PL216516B1 - Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number
PL216516B1
PL216516B1 PL368048A PL36804802A PL216516B1 PL 216516 B1 PL216516 B1 PL 216516B1 PL 368048 A PL368048 A PL 368048A PL 36804802 A PL36804802 A PL 36804802A PL 216516 B1 PL216516 B1 PL 216516B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
region
replaced
conservative
cheese
leu
Prior art date
Application number
PL368048A
Other languages
English (en)
Other versions
PL368048A1 (pl
Inventor
Göran Forsberg
Eva Erlandsson
Per Antonsson
Björn Walse
Original Assignee
Active Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Active Biotech Ab filed Critical Active Biotech Ab
Publication of PL368048A1 publication Critical patent/PL368048A1/pl
Publication of PL216516B1 publication Critical patent/PL216516B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
    • H04L51/06—Message adaptation to terminal or network requirements
    • H04L51/063—Content adaptation, e.g. replacement of unsuitable content
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
    • H04L51/58—Message adaptation for wireless communication

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna.
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny immunologii i chorób proliferacyjnych takich, jak rak. Konkretniej, dotyczy on kompozycji które obejmują superantygeny, które zmodyfikowano w celu zmniejszenia seroreaktywności.
Superantygeny (SAg) tworzą grupę białek bakteryjnych i wirusowych o wyjątkowej zdolności aktywowania dużej części populacji limfocytów T. Superantygeny wiążą się bezpośrednio z głównym układem zgodności tkankowej (MHC) bez wcześniejszej obróbki. W istocie, superantygeny wiążą się bez obróbki poza bruzdą wiążącą antygen na cząsteczkach MHC klasy II, unikając tym samym większości polimorfizmów w konwencjonalnym miejscu wiązania peptydów. Mechanizm wiązania zależy od związania superantygenu z receptorem limfocytów T (TCR) w łańcuchu νβ, zamiast wiązania z nadzmiennymi pętlami receptora limfocytów T (TCR).
Enterotoksyny gronkowcowe (SE) są grupą superantygenów homologicznych pod względem zarówno struktury, jak i funkcji (Papageorgiou i wsp., 2000). Wiadomo, że są główną przyczyną zatrucia pokarmowego i zespołu wstrząsu toksycznego u ludzi. Opracowano nową opartą na SAg strategię leczenia nowotworów w celu leczenia adiuwantami guzów litych. Wykorzystuje ona oba główne elementy układu odpornościowego przez połączenie części Fab swoistego wobec nowotworu przeciwciała monoklonalnego oraz aktywującego limfocyty T SAg w jedno zrekombinowane białko fuzyjne. Białka Fab-Sag związane z komórkami nowotworowymi mogą zaindukować aktywowane przez SAg cytotoksyczne limfocyty T do bezpośredniego zabicia komórek nowotworowych poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od superantygenu i przeciwciała - SADCC. Ponadto, zaktywowane limfocyty T wytwarzają cytokiny niszczące nowotwór i wywołujące stan zapalny, rozwiązując odpowiednio problem heterogenności nowotworu i wchłaniania makrocząsteczek.
Oparte na superantygenach środki lecznicze przeciw nowotworom odniosły pewien sukces, jednym z klinicznych problemów, które należy rozwiązać jest jednak aktywacja ogólnoustrojowej odpowiedzi odpornościowej. Białka fuzyjne z SEA typu dzikiego zbadano w próbach klinicznych dla raka jelita grubego i trzustki (Alpaugh i wsp., 1998). Mimo uzyskania zachęcających wyników zaobserwowano pewne ograniczenia. Po pierwsze, produkt był wysoce toksyczny. Po drugie, występujące u pacjentów przeciwciała przeciwko superantygenom komplikowały zagadnienie dawkowania. Ponadto, produkt był immunogenny. Powtarzanie cykli leczenia było zatem możliwe jedynie u ograniczonej liczby pacjentów.
Do czasu niniejszego wynalazku terapie oparte na SAg były ograniczone dawką. Niniejszy wynalazek jest pierwszym, w którym modyfikowany jest superantygen, co powoduje zmniejszoną seroreaktywność przy zachowaniu aktywności superantygenowej; niniejszy wynalazek jest zatem nowy i nie oczywisty.
Poniżej przedstawiono dosyć ogólny zarys charakterystycznych cech i korzyści technicznych niniejszego wynalazku w celu ułatwienia lepszego zrozumienia następującego dalej szczegółowego opisu wynalazku. Będą w nim opisane dalsze cechy i korzyści wynalazku, które tworzą przedmiot zastrzeżeń patentowych wynalazku. Specjaliści wiedzą, że ujawniona koncepcja i konkretne wykonanie mogą być z łatwością wykorzystane jako podstawa do modyfikacji lub projektowania innych struktur w celu uzyskania tych samych celów, co w niniejszym wynalazku. Specjaliści powinni także stwierdzić, że takie równoważne konstrukcje nie odchodzą od ducha i zakresu wynalazku jak przedstawiono w dołączonych zastrzeżeniach patentowych.
Nowe cechy, które uważane są za charakterystyczne dla wynalazku, zarówno jego organizacji, jak i sposobu działania, wraz z dalszymi celami i korzyściami będą lepiej zrozumiane na podstawie następującego opisu, gdy jest rozpatrywany wraz z towarzyszącymi rysunkami. Należy jednak wyraźnie zrozumieć, że każdy z rysunków dostarczono jedynie w celu ilustracji i opisu i że nie są one zamierzone jako definicja ograniczeń niniejszego wynalazku.
W niniejszym wynalazku dostarczono koniugat obejmujący superantygen bakteryjny oraz część przeciwciała, gdzie superantygen jest superantygenem o niskim mianie obejmującym regiony od A do E, który to region A jest miejscem wiązania TCR, a regiony B do E determinują wiązanie się z cząsteczkami MHC klasy II; a sekwencja DNA kodująca superantygen jest podstawiona tak, że nie więcej niż 15 aminokwasów w regionie A zastąpiono innymi aminokwasami tak, że podstawiony superantygen wykazuje obniżoną seroreaktywność w porównaniu z superantygenem z którego się wywodzi;
PL 216 516 B1 i przy czym część przeciwciała jest przeciwciałem pełnej długości lub dowolnym aktywnym fragmentem przeciwciała wiążącym cząsteczkę, skierowanym przeciwko strukturze powierzchni komórkowej związanej z rakiem. Superantygenem jest enterotoksyna gronkowcowa E (SEE).
Pozycje aminokwasowe w regionie A, które mają być zastąpione jest/są wybrane z grupy obejmującej 20, 21, 24, 27, 173 i 204. Regionie C obejmuje podstawienia nie więcej niż 15 aminokwasów. Podstawienia te występują co najmniej w pozycjach 79, 81, 83 i 84. Ponadto, region E może zawierać podstawienia nie więcej niż 15 aminokwasów i podstawienie zachodzi co najmniej w pozycji 227.
Sekwencja aminokwasowa superantygenu jest dalej podstawiona tak, że nie więcej niż 15 aminokwasów w regionie B i/lub nie więcej niż 15 aminokwasów w regionie C i/lub nie więcej niż 15 aminokwasów w regionie D i/lub nie więcej niż 15 aminokwasów w regionie E zastąpiono innymi aminokwasami tak, że podstawiony superantygen wykazuje obniżoną seroreaktywność w porównaniu z superantygenem, z którego się wywodzi; oraz gdzie część przeciwciała jest przeciwciałem pełnej długości lub dowolnym aktywnym fragmentem przeciwciała wiążącym cząsteczki, skierowanym przeciwko związanej z nowotworem strukturze powierzchni komórki. Konkretnie zamieniane pozycje aminokwasowe w regionie B wybrane są z grupy obejmującej 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 i 49. Aminokwasy w regionie C, które mają być zastąpione mogą być wybrane z grupy składającej się z 74,75 i 78. Pozycje aminokwasowe w regionie D, które mają być zastąpione mogą być wybrane z pozycji 187, 188, 189 i 190. Pozycje aminokwasowe w regionie E, które mają być zastąpione, mogą być wybrane z grupy składającej się z 217, 220, 222, 223 i 225.
Podstawiony superantygen wykazuje obniżoną seroreaktywność w porównaniu z superantygenem z którego się wywodzi. Przeciwciało jest przeciwciałem pełnej długości lub dowolnym aktywnym fragmentem przeciwciała wiążącym cząsteczki, skierowanym przeciwko związanej z rakiem strukturze powierzchni komórki. W konkretnych wykonaniach nowotwór wybrany jest z grupy obejmującej raki płuca, sutka, okrężnicy, nerki, trzustki, jajnika, żołądka, szyjki macicy i gruczołu krokowego.
W dalszym konkretnym wykonaniu koniugat może obejmować sekwencję aminokwasów SEE zawierającą podstawienia R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S lub sekwencję aminokwasów SEE zawierającą podstawienia R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227A. W jeszcze dalszej kolejności koniugat może obejmować sekwencję aminokwasową według SEKW. NR ID.: 2.
W dalszych wykonaniach koniugat może obejmować część przeciwciała, w tym między innymi, fragment Fab. Do konkretnych fragmentów Fab mogą należeć C215Fab lub 5T4Fab.
W jeszcze dalszej kolejności koniugat może także obejmować cytokinę taką, jak interleukina. W konkretnych wykonaniach interleukiną jest IL2 lub jej pochodna o zasadniczo tej samej aktywności biologicznej co natywna IL2.
W konkretnych wykonaniach kompozycja farmaceutyczna może obejmować koniugat obejmujący sekwencję aminokwasów SEE (SEKW. NR ID.:7) oraz dodatkowe podstawienia R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S.
W innym konkretnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna może obejmować sekwencję aminokwasów SEE (SEKW. NR ID.:7) oraz dodatkowe podstawienia R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227A. W jeszcze dalszej kolejności kompozycja farmaceutyczna obejmuje koniugat o sekwencji aminokwasowej według SEKW. NR ID.: 1.
W dalszych konkretnych wykonaniach kompozycja farmaceutyczna obejmuje część przeciwciała, przykładowo fragment Fab. Konkretnie Fab jest C215Fab lub 5T4Fab. Kompozycja farmaceutyczna może ponadto obejmować cytokinę taką, jak interleukina. Interleukiną może być IL2 lub jej pochodna o zasadniczo tej samej aktywności biologicznej co natywna IL2.
Niniejszy wynalazek dotyczy koniugatu obejmującego superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, w którym superantygen jest wariantem gronkowcowej enterotoksyny E (SEE), Sekw. Id. Nr: 7, w którym sekwencja aminokwasowa superantygenu obejmuje regiony A do E, przy czym region A jest w obrębie miejsca wiązania TCR i determinuje wiązanie z TCR, a regiony B do E determinują wiązanie z cząsteczkami MHC klasy II; i różni się od gronkowcowej enterotoksyny E tym, że obejmuje następujące podstawienia aminokwasowe, przy czym pozycje aminokwasowych podstawień odnoszą się do pozycji aminokwasowych w referencyjnej Sek. Id. Nr: 7;
(i) lizyna w pozycji 79 w regionie C została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym wariantem, lizyna w pozycji 81 w regionie C została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym wariantem, lizyna w pozycji 83 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej
PL 216 516 B1 konserwatywnym wariantem, a lizyna w pozycji 84 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej konserwatywnym wariantem (ii) arginina w pozycji 20 w regionie A została zastąpiona glicyną lub jej konserwatywnym wariantem, asparagina w pozycji 21 w regionie A została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, aminokwas w pozycji 24 w regionie A został zastąpiony glicyną lub jej konserwatywnym wariantem, aminokwas w pozycji 27 w regionie A został zastąpiony lizyną lub jej konserwatywnym wariantem i ewentualnie zostały również zastąpione aminokwasy w pozycji 173 i/lub pozycji 204 w regionie A i, (iii) kwas asparaginowy w pozycji 227 w regionie E został zastąpiony seryną, alaniną lub ich konserwatywnym wariantem, i (iv) przy czym jedna lub więcej z następujących reszt aminokwasowych została/zostały tak zastąpiona(e), że • kwas glutaminowy pozycji 34 w regionie B został zastąpiony lizyną, seryną lub ich konserwatywnym fragmentem, • lizyna w pozycji 35 w regionie B została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym fragmentem, • kwas glutaminowy w pozycji 39 w regionie B został zastąpiony lizyną, seryną lub ich konserwatywnym fragmentem, • asparagina w pozycji 40 w regionie B została zastąpiona seryną, lub jej konserwatywnym fragmentem • lizyna w pozycji 41 w regionie B została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym fragmentem, • kwas glutaminowy w pozycji 42 w regionie B został zastąpiony lizyną lub jej konserwowanym fragmentem, • kwas asparaginowy w pozycji 44 w regionie B został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • kwas asparaginowy w pozycji 45 w regionie B został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • kwas glutaminowy w pozycji 49 w regionie B został zastąpiony treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • lizyna w pozycji 74 w regionie C została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • kwas asparaginowy w pozycji 75 w regionie C został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •asparagina w pozycji 78 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej konserwatywnym fragmentem, • histydyna w pozycji 187 w regionie D została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnym fragmentem, • seryna w pozycji 188 w regionie D została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • seryna w pozycji 189 w regionie D została zastąpiona kwasem asparaginowym lub jego konserwatywnym fragmentem, • kwas glutaminowy w pozycji 190 w regionie D został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, • lizyna w pozycji 217 w regionie E została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, • asparagina w pozycji 220 w regionie E została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnymi wariantami, •kwas glutaminowy w pozycji 222 w regionie E został zastąpiony treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, • asparagina w pozycji 223 w regionie E została zastąpiona alaniną lub seryną lub ich konserwatywnym wariantem, i/lub •histydyna w pozycji 225 w regionie E została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnym wariantem tak, że podstawiony superantygen ma zmniejszoną seroreaktywność w porównaniu z seroreaktywnością gronkowcowej enterotoksyny mającej sekwencję aminokwasową z SEK.ID. Nr :7.
i przy czym częścią stanowiącą przeciwciało jest fragment Fab.
PL 216 516 B1
Korzystnie superantygen ma sekwencję aminokwasową opisaną w SEKW. NR ID.:2 (SEA/ /E-120).
Korzystnie podstawieniem w pozycji aminokwasowej 227 jest alanina.
Korzystnie podstawieniem w pozycji aminokwasowej 227 jest seryna.
Korzystnie częścią stanowiącą przeciwciało jest C215Fab lub 5T4Fab.
Korzystnie koniugat ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 1.
Korzystnie do zastosowania w leczeniu raka.
Korzystnie koniugat wchodzi w skład leku, którym leczy się raka wybranego z grupy obejmującej raka płuca, sutka, okrężnicy, nerki, trzustki, jajnika, żołądka, szyjki macicy i gruczołu krokowego, korzystniej raka płuc.
W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie koniugatu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka.
Korzystnie lek przeznaczony jest do podawania dożylnego.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik aktywny i jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która jako czynnik aktywny zawiera terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu według wynalazku.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
Następujące rysunki stanowią część niniejszego opisu i zostały dołączone w celu dalszego w ykazania pewnych aspektów wynalazku. Wynalazek może być lepiej zrozumiany w odniesieniu do jednego lub większej liczby tych rysunków w połączeniu ze szczegółowym opisem konkretnych wykonań tu przedstawionych.
Figura 1 przedstawia fragmenty peptydowe rozpoznawane przez ludzkie anty-SEA, które zidentyfikowano przez trawienie pepsyną SAE/E-18 wyeluowanego z kolumny anty-SEA. Fragmenty zidentyfikowano przed i po oczyszczeniu przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconą fazą sprzężonej ze spektrometrem masowym (MS). Fragmenty odnalezione w trawieniu przy tym samym czasie retencji przed i po oczyszczeniu przez powinowactwo traktowano jako pozytywne.
Figura 2 jest siedmioma różnymi zidentyfikowanymi peptydami przedstawionymi jako linie nad sekwencją aminokwasową SEA/E-120. Jasnoszare znaki oznaczają aminokwasy, które zostały zmienione w SEA/E-120 w porównaniu z SEA/E-18.
Figura 3 jest strukturalnym przyrównaniem sekwencji SEA SED i SEH wykorzystanych jako matryca dla skonstruowania porównawczego modelu komputerowego SEA/E-18. Regiony o zachowanej strukturze zaznaczono czarnymi prostokątami.
Figura 4 jest wielokrotnym przyrównaniem sekwencji SEA, SEE, SEA/E-18 i SEA/E-120.
Figura 5 jest modelem SEA/E-18 (czarny) nałożonym na SEA (1SXT, szary).
Figura 6 wskazuje regiony SEA/E-18 odpowiadające zidentyfikowanym peptydom seroweaktywności.
Figura 7 przedstawia wykres scyntylacyjnego oznaczenia bliskości (SPA - Scintillation Proximity 125
Assay) mierzącego swoiste wiązanie ludzkiego 125I-anty-SEA związanego z C215FabSEA, C215FabSEA/E-18 , -65, -97, -109, -110, 113 lub -120 na skoniugowanym z biotyną anty-mysz F(ab)2 na kulkach streptawidyna-PVT.
Figury 8A i 8B przedstawiają zdolność pośredniczenia w ukierunkowanej na nowotwór cytotoksyczności. Fig. 8A przedstawia cytotoksyczność mierzoną w oznaczeniu cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu i przeciwciała - SADCC. Fig. 8B przedstawia skuteczność superantygenów w pośredniczeniu w zabijaniu przez limfocyty T komórek wyrażających MHC klasy II powodującym ogólnoustrojową cytotoksyczność, która może spowodować skutki uboczne, mierzoną w oznaczeniu cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu - SDCC. Wszystkie nowe chimery wykazywały obniżony efekt w SDCC z przynajmniej 1log, i aż 3log w przypadku C215FabSEA/E-120.
Figura 9 jest schematem wstęgowym modelu SEA/E-120. Łańcuchy boczne reszt G20, T21, G24 i K27 zaznaczono w kolorze ciemnoszarym, łańcuchy boczne reszt S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 i S84 zaznaczono w kolorze szarym, łańcuchy boczne reszt T217, S220, T222, S223, S225 zaznaczono w kolorze czarnym, a łańcuch boczny reszty S227 zaznaczono w kolorze jasnoszarym.
Na Figurze 10 jest sekwencja aminokwasowa 5T4FabSEA/E120 (SEKW. NR ID.:1) z częściami zmiennymi z mysiego przeciwciała 5T4 i częściami stałymi z mysiego przeciwciała C242. Pozycjami 1-458 jest łańcuch A, zaś pozycjami 459-672 jest łańcuch B.
