JP2017141226A - 組換え毒素を含むクロストリジウム・ディフィシレに対するワクチン - Google Patents

組換え毒素を含むクロストリジウム・ディフィシレに対するワクチン Download PDF

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Henry Heinrichs Jon
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Lynn Secore Susan
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Rudy Goerke Aaron
キヤロアグイラー，イベツト
Caro-Aguilar Ivette
ジエンテイル，マリー−ピエール
Gentile Marie-Pierre
ホートン，メラニー，エス
S Horton Melanie
ミーゼイーウスキー，マシユー・ライアン
Ryan Miezeiewski Matthew
スキンナー，ジユリー，エム
M Skinner Julie
ソンダーマイヤー，パウルス・ヤコブス・アントニウス
Jacobus Antonius Sondermeijer Paulus
サブラマニアン，シヤムスンダー
Subramanian Shyamsundar
ヘイイデンリエフケンス，カリン・フベルデイナ・アントニア・バン・デル
Huberdina Antonia Van Der Heijden-Liefkens Karin
ワン，スー
Su Wang
シー，ジーンフー
Jinfu Xie
ソコノスル，レイチエル・フローラ
Flora Xoconostle Rachel
ゾーマン，ジユリー，ケイ
K Zorman Julie
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Abstract

【課題】組換え毒素を含むクロストリジウム・ディフィシレに対するワクチンの提供。
【解決手段】毒性を実質的に低減又は排除する、天然毒素配列に対して特に定められた突然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレからの二成分毒素Ａ（ＣＤＴａ）タンパク質，該タンパク質及び医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物、毒性を実質的に低減又は排除するのに十分な突然変異を含むＣＤＴａ突然変異毒素をバキュロウイルス／昆虫細胞発現系内で発現させる。
【選択図】図２１

Description

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）からの毒素Ａ（ＴｃｄＡ）、毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）および二成分毒素（ＣＤＴａお
よびＣＤＴｂ）タンパク質から選択される少なくとも１つの組換え毒素タンパク質ならび
に追加的な免疫原との組合せを使用するクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答の誘導方法に関する。本発明はまた
、防御免疫応答を誘導しうる、ＣＤＴａおよび／またはＣＤＴｂタンパク質を、単独で又
は１以上の追加的な免疫原、例えばＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わせて含む免疫原性
組成物、特に、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンに
関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年１月２７日付け出願の米国仮特許出願第６１／５９１，６３１号
、２０１２年２月８日付け出願の米国仮特許出願第６１／５９６，４１９号、および２０
１２年９月２０日付け出願の米国仮特許出願第６１／７０３，７５４号（それらの全内容
を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、２０１３年１月２５日付け作成のファイル名「２３１９２−ＰＣＴ
−ＳＥＱＬＩＳＴ−２５ＪＡＮ２０１３．ＴＸＴ」および６３２ＫＢのサイズを有するＡ
ＳＣＩＩファーマット化配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂから電子的に提出されている。ＥＦ
Ｓ−Ｗｅｂから提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本
明細書に組み入れることとする。
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は、土壌中の有機物および哺乳動物の胃
腸管の嫌気性区画中の分解および崩壊に関与する嫌気性グラム陽性芽胞形成細菌の属であ
る。多数のクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）は、それらの機
能に影響を及ぼすために、生物の種々の成分を標的化する分解酵素をコードし、発現する
。これらの酵素の幾つかは非常に強力な毒素および細胞毒へと進化している。これらの毒
素の発現は、幾つかのクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属種を、それぞれ破
傷風、ボツリヌス中毒、ガス壊疽および抗生物質関連大腸炎を引き起こすクロストリジウ
ム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリナム
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェ
ンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびクロストリジウム・デ
ィフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む日和見病原体へと変
化させうる。
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染（ＣＤＩ）は先進国
における最も一般的な院内感染の１つであり、抗生物質により引き起こされる正常なコロ
ニーフローラの破壊により、抗生物質療法を受けている入院患者に広がることが多い。米
国では毎年、推定５００，０００のＣＤＩの症例が見られる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｉｎ
ｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｏｓｐ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，３０（６）：５２６−３３
（２００９）；Ｒｕｐｎｉｋら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，７：５２７−３６（２
