HU228185B1 - Modified/chimeric superantigens and their use - Google Patents

Modified/chimeric superantigens and their use Download PDF

Info

Publication number
HU228185B1
HU228185B1 HU9903444A HUP9903444A HU228185B1 HU 228185 B1 HU228185 B1 HU 228185B1 HU 9903444 A HU9903444 A HU 9903444A HU P9903444 A HUP9903444 A HU P9903444A HU 228185 B1 HU228185 B1 HU 228185B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
region
sea
seq
binding
see
Prior art date
Application number
HU9903444A
Other languages
English (en)
Inventor
Lars Abrahmsen
Per Antonsson
Per Bjoerk
Mikael Dohlsten
Goeran Forsberg
Johan Hansson
Terje Kalland
Original Assignee
Active Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9601245A external-priority patent/SE9601245D0/xx
Application filed by Active Biotech Ab filed Critical Active Biotech Ab
Publication of HUP9903444A2 publication Critical patent/HUP9903444A2/hu
Publication of HUP9903444A3 publication Critical patent/HUP9903444A3/hu
Publication of HU228185B1 publication Critical patent/HU228185B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Módosított/kxméra-szuperantxgének és alkalmazásuk
A. találmány tárgyát funkcionálisan aktív módosított szuperantigének képezik, amelyek olyan vad-típusú szuperantigének (SA~í), .amelyekben egy vagy több aminosav helyettesítve van, a szuperantigén funkció megmaradása mellett- Ka egy vagy több helyettesitő aminosav (vagy azok konzervatív aminosav-megfeleldi) egy másik vad-típusü szuperantigén (SA-II) megfeleld pozíciójában is előfordul, a módosított szuperanfigénf kimérának (vagy hibridnek) nevezzük- A találmány szerinti kimérs-szuperantigének tehát legalább két különböző vad-típusú szuperantigánből származó részszekveneíát vagy régiót tartalmaznak.
A találmány szerinti szuperantigének alkalmasak immunreakciók kiváltására emlősökben, betegségek megelőzése vagy ke zelése cs1jabc1,
A. jelen bejelentésben igényeljük az 1996- március 29-én benyújtott 9601.245-5 szárná svéd bejelentés elsőbbségét, valamint az 1996, augusztus 12-én benyújtott 08/695.692 számú üSA-beli bejelentés elsőbbségét, az ezen bejelentések részét képező találmányi leírásokat a. jelen kitanítás részének keli tekinteni A k t as zámunk: S 6 7 6 5 ~1S 5 0/ PA graft) kífejeA „megfelelő pozíció kifejezés alatt azt értjük, hogy 'az egymást helyettesítő amínosavak, rész-szekvenciák és régiók funkcionálisan, ugyanazt a pozíciót foglalják el az Iés IX-szuperantigenekben, igy a szubsztitúció olyan kiméra formát eredményez, amely sznperantigénként képes működni.
Az „átültetett/átültetés/átültetendő zést a Xl-szuperantigén teljes szekvenciájának olyan részeivel kapcsolatban alkalmazzuk, amelyek az X~szuperan.tigén megfelelő- .részeit helyettesítették, még akkor is, ha egyetlen egy aminosav került helyettesítésre.
A „mődositott/kisiéra-sznperantígénekbe' be le értendőek a más úton módosított funkcionális sznpe.ran.t.igén.e.k is, mint például azok, amelyeket a találmány tárgyát képezdhoz nem kapcsolódé régiókban történő aminosav-heiyefctesitéssei módosítanak, célkereső Utarget~see.ki.ng) részegységhez konjugáltak, .beleértve azokat az összeépített formákat is, ahol a részegység polipeptid/fehérje természetű. A módosítások' végrehajtásának sorrendje tetszőlegesen megválasztható. Lásd alább.
S zupe r an11gének
A legelső definíció szerint (1988-1993 körül; a szuperantigének baktérium vagy vírus eredetű fehérjék, amelyek képesek a II. MHC-osztály antigénekhez kapcsolódni az
ezt megelö: 7.0 7 nt?. y.3. celluláris feldolgozás nélkül. és k Θ/ΟρΝιΘ K
a T-sej; :;ek aktivál ;áSára a Τ- sejt receptor (TCR) vari Λ V. t ; ... «ι,· ι ,λ .1. ,b
régiöjár :ak (Vp) £ Ι-láncához kapcsolódva. A kö' tő dós a T~
sej tek u v-· ú> ίΠ λ v* nyiag n agy részén ek/alcsoportjának a . νβ csa íad
korlátos > f · -¾ aktival ásához és a 11. MHC-osztályt expres-száló
se j tok 1; isiséhez V ~~ 7 β U. (szuperantigén ft ggő .O ’ j ?·
Φ X φφ .φ.φ * közvetített c.ito-ll.zis, S'DCC) .
A fenti definíció szerint a jól lantért vad-típusú szuperen!igének kosé tartoznak a staphyiococcus eredetű •enterotoxlnok ÍSSA, SEB, SEC!, SJSC2, SÉD, SEE és SEHi , További például, szolgálhat a toxikus shock szindróma l-toxtn (TSS'T-1, szintén staphyiococcus eredetű), az exfoiíáló toxinok (EXft) , a streptococeus pirogén exotoxln A, S és C ÍSPE-A, -8 és -C) , sz egér emlőtumor vírus fehérjék (MMTVj, a streptococeus M-fehérjék, a Clostrióiuís perfringens enterotoxin (CPE-T), a mkoplazma arthritis szuperantigének, stb. A szuper-antigének és tulajdonságaik Összefoglalásával Kotzín és attsai, (1993) közleménye foglalkozik.
A kilencvenes évek elején, fedezték fel, hogy aktívádé és ezt követő sejtlizis jöhet létre a II. MKC-os2táIytól független módon abban az esetben, ha a szuperantígént célkereső részegységgel, konjugáljnk, amely részegység képes sejtfelszíni struktúrához kötődni (Dohisten és mtsai.: S0920147Q és Abrahmsén és mtsai.: WO96O1650]. Célsejteket amelyek a célkereső részegység célbavett struktúráját hordozzák) és effaktor sejteket (T-sejtek) a konjugátűmmel ink.ubálva a célsejtek izzást szenvednek (szuperantigén antitest függő sejt-közvetített cítoiízis;, a II-osztály expressziójának bármiféle szükségessége nélkül.
A szuperantigénről alkotott mai felfogásunk értelmében, a találmányi gondolat szellemében - amennyiben másképpen nem jellemezzük - szuperantigénnek tekinthető bármely vegyül et (előnyösen poiipeptíd struktúra), amely képes egy sejtfelszíni struktúrához (célstruktúra) és egy vagy több polimorf TCR-láncfeoz kötődni - előnyösen a VS-lánchoz - és
** ' *.♦ >♦ eszel a 7~sejtek egy alcsoportját aktiválni, amelyek a kapcsolódásban résztvevő specifikus TCR-láncot expresszálják. Ennek következtében a T-sejtek eitotoxíkussá válnak azokra a sejtekre, amelyek a felületi struktúrát hordozzák (célstruktúra, célsejtek)·. Az aktivált 7-sejt alcsoport általában az egyén teljes 7-sejt mennyiségének körülbelül az 1-20 száz a1é kát a1kot j a,
Mutáltato 11 __ és kíméra-szupera n t igének kel végzett szerkezet és funkció kísérletek.
Kiméra-szuperantigének - beleértve azok pontmutál tatott formáit ·- mar korábban leírásra kerültek iKappler és mtsai.; WO9314364, Kappler és mtsai. (1992}; Grossman és mtsai. (1991); Hufnagle és mtsai. (1991); Hartwig és mtsai. (1993) ; Fraser és mtsai. (1993) ; Mollíck és mtsai. (1993); Irwin és mtsai. (1992); Hudson és mtsai. (1993); és Bianeo és mtsai. (1990)). Mollíck és mtsai., valamint Hudson és mtsai.. a kimérik tanulmányozása során kimutatták, hogy az SSA és az SEE V^-specificitása a karboxi terminális régióban elhelyezkedő bizonyos aminosav szekvenciáktól függ (azaz a 290., 206. és 207, aminosavak) . A jórészt ettől a régiótól függő Κβ-speoificításon túl, Mollíck és mtsai. azt ís ki tudták mutatni, hogy az SES-graftokát tartalmazó SEA νδδ-felé irányuló SEE-szerú aktivitásának teljes visszaállításához egy, az SEE-bol származó, az N-terminális 70 aminosavat tartalmazó fragmensre van szükség, Sz a fragmens a S£E-szerű II. Mnü-osztsly a-lánc kötőhely részeit tartalmazza, és az ezt az SEE-ből származó részt tartalmazó kiírtéra SEA/SSE-molekulák SSE-szera módon gátolták az SEA kötődését a II. MüC-osztály DRl-hez.
~
Legutóbb olyan SEE-SEA-kimérákat közöltek le, amelyekben a TCRVp~hez kapcsolódásban részt vevő régiók kerültek kicserélésre [L.amphaer és mtsaí.: J. Immuno1. 156 217« (1996)). Egy SBE-szuperantigén Fab antitest fúziós fehérjét ~ amelyben a T-sejtekkel való kölcsönhatásban részt, vevő SEE-domének lettek helyettesítve a. megfelelő nem-homológ SSA-dcménekkei - ismertettek az 1996. évi ABRF konferencián [Björk és mtsai. : M45 (1996); ABRF Biomo-iecular 'Technigues, San Francisco, CA].
Szuperantigének gyógyászati alkalmazása
A nem-kenj ugá.'lt szuperantigének gyógyászati alkalmazását korábban már javasolták, és feltételezhető, hogy gyógyító hatását az ituaunrendszer általános aktiválása útján fejti ki [Kalland és mtsai.: W09104053; Termán és mtsai.: W09110680 és WC93241.3Ö; Newall és mtsai. (1991)1.
Azt is javasolták, hogy célkereső részegységekhez konjógáit módosított szuperantigéneket alkalmazzanak (Dohisten és mtsai.: $09201470; és Abrahmsén és mtsai. : W09601650, mindkettő a kitaritás részének tekintendő]. Ez lehetővé tette a Vp-n keresztül történő T-sejt aktiválás szélesebb körű gyógyászati alkalmazását. A napjainkig tanulmányozott kon.jugá tárnoknak csökkentett Il-osztáiy affinitása volt, amely viszont a súlyos szisztémás toxicitás csökkenéséhez vezetett, amely rendszerint velejárója a vad-típusú sznpe ránt igenekrek *
Termán és mtsai. (W09110680 és Χ09324136] félmondatokban rákterápiás alkalmazást javasolt módosított szuperantigénekkel és szuperantigén fragmensekkel,
Kappler és mtsaí. (WO9314634) javasolták olyan nem-
* * konjugált szuperantígének (SEB) alkalmazását, amelyek imitáció végrehajtása következtében elvesztették νβ-kötő vagy
II. MHC-osztály kötő képességüket (vakcinák és szuperantígének toxikus hatásának semlegesítése összefüggésben) . Afcrahmsén és misai. [WO9BÖ16501 javasolták a konjagáit szuperantigének rákterápiás alkalmazását, amely szuperantigének ΙΙ-osztály antigén kötő képessége módosított, előnyösen csökkentett. A módosítások magukba foglaltak egyedülálló mutációkat éppúgy, mint különböző szuperantigének közötti kimérák kialakítását.
A humán .populációkból nyert szérum, általában magas titerrel tartalmaz szuperantIgének elleni antitesteket. A staphylococcus eredetű szuperantigének esetében például a relatív fciterek Így következnek egymás után: TSST-1 > SEB >
SEC! > S.E3 > SEC 2 > SSA > SÉD > SEE, Ezek a relatív literek Immunogénitási problémákat jeleznek, és problémák léphetnek fel az antitestek semlegesítésével, amennyiben az SE-k parentorális beadásra kerülnek. Csupán ezeket a problémákat tekintve, az SEB kell, hogy legyen az előnyösen alkalmazható staphylococcus eredetű szuperantigén. A fúziós fehérjékkel végzett munkával összefüggésben azonban azt találtuk, hogy az SSE-konjugátumok T-sejt II. MHC-osz.táiy független citotoxíkus képessége ~ a szuperantigén-antitest függő sejtes c.itotoxícitás (SASCC) - gyenge. Az anti-SE ti terek szintén azt mutatják, hogy előnyökkel járhat egy „magas titerű szuperantigén megváltoztatása oly módon, hogy inkább egy „alacsony titerű szuperantigénhez legyen hasonló,
A találmány tárgyát képezi egy eljárása a korábban ismert szuper-antigének javítására, különös tekintettel.
immunogenitásuk és a semlegesítő antitestekkel való reakciökészségük csökkentésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás, amellyel olyan sznperantigéneket állíthatunk elő, amelyek gyógyszerként való alkalmasásuk esetén kevesebb mellékhatással rendelkezzenek.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás javított szuperantígének előállítására, amelyek aktív anyagként alkalmazhatóak rákterápiában, autoimmun betegségben, parazita fertőzésben, vírusfertőzésben szenvedő emlősök kezelésében, vagy más, felületükön II. MHC-osztály antigéneket, és/vagy olyan struktúrákat expresszálő sejtekhez kapcsolódó betegségekben, amely struktúrák specifikusak a megfelelő betegségekre és- a szuperantigénbe. beépített céikersső részegységhez kötődni képesek.