PL 216 516 B1
Dla specjalisty oczywistym jest, że różne wykonania i modyfikacje mogą być wprowadzone w wynalazku ujawnionym w tym zgłoszeniu bez odejścia od zakresu i ducha wynalazku.
W stosowanym tu w opisie znaczeniu użycie rzeczownika oznaczać może jeden lub więcej. W stosowanym tu w zastrzeżeniach znaczeniu użycie rzeczownika po słowie obejmujący oznaczać może jeden lub więcej niż jeden. W użytym tu znaczeniu inny może oznaczać co najmniej drugi lub więcej.
Termin przeciwciało w użytym tu znaczeniu odnosi się do cząsteczki immunoglobuliny, która jest zdolna do swoistego wiązania konkretnego epitopu w antygenie. W użytym tu znaczeniu, przeciwciało ma oznaczać szeroko dowolny immunologiczny czynnik wiążący, taki jak IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Przeciwciała mogą być kompletnymi immunoglobulinami uzyskanymi ze źródeł naturalnych lub źródeł zrekombinowanych oraz mogą być immunoaktywnymi częściami kompletnych immunoglobulin. Przeciwciała w niniejszym wynalazku mogą występować w postaci fragmentu Fab. Istnieje szereg różnych innych postaci w tym, na przykład, przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał monoklonalnych, Fv, Fab i F(ab)2/a także przeciwciał jednołańcuchowych i przeciwciał humanizowanych (Harlow i wsp., 1988; Bird i wsp., 1988).
Termin antygen w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako cząsteczka, która wywołuje odpowiedź odpornościową. Ta odpowiedź odpornościowa może obejmować wytwarzanie przeciwciał, aktywację swoistych komórek immunokompetentnych lub jedno i drugie. Antygen może pochodzić z organizmów, podjednostek białek/antygenów, zabitych lub zinaktywowanych całych komórek lub lizatów. Specjalista zda sobie sprawę z tego, że dowolna makrocząsteczka, w tym praktycznie wszystkie białka, mogą służyć jako antygeny. Ponadto, antygeny można uzyskać ze zrekombinowanego DNA.
Termin rak w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako choroba proliferacyj na lub złośliwy nowotwór (guz). Do przykładów należą, między innymi, rak sutka, rak gruczołu krokowego, rak jajnika, rak szyjki macicy, rak skóry, rak trzustki, rak jelita grubego i rak płuca.
Termin koniugat w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako białko fuzyjne superantygenu lub wariantu superantygenu połączone lub skoniugowane z fragmentem przeciwciała.
Termin immunogenny lub immunogenność w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako substancja lub cząsteczka wywołująca odpowiedź odpornościową.
Termin główny układ zgodności tkankowej lub MHC w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako swoista grupa genów, z których wiele koduje spokrewnione ewolucyjnie białka powierzchni komórki zaangażowane w prezentacje antygenu, należące do najważn iejszych wyznaczników zgodności tkankowej. MHC klasy I, czyli MHC-I, zaangażowane są głównie w prezentację antygenu limfocytom T CD8. MHC klasy II, czyli MHC-II, zaangażowane są głównie w prezentację antygenu limfocytom T CD4.
Termin seroreaktywny, seroreakcja lub seroreaktywność w użytym tu znaczeniu jest zdefiniowany jako reakcja lub działanie zachodzące za pośrednictwem surowicy lub surowic. Specjalista wie, że surowica lub surowice pacjenta lub zwierzęcia zawierają przeciwciała neutralizujące lub przeciwciała wcześniej uformowane lub przeciwciała endogenne skierowane przeciwko różnym antygenom lub cząsteczkom. Seroreaktywność odnosi się zatem do reakcji neutralizowania przeciwciał w surowicy.
Termin superantygen w użytym tu znaczeniu jest zdefiniowany jako klasa cząsteczek, które stymulują podgrupę limfocytów T przez wiązanie się z cząsteczkami MHC klasy II oraz domenami νβ receptorów limfocytów T, stymulując aktywację limfocytów T wyrażających konkretne segmenty genu V 7β.
Termin receptor limfocytów T w użytym tu znaczeniu jest zdefiniowany jako receptor składający się z połączonego disiarczkowo heterodimeru wysoce zmiennych łańcuchów α lub β wyrażanych na powierzchni komórki w postaci kompleksu z niezmiennymi łańcuchami CD3. Limfocyty T niosące ten typ receptora nazywane są często limfocytami T α:β. Alternatywny receptor złożony ze zmiennych łańcuchów γ i δ jest wyrażany z CD3 na podklasie limfocytów T.
Termin skuteczny terapeutycznie w użytym tu znaczeniu zdefiniowany jest jako ilość kompozycji farmaceutycznej, która jest skuteczna w leczeniu choroby lub schorzenia.
Termin wariant lub warianty w użytym tu znaczeniu odnosi się do białek lub peptydów, które różnią się odpowiednio od białka lub peptydu odniesienia. Warianty w tym znaczeniu są bardziej szczegółowo opisane poniżej i w innym miejscu tego opisu. Na przykład, zmiany w sekwencji nukleotydowej wariantu mogą być ciche, tzn. mogą nie zmieniać aminokwasów kodowanych przez tę
PL 216 516 B1 sekwencję nukleotydową. Tam, gdzie zmiany ograniczone są do cichych zmian, tego typu wariant będzie kodować peptyd o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak peptyd odniesienia. Zmiany w sekwencji nukleotydowej wariantu mogą zmienić sekwencję aminokwasową peptydu kodowanego przez sekwencję nukleotydową odniesienia. Takie zmiany nukleotydowe mogą powodować podstawienia aminokwasów, insercje, delecje, fuzje i skrócenia peptydu kodowanego przez sekwencję odniesienia tak, jak omówiono to poniżej. Ogólnie, różnice w sekwencjach aminokwasowych są ograniczone tak, że sekwencja odniesienia i sekwencja wariantu są ogólnie bardzo zbliżone, a w wielu regionach identyczne. Wariant i peptyd odniesienia mogą różnić się w sekwencji aminokwasowej jednym lub większą liczbą podstawień, insercji, delecji, fuzji i skróceń, które mogą występować w dowolnych kombinacjach. Wariant może także być fragmentem peptydu różniącym się od sekwencji peptydu odniesienia tym, że jest krótszy niż sekwencja odniesienia, na przykład, końcową lub wewnętrzną delecją. Inny wariant peptydu wchodzący w skład koniugatu według wynalazku obejmuje także peptyd, który zachowuje zasadniczo tę samą funkcję lub aktywność jak taki peptyd. Wariant może także być takim, gdzie (i) jeden lub więcej aminokwasów zastąpiono konserwatywnym lub niekonserwatywnym aminokwasem, zaś taki podstawiony aminokwas może być kodowany lub niekodowany przez kod genetyczny, lub (ii) jeden lub więcej aminokwasów zawiera grupę podstawnikową, lub (iii) dojrzały peptyd jest połączony z innym związkiem takim, jak związek zwiększający czas półtrwania peptydu (przykładowo, glikol polietylenowy), lub (iv) dodatkowe aminokwasy dołączone są do dojrzałego peptydu tak, jak w sekwencji sygnałowej lub wydzielniczej lub w sekwencji używanej do oczyszczania dojrzałego peptydu. Warianty można wytworzyć technikami mutagenezy, w tym stosowanymi do kwasów nukleinowych, aminokwasów, komórek lub organizmów, lub też poprzez rekombinację. Wszystkie te zdefiniowane powyżej warianty uznaje się za będące w zasięgu specjalistów na podstawie zawartych tu wskazówek i stanu techniki.
Termin aktywność biologiczna w użytym tu znaczeniu odnosi się do wewnętrznej właściwości konkretnej cząsteczki, np. aktywacji pewnych komórek lub wiązania się z pewnymi receptorami. Użyta tu definicja jest zasadniczo jakościowa nie zaś ilościowa.
I. Modyfikacje superantygenów
Specjalista wie, że seroreaktywność odnosi się do reakcji cząsteczek lub antygenów z neutralizującymi przeciwciałami w surowicach. Konkretnie, niniejszy wynalazek dotyczy koniugatów obejmujących superantygen bakteryjny i część przeciwciała, gdzie superantygen jest superantygenem o niskim mianie obejmującym regiony od A do E, który to region A jest miejscem wiązania TCR, zaś regiony B do E determinują wiązanie z cząsteczkami MHC klasy II; a sekwencja aminokwasowa superantygenu jest podstawiona tak, że nie więcej niż 15 aminokwasów w regionach A do E jest zastąpionych innymi aminokwasami tak, że podstawiony superantygen wykazuje obniżoną seroreaktywność w porównaniu z superantygenem z którego się wywodzi; oraz gdzie część przeciwciała jest fragmentem Fab wiążącym cząsteczki, skierowanym przeciwko związanej z rakiem strukturze powierzchni komórki.
A. Superantygeny
Do superantygenów bakteryjnych rozważanych pod kątem zastosowania w niniejszym wynalazku należy enterotoksyna gronkowcowa E (SEE). Specjalista wie, że strukturę przestrzenną tego superantygenu można uzyskać z bazy danych Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org). Ponadto, specjalista w dziedzinie może uzyskać sekwencję nukleotydową i aminokwasową tego superantygenu z bazy danych GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html).
W konkretnych wykonaniach superantygen jest superantygenem o niskim mianie. Specjaliści wiedzą i rozumieją, że surowice ludzi zawierają normalnie wysokie miana przeciwciał skierowanych przeciwko superantygenom. Na przykład, dla superantygenów gronkowcowych, względne miana kształtują się następująco: TSST-1 > SEB > SEC-1 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Specjalista wie, że te względne miana wskazują na problemy z immunogennością i problemy z seroreaktywnością lub problemy z przeciwciałami neutralizującymi. W niniejszym wynalazku rozważa zatem użycie superantygenu o niskim mianie, takiego SEE dla uniknięcia seroreaktywności podawanych pozajelitowo superantygenów.
Ponadto dobrze wiadomo, że sekwencje białkowe i reaktywność krzyżowa superantygenów lub enterotoksyn gronkowcowych dzieli je na dwie pokrewne grupy. Do jednej grupy należą SEA SEE, SED i SEH. Druga grupa to SPEA, SEC, SEB i SSA. Zatem niniejszym rozważa się także zastosowanie superantygenów o niskim mianie dla obniżenia lub wyeliminowania reaktywności krzyżowej
PL 216 516 B1 z przeciwciałami o wysokim mianie lub endogennymi skierowanymi przeciwko enterotoksynom gronkowcowym.
B. Warianty superantygenów
Warianty sekwencji aminokwasowej białek superantygenowych mogą być wariantami podstawieniowymi, insercyjnymi lub delecyjnymi. Warianty te mogą być oczyszczane znanymi sposobami takimi, jak wytrącanie (np. siarczanem amonu), HPLC, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa (w tym chromatografia immunopowinowactwa) lub różnymi rozdziałami według wielkości (sedymentacja, elektroforeza żelowa, filtrowanie molekularne).
Warianty podstawieniowe lub zamiany zwykle obejmują zamianę jednego aminokwasu na inny w jednym lub większej liczbie miejsc w białku. Podstawienia mogą być konserwatywne to znaczy zamieniać jeden aminokwas na inny o podobnym kształcie i ładunku. Podstawienia konserwatywne są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, na przykład, zamiany: alaniny na serynę; argininy na lizynę; asparaginy na glutaminę lub histydynę; asparaginianu na glutaminian; cysteiny na serynę; glutaminy na asparaginę; glutaminianu na asparaginian; glicyny na prolinę; histydyny na asparaginę lub glutaminę; izoleucyny na leucynę lub walinę; leucyny na walinę lub izoleucynę; lizyny na argininę; metioniny na leucynę lub izoleucynę; fenyloalaniny na tyrozynę, leucynę lub metioninę seryny na treoninę; treoniny na serynę; tryptofanu na tyrozynę; tyrozyny na tryptofan lub fenyloalaninę; i waliny na izoleucynę lub leucynę.
Twórcy przewidują zatem, że w sekwencjach DNA genów można dokonywać różnych zmian bez zauważalnej utraty biologicznej przydatności lub aktywności białek tak, jak omówiono to poniżej. Aktywnością jest indukcja odpowiedzi limfocytów T powodująca cytotoksyczność komórek nowotworowych. Ponadto, powinowactwo superantygenu wobec cząsteczek MHC klasy II jest obniżone przy minimalnym wpływie na cytotoksyczność superantygenu.
Przy wprowadzaniu takich zmian należy uwzględnić wskaźnik hydropatyczny aminokwasów. Znaczenie wskaźnika hydropatycznego aminokwasów dla nadawania białkom interakcyjnej funkcji biologicznej jest na ogół znane w technice (Kyte i Doolittle, 1982). Przyjęto, że względny charakter hydropatyczny aminokwasu przyczynia się do struktury drugorzędowej powstającego białka, która z kolei określa wzajemne oddziaływanie białka z innymi cząsteczkami, na przykład, z enzymami, substratami, receptorami, DNA, przeciwciałami, antygenami i tym podobnymi.
Każdemu aminokwasowi przypisano wskaźnik hydropatyczny na podstawie jego charakterystyk hydrofobowości i ładunku (Kyte i Doolittle, 1982), wynosi on: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9); i arginina (-4,5).
W dziedzinie wiadomo, że pewne aminokwasy można zastąpić innymi aminokwasami o podobnym wskaźniku lub wartości hydropatycznej i wciąż uzyskiwać białko o zbliżonej aktywności biologicznej, tzn. wciąż otrzymywać równoważne biologicznie funkcjonalne białko. Przy wprowadzaniu takich zmian podstawienia aminokwasów, których wskaźniki hydropatyczne mieszczą się w przedziale ±2 są korzystne, w przedziale ±1 są szczególnie korzystne, zaś w przedziale ±0,5 są jeszcze korzystniejsze.
W dziedzinie rozumie się też, że podstawienia podobnych aminokwasów można skutecznie przeprowadzać na podstawie ich hydrofilowości. W patencie USA nr 4,554,101, włączonym tu przez odniesienie, stwierdzono, że największa lokalna średnia hydrofilowość białka, zależna od hydrofilowości sąsiednich aminokwasów, koreluje z właściwościami biologicznymi białka. Jak opisano to szczegółowo w patencie USA nr 4,554,101, aminokwasom przypisano następujące wartości hydrofilowości: arginina (+3,0); lizyna (+3,0); asparaginian (+3,0 ±1); glutaminian (+3,0 ±1); seryna (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histydyna *-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5); tryptofan (-3,4).
Rozumie się, że aminokwas można podstawić innym o podobnej wartości hydrofilowości i wciąż uzyskać białko równoważne biologicznie i równoważne immunologicznie. W takich zmianach podstawienia aminokwasów, których wartości hydrofilowości mieszczą się w przedziale ±2 są korzystne, w przedziale ±1 są szczególnie korzystne, zaś w przedziale ±0,5 są jeszcze korzystniejsze.
C. Białka fuzyjne
Specjalnym rodzajem wariantu insercyjnego jest białko fuzyjne. Cząsteczka ta ma z reguły całość lub znaczną część natywnej cząsteczki połączoną na N- lub C-końcu z całością lub częścią drugiego polipeptydu. Na przykład, białko fuzyjne - koniugat według niniejszego wynalazku obejmuje
PL 216 516 B1 dodanie domeny czynnej immunologicznie takiej, jak fragment przeciwciała w celu skierowania do konkretnych komórek nowotworowych.
W jeszcze dalszej kolejności, włączenie miejsca cięcia w lub przy miejscu połączenia fuzji ułatwi usunięcie dodatkowego polipeptydu po oczyszczeniu. Do innych użytecznych fuzji należy przyłączenie domen funkcjonalnych, takich, jak miejsca aktywne enzymów, domeny glikozylacji, inne obszary kierowania wewnątrz komórki lub obszary transbłonowe.
D. Wymiana domen
Interesującą serię wariantów można utworzyć przez podstawianie homologicznych regionów różnych białek. W niektórych kontekstach jest to znane jako wymiana domen.
Wymiana domen obejmuje wytworzenie cząsteczek chimerycznych przy wykorzystaniu różnych, lecz w tym przypadku spokrewnionych polipeptydów. Porównując różne białka SAg można przewidywać, które regiony tych cząsteczek mają znaczenie funkcjonalne. Możliwe jest więc dokonanie wymiany pokrewnych domen tych cząsteczek w celu określenia znaczenia tych regionów dla funkcji SAg. Cząsteczki te mogą mieć dodatkową wartość przez to, że te chimery mogą być odróżniane od cząsteczek naturalnych przy możliwości dostarczania tej samej funkcji.
E. Oczyszczanie białek
Żądane będzie oczyszczenie SAg lub ich wariantów. Techniki oczyszczania białek są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Techniki te obejmują, na jednym poziomie, surowe frakcjonowanie środowiska wewnątrzkomórkowego na frakcję peptydową i niepeptydową. Po oddzieleniu białka od innych białek, białko będące przedmiotem zainteresowania można w dalszym stopniu oczyścić stosując techniki chromatograficzne i elektroforetyczne w celu osiągnięcia częściowego lub całkowitego oczyszczenia (lub oczyszczenia do homogenności). Metodami analitycznymi szczególnie przydatnymi do przygotowywania czystego peptydu są chromatografia jonowymienna, chromatografia wykluczenie, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, ogniskowanie izoelektryczne. Szczególnie wydajnym sposobem oczyszczania białek jest szybka chromatografia cieczowa białek albo nawet HPLC.
Niektóre aspekty dotyczą oczyszczania, a w niektórych wykonaniach, znaczącego oczyszczenia kodowanego białka lub peptydu. Termin oczyszczone białko lub peptyd w użytym tu znaczeniu ma odnosić się do kompozycji, możliwej do oddzielenia od innych składników, w której białko lub peptyd jest oczyszczone w dowolnym stopniu w porównaniu z jego dającym się naturalnie uzyskać stanem. Oczyszczone białko lub peptyd odnosi się zatem też do białka lub peptydu wolnego od środowiska, w którym naturalnie występuje.
Ogólnie oczyszczone odnosić się będzie do kompozycji białka lub peptydu, którą poddano frakcjonowaniu w celu usunięcia różnych innych składników, i która to kompozycja w istotny sposób zachowuje swoją wyrażaną aktywność biologiczną. Tam gdzie stosowany jest termin zasadniczo oczyszczone, oznaczać to będzie kompozycję, w której białko lub peptyd tworzy główny składnik kompozycji taki, jak stanowiący około 50%, około 60%, około 70%, około 80%, około 90%, około 95% lub więcej białek w kompozycji.
