WO2023131254A1 - N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA合成中的应用 - Google Patents

N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA合成中的应用 Download PDF

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WO2023131254A1
WO2023131254A1 PCT/CN2023/070774 CN2023070774W WO2023131254A1 WO 2023131254 A1 WO2023131254 A1 WO 2023131254A1 CN 2023070774 W CN2023070774 W CN 2023070774W WO 2023131254 A1 WO2023131254 A1 WO 2023131254A1
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alkyl
tetrahydrofuran
compound
formula
group
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PCT/CN2023/070774
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Inventor
李松
郭传鑫
蔡晓茹
钱其军
Original Assignee
上海吉量医药工程有限公司
浙江吉量科技有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the invention relates to N1 position modified pseudouridine and its application in mRNA.
  • mRNA is regarded as a new option for drug manufacturing.
  • a piece of mRNA was injected into mice and successfully encoded a protein. This mRNA is obtained through a technique called in vitro transcription.
  • mRNA shows good biological activity, but limited by its own instability, strong immunogenicity and difficulty in delivery in vivo, mRNA is far from being used in clinical disease treatment.
  • modified nucleotides can reduce the self-immunogenicity of mRNA, improve the stability of mRNA itself, and further enhance the expression time and efficiency of mRNA in target cells, so that mRNA can be truly used in the pharmaceutical field.
  • Moderna and BioNTech adopt 1-methyl pseudouridine (CN110511939A, CN104114572A, CN103974724A) and pseudouridine (US10232055B2, US9597380B2, US9163213B2) respectively, which greatly reduces the immunogenicity of mRNA and improves the expression of mRNA in target cells.
  • the timing and total amount of the target protein expressed in the mRNA laid the foundation for the successful marketing of the COVID-19 vaccine made from mRNA.
  • the present invention designs and synthesizes various pseudouracil derivatives modified at the N1 position, and successfully applies them to the in vitro transcription and synthesis of mRNA.
  • the first aspect of the present invention provides a compound represented by the following formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a stereoisomer thereof:
  • R is selected from H, cyano, optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C2-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted C1-C6 alkylthio, Optionally substituted C3-C8 cycloalkyl, optionally substituted 4-9 membered heterocyclyl and optionally substituted 5-10 membered heteroaryl;
  • R 2 and R 3 are independently hydroxyl or C1-C6 acyl
  • R 4 is optionally substituted C1-C4 alkyl
  • X and Y are each independently O or S.
  • the C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl and C1-C6 alkylthio are optionally replaced by 1-3 Substituents selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclic groups and -COR 5 are substituted, wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl and C2-C6 alkenyl, or R a and R b together with the N they are connected to form a 4-9 membered heterocyclic group, R 5 is C1 -C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein, R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, preferably including azetidinyl, oxetanyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydro Thienyl, piperazinyl, piperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 4-9 membered heterocyclyl is optionally substituted, such as optionally substituted with 1-3 C1-C4 alkyl groups.
  • each of the C3-C8 cycloalkyl, 4-9 membered heterocyclyl and 5-10 membered heteroaryl is optionally replaced by 1-3 Substituents selected from halogen, hydroxy, C1-C4 alkyl and halogenated C1-C4 alkyl, preferably 1-3 substituents selected from halogen and C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 cycloalkyl is a C3-C6 cycloalkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, and preferably, the nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • the 4-9 membered heterocyclic group preferably includes azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetanyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuryl, piperazinyl, piperidine , N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 5-10 membered heteroaryl group includes pyrrolyl, thienyl, furyl, pyridyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, pyridazinyl and pyrimidinyl, etc., preferably nitrogen-containing heteroaryl , preferably, the substitutable nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • said R 1 is optionally selected from 1-3 members selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered hetero C1-C6 alkyl substituted by the substituent of cyclic group and -COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2 -C6 alkenyl, or R a and R b form a 4-9 membered heterocyclic group together with the N they are attached to, R 5 is C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R" , wherein R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is selected from the aforementioned heterocyclic groups. In some embodiments, the 4-9
  • the R 1 is -(CH 2 ) n R 7 , n is an integer from 1 to 3, and R 7 is selected from C1-C4 alkoxy (such as methoxy , ethoxy, etc.), C2-C6 alkenyl (such as 2-methylprop-1-en-1-yl, etc.), C2-C6 alkynyl (such as ethynyl, etc.), -NR a R b ,, cyanide group, -COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2-C6 alkenyl, or Ra and Rb are combined with them
  • the connected N together form a 4-9 membered heterocyclic group
  • R is selected from C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein
  • said R is C3-C6 cycloalkyl, 4-9 membered heterocyclyl optionally substituted by 1-3 selected from halogen and C1-C4 alkyl and 5-10 membered heteroaryl.
  • R2 and R3 are each independently OH or acetyl.
  • R2 and R3 are the same group.
  • R 4 is C1-C4 alkyl substituted by hydroxyl or C1-C6 acyl. In one or more embodiments, R 4 is C1-C4 alkyl substituted with -OH or -O-acetyl.
  • both R 2 and R 3 are hydroxyl
  • R 4 is C1-C4 alkyl substituted by hydroxyl, preferably CH 2 (OH)-.
  • both R 2 and R 3 are acetyl, and R 4 is C1-C4 alkyl substituted by acetyl, preferably CH 3 COCH 2 -.
  • said compound of formula I is selected from:
  • the second aspect of the present invention provides a compound represented by the following formula II or a pharmaceutically acceptable salt or stereoisomer thereof:
  • R is selected from H, cyano, optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C2-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted C1-C6 alkylthio, Optionally substituted C3-C8 cycloalkyl, optionally substituted 4-9 membered heterocyclyl and optionally substituted 5-10 membered heteroaryl;
  • R 2 and R 3 are hydroxyl groups
  • X and Y are each independently O or S;
  • R6 is:
  • X, Y, R 1 -R 3 and R 6 are as described in any embodiment of formula II.
  • the C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl and C1-C6 alkylthio are optionally replaced by 1-3 Substituents selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclyl and C-COR 5 are substituted, wherein R a and R b are each independently selected from H , C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2-C6 alkenyl, or R a and R b together with the N they are connected to form a 4-9 membered heterocyclic group, R 5 is C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein, R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, preferably including azetidinyl, oxetanyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydro Thienyl, piperazinyl, piperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 4-9 membered heterocyclyl is optionally substituted, such as optionally substituted with 1-3 C1-C4 alkyl groups.
  • each of the C3-C8 cycloalkyl, 4-9 membered heterocyclyl and 5-10 membered heteroaryl is optionally replaced by 1-3 Substituents selected from halogen, hydroxy, C1-C4 alkyl and halogenated C1-C4 alkyl, preferably 1-3 substituents selected from halogen and C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 cycloalkyl is a C3-C6 cycloalkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, and preferably, the nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • the 4-9 membered heterocyclic group includes azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetanyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, piperazinyl, piperazinyl Pyridyl, N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 5-10 membered heteroaryl group includes pyrrolyl, thienyl, furyl, pyridyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, pyridazinyl and pyrimidinyl, etc., preferably nitrogen-containing heteroaryl , preferably, the substitutable nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • said R 1 is optionally selected from 1-3 members selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered hetero C1-C6 alkyl substituted by the substituent of cyclic group and C-COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl and C2 -C6 alkenyl, or R a and R b form a 4-9 membered heterocyclic group together with the N they are attached to, R 5 is C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R" , wherein R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the R 1 is -(CH 2 ) n R 7 , n is an integer from 1 to 3, and R 7 is selected from C1-C4 alkoxy (such as methoxy , ethoxy, etc.), C2-C6 alkenyl (such as 2-methylprop-1-en-1-yl, etc.), C2-C6 alkynyl (such as ethynyl, etc.), -NR a R b ,, cyanide group, -COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2-C6 alkenyl, or Ra and Rb are combined with them
  • the connected N together form a 4-9 membered heterocyclic group
  • R is selected from C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein
  • said R 1 is C3-C6 cycloalkyl, 4-9 membered heterocyclyl optionally substituted by 1-3 selected from halogen and C1-C4 alkyl and 5-10 membered heteroaryl.
  • said compound of formula II is selected from:
  • the pharmaceutically acceptable salt is an alkali metal salt, preferably a sodium salt or a lithium salt, more preferably a sodium salt.
  • the alkali metal salt molecule there may be 1-4 alkali metal ions.
  • the salt when it is a sodium salt, it may be a monosodium, disodium, trisodium, and/or tetrasodium salt.
  • a third aspect of the present invention provides an isolated polynucleotide molecule encoding a polypeptide, said isolated polynucleotide molecule comprising an open reading frame encoding said polypeptide, said open reading frame comprising adenosine (AMP), guanosine (GMP), cytidylic acid (CMP) and modified pseudouracil derivatives; wherein, the structure of the modified pseudouracil derivatives is shown in formula II.
  • AMP adenosine
  • GMP guanosine
  • CMP cytidylic acid
  • the isolated polynucleotide molecule further includes one or more of a 5'UTR, a 3'UTR, and a 5'cap structure.
  • the 5' cap structure is selected from: Cap0, Cap1, ARCA, inosine, N1-methyl-guanosine, 2-'fluoro-guanosine, 7-deaza-guanosine , 8-oxo-guanosine, 2-amino-guanosine, LNA-guanosine and 2-azido-guanosine.
  • the fourth aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition, which contains the isolated polynucleotide molecule of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a fifth aspect of the present invention provides a method of increasing the level of a target polypeptide in a mammalian subject, said method comprising administering to said subject an isolated polynucleotide molecule of the present invention, or an isolated polynucleotide molecule comprising said isolated polynucleotide molecule.
  • Pharmaceutical composition of polynucleotide molecules comprising
  • the sixth aspect of the present invention provides the use of the compound represented by formula II in the preparation of isolated polynucleotide molecules.
  • the seventh aspect of the present invention provides a method for preparing mRNA to reduce the autoimmunogenicity of the mRNA, improve the stability of the mRNA itself, and/or enhance the expression time and expression efficiency of the mRNA in the target cell, the method comprising using the formula II The steps for preparing the mRNA for the indicated compound.
  • the eighth aspect of the present invention provides the application of the compound represented by formula II in reducing mRNA autoimmunogenicity, improving mRNA self-stability, enhancing mRNA expression time and expression efficiency in target cells, or in the preparation of autoimmune Application in the preparation of mRNA with reduced originality, improved self-stability, prolonged expression time in target cells, and/or improved expression efficiency in target cells.
  • Figure 1 1% agarose gel detection results of LS1, LS4, LS18, LS21, LS24, LS27, LS29, LS31 in vitro mRNA transcription synthesis products.
  • Figure 2 The purity test results of EGFP mRNA synthesized by LS1 in vitro mRNA transcription after capping.
  • Figure 3 The purity test results of EGFP mRNA synthesized by LS2 in vitro mRNA transcription after capping.
  • Figure 4 The purity test results of EGFP mRNA synthesized by LS3 in vitro mRNA transcription after capping.
  • Figure 5 RNA/DNA helix computer model and chemical structure.
  • reactions and purifications can be carried out using the manufacturer's instructions for the kit, or by methods known in the art or as described herein.
  • the techniques and methods described above can generally be performed according to conventional methods well known in the art as described in various general and more specific documents that are cited and discussed in this specification.
  • groups and substituents thereof can be selected by those skilled in the art to provide stable moieties and compounds.
  • substituent When a substituent is described by a conventional chemical formula written from left to right, the substituent also includes chemically equivalent substituents obtained when the structural formula is written from right to left. For example, -CH 2 O- is equivalent to -OCH 2 -.
  • C1-C6 alkyl refers to an alkyl group as defined below having a total of 1 to 6 carbon atoms.
  • the total number of carbon atoms in the abbreviated notation does not include carbons that may be present in substituents of the stated group.
  • halogen means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • Haldroxy means an -OH group.
  • Hydroalkyl means an alkyl group as defined below substituted with a hydroxy group; the hydroxy group may replace one C at the end of the alkyl group or one or more Cs in the middle of the alkyl group.
  • Cyano refers to -CN.
  • Amino refers to -NH2 .
  • Substituted amino can be represented as -NR'R' or -NR a R b , wherein said R' and R" and R a and R b are as defined for any of the embodiments herein.
  • Carboxy refers to -COOH.
  • Alkoxy means -OR, where R can be alkyl as defined herein.
  • Alkylthio means -SR, where R may be alkyl as defined herein.
  • alkyl refers to a fully saturated linear or branched hydrocarbon chain group, consisting only of carbon atoms and hydrogen atoms, having, for example, 1 to 12 (such as 1 to 8, 1 to 6, or 1 to 4) carbon atoms, and are connected to the rest of the molecule by a single bond, including but not limited to methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, 2-methylbutyl, 2,2-dimethylpropyl, n-hexyl, heptyl, 2-methylhexyl, 3 -Methylhexyl, octyl, nonyl, decyl and the like.
  • alkenyl as a group or part of another group, means consisting only of carbon atoms and hydrogen atoms, containing at least one double bond, having, for example, 2 to 20 (such as 2 to 10 , 2 to 6 or 2 to 4) carbon atoms and is connected to the rest of the molecule by a single bond, straight or branched hydrocarbon chain group, including but not limited to vinyl, propenyl, allyl, butyl -1-enyl, but-2-enyl, pent-1-enyl, pent-1,4-dienyl and the like.
  • alkynyl as a group or part of another group, means consisting only of carbon and hydrogen atoms, containing at least one triple bond, having, for example, 2 to 20 (eg 2 to 10 , 2 to 6 or 2 to 4) carbon atoms and a straight or branched hydrocarbon chain group connected to the rest of the molecule through a single bond, including but not limited to ethynyl, propynyl, etc.
  • cycloalkyl is usually C3-C8 cycloalkyl, such as C3-C6 cycloalkyl.
  • exemplary cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and cycloheptyl.
  • heterocyclyl as a group or part of another group, means a group consisting of 2 to 14 carbon atoms (such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13 or 14 carbon atoms) and a stable 3- to 20-membered non-aromatic cyclic group consisting of 1 to 6 heteroatoms selected from nitrogen, phosphorus, oxygen and sulfur.
  • the heterocyclyl group may be a monocyclic, bicyclic, tricyclic or multicyclic ring system, which may include fused ring systems (also known as fused ring systems), bridged ring systems, or spiro ring systems.
  • heterocyclyl group can be attached to the rest of the molecule via a carbon atom or a heteroatom and by a single bond.
  • one or more rings may be aryl or heteroaryl as defined below, provided that the point of attachment to the rest of the molecule is a non-aromatic ring atom.
  • heterocyclyl is preferably a stable 4- to 12-membered, 5- to 12-membered, or 4- to 9-membered non- Aromatic monocyclic or heterocyclic (such as bicyclic), 6-12 membered bridged heterocyclic or 6-12 membered spiro heterocyclic groups, more preferably containing 1 to 3 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur Stable 5- to 9-membered non-aromatic monocyclic, bicyclic, bridged heterocyclic or spirocyclic groups.
  • heterocyclic groups described in various embodiments herein include, but are not limited to: pyrrolidinyl, morpholinyl, piperazinyl, homopiperazinyl, piperidinyl, thiomorpholinyl, azetidinyl , oxetanyl, thietanyl, thiolanyl, pyranyl, tetrahydropyranyl, thiopyranyl, tetrahydrofuranyl, oxazinyl, dioxolyl, tetrahydropyranyl Hydroisoquinolinyl, decahydroisoquinolinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, quinazinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, isoxazolidinyl, indolinyl, octahydroindole base, octahydroisoindolyl,
  • aryl means having 6 to 18 carbon atoms (preferably having 6 to 14 carbon atoms, more preferably having 6 to 10 carbon atoms, For example 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms) conjugated hydrocarbon ring system groups.