００９））。米国で報告されているクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）の症例数は、ＣＤＩ排出物診断での入院の比率が２００１年から２００５年まで
に９２％増加していることにより認められるとおり、増加している。クリンダマイシン、
セファロスポリン、ペニシリンおよびフルオロキノロンを含むほとんど全ての抗生物質は
、毒素産生性クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）により引き起
こされる症候性疾患に関連づけられている（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｌｉｎ Ｉ
ｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．４６（１０）：１４８９−９２（２００８）；Ｇｏｒｂａｃｈ，Ｓ
．Ｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３４１（２２）：１６９０−１（１９９９）；Ｋｅ
ｌｌｙら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３０（４）：２５７−６２（１９９４））。クロ
ストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）は、抗生
物質関連下痢、大腸炎および偽膜性大腸炎を含み、場合によっては、中毒性巨大結腸症、
敗血症および死亡へと進行しうる。この理由により、ＣＤＩは重大な医療問題である。Ｃ
ＤＡＤに罹患している幾人かの患者は抗生物質療法の中断に応答するが、ほとんどはメト
ロニダゾールまたはバンコマイシンのような更なる薬剤での治療を要する（ＤｕＰｏｎｔ
ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ
２１：５００−５０７（２００８）に概説されている）。既存療法は、しばしば、ＣＤ
ＡＤを排除できずあるいは再発性疾患につながり、したがって、予防または治療の新規方
法が必要とされている。
過去１０年にわたり、重篤または致死的な感染症の増加、標準的な治療の失敗、よりビ
ルレントな流行性株（ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ）の出現、益々増加している市中感染およ
び回帰発症の頻度（〜１５から２５％と見積もられている）が、ＣＤＩに対する治療的お
よび／または予防的治療の必要性の増大をもたらしている（Ａｓｌａｍら，Ｌａｎｃｅｔ
，３６５（９４６９）：１４６４（２００５）；Ｌｏｏら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，
３６５（１８）：１６９３−７０３（２００６）；ＭｃＤｏｎａｌｄら，Ｎ Ｅｎｇｌ
Ｊ Ｍｅｄ，３５３（２３）：２４３３−４１（２００５）；Ｍｕｔｏ，Ｃ．Ａ．，Ｉｎ
ｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｏｓｐ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２６（１）：１０−２（２
００５）；Ｐｅｐｉｎら，Ｃｍａｊ，．１７１（５）：４６６−７２（２００４）；Ｚａ
ｒら，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，４５（３）：３０２−７．（２００７））。幾
つかの研究は最近、市中感染ＣＤＩの頻度が増加していることを示唆している（ＭＭＷＲ
Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ，５７（１３）：３４０−３（２００８）
；Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎら，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，．１６９（１）：１２７−３３
（１９９４）；Ｋａｒｌｓｔｒｏｍら，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２６（１）：
１４１−５（１９９８）；Ｋｙｎｅら，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ，３６（３）：２８７−８（１
９９８）；Ｌａｍｂｅｒｔら，Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｏｓｐ Ｅｐｉｄｅｍ
ｉｏｌ，３０（１０）：９４５−５１（２００９）；Ｎｏｒｅｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ，４２（８）：ｐ．３６３５−４３（２００４）；Ｐａｌｔａｎｓｉｎｇ
ら，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，１３（１１）：１０５８−６４（２
００７））。
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の
毒素産生性分離体は、通常、毒素Ａおよび毒素Ｂ（「ＴｃｄＡ」および「ＴｃｄＢ」）と
称される２つの大きなクロストリジウム毒素をコードしており、それらは、それらの特異
な大分子量（＞２５０ｋＤａ）および作用メカニズムゆえに、大クロストリジウム毒素（
ＬＣＴ）と称される、より大きな毒素ファミリーの一部である（Ｓｃｈｉｒｍｅｒおよび
Ａｋｔｏｒｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １
６７３：６６−７４（２００４））。他の毒素産生株は毒素Ｂのみを発現し、毒素Ａを発
現しない。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはＣＤＩの唯一の原因因子であることが示されている
。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の一部は、クロストリ
ジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トランスフェラーゼまたはＣＤＴと称
されるアクチン−ＡＤＰ−リボシル化毒素をも産生する。二成分毒素と一般に称されるこ
の毒素は、特に、非常にビルレントな流行性株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩに関連し
ており、２つのタンパク質ＣＤＴａおよびＣＤＴｂからなる。
ＣＤＴｂサブユニットは、酵素的に活性なＣＤＴａタンパク質の細胞質内進入を可能に
する七量体環状構造を形成する。ＣＤＴａタンパク質はアルギニン１７７におけるＧ−ア
クチンのＡＤＰ−リボシル化を触媒し、アクチン重合を妨げる（Ｂａｒｔｈ，Ｈ．ら，Ｂ
ｉｎａｒｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂ
ｉｏｌ Ｒｅｖ，６８（３）：３７３−４０２（２００４））。クロストリジウム・ディ
フィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患の病理発生における二成分毒素の厳密な役割は
十分には解明されていないが、これらの毒素は腸管毒として機能し（Ｇｅｒｉｃ，Ｂ．ら
，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９３（８）：１
１４３−１１５０（２００６））、微小管の形成を誘導し、それによりクロストリジウム
・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の定着を増進することが示されており（Ｓｃ
ｈｗａｎ，Ｃら，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，５（１０）：ｅｌ０００６２６（２００９）
）、より最近になって、非二成分毒素含有株と比較して増加した死亡率に関連づけられて
いる（Ｂａｃｃｉら，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７（６）：９７６−８２
（２０１１）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＳＤ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ，６２：３５５−６２（２０１１））。
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素中和性ポリクローナ
ル血清での受動免疫（Ｔｈｏｍａｓら，ＷＯ ９９／２０３０４およびＷＯ ２００５／
０５８３５３を参照されたい）、毒素断片で免疫化（Ｗａｒｄら，ＷＯ ９８／５９０５
３；Ｌｙｅｒｌｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１：２９−３２（
１９９０）；ＷＯ ００／／０６１７６１）およびホルマリン不活化完全天然毒素での免
疫化（Ｔｏｒｒｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３（１２）
：４６１９−４６２７（１９９５）；Ｋｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ ５５（１２）：２９８４−２９９２（１９８７））；Ｆｅｒｎｉｅら，Ｄｅｖ
ｅｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ ５３：３２５−３２（１９８３）；Ｌｉｂｂｙら，
Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３６：８２２−９（１９８２）；Ｇｈｏｓｅら，Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７５（６）：２８２６−２８３２）を含む、クロ
ストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの開発に対する幾つか
のアプローチが文献に記載されている。また、二成分毒素（Ｊ．Ｅ．Ｇａｌｅｎ，ＷＯ
２０１１／０６０４３１）を含む毒素断片をコードするＤＮＡに基づくワクチンも記載さ
れている（Ｇａｒｄｉｎｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：３５９８−３６０４（２００９
））。Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈらは、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの受容体結合ドメインを
含む組換え融合タンパク質を開示している（ＷＯ２０１２／０２８７４１）。
また、毒性に関与する特定部位が突然変異している、組換え毒素に基づくワクチンも記
載されている。ＢａｌｌａｒｄおよびＳｐｙｒｅｓは、３９５位のシステインが別のアミ
ノ酸により置換された組換えＴｃｄＢワクチンを記載している（米国特許第７，２２６，
５９７号）。酵素活性にとって重要だと記載されている他の部位は、ＴｃｄＢの１０２位
のトリプトファン残基（Ｗ１０２）、およびＬＣＴが含まれるグリコシルトランスフェラ
ーゼＡファミリーのシグネチャーモチーフである触媒性三つ組モチーフＤＸＤである（Ｂ
ｕｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３２２８−２３４（２０００
））。Ｆｅｎｇらは、毒性を排除するための単一、二重または三重突然変異を有するＴｃ
ｄＡ毒素、および二重突然変異を有するＴｃｄＢ毒素を記載している（ＷＯ２０１１／０
６８９５３）。
本明細書に記載されている本発明は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５
Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも３つ
の突然変異を含む又はそれらからなる組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質に関する。本発明の好ましい実施形態に
おいては、組換えＴｃｄＡタンパク質は、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４
Ｑ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、
Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ
およびＳ５１７Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａお
よびＣ７００Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。追
加的な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は実質的に精製されている。
本発明は更に、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５
２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む又は
それらからなる組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素
Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク質に関する。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、
精製ＴｃｄＢタンパク質は、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ
１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、
Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１
８Ａ；ならびに（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８
Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。追加的な実施形
態においては、ＴｃｄＢタンパク質は実質的に精製されている。
本発明はまた、本明細書に記載されているＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢ突然変異毒
素を医薬上許容される担体と共に含むワクチンおよび免疫原性組成物に関する。好ましい
実施形態においては、組成物およびワクチンは、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパ
ク質を含む。組成物およびワクチンは、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント
および／またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を更に含みうる。
本発明は更に、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列
を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、細胞培養において発現させて組換え突
然変異タンパク質を得ることによる、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質の製造
に関するものであり、組換え突然変異タンパク質は単離および／または精製されうる。本
発明の特定の実施形態においては、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素タンパク質は、
昆虫細胞培養においてバキュロウイルス発現系を使用して製造される。
本発明はまた、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、
Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２
Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２
つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）に関する。幾つかの実施
形態においては、ＣＤＴａ突然変異は、Ｃ２Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、
Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される。本発明のこの態様の実施形態
においては、ＣＤＴａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑお
よびＥ３８７Ｑ；（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｅ）
Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；
（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３Ａお
よびＹ３８２Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む。本発明の好ましい実施
形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、シグナルペプチドを欠いている。本発明の追加
的実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は実質的に精製されている。
本発明は更に、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴ
ｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。幾つかの実施形態
においては、ヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
またはバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）における最適な発現のため
にコドン最適化されている。更に、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターおよび宿主
細胞を本発明において提供する。
また、本明細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／またはＣＤＴａタンパク
質およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素
タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）と医薬上許容される担体とを含む免疫原性組成物を本発明にお
いて提供する。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質はシグナルペ
プチドを欠いている。追加的実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質は更に、活性化ド
メインを欠いている。好ましい実施形態においては、組成物はＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤ
ＴａおよびＣＤＴｂタンパク質を医薬上許容される担体と共に含む。本発明の幾つかの実
施形態においては、免疫原性組成物はアジュバントを更に含む。
本発明はまた、対応ヌクレオチドの配列の発現を可能にする条件下、ＣＤＴａまたはＣ
ＤＴｂタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで細胞を形質転換してＣＤＴａま
たはＣＤＴｂタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａまたはＣＤＴｂタンパク質の
製造方法に関する。
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの有効量を患者に投与することを含む、
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療および／ま
たは予防方法を本発明において提供する。
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形“ａ”、“ａｎ”、