Różne sposoby ilościowego oznaczania stopnia oczyszczenia białka lub peptydu będą znane specjalistom w świetle niniejszego ujawnienia. Obejmują one, na przykład, wyznaczanie aktywności właściwej aktywnej frakcji lub ocenianie ilości polipeptydów we frakcji przez analizę SDS/PAGE. Korzystnym sposobem oceny czystości frakcji jest obliczenie aktywności właściwej frakcji, porównanie jej z aktywnością właściwą wstępnego ekstraktu i obliczenie w ten sposób stopnia oczyszczenia, oznaczanego tu przez krotność oczyszczenia. Właściwe jednostki stosowane do przedstawienia ilości aktywności będą, oczywiście, zależeć od konkretnej techniki oznaczenia wybranej do monitorowania oczyszczania i od tego, czy wyrażane białko lub peptyd wykazuje wykrywalną aktywność.
Różne techniki nadające się do oczyszczania białek będą znane specjalistom. Obejmują one, na przykład, wytrącanie siarczanem amonu, PEG, przeciwciałami i im podobnymi lub przez denaturację cieplną z późniejszym wirowaniem; etapy chromatograficzne, takie jak chromatografia jonowymienna, filtracja molekularna w odwróconej fazie, hydroksyapatytowa i powinowactwa; ogniskowanie izoelektryczne; elektroforeza w żelu i kombinacje tych i innych technik. Jak to ogólnie wiadomo w dziedzinie, uważa się, że kolejność przeprowadzania poszczególnych etapów oczyszczania może być zmieniona, lub że poszczególne etapy mogą być pomijane wciąż dając odpowiedni sposób przygotowania zasadniczo oczyszczonego białka lub peptydu.
Wiadomo, że w różnych warunkach SDS/PAGE migracja polipeptydu może zmieniać się, niekiedy znacząco (Capaldi i wsp., 1977). Zatem zrozumiałym będzie, że w różnych warunkach elektroforezy
PL 216 516 B1 widoczne masy cząsteczkowe oczyszczonych lub częściowo oczyszczonych produktów ekspresji mogą się zmieniać.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) charakteryzuje się bardzo szybkim rozdziałem z wyjątkowo wysoką rozdzielczością pików. Rozdział uzyskuje się stosując bardzo drobne cząstki i wysokie ciśnienie dla uzyskania odpowiedniej szybkości przepływu. Rozdział można przeprowadzić w ciągu minut, lub co najwyżej w godzinę. Ponadto, potrzeba jedynie niewielkiej objętości próbki, ponieważ cząstki są tak małe i ciasno upakowane, że objętość międzyziarnowa stanowi bardzo mały ułamek objętości złoża. Również stężenie próbki nie musi być bardzo wysokie, ponieważ ścieżki są tak wąskie, że rozcieńczanie próbki zachodzi w bardzo niewielkim stopniu.
Filtrowanie molekularne lub chromatografia sita molekularnego jest szczególnym rodzajem chromatografii podziałowej opartym na wielkości cząsteczek. Teoria filtrowania molekularnego polega na tym, że kolumna, którą przygotowuje się z małych cząstek obojętnej substancji zawierających drobne pory rozdziela większe cząsteczki od mniejszych cząsteczek, gdy przechodzą one przez lub obok porów, w zależności od rozmiaru. Jeżeli tylko materiał, z którego wykonano te cząstki nie adsorbuje cząsteczek, jedynym czynnikiem wyznaczającym szybkość przepływu jest wielkość, tak długo jak kształt jest stosunkowo stały. Chromatografia żelowa jest niezastąpiona w rozdziale cząsteczek o różnym rozmiarze, ponieważ rozdział niezależny od wszystkich innych czynników, takich, jak pH, siła jonowa, temperatura itp. Praktycznie nie zachodzi też adsorpcja, mniej rozmycia stref, a objętość elucji w prosty sposób zależy od masy cząsteczkowej.
Chromatografia powinowactwa jest procedurą chromatograficzną, która polega na swoistym powinowactwie między izolowaną substancją a cząsteczką, z którą może się ona swoiście związać. Jest to wzajemne oddziaływanie typu receptor-ligand. Materiał kolumny syntetyzuje się łącząc kowalencyjnie jednego z partnerów wiązania z nierozpuszczalnym złożem. Materiał kolumny może wtedy swoiście adsorbować substancję z roztworu. Elucja następuje przez zmianę warunków na takie, w których wiązanie nie zajdzie (zmiana pH, siły jonowej, temperatury itp.).
F. Mutageneza wariantów
Modyfikacja powinowactwa superantygenu do cząsteczek MHC klasy II może obniżyć toksyczność superantygenu. Zatem, obniżone powinowactwo do cząsteczek MHC klasy II powoduje obniżoną seroreaktywność lub obniżoną reakcję z przeciwciałami neutralizującymi lub przeciwciałami endogennymi lub wstępnie utworzonymi.
W konkretnych wykonaniach stosuje się mutagenezę do modyfikacji regionu superantygenu, który determinuje wiązanie z cząsteczkami MHC klasy II. Mutagenezy dokonuje się przez zastosowanie szeregu standardowych procedur mutagennych. Mutacja jest to proces, w wyniku którego zachodzą zmiany strukturalne lub ilościowe organizmu. Mutacja może dotyczyć modyfikacji sekwencji nukleotydowej pojedynczego genu, bloków genów lub całego chromosomu. Zmiany w pojedynczych genach mogą być konsekwencją mutacji punktowych, które polegają na usunięciu, dodaniu lub podstawieniu pojedynczych nukleotydów w sekwencji DNA, lub też mogą być konsekwencją zmian obejmujących wstawienie lub usunięcie dużej liczby nukleotydów.
Szczególnie przydatną techniką mutagenezy jest mutageneza skanująca alaniny, w której szereg aminokwasów zastępuje się pojedynczo aminokwasem alaniną tak, że można stwierdzić jakie będą skutki utraty oddziaływań łańcucha bocznego przy minimalnym ryzyku wielkoskalowych zaburzeń w konformacji białka (Cunningham i wsp., 1989).
W ostatnich latach opracowano techniki szacowania stałej równowagi wiązania ligandu przy użyciu minimalnych ilości białka (opisy patentowe USA 5,221,605 i 5,238,808). Możliwość przeprowadzenia oznaczeń funkcjonalnych z małymi ilościami materiału można wykorzystać do opracowania bardzo wydajnych metodologii in vitro dla mutagenezy wysycającej przeciwciał. Twórcy ominęli etapy klonowania przez połączenie mutagenezy PCR ze sprzężoną transkrypcją/translacją in vitro w celu wytworzenia mutantów białkowych z dużą wydajnością. Produkty PCR stosuje się bezpośrednio, jako matrycę dla transkrypcji/translacji in vitro zmutowanych przeciwciał jednołańcuchowych. Ze względu na wysoką wydajność, z którą można w ten sposób wytworzyć i przeanalizować wszystkie 19 podstawień aminokwasowych możliwe jest obecnie przeprowadzenie wysycającej mutagenezy dla wielu aminokwasów będących przedmiotem zainteresowania w procesie, który można opisać jako wysycającą skanującą mutagenezę in vitro (Burks i wsp., 1997).
Wysycająca skanująca mutageneza in vitro dostarcza szybkiego sposobu pozyskania dużej ilości informacji strukturalno-funkcjonalnej obejmującego: (i) identyfikację aminokwasów modulujących swoistość wiązania ligandu, (ii) lepszego zrozumienia wiązania ligandu opartego na identyfikacji tych
PL 216 516 B1 aminokwasów, które zachowują aktywność i tych, które znoszą aktywność w danej pozycji, (iii) oszacowania ogólnej plastyczności miejsca aktywnego lub domeny białkowej, (iv) identyfikacji podstawień aminokwasowych powodujących zwiększone wiązanie.
Mutageneza ukierunkowana kierowana przez strukturę stanowi potężne narzędzie analizy i wytworzenia oddziaływań białko-ligand (Wells, 1996, Braisted i wsp., 1996). Technika ta polega na przygotowaniu i badaniu wariantów sekwencji przez wprowadzanie jednej lub większej liczby zmian w sekwencji nukleotydowej w wybranym DNA.
Mutageneza ukierunkowana wykorzystuje specyficzne sekwencje oligonukleotydowe kodujące sekwencję DNA żądanej mutacji wraz z odpowiednią liczbą sąsiednich niezmodyfikowanych nukleotydów. W ten sposób dostarcza się sekwencji startera o odpowiedniej wielkości i złożoności dla utworzenia stabilnego dupleksu po obu stronach obejmowanego miejsca delecji. Korzystny jest starter o długości około 17 do 25 nukleotydów, z około 5 do 10 nukleotydami po obu stronach połączenia sekwencji poddanej zmianie.
Technika ta wykorzystuje zwykle wektor bakteriofagowy występujący zarówno w postaci jednoniciowej, jak i dwuniciowej. Do wektorów przydatnych w mutagenezie ukierunkowanej należą wektory, takie jak fag M13. Te wektory fagowe są dostępne w handlu, a ich zastosowanie jest ogólnie dobrze znane specjalistom. Plazmidy dwuniciowe są również rutynowo wykorzystywane w mutagenezie ukierunkowanej, co eliminuje etap przenoszenia genu będącego przedmiotem zainteresowania z faga do plazmidu.
Ogólnie, najpierw uzyskuje się wektor dwuniciowy lub denaturuje dwie nici wektora dwuniciowego, który obejmuje w swej sekwencji sekwencję DNA kodująca żądane białko lub element genetyczny. Starter oligonukleotydowy niosący żądaną zmutowaną sekwencję, przygotowany syntetycznie jest następnie przyłączany do preparatu jednoniciowego DNA, z uwzględnieniem stopnia niedopasowania przy wyborze warunków hybrydyzacji. Zhybrydyzowany produkt jest następnie poddawany działaniu enzymów polimeryzujących DNA, takich, jak polimeraza I E. coli (fragment Klenowa) w celu zakończenia syntezy nici niosącej mutację. W ten sposób tworzony jest heterodupleks, w którym jedna nić koduje wyjściową niezmutowaną sekwencję, zaś druga nić niesie żądaną mutację. Taki heterodupleksowy wektor jest następnie wykorzystywany do transformacji odpowiednich komórek gospodarza, takich jak komórki E. coli, po czym selekcjonowane są klony zawierające zrekombinowane wektory niosące zmutowaną sekwencję.
Pełną informację dotyczącą znaczenia funkcjonalnego i zawartości informacyjnej danej pozycji aminokwasowej w białku najlepiej uzyskać przez mutagenezę wysycającą, w której bada się wszystkie 19 podstawień aminokwasowych. Wadą tej strategii jest to, że logistyka mutagenezy wysycającej dla wielu pozycji aminokwasowych jest bardzo trudna (Warren i wsp., 1996, Brown i wsp., 1996; Zeng i wsp., 1996; Burton and Barbas, 1994; Yelton i wsp., 1995; Jackson i wsp., 1995; Short i wsp., 1995; Wong i wsp., 1996; Hilton i wsp., 1996). Należy zbadać setki, a może nawet tysiące ukierunkowanych mutantów. Jednak ulepszone techniki sprawiają, że wytwarzanie i szybkie przeszukiwanie mutantów jest znacznie prostsze. Patrz też opisy patentowe USA 5,798, 208 i 5,830, 650 z opisaną mutagenezą kroczącą.
Inne sposoby mutagenezy ukierunkowanej ujawniono w opisach patentowych USA 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377; i 5,789,166.
Poza biologicznymi równoważnikami funkcjonalnymi wytwarzanymi przy zastosowaniu opisanych powyżej technik mutagenezy, twórcy niniejszego wynalazku rozważają też to, że związki o podobnej strukturze można formułować tak, aby naśladowały kluczowe części superantygenu lub koniugatu według niniejszego wynalazku. Takie związki, które można określić jako peptydomimetyki, mogą być wykorzystane w ten sam sposób, co koniugaty według wynalazku, są zatem także ich funkcjonalnymi równoważnikami.
Niektóre mimetyki naśladujące elementy struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej opisane są przez Johnsona i wsp. (1993). Podstawą zastosowania peptydomimetyków jest to, że szkielet peptydowy białek istnieje głównie po to, aby zorientować łańcuchy boczne aminokwasów tak, aby ułatwić oddziaływania molekularne, takie jak oddziaływanie przeciwciała z antygenem. Peptydomimetyk jest zatem zaprojektowany tak, aby umożliwić oddziaływania molekularne podobne do właściwych naturalnej cząsteczce.
Pewne zakończone sukcesem zastosowania koncepcji peptydomimetyków skoncentrowane były na związkach naśladujących skręty β w białkach, o których wiadomo, że są wysoce antygenowe. Prawdopodobną strukturę skrętów β w polipeptydzie można przewidzieć przy pomocy algorytmów
PL 216 516 B1 komputerowych, jak tu omówione. Po zidentyfikowaniu aminokwasów wchodzących w skład skrętu można skonstruować mimetyki tak, aby uzyskać podobną orientację przestrzenną istotnych elementów łańcuchów bocznych aminokwasów.
Inne strategie koncentrowały się na wykorzystaniu małych białek zawierających wiele mostków disiarczkowych, jako atrakcyjnych matryc strukturalnych dla wytwarzania aktywnych biologicznie konformacji naśladujących miejsca wiązania dużych białek. Vita i wsp. (1998). Motyw strukturalny, który wydaje się być zachowywany ewolucyjnie w niektórych toksynach jest mały (30-40 aminokwasów), stabilny i wysoce podatny na mutacje. Motyw ten składa się z kartki beta oraz helisy alfa połączonych w wewnętrznym rdzeniu przez trzy mostki disiarczkowe.
Skręty beta II skutecznie naśladowano stosując cykliczne L-pentapeptydy oraz takie, które zawierały D-aminokwasy (Weishoff i wsp., 1999). Johannesson i wsp. (1999) donoszą także o dwucyklicznych tripeptydach o właściwościach wytwarzania odwrotnego skrętu.
Sposoby wytwarzania konkretnych struktur opisano w technice. Na przykład, mimetyki alfa-helisy ujawniono w opisach patentowych USA 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833; i 5,859,184. Struktury te sprawiają, że peptyd lub białko są bardziej termostabilne, a także zwiększają oporność na degradację proteolityczną. Ujawnione są struktury o pierścieniach złożonych z sześciu, siedmiu, jedenastu, dwunastu, trzynastu i czternastu elementów.
Sposoby wytwarzania ograniczonych konformacyjnie skrętów beta i wybrzuszeń beta opisane są, na przykład, w opisach patentowych USA 5,440,013; 5,618,914; i 5,670,155. Skręty beta umożliwiają zmianę podstawników bocznych bez zmiany w odpowiedniej konformacji szkieletu i mają odpowiednie końce do włączenia do peptydów standardowymi procedurami syntezy. Do innych typów mimetycznych skrętów należą skręty odwrotne i gamma. Mimetyki odwrotnych skrętów opisano w opisach patentowych USA 5,475,085 i 5,929,237, zaś mimetyki skrętów gamma opisano w opisach patentowych USA 5,672,681 i 5,674,976.
G. Ekspresja superantygenów
Wektory ekspresyjne, które zmieniono metodami inżynierii genetycznej tak, aby zawierały sekwencję nukleotydową koniugatów wprowadza się lub transformuje do komórek gospodarza w celu wytworzenia koniugatów według niniejszego wynalazku.
Komórki gospodarza mogą być zmienione genetycznie tak, aby zawierały sekwencje nukleotydowe i wyrażały peptydy będące przedmiotem zainteresowania. Wprowadzenie sekwencji nukleotydowych do komórek gospodarza można osiągnąć przez transfekcję fosforanem wapnia, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transwekcję, mikroiniekcję, transfekcję za pośrednictwem związków kationowo-lipidowych, elektroporację, transdukcję, zdrapywanie komórek (ang. scrape loading), wprowadzanie balistyczne, infekcję lub inne sposoby. Sposoby takie opisane są w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Davis, i wsp., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) i Sambrook, i wsp., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).
Do reprezentatywnych przykładów odpowiednich komórek gospodarza należą komórki bakteryjne, takie jak paciorkowce, gronkowce, E. coli, komórki streptomyces i Bacillus subtilis; komórki grzybów, takich jak drożdże i Aspergillus; komórki owadów, takie jak komórki Drosophila S2i komórki Sf9 Spodoptera; komórki zwierząt takie, jak komórki CHO, COS, HeLa, C127,3T3, BHK, 293 i czerniaka Bowesa.
II. Terapia raka
W niniejszym wynalazku superantygen skoniugowany jest z fragmentem przeciwciała w celu rozpoznawania i zniszczenia komórek rakowych. Do przykładów raka należą, między innymi, raki, sutka, okrężnicy, nerek, trzustki, jajnika, żołądka, szyjki macicy i gruczołu krokowego.
Komórka nowotworowa musi nieść pewien znacznik (marker), który nadaje się do rozpoznawania, tzn. nie jest obecny na większości innych komórek. Istnieje wiele znaczników nowotworowych i każdy z nich może nadawać się do rozpoznawania w kontekście niniejszego wynalazku. Do swoistych celów należą przeciwciała. Do przeciwciał rozważanych w niniejszym wynalazku należy, między innymi fragment Fab. Do przykładów fragmentu Fab należą C215Fab lub 5T4Fab. Poza Fab, do innych częstych znaczników nowotworów należą antygen rakowo-płodowy, antygen swoisty dla gruczołu krokowego, antygen związany z nowotworem układu moczowego, antygen płodowy, tyrozynaza (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antygen sialilowy Lewisa, MucA, MucB, PLAP, receptor estrogenu, receptor lamininy, erbB i p155.
PL 216 516 B1
W niniejszym wynalazku rozważa się możliwość stosowania cząsteczki stymulującej układ odpornościowy jako czynnika, lub korzystniej w połączeniu z innym czynnikiem, takim, jak na przykład cytokina, taka jak na przykład IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, czynnik martwicy nowotworów; interferony alfa, beta i gamma; F42K i inne analogi cytokin; chemokina, taka jak na przykład MIP-1, MIP-1beta, MCP-1, RANTES, IL-8; lub czynnik wzrostu taki, jak przykładowo ligand FLT3. Cząsteczkę stymulującą może skoniugować z koniugatem według niniejszego wynalazku lub podawać jako adiuwant w połączeniu z koniugatem według niniejszego wynalazku.
Jedną konkretną cytokiną rozważaną pod kątem zastosowania w niniejszym wynalazku jest IL-2 lub pochodna mająca zasadniczo tę samą aktywność biologiczną co natywna IL-2. Interleukina-2 (IL-2), początkowo nazwana czynnikiem wzrostu limfocytów T I jest wysoce skutecznym induktorem proliferacji limfocytów T i jest czynnikiem wzrostu dla wszystkich podpopulacji limfocytów T. IL-2 jest niezależnym od antygenu czynnikiem proliferacyjnym indukującym progresję cyklu komórkowego w komórkach spoczynkowych, pozwala zatem na ekspansję klonalną zaktywowanych limfocytów T. Ponieważ świeżo wyizolowane komórki białaczkowe również wydzielają IL-2 i na nią odpowiadają, IL-2 może działać jako autokrynny modulator wzrostu dla tych komórek, zdolny do pogarszania białaczki z limfocytami T (ATL). IL-2 stymuluje również proliferację zaktywowanych limfocytów B, choć wymaga to obecności dodatkowych czynników, na przykład, IL-4. In vitro IL-2 stymuluje także wzrost komórek glejowych skąpowypustkowych (oligodendromy). Ze względu na jej działanie na limfocyty T i limfocyty B, IL-2 jest centralnym regulatorem odpowiedzi odpornościowych. Odgrywa także rolę w reakcjach przeciwzapalnych, w hematopoezie i w obserwacji nowotworów. IL-2 stymuluje syntezę IFN-γ w leukocytach obwodowych, a także indukuje wydzielanie IL-1, TNF-α i TNF-β. Indukcja wydzielania cytokin niszczących nowotwory, obok aktywności w ekspansji komórek LAK (komórek cytotoksycznych aktywowanych przez limfokiny) to prawdopodobnie główne czynniki odpowiedzialne za aktywność przeciwnowotworową IL-2.
Planuje się, że koniugat według niniejszego wynalazku może być podany pacjentowi cierpiącemu na raka lub chorobę proliferacyjną. Ilość podana pacjentowi jest terapeutycznie skuteczną ilością lub ilością powodującą wyleczenie raka lub choroby. Podanie koniugatu może nastąpić drogą pozajelitową lub pokarmową. Do przykładowych dróg pokarmowych należą, między innymi, droga doustna, doodbytnicza, podjęzykowa i dopoliczkowa. Do przykładowych dróg pozajelitowych należą, między innymi, droga dootrzewnowa, dożylna, podskórna, domięśniowa, śródskórna, wewnątrznowotworowa i śródnaczyniowa.
III. Kompozycje farmaceutyczne
Postacie farmaceutyczne odpowiednie do stosowania w postaci iniekcji obejmują jałowe roztwory wodne i/lub zawiesiny; formulacje zawierające olej sezamowy, olej z orzeszków ziemnych i/lub uwodniony glikol propylenowy; i/lub jałowe proszki dla późniejszego przygotowania jałowych roztworów i/lub zawiesin do iniekcji. We wszystkich przypadkach postać musi być jałowa i/lub musi być płynna w stopniu pozwalającym na łatwe pobranie do strzykawki. Musi być stabilna w warunkach wytwarzania i/lub przechowywania i/lub musi być zabezpieczona przed zakażającym działaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie i/lub grzyby.
Roztwory związków aktywnych w postaci wolnej zasady i/lub dopuszczalnych farmakologicznie soli można przygotować w wodzie odpowiednio zmieszanej ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak hydroksypropyloceluloza. Zawiesiny można też przygotować w glicerolu, ciekłych glikolach polietylenowych i/lub ich mieszaninach i/lub w olejach. W normalnych warunkach przechowywania i/lub stosowania preparaty te zawierają środek konserwujący zapobiegający wzrostowi mikroorganizmów.
Koniugat według niniejszego wynalazku może być formułowany w kompozycję w postaci obojętnej i/lub w postaci soli. Do dopuszczalnych farmaceutycznie soli należą sole powstałe przez przyłączenie kwasów (tworzone przez wolne grupy aminowe białka) i/lub które tworzone są z kwasami nieorganicznymi, takimi jak na przykład kwas solny i /lub fosforowy, i/lub takimi kwasami organicznymi, jak octowy, szczawiowy, winny, migdałowy i/lub im podobne. Sole utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą również pochodzić z zasad nieorganicznych, takich jak na przykład, wodorotlenek sodu, potasu, amonu, wapnia i/lub wodorotlenki żelaza, i/lub takich zasad organicznych, jak izopropyloamina, trimetyloamina, histydyna, prokaina i/lub im podobne. W zakresie stosowania peptydowych czynników terapeutycznych jako składników aktywnych, może być stosowana technologia z opisów patentowych USA 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; i/lub 4,578,770, z których każdy jest tu włączony przez odniesienie.
PL 216 516 B1
Nośnikiem może też być rozpuszczalnik i/lub środowisko dyspersyjne zawierające, na przykład, wodę, etanol, poliol (na przykład, glicerol, glikol propylenowy i/lub ciekły glikol polietylenowy i/lub im podobne), ich odpowiednie mieszaniny, i/lub oleje roślinne. Odpowiednią płynność można utrzymać przez, na przykład, zastosowanie opłaszczenia takiego, jak lecytyna, utrzymanie odpowiedniego rozmiaru cząstek w przypadku zawiesiny i/lub użycie środków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można osiągnąć przy pomocy różnych czynników przeciwbakteryjnych i/lub przeciwgrzybowych, na przykład, parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego, timerosalu i/lub im podobnych. W wielu przypadkach korzystnym będzie włączenie czynników izotonicznych, na przykład cukrów i/lub chlorku sodu. Przedłużone wchłanianie kompozycji do iniekcji można osiągnąć przez zastosowanie w kompozycjach czynników opóźniających wchłanianie, na przykład monostearynianu glinu i/lub żelatyny.
Jałowe roztwory do iniekcji wytwarzane są przez włączenie związków aktywnych w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika z różnymi wymienionymi powyżej składnikami, zgodnie z wymaganiami, a następnie wyjaławianie przez filtrowanie. Zawiesiny ogólnie wytwarza się przez włączenie różnych wyjałowionych składników aktywnych do sterylnego nośnika zawierającego podstawowe podłoże dyspersyjne i/lub inne wymagane składniki spośród wymienionych powyżej. W przypadku jałowych proszków do przygotowywania jałowych roztworów do iniekcji, korzystnymi sposobami wytwarzania są techniki suszenia próżniowego i/lub liofilizacji dające proszek składnika aktywnego wraz z dowolnym dodatkowym składnikiem z jego uprzednio wyjałowionego przez filtrowanie roztworu. Rozważane jest także wytwarzanie bardziej i/lub wysoce stężonych roztworów dla bezpośredniego wstrzykiwania, gdzie przewiduje się zastosowanie DMSO jako rozpuszczalnika w celu uzyskania wyjątkowo szybkiej penetracji i dostarczenia wysokich stężeń czynników aktywnych do niewielkiego obszaru.
Po sformułowaniu roztwory będą podawane w sposób zgodny z dawkowaniem formulacji i/lub w ilości takiej, która jest skuteczna terapeutycznie. Formulacje są łatwe do podawania w różnych postaciach dawkowania, takich, jak opisane powyżej roztwory do iniekcji, mogą jednak też być stosowane kapsułki uwalniające lek i/lub im podobne.
Na przykład, do podawania pozajelitowego w roztworze wodnym roztwór powinien być odpowiednio buforowany, jeżeli jest to konieczne, i/lub ciekły rozcieńczalnik najpierw doprowadzony do izotoniczności odpowiednią ilością soli i/lub glukozy. Te konkretne roztwory wodne są szczególnie odpowiednie do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego i/lub dootrzewnowego. W tym kontekście jałowe nośniki wodne, które można zastosować, będą znane specjaliście w świetle niniejszego opisu. Na przykład, jedną dawkę można rozpuścić w 1 ml izotonicznego roztworu NaCl i/lub dodać do 1000 ml płynu do wlewu podskórnego i/lub wstrzyknąć w proponowane miejsce wlewu (patrz, na przykład, Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition, strony 1035-1038 i/lub 1570-1580). Niezbędne będzie wprowadzanie pewnych zmian w dawkowaniu w zależności od stanu leczonego pacjenta. Osoba odpowiedzialna za podawanie będzie, w każdym w przypadku, określała odpowiednią dawkę dla danego pacjenta.
Aktywny koniugat i/lub czynniki mogą być formułowane w mieszaninie terapeutycznej tak, aby obejmowały około 0,0001 do 1,0 miligramów, i/lub około 0,001 do 0,1 miligramów, i/lub około 0,1 do 1,0 i/lub nawet około 10 miligramów na dawkę. Można także podawać wiele dawek.
Poza związkami sformułowanymi do podawania pozajelitowego, takiego jak iniekcja dożylna, dostawowa i/lub domięśniowa, do innych dopuszczalnych farmaceutycznie postaci należą np. tabletki i/lub inne formy stałe do podawania doustnego; formulacje liposomowe; kapsułki z opóźnionym uwalnianiem; i/lub inne aktualnie stosowane postacie, w tym kremy.
Można także stosować w niniejszym wynalazku roztwory i/lub rozpylacze donosowe, aerozole i/lub środki do inhalacji. Roztwory donosowe są to zwykle roztwory wodne zaprojektowane do podawania do dróg nosowych w postaci kropli i/lub spray'ów. Roztwory donosowe są wytworzone tak, aby w wielu aspektach przypominały wydzieliny nosa tak, aby utrzymać normalne działanie rzęsek. Wodne roztwory donosowe są zatem zwykle izotoniczne i/lub lekko buforowane dla utrzymania pH 5,5 do 6,5. Ponadto w preparacie mogą być zawarte środki konserwujące przeciwko mikroorganizmom, podobne do stosowanych w preparatach okulistycznych, i/lub odpowiednie czynniki stabilizujące lek, o ile są niezbędne. Znane są różne dostępne w handlu preparaty donosowe i/lub zawierają one, na przykład, antybiotyki i/lub czynniki antyhistaminowe i/lub są stosowane w profilaktyce astmy.
Do dodatkowych formulacji odpowiednich w innych drogach podawania należą czopki i/lub pesaria dopochwowe. Można również wykorzystać pesarium i/lub czopek doodbytniczy. Czopki są to
PL 216 516 B1 stałe postaci dawkowania o różnej wadze i /lub kształcie, zwykle zawierające leki, służące do umieszczenia w odbycie, pochwie i/lub cewce moczowej. Po umieszczeniu czopki miękną, topnieją i/lub rozpuszczają się w płynach jamy ciała. Ogólnie, do tradycyjnych środków wiążących i/lub nośników dla czopków mogą należeć, na przykład, glikole polialkilenowe i/lub triglicerydy; takie czopki mogą być formowane z mieszanin zawierających składnik aktywny w zakresie 0,5% do 10%, korzystnie 1%-2%.
Formulacje doustne obejmują takie normalnie stosowane substancje pomocnicze, jak na przykład, mannitol farmaceutycznej klasy, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu i/lub im podobne. Kompozycje te przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, formulacji o przedłużonym uwalnianiu i/lub proszków. W niektórych określonych wykonaniach doustne kompozycje farmaceutyczne będą obejmować obojętny rozcieńczalnik i/lub przyswajalny jadalny nośnik, i/lub mogą być zawarte w kapsułce żelatynowej o twardej i/lub miękkiej powłoce, i/lub mogą być sprasowane do tabletek, i/lub mogą być włączone bezpośrednio do pokarmu w diecie. Do terapeutycznego podawania doustnego związki aktywne mogą być połączone z substancjami pomocniczymi i/lub stosowane w postaci jadalnych tabletek, tabletek dopoliczkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków i/lub im podobnych.
Takie kompozycje i/lub preparaty powinny zawierać przynajmniej 0,1% związku aktywnego. Skład kompozycji i/lub preparatów może oczywiście się zmieniać i dogodnie może zawierać się w zakresie od około 2% do około 75% masy jednostki, i/lub korzystnie między 25-60%. Ilość związków aktywnych w takich przydatnych terapeutycznie kompozycjach jest taka, aby uzyskać odpowiednie dawkowanie.
Tabletki, kołaczyki, pigułki, kapsułki i/lub im podobne mogą także zawierać następujące składniki: czynnik wiążący jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana i/lub żelatyna; substancje pomocnicze takie, jak fosforan diwapnia; czynniki dezintegrujące, takie jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas aliginowy i/lub im podobne; środek smarujący taki, jak stearynian magnezu i/lub może być dodany środek słodzący taki, jak sacharoza, laktoza i/lub sacharyna i/lub środek smakowy taki, jak mięta, olejek wintergrinowy i/lub smak wiśniowy. Gdy jednostka dawkowania ma postać kapsułki, może ona oprócz substancji powyższego typu zawierać także ciekły nośnik. Różne inne substancje mogą być obecne jako powłoczki i/lub w inny sposób modyfikować fizyczną postać jednostki dawkowania. Na przykład , tabletki, pigułki i/lub kapsułki mogą być pokryte szelakiem, cukrem, i/lub jednym i drugim. Syrop lub eliksir może zawierać związek aktywny, sacharozę jako środek słodzący, metylo- lub propyloparabeny, jako środek konserwujący, barwniki i/lub środek smakowy, taki jak smak wiśniowy i/lub pomarańczowy.
W niektórych wykonaniach rozważane jest zastosowanie formulacji lipidowych i/lub nanokapsułek do wprowadzenia do komórek gospodarza koniugatu /lub czynników, i/lub wektorów terapii genowej, w tym, zarówno wektorów typu dzikiego jak i/lub wektorów antysensownych.
Nanokapsułki mogą ogólnie zamykać związki w stabilny i/lub powtarzalny sposób. Dla uniknięcia skutków ubocznych związanych z wewnątrzkomórkowym przeładowaniem polimerami takie ultradrobne cząstki (o rozmiarze około 0,1 μm) powinny być zaprojektowane z wykorzystaniem polimerów zdolnych do degradacji in vivo. Biodegradowalne nanocząstki polialkilocyjanoakrylanowe spełniające te wymagania są rozważane pod kątem wykorzystania w niniejszym wynalazku i/lub mogą być łatwo wytworzone.
Koniugat można przyłączyć do lipidu. Koniugaty przyłączone do lipidu mogą być zamknięte w wodnym wnętrzu liposomu, wmieszane w dwuwarstwę lipidową liposomu, przyłączone do liposomu przez cząsteczkę łącznikową połączoną zarówno z liposomem, jak i oligonukleotydem, zamknięte w liposomie, skompleksowane z liposomem, rozproszone w roztworze zawierającym lipid, zmieszane z lipidem, połączone z lipidem, zawarte w postaci zawiesiny w lipidzie, zawarte lub skompleksowane z micelą lub w inny sposób związane z lipidem. Kompozycje powiązane z lipidem lub lipidami/koniugatami według niniejszego wynalazku nie są ograniczone do żadnej konkretnej struktury w roztworze. Na przykład, mogą być obecne w dwuwarstwowej strukturze, jako micele lub w strukturze zapadniętej. Mogą także być po prostu rozproszone w roztworze, być może tworząc agregaty nie posiadające równomiernego rozmiaru i kształtu.
Lipidami są substancje tłuszczowe, którymi mogą być lipidy występujące naturalnie lub syntetyczne. Na przykład, do lipidów należą kropelki tłuszczu naturalnie występujące w cytoplazmie, a także klasa związków, dobrze znanych specjalistom, zawierających długołańcuchowe alifatyczne węglowodory i ich pochodne, takie jak kwasy tłuszczowe, alkohole, aminy, aminoalkohole i aldehydy.
PL 216 516 B1
Fosfolipidy mogą być wykorzystane do wytwarzania liposomu i mogą one nieść całkowity ładunek dodatni, ujemny lub obojętny. Fosforan diacetylu może być stosowany do nadania liposomom ujemnego ładunku, zaś stearyloamina może być stosowana do nadania liposomom ładunku dodatniego. Liposomy mogą być wytworzone z jednego lub więcej fosfolipidów.
Lipid o ładunku obojętnym może obejmować lipid pozbawiony ładunku, lipid zasadniczo nienaładowany lub mieszaninę lipidów o równej ilości ładunków dodatnich i ujemnych. Do odpowiednich lipidów należą fosfatydylocholiny i inne, które są dobrze znane specjalistom.
Odpowiednie lipidy można pozyskać ze źródeł handlowych. Na przykład dimirystylofosfatydylocholinę (DMPC) można pozyskać z firmy Sigma Chemical Co., dicetylofosforan (DCP) pozyskuje się z K & K Laboratories (Plainview, NY); cholesterol (Chol) pozyskuje się z Calbiochem-Behring; dimirystylofosfatydyloglicerol (DMPG) i inne lipidy można pozyskać z Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Roztwory podstawowe lipidów w chloroformie lub mieszaninie chloroform/metanol można przechowywać w około -20°C. Korzystnie jako jedyny rozpuszczalnik stosowany jest chloroform, gdyż łatwiej można go odparować niż metanol.
Fosfolipidy ze źródeł naturalnych, takie jak fosfatydylocholina z jajka lub soi, kwas fosfatydowy z mózgu, fosfatydyloinozytol z mózgu lub rośliny, kardiolipina z serca i roślinna lub bakteryjna fosfatydyloetanolamina, korzystnie nie są stosowane jako główny fosfatyd, tzn. stanowiący 50% lub więcej całego składu fosfatydów, ze względu na niestabilność i nieszczelność powstających liposomów.
Fosfolipidy przy rozproszeniu w wodzie mogą oprócz liposomów tworzyć szereg różnych innych struktur, zależnie od molowego stosunku lipidu do wody. Przy niskim stosunku korzystną struktura jest liposom. Cechy fizyczne liposomy zależą od pH, siły jonowej i/lub obecności kationów dwuwartościowych. Liposomy mogą wykazywać niską przepuszczalność dla substancji jonowych i/lub polarnych, lecz w podwyższonych temperaturach podlegają przejściu fazowemu, które znacząco zmienia ich przepuszczalność. Przejście fazowe polega na zmianie ze ściśle upakowanej, uporządkowanej struktury w luźniej upakowaną, mniej uporządkowaną strukturę, znaną jako stan ciekły. Zmiana faz zachodzi przy charakterystycznej temperaturze przejścia fazowego i/lub powoduje wzrost przepuszczalności dla jonów, cukrów i/lub leków.
Liposomy oddziałują z komórkami przez cztery różne mechanizmy: endocytozę przez komórki fagocytujące układu siateczkowo-śródbłonkowego, takie jak makrofagi i/lub granulocyty obojętnochłonne; adsorpcję na powierzchni komórki, albo przez nieswoiste oddziaływania słabe hydrofobowe i/lub elektrostatyczne i/lub swoiste oddziaływania ze składnikami powierzchni komórki; fuzję z błoną komórkową przez włączenie dwuwarstwy lipidowej liposomu w błonę komórkową z jednoczesnym uwolnieniem zawartości liposomu do cytoplazmy; i/lub przez transfer lipidów liposomowych do błon komórkowych i/lub wewnątrzkomórkowych i/lub vice versa, bez połączenia z zawartością liposomu. Różnicowanie formulacji liposomowej może zmienić działający mechanizm, choć w tym samym czasie może działać więcej niż jeden mechanizm.
