＡを示す場合は、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。

１．慢性関節リウマチの発症に関連した遺伝子多型
本発明で検出対象とする遺伝子多型は、本発明者らによってＲＡ患者に高い頻度で現れることが確認された、PADI4遺伝子上の遺伝子多型である。

該遺伝子多型の具体的な例としては、以下のａ）〜ｅ）が挙げられる。このうち、ｂ）〜ｅ）は本発明者らによって新規に見出された多型である。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基がシトシンかチミンである一塩基多型
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基がアデニンかグアニンである一塩基多型
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基がシトシンかチミンである一塩基多型
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基がシトシンかグアニンである一塩基多型
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基がシトシンかチミンである一塩基多型

上記一塩基多型は、いずれもPADI4遺伝子上に存在し、互いにほぼ完全連鎖（98.9〜100％）の関係にあることが本発明者らの研究によって判明した。したがって、ＲＡの発症危険度の判定は、上記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれかの遺伝子多型の検出結果に基づいて行っても良いし、二つ以上の遺伝子多型を組合せたハプロタイプの検出結果に基づいて行ってもよい。

２．ヒトゲノムＤＮＡを含む試料の調製
本発明の方法で用いられる「ヒトゲノムＤＮＡを含む試料」は、被験者から単離されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。

例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989)："Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。

３．遺伝子多型の検出
次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、本発明者らによって解明された、ＲＡと極めて関連の深い遺伝子多型を検出する。以下、代表的な遺伝子多型の検出方法について説明する。

(1)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素の消化により生じるＤＮＡ断片の長さの違いにから、当該遺伝子多型の検出が可能である。この場合、(i)ゲノムＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行なう方法と、(ii)多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析する方法が挙げられる。(i)の方法で用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、かつその多型部位から５’末端側および３’末端側にそれぞれ約０．０５〜２ｋｂにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチンあるいは蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、(ii)の方法に用いられるＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。

(2)ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法である〔Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)〕。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。タイピングの標準とするために、予め多型部位のヌクレオチド配列が確認されているヒトゲノム由来のＤＮＡ試料を、ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして、被検試料と同時に用いることが好ましい。ＰＣＲ増幅用プライマーとしては、５’末端を蛍光色素で標識した、多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。

(3)ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したプローブとのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値に準じた洗浄操作を行い、多型を検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）する方法である〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕。プローブとしては、通常１５〜２５ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチド（シグナルを得るにはラジオアイソトープ、ビオチンまたは蛍光色素による標識が必要）が用いられる。また、ＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。

(4)ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法である〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。

(5)ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動による検出が不可能になる。ＡＲＭＳ法は、その３’末端ヌクレオチドが検出しようとする変異ヌクレオチドに相補的になるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無で遺伝子多型を検出する方法である〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991), Nuc. Acids. Res., 20,4831-4837 (1992)〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、１つは３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、もう１つは、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。

(6)変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、以下「ＤＧＧＥ」という）法
ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲ産物中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)〕。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素およびホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差がさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。

(7)ＲＮａｓｅＡ切断法
ＲＮａｓｅＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。したがって、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、アイソトープ標識したＲＮＡプローブを、変性して１本鎖にしたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理後、電気泳動により分離すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるため、２本のバンドとして検出できる〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。

(8)化学切断法
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「c（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「t（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、上記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。

(9)ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法である〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。

(10)ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３’末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。

(11)インベーダー法
インベーダー法では、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドと１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドが使用される。非蛍光標識オリゴヌクレオチドの一つは、その５’末端側に、検出しようとする多型部位の存在するゲノム配列（以下「鋳型」という）とは無関係な配列（以下「フラップ」という）を有しており、フラップより３’末端側は、鋳型の多型部位から５’末端側の配列に特異的な相補配列となっている（以下「アレルプローブ」という）。すなわちアレルプローブの鋳型に特異的な相補配列部分の５’末端は鋳型の多型部位に相当する。もう一つの非蛍光標識オリゴヌクレオチドは、鋳型の多型部位から３’末端側の配列に特異的な相補配列を有する（以下「インベーダープローブ」という）。インベーダープローブの３’末端も鋳型の多型部位に相当するが、鋳型の多型部位のヌクレオチドとは相補的でなくてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下「ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）プローブ」という）は、３’末端側部分がフラップと相補的な配列であり、５’末端側はパリンドローム配列になっているため自ら二本鎖を形成している。またＦＲＥＴプローブの５’末端近傍は蛍光色素で標識され、５’末端にはその蛍光を打ち消すクエンチャーが結合している。まず鋳型にアレルプローブとインベーダープローブをハイブリダイズさせると、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的である場合は、その多型部位において、鋳型、アレルプローブの５’末端およびインベーダープローブの３’末端が特殊な構造を形成する。この構造を特異的に認識してエンドヌクレアーゼ活性を表す酵素（以下「クリベース」という）が、アレルプローブからフラップ部分を切り離す。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズする。このとき、フラップとＦＲＥＴプローブとが、ＦＲＥＴプローブのクエンチャーが結合している５’末端の位置において、クリベースに特異的に認識される構造を形成するため、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによりＦＲＥＴプローブから切り離されて、ＦＲＥＴプローブに残った蛍光色素が蛍光を発する。一方、鋳型配列に変異が存在し、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的でなく、ミスマッチとなっている場合は、クリベースに特異的に認識される構造が形成されないため、フラップはアレルプローブから切り離されない。このとき、切り離されずにアレルプローブに残ったままのフラップもＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズ可能であるが、アレルプローブから切り離されたフラップがハイブリダイズした場合と比較すると、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによってＦＲＥＴプローブから切り離される反応効率が低いため、ＦＲＥＴプローブが発する蛍光強度も低い。以上の原理により、多型の検出が可能となる〔Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕。

(12)ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なるヌクレオチドを含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法である〔Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)〕。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルに基づき解析する。このときに用いられＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５から３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。

(13)ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取りこませる方法である〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７、アプライドバイオシステムズ社製）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。

(14)モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法
Molecular Beaconsは両末端に発光抑制体（Quencher）と蛍光体（Fluorophore）を持ったオリゴヌクレオチドである。通常はステム部分が５−７ヌクレオチドでループ構造が１５−３０ヌクレオチドのステムループ構造である。したがって蛍光体は発光抑制体の働きにより、励起光照射下でも発光しない。一方、ループ構造内の塩基配列と相同なターゲットのＤＮＡとループ構造内の塩基配列がハイブリダイズすると、発光抑制体と蛍光体の距離が離れるために蛍光体が励起光下で励起し蛍光を発する〔Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)〕。Molecular Beaconのステム部分の塩基配列は、ターゲットＤＮＡとは相補的でない。Molecflar Beaconsのステム構造のTm値（溶解温度：melting temperature）は、ターゲットＤＮＡとＰＣＲプライマーのTm値より、７−10℃高くなるように設計する。そして、ターゲット領域をＰＣＲで増幅させるときにMolecular Beaconsを反応液にいれて、ＰＣＲのアニーリング温度で励起光を当て蛍光を測定するとMolecular Beaconsがターゲット遺伝子に完全に相同な配列であればHybridizeするため蛍光を発する。逆にミスマッチがあれば、Molecular Beaconsはターゲットにハイブリダイズできず蛍光を発することができない。この方法により遺伝子多型を見つけることができる。

