KR20230091911A - 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스 LukA 및 LukB 폴리펩티드 및 백신 조성물 - Google Patents

변이체 스태필로코쿠스 아우레우스 LukA 및 LukB 폴리펩티드 및 백신 조성물 Download PDF

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브라이언 모로우
세르게이 콘스탄티노브
제로앤 게르트센
진큐안 루오
샌딥 소마니
피터 티. 버클리
빅터 제이. 토레스
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얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
뉴욕 유니버시티
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Abstract

본 개시는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A(LukA) 및 류코시딘 B(LukB) 변이체 폴리펩티드, 및 LukA, LukB 및 LukAB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이들 LukA 및 LukB 변이체를 포함하는 백신 조성물, 및 대상체에서 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다.

Description

변이체 스태필로코쿠스 아우레우스 LukA 및 LukB 폴리펩티드 및 백신 조성물
본 출원은 2020년 9월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/084,273호의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 개시는 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘(leukocidin) A(LukA) 및 류코시딘 B(LukB) 단백질 및 폴리펩티드, 이들 LukA 및 LukB 변이체를 포함하는 백신 조성물, 및 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 대상체 내 면역 반응을 유도하기 위한 상기 기술된 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)은 덜 심각한 피부 및 연조직 감염과 함께, 패혈증, 감염성 심내막염 및 독성 쇼크를 포함한, 광범위한 침습성 질환을 야기한다 (Tong 등, "Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management," Clin. Microbiol. Rev. 28(3):603-661 (2015)). 현재로서는, S. 아우레우스(S. aureus)와 싸우도록 승인된 백신이 없으며, 항생제 내성의 등장으로 치료 옵션이 더욱 제한되고 있다 (Sause 등, "Antibody-Based Biologics and Their Promise to Combat Staphylococcus aureus Infections," Trends Pharmacol. Sci. 37(3):231-241 (2016)). 다양한 임상 증후군을 유발하는 S. 아우레우스(S. aureus)의 능력은 종종 게놈 함량의 주된 변화와 연관이 있다 (Copin 등, "After the Deluge: Mining Staphylococcus aureus Genomic Data for Clinical Associations and Host-Pathogen Interactions," Curr. Opin. Microbiol. 41:43-50 (2018) 및 Recker 등, "Clonal Differences in Staphylococcus aureus Bacteraemia-Associated Mortality," Nat. Microbiol. 2(10):1381-1388 (2017)). 특히, 게놈의 대략 40%가 모든 S. 아우레우스(S. aureus) 분리주에 의해 공유되지 않으며(Bosi 등, "Comparative Genome-Scale Modelling of Staphylococcus aureus Strains Identifies Strain-Specific Metabolic Capabilities Linked to Pathogenicity," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(26):E3801-3809 (2016)), 이에 의해 백신 및 생물학적 제제의 생성을 위한 보존된 표적의 식별을 더욱 복잡하게 만든다.
본 개시는 당 기술분야에서 이들 및 다른 한계를 극복하는 것에 관한 것이다.
본 개시의 제1 측면은 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A(LukA) 단백질 또는 이의 폴리펩티드에 관한 것이다. 일 측면에서, LukA 변이체는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 서열번호 25의 LukA 단백질 또는 폴리펩티드의 변이체이다. 　
본 개시의 추가 측면은 전술한 것들에 대한 하나 이상의 추가 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는 LukA 변이체에 관한 것이다. 본 개시는 또한 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 전술한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B (LukB) 단백질 또는 이의 폴리펩티드에 관한 것이다. 일 측면에서, LukB 변이체는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 39의 LukB 단백질 또는 폴리펩티드의 변이체이다. 　
일 측면에서, LukB 변이체는 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 39의 LukB 단백질 또는 폴리펩티드의 변이체이다.
본 개시의 추가 측면은 전술한 것들에 대한 하나 이상의 추가 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 갖는 LukB 변이체에 관한 것이다. 본 개시는 또한 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 전술한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukB 폴리펩티드 또는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 작동 가능하게 결합된 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 변이체 폴리펩티드 를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 발현 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 변이체 폴리펩티드 및 본원에서 설명되는 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 다른 측면은 대상체에서 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 상기 면역 반응을 생성하기에 효과적인 조건 하에서 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다.
스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(S. 아우레우스(S. aureus))는 다수의 병원 및 지역사회 획득 감염에 대한 원인이 된다. 면역계에 의한 제거를 피하기 위해, S. 아우레우스(S. aureus)는 류코시딘으로 알려진 이성분 기공-형성 독소의 분비를 포함하여, 광범위한 전략을 사용한다. 각각의 류코시딘은 약 300개 아미노산 길이로 이루어진 2개의 폴리펩티드로 구성되며, 숙주 세포 표적화(S, 느린 경우, 그의 크로마토그래피 용리 프로파일에 기초함) 및 중합화(F, 빠른 경우) 서브유닛으로서 그룹화된다. 최대 5개의 류코시딘이 인간 S. 아우레우스(S. aureus) 분리주에 기술되어 있다: Panton-Valentine 류코시딘 (PVL, 또는 LukSF-PV), 감마-헤몰리신(gamma-hemolysins) (HlgAB 및 HlgCB), 류코시딘 ED (LukED) 및 류코시딘 AB (LukAB, LukGH로도 지칭됨). 류코시딘은 특이적 세포 표면 단백질 수용체에 결합하여 올리고머성 기공으로 조립되며, 이는 결국 신속한 삼투성 탈조절로 인한 세포 용해로 이어진다 (Spaan 등, "Leukocidins: Staphylococcal Bi-Component Pore-Forming Toxins find their Receptors" Nat. Rev. Microbiol. 15(7):435-447(2017)).
가장 최근에 확인된 류코시딘, LukAB (DuMont 등, "Characterization of a New Cytotoxin that Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis" Mol. Microbiol. 79(3):814-825 (2011))은, 다른 이성분 류코시딘과 구별되는 몇 가지 고유한 특징을 보유한다. LukA(S 유형) 및 LukB(F 유형) 서브유닛은 개별 단량체가 아닌 용액에서 미리 조립된 이량체로서 존재한다(DuMont 등, "Identification of a Crucial Residue Required for Staphylococcus aureus LukAB Cytotoxicity and Receptor Recognition" Infection and Immunity 82(3):1268-1276 (2014)). 더욱이, 특이적 7-막관통 케모카인 수용체와 상호작용하는, PVL, LukED, HlgAB, 및 HlgCB와 달리(Spaan 등, "Leukocidins: Staphylococcal Bi-Component Pore-Forming Toxins find their Receptors" Nat. Rev. Microbiol. 15(7):435-447(2017)), LukAB는 숙주 세포 표면 상에서 CD11b/CD18 인테그린을 표적화한다(DuMont 등, "Staphylococcus aureus LukAB cytotoxin kills human neutrophils by targeting the CD11b subunit of the integrin Mac-1" Proc Natl Acad Sci USA. 110(26):10794-9 (2013)). 마지막으로, LukAB는 일차 인간 백혈구를 사용하는 생체 외 감염 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus) 매개 세포 용해를 담당하는 주요 독소다(DuMont 등, "Characterization of a New Cytotoxin that Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis" Mol. Microbiol. 79(3):814-825 (2011)). 이러한 독특한 특징은 다른 류코시딘과 LukAB의 차이로 설명될 수 있다. 일반적으로, 각 그룹 내에서, 유형 S- 및 F- 성분은 각각 71-82% 및 65-81%의 동일성을 공유하는 반면, LukA 및 LukB는 다른 류코시딘과 단지 30% 및 39%만 동일하다. 중요하게는, 류코시딘 AB(LukAB)는 현재까지 기술된 모든 인간 감염 분리주에 존재하며, 가장 먼 스태필로코쿠스 계통 간에 최대 20%의 아미노산 차이를 나타낸다.
S. 아우레우스(S. aureus) 발병기전 및 감염에서 LukAB 독소의 중요성을 고려하여, 신규한 LukA 및 LukB 변이체 단백질 및 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 본원에 개시된 LukA 및 LukB 변이체 단백질 및 폴리펩티드는 서로 이량체화하는 능력을 보유하여, 이들이 강력한 면역 반응을 위해 본래의 독소 구조를 유지하고 면역계에 제시하지만 세포독성 활성은 결여되기 때문에 이상적인 백신 후보가 된다. 매년 S. 아우레우스(S. aureus)에 감염되는 많은 수의 개인들을 감안할 때, 이러한 감염 중 상당 부분이 전통적인 항생제 치료 과정에 불응성일 가능성이 높다. 본원에서 설명되는 이러한 감염을 치료하고, 더욱 중요하게는 예방하는 혁신적인 접근법은, S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 방어에 관여하는 가장 중요한 선천적 면역 세포인, 다형핵 백혈구(PMN, polymorphogenuclear leukocyte)를 사멸시키는 역할을 하는, LukAB와 같은 S. 아우레우스(S. aureus) 독성 인자를 억제하는 것을 수반한다.
도 1은 클론 복합체(CC) 8 (서열번호 1); CC45 (서열번호 2); CC30의 HMPREF0772_044(TCH60) (서열번호 27); CC30의 SAR2108(MRSA252) (서열번호 36); CC45의 SALG_02329(A9635) (서열번호 34); CC398의 SAPIG2061(ST398) (서열번호 35); CC10의 SATG_01930(D139) (서열번호 37); CC8의 NEWMAN (서열번호 26); CC151의 SAB1876C(RF122) (서열번호 32); CC5의 SAV2005(Mu50) (서열번호 38); CC5의 SA1813(N315) (서열번호 31); CC8의 SACOL2006 (서열번호 33); CC7의 HMPRE0776_0173 USA300(TCH959) (서열번호 29); CC72의 HMPREF0774_2356 TCH130 (서열번호 28); 및 CC1의 MW1942(MW2) (서열번호 30)의 LukA를 포함하는 15개의 상이한 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) LukA 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 것의 비교로부터 생성된 대부분의 LukA 서열의 아미노산 서열은 서열번호 25로서 제공된다. 　 본원에서 설명되는 아미노산 치환의 위치 또한 각각의 LukA 서열 내에서 확인된다.
도 2는 CC8 (서열번호 15); CC45 (서열번호 16); CC45의 A9635 (서열번호 40); CC30의 E1410 (서열번호 43); CC30의 MRSA252 (서열번호 45); CC10의 D139 (서열번호 42); CC5의 Mu.50 (서열번호 46); CC239의 JKD6008 (서열번호 44); CC8의 COL (서열번호 41); CC8의 USA300_FPR3757 (서열번호 50); CC8의 NEWMAN (서열번호 51); CC151의 RF122 (서열번호 48); CC1의 MW2 (서열번호 47); 및 CC72의 TCH130 (서열번호 49)의 LukB를 포함하는 14개의 상이한 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) LukB 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 것의 비교로부터 생성된 대부분의 LukB 서열의 아미노산 서열은 서열번호 39로서 제공된다. 　 본원에서 설명되는 아미노산 치환의 위치 또한 각각의 LukB 서열 내에서 확인된다.
도 3은 면역화에 사용된 상이한 LukAB 변이체의 세포독성을 보여준다. 상이한 LukAB 변이체의 적정으로 일차 인간 PMN(n=4)의 중독을 1시간 동안 수행하였다. 세포 생존력을 CellTiter로 평가하였다. 데이터는 2개의 별도 실험에서 수득된 4명의 공여자로부터의 평균 ± SEM이다.
도 4a 내지 도 4b는 상이한 LukAB 변이체로 면역화된 마우스에서 LukAB CC8 또는 CC45에 대한 항체 역가를 보여준다. Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg의 LukAB를 피하 투여하였다. 5마리 마우스의 코호트도 동일한 부피의 10% 글리세롤 1X TBS 및 TiterMax® Gold로 이루어진 모의 면역화를 받았다. 동일한 항원 애쥬번트 칵테일의 2회 추가 투여(2주 간격 추가 투여) 후, 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 혈청을 수득하였다. 표시된 면역화 항원으로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 풀링하고 연속 희석하여 CC8 LukAB(도 4a) 또는 CC45 LukAB(도 4b)에 대한 항체 역가를 결정하였다. 플레이트를 2 μg/ml의 CC8 또는 CC45 LukAB로 코팅하였다. 히트맵은 중복 측정으로부터의 평균 흡광도 값을 보여준다.
도 5는 다양한 LukAB 독소에 대해 상이한 LukAB 변이체로 면역화된 마우스로부터의 혈청에 대한 중화 프로파일을 제공한다. 표시된 항원으로 면역화된 마우스로부터의 4-0.031% 혈청의 존재 하에 표시된 LukAB 변이체(LD90) 0.156 μg/ml로 1시간 동안 인간 PMN(n=4)의 중독. 표시된 면역 항원을 갖는 면역화된 마우스로부터의 혈청을 풀링하고 사용 전에 열 불활성화시켰다. 세포 생존력을 CellTiter로 결정하였다. 히트맵은 4명의 공여자의 평균 사멸 세포 백분율을 표시하고, 검은색은 세포 사멸 없음을 나타내고, 흰색은 100% 세포 사멸을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 표시된 항원으로 면역화된 마우스 유래의 2%(도 6a), 1%(도 6b), 및 0.5%(도 6c) 마우스 혈청의 부재 또는 존재 시, LukAB 독소 서열 변이체의 LD90으로의 중독 후 사멸된 인간 다형핵 백혈구의 백분율을 보여주는 표이다. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로서 제시된다. 음영이 없는 세포는 가장 낮은 세포 사멸을 나타내고, 가장 짙은 회색 음영이 있는 세포는 가장 높은 세포 사멸을 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 고농도에서 LukAB RARPR-33의 중독이 세포독성이 아님을 보여준다. 건강한 공여자(n=4-6)로부터 새로 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 CellTiter의 흡광도에 의해 결정하였다(도 7a 및 도 7b). 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸 상태로 설정된 Triton X100으로 처리된 세포로 정규화함으로써 계산하였다. 평균 ± SEM이 표시되어 있다. 건강한 공여자(n=4-6)로부터 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 LDH 방출에 의해 결정하였다. (도 7c 및 7d). 평균 ± SEM이 표시되어 있다.
도 8a 내지 8d는 고농도에서 LukAB RARPR-33 및 D39A/R23E 톡소이드의 중독을 보여준다. 건강한 공여자(n=5)로부터 새로 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 CellTiter의 흡광도에 의해 결정하였다(도 8a 및 8b). 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸 상태로 설정된 Triton X100으로 처리된 세포로 정규화함으로써 계산하였다. 평균 ± SEM이 표시되어 있다. 건강한 공여자(n=5)로부터 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 LDH 방출에 의해 결정하였다 (도 8c 및 8d). 평균 ± SEM이 표시되어 있다.
도 9는 다양한 LukAB 독소에 대해 2개의 상이한 LukAB 톡소이드로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 중화 프로파일을 보여준다. 2개의 상이한 항원으로 면역화된 마우스의 0.125% 혈청의 존재 하에 표시된 LukAB 독소 변이체(LD90) 0.156 μg/ml로 1시간 동안 인간 PMN(n=4)의 중독. 표시된 면역 항원 모두로 면역화된 마우스 유래의 혈청을 풀링하고 사용 전에 열 불활성화시켰다. 세포 생존력을 CellTiter로 결정하였다. 막대 그래프는 4개의 상이한 공여자의 평균 + SEM을 보여준다. 통계적 유의성은 비대응 t 검정을 사용하여 결정하였고, P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001.
본 개시는 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 단백질 및 폴리펩티드 및 이들 변이체 단백질 및 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 대상체에서 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염을 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
정의
본 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 조성물 또는 방법론에 한정되지 않는 것으로 이해해야 하는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 설명에 사용된 용어는 단지 특정 버전 또는 실시예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본원의 실시예의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본원의 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이제 설명하기로 한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참조로서 통합된다. 본원에서의 어느 것도 본원의 실시예가 종래 발명으로 인해 이러한 개시를 앞질러야 할 권리가 없다고 인정하는 것으로 해석되어선 안된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a," "an," "the")는 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 주목해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 설명되는 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 숫자 값은 일반적으로 인용된 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10%(w/v)의 농도 범위는 0.9%(w/v) 내지 11%(w/v)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위를 명시적으로 포함하며, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 포함하여, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값을 포함한다.
달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 시리즈 내의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당 분야의 숙련자는, 본원에서 설명되는 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 균등물을, 통상적인 실험 정도로 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함한다(includes)", "포함하는(including)", "가진다(has)", "갖는(having)", "함유한다(contains)" 또는 "함유하는(containing)", 또는 이들의 임의의 다른 변형은, 언급된 정수 또는 정수들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제하지 않고 비-배타적이거나 개방적인 것으로 의도되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 한정되지는 않지만, 이러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 명시적으로 열거되거나 내재되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 반대로 명시적으로 언급되지 않는 한, "또는"은 포괄적인 또는 을 지칭하며 배타적인 또는 을 지칭하지 않는다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 어느 하나에 의해 충족된다: A는 참(또는 존재)이고 B는 거짓(또는 존재하지 않음)이고, A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B는 참(또는 존재)이고, A 및 B 모두가 참(또는 존재)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 접속어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소가 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 첫번째 옵션은 제2 요소가 없는 제1 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두번째 옵션은 제1 요소가 없는 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세번째 옵션은 제1 및 제2 요소의 적용 가능성을 함께 지칭한다. 이들 옵션 중 어느 하나가 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 둘 이상의 옵션의 동시 적용 가능성 또한 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은, 용어 "~으로 이루어진다", 또는 "~으로 이루어진다" 또는 "~으로 이루어지는"과 같은 변형은, 임의의 인용된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 특정 방법, 구조 또는 조성물에 추가 정수 또는 정수의 군을 추가할 수 없음을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은, 용어 "필수적으로 "~으로 이루어진다", 또는 "필수적으로 "~으로 이루어진다" "필수적으로 "~으로 이루어지는"와 같은 변형은 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 포함하는 것과, 특정 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 선택적으로 포함하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등, 보다 바람직하게는 인간을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 구성요소의 치수 또는 특징을 지칭할 때 본원에서 사용되는, 용어 "약", "대략", "대체로", "실질적으로" 및 유사한 용어는 설명된 치수/특징이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니며, 당 분야의 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 기능적으로 동일하거나 유사한 작은 변형을 배제하지 않음을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 최소한, 수치 파라미터를 포함하는 이러한 참조는 당 기술분야에서 용인되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 또는 기타 체계적인 오차, 제조 허용 오차 등)를 사용하는 변형을 포함할 것이고, 이는 최소한의 유효 숫자를 변화시키지 않을 것이다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) LukA 및 LukB 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은, 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 육안 검사에 의해 측정될 때 최대한의 대응을 위해 비교하고 정렬할 때, 동일한 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터 내로 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사도 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., 위스콘신 메디슨), 또는 육안 검사(일반적으로, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, eds., Current Protocols, (1995 Supplement) 참조)에 의해 수행 가능하다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는, Altschul 등의 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul 등의 (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402 각각에서 설명되는, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.
서열 동일성 백분율을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 시험 핵산과 기준 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가의 표시는, 후술하는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 폴리펩티드와 일반적으로 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화된다는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 동의어로 지칭되며, 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역들의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역들의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는, 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어, 트리틸화된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 비정상적인 염기를 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있다; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 자연에서 일반적으로 발견되는 바와 같이, 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드를 비롯하여, 바이러스 및 세포의 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA를 포괄한다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 흔히 올리고뉴클레오티드로 지칭되는, 비교적 짧은 핵산 사슬을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는, 예를 들어, 유전적 환경 간의 수송을 위해 또는 숙주 세포에서의 발현을 위해, 원하는 서열이 삽입될 수 있는, 예를 들어, 제한 및 결찰일 수 있는, 임의의 수의 핵산을 지칭한다. 핵산 벡터는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지, 파지미드, 박테리아 게놈, 바이러스 게놈, 자가 증폭 RNA, 레플리콘을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어, 일차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 일 실시예에서, "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자로 형질감염되거나 형질도입된 세포이다. 또 다른 실시예에서, "숙주 세포"는 이러한 형질감염되거나 형질도입된 세포의 후손 또는 잠재적 후손이다. 세포의 후손은, 예를 들어, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 핵산 분자의 숙주 세포 게놈 내로의 통합으로 인해, 부모 세포와 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 상기 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이 용어는 또한 RNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함하며, 또한 모든 자연 발생 전사-후 및 번역-후 변형을 포함한다. 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 세포질 내에 있을 수 있고, 세포 배양물의 성장 배지와 같은 세포외 환경 내로 들어가거나 세포막에 고정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 또는 "단백질"은 아미노산으로 이루어진 분자를 지칭할 수 있고 당 분야의 숙련자에 의해 단백질로서 인식될 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 종래의 1자리 또는 3자리 코드가 본원에서 사용된다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당질화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은, 임의의 다른 조작 또는 변형을 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)를 함유하는 폴리펩티드뿐만 아니라 당 기술분야에 공지된 다른 변형도 본 정의 내에 포함된다.
본원에서 설명되는 폴리펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 영역이 좌측에 있고 C-말단 영역이 우측에 있는 통상적인 관례에 따라 작성된다. 아미노산의 이성질체 형태가 알려져 있지만, 달리 명시적으로 명시되지 않는 한, 표시되는 아미노산의 L-형태이다.
용어 "단리된"은 실질적으로 그의 기원 소스의 세포 물질, 박테리아 물질, 바이러스 물질, 또는 (재조합 DNA 기술에 의해 생산된 경우) 배양 배지, 또는 (화학적으로 합성된 경우) 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 또한, 단리된 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드로서 대상체에게 투여될 수 있는 것을 지칭하며; 즉, 폴리펩티드가 컬럼에 접착되거나 겔에 매립되는 경우, 폴리펩티드는 단순히 "단리된" 것으로 간주되지 않을 수 있다. 또한, "단리된 핵산 단편" 또는 "단리된 펩티드"는 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고/않거나 전형적으로 기능적 상태로 되지 않은 핵산 또는 단백질 단편이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응" 또는 이와 동등한 "면역학적 반응"이라는 구절은 수용자 대상체에서 본 개시의 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 폴리펩티드에 대해 유도된 체액성(항체 매개), 세포성(항원-특이적 T 세포 또는 이의 분비 산물에 의해 매개) 또는 체액성 및 세포성 반응 모두의 발생을 지칭한다. 이러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 능동 반응 또는 항체, 항체 함유 물질, 또는 프라이밍된 T 세포의 투여에 의해 유도된 수동 반응일 수 있다. 세포성 면역 반응은, 항원-특이적 CD4 (+) T 헬퍼 세포 및/또는 CD8 (+) 세포독성 T 세포를 활성화시키기 위해, 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 관련된 폴리펩티드 에피토프의 제시에 의해 유도된다. 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호염기구, 수지상 세포, 성상 세포, 미세아교세포, 호산구, 또는 선천성 면역의 다른 성분의 활성화를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "능동 면역(active immunity)"은 항원의 투여에 의해 대상체에게 부여된 임의의 면역을 지칭한다.
S. 아우레우스(S. aureus ) 류코시딘 A(LukA) 변이체
본 개시의 제1 측면은 변이체, 즉, 비-자연 발생, 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus(S. 아우레우스(S. aureus)) 류코시딘 A (LukA) 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는, LukAB 이성분 독소를 비-세포독성으로 만들고, LukAB 이종이량체를 안정화시키고, 용융 온도를 증가시키고 그리고/또는 용해도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 이들 변이체 LukA 단백질 및 폴리펩티드는 이상적인 백신 항원 후보물질이며, 단독으로 투여되거나 류코시딘 B (LukB) 야생형 또는 변이체 단백질 또는 폴리펩티드와 병용하여 투여될 수 있다. LukB 단백질 또는 이의 폴리펩티드와 병용하여 투여될 때, 생성된 톡소이드는 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소의 구조를 모방하며, 이에 의해 S. 아우레우스(S. aureus)의가장 강력한 독소 중 하나에 대한 강력한 면역 반응의 생성을 용이하게 한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukA 단백질 서열에 대응하는 모든 아미노산 잔기를 포함하는 전장 LukA 단백질의 변이체이다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, "성숙한" 류코시딘 단백질 서열은, 일반적으로 아미노 말단 상의 첫 27-28개 아미노산 잔기를 포함하는, 아미노 말단 분비 신호가 결여된 류코시딘 단백질의 서열이다.