Dostarczanie oligonukleotydów i wyrażanie obcego DNA in vitro za pośrednictwem liposomów odniosło duży sukces. Wong i wsp. (1980) wykazali możliwość dostarczenia za pośrednictwem liposomów i wyrażenia obcego DNA w hodowanych komórkach zarodka kurczaka, HeLa i wątrobiaka. Nicolau i wsp. (1987) osiągnęli udany transfer genów za pośrednictwem liposomów u szczurów po wstrzyknięciu dożylnym.
Niekiedy lipid może być połączony z wirusem hemaglutynującym (HVJ). Wykazano, że ułatwia to fuzję z błoną komórkową i ułatwia wprowadzenie do komórki zawartego w liposomach DNA (Kaneda i wsp., 1989). Lipid może być także skompleksowany lub stosowany w połączeniu z jądrowymi niehistonowymi białkami chromosomalnymi (HMG-1) (Kato i wsp., 1991). Lipid można także skompleksować lub zastosować w połączeniu z zarówno HVJ, jak i HMG-1. O ile takie wektory ekspresyjne były skutecznie stosowane do wprowadzenia i wyrażenia oligonukleotydu in vitro i in vivo, nadają się one do niniejszych celów. Gdy w konstrukcie DNA stosowany jest promotor bakteryjny, pożądane jest także włączenie do liposomu odpowiedniej bakteryjnej polimerazy.
Liposomy mogą być wytworzone różnymi sposobami. Rozmiar liposomu zmienia się w zależności od sposobu syntezy. Liposom zawieszony w roztworze wodnym ma ogólnie kształt sferycznego pęcherzyka mającego jedną lub więcej koncentrycznych warstw cząsteczek dwuwarstwy lipidowej. Każda warstwa składa się z równoległych szeregów cząsteczek reprezentowanych przez wzór XY, gdzie X jest częścią hydrofilową, a Y jest częścią hydrofobową. W zawiesinie wodnej koncentryczne warstwy ułożone są tak, że części hydrofitowe mają tendencję do pozostawania w kontakcie z fazą wodną, zaś obszary hydrofobowe mają tendencję do łączenia się ze sobą. Na przykład, gdy fazy
PL 216 516 B1 wodne obecne są zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz liposomu, cząsteczki lipidów mogą utworzyć dwuwarstwę, znaną jako blaszka, o układzie XY-YX. Agregaty lipidów mogą tworzyć się gdy części hydrofilowe i hydrofobowe więcej niż jednej cząsteczki lipidu łączą się ze sobą. Rozmiar i kształt takich agregatów będzie zależał od wielu różnych zmiennych, takich jak natura rozpuszczalnika i obecność innych związków w roztworze.
Liposomy mogą być przygotowane zgodnie ze znanymi technikami laboratoryjnymi. W jednym korzystnym wykonaniu liposomy są przygotowywane przez mieszanie lipidów liposomowych w rozpuszczalniku w pojemniku, np. szklanej gruszkowatej kolbie. Pojemnik powinien mieć objętość dziesięciokrotnie większą niż objętość oczekiwanej zawiesiny liposomów. Przy pomocy wyparki obrotowej rozpuszczalnik usuwa się w około 40°C z podciśnieniem. Usunięcie rozpuszczalnika normalnie trwa od około 5 min do 2 godzin, zależnie od żądanej objętości liposomów. Kompozycja może być dalej wysuszona w eksykatorze pod próżnią. Wysuszone lipidy z reguły są odrzucane po około 1 tygodniu ze względu na tendencję do rozkładu w czasie.
Wysuszone lipidy można uwodnić, przy stężeniu około 25-50 mM fosfolipidu, w sterylnej, pozbawionej pirogenów wodzie, przez wytrząsanie aż do zawieszenia całości błony lipidowej. Uwodnione liposomy można następnie podzielić na porcje, umieścić każdą we fiolce, liofilizować i zamknąć w próżni.
Alternatywnie, liposomy można wytworzyć zgodnie z innymi znanymi procedurami laboratoryjnymi: metodą Banghama i wsp. (1965), której zawartość jest tu włączona przez odniesienie; metodą Gregoriadisa, opisaną w DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis red. (1979) ss. 287-341, której zawartość jest tu włączona przez odniesienie; oraz metodą odparowywania w odwróconej fazie opisaną przez Szoka i Papahadjopoulosa (1978). Powyższe metody różnią się zdolnością zamykania materiału wodnego i stosunkiem przestrzeni fazy wodnej do fazy lipidowej.
Wysuszone lipidy lub liofilizowane liposomy wytworzone tak, jak opisano to powyżej, mogą być odwodnione i rekonstytuowane w roztworze peptydu hamującego i rozcieńczone do odpowiedniego stężenia odpowiednim rozpuszczalnikiem, np. DPBS. Mieszanina jest następnie energicznie wytrząsana w mieszalniku wirowym. Niezamknięty kwas nukleinowy jest usuwany przez wirowanie przy 29000 x g a osad liposomów przepłukany. Przepłukane liposomy są zawieszane w odpowiednim całkowitym stężeniu fosfolipidów, np. około 50-200 mM. Ilość zamkniętego kwasu nukleinowego można wyznaczyć zgodnie ze standardowymi metodami. Po wyznaczeniu ilości kwasu nukleinowego zamkniętego w preparacie liposomowym, liposomy można rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia i przechowywać w 4°C do czasu użycia.
Kompozycja farmaceutyczna obejmująca liposomy będzie zwykle zawierać jałowy, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik, taki jak woda lub roztwór soli.
IV. PRZYKŁADY
Następujące przykłady mają na celu przedstawienie korzystnych wykonań wynalazku. Specjaliści powinni zauważyć, że ujawnione w następujących przykładach techniki przedstawiają techniki odkryte przez twórców dla skutecznego działania w praktyce wynalazku, i mogą zatem być uważane za stanowiące korzystne drogi jego praktykowania. Specjalista powinien jednak w świetle niniejszego opisu zauważyć, że w konkretnych ujawnionych wykonaniach można wprowadzić wiele zmian i wciąż uzyskać podobny wynik bez odejścia od ducha i zakresu wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Mutageneza in vitro
Różne warianty superantygenu uzyskano przy zastosowaniu metody opartej na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).
W skrócie, produkty PCR zawierały dwa pojedyncze miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, po jednym na każdym końcu. Do procedury subklonowania wykorzystano pUC19 (GIBCO BRL Life Technologies, Middlesex, U.K.) wytworzony zgodnie z protokołem zestawu do minipreparatyki DNA QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Mutacje punktowe niewpływające na sekwencję aminokwasową wprowadzono dla ułatwienia dalszych analiz. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze Perkin Elmer Gene Amp PCR 2400 przy użyciu polimerazy DNA Taq i odpowiedniego buforu do PCR zawierającego 15 mM MgCl2 (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Szwajcaria). Produkty PCR i wektory cięto przez noc odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Oczyszczono je przy pomocy elektroforezy w 1% żelu agarozowym (GIBCO BRL Life Technologies) zawierającym 0,5 μg/ml bromku etydyny (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy)w buforze TAE (Sigma-Aldrich). Fragment zawierający DNA wycięto z żelu i wyizolowano przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA z żelu
PL 216 516 B1
CONSERT™ Rapid Gel Extraction System (GIBCO BRL Life Technologies). Wektor i wstawkę zligowano (ligaza DNA T4, Roche Molecular Biochemicals) w temperaturze pokojowej przez 3-4 godziny.
Mieszaniną ligacyjną transformowano Escherchia coli szczepu DH5a (GIBCO BRL Life Technologies) zgodnie z instrukcjami dołączonymi do komórek. Pozytywne klony zidentyfikowano przy pomocy sekwencjonowania DNA. Odpowiednie sekwencje wycięto RsrII/HindIII w 37°C przez noc i zligowano z wektorem ekspresyjnym (Dohlsten i wsp., 1994). Części zmienne Fab zmieniono na C215 ze względu na wykorzystywane modele zwierzęce. Konstrukt ostatecznie elektroporowano do komórek Escherchia coli szczepu K12 UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, AompT).
P r z y k ł a d 2
Identyfikacja regionów wiązanych przez ludzkie anty-SEA
Regiony rozpoznawane przez ludzkie anty-SEA zidentyfikowano w trawieniu pepsyną SEA lub chimerycznego wariantu SEA i SEE, SEA/E-18, opisanego uprzednio jako SEE/A-A (Antonsson i wsp., 1997) z podstawieniem D227A.
Każdy superantygen inkubowano z 0,5% pepsyną, 10 mM HCl, 150 mM NaCl (wag./wag.) przez 60 minut w 37°C. Mieszaninę peptydów zobojętniono 2M Tris-HCl pH 8,0 i nałożono na 1 ml kolumnę HiTrap (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) z unieruchomionym ludzkim anty-SEA. PBS, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mMKCl, pH 7,3 użyto jako bufor do płukania a fragmenty wiążące przeciwciało wypłukano przy zastosowaniu 0,1 M kwasu octowego pH 3,0. Fragmenty zidentyfikowano przed i po oczyszczeniu przy zastosowaniu HPLC sprzężonej ze spektrometrem masowym (MS) (Fig. 1). Chromatografię przeprowadzono na kolumnie C18 (2x250 mm) (VYDAC™, Hesperia, California, USA) przy użyciu liniowego gradientu od 10 do 60% acetonitrylu w 0,1% kwasie trójfluoroctowym przez 30 min w 40°C. Wyznaczenie mas przeprowadzono przy użyciu MS termorozpylającego (Finnigan LCQ, Thermoquest, San Jose, California, USA). Fragmenty odnalezione w trawieniu przy tym samym czasie retencji przed i po oczyszczaniu przez powinowactwo traktowano jako pozytywne (Fig. 2).
P r z y k ł a d 3
Modelowanie molekularne
Chimeryczny superantygen SEA/E-18 bazował na sekwencji SEE z wyjątkiem czterech aminokwasów w pobliżu N-końca, które pochodziły z SEA i jednego podstawienia w części C-końcowej D227A (Fig. 3 i Fig. 4) (Antonsson i wsp., 1997).
W skrócie, struktury przestrzenne superantygenów o znacznie wyższej identyczności sekwencji względem SEE dostępne w PDB wykorzystano jako matryce do skonstruowania modelu homologii SEAE-18, tzn. SEA (1ESF, Shard i wsp., 1SXT, Sundstrom i wsp. 1996 A), SED (Sundstrom i wsp., 1996B) i SEH (1ENF) (Hakansson i wsp., 2000). SEA był najbardziej podobny do SEE, przy identyczności sekwencji 80%. SED wykazywał identyczność sekwencji 60%, a SEH 50% względem SEE.
Konstrukcję modelu przeprowadzono stosując moduł HOMOLOGY oprogramowania INSIGHTII (MSI, San Diego). Struktury trzech superantygenów SEA, SED i SEH przyrównano i wyznaczono regiony strukturalnie konserwatywne (SCR) (Fig. 3). Regiony te z reguły mapowały się do regularnych struktur drugorzędowych cząsteczek. Pierwotną sekwencję SEA/E-18 załadowano i naciągnięto na SCR ze struktury SEA (Fig 5). Dla SEA wykorzystano współrzędne 1SXT z wyjątkiem pierwszych dziewięciu aminokwasów na N-końcu, gdzie użyto 1ESF. Regiony między SCR były w większości przypadków regionami elastycznych pętli i zostały zbudowane na podstawie SEA i SED. Większość pętli zbudowano na podstawie SEA, z wyjątkiem aminokwasów Gln19, Ile140, Asp141, Lys142, Ser189, Gly191, Asp200, Pro206, Asp207 i Leu224, które zbudowano na podstawie SED. Niektóre regiony w obrębie SCR wykazywały większe podobieństwo sekwencji z SED i zostały zatem zbudowane przy wykorzystaniu SED jako matrycy strukturalnej (Ile37, Glu49, Asn50, Thr51, Leu52, Ser195 i Thr218) (Fig. 3).
Ze względu na fakt, że jako matrycę strukturalną dla większości aminokwasów w SEA/E-18 wykorzystano SEA, nie wystąpiły problemy z nakładającymi się łańcuchami bocznymi. Punkty połączenia przed i za SCR naprawiono. Najpierw rozluźniono podstawione łańcuchy boczne, po czym minimalizacja energii i symulacje dynamiki molekularnej rozluźniły wszystkie łańcuchy boczne wewnątrz SCR przy zastosowaniu standardowych protokołów w programie HOMOLOGY. Obszary pętli rozluźniano po jednym przy użyciu najpierw 1000 kroków minimalizacji energii a następnie 1000 kroków dynamiki molekularnej. Ten protokół ulepszania zastosowano najpierw dla łańcuchów bocznych w pętli, a następnie dla wszystkich atomów w pętli. We wszystkich symulacjach zastosowano pole siłowe CVFF ze stałą siły 100 kcal/A2 z krokiem czasowym 2 fs.
PL 216 516 B1
Ostateczny model zbadano pod kątem występowania nieprawidłowych regionów przy pomocy modułu PROSTAT w INSIGHTII.
Nie wykryto żadnych nieprawidłowych regionów. Wnętrze białka było dobrze upakowane bez znaczących różnic w porównaniu z SEA. Wszystkie aminokwasy znajdują się w dozwolonych obszarach na wykresie Ramachandrana. Nałożenie 1SXT na model daje średnią kwadratową odległość (RMSD) 0,4A przy porównywaniu atomów Ca. Główne różnice między tymi dwiema strukturami są widoczne w pętli β9 - β10 (aminokwasy His187-Thr193) (Fig. 5).
Nowe modele nowych wariantów superantygenów skonstruowano przy użyciu modelu SEA/E-18 jako matrycy. Konkretne aminokwasy zmieniano bezpośrednio na modelu. Najkorzystniejszą konformację łańcucha bocznego wybrano przy zastosowaniu prostego wyszukiwania zawad sferycznych a następnie krótkiej minimalizacji energii
P r z y k ł a d 4
Hodowla i oczyszczanie
Chimery C215FabSEA/E wyrażano jako białka fuzyjne w szczepie E. coli K12 UL635 z wykorzystaniem plazmidu z indukowanym IPTG promotorem Lac UV-5 i genem oporności na kanamycynę.
W skrócie, bakterie z zamrożonego (-70°) roztworu podstawowego w 20% glicerolu inkubowano w 25°C przez 22-24 godzin w kolbach do wytrząsania zawierających (na litr) 2,5 g (NH4)2SO4, 3 g KH2PO4, 2 g K2HPO4, 0,5 g cytrynianu sodowego, 1 g MgSO4 · H2O, 0,05 g kanamycyny, 12 g jednowodzianu glukozy i 1 ml roztworu pierwiastków śladowych, jednakże bez Na2MoO4 · 2H2O. Komórki hodowano do Abs620 2-3 i 10 ml podłoża hodowlanego zastosowano do zaszczepienia 1 litrowego fermentora (Belach Bioteknik, Szwecja) z objętością początkową 800 ml. Podłoże w fermentorze zawierało (na litr) 2,5 g (NH4)2SO4, 9 g KH2PO4, 6 g K2HPO4, 0,5 g cytrynianiu sodowego, 1 g MgSO47H2O, 0, 05 g kanamycyny, 23,1 g jednowodzianu glukozy i 1 ml roztworu pierwiastków śladowych jak powyżej. Stałe pH utrzymywano przez miareczkowanie 25% NH3, napowietrzanie wynosiło 1 litr/minutę a temperatura 25°C. Podczas fazy wsadowej rozpuszczony O2 utrzymywano przy wartości 30% przez regulację wytrząsania od 400 rpm do 2000 rpm, zaś podczas fazy wsadowej z uzupełnianiem przez regulację dopływu glukozy (60% wag./obj.). Wytwarzanie produktu zaindukowano przy absorbancji przy 620 nm wynoszącej 45 przez dodanie 0,1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Po fermentacji komórki usunięto przez wirowanie w -20°C przed oczyszczaniem.
Procedurę oczyszczania podzielono na trzy etapy. Najpierw z superanatantu hodowli usunięto DNA przez 0,19% polietylenoiminy (wag./obj.) w 0,2 M NaCl, pH 7,4, przy użyciu pompy perystaltycznej z natężeniem przepływu 12 ml/min. Po odwirowaniu przy 7500 x g przez 30 min zebrano superanatant.
Nałożono go na 60 ml kolumnę o szybkim przepływie białko-G Sepharose 4 (Amersham Pharmacia Biotech) z szybkością przepływu 14 ml/min. Kolumnę przepłukano PBS i przeprowadzono elucję 100 mM kwasem octowym, 0,025% Tween 20, pH 3,0. Wyeluowany produkt zebrano i ustalono pH na 1,5 jednostki poniżej teoretycznego punktu izoelektrycznego przy pomocy 1M NaOH, przefiltrowano (0,2 μm) i rozcieńczono czterokrotnie 0,025% Tween 20. Zdegradowane warianty usunięto przy pomocy chromatografii jonowymiennej. Siłę jonową próbki doprowadzono do 2 mS/cm i użyto kolumny SP-Sepharose-HP Hiload 16/10 (Amersham Pharmacia Biotech). Elucję przeprowadzono z przepływem 4,0 ml/min przez 50 min przy zastosowaniu liniowego gradientu od 0-55% buforu B, 100 mM NaAc, 400 mM NaCl, 0,025% Tween 20, pH 5,0 w buforze A, 10 mM Na Ac, 0,025% Tween 20, pH 5,0.
P r z y k ł a d 5
Seroreaktywność
Reaktywność między wariantami superantygenu a ludzkim anty-SEA zmierzono w scyntylacyjnym oznaczeniu bliskości (SPA - Scintillation Proximity Assay).
W płytce mikrotitracyjnej (OptiPlate, Packard Instruments) inkubowano przez 30 min kulki PVT pokryte streptawidyną, 150 μg kulek/studzienkę z fragmentami F(ab)2 IgG anty-mysz, 3 μg/mg kulek. Kulki preinkubowano z superantygenami skoniugowanymi z C215Fab w serii rozcieńczeń 1:2, gdzie najwyższe końcowe stężenie w studzienkach wynosiło 40 nM. Ostatecznie inkubowano je z 1 nM oczyszczonych chromatografią powinowactwa ludzkich przeciwciał anty-SEA skoniugowanych ze 125I, zaś ilość β-scyntylacji zmierzono w liczniku Top Counter (Packard instruments).