Az .SEA- és az SEF-szekvencíák homológra analízise (2. ábra) kimutatta, hogy az eltérő amínosavak nyolc különálló régióban koncentrálódnak. Ezen a nyolc régión kívül - a szekvencia 34 százalékát kiadva - a két SE azonossága 97 '%., és a maradék különbségeket konzervatív aminosav szubsztitúciók teszik ki. A régiók közül, négy szerkezetileg közel van a két II. MlíC-osztály kötőhelyhez ;8: 37-5Ό. amínosavak; D: 71-73. aminosavak? E: 136-149. aminosavak és G: 189-195. aminosavak) és nem valószínű, hogy kölcsönhatásba lépnének a TCR-rei, A további négy régió (A: 20-27. aminosavak? C; Sö~ö2, aminosavak; F: 161-176. aminosavak és K; 2Ö0--207. aminosavak) a molekula peremén helyezkedik el, a vélelmezett TGR-kötŐhely szomszédságában, amelynek a két alegység közötti árokban kell elhelyezkednie. Az. egyes régiók átültetősével (a különbséget jelentő amlnosavak kicserélésével) rájöttünk arra, hogy az S£A.~k.onjugátuxaok cltotoxikus választ indukáló hatása, éppúgy, mint a Ili MHC-osztály hiányában a pr öli feratív választ megerősítő hatása, az SEA TCR-köto dóménjának egy adott régiójához kapcsolható·. Ez a régió (A) átvihető az SSE-molekuIára és nagy hatással van a2 aktivitásra a II-osztály hiányában, bár csak korlátozott hatással rendelkezik a szuperantigén νβ-specifieitására (€,. ábra, 2. táblásat) . Úgy tűnik, hogy az összes régió (A, C, F és H) közvetlenül vagy közvetve részt vess a TCR-rel való kölcsönhatásban, ami megváltoztatott serkentő hatásban nyilvánul meg egér T-sejt híbrídőmákon (2. táblázat).
A működési analógiának megfelelően elfogadható, hogy egy hasonló szerkezeti szétválást tapasztalhatunk ezekben a TCRVp-kötö tulajdonságokban az SSA-val és az SEE-vel analóg szuperantigének esetében ís. Lehetséges, hogy ugyanez érvényes más szuperantigén típusok esetében is, amelyekben a kötő struktúrák másképpen szerveződnek. Felfedezésünk lehetővé tette, hogy körvonalazzuk olyan kiméra-szuperantígének megszerkesztését,· amelyek rendkívül nagy potenciális jelentőséggel bírnak, mint gyógyitő hatású anyagok.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás betegség kezelésére emlősben, annak immunrendszerét aktiválva, egy módosított, előnyösen kíméra-szuperantigén gyógyászatllag hatékony iimmunrendszert, aktiváló) mennyiségének beadásával. Az emlős előnyösen humán. A kérdéses betegségek többnyire olyan sejtekkel kapcsolatosak, amelyek felületükön a szuperantigénhez kötődő -célstruktúrát sxpresszáiják. A legtöbb esetben a céistruktúra különbözik a TüR-epitóptől, κκ ** *9**
♦. 9 * ♦ * β «>«*** * * * ν # χ > 9 ♦ amely általában kapcsolódni képes a szuperantígénekhez. A oéistruktúrához történő kapcsolódás ugyanakkor lehetővé teszi a TCR-hez való kötődést és a T-sejt aktiválást. Például szolgálhatnak a II. MHC-osztáiy antigénjei és más sejtfelszíni struktúrák/ amelyek a betegségek lezajlásával összefüggő sejteken expresszálödnsk. Például szolgáló betegségek közé tartoznak a maíignus tumorok, közöttük bármely típusú rák (olyanok mint karóinéma, szarkóma, melanóma, limfóma, stb.}, a vírusfertőzések, parazita fertőzések és autoimmun méh, vese,· betegségek. A kezelendő rák lehet végbe!, mai gyomor, vékonybél, patkóból, prosztata, here, bő: máj, hasnyálmirigy, csontváz stb. elhelyezkedésű, beleértve ezek különböző elhelyezkedésű áttételeit. A találmány szerinti aktív hatóanyag alkalmazható a rákos elváltozások úgynevezett multidrog-rezísztens formáiban is, A cé.lstruktürát expresszálő sejtek lehetnek olyan sejtek is, amelyek valamilyen módon kontrollálják, vagy szabályozzák a kezelendő betegség kialakulását.
Az eljárás jellemző sajátossága, hogy módosított szuperantigént alkalmazunk, amelyben vad-típusú szuperantígén (SA-Ϊ) T-sejt alcsoport kötődését egy polimorf TCP-láncon - adott esetben TCRVp - keresztül biztosító régiójában egy vagy több aminosavat megfelelő aminosawal kicserélünk úgy, hogy az így módosított szuperantigén megtartja szuperantígén aktivitását, A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint kiméra-szaperantigent állítunk elő úgy, hogy egy első vad-típusú szuperantígén ÍSA-1; egy régiójában (régió-I) egy vagy több aminosavat helyettesítünk a megfelelő egy vagy több aminosawal egy második vad« * * típusú szuperantigé-n (SA-II) me-gfelelő régiójából (régíöII) . Az I- és XI-·régiók egymástól -aminosav szekvenciájukban különböznek. Az I- és Il-szuperantigéneket úgy választjuk ki, hogy az 1- és Il-z'égiók egymást helyettesíteni tudják anélkül, hogy a szuper-antigén funkció megsemmisüljön. Ebben az összefüggésben figyelembe kell venni azt a tényt is, hogy egy adott régiő-X egymagában nem. feltétlenül cserélhető szabadon egy másik vad-típusú szuperantigén megfeleld régiójával, -de amennyiben más, T€R~kötődést -és T-sejt aktiválást meghatározd régiókkal együtt kerül sor a cserélésre, eredményképpen funkcionálisan aktív szupsrantígénhez jutunk. Az érintett régiók általánosságban, kevesebb, mint húsz aminosavat tartalmaznak,- különösen az SEA-val analóg szupsrantígének esetében. A helyettesítő aminosav így különbözik a helyettesített aminosavtól és feltételezhetően konzervatív szubsztitúciókat és más aminosav szubsztitúciókat is tartalmaz, amelyek funkcionálisan aktív módosított szupsrantí génekhez vezetnek,- amelyek lehetővé teszik a ΤΟΑνβ kötődést és a T-sejt alcsoport aktiválását. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerinti módosított szuperantigének a legtágabb értelemben magukba foglalnak bármely módosított szuperantigént, amelyekben a fent említett régiókban, egy vágy több aminosav funkcionálisan he2 yg t; ( gg f f; ve 1Ct1 .
A „konzervatív szubsztitúció kifejezés alatt olyan helyettesítéseket értünk, ahol az aminosavat kémiailag hasonló aminosawal cseréljük ki, azaz hídrofőfo karakterűt egy másik hídrofőfo karakterűvel, töltéssel rendelkező amínosavet egy tőle különböző, de h x aminosavval, stb.
Az elsőbbség időpontjában 1-, II-, stb. szuperantigénként a staphylococcus eredetű enterotoxinok, közelebbről azok, amelyek cinket koordinálnak - mint például az SEA, SEE, SÉD és valószínűleg az SEH is - voltak előnyösen alkalmazhatóak.
A szerepet játszó régiók a lentebb említett tulajdonságok valamelyikével rendelkezhetnek (lásd még a példákat és a találmányi gondolat kifejtését), azaz:
(1) Nagy hatással vannak a szuperantigén aktivitásra, mint olyanra, és korlátozott hatással a ?CR-specíficitásra, közelebbről a νβ spéciticitásra, Az SEA- tipusű szuperantigének esetében ez az „A régiót jelenti (a 20-27. pozícióban található aminosavak).
/2) Kifejezetten hatással vannak a .spéci*icitásra a polimorf TCR-láncok ~ .mint például a Υβ-lánc - kötésének vonatkozásában. Az SEA~típusú sznperantígének esetében ez a ,,C (a 60-62. pozíciójú aminosavak) , az „F (a. 110-126. pozíciójú aminosavak) és a „F (a 200-207. pozíciójú amínosavak) régiókat jelenti.
Az SEA-szera szuperantigének esetében ez az alábbi szubsztitúciók közül egy vagy több meglétét jelenti (az SőA-bői SEE-be történő átültetésekre alkalmazva, SEE/A-kimérák;:
A- régió: R2 oS y N21T
régi ö: G60D, F62S
-
régió: H111R, ÜU
Cl 2 62;
régió: D20GG, R20
GW, S124V, #·*. \ *
Az elsőbbségi időpontban előnyösen az összes szubsztitüdőt létrehoztuk, mindegyik régióra. Más szuperantigének esetében is, az egymásnak megfelelő pozicíók/régi.ók. között feltételezhetően végre lehet hajtani analóg szubsztitúciókat .
Tipikusan kiindulhatunk egy első szuperantigénből, mint például SEE és SÉD, ezt követően egyet vagy többet kicserélünk az egyedülálló νβ-kötő régióiból egy második szuperantigén ~ Mint például SEA ~ megfelelő régióival; az. első és második szuperantigéneket előnyösen úgy választjuk ki, hogy normái humán szérumban az antitest titer az első szuperantigén esetén alacsonyabb legyen, mint a második szuperantigénre. Az. SEA- és SEE-kimérák -esetében az előnyös megoldásokat az SEE/A-A, SEE/A--AH és SEA/E-BDSG kimérik képezik, a legelőnyösebb pedig az SEE/Ά-Ά kiméra. Lásd még a példákat és az ábrákat.
Az A, C, F és H régiókkal együtt más részekhez tartozó amínosavak is kicseréihetöek. Az egyik típusú kicserélés célja a II-osztsiy kötőképesség csökkentése, mert. ez a tulajdonság- összefüggésben van a szuperantigén terápia során fellépő gyakori mellékhatásokkal {általános ímmunaktiválás egyidejű tumor nekr-ózis faktor (INF) és γ-interferon szisztémás felszabadulással együtt). Olyan szuperantigének esetében, mint például az SEA, SÉD és SEE, előnyösen azokban a pozíciókban hajtunk végre cserét, amelyek a cinkionokat koordináló képesség szempontjából fontosak, mint például a £25. és .227. pozíciókban az SEA H225A mutáció esetében, és előnyösen a D22TA csere lesz pozitív hatással a toxikus mellékhatások csökkentésében {lásd még; Abrahmsén és
“ ,,1 «<
mtsai.: WS6Ö1650; valamint Fraser és mtsai. (1993)].
Más szubsztitúciók is végrehajthatók a molekula teljes terjedelmében, amennyiben ezek nem teszik tönkre a szuperantigén funkciót, ilyenek lehetnek például konzervatív szubsztitúciók, előnyösen a Il-osztály és a TCR kötésében résztvevő régiókon kívül. A II. MHC-osztály kötését módosító változtatás a DNS szekvenciában, vagy bármely más, DNS szinten történő változtatás végrehajtható a TCR kötést biztosító régiókban létrehozott változtatás előtt vagy után. Ezek a más típusú módosítások éppígy létrehozhatóak az I-régióban történő aminosav kicserélés előtt is. A kitanítás érteimében, az igénypontok szerinti módosítás megkezdésekor a „vad-típusú szuperantigén alkalmazása kifejezés elsődlegesen az I-régióban található vad-típusú aminosav szekvenciára vonatkozik, amely régión kívül korábbi módosítások már létrehozhatóak voltak.
Kiméta és mutálhatott S2uperantigémek megszerkesztése a technika állása szerint ismert eljárásokkal megvalósítható.. Az egyik szuperantígénre specifikus régióból a másik szuperantigén megfeleld régiójára történő átváltást a genomí szinten valósítjuk meg, és végrehajtható agy teljes szekvencia cseréjével, vagy azoknak a specifikus bázisoknak a pontmutáitatásával, amelyek a kívánt aminosav szekvencia létrehozásához szükségesek. Lásd például a kísérleti részt és a fentebb idézett korábbi tanulmányokat. A „mutáció kifejezés magába foglalja egy vagy több aminosavhelyettesítését, beszúrását vagy eltávolítását, a mutációnak alávetett fehérjét kódoló DhS-szekvencia módosítása útj án.
χ. Φ χ Φ < Φ « * Φ Φ Φ X V * 4 * φ X X Φ X X Φ φτ X Φ « * *
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott szuperantigén lehet a fent leírtak szerint módosított nemkonjugált szuperantigén, például egy módosított szuperántígén, amelyben nincs jelen egy specifikusan hozzákapcsolt célkereső részegység, de kifejezetten képes mind a
11. MHC-osztály antigéneket, nind a 'TCR-en keresztül a Tsejtek egy alcsoportját meg kötni. Előnyösebben, a módositett szuperantigént, előnyösen egy kiméra-szuperantigént, cél kereső részegységhez konjugálunk. Ez utóbbi esetben a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy fúziót hozunk létre a célkereső részegység és a módosított szuperantigén között. A konjugátűrnek, mint olyanok, újak, és a találmány egy külön megvalósítási módjának tekintendők.
A találmány szerinti konjugátumok szerkezete analóg a már régebbről ismert anti.t.est-szuper.antigén konjugátumokkal (Dohisten és mtsai.: WO920147Ö; valamint Abrahmsen és mtsai.:: W096Ö1650, mindkét publikáció a kítanitás részeként tekintendő], azaz. a konjugátumok gyakran a következő képlettel irhatők le:
T-S-SAÍső ahol T felel meg a célkereső részegységnek, SA(m) felei meg a módosított - előnyösen kínéra ~ fentiekben meghatározott szuperantigénnek, és -B~ egy kovalens hidat jelképez, amely a T és az SA(m] részeket összekapcsolja. Elvben T további szuperantigén részegységeket tartalmazhat {SACm}) és SA(m) további célkereső· részegységeket is tartalmazhat, azonban az előnyösen alkalmazható kenjugatumokban csak egyetlen. célkereső részegység és egy módosított « « « « szuperantígén részegység található a fentiek szerint.
Elvileg T bármely olyan Molekula lehet, amely képes sejtfelszíni struktúrához kapcsolódni, előnyösen egy betegség specifikus struktúrához, A sejtfelszíni struktúra, amelyre a T irányul, általában különbözik: (a; a νβ-lánc epitéptöl, amelyhez sz Síim; kapcsolódik., és ifc) a 11. MEGosztály epitöspoktól, amelyekhez a szuperantigének kapcsolódnak. A célkereső részegység elsődlegesen olyanok közül választható, mint például az ínterieukinok [például interIeukín-2), hormonok, antitestek, - beleértve az antitestek antigén-kötő fragmenseit - növekedési faktorok, stb. [Lásd például: yfoodworih: Preciiníoal and Ciinical Development of Cytokine Toxins, előadásra került: fíolecular Approaches to Cancer Immunotherapy, Ashville, NC, {1993;}.
Az elsőbbségi időpontban előnyösen antitestet alkalmaztunk, mint T, {teljes nagyságú antitest, Fab, Fiab}?, Fv, egylánoú antitest és bármely más antigén kötő antitest fragmens;, különös tekintettel az antitest aktív íragmensekre [mint például Fab; , amelyek az úgynevezett C242 epltopra irányultak [Lindholm és mtsai.: W093öl303j, vagy előnyösebben a tüdőrák specifikus STi-antítest kötő epitópjára irányultak jStern és mtsai.: W08S07947} . Ez azonban nem zárja ki, hogy más rákspecifíkus antitestek hasonlóképpen jól, vagy esetleg még jobban működjenek. Az „antitest kifejezés magába foglal monoklonálís és úgyszintén poliklonális variánsokat, előnyt élveznek a no no k1on ális ké s z i tmén ye k.
A T-részegység irányulhat a többé-kevésbé egészséges sejtek felszínén található egyedülálló struktúrákra is, *
előnyösen elvan hidrofil amínosavakat tartalmazva, Min amelyek szabályozzák vagy kontrollálják egy betegség kifejlődését.
A -B- hídstruktűra a korábban leírtak szerint választható ki (Dohisten és mtsai.: $09201470; valamint Abrahmsen és mtsai,: WO9601650], azaz -B~ előnyösen hidrofil jellegű, és az alábbi szerkezet (ekj bői egyet vagy többet tartalmaz; amid, tioéter, díszül fid, stb. A legkézenfekvőbb hídszerkezetek azok, amelyeket rekombináns eljárásokkal állítunk elő, azaz a konjugáció a gének szintjén történik meg. Az ilyen esetekben olígopeptid hídszerkezetek jönnek létre, _______________ _ ; .........r például a Gin, Ser, Gly, Glu, Pro, Hís és Arg. Különösen előnyös B-szerkszetek azok a peptidhidafc, amelyek 1-10 aminosavat tartalmaznak, és abszolút előnyösen 3-7 aminosavat tartalmaznak. Sgy tipikus hídszerkezetre például szolgálhat a GiyGlyPro tripeptíd, az I, azonosítási szám szerinti szekvencla.
A találmány szerinti új konjugatnmok előállítása elvileg két fő hton történhet; (1) rskombináns eljárások; és (2) a célkereső T-részagység kémiai utón történő hozzákapcsolása egy módosított - előnyösen kiméra szuperantigenhez (SAjm; ), ahogyan az előbbiekben meghatároztuk, A szakember számára ezek az eljárások ismertek és nagyszámú variánst tartalmazhatnak.
Módosított nem-konjugált szuperantigén és eélkereső 7részegyssg kémiai összekapcsolásához gyakran használjuk fel. a vagyaiébekben több helyen is előforduló funkcionális csoportokat (például primer amino csoportokat vagy karfcoxi csoportokat). Ebből következik, hogy a végtermék a kapcso~ 17 lási helyekben egymástól különböző molekula konjugátumok keverékét fogja tartalmazni, éppúgy, mint 'különböző heteroés homo-kongugaturnakát.
Rekombínáns konjugátumok esetében ífúziós fehérjék; a kapott konjugált anyagok a kapcsolódási hely tekintetében egyformák lesznek, A kiméra-szuperantigén amino-terminálisa egyaránt kapcsolódhat a célkereső részegység karboxiterminálisához, vagy fordítva. Antitestek esetében - mint például intakt antitestek ss antigén-kötő fragmensek ÍFab# Fv, egyláncú antitestek# stb,) - a könnyű és nehéz lánc •egyaránt alkalmazható a fúzióban.. Jelenleg a rekombínáns konjugátumok alkalmazhatók előnyösen# legelőnyösebben pedig Fab-fragmenseket. alkalmazunk oly módon, hegy az antitest nehéz lánc (CH1) első konstans dóménjéhez kapcsoljuk a ki.méra-szuperantigén aminö-termínálisát, de nem zárjuk ki az analóg kapcsolást a könnyű lánchoz, vagy a VH és VL •doménekhez, amely kapcsolások szintén igen jó eredményeket biztosíthatnak A találmány szerinti módosított szuper.antigének (a fuzionált és a nem-konjugált formák esetében egyaránt) nagyméretű rekombínáns termelésére a fő gazdasejt az E, coli.. Ez a gazdaszervezet elvben két utat is biztosíthat: sejten belüli termelést és szekréciós termelést. Ez utóbbi variáns alkalmazható előnyösen, mert biztosítja a helyesen fai tekeredett fehérjék elválasztását a periplazmától és a tenyésztáptalajtól, A fentiek nem zárják ki a lehetőséget, hogy aktív konjugátuook más gazdasejtekben is előálláthatóak, például eukarióta sejtekben# mint például élesztő, vagy emlős sejtekben.
1.8 * ♦
Gyógyászati készítmények, adagolásuk és a beadásuk mő dg
Egy harmadik szempont szerint a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények is, amelyek a fentebb meghatározott, találmány szerinti módosított - előnyösen, kíméra szuperantigéneket tartalmazzák (mind. a konjugált és a nemkonjugált formákban). A gyógyászati készítmények a technika állása szerint már ismertek lehetnek, azzal az eltéréssel, hogy találmány szerinti szuperantigént is tartalmaznak. Ily módon a készítmények lehetnek liofilizált szemcsés anyagok, steril, vagy aszeptikus körülmények között készített oldatok, tabletták, ampullák, stb, Hordozó anyagok, mint például víz (előnyösen fiziológiailag elfogadható pH értékre pufférőit formában, például mint a PBS esetében), vagy más közömbös szilárd vagy folyékony anyagok, lehetnek jelen. Általánosságban ismertetve, a készítményeket ügy állítjuk elő, hogy a konjugátumot összekeverjük, feloldjuk, hozzákötjük vagy bármely más módon összehozzuk egy vagy több vízoldható vagy vízben oldhatatlan, vizes vagy nem-vizes hordozóval, szükség szerint további megfelelő segédanvagokés adjuvánsokkai együtt. Nagyon fontos, hogy és a körülmények hátrányosan ne befolyásolják a módosított szuperantigén aktivitását.
Általánosságban a találmány szerinti szuperantigén előre adagolt dózisokban kerül árusításra és beadásra, mindegyik dózis a konjugátum hatékony mennyiségét tartalmazva, amely a leírásban bemutatott eredmények alapján elképzelhetően a 10 ng ···· 50 mg tartományban van, közelebbről a 10 ng - 1 mg, vagy a 10 pg - 50 mg tartományon belül van. A pon< « * ' » « * „ «*» ♦·».» * > fc ; Μ * * * * * * * « χ «« χ y * tos dózis ese.tról-esetre változik, a beteg testsúlyától és életkorától,· a beadás módjától, a betegség típusától, a célkereső részegység, a szuperantígén, a kapcsolóelem (~B~ ), stb. temészetétől. függően.
A beadási módot a technika állása szerint ismertek közút választhatjuk, azaz a találmány szerinti módosított, szuperantigén célsejtet elpusztító hatásos mennyiségét, vagy terápiásán aktív mennyiségét érintkeztéljük a célsejtekkel. A fentebb részletezett indikációk esetében ez többnyire parenterális beadást jelent, mint például injekciót vagy infúziót (szubkután, intravénásán, infra-arteriáiisan, íntra-muszkulárisan, intra-peritoneáiisan) beadva egy emlősnek, mint például, egy embernek. A módosított - előnyösen kiméra - megtervezett szuperantigéneket lokálisan, vagy szisztémásán adhatjuk, be.
Megfontolás szerint a „célsejtet elpusztító hatásos mennyiség kifejezés alatt, olyan mennyiséget értünk, amely hatékonyan képes aktiválni és irányítani a T-sejleket, hogy azok a célsejteket elpusztítsák.
Az elsőbbségi időpontban az előnyös beadási mód megegyezik a szuper ant igén. kenjugátumokra Dohisten és Abrahmsén szerint kidolgozottal (Dohisten és mtsai.: W0920í4v0; valamint Abrahmsén és mtsaí.: WC95G1650]. Ez naponta 1-5 óra hosszan tartó (előnyösen 4 óra) intravénás infúziót jelent, lázcsillapító hatású anyaggal (paracetamol) kombinálva. A beadást néhány napon keresztül megismételjük - például 4 napon keresztül - a kockázat miatt kellő gondossággal ügyelve, hogy a konjugátummal szemben ne történjen antitest serkentés.
X * « ♦ ♦ # * * * «· *♦ * « ♦ * * *
Λ ** a1 ka ί ςβ azasara, a m e z y
A találmány szerinti szuperantigének alkalmazhatók fő kezelési módként, vagy az előnyös megvalósítási módok szerint adjuváns terápiaként, sebészeti beavatkozással vagy más gyógyszerekkel együtt.
A kezeléssel összefüggésben azt találtuk, hogy olyan antitest preparátumok, amelyek a nem-kovalensen összetapadt nehéz és könnyű antitest láncok vonatkozásában „tiszták, előnyösebben alkalmazhatóak mint az olyan preparátumok, amelyekben az antitestek láncait císztin kötések kapcsolják össze. Ebből következően egy negyedik szempont szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás antitest készítmény, közelebbről Fab készítmény terápia készítményben a láncokat összekapcsoló risztéin aminosavakar díszulfid híd kialakulását biztosítani nem képes aminosavra, mint például szerinre, kicseréljük. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható legelőnyösebb antitestfajták az elsőbbség dátuma Idején a C242 monoklonáíis antitest [Lindholm és mtsai»: W093-01302J és az ST4 monoklonáíis antitest volt, ahogyan ez as említett publikációkban leírásra került. Az előnyös megoldások szerint úgy járunk el, hogy az antitest ráncok egyikét, a fentebb leírtak szerint a Tsejtek egy alcsoportját νβ-specifikus- módon aktiválni képes szuperantígénhez fuzionáljuk. A szuperantígén lehet vadtípusú, kiméra vagy pontmutált változat (valamint ezek kombinációja) a fentebb, vagy Dohisten, vagy Abrahmsén által leírtak szerint {Dohisten és mtsai.; W09201470; valamint Abrahmsén és mtsai,; Wő9601650j. Ebben a megközelítésben a találmány tárgyát képezik még a fentiek szerinti gyógyászati készítmények is, azzal a különbséggel, hogy a kiméra21 * * ♦ ♦ * * * * * » * A « > * φ* «* «« φ szuperantígén helyett az itt leírtak szerinti antitest készítményt tartalmazza.
Az elsőbbségi dátum idején előnyösen az STi-antltest Rab-fragmenst alkalmaztuk (Stern és mtsai.: W0890794?} a D227A mutációt hordozó SSE/A-A. kimérával kombinációban. Az előnyösen alkalmazott Fsb-fragmens mindkét láncában mutációkat hoztunk létre a láncok közötti diszulfid kötést biztosító helyeken (Cys-böl Ser-t kaptunk). Annak érdekében, hogy az antitest/fúziós fehérje kitermelését megnöveljük, amikor F, oolí-ban termeltetjük, mutációkat hoztunk létre bizonyos helyeken a Vkappa láncban is. Lásd még a kísérleti részt.
1. példa (A) SEA/SEE-kimére gének megszerkesztése
Az SEA/SSE-fcimérák megszerkesztése a szekvencia átfedéses megköss zab-bit ás polimeráz láncreakció (PCR) alapú eljárás segítségével történt (Körten és mtsai.). A PCR reakciókat a gyártó előírásai szerint UlTma (Perkín-Elmer) alkalmazásával hajtottuk végre, A PCR útján előállított fragmenseket PCR-script-be klónoztuk' íStratagene, Egyesült Államok) és szekvenáltuk a helyes szekvencia igazolására. A kiméra-szuperantigén géneket ezután a 0KP8SP expressziós vektorba [Abrahmsén és mtsai. (1995)) szubkiőnoztuk úgy, hogy az SS-konstrukeiökat az egér eredetű C215 monoklonálís antitest Fab-fragmensének nehéz láncrészéhez fuzionáltuk. Az SEA és az SEE rekombináns fúziós fehérjéket, mint teljes hosszúságú poiipeptideket ál ütöttük elő a szignál pepiid
X φ
X φφΧ φφφ # * * « * * ♦ * * *
X * Φ * ** * iehasitás konszenzus szekvenciájának megfelelően (von Heijne (1986)}, (B) Fehérje expresszié és tisztítás
A KI2 Fsoherich-ia coli U1635 törzset alkalmaztuk az Fab-SS fúziós fehérjék és az SBA-mutánsok expresszáiására a korábban leírtak szerint. [Abrahmsén és mtsai, (199-5)} . Az Fab-SE fúziós fehérjét centrífugálá-ssal gyűjtöttük össze (5000 u) és a felülúszó frakciókat a korábban leírtak szerint [Abrahmsén és mtsai, (1995)] Protein G Sepharose (Pharmacia Biotech AB, dppsala, Svédország) tisztításnak vetettük alá.. Az affinitás alapján tisztított Fab-SE variánsok tisztaságát 90 %-ná.I nagyobbnak találtuk SDS-FAGE' analízis alapján.
(C) Sejtek
A Raji humán B-sejt limtóma sejtvonaiat és humán végbél karcinóma Colo 205 sejtvonalat tenyésztettünk komplett E~ táptalajban (F.PMI-1M0; a következőkkel kiegészítve: 10 % totális borjúsavó (Gibco BRL, Life Technologies Ltd. Paisiey, Skócia); 1 mH giutamin (HyClone Europe Ltd, Crsmiíngton) ; 5 χ I0~ M $~merkaptoetanoi (ICN Biomedicais Inc. Costa Mese, Kalifornia); 0,1 M NaKCOj (Seromsd Bíochrome); 1 χ 10<; M Hepes puffer (HyClone Surope Ltd, Cramiington); 0,1 mg/ml gentamlcin CBiologicai Industries
Kíbbutz Beit Ha esnek., Izrael); 1 x l-ö~- M nátrium-piruvát (HyClone Surope Ltd. Cramiington). Humán C2I5 és CD80 molekulákkal transzfektált CHC sejteket 0,5 m.g/ml Geníticínnel (G4Í8, Gibco BRL, Life Technologies Ltd. Paisiey, Skócia) kiegészített komplett R-táptalajban tenyésztettünk. Perifériás vér mononukleárís sejteket (PSM) normái donorok
X* 99 X* *9Λ·« 9 «9 * 4 » ¢99 * * 9 « V 9 9 * X *X .9 9 xx « heparinezett véréből állítottunk elő. A sejteket FicollPague-on történő sűrűs'éggradiens centrifugálással izoláltuk a korábban ismertetett eljárás szerint [DohIsten és mtsai. (1991)]. Humán T-limfocitákat homogenitásig tisztítottunk pozitív szelekcióval, MiniMACS oszlopon, humán CD4-re és CDS-ra specifikus antitestekkel bevont mágneses gyöngyöket alkalmazva a gyártó utasításai szerint (Miltenyi Bioteo GmbH, Németország) . Humán SEA~ és SES-reaktiv sejtvonalakat a korábban leírtak szerint állítottunk elő (Dohisten és mtsai. (.19.94)]. Humán TCR Vp22-expresszáló sejtvonalat primer stimulált SEA~reaktiv sejtvonalbói állítottunk elő pozitív szelekciót alkalmazva mágneses Dynabeads (Dynal A.S., Norvégia; segítségével, amelyeket TCR νβ-22-specifikus monoklonális antitestekkel vontunk be (Immunotech, Franciaország) . A dúsított sejtek több mint 95 % TCR Vp22' Tsejteí tartalmaztak, áramlási citömetria segítségével meghatározva (az adatokat nem tüntettük fel). Egér T-sejt híbrídőmákat (1183, 2B4 és 11.40) a korábban leírtak szerint állítottunk elő [Eleury és mtsai. (1991)1.
(D) Citotoxicitás vizsgálati eljárás
A oitotoxícitást a standard. ‘Cr kibocsátás vizsgálati eljárás szerint határoztuk meg 4 vagy 6 óra. után, ahogyan ezt korábban leközölték [Dohisten és mtsai. (1991)3. Célsejtként humán Colo205 vagy Raji sejteket alkalmaztunk. Az eflektor sejteket -· akár SEA~ vagy SEB-reaktív humán. T-sejt vonalakat, akár TCR V022 sejtvonalakat alkalmazva - 30:1 eífektorsejtrcélsejt arányban adtuk. “‘Cr-jsiölt célsejteket alkalmaztunk a citotoxicitási vizsgálati eljárás során 2500 sejt/200 μί komplett táptalaj koncentrációban, V** > * « X $ ♦
XX* *** « * * * X 4« *Φ «X fenekű mikrotitar lapokban. C'2'15Fab-SEA/E hibrideket adagoltunk különböző koncentrációkban, ahogy feltüntetjük, és az 5iCr kibocsátást γ-számláló segítségévei határoztuk meg tcpm: beütés percenként). A specifikus citotoxicitás százalékos értékét a következő képlet szerint számoltuk ki: 100 x UcpKt vizsgálati kibocsátás - cpm. háttér kibocsátás)/(cpm teljes kibocsátás - cpm háttér kibocsátás)j.
(Ej Límfocita proliferáció vizsgálati eljárás A proliferáció méréséhez lö5' reagáló humán T-sejtet inkubáitnnk 37 X-or lö4 besugárzott (20.000 Radt stimulátor sejttel 200 μΐ komplett táptalajban Ú-alakú 96lyukas mikrotitér lapokban, változó mennyiségű C215Fafe~ SEA/E hibridekkel, 72 órán keresztül. A proliferáció mértékére a korábban leírtak szerint [Dohisten és mtsai. (1928:) a 1JH]-timidin beépülése alapján következtettünk.
(F) Eab-SAg indukált IL-2 termelés analízise Egér eredetű T-T hibridóma sejteket (10^) inkubáltunk 200 μΐ komplett R-táptalajban C21SFab-SEA/E kimére fehérjével 2 x 10* Raji stimulátor sejt jelenlétében. 48 óra leteltével a felülő,szokat begyűjtöttük, és egér eredetű IL-2 megjelenésére: analizáltuk. Röviden, δ vizsgáltuk patkány eredetű, egér monoklonális antitestet alkalmazva elfogó antitestként, A tisztított patkány eredetű egér IL-2 ellenes antitestet, a biotín jelölt patkány eredetű egér IL-2 és rI.L-2 ellenes antitesteket a P'harMíngen (San Diego, CA.) cégtől szereztük be. Eiotin-jelölt citokin-ellení monoklonális antitestet, Vectastain ABC reagenskészletet (Vector Laboratories, CA) és peroxidáz szubsztrát reagenskészletet (Bio-Rad olt ok i n t artaImat citokin
«Λ
Laboratories, CA) alkalmaztunk cifcokinek kimutatására. Az abszorbanciát NJ2000 típusú IramunoReade-r {InterMed Roskilde, Dánia) .segítségével 405 vagy 450 nm hullámhossznál határoztuk meg.
2. példa
Mutác16 végr ehaj t á s a az 5T4 Fafo-fragmensen (A) Vektor megszerkesztése az 5T4F-ab~SEA expresszíöjáho.z F. colí~ban.
Az 574 Fv-kédolé részeit az 5?4~hibrídómáböl klónoztuk, amelyet Dr. Pefcer Stern biztosított számunkra (Stern és mtsai.: WG-890794?) . Részletesebben: c.DNS-t készítettünk az mRUS-ből, és PCR. segítségével a teljes variábilis domének régióit és a szignál szekvenciák részeit, éppúgy, mint a nehéz lánc első konstans dóménját és a könnyű lánc konstans doménját ampli.fikáltuk. A következő eligonukleotídókat: 5' CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC-3·' ír. azonosítási szám szerinti szekvencia), és 5? ~ACTAGTCGAhATGGATGGAGCTI7ATCATlyTC:r?-3' (3. azonosítási szám szerinti szekvencia) alkalmaztuk a nehéz lánc esetében, amelynek eredményeképpen 553 bp nagyságú fragmenst kaptunk,- és a következő oiigonukleotídokat: 5#ACTAGTCGACATGGGCX TCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG- 3f {4 . a zonosi tási szám szerinti szekvencia), és 5f~
GCGGCG7CTAGAAT7AAGACTCATTGCTGTTGAA-3? í5. azonosítási szám szerinti szekvencia) alkalmaztuk a .könnyű lánc esetében, amelynek eredményeképpen 724 bp nagyságú fragmenst kaptunk. Mindegyik lánc esetében három külön klőnt szekvenáltunk és azonosnak találtuk. Az expressziős vektorba (ref) történő beillesztésre alkalmas fragmenseket egy második PCR lépés* * # χ « * * < * ♦ X» Χ*« Φ X X ben kaptuk. Annak érdekében, hogy Fáh-expresszálő plazmádat állítsunk össze, az 5T4 variábilis régiókat az egér eredetű IgGl/k antitest C242 monoklonális antitestből származó konstans régiókat kódoló szekvenciákhoz fuzionáItattuk (Lindholm és mtsai.: ^09301302]. Staphylococous eredetű enterotoxin A-ból ÍSBA) származó szuperantigént kódoló régiót fuzionáltunk a nehéz lánc után. A Vkappa lánc antitest szerkezet 5T4 antitestre igazolt szekvenciáját az eredmények között tűntetjük fel.
(B) Az 5T4 mutagenézise.
Hét aminosav-helyettesitést hoztunk létre az antitest szerkezetet kódoló régiókban. Ezek a következők voltak: PhelOSer, Thr4SLys, IleőSSer, Tyr67Serf ?hs73Leu, Thr77Ser és Leu78Val, Hasonlóképpen, bármelyik láncban a domének közötti diszulfid kötések kialakításában résztvevő cisztein amínosavakat szerin axainosavakkai helyettesítettük, amelynek eredményeképpen a nehéz láncban a Cys4S8Ser mutációt és a könnyű láncban a Cys214Ser mutációt hoztuk létre. A mutációkat PCR-aiapú mntagenezissei hoztuk létre és az igy kapott DNS-szekvemciáfc szekvenáiás segítségével igazoltuk.
(C) Az 5?4Fab-SEA fermentorban történő expressziója és tisztítása.
Az expressziős piazmid tartalmazza a kanamicín rezisztencia génjét és egy lacWS-promőtert, amely IPTG segítségével indukálható. A fúziós fehérjéket az útépítés után kapott tenyésztáptalajből tisztítottuk Protein-G Sepharose és SP-Sepharose (Pharmacia Biotec, Uppsala, Svédország) alkalmazásával, és .lényegében a leírás szerint került kiszerelésre cit.rát puff őrben, Sephadex G-25 alkalmazásával. SDS*”5 x« «* x<
PAGE, fordított fázisú HPLC és tömegspektrometría segítségével történő jellemzés kimutatta, hogy a tisztított fúziós fehérje több mint 95 %-os tisztaságú és az elvárható móltömeggel rendelkezik.
.3. példa .Szuperantigén módosítása és a hibridek tulajdonságai
A C2'Í5.Fab-SEA és a CxlSFab-SSE szuperantigén függő sejtes citotoxioitását (SDCC) a XI. MHC-osztály* Raji sejtek ellen SEA- és SEE-reaktív humán T-sejtek, mint eflektor sejtvonalak, alkalmazásával vizsgáltuk. Az SEA és az SEE között meglévő Υβ-specifitás különbség ellenére mindkét szuperantígén összevethető mértékű citotoxieítás indukálást mutatott mindkét effaktor sejtvonallal (1. ábra) . Annak érdekében, hogy különbséget tudjunk tenni a II. MHC-osztály prezentálásának hatása és az SEA és az SEE direkt hatása között a TCR felismerésben, megvizsgáltuk ezeket szuperantigén-függő sejtes citotoxíoltásban (SADCCJ, C215expresszáló ColoEOS sejtek ellen. Ebben a vizsgalati eljárásban a fúziós fehérjét az Fab részegység irányítja a C21o-expresszálő célsejtekhez és a fuzionált SE-molekuiák II. MHC-osztály független, (DohIsten és mtsai.;: (1994)] a citotoxikus T-sejtek (CTL) felé történő prezentációjához vezet. Az SEA és az SEE közötti 80 %-nál nagyobb aminosav szekvencia azonosság ellenére, az SEA és az SEE TCRkölcsönhatása ebben a vizsgálati eljárás típusban kvalitatív különbségeket mutat. A C215Fab~SEA fúziós fehérje megtartja az a képességét, hogy az SEA- és az SEE-reaktív CTLt a II. MHC-osztály célsejtekhez irányítja (1. ábra) míg a *« χχ- :♦* *»#♦ χ χ ♦ ♦ χ » \ xx * * « » ««*««» e / «- «.» · ♦- * * *
C215Fab~SEE nem képes a II.. MHC-os z tá1y ’ cé1s ej te k
citotoxicitását indukálni, sem az SEA, sem az SE'E-rea.ktí.v
CIL-lel (1. ábra?.
három aminosavas különbségnek tndh at-ő- be a hélix.et megelőzd
hurokban és a szabálytalan a5 hé) .ixben {Irw.in és mtsai. :
(1992)-; Hudson és mtsai.: (19-93); Fraser és mtsai.: {1993?
és Moliick és mtsai.: (1993)). Az ebben a vizsgálatban ko-
zölt TCR-kölcsönhatásra vonatkozó különbség nincs kapcsa-
latban, a megváltoztatott TCR νβ- -spéciiicitással, mert a
CzlÓFab-SEA képessége, hogy II. MHC-osztály független
citotoxicitást indukáljon, nem kor 'látozódik az SEA-resktív
CTL-re, hanem megfigyelhető az S-BE - r e-a k-t i v c T L -1 e .1 i s .
Az SEA és az SEE szekvenciák homológra analízise (2.
ábra? feltárja azt, hogy az eltérő amínosavak nyolc, egymástól jól megkülönböztethető régióban koncentrálódnak.
ki, a két SE azonossága 97 % és a megmaradó különbséget
konzervatív ami no s av~ h e 1. ve tte s í t é; sek teszik ki. A nem-
MHC-osztály kötőhelyhez (B, D, E és G) és nem vaioszrnu.
hogy kölcsönhatásba lépnek a TCR-: rel (3. ábra) . A további
négy régió (A: 20-27. amínosavak; C: 60-62. amínosavak; F:
162-13 6. amínosavak és H: 290-207 . amínosavak) a molekula
peremén helyezkednek el í 3, ábra) a TCR-kötöhely szomszéd-
ságában, amely a két szubdomén kö; íötti árokban helyezkedik
>***«« φ * * X Φ Φ « »ί Φ X <« hibrid fehérjéket' készítettünk oly módon, hogy az SEA-ból régiókat ültettünk át az SEE-be, ezzel egyetlen régiójú kimé rá kát állítva elő (SEE/A-A, -€, ~F, -Hs, kettős régiójú hibridet állítva elő (SSE/A-AW, és oly módon, hogy átültettük a 11. MHC-osztály kötőhely szomszédságában levő SSSrégiókat az SEA-ba (SEA/.E-8DEG, 4. ábra). Az összes kimére SS-t mint CzlSEab fúziós fehérjét expresszi!tűk, hogy képesek legyünk kimutatni az aktivitásukra vonatkozó különbségeket II. MHC-osztáiy hiányában.
(Ai A. C2lóbab-részegységgel fuzionált SEA/S hibrid fehérjék közötti különbségek meghatározása Fab-ra irányuló citotoxicítási vizsgálati eljárásban.
A 11. MHC-osztály' Raji sejtek ellen irányuló CzlöFabSEE/A hibrid fehérjék SDCC aktivitását efrektorként SEAreaktiv humán T~sejteket alkalmazva vizsgáltuk. Az összes CllSfab-SE hibrid BCh<, értéke, éppúgy mint a C215Fab-SEAwt és -S'EEwfc értékel a hibahatáron belülre esnek (azaz 10^1011 M közé, 5. ábra) . Az egyetlen kimutatható különbség egv enyhén alacsonyabb platóérték a C215Eab-SES/A~AH hibrid esetén, amely a reagáló T-sejtek számának csökkenését jelzi. Másrészről az SADCC kísérletekben, ahol a eitotoxieitás a II. MMC'-osztáIyZC2I5'’ ColokOS sejtvonal ellen irányított, csak a C215Fab-SEE/A-A, C21 óFab-SSE/A-Aü és a C21 SFafe-SEA/E-BDEö indukált a C215Fab-S'EAwt-vel. összevethető mértékű citotoxicitást (5. ábra;. A C215Fab-SEE/A-F hibrid képes C21S-re irányított citotoxicitást indukálni nagyobb koncentrációknál (Εζ>:: nagyobb mint lö':'iJ M} . Sár a C21öEabSEE/A~B hibrid képes arra, hogy a CilóFafc-SSEwt-hez hasonló fél-maximális koncentrációnál indukálja a C21530 « » * « 4· ' ♦ ««««-»« * ♦ X * - ♦ » * * » *
Ψ» Κ« »> « irányított oitotoxicitást (azaz EC-sö 1<Γ” Μ), a citotoxioltás abszolút szintje nagymértékben lecsökkent (5, ábra). Ez a különbség lehet a €215Fab-SEE/A~H korlátozott νβspecifícitásának a következménye, mig a C215-re irányított citotoxicitás indukáló képesség kerül előtérbe a reagáló T~ sejt szubpopuiácíóben. Ennek a jelenségnek a további vizsgálatára humán V022 olígoklónális CTL-sejtvonalat készítettünk. A humán νβ22 analóg az egér eredetű Vp3-mal abban a tekintetben, hogy ez egy SEA- de nem SEE~specifikus- νβ család. Korábban leközölték (Mollíck és mtsai. ; (1993) ], hogy az SEA~ és az SEE-νβ: fő hozzájárulása elsődlegesen az SEA és az SEE között a H-régiöban (200-207. amínosavak) található három aminosavas különbségre vezethető vissza. A 11. MEC-osztály’ Raji célsejtek elleni SDCC vizsgálati eljárásokban effektorként a νβ22 oiigoklonális CTL-sejtvonalat alkalmazva csak az SEA-H régiót tartalmazó hibridek képesek arra, hogy C215Fab-SEAwt-szerü választ adjanak (mint például C215Fab-SEE/A-H, C215Fab~SSS/~AH és C2ioFab-SEA/E-BDEG,
6. ábra}, A €215Fah~SEE/A~& hibridnek, amely képes volt teljes SDCC válasz indukálására effektorként teljes CTLpopuláeiót alkalmazva, ebben a vizsgálati eljárásban mind a fél-maximális koncentráció értéke, mind a piatóértéke erőteljesen lecsökkenteti (6. ábra) . Amikor a νβ22 CTL oitotoxiciiása a II. MHC-osztály‘ /0215’ ColoCOS sejtvonalra irányított, csak olyan hibridek képesek C215Fab-SEAwtvel összevethető citotoxikus válasz indukálasára, amelyek mind az SEA-A és az SEA-H régiókat (mint például C2l5FabSEE/A-AH és €.21 SFab-SEA/E-BDEG} tartalmazzák (ő. ábra) . Az a hibrid, amelyik csak az SEA-A régiót tartalmazza * φ οχ (C21hFab-SEE/A-A) alacsonyabb színtű cít-otoxícitást indukál összevethető SC&s· értékkel. Ez azt jelzi, hogy a C.215Fab~ SEE/A-H hibriddel tapasztalható .maradék aktivitás az SADCC során, amikor efrektorként teljes T-sejt populációt alkalmazunk, nem. a hibrid indukálta válasz következménye a T~ sejtek, korlátozott populációjában. A -megfigyelés sokkal valószínűbb magyarázata az, hogy a C215Fa.b SE hibridfeherjók SADCC válasz indukáló képessége elsősorban az S'EA-A régión beiül helyezkedik el, és az SEA-H és az -F régiók kismértékben járulnak hozzá. Nincs bizonyíték arra, hogy ez a tulajdonság a T-sejtek bármely alcsoportjára korlátozódna a kombinált SEA-SEE-reagáló T-sejt populációban, mert a C2.1SFab-SEA képes ugyanolyan választ kiváltani az SEEreaktív CTl-ekkel és a C215Fab-SEE/A-A képes a C2i5Bab~SBAval tapasztalható választ teljes mértékben kiegészíteni.
(Bí A CzlSEab részegységgel fuzionált SEA./.E hibrid fehérjék közötti különbségek meghatározása Fab~ra irányuló proliferáüiós vizsgálati eljárásban.
Korábban már leközölték, hogy tisztított nyugvó humán T-sejtek proliferáciöja indukálható C215Eab~SEA orezentálá-
savai II. MHC-os z t á ( ly~/C215VC68Ö‘ sejf vonalban (Lando és
mtsai, : (1993i1, A C2I5Eab-SEA~nak az a képessége, hogy
MHC— 7T független ·«* -Λ X <-· liferációt indukál 3 20nb an jelen tő sen
lecsók ken C215Fab· £*< *·< í~vei (1, táblázat) . Annak feltárására,
hogy sz a minőségbeli különbség éppúgy az SEA A-régiőra korlátozódik, mint ahogyan az SADCC végrehajtása esetében tapasztaltuk, megvizsgáltuk a C2ISFab-SE hibridek proliferáoiós kapacitását, akár a CHO-DRlVCDaO', akár a CHO-C2.15'7€D8ö+ transzfektéit sejtvonalak esetében, tiszti32 *·♦**« X ί ;* * ♦ » * >» Κ « Φ » tott nyugvó humán T-sejteker alkalmazva.· Amikor az Fab-SE konjugá tumo ka t üH0~DRi+/CD8ö' sejteken prezentáltuk, nem tapasztaltunk különbségeket a különböző SE-fehérjék között (adatokat nem tüntettünk fel) « Azonban az SEA A-., C~ és Hréglók átültetése az SEE-be a. C2.15Fab-SSE~hez képest megerősíti a proliferációs aktivitást. A legjobb eredményeket akkor kaptuk, amikor SEA. A- és H-régiőkat ültettünk át, amely az A-régiö fontosságát hangsúlyozza, ahogyan ezt a II. MHC-osztály független citotoxícitás -esetében tapasztaltuk. Negatív szelekciót alkalmazva elképzelhető, hogy az Fab-SEA és -SEE közötti különbségek még erőteljesebbek i es.zne k.
(C) Az SE-hibridek Vp-specificitásának. meghatározása. Annak érdekében, hogy tovább vizsgáljuk, vajon a
C2ISFab-SEA/SEE hibrid fúziós fehérjékhez kapcsolódik-eadott νβ-specifícitás, νβΐ, V&3 és VplI expresszálő SEAreaktív egér eredetű T-sejt hibrídőmákat alkalmaztunk. A kapott adatokból nyilvánvaló, hogy az összes megvizsgált régió közvetlenül vagy közvetve befolyásolja a TCR-rel történő kölcsönhatást. SEA C~ és E-régiókat átültetve C215FabSEE-be az SEA.- és az SEE-keresztreagáló νβ1-Ι1Β3hibridómára irányuló aktivitás tönkremegy. Ugyanezek a kimér ák nem, vagy csak enyhe hatást mutatnak a νβ3- és νβΐΐhibridömák aktivitására (2.B4 és 11.40), C215Fab-SEE-vel összehasonlítva. Az SEA A-régió átültetésével C215F-áb-SBE~ be a V$3-ra {2.34) irányuló aktivitás legalább százszoros mértékben megnövekszik, űziSFab-SSE-vel összehasonlítva. Még erőteljesebb hatások tapasztalhatóak ugyanezzel a sejtrégiót ültetünk át C215Fab-SEE-be.
*χ
Az SEA H-régiónak ezt a kifejezett hatását a νβ3specificitás befolyásolására már korábbi vizsgálatok is feltárták (Mollick és mtsai. (1933)), Azonban ugyanez a kimára - <C21.5Fab-SEE/A~H) - úgy látszik# hogy az SEA./SEEkeresztreagáló νβΐ- és V^ll-hiferidómákra (1133 és 11.40) irányuló aktivitást tízedére csökkenti. Következtetésképpen úgy tűnik# hogy az S.EA-TCR kölcsönhatásban az SEA-SEE egésze# az A# C, F és H variábilis régiók# egyaránt részt vesznek, <D) SE-k..íxnérák szaroreaktivi.fásának meghatározása. Megvizsgáltuk humán szérum mintákban a kiméra SE-re irányuló szeroreakfcivitást mind a világ különböző részeiből .származó egyesített mintákban# mind egyedi szérum mintákban. Az SEA A- és Ή-régiók. együttes átültetésével SEE-be közepes szeroreakfcivitást .hoztunk létre (8. ábrái. Hasonló sze.roreaktívitást tapasztaltunk a kimér.a C215Fab-SEE/A ellen is. Azonban az SEA A-régió· egyedüli
C21SF.ab-SEE-szerű átültetése SEE-be szeroreaktívitást ::215FáÖ-5EE'/A-A.) jelzi, hogy spitopnak az
-Cl*' sdofct, arra utalva# hogy az SEA H-régió felelős a megmaradó# C215Fab-SEE/A-AH elleni szeroreaktivitásért. Ez azt az SEA H-régió része egy domináló antigén 5Eá~ban. A szeroreakt.i vitás a világ más részéről (Japán és az Egyesült Államok) származó egyesített zéróm mintákban# éppúgy, mint 14 Svédországból származó gyeni mintában, ugyanezt az általános elrendeződést t asztja alá (adatok nem kerültek közlésre).
* * *
4. példa.
A fúziós fehérjék Fab részének mutációi
5T4Fab-SEA-konstrukció-k expresszálása.
F. coli alkalmazásával az 5T4Fab-SEA terme lésének szintjét a fermentorban lényegesen alacsonyabbnak találtuk,· mint más Fab-szupersntigén konstrukcióknál, amelyeket korábban laboratóriumunkban tanulmányoztunk. Ezért kétféle módosítást hoztunk létre, hogy a termelési szintet megnöveljük. Először hét különböző pontmutációt hoztunk létre a könnyű lánc szerkezeti régiójában. Szék a következők voltak: FheiOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67$er, Fne?3Leu, Thr77Ser és Leu78Vai. Másodszor., a nehéz és könnyű láncokat összekapcsoló diszulfid kötéseket kialakító cisztáin aminosavakat helyettesítettük szerin aminosavakkal. Ez utóbbi módosítás a termelés szintjén háromszoros növekedést eredményezett., míg a hét pontmutáció további 12-szeres növekedést eredményezett. A jelentősen megnövelt termelési szint mellett a diszulfid kötések eltávolítása jóval homogénebb temeket is eredményez, mert. kiküszöböltük annak lehetőségét, hogy ezek a. reaktív tiol csoportok más tioi tartalmú, anyagokkal reagáljanak,
A módosított STé-molekuIát megvizsgáltuk az antigénjével szembeni affinitásra éppúgy, mint az .SADCC-ben -mutatott biológiai aktivitásra. Ezekben a vizsgálati eljárásokban nem tudtunk különbségeket kimutatni a mutáns forma és a vad-típusú forma között.
.A Cys/Ser mutációt létrehoztuk, számos más monok! ónál is antitest Fab-fragmensének nehéz és könnyű láncában. A tér♦ * mékek így homogének lettek és teljes mértékben megtartották ant i gén'kö tő kapa c i t á suka t.
Az antitest szerkezeti régiójának szekvenciája az 514 Vkappa lánc esetében:
DAVMTQ1PTF 1LVSAGDRVT 1TCKASQSVS NDVA^YQQKF GQSP?LLIS¥_.........50
TSSRYAGVPb AFXGSGYGTD FTFTIS'TLQA EDLAVYFCQQ DYNSPPTFGG 100 GTKLE1K (6. azonosítási szám szerinti szekvencia)
Az aláhúzott szekvenciák feleinek meg a CDR-eknek. A félkövéren szedett pozíciókban hajtottunk végre mutációkat: PhelöSer, lhr45Lys, Ile6-3Ser, IleŐGThr, TyrSYSer, Phe?3Leu, Thr775er és lenVSVal.
1. tábla:
proli.féráció £Cs0 (pH)
C2.1 SFab-SEA^'t 7 2 f <£»
C215Fab~SEBwt 6, 9
C215Fab~SES/A-A 0, 9
C2I5Fab-SEE/A-C 2,8
C215Fab-SEE/A~F 5,7
C21.5Fah~SWA.-H 1,0
C2Í 5Fab-SBE/A-~AH ö, 3
C215Fab—S.EA./E-BDEG 1, 6
y *
2, táblázat
Az ábrák leírása
I. ábra. XI. MHC-osztály függő és független eltotoxicitas humán SES~ és SEA-CTL-le.l.
II. MRC-osztály függő sejtes cltotoxlcítás (A és B) és C2i5~függő sejtes citotoxíeitás (C és D) C21S'Fáb~SEA-val (») és C21SFab~SS£-vei (♦), mint effektor molekulákkal . A
.otoxicitást standard négyórás hiCr kibocsátási vi zsgálá-
eljárás keretében h atároztuk meg SEE-reaktív hí imén T-
tvonalat alkalmazva te és Ci és SSA-reaktiv humán T-
tvonalat alkalmazva (B és Dj . A cé lsejt vonala köveί-
ők voltak: 11. MBC-í zsztályVCalS Raj i. (A és B; ο s 11.
™ n k, ía J. V / kő l 0 205 (C és D) . Az adatok kü Iönálló
sgálati eljárásokból származnak, s tmelyek 2 (A és Cj - 5
(B és Dj független kísérletnek felelnek meg.
2. ábra. SEA- és SEE-homolőgiák összeillesztése.
SEA/SEE-variábilis régiók a. ICA-kötőhely közelében (A,
C, F és H) f és variábilis régiók a két il. MHC-osztály kötőbe 1 y kö z e 1 ében..
3. ábra. SEA megrajzolt modellje.
Az SEA-kristály [Schad és mtsai., (1995)1 Mols-cript modellje [Xraülís, (1991) } . SEA/SEE-varlábills régiók a ?CR~ kötőhely (A, C, F és H) közelében, és variábilis régiók a két II. MHC-osztály kötőhely közelében, A cinkíont egy gömb jelzi,
4. - ábra. Kiméra SE-molekulák vázlatos szerkezete,
Az S:EA-szekvencia részegységek alsó helyzetben vannak. Az SSA/SEE-variábilis régiókat .A, B, C, D, E, F, G, és H
5. ábra. il.
citás h- amán SEA-
11 . MKC-os zl
C2.I5- fii ggő sejts
Iáknak; C215Fab-
qs?F /&...v • A \ ,·**< ·> -
i V ? t '-·
oz rónát· ~.S EA/EwBD
;?iCr kibocsátási
meg SEA -reaktív
vonalak a követ
(A) és 11. MHC-=
FíS.(üggő sejtes citofcoxieitása (A), és (O) . A cltotoxicitást standard négyórás zők voltak: II. MHC-osztályVCzl 5 Raji :tály7C21S' Colo 205 (3) . Az adatok különálló vizsgálati eljárásokból származnak, amelyek öt független kísérletet reprezentálnak.
«φ» **Χ * # φ * * * « φ φ φ «« Φ» »< χ.
6. ábra. II. HHC-osztály függő és független cítotoxícitás humán Vb22' CTL-lel.
II. MHC-osztáiy függő sejtes citotoxícítás (A), és C215~függő sejtes cítotoxícitás (B) ? effektor molekulákként C2IöFab-SEA-t ί») , €2XSFab~SEE~t {♦·}, C215Fab-SEE./A-A~t {♦}, C2I5Fab~SES/A-C~t (□) , C215Fab-SEE/A-F~t -(0), C215FabSEE/A-H-t {·} , C215Eab-SES/A-AH-t <A) és C215Fab~SEA/E~ SD'EG-t CO) alkalmazva. A citotoxicitást standard négyórás ';;Cr kibocsátási vizsgálati eljárás keretében határoztuk meg Vfo.22 szelektált SEA-reaktív humán T-sejtvonalat alkalmazva. A célsejt vonalak a következők voltak: II. MHCosztáIy7C215~ Raji (A), és II. MH.C-osztáiy7C215* Colo 205 CB; . Az adatok különálló vizsgálati eljárásokból származnak, amelyek két független kísérletet reprezentálnak.
7. ábra. IX. MHC-osztály függő és független proliferáciő (nem szerepel az elsődleges bejelentésben).
Fab~S£ hibridek hatása a XI. MHC-osztály függő {&) , és független CB), T~sejt proliferációra. Tisztított humán Tsejteket 96 órán keresztül stimuláltunk a következő molekulákkal: C2í5Fab-SFA {«}, C2X5Fab-SFF (♦}, C2XSFab-SSF/A-A C*) , C215Fab-S.EE/A~C ·(□} , C2X5Fah~SES/A-F (0), C2l5Fab~ SEE/A-H (») , C215Fab~SEE/A~AH. (Δ) és C21 SFab-SEA/E-BBEG (O), amelyeket IX. MHC-osztáXy7C2XS CHO-DR4/C2I5 transzfektánsokon (A) , és II.. MHC-osztály~/C215* CHOCD80/C215 transzfektánsokon {Sj, prezentál tünk. 72 óra elteltével a sejteket 7H1-túrnidinnel 24 órán keresztül inkubáltuk, a beépülő jelölést meghatároztuk és félmaximális koncentrációként jellemeztük (£77 - Az adatok különálló vizsgálati eljárásokból származnak, amelyek két «·> * független kísérletet reprezentálnak..
S, ábra.. Szeroreaktivitás egy humán Xg gyűjtésben. Egyesített minta több, mint SOOO szérumból, Déi-Surópai egészséges donoroktól, C2X5Fab~S'.E fúziós fehérjékkel szemben vizsgálva·. A sorozatban hígított humán Ig-t szobahőmérsékleten 1 órán át hagytuk reagálni a következő .molekulák kai, -amelyeket 1 ng/lyuk mennyiségben mlkrotiter lapon immobil i zártunk: C215Fab~SEAwt, C2:l5Fab-SEEwt, €215FabSBE/A-A, CzlöFab-SFE/A-H és FabSEE/A-AH. A szérumféhérjék C215Fab kötését úgy vettük korrekcióba, hogy minden. mérési pontnál levontuk & C215Fab OD-érfcéket. Mindegyik mérési pont két párhuzamos minta középértékének felel meg. További részletek az Anyagok és módszerek fejezetben találhatóak.
1. táblázat. Tisztított humán T-sejteket stimulál tünk
9S órán. keresztül a megfelelő C21SEab~S£~vei, amelyeket XI, MHC-osztály CHO-CD80/C215 transzfektánsofcon prezentáltunk. 72 óra elteltével a sejteket (¼}-tími dinnel 24 órán keresztül inkubáltuk, a beépülő jelölést meghatároztuk és fél-maximális koncentrációként jellemeztük CEC^) .
2. táblázat. Egér eredetű T-sejt hibrídőmákat. stimuláltunk 48 órán keresztül natív vagy kíméra Fab konjugált szuperantigénnel. Az aktivitást mint az XL~2 termelést határoztuk meg, és a félmaximális koncentrációval jelismezAz elsőbbségi év során elvégzett munka
Annak érdekében, hogy a C215Eab~SEE/A~A szuperantigén kimére antitest fúzió toxíeitását a minimumra csökkentsük, az SEE/A-A kimérában mutációkat hoztunk létre a II-osztálv
Λ» * » φ
ik elő: 7? ..A,„ ¢.. A i db
CzlSFab- -SEE/A-A-
G215Fab- -SEE/A-A-
C215Fab- -SEE/A-A-
7 A és GzloFab-
vizsgáltuk humán
kötőhelyeken bellii, ahogyan ez a W09601650 szabadalmi bejelentésben leírásra került, és ezeket C215Fab~hez fuzionáltuk. A következő konstrukciókat állítottuk elő;
SSE/A-A-D227A, C2ISFab~SES/A~A~F47A/D227A, C21SFa H.Í87A/D227A, e21SFab~SBB/A-A~W13QA/D227A, G215Fa D7ÖA/D227A, C21SFab~S£S/.A~A~KSÖS/D227A, C215Fa N50S/D7OA/Ü227A, C215Fab“SEB7A-A-E47Y/D227A és SüE:/A-A“D70R/D227Á. Az összes fúziót megvizsgál PBM'C proliíerációt indukáló képességükre, annak érdékában, hogy azonosítsuk azokat a mutánsokat, amelyek aktivitása lecsökkent a C21SFab~SEE/Á~A-D227A~hoz viszonyítva. Lecsökkent proliferációs aktivitást tapasztaltunk a következő mutánsok esetében: C215Eab~SEE/A~A-F47A/D227A, C21SFab~SEE/A~ A-F47y/D227A és C215Fab~SS£/A~A~D70R/D227A, A kiméra fúziók közül néhányat megvizsgáltunk antitest titerre is normál humán szérumban (C2i5Fab-SEE/A-A-D227A, C215Fab-SEE/A~A~ D70A/D227A és C215Eab~SSE/A-A-ü70R/D227A). Összehasonlítottuk a C2!SFab~SSA-D227A-t és a C215Fab~SES~D227A~fc, A C215Fab“SEA-D227A-hoz viszonyítva a titer mindegyik vizsgált kiméra. esetében sokkal alacsonyabb volt. A C2.15FabSEE-D227A~hoz viszonyítva a titer mindegyik vizsgáit kiméra esetében enyhén magasabb volt.
Ezek olyan kicseréléseket jelentenek, ahol az alábbi ozioíökban: 47, f 50., 70., 130.., 187. és 227,, egvet vaav többet, előnyösen kettőt helyettesítünk, ahogyan ezt a 2, ábrán a 7, és 8. azonosítási szám szerinti szekvenciák feltüntetik.
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az előzőekben ismertetett specifikációk, megvalósítási módok és példák csupán a #if <·>$
- 41 - :♦*
A A V«
ΑΑ * * « * A A « « * A
AA » találmány jobb megérthetőségét szolgálják és nem korlátozó értelemben kerültek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel •gyenértékü módosítás illetve- változtatás hajthat és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott, igényelt oltalmi körön belül maradnak.
HIVATKOZÁSOK
Abrahmsán L efc al <1935} Cbaracterization of two distinct MHC Class IX binding sítes ín fche superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMB0 J 14:2978-86.
Abrahmsén et al {1993} WG9ŐÖI650 (patent Application). A eonjugate between a módit led superantigen and a fcarget-seeking compound and the use of the conjugate.
totoassoa £ et al {1998} Staphylococcal enterotoxin A and S chimera with reduced seroreactivifcy and retained ability fco target eytotoxie T cells fór use in tumor therapy. A3P.F '98: Bxomolecular Tachniguas, Boliday Xnn Go Idén Gateway, San Francisco, Calxfornia. March 3ö-Apríl 2, 1936.
ipheral blood to produce IL-2 -.18 and U0HL1 173.
Dohisten afc al (1988) Two subsets of humán per CD4* T halper cells diftering ín the capacity and in tér férőn-gamma can be defíned by the Leu monoclonai antíbodies. Búr o Immunoi 18:1173-1
Bianeo et al (1990) Mutants of staphylococcal toxic shock syndrome toxín 1: Mitogeniclty and reeognítion by a neutraüsing monoclonal antíbody. Xnfect. Immun. 58 (1990) 3020-3028.
Dohisten K et al (1934) Monoclonal antibody-superantígen fuslori oroteíns: Tumor spéciiic agents fór T cell based tumor therapy.
Froc Natl Acad Se:
8345-8949.
Dohisten M et al <1991} Monoélónál ant) superantigens: A dlfterent eláss of an* Na ti Acad Sei USA 88:9237-9221.
get ed agents
Pro·:
9 ¢1 β> X ·» 4 * ♦ « φ * * «X ♦ χ φ » ♦ ♦ Λ * * ♦ «ί κ * hohlsten et al (1992) WO92Ö147Ö (patent application}. Target spéciire antibody -supersntigen conjugates and their preparation.
Kleury £ at al (1991) Mutationai analysis of the interaction between CD4 and eláss IX MHC: eláss XX antigens. Cell SS;1037Kraser 0Ώ et al (1993) Structural módéi of Staphylococcal enterotoxin A interactions with MHC eláss XX ant Igene. In: Huber,BT Palaer, S (eds) Current Communications in Cell and Molecular Biology 7. Cold Spríng Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp 7-29.
Grossman et al s t aphyloeoeoal reeognition. J (1991) Mutation of the dist enterotoxin A. Conseguences Immunoi 147:3274-3281κ Vrt V.» .ooo m fór T eell
Hartwig GB et al (1993) Mutations affeoting MHC eláss XX minding of the superantigen streptococcal erythroganic taxin A. Int. Isasunol. 5 (8) 8S9-875.
Karton KM ©t al (1990) Gene splicing by overlap extension: tailor-nade genes using the polymerase ehain reaction. Biotechnicues 8:528-535
Huáson et al (1993 ) Two adjacent residues in staphylococcal enterotoxíns A and £ determine T eell receptor V béta specífieíty. J Exp Mad 177:175-181.
Hufnagle WO et al (1991) The carboxyl™terminál region of staphylococcal enterotoxin type A is reguired fór a fully activs molecule. Xnfect Immun 59:2126-2134.
Irwin MJ et al (1592} Enterotoxin residues de t amin ing T-cell receptor Vb minding soecifícitv. Mature 359:841-3 íi » X
X * «>· *0» * ♦ x » * * * « k 9 »9 *♦· «& 4
Kallaad ©fc &X (1991) WO 9104053 (patent Application) <
Pharmaceufcical cojsposition that makes cella expressing MHC Class XI antigens targets fór cytotoxit cells.
Kappler JW ©fc al (1992) Mutations defining funcfcional regions of fche superantigen staphylococoal enterotoxin S, J Sxp Med 175:387-395
Kappler et al (1993) WO9314634 (patent applicafcion) . Protective effecfcs of mutated superantigens.