及び“ｔｈｅ”は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形を含む。
本出願の全体にわたり、「含む」なる語は非限定的であり、他の要素、例えば突然変異
の追加を許容する。１つの実施形態においては、本出願の全体における「含む」なる語は
、「からなる」または「から実質的になる」でありうる。幾つかの場合には、「からなる
」なる語は、「からなる」なる語を伴う実施形態の可能性を強調するために用いられてい
る。
ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのいずれにも具体的には言及されていない、本明細書の全体に
わたる毒素突然変異の全般的考察においては、アミノ酸残基の番号づけは、特に示されて
いない限りＴｃｄＢに関する適切な番号づけを意味する（ＴｃｄＡに特に向けられている
テキストはＴｃｄＡに関する適切な番号づけを示し、ＴｃｄＢに特に向けられているテキ
ストはＴｃｄＢに関する適切な番号づけを示す）。残基番号１３の後のＴｃｄＡにおける
単一アミノ酸欠失のため（ＴｃｄＢに対して；ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのアライメントは
図１６を参照されたい）、毒素Ａの突然変異に関する残基番号づけは毒素Ａに関しては毒
素Ｂに対して１単位だけずれる（すなわち、ＴｃｄＡでは、本明細書に記載されている突
然変異に関する残基番号づけはＴｃｄＢに対してｎ−１である；例えば、ＴｃｄＢにおけ
るＷ１０２はＴｃｄＡにおけるＷ１０１である）。例外はＴｃｄＡにおけるシステイン突
然変異Ｃ７００Ａであり、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメイン内の追加的な３つ
の残基の存在のため、これはＴｃｄＢにおいてはＣ６９８Ａである（図１６を参照された
い）。
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体においては、以下の定義および略語が用い
られる。
「ＴｃｄＡ」および「ＴｃｄＢ」は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素産生性分離体からの大きなクロストリジウム毒
素であるそれぞれ毒素Ａおよび毒素Ｂ、ならびに本明細書に記載されているそれらの突然
変異体および誘導体を意味する。「ＴｃｄＡ」および／または「ＴｃｄＢ」に対する言及
は、発現系としてクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を使用し
てタンパク質が産生されることを必要とするものではなく、すなわち、本明細書に記載さ
れているとおり、異なる発現系が使用されうる。
「ＣＤＴａ」および「ＣＤＴｂ」は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅ）トランスフェラーゼまたはＣＤＴと称され二成分毒素としても公知であるア
クチン−ＡＤＰ−リボシル化毒素からのそれぞれサブユニットタンパク質ＡおよびＢであ
る。本明細書において定義されているとおり、「ＣＤＴａ」および「ＣＤＴｂ」は、本明
細書に記載されている天然または野生型ＣＤＴａおよびＣＤＴｂの突然変異体および誘導
体を含む。「ＣＤＴａ」および／または「ＣＤＴｂ」に対する言及は、発現系としてクロ
ストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を使用してタンパク質が産生さ
れることを必要とするものではなく、すなわち、本明細書に記載されているとおり、異な
る発現系が使用されうる。
突然変異体は、本明細書においては一般に以下のとおりに称される：３個の点突然変異
を有する毒素Ａ（３ｍＴｃｄＡ）、３個の点突然変異を有する毒素Ｂ（３ｍＴｃｄＢ）、
４個の点突然変異を有する毒素Ａ（４ｍＴｃｄＡ）、４個の点突然変異を有する毒素Ｂ（
４ｍＴｃｄＢ）、５個の点突然変異を有する毒素Ａ（５ｍＴｃｄＡ）および５個の点突然
変異を有する毒素Ｂ（５ｍＴｃｄＢ）。
二成分毒素Ａの具体的な突然変異体は、以下のとおりに称される。３ｍＣＤＴａ１は、
突然変異Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄを有する、シグナルペプチドを伴わな
いＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ２は、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３
８７Ｑを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。４ｍＣＤＴａ３は、
突然変異Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑを有する、シグナルペプ
チドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ４は、突然変異Ｙ６２Ａ、Ｙ６９Ａお
よびＲ２５５Ａを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴ
ａ５は、突然変異Ｒ３５９Ａ、Ｙ６２ＡおよびＱ３０７Ｅを有する、シグナルペプチドを
伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ６は、突然変異Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａおよ
びＳ３４５Ｆを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。３ｍＣＤＴａ
７は、突然変異Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａを有する、シグナルペプチドを
伴わないＣＤＴａを意味する。４ｍＣＤＴａ８は、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ
３８７ＱおよびＣ２Ａを有する、シグナルペプチドを伴わないＣＤＴａを意味する。シグ
ナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（すなわち、突然変異無し）、３ｍＣＤＴａ１および３
ｍＣＤＴａ２に関する、ＮＡＰ１株Ｒ２０２９から得られた参照配列は、それぞれ、配列
番号３８、配列番号４０および配列番号４２として示されている（図１３を参照されたい
）。Ｎａｐ株から誘導された４ｍＣＤＴａ８の参照配列は、配列番号６７として示されて
いる。本明細書に記載されている研究に用いたＣＤＴａおよびＣＤＴａの突然変異体の実
際のアミノ酸配列は、配列番号３８、４０、４２および６７に示されている配列と比較す
ると、追加的なＮ末端メチオニンを含有していた。本発明のＣＤＴａ配列を得るのに有用
な参照配列に関しては、当業者は、二成分毒素を発現する他の株からのＣＤＴａ配列も３