Reaktywność ludzkiego anty-SEA z wariantami superantygenu zmierzono także w teście immunoenzymatycznym ELISA (Cavallin i wsp., 2000). Wyniki były zbliżone do uzyskanych w SPA.
PL 216 516 B1
P r z y k ł a d 6
Funkcja biologiczna
Zdolność do zaindukowania cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu i przeciwciała, SADCC i cytotoksyczności komórkowej zależnej od superantygenu, SDCC porównano w standardowym czterogodzinnym oznaczeniu uwalniania 51Cr.
W skrócie, docelowymi komórkami użytymi w SDCC były komórki Raji ludzkiego chłoniaka komórek B, zaś komórkami docelowymi w SADCC były komórki ludzkiego raka jelita grubego Colo205.
Komórki wyznakowano 51Cr i rozcieńczono do stężenia 50000 komórek/ml do studzienek mikrotitracyjnych w kształcie litery V. Jako komórki efektorowe zastosowano linię ludzkich limfocytów T reagujących z SEA przy stosunku efektora do celu wynoszącym 45:1 dla SADCC i 30:1 dla SDCC. Warianty
Sag dodawano w stężeniach od 10-9-10-16M dla SADCC i od 10-7-10-14M dla SDCC. Zebrano superna51 tanty i zmierzono uwalnianie 51Cr w urządzeniu TopCount (Packard Instruments). Procent cytotoksyczności swoistej obliczono jako 100 x [(cpm uwolnione w doświadczeniu - uwolnione cpm tła)/(całkowite uwolnione cpm - uwolnione cpm tła)].
P r z y k ł a d 7
Identyfikacja epitopów dla przeciwciał
Istniejące wcześniej u pacjentów przeciwciała przeciwko superantygenom komplikowały ich zastosowanie kliniczne, wymagając dostosowania ich dawkowania w terapii (Alpaugh i wsp., 1998). Inną strategią ograniczenia wpływu wcześniej utworzonych przeciwciał była modyfikacja regionu superantygenu odpowiadającego za wiązanie receptora limfocytów T (Antonsson i wsp., 1997). Niniejszy wynalazek ulepszył jednak w dalszym stopniu potencjał terapeutyczny superantygenów przez zastosowanie inżynierii genetycznej do usunięcia epitopów dla przeciwciał z superantygenu.
Stwierdzono, że SEE wykazywał silne obniżenie reaktywności z przeciwciałami w porównaniu z SEA (Antonsson i wsp., 1997). Niestety, obniżeniu temu towarzyszyło także znaczne obniżenie zdolności zabijania nowotworów po połączeniu z reaktywnym wobec nowotworu Fab (Antonsson i wsp., 1997). Zatem zbadano również chimeryczne konstrukty SEA i SEE. Kiedy tylko wprowadzono odpowiednie aminokwasy z SEA do czterech pozycji regionu SEE wiążącego TCR uzyskano żądane właściwości. Te podstawienia: Arg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly i Arg27Lys (region A) w SEE dały w efekcie chimerę SEA/E-18 (Fig. 4) (Antonsson i wsp., 1997). Chimera ta wykazała ponad 50% obniżenie reaktywności z przeciwciałami, jak w przypadku SEE, utrzymując skuteczny poziom cytotoksyczności, jak w przypadku SEA. Ponadto, dla obniżenia powinowactwa między superantygenem a MHC klasy II, co obniża SDCC i tym samym poprawia okno terapeutyczne, SEA/E-18 zawiera także podstawienie Asp227Ala (Abrahmsen i wsp., 1995).
W celu dalszego obniżenia zdolności ludzkiego anty-SEA do rozpoznawania SEA/E-18 określono epitopy wiążące przeciwciała w superantygench. Peptydy/fragmenty po częściowym trawieniu pepsyną SEAwt albo SEA/E-18 wychwycono przy zastosowaniu unieruchomionych przeciwciał anty-SEA. Po oczyszczeniu sekwencje peptydów zidentyfikowano przy zastosowaniu LC_MS (Fig. 1). Tym samym zlokalizowano w sekwencji aminokwasowej potencjalne regiony zaangażowane w rozpoznawanie przeciwciał. W znacznej mierze, większość odzyskanych peptydów była zlokalizowała wokół regionów, o których wiadomo, że oddziałują z MHC klasy II (Abrahmsen i wsp., 1995) (Fig. 2 i Fig. 6). Struktura trójwymiarowa SEA (Schad i wsp., 1995; Sundstrom i wsp., 1996) oraz model komputerowy SEA/E-18 (Fig. 5) oparty na strukturze krystalicznej SEA (Schad i wsp., 1995; Sundstrom i wsp., 1996 A) zastosowano do zlokalizowania reszt aminokwasowych eksponowanych na powierzchni w zidentyfikowanych peptydach. Następujące aminokwasy zidentyfikowano jako eksponowane na powierzchnie i potencjalnie będące kandydatami na epitopy wiążące przeciwciała: Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Asp173, His187, Ser189, Glu190, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 i Asp227 (Tabela 1). Aminokwasy te następnie podstawiono w celu zmniejszenia wiązania z przeciwciałami. Cały czas tworzono nowe modele komputerowe z dalej ulepszonymi wariantami Sag w celu potwierdzenia i porównania uzyskanych z nimi wyników. Konkretnie, badano wpływ łańcuchów bocznych i identyfikowano zmiany wpływające na stabilność białka.
P r z y k ł a d 8
Modyfikacja superantygenu w celu zmniejszenia seroreaktywności
Poziomy wiązania przeciwciał zidentyfikowanych aminokwasów scharakteryzowano początkowo przez dwa do sześciu jednoczesnych podstawień w SEA/E-18. Uzyskano w ten sposób warianty Sag SEA/E-62 (Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala) (region E), SEA/E-63
PL 216 516 B1 (Ser189Asp, Glu190Ala) (region D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (region B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (region C), SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45Ala, Glu49Thr) (region B) i SEA/E-75 (Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser) (region C) (Tabela 1, Fig. 4).
W celu zbadania, czy przeciwciała anty-SEA z ludzkiej puli IgG mogły rozpoznawać różne warianty Sag, opracowano scyntylacyjne oznaczenie bliskości (SPA - Scintillation Proximity Assay). Wszystkie zmodyfikowane warianty były rozpoznawane w mniejszym stopniu w porównaniu z SEA/E-18 (Tabela 1). Najbardziej znaczące obniżenie wiązania spowodowane było podstawieniami wprowadzonymi w SEA/E-65. W analizie SPA zaobserwowano redukcję o ponad 40% (Fig. 7). Wiele podstawień spowodowało jednak zmniejszenie poziomu wytwarzania E. coli i ponadto, w niektórych przypadkach, obniżona była także aktywność biologiczna. Poprzez dokładne zbadanie zmian mogliśmy zidentyfikować odpowiadające za to aminokwasy w każdym z wariantów i wyłączyć lub zmodyfikować je dla osiągnięcia lepszych właściwości. Ogólnie, poziom wytwarzania zwiększył się na skutek podstawień bardziej hydrofilowych w porównaniu z bardziej hydrofobowymi.
Zmniejszenie wiązania przeciwciał wzrosło synergistycznie, gdy warianty połączono tak, jak w SEA/E-91 złożonym z SEA/E-63, SEA/E-65 i zmodyfikowanego SEA/E-74 (z Asp45 typu dzikiego) (Tabela 1). Wariantem o najbardziej wyjątkowym wyniku w analizie SPA ze zmniejszeniem wiązania o prawie 70% w porównaniu z SEA/E-18 był SEA/E-110, kombinacja SEA/E-63, SEA/E-75 i zmodyfikowanego SEA/E-62 (SEA/E-97), SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) i SEA/E-74 (Asp45 typu dzikiego) (Fig. 7, tabela 1). Modyfikacje odpowiadające za większość zmniejszenia wiązania przeciwciał znajdowały się w SEA/E-109 (Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser) kombinacji SEA/E-75 i zmodyfikowanego SEA/E-64(SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) i SEA/E-74 (Asp45 typu dzikiego). Przyczyną jest to, że warianty superantygenów zawierające te podstawienia wszystkie wykazywały wyraźne zmniejszenie w analizie SPA.
Zatem, aminokwasy podstawione w SEA/E-62, SEA/64, SEA/E-65 i SEA/E-74 powodowały między 20 a 40% zmniejszenia reaktywności w porównaniu z SEA/E-18 (Tabela 1).
PL 216 516 B1
Tabefe 1
pogrubione czcionką dotyczą dołwiadczeń przeprowadzonych z inną porcja przeciwciał niż pozostałe.
PL 216 516 B1
P r z y k ł a d 9
Zastąpienia wpływające na poziomy wytwarzania
Jak wskazano powyżej, niektóre podstawienia na powierzchni superantygenu spowodowały zmniejszenie poziomu wytwarzania w E. coli. Wiele kombinacji takich zamian nie było nawet możliwych do wytworzenia. Zdecydowano zatem zbadać alternatywne modyfikacje tych aminokwasów, które wyraźnie powodowały zmniejszenie wydajności. Podstawień, które wpływały na wydajność bez zmniejszenia wiązania przeciwciał, nie badano dalej. Zamiast nich użyto aminokwasów typu dzikiego.
We wstępnym zestawie wariantów superantygenów aminokwas Lys35 w SEA/E-64 negatywnie wpływał na poziom ekspresji. Przy stosowaniu aminokwasu typu dzikiego w pozycji 35 wraz z podstawieniem seryną Glu34 i Glu39, co dało wariant Sag SEA/E-108, wydajność wzrosła z 23 mg/l do 30 mg/l. Utrzymane jednak było zmniejszenie reaktywności przeciwciała. Przy wprowadzeniu podstawień kwasem glutaminowym aminokwasów Lys79, Lys81, Lys83 i Lys84 w SEA/E-65 poziom wytwarzania wynosił zaledwie 1,5 mg/l. Ze względu na fakt, że reaktywność z przeciwciałami zmniejszyła się o 43% w porównaniu z SEA/E18 podjęto starania zidentyfikowania lepszych zastąpień. Stwierdzono, że najlepszą kombinacją, pod względem zarówno wydajności, jak i zmniejszonej reaktywności z przeciwciałami była SEA/E-84 z resztami seryny w pozycji 83 i 84 oraz zachowanym kwasem glutaminowym w pozycjach 79 i 81 (Tabela 1). Poziom wytwarzania wzrósł dziesięciokrotnie zaś reaktywność z przeciwciałami zmniejszyła się o 41% w porównaniu z SEA/E-84 (Tabela 1). Poziom wytwarzania zmniejszył się także ponad dziesięciokrotnie dla podstawień Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala i Asp227Ala w SEA/E-62, do 1,0 mg/l. Zamieniając podstawienia alaninowe na reszty seryny, co dało SEA/E-97, uzyskano jednak wydajności wytwarzania 48 mg/l (Tabela 1).
Co ciekawe, połączenie SEA/E-65 z większą liczbą wariantów takich, jak SEA/E-63 i zmodyfikowany SEA/E-74, jak w przypadku SEA/E-91, powodowało odwrócenie niskiego poziomu wytwarzania do 12 mg/l (Tabela 1). Z drugiej strony wariant superantygenu SEA/E-110 wykazywał poziom ekspresji odpowiednio 0,5 mg/l i 14 mg/l. Poziom wytwarzania SEA/E-100 wzrósł jednak do 30 mg/l po usunięciu podstawień Asp174Ala, His87Ala, Ser188Thr, Ser189Asp, Glu190Ala i Gln204Thr, co stworzyło SEA/E-120 (Tabela 1).
Wprowadzen ie znacznej liczby podstawień do superantygenu może doprowadzić do problemów z wyrażaniem w E. coli.
Tłumaczą to co najmniej trzy mechanizmy: obniżona termodynamika, zniszczony naturalny szlak fałdowania lub nowo wprowadzone miejsca proteolityczne. Mimo, że celem tego badania było usunięcie epitopów antygenowych na powierzchni, co najprawdopodobniej nie wpływałoby na jakikolwiek główny szkielet strukturalny, istniała zawsze możliwość, że nowe struktury zależne były od innych reszt niż konstrukt typu dzikiego przy utrzymywaniu stabilności. Zatem, tworzono stale nowe modele komputerowe w celu przewidzenia lub potwierdzenia położenia podstawionych reszt w obrębie nowej struktury. W ten sposób mogliśmy zidentyfikować odpowiedzialne aminokwasy we wczesnych wariantach superantygenów powodujące problemy z, na przykład, poziomami ekspresji i uzyskać ulepszone warianty albo z aminokwasami dzikimi, albo z lepszymi podstawieniami (Tabela 1).
W podsumowaniu, dla uzyskania lepszego poziomu wytwarzania, następujące aminokwasy: Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 i Asp227 powinny być podstawione seryną, nie alaniną. Ponadto, dla uniknięcia zmniejszenia poziomów wytwarzania aminokwasy Lys35, Asp173, His187, Ser188, Ser189, Glu190 i Gln204 powinny być zachowane.
P r z y k ł a d 10
Ocena funkcji biologicznej w różnych wariantach Sac
Ponieważ superantygeny zaprojektowano zasadniczo dla terapii nowotworów (Dohlsten i wsp., 1994), istotnym było uniknięcie zastąpień zmniejszających skierowaną przeciwko nowotworom cytotoksyczność w nowych wariantach superantygenów. Zdolność do pośredniczenia w tej skierowanej przeciwko nowotworom cytotoksyczności została zatem zmierzona dla wszystkich nowych wariantów superantygenów w oznaczeniu SADCC (Fig. 3). Dodatkowo, skuteczne pośredniczenie superantygenów w zabijaniu przez limfocyty T komórek wyrażających MHC klasy II powoduje ogólnoustrojową cytotoksyczność, która mogłaby wywołać skutki uboczne mierzone w oznaczeniu SDCC (Fig. 3). Dla zastosowania klinicznego SDCC najprawdopodobniej powinna być niska, aby zwiększyć okno terapeutyczne.
Większość z wstępnego zestawu wariantów SAg wykazywała ten sam poziom swoistej wobec nowotworu siły działania co SEA/E-18 (Tabela 1). Wyjątkami były SEA/E-75 z zastąpieniami Lys74Thr, Asp75Ala i Asn78Ser z siłą zmniejszoną dziesięciokrotnie, oraz SEA/E-64, z zastąpieniami
PL 216 516 B1
Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu i Glu42Lys, z siłą obniżoną pięciokrotnie w porównaniu z SEA/E-18 (Tabela 1). Co ciekawe, zmniejszoną aktywność SEA/E-75 obserwowano jedynie w tym wariancie, w kombinacjach z dalszymi podstawieniami, na przykład w SEA/E-109, wykrywano pełną aktywność (Tabela 1). Dodatkowo, aktywność SDCC w SEA/E-75 była niezmieniona w porównaniu z SEA/E-18. Podstawienia Lys74Thr, Asp75Ala i Asn78Ser prawdopodobnie zaburzają zatem oddziaływania ważne dla samej zależnej od przeciwciał cytotoksyczności.
Większość opisanych tu wariantów superantygenów wykazała wyraźne zmniejszenie SDCC. Niewielkie zmniejszenie SDCC zaobserwowano dla wstępnych wariantów SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 i SEA/E-74 w porównaniu z SEA/E-18.
Wszystkie warianty superantygenów zawierały podstawiony aminokwas Asp227Ala lub Ser. Wiadomo było, że podstawienie to zmniejsza powinowactwo do MHC klasy II stukrotnie i tym samym obniża aktywność SDCC (Abrahmsen i wsp., 1995). Skoro jednak wariant SAg SEA/E-109, z podstawieniami N-końca, wykazał większe zmniejszenie w porównaniu z SEA/E-18 niż SEA/E-113 z podstawieniami C-końca, sugeruje to, że w SEA/E-109 zmieniono dodatkowe aminokwasy istotne dla SDCC i najprawdopodobniej wiążące się z MHC klasy II (Fig. 8).
Aminokwasami, które spowodowały największe zmniejszenie były zatem Lys79Ser i Lys81Ser w SEA/E-83 i podstawienie Asp45Ala w SEA/E-74. Większość z tych podstawień jest zlokalizowana wokół aminokwasów, dla których wcześniej wykazano, że oddziałują one z MHC klasy II (Abrahmsen i wsp., 1995).
P r z y k ł a d 11
Projektowanie nowego wariantu superantygenu
W celu zaprojektowania optymalnego wariantu superantygenu połączono wszystkie korzystne podstawienia dając najkorzystniejszy SEA/E-120 (Fig. 4 i Fig. 9).
Po pierwsze zebrano wszystkie korzystne modyfikacje na C-końcu, tj. aminokwasy Asp173Ala, Ser189Thr, Glu190Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, Glu222Thr, Asn223Ser, His225Ser i Asp227Ser wraz z Gln204Thr, tworząc wariant SAg SEA/E-113. Wariant ten wykazywał oczekiwane zmniejszenie reaktywności anty-SEA i dopuszczalne poziomy ekspresji lecz nieco obniżoną aktywność biologiczną (Tabela 1, Fig. 7 i Fig. 8A i Fig. 8B). Wszystkie korzystne podstawienia na N-końcu, tj. aminokwasy Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49T, Lys74T, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser i Lys84Ser złożono w SEA/E-109. Dla tego wariantu zaobserwowano wyraźne zmniejszenie reaktywności anty-SEA wraz z wysokim poziomem ekspresji i nawet poprawionym profilem biologicznym (Tabela 1, Fig. 7 i Fig. 8A i Fig. 8B). Gdy jednak stworzono kombinacje tych dwóch wariantów SEA/E-113 i SEA/E-109 w SEA/E-110 nastąpił dramatyczny spadek zarówno wydajności jak i funkcji biologicznej (Tabela 1). Biologiczną siłę działania odzyskano w pełni po ponownym użyciu aminokwasów typu dzikiego w pozycjach Ser189, Glu190 i Gln204 w SEA/E-115 (Tabela 1), lecz poziom wytwarzania był wciąż niski. Modelowanie molekularne tego wariantu sugerowało, że aminokwasy Asp173m, His187 i Ser188 mogły być istotne dla stabilizacji fałdowania i w efekcie spowodować wzrost wydajności.
W celu zbadania tych aminokwasów stworzono kilka różnych kombinacji, uzyskując SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 i SEA/E-122 (Tabela 1). Najlepsze wytwarzanie uzyskano dla SEA/E-120 z aminokwasami typu dzikiego we wszystkich tych pozycjach. Wraz z uzyskanymi wcześniej SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 i SEA/E-109 były to jedyne warianty SAg osiągające poziom ekspresji powyżej 20 mg/l (Tabela 1). Nie zaobserwowano między tymi wariantami istotnych różnic pod względem aktywności biologicznej lub reaktywności wobec przeciwciał.