임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukA 단백질 미만의 변이체이다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 적어도 100개 아미노산 잔기 길이이다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개, 적어도 180개, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 210개, 적어도 220개, 적어도 230개, 적어도 240개, 적어도 250개, 적어도 260개, 적어도 270개, 적어도 280개, 적어도 290개, 적어도 300개의 아미노산 잔기 길이이다.
본원에서 설명되는 예시적인 LukA 변이체 단백질 및 폴리펩티드는 클론 복합체 CC8(서열번호 1) 및 CC45 (서열번호 2) (하기 표 1 참조)의 변이체 LukA 단백질이지만, 당 분야의 숙련자라면 서열번호 1 및 서열번호 2의 맥락에서 식별된 LukA의 아미노산 치환 및/또는 결실이 다양한 클론 복합체에 걸쳐 보존되거나, 다양한 클론 복합체에 걸쳐 고도로 보존되는 LukA의 영역 내에 있는 아미노산 잔기이다. 실제로, S. 아우레우스(S. aureus)의 15개의 상이한 균주로부터의 LukA 단백질 서열의 정렬(도 1 참조)은 변이의 대상이 되는 잔기로서 본원에서 식별된 아미노산 잔기가 정렬된 LukA 아미노산 서열의 15개 모두에 걸쳐 보존되는 잔기임을 보여준다. 식별된 변이 잔기의 위치는 개별 LukA 서열 간에 상이할 수 있지만, 서열 정렬은 이들 위치 간의 대응관계를 보여준다. 명확성을 위해, 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LukA 공통 서열을, 서열 정렬로부터 생성하고, 특정 아미노산 변이체의 위치를 할당하기 위한 목적으로 사용하였다. 예를 들어, 서열번호 25 내의 리신 잔기 83에서의 아미노산 치환은 서열번호 1의 LukA 서열에서의 위치 80에서의 리신 잔기, 서열번호 2의 LukA 서열에서의 위치 81에서의 리신 잔기, 및 서열번호 26-38의 LukA 서열에서의 위치 83에서의 리신 잔기에 대응한다. 따라서, 본원에서 설명되는 식별된 아미노산 변이는 현재 또는 미래에 알려진 임의의 LukA 아미노산 서열의 대응하는 아미노산 잔기에 보편적으로 적용될 수 있다.
본 개시의 본 측면에 따르면, 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193 잔기에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 치환 및/또는 결실에 추가하여 서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, Glu323에서의 아미노산 치환 또는 결실은 서열번호 25의 위치 323(Glu323Ala)에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, LukA(및 본원에서 설명되는 바와 같은 LukB)의 하나 이상의 식별된 위치에서의 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 동일한 부류의 구성원인 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 수반하며, 이는 기능적 등가물로서 작용하여, 침묵 변경을 초래한다. 즉, 본래의 서열에 대한 변화는 LukA의 기본 특성을 눈에 띄게 감소시키지 않을 것이다. 이들 부류의 아미노산 잔기는 비극성(소수성) 아미노산(예를 들어,알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌); 극성 중성 아미노산(예를 들어, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민); 양으로 하전된 (염기성) 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 및 음으로 하전된 (산성) 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산)을 포함한다.
다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 변이체 류코시딘 폴리펩티드의 하나 이상의 식별된 위치에서의 아미노산 치환은 비보존적 변경(즉, 식별된 영역의 서열, 구조, 기능 또는 활성을 파괴하는 치환)이다. 이러한 치환은 단백질의 세포독성을 감소시키거나 완화시키기 위한 목적으로 바람직할 수 있다. 비보존적 치환은 하나의 특정 부류의 아미노산 잔기를 상이한 부류의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 수반한다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산 잔기를 극성 중성 아미노산으로 치환하거나 그 반대. 또 다른 실시예에서, 비보존적 치환은 양으로 하전된 (염기성) 아미노산 잔기를 음으로 하전된 (산성) 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산으로 치환하는 것, 또는 그 반대를 수반한다. 이러한 분자 변경은 단일 가닥 템플릿(Kunkel 등의 Proc. Acad. Sci., USA 82:488-492 (1985), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이중 가닥 DNA 템플릿(Papworth 등의 Strategies 9(3):3-4 (1996), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 PCR 클로닝(Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS Protocols, 2nd ed. Humana Press, Totowa, N.J. (2002), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하는 플라스미드 템플릿 상의 프라이머 연장을 포함하여, 당 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 83(Lys83Met)에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 80(Lys80Met)에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 81(Lys81Met)에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 141(Ser141Ala)에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 138(Ser138Ala)에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 139(Ser139Ala)에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 113(Val113Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 110(Val110Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 111(Val111Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 193(Val193Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 190(Val190Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 191(Val191Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 잔기에서의 치환 중 어느 하나 이상에 추가하여, 서열번호 25의 글루탐산 잔기 위치 323(Glu323Ala)에 대응하는 잔기에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190에 대응하는 잔기에서의 치환 중 어느 하나 이상에 더하여 서열번호 1의 글루탐산 잔기 위치 320(Glu320Ala)에 대응하는 잔기에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys81, Ser139, Val111, Val191에 대응하는 잔기에서 치환 중 어느 하나 이상에 추가하여 서열번호 2의 글루탐산 잔기 위치 321(Glu321Ala)에 대응하는 잔기에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 전술한 아미노산 잔기 중 2개에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 아미노산 잔기 중 3개에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 아미노산 잔기의 4개 전부에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, 및 Val193Ile에 대응하는 전술한 아미노산 잔기에서 리신에서 메티오닌으로, 세린에서 알라닌으로, 및 발린에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 잔기 323(Glu323Ala)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 추가로 포함한다, 즉, 변이체 LukA는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala에 대응하는 치환을 포함한다. 　
본 개시의 예시적인 변이체 LukA 폴리펩티드는 서열번호 25에서의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala에 대응하는 아미노산 치환을 보유한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1에서의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체이다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　
임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2에서의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　 다른 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25에서의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala의 치환에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 일 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Tyr74(Tyr74Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 25의 Asp140(Asp140Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아스파라긴에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 　 위치 74 및 140에서 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukA에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 다른 변이체 LukA 폴리펩티드에 비해 변이체 LukA의 열안정성을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Gly149(Gly149Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 25의 Gly156(Gly156Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 　 위치 149 및 156에 도입된 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukA에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 다른 변이체 LukA 폴리펩티드에 비해 변이체 LukA의 열안정성을 증가시킨다.
임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Tyr71, Asp137, Gly146, 및 Gly153에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 Tyr72, Asp138, Gly147, 및 Gly154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다.
임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환과 조합된 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323 및 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, Tyr71, Asp137, Gly146, 및 Gly153 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, 및 Gly153Cys 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, Tyr72, Asp138, Gly147, 및 Gly154 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, 및 Gly154Cys 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
다른 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, Glu323, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukA 변이체는 Thr249에 대응하는 잔기에서 치환을 포함하며, 여기서 치환은 이 잔기에서 (Thr249Val) 트레오닌에서 발린으로의 치환이다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Thr246에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 Thr247에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 다른 아미노산 잔기 치환 중 어느 하나, 즉, 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323 Tyr74, Asp140, Gly149 및 Gly156에 대응하는 잔기에서의 치환과 조합된 서열번호 25의 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 다른 아미노산 잔기 치환 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 전부와 조합된 서열번호 25의 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, 및 Thr249에 대응하는 각각의 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, 및 Thr246 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, 및 Thr246Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, 및 Thr247Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　
다른 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, 및 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다.
임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Thr249, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, Tyr71, Asp137, Gly146, Gly153, 및 Thr246 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys, 및 Thr246Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, Tyr72, Asp138, Gly147, Gly154 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 　 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 　
다른 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Thr249, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 잔기의 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 　
하기 표 1은 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 변이체 LukA 아미노산 서열을 제공한다.
예시적인 LukA 폴리펩티드 아미노산 서열
서열번호 명칭 설명
1 LukA CC8 WT HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYKEG
2
LukA CC45 WT 		ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYKEG
3 LukA CC8 W95 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
4 LukA CC45 W95E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
5 LukA CC8 W95W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSSG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
6 LukA CC45 W95W72E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSLG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
7 LukA CC8 W97E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVN A TFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
8 LukA CC45 W97 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
9 LukA CC8 W97 W72E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSSG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
10 LukA CC45 W97 W72 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val,
Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys		 ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSLG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
11 LukA CC45 W94E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile
 ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK L QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
12 LukA CC45 W96E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val
 ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK L QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
13 LukA CC8
Glu320Ala
 HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
14 LukA CC45 Glu321Ala ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
64 LukA CC8 delta 10 HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKY
65 LukA CC45 delta 10 ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKY
S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B (LukB) 변이체
본 개시의 다른 측면은 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B (LukB) 변이체 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 LukB 변이체 폴리펩티드는 LukB 안정성을 개선하여 LukAB 톡소이드 안정성에 기여하는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 이들 LukB 변이체 폴리펩티드는 단독으로 투여되거나 류코시딘 A(LukA) 야생형 또는 변이체 단백질 또는 폴리펩티드와 조합된 투여될 수 있는 이상적인 백신 항원 후보이다. LukA 야생형 또는 변이체 폴리펩티드와 조합된 투여될 때, 생성되는 톡소이드는 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소의 구조를 모방하며, 이에 의해S. 아우레우스(S. aureus)의 가장 강력한 독소 중 하나에 대한 강력한 면역 반응의 생성을 용이하게 한다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukB 단백질 서열에 대응하는 아미노산 잔기를 모두를 포함하는 전장 LukB 단백질의 변이체이다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체는 전장 성숙 LukB 단백질보다 작은 참조된 단백질의 아미노산 사슬을 포함한다. 일 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 적어도 100개 아미노산 잔기 길이이다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개, 적어도 180개, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 210개, 적어도 220개, 적어도 230개, 적어도 240개, 적어도 250개, 적어도 260개, 적어도 270개, 적어도 280개, 적어도 290개, 적어도 300개의 아미노산 잔기 길이이다.
본원에서 설명되는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 클론 복합체 CC8(서열번호 15) 및 CC45(서열번호 16)의 LukB 변이체이지만(아래 표 2 참조), 당 분야의 숙련자라면 서열번호 15 및 서열번호 16과 관련하여 확인된 LukB의 아미노산 치환 및/또는 결실이 다양한 클론 복합체에 걸쳐 보존되는 아미노산 잔기이거나 다양한 클론 복합체에 걸쳐 고도로 보존되는 LukB의 영역 내에 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. S. 아우레우스(S. aureus)의 14개의 상이한 균주로부터 LukB 단백질 서열의 정렬(도 2 참조)은, 변이의 대상이 되는 잔기로서 본원에서 식별된 아미노산 잔기가 정렬된 LukB 아미노산 서열의 14개 모두에 걸쳐 보존되는 잔기임을 보여준다. 식별된 변이 잔기의 위치는 개별 LukB 서열 간에 다를 수 있지만, 서열 정렬은 이들 위치 간의 대응관계를 보여준다. 명확성을 위해, 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는, LukB 컨센서스 서열을 서열 정렬로부터 생성하고, 특정 아미노산 변이의 위치를 할당하기 위한 목적으로 사용하였다. 예를 들어, 서열번호 39에서의 글루탐산 잔기 109에서의 아미노산 치환은 서열번호 15, 42, 44 및 46-51의 LukB 서열에서 위치 109에서의 글루탐산 잔기, 서열번호 16, 40, 43 및 45의 LukB 서열에서의 위치 110에서의 글루탐산 잔기, 및 서열번호 41에서 위치 60에서의 글루탐산 잔기에 대응한다. 　 따라서, 본원에서 설명되는 식별된 아미노산 변이는 현재 또는 미래에 알려진 임의의 LukB 아미노산 서열 내의 대응하는 아미노산 잔기에 보편적으로 적용될 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, Val53에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 치환(Val53Leu)을 포함한다. 일 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39에서의 Val53Leu 치환에 대응하는 치환을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 위치 53에서 발린에서 류신으로의 치환을 갖는 예시적인 CC8 LukB 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 일 실시예에서, 서열번호 39에서의 Val53Leu 치환에 대응하는 치환을 포함하는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
다른 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 40-51의 LukB 단백질 중 어느 하나를 포함한다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 일 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu45(Glu45Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 39의 Thr121(Thr121Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 트레오닌에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 　 위치 45 및 121에서 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukB에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 본원에서 설명되는 다른 변이체 LukB 단백질 및 폴리펩티드에 비해 변이체 LukB의 열안정성을 증가시킨다.
또 다른 실시예에서, 본원에서 설명되는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu109(Glu109Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 39의 Arg154(Arg154Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 위치 109 및 154에 도입된 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써, 야생형 LukB에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 다른 LukB 변이체 폴리펩티드에 비해 LukB 변이체의 열안정성을 증가시킨다.
임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다.
임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 일 실시예에서, 서열번호 39의 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 잔기에서 시스테인 아미노산 치환을 포함하는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 아미노산 잔기 중 어느 하나에서 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 또 다른 실시예에서, 서열번호 39의 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 잔기에서 시스테인 아미노산 치환을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
다른 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 잔기 Glu45, Glu109, Thr121 및 Arg154에 대응하는 잔기에서 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 40-51의 LukB 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 치환과 조합된 서열번호 39의 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, 예시적인 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Val53Leu, Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 　 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 Val53, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 잔기에서 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 40-51의 LukB 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 　
하기 표 2는 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 변이체 LukB 아미노산 서열을 제공한다.
예시적인 LukB 폴리펩티드 아미노산 서열
서열번호 명칭 설명
15
LukB CC8 WT		 KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLTEPNYDKETVFIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSYRTLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
16
LukB CC45 WT		 EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLTEPNYDKETVFIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSYRTLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
17
LukB CC8 Val53Leu		 KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLTEPNYDKET L FIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSYRTLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
18
LukB CC45 Val53Leu		 EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLTEPNYDKET L FIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSYRTLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
19
LukB CC8 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys		 KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLT C PNYDKET L FIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSY C TLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
20
LukB CC45 Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys		 EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLT C PNYDKET L FIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSY C TLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
21
LukB CC8 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys		 KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLT C PNYDKETVFIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSY C TLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
22
LukB CC45 Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys		 EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLT C PNYDKETVFIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSY C TLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
본 개시의 모든 측면에 따르면, 본원에 개시된 변이체 LukA 및/또는 LukB 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 이종 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 적절한 이종 아미노산 서열은 태그 서열, 면역원, 신호 서열 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 태그 서열은, 폴리히스티딘-태그, 폴리아르기닌 태그, FLAG 태그, Step-태그 II, 유비퀴틴 태그, NusA 태그, 키틴 결합 도메인, 칼모둘린-결합 펩티드, 셀룰로오스-결합 도메인, Hat-태그, S-태그, SBP, 말토오스-결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제( Terpe K., "Overview of Tag Protein Fusions: From Molecular and Biochemical Fundamentals to Commercial Systems," Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003) 참조, 참조로서 본원에 통합됨)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 면역원은 T-세포 에피토프, B-세포 에피토프를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 신호 서열은 PelB 신호 서열, Sec 신호 서열, Tat 신호 서열, AmyE 신호 서열(Freudl R., "Signal Peptides for Recombinant Protein Secretion in Bacterial Expression Systems," Microbial Cell Factories 17:52 (2018) 참조, 참조로서 본원에 통합됨)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 변이체 폴리펩티드는 PelB 서열(MKYLLPTAAAGLLLAQPAMA; 서열번호 23)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 변이체 폴리펩티드는 His-태그(예를 들어, NSAHTTHGS; 서열번호 24)를 포함한다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 변이체 폴리펩티드는 전술한 PelB 서열 및 His-태그 둘 다를 포함한다.
변이체 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드 및 작제물
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서 설명되는 핵산 분자는 단리된 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 벡터의 부분 또는 시험관 내 또는 생체 내 전사/번역에 사용된 선형 DNA 또는 RNA 서열을 비롯한, 선형 DNA 또는 RNA 서열의 부분, 및 본원에서 설명되는 바와 같은 그의 LukA 및 LukB 변이체 폴리펩티드의 원핵 세포 및 진핵 세포 발현 및 분비와 호환 가능한 벡터를 포함한다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함한다. 임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드는 RNA, 특히 mRNA를 포함한다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드는 자동화된 폴리뉴클레오티드 합성기 상에서의 고상 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산되고 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 PCR 후 이어서 일상적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 주어진 서열의 폴리뉴클레오티드를 생산하거나 수득하기 위한 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 83(Lys83Met)에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 141(Ser141Ala)에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 113(Val113Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 193(Val193Ile)에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 전술한 아미노산 잔기에 대응하는 잔기, 즉, 서열번호 25의 Lys803Met, Ser141Ala, Val113Ile, 및 Val193Ile에서 리신에서 메티오닌으로의 아미노산 치환, 세린에서 알라닌으로의 아미노산 치환, 및 발린에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 Glu323Ala에 대응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하며, 즉, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala 치환에 대응하는 치환을 포함하는 LukA 변이체를 암호화한다. 　
일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 1에서 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 CC8 LukA를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 52로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 52의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
일 실시예에서, CC8 Luk8 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 54과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 2에서 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 CC45 LukA를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 53로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 53의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
일 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile)의 CC45 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 55과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Tyr74(Tyr74Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호 25의 Asp140(Asp140Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아스파라긴에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Gly149(Gly149Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호 25의 Gly156(Gly156Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기이다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환과 조합된 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323 및 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　
일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, 및 Gly153Cys 각각에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 5(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys) 의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, 및 Gly154Cys의 각각에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 일 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 6(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 249에 대응하는 이러한 잔기에서 트레오닌에서 발린으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환 중 어느 하나 또는 전부와 조합된 Thr249에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　
일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, 및 Thr246Val 각각에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 일 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 7(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Thr246Val)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146CysCs 및 Gly153Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 9의 CC8 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 서열번호 9의 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 56과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 56의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, 및 Thr247Val 각각에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 일 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 8(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 　 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys 및 Gly154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 10의 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 임의의 실시예에서, 서열번호 10의 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 57과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 57의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
본 개시의 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, Val53에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 치환(Val53Leu)을 포함한다. 일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 15의 위치 53에서 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 CC8 LukB를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 58로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 58의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
일 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 17(LukB CC8 V53L)의 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukB CC8 V53L 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 60과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 60의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 16의 위치 53에서 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 CC45 LukB를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 59로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 59의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 59의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
또 다른 실시예에서, 본 개시의 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18(LukB CC45 V53L)의 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukB CC45 V53L 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 61과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 61의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 일 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu45(Glu45Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환, 및 서열번호 39의 Thr121(Thr121Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 트레오닌에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 　 또 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu109(Glu109Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환, 및 서열번호 39의 Arg154(Arg154Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌에서 시스테인으로의 치환을 포함하는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술한 바와 같은 시스테인 잔기의 도입을 수반한다.
일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21(LukB CC8 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys)의 아미노산 서열 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22(LukB CC45 Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys)의 아미노산 서열 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 치환과 조합된 서열번호 39의 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 15의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19(LukB CC8 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys)의 아미노산 서열 또는 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　 또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 16의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. 　 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20(LukB CC45 Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys)의 아미노산 서열 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 　
또 다른 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 본원에 개시된 바와 같은 LukA 서열 및 LukB 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 서열(변이체 또는 비-변이체) 및 CC45 LukB 서열(변이체 또는 비-변이체)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CC45 LukA 변이체 서열 및 CC45 LukB 비-변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 CC45 LukA 비-변이체 서열 및 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 서열(변이체 또는 비-변이체) 및 CC8 LukB 서열(변이체 또는 비-변이체)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CC8 LukA 변이체 서열 및 CC8 LukB 비-변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 CC8 LukA 비-변이체 서열 및 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 서열(변이체 또는 비-변이체) 및 CC8 LukB 서열(변이체 또는 비-변이체)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CC45 LukA 변이체 서열 및 CC8 LukB 비-변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 CC45 LukA 비-변이체 서열 및 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 서열(변이체 또는 비-변이체) 및 CC45 LukB 서열(변이체 또는 비-변이체)을 암호화하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CC8 LukA 변이체 서열 및 CC45 LukB 비-변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 CC8 LukA 비-변이체 서열 및 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또 다른 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 LukA 변이체 서열 및 LukB 야생형 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 LukA 야생형(즉, 비-변이체) 서열과 조합되는, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 LukA 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 LukA 야생형 서열 및 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나로부터 선택된 LukB 변이체 서열과 조합되는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 LukA 야생형 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 LukA 변이체 서열 및 LukB 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나로부터 선택된 LukB 변이체 서열과 조합되는, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 중 어느 하나로부터 선택된 LukA 변이체 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 5의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 6의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 7의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 8의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 9의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 10의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 11의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 12의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15 또는 16의 LukB 비-변이체 서열, 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 13의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 14의 LukA 변이체 서열 및 서열번호 17 또는 18의 LukB 변이체 서열, 서열번호 19 또는 20의 LukB 변이체 서열, 또는 서열번호 21 또는 22의 LukB 변이체 서열을 암호화한다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 17의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 18의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 19의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 20의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 21의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 22의 LukB 변이체 서열 및 서열번호 1 또는 2의 LukA 비-변이체 서열, 서열번호 3 또는 4의 LukA 변이체 서열, 서열번호 5 또는 6의 LukA 변이체 서열, 서열번호 7 또는 8의 LukA 변이체 서열, 서열번호 9 또는 10의 LukA 변이체 서열, 서열번호 11 또는 12의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 13 또는 14의 LukA 변이체 서열을 암호화한다.
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체 서열 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-15)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 59(CC45 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55(CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 59의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체 서열 및 서열번호 18의 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-30)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 61(CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55(CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 61의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-32)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 58(CC8 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 58의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 18의 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-33)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 61(CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 61의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본 개시의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 17의 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-34)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 60(CC8 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 60의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 　
본 개시의 예시적인 핵산 분자 서열은 아래 표 3에 제공된다.
예시적인 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드 서열
작제물 이름 서열번호 DNA 서열
CC8 LukAwt 52 GCT CAC AAA GAT TCT CAG GAT CAA AAT AAG AAG GAG CAC GTC GAC AAG TCT CAG CAG AAA GAC AAG CGT AAT GTT ACA AAC AAG GAC AAA AAC AGC ACT GCT CCA GAC GAC ATT GGA AAA AAC GGT AAG ATT ACT AAA CGC ACC GAA ACG GTA TAT GAC GAA AAA ACG AAC ATT TTG CAA AAC TTG CAG TTC GAT TTC ATT GAC GAC CCC ACT TAT GAC AAG AAT GTC CTT CTG GTG AAG AAG CAG GGC AGC ATT CAC TCA AAC TTG AAA TTT GAG TCT CAC AAG GAG GAG AAG AAC TCC AAT TGG CTG AAA TAC CCA TCA GAG TAC CAC GTT GAT TTT CAA GTG AAA CGT AAC CGC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTG CCG AAA AAC AAG ATC TCC ACC GCG AAA GTA GAC TCA ACA TTC AGT TAC TCT TCC GGC GGA AAG TTC GAC AGC ACT AAG GGG ATC GGG CGC ACT TCT TCC AAT TCG TAC TCG AAA ACG ATT TCT TAC AAT CAG CAG AAT TAT GAC ACT ATC GCA TCT GGT AAA AAT AAT AAC TGG CAC GTG CAT TGG TCG GTG ATT GCT AAT GAT TTA AAG TAT GGA GGT GAG GTA AAA AAT CGT AAT GAC GAG CTG CTG TTT TAC CGT AAC ACT CGC ATC GCA ACC GTT GAA AAC CCG GAA TTG TCC TTT GCC TCG AAA TAC CGC TAC CCT GCA TTA GTT CGT TCA GGC TTT AAT CCC GAG TTT TTG ACT TAT CTT TCC AAT GAA AAA TCG AAC GAG AAG ACT CAG TTC GAG GTT ACG TAC ACC CGC AAT CAG GAC ATT TTG AAG AAC CGT CCG GGA ATT CAC TAT GCG CCT CCC ATC TTA GAG AAG AAT AAG GAT GGA CAA CGT TTG ATC GTT ACA TAT GAA GTT GAC TGG AAA AAT AAG ACC GTA AAG GTT GTG GAT AAG TAT TCG GAT GAT AAT AAG CCC TAT AAA GAA GGG
CC45 LukAwt 53 GCG AAC AAA GAT TCT CAG GAC CAG ACC AAA AAG GAG CAC GTA GAC AAG GCC CAG CAA AAA GAG AAG CGT AAT GTG AAC GAC AAA GAT AAG AAT ACT CCG GGG CCA GAT GAT ATC GGC AAG AAC GGT AAA GTC ACG AAG CGT ACA GTG TCT GAG TAT GAC AAA GAA ACA AAC ATC CTG CAG AAC TTA CAA TTC GAC TTT ATT GAT GAT CCA ACT TAC GAT AAG AAT GTG TTG CTG GTT AAG AAA CAA GGT TCA ATC CAT TCT AAC TTG AAG TTC GAG TCA CAC CGT AAC GAA ACG AAC GCG TCG TGG TTG AAA TAT CCG TCA GAG TAT CAT GTT GAT TTT CAA GTA CAA CGT AAT CCC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTA CCT AAA AAT AAG ATT AGC ACC GCC AAG GTT GAC TCA ACT TTC TCC TAC TCA TTA GGA GGA AAG TTC GAT TCG ACA AAA GGG ATC GGG CGT ACA TCT TCG AAT AGC TAC AGT AAG AGC ATT AGC TAT AAC CAG CAG AAC TAT GAT ACG ATT GCT TCA GGG AAA AAT AAC AAC CGT CAC GTA CAT TGG TCA GTG GTT GCG AAC GAT CTT AAA TAT GGA AAC GAG ATT AAG AAT CGT AAC GAC GAA TTT TTG TTT TAC CGC AAT ACA CGC CTT AGT ACC GTG GAA AAT CCC GAG CTG TCC TTC GCG TCG AAG TAT CGC TAT CCG GCC CTT GTG CGT TCG GGT TTC AAT CCC GAG TTC TTA ACA TAT ATT TCC AAT GAG AAA ACT AAC GAC AAG ACT CGC TTC GAA GTC ACC TAC ACT CGC AAC CAG GAC ATT CTG AAA AAC AAG CCT GGA ATT CAT TAC GGG CAA CCA ATT TTA GAG CAG AAT AAG GAT GGA CAG CGC TTT ATT GTG GTA TAT GAG GTG GAC TGG AAG AAT AAG ACA GTA AAA GTT GTG GAA AAG TAC TCT GAC CAG AAT AAG CCC TAT AAA GAA GGA
CC8 LukAΔ10C 62 GCT CAC AAA GAT TCT CAG GAT CAA AAT AAG AAG GAG CAC GTC GAC AAG TCT CAG CAG AAA GAC AAG CGT AAT GTT ACA AAC AAG GAC AAA AAC AGC ACT GCT CCA GAC GAC ATT GGA AAA AAC GGT AAG ATT ACT AAA CGC ACC GAA ACG GTA TAT GAC GAA AAA ACG AAC ATT TTG CAA AAC TTG CAG TTC GAT TTC ATT GAC GAC CCC ACT TAT GAC AAG AAT GTC CTT CTG GTG AAG AAG CAG GGC AGC ATT CAC TCA AAC TTG AAA TTT GAG TCT CAC AAG GAG GAG AAG AAC TCC AAT TGG CTG AAA TAC CCA TCA GAG TAC CAC GTT GAT TTT CAA GTG AAA CGT AAC CGC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTG CCG AAA AAC AAG ATC TCC ACC GCG AAA GTA GAC TCA ACA TTC AGT TAC TCT TCC GGC GGA AAG TTC GAC AGC ACT AAG GGG ATC GGG CGC ACT TCT TCC AAT TCG TAC TCG AAA ACG ATT TCT TAC AAT CAG CAG AAT TAT GAC ACT ATC GCA TCT GGT AAA AAT AAT AAC TGG CAC GTG CAT TGG TCG GTG ATT GCT AAT GAT TTA AAG TAT GGA GGT GAG GTA AAA AAT CGT AAT GAC GAG CTG CTG TTT TAC CGT AAC ACT CGC ATC GCA ACC GTT GAA AAC CCG GAA TTG TCC TTT GCC TCG AAA TAC CGC TAC CCT GCA TTA GTT CGT TCA GGC TTT AAT CCC GAG TTT TTG ACT TAT CTT TCC AAT GAA AAA TCG AAC GAG AAG ACT CAG TTC GAG GTT ACG TAC ACC CGC AAT CAG GAC ATT TTG AAG AAC CGT CCG GGA ATT CAC TAT GCG CCT CCC ATC TTA GAG AAG AAT AAG GAT GGA CAA CGT TTG ATC GTT ACA TAT GAA GTT GAC TGG AAA AAT AAG ACC GTA AAG GTT GTG GAT AAG TAT
CC45 LukAΔ10C 63 GCAAATAAAGACTCTCAAGATCAGACTAAAAAGGAACATGTTGATAAGGCGCAACAAAAAGAAAAGCGTAATGTCAATGATAAGGACAAGAATACTCCGGGACCCGACGACATTGGCAAGAACGGAAAGGTGACAAAGCGTACCGTTAGTGAGTACGACAAGGAAACAAATATCCTGCAGAACTTACAGTTCGATTTTATTGACGATCCTACCTATGACAAGAATGTCCTGTTGGTGAAGAAACAGGGCAGCATTCATTCCAATTTAAAATTTGAAAGCCATCGTAACGAAACAAATGCATCTTGGCTTAAATACCCTTCTGAGTACCACGTAGATTTTCAGGTACAACGCAACCCAAAAACCGAAATTCTGGATCAACTGCCCAAGAATAAAATTTCTACGGCTAAAGTTGACAGTACATTTAGCTACAGTTTAGGGGGAAAGTTTGATAGTACAAAAGGAATTGGTCGTACTTCCAGTAACTCCTATTCGAAATCTATTTCCTATAATCAACAGAATTACGACACCATCGCATCCGGTAAAAACAATAATCGCCACGTACATTGGAGTGTTGTCGCGAATGACTTAAAGTACGGTAACGAAATCAAGAACCGCAACGACGAATTCTTATTCTATCGTAACACGCGTTTAAGCACCGTCGAGAACCCCGAGTTATCCTTTGCTAGCAAATATCGCTATCCTGCGTTAGTACGCTCAGGGTTCAATCCTGAGTTCTTAACCTACATCTCCAACGAGAAAACTAATGATAAGACACGCTTCGAGGTGACCTACACCCGTAATCAGGATATCCTTAAAAATAAACCGGGTATTCATTACGGGCAACCCATTTTAGAACAGAATAAGGACGGCCAACGTTTTATCGTGGTCTATGAGGTTGATTGGAAGAACAAGACAGTGAAAGTGGTTGAAAAGTAT
CC8 LukA W95 54 CATAAAGATTCGCAGGATCAAAATAAGAAGGAGCATGTTGACAAGAGCCAGCAGAAAGACAAGCGCAATGTTACAAACAAAGATAAGAACTCTACAGCGCCCGATGACATTGGTAAGAACGGCAAGATAACTAAGCGGACGGAAACCGTGTATGACGAGAAAACTAACATTCTGCAAAATTTGCAATTTGACTTTATCGACGATCCAACCTATGACAAGAATGTCTTGCTTGTCAAAATGCAAGGTTCGATTCATTCAAACCTTAAATTTGAATCCCACAAAGAGGAGAAAAACTCTAATTGGTTAAAGTATCCTTCAGAATATCACATAGATTTCCAGGTAAAGAGAAACCGTAAAACGGAGATACTGGATCAACTGCCTAAAAACAAGATCTCGACAGCTAAGGTGGACGCTACGTTCTCGTACTCGTCTGGTGGGAAGTTCGACTCGACCAAAGGCATTGGGCGTACATCATCAAATAGCTATTCAAAGACTATTAGCTATAATCAGCAGAACTATGATACGATAGCTTCGGGTAAGAATAACAACTGGCACGTTCATTGGTCGATCATTGCAAATGACTTGAAGTATGGCGGAGAGGTAAAGAATCGCAACGATGAGCTGTTATTCTATCGCAATACGAGAATTGCGACTGTAGAGAACCCGGAATTGTCTTTTGCCTCCAAATATCGGTACCCGGCATTGGTACGCTCTGGTTTCAATCCTGAGTTTTTAACTTACCTTTCCAACGAAAAGAGTAATGAGAAGACCCAATTTGAGGTTACCTACACCCGTAACCAGGATATTTTGAAGAATCGGCCGGGCATCCATTATGCCCCACCAATCCTGGAGAAAAATAAAGACGGTCAGCGGCTTATTGTGACTTACGAGGTCGATTGGAAAAATAAGACGGTCAAGGTAGTGGACAAATATTCTGATGACAATAAACCGTACAAAGCTGGC
CC45 LukA W95 55 GCTAATAAGGACTCCCAGGACCAGACAAAGAAGGAACACGTCGACAAAGCCCAGCAAAAAGAAAAACGCAACGTAAACGATAAGGACAAGAACACCCCAGGACCCGATGATATTGGGAAGAACGGTAAAGTCACAAAACGCACAGTGAGCGAGTACGATAAAGAAACAAATATCCTGCAAAATCTGCAATTTGACTTCATCGATGACCCTACCTATGATAAGAATGTGTTGTTGGTTAAGATGCAGGGAAGTATTCATTCCAACTTGAAATTCGAGAGCCACCGTAACGAAACGAATGCGAGTTGGTTAAAGTACCCTTCAGAATACCACATTGATTTTCAGGTGCAGCGTAACCCGAAAACCGAAATCTTAGACCAGCTGCCTAAAAACAAGATTTCTACGGCCAAGGTGGACGCAACTTTCAGTTATAGTCTTGGAGGAAAGTTCGACAGTACCAAAGGTATCGGCCGCACATCCTCAAACAGCTATTCGAAATCCATTTCTTACAACCAGCAAAATTATGACACGATCGCCTCAGGTAAGAACAACAATCGTCATGTGCATTGGAGCATCGTGGCTAACGATTTGAAATATGGTAACGAAATCAAAAATCGCAATGACGAGTTCTTGTTTTACCGCAATACTCGCCTTTCTACGGTAGAGAATCCTGAGCTTAGCTTTGCGAGCAAGTATCGTTACCCTGCTCTTGTACGTTCGGGTTTCAACCCAGAGTTCCTTACTTATATCTCCAATGAGAAGACGAACGATAAAACCCGTTTTGAAGTTACATACACGCGTAATCAGGACATCTTAAAGAATAAACCGGGGATTCATTATGGGCAGCCGATCTTAGAGCAAAATAAGGATGGACAGCGTTTCATTGTAGTGTATGAGGTTGACTGGAAGAACAAGACGGTAAAAGTAGTTGAAAAGTATTCCGACCAAAACAAGCCTTATAAGGCGGGT
CC8 LukA W97 W92 56 CACAAAGACAGCCAGGATCAAAACAAGAAAGAGCACGTGGACAAGAGCCAGCAAAAGGATAAACGTAACGTTACCAACAAGGACAAAAACAGCACCGCGCCGGACGATATCGGCAAGAACGGCAAAATTACCAAGCGTACCGAGACCGTGTACGATGAAAAAACCAACATCCTGCAGAACCTGCAATTCGACTTTATTGACGATCCGACCTGCGATAAAAACGTGCTGCTGGTTAAGATGCAGGGCAGCATCCACAGCAACCTGAAATTCGAAAGCCACAAAGAGGAAAAGAACAGCAACTGGCTGAAGTACCCGAGCGAGTATCACATTGACTTTCAGGTGAAACGTAACCGTAAGACCGAAATCCTGGATCAACTGCCGAAGAACAAAATTAGCACCGCGAAGGTTTGCGCGACCTTCAGCTACAGCAGCGGTTGCAAATTTGACAGCACCAAGTGCATCGGCCGTACCAGCAGCAACAGCTATAGCAAAACCATCAGCTACAACCAGCAAAACTATGATACCATTGCGAGCGGCAAGAACAACAACTGGCACGTGCACTGGAGCATCATTGCGAACGACCTGAAATACGGTGGCGAGGTTAAGAACCGTAACGATGAACTGCTGTTCTATCGTAACACCCGTATCGCGACCGTGGAGAACCCGGAACTGAGCTTTGCGAGCAAATACCGTTATCCGGCGCTGGTGCGTAGCGGTTTCAACCCGGAGTTTCTGGTTTACCTGAGCAACGAGAAAAGCAACGAAAAGACCCAGTTCGAAGTTACCTACACCCGTAACCAAGACATCCTGAAGAACCGTCCGGGTATCCACTATGCTCCGCCGATTCTGGAGAAGAACAAAGATGGCCAACGTCTGATTGTGACCTATGAAGTTGACTGGAAGAACAAAACCGTTAAAGTGGTTGATAAGTACAGCGACGATAACAAACCGTATAAGGCGGGT
CC45 LukA W97 W92 57 GCAAACAAAGACTCACAAGATCAGACAAAGAAAGAGCATGTAGACAAAGCTCAACAGAAGGAAAAGCGCAATGTGAACGACAAGGATAAAAATACTCCTGGTCCAGATGACATTGGTAAGAATGGTAAAGTTACTAAGCGGACCGTCTCTGAATATGATAAGGAGACAAATATTCTCCAGAATTTGCAATTCGATTTCATTGATGATCCGACGTGCGATAAGAACGTATTGCTCGTTAAAATGCAGGGCTCCATCCATTCGAATCTCAAGTTCGAATCCCATCGCAACGAGACAAACGCTTCCTGGCTCAAATATCCTAGCGAGTATCATATCGACTTCCAAGTTCAACGGAACCCTAAAACTGAAATCCTTGATCAACTCCCTAAGAACAAAATCTCAACTGCCAAGGTCTGTGCCACATTTTCTTATTCTCTTGGCTGCAAATTCGATTCAACAAAGTGTATTGGTCGTACATCAAGTAATAGCTATAGTAAAAGCATCAGTTATAACCAGCAAAACTATGATACAATCGCGTCAGGCAAAAACAATAATCGTCATGTCCATTGGTCCATTGTCGCGAACGACCTTAAGTACGGTAACGAAATTAAGAATCGGAACGATGAGTTTTTGTTCTATCGCAACACCCGTCTGTCTACTGTCGAAAACCCGGAGTTGTCCTTCGCAAGTAAATATCGCTATCCTGCTTTGGTACGTTCTGGGTTTAACCCGGAATTTCTCGTCTACATCAGCAACGAGAAAACAAATGACAAAACGCGCTTTGAAGTCACGTACACACGTAATCAGGACATCTTAAAAAATAAACCAGGGATTCACTATGGTCAGCCAATCTTGGAGCAGAATAAAGACGGCCAGCGTTTCATTGTCGTTTATGAAGTGGACTGGAAAAACAAAACTGTTAAGGTGGTTGAGAAATATTCCGACCAAAACAAACCGTATAAGGCCGGT
CC8 LukBwt 58 AAAATCAATTCTGAAATTAAGCAAGTGTCCGAAAAAAATTTGGATGGAGACACGAAGATGTATACGCGTACTGCTACGACGTCAGACTCCCAGAAGAACATTACACAGAGTCTGCAATTTAATTTTCTGACAGAACCAAACTATGACAAGGAAACTGTCTTTATTAAGGCTAAAGGGACTATCGGAAGCGGCTTACGCATTTTAGACCCCAACGGTTATTGGAATAGCACGCTGCGCTGGCCGGGCAGTTACTCAGTATCAATCCAAAATGTCGATGATAACAATAACACCAATGTTACCGATTTCGCCCCCAAGAACCAGGATGAATCGCGCGAGGTTAAATACACATACGGCTACAAGACAGGCGGTGACTTTAGCATCAACCGTGGGGGCTTGACAGGGAATATTACTAAGGAATCAAATTATAGTGAGACTATCTCTTATCAACAACCGTCCTATCGTACCTTATTAGACCAGAGTACCTCCCACAAAGGTGTAGGGTGGAAAGTTGAAGCGCACCTGATTAATAATATGGGTCACGATCACACACGCCAACTGACCAACGACAGTGACAACCGCACAAAAAGTGAAATTTTTAGTCTTACCCGTAACGGAAATCTGTGGGCCAAAGACAATTTTACACCGAAAGATAAGATGCCGGTCACTGTATCTGAGGGGTTCAATCCCGAGTTTTTAGCAGTAATGTCGCATGACAAAAAGGACAAAGGGAAATCCCAGTTTGTTGTCCACTATAAGCGTAGCATGGATGAATTCAAAATCGACTGGAACCGTCACGGTTTCTGGGGTTACTGGTCAGGTGAGAACCACGTAGACAAGAAAGAGGAGAAACTGAGCGCATTATATGAGGTTGATTGGAAAACGCACAATGTGAAATTTGTTAAAGTCCTGAATGACAACGAGAAAAAG
CC45 LukBwt 59 GAAATTAAGTCTAAGATCACAACAGTATCGGAGAAAAACCTGGATGGCGATACTAAGATGTATACACGCACCGCCACTACTTCGGACACGGAGAAGAAGATCTCACAATCGTTACAGTTTAATTTTCTTACAGAACCGAACTACGACAAAGAGACCGTCTTCATTAAAGCTAAAGGTACGATTGGTTCGGGATTAAAAATTCTGAATCCGAATGGCTATTGGAACAGTACCTTACGTTGGCCGGGGTCATATTCTGTATCCATTCAAAACGTGGACGACAATAACAACAGCACCAATGTGACAGATTTCGCTCCAAAGAATCAGGATGAGTCCCGCGAGGTGAAATATACCTATGGGTACAAAACAGGAGGTGACTTTAGCATTAACCGTGGTGGCTTGACTGGTAATATCACGAAGGAAAAAAATTACTCTGAGACTATTTCCTACCAACAGCCGTCGTATCGCACCTTGATCGACCAACCAACGACTAACAAAGGGGTCGCGTGGAAAGTTGAGGCCCACAGTATTAACAATATGGGCCACGATCACACTCGTCAGCTTACTAACGATTCGGATGACCGCGTCAAGTCGGAAATTTTCAGCCTGACGCGTAACGGAAATTTGTGGGCTAAAGACAATTTCACTCCTAAGAACAAGATGCCCGTGACTGTTTCCGAAGGCTTTAATCCCGAATTCTTAGCGGTGATGTCTCATGATAAAAATGATAAAGGAAAATCGCGCTTCATTGTGCATTATAAGCGTTCTATGGACGACTTCAAATTGGATTGGAATAAGCACGGATTCTGGGGGTACTGGTCCGGGGAAAATCACGTAGATCAAAAGGAAGAGAAGTTGTCCGCTTTGTATGAAGTGGACTGGAAGACTCACGACGTTAAGTTGATCAAGACCTTCAATGACAAAGAGAAGAAA
CC8 LukB Val53Leu 60 AAGATCAATTCGGAAATTAAACAGGTAAGTGAGAAAAATTTGGATGGCGATACCAAAATGTACACCCGCACCGCTACCACGTCAGATTCACAAAAAAATATTACACAGTCCTTGCAGTTCAATTTCCTGACAGAACCGAATTACGACAAGGAGACTTTGTTCATTAAAGCCAAGGGAACCATCGGGTCCGGATTGCGTATCTTGGACCCGAACGGATATTGGAACTCGACCTTACGTTGGCCGGGGTCTTACAGTGTTAGTATCCAAAACGTAGATGATAACAATAACACAAACGTGACAGATTTTGCACCTAAAAACCAGGACGAAAGCCGCGAGGTAAAGTACACATATGGGTATAAAACAGGGGGGGACTTTTCCATCAACCGTGGTGGTTTGACCGGGAACATCACCAAAGAGTCAAATTACAGTGAGACCATCAGTTATCAGCAGCCGTCCTATCGTACATTATTGGATCAGTCGACTTCACATAAAGGGGTCGGATGGAAAGTAGAGGCTCATTTGATCAACAACATGGGTCACGATCATACACGTCAGTTAACGAACGATAGCGATAATCGCACGAAGTCAGAAATCTTTAGTCTGACTCGTAACGGTAACTTGTGGGCCAAGGACAATTTCACGCCCAAAGATAAGATGCCTGTGACGGTATCGGAGGGGTTCAATCCAGAATTCCTTGCTGTAATGTCCCATGACAAAAAAGACAAGGGCAAATCGCAATTTGTAGTCCACTATAAGCGTTCTATGGACGAGTTCAAGATTGACTGGAACCGCCACGGCTTCTGGGGGTACTGGAGTGGTGAGAATCATGTGGATAAAAAGGAGGAGAAACTTAGCGCCCTGTATGAGGTAGATTGGAAAACACACAATGTCAAGTTCGTGAAAGTTCTTAATGACAACGAAAAAAAA
CC45 LukB Val53Leu 61 GAGATCAAGAGCAAAATTACCACCGTGAGCGAAAAGAACCTGGACGGTGATACCAAAATGTATACCCGTACCGCGACCACCAGCGACACCGAGAAGAAAATTAGCCAGAGCCTGCAATTCAACTTTCTGACCGAGCCGAACTACGATAAGGAAACCCTGTTCATCAAGGCGAAAGGCACCATTGGTAGCGGCCTGAAAATCCTGAACCCGAACGGTTATTGGAACAGCACCCTGCGTTGGCCGGGTAGCTACAGCGTGAGCATCCAGAACGTTGACGATAACAACAACAGCACCAACGTGACCGACTTCGCGCCGAAGAACCAAGATGAGAGCCGTGAAGTTAAATACACCTATGGTTACAAAACCGGTGGCGACTTTAGCATTAACCGTGGTGGCCTGACCGGCAACATCACCAAGGAGAAAAACTATAGCGAAACCATTAGCTATCAGCAACCGAGCTACCGTACCCTGATCGATCAGCCGACCACCAACAAGGGTGTGGCGTGGAAAGTTGAGGCGCACAGCATTAACAACATGGGCCACGACCACACCCGTCAACTGACCAACGATAGCGACGATCGTGTGAAGAGCGAAATCTTCAGCCTGACCCGTAACGGTAACCTGTGGGCGAAAGACAACTTTACCCCGAAGAACAAAATGCCGGTGACCGTTAGCGAGGGTTTCAACCCGGAATTTCTGGCGGTGATGAGCCACGACAAGAACGATAAGGGCAAAAGCCGTTTCATTGTTCACTACAAACGTAGCATGGACGATTTCAAGCTGGACTGGAACAAACACGGTTTTTGGGGCTATTGGAGCGGCGAGAACCACGTTGATCAGAAAGAGGAGAAACTGAGCGCGCTGTACGAAGTGGACTGGAAGACCCACGATGTTAAGCTGATCAAAACCTTTAACGATAAAGAAAAGAAA
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 변이체 LukA 및 LukB 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 코돈-최적화 방법은 공지되어 있고 이전에 기술되었다(예를 들어, Seed의 국제 특허 출원 공개번호 WO1996/09378, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 비-선호 코돈이 더 선호되는 코돈으로 대체되는 경우, 서열은 코돈 최적화된 것으로 간주된다. 여기에서, 비-선호 코돈은 동일한 아미노산에 대해 코딩하는 다른 코돈보다 유기체에서 덜 빈번하게 사용되는 코돈이고, 더 선호되는 코돈은 비-선호 코돈보다 유기체에서 더 빈번하게 사용되는 코돈이다. 특이적 유기체에 대한 코돈 사용 빈도는 당 기술분야에 잘 알려져 있고 이용 가능한 코돈 빈도 표에서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 하나 초과의 비-선호 코돈, 예를 들어, 10%, 40%, 60%, 80% 초과의 비-선호 코돈, 바람직하게는 대부분 (예를 들어, 적어도 90%) 또는 모든 비-선호 코돈은, 더 선호되는 코돈으로 대체된다. 바람직하게는, 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 코돈 최적화된 서열에 사용된다. 바람직한 코돈에 의한 대체는 일반적으로 더 높은 발현을 초래한다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 일상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 클로닝되거나, DNA 합성에 의해 새로운 형태로 생성될 수 있으며, 이는 DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야에서 사업을 수행하는 서비스 회사(예: GeneArt, GenScript, Invitrogen, Eurofins)에 의한 일상적인 절차를 사용해 수행될 수 있다.
임의의 실시예에서, 전술한 핵산 분자는 벡터, 즉 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물에 사용하기 위한 발현 벡터에 삽입된다. 대안적으로, 이들 핵산 분자는, 암호화된 변이체 LukA 단백질, 변이체 LukB 단백질, 또는 변이체 LukAB 복합체(안정적인 이종이량체로서임)의 발현 및 단리를 위해 적절한 숙주 세포 내로 형질전환되거나 형질감염되는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 여기에서 변이체 LukAB 복합체는 본원에 개시된 변이체 LukA 및 비-변이체 LukB, 비-변이체 LukA 및 변이체 LukB, 또는 변이체 LukA 및 변이체 LukB를 포함한다.
본 개시의 이러한 측면에 따르면, 본원에서 설명되는 바와 같은 S. 아우레우스(S. aureus) LukA 및/또는 LukB 단백질 및 이의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터 내로 통합될 수 있다. 적절한 발현 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화된 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 폴리펩티드의 발현을 제어, 조절, 유발 또는 허용하는 핵산 서열 요소를 포함한다. 이러한 요소는 전사 인핸서 결합 부위, RNA 중합효소 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 다른 부위를 포함할 수 있다. 적절한 벡터는, 제한 없이, DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 선형 핵산, 및 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
일 실시예에서, 발현 벡터는 원형 플라스미드이다(예를 들어, Muthumani 등의 "Optimized and Enhanced DNA Plasmid Vector Based In vivo Construction of a Neutralizing anti-HIV-1 Envelope Glycoprotein Fab," Hum. Vaccin. Immunother. 9: 2253-2262 (2013) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 플라스미드는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체 외로 존재할 수 있다(예를 들어, 복제 원점을 갖는 자가 복제 플라스미드). 예시적인 플라스미드 벡터는, 제한 없이, pCEP4, pREP4, pVAX, pcDNA3.0, provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 변이체 LukA 및/또는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 플라스미드 발현 벡터를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 발현 벡터는 선형 발현 카세트("LEC")이다. LEC는 전기천공을 통해 대상체에게 효율적으로 전달되어 본원에서 설명되는 재조합 핵산 분자에 의해 암호화된 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있다. LEC는 인산염 골격이 결여된 임의의 선형 DNA일 수 있다. 일 실시예에서, LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않는다. 또 다른 실시예에서, LEC는 원하는 유전자 발현과 무관한 다른 핵산 서열을 함유하지 않는다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 본원에서 설명되는 바와 같은 재조합 핵산 분자에 의해 암호화된 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 예시적인 플라스미드는, 제한 없이, pNP (Puerto Rico/34), pM2 (New Caledonia/99), WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 변이체 LukA 및/또는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. LukA 및/또는 t LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 적절한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, Krause 등, "Delivery of Antigens by Viral Vectors for Vaccination," Ther. Deliv. 2(1):51-70 (2011); Ura 등, "Developments in Viral Vector-Based Vaccines," Vaccines 2: 624-641 (2014); Buning 등, "Recent Developments in Adeno- associated Virus Vector Technology," J.　Gene　Med. 10:717-733 (2008) 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 렌티바이러스 벡터(예를 들어, Ura 등, "Developments in Viral Vector-Based Vaccines," Vaccines 2: 624-641 (2014); 및 Hu 등, "Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infection Diseases," Immunol. Rev. 239: 45-61 (2011) 참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 레트로바이러스 벡터(예를 들어, Ura 등, "Developments in Viral Vector-Based Vaccines," Vaccines 2: 624-641 (2014) 참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 우두바이러스, 복제 결핍성 아데노바이러스 벡터, 및 거트리스 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 번호 5,872,005, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)를 포함한다. 벡터로서 사용하기에 적합한 아데노-연관 바이러스(AAV)를 생성하고 단리하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Grieger & Samulski, "Adeno-associated Virus as a　Gene　Therapy　Vector: Vector Development, Production and Clinical Applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145 (2005); Buning 등, "Recent Developments in Adeno- associated Virus Vector Technology," J.　Gene　Med. 10:717-733 (2008) 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
본원에서 설명되는 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 일반적으로 최대 발현을 달성하기 위해 발현 벡터 작제물에서 프로모터, 번역 개시, 3' 미번역 영역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결의 서열과 조합된다. LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 이의 폴리펩티드의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터 서열은 제한 없이, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 극초기 유전자 프로모터(CMV), 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), 트랜스티레틴 프로모터(TTR), 시미안 바이러스 40 프로모터(SV40) 및 CK6 프로모터를 포함한다. 당 기술분야에 공지된 숙주 세포에서 유전자 발현을 유도하기에 적합한 다른 프로모터도 본원에 개시된 발현 작제물에 혼입하기에 적합하다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 발현 작제물은 숙주 세포 내로 공동 형질감염되거나, 연속 형질감염되거나, 별도로 형질감염될 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 단백질 및 폴리펩티드는 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포들의 클론 모집단에 의해 임의로 생산될 수 있고, (예를 들어, Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd　Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan 등, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan 등, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에서도 주지되어 있는 바와 같다. 이러한 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균 세포일 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드는 박테리아 세포에서 생산된다. 적절한 박테리아 숙주 세포는, 제한 없이, 에스케리치아(Escherichia) 숙주 세포, 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 숙주 세포, 스트렙토미세스(Streptomyces) 숙주 세포, 미코박테륨(Mycobacterium) 숙주 세포, 및 바실루스(Bacillus) 숙주 세포를 포함한다. 임의의 실시예에서, 숙주 세포는 에스케리치아(Escherichia) 숙주 세포이다. 임의의 실시예에서, 숙주 세포는 S. 아우레우스(S. aureus) 숙주 세포이다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드는 진핵 세포에서 생산된다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원일 수 있다. 포유동물 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0 (ATCC(American Type Culture Collection)), 마나사스, 버지니아, CRL-1581), NSO (ECACC(European Collection of Cell Cultures)), 솔즈베리, 윌트셔, 영국, ECACC 번호 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 쥣과 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 CHO-K1SV(Lonza Biologics, 워커스빌, 메디슨), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44와 같은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래된 것들을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 LukA 및 LukB 폴리펩티드는 전술한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 단백질은 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 단백질 또는 폴리펩티드를 회수하는 데 흔히 사용되는 표준 클로닝 및 세포 배양 기술에 의해 생산된다. 숙주 세포를 형질감염시키는 것은, 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는 데 일반적으로 사용되는 다양한 기술을 사용하여, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 설명되는 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드는 당질화, 이성질체화, 탈당질화 또는 비-자연 발생 공유 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 첨가(pegylation) 및 지질화 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이러한 변형은 생체 내 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 바람직하게는 "단리된" 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드이다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된"은 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 그의 생산 환경의 성분으로부터 식별, 분리 및/또는 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 생산 환경으로부터의 다른 성분과의 연관성을 갖지 않는다. 재조합 형질감염 세포로부터 생성된 것과 같은, 생산 환경의 오염 성분은 일반적으로 약학적 사용을 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수되고 정제된다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제에 사용될 수 있다.
S. 아우레우스(S. aureus ) 백신 조성물
본 개시의 다른 측면은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물에 관한 것이다. 임의의 실시예에서, S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조성물은 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드 중 어느 하나 이상, 또는 본원에서 설명되는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 특히, 백신 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 본원에 식별되고 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 잔기 중 어느 하나에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukA 변이체는 서열번호 25의 변이체 또는 서열번호 1, 2 또는 26-38 중 어느 하나의 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukA 변이체는 서열번호 1의 변이체를 포함한다 (CC8). 예시적인 CC8 LukA 변이체는 서열번호 3, 5, 7, 9 및 13의 LukA 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukA 변이체는 서열번호 2의 변이체를 포함한다 (CC45). 예시적인 CC45 LukA 변이체는 서열번호 4, 6, 8, 10, 11, 12 및 14의 LukA 변이체를 포함하되 이들로 한정되지는 않는다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조성물은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조성물은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조성물은 본원에서 설명되는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드 중 어느 하나 이상, 또는 본원에서 설명되는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 특히, 백신 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 본원에 식별되고 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 잔기 중 어느 하나에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukB 변이체는 서열번호 39의 변이체 또는 서열번호 15, 16 또는 40-51 중 어느 하나의 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukB 변이체는 서열번호 15의 변이체를 포함한다 (CC8). 예시적인 CC8 LukB 변이체는 서열번호 17, 19 및 21의 LukB 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukB 변이체는 서열번호 16의 변이체를 포함한다 (CC45). 예시적인 CC45 LukB 변이체는 서열번호 18, 20 및 21의 LukB 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물은 LukA 및 LukB 단백질 둘 다를 포함한다. 따라서, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 비-변이체 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, CC8 LukB 서열 변이체 서열은 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 5의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 7의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 9의 CC8 LukA 변이체를 포함한다.
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, CC45 LukB 변이체 서열은 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 5의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 7의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 9의 CC8 LukA 변이체를 포함한다.
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하는 변이체 LukA 단백질 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 단백질을 포함한다.
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, CC45 LukB 변이체 서열은 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 6의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 8의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 10의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 11의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 12의 CC45 LukA 변이체를 포함한다.
일 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
일 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
일 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
일 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
일 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, CC8 LukB 변이체 서열은 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 6의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 8의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 9의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 10의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 11의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열과 조합된 서열번호 12의 CC45 LukA 변이체를 포함한다.
본 개시의 다른 측면은 본원에서 설명되는 바와 같은 변이체 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 LukB 변이체를 암호화하는 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물에 관한 것이다. 특히, 백신 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukB 변이체는 서열번호 15의 변이체를 포함한다 (CC8). 예시적인 CC8 LukB 변이체는 서열번호 17, 19 및 21의 LukB 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukB 변이체는 서열번호 16의 변이체를 포함한다 (CC45). 예시적인 CC45 LukB 변이체는 서열번호 18, 20 및 22의 LukB 변이체를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물은 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 갖는 본원에서 설명되는 바와 같은 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 1의 CC8 LukA 서열 또는 서열번호 1과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 및 21의 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 2의 CC45 LukA 서열 또는 서열번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 및 21의 변이체를 포함한다. 　
임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 1의 CC8 LukA 서열 또는 서열번호 1과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 또는 22의 변이체를 포함한다. 　 임의의 실시예에서, 백신 조성물은 서열번호 2의 CC45 LukA 서열 또는 서열번호 2과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 또는 22의 변이체를 포함한다. 　
본 개시의 백신 조성물은 본원에서 설명되는 바와 같은 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제형화함으로써 제조된다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당 기술분야에 공지되어 있다, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (예: 제21판 (2005) 및 이후 판). 추가 성분의 비제한적인 예로는: 완충제, 희석제, 용매, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 및 킬레이트제를 포함한다. 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체가 본 발명의 약학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약학적으로 허용 가능한 부형제"(예를 들어, 희석제, 면역자극제, 애쥬번트, 항산화제, 보존제 및 가용화제와 같은 첨가제)는 사용된 용량 및 농도에서 조성물을 투여하는 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는, 예를 들어, 인산염, 구연산염 및 다른 유기산으로 완충된, 물을 포함한다. 본 개시에서 유용할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 부형제의 대표적인 예로는 아스코르브산과 같은 항산화제; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 고분자, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린를 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물은 액체 제형이다. 액체 제형의 바람직한 예는 수성 제형, 즉, 물을 포함하는 제형이다. 액체 제형은 용액, 현탁액, 유화액, 마이크로유화액, 겔 등을 포함할 수 있다. 수성 제형은 통상적으로 적어도 50% w/w의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% w/w의 물을 포함한다.
백신 조성물은 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "애쥬번트(adjuvant)"는 본원에서 설명되는 LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드와 함께 투여될 때 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강, 강화 및/또는 부스팅시키는 화합물을 지칭한다. 그러나, 애쥬번트 화합물이 단독으로 투여되는 경우, 이를 암호화하는 전술한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 생성하지 않는다. 애쥬번트는, 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 항원 제시 세포의 자극을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본원에서 설명되는 백신 조성물은 애쥬번트를 포함하거나 애쥬번트와 병용하여 투여된다. 본원에서 설명되는 백신 조성물과 병용하여 투여하기 위한 애쥬번트는 백신 조성물의 투여 전, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다.
적절한 애쥬번트는 당 기술분야에 공지되어 있으며, 편모, 프로인드 완전 애쥬번트, 프로인드 불완전 애쥬번트, 수산화알루미늄, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 유화액, 디니트로페놀, 이소코매트릭스, 및 리포솜 폴리양이온 DNA 입자를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 애쥬번트의 추가 예는, 예를 들어, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는, 미국 특허 제6,355,625호에 기술된 바와 같은 β-글루칸, 또는 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF)를 포함한다.
추가적인 예시적인 애쥬번트는 알루미늄 염 (alum) (예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 산화 알루미늄, 예로 명반 또는 nanoalum 제형을 포함하는 나노입자), 인산칼슘(예를 들어, Masson JD 외, Expert Rev Vaccines 16: 289-299 (2017), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL) (예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), AS01, AS02, AS03 및 AS04 (예를 들어, EP1126876, US7357936 (AS04의 경우), EP0671948, EP0761231, US5750110 (AS02의 경우), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 델타-이눌린(예를 들어, Petrovsky N 및 PD Cooper, Vaccine 33: 5920-5926 (2015), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), STING-활성화 합성 환형-디-뉴클레오티드(예를 들어, US20150056224, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 레시틴 및 카보머 동종중합체의 조합 (예를 들어, US6,676,958, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 사포닌, 예컨대 Quil A 및 QS21(예를 들어, Zhu D 및 W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 선택적으로 QS7 (Kensil 등, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 제5,057,540호 참조, 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)과 조합하여 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 프로인드 애쥬번트(완전 또는 불완전)이다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 Quil-A, 예를 들어, Brenntag(현재의 Croda) 또는 Invivogen으로부터 상업적으로 수득할 수 있는 것을 포함한다. QuilA는 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 몰리나 나무에서 추출 가능한 사포닌 분획을 함유하고 있다. 이들 사포닌은 일반적인 트리테르페노이드 골격 구조를 갖는, 트리테르페노이드 사포닌 군에 속한다. 사포닌은 T-의존적 항원뿐만 아니라 T-독립적 항원에 대한 강한 애쥬번트 반응뿐만 아니라, 강력한 세포독성 CD8+ 림프구 반응을 유도하고 점막 항원에 대한 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 사포닌을 포함한다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 QS-21을 포함한다.
임의의 실시예에서, 사포닌은 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어, 상이한 기원으로부터의 광범위한 항원에 대한 항체-매개 및 세포-매개 면역 반응을 활성화시킬 수 있는, 면역자극 복합체(ISCOM)를 형성한다. 특정 실시예에서, 애쥬번트는 AS01, 예를 들어 AS01B이다. AS01은 MPL(3-O-데사실-4'-모노포스포릴 지질 A), QS21(키라야 사포나리아 몰리나, 분획 21), 및 리포솜을 함유하는 애쥬번트 시스템이다. 소정의 실시예들에서, AS01은 상업적으로 이용 가능하거나 WO 96/33739에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 애쥬번트는 유화액을 포함하는데, 이는 2개의 불혼화성 유체, 예를 들어, 오일과 물의 혼합물이며, 그 중 하나는 다른 것의 내부에 작은 방울로서 현탁되고 표면 활성제에 의해 안정화된다. 수중유 유화액은 오일의 작은 액적을 둘러싸는, 연속 상을 형성하는 물을 가지는 반면, 유중수 유화액은 연속 상을 형성하는 오일을 갖는다. 특정 수중유 유화액은 스쿠알렌(대사 가능한 오일)을 포함한다. 특정 애쥬번트는 블록 공중합체를 포함하며, 이는 2개의 단량체가 함께 클러스터링되어 반복 단위의 블록을 형성할 때 형성되는 공중합체이다. 블록 공중합체, 스쿠알렌 및 미세미립자형 안정화제를 포함하는 유중수 유화액의 예는 TiterMax®이며, 이는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
임의로, 유화액은 TLR4 작용제와 같은, 추가 면역자극 성분과 조합되거나 이를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 조성물에 사용하기 위한 애쥬번트 조합의 적절한, 그러나 비제한적인 예는, 수중유 유화액(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩 오일), MF59(예를 들어, EP0399843, US 6299884, US6451325 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 AS03, 선택적으로, 면역 자극제, 예컨대, AS02에서와 같은 모노포스포릴 지질 A 및/또는 QS21와 조합된다(예를 들어, Stoute 등, N. Engl. J. Med. 336: 86-91 (1997)s 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 애쥬번트의 추가 예는, AS01E 및 AS01B에서와 같은, MPL 및 QS21과 같은 면역 자극제를 함유하는 리포솜이다(예를 들어, US 2011/0206758 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 애쥬번트의 다른 예는 CpG 및 이미다조퀴놀린(예: 이미퀴모드 및 R848)이다(예를 들어, Reed G. 등 Nature Med, 19: 1597-1608 (2013) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 본 발명에 따른 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 Th1 애쥬번트이다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 백신 조성물의 애쥬번트는 톨-유사 수용체 4(TLR4) 작용제를 단독으로 또는 또 다른 애쥬번트와 조합하여 함유한다. TLR4 작용제는 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Ireton GC 및 SG Reed, Expert Rev Vaccines 12: 793-807 (2013) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 지질 A, 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 TLR4 작용제이다.
임의의 실시예에서, 백신 조성물의 애쥬번트는 지질 A 또는 지질 A 유사체 또는 유도체를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A"는 글루코사민을 포함하고, 그램-음성 세균의 외막의 외엽 내에 LPS 분자를 고정시키는, 케토시드 결합을 통해 LPS 분자의 내부 코어에서 케토-데옥시옥툴로소네이트에 연결되는 LPS 분자의 소수성 지질 모이어티를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질 A는 자연적으로 발생하는 지질 A, 이의 혼합물, 유사체, 유도체 및 전구체를 포함한다. 상기 용어는 단당류, 예를 들어, 지질 X로 지칭되는 지질 A의 전구체; 이당류 지질 A; 헵타-아실 지질 A; 헥사-아실 지질 A; 펜타-아실 지질 A; 예를 들어, 지질 IVA로서 지칭되는, 지질 A의 테트라-아실 전구체, 테트라-아실 지질 A; 디포스포릴 지질 A; 모노포스포릴 지질 A; 디포스포릴 지질 A, 예컨대 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 및 로도박터 세파에로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 지질 A를 포함한다. 몇몇 면역 활성화 지질 A 구조는 6개의 아실 사슬을 함유한다. 글루코사민 당에 직접 부착된 4개의 일차 아실 사슬은 일반적으로 10 내지 16개의 탄소 길이인 3-하이드록시 아실 사슬이다. 2개의 추가 아실 사슬은 종종 일차 아실 사슬의 3-하이드록시 기에 부착된다. 예로서, E. 콜리(E. coli) 지질 A는 일반적으로 당에 부착된 4개의 C14 3-히드록시 아실 사슬 및 2' 및 3' 위치에서 일차 아실 사슬의 3-히드록시 기에 부착된 1개의 C12 및 1개의 C14를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A 유사체 또는 유도체"는 지질 A의 구조 및 면역학적 활성과 유사하지만, 반드시 자연에서 발생하는 것은 아닌 분자를 지칭한다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 단축되거나 축합되고/되거나, 위치 4'에서 인산염 대신 갈락투론산 모이어티를 가지도록, 환원 말단에서 글루코사민-1-포스페이트 대신 2-데옥시-2-아미노글루콘산을 함유하도록, 또 다른 아민 당 잔기, 예를 들어 갈락토사민 잔기로 치환된 이들의 글루코사민 잔기를 갖도록 변형될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어, 화학적 유도에 의해, 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조되거나, 예를 들어, 선호되는 지질 A의 구조를 먼저 결정하고 이의 유사체 또는 유도체를 합성함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 또한 TLR4 작용제 애쥬번트로서 유용하다(예를 들어, Gregg KA 등, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17 (2017) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
MPL 및 3D-MPL은 지질 A 독성을 약화시키기 위해 변형된 지질 A 유사체 또는 유도체이다. 지질 A, MPL, 및 3D-MPL은 긴 지방산 사슬이 부착되는 당 골격을 가지며, 여기서 골격은 글리코시드 연결에서 2개의 6-탄소 당을 함유하고, 4 위치에서 포스포릴 모이어티를 함유한다. 일반적으로, 5 내지 8개의 장쇄 지방산(보통 12 내지 14개의 탄소 원자)이 당 골격에 부착된다. 천연 공급원의 유도체화로 인해, MPL 또는 3D-MPL은 다양한 지방산 길이를 가지면서, 다수의 지방산 치환 패턴, 예를 들어 헵타-아실, 헥사-아실, 펜타-아실 등의 복합물 또는 혼합물로서 존재할 수 있다. 이는 본원에서 설명되는 다른 지질 A 유사체 또는 유도체 중 일부에 대해서도 사실이지만, 합성 지질 A 변이체가 정의되고 균질할 수도 있다. MPL 및 그 제조는 미국 특허 제4,436,727호에 기술되어 있으며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 3D-MPL은 미국 특허 제4,912,094B1호(이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술되어 있고, 위치 3에서 환원 말단 글루코사민에 연결된 에스테르인 3-히드록시미리스틱 아실 잔기의 선택적 제거에 의해 MPL과 상이하다. 본원에서 설명되는 백신 조성물에 포함시키기에 적합한 지질 A(아날로그, 유도체)의 예는 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 EP1385541 참조), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 애쥬번트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어, US20100310602 및 US8722064 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), SLA (예를 들어, Carter D 등, Clin. Transl. Immunology 5: e108 (doi:10.1038/cti.2016.63) (2016) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합되고, 인간 백신에 대한 TLR4 리간드를 최적화하기 위한 구조-기능 접근법을 기술함), PHAD (인산화 헥사아실 이당류; 그 구조가 GLA와 동일함), 3D-PHAD, 3D-(6-아실)-PHAD (3D(6A)-PHAD), E6020 (CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174, 기타 등등을 포함한다. 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 애쥬번트는 3D-MPL, GLA, 또는 SLA로부터 선택된 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하는 TLR4 작용제 애쥬번트이다. 특정 실시예에서, 지질 A 유사체 또는 유도체는 리포솜으로 제형화된다.
바람직하게는 TLR4 작용제를 포함하는, 애쥬번트는, 다양한 방식으로, 예를 들어, 유화액, 예컨대 유중수(w/o) 유화액 또는 수중유(o/w) 유화액(예는 MF59, AS03임), 안정적 (나노-)유화액 (SE), 지질 현탁액, 리포솜, (중합체) 나노입자, 비로솜, 흡착된 명반, 수성 제형(AF), 기타 등등으로 제형화될 수 있어서, 애쥬번트의 면역조절 분자 및/또는 면역원에 대한 다양한 전달 시스템을 나타낸다(예를 들어, Reed 외, Nature Med, 19: 1597-1608 (2013) 및 Alving CR 외, Curr Opin Immunol 24: 310-315 (2012) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
임의의 실시예에서, 면역자극 TLR4 작용제는 임의로 다른 면역조절 성분, 예컨대 스쿠알렌 수중유 유화액(SE)(예를 들어,MF59; AS03); 사포닌(예를 들어, QuilA, QS7, QS21, 매트릭스 M, 이소콤, 이소코매트릭스, 등); 알루미늄 염; 다른 TLR에 대한 활성화제(예를 들어, 이미다조퀴놀린, 편모, dsRNA 유사체, TLR9 작용제, 예컨대 CpG, 등); 기타 등등(예를 들어, Reed G. 외, Nature Med, 19: 1597-1608 (2013) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)과 조합될 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 백신 조성물의 애쥬번트는 TLR4 작용제의 조합, 예를 들어, SE와 조합된, GLA (즉, GLA-SE)이다. 임의의 실시예에서, 본원에 개시된 백신 조성물의 애쥬번트는 TLR4 작용제의 조합, 예를 들어, 사포닌과 조합된, GLA(예를 들어, GLS-QS21)이다. 임의의 실시예에서, 전술한 애쥬번트는 리포솜으로서 제형화될 수 있다. 따라서, 예시적인 애쥬번트는 또한, 리포솜으로 제형화된, 합성 TLR4 작용제(예: MPL [GLA]) 및 사포닌(예: QS21)을 포함하는, GLA-LSQ를 포함한다.
본원에서 설명되는 백신 조성물에 사용하기 위한 추가적인 예시적인 애쥬번트는 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하고, 예를 들어, SLA-SE (합성 MPL [SLA], 스쿠알렌 오일/물 유화액), SLA-Nanoalum (합성 MPL [SLA], 알루미늄 염), GLA- Nanoalum (합성 MPL [GLA], 알루미늄 염), SLA-AF(합성 MPL [SLA], 수성 현탁액), GLA-AF (합성 MPL [GLA], 수성 현탁액,) SLA-알룸 (합성 MPL [SLA], 알루미늄 염), GLA-알룸 (합성 MPL [GLA], 알루미늄 염), AS01(MPL, QS21, 리포솜), AS02(MPL, QS21, 오일/물 유화액), AS25(MPL, 오일/물 유화액), AS04(MPL, 알루미늄 염), 및 AS15(MPL, QS21, CpG, 리포솜)을 포함한다. 참조: 예를 들어, WO2008/153541; WO2010/141861; WO2013/119856; WO2019/051149; WO 2013/119856; WO 2006/116423; 미국 특허 번호 4,987,237; 미국 특허 번호 4,436,727; 미국 특허 번호 4,877,611; 미국 특허 번호 4,866,034; 미국 특허 번호 4,912,094; 미국 특허 번호 4,987,237; 미국 특허 번호 5,191,072; 미국 특허 번호 5,593,969; 미국 특허 번호 6,759,241; 미국 특허 번호 9,017,698; 미국 특허 번호 9,149,521; 미국 특허 번호 9,149,522; 미국 특허 번호 9,415,097; 미국 특허 번호 9,415,101; 미국 특허 번호 9,504,743; Reed G. 등, Nature Med, 19: 1597-1608 (2013), Johnson 등, J Med Chem, 42:4640-4649 (1999), 및 Ulrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
임의의 실시예에서, 백신 조성물의 LukA 및/또는 LukB 단백질 또는 이의 폴리펩티드는 면역원성 담체 분자에 접합될 수 있다. 적절한 면역원성 담체 분자는, 소 혈청 알부민, 닭 달걀 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 티로글로불린, 폐렴구균 협막 다당류, CRM 197, 및 수막구균 외막 단백질을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
백신 조성물은 추가로 혈청형 336 다당류 항원, 응집 인자(clumping factor) A, 응집 인자 B, 피브리노겐 결합 단백질, 콜라겐 결합 단백질, 엘라스틴 결합 단백질, MHC 유사 단백질, 다당류 세포내 부착, 베타 용혈소, 델타 용혈소, 판톤-발렌틴 류코시딘, 류코시딘 M, 박리성 독소 A, 박리성 독소 B, V8 프로테아제, 히알루론산 분해효소, 리파아제, 스태필로키나아제, 장독소, 장독소 초항원 SEA, 장독소 초항원 SAB, 독성 쇼크 증후군 독소-1, 폴리-N-숙시닐 베타-1→6 글루코사민, 카탈라아제, 베타-락타마아제, 테이코산, 펩티도글리칸, 페니실린 결합 단백질, 화학주성 억제 단백질, 보체 억제제, Sbi, 5형 항원, 8형 항원, 및 리포티코산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원을 포함한다. 본원에서 설명되는 백신 조성물에 포함하기에 적합한 다른 S. 아우레우스(S. aureus) 항원은 다음을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다: CP5, CP8, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, EsxAB(융합), IsdA, IsdB, IsdC, MntC, rTSST-1, rTSST-1v, TSST-1, SasF, vWbp, vWh 비트로넥틴 결합 단백질, Aaa, Aap, Ant, 자가리신 글루코사미니다아제, 자가리신 아미다아제, Can, 콜라겐 결합 단백질, Csa1A, EFB, 엘라스틴 결합 단백질, EPB, FbpA, 피브리노겐 결합 단백질, 피브로넥틴 결합 단백질, FhuD, FhuD2, FnbA, FnbB, GehD, HarA, HBP, 면역우성 ABC 수송체, IsaA/PisA, 라미닌 수용체, 리파아제 GehD, MAP, Mg2+ 수송체, MHC II 유사체, MRPII, NPase, RNA III 활성화 단백질 (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SEA 엑소독소, SEB 엑소독소, mSEB, SitC, Ni ABC 수송체, SitC/MntC/살리바 결합 단백질, SsaA, SSP-1, SSP-2, Sta006, 및 Sta011.
임의의 실시예에서, 백신 조성물은, 예를 들어, 주사 디바이스(예: 주사기 또는 주입 펌프)를 통해 주사될 수 있는 주사식으로서 제형화된다. 주사는, 예를 들어, 근육내, 복강내, 유리체강내, 또는 정맥내로 전달될 수 있다.
본 개시의 백신 조성물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물의 용액, 현탁액 또는 유화액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 오일 중의 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 제조될 수 있다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 또는 광물유이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주사 가능한 용액에 대해 바람직한 액체 담체이다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주사용 용도에 적합한 약학적 백신 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균 상태여야 하며, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 상태 하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은, 미생물의 오염 작용에 맞서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물은 고형 제형, 예를 들어, 냉동 건조된 또는 분무 건조된 조성물이며, 이는 그대로 사용될 수 있거나, 사용 전에 의사 또는 환자가 여기에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다. 고형 투여 형태는 정제, 예컨대 압축된 정제, 및/또는 코팅된 정제, 및 캡슐(예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐)을 포함할 수 있다. 백신 조성물은, 예를 들어, 재구성을 위한 낭, 드래지, 분말, 과립, 캔디 또는 분말 형태일 수도 있다.
백신 조성물의 투여 형태는 즉시 방출형일 수 있고, 이 경우 이들은 수용성 또는 분산성 담체를 포함할 수 있거나, 지연 방출, 서방형, 또는 변형 방출형일 수 있고, 이 경우 이들은 위장관 또는 피부 아래에서 투여 형태의 용해 속도를 조절하는 수불용성 고분자를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 백신 조성물은 비강내, 구강내, 또는 설하로 전달될 수 있다.
백신 조성물의 수성 제형에서의 pH는 pH 3 내지 pH 10일 수 있다. 일 실시예에서, 백신 조성물의 pH는 약 7.0 내지 약 9.5이다. 또 다른 실시예에서, 백신 조성물의 pH는 약 3.0 내지 약 7.0이다.
S. 아우레우스( S. aureus ) 백신 조성물의 용도
본 개시의 다른 측면은 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 발병을 예방하거나 억제하기 위한 본원에서 설명되는 백신 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시예에서, 본 개시는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 대상체에서 상기 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 생성하는 데 효과적인 조건 하에서 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예는, 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예는, 본원에 개시된 바와 같은 백신 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)의 집락화 또는 재집락화를 탈집락화 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 측면에 따르면, 본원에서 설명되는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)의 단기 및 지속성 집락화 또는 재집락화를 예방하는 데 적합하다.
이들 방법은 본원에서 설명되는 백신 조성물 중 어느 하나를 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus) 노출 또는 감염 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 백신 조성물은 LukA 변이체 폴리펩티드(즉, 서열번호 1 또는 2의 변이체) 및 전술한 야생형 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 백신 조성물은 전술한 야생형 LukA 단백질 또는 폴리펩티드 및 LukB 변이체 폴리펩티드(즉, 서열번호 15 또는 16의 변이체)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 백신 조성물은 전술한 LukA 변이체 폴리펩티드 및 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시의 본 측면에 따른 치료에 적합한 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염이 발생할 위험이 있는 대상체이다.
본 개시의 이러한 측면에 따르면, 예방적으로 유효한 양의 백신 조성물이 대상체에게 투여되어 S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 면역 반응을 생성한다. 예방적으로 유효한 양은 체액성(즉, 항체 매개) 및 세포성(T 세포) 면역 반응을 생성하거나 유도하는 데 필요한 양이다. 유도된 체액성 반응은 그렇지 않으면 이러한 반응이 없을 때 발생할 수 있는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 정도를 예방하거나 적어도 감소시키기에 충분하다. 바람직하게는, 본원에서 설명되는 백신 조성물의 예방적 유효량을 투여하면 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 중화 면역 반응이 유도된다. 대상체에서 효과적인 면역 반응을 유발하기 위해, 조성물은 전술한 하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원 또는 애쥬번트를 추가로 함유할 수 있다. 대안적인 실시예에서, 애쥬번트는 본 개시의 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여와 동시에, 조성물과 별도로 대상체에게 투여된다.
본 개시의 본 측면의 목적을 위해, 표적 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 포함한다. 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염 및 S. 아우레우스(S. aureus) 집락화의 중증도를 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 목적으로 백신 조성물을 투여하는 맥락에서, 표적 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus)에 감염될 위험이 있는 임의의 대상체를 포함한다. 특히 취약한 대상체는 면역손상 영유아, 청소년, 성인 및 노인을 포함한다. 그러나, S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 위험이 있는 임의의 영유아, 청소년, 성인 또는 노인은 본원에서 설명되는 방법 및 백신 조성물에 따라 치료될 수 있다. 특히 적합한 대상체는 메티실린-내성 S. 아우레우스(S. aureus) (MRSA) 또는 메티실린 감수성 S. 아우레우스(S. aureus) (MSSA)에 감염될 위험이 있는 대상체를 포함한다. 다른 적합한 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염, 즉, S. 아우레우스(S. aureus) 관련 병태, 예를 들어, 피부 상처 및 감염, 조직 농양, 모낭염, 골수염, 폐렴, 가피성 피부 증후군, 패혈증, 패혈성 관절염, 심근염, 심내막염, 및 독성 쇼크 증후군으로 인한 병태를 갖거나 이에 의해 발생할 위험이 있는 대상체를 포함한다.
임의의 실시예에서, 대상체는 최소한 또는 최대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 또는 90세(또는 그 안에서 파생 가능한 모든 범위)이다. 특정 실시예에서, 본원에서 설명되는 대상체 또는 환자는, 인간 대상체와 같은 소아 대상체이다. 소아 대상체는 18세 미만으로 정의되는 대상체이다. 임의의 실시예에서, 소아 대상체는 2세 이하이다. 임의의 실시예에서, 소아 대상체는 1세 미만이다. 임의의 실시예에서, 소아 대상체는 6개월 미만이다. 임의의 실시예에서, 소아 대상체는 2개월 이하이다. 임의의 실시예에서, 인간 환자는 65세 이상이다. 임의의 실시예에서, 인간 환자는 의료 종사자이다. 임의의 실시예에서, 환자는 수술 절차를 받게 될 것이다.
강력한 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 백신 조성물을 투여할 때 수많은 다른 인자가 또한 고려될 수 있다. 이들 인자는, 예를 들어, 제한 없이, 조성물 중의 활성제의 농도, 투여 방식 및 빈도, 및 연령, 체중 및 전반적 건강 및 면역 상태와 같은 대상체의 세부사항을 포함한다. 일반 지침은, 예를 들어, 국제 조화 회의(International Conference on Harmonization) 및 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Company 1990)의 간행물에서 일반적인 지침을 찾을 수 있으며, 이는 전체 내용이 참조로 포함된다. 임상의는 원하는 또는 요구되는 예방적 효과, 예를 들어 원하는 항체 역가를 제공하는 투여량에 도달할 때까지 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물을 투여할 수 있다. 예방적 반응의 진행은 종래의 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
본 개시의 일 실시예에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 백신 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus)에 감염될 위험이 있거나 관련 병태가 발생할 위험이 있는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 발생을 예방, 지연 또는 억제하기 위해 예방적으로 투여된다. 본 개시의 임의의 실시예에서, 백신 조성물의 예방적 투여는 개체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 완전히 예방하는 데 효과적이다. 다른 실시예에서, 예방적 투여는 그렇지 않으면 이러한 투여의 부재 시 발생할 감염의 완전한 정도를 예방, 즉, 개체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 실질적으로 예방하거나 억제하는 데 효과적이다.
S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 예방하기 위해 예방적 조성물을 사용하는 맥락에서, 조성물의 투여량은 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 매개 세포독성을 중화시킬 수 있는 항체 역가를 생성하기에 적합하고, 다수의 증상의 감소, 적어도 하나의 증상의 중증도 감소, 또는 적어도 하나의 증상의 추가 진행의 지연, 또는 심지어 감염의 완전 완화를 달성할 수 있는 것이다.
본원에서 설명되는 백신 조성물의 예방적 유효량은 애쥬번트가 공동 투여되는지 여부에 따라 달라지며, 애쥬번트가 없는 경우 더 높은 투여량이 요구된다. 투여를 위한 변이체 LukA 및/또는 LukB의 양은 환자당 1 μg 내지 500 μg로 다양할 수 있다. 임의의 실시예에서, 5, 10, 20, 25, 50 또는 100 μg이 각각의 인간 주사에 사용된다. 때때로, 주사 당 1-50 mg의 더 높은 투여량이 사용된다. 일반적으로, 약 10, 20, 30, 40, 또는 50 mg이 각각의 인간 주사에 사용된다. 주사 시기는 1년에 한 번에서 10년에 한 번까지 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로, 유효 투여량은, 당 기술분야에 잘 알려져 있고 측정될 특정 항원에 쉽게 적응할 수 있는 방법을 사용하여, 대상체로부터의 유체 샘플, 일반적으로 혈액 혈청 샘플을 수득하고, LukA, LukB 또는 LukAB에 대해 개발된 항체의 역가를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 이상적으로는, 초기 투여 전에 샘플을 채취하고, 후속 샘플은 각각의 면역화 후에 채취하여 역가를 부여한다. 일반적으로, 1:100의 혈청 희석에서 대조군 또는 "배경" 수준보다 적어도 4배 더 큰 검출 가능한 역가를 제공하는 투여량 또는 투여 일정이 바람직하며, 여기서 배경은 대조군 혈청에 대해 정의되거나 ELISA 검정에서 플레이트 배경에 대해 상대적으로 정의된다.
본 개시의 백신 조성물은 예방적 치료를 위한 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 복강 내, 비강 내 또는 근육 내 수단에 의해 투여될 수 있다.
본 개시의 백신 조성물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물의 용액, 현탁액 또는 유화액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 오일 중의 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 제조될 수 있다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 또는 광물유이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주사 가능한 용액에 대해 바람직한 액체 담체이다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주사용 용도에 적합한 약학적 백신 제형은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균 상태여야 하며, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 상태 하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은, 미생물의 오염 작용에 맞서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
실시예
본 개시는 다음의 비제한적인 실시예를 제공한다.
실시예 1은 서열번호 25의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A (LukA) 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 2는 실시예 1의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 　
실시예 3은 실시예 2의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 알라닌으로의 (Glu323Ala) 치환을 포함한다.
실시예 4는 실시예 1 내지 3 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Lys83에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환이 리신에서 메티오닌으로의 (Lys83Met) 치환을 포함한다.
실시예 5는 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Ser141에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린에서 알라닌으로의 (Ser141Ala) 치환을 포함한다.
실시예 6은 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Val113에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 이소류신으로의 (Val113Ile) 치환을 포함한다.
실시예 7은 실시예 1 내지 6 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Val193에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 이소류신으로의 (Val193Ile) 치환을 포함한다.
실시예 8은 실시예 2 내지 7 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 9는 실시예 8의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 아미노산 치환은 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala를 포함한다.
실시예 10은 실시예 1의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 1에서의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체이다. 　
실시예 11은 실시예 10의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 12는 실시예 1의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 2에서의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체이다. 　
실시예 13은 실시예 12의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 14는 실시예 1 내지 13 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 　
실시예 15는 실시예 14의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Tyr74에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 티로신에서 시스테인으로의 (Tyr74Cys) 치환을 포함한다.
실시예 16은 실시예 14 또는 15의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Asp140에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴에서 시스테인으로의 (Asp140Cys) 치환을 포함한다.
실시예 17은 실시예 14 내지 16 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Gly149에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신에서 시스테인으로의 (Gly149Cys) 치환을 포함한다.
실시예 18은 실시예 14 내지 17 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신에서 시스테인으로의 (Gly156Cys) 치환을 포함한다.
실시예 19는 실시예 14 내지 18 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 20은 실시예 14의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys 및 Gly153Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체이다. 　
실시예 21은 실시예 20의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 22는 실시예 14의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys 및 Gly154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체이다. 　
실시예 23은 실시예 22의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 24는 실시예 1 내지 23 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 　
실시예 25는 실시예 24의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 발린으로의 (Thr249Val) 치환을 포함한다.
실시예 26은 실시예 25의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체 LukA 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 27은 아미노-말단 신호 서열을 더 포함하는 실시예 1 내지 26 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드이다.
실시예 28은 실시예 27의 LukA 변이체 폴리펩티드로서, 아미노산-말단 신호 서열은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 29는 아미노-말단 정제 서열을 추가로 포함하는 실시예 1 내지 28 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드이다.
실시예 30은실시예 1 내지 29 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자이다.
실시예 31은 실시예 30의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터이다.
실시예 32는실시예 31의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
실시예 33은 서열번호 39의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B (LukB) 단백질 또는 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 34는 실시예 33의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 (Val53Leu) 치환을 포함한다.
실시예 35는 실시예 33의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체이다. 　
실시예 36은 실시예 35의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 37은 실시예 33의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체이다. 　
실시예 38은 실시예 37의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 39는 실시예 33 또는 실시예 34의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 　
실시예 40은 실시예 39의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Glu45에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu45Cys) 치환을 포함한다.
실시예 41은 실시예 39 또는 실시예 40의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Glu109에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu109Cys) 치환을 포함한다.
실시예 42는 실시예 39 내지 41 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Thr121에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 시스테인으로의 (Thr121Cys) 치환을 포함한다.
실시예 43은 실시예 39 내지 42 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌에서 시스테인으로의 (Arg154Cys) 치환을 포함한다.
실시예 44는 실시예 39 내지 43 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 45는 실시예 39의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체이다. 　
실시예 46은 실시예 45의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 47은 실시예 39의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Val53Leu, Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체이다. 　
실시예 48은 실시예 47의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 49는 서열번호 39의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 50은 실시예 49의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Glu45에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu45Cys) 치환을 포함하고, Thr121에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 시스테인으로의 (Thr121Cys) 치환을 포함한다.
실시예 51은 실시예 49 또는 실시예 50의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, Glu109에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu109Cys) 치환을 포함하고, Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌에서 시스테인으로의 (Arg154Cys) 치환을 포함한다.
실시예 52는 실시예 49 내지 51 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 53은 실시예 52의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체이다. 　
실시예 54는 실시예 53의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 55는 실시예 52의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체이다. 　
실시예 56은 실시예 55의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 57은 아미노-말단 신호 서열을 추가로 포함하는 실시예 33 내지 56 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드이다.
실시예 58은 실시예 57의 LukB 변이체 폴리펩티드로서, 아미노산-말단 신호 서열은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 　
실시예 59는 아미노-말단 정제 태그를 추가로 포함하는 실시예 33 내지 58 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드이다.
실시예 60은실시예 33 내지 59 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자이다.
실시예 61은실시예 60의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터이다.
실시예 62는실시예 60의 핵산 분자에 작동 가능하게 결합된 실시예 30의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터이다.
실시예 63은 서열번호 59 (CC45 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55 (CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예 62의 발현 벡터이다.
실시예 64는 서열번호 61 (CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 55 (CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예 62의 발현 벡터이다. 　
실시예 65는 서열번호 58 (CC8 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54 (CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예 62의 발현 벡터이다. 　
실시예 66은 서열번호 61 (CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54 (CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예 62의 발현 벡터이다. 　
실시예 67은 서열번호 60 (CC8 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 54 (CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예 62의 발현 벡터이다. 　
실시예 68은실시예 61 내지 67 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
실시예 69는 실시예 61 내지 67 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물이다.
실시예 70은실시예 1 내지 29 중 어느 하나의 하나 이상의 변이체 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물이다.
실시예 71은실시예 70의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 변이체이다.
실시예 72는 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하는 실시예 70 또는 실시예 71의 백신 조성물로서, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 73은 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하는 실시예 70 또는 실시예 71의 백신 조성물로서, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 74는 실시예 73의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의아미노산 잔기 Lys80, Ser138, Val110, Val190, 및 Glu320Ala에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.
실시예 75는실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, LukB 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 76은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하고, LukB 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 77은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 78은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 79는실시예 70의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 변이체이다.
실시예 80은 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하는 실시예 79의 백신 조성물로서, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 81은 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하는 실시예 79의 백신 조성물로서, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 82는실시예 79 내지 81 중 어느 하나의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 Lys81, Ser139, Val111, Val191, 및 Glu321Ala에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 　
실시예 83은실시예 82의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 84는실시예 82의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 85는 실시예 33 내지 56 중 어느 하나의 하나 이상의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스( Staphylococcus aureus) 백신 조성물이다.
실시예 86은 류코시딘 A(LukA) 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 실시예 85의 백신 조성물로서, 상기 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 1(CC8)의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 87은 류코시딘 A(LukA) 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 실시예 85의 백신 조성물로서, 상기 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 2(CC45)의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는다.
실시예 88은 실시예 1 내지 32 중 어느 하나의 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 실시예 33 내지 56 중 어느 하나의 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함하는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물이다.
실시예 89는실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 90은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 91은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 92는실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 93은실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 94는실시예 74의 백신 조성물로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 95는 애쥬번트를 추가로 포함하는 실시예 64 내지 69 내지 94 중 어느 하나의 백신 조성물이다.
실시예 96은 하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원을 추가로 포함하는 실시예 69 내지 94 중 어느 하나의 백신 조성물이다.
실시예 97은 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 상기 면역 반응을 발생시키는 데 효과적인 조건 하에서 실시예 69 내지 94 중 어느 하나의 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시예 98은 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법에 사용하기 위한 실시예 69 내지 94 중 어느 하나의 백신 조성물이다.
예
다음의 예는 본 개시의 실시예를 예시하기 위해 제공되지만, 그 범위를 제한하도록 의도된 것은 아니다.
예 1 - 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드, LukB 변이체 폴리펩티드, 및 안정한 LukAB 복합체
LukAB 이종이량체 단백질의 발현을 위해, E. coli BL21(DE3) 세포를 pCDFDuet-1에 클로닝된 lukA 작제물 및 pETDuet-1에 클로닝된 lukB 작제물로 공동-형질전환시켰다. 형질전환체를 50 μg/mL 암피실린 및 50 μg/mL 스펙티노마이신에서 배양하여, 37℃에서 루리아-베르타니 액체 배지 중에서 pETDuet-1 및 pCDFDuet-1을 선택하고, 190 rpm에서 밤새 진탕시켰다. 발현을 위해, 신선한 Terrific Broth 배지를 37℃에서 1:50 희석의 밤새 배양물로 접종하고, 배양물이 OD600 = 2에 도달할 때까지 190 rpm에서 진탕시켰다. 그런 다음, 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드를 1 mM의 최종 농도까지 첨가하여 발현을 유도하고, 37℃에서 추가로 5시간 동안 유도를 계속하였다. LukA 및/또는 LukB에서 시스테인 치환 쌍을 포함하는 LukAB 이종이량체의 발현은 이황화 결합 형성을 지원하기 위해 E. coli Origami 2(DE3) 세포의 세포질에서 발현되었다. E. coli BL21(DE3)의 주변 세포질에서 LukA 단량체의 발현은, 37℃에서 4 mM 람노오스의 최종 농도를 4시간 동안 사용하여, Terrific Broth (30 μg/mL 카나마이신이 보충됨)에서 유도 하에, pD861-CH에서 lukA 작제물의 형질전환을 통해 수행하였다. 세포질 및 주변 세포질 발현 작제물 모두를 유도한 후, 4℃에서 4000 rpm으로 15분 동안 원심분리를 통해 세포를 수확한 다음, 용해 완충액(94% Bugbuster [EMD Millipore] + 6% 5 M NaCl + 0.4% 4 M 이미다졸 + 프로테아제 억제제 칵테일 [ProteaseArrest, G-Biosciences])에 재현탁시켰다. 실온에서 20분 동안 용해시킨 후, 용해물을 얼음에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 16100 x g, 4℃에서 35분 동안 원심분리하였다. AKTA Pure 25M FPLC 및 HisTrap 컬럼을 사용하여 LukA의 N-말단에서 6xHis-tag를 통해 단백질을 정제하고, 이미다졸 구배(50 mM 인산나트륨 완충액 중 50-500 mM 이미다졸, pH 7.4, 200 mM NaCl)를 사용해 용리하였다. SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이, 정제된 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤에서 투석하였다. 정제된 단백질을 비신코닌산(BCA) 단백질 검정(Pierce)을 통해 정량화하였다.
본원에서 설명되는 연구에서 사용된 예시적인 LukA, LukB, 및 LukAB 이종이량체 복합체
톡소이드/
독소 명칭 		LukA LukA 치환 서열번호 LukB LukB 치환 서열번호
RARPR-013 CC45 W94 E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile 11 CC45 없음 16
RARPR-015 CC45 W95 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile 4 CC45 없음 16
RARPR-017 CC45 W96 E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val 12 CC45 없음 16
RARPR-019 CC45 W97 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val 8 CC45 없음 16
RARPR-30 CC45 W95 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile 4 CC45 Val53Leu 18
RARPR-31 CC8 W95
 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile 3 없음
RARPR-32 CC8 W95 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile 3 CC8 없음 15
RARPR-33 CC8 W95 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile 3 CC45 Val53Leu
 18
RARPR-34 CC8 W95 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile 3 CC8 Val53Leu
 17
LukA 단량체 CC8 W97 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys 9 없음
LukA 단량체 CC45 W97 W72 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys

 10 없음
CC8 W95 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys 5 CC45 없음 16
CC8 W95 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys 5 CC45 Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys 22
CC8 W95 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys 5 CC45 Val53Leu 18
CC8 W95 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys 5 CC45 Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys 20
CC8delta10 CC8 C-말단 잔기 312-321 결실 64 CC8 없음 15
CC45delta10 CC45 결실 C-말단 잔기 313-322 65 CC45 없음 16
CC8 독소 CC8 없음 1 CC8 없음 15
CC45 독소 CC45 없음 2 CC45 없음 16
예 2 - 야생형, LukA, 및 LukAB 톡소이드의 세포독성
(표 4에 정의된 바와 같은) LukAB 톡소이드 단백질의 세포독성을, 전핵구 세포주 THP-1, 또는 신선하게 단리된 일차 인간 다형핵 백혈구(hPMN)를 사용하여 야생형 LukAB 독소와 비교하여 평가하였다.
세포독성을 시험하기 전에, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트의 존재 하에 THP-1 세포를 분화시켰다. THP-1 세포독성 분석을 위해, 50 mL RPMI 중 총 1 x 105 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. LukAB 독소 및 톡소이드 단백질을 표준 단백질 농도로 조정하고, 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에서 연속 희석하고, 각각의 50 mL 부피를 적절한 웰에 첨가하였다. RPMI 단독 음성 대조군에 더하여, Triton X-100을 양성 대조군으로서 0.1%의 최종 농도까지 첨가하였다. CytoTox-ONE 검정(Promega)을 사용하여, 막 무결성의 마커로서 역할한, 세포질 효소 젖산 탈수소효소의 방출을 평가하기 전에, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
분화된 THP-1 세포에 대한 LukA 및 LukAB 톡소이드의 세포독성이 아래 표 5에 제공되어 있다. 분화된 THP-1 세포는 CC8 및 CC45 LukAB 야생형 독소 모두가 0.313 μg/mL의 낮은 독소 농도에서 세포 집단의 30% 이상을 사멸시켰으므로, 야생형 독소에 민감하였다. LukA(delta10)의 C-말단에서 최종 10개의 아미노산 잔기를 결실시키면 CC8delta10 독소의 세포독성이 40 μg/mL에서 5% 미만 세포 사멸로 감소하였지만, 분화된 THP-1 세포를 향해 CC45delta10 독소의 세포독성을 감소시키지 않았다. LukA 단량체 중 어느 것도 분화된 THP-1 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않았다. 이 결과는, LukA가 LukB가 없는 상태에서 활성 기공 복합체를 형성하지 않아야 하기 때문에, 예상되었다. RARPR-33, RARPR-34, 및 RARPR-15를 포함하는 각각의 LukAB 이량체 톡소이드는 분화된 THP-1 세포에 대해 현저하게 감소된 세포독성을 나타냈고, 시험된 최고 농도인 40 μg/mL에서 시험된 톡소이드 각각에 대해 1% 이하의 세포 사멸을 나타냈다.
표준화된 양의 독소를 사용하여 인간 단핵구 세포주인 분화된 THP-1 세포에 대한 LukA 또는 LukAB 단백질의 세포독성. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로서 제시된다.
LukAB 농도 (μg/mL)
톡소이드/독소 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 0.078 0.04
RARPR-15 -12 -12 -12 -14 -14 -15 -10 -14 -12 -11 -9
RARPR-30 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
RARPR-31 0 0 -1 0 0 0 -1 -1 0 0 -1
RARPR-32 0 -1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0
RARPR-33 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1
RARPR-34 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0
CC8 LukA W97 (단량체) 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1
CC45 LukA W97 (단량체) 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1
CC8delta10 4 3 1 1 0 0 0 0 0 -1 0
CC45delta10 53 39 32 31 33 41 54 55 53 35 13
CC8 독소 41 44 43 39 39 38 37 30 15 6 2
CC45 독소 42 34 31 34 40 46 46 36 18 4 1
hPMN의 경우, 중독 전에, 모든 독소를 (서브유닛당) 2.5 μg/mL로 정규화한 다음, 20 μL의 독소를 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. PMN을 분리하고 90 μL RPMI당 200,000개 세포로 정규화하였다 (10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, 90 μL의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다.
인간 일차 PMN 세포에 대한 LukA 단량체 및 LukAB 이량체 톡소이드의 세포독성이 아래 표 6에 제공되어 있다. 야생형 CC8 및 CC45 독소는 각각 0.313 μg/mL 및 1.25 μg/mL의 독소 농도에서 일차 인간 PMN의 90%를 초과하여 사멸하는 것을 나타냈다. 대조적으로, 각각의 LukAB 톡소이드 및 LukA 단량체는 이들 세포에 대한 세포독성이 상당히 감소되었다. CC8 LukA에서 10개의 C-말단 잔기의 결실은 분화된 THP-1 세포를 향해 세포독성을 근본적으로 제거하였지만, 이 독소는 hPMN에 대한 세포독성을 유지하였으며, 5 mg/mL 이상의 농도에서 20%를 초과하는 사멸이 관찰되었다. 활성 기공 복합체의 형성에 중요한 LukB 성분이 결여된 톡소이드에 대해 예상되는 바와 같이, CC8 및 CC45 LukA 단량체는 hPMN에 대해 세포독성을 거의 나타내지 않았다. 각각의 LukAB 이량체 톡소이드는 CC8 및 CC45 야생형 LukAB 독소와 비교하여 hPMN 세포에 대한 세포독성을 현저하게 감소시켰다. RARPR-33 LukAB 톡소이드뿐만 아니라 관련 톡소이드인 RARPR-32 및 -34는, CC8delta10보다 세포독성이 덜한 것으로 나타났으며, RARPR-33은 시험된 최고 농도인 20 μg/mL에서 세포 집단의 15%만을 사멸시켰다.
표준화된 양의 독소를 사용하여 인간 일차 다형핵 백혈구에 대한 LukA 또는 LukAB 단백질의 세포독성. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로 표시된다.
LukAB 농도 (μg/mL)
톡소이드/독소 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 0.078 0.04 0.02
RARPR-15 42 36 31 20 14 11 11 11 6 10 11
RARPR-30 27 17 14 10 5 0 0 0 0 0 0
RARPR-31 12 2 1 0 0 3 0 0 0 0 0
RARPR-32 17 6 4 4 2 1 0 0 0 0 0
RARPR-33 15 8 6 3 1 0 0 0 0 0 0
RARPR-34 16 9 5 3 0 0 0 0 0 0 0
CC8 LukA W97 (단량체) 5 3 2 1 2 1 1 2 0 2 1
CC45 LukA W97 (단량체) 7 6 2 3 4 1 0 1 2 0 0
CC8delta10 29 26 22 18 11 11 4 4 3 4 3
CC8 독소 93 96 97 96 97 93 90 87 75 52 29
CC45 독소 97 97 97 97 96 85 72 57 49 30 19
예 3 - RARPR-33 LukAB 톡소이드 및 WT LukAB 독소의 다른 변이체의 세포독성.
RARPR-33 및 WT LukAB 독소 및 LukA 단량체의 상이한 변이체의 세포독성 및 면역원성을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 마우스를 면역원성 연구에 사용하였다.
LukAB 독소, 톡소이드, 및 단량체의 세포독성을 인간 PMN 상에서 평가하였다. 중독 전에, 모든 독소를 (서브유닛당) 100 μg/mL로 정규화한 다음, 20 μL의 독소를 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. 상이한 공여자로부터 PMN을 분리하고, 90 μL RPMI 당 200,000개의 세포로 정규화하였다 (10 mM HEPES + 0.1% HSA). 90 μL의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸로 설정된 Triton X100-처리 세포에 대해 정규화함으로써 계산하였다.
인간 일차 PMN 세포에 대한 LukA 단량체 및 LukAB 독소의 세포독성이 도 3에 제공된다. 야생형 LukAB CC8 및 CC45 독소는 각각 2.5 μg/mL 및 5 μg/mL의 독소 농도에서 일차 인간 PMN의 90%를 초과하여 사멸하는 것을 나타냈다. 2.5 μg/mL에서 LukAB 혼성 독소 CC8/CC45 및 CC45/CC8에 대해서도 최대 사멸이 관찰되었다. 대조적으로, LukAB 톡소이드 및 LukA 단량체는 이들 세포에 대한 세포독성에서 상당히 감소되었다. CC8 LukA에서 10개의 C-말단 잔기의 결실은 hPMN에 대한 세포독성을 유지시켰으며, 5 μg/mL 이상의 농도에서 20%를 초과하는 사멸이 관찰되었다. CC8 및 CC45 LukA 단량체 및 이들 단량체의 조합은 hPMN에 대해 거의 세포독성을 나타내지 않았다. RARPR-33 LukAB 톡소이드는 CC8Δ10C보다 세포독성이 더 적은 것으로 나타났으며, RARPR-33은 시험된 최고 농도인 20 μg/mL에서 세포 집단의 15%만을 사멸시켰다.
예 4 - 마우스에서의 면역원성.
상이한 LukAB 변이체의 면역원성을 결정하기 위해, Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg LukAB를 피하 투여하였다. 5마리 마우스의 코호트도 동일한 부피의 10% 글리세롤 1X TBS 및 TiterMax® Gold로 이루어진 모의 면역화를 받았다. 2주 간격으로 동일한 항원-애쥬번트 칵테일을 2회 추가 투여한 후, 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 혈청을 얻었다.
항-LukAB 항체 역가를 결정하기 위해, ELISA를 수행하였다. WT LukAB CC8 또는 CC45를 1X PBS 중 2 μg/ml로 희석하고, 96 웰 Immulon 2HB 플레이트(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 3455) 중 100 μl로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 세척 완충액(1X PBS + 0.05% Tween)으로 3회 세척한 다음, 200 μl의 차단 완충액(1X PBS 중 2.5% 우유)으로 1시간 동안 차단하였다. 1:500의 혈청에서 시작하여 차단 완충액으로의 5배 연속 희석을 생성하고, 로커에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 다시 3회 세척하고, 차단 완충액 중에서 1:5,000으로 희석된 마우스 IgG-HRP(Biorad) 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미결합 이차 항체를 세척 완충액으로 3회 연속 세척하여 씻어냈다. 실온까지 상승시킨 TMB(100 μl)를 각 웰에 첨가하고 25분 동안 인큐베이션하였다. 반응이 완료된 후, 반응을 중단시키기 위해 동일한 양의 2N 황산을 각 반응 웰에 첨가하였다. 그런 다음, Envision 플레이트 판독기에서 플레이트를 450 nm 흡광도로 판독하였다. 도 4a 및 4b에 도시된 히트맵은 이중 측정으로부터의 평균 흡광도 값을 보여주며, 검은색은 높은 흡광도 및 코팅 항원에 대한 항체 결합을 나타내고, 흰색은 낮은 흡광도 및 항체 결합이 없음을 나타낸다.
RARPR-33은 강력한 항-CC8 및 항-CC45 LukAB IgG 항체 역가를 도출하였다. (도 4a 및 도 4b). RARPR-33 면역화는 CC8 WT 독소, CC8/CC45 하이브리드 독소 및 CC8Δ10C 톡소이드로 면역화하는 것과 유사한 항-CC8 IgG 반응을 유도하였다. 개별 CC8 LukA 단량체에 의해 유도된 항-CC8 LukAB IgG 역가는 CC8 LukAB 독소 또는 CC8/CC45 하이브리드 독소, CC45/CC8 하이브리드 독소 및 RARPR 33 하이브리드 항원에 의해 유도된 역가만큼 높지 않았다(도 4a).
RARPR-33 면역화된 마우스에서 항-CC45 LukAB 역가는 CC8/CC45 WT 하이브리드 항원에 의해 유도된 것보다 높았으며, CC45 WT 항원에 의해 유도된 것과 동등하였다. CC8 및 CC45 LukA 단량체를 조합하면 CC8 및 CC45 LukAB 둘 다에 대한 항체 역가가 유도되었다(도 4b). 그러나, 조합된 CC8 및 CC45 LukA 단량체에 의해 유도된 이러한 항-CC8 및 항-CC45 LukAB 역가는 RARPR 33에 의해 유도된 것만큼 높지 않았다. 개별 CC45 LukA 단량체는 CC45/CC8 하이브리드에 의해 유도된 수준과 유사하게 매우 높은 항-CC45 LukAB 역가를 유도하며, RARPR-33 또는 CC45 WT 독소에 의해 유도된 것보다 약간만 더 낮다. 이들 결과는, RARPR-33 면역화 시 LukAB CC8 및 CC45 둘 다에 대한 항체 반응이 높은 크기로 유도된다는 것을 보여준다.
실험 5 - 독소 세포독성의 항체 매개 중화
독소 세포독성의 항체 매개 중화를 상기 예 4에서 전술한 바와 같이 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청으로 평가하였다. 열-불활성화 풀링된 혈청을 PBS에서 40% 혈청으로 정규화한 다음, 20 μL의 혈청을 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. 각각의 LukAB 독소 클론 복합체 서열 변이체의 LD90을 실온에서 15분 동안 플레이트(10 μL/웰)에 첨가하였다. 그런 다음, 80 μL RPMI 당 200,000 세포로 정규화된 (10 mM HEPES + 0.1% HSA) 신선하게 분리된 인간 일차 다형핵 백혈구(hPMN)를 혈청-독소 혼합물에 첨가하고 37℃ + 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 항체 중화 데이터가 도 5에 제시되어 있다.
RARPR-33으로 면역화된 마우스 유래의 혈청은 모든 항원 중 가장 강력하고 광범위하게 LukAB 중화 능력을 나타냈다(도 5). RARPR 33-면역화된 마우스로부터의 혈청은 0.25%의 낮은 혈청에서 시험된 모든 11개의 LukAB 변이체의 세포독성 효과를 강력하게 중화시켰으며, 대부분의 LukAB 변이체에 대해서도 0.063-0.125%의 낮은 혈청에서 보호를 제공하였다(도 5). 개별 CC8 및 CC45 LukA 단량체로의 면역화는 항원 백본에 대해 고도로 편향된 LukAB 중화 능력을 갖는 혈청을 생성하였다(도 5). 각각의 면역화에 대해 20 μg의 각각의 단량체로 투여된 CC45 LukA와 CC8 LukA 단량체의 조합(40 μg의 총 단백질)은 광범위하고 강력한 LukAB 중화 능력 둘 다를 갖는 혈청을 생성하였는데, 이는 0.5% 혈청만큼 낮게 시험된 모든 11개의 LukAB 변이체를 중화시키지만(도 5), 이는 RARPR-33 면역화 마우스의 혈청에서 관찰된 것보다 낮다.
종합하면, 예 3 내지 5에 제시된 데이터는, RARPR-33의 CC8/CC45 LukAB 백본에 통합된 약독화 및 안정화 돌연변이가 CC8/CC45 WT LukAB 하이브리드의 광범위한 면역원성 효과를 개선시키는 한편(도 4 및 도 5), RARPR-33은 CC8/CC45 WT LukAB 독소에 비해 고도로 약독화되었다(도 3).
예 6 - 항혈청 독소 중화
독소 세포독성의 항체 매개 중화를 야생형 LukAB, 야생형 LukAB 하이브리드(즉, CC8 LukA/CC45 LukB 및 CC45 LukA/CC8 LukB), LukA 단량체, 또는 LukAB 톡소이드로 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청으로 평가하였다. 열-불활성화 풀링된 혈청을 PBS에서 40% 혈청으로 정규화한 다음, 20 μL의 혈청을 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. 그런 다음, LukAB 독소 클론 복합체 서열 변이체 각각의 LD90을 실온에서 15분 동안 2%, 1% 또는 0.5% 혈청을 함유하는 플레이트(10 μL/웰)의 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 인간 일차 다형핵 백혈구(hPMN)를 80 μL RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하고(10 mM HEPES + 0.1% HSA), 혈청-독소 혼합물에 첨가하고, 37℃ + 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 항체 중화 데이터가 도 6a(2% 항체 혈청), 도 6b(1% 항체 혈청, 및 도 6c(0.5% 항체 혈청)의 표에 제시되어 있다.
야생형 CC8 및 CC45 LukAB로의 면역화는 면역화된 항원의 서열 조성을 반영하는 패턴으로 LukAB 독소의 자연 발생 서열 변이체를 중화시킨 항체를 유도하였다. CC8 LukAB 독소에 의해 유도된 항체는 CC8, CC1, CC5, 및 기타 S. 아우레우스(S. aureus) 계통으로부터 유래된 독소를 강력하게 중화하였지만, CC30, CC45, 또는 ST22A S. 아우레우스(S. aureus)로부터 유래된 독소의 완전한 중화를 제공하지 않았다. 마찬가지로, CC45 LukAB 독소를 사용한 면역화는 CC30, CC45, 또는 ST22A S. 아우레우스(S. aureus) 계통으로부터 유래된 독소를 강력하게 중화시키지만, 다른 계통으로부터 유래된 독소는 중화시키지 않는 항체를 유도하였다.
CC45 LukB와 조합된 CC8 LukA 또는 CC8 LukB와 조합된 CC45 LukA 중 하나인, 비-천연 하이브리드 LukAB로 마우스를 면역화하면, 자연 발생 이량체 조합과 비교하여 LukAB 서열 변이체의 더 넓은 중화를 나타내는 항체를 유도하였다. 비-천연 하이브리드 이량체 중에서, CC8 LukA 및 CC45 LukB는 LukA의 (E323A) 끝에서 두 번째 잔기에서 Glu에서 Ala로의 치환을 운반하는 단백질에 보유된 패턴인, 반대 조합보다 약간 더 양호한 중화 프로파일을 나타냈다. 야생형 독소에 대해 유도된 항체에 대해 관찰된 바와 같이, LukA 단량체는 이들의 서열 조성을 나타내는 중화 패턴을 나타내는 항체를 유도하였다. CC8 LukA 및 CC45 LukA 단량체(RARPR-31 + CC45 LukA W97)의 조합은 광범위한 중화 패턴을 나타낸 항체를 유도하였지만, 중화 효능은 1% 또는 0.5% 혈청에서의 중화 수준 감소에 의해 명백한 바와 같이, 이량체 항원과 비교하여 감소되었다.
이량체 톡소이드 중에서, RARPR-15, RARPR-33, 및 RARPR-34는 시험된 모든 LukAB 서열 변이체에 대해 광범위한 중화 항체 반응을 나타냈다. 비-천연 야생형 이량체 조합은, 중화 반응의 효능이 여러 톡소이드에 대해 관찰된 것보다 열등하였지만, 광범위한 중화 프로파일을 또한 나타냈다. 하이브리드 야생형 및 톡소이드 항원 둘 다는 2%(도 6a) 및 1%(도 6b) 혈청에서 시험될 때 광범위하게 중화 프로파일을 나타냈지만, 0.5% 혈청(도 6c)에서 시험했을 때 톡소이드에 대한 반응의 개선된 효능이 명백하였다. 이러한 최저 시험 농도에서, RARPR-15, RARPR-32 RARPR-33, 및 RARPR-34는 각각 광범위한 중화 반응을 나타냈다. 특히, RARPR-33은 광범위한 중화 반응을 유지한 혈청을 유도한 반면, 하이브리드 야생형 항원 및 E323A 톡소이드는 0.5% 혈청에서 광범위한 보호 반응을 유도하지 못하였고, CC30, CC45, 및 ST22A LukAB 독소에 대해서만 높은 중화 수준이 관찰됨에 따라, 가장 낮은 시험 농도에서 CC45 톡소이드 RARPR-15에 의해 유도된 중화 패턴은 그의 서열 조성을 반영하였다. 하이브리드 이량체 톡소이드 RARPR-33은 강력하고 광범위한 중화 면역 반응을 유도하였다.
예 7 - 고농도에서 RARPR-33의 세포독성.
방법:
세포독성 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체의 세포독성을 평가하기 위해, 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) 독소로 중독시켰다. 상이한 공여자로부터 PMN을 분리하고, 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). PBS 중 50 μl의 독소를 세포에 첨가하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μl의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 사멸 세포 %는 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포로 정규화함으로써 계산된다.
LDH 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체가 세포 용해를 야기할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. aureus LukAB 독소로 중독시키고 LDH 방출을 측정하였다. 야생형 독소를 PBS에서 2배 연속 희석하고, 5-0.0024 μg/ml 범위의 농도로 시험하였다. LukAB 톡소이드를 PBS에 희석하고 2.5, 2, 1, 1.5 및 0.5 mg/ml로 시험하였다. PMN을 분리하고 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, 50 μl의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 50 μl의 희석된 독소를 웰당 첨가하였다. 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. LDH 방출을 평가하기 위해, 플레이트를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 다음, 25 μl의 상청액을 각 웰로부터 제거하고 96-웰 흑색 투명-바닥 플레이트로 옮겼다. 25 μl의 CytoTox-ONE 균질 막 완전성 시약(Promega)을 흑색 투명-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해는 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 갖는 형광을 기록함으로써 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸 상태로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸 세포 %를 계산하였다.
결과:
이전 예들에서, hPMN에 대한 LukAB 톡소이드 RARPR-33의 세포독성을 20 μg/ml의 농도까지 측정하였다. 다음으로, 더 높은 농도(최대 2.5 mg/ml)의 RARPR-33의 존재 시에 인간 PMN의 세포독성을 모니터링하였다. CellTiter 측정에 기반한 인간 PMN(4-6명의 공여자)의 최대 세포독성을 ~0.156 μg/ml 독소로 1시간 중독 시 WT LukAB CC8, CC45 및 CC8/CC45 독소에 대해 관찰하였다(도 7a). RARPR-33 및 CC8 LukA 단량체의 경우, CellTiter로 측정한 사멸 세포 백분율은 0.5 mg/ml의 농도에서 ~10%였다(도 7b). 최대 2.5 mg/ml의 RARPR-33 또는 CC8 LukA 단량체의 농도로 PMN을 인큐베이션하더라도 CellTiter 측정에 의해 결정된 사멸 세포 백분율을 더 이상 증가시키지 않았다.
LD15 값은 15% 세포 사멸을 유도하는 항원의 농도를 나타낸다. LD15는 선형 회귀를 사용하여 결정하였다. CC8 WT LukAB의 경우, LD15는 0.013 μg/ml였고, CC45 WT LukAB의 경우, LD15는 0.004 μg/ml였으며, CC8/CC45 LukAB 하이브리드의 경우, LD15는 0.002 μg/ml였다. LukAB RARPR-33의 LD15는 2.5 mg/ml이었다. LD15 값은 RARPR-33의 LD15 농도를 WT 항원의 LD15농도로 나눔으로써 비교하였다. 이러한 관찰에 기초하여, LukAB RARPR-33 독성은 LukAB CC8 WT보다 >192,308배, LukAB CC45 WT보다 >625,000배, 및 LukAB CC8/CC45 하이브리드보다 >1,250,000배 적다.
또한, 상이한 WT 독소, CC8 LukA 단량체 또는 RARPR-33과 함께 2시간 인큐베이션한 후, 원형질 막 손상을 평가하기 위해 LDH 분석을 수행하였다. 인간 PMN의 세포독성은 WT 독소, CC8 WT, CC45 WT, 또는 CC8/CC45 독소 하이브리드에 2시간 노출 후 유도하였다(도 7c). LDH에 의해 결정된 최대 세포 사멸은 0.625 μg/ml 독소의 농도에서 관찰되었다. 대조적으로, 최대 2.5 mg/ml의 농도에서 RARPR-33 또는 CC8 LukA 단량체에 2시간 노출 후 인간 PMN의 원형질 막 손상은 관찰되지 않았다(도 7d). 이들 데이터는, RARPR-33이 해독되어 최대 2.5 mg/ml의 농도에서 인간 PMN의 세포 사멸을 유도할 수 없음을 보여준다. RARPR-33의 CC8/CC45 LukAB 백본에 통합된 돌연변이는 CC8/CC45 WT LukAB 독소와 비교하여 세포독성을 고도로 약화시켰다.
예 8: RARPR-33 대 D39A/R23E 톡소이드의 비교
LukA에는 D39A 돌연변이가 있고 LukB에는 R23E 점 돌연변이가 있는 CC8 백본을 기반으로 하는 LukAB 변성독소가 생성되었다. 이러한 "D39A/R23E 톡소이드"는 Kailasan, S. 등의 "Rational Design of Toxoid Vaccine Candidates for Staphylococcus aureus Leukocidin AB (LukAB)," Toxins 11(6): (2019)에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이 톡소이드는 LukAB CC8 백본에서 생성되었고, WT CC8 LukAB 독소와 비교하여 독성이 > 36,000배 약화된 것으로 기술되었다. 세포독성은 PMN-유사로 분화된 HL-60 세포주를 사용하여 결정하였다. 본 실험에서는 D39A/R23E 톡소이드와 RARPR-33을 비교하였다. 인간 다형핵 백혈구(PMN)에 대한 세포독성을 결정하고, 면역화 시 광범위하게 독소 중화 항체를 유도하는 능력을 평가하였다.
방법:
세포독성 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체의 세포독성을 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) 독소로 중독시켰다. PMN을 분리하고, 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 세포에, PBS 중 50 μl의 독소를 첨가하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μl의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. PMN 생존력을 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 사멸된 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 죽은 상태로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 계산된다.
LDH 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체가 세포 용해를 유발하는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소로 중독시키고 LDH 방출을 측정하였다. 야생형 독소를 PBS에서 2배 연속 희석하고 0.5 μg/ml 내지 0.00024 μg/ml 범위의 농도로 시험하였다. LukAB 톡소이드를 PBS에서 1 mg/ml 내지 0.03125 mg/ml 범위의 농도로 희석하고 시험하였다. PMN을 분리하고 50 μl RPMI당 200,000 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, PMN(50 μl)을 각 웰에 피펫팅하고, 웰당 50 μl의 희석된 독소를 첨가하였다. 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. LDH 방출을 평가하기 위해, 플레이트를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 다음, 25 μl의 상청액을 각 웰로부터 제거하고 96-웰 흑색 투명-바닥 플레이트로 옮겼다. 25 μl의 CytoTox-ONE 균질 막 완전성 시약(Promega)을 흑색 투명-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해는 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 갖는 형광을 기록함으로써 PerkinElmer EnVision 2103 Multilabel Reader로 평가하였다. 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸된 세포의 백분율을 계산하였다.
마우스 면역화. Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg의 LukAB를 피하 투여하였다. 동일한 항원/보조 칵테일의 2회 추가 투여 후, 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 독소 중화 연구를 위해 혈청을 수득하였다.
독소 중화 분석. 각 군으로부터 면역화된 마우스로부터의 혈청을 풀링하고, 55℃의 수조에서 30분 동안 열 불활성화시켰다. 그런 다음, 풀링된 열-불활성화 혈청을 PBS로 40%로 희석하였다. 그런 다음, 96 웰 플레이트에서 10 μl의 PBS에 40% 스톡을 2배 연속 희석하여 혈청의 추가 희석을 달성하였다. 독소(10 μl)를 0.156 μg/ml 독소(LD90)의 최종 농도로 혈청 웰에 첨가하였다. RPMI + 0.1% HSA + 10 mM HEPES 중 200,000 세포의 농도로 80 μl의 hPMN을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 역가를 중독물에 첨가하고 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 플레이트 판독기 상에서 492 nm 흡광도로 판독하였다. 배경(건강한 세포 +PBS)을 빼고, 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸된 세포 백분율을 계산하였다.
결과:
D39A/R23E 톡소이드의 세포독성은 최대 약 12 μg/ml까지 시험된 것으로 보고되었다. 여기서, RARPR-33 및 D39A/R23E 톡소이드의 세포독성을 1 mg/ml의 농도까지 인간 PMN 상에서 결정하였다. 또한, WT LukAB CC8, CC45 및 CC8/CC45를 비교를 위해 시험하였다. CellTiter 측정에 기반한 인간 PMN의 최대 세포독성은 ~0.02 μg/ml WT LukAB CC8/CC45, ~0.03 μg/ml LukAB CC8 및 0.125 μg/ml LukAB CC45로 1시간 동안 중독될 때 관찰되었다(도 8a). 5명의 공여자의 평균이 도시되어 있다. D39A/R23E 톡소이드의 경우, 1 mg/ml로 인큐베이션 시 약 22%의 세포독성이 관찰되었다. RARPR-33의 경우, CellTiter로 측정한 사멸 세포 백분율은 1 mg/ml의 농도에서 약 3%였다(도 8b).
또한, 상이한 WT 독소, D39A/R23E 톡소이드 및 RARPR-33과 함께 2시간 인큐베이션한 후 원형질 막 손상을 평가하기 위해 LDH 분석을 수행하였다. WT 독소, CC8 WT, CC45 WT 및 CC8/CC45 독소 혼성체의 조합에 노출된 후 2시간 후에 인간 PMN의 세포독성을 유도하였다(도 8c). LDH에 의해 결정되는 최대 세포 사멸은 0.25 μg/ml 독소의 농도에서 관찰되었다. 최대 1 mg/ml의 D39A/R23E 톡소이드 농도로 2시간 동안 인간 PMN에 노출시켰을 때, 약 8%의 세포 사멸이 관찰되었다. 유사한 농도의 RARPR-33을 사용해 인간 PMN을 배양할 때, 원형질 막 손상이 관찰되지 않았으며, 세포 사멸이 없음을 나타낸다(도 8d). 이러한 결과는 RARPR-33이 검정에서 검출 한계 미만으로 약화되고 D39A/R23E 톡소이드보다 더 약화됨을 나타낸다.
RARPR-33 또는 D39A/R23E 톡소이드로 면역화된 마우스 유래의 혈청을 독소 중화 검정으로 시험하여 인간 PMN의 독소 유도 세포 사멸을 예방하는 혈청의 능력을 평가하였다. 4명의 공여자로부터 분리된 PMN에 대해 16개의 상이한 LukAB 독소를 대상으로 중화를 시험하였다.
RARPR 33-면역화된 마우스로부터의 0.125% 혈청의 존재 시에, 시험된 모든 16개의 LukAB 변이체의 세포독성 효과를 중화시켰다(도 9). 유사한 혈청 농도에서, D39A/R23E 톡소이드로 면역화된 마우스로부터의 혈청은, LukAB CC8의 세포독성 효과에 대해 RARPR-33으로 면역화된 마우스로부터의 혈청과 동등하게만 보호하였다. 다른 모든 독소에 대해, D39A/R23E 톡소이드 면역화 마우스의 혈청에 대해서는 보호가 없거나 훨씬 낮은 보호가 관찰되었다. 이들 결과는 RARPR-33 면역화가 D39A/R23E 톡소이드로의 면역화보다 훨씬 더 넓은 독소 중화 반응을 유도하였음을 보여준다.
예 9: LukAB 톡소이드의 열 안정화
야생형 단백질과 비교하여 LukAB 톡소이드의 안정성을, 접힌 상태로부터 풀린 상태로의 단백질의 전환의 중간 지점에 대응하는 용융 온도(Tm)를 추정하기 위해 고유한 트립토판 또는 티로신 형광을 사용하여 열 풀림 실험을 통해 평가하였다. 열 안정성을 NanoTemper의 PromethiusNT.Plex 기기(NanoTemper Inc., 독일)를 사용하여 평가하였다. 0.3 내지 1 mg/mL(20 uL, 완충액: 50 mM 인산나트륨 완충액, 200 mM NaCl, pH 7.4, 10% 글리세롤)의 단백질 샘플에 대해 각각의 샘플에 대한 2회 실시로 열 풀림 측정을 수행하였다. Prometheus NanoDSF 사용자 인터페이스(Melting Scan 탭)를 사용하여 실행을 위한 실험 파라미터를 설정하였다. 일반적인 샘플에 대한 열 스캔은 1.0℃/분의 속도로 20℃ 내지 95℃의 범위이다. 샘플에 사용된 동일한 완충액 중의 표준 mAb(CNTO5825 또는 NIST)를 대조군으로서 포함시키고, 실행을 2회 수행하였다. 열 용융 프로파일을 벤더 소프트웨어 PR.ThermControl로 분석해서 단백질의 50%가 풀리는 온도(Tm)를 결정하였다.
표 7A 및 표 7B는 nanoDSF에 의해 평가했을 때, LukA 및 LukAB 톡소이드 단백질의 열 안정성을 보여준다. 단백질 풀림의 시작 온도(Tonset) 및 단백질 풀림의 전환의 중간 지점(Tm1)이 안정화 치환을 갖는 또는 갖지 않는 유사한 작제물 간의 Tm 차이(DTm)와 함께 제시된다.
Figure pct00001
aΔTm은 하나 이상의 치환을 운반하는 대응하는 LukAB 단백질과 비교하여, 안정화 치환 및 이황화 결합 없는 CC45 또는 CC8/CC45 독소에 대한 Tm 값 사이의 차이를 나타낸다.
LukA 단량체는 이황화 결합 형성을 지원하기 위해 E. coli의 주변 세포질에 발현을 지시하기 위한 N-말단 PelB 신호 서열을 포함하였다.
이황화 결합 형성을 지원하기 위해 시스테인 치환 쌍을 운반하는 LukAB 이량체는 E. coli Origami 2(DE3) 세포의 세포질에서 발현되었다.
Figure pct00002
결과: 열 안정성 분석(표 7A)은 CC45 LukAE321A / CC45 LukB 단백질이 CC8 LukAE321A / CC45 LukB 하이브리드 단백질에 대한 Tm 보다 3℃ 더 높은 Tm 값을 나타냄을 밝혔다. CC45 LukA에서의 개별 치환은, CC45 LukBwt와 조합하여, Tm을 0 내지 0.4℃로 약간 증가시켰다. LukB에서의 Val53Leu 치환은 Tm을 0.5℃ 증가시켰다. 하이브리드 LukAB 톡소이드는 CC8 LukA 배경을 포함하였으므로, 개별 아미노산 치환을 야생형 CC45 LukB와 조합된 CC8 LukA에서 시험하였다(표 7B). CC45 LukA로 확인한 바와 같이, CC8 LukA에서의 개별 치환 또한 야생형 LukAB보다 높은 Tm 값을 증가시켰다. LukA(RARPR-15)에서의 치환의 조합은 CC45 LukAE321A / CC45 LukB 단백질보다 1.6℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였고, LukBVal53Leu (RARPR-33)와의 CC8 LukA 치환의 조합은 CC8 LukAE321A / CC45 LukB 하이브리드보다 4℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였다. 두 데이터세트 모두에서 RARPR-33의 증가된 열 안정성이 관찰되었다(표 7A 및 7B). nanoDSF가 50℃ 미만에서 풀리는 단백질에 대해 약간의 변동성을 생성할 수 있지만, 각각의 세트 내에서 실행되는 대조군을 사용하여 결정된 DTm은 4.0 및 4.1℃에서 각각 데이터세트에 걸쳐 일관성이 있었다. LukA 단량체는 치환의 조합 및 시스테인 치환 쌍을 모두 포함하였고, ≥58℃의 상승된 Tm 값을 나타내어, 증가된 열 안정성을 위한 이황화 결합의 추가 기여를 나타냈다.
예 1-9 논의:
본원에서 설명되는 안정한 LukAB 변이체 이종이량체 톡소이드는 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 항원 후보로서 매우 적합한 것으로 여겨지는 여러 가지 특징을 갖는다.
첫째, RARPR-30, RARPR-31, RARPR-32, RARPR-33, RARPR-34, 및 RARPR-15를 포함하여, 본원에서 설명되는 LukA 단량체 및 LukAB 이량체 톡소이드는 야생형 독소 및 다른 공지된 톡소이드(즉, CC8delta10 및 CC45delta10 톡소이드)와 비교하여 분화된 인간 THP-1 및 인간 PMN에 대해 현저하게 감소된 세포독성을 나타냈다. 최대 2.5 mg/ml의 농도에서도, RARPR-33은 세포독성이 없는 것으로 유지되어, 완전한 약독화를 입증하였다.
둘째, LukA 및 LukB 변이체 단백질에 도입된 치환의 조합은 단일 치환만을 함유하는 대응하는 톡소이드에 비해 이종이량체 RARPR 복합체의 열 안정성을 상당히 향상시켰다. 특히, LukA(RARPR-15)에서의 치환의 조합은 CC45 LukAE321A / CC45 LukB 단백질보다 1.6℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였고, CC8 LukA 치환과 LukBVal53Leu(RARPR-33)의 조합은 CC8 LukAE321A / CC45 LukB 하이브리드보다 4℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였다.
약독화된 세포독성 및 향상된 열 안정성에 더하여, 본원에서 설명되는 LukAB RARPR 톡소이드, 특히 RARPR-15, RARPR-33, 및 RARPR-34는 야생형 CC45 및 CC8 독소, 야생형 하이브리드 독소, 및 E323A 톡소이드 및 D39A/R23E 톡소이드를 포함하는, 톡소이드보다 유사하거나 더 넓은 독소 중화 반응 및 중화 항체의 더 높은 역가를 유도했다.
요약하면, 약독화된 세포독성, 개선된 열 안정성, 강력한 면역원성, 및 광범위한 중화 항체 프로파일은 본원에서 설명되는 LukAB RARPR 톡소이드를 이상적인 백신 항원 후보물질로 만든다.
바람직한 실시예가 본원에서 상세히 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 첨가, 치환 등이 이루어질 수 있고, 따라서 이들은 이어지는 청구범위에서 정의된 바와 같은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것이 당 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NEW YORK UNIVERSITY Janssen Biotech Inc. <120> VARIANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS LUKA AND LUKB POLYPEPTIDES AND VACCINE COMPOSITIONS <130> 142772.000101 <150> PCT/US2021/052418 <151> 2021-09-28 <150> 63/084,273 <151> 2020-09-28 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> S. aureus <400> 1 His Lys Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Gln Gln Lys Asp Lys Arg Asn Val Thr Asn Lys Asp Lys Asn Ser Thr 20 25 30 Ala Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Ile Thr Lys Arg Thr Glu 35 40 45 Thr Val Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe Asp 50 55 60 Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Asn Ser Asn Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp Phe 100 105 110 Gln Val Lys Arg Asn Arg Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro Lys 115 120 125 Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser Ser 130 135 140 Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser Asn 145 150 155 160 Ser Tyr Ser Lys Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr Ile 165 170 175 Ala Ser Gly Lys Asn Asn Asn Trp His Val His Trp Ser Val Ile Ala 180 185 190 Asn Asp Leu Lys Tyr Gly Gly Glu Val Lys Asn Arg Asn Asp Glu Leu 195 200 205 Leu Phe Tyr Arg Asn Thr Arg Ile Ala Thr Val Glu Asn Pro Glu Leu 210 215 220 Ser Phe Ala Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly Phe 225 230 235 240 Asn Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Leu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Glu Lys 245 250 255 Thr Gln Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys Asn 260 265 270 Arg Pro Gly Ile His Tyr Ala Pro Pro Ile Leu Glu Lys Asn Lys Asp 275 280 285 Gly Gln Arg Leu Ile Val Thr Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys Thr 290 295 300 Val Lys Val Val Asp Lys Tyr Ser Asp Asp Asn Lys Pro Tyr Lys Glu 305 310 315 320 Gly <210> 2 <211> 322 <212> PRT <213> S. aureus <400> 2 Ala Asn Lys Asp Ser Gln Asp Gln Thr Lys Lys Glu His Val Asp Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln Lys 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Aureus LukB variant <400> 18 Glu Ile Lys Ser Lys Ile Thr Thr Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Thr Glu Lys 20 25 30 Lys Ile Ser Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Glu Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Leu Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Ile Leu Asn Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Ser Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Glu Ser Arg 100 105 110 Glu Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ser Ile 115 120 125 Asn Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Lys Asn Tyr Ser 130 135 140 Glu Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Arg Thr Leu Ile Asp Gln 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asn Lys Gly Val Ala Trp Lys Val Glu Ala His Ser Ile 165 170 175 Asn Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp 180 185 190 Asp Arg Val Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu 195 200 205 Trp Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asn Lys Met Pro Val Thr Val 210 215 220 Ser Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys 225 230 235 240 Asn Asp Lys Gly Lys Ser Arg Phe Ile Val His Tyr Lys Arg Ser Met 245 250 255 Asp Asp Phe Lys Leu Asp Trp Asn Lys His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp 260 265 270 Ser Gly Glu Asn His Val Asp Gln Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu 275 280 285 Tyr Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asp Val Lys Leu Ile Lys Thr Phe 290 295 300 Asn Asp Lys Glu Lys Lys 305 310 <210> 19 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S. Aureus LukB variant <400> 19 Lys Ile Asn Ser Glu Ile Lys Gln Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Ser Gln Lys 20 25 30 Asn Ile Thr Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Cys Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Leu Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Cys Ser Arg Glu 100 105 110 Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Cys Gly Gly Asp Phe Ser Ile Asn 115 120 125 Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Glu 130 135 140 Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Cys Thr Leu Leu Asp Gln Ser 145 150 155 160 Thr Ser His Lys Gly Val Gly Trp Lys Val Glu Ala His Leu Ile Asn 165 170 175 Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp Asn 180 185 190 Arg Thr Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu Trp 195 200 205 Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Val Ser 210 215 220 Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Lys Ser Gln Phe Val Val His Tyr Lys Arg Ser Met Asp 245 250 255 Glu Phe Lys Ile Asp Trp Asn Arg His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp Ser 260 265 270 Gly Glu Asn His Val Asp Lys Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Tyr 275 280 285 Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asn Val Lys Phe Val Lys Val Leu Asn 290 295 300 Asp Asn Glu Lys Lys 305 <210> 20 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S. Aureus LukB variant <400> 20 Glu Ile Lys Ser Lys Ile Thr Thr Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Thr Glu Lys 20 25 30 Lys Ile Ser Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Cys Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Leu Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Ile Leu Asn Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Ser Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Cys Ser Arg 100 105 110 Glu Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Cys Gly Gly Asp Phe Ser Ile 115 120 125 Asn Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Lys Asn Tyr Ser 130 135 140 Glu Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Cys Thr Leu Ile Asp Gln 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asn Lys Gly Val Ala Trp Lys Val Glu Ala His Ser Ile 165 170 175 Asn Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp 180 185 190 Asp Arg Val Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu 195 200 205 Trp Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asn Lys Met Pro Val Thr Val 210 215 220 Ser Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys 225 230 235 240 Asn Asp Lys Gly Lys Ser Arg Phe Ile Val His Tyr Lys Arg Ser Met 245 250 255 Asp Asp Phe Lys Leu Asp Trp Asn Lys His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp 260 265 270 Ser Gly Glu Asn His Val Asp Gln Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu 275 280 285 Tyr Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asp Val Lys Leu Ile Lys Thr Phe 290 295 300 Asn Asp Lys Glu Lys Lys 305 310 <210> 21 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S. Aureus LukB variant <400> 21 Lys Ile Asn Ser Glu Ile Lys Gln Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Ser Gln Lys 20 25 30 Asn Ile Thr Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Cys Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Cys Ser Arg Glu 100 105 110 Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Cys Gly Gly Asp Phe Ser Ile Asn 115 120 125 Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Glu 130 135 140 Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Cys Thr Leu Leu Asp Gln Ser 145 150 155 160 Thr Ser His Lys Gly Val Gly Trp Lys Val Glu Ala His Leu Ile Asn 165 170 175 Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp Asn 180 185 190 Arg Thr Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu Trp 195 200 205 Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Val Ser 210 215 220 Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Lys Ser Gln Phe Val Val His Tyr Lys Arg Ser Met Asp 245 250 255 Glu Phe Lys Ile Asp Trp Asn Arg His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp Ser 260 265 270 Gly Glu Asn His Val Asp Lys Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Tyr 275 280 285 Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asn Val Lys Phe Val Lys Val Leu Asn 290 295 300 Asp Asn Glu Lys Lys 305 <210> 22 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> S. Aureus LukB variant <400> 22 Glu Ile Lys Ser Lys Ile Thr Thr Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Thr Glu Lys 20 25 30 Lys Ile Ser Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Cys Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Ile Leu Asn Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Ser Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Cys Ser Arg 100 105 110 Glu Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Cys Gly Gly Asp Phe Ser Ile 115 120 125 Asn Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Lys Asn Tyr Ser 130 135 140 Glu Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Cys Thr Leu Ile Asp Gln 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asn Lys Gly Val Ala Trp Lys Val Glu Ala His Ser Ile 165 170 175 Asn Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp 180 185 190 Asp Arg Val Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu 195 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966 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 52 gctcacaaag attctcagga tcaaaataag aaggagcacg tcgacaagtc tcagcagaaa 60 gacaagcgta atgttacaaa caaggacaaa aacagcactg ctccagacga cattggaaaa 120 aacggtaaga ttactaaacg caccgaaacg gtatatgacg aaaaaacgaa cattttgcaa 180 aacttgcagt tcgatttcat tgacgacccc acttatgaca agaatgtcct tctggtgaag 240 aagcagggca gcattcactc aaacttgaaa tttgagtctc acaaggagga gaagaactcc 300 aattggctga aatacccatc agagtaccac gttgattttc aagtgaaacg taaccgcaaa 360 acggaaattt tggaccaatt gccgaaaaac aagatctcca ccgcgaaagt agactcaaca 420 ttcagttact cttccggcgg aaagttcgac agcactaagg ggatcgggcg cacttcttcc 480 aattcgtact cgaaaacgat ttcttacaat cagcagaatt atgacactat cgcatctggt 540 aaaaataata actggcacgt gcattggtcg gtgattgcta atgatttaaa gtatggaggt 600 gaggtaaaaa atcgtaatga cgagctgctg ttttaccgta acactcgcat cgcaaccgtt 660 gaaaacccgg aattgtcctt tgcctcgaaa taccgctacc ctgcattagt tcgttcaggc 720 tttaatcccg agtttttgac ttatctttcc aatgaaaaat cgaacgagaa gactcagttc 780 gaggttacgt acacccgcaa tcaggacatt ttgaagaacc gtccgggaat tcactatgcg 840 cctcccatct tagagaagaa taaggatgga caacgtttga tcgttacata tgaagttgac 900 tggaaaaata agaccgtaaa ggttgtggat aagtattcgg atgataataa gccctataaa 960 gaaggg 966 <210> 53 <211> 966 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 53 gcgaacaaag attctcagga ccagaccaaa aaggagcacg tagacaaggc ccagcaaaaa 60 gagaagcgta atgtgaacga caaagataag aatactccgg ggccagatga tatcggcaag 120 aacggtaaag tcacgaagcg tacagtgtct gagtatgaca aagaaacaaa catcctgcag 180 aacttacaat tcgactttat tgatgatcca acttacgata agaatgtgtt gctggttaag 240 aaacaaggtt caatccattc taacttgaag ttcgagtcac accgtaacga aacgaacgcg 300 tcgtggttga aatatccgtc agagtatcat gttgattttc aagtacaacg taatcccaaa 360 acggaaattt tggaccaatt acctaaaaat aagattagca ccgccaaggt tgactcaact 420 ttctcctact cattaggagg aaagttcgat tcgacaaaag ggatcgggcg tacatcttcg 480 aatagctaca gtaagagcat tagctataac cagcagaact atgatacgat tgcttcaggg 540 aaaaataaca accgtcacgt acattggtca gtggttgcga acgatcttaa atatggaaac 600 gagattaaga atcgtaacga cgaatttttg ttttaccgca atacacgcct tagtaccgtg 660 gaaaatcccg agctgtcctt cgcgtcgaag tatcgctatc cggcccttgt gcgttcgggt 720 ttcaatcccg agttcttaac atatatttcc aatgagaaaa ctaacgacaa gactcgcttc 780 gaagtcacct acactcgcaa ccaggacatt ctgaaaaaca agcctggaat tcattacggg 840 caaccaattt tagagcagaa taaggatgga cagcgcttta ttgtggtata tgaggtggac 900 tggaagaata agacagtaaa agttgtggaa aagtactctg accagaataa gccctataaa 960 gaagga 966 <210> 54 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC8 LukA variant <400> 54 cataaagatt cgcaggatca aaataagaag gagcatgttg acaagagcca gcagaaagac 60 aagcgcaatg ttacaaacaa agataagaac tctacagcgc ccgatgacat tggtaagaac 120 ggcaagataa ctaagcggac ggaaaccgtg tatgacgaga aaactaacat tctgcaaaat 180 ttgcaatttg actttatcga cgatccaacc tatgacaaga atgtcttgct tgtcaaaatg 240 caaggttcga ttcattcaaa ccttaaattt gaatcccaca aagaggagaa aaactctaat 300 tggttaaagt atccttcaga atatcacata gatttccagg taaagagaaa ccgtaaaacg 360 gagatactgg atcaactgcc taaaaacaag atctcgacag ctaaggtgga cgctacgttc 420 tcgtactcgt ctggtgggaa gttcgactcg accaaaggca ttgggcgtac atcatcaaat 480 agctattcaa agactattag ctataatcag cagaactatg atacgatagc ttcgggtaag 540 aataacaact ggcacgttca ttggtcgatc attgcaaatg acttgaagta tggcggagag 600 gtaaagaatc gcaacgatga gctgttattc tatcgcaata cgagaattgc gactgtagag 660 aacccggaat tgtcttttgc ctccaaatat cggtacccgg cattggtacg ctctggtttc 720 aatcctgagt ttttaactta cctttccaac gaaaagagta atgagaagac ccaatttgag 780 gttacctaca cccgtaacca ggatattttg aagaatcggc cgggcatcca ttatgcccca 840 ccaatcctgg agaaaaataa agacggtcag cggcttattg tgacttacga ggtcgattgg 900 aaaaataaga cggtcaaggt agtggacaaa tattctgatg acaataaacc gtacaaagct 960 ggc 963 <210> 55 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC45 LukA variant <400> 55 gctaataagg actcccagga ccagacaaag aaggaacacg tcgacaaagc ccagcaaaaa 60 gaaaaacgca acgtaaacga taaggacaag aacaccccag gacccgatga tattgggaag 120 aacggtaaag tcacaaaacg cacagtgagc gagtacgata aagaaacaaa tatcctgcaa 180 aatctgcaat ttgacttcat cgatgaccct acctatgata agaatgtgtt gttggttaag 240 atgcagggaa gtattcattc caacttgaaa ttcgagagcc accgtaacga aacgaatgcg 300 agttggttaa agtacccttc agaataccac attgattttc aggtgcagcg taacccgaaa 360 accgaaatct tagaccagct gcctaaaaac aagatttcta cggccaaggt ggacgcaact 420 ttcagttata gtcttggagg aaagttcgac agtaccaaag gtatcggccg cacatcctca 480 aacagctatt cgaaatccat ttcttacaac cagcaaaatt atgacacgat cgcctcaggt 540 aagaacaaca atcgtcatgt gcattggagc atcgtggcta acgatttgaa atatggtaac 600 gaaatcaaaa atcgcaatga cgagttcttg ttttaccgca atactcgcct ttctacggta 660 gagaatcctg agcttagctt tgcgagcaag tatcgttacc ctgctcttgt acgttcgggt 720 ttcaacccag agttccttac ttatatctcc aatgagaaga cgaacgataa aacccgtttt 780 gaagttacat acacgcgtaa tcaggacatc ttaaagaata aaccggggat tcattatggg 840 cagccgatct tagagcaaaa taaggatgga cagcgtttca ttgtagtgta tgaggttgac 900 tggaagaaca agacggtaaa agtagttgaa aagtattccg accaaaacaa gccttataag 960 gcgggt 966 <210> 56 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC8 LukA variant <400> 56 cacaaagaca gccaggatca aaacaagaaa gagcacgtgg acaagagcca gcaaaaggat 60 aaacgtaacg ttaccaacaa ggacaaaaac agcaccgcgc cggacgatat cggcaagaac 120 ggcaaaatta ccaagcgtac cgagaccgtg tacgatgaaa aaaccaacat cctgcagaac 180 ctgcaattcg actttattga cgatccgacc tgcgataaaa acgtgctgct ggttaagatg 240 cagggcagca tccacagcaa cctgaaattc gaaagccaca aagaggaaaa gaacagcaac 300 tggctgaagt acccgagcga gtatcacatt gactttcagg tgaaacgtaa ccgtaagacc 360 gaaatcctgg atcaactgcc gaagaacaaa attagcaccg cgaaggtttg cgcgaccttc 420 agctacagca gcggttgcaa atttgacagc accaagtgca tcggccgtac cagcagcaac 480 agctatagca aaaccatcag ctacaaccag caaaactatg ataccattgc gagcggcaag 540 aacaacaact ggcacgtgca ctggagcatc attgcgaacg acctgaaata cggtggcgag 600 gttaagaacc gtaacgatga actgctgttc tatcgtaaca cccgtatcgc gaccgtggag 660 aacccggaac tgagctttgc gagcaaatac cgttatccgg cgctggtgcg tagcggtttc 720 aacccggagt ttctggttta cctgagcaac gagaaaagca acgaaaagac ccagttcgaa 780 gttacctaca cccgtaacca agacatcctg aagaaccgtc cgggtatcca ctatgctccg 840 ccgattctgg agaagaacaa agatggccaa cgtctgattg tgacctatga agttgactgg 900 aagaacaaaa ccgttaaagt ggttgataag tacagcgacg ataacaaacc gtataaggcg 960 ggt 963 <210> 57 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC45 LukA variant <400> 57 gcaaacaaag actcacaaga tcagacaaag aaagagcatg tagacaaagc tcaacagaag 60 gaaaagcgca atgtgaacga caaggataaa aatactcctg gtccagatga cattggtaag 120 aatggtaaag ttactaagcg gaccgtctct gaatatgata aggagacaaa tattctccag 180 aatttgcaat tcgatttcat tgatgatccg acgtgcgata agaacgtatt gctcgttaaa 240 atgcagggct ccatccattc gaatctcaag ttcgaatccc atcgcaacga gacaaacgct 300 tcctggctca aatatcctag cgagtatcat atcgacttcc aagttcaacg gaaccctaaa 360 actgaaatcc ttgatcaact ccctaagaac aaaatctcaa ctgccaaggt ctgtgccaca 420 ttttcttatt ctcttggctg caaattcgat tcaacaaagt gtattggtcg tacatcaagt 480 aatagctata gtaaaagcat cagttataac cagcaaaact atgatacaat cgcgtcaggc 540 aaaaacaata atcgtcatgt ccattggtcc attgtcgcga acgaccttaa gtacggtaac 600 gaaattaaga atcggaacga tgagtttttg ttctatcgca acacccgtct gtctactgtc 660 gaaaacccgg agttgtcctt cgcaagtaaa tatcgctatc ctgctttggt acgttctggg 720 tttaacccgg aatttctcgt ctacatcagc aacgagaaaa caaatgacaa aacgcgcttt 780 gaagtcacgt acacacgtaa tcaggacatc ttaaaaaata aaccagggat tcactatggt 840 cagccaatct tggagcagaa taaagacggc cagcgtttca ttgtcgttta tgaagtggac 900 tggaaaaaca aaactgttaa ggtggttgag aaatattccg accaaaacaa accgtataag 960 gccggt 966 <210> 58 <211> 927 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 58 aaaatcaatt ctgaaattaa gcaagtgtcc gaaaaaaatt tggatggaga cacgaagatg 60 tatacgcgta ctgctacgac gtcagactcc cagaagaaca ttacacagag tctgcaattt 120 aattttctga cagaaccaaa ctatgacaag gaaactgtct ttattaaggc taaagggact 180 atcggaagcg gcttacgcat tttagacccc aacggttatt ggaatagcac gctgcgctgg 240 ccgggcagtt actcagtatc aatccaaaat gtcgatgata acaataacac caatgttacc 300 gatttcgccc ccaagaacca ggatgaatcg cgcgaggtta aatacacata cggctacaag 360 acaggcggtg actttagcat caaccgtggg ggcttgacag ggaatattac taaggaatca 420 aattatagtg agactatctc ttatcaacaa ccgtcctatc gtaccttatt agaccagagt 480 acctcccaca aaggtgtagg gtggaaagtt gaagcgcacc tgattaataa tatgggtcac 540 gatcacacac gccaactgac caacgacagt gacaaccgca caaaaagtga aatttttagt 600 cttacccgta acggaaatct gtgggccaaa gacaatttta caccgaaaga taagatgccg 660 gtcactgtat ctgaggggtt caatcccgag tttttagcag taatgtcgca tgacaaaaag 720 gacaaaggga aatcccagtt tgttgtccac tataagcgta gcatggatga attcaaaatc 780 gactggaacc gtcacggttt ctggggttac tggtcaggtg agaaccacgt agacaagaaa 840 gaggagaaac tgagcgcatt atatgaggtt gattggaaaa cgcacaatgt gaaatttgtt 900 aaagtcctga atgacaacga gaaaaag 927 <210> 59 <211> 930 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 59 gaaattaagt ctaagatcac aacagtatcg gagaaaaacc tggatggcga tactaagatg 60 tatacacgca ccgccactac ttcggacacg gagaagaaga tctcacaatc gttacagttt 120 aattttctta cagaaccgaa ctacgacaaa gagaccgtct tcattaaagc taaaggtacg 180 attggttcgg gattaaaaat tctgaatccg aatggctatt ggaacagtac cttacgttgg 240 ccggggtcat attctgtatc cattcaaaac gtggacgaca ataacaacag caccaatgtg 300 acagatttcg ctccaaagaa tcaggatgag tcccgcgagg tgaaatatac ctatgggtac 360 aaaacaggag gtgactttag cattaaccgt ggtggcttga ctggtaatat cacgaaggaa 420 aaaaattact ctgagactat ttcctaccaa cagccgtcgt atcgcacctt gatcgaccaa 480 ccaacgacta acaaaggggt cgcgtggaaa gttgaggccc acagtattaa caatatgggc 540 cacgatcaca ctcgtcagct tactaacgat tcggatgacc gcgtcaagtc ggaaattttc 600 agcctgacgc gtaacggaaa tttgtgggct aaagacaatt tcactcctaa gaacaagatg 660 cccgtgactg tttccgaagg ctttaatccc gaattcttag cggtgatgtc tcatgataaa 720 aatgataaag gaaaatcgcg cttcattgtg cattataagc gttctatgga cgacttcaaa 780 ttggattgga ataagcacgg attctggggg tactggtccg gggaaaatca cgtagatcaa 840 aaggaagaga agttgtccgc tttgtatgaa gtggactgga agactcacga cgttaagttg 900 atcaagacct tcaatgacaa agagaagaaa 930 <210> 60 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC8 LukB Variant <400> 60 aagatcaatt cggaaattaa acaggtaagt gagaaaaatt tggatggcga taccaaaatg 60 tacacccgca ccgctaccac gtcagattca caaaaaaata ttacacagtc cttgcagttc 120 aatttcctga cagaaccgaa ttacgacaag gagactttgt tcattaaagc caagggaacc 180 atcgggtccg gattgcgtat cttggacccg aacggatatt ggaactcgac cttacgttgg 240 ccggggtctt acagtgttag tatccaaaac gtagatgata acaataacac aaacgtgaca 300 gattttgcac ctaaaaacca ggacgaaagc cgcgaggtaa agtacacata tgggtataaa 360 acaggggggg acttttccat caaccgtggt ggtttgaccg ggaacatcac caaagagtca 420 aattacagtg agaccatcag ttatcagcag ccgtcctatc gtacattatt ggatcagtcg 480 acttcacata aaggggtcgg atggaaagta gaggctcatt tgatcaacaa catgggtcac 540 gatcatacac gtcagttaac gaacgatagc gataatcgca cgaagtcaga aatctttagt 600 ctgactcgta acggtaactt gtgggccaag gacaatttca cgcccaaaga taagatgcct 660 gtgacggtat cggaggggtt caatccagaa ttccttgctg taatgtccca tgacaaaaaa 720 gacaagggca aatcgcaatt tgtagtccac tataagcgtt ctatggacga gttcaagatt 780 gactggaacc gccacggctt ctgggggtac tggagtggtg agaatcatgt ggataaaaag 840 gaggagaaac ttagcgccct gtatgaggta gattggaaaa cacacaatgt caagttcgtg 900 aaagttctta atgacaacga aaaaaaa 927 <210> 61 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC45 LukB Variant <400> 61 gagatcaaga gcaaaattac caccgtgagc gaaaagaacc tggacggtga taccaaaatg 60 tatacccgta ccgcgaccac cagcgacacc gagaagaaaa ttagccagag cctgcaattc 120 aactttctga ccgagccgaa ctacgataag gaaaccctgt tcatcaaggc gaaaggcacc 180 attggtagcg gcctgaaaat cctgaacccg aacggttatt ggaacagcac cctgcgttgg 240 ccgggtagct acagcgtgag catccagaac gttgacgata acaacaacag caccaacgtg 300 accgacttcg cgccgaagaa ccaagatgag agccgtgaag ttaaatacac ctatggttac 360 aaaaccggtg gcgactttag cattaaccgt ggtggcctga ccggcaacat caccaaggag 420 aaaaactata gcgaaaccat tagctatcag caaccgagct accgtaccct gatcgatcag 480 ccgaccacca acaagggtgt ggcgtggaaa gttgaggcgc acagcattaa caacatgggc 540 cacgaccaca cccgtcaact gaccaacgat agcgacgatc gtgtgaagag cgaaatcttc 600 agcctgaccc gtaacggtaa cctgtgggcg aaagacaact ttaccccgaa gaacaaaatg 660 ccggtgaccg ttagcgaggg tttcaacccg gaatttctgg cggtgatgag ccacgacaag 720 aacgataagg gcaaaagccg tttcattgtt cactacaaac gtagcatgga cgatttcaag 780 ctggactgga acaaacacgg tttttggggc tattggagcg gcgagaacca cgttgatcag 840 aaagaggaga aactgagcgc gctgtacgaa gtggactgga agacccacga tgttaagctg 900 atcaaaacct ttaacgataa agaaaagaaa 930 <210> 62 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC8 LukA variant <400> 62 gctcacaaag attctcagga tcaaaataag aaggagcacg tcgacaagtc tcagcagaaa 60 gacaagcgta atgttacaaa caaggacaaa aacagcactg ctccagacga cattggaaaa 120 aacggtaaga ttactaaacg caccgaaacg gtatatgacg aaaaaacgaa cattttgcaa 180 aacttgcagt tcgatttcat tgacgacccc acttatgaca agaatgtcct tctggtgaag 240 aagcagggca gcattcactc aaacttgaaa tttgagtctc acaaggagga gaagaactcc 300 aattggctga aatacccatc agagtaccac gttgattttc aagtgaaacg taaccgcaaa 360 acggaaattt tggaccaatt gccgaaaaac aagatctcca ccgcgaaagt agactcaaca 420 ttcagttact cttccggcgg aaagttcgac agcactaagg ggatcgggcg cacttcttcc 480 aattcgtact cgaaaacgat ttcttacaat cagcagaatt atgacactat cgcatctggt 540 aaaaataata actggcacgt gcattggtcg gtgattgcta atgatttaaa gtatggaggt 600 gaggtaaaaa atcgtaatga cgagctgctg ttttaccgta acactcgcat cgcaaccgtt 660 gaaaacccgg aattgtcctt tgcctcgaaa taccgctacc ctgcattagt tcgttcaggc 720 tttaatcccg agtttttgac ttatctttcc aatgaaaaat cgaacgagaa gactcagttc 780 gaggttacgt acacccgcaa tcaggacatt ttgaagaacc gtccgggaat tcactatgcg 840 cctcccatct tagagaagaa taaggatgga caacgtttga tcgttacata tgaagttgac 900 tggaaaaata agaccgtaaa ggttgtggat aagtat 936 <210> 63 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CC45 LukA variant <400> 63 gcaaataaag actctcaaga tcagactaaa aaggaacatg ttgataaggc gcaacaaaaa 60 gaaaagcgta atgtcaatga taaggacaag aatactccgg gacccgacga cattggcaag 120 aacggaaagg tgacaaagcg taccgttagt gagtacgaca aggaaacaaa tatcctgcag 180 aacttacagt tcgattttat tgacgatcct acctatgaca agaatgtcct gttggtgaag 240 aaacagggca gcattcattc caatttaaaa tttgaaagcc atcgtaacga aacaaatgca 300 tcttggctta aatacccttc tgagtaccac gtagattttc aggtacaacg caacccaaaa 360 accgaaattc tggatcaact gcccaagaat aaaatttcta cggctaaagt tgacagtaca 420 tttagctaca gtttaggggg aaagtttgat agtacaaaag gaattggtcg tacttccagt 480 aactcctatt cgaaatctat ttcctataat caacagaatt acgacaccat cgcatccggt 540 aaaaacaata atcgccacgt acattggagt gttgtcgcga atgacttaaa gtacggtaac 600 gaaatcaaga accgcaacga cgaattctta ttctatcgta acacgcgttt aagcaccgtc 660 gagaaccccg agttatcctt tgctagcaaa tatcgctatc ctgcgttagt acgctcaggg 720 ttcaatcctg agttcttaac ctacatctcc aacgagaaaa ctaatgataa gacacgcttc 780 gaggtgacct acacccgtaa tcaggatatc cttaaaaata aaccgggtat tcattacggg 840 caacccattt tagaacagaa taaggacggc caacgtttta tcgtggtcta tgaggttgat 900 tggaagaaca agacagtgaa agtggttgaa aagtat 936 <210> 64 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LukA variant <400> 64 His Lys Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Gln Gln Lys Asp Lys Arg Asn Val Thr Asn Lys Asp Lys Asn Ser Thr 20 25 30 Ala Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Ile Thr Lys Arg Thr Glu 35 40 45 Thr Val Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe Asp 50 55 60 Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Asn Ser Asn Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp Phe 100 105 110 Gln Val Lys Arg Asn Arg Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro Lys 115 120 125 Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser Ser 130 135 140 Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser Asn 145 150 155 160 Ser Tyr Ser Lys Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr Ile 165 170 175 Ala Ser Gly Lys Asn Asn Asn Trp His Val His Trp Ser Val Ile Ala 180 185 190 Asn Asp Leu Lys Tyr Gly Gly Glu Val Lys Asn Arg Asn Asp Glu Leu 195 200 205 Leu Phe Tyr Arg Asn Thr Arg Ile Ala Thr Val Glu Asn Pro Glu Leu 210 215 220 Ser Phe Ala Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly Phe 225 230 235 240 Asn Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Leu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Glu Lys 245 250 255 Thr Gln Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys Asn 260 265 270 Arg Pro Gly Ile His Tyr Ala Pro Pro Ile Leu Glu Lys Asn Lys Asp 275 280 285 Gly Gln Arg Leu Ile Val Thr Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys Thr 290 295 300 Val Lys Val Val Asp Lys Tyr 305 310 <210> 65 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LukA variant <400> 65 Ala Asn Lys Asp Ser Gln Asp Gln Thr Lys Lys Glu His Val Asp Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln Lys Glu Lys Arg Asn Val Asn Asp Lys Asp Lys Asn Thr 20 25 30 Pro Gly Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Val Thr Lys Arg Thr 35 40 45 Val Ser Glu Tyr Asp Lys Glu Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe 50 55 60 Asp Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys 65 70 75 80 Lys Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Arg Asn 85 90 95 Glu Thr Asn Ala Ser Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp 100 105 110 Phe Gln Val Gln Arg Asn Pro Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro 115 120 125 Lys Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser 130 135 140 Leu Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ser Tyr Ser Lys Ser Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr 165 170 175 Ile Ala Ser Gly Lys Asn Asn Asn Arg His Val His Trp Ser Val Val 180 185 190 Ala Asn Asp Leu Lys Tyr Gly Asn Glu Ile Lys Asn Arg Asn Asp Glu 195 200 205 Phe Leu Phe Tyr Arg Asn Thr Arg Leu Ser Thr Val Glu Asn Pro Glu 210 215 220 Leu Ser Phe Ala Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly 225 230 235 240 Phe Asn Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Ile Ser Asn Glu Lys Thr Asn Asp 245 250 255 Lys Thr Arg Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys 260 265 270 Asn Lys Pro Gly Ile His Tyr Gly Gln Pro Ile Leu Glu Gln Asn Lys 275 280 285 Asp Gly Gln Arg Phe Ile Val Val Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys 290 295 300 Thr Val Lys Val Val Glu Lys Tyr 305 310

Claims (84)

  1. 서열번호 25의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A (LukA) 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 알라닌으로의 (Glu323Ala) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Lys83에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 리신에서 메티오닌으로의 (Lys83Met) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Ser141에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린에서 알라닌으로의 (Ser141Ala) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Val113에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 이소류신으로의 (Val113Ile) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Val193에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 이소류신으로의 (Val193Ile) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala를 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1에서의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체인, LukA 변이체 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 2에서의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체인, LukA 변이체 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, Tyr74에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 티로신에서 시스테인으로의 (Tyr74Cys) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, Asp140에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴에서 시스테인으로의 (Asp140Cys) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Gly149에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신에서 시스테인으로의 (Gly149Cys) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신에서 시스테인으로의 (Gly156Cys) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  20. 제14항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys 및 Gly153Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체인, LukA 변이체 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  22. 제14항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys 및 Gly154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체인, LukA 변이체 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 발린으로의 (Thr249Val) 치환을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 변이체 LukA 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노-말단 신호 서열을 추가로 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 상기 아미노-말단 신호 서열은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노-말단 정제 서열을 추가로 포함하는, LukA 변이체 폴리펩티드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  31. 제30항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  32. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  33. 서열번호 39의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B (LukB) 단백질 또는 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드. 　
  34. 제33항에 있어서, Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 (Val53Leu) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  35. 제33항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  37. 제33항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  38. 제37항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  39. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, Glu45에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu45Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, Glu109에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu109Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, Thr121에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 시스테인으로의 (Thr121Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌에서 시스테인으로의 (Arg154Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  45. 제39항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  46. 제45항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  47. 제33항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Val53Leu, Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  49. 서열번호 39의 변이체 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드로서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는:
    서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  50. 제49항에 있어서, Glu45에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu45Cys) 치환을 포함하고, Thr121에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 트레오닌에서 시스테인으로의 (Thr121Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, Glu109에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글루탐산에서 시스테인으로의 (Glu109Cys) 치환을 포함하고, Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아르기닌에서 시스테인으로의 (Arg154Cys) 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 15의 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 15의 CC8 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  54. 제53항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  55. 제52항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 16의 Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 16의 CC45 LukB 변이체인, LukB 변이체 폴리펩티드.
  56. 제55항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  57. 제33항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노-말단 신호 서열을 추가로 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  58. 제57항에 있어서, 상기 아미노-말단 신호 서열은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  59. 제33항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노-말단 정제 태그를 추가로 포함하는, LukB 변이체 폴리펩티드.
  60. 제33항 내지 제59항 중 어느 한 항의 LukB 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  61. 제60항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  62. 발현 벡터로서,
    제60항의 핵산 분자에 작동 가능하게 결합된 제30항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  63. 제61항 또는 제62항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  64. 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물로서,
    제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 백신 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 변이체인, 백신 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Lys80, Ser138, Val110, Val190, 및 Glu320Ala에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 백신 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하고, 상기 LukB 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
  70. 제68항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
  71. 제68항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
  72. 제64항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 변이체인, 백신 조성물.
  73. 제72항에 있어서,
    류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  74. 제72항에 있어서,
    류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  75. 제73항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 Lys81, Ser139, Val111, Val191, 및 Glu321Ala에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 백신 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하고, 상기 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, 백신 조성물.
  77. 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물로서,
    제33항 내지 제56항 중 어느 한 항의 하나 이상의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 백신 조성물.
  78. 제77항에 있어서,
    류코시딘 A(LukA) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 1(CC8)의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  79. 제77항에 있어서,
    류코시딘 A(LukA) 단백질 또는 폴리펩티드를 더 포함하되, 상기 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 2(CC45)의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는, 백신 조성물.
  80. 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 백신 조성물로서,
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 LukA 변이체 폴리펩티드, 및
    제33항 내지 제56항 중 어느 한 항의 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함하는, 백신 조성물.
  81. 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    애쥬번트를 더 포함하는, 백신 조성물.
  82. 제64항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원을 더 포함하는, 백신 조성물.
  83. 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 상기 면역 반응을 발생시키는 데 효과적인 조건 하에서 제64항 내지 제81항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법에 사용하기 위한 제64항 내지 제81항 중 어느 한 항의 백신 조성물.
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