(15)ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法（Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)法
ターゲットＤＮＡ（60−90塩基対）をゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅する際に、末端をビオチン化したプライマーを用いて行う方法である〔Nat. Biotechnol.，1, p87-88, (1999)、遺伝子医学, 4, p47-48 (2000)〕。ＰＣＲ終了後、ビオチン化したプライマー側のストランド(strand)はストレプトアビジン（Streptavidin）でコーティングされたマイクロタイターウェルに結合する。これに対して未修飾のPrimer側のストランドは結合することができず、アルカリ溶液でリンスすると除去される。その後、このビオチン化したプライマーのストランドに対して、プローブＤＮＡ（１５−２１ヌクレオチド）をハイブリダイズさせる。この時に2本鎖ＤＮＡに特異的に結合し蛍光を発する蛍光物質（Syber Green I dye）を一緒に取込ませる。その後、この蛍光強度を観察しながら変性（denature）させる。ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが完全に相補的でなくミスマッチが有ったときには完全に相補的である場合に比べ変性し発光しなくなる温度が低くなる。この温度の違いを観察することにより、遺伝子多型を検出することができる。

(16)パドロック・プローブ（Padlock Probe）法
Lizardiらによって開発された方法である〔Nat. Genet., 3, p225-232 (1998)、遺伝子医学, 4, p50-51 (2000)〕。一本鎖ターゲットＤＮＡにハイブリダイズするとプローブが環状になるように設計したプローブを用い、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズした後にＤＮＡリガーゼで結合させて完全な環状にしその後アルカリフォスファターゼ（Calf intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)）の脱リン酸化酵素でリン酸基を除去する。末端にミスマッチがあり環状になれなかった場合リン酸基がなくなり環状化できなくなる。この環状ＤＮＡに対してプライマー（１）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼで複製してレプリコン多量体を得る。このレプリコンに対してもプライマー（２）を設計し、この２種類のプライマーを一緒に混ぜてＤＮＡポリメラーゼで反応し、２本鎖ＤＮＡを増幅する。プライマー（１）はターゲットＤＮＡとは相補的でない部分に設計し、プライマー（２）は環状になったプローブ（Padlock Probe）の末端部分（ターゲットＤＮＡと相補的な配列（３'末端に遺伝子多型を含む）に設計し、多型検出には３’末端の一塩基置換させたプライマーを用いる。環状化したプローブ（Padlock Probe）に対してローリング・サイクル・反応（Rolling Circle-Reaction:RCR）を改良したハイパーブランチド・ローリング−サークル増幅法（Hyperbranched Rolling-Circle Amplification (HRCA)）法を用いて増幅させた後に、Padlock Probe内にある制限酵素認識サイトの制限酵素で処理し、電気泳動でバンドの有無を確認する。

(17)ＵＣＡＮ法
ＵＣＡＮ法［タカラ酒造株式会社ホームページ（http://www.takara.co.jp）参照］は、ＲＮＡをＤＮＡが両側からはさんだ型のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマー（ＤＲＤプライマー）の3'末端のＤＮＡを化学変化させておき、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないようにしておく。次に、一塩基変換が起こっている可能性のある塩基部分に、ＲＮＡ部分が結合するように設計したＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡを対合させる。ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみRNaseHにより、対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分が切断される。この切断によって3'末端が新しく出現するのでＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがその場所でマッチしていない場合、つまりＳＮＰが存在するときは、ＲＮaseＨがＤＲＤプライマーを切断しないので、ＤＮＡ増幅が起こらない。この遺伝子増幅の有無を検出することで遺伝子多型を検出することができる。

(18)ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイは多種類の多型部位を含むＤＮＡプローブをガラス基盤上に固定したもので、これに標識した核酸試料をハイブリダイゼーションして、蛍光シグナルによって多型の有無を検出する。一般にガラス基盤上にｃＤＮＡを乗せていくものをＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡをガラス基盤上で合成していくものをＤＮＡチップ（オリゴＤＮＡチップ）という。基盤上に固定（または合成）されるプローブは、オリゴＤＮＡアレイであれば、通常多型部位を含む２０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡマイクロアレイであれば、１００〜１５００ｍｅｒ程度の２本鎖ＤＮＡが用いられる。

(19)ＥＣＡ法
ＥＣＡ（Electrochemical Array）法は、ＤＮＡの２本鎖に結合するインターカレーターの電気化学的性質を利用した遺伝子タイピング法である。すなわち、ゲノム上の多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、基盤に固定化したそれぞれのアレルと相補するプローブとハイブリダイズ後にインターカレーターを作用させる。このとき、プローブに対して完全相補と不完全相補の場合で結合するインターカレーターの量が異なる。ＥＣＡ法で用いるインターカレーターは、電気化学的性質を有するフェロセンという物質を含有しているため、結合したインターカレーターの量に比例して電気的シグナルが異なる。ＥＣＡ法は、この違いを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Anal. Chem., 72, p1334-1341, 2000〕。

以上は代表的な多型検出方法であるが、これらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出方法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の好適な実施形態の一つとして、後述する実施例では、インベーダー法またはダイレクトシークエンス法を用いた判定方法を示す。

４．ＲＡを発症する危険度を判定するための試薬、またはキット
本発明の判定方法では、ＲＡの発症に関連した遺伝子多型を検出するために、検出すべき遺伝子多型が存在する部位またはその近傍の配列を検出するためのプローブまたは固相化試料、もしくは該配列を特異的に増幅するためのプライマーが用いられる。これらのプローブ、プライマーおよび固相化試料は、本発明の判定方法を実施するための試薬、またはキットとして有用である。

すなわち、本発明は、PADI4遺伝子上の遺伝子多型を検出するためのプローブ、プライマーおよび固相化試料、ならびにこれらの少なくとも一つ以上を含む、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するための試薬またはキットを提供する。

(1)プローブ
本発明の方法で用いられるプローブは、PADI4遺伝子上の遺伝子多型を含む部位に特異的にハイブリダイズし、該多型部位を検出するためのポリヌクレオチドプローブである。