ｍＣＤＴａ１、３ｍＣＤＴａ２または４ｍＣＤＴａ８のバックボーン配列を提供すること
が可能であり、そのような配列は、与えられたＮＡＰ１参考株配列からの小さな変異を有
しうると認識するであろう。ＣＤＴａの残基番号づけは、天然ＣＴＤａアミノ酸配列から
シグナルペプチドが除去された後のＮ末端残基（ＮＡＰ１参考株においてはバリン）から
始まる（図１５を参照されたい）。
本明細書中で用いる他の略語には以下のものが含まれる：ｂｍ＝バシラス・メガテリウ
ム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系；ｂｖ＝バキュロウイルス発現系
；ｃｄ＝クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌ
ｅ）発現系；ｅｃ＝大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現系；ＮＡＰ＝ＮＡ
Ｐ１／０２７／ＢＩ１７株；ＶＰＩ＝ＶＰＩ１０４６３株。
「有効量」は、所望の効果を得るために、例えば、患者におけるクロストリジウム・デ
ィフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘導するためにまたはクロス
トリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を予防するために、十分なワ
クチンまたは免疫原性組成物が患者に導入されることを意味する。当業者は、このレベル
は変動しうるものと認識する。
「ＭＡＡ」は無定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバントを
意味する。
本明細書中で用いる「ＩＳＣＯＭ型アジュバント」は、その機能に寄与する特有の球状
籠状構造を有する特徴的な籠状粒子を一緒になって形成する、サポニン、コレステロール
およびリン脂質から構成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントである
（総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい）。この語は、抗
原を使用して製造されたＩＳＣＯＭ粒子内に抗原を含むＩＳＣＯＭアジュバント、および
抗原を使用しないで製造されたＩＳＣＯＭ型アジュバントを中空にしたＩＳＣＯＭマトリ
ックスアジュバントの両方を含む。
本明細書中で用いる「単離（された）」なる語は、天然で見出されるものとは異なる形
態を示す。タンパク質（ポリペプチド）または核酸の異なる形態は、例えば、天然で見出
されるものとは異なる純度でありうる。１つの実施形態においては、この語は、文脈に応
じて、天然状態で通常付随する成分を実質的または本質的に含有しないタンパク質または
核酸に関するものである。
本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、参照配列（例えば、本明細書に記載されてい
るＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａまたはＣＤＴｂ配列）と比較した場合のアミノ酸配列に
おける変化（アミノ酸残基の付加および欠失を含む）および／または化学修飾でありうる
１以上の改変を有するポリペプチドを意味する。好ましい実施形態においては、誘導体は
改変前の元の参照配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である。一般に、誘導体は参照配列の活性（
例えば、免疫応答の誘導）を保有する。本明細書中で用いる「誘導体」なる語は野生型ま
たは天然参照配列の誘導体に限定されず、参照配列としての突然変異体配列の誘導体を含
む。好ましい実施形態においては、いずれかの特定の参照配列の突然変異が維持されてい
るが、誘導体配列においては、参照配列の特定の突然変異以外のアミノ酸残基における突
然変異参照配列に対する改変／修飾が含まれる。本明細書中で用いる「誘導体」なる語は
、参照ヌクレオチド配列に対する１以上の改変を有するポリヌクレオチドをも含む。
１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは１以上のアミノ酸
置換により異なっているアミノ酸配列であるポリペプチドである。アミノ酸置換は、「保
存的」［すなわち、該アミノは、アミノ酸の同一クラス（無極性、極性／中性、酸性およ
び塩基性）からの異なるアミノ酸、概ね類似した特性または類似構造（脂肪族、ヒドロキ
シルまたは硫黄含有、環状、芳香族、塩基性および酸性）を有するアミノ酸で置換されて
いる］または「非保存的」（すなわち、該アミノ酸は、異なるタイプのアミノ酸で置換さ
れている）でありうる。大まかに言えば、ポリペプチドの生物活性を改変することなく、
より少数の非保存的置換が可能であろう。本発明の幾つかの実施形態は、２５アミノ酸以
下の残基、２０アミノ酸以下の残基、１５アミノ酸以下の残基、１２アミノ酸以下の残基
、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ
酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、
４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸
の残基が参照配列に対して置換されている誘導体を含む。
もう１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは、任意の組合
せでの１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を有することにより異なっているアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである。欠失または付加アミノ酸は連続的又は個別の残基
でありうる。幾つかの実施形態においては、２５アミノ酸以下の残基、２０アミノ酸以下
の残基、１５アミノ酸以下の残基、１２アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以下の残基、
８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下
の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１
アミノ酸の残基が参照配列に対して欠失または付加している。
もう１つの実施形態においては、誘導体は、それが由来する塩基配列とは、タンパク質
の化学修飾の１以上を有することにより異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチド
である。化学修飾には、官能基の修飾（例えば、アルキル化、ヒドロキシル化、リン酸化
、チオール化、カルボキシル化など）、タンパク質合成中の非天然アミノ酸および／また
はそれらの誘導体の組込み、ならびにポリペプチドにコンホメーション拘束を課す架橋剤