Projektowanie nowego koniugatu
SEA/E-120 sfuzowano genetycznie z częścią Fab reagującego z nowotworami przeciwciała, jakim jest 5T4 (Dohlsten i wsp., 1994) (Fig. 10).
Antygen dla 5T4 wyrażany jest na szeregu różnych nowotworów, takich jak niedrobnokomórkowy rak płuca, rak sutka, gruczolakorak nerki, rak trzustki, rak jajnika i rak okrężnicy. Zostały także wprowadzone podstawienia w sekwencji 5T4 typu dzikiego dla uzyskania wyższych wydajności. W łańcuchu ciężkim: His41Pro, Ser44Gly, Ile69Thr i Val113Gly oraz w łańcuchu lekkim Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val i Leu83Ala.
Chociaż niniejszy wynalazek i płynące z niego korzyści opisano szczegółowo, powinno być zrozumiałe, że różne zmiany podstawienia i zamiany mogą być w nim dokonane bez odejścia od ducha i zakresu wynalazku określonych przez dołączone zastrzeżenia. Ponadto, zakres niniejszego wniosku nie ma być ograniczony do konkretnych wykonań procesu, urządzenia, wytwarzania, składu materii,
PL 216 516 B1 środków, sposobów i etapów opisanych w wyszczególnieniu. Jak specjalista w tej dziedzinie z łatwością zauważy na podstawie opisu niniejszego wynalazku, procesy, urządzenia, wytwarzanie, składy materii, środki, sposoby i etapy istniejące obecnie lub opracowane w przyszłości spełniające zasadniczo tę samą funkcję lub osiągające zasadniczo ten sam efekt jak odpowiednie wykonania tu opisane mogą być wykorzystane według niniejszego wynalazku. Odpowiednio, dołączone zastrzeżenia mają obejmować swym zakresem takie procesy, urządzenia, wytwarzanie, składy materii, środki, sposoby czy etapy.
Specjalista z łatwością zauważy, że niniejszy wynalazek jest dobrze przystosowany do przeprowadzenia zadań i uzyskania efektów i korzyści wspomnianych i nierozłącznie z nim związanych. Kompozycje, sposoby, procedury i techniki tu opisane są obecnie reprezentatywne dla korzystnych wykonań i mają służyć przykładem i nie mają na celu ograniczenia zakresu. Specjalistom nasuną się zmiany w nich i inne zastosowania, które są objęte duchem wynalazku lub określone przez zakres załączonych zastrzeżeń.
CYTOWANA LITERATURA
Wszystkie patenty i publikacje wzmiankowane w opisie wskazują na poziom tych specjalistów, do których odnosi się wynalazek. Wszystkie patenty i publikacje są tu włączone przez odniesienie w tym samym stopniu, jak gdyby każda pojedyncza publikacja była konkretnie i indywidualnie wskazana jako włączona przez odniesienie.
Patent USA 4,554,101
Patent USA 5,221,605
Patent USA 5,238,808
Patent USA 5,798,208
Patent USA 5,830,650
Patent USA 5,220,007
Patent USA 5,284,760
Patent USA 5,354,670
Patent USA 5,366,878
Patent USA 5,389,514
Patent USA 5,635,377
Patent USA 5,789,166
Patent USA 5,446,128
Patent USA 5,710,245
Patent USA 5,840,833
Patent USA 5,859,184
Patent USA 5,440,013
Patent USA 5,618,914
Patent USA 5,670,155
Patent USA 5,475,085
Patent USA 5,929,237
Patent USA 5,672,681
Patent USA 5,674,976
Patent USA 4,608,251
Patent USA 4,601,903
Patent USA 4,599,231
Patent USA 4,599,230
Patent USA 4,596,792
Patent USA 4,578,770
Abrahmsen L., i wsp. EMBO J. 14: 2978-86, 1995.
Alpaugh R. K., i wsp. Clin Cancer Res. 4: 1903-14, 1998.
Antonsson P., i wsp. J Immunol 158: 4245-51, 1997.
Bangham i wsp., J. Mol. Biol., 13: 238-252, 1965.
Bird i wsp., Science. 242: 423-6, 1988.
Braised i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 93 (12): 5688-92 1996.
Burks i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 94 (2): 412-7, 1997.
Capaldi i wsp., Biochem. Biophys.Res. Comm., 76: 425, 1977.
PL 216 516 B1
Cavallin A., i wsp. J Biol Chem. 275: 1665-72, 2000.
Cunningham i wsp., Science. 244 (4908): 1081-5, 1989.
Davis i wsp., Basic Methods in Molecular Biology, 1986
Dohlsten M., i wsp. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91: 8945-9 1994.
DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis red. (1979) pp.287-341. Hakansson, M. i wsp. J Mol Biol. 302: 527-37, 2000.
Harlow, i wsp. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988.
Johannesson i wsp., J. Med. Chem. 42: 601-608, 1999.
Kaneda i wsp., J Biol Chem., 264 (21): 12126-12129, 1989.
Kato i wsp., J Biol Chem., 266 (6): 3361-3364, 1991.
Nicolau i wsp., Methods Enzymol., 149: 157-176, 1987.
Papageorgiou A. C. i wsp. Trends in Microbiology 8 369375, 2000.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition,
Chapter 61, pages 1035-1038 and 1570-1580.
Sambrook et.al., In: Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d Ed., 1989.
Schad E. M., i wsp. EMBO J. 14: 3292-3301, 1995.
Short i wsp., J Biol Chem. 270 (48): 28541-50, 1995.
Sundstrom M, i wsp. EMBO J. 15: 6832-40, 1996 A.
Sundstrom M., i wsp. J Diol Chem 271: 32212-16, 1996 B.
Szoka and Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 4194-4198, 1978.
Vita i wsp., Biopolymers 47: 93-100, 1998.
Warren i wsp., Biochemistry 35 (27): 8855-62, 1996.
Weisshoff i wsp., Eur. J. Biochem. 259: 776-788, 1999.
Wells i wsp., Methods. 10(1): 126-34, 1996.
Wong i wsp., Gene, 10: 87-94, 1980.
Yelton i wsp., J Immunol. 155 (4): 1994-2004, 1995.
PL 216 516 B1
LISTA SEKWENCJI <110> FORSBERG, GORAN ERLANDSSON, EVA ANTONSSON, PER WALSE, B3ORN <120> N0WY UZYSKANY METODAMI INŻYNIERII GENETYCZNEJ SUPERANTYGEN DLA TERAPII U LUDZI <130> P02188US0;10104199 <140> TBA <141> 2001-06-20 <160> 7 <170> Patent w wersji 3.0 <210> 1 <211> 672 <212> PR.T <213> sztuczna sekwencja <220>
<221> PEPTYD <222> (1)..(672) <223> Koniugat białkowy <400> 1
Glu 1 val Gin Leu Gl n 5 Gin ser Gly Pro ASP 10 Leu val Lys pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys ile Ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gin Lys phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Gltl Asp Ser Ala Val Tyr Tyr cys
85 90 95
PL 216 516 B1
Ala Arg Ser Thr Met 100 Ile Val Thr Asn Tyr 105 val Met Asp Tyr Trp 110 Gly Ser Gin Val
Gly Thr ser val Thr 115 ser Ser 120 Ala Lys Thr Thr Pro 125 Pro
Tyr Pro Leu Ala pro Gly ser Ala Ala Gin Thr Asn ser Met val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn ser Gly ser Leu Ser ser Gly Val His Thr phe Pro Ala val
165 170 175
Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr cys Asn val Ala His Pro Ala
195 200 205
ser ser 210 Thr Lys Val Asp Lys 215 Lys Ile Val Pro Arg 220 Asp ser Gly Gly
pro ser Glu Lys ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys
225 230 235 240
ser Glu Leu Gin Gly 245 Thr Ala Leu Gly Asn 250 Leu Lys Gin Ile Tyr 255 Tyr
Tyr Asn Ser Lys Ala Ile Thr ser Ser Glu Lys ser Ala Asp Gin Phe
260 265 270
Leu Thr Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp
275 280 285
Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly ser Thr Ala Ala Thr ser Glu
290 295 300
Tyr Glu Gly Ser Ser Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gin
305 310 315 320
cys Ala Gly Gly Thr 325 Pro Asn Lys Thr Ala 330 cys Met Tyr Gly Gly 335 Val
Thr Leu His ASp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys val Pro Ile
340 345 350
Asn Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gin Thr Thr val pro Ile Asp Lys val
355 360 365
Lys Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala
370 375 380
Arg His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn ser Asp ser Phe
385 390 395 400
Gly Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu ile Val Phe His Ser ser Glu Gly
405 410 415
Ser Thr Val Ser Tyr ASp Leu Phe Asp Ala Gin Gly Gin Tyr Pro Asp
420 425 430
Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr ile Ser Ser Thr Ser
435 440 445
Leu Ser Ile ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr Ser ile Val Met Thr Gin
450 455 460
PL 216 516 B1
Thr 465 pro Thr ser Leu Leu val 470 ser Ala Gly Asp 475 Arg Val Thr Ile Thr 480
cys Lys Ala ser Gin ser Val Ser Asn Asp val Ala Trp Tyr Gin Gin
485 490 495
Lys Pro Gly Gin 500 ser Pro Lys Leu Leu 505 Ile ser Tyr Thr Ser 510 Ser Arg
Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Tyr Gly Thr ASp
515 520 525
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser val Gin Ala GlU Asp Ala Ala val Tyr
530 535 540
phe Cys Gin Gin Asp Tyr Asn ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
545 550 555 560
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe
565 570 575
Pro pro ser Ser Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala ser Val Val cys
580 585 590
Phe Leu Asn 595 Asn phe Tyr Pro Lys 600 Asp Ile Asn val Lys 605 Trp Lys ile
Asp Gly 610 Ser Glu Arg Gin Asn 615 Gly val Leu Asn Ser 620 Trp Thr Asp Gin
Asp ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
625 630 635 640
Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr cys Glu Ala Thr His
645 650 655
Lys Thr ser Thr Ser pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu ser
660 665 670
<210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<221> Peptyd <222> (1) .. C233)<223> Białko chimeryczne <400> 2
ser Glu Lys ser Glu Glu ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Leu Gin Gly 20 Thr Ala Leu Gly Asn 25 Leu Lys Gin ile Tyr 30 Tyr Tyr
Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ser Ser Glu Lys Ser Al a Asp Gin Phe Leu
35 40 45
PL 216 516 B1
Thr Asn 50 Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr
55 60
Asn ASp Leu Leu val Asp Leu Gly ser Thr Ala Ala Thr Ser Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Gly ser Ser val 85 Asp Leu Tyr Gly Ala 90 Tyr Tyr Gly Tyr Gin 95 cys
Ala Gly Gly Thr 100 Pro ASH Lys Thr Ala 105 cys Met Tyr Gly Gly 110 val Thr
Leu Hi s ASD Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys val Pro Ile Asn
115 120 125
Leu Trp 130 Ile ASp Gly Lys Gin 135 Thr Thr val Pro Ile 140 Asp Lys Val Lys
Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Ara 160
145 150 155
His Tyr Leu His £iy Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly
165 170 175
Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu ile val Phe His Ser Ser Glu Gly ser
180 185 190
Thr val Ser Tyr Asp Leu Phe ASP Ala Gin Gly Gin Tyr Pro Asp Thr
195 200 205
Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr ile ser Ser Thr ser Leu
210 215 220
Ser Ile Ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr
225 230
<210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>
<221> Peptyd <222> (1)..(233) <223> Białko chimeryczne <400> 3
ser Glu Lys Ser Glu Glu ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin Ile Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gin Phe Leu
35 40 45
PL 216 516 B1
Glu Asn 50 Thr Leu Leu Phe Gly Phe Phe Thr Gly 60 His pro Trp Tyr
AS Π 65 Asp Leu Leu Val Asp 70 Leu Gly Ser Lys Asp 75 Ala Thr Asn Lys Tyr 80
Lys Gly Lys Lys Val 85 Asp Leu Tyr Gly Ala 90 Tyr Tyr Gly Tyr Gin 95 cys
Ala Gly Gly Thr 100 pro Asn Lys Thr Ala 105 cys Met Tyr Gly Gly 110 val Thr
Leu His Asp 115 Asn Asn Arg Leu Thr 120 Glu Glu Lys Lys Val 125 Pro Ile Asn
Leu Trp 130 Ile Asp Gly Lys Gin 135 Thr Thr val Pro Ile 140 Asp Lys Val Lys
Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gin Glu Leu Asp Leu Gin Ala Arg
145 150 155 160
His Tyr Leu Hi s Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn ser Asp Ser Phe Gly
165 170 175
Gly Lys Val Gl n Arg Gly Leu Ile val Phe His ser Ser Glu Gly ser
180 185 190
Thr val Ser 195 Tyr Asp Leu Phe Asp 200 Ala Gin Gly Gin Tyr 205 Pro Asp Thr
Leu Leu Arg ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr ile Asn Ser Glu Asn Leu
210 215 220
Hi s ile Ala Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr
225 230
<210> 4
<211> 233
<212> PRT
<213> Staphylococcus sp.
<400> 4
Ser Glu Lys ser Glu Glu ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys ser
15 10 15
Glu Leu Gin Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gin Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30
Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu ser His Asp Gin Phe Leu
35 40 45
Gin His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His ser Trp Tyr 50 55 60
Asn Asp Leu Leu val Asp Phe Asp ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Gly Lys Lys val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gin cys
85 90 95
PL 216 516 B1
Ala Gly Gly Thr pro Asn 100 Asn Asn Arg Lys Thr Ala cys Met Tyr Gly 105 Gly val Thr 110 Pro ile Asn
Leu His li? Leu Leu Gin 135 Thr Glu Glu Lys 120 Lys val 125
Leu I5S Asp Gly Lys Asn Thr val pro Leu 140 Glu Thr Val Lys
Thr 145 Asn tys Lys Asn val 150 Thr Val Gin Glu Leu 155 ASP Leu Gin Ala Arg 160
Arg Tyr Leu Gin Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn ser Asp val Phe ASp
165 170 175
Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu Ile val Phe His Thr ser Thr Glu Pro
180 185 190
ser Val Asn 195 Tyr Asp Leu Phe Gly Ala 200 Gin Gly Gin Tyr 205 Ser Asn Thr
Leu Leu 210 Arg Ile Tyr Arg Asp 215 Asn Lys Thr ile Asn 220 Ser Glu Asn Met
His 225 Ile Asp ile Tyr Leu 230 Tyr Thr Ser
<210> 5
<211> ; 203
<212> 1 PRT
<213> 1 staphylococcus sp.