そのようなプローブは、配列番号１で示されるPADI4遺伝子断片上において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む、１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続したポリヌクレオチドとして設計される。
ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基

(2)プライマー
本発明の方法で用いられるプライマーは、PADI4遺伝子上の遺伝子多型を含む部位を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。

そのようなプライマーは、配列番号１で示されるPADI4遺伝子断片上において、前項ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。

増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１６〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。

すなわち、多型部位近傍の配列（例えば、配列番号１で示される塩基配列）に含まれる、１５塩基以上の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドは、いずれも上記プライマーまたはプローブとして利用することができる。

本発明のプライマーまたはプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものも含むものとする。

なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般に塩基を標識して、核酸の定量、検出等に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（TMR））等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素で塩基を標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Nature Biotechnology, 14, p303-308 (1996)〕参照」。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製 オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’-オリゴラベリングシステム等）。

また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含むものとする。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。

なお、本明細書中において、「ポリヌクレオチド」は核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよく、したがって、ある配列を有するポリヌクレオチドには、これに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも常に包含される（オリゴヌクレオチドも同様）。さらに、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。

本発明の１つの実施形態である、ダイレクトシークエンス法を用いた検出について、上記プライマーの好適な例を以下に示す。

i）PADI4遺伝子の第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基に存在する遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の５９２７から６１７６番目に示される塩基配列中、より好適には同６０７７から６１７６番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列を選択する。

アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の６１７８から６４２７番目に示される塩基配列中、より好適には同６１７８から６２７７番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列のアンチセンス配列を選択する。

ii）PADI4遺伝子の第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基に存在する遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の８２１から１０７０番目に示される塩基配列中、より好適には同９７１から１０７０番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列を選択する。

アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の１０７２から１３２１番目に示される塩基配列中、より好適には同１２２２から１３２１番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列のアンチセンス配列を選択する。

iii）PADI4遺伝子の第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基に存在する遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の９０３から１１５２番目に示される塩基配列中、より好適には同１０５３から１１５２番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列を選択する。

アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の１１５４から１４０３番目に示される塩基配列中、より好適には同１１５４から１２５３番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列のアンチセンス配列を選択する。

iv）PADI4遺伝子の第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基に存在する遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の３７８６から４０３５番目に示される塩基配列中、より好適には同３９３６から４０３５番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列を選択する。

アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の４０３７から４２８６番目に示される塩基配列中、より好適には同４０３７から４１３６番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列のアンチセンス配列を選択する。

v）PADI4遺伝子の第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基に存在する遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の５９５０から６１９９番目に示される塩基配列中、より好適には同６１００から６１９９番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列を選択する。

アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１の６２０１から６４５０番目に示される塩基配列中、より好適には同６２０１から６３００番目に示される塩基配列中の、１５塩基以上（好ましくは１５〜３０塩基）の連続した塩基配列のアンチセンス配列を選択する。

上記プライマーまたはプローブとして用いられ得るポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法に基づき化学合成することができる。これらのプローブまたはプライマーとして用いられるポリヌクレオチドは、ＲＡの発症危険度を判定するための試薬として利用できる。

（3）固相化試料
本発明の固相化試料は、(1)記載のプローブとして用いられるポリヌクレオチドを、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等の固相に固定することにより作製される。固相への固定は、予め合成したポリヌクレオチドを固相上に乗せる方法であってもよいし、目的とするポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製等）を利用するなど、目的とする固相化試料に適した方法が、当該技術分野で周知である。このような固相化試料としては、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。

(4)キット
本発明のキットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられ得るポリヌクレオチド（あるいは、オリゴヌクレオチド）、ならびに固相化試料から選ばれる少なくとも一つ以上を含む。本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明の判定方法に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。

５．検出結果の解析と評価
ＲＡ患者および健常人における、前記遺伝子多型検出の統計解析結果から、本発明の方法は高い確率でＲＡを発症する潜在的危険度の判定が可能であることが判明している。

例えば、本発明の方法にしたがい、単離されたヒトゲノムＤＮＡを含む試料におけるPADI4遺伝子上の遺伝子多型を調べた結果、下記ａ）〜ｅ）のいずれか一つ、または二つ以上が検出された被験者については、慢性関節リウマチを発症する危険度が高いと判定することができる。
ａ）PADI4遺伝子上の第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基のアデニンからグアニンへの置換
ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）のシトシンからチミンへの置換
ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基のシトシンからグアニンへの置換
ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換

本発明によって、上記判定基準からＲＡを発症する危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予めＲＡの発症を防ぐための対策を講じることができる。したがって、本発明はＲＡを予防するための検査方法としてきわめて有用である。

６． 多型とＲＡとの関連
本発明にかかる４つのＳＮＰｓはいずれもほぼ完全連鎖（98.9〜100％）の関係にあり、かつエクソン部分の３つの多型はいずれもPADI4タンパクのアミノ酸置換をもたらす。

本発明者らが、日本人集団に存在するPADI4の各ハプロタイプについて、そのｍＲＮＡの安定性と酵素活性を確認したところ、以下のことが確認された。
１）ＲＡに関連していると考えられるPADI4のタイプは、ＲＡとの関連が認められないタイプに比べてｍＲＮＡの安定性が高い
２）ＲＡに関連していると考えられるPADI4のタイプは、ＲＡとの関連が認められないタイプに比べて酵素活性が高い

また、本発明者らは、ヒトＲＡの病変組織では高いPADI4発現が見られることと、マウスＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎）モデルの病変組織ではPADI4のオーソログ（相同遺伝子）であるPADI4の高い発現がみられることを確認した。そして、ＲＡ患者の滑膜組織ではPADI4と抗シトルシン化ペプチドがほぼ同じ位置に局在して発現していることも確認した。

PADI4はタンパクのシトルリン化に関与する酵素である。前述したように、ＲＡ患者の滑膜組織では抗シトルリン化ペプチド抗体価が高く、これが自己抗体となってＲＡ病変に関与していることが示唆されている。すなわち、PADI4活性の亢進はタンパクのシトルリン化を亢進させ、ＲＡ病変につながる可能性もあることが推測される。以上の知見は、本発明の多型が、ジェノタイプとしてＲＡ発症の潜在的危険度を示すマーカーであるとともに、フェノタイプとしてPADI4酵素の活性変化をもたらし、ＲＡ発症の要因ともなりうることを示唆するものである。

以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１〕 PADI4第３イントロン中の一塩基多型とＲＡ罹患とのアソシエーション解析
１． 解析対象患者の選択
日本各地の臨床施設より846人のＲＡ患者と658人の非患者とからゲノムDNA抽出用の血液を採取した。すべての検体提供者は日本人である。提供者からは、理化学研究遺伝子多型研究センター倫理委員会によるインフォームドコンセントに対する同意を得た。ＲＡ患者については、The revised criteria of the American College of Rheumatology for the classification of rheumatoid arthritisの以下の７つの基準のうち少なくとも３項目に該当する者をＲＡ患者群として選択した。
(1) 朝のこわばり
(2) ３領域以上の関節炎
(3) 手関節炎
(4) 対称性関節炎
(5) リウマトイド結節
(6) リウマトイド因子
(7) Ｘ線所見
非患者群については、日本人一般集団から患者とは独立に選抜した。ＲＡの診断の有無以外ではＲＡ患者群、非患者群の間に差がないようにサンプリングした。

２． ゲノムＤＮＡの調製
ＲＡ患者および非患者の末梢血から分離した白血球を出発材料とし、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAの抽出にあたっては、EDTA・2Na入り採血菅（ベノジェクト）に採血し、QIAamp DNA Blood kit (QIAGEN)を使用した。得られた各試料の２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、調製したDNAは、1mM EDTA・2Naを含む10mM Tris-塩酸緩衝液 (pH8.0)に溶解し、使用するまで、-80℃で保存した。

３． 第３イントロン中の一塩基多型の検出
以下に示す3種のプローブを用いて、PADI4の第３イントロンの２１３６（−１５）番目の位置（配列番号１の６１７７番目）における塩基がシトシンであるかチミンであるかの検出を行った。
インベーダープローブ：
5'-CTGCGCACAGGGAGATTTCTGAAATCCCATCAT-3'（配列番号２）
シトシン検出用ＦＡＭプローブ：
5'-ATGACGTGGCAGACGGTAAGAGGAGAGGTTGGY-3'（配列番号３）
チミン検出用ＶＩＣプローブ：
5'-CGCGCCGAGGAGTAAGAGGAGAGGTTGGY-3'（配列番号４）

各プローブはThird Wave Technologies, Inc.に委託して設計・合成後、試薬として混合されたものを使用した。インベーダーアッセイは、96ウェル(日本ジェネティックス)か384ウェルプレート(ABI)に、PCR反応液の４倍希釈液2μlおよび上記の3種のプローブの入ったインベーダー反応液（Applied Biosystems社）を3μl加え、95℃にて5分間インキュベートした後、63℃にて20分から80分、シグナルが分離するまで反応させた。96ウェルの場合は ABI PRISM 7700 Sequence Detector System（Applied Biosystems社）、384ウェルの場合は ABI PRISM 7900HT Sequence Detector System（Applied Biosystems社）を使ってシグナルを検出した。

４． 統計解析
ケース群（ＲＡ患者群）846人とコントロール群（非患者群）658人を対象とし、第３イントロン２１３６番目の塩基の１塩基多型についてケース・コントロール関連検定を行った。検定は2群間のアレル頻度分布比較・優性遺伝形式モデルによるジェノタイプ分布比較・劣性遺伝形式モデルによるジェノタイプ頻度比較にて行った。検定方法は2X2分割表χ2検定を用いた。解析結果を表１に示す。

以上のとおり、PADI4遺伝子の第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の位置の遺伝子多型と慢性関節リウマチ罹患との間に統計的に有意な相関が認められた。

〔実施例２〕 PADI4遺伝子中の新規エクソン一塩基多型の検出
１．検出方法
GenBankのアクセション番号：NT_030584.2に示されるゲノム配列の第415,085塩基から第470,600塩基に存在する、PADI4遺伝子上の新規遺伝子多型の検出を以下の方法により試みた。

まず、該遺伝子の全エクソン、およびエクソン近傍イントロン、5'-flanking 領域を約500塩基対ごとに分割して増幅領域と設定し、PCR増幅した。PCR用のプライマーはPrimer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)ソフトウェアを用いてデザインした。PCR条件はDMSOの濃度と、アニール温度を変えることで最適化した。

PCRは96ウェルPCRプレートで行い、各ウェルに4 ng/μlゲノムDNAを2μlずつ使用した。反応は26.5mM (NH₄)₂SO₄, 7.2mM Tris-HCl (pH8.8), 3.2 mM Mg²⁺, 1.5mM dNTPs, 1.6mM b-Mercapto ethanol, 10% DMSO(DMSOを用いない場合には、H₂Oにて代用), 1μM primers , 2.0U DNA polymerase (ExTaq (TaKaRa)), 0.04μM Taq Start Antibody (Clontech)の溶液条件で行った。反応時間および反応温度の条件として、94℃にて2分間変性させた後、94℃ 15 秒、反応ごとに最適化したアニール温度で45 秒, 72℃にて1 あるいは3 分の伸張反応を37サイクル、ABI9700 thermal cycler (Applied Biosystems社)を用いて行った。増幅されたDNA配列は、BigDye^TM Terminator RR Mix (Applied Biosystems社)を使って反応を行い、ABI 3700 sequencerを用いて塩基配列を決定した。

２．結果
各々の領域につき48人分の塩基配列を比較し、多型性の認められた塩基を1塩基多型とみなした。この結果、アミノ酸の置換を伴う以下の3種の新規エクソン一塩基多型とアミノ酸の置換を伴わない１種の新規エクソン多型が見出された。
１）第５５番アミノ酸の置換（Ser/Gly）を伴う多型：
第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基がアデニンまたはグアニンである一塩基多型
２）第８２番アミノ酸の置換（Ala/Val）を伴う多型：
第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型
３）第１１２番アミノ酸の置換（Ala/Gly）を伴う多型：
第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基がシトシンまたはグアニンである一塩基多型
４）第１１７番アミノ酸（Leu）における、アミノ酸の置換を伴わない多型：
第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基がシトシンまたはチミンである一塩基多型

〔実施例３〕 PADI4遺伝子上の各一塩基多型の連鎖解析
１．解析方法
ＲＡと強い関連が認められたPADI4第３イントロン２１３６番目（−１５番目）のヌクレオチドの一塩基多型（以下、「PADI4 intron 3 -15 T/C」と示す。）とPADI4上の４つの新規一塩基多型とのPairwise Linkage Disequilibrium Index (D’)をEMアルゴリズムを用いて算出した。

２．結果
その結果、４つの一塩基多型は相互にほぼ完全連鎖（98.9〜100％）の関係にあり、かつPADI4 intron 3 -15 T/Cともほぼ完全連鎖の関係にあることが、EMアルゴリズムによるハプロタイプ解析によって確認された。一方、PADI4近傍のPADI2、PADI1遺伝子内の公知の一塩基多型とPADI4 intron 3 -15 T/Cについては、ほとんど連鎖平衡に達していた。

つまり、日本人集団では、ＲＡ患者群と非患者群の両群において、55(Ser)-82(Ala)-112(Ala) タイプと55(Gly)-82(Val)-112(Gly) タイプの2ペプチドタイプのみが存在し、このうち後者のタイプとＲＡとの間に、PADI4 intron 3 -15 T/Cと同様のアソシエーションがあることが確認された。以下、前者を「PADI4 V18」（あるいは単に「V18」）、後者を「PADI4 V9」（あるいは単に「V9」）と記載する。V18のcDNA配列は配列表の配列番号１６に、アミノ酸配列は同配列番号１７に記載した。また、V9のcDNA配列は配列表の配列番号２０に、アミノ酸配列は同配列番号２１に記載した。

以上より、PADI4 遺伝子のジェノタイプとＲＡ発症との間には関連があり、その関連はPADI4遺伝子に存在する２つのハプロタイプに由来するものと考えられた。そして、ＲＡの発症に関連するハプロタイプはV9であり、ＲＡの発症と関連がないハプロタイプは V18であると考えられた。

〔実施例４〕 ヒトPADI4ｍＲＮＡの安定性比較
１．分解度の測定
２つのPADI4ハプロタイプをコードする遺伝子は以下の方法で調製した。
まず、Bone marrow total RNA（Clontech社）を用いてfirst strand cDNA synthesis kit（Amersham Pharmacia社）により合成したcDNAをpDONR201（Invitrogen社）にクローニングした。得られたcDNAを、さらにT7プロモーターを含むpDEST14（Invitrogen社）にリクローニングし、それぞれpV18-T7およびpV9-T7 ベクターを作製し、それらについてシークエンシングを行った。次いで、pV18-T7およびpV9-T7 ベクターをClaIで消化し、RiboMax^TMLarge Scale RNA Production System-T7（Promega社）を用いてin vitro transcriptionを行い、V9、およびV18のmRNAを作製した。

Whole cell extractを調製するために、HL-60細胞をPBSで洗浄し、抽出バッファー（0.5% NP-40; 20mM HEPES pH8.0; 20%glycerol (v/v); 400mM NaClcontaining 0.5mM DTT; 0.2mM EDTA; 1% proteinase inhibitor cocktail (Nacalai)）に懸濁した。氷上で30分インキュベーションした後、4℃で遠心し、上清を80℃で保存した。

V9、およびV18の各mRNA 5μg/reactionに1000倍希釈した前述のWhole cell extract 3μlを混ぜ、室温でインキュベートした。0,5,10分反応後、formamide dyeを加えて反応を止め、68℃で10分間加熱し、氷冷した。転写産物はノザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。スキャニングはDocuCentre color 500cp (Fuji-Xerox社)を用いて行い、シグナル強度はAdobePhotoshop 6.0 (Adobe社)により測定した。

結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＲＡ病変に関連したV9のmRNAはＲＡ病変に関連しないV18のmRNAに比べて有意に分解し難い傾向にあることがわかった（*T検定より5分後でp=0.048, 10分後でp=0.013）。

〔実施例５〕 ヒトPADI4タンパクの調製
１．大腸菌によるHis-tag付加PADI4タンパク質の発現
His-tagを付加した2つのPADI4ハプロタイプ断片：RGS6-HisV18（配列番号５）、またはRGS6-HisV9（配列番号６）がpET11d（Stratagene社）のNcoI/BamHIへ挿入された発現プラスミドを作製した。このプラスミドで形質転換した大腸菌BL21-codonPlus(DE3)-RIL cell(Strategene社)をアンピシリン50μg/ml（Sigma社）とクロラムフェニコール50μg/ml（Sigma社）を添加したLB培地（Invitrogen社）に接種し、37℃で一晩培養した。10mLの培養液を1Lの2%グルコース（和光純薬）、アンピシリン50μg/ml（Sigma社）を添加した2倍濃度のLB培地（Invitrogen社）に添加し、600nm波長の吸光度が0.9 になるまで37℃で培養した。終濃度0.1mMになるようにイソプロピルチオ-β-Ｄ-ガラクトシド（IPTG：和光純薬）を添加し、20℃で4時間培養した。培養液を6000×gで10分遠心して、菌体を回収した。菌体を30ｍｌの50ｍＭ トリス-塩酸（pH7.6）(和光純薬)、100mM 塩化ナトリウム（和光純薬）、2mM ジチオスレイトール（DTT：和光純薬）、規定量の完全蛋白分解酵素阻害剤カクテル（Roche Diagnostics社）を含む溶解用緩衝液へ懸濁して、4℃で超音波破砕し、97000×gで30分遠心して上清を回収した。さらにこの上清をMillex-HV (ミリポア社)フィルターにかけた。

２．His-tag付加PADI4 タンパク質の精製
前項で調製した上清を予めバッファーA {50ｍＭ トリス-塩酸（pH7.6）(和光純薬)、1mM エチレンヂアミンテトラ酢酸（EDTA：同仁化学）}で平衡化したSephadex-G25（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、0.1Mの塩酸ナトリウムが入ったバッファーAで分画した。活性が認められた画分をバッファーAで予め平衡化したDEAE-Sepharose（アマシャム・バイオサイエンス社）に供し、0.1Mの塩酸ナトリウムが入ったバッファーAで洗浄した後、バッファーAへ添加した塩酸ナトリウム濃度を0.1Mから0.2Mへ徐々に変化させて溶出し、分画した。活性が認められた画分に三倍量のバッファーB｛50ｍＭ トリス-塩酸（pH7.6）(和光純薬)、0.1M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.1% トライトンX-100｝を加え、Ni-NTA スーパーフローカラム（QIAGEN社）に供した。カラムを20mMのイミダゾールが入ったバッファーBで洗浄し、200ｍMのイミダゾールが入ったバッファーBで溶出した。活性が認められた画分をバッファーC｛10mM トリス-塩酸(pH7.6) (和光純薬)、0.15M塩化ナトリウム(和光純薬)、2mM DTT(和光純薬)、1mM EDTA（同仁化学）｝で透析し、濃縮後、終濃度10％になるようにグリセロール（Sigma社）を添加して、-80℃に保存した。

〔実施例６〕 ヒトPADI4タンパクの活性測定
１．PADI4活性の測定方法（蛍光法）
酵素反応用の緩衝液として、100mM Tris/HCl（pH7.8）、10mM CaCl₂、5mM DTT、10mM BAEE（Sigma）またはN-α-Benzoyl-l-arginine（東京化成）を含む溶液を調製した。この緩衝液40μlと、実施例５で調整したV18酵素原液（113μg/ml）の希釈列10μlをPCR反応プレート（Applied Biosystems社）内にて混合し、37℃で2時間反応させた。反応後、10μlの200mM EDTAを添加して反応を停止した。このうち50μl分をdeep well plate（日本ジェネティクス社）に移した。なお同時に、検量線作成のため、0-50nMの硫酸アンモニウム溶液も別のウェルへ添加した。さらにこれらのウェルへ、50mM ホウ酸を1ml、および50mM o-phthalaldehydeと50mM DTTの等量混合溶液を50μlずつ添加し、室温で2時間反応させた。反応溶液は200μl分を白色プレート（コースター・コーニング社）に移し、Spectra max GEMINI（Molecular Devices社）を用いて励起波長413nm、蛍光波長476nmの各波長を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用硫酸アンモニウムを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したアンモニウムイオンの濃度を求めた（図２Ａ）。

２．PADI4活性の測定方法（吸光法）
酵素反応用の緩衝液として、100mM Tris/HCl（pH7.6）、10mM CaCl₂、5mM DTT、10mM BAEE（Sigma）を含む溶液を調製した。この緩衝液40μlと、113μg/mlの実施例５で調整したV18酵素原液（113μg/ml）の希釈列10μlをPCR反応プレート（Applied Biosystems社）内にて混合し、50℃もしくは37℃で2時間反応させた。反応後、A液（80mM Diacetyl monoxime（3−hydroxyimino 2−butane）、2mM thiosemicarbazide）を含む）とB液（3M H₃PO₄、6M H₂SO₄、2mM NH₄Fe(SO₄)₂を含む）を1：3の比率で混合した溶液を150μlずつ添加した。なお同時に、検量線作成のため、0−400μMのL-シトルリン溶液も別のウェルへ添加し、同様にＡ液とＢ液の混合溶液を添加した。混合溶液は、サーマルサイクラー（GeneAmp^TMPCR System 9700、Applied Biosystems社）を使用して95℃15分の後室温で10分反応させた。反応後の溶液は150μl分を96ウェルプレート（コーニング社）に移し、Spectra max 250（Molecular Devices社）を用いて540nmの吸光度を測定した。酵素を含まないウェルの測定値をバックグラウンドとして差し引き、検量線作成用シトルリンを添加したウェルでの測定値から検量線を描くことにより、反応によって生成したシトルリンの濃度を求めた（図２Ｂ）。

３．ヒトPADI4ハプロタイプV9およびV18の酵素活性
吸光度法を用いてヒトPADI4ハプロタイプV9およびV18の酵素活性を測定し、比較した（図３）。図３から明らかなように、V9はV18に比べて有意に酵素活性が高いことが確認された(P<0.01)。以上より、ＲＡ病変に関連したPADI4タイプ（V9）は正常PADI4タイプ（V18）よりもその酵素活性が高く、こうした酵素活性の違いがＲＡ発症と何らかの関連を有することが推測された。

〔実施例７〕 ＲＡ患者のPADI4ジェノタイプと抗シトルリン化フィラグリン抗体価との関連
１．抗シトルリン化ペプチド抗体価の測定方法
ＲＡ患者血清の抗シトルリン化ペプチド抗体価をMESACUP ACFテストは、医学生物学研究所（名古屋）委託して作製したキットを用いて行った。MESACUP ACFテストとは、リコンビナント ヒトフィラグリンペプチドをPADによりシトルリン化した、シトルリン化フィラグリンを抗原として、ELISA法により抗体価を測定する方法である。

まず、患者末梢血より血清を調製し、10μlを反応用緩衝液1mLに加えて101 倍希釈した。抗フィラグリン抗体標準血清2、標準血清1および希釈した検体を 150μLずつ一次反応準備用マイクロプレートに実際と同じように添加した。その後、抗原感作マイクロカップにマルチピペットを用い 100μLずつ移した。室温（20〜25℃）で１時間静置反応させた後、洗浄液で４回洗浄し、酵素標識抗体をマルチピペットで 100μL ずつ添加した。その後、室温（20〜25℃）で１時間静置反応させ、反応停止液をマルチピペットで 100μL ずつ添加した。
各反応後のサンプルを分光吸光度計を用いてＯＤ４５０を測定し、Index値を下式を用いて算出した。

２．PADI4ジェノタイプと抗シトルリン化フィラグリン抗体価との関連
PADI4 intron 3 -15 T/C ジェノタイプの決められた、ＲＡ患者57人につき、血清中の抗合成シトルリン化フィラグリン抗体価を測定した。
カットオフ値10にて、分割表検定を行ったところ、下表２のようになった。

罹患ホモ接合体（TT）のジェノタイプと他のジェノタイプとの間の比較をFisher’s 正確検定(One-sided)にて行ったところ、p=0.0284を得た。すなわち、ＲＡ患者内において、罹患ホモ接合体（TT）のジェノタイプを有する患者では抗シトルリン化フィラグリン抗体価が他のジェノタイプを有する患者に比較して有意に高いことが示された。この結果と実施例４、６の結果より、PADI4ジェノタイプの違いは、mRNAの安定性や酵素活性といったPADI4フェノタイプの変化をもたらし、シトルリン化タンパクのレベルの亢進につながる可能性が高いことが推測された。

〔実施例８〕 ＲＡ患者滑膜組織におけるPADI4発現量の検討
１．In situ-RT-PCR
ＲＡ患者の滑膜組織から調整した組織片にPro STAR HF（Stratagenes社）を添加し、以下の条件でOne step In situ-RT-PCR をHybaid Omnislide (Hybaid Ltd., Middlesex, UK)上にて実施した。
(1) 42℃ 30 分
(2) 94℃ 2 分, 55℃ 45秒, 68℃ 2分
(3) 94℃ 45秒, 55℃ 45秒, 68℃ 2分、25サイクル
PCR反応後のスライドグラスはPBS にて5分間ずつ2回洗浄した。

hPADI4 V18のcDNA（配列番号１６）を鋳型に、以下のPADI4増幅用プライマーを用いてPCRを行い、得られた335塩基長の増幅産物をジゴキシゲニン（DIG）標識して、PADI4検出用プローブとした。
Forward Primer: 5'-GACCAGAAGGTTCAGATTTCATACTAC-3'（配列番号７）
Reverse Primer: 5'-ACCAGTGTATGGTTTGTGAAGAAGT-3'（配列番号８）
なお、DIG標識はPCR DIG probe synthesis kit (Roche Diagnostics社)を用いて行った。

逆転写後のサンプルに、前述のプライマーを最終濃度0.34μMとなるように加え、スライドグラスを被せて37℃ 1時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、94℃で5分間変性させたDIG標識プローブを加え、37℃で12時間ハイブリダイゼーションを行った。反応後のスライドを洗浄し、digoxygenin detection kit (Roche Diagnostics社)を用いてPADI4遺伝子の検出を行った。陰性対照として、プライマー非添加、反応酵素非添加の条件で同様に検出を行った。