  • aryl can be a monocyclic, bicyclic, tricyclic or multicyclic ring system and can also be fused to a cycloalkyl or heterocyclyl as defined above, provided that the aryl is via The atoms on the aromatic ring are connected to the rest of the molecule by single bonds.
  • aryl groups described in various embodiments herein include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, anthracenyl, phenanthrenyl, fluorenyl, 2,3-dihydro-1H-isoindolyl, 2-benzoxazole Linone, 2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-on-7-yl, etc.
  • heteroaryl as a group or part of another group, means having 1 to 15 carbon atoms (preferably 1 to 10 carbon atoms, eg 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms) and 1 to 6 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur are 5- to 16-membered conjugated ring groups.
  • heteroaryl may be a monocyclic, bicyclic, tricyclic or multicyclic ring system, and may be fused to a cycloalkyl or heterocyclyl as defined above, provided that hetero An aryl group is connected to the rest of the molecule by a single bond through an atom on the aromatic ring.
  • a nitrogen, carbon or sulfur atom in a heteroaryl can be optionally oxidized; the nitrogen atom can be optionally quaternized.
  • heteroaryl is preferably a stable 5- to 12-membered aromatic group containing 1 to 5 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur, more preferably 1 to 4 heteroatoms selected from A stable 5- to 10-membered aromatic group of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur or a 5- to 6-membered aromatic group containing 1 to 3 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur.
  • heteroaryl groups described in various embodiments herein include, but are not limited to, thienyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, isoxazolyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrimidinyl, Azinyl, pyridazinyl, benzimidazolyl, benzopyrazolyl, indolyl, furyl, pyrrolyl, triazolyl, tetrazolyl, triazinyl, indolyl, isoindolyl, indolyl Azolyl, isoindazolyl, purinyl, quinolinyl, isoquinolyl, naphthyl, naphthyridinyl, quinoxalinyl, quinoxalinyl, pteridinyl, carbazolyl, carbolinyl , phenanthridinyl
  • heteroarylalkyl refers to an alkyl group as defined above substituted by a heteroaryl group as defined above.
  • the substituents may be selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, halo, haloalkyl, haloalkenyl, haloalkynyl, alkoxy, cyano, hydroxy, amino, mono One or more of alkylamino, dialkylamino, nitro, aryl, heteroaryl, cycloalkyl and heterocyclyl; these groups as substituents include alkyl, alkenyl, alkynyl, Alkyl in haloalkyl, alkenyl in haloalkenyl, alkynyl in haloalkynyl, alkoxy, alkyl in monoalkylamino, alkyl in dialkylamino, aryl, Heteroaryl, cycloalkyl and heterocyclyl, optionally also selected from the group consisting of alkyl, halogen, haloalkyl, alkoxy, hydroxy, amino,
  • the number of substituents can be 1 or more, that is, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 or more, depending on the group to be substituted and the nature of the substituent.
  • the substituent when the substituent is halogen, according to the structure of the substituted group, the group can be substituted by 1-6 substituents, such as trifluoromethyl, pentafluoroethyl, etc.; when the substituent is aryl, In the case of a heteroaryl group, a heterocyclic group, a cycloalkyl group, a cyano group, a sulfone group, etc., the number of substituents is usually one.
  • the functional groups of intermediate compounds may need to be protected by appropriate protecting groups.
  • Such functional groups include hydroxyl, amino, mercapto and carboxylic acid.
  • Suitable hydroxy protecting groups include trialkylsilyl or diarylalkylsilyl groups (eg tert-butyldimethylsilyl, tert-butyldiphenylsilyl or trimethylsilyl) , tetrahydropyranyl, benzyl, etc.
  • Suitable protecting groups for amino, amidino and guanidino include tert-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and the like.
  • Suitable protecting groups for mercapto include -C(O)-R (wherein R is alkyl, aryl or aralkyl), p-methoxybenzyl, trityl and the like.
  • Suitable carboxy protecting groups include alkyl, aryl or aralkyl esters.
  • Protecting groups can be introduced and removed according to standard techniques known to those skilled in the art and as described herein. The use of protecting groups is described in detail in Greene, T.W. and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organi Synthesis, (1999), 4th Ed., Wiley.
  • the protecting group can also be a polymeric resin.
  • Unmodified uridine (U) will strongly induce the immunogenicity of the cell itself through the TLR system, resulting in the degradation of mRNA synthesized in vitro, making the mRNA unable to express the target protein normally.
  • uridine (U) in mRNA with pseudouridine (Pseudo-U) or N1-methylpseudo-U (N1-Me-Pseudo-U)
  • Pseudo-U pseudouridine
  • N1-Me-Pseudo-U N1-methylpseudo-U
  • the N1 position of pseudouridine is further modified, and a series of innovative artificial nucleotides are prepared, which do not affect the Watson-Crick pairing principle.
  • it can be recognized by T7 polymerase and successfully achieve in vitro transcription of mRNA (as shown in Figure 5).
  • the present invention provides N1 modified pseudouridines, their nucleotides and their application in mRNA synthesis.
  • the present invention finds that by adopting the method of the present invention, it is possible to easily synthesize N1-position modified pseudouridine in a very simple manner, reduce the autoimmunogenicity of mRNA containing the pseudouridine nucleotide, and improve the self-stability of mRNA , to enhance the expression time and efficiency of mRNA in target cells.
  • R is selected from H, cyano, optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C2-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted C1-C6 alkane Thio, optionally substituted C3-C8 cycloalkyl, optionally substituted 4-9 membered heterocyclyl and optionally substituted 5-10 membered heteroaryl;
  • R2 and R3 are independently hydroxyl or C1- C6 acyl;
  • R 4 is an optionally substituted C1-C4 alkyl;
  • X and Y are each independently O or S.
  • X and Y are both O or both S. In some embodiments, both X and Y are O.
  • the C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl and C1-C6 alkylthio are optionally selected from 1-3 Substituents of C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclic groups and C-COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1- C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2-C6 alkenyl, or R a and R b together with the N they are connected to form a 4-9 membered heterocyclic group, R 5 is C1- C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 cycloalkyl group, 4-9 membered heterocyclic group and 5-10 membered heteroaryl group are each optionally replaced by 1-3 members selected from halogen, hydroxyl, C1-C4 alkyl and halogenated C1-C4 Alkyl substituents are substituted, preferably with 1-3 substituents selected from halogen and C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 alkyl is a C3-C6 alkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclyl is optionally substituted, such as optionally substituted with 1-3 C1-C4 alkyl groups.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, preferably including azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetidine group, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothienyl, piperazinyl, piperidinyl, N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • nitrogen and/or oxygen preferably including azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetidine group, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothienyl, piperazinyl, piperidinyl, N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 5-10 membered heteroaryl group includes pyrrolyl, thienyl, furyl, pyridyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, pyridazinyl and pyrimidinyl, etc., preferably nitrogen-containing heteroaryl , preferably, the substitutable nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • said R 1 is optionally selected from 1-3 members selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclyl and The C1-C6 alkyl substituted by the substituent of C-COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 aldehyde substituted C1-C4 alkyl, and C2- C6 alkenyl, or R a and R b form a 4-9 membered heterocyclic group together with the N they are connected to, R 5 is C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", Wherein, R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl. In some other embodiments of the compound of formula I, said R 1 is C3-C6 cycloalkyl, 4-9 membered
  • R2 and R3 are each independently OH or acetyl.
  • R2 and R3 are the same group.
  • R 4 is hydroxyl or C1-C6 acyl substituted C1-C4 alkyl. In some embodiments, R 4 is C1-C4 alkyl substituted with OH or -O-acetyl.
  • both R2 and R3 are hydroxyl, and R4 is C1-C4 alkyl substituted by hydroxyl.
  • both R2 and R3 are acetyl, and R4 is C1-C4 alkyl substituted by acetyl.
  • Compounds of formula I may be precursor compounds of compounds of formula II according to the invention.
  • the compound of formula II of the present invention has the following structure:
  • R is selected from H, cyano, optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C2-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted C1-C6 alkane Thio, optionally substituted C3-C8 cycloalkyl, optionally substituted 4-9 membered heterocyclyl and optionally substituted 5-10 membered heteroaryl;
  • R 2 and R 3 are hydroxyl;
  • X and Y are each independently O or S;
  • R 6 is:
  • X and Y are both O or both S. In some embodiments, both X and Y are O.
  • the C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl and C1-C6 alkylthio are optionally selected from 1-3 Substituents of C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclic groups and C-COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1- C4 alkyl, C1-C4 acyl substituted C1-C4 alkyl, and C2-C6 alkenyl, or R a and R b together with the N they are connected to form a 4-9 membered heterocyclic group, R 5 is C1- C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", wherein R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 cycloalkyl group, 4-9 membered heterocyclic group and 5-10 membered heteroaryl group are each optionally replaced by 1-3 members selected from halogen, hydroxyl, C1-C4 alkyl and halogenated C1-C4 Alkyl substituents are substituted, preferably with 1-3 substituents selected from halogen and C1-C4 alkyl.
  • the C3-C8 alkyl is a C3-C6 alkyl.
  • the 4-9 membered heterocyclyl is optionally substituted, such as optionally substituted with 1-3 C1-C4 alkyl groups.
  • the 4-9 membered heterocyclic group is a heterocyclic group containing nitrogen and/or oxygen, preferably including azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetane group, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothienyl, piperazinyl, piperidinyl, N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • nitrogen and/or oxygen preferably including azetidinyl, N-methylazetidinyl, oxetane group, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothienyl, piperazinyl, piperidinyl, N-methylpiperidinyl, tetrahydropyranyl, oxepanyl and azepanyl.
  • the 5-10 membered heteroaryl group includes pyrrolyl, thienyl, furyl, pyridyl, pyrazolyl, imidazolyl, thiazolyl, pyridazinyl and pyrimidinyl, etc., preferably nitrogen-containing heteroaryl , preferably, the substitutable nitrogen atom in the ring is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • the R 1 is optionally selected from 1-3 members selected from C1-C4 alkoxy, hydroxyl, -NR a R b , cyano, 4-9 membered heterocyclyl and The C1-C6 alkyl substituted by the substituent of C-COR 5 , wherein, R a and R b are each independently selected from H, C1-C4 alkyl, C1-C4 aldehyde substituted C1-C4 alkyl, and C2- C6 alkenyl, or R a and R b form a 4-9 membered heterocyclic group together with the N they are connected to, R 5 is C1-C4 alkyl, OH, C1-C4 alkoxy and -NR'R", Wherein, R' and R" are each independently H or C1-C4 alkyl. In some other embodiments of the compound of formula II, the R 1 is C3-C6 cycloalkyl, 4-9 membered
  • the present invention also includes pharmaceutically acceptable salts, enantiomers, diastereomers, tautomers, solvates, isotope substitutions, polymorphs, prodrugs or metabolites.
  • stereoisomer refers to a compound composed of the same atoms bonded by the same bond, but having a different three-dimensional structure.
  • the present invention will encompass each stereoisomer and mixtures thereof.
  • the stereoisomer of the compound of formula I of the present invention has the structure shown in the following formula I':
  • the stereoisomer of the compound of formula II of the present invention has the structure shown in the following formula II':
  • X, Y, R 1 -R 3 and R 6 are as described in any embodiment of formula II.
  • Tautomer refers to isomers formed by the transfer of a proton from one atom of a molecule to another atom of the same molecule. All tautomeric forms of the compounds of the invention are also intended to be within the scope of the invention.
  • the compounds of the present invention may contain one or more chiral carbon atoms, and thus may give rise to enantiomers, diastereoisomers and other stereoisomeric forms.
  • Each chiral carbon atom can be defined as (R)- or (S)- based on stereochemistry.
  • the present invention is intended to include all possible isomers, as well as their racemates and optically pure forms.
  • pharmaceutically acceptable salt includes pharmaceutically acceptable acid addition salts and pharmaceutically acceptable base addition salts.
  • pharmaceutically acceptable acid addition salt refers to a salt formed with an inorganic or organic acid that retains the biological effectiveness of the free base without other side effects.
  • Inorganic acid salts include but not limited to hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate, etc.; organic acid salts include but not limited to formate, acetate, 2,2-dichloroacetate , Trifluoroacetate, Propionate, Caproate, Caprylate, Caprate, Undecylenate, Glycolate, Gluconate, Lactate, Sebacate, Hexanoate glutarate, malonate, oxalate, maleate, succinate, fumarate, tartrate, citrate, palmitate, stearate, oleate , cinnamate, laurate, malate, glutamate, pyroglutamate, aspartate, benzoate, mesylate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate , alginate, ascorbate, salicylate, 4-amino salicylate, naphthalene disulfon
  • “Pharmaceutically acceptable base addition salt” refers to a salt formed with an inorganic base or an organic base that can maintain the biological effectiveness of the free acid without other side effects.
  • Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum, and the like.
  • Preferred inorganic salts are ammonium, sodium, potassium, calcium and magnesium salts.
  • Salts derived from organic bases include, but are not limited to, those of primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines, including natural substituted amines, cyclic amines, and basic ion exchange resins , such as ammonia, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dimethylethanolamine, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, bicyclic Hexylamine, Lysine, Arginine, Histidine, Caffeine, Procaine, Choline, Betaine, Ethylenediamine, Glucosamine, Methylglucamine, Theobromine, Purine, Piperazine, Piperazine Pyridine, N-ethylpiperidine, polyamine resin, etc.
  • Preferred organic bases include isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine,
  • the present invention provides an isolated polynucleotide molecule encoding a polypeptide, said isolated polynucleotide molecule comprising an open reading frame encoding said polypeptide, said open reading frame comprising an adenosine mononucleotide (AMP ), guanylic acid (GMP), cytidylic acid (CMP) and modified pseudouracil derivatives; wherein, the structure of the modified pseudouracil derivatives is shown in formula II.
  • AMP adenosine mononucleotide
  • GMP guanylic acid
  • CMP cytidylic acid
  • polypeptide may be a polypeptide that is expected to be expressed in a subject to exert a biological function of interest.
  • a polypeptide may be a prophylactic polypeptide, or a therapeutic polypeptide, or a polypeptide whose expression elicits an immune response in a subject such that the subject develops antibodies against the polypeptide.
  • the polypeptide is an antigenic peptide, which may be derived from a virus or bacterium, and its coding sequence can trigger humoral immunity and/or cellular immunity against the virus or bacterium in the subject after being expressed in the subject.
  • humoral immunity is the B cell effector and memory cells produced by B cells in the body tissues after the body is stimulated by antigens, thereby producing antibodies
  • cellular immunity is the generation of T cells by T cells in the body after the body is stimulated by antigens Memory and T cell effectors, which produce cytokines.
  • the "polypeptide” has the effect of treating diseases in the human body, including treating various tumors or cancers.
  • Subjects or subjects described herein include mammals, especially humans.
  • the isolated polynucleotide molecule further includes one or more of a 5'UTR, a 3'UTR, and a 5'cap structure.
  • the 5'cap structure is selected from: Cap0, Cap1, ARCA, inosine, N1-methyl-guanosine, 2-'fluoro-guanosine, 7-deaza-guanosine, 8-oxo- Guanosine, 2-amino-guanosine, LNA-guanosine and 2-azido-guanosine.
  • a nucleic acid molecule of interest can be synthesized using the compound represented by formula II of the present invention and other nucleotides by methods well known in the art.
  • the DNA template containing the compound of formula II of the present invention, RNase inhibitor, inorganic pyrophosphatase, RNA polymerase, reaction solution and polypeptide of interest is incubated at about 37° C. for a period of time, and then Add DNase, continue to incubate for a period of time, complete transcription, separate and purify to obtain the nucleic acid molecule of interest.