<400> . 5
Ala Leu His Lys Lys Ser Glu Leu ser Ser Thr Ala Leu Asn Asn Met
1 5 10 15
Lys His ser Tyr Ala Asp Ala Asn Pro Ile ile Gly Ala Asn Lys ser
20 25 30
Thr Gly Asp Gin Phe Leu Glu Asn Thr Leu Leu Tyr Lys Ala Phe Phe
35 40 45
Leu Leu ile Asn Phe Asn ser Ala Glu Met Ala Gin His Phe Lys ser
50 55 60
Lys Asn val Asp Va1 Tyr Ala ile Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Arg Thr
65 70 75 80
Ala cys Thr Tyr Gly Gly 85 Val Thr Pro Hi 5 90 Ala Gly Asn Ala Leu 95 Lys
Ala Arg Lys Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp ile Ile Gly Val Gin Lys
100 105 110
Glu val Ser Leu Asp Lys val Gin Thr Asp Lys Lys Asn Val Thr val
115 120 125
Gin Glu 130 Leu Asp Ala Gin Ala 135 Arg Arg Tyr Leu Gin 140 Lys Asp Leu Lys
Leu Tyr Asn Ala Ile Gin Arg Gly Lys Leu Glu Phe Asp Ser Ala Ala
145 150 155 160
PL 216 516 B1
Ala Ser Lys Val Ser 165 Tyr Asp Leu Phe Asp 170 Val Ala Gly Asp Phe 175 Pro
Glu Lys Gin Leu 180 Arg Ile Tyr ser ii? Asn Lys Thr Leu ser 190 Thr Glu
His Leu His Ile Asp ile Tyr Leu Tyr Glu Ala
195 200
<210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Staphylococcus sp <40Q> 6
Glu 1 Asp Leu His Asp Lys ser Glu Leu Thr Asp Leu Ala Leu Ala 15 Asn
5 10
Ala Tyr Gly Gin 20 Tyr Asn His Pro Phe 25 Ile Lys Glu Asn Ile 30 Lys Ser
Asp Glu Ile 35 ser Gly Glu Lys Asp 40 Leu ile Phe Arg Asn 45 Gin Gly ASp
ser Gly 50 Asn Asp Leu Arg val 55 Lys Phe Ala Thr Ala 60 Asp Leu Ala Gin
Lys Phe Lys Asn Lys Asn Val Asp ile Tyr Gly Ala ser phe Tyr Tyr
65 70 75 80
Lys Cys Glu Lys ile 85 Ser Glu Asn Ile Ser 90 Glu Cys Leu Tyr Gly 95 Gly
Thr Thp· Leu Asn- Ser Glu- Lys Leu Ala Gin Glu Arg Val Ile Gly Ala
100 105 110
Asn Val Trp Val Asp Gly ile Gin Lys Glu Thr Glu Leu Ile Arg Thr
115 120 125
Asn Lys 130 Lys Asn yal Thr Leu 135 Gin Glu Leu Asp Ile 140 Lys ile Arg Lys
Ile Leu ser Asp Lys Tyr Lys Ile Tyr Tyr Lys Asp ser Glu Ile Ser
145 150 155 160
Lys Gly Leu Ile Glu Phe Asp Met Lys Thr pro Arg Asp Tyr Ser Phe
165 170 175
Asp Ile Tyr Asp 180 Leu Lys Gly Glu Asn 185 Asp Tyr Glu ile Asp 190 Lys ile
Tyr Glu Asp Asn Lys Thr Leu Lys Ser ASp Asp ile Ser His Ile Asp
195 200 205
Val Asn Leu Tyr Thr Lys Lys Lys val 210 215 <210> 7
PL 216 516 B1 <211> 233 <212> PRT <213> Staphylococcus sp <400> 7
Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser
1 5 10 15
GlU Leu Gin Arg 20 Asn Ala Leu ser Asn 25 Leu Arg Gin Ile Tyr 30 Tyr Tyr
Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu ser Asp Asp Gin Phe Leu
35 40 45
Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr
50 55 60
Asn ASp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Gly Lys Lys Val 85 Asp Leu Tyr Gly Ala 90 Tyr Tyr Gly Tyr Gin 95 Cys
Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala cys Met Tyr Gly Gly val Thr
100 105 110
Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr GlU Glu Lys Lys val Pro ile Asn
115 120 125
Leu Trp 130 Ile ASp Gly Lys Gin 135 Thr Thr Val Pro Ile 140 Asp Lys val Lys
Thr 145 ser Lys Lys Glu Val 150 Thr val Gin Glu Leu 155 Asp Leu Gin Ala Arg 160
His Tyr Leu His & Lys Phe Gly Leu Tyr 170 Asn ser ASp Ser Phe 175 Gly
Gly Lys Val Gin Arg Gly Leu Ile Val Phe His ser ser Glu Gly Ser
180 185 190
Thr Val Ser 195 Tyr Asp Leu Phe Asp 200 Ala Gin Gly Gin Tyr 205 Pro Asp Thr
Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Gl u Asn Leu
210 215 220
His Ile ASp Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr
225 230
PL 216 516 B1

Claims (13)

1. Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, znamienny tym, że superantygen jest wariantem gronkowcowej enterotoksyny E (SEE), Sekw. Id. Nr: 7, w którym sekwencja aminokwasowa superantygenu obejmuje regiony A do E, przy czym region A jest w obrębie miejsca wiązania TCR i determinuje wiązanie z TCR, a regiony B do E determinują wiązanie z cząsteczkami MHC klasy II; i różni się od gronkowcowej enterotoksyny E tym, że obejmuje następujące podstawienia aminokwasowe, przy czym pozycje aminokwasowych podstawień odnoszą się do pozycji aminokwasowych w referencyjnej Sek. Id. Nr: 7;
(i) lizyna w pozycji 79 w regionie C została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym wariantem, lizyna w pozycji 81 w regionie C została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym wariantem, lizyna w pozycji 83 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej konserwatywnym wariantem, a lizyna w pozycji 84 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej konserwatywnym wariantem (ii) arginina w pozycji 20 w regionie A została zastąpiona glicyną lub jej konserwatywnym wariantem, asparagina w pozycji 21 w regionie A została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, aminokwas w pozycji 24 w regionie A został zastąpiony glicyną lub jej konserwatywnym wariantem, aminokwas w pozycji 27 w regionie A został zastąpiony lizyną lub jej konserwatywnym wariantem i ewentualnie zostały również zastąpione aminokwasy w pozycji 173 i/lub pozycji 204 w regionie A i, (iii) kwas asparaginowy w pozycji 227 w regionie E został zastąpiony seryną, alaniną lub ich konserwatywnym wariantem, i (iv) przy czym jedna lub więcej z następujących reszt aminokwasowych została/zostały tak zastąpiona(e), że •kwas glutaminowy pozycji 34 w regionie B został zastąpiony lizyną, seryną lub ich konserwatywnym fragmentem, •lizyna w pozycji 35 w regionie B została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym fragmentem, •kwas glutaminowy w pozycji 39 w regionie B został zastąpiony lizyną, seryną lub ich konserwatywnym fragmentem, •asparagina w pozycji 40 w regionie B została zastąpiona seryną, lub jej konserwatywnym fragmentem •lizyna w pozycji 41 w regionie B została zastąpiona kwasem glutaminowym lub jego konserwatywnym fragmentem, •kwas glutaminowy w pozycji 42 w regionie B został zastąpiony lizyną lub jej konserwatywnym fragmentem, •kwas asparaginowy w pozycji 44 w regionie B został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •kwas asparaginowy w pozycji 45 w regionie B został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •kwas glutaminowy w pozycji 49 w regionie B został zastąpiony treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •lizyna w pozycji 74 w regionie C została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •kwas asparaginowy w pozycji 75 w regionie C został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •asparagina w pozycji 78 w regionie C została zastąpiona seryną lub jej konserwatywnym fragmentem, •histydyna w pozycji 187 w regionie D została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnym wariantem, •seryna w pozycji 188 w regionie D została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym fragmentem, •seryna w pozycji 189 w regionie D została zastąpiona kwasem asparaginowym lub jego konserwatywnym fragmentem, •kwas glutaminowy w pozycji 190 w regionie D został zastąpiony alaniną lub jej konserwatywnym fragmentem,
PL 216 516 B1 •lizyna w pozycji 217 w regionie E została zastąpiona treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, •asparagina w pozycji 220 w regionie E została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnym wariantem, •kwas glutaminowy w pozycji 222 w regionie E został zastąpiony treoniną lub jej konserwatywnym wariantem, •asparagina w pozycji 223 w regionie E została zastąpiona alaniną lub seryną lub ich konserwatywnym wariantem, i/lub •histydyna w pozycji 225 w regionie E została zastąpiona alaniną, seryną lub ich konserwatywnym wariantem tak, że podstawiony superantygen ma zmniejszoną seroreaktywność w porównaniu z seroreaktywnością gronkowcowej enterotoksyny mającej sekwencję aminokwasową z SEK.ID. Nr: 7.
i przy czym częścią stanowiącą przeciwciało jest fragment Fab.
2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że superantygen ma sekwencję aminokwasową opisaną w SEKW. NR ID.: 2 (SEA/E-120).
3. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że podstawieniem w pozycji aminokwasowej 227 jest alanina.
4. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że podstawieniem w pozycji aminokwasowej 227 jest seryna.
5. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że częścią stanowiącą przeciwciało jest C215Fab.
6. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że częścią stanowiącą przeciwciało jest 5T4Fab.
7. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 1.
8. Koniugat według zastrz. 1-7 do zastosowania w leczeniu raka.
9. Koniugat według zastrz. 8, znamienny tym, że rak wybrany jest z grupy obejmującej raka płuca, sutka, okrężnicy, nerki, trzustki, jajnika, żołądka, szyjki macicy i gruczołu krokowego.
10. Koniugat według zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że rakiem jest rak płuc.
11. Zastosowanie koniugatu określonego w zastrz. 1-7 do wytwarzania leku do leczenia raka.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do podawania dożylnego.
13. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca czynnik aktywny i jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu określonego w dowolnym z zastrz. 1-7.
PL368048A 2001-06-28 2002-06-19 Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna PL216516B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0102327A SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 A novel engineered superantigen for human therapy
PCT/SE2002/001188 WO2003002143A1 (en) 2001-06-28 2002-06-19 A novel engineered superantigen for human therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL368048A1 PL368048A1 (pl) 2005-03-21
PL216516B1 true PL216516B1 (pl) 2014-04-30

Family

ID=20284677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL368048A PL216516B1 (pl) 2001-06-28 2002-06-19 Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna

Country Status (28)

Country Link
US (3) US7125554B2 (pl)
EP (1) EP1406657B1 (pl)
JP (1) JP4523773B2 (pl)
KR (1) KR100961054B1 (pl)
CN (1) CN1522156B (pl)
BG (1) BG66321B1 (pl)
BR (1) BRPI0210568B8 (pl)
CA (1) CA2451847C (pl)
CZ (1) CZ307180B6 (pl)
DK (1) DK1406657T3 (pl)
EE (1) EE05475B1 (pl)
ES (1) ES2564041T3 (pl)
HK (1) HK1067980A1 (pl)
HR (1) HRP20031054B1 (pl)
HU (1) HUP0400313A3 (pl)
IL (2) IL159562A0 (pl)
IS (1) IS2986B (pl)
MX (1) MXPA03011761A (pl)
NO (1) NO333676B1 (pl)
NZ (1) NZ529827A (pl)
PL (1) PL216516B1 (pl)
RS (1) RS52581B (pl)
RU (1) RU2307837C2 (pl)
SE (1) SE0102327D0 (pl)
SK (1) SK16112003A3 (pl)
UA (1) UA85993C2 (pl)
WO (1) WO2003002143A1 (pl)
ZA (1) ZA200309150B (pl)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
EP0998305B1 (en) * 1997-07-21 2007-05-02 Active Biotech AB Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation
US7491402B2 (en) * 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
US20040214783A1 (en) * 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
MXPA05001933A (es) * 2002-08-19 2005-04-28 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
US8226958B2 (en) * 2003-03-28 2012-07-24 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Modified SEB and prophylactics/remedies for immunopathy containing the same
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
EP1812574A2 (en) * 2004-11-18 2007-08-01 Avidex Limited Soluble bifunctional proteins
GB0427585D0 (en) * 2004-12-16 2005-01-19 Avidex Ltd Assay
CA2676143A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
GB0822836D0 (en) * 2008-12-15 2009-01-21 Oxford Biomedica Ltd Method
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
MX2014003313A (es) 2011-09-23 2014-07-09 Amgen Res Munich Gmbh Moleculas de union biespecificas para 5t4 y cd3.
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN102516392B (zh) * 2011-11-25 2014-05-28 孙嘉琳 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
CN103965302B (zh) * 2013-01-29 2019-05-28 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 一种重组超抗原seb突变体，其制备方法及应用
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
KR20180100412A (ko) 2016-01-10 2018-09-10 네오티엑스 테라퓨틱스 엘티디. 면역강화제에 의해 증진되는 초항원 매개된 암 면역요법
EP3658181A4 (en) 2017-07-27 2021-06-16 Integrated Biotherapeutic Vaccines, Inc. IMMUNOGENIC COMPOSITION CONSISTING OF A FUSION PEPTIDE DERIVED FROM SUPERANTIGEN TOXOIDS
AU2020275142A1 (en) 2019-05-15 2021-12-16 Neotx Therapeutics Ltd. Cancer treatment
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
KR20230091911A (ko) * 2020-09-28 2023-06-23 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스 LukA 및 LukB 폴리펩티드 및 백신 조성물
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US5221605A (en) 1984-10-31 1993-06-22 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5238808A (en) 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US4608251A (en) 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5284760A (en) 1989-04-03 1994-02-08 Feinstone Stephen M Techniques for producing site-directed mutagenesis of cloned DNA
US6042837A (en) * 1989-09-20 2000-03-28 Kalland; Terje Methods of staphylococcal enterotoxin directed cell-mediated cytotoxicity (SDCC)
US5728388A (en) * 1989-10-03 1998-03-17 Terman; David S. Method of cancer treatment
US6126945A (en) * 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
CA2078003C (en) 1990-01-17 2006-11-21 David S. Terman Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
EP0527809B1 (en) 1990-04-05 1995-08-16 CREA, Roberto Walk-through mutagenesis
US6197299B1 (en) * 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
US5858363A (en) * 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US5475085A (en) 1991-02-07 1995-12-12 Molecumetics, Ltd. Conformationally restricted mimetics of beta turns and beta bulges and peptides containing the same
JPH06505486A (ja) 1991-02-07 1994-06-23 モレキュメティクス，リミティド βターンおよびβバルジのコンフォメーション的に制限された模倣物およびそれらを含有するペプチド
CA2126438C (en) 1991-12-24 2003-12-02 Jac A. Nickoloff Site-directed mutagenesis of dna
US5389514A (en) 1992-08-28 1995-02-14 Fox Chase Cancer Center Method for specifically altering the nucleotide sequence of RNA
US5545716A (en) * 1992-09-08 1996-08-13 University Of Florida Superantigen agonist and antagonist peptides
US5446128A (en) 1993-06-18 1995-08-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Alpha-helix mimetics and methods relating thereto
US5519114A (en) * 1993-10-29 1996-05-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Retroviral superantigens, superantigen peptides, and methods of use
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
US5935568A (en) 1995-05-18 1999-08-10 National Jewish Medical & Research Center Gene therapy for effector cell regulation
DK0832241T3 (da) * 1995-06-07 2005-08-01 Univ Minnesota Streptokoktoksin A-mutanter og anvendelsesfremgangsmåder
US5840833A (en) 1995-10-27 1998-11-24 Molecumetics, Ltd Alpha-helix mimetics and methods relating thereto
US5929237A (en) 1995-10-27 1999-07-27 Molecumetics Ltd. Reverse-turn mimetics and methods relating thereto
US5789166A (en) 1995-12-08 1998-08-04 Stratagene Circular site-directed mutagenesis
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
US6244030B1 (en) 1996-03-27 2001-06-12 Zellweger Luwa Ag Process and device for monitoring the quality of yarns
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
AU2429397A (en) * 1996-03-29 1997-10-22 David S. Terman Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases
CN1211487C (zh) * 1996-12-06 2005-07-20 明尼苏达大学董事会 链球菌毒素a突变体及其使用方法
BR9713679A (pt) * 1996-12-06 2001-07-17 Univ Minnesota Mutantes de toxina c de estreptococo e métodos de uso
US6774218B2 (en) * 1996-12-06 2004-08-10 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin C and methods of use
WO1998026747A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
IL119938A (en) * 1996-12-30 2005-08-31 Yissum Res Dev Co Peptides capable of eliciting protective immunity against toxic shock induced by pyrogenic exotoxins or of antagonizing toxin-mediated activation of t cells
US6713284B2 (en) * 1997-06-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial superantigen vaccines
US7087235B2 (en) * 1997-06-25 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fusion protein of streptococcal pyrogenic exotoxins
EP0998305B1 (en) 1997-07-21 2007-05-02 Active Biotech AB Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation
WO1999036433A2 (en) * 1998-01-14 1999-07-22 Morphogenesis, Inc. Materials and methods for treating oncological disease
CA2337966A1 (en) * 1998-07-10 2000-01-20 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Vaccine against staphylococcus intoxication
US20050112141A1 (en) * 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20020177551A1 (en) * 2000-05-31 2002-11-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20040214783A1 (en) * 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
SE9903895D0 (sv) 1999-10-28 1999-10-28 Active Biotech Ab Novel compounds
JP2003515323A (ja) 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
US20030157113A1 (en) * 1999-12-28 2003-08-21 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20010046501A1 (en) * 2000-03-14 2001-11-29 Johnson Howard M. Superantigen enhancement of specific immune responses
JP4283430B2 (ja) * 2000-09-26 2009-06-24 株式会社カネカ エンテロトキシンの吸着材、吸着除去方法および吸着器
ATE442856T1 (de) * 2000-12-04 2009-10-15 Auckland Uniservices Ltd Immunmodulatorische konstruktionen und ihre verwendung
CN1369550A (zh) * 2001-02-16 2002-09-18 沈阳协合集团有限公司 一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
JP2005535351A (ja) * 2002-08-21 2005-11-24 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング ブドウ球菌エンテロトキシンｂのｔ細胞エピトープ
WO2006004620A2 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Terman David S Enterotoxin gene cluster (egc) superantigens to treat malignant disease
US20060005711A1 (en) 2004-07-07 2006-01-12 Andrew Olefson Replaceable filter for a vehicle air conditioning system adapted to scent air
SE0402025D0 (sv) 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20070280905A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Shulin Li Prognosis and Systemic Therapy for Treating Malignancy

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040015264A (ko) 2004-02-18
UA85993C2 (ru) 2009-03-25
EE200400037A (et) 2004-04-15
CZ307180B6 (cs) 2018-02-28
CA2451847A1 (en) 2003-01-09
IL159562A (en) 2010-12-30
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28
EP1406657A1 (en) 2004-04-14
US20100111978A1 (en) 2010-05-06
ZA200309150B (en) 2005-01-26
HRP20031054B1 (hr) 2016-12-30
WO2003002143A1 (en) 2003-01-09
RS52581B (en) 2013-04-30
JP4523773B2 (ja) 2010-08-11
US7615225B2 (en) 2009-11-10
SK16112003A3 (en) 2004-11-03
BG66321B1 (bg) 2013-05-31
BRPI0210568B8 (pt) 2021-05-25
BR0210568A (pt) 2004-08-03
CN1522156A (zh) 2004-08-18
CN1522156B (zh) 2012-10-10
RU2307837C2 (ru) 2007-10-10
BG108499A (en) 2005-03-31
IS7083A (is) 2003-12-18
IL159562A0 (en) 2004-06-01
EP1406657B1 (en) 2015-12-30
IS2986B (is) 2017-09-15
CA2451847C (en) 2012-10-16
US20070082001A1 (en) 2007-04-12
PL368048A1 (pl) 2005-03-21
JP2005503362A (ja) 2005-02-03
EE05475B1 (et) 2011-10-17
NO20035773L (no) 2004-02-27
NO333676B1 (no) 2013-08-05
HUP0400313A2 (hu) 2004-09-28
BRPI0210568B1 (pt) 2020-10-13
CZ20033559A3 (en) 2004-06-16
HRP20031054A2 (en) 2004-04-30
DK1406657T3 (en) 2016-03-07
HK1067980A1 (en) 2005-04-22
US7125554B2 (en) 2006-10-24
NZ529827A (en) 2005-06-24
KR100961054B1 (ko) 2010-06-01
YU101503A (en) 2006-05-25
ES2564041T3 (es) 2016-03-17
HUP0400313A3 (en) 2006-02-28
MXPA03011761A (es) 2004-04-02
RU2004102199A (ru) 2005-05-20
US20030039655A1 (en) 2003-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL216516B1 (pl) Koniugat obejmujący superantygen bakteryjny i część stanowiącą przeciwciało, zastosowanie tego koniugatu i kompozycja farmaceutyczna
JP5795765B2 (ja) 低減した免疫原性を有する改良型シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ
JP2021531013A (ja) Ｉｌ２アゴニスト
US6238667B1 (en) Method of affinity cross-linking biologically active immunogenic peptides to antibodies
JP2001504334A (ja) プロテアーゼ活性化可能なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様プロタンパク質
JP2002502363A (ja) 改変／キメラスーパー抗原およびその使用
KR20140033391A (ko) 면역원성이 보다 낮은 t 세포 및/또는 b 세포 에피토프를 갖는 슈도모나스 외독소 a
US20210251899A1 (en) Polymersomes comprising a soluble encapsulated antigen as well as methods of making and uses thereof
EP3601363B1 (en) Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies
WO2013090293A1 (en) Methods and compositions for cancer therapy using mutant light molecules with increased affinity to receptors
AU2022201940A1 (en) Vaccination with MICA/B alpha 3 domain for the treatment of cancer
CA2360382C (en) Use of antibodies for the vaccination against cancer
WO2019120063A1 (zh) 低pH插入肽及其组合物
AU2002315979B2 (en) A novel engineered superantigen for human therapy
CN114073775A (zh) 用于跨血脑屏障递送的组合治疗
AU2002315979A1 (en) A novel engineered superantigen for human therapy
JP2022546384A (ja) 免疫耐性エラスチン様組換ペプチドおよび使用方法
WO2022218957A1 (en) Polymersomes comprising a soluble encapsulated polynucleotide and an ionizable lipid as well as methods of making and uses thereof