Kotzin Rt ©fc al (1993) Superantigens and fcheir potential role in humán disease. Adv Immunoi 54:99-166,
Xraulis PJ (1991) MötSCRXPT: A program. fco produce bofcfc detailed and schematic plots of protein structures. J Appl Cryst 24:946950 .
tamphear JG ©fc al (1996) Resídues near the amino and carboxy fcermini of sfcaphylococcal enfcerotoxin S independenfcly medíafce TCRV^-specifle infceracfcions. J Immunoi 15S; 2178-2185 (March 15, 1996} tando PA ©fc al (1993) Co-stimulation wifch B7 aná fcargefced superantigen is required fór MHC eláss Il-independent T~tell proliiération bút nofc cyfcotoxicity. Immunology 80: 236-241.
appl itat ion) al antíbody tindholm ©fc al (1993) 9301302 (patent carbohydrate antigén specific monodon line.
, Tumor, and cell
Mollick JA ©fc al (1993) Localization of a site on baofcerial superantigens fchafc determines T cell receptor béta chain specificity. J Exp Med 177:283-293.
Newall ©fc a.l (1991) In vívó T-cail acfcivat enterotoxin S prevents oufcgrowth of a mali Nati Átad Sói USA 88 1074-1078 on by sfcaphylococcal nant tumor, Proc
X*,* * * ♦ X
X · * χ V * X
X ι «Α
Sokad. £24 et al (X99S) CrystaX structure of the stperantigen, Staphylococcal enterotoxin type A, ER30 J 14:3232-33 01
Stera et al (1989) WOS987947 (patent application) < Imprevements relating te anigens.
Temaa et al (1391) WO3110680 (patent application) , Tumor kllllng effacts of enterotoxlns and related eompounds.
Termán et al (1993) WO9324136 (patent application). Tumor kíXllng effects of enterotoxins and related compounds.
von Keijne# G (1986) . A new raathod fór predictíng signal sequen.ce cleavage sitas, Nucleic A-cíd Rés, 14, 1483-1490, * * ,ν’χ ♦**«
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA .ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 3 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULÁTÍPUS: peptíd
AZ I. AZONOSÍTÓ' SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Gly Gly Pro
A 2, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA.: 24 bázispár
TÍFUSA: nukleínsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 barispán TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 41 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTAGTCGAO ATSGGGITCA AGATGGAGTC ACAKNYYCNG G
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár TÍPUSA: nukieinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TGAA
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 10? aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: pepiid « «
6. Α2 □NŐSÍTŐ S □ÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁS A *
Aso 1 ' Alá Val Hat Thr ** £ Gin Thr Pro Thr Pha 10
Leu Leu Val Ser Alá 15 G ly Asp Arc Val Thr 20
XX e Thr Cys Lys Alá 25 Ser Gin Ser Val Ser 30
Asn Asp Val Alá Trp 35* Gin Gin ΧΛ' 3 Pro 40
Gly Gin S sr Pro yh—· 4 5 Leu Leu lle S Tyr 50
Tor Ser Ser Arc Tyr 5 A, la Gly Val Pro Asp 80*
* - •r·· L T ?; - Gly e \a< V A. t 5 2Λ' f~ , · V. G xy V- / V
Phe Thr Pha Thr Lle 75 Ser Thr Leu Gin Alá Sö
Glu Asp Leu Alá Val 85 Tyr Pha Cys Gin Gin Sö
Asp Tyr Asn Ser Pro 95 Pro Thr Phe Gly Gly 100
Glv Thr Lys Leu Glu lle Lys
105 * *
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 233 aminosav
TÍPUSA: ásd no sav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULÁT í?US: pép t id
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA. LE í PÁS A;
Ser Gin Lys Sár Glu S Glu Ile Asn Glu Lys 10 Asp Lee
Arg Lys Lys 15 Ser GlU Leu Gin Gly 2 0 Thr Alá Lau Gly
Asn 25 XiteU Lys Gin Ile Tyr 30 Tyr Tyr Asn Glu Lys 35 Alá
gs Chr Glu As n 40 Lys Glu Ser Kis Asp 45 Gin Phe XíGvj
Gin Kis SO Thr Ide Lau Phe Lvs 55 Gly Phe Pha Thr so’
Kis Sár Trp Tyr Asm 65 A,sp Lee Leu Val Asp 70* Phe Asp
Ser Lys Asp 75 Ile Val Asp Lys Tyr SO Lys Gly Lys Lys
Val SS Asp Leu Tyr Gly Alá SO Tyr Tyr Gly Tyr Gin OS Cys
Alá Gly Gly Thr 100 Pro Asn Lys Thr Als 105 Cys Két Tyr
Gly Gly 110 Vei Thr Leu Kis Asp 115 Asm Asn Arg Leu *PX**· A £ & >X, 120
ö Xat Glu Lys Lys Vei Pro 11a Asn Leu Trp Leu Asp
125 130 o fi
Gly Lys Gin Asn Thr Vai Pro LeU Glu Thr Val Lys 135 140 φ φ
Φ -φ « «φ* »*♦
Λ ♦ Φ
Thr 14 5 Asn Lys Lys Asn Val ISO Thr Vei Gin GlU Leu 155 Asp
Leu Gin Alá Arg ISO Arg Tyr Leu Gin Glu 265 Lys Tyr Asn
r>eu Tyr 170 Asn Ser Asp Val Phe Asp 17 5 Gly Lys Val Gin 180
Arg Gly Len lle Vei 185 Phe Kis Thr Ser Thr 190 Glu Pro
Ser Val Asn 195 A \ Λ< Asp Xt&U' Pae Oly 200 Ale Gin Gly Gin
Tyr 205 Ser Asn Thr Leu Leu 210 Arg lle Tyr Arg Asp 215 Asn
-lvs >* Ile Asn 22 0 Ser Glu Asn Két Hús -> ? s X Is Asp lle
Tyr Leu 230 Tyr Thr Ser
A AZON OSÍTÖ SZÁM Ú SZE. KVENC IA ADATAI:
A SZSKVEN ClA JELLEM TÓI:
HOSSZA: 2 33 am. inasa V
Τί BUSA: am1nos av
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁT!PUSí pepiid
Á 8. ΑΪ IONOS ÍTÖ SZÁMÚ ; SZEKVENCIA LEÍRÁ SA:
Ser Glu Lys Ser Glu Glu lle Asn Glu Lys Asp Leu
5 10
Arg Lys Lys Ser Glu Gin Arg Asn Alá Leu Ser
25 20
Asn Len Arg Gin lle Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Alá
25 30 35
lle Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gin Phe Leu
40 4 5
Glu Asn 50 Thr Leu Leu Phe Lys SS Gly Phe Phe Thr Gly §0
Kis Pro Trp Tyr Asn 55 Asp Leu Leu Val Asp 70 Leu Gly
Ser Lys Asp 75* Alá Thr Asn Lys Tyr 00 Lys Gly Lys Lys
Val S5 Asp Leu Tyr Glv Alá 90 Tyr Tvr Gly Tyr Gin SS Cys
Az a Gly Gly Thr 200 Pro Asn Lys Thr Alá 205 Gys Két Tyr
Gly Gly 110 Val Thr Leu Kis As? 215 Asn Asn Arc Leu Thr Xz u
u le Ζ* Λ X LS Lí Lys Lvs Val 125 P V-'Z-h Tls A s n Τ,Λ' ΐ ·»-- V* Tro 130 Σ Asp
Gly Lys Gin 135 Thr Thr Val Pro Xle 140 Asp Lys Val Lys
Thr 145 Ser Lys Lys Glu Val ISO Thr Val Gin Glu Leu IS 5 Asp
Leu Gin Alá Arg ISO Kis Tyr Leu Kis Gly 155 Lys Phe Gly
Leu Tyr 170 Asn Ser Asp Ser Phe 275 Gly Gly Lys Val Gin 250
Arg Gly Leu Xle Val 1S5 Phe Kis Ser Ser Glu ISO Gly Ser
Thr Val Ser 2S5 Tyr Asp Leu Phe Asp 200 Alá Gin Gly Gin
Tyr 205 Pro Asp Thr Leu Leu 210 Arg Xle Tyr Arg Asp 225 Asn
Lys Thr Xle Asn 220 Ser Glu Asn XfiSU. Kis 225 Xle Asp Leu
Tyr Leu Tyr Thr
230

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Konjagárént, amely
    a) módosított vad-típusú szuperandgéak, és
    b) célkeresö részegységei tartalmaz;
    aszstjeftentezve, hogy a módosított szaperantigés SEB, amelyben egy I. régióban - amely X, régió a. T-sejt receptor (TCR) kötőhelyé» belül található- és meghatározza a TCR Vp-brériihoz kötődést és a T-sejt aktiválódást
    - egy vagy több .amixtösav ki vas cserélve az SEA megfelelő pozíciójában található egy vagy több amsaosawaX, oly módon, hogy a módosított szaperaatígén T-sejtes. eitotodcitásl. kiváltó aktivitása fokozódik az SEE-hez viszonyítva, és szeroreakiivitisa csökken az SEA-hoz képest, és a módosított szupcrantígóx! -olyan mutációt is tartalmaz, amely.- a vad-típus» szuperastígénhez viszonyítva
    - csökkenti az MBC H. osztályba tartozó antigénekhez: való kötődést képességét.
  2. 2. Az 1. igénypont szerint! koajngátom, ahol az I. régió a 2. ábra szerinti A régió, amely a SEQ ID NO 7 szedeti szekvencia 2D-27. aminosavaiból áll,
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti konjugátnm, ahol az I. régió a 2. ábra szerinti C régió, amely a SEQ 1D NO 7 szerinti szekvencia 60-62. arrénosavaiból áb.
  4. 4. Az X, igénypont szerinti konjngátunn ahol az I. régió a 2. ábra szerinti F régió, amely a SEQ ID NO 7 szerinti szekvencia 101-176. amioosavaiból áll.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti konjugtem, ahol tsz í, régió a 2, ábra szerinti H régió, amely a SEQID NO 7 szerinti szekvencia 200-207. aminosavaihól áll
  6. 6. A 2. igénypont szerinti koniogámm, amelyben a kővetkező sn'.ínosav-szebsztiiűeiók lettek, -végrehajtva; R2ÖG, N2IT, S24G és R27K, ahol a pozíciók a SEQ XX> NO 7 szerint vannak definiálva.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti kenjogátem, amely tartalmaz egy mutációt is, a SEQ ID NO 7 szerint definiált 227, pozícióban.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti konjogátoa, ahol a mutáció D22.7A.
  9. 9. Az 1-8. igénypoBíok bármelyike szerinti koníngálmn. ahol a ceikeresö részegység; a következőkből álló csoportból van kiválasztva: antigénkőtő ellenanyag; aktív fmgjaense, -antígéskőtő ellenanyag,, egyláncú ellenanyag, Eab, F(ab)2 és Fv.
    lő, Készítmény, amely tartalmazza egy konjagátom- terápiásán hatásos mennyiségét, amely konjugámm
    a) módoshoit vad-tipusú szuperanrigéní, és
    b) celkeresö részegységet tartalmaz;
    emlős betegségének kezelésében ibriésö alkalmazásra, az emlős immunrendszerének aktiválása útján, ahol. a ..koajngátma özzím wn/eteserve, hpgy a módosított szuperantigén SEE, amelyben egy I. régióban - amely L régió a Tsejt receptor (TCR) kötőhelyén beüli taláíbatö és meghatározza a TCR VfMáncához kötődést és s T-seji aktiválódást- egy vagy több amlsosav ki yen cserélve az SEA megfelelő pozíciójában található egy vagy több amhosavval, oly módon, hogy a módosított sznperattiigéa T-sejtes choio.xíeltást kiváltó aktivitása fokozódik az SEEhez viszonyítva, és szermeaktivitása-csökken az SEA-hoz képest, és:
    a módosított szHperaatigés olyan mutációt is tartalmaz, amely - a vad-tipusö szuperautigénhez viszonyítva
    - csökkeni! az MHC U, osztályba tartozó antigénekhez való kötődési képességét.
    - 52 ϊ 1. Α 10. igényporst szrriaíi készítmény, abe-í a betegség .-olyan sejtekkel -asszociált, amelyek: olyan sejtfelszíni céí-stinktórát exptesszálnak, melyek a sznperantigén-füzíöhoz olyan szcperantigén epitópen keresztS: kötődnek, amely szerkezetileg különbözik a TCR-kötő spítóptöl, és amely kötődés lehetővé teszt a TCR-hez történő kötődés: és a szttperaatigén általi T-se$aktiváíásL : 2. A 10. vagy 11. igénypont szerinti készítmény, ahol a betegség a kővetkezőkből álló csoportból van kiválasztva: rákok, vitális fertőzések, parazitsfertőzések és antoíntmun betegségek.
  10. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, ahol a betegség rák.
  11. 14. A 10. igénypont szerinti készítmény, ahol az I régió a 2. ábra szerinti A régié, amely a SEQ H> NO 7 szerinti szekvencia 20-27, amínosavaífeól áll.
  12. 15. A 10. igénypont szerinti készítmény, ahol-az 1. régió a 2. ábra szerinti C régió, amely a SEQ ID NO 7 szerinti szekvencia 60-62, aminosavaíből áll, lő. A 10. igénypont szerinti készítmény, ahol az I. régió -a 2. ábra szerinti f régió, amely a SEQ 1D NO 7 szerinti szekvencia l é i-176. .ntntnosavatbéí áll.
  13. 17. A íö. igénypont szerinti. készítmény, ahol az 1, régió a 2. ábra szerinti H régié, amely a SEQ S> NO 7 -szerinti szekvencia 200-207. annnosavaiből áll.
