CN1087523A - 地衣芽孢杆菌生态制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌生态制剂的制备 方法，其中采用地衣芽孢杆菌63516株培育后的菌 苔加无水碳酸钙脱水干燥，并用乳糖和淀粉稀释成的 每克含10亿±1亿活菌的制剂，在临床上可用于治 疗急性腹泻和菌落失调症。

Description

本发明涉及制造含有抗原或抗体的医药制品的方法，特别是涉及制造含地衣芽孢杆菌抗原的医药制品的方法。

本发明的方法中涉及的杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus        Licheniformis）。

有关活菌制剂以及生态防治的应用已有近百年的历史，并在本世纪50年代后有了较快的发展，各种生菌制剂不断问世，如单价或多价的口服与注射的制剂，皆收到较好的防治效果。但在国外这类制剂多为双岐杆菌和乳酸菌类，制成单价的或多联的;1981年国内康白教授以腊样芽孢杆菌制成了活菌制剂“促菌生”。但在国内仍无地衣芽孢杆菌的生态制剂。在国外，对地衣芽孢杆菌的研究、文献也很少，并且只限于生物酶类（如淀粉酶）、抗生素以及畜牧方面（如家畜育肥、乳牛产奶等）。根据已知现有技术中，地衣芽孢杆菌生态制剂在国内外尚无先例。

本发明的目的在于提供一种制造含地衣芽孢杆菌63516株的生态制剂的方法。为完成本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及用于临床治疗急慢性腹泻和肠道菌群失调症的地衣芽孢杆菌生态制剂的制备方法，其特征在于使用分离正常待产妇女阴道拭子的地衣芽孢杆菌63516株（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：No.0183），作为菌种，经在肉汤培养基内培养制成种子液;对种子液在琼脂培养基内扩大培养制成菌苔液;并在菌苔液中加入无水碳酸钙脱水干燥制成原菌粉;然后再在原菌粉中加入药用乳糖和药用淀粉稀释，研磨后制成每克含10亿±1亿活菌的成品粉。

用本发明的方法制造的生态制剂是用地衣芽孢杆菌63516株培育后的菌苔加无水碳酸钙脱水干燥、并用乳糖和淀粉稀释成的每克含10亿±1亿活菌的制剂。

所述的地衣芽孢杆菌菌种已于1992年11月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：0183。

地衣芽孢杆菌63516株是用普通营养琼脂分离于正常待产妇女的阴道拭子的。七年来经过大量的基础与临床研究证明，该菌株是一种安全、无毒、有效的新菌种。该菌株（及其生态制剂）对大肠内的大肠杆菌和嗜酸乳杆菌相互呈共生作用，对葡萄球菌和白色含珠菌有明显拮抗作用，对肠道内生理性厌氧菌通过生物耗氧作用有明显的促生长效应。因此该菌株调整肠道菌群或生态防治的作用机制是双重双向效应，可用于急慢性肠炎和肠道菌群失调症的治疗。并且该菌株基本无毒性，故在临床应用时可酌情增减该制剂的用量，以得到较好的防治效果。

地衣芽孢杆菌63516株在培养基（pH值为6.0-7.8的普通营养肉汤以及pH值为6.0-7.8的普通营养琼脂）培养时，应具有典型的形态、染色特征、菌落特征、以及生化反应谱;在血清定量凝集试验中，该菌株的凝集价不应低于原血清的原效价的1/2-1/4。在进行这种血清定量凝集试验时，以磷酸冲盐水洗脱经16-24小时在37℃温度下培养的固定培养基上的培养物每毫升含菌4-8亿，将其与地衣芽孢杆菌特异诊断血清混合，混合后在温度为37℃的情况下过夜，以肉眼观察到凝集（+）的血清的最高稀释度即为凝集反应的凝集效价。该菌株是在2-8℃下冻干保存的。

下面详细描述利用地衣芽孢杆菌63516株制造本发明的地衣芽孢杆菌生态制剂的方法。按照本发明的制造方法，依次包括如下步骤：

（a）制种子液：

首先，对菌种进行检查。冻干菌种启开后，应检查菌体染色形态、纯度，并进行玻片凝集试验，合格方可使用。冻干菌种启开后，传代不得超过5代。

然后，将pH值为6.0-7.8，优选为7.2-7.4的营养肉汤作为培养基，分装试管，每支20毫升。

接着，用白金耳从琼脂平板取该菌株的典型菌落，接种于种子液肉汤管，并在34-37.5℃，优选为37℃温度下培育15-24小时，优选为18-24小时。

为了进行纯菌试验，可以用白金耳从培育的种子液中取样并接种于二枚琼脂平板上，分别在34-37.5℃和25℃温度下培育24-48小时，应无杂菌生长。如有，则废弃。

（b）扩大培养：

首先，将pH值为6.0-7.8，优选为7.2-7.4的营养琼脂作为培养基，分装在克氏瓶内，每支装250毫升培养基;