２．結果
結果を図４に示した。PADI4 の転写産物はＲＡ患者滑膜組織の表層（lining）と滑膜表層下（sub-lining layer）付近に局在していた。また、シグナルは繊維芽細胞様細胞や血管周囲の球状核細胞（round-nuclear cell）中で観察された。

〔実施例９〕 マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるPADI4遺伝子発現量の検討
マウスにコラーゲン誘導関節炎（CIA）を誘導し、その滑膜組織および脾臓組織における、マウス ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプIV(mPADI4)遺伝子の発現量について検討した。なお、mPADI4は、ヒト ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ（hPADI4）のマウスオーソログである。mPADI4のcDNA配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列表の配列番号１８および配列番号１９に記載した。

１． マウスＣＩＡモデルの作製
DBA/1Jマウス（５週齢の雌、日本チャールスリバー（株）より購入）は、CIA群（N=11）と健常群（N=11）に分けた。CIA群は訓化後、タイプIIコラーゲン2mg/ml(コラーゲン技術研修会)およびADJUVANT COMPLETE FREUND(DIFCO)を等量の割合で混ぜ、超音波によりエマルジョン化したものを、１匹あたり100μl、一週間の間隔をおいて計２回 尾根部に皮内投与した。最終的に、CIA群は発症が見られた5匹7肢を、健常群は11匹22肢を以下の実験に供した。

２．滑膜組織および脾臓組織における、mPADI4遺伝子発現量の測定
マウスは２回目の投与後７週目に断頭放血により致死させ、滑膜組織および脾臓組織をハサミおよびピンセットで摘出した。摘出した組織より、RNeasy mini kitまたはRNeasy midi kit (QIAGEN社)を用いて、添付のプロトコールに従い全RNAを調製した。調製した全RNAより、TaKaRa RNA PCR^TM Kit (AMV) Ver.2.1（TaKaRa）を用いて、添付プロトコールに従いcDNAを合成した。

mPADI4遺伝子の発現は、ABI PRIZM 7700 System（Applied Biosystems社）を用いたRT-PCRにより検討した。用いたmPADI4遺伝子増幅用プライマー、およびmPADI4遺伝子検出用プローブは以下のとおりである。
Forward Primer: 5'-ACGCTGCCTGTGGTCTTTG-3'（配列番号９）
Reverse Primer: 5'-CCAGCCCAGTGAGCTCTGA-3'（配列番号１０）
Probe: 5'-CCTGAAGGATTTCCCTGTCAAGCGAGTT-3'（配列番号１１）

なお、mPADI4遺伝子発現量は、内部標準として用いたマウスβ-glucuronidase (mGUS)遺伝子の発現量で補正した。MGUS4遺伝子増幅用プライマー、およびMGUS4遺伝子検出用プローブの配列は以下のとおりである。
Forward Primer: 5'-TACGGGATTGTGGTCATCGA-3'（配列番号１２）
Reverse Primer: 5'-CGAACCAGCTCCTCCATCAC-3'（配列番号１３）
Probe: 5'-CAACGAGTCACTTCGGCACCACCTAGAG-3'（配列番号１４）

３． 結果
結果を図５に示した。CIA群滑膜組織では健常群滑膜組織に比べmPADI4の発現量は19.5倍に上昇していた。また、CIA群脾臓組織では健常群脾臓組織に比べmPADI4の発現量は3倍に上昇していた。以上よりCIA群では、滑膜組織および脾臓組織においてmPADI4遺伝子発現が著しく上昇することが確認された。

〔実施例１０〕 抗PADI4抗体（抗PADI4 ペプチド抗血清）の調製
ヒトPADI4由来のペプチド配列 ( PAKKKSTGSSTWP-Cys：配列番号１５) を合成し（オリエンタル酵母北山ラベス, ペプチド合成機：アプライドバイオシステムズジャパン株式会社，Pioneer, 合成法：Fmocアミノ酸を用いた固相合成）、KHL (Keyhole limpet hemocyanin, CALBIOCHEM )をMBS(PIERCE)法を用いてコンジュゲーションした。

免疫動物はウサギ(Kbl:JW, オス, 週齢:リタイア)を使用し、初回免疫において、FCA(フロイント完全アジュバント, DIFCO)と抗原との等量混合液を背部皮下に注射した。初回免疫はこの抗原を600μgペプチド/匹 用いて行った。２回目以降はFIA(フロイントの不完全アジュバント, DIFCO)と抗原との等量混合液を２週間おきに３回背部皮下に注射した。２次免疫以降はこの抗原を300μgペプチド/匹 用いて行った。最終免疫から２週間後に全採血し、3000rpmにて20分間、遠心し、血清を分離回収したのち、NaN₃（和光純薬）を0.05% (w/v) 添加し、4℃（冷蔵）にて保存した。

〔実施例１１〕 ＲＡ患者関節滑膜組織片の免疫染色
１．関節滑膜組織切片の調製
人工膝関節置換術に際して得られた切離組織より、関節滑膜組織片を得た。得られた滑膜組織片は即座に液体窒素中に漬け、スライドグラス上薄層切片作製まで-80℃で保存した。薄層切片化に際し、凍結組織片を10％中和緩衝ホルマリンにて固定し、70%エタノール、85%エタノール、90%エタノール、100%エタノール(100％エタノールの場合に限り2回)にて各1時間脱水処理し、ついで、50%エタノール50%パラフィン溶液で30分間にて1回、100%パラフィン溶液で30分間にて２回、処理し、組織片をパラフィン化した。その後、組織片をパラフィン中に包埋した。パラフィン包埋組織片はライカミクロトームRM2165で4μmの厚さにスライスし、スライドグラスに固定した。

２．免疫染色
免疫染色に先立ち、前項で調製したパラフィン包埋切片をキシレンに３分間ずつ２回つけ、脱パラフィン化した後、100%エタノールに１分間ずつ２回、95%エタノールに1分間ずつ２回、さらにPBS(0.13M NaCl, 8.6mM K2HPO4, 1.5mM KH2PO4)に３分間ずつ２回つけ、再水和した。30%H₂O₂メタノール溶液で３分間処理し、内在性ビオチンを除去した。PBSにて５分間ずつ２回、洗浄し、1000倍希釈したそれぞれの抗体：抗シトルリン化タンパク質抗体（Biogenesis社）と実施例１０で調製した抗PADI4抗体とを加えて4℃にて12時間反応させた。反応後、PBSにて５分間ずつ2回洗浄し、SimpleStain MAX-PO(Nichirei)を1スライドにつき100μlずつ加え、25℃にて30分間反応させた。その後、PBSにて5分間ずつ２回洗浄を行った。基質として、SimpleStain AEC(Nichirei)を１スライドにつき100μlずつ加え、シグナルが検出されるまで5分から20分反応させた。反応は超純水につけて停止させた。