および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。
参照配列（例えば、配列番号４４または６７）と誘導体との相違の度合を決定するため
には、当技術分野で公知の任意の方法が用いられうる。１つの実施形態においては、関連
性を決定するために配列同一性が用いられる。本発明の誘導体は参照配列（例えば、配列
番号４４）に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同
一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一である。同一
性（％）は、同一残基の数を残基の総数で割り算し１００を掛けたものとして定義される
。アライメントにおける配列が（ギャップまたは伸長により）異なる長さのものである場
合、最長配列の長さが計算において用いられ、全体の長さの値を表す。有利には、参照配
列に対する配列の関連性は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム・バージョン６．０
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能）のような配列解析ソフトウェアを使用し
て配列情報を比較することにより決定されうる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）により修正さ
れたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１
９７０）アライメント法を用いる。
追加的実施形態においては、関連性を決定するためにハイブリダイゼーションが用いら
れる。本発明の誘導体をコードする核酸は、高ストリンジェント条件下で参照配列をコー
ドする核酸にハイブリダイズするであろう。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェ
ンシーは当業者により容易に決定され、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に左
右される経験的計算である。
「医薬上許容される担体」は、投与を促進する物質を意味する。具体例には、液体充填
剤、希釈剤、または全身投与に安全に使用されうる他の物質が含まれる。特定の投与経路
に応じて、当技術分野でよく知られている種々の医薬上許容される担体が使用されうる。
これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク
、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、例えば
リン酸緩衝生理食塩水、乳化剤、等張生理食塩水および発熱物質非含有水を含む群から選
択されうる。特に、医薬上許容される担体は、バッファー、注射用無菌水、正常生理食塩
水またはリン酸緩衝生理食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートのよ
うな種々の成分を含有しうる。「生理的に許容される」、「希釈剤」または「賦形剤」の
ような語は互換的に用いられうる。
「ＰＤ」は「投与後」を意味し、「ＰＤ１」、「ＰＤ２」、「ＰＤ３」などは「用量１
の投与後」、「用量２の投与後」、「用量３の投与後」などを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、毒素酵素活性を有意に低減または排除しハムスターチャレンジモデルにおけ
る原型クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのクロストリ
ジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でのチャレンジに対する防御の付
与に有効である特異的突然変異を含む組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素、なら
びに該毒素を含むワクチンおよび免疫原性組成物を含む。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはＣＤ
Ｉの唯一の原因因子であるため、これらの毒素はこの疾患の予防および／または治療のた
めの望ましい標的である。これらの毒素での対象のワクチン接種は、該対象におけるこれ
らの分子の毒性作用を中和する防御抗体の産生を潜在的に誘導しうるであろう。しかし、
これらの毒素でのワクチン接種は、タンパク質に関連した毒性が排除され又は劇的に低減
されない限り、ヒトにとって安全ではない。本出願人は、毒性を有意に低減し、そして好
ましくは排除する突然変異およびそれらの組合せを特定し、同時に、これらの突然変異を
含有する毒素は、免疫原性を誘導する能力を保有することを特定した。
本発明はまた、組換えＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素タンパク質、ならびに突然変異Ｔｃ
ｄＡおよびＴｃｄＢと該毒素を組み合わせて含むワクチンおよび免疫原性組成物を含み、
ここで、該ＣＤＴａ毒素タンパク質は、毒素酵素活性を有意に低減または排除する特異的
突然変異を含む。本明細書に記載されているＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素タンパク質を含
むワクチンおよび組成物は、ハムスターチャレンジモデルにおける流行性クロストリジウ
ム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのクロストリジウム・ディフィシレ
（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でのチャレンジに対する防御をもたらすのに有効である
（実施例１１を参照されたい）。
構造的には、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、Ｎ末端の酵素ドメイン（ＥＤ）、システイン
プロテアーゼドメイン（ＣＰＤ）、トランスロケーションドメイン（ＴＤ）およびＣ末端
の結合ドメイン（ＢＤ）から構成される（図１を参照されたい）。ＥＤは小Ｒｈｏ ＧＴ
Ｐアーゼを不活性化して、細胞性細胞骨格の劇的な不可逆的変化をもたらし、最終的には
アポトーシスにより罹患細胞の死を招く（Ｇｅｒｈａｒｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５７：７６５−７７０（２００８）；Ｓｐｙ
ｒｅｓら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１（６）：３２９４−３
３０１（２００３）；Ｂｕｓｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３１）：１９５
６６−１９５７２（１９９８））。ＣＰＤは、ＥＤの自己触媒的切断をもたらす。ＴＤは
細胞質内へのