CN1369550A - 一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种制备金黄色葡萄球菌培养物的方法,包括将猪心加入水中粉碎,得猪心浸出液,并加入蛋白胨和氯化钠制得培养基;将金黄色葡萄球菌菌株CGMCC 0485复苏、增菌后,制成种子液,发酵后得一培养物。该培养物具有抗肿瘤作用。

Description

一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法。
本领域技术人员熟知金黄色葡萄球菌的培养物中含有抗肿瘤成分，其主要的有效成分含有金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin，SE)目前认为这种毒素是一种生物活性极其强大的超级抗原(superantigen，SAg)。现有文献中报道的超级抗原来源包括细菌，病毒和寄生虫等等。超级抗原的含义，作用以及作用机制完全不同于现今所有的普通抗原，或者称一般抗原。超级抗原是一类来源复杂的蛋白质，它在免役应答中只需要微量即可，例如可按照ngM计算。这种抗原利用非常独特的机制刺激T细胞大量增殖，产生大量的细胞因子，其表现的细胞毒性为：(一)直接激活细胞毒性T淋巴细胞，使之对靶细胞产生杀伤作用；(二)通过细胞因子的作用，激活NK细胞；(三)借超级抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(Superantigen dependentcell-mediated cytotoxicity，SDCC)，杀伤肿瘤细胞。
今年来，证实超级抗原具有抗肿瘤作用后，接着用化学方法合成McAb-SEA结合物，最后采用重组技术制成融合蛋白。这种融合蛋白于1997年进行I期临床试验，其结果表明：一次计量达1.5ng/kg是安全的，但是病人全身反应较大，大多数接受治疗的病人白细胞数量明显减少，血小板数量减少者更甚。
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的金黄色葡萄球菌菌株。
本发明的另一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的培养物及其培养方法，以及培养中采用的培养基。
本发明的另一目的在于提供所述的金黄色葡萄球菌的培养物具有抗肿瘤作用的用途。
本发明采用金黄色葡萄球菌菌株，在新的培养基中发酵培养制备一种培养物，该培养物具有抗肿瘤作用。本发明方法中培养基配方简单，有效地减少了原料使用量。其治疗用的培养物滤液可以不再进行灭菌处理。菌种产生酶的稳定性提高。使用本产品后，使用者的白细胞数量大大增加，提高抗肿瘤的效果。
本发明中所涉及的金黄色葡萄球菌菌株(staphylococcus aures)已经于2000年9月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC 0485。
菌株CGMCC No.0485的来源是从医院临床细菌检验室的标本中分离得到的100多株葡萄球菌中筛选得到菌株CGMCC No.0165后，再经亚硝基胍诱变，选育得之。
菌株CGMCC No.0485的形态特征：
形态特征：
金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定的细胞经透射电子显微镜放大2万倍(包埋法)和6万倍(超薄切片法)可看到细胞均成球行，直径0.5-1.0μm，单个，成对排列，具特征性的多于一个平面分裂，形成不规则的堆团，无鞭毛，不运动，不形成夹膜，不产生芽孢。在电子显微镜(超薄切片法)下，细胞壁、细胞膜、染色质均可见，不同生长期细胞的大小、结构有所不同，但金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株并无明显区别。
培养特征：
血平皿培养，菌落成圆形，突起，表面光滑，边缘整齐，不透明去，菌落呈金黄色，有大而透明的溶血环，35℃培养24hr，菌落直径约1.5-2.0mm。
液体培养基中生长物最初浑浊，后来变清，并具有细的，易悬浮的沉淀，培养2-3天时常有环状的膜，液体培养物在相同条件下，浊度略小，菌浓度略低。
染色特征：
用标准革兰氏染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均为革兰氏阳性菌。
用夹膜染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株均为阴性。
用芽孢染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株均为阴性。
生理生化特征：
血浆凝固酶阳性，在培养基中产酶能力很强。
葡萄糖、甘露醇发酵实验，产酸能力较弱。
培养物除菌后的滤液热源合格率高，可达95％以上。
水解淀粉试验：金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均呈阴性。
过氧化氢酶实验：金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均呈阳性。
本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)将原料猪心加入1～2倍水中粉碎、过滤、得第一滤液和滤渣；
(2)向所述的滤渣中加入1～2倍水，于90～95℃浸泡，过滤，得第二滤液和滤渣；合并第一滤液和第二滤液得第三滤液；
(3)将按照液体总重量计算的，向第三滤液中加入0.025～0.5g％蛋白胨，以及0.3～0.9g％氯化钠加入第三滤液，并向该滤液中加入0.5％的活性炭，将其pH值调整为7.2左右得一培养基；
(4)将金黄色葡萄菌菌株复苏，增菌后制成种子液，使其细菌浓度达到105-107后进行接种，其接种量为0.02～0.2ml％；
(5)35℃发酵约15-20小时后，得一培养物，
(6)将所述的培养物除菌、过滤、其渗透压调至等渗，并将其pH值调整6.8～7.4后得终产物。
本发明所得之产物可以直接进行加工，灌封成安培针剂，供肌肉注射。该注射液对肿瘤病人的使用计量为：每日一支，2ml/支。
上述的方法中所述的金黄色葡萄菌菌株是已经于2000年9月14日保藏在中国典型微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC 0485的菌株。
采用本发明所述的菌株明显地缩短了约1/5的发酵时间，种子液培养时间缩短了2/3，减少了原料的使用量，工艺简单，容易控制，大大提高了产品的质量，降低了成本。另外，诱变后菌株的产酶能力得到了提高，该菌株对营养条件要求较低，产品热源合格率大幅度提高，副反应减少。
为了进一步理解本发明的实施方案，以下将结合实施例对本发明进行非限定性的描述。
实施例1
取猪心100公斤，用清水洗净后，采用铰肉机，(广东番禹市肉联食品机械长生产的，型号：TJL12-4)进行铰碎处理，加入150公斤注射用水于90℃浸泡1小时，然后过滤出滤渣，得猪心滤液备用。
向上述的滤渣中加入注射用水100公斤，90℃浸泡1小时，然后过滤，滤渣弃之，得滤液。将得到的所有滤液合并。取合并后的猪心滤液2000毫升，加入蛋白胨100克，氯化钠1200克，搅拌沸煮后使加入的物质使其完全溶解，在加入清水，并将它们pH值保持在约8.5，4℃下放置过夜。向该滤液中加入活性炭10克，将所述滤液pH值从8.5逐步调整为7.2左右。
将得到的经过上述处理后的滤液调成等渗液后，分装栽500毫升的密封瓶瓶内，0.1Mpa的压力下，消毒灭菌20分钟，制得培养基400公斤，总体积约为400,000毫升。
将金黄色葡萄球菌菌种CGMCC 0485在35℃温度复苏24小时，然后在血平皿上增菌8小时，增菌温度为35℃，得种子液。该种子液的细菌浓度为107。
然后，将培养基混于一不锈钢容器内，经除菌过滤后装入发酵罐中；预热至35℃接种，接种量为0.2％ml。35℃发酵培养16小时后，得到培养物。对所述的培养物进行灭菌、过滤和检验合格后，直接灌封成针剂。
每次发酵培养得到的培养物都进行热源，酶活性以及过敏实验等检测。
实施例2
取猪心100公斤，用清水洗净后，采用铰肉机，(广东番禹市肉联食品机械长生产的，型号：TJL12-4)进行铰碎处理，加入150公斤注射用水于90℃浸泡1小时，然后过滤出滤渣，滤液备用。
向上述的滤渣中加入注射用水100公斤，90℃浸泡1小时，然后过滤，滤渣弃之，得滤液。将得到的所有滤液合并。取合并后的猪心滤液4000毫升，加入蛋白胨2000克，氯化钠3600克，搅拌沸煮后使加入的物质使其完全溶解，在加入清水，并将它们pH值保持在约8.5，4℃下放置过夜。向该滤液中加入活性炭200克，将所述滤液pH值从8.0逐步调整为7.0。
将得到的经过上述处理后的滤液调成等渗液后，分装栽500毫升的密封瓶瓶内，0.1Mpa的压力下，消毒灭菌20分钟，制得培养基总体积约400,000毫升。
将金黄色葡萄球菌菌种CGMCC 0485在35℃温度复苏24小时，然后在血平皿上增菌8小时，增菌温度为35℃，得种子液。该种子液的细菌浓度为105。
然后，向将所述的培养基混合于一不锈钢容器内，经除菌过滤后装入发酵罐中；预热至35℃接种，接种量为0.2ml％。35℃发酵培养20小时后，得到培养物。对所述的培养物进行灭菌、过滤和检验合格后，直接灌封成针剂。
每次发酵培养得到的培养物都进行热源，酶活性以及过敏实验等检测。
实验例一  抗化疗引起的白细胞减少试验
取本发明实施例1所得的金黄色葡萄球菌培养物在中日友好医院进行抗化疗引起的白细胞减少的临床试验。20个病例的选择主要为进行化疗的癌症，主要为肺癌(占60％以上)。试验经过病理学与细胞学证实，肌肉注射本发明之培养物治疗前后对病人肝肾均无影响。对减轻化疗引起的白细胞下降有显著的作用(p＜0.05和p＜0.01)对抗化疗引起的白细胞减少的疗效在治疗期有效率可达90％，其中显效率为55％，而对照有效率仅为15％，显效率为5％。
因此，本发明方法制得的培养物具有对抗化疗引起的白细胞减少，保护白细胞不下降或减少降低白细胞的程度，缩短白细胞减少的期限，并促进下降的细胞恢复正常。
实验例二  对自然杀伤细胞活性的影响
根据军事医学科学院的试验报告：取本发明所述之培养物将其制成注射剂，该注射剂每毫升含有500u。此处本品以每ml药液含有在37℃6小时能使血浆中的液态纤维蛋白原产生1μg纤维蛋白的游离凝固酶作为一个活性单位(u)。试验肿瘤为：S180肉瘤、Lewis肺癌和U14宫颈癌。采用本领域技术人员公知方法给昆明种小鼠和C57BL/6小鼠进行试验，测定自然杀伤细胞(NK)活性的测定和淋巴细胞转化试验。试验结果为：
一次性注射本发明所述之培养物两天后，杀伤细胞活性升高，四天后达高峰，六天后逐渐恢复至给药前水平。抑瘤率可达90％以上。
对于S180肉瘤小鼠中一次给药后的变化为：200～1000u/鼠可使得小鼠的杀伤细胞活性轻度增高，剂量增至1200～1500u/鼠，杀伤细胞活性明显增强。在Lewis和U14宫颈癌荷瘤小鼠中32u/天/一次，连续9天后NK细胞的活性也明显增高(p＜0.05)。
因此，一次或多次向小鼠给予本发明制培养物均能显著增强正常小鼠以及荷瘤小鼠的NK细胞的活性。
实验例三对淋巴细胞转化率的影响根据军事医学科学院的试验报告：对于正常小鼠10只一次性给药32.5u，可使淋巴细胞转化率轻度增高给药后4天较明显，6天后恢复正常。
荷瘤小鼠每天腹腔注射32.5u的本发明实施例1之培养物，连续9天也可以使其淋巴细胞转化率轻度升高。当一次性大剂量给药(例如1000或1500u时，则可见淋巴细胞转化率明显增高。
实验例四对肿瘤细胞的抑制作用
根据军事医学科学院的试验报告：自荷S180腹水小鼠瘤小鼠抽腹水，计数瘤细胞，稀释至预期瘤细胞，加入不同量的本发明实施例1所得的培养物，混合后立即给每只小鼠皮下接种0.2ml，10天后活杀小鼠取出肿瘤称重。对照组不加本发明的培养物，只加入等量的生理盐水，其他与实验组相同。结果表明：50u/鼠剂量即对S180肿瘤生长有明显抑制作用，与对照组比较平均抑瘤率为：38.3±20.9％。随着剂量的增加，抑瘤作用呈现正相关结果。如果给药剂量为200～1500u时，抑瘤率最高可达91％。
实验例五对S180实体瘤的治疗作用
根据军事医学科学院的试验报告：将小鼠86只分成四组，23只为对照组，其他为每组21只，在实验组小鼠皮下接种S180腹水瘤细胞，24小时后在注射本发明实施例2之培养物。每天一次，连续9天，于10天后活杀取瘤称重。其中对照组为注射生理盐水。实验结果表明：50，100以及150u/鼠组剂量的培养物，随S180的抑制率分别为25％，30％和37％。
另外，C57BL/6小鼠皮下接种肿瘤后24小时皮下注射本发明之培养物，50，100和150u/鼠，每天1此连续9天。实验显示表现出有轻度抑制作用。
实验例六对人体观察的结果
经过中日友好医院、青岛人民医院、沈阳市第五医院、蚌埠医学院附属医院大连医学院附属医院以及上海同仁医院等六家医院的临床大量实验，包括化疗、放疗综合实验，以及该培养物对人体的各个方面的影响等等实验结果显示：本发明的培养物对放疗、化疗引起的白细胞数目减少有明显提升作用。另外，对放、化疗期间同时使用所述的培养物可见它可以阻止人体的由于放、化疗作用白细胞下降。由于篇幅的缘故，不在此处赘述。
另外，本发明的培养物含有减轻放、化疗毒副作用(例如骨髓抑制、胃肠道反应、食欲不振以及体重和活动状况等等)的效果。
本发明培养物是安全的，在实验中开始1-3天有部分实验者出现发热，一般体温在38度左右，但是经过处理很快好转，多数受试者能够耐受，自行或者轻微处理当天可以恢复。
总之，综合疗效判断结果显效占25.93％，有效占55.09％，进步占15.74％，无效占3.24％，故总有效率：(显效加有效)81.02％。

Claims (6)

1.一种制备金黄色葡萄球菌(staphylococcus aures)培养物的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将原料猪心加入1～2倍水中粉碎，过滤，得第一滤液和滤渣；(2)向所述的滤渣中加入1～2倍的90～95℃净水浸泡后粉碎，得第二滤液和滤渣；合并第一滤液和第二滤液得第三滤液；(3)将按照液体总重量计算的合并后的猪心浸出液中加入，0.025～0.5g％蛋白胨，以及0.3～0.9g％氯化钠，并向该滤液中加入0.5％的活性炭，将所述的第三滤液pH值从8.5逐步调整为7.2左右得培养基；(4)将金黄色葡萄球菌菌株CGMCC 0485复苏、增菌后，制成种子液，使其细菌浓度达到105-107后向培养基接种，其接种量为0.02～0.2ml％；(5)在35℃发酵培养菌株CGMCC 048约15-20小时后，得一培养物，(6)将所述的培养物除菌，过滤，其渗透压调至等渗，并将其pH值调整6.8～7.4。
2.一种金黄色葡萄球菌菌株(staphylococcus aures)，已经于2000年9月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.0485。
3.一种如权利要求1所述的方法中所述的培养基，其中按照培养基总重量计算，该培养基含有0.5～10ml％的猪心浸出液，0.025～0.5g％蛋白胨，以及0.3～0.9g％氯化钠。
4.一种如权利要求1所述的方法制备的金黄色葡萄球菌培养物。
5.如权利要求4所述的金黄色葡萄球菌培养物在制备抗化疗引起的白细胞减少药物中的应用。
6.如权利要求4所述的金黄色葡萄球菌培养物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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