  • nucleic acid molecules comprising compounds of formula II of the invention are capped using enzymatic capping.
  • the capping reaction usually uses a capping buffer, a capping enzyme, and a cap structure to be capped.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an isolated polynucleotide molecule described herein and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • pharmaceutically acceptable carriers or excipients include diluents, adjuvants or vehicles, including but not limited to water, animal oil, vegetable oil, starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, sodium stearate, monostearate Glycerides, Sodium Chloride, Skimmed Milk Powder, Glycerin, Propylene, Propylene Glycol, Water, Ethanol, etc.
  • the composition if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solution, suspension and the like.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared into a suitable dosage form according to the specific administration mode and administration route.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a vaccine, such as an RNA vaccine, comprising the isolated polynucleotide molecule described herein and a carrier commonly used in the field of RNA vaccines, including adjuvants.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a cationic liposome.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a lipid nanoparticle.
  • a therapeutically or prophylactically effective amount of the isolated polynucleotide molecule is contained in the pharmaceutical composition. Effective amounts can be determined by those skilled in the art based on factors such as the subject's age, sex, weight, condition, general health, and previous medical history.
  • the invention also provides a method of increasing the level of a polypeptide of interest in a mammalian subject, said method comprising administering to said subject an isolated polynucleotide molecule of the invention, or an isolated polynucleotide molecule comprising the same pharmaceutical composition.
  • polynucleotide molecules described herein, or pharmaceutical compositions thereof can be administered using methods well known in the art.
  • suitable administration methods and administration routes are well known in the art, and suitable administration routes include intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, spinal or other parenteral administration routes, such as via injection or perfusion.
  • Parenteral administration is a mode of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, but is not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intrathecal, intraorbital, intracardiac, dermal Intra-, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcutaneous, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural, and intrasternal injection and infusion.
  • Actual dosage levels of the polynucleotide molecule or its presence in pharmaceutical compositions may be varied to obtain an amount of the active ingredient effective to achieve the desired therapeutic response for the particular patient, composition, and mode of administration, and for the patient.
  • the selected dosage level will depend on a variety of pharmacokinetic factors, including the activity of the polypeptide used in the invention, the route of administration, the time of administration, the duration of treatment, other drugs, compounds and/or compounds used in combination with the particular composition used. or substance, age, sex, weight, condition, general health and prior medical history of the patient being treated, and similar factors well known in the medical field.
  • the present invention also provides the application of the compound represented by formula II in the preparation of isolated polynucleotide molecules, in reducing RNA autoimmunogenicity, improving RNA self-stability, and enhancing the expression time and expression efficiency of RNA in target cells , or in the preparation of preparations for preparing RNAs with reduced autoimmunogenicity, improved self-stability, prolonged expression time in target cells, and/or improved expression efficiency in target cells.
  • the present invention also provides a method for preparing RNA to reduce the autoimmunogenicity of the RNA, improve the stability of the RNA itself, and/or enhance the expression time and expression efficiency of the RNA in the target cell, the method includes using the Compound steps for preparing the RNA.
  • the method may include: incubating a DNA template reaction system containing a compound of formula II of the present invention, an RNase inhibitor, an inorganic pyrophosphatase, an RNA polymerase, a reaction solution, and a polypeptide of interest, adding DNase after the reaction, and continuing to incubate for a period of time. time until the transcription is completed, and then the RNA is isolated and purified.
  • RNA described herein is preferably mRNA.
  • the OH on compound 1 is protected with a suitable protecting group G.
  • the protecting group G is a C1-C4 acyl group, such as acetyl.
  • compound 2 can be reacted with R 1 -L under basic conditions to generate compound 3, wherein L is a well-known leaving group in the art, such as halogen, -OTf and the like.
  • L is a well-known leaving group in the art, such as halogen, -OTf and the like.
  • Compound 3 is then deprotected to yield compound of Formula Ia.
  • the compound of formula Ia is converted into the compound of formula IIa through triphosphorylation, and the triphosphorylation can be carried out by Yoshikawa method or Ludwig-Eckstein method well known in the art.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran -3,4-diyl diacetate
  • Pseudouridine (9.5 g, 38.9 mmol, purchased from Tokyo Chemical Industry, Cat. No. P2396) was dissolved in pyridine (150 ml). Acetic anhydride (35.7 g, 350 mmol) was slowly added dropwise to the reaction solution. After the addition was complete, the reaction was stirred for an additional 3 hours. The reaction solution was directly spin-dried. The crude product was dissolved in dichloromethane solution, and then KHCO 3 aqueous solution was added to adjust the pH to weak alkaline. The mixture was separated.
  • the fifth step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-cyclopropyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3, 4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • Tributylammonium pyrophosphate (8.1g, 8.8mmol), tributylamine (3.9g, 21.1mmol) and acetonitrile (15ml) were added to the reaction solution, and stirred for 10 minutes.
  • the reaction solution was slowly poured into 500ml of water, and the pH was adjusted to 6.5.
  • the crude product was concentrated and purified to give ((2R,3S,4R,5S)-5-(1-cyclopropyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)- 3,4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrotriphosphoric acid.
  • the product was purified by DEAE anion column chromatography and ion exchanged to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS1.
  • the first step 2,2-difluorocyclopropyl trifluoromethanesulfonate
  • the fourth step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-(2,2-difluorocyclopropyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine -5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclobutyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine -5-yl) tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate
  • tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate is the third step of raw material reference example 1 to obtain (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclobutane yl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyldiacetate.
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-cyclobutyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3, 4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(3-cyclobutoxy)-2,4-dioxy-1,2, 3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(3-cyclobutoxy)pyrimidine- 2,4(1H,3H)-dione
  • Tributylammonium pyrophosphate (8.1g, 8.8mmol), tributylamine (3.9g, 21.1mmol) and acetonitrile (15ml) were added to the reaction solution, and stirred for 10 minutes.
  • the reaction solution was slowly poured into 500ml of water, and the pH was adjusted to 6.5.
  • the crude product was concentrated and purified to give (2R,3S,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(3-cyclobutoxy)-2,4-dioxy-1,2,3 , 4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-2-ylmethyl triphosphate.
  • the product was purified by DEAE anion column chromatography and ion exchanged to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS4.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(azetidin-3-yl)-2,4-dioxy-1 , 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(1-methylazetidin-3-yl)-2,4-di Oxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(1-methylazetidine -3-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(1-methylazetidin-3-yl)-2,4-dioxy -1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl sodium hydrogen triphosphate
  • the first step 2,2-difluorocyclobutyl trifluoromethanesulfonate
  • the fourth step ((2R,3S,4R,5S)-5-(1-(2,2-difluorocyclobutyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine -5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R,3R,4S,5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclopentyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine -5-yl) tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate
  • tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate is the third step of reference example 1 to obtain (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclopentyl) yl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyldiacetate.
  • the third step ((2R,3S,4R,5S)-5-(1-cyclopentyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3, 4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R,3R,4S,5S)-2-(acetylmethyl)-5-(dioxo-1-(tetrahydrofuran-3-yl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine- 5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)1-(tetrahydrofuran-3-yl)pyrimidine-2, 4(1H,3H)-Diketone
  • tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate is the fourth step of reference example 1 to obtain 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxyl-5-(hydroxymethyl )tetrahydrofuran-2-yl)1-(tetrahydrofuran-3-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione.
  • the third step ((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-dioxo-1-(tetrahydrofuran-3-yl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl) -3,4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • Tetrahydrothiophen-3-yl trifluoromethanesulfonic acid was obtained by referring to the second step of Example 1 using tetrahydrothiophen-3-ol as a raw material.
  • the third step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(tetrahydrothiophen-3-yl)pyrimidine -2,4(1H,3H)-dione
  • the fourth step ((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-dioxo-1-(tetrahydrothiophen-3-yl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5 -yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)tetrahydromethyl triphosphate
  • the first step (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-dioxo-1-(pyrrolidin-3-yl)-1,2,3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(pyrrolidin-3-yl)pyrimidine- 2,4(1H,3H)-Diketone
  • the third step ((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-dioxo-1-(pyrrolidin-3-yl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5- base)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrogen triphosphate
  • the first step (2S, 3S, 4R, 5R)-2-(1-(1H-imidazol-2-yl)-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5 -yl)-5-(acetoxymethyl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-(1H-imidazol-2-yl)-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine- 5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrofuran triphosphate
  • the first step (2R,3R,4S,5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(1-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2,4-dioxo yl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(1-methyl-1H-imidazole- 2-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione
  • (2R,3R,4S,5S)-2-(Acetoxymethyl)-5-(1-(1-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2,4-dioxy-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate (1g, 2.22mmol) was added to 15ml of 7M ammonia methanol solution, stirred for 4 hours, then spin-dried and purified by column.
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(1-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2,4-dioxy- 1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl hydrogen triphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclohexyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine- 5-yl) tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate
  • tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate is the third step of raw material reference example 1 to obtain (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-cyclopenta yl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyldiacetate.
  • the second step 1-cyclohexyl-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)pyrimidine-2,4(1H, 3H)-Diketone
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-cyclohexyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3,4 -Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-dioxo-1-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-1 , 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(2,4-dioxo-1-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-1,2,3,4-tetra Hydropyrimidin-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(1-(tert-butoxycarbonyl)piperidin-4-yl)-2,4 -Dioxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester
  • (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(1-(tert-butoxycarbonyl)piperidin-4-yl)-2,4-dioxo -1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester is the second step of raw material reference example 5 to obtain (2S, 3R, 4S, 5R)-2-(acetyl Oxymethyl)-5-(2,4-dioxo-1-(piperidin-4-yl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-di Acetate diester.
  • the third step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(piperidin-4-yl)pyrimidine- 2,4(1H,3H)-dione
  • (2S, 3R, 4S, 5R)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-dioxo-1-(piperidin-4-yl)-1,2,3,4- Tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester is the third step of raw material reference example 5 to obtain 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-( Hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(piperidin-4-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione.
  • the fourth step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(2,4-dioxo-1-(piperidin-4-yl)-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5- base)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl trihydrogen tetraphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(1-(1-methylpiperidin-4-yl)-2,4-dioxo-1,2 ,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(1-methylpiperidin-4-yl)-2,4-dioxo-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-methoxyethyl)-2,4-dione-1,2, 3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • Tributylammonium pyrophosphate (8.1g, 8.8mmol), tributylamine (3.9g, 21.1mmol) and acetonitrile (15ml) were added to the reaction solution, and stirred for 10 minutes.
  • the reaction solution was slowly poured into 500ml of water, and the pH was adjusted to 6.5.
  • the crude product was concentrated and purified to give (2R,3S,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(2-methoxyethyl)-2,4-dione-1,2,3, 4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrotriphosphoric acid.
  • the product was purified by DEAE anion column chromatography and ion exchanged to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS18.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-hydroxyethyl)-2,4-dione-1,2,3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(2-hydroxyethyl)pyrimidine-2 , 4(1H,3H)-diketone
  • (2R,3R,4S,5S)-2-(Acetoxymethyl)-5-(1-(2-Hydroxyethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydro Pyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate (2g, 4.83mmol) was added to 20ml of 7M ammonia methanol solution, stirred for 4 hours, then spin-dried and purified by column.
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(2-hydroxyethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetra hydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl)tetrahydrotriphosphoric acid
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-(methylamino)ethyl)-2,4-dione-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(2-(methylamino)ethyl) Pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(2-(methylamino)ethyl)-2,4-dione-1,2,3 , 4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl)tetrahydrotriphosphoric acid
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-(dimethylamino)ethyl)-2,4-dione-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-(2-(dimethylamino)ethyl) -2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl)tetrahydrotriphosphoric acid
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-bromoethyl)-2,4-dione-1,2,3, 4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • Azetidine hydrochloride (705.68mg, 7.54mmol) was dissolved in 100ml of anhydrous acetonitrile, cesium carbonate (2.46g, 7.54mmol) was added and stirred for 5min, then slowly added (2R, 3R, 4S,5S)-2-(Acetoxymethyl)-5-(1-(2-bromoethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl ) tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester (4g, 8.38mmol), followed by stirring at room temperature for 3 hours.
  • reaction solution was filtered, spin-dried, and purified by column chromatography to obtain (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-(azetidine-1 -yl)ethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate diester.
  • the third step 1-(2-(azetidin-1-yl)ethyl)-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl ) Tetrahydrofuran-2-yl) pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione
  • the first step ((2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-dithio-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5- base) tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(2,4-dithio-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran -2-yl) methyl tetrahydrofuran triphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetylmethyl)-5-(2,4-diketone-1-(prop-2-yn-1-yl)-1,2 ,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(prop-2-yn-1-yl ) pyridine-2,4(1H,3H)-dione
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-dioxy-1-(1,2,2-trichloroethenyl)- 1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the third step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-ethynylpyrimidine-2,4(1H, 3H)-Diketone
  • the fourth step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-ethynyl-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3, 4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrofuran triphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(methylthio)-2,4-dioxy-1,2,3,4 -tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(methylthio)pyrimidine-2,4 (1H,3H)-Diketone
  • the fourth step ((2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(methylthio)-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetra Hydrogen pyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl sodium hydrogen triphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetyl hydroxymethyl)-5-(1-(3-methylbut-2-en-1-yl)-2,4-dione -1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-cyano-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetrahydro Pyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dioxy-3,4- Dihydropyrimidine-1(2H)-carbonitrile
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-ethynyl-2,4-dioxy-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)-3, 4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrofuran triphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(ketonemethyl)-5-(1-(nitrilemethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydro Pyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3, 4-Dihydropyridin-1(2H)-yl)acetonitrile
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-((methylamino)methyl)-2,4-dione-1,2,3 ,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-((methylamino)methyl)pyridine- 2,4(1H,3H)-dione
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-diketone-1-(2-carbonylpropyl)-1,2,3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(2-carbonylpropyl)pyrimidine-2 , 4(1H,3H)-diketone
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(2,4-diketone-1-(2-acetonyl)-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl) -3,4-Dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step 2-(5-((2S,3S,4R,5R)-3,4-diacetoxy-5-(acetoxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-di Keto-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)acetic acid
  • the second step 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3, 4-Dihydropyrimidin-1(2H)-yl)acetic acid
  • the third step 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(((tetrahydrotriphosphate)methyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4 -Diketo-3,4-dihydroxypyridin-1(2H)-yl)acetic acid
  • 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3,4-dihydro Pyrimidin-1 (2H)-yl) acetic acid is that raw material reference example 18 third step makes 2-(5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxyl-5-(((four hydrogen triphosphate)methyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3,4-dihydroxypyridin-1(2H)-yl)acetic acid, ion exchange to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS32.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxy)-5-(1-(2-methoxy-2-ketoethyl)-2,4-dione-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step methyl 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione- 3,4-Dihydropyrimidin-1(2H)-yl)acetate
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(2-methoxy-2-ketoethyl)-2,4-dione-1,2 , 3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrophosphoric acid
  • Methyl 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3,4- Dihydropyrimidin-1(2H)-yl) acetate is the third step of (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(2- Methoxy-2-ketoethyl)-2,4-diketone-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrogenphosphoric acid, ion exchange, to obtain Its sodium salt, hereinafter referred to as LS33.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-((ethylamino)methyl)-2,4-dione-1,2,3 ,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-((ethylamino)methylpyridine-2 , 4(1H,3H)-diketone
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-((aminoethyl)methyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydropyridine-5- base)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrogenphosphoric acid
  • 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-((ethylamino)methylpyridine-2,4(1H , 3H)-diketone is the third step of raw material reference example 18 to prepare (2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-((aminoethyl)methyl)-2,4-diketone-1 , 2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrophosphoric acid, ion exchange, to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS34.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(2,4-diketone-1-(((2-ketoethyl)amino)methyl) -1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(((2-acetonyl)ammonia) Methyl)pyridine-2,4(1H,3H)-dione
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(2,4-diketone-1-(((2-acetonyl)amino)methyl)-1,2,3,4-tetra Hydropyridine-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-((benzylamino)methyl)-2,4-dione-1,2,3 ,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diethyl ester
  • the third step 1-(aminomethyl)-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)pyridine-2,4 (1H,3H)-Diketone
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl ester)-5-(1-(1-hydroxy-2-methoxy-2-oxyethyl)-2,4 -Diketo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step methyl 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione- 3,4-Dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-2-hydroxyacetic acid
  • Methyl 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3,4- Dihydropyrimidin-1(2H)-yl) acetate is the third step of (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(1- Hydroxy-2-methoxy-2-one ethyl)-2,4-dione-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate , ion exchange to obtain its sodium salt, hereinafter referred to as LS37.
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(2-amino-1-hydroxyl-2-ketoethyl)-2,4-di Keto-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 2-(5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-2,4-dione-3, 4-Dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-2-hydroxyacetamide
  • the third step ((2R, 3S, 4R, 5S)-5-(1-(2-amino-1-hydroxy-2-ketone ethyl)-2,4-dione-1,2,3,4 -tetrahydropyridin-5-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl tetrahydrotriphosphate
  • the first step (2R, 3R, 4S, 5S)-2-(acetoxymethyl)-5-(1-(((3-methylbut-2-en-1-yl)amino)methyl )-2,4-diketone-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-3,4-diacetate
  • the second step 5-((2S, 3R, 4S, 5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1-(((3-methylbutan-2 -en-1-yl)amino)methyl)pyridine-2,4(1H,3H)-dione
  • the third step (2R, 3S, 4R, 5S)-3,4-dihydroxy-5-(1-(((3-methylbut-2-en-1-yl)amino)methyl)-2 , 4-diketone-1,2,3,4-tetrahydropyridin-5-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyltetrahydrotriphosphoric acid
  • Embodiment 40 Transcription experiment of EGFP mRNA
  • Compound LS1 in Example 1 was formulated as a 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 using NaOH (1M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS1 was shown in Figure 1 (the yield was 7.09 mg/mL).
  • Compound LS4 in Example 4 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS4 was shown in Figure 1 (the yield was 2.54 mg/mL).
  • Compound LS18 in Example 18 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS18 was shown in Figure 1 (the yield was 1.59 mg/mL).
  • the compound LS21 in Example 21 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS21 was shown in Figure 1 (the yield was 0.85 mg/mL).
  • the compound LS24 in Example 24 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS24 was shown in Figure 1 (the yield was 7.35 mg/mL).
  • Example 27 The compound LS27 in Example 27 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS27 was shown in Figure 1 (the yield was 3.44 mg/mL).
  • Example 29 The compound LS29 in Example 29 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS29 was shown in Figure 1 (the yield was 1.23 mg/mL).
  • the compound LS31 in Example 31 was formulated into 100 mM aqueous solution and the pH was adjusted to 8.0-8.5 with NaOH (1 M).
  • reaction solution 400 mM Tris-HCl, 60 mM MgCl 2 , 20 mM Spermidine, 100 mM DTT, pH 7.9 2 ⁇ L.
  • Add 1 ⁇ g of EGFP DNA template (purchased from Jinweizhi) to 20 ⁇ L with ultrapure water. After incubating at 37°C for 2 hours, add 1 ⁇ L of DNase, and continue to incubate at 37°C for 6 hours.
  • the completed transcription product is precipitated with 2.5M lithium chloride or purified with a DEAE cellulose column. After the product was purified, it was detected by electrophoresis on 1% agarose gel, and the result of LS31 was shown in Figure 1 (the yield was 2.12 mg/mL).
  • the EGFP mRNA sample was heated to 65°C for 5 minutes, then quickly transferred to ice and cooled to 0°C, then added 10 ⁇ Capping Buffer, 10mM GTP, 2mM S-Adenosylmethionine, 10U/ ⁇ L vaccinia capping enzyme and incubated at 37°C for 30min.
  • the capped EGFP mRNA was purified using a DEAE cellulose column. And use LabChip GXII Touch HT (PerkinElmer) to test the purity of EGFP mRNA, the results of LS1-LS3 are shown in Figure 2-4.
  • the purified EGFP mRNA was stored at -80°C.
  • Example 41 Using EGFP mRNA with different modified nucleotides to transfect target cells and detecting the positive rate of target cells and the expression efficiency of fluorescent proteins
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells, purchased from Miaoshun Biotechnology Co., Ltd.
  • 1 ⁇ 107 cells were divided into 1.5mL centrifuge tubes, and electroporation solution and EGFP mRNA sample mixture were added. Shock after mixing well. After the completion of electroporation, the cell suspension was added to AIM-V medium containing 2% FBS and cultured at 37°C and 5% CO 2 .
  • PBMC cells were transferred out of the antibody-coated plate, and fresh AIM-V medium (Gibco) containing 2% FBS was added, and IL-2 antibody was added to a concentration of 200 U/mL.
  • AIM-V medium Gibco
  • IL-2 antibody was added to a concentration of 200 U/mL.
  • Cell samples were collected 1 day and 14 days after electroporation, and flow cytometry was used to detect the positive rate of PBMC cells and the expression efficiency of EGFP mRNA. The results showed that EGFP mRNA of LS1-39 could transfect the target cells, and the expression efficiency was high.
  • the results show that the modified nucleotides can be integrated into the mRNA to replace uridine through in vitro transcription, enzymatic capping, and column purification methods, and the structural integrity and purity of the mRNA have been achieved, thus providing a basis for the preparation of medicinal mRNA more choices.

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Abstract

本发明提供N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA合成中的应用。具体而言，本发明的化合物包括下式I和式II所示的化合物，式中各基团的定义如文中所述。本发明的化合物可用于制备mRNA以降低该mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，和/或增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率。

Description

N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA合成中的应用 技术领域
本发明涉及N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA当中的应用。
背景技术
随着核酸药物的发展，mRNA被视为了一种可以用于药物制造的新选择。1990年，一段mRNA被注射进入小鼠体内，并成功编码出了蛋白质。这段mRNA则是通过一种名为体外转录的技术得到。随后，1992年的一项研究发现注射抗利尿激素的编码mRNA可以成功诱导大鼠的下丘脑的神经活动。虽然mRNA显示出很好的生物活性，但是受限于其自身的不稳定性，强免疫原性和体内递送困难，mRNA远远无法应用于临床疾病治疗中。
修饰核苷酸的加入，可以降低mRNA的自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，进一步增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率，使mRNA可以真正用于制药领域。其中Moderna和BioNTech分别采用1-甲基假尿苷(CN110511939A，CN104114572A，CN103974724A)和假尿苷(US10232055B2，US9597380B2，US9163213B2)，极大的降低了mRNA的免疫原性，并且提高了mRNA在靶细胞内表达目的蛋白的时间和总量，为mRNA制成COVID-19疫苗并成功上市奠定了基础。
发明内容
本发明通过设计并合成了多种N1位修饰的假尿嘧啶衍生物，并成功将其应用于mRNA的体外转录合成当中。
本发明第一方面提供下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体：
Figure PCTCN2023070774-appb-000001
式中，
R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；
R 2和R 3各自独立为羟基或C1-C6酰基；
R 4为任选取代的C1-C4烷基；
X和Y各自独立为O或S。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，式I所示的化合物如下式I’所示：
Figure PCTCN2023070774-appb-000002
式中，X、Y和R 1-R 4如式I任一实施方案所述。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 1中，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地包括氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。在一些实施方案中，所述4-9元杂环基任选地被取代，如任选地被1-3个C1-C4烷基取代。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 1中，所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代。优选地，所述C3-C8环烷基为C3-C6环烷基。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地，环中的氮原子被C1-C4烷基取代。所述4-9元杂环基优选地包括氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。优选地，所述5-10元杂芳基包括吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基等，优选为含氮杂芳基，优选地，环中的可 取代氮原子被C1-C4烷基取代。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。所述4-9元杂环基选自前文所述的杂环基。在一些实施方案中，所述4-9元杂环基任选地被取代，如任选地被1-3个C1-C4烷基取代。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为-(CH 2) nR 7，n为1至3的整数，R 7选自C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、C2-C6烯基(例如2-甲基丙-1-烯-1-基等)、C2-C6炔基(例如乙炔基等)、-NR aR b、、氰基、-COR 5，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者Ra和Rb与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5选自C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。所述4-9元杂环基选自前文所述的杂环基。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 2和R 3各自独立为OH或乙酰基。优选地，R 2和R 3为相同的基团。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 4为被羟基或C1-C6酰基取代的C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R 4为被-OH或-O-乙酰基取代的C1-C4烷基。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 2和R 3都为羟基，R 4为羟基取代的C1-C4烷基，优选为CH 2(OH)-。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，R 2和R 3都为乙酰基，R 4为乙酰基取代的C1-C4烷基，优选为CH 3COCH 2-。
在式I化合物的一个或多个实施方案中，所述式I化合物选自：
Figure PCTCN2023070774-appb-000003
Figure PCTCN2023070774-appb-000004
Figure PCTCN2023070774-appb-000005
Figure PCTCN2023070774-appb-000006
Figure PCTCN2023070774-appb-000007
本发明第二方面提供下式II所示的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体：
Figure PCTCN2023070774-appb-000008
式中，
R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；
R 2和R 3为羟基；
X和Y各自独立为O或S；
R 6为：
Figure PCTCN2023070774-appb-000009
在式II化合物的一个或多个实施方案中，式II所示的化合物如下式II’所示：
Figure PCTCN2023070774-appb-000010
式中，X、Y、R 1-R 3和R 6如式II任一实施方案所述。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，R 1中，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6 炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地包括氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。在一些实施方案中，所述4-9元杂环基任选地被取代，如任选地被1-3个C1-C4烷基取代。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，R 1中，所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代。优选地，所述C3-C8环烷基为C3-C6环烷基。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地，环中的氮原子被C1-C4烷基取代。优选地，所述4-9元杂环基包括氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。优选地，所述5-10元杂芳基包括吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基等，优选为含氮杂芳基，优选地，环中的可取代氮原子被C1-C4烷基取代。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为-(CH 2) nR 7，n为1至3的整数，R 7选自C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、C2-C6烯基(例如2-甲基丙-1-烯-1-基等)、C2-C6炔基(例如乙炔基等)、-NR aR b、、氰基、-COR 5，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者Ra和Rb与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5选自C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。所述4-9元杂环基选自前文所述的杂环基。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
在式II化合物的一个或多个实施方案中，所述式II化合物选自：
Figure PCTCN2023070774-appb-000011
Figure PCTCN2023070774-appb-000012
Figure PCTCN2023070774-appb-000013
Figure PCTCN2023070774-appb-000014
在一个或多个实施方案中，所述药学上可接受的盐为碱金属盐，优选钠盐或锂盐，更优选为钠盐。碱金属盐分子中，碱金属离子可为1-4个。例如，当所述盐为钠盐时，可以是一钠盐、二钠盐、三钠盐、和/或四钠盐。
本发明第三方面提供编码多肽的分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码所述多肽的开放阅读框，所述开放阅读框含有腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和修饰的假尿嘧啶衍生物；其中，所述修饰的假尿嘧啶衍生物的结构如式II所示。
在一个或多个实施方案中，所述分离的多核苷酸分子还包括5’UTR、3’UTR和5’帽结构中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述5’帽结构选自：Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2-′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
本发明第四方面提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明所述的分离的多核苷酸分子和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明第五方面提供一种增加哺乳动物受试者的目标多肽的水平的方法，所述方法包括对所述受试者施用本发明所述的分离的多核苷酸分子，或含该分离的多核苷酸分子的药物组合物。
本发明第六方面提供式II所示化合物在制备分离的多核苷酸分子中的应用。
本发明第七方面提供一种制备mRNA以降低该mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，和/或增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率的方法，该方法包括使用式II所示的化合物制备该mRNA的步骤。
本发明第八方面提供式II所示的化合物在降低mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率中的应用，或在制备用于制备自身免疫原性降低、自身稳定性提高、在目标细胞内的表达时间延长、和/或在目标细胞内的表达效率提高的mRNA的制剂中的应用。
附图说明
图1：LS1、LS4、LS18、LS21、LS24、LS27、LS29、LS31体外mRNA转录合成所得产物的1％琼脂糖凝胶检测结果。
图2：用LS1体外mRNA转录合成的EGFP mRNA加帽后的纯度检测结果。
图3：用LS2体外mRNA转录合成的EGFP mRNA加帽后的纯度检测结果。
图4：用LS3体外mRNA转录合成的EGFP mRNA加帽后的纯度检测结果。
图5：RNA/DNA helix计算机模型和化学结构。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本申请中引用的所有文献或文献部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、操作手册和论文，均通过引用方式整体并入本文。本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。
应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本申请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性，其可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”之义。
可在参考文献(包括Carey and Sundberg″ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4TH ED.″Vols.A(2000)and B(2001)，Plenum Press，New York)中找到对标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、NMR、IR和UV/VIS光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学的有关描述中采用的术语是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，以及对患者的治疗中使用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。
当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，-CH 2O-等同于-OCH 2-。
在本文中定义的某些化学基团前面通过简化符号来表示该基团中存在的碳原子总数。例如，C1-C6烷基是指具有总共1至6个碳原子的如下文所定义的烷基。简化符号中的碳原子总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。
除前述以外，当用于本申请的说明书及权利要求书中时，除非另外特别指明，否则以下术语具有如下所示的含义。
在本申请中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“羟基”指-OH基团。
“羟基烷基”指被羟基取代的如下文所定义的烷基；羟基可取代烷基最末端的一个C，也可取代烷基中间的一个或多个C。
“氰基”指-CN。
“氨基”指-NH 2。
“取代的氨基”可以表示为-NR’R’或-NR aR b，其中，所述R’和R”以及R a和R b如本文任一实施方案所定义。
“羧基”指-COOH。
“酰基”指-COR，该R可以是本文所定义的烷基。
“烷氧基”是指-OR，该R可以是本文所定义的烷基。
“烷硫基”是指-SR，该R可以是本文所定义的烷基。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“烷基”是指完全饱和的直链或支链的烃链基，仅由碳原子和氢原子组成、具有例如1至12个(如1至8个，1至6个或1至4个)碳原子，且通过单键与分子的其余部分连接，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、壬基和癸基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“烯基”意指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个双键、具有例如2至20个(例如2至10个，2至6个或2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团，包括但不限于乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、戊-1-烯基和戊-1，4-二烯基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“炔基”意指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个三键、具有例如2至20个(例如2至10个，2至6个或2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团，包括但不限于乙炔基、丙炔基等。
在本申请中，环烷基通常为C3-C8环烷基，如C3-C6环烷基。示例性的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂环基”意指由2至14个碳原子 (例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子)以及1至6个选自氮、磷、氧和硫的杂原子组成的稳定的3元至20元非芳香族环状基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，其可包括稠合环体系(也称为并环体系)、桥环体系或螺环体系；其杂环基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化；且杂环基可为部分或完全饱和。杂环基可以经由碳原子或者杂原子并通过单键与分子其余部分连接。在包含稠环的杂环基中，一个或多个环可以是下文所定义的芳基或杂芳基，条件是与分子其余部分的连接点为非芳香族环原子。就本发明的目的而言，杂环基优选为包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的4元至12元、5元至12元、或4元至9元非芳香性单环或并杂环(如双环)、6-12元桥杂环或6-12元螺杂环基团，更优选为包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至9元非芳香性单环、双环、桥杂环或螺在环基团。
本文各实施方案所述的杂环基的实例包括但不限于：吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、硫杂环戊烷基、吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、四氢呋喃基、噁嗪基、二氧环戊基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、吡唑烷基、邻苯二甲酰亚氨基、二氧代硫代吗啉、二氧代硫杂环戊烷基、二氧代硫杂环丁烷基、硫杂环己烷基、二氧代硫代环己烷基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“芳基”意指具有6至18个碳原子(优选具有6至14个碳原子、更优选具有6至10个碳原子，例如6、7、8、9或10个碳原子)的共轭烃环体系基团。就本发明的目的而言，芳基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所定义的环烷基或杂环基稠合，条件是芳基经由芳香环上的原子通过单键与分子的其余部分连接。本文各实施方案所述的芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基、芴基、2，3-二氢-1H-异吲哚基、2-苯并噁唑啉酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂芳基”意指环内具有1至15个碳原子(优选具有1至10个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至16元共轭环系基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂芳基可为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所定义的环烷基或杂环基稠合，条件是杂芳基经由芳香环上的原子通过单键与分子的其余部分连接。杂芳基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。就本发明的目的而言，杂芳基优选为包含1至5个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至12元芳香性基团，更优选为包含1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的5元至10元芳香性基团或者包含1至3个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至6元芳香性基团。本文各实施方案所述的杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡 嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吲哚基、呋喃基、吡咯基、三唑基、四唑基、三嗪基、吲嗪基、异吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氮萘基、萘啶基、喹噁啉基、喹喔啉基、蝶啶基、咔唑基、咔啉基、菲啶基、菲咯啉基、吖啶基、吩嗪基、异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、噁三唑基、噌啉基、喹唑啉基、苯硫基、中氮茚基、邻二氮杂菲基、异噁唑基、吩噁嗪基、吩噻嗪基、萘并吡啶基等。
在本申请中，术语“杂芳基烷基”是指被上文所定义的杂芳基所取代的上文所定义的烷基。
在本申请中，“任选”或“任选地”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如，“任选地被取代的芳基”表示芳基被取代或未被取代，且该描述同时包括被取代的芳基与未被取代的芳基。当被取代时，取代基可选自本文所述的烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、烷氧基、氰基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、硝基、芳基、杂芳基、环烃基和杂环基中的一个或多个；作为取代基的这些基团，包括烷基、烯基、炔基、卤代烷基中的烷基、卤代烯基中的烯基、卤代炔基中的炔基、烷氧基、单烷基氨基中的烷基、二烷基氨基中的烷基、芳基、杂芳基、环烃基和杂环基，还可任选地被选自烷基、卤素、卤代烷基、烷氧基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、硝基、芳基、杂芳基、环烃基和杂环基中的一个或多个基团取代。本文中，取代基的数量可为1或多个，即1、2、3、4、5或6个或更多个，根据被取代的基团以及取代基的性质决定。例如，当取代基为卤素时，根据被取代的基团的结构，该基团可被1-6个取代基取代，如三氟甲基、五氟乙基等；当取代基为芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、氰基、砜基等时，取代基的数量通常为1个。
本领域技术人员还应当理解，在下文所述的方法中，中间体化合物官能团可能需要由适当的保护基保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基及羧酸。合适的羟基保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。合适的氨基、脒基及胍基的保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。合适的巯基保护基包括-C(O)-R(其中R为烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。合适的羧基保护基包括烷基、芳基或芳烷基酯类。
保护基可根据本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术来引入和除去。保护基的使用详述于Greene，T.W.与P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organi Synthesis，(1999)，4th Ed.，Wiley中。保护基还可为聚合物树脂。
未经过修饰的尿苷(U)会通过TLR系统强烈诱发细胞自身的免疫原性从而导致体外合成mRNA的降解，使得mRNA无法正常表达目标蛋白。科学家通过对mRNA中的尿苷(U)替换成为假尿苷(Pseudo-U)或者N1甲基假尿苷(N1-Me-Pseudo-U)可以有效降低体外合成mRNA的自身免疫原性，提高表达效率。这种核酸修饰技术的发现直接促成两种mRNA新 冠疫苗BNT162b2和mRNA-1273成功上市。本申请通过对DNA/RNA双螺旋结构进行计算机模拟和结构预测，对假尿苷的N1位置进行进一步的修饰，制备出一系列的创新型人工核苷酸，在不影响Watson-Crick配对原则的同时可以被T7聚合酶识别并成功实现mRNA的体外转录(如图5所示)。
因此，本发明提供N1位修饰的假尿嘧啶核苷，其核苷酸以及它们在mRNA合成中的应用。本发明发现，采用本发明的方法，能够以非常简单的方式容易地合成N1位修饰假尿嘧啶核苷，并降低含有该假尿嘧啶核苷酸的mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率。
具体而言，本发明提供本下式I所示的化合物：
Figure PCTCN2023070774-appb-000015
式中，R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；R 2和R 3各自独立为羟基或C1-C6酰基；R 4为任选取代的C1-C4烷基；X和Y各自独立为O或S。
在式I化合物的一些实施方案中，X和Y均为O或均为S。在一些实施方案中，X和Y均为O。
在式I化合物的一些实施方案中，R 1中，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代。优选地，所述C3-C8烷基为C3-C6烷基。在一些实施方案中，所述4-9元杂环基任选地被取代，如任选地被1-3个C1-C4烷基取代。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地包括氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、 四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。优选地，所述5-10元杂芳基包括吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基等，优选为含氮杂芳基，优选地，环中的可取代氮原子被C1-C4烷基取代。
在式I化合物的一些实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4醛基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。在式I化合物的另外一些实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
在式I化合物的一些实施方案中，R 2和R 3各自独立为OH或乙酰基。优选地，R 2和R 3为相同的基团。
在式I化合物的一些实施方案中，R 4为羟基或C1-C6酰基取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，R 4为OH或-O-乙酰基取代的C1-C4烷基。
在式I化合物的优选实施方案中，R 2和R 3都为羟基，R 4为羟基取代的C1-C4烷基。在另外一些优选的实施方案中，R 2和R 3都为乙酰基，R 4为乙酰基取代的C1-C4烷基。
式I化合物可以是本发明式II化合物的前体化合物。本发明式II化合物具有以下结构：
Figure PCTCN2023070774-appb-000016
式中，R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；R 2和R 3为羟基；X和Y各自独立为O或S；R 6为：
Figure PCTCN2023070774-appb-000017
在式II化合物的一些实施方案中，X和Y均为O或均为S。在一些实施方案中，X和Y均为O。
在式II化合物的一些实施方案中，R 1中，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代。优选地，所述C3-C8烷基为C3-C6烷基。在一些实施方案中，所述4-9元杂环基任选地被取代，如任选地被1-3个C1-C4烷基取代。优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地包括氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基。优选地，所述5-10元杂芳基包括吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基等，优选为含氮杂芳基，优选地，环中的可取代氮原子被C1-C4烷基取代。
在式II化合物的一些实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和C-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4醛基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基。在式II化合物的另外一些实施方案中，所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
本发明也包括式I化合物和式II化合物的药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、溶剂化物、同位素取代物、多晶型物、前药或代谢产物。
本文中，“立体异构体”是指由相同原子组成，通过相同的键键合，但具有不同三维结构的化合物。本发明将涵盖各种立体异构体及其混合物。
在一些实施方案中，本发明式I化合物的立体异构体具有下式I’所示的结构：
Figure PCTCN2023070774-appb-000018
式中，X、Y、R 1-R 4如式I任一实施方案所述。
在一些实施方案中，本发明式II化合物的立体异构体具有下式II’所示的结构：
Figure PCTCN2023070774-appb-000019
式中，X、Y、R 1-R 3和R 6如式II任一实施方案所述。
“互变异构体”是指质子从分子的一个原子转移至相同分子的另一个原子而形成的异构体。本发明的化合物的所有互变异构形式也将包含在本发明的范围内。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可能含有一个或多个手性碳原子，且因此可产生对映异构体、非对映异构体及其它立体异构形式。每个手性碳原子可以基于立体化学而被定义为(R)-或(S)-。本发明旨在包括所有可能的异构体，以及其外消旋体和光学纯形式。
在本文中，术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2，2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。
本发明的式II化合物可用于制备多核苷酸分子，尤其是RNA分子，更具体是mRNA分 子。因此，在一些实施方案中，本发明提供编码多肽的分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码所述多肽的开放阅读框，所述开放阅读框含有腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和修饰的假尿嘧啶衍生物；其中，所述修饰的假尿嘧啶衍生物的结构如式II所示。
本文所述的“多肽”可以是期望在对象体内被表达出来以发挥感兴趣的生物学功能的多肽。例如，多肽可以是起到预防作用的多肽，或者起到治疗作用的多肽，或者是其表达能在对象体内引发免疫应答从而使该对象产生针对该多肽的抗体的多肽。在一些实施方案中，所述多肽是抗原肽，可以来自病毒或细菌，其编码序列在对象体内表达后能在该对象体内引发针对该病毒或细菌的体液免疫和/或细胞免疫。本领域周知，体液免疫是机体受到抗原刺激以后，机体组织中的B细胞所产生的B细胞效应和记忆细胞，从而产生抗体；细胞免疫是机体受到抗原刺激以后，机体中的T细胞产生T细胞记忆性和T细胞效应性，从而产生细胞因子。
在一些实施方案中，所述“多肽”在人体内起到治疗疾病的作用，包括治疗各种肿瘤或癌症。
本文所述的受试者或对象包括哺乳动物，尤其是人。
在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸分子还包括5’UTR、3’UTR和5’帽结构中的一种或多种。优选地，所述5’帽结构选自：Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2-′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
可采用本领域周知的方法使用本发明式II所示的化合物与其它的核苷酸合成感兴趣的核酸分子，尤其是mRNA分子。在示例性的合成方法中，在使含有本发明式II化合物、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶、RNA聚合酶、反应液以及感兴趣多肽的DNA模板在大约37℃下孵育一段时间，然后加入DNA酶，继续孵育一段时间，完成转录，分离纯化得到感兴趣的核酸分子。
在一些实施方案中，采用酶法加帽对含有本发明式II化合物的核酸分子进行加帽。加帽反应通常使用到加帽缓冲液、加帽酶以及需加帽的帽结构等。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明所述的分离的多核苷酸分子和药学上可接受的载体或赋形剂。本文中，药学上可接受的载体或赋形剂包括稀释剂、佐剂或溶媒，包括但不限于水、动物油、植物油、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。本文中，药物组合物可以为溶液、混悬液等形式。可根据具体的给药方式和给药途径将本发明的多肽制备成合适的剂型。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物是一种疫苗，如RNA疫苗，其含有本文所述的分离的多核苷酸分子和RNA疫苗领域常用的载体，包括佐剂。在一些实施方案中，所述 药学上可接受的载体是阳离子脂质体。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体是脂质纳米颗粒。
药物组合物中含有治疗或预防有效量的所述分离的多核苷酸分子。有效量可根据对象年龄、性别、体重、病症、一般健康以及先前医疗史等因素由本领域技术人员确定。
本发明还提供增加哺乳动物受试者的目标多肽的水平的方法，所述方法包括对所述受试者施用本发明所述的分离的多核苷酸分子，或含该分离的多核苷酸分子的药物组合物。
可采用本领域周知的方法给予本文所述的多核苷酸分子或其药物组合物。本文中，合适的给药方式和给药途径为本领域所周知，合适的施用途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如经注射或灌注。“胃肠外给药”是除了肠内和局部施用以外的施用模式，通常经注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和灌注。
多核苷酸分子或其在药物组合物中的实际剂量水平可以改变，以获得有效达到下述效果的活性成分的量：达到对具体患者、组合物和施用模式的所需治疗反应，且对患者无毒性。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括本发明所用的多肽的活性、施用途径、施用时间、治疗持续时间、用于与所用特定组合物组合的其它药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康以及先前医疗史，以及医学领域内熟知的类似因素。
本发明还提供式II所示化合物在制备分离的多核苷酸分子中的应用，在降低RNA自身免疫原性，提高RNA自身稳定性，增强RNA在目标细胞内的表达时间和表达效率中的应用，或在制备用于制备自身免疫原性降低、自身稳定性提高、在目标细胞内的表达时间延长、和/或在目标细胞内的表达效率提高的RNA的制剂中的应用。
本发明还提供一种制备RNA以降低该RNA自身免疫原性，提高RNA自身稳定性，和/或增强RNA在目标细胞内的表达时间和表达效率的方法，该方法包括使用式II所示的化合物制备该RNA的步骤。该方法可包括：孵育含有本发明式II化合物、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶、RNA聚合酶、反应液以及感兴趣多肽的DNA模板反应体系，待反应结束后加入DNA酶，继续孵育一段时间至转录完成，然后分离纯化得到所述RNA。
本文所述的RNA优选是mRNA。
在一些实施方案中，式I、II化合物分别如下式Ia、IIa所述：
Figure PCTCN2023070774-appb-000020
其合成可采用如下反应路线：
Figure PCTCN2023070774-appb-000021
首先，对化合物1上的OH用合适的保护基团G进行保护，该步骤可采用本领域公知的OH保护方法，优选地，保护基团G为C1-C4酰基，如乙酰基。然后化合物2可在碱性条件下与R 1-L反应生成化合物3，其中L为本领域公知的离去基团，例如卤素、-OTf等。然后，化合物3脱保护生成式Ia化合物。然后，式Ia化合物通过三磷酸化生成式IIa化合物，三磷酸化可采用本领域公知的Yoshikawa方法或者Ludwig-Eckstein方法。式Ia和IIa中，X、Y和R 1如本文任一实施方案所述。对于式I、II化合物中的R 2、R 3、R 4为本文所述的其它基团时，可采用类似的合成方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例中所用的材料和试剂，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和试剂，可从市售途径获得。
实施例1
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000022
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000023
假尿苷(9.5g，38.9mmol，购自东京化成，货号P2396)溶于吡啶(150ml)。醋酸酐(35.7g，350mmol)慢慢滴加至反应液中。加完以后，反应继续搅拌3小时。反应液直接旋干。粗产品溶于二氯甲烷溶液，再加入KHCO 3水溶液，调节pH至弱碱性。混合物分液。有机相收集后干燥，得到的粗产品再通过柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯(11.8g，收率：82％)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ9.95(s，1H)，9.81(s，1H)，7.69-7.52(m，1H)，5.48-5.37(m，1H)，5.37-5.27(m，1H)，4.99-4.87(m，1H)，4.51-4.39(m，1H)，4.39-4.26(m，2H)，2.23-2.03(m，9H).
MS m/z(ESI)：370.9[M+H] +。
第二步：三氟甲烷磺酸环丙基酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000024
环丙醇(2g，34.4mmol)溶于吡啶(60ml)。反应液冷却至0℃，(CF 3SO 2) 2O(10.0g，35.44mmol)分批加入其中。加完以后，反应慢慢升温至室温，并室温搅拌20小时。反应液直接向下使用。
第三步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000025
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯(10g，27mmol)溶于DMF(120ml)，分别加入碳酸铯(17，6g，54mmol)，NaI(404.7mg，2.7mmol)和三氟甲烷磺酸环丙基酯(60ml，0.5Mol/L，30mmol)。该反应在60℃搅拌过夜。水加入其中，再加入DCM萃取。有机相干燥后旋干。粗产品通过柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯1.6g。
MS m/z(ESI)：411.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.48(s，1H)，7.71(s，1H)，6.01-5.84(m，1H)，5.41(t，J＝5.5Hz，1H)，5.29-5.12(m，3H)，4.69(d，J＝5.2Hz，1H)，4.37-4.27(m，3H)，4.17-4.08(m，2H)，2.11-2.00(m，9H).
第四步：1-环丙基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000026
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯(3g，7.3mmol)溶于7NNH3/MeOH溶液(50ml)中。该反应在室温搅拌过夜。反应液旋干，得到1-环丙基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：285.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.38(s，1H)，7.75(s，1H)，6.01-5.79(m，1H)，5.26-5.10(m，2H)，4.96(d，J＝5.1Hz，1H)，4.82-4.71(m，2H)，4.50(d，J＝4.3Hz，1H)，4.31(d，J＝5.4Hz，2H)，4.00-3.94(m，1H)，3.93-3.85(m，1H)，3.78-3.69(m，1H)，3.68-3.59(m，1H)，3.54-3.44(m，1H).
第五步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000027
1-环丙基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(1g，3.5mmol)溶于三甲基磷酸(20ml)，冷却至0℃。POCl 3(539mg，3.5mmol)慢慢滴加至反应液。加完以后，反应液搅拌10分钟。再往反应液中滴加POCl3(539mg，3.5mmol)。反应液继续搅拌40分钟。焦磷酸三丁酯铵(8.1g，8.8mmol)，三丁胺(3.9g，21.1mmol)和乙腈(15ml)分别加入反应液，搅拌10分钟。反应液慢慢倒入500ml水中，并调节pH至6.5。粗品浓缩后纯化，得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丙基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS1。
MS m/z(ESI)：525.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.85(s，1H)，6.05-5.92(m，1H)，5.34-5.21(m，2H)，4.85-4.82(m，1H)，4.57-4.39(m，2H)，4.38-4.14(m，5H). 31P NMR(202MHz，Deuterium Oxide)δ-7.51(d，J＝19.8Hz)，-11.00(d，J＝19.2Hz)，-21.97(t，J＝19.3Hz).
实施例2
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000028
第一步：2，2-二氟环丙基三氟甲烷磺酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000029
以2，2-二氟环丙-1-醇为原料参考实施例1第二步得到2，2-二氟环丙基4-甲基苯磺酸酯。
MS m/z(ESI)：227.0[M+H] +。
第二步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000030
以2，2-二氟环丙基三氟甲烷磺酸酯和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：447.3[M+H] +。
第三步：1-(2，2-二氟环丙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000031
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到1-(2，2-二氟环丙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：321.2[M+H] +。
第四步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000032
以1-(2，2-二氟环丙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2，2-二氟环丙基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS2。
MS m/z(ESI)：560.9[M+H] +。
实施例3
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000033
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000034
以溴代环丁烷和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：425.2[M+H] +。
第二步：1-环丁基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000035
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到1-环丁基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：299.2[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000036
以1-环丁基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环丁基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS3。
MS m/z(ESI)：539.2[M+H] +。
实施例4
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000037
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000038
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入3-溴环氧丁烷(1.49g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：427.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.53(s，1H)，7.91(s，1H)，5.49(t，J＝5.5Hz，1H)，5.36-5.27(m，2H)，4.86-4.73(m，5H)，4.37-4.27(m，1H)，4.21-4.09(m，2H)，2.07(d，J＝4.7Hz， 9H).
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-环丁氧基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000039
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.69mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-环丁氧基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：301.3[M+H] +。
1H NMR(400MHz，氧化氘)δ8.01(s，1H)，5.50-5.39(m，1H)，5.01(t，J＝7.7Hz，2H)，4.93(td，J＝7.0，3.7Hz，2H)，4.75(s，1H)，4.28(t，J＝4.9Hz，1H)，4.18(t，J＝5.7Hz，1H)，4.05-3.99(m，1H)，3.93-3.84(m，1H)，3.80-3.70(m，1H).
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000040
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-环丁氧基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(1g，3.3mmol)溶于三甲基磷酸(20ml)，冷却至0℃。POCl3(536mg，3.3mmol)慢慢滴加至反应液。加完以后，反应液搅拌10分钟。再往反应液中滴加POCl3(536mg，3.3mmol)。反应液继续搅拌40分钟。焦磷酸三丁酯铵(8.1g，8.8mmol)，三丁胺(3.9g，21.1mmol)和乙腈(15ml)分别加入反应液，搅拌10分钟。反应液慢慢倒入500ml水中，并调节pH至6.5。粗品浓缩后纯化，得到(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS4。
MS m/z(ESI)：540.9[M+H] +。
实施例5
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000041
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000042
2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入N-Boc-3-溴环丁烷(1.47g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-(叔丁氧羰基)氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯.
MS m/z(ESI)：526.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.51(s，1H)，7.86(s，1H)，5.48(t，J＝5.5Hz，1H)，5.32(t，J＝5.8Hz，1H)，5.00(t，J＝7.1Hz，1H)，4.77(d，J＝5.1Hz，1H)，4.39-4.27(m，1H)，4.20-4.06(m，6H)，2.11-2.03(m，9H)，1.42(s，9H).
第二步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000043
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，3.81mmol)加入20ml 1M盐酸乙酸乙酯溶液，搅拌2小时后，加入DCM和适量的10％的氢氧化钠溶液分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：426.1[M+H] +。
第三步：1-(3-氮杂环丁烷基)-5-(2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000044
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(1g，2.35mmol)加入15ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到1-(3-氮杂环丁烷基)-5-(2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：300.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.40(br.s，1H)，7.85(s，1H)，5.02-4.87(m，2H)，4.81(t，J＝5.7Hz，1H)，4.71(d，J＝5.7Hz，1H)，4.53(d，J＝3.7Hz，1H)，4.25.4.06(m，4H)，3.98-3.87(m，2H)，3.79-3.68(m，1H)，3.68-3.58(m，1H)，3.52.3.42(m，1H)，1.39(s，9H).
第四步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000045
以1-(3-氮杂环丁烷基)-5-(2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS5。
MS m/z(ESI)：540.1[M+H] +。
31PNMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-5.71(d，J＝19.9Hz)，-10.35(d，J＝18.2Hz)，-21.36(t，J＝18.9Hz).
实施例6
((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸氢钠
Figure PCTCN2023070774-appb-000046
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000047
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.70mmol)溶于15ml DMF，分别加入碘甲烷(0.67g，4.70mmol)和无水碳酸钾(1.30g，9.40mmol)。随后室温反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：440.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000048
((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(1g，2.28mmol)加入15ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小 时后旋干过柱纯化。得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：314.1[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-3,4-二羟基-5-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸氢钠
Figure PCTCN2023070774-appb-000049
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到(2R，3S，4R，5S)-3,4-二羟基-5-(1-(3-环丁氧基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基甲基三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS6。
MS m/z(ESI)：554.2[M+H] +。
实施例7
((2R,3S,4R,5S)-5-(1-(2,2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000050
第一步：2,2-二氟环丁基三氟甲烷磺酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000051
以2,2-二氟环丁-1-醇为原料参考实施例1第二步得到2,2-二氟环丁基4-甲基苯磺酸酯。
MS m/z(ESI)：240.2[M+H] +。
第二步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000052
以2,2-二氟环丁基三氟甲烷磺酸酯和(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：461.3[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.51(br.s，1H)，7.77(s，1H)，5.47(t，J＝5.5Hz，1H)，5.34-5.26(m，1H)，4.71(d，J＝5.2Hz，1H)，4.59-4.43(m，1H)，4.35-4.23(m，1H)，4.16-4.04(m，2H)，3.20-3.04(m，2H)，3.01-2.87(m，2H)，2.08-1.97(m，9H).
第三步：1-(2，2-二氟环丁基)-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000053
以(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(2，2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到1-(2，2-二氟环丁基)-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：335.2[M+H] +。
第四步：((2R,3S,4R,5S)-5-(1-(2，2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000054
以1-(2，2-二氟环丁基)-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶- 2,4(1H,3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R,3S,4R,5S)-5-(1-(2，2-二氟环丁基)-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS7。
MS m/z(ESI)：575.2[M+H] +。
实施例8
((2R,3S,4R,5S)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000055
第一步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000056
以溴代环戊烷和(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：439.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.39(br.s，1H)，7.75(s，1H)，5.47(t，J＝5.7Hz，1H)，5.29(t，J＝5.7Hz，1H)，4.79-4.66(m，2H)，4.35-4.24(m，1H)，4.14-4.04(m，2H)，2.07-2.01(m，9H)，1.99-1.87(m，2H)，1.82-1.70(m，2H)，1.69-1.52(m，4H).
第二步：1-环戊基-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000057
以(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到1-环戊基-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：313.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.71(br.s，1H)，8.30(s，1H)，5.42(d，J＝4.3Hz，1H)，5.35(t，J＝5.1Hz，1H)，5.24-5.06(m，2H)，4.97(d，J＝2.7Hz，1H)，4.40-4.30(m，2H)，4.21-4.05(m，2H)，3.97-3.86(m，1H)，2.41-2.29(m，2H)，2.26-2.18(m，1H)，2.17-2.11(m，1H)，2.10-1.91(m，4H).
第三步：((2R,3S,4R,5S)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000058
以1-环戊基-5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R,3S,4R,5S)-5-(1-环戊基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS8。
MS m/z(ESI)：553.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.74(s，1H)，4.77-4.73(m，1H)，4.35-4.27(m，2H)，4.27-4.12(m，3H)，2.15-2.00(m，2H)，1.92-1.61(m，7H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-9.53(d，J＝19.0Hz)，-11.19(d，J＝20.0Hz)，-22.60(t，J＝19.3Hz).
实施例9
((2R,3S,4R,5S)-5-(二氧-1-(四氢呋喃-3-基-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000059
第一步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(二氧-1-(四氢呋喃-3-基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000060
以3-溴四氢呋喃和(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(二氧-1-(四氢呋喃-3-基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：441.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.45(br.s，1H)，7.57(d，J＝2.7Hz，1H)，5.46-5.37(m，1H)，5.31-5.23(m，1H)，5.08-4.98(m，1H)，4.72(t，J＝4.6Hz，1H)，4.34-4.23(m，1H)，4.15-4.05(m，2H)，4.05-3.65(m，5H)，2.42-2.27(m，1H)，2.03(s，9H).
第二步：5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)1-(四氢呋喃-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000061
以((2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(二氧-1-(四氢呋喃-3-基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)1-(四氢呋喃-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：315.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(br.s，1H)，7.67(d，J＝10.0Hz，1H)，5.07-4.93(m，2H)，4.84-4.78(m，1H)，4.75-4.68(m，1H)，4.51(t，J＝3.2Hz，1H)，4.04-3.95(m，1H)，3.95-3.82(m，2H)，3.78-3.56(m，5H)，3.53-3.42(m，1H)，2.39-2.25(m，1H)，2.05-1.88(m，1H).
第三步：((2R,3S,4R,5S)-5-(2，4-二氧1-(四氢呋喃-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸脂
Figure PCTCN2023070774-appb-000062
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)1-(四氢呋喃-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R,3S,4R,5S)-5-(1-环己基-2,4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基氢三磷酸脂和其钠盐，下文简称LS9。
MS m/z(ESI)：555.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.66(d，J＝2.9Hz，1H)，5.13-5.01(m，1H)，4.29-4.23(m，2H)，4.20-4.09(m，4H)，4.06-3.81(m，3H)，2.52-2.41(m，1H)，2.22-2.16(m，2H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-10.10(d，J＝19.2Hz)，-11.02--11.26(m)，-22.79(t，J＝19.1Hz).
实施例10
((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)三磷酸四氢甲酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000063
第一步：四氢噻吩-3-基三氟甲磺酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000064
以四氢噻吩-3-醇为原料参考实施例1第二步得到四氢噻吩-3-基三氟甲磺酸。
MS m/z(ESI)：237.2[M+H] +。
第二步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000065
以四氢噻吩-3-基三氟甲磺酸酯和(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：457.3[M+H] +。
第三步：5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢噻吩-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000066
以(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯为原料参考实施例1第四步得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢噻吩-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：331.2[M+H] +。
第四步：((2R,3S,4R,5S)-5-(2，4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)三磷酸四氢甲酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000067
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢噻吩-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R,3S,4R,5S)-5-(2，4-二氧-1-(四氢噻吩-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)三磷酸四氢甲酯和其钠盐，下文简称LS10。
MS m/z(ESI)：570.9[M+H] +。
实施例11
((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸四氢
Figure PCTCN2023070774-appb-000068
第一步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000069
以3-溴吡咯烷和(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：440.2[M+H] +。
第二步：5-((2S,3R,4S,5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(吡咯烷-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000070
以(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸二酯为原料参考实施例1第四步得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(吡咯烷-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：314.2[M+H] +。
第三步：((2R,3S,4R,5S)-5-(2，4-二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸四氢
Figure PCTCN2023070774-appb-000071
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(吡咯烷-3-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R,3S,4R,5S)-5-(2，4-二氧-1-(吡咯烷-3-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸四氢和其钠盐，下文简称LS11。
MS m/z(ESI)：554.2[M+H] +。
实施例12
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000072
第一步：(2S，3S，4R，5R)-2-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000073
(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40mlDMF，分别加入3-碘吡唑(2.10g,10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2S，3S，4R，5R)-2-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：437.1[M+H] +。
第二步：5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1H-咪唑-2-基) 嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000074
(2S，3S，4R，5R)-2-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯(2g,4.58mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1H-咪唑-2-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：311.1[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000075
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1H-咪唑-2-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS12。
MS m/z(ESI)：550.9[M+H] +。
实施例13
((2R，3S，4R，5S)-3,4-二羟基-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)三磷酸氢甲酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000076
第一步：(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基 -1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000077
(2S，3S，4R，5R)-2-(1-(1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯(2g，4.58mmol)溶于15ml DMF，分别加入碘甲烷(0.65g,4.58mmol)和无水碳酸钾(1.30g，9.40mmol)。随后室温反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：451.1[M+H] +。
第二步：5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000078
(2R,3R,4S,5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3,4-二乙酸酯(1g,2.22mmol)加入15ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：325.1[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-3,4-二羟基-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2,4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)三磷酸氢甲酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000079
以5-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基-1H-咪唑-2- 基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)三磷酸氢甲酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS13。
MS m/z(ESI)：565.0[M+H] +。
实施例14
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环己基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000080
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环己基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000081
以溴代环戊烷和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环戊基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：453.2[M+H] +。
第二步：1-环己基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000082
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-环己基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃- 3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第四步得到1-环己基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：327.2[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环己基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000083
以1-环己基-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-环己基-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS14。
MS m/z(ESI)：567.2[M+H] +。
实施例15
((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000084
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000085
以4-溴四氢吡喃和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：455.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000086
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4二氧-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯为原料参考实施例1第四步得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：329.2[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000087
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸和其钠盐，下文简称LS15。
MS m/z(ESI)：569.2[M+H] +。
实施例16
((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基三氢四磷酸脂
Figure PCTCN2023070774-appb-000088
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000089
以1-Boc-4-溴哌啶和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：554.2[M+H] +。
第二步：(2S，3R，4S，5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000090
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯为原料参考实例5第二步得到(2S，3R，4S，5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：454.2[M+H] +。
第三步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000091
以(2S，3R，4S，5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯为原料参考实例5第三步得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：328.2[M+H] +。
第四步：((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四磷酸三氢
Figure PCTCN2023070774-appb-000092
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二氧-1-(哌啶-4-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四磷酸三氢和其钠盐，下文简称LS16。
MS m/z(ESI)：568.2[M+H] +。
实施例17
((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000093
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000094
以N-甲基-4-溴哌啶和(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二基二乙酸酯为原料参考实施例1第三步得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：468.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000095
以(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯为原料参考实施例1第四步得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：342.2[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4-二氧代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸四氢
Figure PCTCN2023070774-appb-000096
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(1-甲基哌啶-4-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例1第五步得到((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-甲基哌啶-4-基)-2，4-二氧代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸四氢和其钠盐，下文简称LS17。
MS m/z(ESI)：582.2[M+H] +。
实施例18
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000097
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-甲氧基乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000098
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入2-溴乙基甲基醚(1.5g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-甲氧基乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：429.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.45(br.s，1H)，7.69(s，1H)，5.38(t，J＝5.5Hz，1H)，5.24(t，J＝5.6Hz，1H)，4.67(d，J＝5.2Hz，1H)，4.40-4.25(m，1H)，4.20-4.04(m，2H)，3.95-3.76(m，2H)，3.60-3.46(m，2H)，3.24(s，3H)，2.06-1.99(m，9H).
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-甲氧基乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000099
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-甲氧基乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四 氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.67mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-甲氧基乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：303.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，氧化氘)δ7.72(d，J＝0.9Hz，1H)，4.67(d，J＝5.2，0.8Hz，1H)，4.24(t，J＝5.2Hz，1H)，4.12(t，J＝5.5Hz，1H)，4.03-3.92(m，3H)，3.83(dd，J＝12.6，3.1Hz，1H)，3.75-3.66(m，3H)，3.34(s，3H).
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000100
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-甲氧基乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(1g，3.31mmol)溶于三甲基磷酸(20ml)，冷却至0℃。POCl3(507mg，3.5mmol)慢慢滴加至反应液。加完以后，反应液搅拌10分钟。再往反应液中滴加POCl3(507mg，3.5mmol)。反应液继续搅拌40分钟。焦磷酸三丁酯铵(8.1g，8.8mmol)，三丁胺(3.9g，21.1mmol)和乙腈(15ml)分别加入反应液，搅拌10分钟。反应液慢慢倒入500ml水中，并调节pH至6.5。粗品浓缩后纯化，得到(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS18。
MS m/z(ESI)：543.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.82(s，1H)，4.83(d，J＝4.5Hz，1H)，4.32(t，J＝5.5Hz，1H)，4.29-4.23(m，2H)，4.22-3.96(m，4H)，3.80-3.71(m，2H)，3.39(s，3H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-10.22(d，J＝18.8Hz)，-11.11，-22.78(t，J＝19.2Hz).
实施例19
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000101
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000102
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml干燥的DMF，在氩气保护下分别加入碳酸乙烯酯(903.65mg，10.26mmol)和钠氢(259.22mg，10.8mmol)。随后加热至150℃，反应1.5小时。加入DCM和水猝灭并分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：415.1[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羟乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000103
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.83mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羟乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：289.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000104
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羟乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-羟乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸，下文简称LS19。
MS m/z(ESI)：528.9[M+H] +。
实施例20
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-(甲基氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000105
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(甲胺基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000106
将三苯基膦(2.83g，10.8mmol)和偶氮二甲酸二叔丁酯(2.49g，10.8mmol)溶于40ml DCM后，0℃冰浴下加入N-甲基-2-羟基乙胺(811.32mg，10.8mmol)，搅拌10min后加入(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)。反应混合物慢慢升温至室温过夜。反应结束后旋干过柱纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(甲胺基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：428.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(甲氨基)乙基)嘧啶- 2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000107
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(甲胺基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.68mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(甲氨基)乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：302.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-(甲基氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000108
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(甲氨基)乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-(甲基氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸，下文简称LS20。
MS m/z(ESI)：542.1[M+H] +。
实施例21
(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000109
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000110
将三苯基膦(2.83g，10.8mmol)和偶氮二甲酸二叔丁酯(2.49g，10.8mmol)溶于40ml DCM后，0℃冰浴下加入N，N-二甲基乙醇胺(962.84mg，10.8mmol)，搅拌10min后加入(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)。反应混合物慢慢升温至室温过夜。反应结束后旋干过柱纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：442.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(二甲氨基)乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000111
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.53mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(二甲氨基)乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：316.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，氧化氘)δ7.83(d，J＝0.9Hz，1H)，4.74(d，J＝5.4Hz，1H)，4.35(t，J＝5.3Hz，1H)，4.23(t，J＝5.4Hz，1H)，4.09(m，1H)，4.03(m，2H)，3.92(dd，J＝12.6，3.0Hz，1H)，3.80(dd，J＝12.6，4.3Hz，1H)，2.86(t，J＝6.7Hz，2H)，2.43(s，6H).第三步：(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000112
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-(二甲氨基)乙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(二甲氨基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基)四氢三磷酸，下文简称LS21。
MS m/z(ESI)：556.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ8.00(s，1H)，4.91(d，J＝2.9Hz，1H)，4.40-4.27(m，4H)，4.24-4.13(m，3H)，3.50(t，J＝6.8Hz，2H)，2.97(s，6H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-10.15(d，J＝18.6Hz)，-10.98(d，J＝18.3Hz)，-22.53(t，J＝19.1Hz).
实施例22
(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(氮杂丁-1-基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000113
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-溴乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000114
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(8g，21.6mmol)溶于80ml DMF，加入无水碳酸铯(7.74g，23.76mmol)并搅拌5min。随后加入1，4-二溴乙烷，反应2小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-溴乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：477.1[M+H] +。
第二步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000115
氮杂环丁烷盐酸盐(705.68mg，7.54mmol)溶于100ml无水乙腈，加入碳酸铯(2.46g，7.54mmol)并搅拌5min，随后缓慢加入溶于40ml DMF中的(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-溴乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯(4g，8.38mmol)，随后常温搅拌3小时。反应液过滤后旋干，使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯。
MS m/z(ESI)：454.2[M+H] +。
第三步：1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000116
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯(2g，4.41mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：328.1[M+H] +。
第四步：(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(氮杂丁-1-基)乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000117
1-(2-(氮杂环丁烷-1-基)乙基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-(氮杂丁-1-基)乙基)-2，4-二 酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，下文简称LS22。
MS m/z(ESI)：568.0[M+H] +。
实施例23
((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000118
第一步：((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000119
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml 1，2-二氯乙烷，加入劳森试剂(4.37g，10.8mmol)。氮气保护下回流反应16小时，蒸干溶剂。粗品使用柱层析纯化，得((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：403.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ10.80(s，1H)，10.55(s，1H)，7.33(d，J＝4.9Hz，1H)，5.44(dd，J＝5.2，2.7Hz，1H)，5.27-5.22(m，1H)，5.10(dd，J＝7.9，5.3Hz，1H)，4.31(dt，J＝15.7，3.7Hz，3H)，2.14(d，J＝6.8Hz，6H)，2.06(s，3H).
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二硫酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000120
((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃 -3，4-二乙酸酯(2g，4.97mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二硫酮。
MS m/z(ESI)：277.2[M+H] +。
1H NMR(400MHz，氧化氘)δ7.59(d，J＝1.1Hz，1H)，5.13(dd，J＝2.4，1.1Hz，1H)，4.17(t，J＝3.3Hz，1H)，3.98(dd，J＝3.9，2.3Hz，2H)，3.91(dd，J＝12.6，1.8Hz，1H)，3.74(dd，J＝12.9，3.8Hz，1H).
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000121
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二硫酮为原料参照实施例4法，得到((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS23。
MS m/z(ESI)：516.9[M+H] +。
实施例24
(2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000122
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000123
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入溴丙炔(1.28g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至40℃，反应3小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：409.1[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000124
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯(2g，4.9mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：283.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.83(d，J＝0.9Hz，1H)，4.75-4.70(m，1H)，4.64(dd，J＝5.2，0.9Hz，1H)，4.57-4.45(m，2H)，4.14(dt，J＝62.6，5.3Hz，2H)，3.94(ddd，J＝6.0，4.6，3.1Hz，1H)，3.79(dd，J＝12.5，3.1Hz，1H)，3.66(dd，J＝12.6，4.6Hz，1H).
第三步：(2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000125
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(丙-2-炔-1-基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，下文简称LS24。
MS m/z(ESI)：523.0[M+H] +。
1H NMR(500MHz，氧化氘)δ7.83(d，J＝0.9Hz，1H)，4.68(s，1H)，4.64(dd，J＝5.2，0.9Hz，1H)，4.58-4.45(m，2H)，4.20(t，J＝5.2Hz，1H)，4.08(t，J＝5.5Hz，1H)，3.98-3.90(m，1H)，3.79(dd，J＝12.5，3.1Hz，1H)，3.66(dd，J＝12.6，4.6Hz，1H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-6.20(d，J＝19.6Hz)，-10.90(d，J＝20.1Hz)，-21.52--21.82(m).
实施例25
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000126
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1-(1，2，2-三氯乙烯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000127
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于20ml DMSO，分别加入四氯乙烯(1.79g，10.8mmol)和无水碳酸钾(2.98g，21.6mmol)。随后室温反应16小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1-(1，2，2-三氯乙烯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：499.2[M+H] +。
第二步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000128
((2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1-(1，2，2-三氯乙烯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.0mmol)溶于20mlTHF，冷却至-70℃下滴加2.5M正丁基锂(6.4mL，16.0mmol)。在此温度下反应3小时。加氯化铵水溶液淬灭后，加入EA和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：395.1[M+H] +。
第三步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-乙炔基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000129
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(1g，2.54mmol)加入15ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-乙炔基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：269.1[M+H] +。
第四步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000130
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-乙炔基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱 层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS25。
MS m/z(ESI)：508.9[M+H] +。
实施例26
((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸氢钠
Figure PCTCN2023070774-appb-000131
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000132
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入甲基硫代磺酸甲酯(1.36g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：417.1[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(甲硫基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000133
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.80mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过 柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(甲硫基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：291.1[M+H] +。
第四步：((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸氢钠
Figure PCTCN2023070774-appb-000134
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(甲硫基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参照实施例4法，得到((2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(甲硫基)-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸氢钠。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS26。
MS m/z(ESI)：530.9[M+H] +。
实施例27
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000135
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰羟甲基)-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000136
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入1-溴-3-甲基-2-丁烯(1.61g，10.8mmol)和无水碳酸 钾(3g，21.6mmol)。随后加热至40℃，反应3小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰羟甲基)-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：439.1[M+H] +。
第二步5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000137
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰羟甲基)-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯(2g，4.56mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-乙酸酯。
MS m/z(ESI)：313.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.71(s，1H)，5.25(t，J＝7.3Hz，1H)，4.67(d，J＝5.1Hz，1H)，4.36(t，J＝6.1Hz，2H)，4.24(t，J＝5.2Hz，1H)，4.11(t，J＝5.5Hz，1H)，3.99(s，1H)，3.82(d，J＝3.1Hz，1H)，3.69(dd，J＝12.5，4.6Hz，1H)，1.79-1.69(m，6H).
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000138
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)吡啶-2，4(1H，3H)-乙酸酯参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(3-甲基丁-2-烯-1-基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS27。
MS m/z(ESI)：553.0[M+H] +。
1H NMR(500MHz，氧化氘)δ7.65(d，J＝0.8Hz，1H)，5.24-5.15(m，1H)，4.61(d，J＝5.1Hz，1H)，4.29(h，J＝7.5Hz，2H)，4.19(t，J＝5.2Hz，1H)，4.06(t，J＝5.5Hz，1H)，3.94(m，1H)， 3.82-3.75(m，1H)，3.69-3.60(m，1H)，1.76-1.61(m，6H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-8.69(d，J＝18.8Hz)，-11.11(d，J＝17.6Hz)，-22.37(t，J＝19.7Hz).
实施例28
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-氰基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000139
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-氰基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000140
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40mlDMF，分别加入氰化溴(1.14g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-氰基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：396.1[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二氧基-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-碳腈
Figure PCTCN2023070774-appb-000141
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-氰基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.69mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二氧基-3，4-二氢 嘧啶-1(2H)-碳腈。
MS m/z(ESI)：270.1[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000142
以5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二氧基-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-碳腈为原料参照实施例4第三步，得到((2R，3S，4R，5S)-5-(1-乙炔基-2，4-二氧基-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟四氢呋喃-2-基)甲基四氢呋喃三磷酸酯。产品经过DEAE阴离子柱层析纯化，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS28。
MS m/z(ESI)：509.9[M+H] +。
实施例29
(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000143
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(酮甲基)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000144
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入溴乙腈(1.3g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应3小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后 用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(酮甲基)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：410.1[M+H] +。
第二步：2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢吡啶-1(2H)-基)乙腈
Figure PCTCN2023070774-appb-000145
(2R，3R，4S，5S)-2-(酮甲基)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸二酯(2g，4.89mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢吡啶-1(2H)-基)乙腈。
MS m/z(ESI)：284.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000146
2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢吡啶-1(2H)-基)乙腈为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(腈甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS29。
MS m/z(ESI)：523.9[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.94(s，1H)，4.94(s，2H)，4.87(d，J＝3.6Hz，1H)，4.37-4.27(m，2H)，4.26-4.12(m，3H). 31P NMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-10.43(d，J＝19.9Hz)，-11.09(d，J＝18.9Hz)，-22.82(t，J＝19.6Hz).
实施例30
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-((甲氨基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000147
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((甲氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000148
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml乙醇，接着逐滴加入356.76mg甲醛和369.03mg甲氨的混合液。随后加热至70℃回流。反应3小时后旋干过柱，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((甲氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：414.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((甲氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000149
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((甲氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.84mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((甲氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：288.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-((甲氨基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000150
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((甲氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-((甲氨基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS30。
MS m/z(ESI)：528.0[M+H] +。
实施例31
((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(2-丙酮基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000151
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(2-羰丙基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000152
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入溴丙酮(1.48g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应3小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(2-羰丙基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯2.12g淡黄色固体，产率46％。
MS m/z(ESI)：427.1[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羰丙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000153
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(2-羰丙基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.69mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后TLC确认反应结束，随后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羰丙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮0.9g，产率64.3％。
MS m/z(ESI)：301.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.61(s，1H)，4.79(s，1H)，4.70-4.64(m，2H)，4.26(t，J＝5.2Hz，1H)，4.12(t，J＝5.5Hz，1H)，4.02-3.95(m，1H)，3.87-3.78(m，1H)，3.69(dd，J＝12.6，4.7Hz，1H)，2.28(s，3H).
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(2-丙酮基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000154
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(2-羰丙基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(2-丙酮基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS31。
MS m/z(ESI)：541.0[M+H] +。
1H NMR(500MHz，氧化氘)δ7.47(d，J＝1.1Hz，1H)，4.66(d，J＝2.8Hz，2H)，4.55-4.51(m，1H)，4.12(t，J＝5.3Hz，1H)，3.98(t，J＝5.5Hz，1H)，3.88-3.83(m，1H)，3.72-3.66(m，1H)，3.59-3.52(m，1H)，2.15(s，3H). 31PNMR(162MHz，Deuterium Oxide)δ-10.12(d，J＝19.5Hz)，-11.12(d，J＝20.1Hz)，-22.81(t，J＝19.3Hz).
实施例32
2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(((四氢三磷酸)甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二羟 吡啶-1(2H)-基)乙酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000155
第一步：2-(5-((2S，3S，4R，5R)-3，4-二乙酰氧基-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000156
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40mlDMF，分别加入溴乙酸(1.5g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得2-(5-((2S，3S，4R，5R)-3，4-二乙酰氧基-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸。
MS m/z(ESI)：429.1[M+H] +。
第二步：2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000157
2-(5-((2S，3S，4R，5R)-3，4-二乙酰氧基-5-(乙酰氧基甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸(2g，4.67mmol)加入20ml7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸。
MS m/z(ESI)：303.1[M+H] +。
1H NMR(400MHz，Deuterium Oxide)δ7.85-7.71(m，1H)，4.77(d，J＝5.3Hz，1H)，4.43-4.33(m，3H)，4.23(t，J＝5.4Hz，1H)，4.12-4.04(m，1H)，3.95-3.87(m，1H)，3.83-3.75(m，1H).
第三步：2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(((四氢三磷酸)甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二羟吡啶-1(2H)-基)乙酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000158
2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸为原料参考实施例18第三步制得2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(((四氢三磷酸)甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二羟吡啶-1(2H)-基)乙酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS32。
MS m/z(ESI)：543.0[M+H] +。
实施例33
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000159
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基)-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000160
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml DMF，分别加入溴乙酸甲酯(1.65g，10.8mmol)和无水碳酸钾(3g，21.6mmol)。随后加热至60℃，反应4小时。加入DCM和水分液，随后有机层用水和饱和食盐水清洗后用无水硫酸钠脱水旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基)-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：443.1[M+H] +。
第二步：甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000161
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基)-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.52mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸酯.
MS m/z(ESI)：317.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000162
甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸酯为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS33。
MS m/z(ESI)：557.0[M+H] +。
实施例34
(2R，3S，4R，5S)-5-(1-((氨乙基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000163
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((乙氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000164
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml乙醇，接着逐滴加入356.76mg甲醛和535.69mg乙氨的混合液。随后加热至70℃回流。反应3小时后旋干过柱，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((乙氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：428.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((乙氨)甲基吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000165
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((乙氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.68mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((乙氨)甲基吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
MS m/z(ESI)：302.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-5-(1-((氨乙基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000166
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-((乙氨)甲基吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(1-((氨乙基)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS34。
MS m/z(ESI)：542.0[M+H] +。
实施例35
((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-y基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000167
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(((2-酮乙基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000168
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml乙醇，接着逐滴加入356.76mg甲醛和868.5mg氨基丙酮的混合液。随后加热至70℃回流。反应3小时后旋干过柱，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(((2-酮乙基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：456.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000169
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(2，4-二酮-1-(((2-酮乙基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.39mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：330.2[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-y基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000170
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得((2R，3S，4R，5S)-5-(2，4-二酮-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)-1，2，3，4-四氢吡啶-5-y基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS35。
MS m/z(ESI)：570.0[M+H] +。
实施例36
(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000171
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((苄氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000172
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(8g，21.6mmol)溶于80ml乙醇，接着逐滴加入713.53mg甲醛和2.55g苄氨的混合液。随后加热至70℃回流。反应3小时后旋干过柱，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((苄氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯
MS m/z(ESI)：490.2[M+H] +。
第二步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000173
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-((苄氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯(4g，8.17mmol)溶于40ml甲醇，在氢气氛中加入Pd/C 0.04g，搅拌过夜。随后滤掉钯碳，旋干后在甲基叔丁基醚中打浆，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯
MS m/z(ESI)：400.1[M+H] +。
第三步：1-(氨甲基)-5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000174
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酯(2g，5.01mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
MS m/z(ESI)：274.1[M+H] +。
第四步：(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000175
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((2-丙酮基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-5-(1-(氨甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS36。
MS m/z(ESI)：514.0[M+H] +。
实施例37
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000176
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲酯)-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000177
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml甲苯，加入乙醛酸甲酯(0.951g，10.8mmol)后加热至65℃，反应4小时。随后反应液直接旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲酯)-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：459.1[M+H] +。
第二步：甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟基乙酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000178
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲酯)-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-氧乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.36mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸酯。
MS m/z(ESI)：333.1[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000179
甲基2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸酯为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(1-羟基-2-甲氧基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS37。
MS m/z(ESI)：573.0[M+H] +。
实施例38
((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-氨-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000180
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-氨基-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000181
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml甲苯，加入α-酮酰胺(0.789g，10.8mmol)后加热至65℃，反应4小时。随后反应液直接旋干。粗品使用柱层析纯化，得(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-氨基-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸。
MS m/z(ESI)：444.1[M+H] +。
第二步：2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟基乙酰胺
Figure PCTCN2023070774-appb-000182
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(2-氨基-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.51mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟基乙酰胺。
MS m/z(ESI)：318.1[M+H] +。
第三步：((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-氨-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000183
2-(5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2，4-二酮-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟基乙酰胺为原料参考实施例18第三步制得((2R，3S，4R，5S)-5-(1-(2-氨-1-羟基-2-酮乙基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS38。
MS m/z(ESI)：558.0[M+H] +。
实施例39
(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000184
第一步：(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯
Figure PCTCN2023070774-appb-000185
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰基甲基)-5-(2，4-二氧-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(4g，10.8mmol)溶于40ml乙醇，接着逐滴加入356.76mg甲醛和1.01g3-甲基-2-丁烯-1-胺的混合液。随后加热至70℃回流。反应3小时后旋干过柱，得到(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯。
MS m/z(ESI)：468.2[M+H] +。
第二步：5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基) 氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮
Figure PCTCN2023070774-appb-000186
(2R，3R，4S，5S)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-3，4-二乙酸酯(2g，4.28mmol)加入20ml 7M氨甲醇溶液，搅拌4小时后旋干过柱纯化。得到5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮。
MS m/z(ESI)：342.2[M+H] +。
第三步：(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸
Figure PCTCN2023070774-appb-000187
5-((2S，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)吡啶-2，4(1H，3H)-二酮为原料参考实施例18第三步制得(2R，3S，4R，5S)-3，4-二羟基-5-(1-(((3-甲基丁-2-烯-1-基)氨)甲基)-2，4-二酮-1，2，3，4-四氢吡啶-5-基)四氢呋喃-2-基)甲基四氢三磷酸，离子交换，得到其钠盐，下文简称LS39。
MS m/z(ESI)：582.1[M+H] +。
实施例40：EGFP mRNA的转录实验
LS1：
将实施例1中的化合物LS1配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS1、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智) 1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS1的结果见图1(产率为7.09mg/mL)。
LS4：
将实施例4中的化合物LS4分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS4、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS4的结果见图1(产率为2.54mg/mL)。
LS18：
将实施例18中的化合物LS18分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS18、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS18的结果见图1(产率为1.59mg/mL)。
LS21：
将实施例21中的化合物LS21分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS21、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公 司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS21的结果见图1(产率为0.85mg/mL)。
LS24：
将实施例24中的化合物LS24分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS24、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS24的结果见图1(产率为7.35mg/mL)。
LS27：
将实施例27中的化合物LS27分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS27、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS27的结果见图1(产率为3.44mg/mL)。
LS29：
将实施例29中的化合物LS29分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH 调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS29、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS29的结果见图1(产率为1.23mg/mL)。
LS31：
将实施例31中的化合物LS31分别配置成为100mM水溶液并使用NaOH(1M)将pH调节至8.0-8.5。
取1.5mL离心管加入2μL配置完成的100mM的LS31、ATP、GTP和CTP水溶液(购自杭州美亚药业股份有限公司)。复合酶(40U/μL RNA酶抑制剂(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10603ES05)，0.1U/μL无机焦磷酸酶，1000U/μL T7 RNA聚合酶(上海翊圣生物科技有限公司，货号：10618ES90)，0.2M氯化镁)2μL。10×反应液(400mM Tris-HCl，60mM MgCl 2，20mM Spermidine，100mM DTT，pH 7.9)2μL。EGFP DNA模板(购自金维智)1μg补加超纯水至20μL。37℃孵育2小时后加入1μL DNA酶，继续37℃孵育6小时，对转录完成产物进行2.5M氯化锂沉淀或利用DEAE纤维素色谱柱纯化。产物纯化完成后通过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，LS31的结果见图1(产率为2.12mg/mL)。
EGFP mRNA的酶法加帽：
纯化完成后将EGFP mRNA样品加热至65℃保持5min后迅速转至冰上冷却至0℃，加入10×Capping Buffer，10mM GTP，2mM S-Adenosylmethionine，10U/μL牛痘加帽酶37℃孵育30min。
加帽完成后的EGFP mRNA利用DEAE纤维素色谱柱进行纯化。并利用LabChip GXII Touch HT(PerkinElmer)进行EGFP mRNA纯度测试，LS1-LS3的结果见图2-4。纯化完成后的EGFP mRNA放入-80℃进行保存。
实施例41：利用带有不同修饰核苷酸的EGFP mRNA对靶细胞进行转染并检测靶细胞的阳性率和荧光蛋白的表达效率
将LONZA电转液按a/b＝0.82/0.18比例混合，取10μg含有1-39实施例中修饰核苷酸的 不同的EGFP mRNA样品与相应电转液混合均匀。
将CD3/CD28抗体孵化，加入D-PBS缓冲液，调整浓度为5μg/mL，混匀后加入6孔板进行37℃孵育。
将低温冻存的PBMC(外周血单个核细胞，购自妙顺生物科技有限公司)进行复苏后，1×10 7个细胞分装至1.5mL离心管内，加入电转液及EGFP mRNA样本混合液，混合均匀后进行电击。电穿孔完成后将细胞悬液加入含2％FBS的AIM-V培养液中37℃，5％CO 2培养。
4-6小时后取出CD3/CD28抗体包被平板，去除D-PBS缓冲液，将电转完成的PBMC转移至抗体包被平板中并补加IL-2(山东港泉药业)至500U/mL，37℃，5％CO 2培养。
培养4-5天后将PBMC细胞转移出抗体包被平板后加入新鲜含2％FBS的AIM-V培养基(Gibco)，并加入IL-2抗体至浓度200U/mL。分别在电转后1天和14天收集细胞样本，并用流式细胞仪检测样本PBMC细胞的阳性率和EGFP mRNA的表达效率。结果显示LS1-39的EGFP mRNA均能对靶细胞进行转染，而且表达效率较高。
结果显示，修饰核苷酸可以通过体外转录，酶法加帽，柱纯化的方法整合进入mRNA内部实现对尿苷的替换，并且取得了mRNA结构完整性和纯度，从而为药用mRNA的制备提供了更多的选择。

Claims (22)

  1. 下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100001
    式中，
    R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；
    R 2和R 3各自独立为羟基或C1-C6酰基；
    R 4为任选取代的C1-C4烷基；
    X和Y各自独立为O或S。
  2. 如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，式I所示的化合物如下式I’所示：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100002
  3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R 1中：
    所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和- NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基；优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地选自氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基；优选地，所述4-9元杂环基任选地被1-3个C1-C4烷基取代；
    所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代；所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地，环中的氮原子被C1-C4烷基取代；优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，任选地被1-3个C1-C4烷基取代，优选选自氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基，所述5-10元杂芳基选自吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基，任选地被1-3个C1-C4烷基取代。
  4. 如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基；或
    所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
  5. 如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，R 2和R 3各自独立为OH或乙酰基；优选地，R 2和R 3为相同的基团。
  6. 如权利要求1-5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，R 4为被羟基或C1-C6酰基取代的C1-C4烷基；优选地，R 4为被-OH或-O-乙酰基取代的C1-C4烷基。
  7. 如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，R 2和R 3都为羟基，R 4为羟基取代的C1-C4烷基，优选为CH 2(OH)-；或R 2和R 3都为乙酰基，R 4为乙酰基取代的C1-C4烷基，优选为CH 3COCH 2-。
  8. 如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，所述化合物选自：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100003
    Figure PCTCN2023070774-appb-100004
    Figure PCTCN2023070774-appb-100005
    Figure PCTCN2023070774-appb-100006
  9. 下式II所示的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100007
    式中，
    R 1选自H、氰基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6烷硫基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的4-9元杂环基和任选取代的5-10元杂芳基；
    R 2和R 3为羟基；
    X和Y各自独立为O或S；
    R 6为：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100008
  10. 如权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，式II所示的化合物如下式II’所示：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100009
  11. 如权利要求9或10所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，R 1中：
    所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基和C1-C6烷硫基任选地被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基；优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地选自氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌嗪基、哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基；优选地，所述4-9元杂环基任选地被1-3个C1-C4烷基取代；
    所述C3-C8环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基各自任选地被1-3个选自卤素、羟基、C1-C4烷基和卤代C1-C4烷基的取代基取代，优选地被1-3个选自卤素和C1-C4烷基的取代基取代；所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，优选地，环中的氮原子被C1-C4烷基取代；优选地，所述4-9元杂环基为含氮和/或氧的杂环基，任选地被1-3个C1-C4烷基取代，优选选自氮杂环丁烷基、N-甲基氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、N-甲基哌啶基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基和氮杂环庚烷基，所述5-10元杂芳基选自吡咯基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、哒嗪基和嘧啶基，任选地被1-3个C1-C4烷基取代。
  12. 如权利要求9-11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，所述R 1为任选被1-3个选自C1-C4烷氧基、羟基、-NR aR b、氰基、4-9元杂环基和-COR 5的取代基取代的C1-C6烷基，其中，R a和R b各自独立选自H、C1-C4烷 基、C1-C4酰基取代的C1-C4烷基、和C2-C6烯基，或者R a和R b与它们所连接的N一起形成4-9元杂环基，R 5为C1-C4烷基、OH、C1-C4烷氧基和-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H或C1-C4烷基；或
    所述R 1为任选被1-3个选自卤素和C1-C4烷基取代的C3-C6环烷基、4-9元杂环基和5-10元杂芳基。
  13. 如权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，所述式II化合物选自：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100010
    Figure PCTCN2023070774-appb-100011
    Figure PCTCN2023070774-appb-100012
    Figure PCTCN2023070774-appb-100013
  14. 如权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体，其特征在于，所述药学上可接受的盐为碱金属盐，优选钠盐或锂盐。
  15. 编码多肽的分离的多核苷酸分子，其特征在于，所述分离的多核苷酸分子包含编码所述多肽的开放阅读框，所述开放阅读框含有腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和修饰的假尿嘧啶衍生物；其中，所述修饰的假尿嘧啶衍生物的结构如权利要求9-14中任一项所述的式II所示。
  16. 如权利要求15所述的分离的多核苷酸分子，其特征在于，所述分离的多核苷酸分子还包括5’UTR、3’UTR和5’帽结构中的一种或多种；优选地，所述5’帽结构选自：Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2-′氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
  17. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求15或16所述的分离的多核苷酸分子和药学上可接受的载体或赋形剂。
  18. 权利要求9-14中任一项所述的式II化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体在制备分离的多核苷酸分子中的应用。
  19. 一种制备mRNA以降低该mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，和/或增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求9-14中任一项所述的式II化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体制备该mRNA的步骤。
  20. 权利要求9-14中任一项所述的式II化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体在降低mRNA自身免疫原性，提高mRNA自身稳定性，增强mRNA在目标细胞内的表达时间和表达效率中的应用，或在制备用于制备自身免疫原性降低、自身稳定性提高、在目标细胞内的表达时间延长、和/或在目标细胞内的表达效率提高的mRNA的制剂中的应用。
  21. 下式Ia所示的化合物的制备方法：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100014
    其特征在于，所述方法包括：
    用保护基团保护下式1所示的化合物的羟基，获得受保护的式2化合物，然后使式2化合物在碱性条件下与化合物R 1-L反应生成下式3的化合物，然后使式3化合物脱保护，获得式Ia化合物：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100015
    式中，X和Y各自独立为O或S；G为羟基保护基团，优选C1-C4酰基，更优选乙酰基；R 1如权利要求1-4中任一项所述；L为离去基团，如卤素、-OTf。
  22. 下式IIa化合物的制备方法：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100016
    其特征在于，所述方法包括，使式Ia化合物通过三磷酸化生成式IIa所示的化合物：
    Figure PCTCN2023070774-appb-100017
    其中，X和Y各自独立为O或S；R 1如权利要求1-4中任一项所述；优选地，采用Yoshikawa方法或Ludwig-Eckstein方法进行三磷酸化。
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