然后，将一管种子液倾注到克氏瓶内进行接种，使种子液布满琼脂表面，并在35-38℃，优选为37℃温度下培育48小时;

接着着手收集菌苔液。为此，在每只克氏瓶内加入50毫升生理盐水以便洗脱瓶中的菌苔。将每10瓶的洗脱液收集在一个称重的500毫升离心瓶内。以3000-5000转/分，优选为4500转/分的转速使离心瓶离心40分钟。而后除弃上清液，并称量所剩菌泥的重量。

在将克氏瓶内的菌苔液合并前，也须再进行一次纯菌试验。即取一白金耳洗脱的菌液，将其接种于二枚琼脂平板，并在37℃和25℃下培育24-48小时。如生长杂菌，则应废弃。

（c）制原菌粉：

在按步骤（b）得到的菌泥中加入50毫升生理盐水，使菌泥溶解。将溶解的菌泥倒入无菌的研钵内。按菌泥与无水碳酸钙的重量比为1∶8，优选为1∶5，在研钵内加入无水碳酸钙，使菌泥和碳酸钙充分研混，并放入65-75℃，优选为65℃的烤箱内烘烤30分钟，间歇30分钟，重复三次使之干燥成菌泥块。

然后，将烘干的菌泥块放入球磨机内研磨1小时使之成粉，并可以将磨过的菌粉过筛，例如用80目筛。

最后，要对制成的原菌粉进行活菌数测量。为此，从筛过后的原菌粉上随意选取5个点位，并在每一个点位上取原菌粉样0.5克，并对它们用肉汤进行10^-10-10^-10的稀释。充分混合后，从每个稀释管取0.1毫升稀释后的原菌粉，并将它们接种于琼脂平板，再用L棒涂匀，然后再在34-37.5℃，优选为37℃下培育18-24小时。从生长的菌落数在30-200个之间的琼脂平板的实际菌落数，算出每克原菌粉的实际活菌数。即每克活菌数＝菌落数×稀释倍数×20。

（d）制成品菌粉：

首先将药用淀粉在12.5磅压力下高压灭菌15分钟，用作稀释剂;

然后，将药用乳糖在150℃温度下干热灭菌50分钟，用作保护剂;

按原菌粉活菌数和每克需含的活菌数（10亿/克）加入乳糖和淀粉，其中乳糖10%，淀粉90%，并将它们放入球磨机研混1小时。

按步骤（c）中相同的方法测活菌数，每克活菌数应为（10±1）亿。

最后，将成品菌粉制成可服用的形式，例如装入每粒0.25克±0.025克成品菌粉的胶囊内。

对于按上述步骤制成的本发明的地衣芽孢杆菌生态制剂应进行如下的检验：

1.理化检查：成品菌粉应为白色、无异味、无粗大颗粒;

2.菌形及纯度检查：

取成品菌粉1克，溶于5毫升肉汤内，充分混匀，并静置5分钟。用白金耳取其上清液涂片，进行G染色镜检，应为G⁺大捍菌。至少应观察10个视野，不应有杂菌，芽孢形成率应为50%-80%。

3.活菌数测定：

按前述的步骤（c）中测活菌数的方法测量活菌数。对于每粒0.25克±0.025克的胶囊，其活菌数应为（2.5±0.25）亿。

4.杂菌总数检查：

例如取成品胶囊4粒（1.0克），溶于含5毫升肉汤的管内，充分混匀后静置5分钟。用无菌吸管取出1毫升上清液，再加入2毫升的抗血清（凝集效价为1∶（3000-8000）摇匀。经37℃水浴15分钟后再以500转/分的转速离心10分钟。然后，取出0.3毫升上清液，并将其分别滴在营养琼脂板，每枚0.1毫升，并用L棒涂匀，再置入37℃温箱中开盖烤30分钟、合盖培育24小时。对杂菌菌落总数进行计数（不含真菌），算出杂菌总数。每克含杂菌总数应少于1000个。

5.大肠杆菌检查：

取成品菌粉1克，溶于1毫升肉汤内，并将肉汤管摇混匀，然后取出0.5毫升。用5枚EMB琼脂平板，每枚平板种0.1毫升，再用L棒涂匀，置于37℃温箱中开盖烘15分钟，合盖培育24小时，不应生长大肠杆菌。

6.真菌检查：

和大肠杆菌检查进行同样的稀释后，取菌液0.5毫升，接种5枚含青链霉素沙保弱氏培养基（斜面）平板上，每枚平板0.1毫升，在25℃温度下培育7天，不应生长真菌。

7.小鼠安全试验：

用含40%成品菌粉的生理盐水，给5只18-20克重的小鼠灌胃，每只小鼠灌入0.5毫升，观察5天，应无不良反应。

8.生物耗氧试验（平板生物厌氧培养法）：

将地衣芽孢杆菌肉汤12小时培养物0.1毫升，滴于营养琼脂平板（盖或底），用L棒涂匀并在37℃温度下培育3小时;

再用白金耳对拟杆菌的48-72小时液体培养物取样，接种于含拟杆菌选择性固体培养物（BD）的平板（盖或底）;

将二者合拢，用透明胶布密封两个平板的间隙，在37℃温度下培育72小时，则应有拟杆菌生长。如用不接种地衣芽孢杆菌平板作对照，则拟杆菌不生长。

本发明的地衣芽孢杆菌生态制剂对某些重要的致病菌、条件致病菌有明显的拮抗作用，能调整肠道内的菌群，无毒、无不良反应，使用安全。经在北京协和医院、北京军区总医院、及酒仙桥医院进行了Ⅱ期临床实验，并和服用氟哌酸的疗效进行了对比如下：

北京协和医院临床观察方案在肠道门诊治疗急性腹泻139例，其中治疗组（本发明制剂）83例，对照组（氟哌酸）36例，失访20例。现将符合评价的病例情况总结如下：

一、各组性别例数、平均年龄和病程

本发明制剂(83)        氟哌酸组(36)

轻型(39)        重型(44)        轻型(39)        重型(44)

性别

男(52)        18        22        6        6

女(67)        21        22        13        11

平均年龄        36.6±11.8        36.2±14.6        39.1±16.3        39.8±13.2

病程(天)        4.8±6.6        1.9±2.0        4.2±6.7        1.8±1.1

二.各组疗效情况

显效        有效        无效        加重

轻        本发明制剂(39)        24(82)        13(33)        2(5)

型        氟哌酸(19)        11(68)        8(42)

重        本发明制剂(44)        23(5)        14(32)        7(16)

型        氟哌酸(17)        9(63)        7(41)        1(6)

治疗组(83)        47(67)        27(33)        9(11)

对照组(36)        20(56)        15(42)        1(3)

临床实验的结果表明，本发明制剂对急性肠炎和轻型痢疾有较好的疗效，其作用与氟哌酸相同，并具有治疗肠菌群失调的作用，且无毒、无不良反应。

Claims (9)

1、一种用于临床治疗急慢性腹泻和肠道菌群失调症的地衣芽孢杆菌生态制剂的制备方法，其特征在于使用分离正常待产妇女阴道拭子的地衣芽孢杆菌63516株(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：No.0183)，作为菌种，经在肉汤培养基内培养制成种子液；对种子液在琼脂培养基内扩大培养制成菌苔液；并在菌苔液中加入无水碳酸钙脱水干燥制成原菌粉；然后再在原菌粉中加入药用乳糖和药用淀粉稀释，研磨后制成每克含10亿±1亿活菌的成品粉。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于在制种子液时使用pH值为6.0-7.8的营养肉汤作为培养基，在37℃温度下对菌种培育15-24小时。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于在制种子液时使用pH值为6.0-7.8的营养肉汤作为培养基，在37℃温度下对菌种培育18-24小时。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于扩大培养时使用pH值为6.0-7.8的营养琼脂作为培养基，在35-38℃温度下对种子液培育48小时。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于使用pH值为6.0-7.8的营养琼脂作为培养基，在37℃温度下对种子液培育48小时。

6、如权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于在制原菌粉时菌泥与无水碳酸钙的重量比为1∶8，并在65-75℃的烤箱中烘烤30分钟、间歇30分钟，如此重复三次使之干燥。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于其中所说的烘烤温度为65℃。

8、如权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于在制成品粉时加入的乳糖为10%，淀粉为90%。

9、如权利要求6所述的方法，其特征在于在制成品粉时加入的乳糖为10%，淀粉为90%。