３．結果
結果を図６および図７に示す。ＲＡ患者の滑膜組織ではPADI4 を特異的に認識する抗体による反応（Ａの枠で囲った箇所の赤い部分）が認められたが、関節リウマチの陰性対照である変形性関節症（ＯＡ）患者の滑膜組織にはPADI4 を認識する抗体による反応は認められなかった（図６Ｂ）。また、ＲＡ患者の滑膜組織では、PADI4 とほぼ同じような部分にシトルリン化タンパク質が認められた（図７）

〔実施例１２〕 ヒトPADI4 mRNAの安定性比較
１．mRNAの調製
2つのPADI4ハプロタイプのmRNAは、以下の方法で調製した。
V9もしくはV18をコードする遺伝子をCMVプロモーターの下流につないだプラスミドを、リポフェクトアミン2000（Invitrogen社）を用い、添付のプロトコールに従ってヒトK562細胞への遺伝子導入を行った。37℃で4時間培養した後、PMA（Sigma社）を最終濃度50ng/mlとなるように添加した。40時間培養した後、アクチノマイシンD（Sigma社）を最終濃度5μg/mlとなるように添加し、0、2、4時間後にそれぞれ細胞を回収した。

次いで、全RNA抽出用試薬（RNeasy MiniおよびRNase-Free Dnase set: QIAGEN社）を添付のプロトコールに従って用いることにより、全RNAを抽出した。なお、回収した全RNAは-80℃に保存した。残存したヒトPADI4 V9もしくはV18のmRNAを、TaqMan One-step RT−PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用い、指定のプロトコールに従って、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems社）を用いて測定した。なお、得られたデータはリボゾーマルRNA（18S）の値を用いて補正した。

２．結果
図８に示すように、PADI4 V9のmRNAは、PADI4 V18に比べて有意に分解し難い傾向にあることが分かった（T検定より、4時間後でp=0.03）

本発明の方法は、医療の分野において、被験者が慢性関節リウマチを発症する潜在的危険度の早期判定に利用できる。

図１は、ヒトPADI4 の2つのハプロタイプ：V9とV18の各mRNA 安定性（分解度）を比較したグラフである。 図２は、（Ａ）蛍光法によるPADI4酵素活性測定の結果を示すグラフ、および（Ｂ）吸光法によるPADI4酵素活性測定の結果を示すグラフである。 図３は、PADI4 の2つのハプロタイプ：V9およびV18の酵素活性を吸光法により比較した結果を示すグラフである。 図４は、ＲＡ患者滑膜組織におけるPADI4 mRNA発現をみたIn situ RT-PCRの結果を示す写真である。図中右の２つは陰性対照である。 図５は、マウスコラーゲン誘導関節炎（CIA）群と正常（normal）群における滑膜組織および脾臓組織におけるmPADI4遺伝子発現量を示すグラフである。 図６は、（Ａ）抗PADI4抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）PADI4を特異的に認識する抗体とPADIの全てのサブタイプを認識する抗体の両者を用いたＯＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。 図７は、（Ａ）抗PADI4抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像、および（Ｂ）抗シトルリン化タンパク質抗体を用いたＲＡ患者滑膜での免疫組織染色像を示す写真である。 図８は、ヒトPADI4 V9とPADI4 V18のmRNAの安定性を比較したグラフである。

配列番号１−ヒトPADI4遺伝子断片(第1イントロン-1000〜第4イントロン)
−変異の説明：(A)と(G)の置換による一塩基多型
−変異の説明：(C)と(T)の置換による一塩基多型
−変異の説明：(C)と(G)の置換による一塩基多型
−変異の説明：(C)と(T)の置換による一塩基多型
−変異の説明：(C)と(T)の置換による一塩基多型
配列番号２−人工配列の説明：プローブ
配列番号３−人工配列の説明：プローブ
配列番号４−人工配列の説明：プローブ
配列番号７−人工配列の説明：プライマー
配列番号８−人工配列の説明：プライマー
配列番号９−人工配列の説明：プライマー
配列番号１０−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プローブ
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
配列番号１３−人工配列の説明：プライマー
配列番号１４−人工配列の説明：プローブ
配列番号１５−人工配列の説明：ヒトPADI4由来ペプチド

Claims (8)

1. ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の遺伝子多型を検出することにより、該試料を提供した被験者が慢性関節リウマチを発症する危険度を判定する方法であって、検出する遺伝子多型が、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれかのペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の一塩基多型、またはその二つ以上の組合せからなるハプロタイプであることを特徴とする、前記方法。
   ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基に存在する一塩基多型
   ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基に存在する一塩基多型
   ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基に存在する一塩基多型
   ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基に存在する一塩基多型
   ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基に存在する一塩基多型
2. ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子上の遺伝子多型において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上が検出された場合に、被験者は慢性関節リウマチを発症する危険度が高いと判定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
   ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
   ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基のアデニンからグアニンへの置換
   ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
   ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基のシトシンからグアニンへの置換
   ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基のシトシンからチミンへの置換
3. 検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法からなる群より選択される一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 検出が、ダイレクトシークエンス法、および／またはインベーダー法を用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 配列番号１で示されるペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子断片上において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチドまたはその標識物からなる、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するためのプローブ。
   ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基
   ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基
   ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基
   ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基
   ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基
   （ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする）
6. 配列番号１で示されるペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプＩＶ遺伝子断片上において、下記ａ）〜ｅ）から選ばれるいずれか一つの塩基を含む１６〜１０００塩基長の連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、前記遺伝子断片上の連続した１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドの相補鎖またはその標識物からなる、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するためのプライマー。
   ａ）第３イントロンの２１３６番目（配列番号１の６１７７番目）の塩基
   ｂ）第２エクソンの７１番目（配列番号１の１０７１番目）の塩基
   ｃ）第２エクソンの１５３番目（配列番号１の１１５３番目）の塩基
   ｄ）第３エクソンの６２番目（配列番号１の４０３６番目）の塩基
   ｅ）第４エクソンの９番目（配列番号１の６２００番目）の塩基
   （ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする）
7. 請求項５に記載のプローブを固定した固相化試料。
8. 以下の１）〜３）から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、慢性関節リウマチを発症する危険度を判定するための試薬またはキット。
   １）請求項５に記載のプローブ
   ２）請求項６に記載のプライマー
   ３）請求項７に記載の固相化試料

Images