    IS. A 14, igénypont szerinti készítmény, amelybe®, a következő ansnosav-szubszritációk lettek végrehajtva', R2öG, N21T, S24Q és R2.7K, ahol a pozíciók a SEQ ,ID NO 7 szerint vannak definiálva.
  14. 19. A 1.8. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz. egy mutációt is, a SEQ ID NO 7 szerint definiált 227. pozícióban.
  15. 20. A19. igénypont szerinti készítmény, almi a mníáció D227A.
  16. 21. A 10-20. igénypontok bármelyike szerisii készítmény, ahol a célkeresc részegység a következőkből álló csoportból van kiválasztva: anfigéskötő ellenanyag aktív ftagmense, tmtigénkötö ellenanyag, egyíáaeú ellenanyag, Eafe, F(ab)2 és Fv.
  17. 22. Az : -9. igénypontok bármelyike szerinti kenjagáínm, gyógyszerként történő alkalmazásra.
  18. 23. Az 19. igénypontok bármelyike-szerinti konjngátemalkalmazása, emlős ínmnmrendszerének aktiválása útján emlős betegségének kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
  19. 24. A 23. igénypont .szerinti alkalmazás, a betegség olyan sejtekkel asszociált, amelyek olyan sejtfelszíni cél-stmkiűrát expresszálnak, melyek a ssnperantígén-íözióhor olyan szuperanfigén epitőpon .keresztül kötődnek, amely szerkezetileg, különbözik a. TCR-kötő epítóptöl, és amely kötődés lehetővé teszi a TCR-hez történő kötődést és a szupernntigén általi T-sejíaktivátást
  20. 25. -A 23. vagy 24. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a betegség a következőkből álló csoportból van kiválasztva; rákok, vírálís fertőzések, parazítafertőzések és autoimmun betegségek.
  21. 26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, alsói a betegség rak.
HU9903444A 1996-03-29 1997-03-26 Modified/chimeric superantigens and their use HU228185B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9601245A SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Chimeric superantigens and their use
US08/695,692 US6514498B1 (en) 1996-03-19 1996-08-12 Modified/chimeric superantigens and their use
PCT/SE1997/000537 WO1997036932A1 (en) 1996-03-29 1997-03-26 Modified/chimeric superantigens and their use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9903444A2 HUP9903444A2 (hu) 2000-02-28
HUP9903444A3 HUP9903444A3 (en) 2003-08-28
HU228185B1 true HU228185B1 (en) 2013-01-28

Family

ID=26662565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9903444A HU228185B1 (en) 1996-03-29 1997-03-26 Modified/chimeric superantigens and their use

Country Status (20)

Country Link
US (1) US7226595B2 (hu)
EP (1) EP0835266B1 (hu)
JP (1) JP4114951B2 (hu)
AT (1) ATE294818T1 (hu)
AU (1) AU707827B2 (hu)
BR (1) BR9702179A (hu)
CA (1) CA2222757C (hu)
CZ (1) CZ294475B6 (hu)
DE (1) DE69733179T2 (hu)
ES (1) ES2242222T3 (hu)
HU (1) HU228185B1 (hu)
ID (1) ID16512A (hu)
IL (1) IL122211A (hu)
MX (1) MX9709265A (hu)
NO (1) NO321984B1 (hu)
NZ (1) NZ329145A (hu)
PL (1) PL189696B1 (hu)
PT (1) PT835266E (hu)
TW (1) TW517061B (hu)
WO (1) WO1997036932A1 (hu)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
WO2001036486A2 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules
CN1224712C (zh) 1997-06-04 2005-10-26 牛津生物医学（英国）有限公司 载体
US7276488B2 (en) 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7087235B2 (en) 1997-06-25 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fusion protein of streptococcal pyrogenic exotoxins
US6713284B2 (en) 1997-06-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial superantigen vaccines
CN1275085A (zh) * 1997-07-21 2000-11-29 法玛西雅和厄普约翰公司 靶细胞的定向细胞溶解、引起细胞溶解的试剂和组合物以及可用于制备这些试剂的化合物
US6872394B1 (en) 1997-12-02 2005-03-29 Idaho Research Foundation, Inc. Non-toxic immune stimulating enterotoxin compositions
DK1035860T3 (da) * 1997-12-02 2006-09-18 Idaho Res Found Ikke-toksiske immunstimulerende enterotoksinsammensætninger
EP1105154B1 (en) * 1998-08-13 2016-06-01 Walter Reed Army Institute of Research Bacterial superantigen vaccines
US7491402B2 (en) * 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
AU1648102A (en) * 2000-12-04 2002-06-18 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
SE0102327D0 (sv) * 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
US20060240044A1 (en) * 2002-05-09 2006-10-26 Fraser John D Streptococcal superantigens spe-l and spe-m
NZ519371A (en) * 2002-06-04 2004-11-26 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) * 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20080274133A1 (en) * 2004-11-18 2008-11-06 Avidex Ltd. Soluble Bifunctional Proteins
WO2006105168A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Regents Of The University Of Minnesota Enhancing immune responses with bacterial exotoxins
US20070178113A1 (en) * 2005-11-22 2007-08-02 Backstrom B T Superantigen conjugate
TWI461211B (zh) * 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2707251C2 (ru) 2011-10-03 2019-11-25 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
DK3010535T3 (da) * 2013-06-19 2020-11-30 Integrated Biotherapeutics Inc Toxoide peptider afledt fra fenol opløselige modulin, delta toxin, superantigener og fusioner deraf
EP3632930A1 (en) * 2013-08-30 2020-04-08 Aprilbio Co., Ltd An anti serum albumin fab-effector moiety fusion construct
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CA3010678A1 (en) 2016-01-10 2017-07-20 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for enhancing the potency of superantigen mediated cancer immunotherapy
CN110996993B (zh) 2017-07-27 2024-05-31 Ab疫苗公司 包含源自超抗原类毒素的融合肽的免疫原性组合物
WO2020162203A1 (ja) * 2019-02-08 2020-08-13 国立大学法人東京工業大学 ホモジニアス免疫測定法に適した酵素変異体
KR20220009428A (ko) 2019-05-15 2022-01-24 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. 암 치료
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CA3170369A1 (en) 2020-03-05 2022-04-14 Michal Shahar Methods and compositions for treating cancer with immune cells
WO2023215560A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Atoosa Corporation Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp)
WO2024077066A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Musc Foundation For Research Development Superantigen vaccine conjugate for the treatment of cancer

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627644A (en) 1968-03-01 1971-12-14 Hajime Okamoto Process for the cultivation of hemolytic streptococci
US3903262A (en) * 1972-03-13 1975-09-02 Cutter Lab Pharmaceutical compositions comprising intravenously injectable modified serum globulin, its production and use
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
GB1587244A (en) 1977-07-01 1981-04-01 Memm Spa Streptococcal antigen pharmaceutical compositions containing it and its use in medical diagnosis and treatment
US4268434A (en) 1979-01-09 1981-05-19 Higerd Thomas B Immunosuppressive extracellular product from oral bacteria
US5091091A (en) 1981-11-06 1992-02-25 Terman David S Protein A perfusion and post perfusion drug infusion
US4699783A (en) 1983-03-11 1987-10-13 Terman David S Products and methods for treatment of cancer
US4681870A (en) 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
FR2589267B1 (fr) 1985-10-25 1991-05-31 Bertin & Cie Procede de traitement d'images, notamment dans une installation de tri postal
US4980160A (en) 1986-10-16 1990-12-25 Biogen, Inc. Combinations of tumor necrosis factors and anti-inflammatory agents and methods for treating malignant and non-malignant diseases
WO1989007947A1 (en) 1988-03-04 1989-09-08 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
DE68907388T2 (de) 1988-07-22 1994-01-05 Imre Corp Gereinigte Protein A-Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
DE3921211C1 (hu) 1989-06-28 1990-11-29 Idt Ag Fuer In Vivo Diagnostik Und Therapie, Zuerich, Ch
SE8903100D0 (sv) 1989-09-20 1989-09-20 Pharmacia Ab New pharmaceutical agent
US6042837A (en) 1989-09-20 2000-03-28 Kalland; Terje Methods of staphylococcal enterotoxin directed cell-mediated cytotoxicity (SDCC)
US6126945A (en) 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US5728388A (en) 1989-10-03 1998-03-17 Terman; David S. Method of cancer treatment
WO1991010680A1 (en) 1990-01-17 1991-07-25 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds
SE465328B (sv) 1990-02-19 1991-08-26 Duotech Innovation Ab Kompensationsventil
US5858363A (en) 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
US6197299B1 (en) 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
CA2087164C (en) 1990-07-20 2002-11-26 Terje Kalland Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
JPH08500328A (ja) 1992-01-28 1996-01-16 ナショナル ジューイッシュ センター フォア イミュノロジィ アンド レスパラトリィ メディスン 突然変異したスーパー抗原の保護作用
US5545716A (en) 1992-09-08 1996-08-13 University Of Florida Superantigen agonist and antagonist peptides
US5519114A (en) 1993-10-29 1996-05-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Retroviral superantigens, superantigen peptides, and methods of use
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
EP0832241B1 (en) 1995-06-07 2005-03-23 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin a and methods of use
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
US6447777B1 (en) 1996-03-29 2002-09-10 David S. Terman Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
WO1998024911A2 (en) 1996-12-06 1998-06-11 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin a and methods of use
US6774218B2 (en) 1996-12-06 2004-08-10 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin C and methods of use
AU734597B2 (en) 1996-12-06 2001-06-21 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin C and methods of use
WO1998026747A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
IL119938A (en) 1996-12-30 2005-08-31 Yissum Res Dev Co Peptides capable of eliciting protective immunity against toxic shock induced by pyrogenic exotoxins or of antagonizing toxin-mediated activation of t cells
US7087235B2 (en) 1997-06-25 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fusion protein of streptococcal pyrogenic exotoxins
US6713284B2 (en) 1997-06-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial superantigen vaccines
WO1999036433A2 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Morphogenesis, Inc. Materials and methods for treating oncological disease
EP1097212B1 (en) 1998-07-10 2008-12-24 U.S. Medical Research Institute of Infectious Diseases Anthrax vaccine
US20020177551A1 (en) 2000-05-31 2002-11-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20030157113A1 (en) 1999-12-28 2003-08-21 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20010046501A1 (en) 2000-03-14 2001-11-29 Johnson Howard M. Superantigen enhancement of specific immune responses
JP4283430B2 (ja) 2000-09-26 2009-06-24 株式会社カネカ エンテロトキシンの吸着材、吸着除去方法および吸着器
AU1648102A (en) 2000-12-04 2002-06-18 Auckland Uniservices Ltd Immunomodulatory constructs and their uses
CN1369550A (zh) 2001-02-16 2002-09-18 沈阳协合集团有限公司 一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP0835266B1 (en) 2005-05-04
AU2525197A (en) 1997-10-22
CZ294475B6 (cs) 2005-01-12
TW517061B (en) 2003-01-11
PL189696B1 (pl) 2005-09-30
US20030092894A1 (en) 2003-05-15
CA2222757C (en) 2011-07-26
DE69733179T2 (de) 2005-10-06
JP2002502363A (ja) 2002-01-22
IL122211A0 (en) 1998-04-05
NO321984B1 (no) 2006-07-31
HUP9903444A3 (en) 2003-08-28
ES2242222T3 (es) 2005-11-01
CA2222757A1 (en) 1997-10-09
ATE294818T1 (de) 2005-05-15
NO975435D0 (no) 1997-11-26
BR9702179A (pt) 1999-03-16
WO1997036932A1 (en) 1997-10-09
EP0835266A1 (en) 1998-04-15
PL323626A1 (en) 1998-04-14
NO975435L (no) 1998-01-29
MX9709265A (es) 1998-03-31
JP4114951B2 (ja) 2008-07-09
IL122211A (en) 2009-07-20
ID16512A (id) 1997-10-02
DE69733179D1 (de) 2005-06-09
CZ371297A3 (cs) 1998-05-13
NZ329145A (en) 2000-06-23
HUP9903444A2 (hu) 2000-02-28
US7226595B2 (en) 2007-06-05
AU707827B2 (en) 1999-07-22
PT835266E (pt) 2005-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228185B1 (en) Modified/chimeric superantigens and their use
US6514498B1 (en) Modified/chimeric superantigens and their use
KR100426113B1 (ko) 티(t)-세포항원,및티(t)-세포매개증상의진단및치료에있어서의이의용도
JP3786695B2 (ja) 修飾した抗原性免疾グロブリンによるｔ細胞の活性化
KR20200104284A (ko) Hpv-특이적 결합 분자
US20050260215A1 (en) Conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate
JP2000511403A (ja) 抗癌胎児抗原抗イディオタイプ抗体のヒト化と腫瘍ワクチンとしての使用及びターゲッティング用途のための使用
US11041011B2 (en) Human alpha fetoprotein-specific murine T cell receptors and uses thereof
CZ418691A3 (en) CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR RECEPTOR IL-2 PROTEIN p 55 TAC
WO2011137687A1 (zh) 一种抗癌胚抗原抗体及其应用
WO2003061694A1 (en) Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
WO2021102624A1 (en) Covalent protein drugs developed via proximity-enabled reactive therapeutics (perx)
KR20050090980A (ko) 단백질성 화합물의 독성 효과 변형 조성물 및 방법
Hintz et al. Simultaneous engagement of tumor and stroma targeting antibodies by engineered NK-92 cells expressing CD64 controls prostate cancer growth
Antonsson et al. Functional characterization of the interaction between the superantigen staphylococcal enterotoxin A and the TCR.
CN115304680B (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
US20090226942A1 (en) Modified aerolysin and methods of use for treating lung cancer
RU2804664C2 (ru) Hpv-специфические связывающие молекулы

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees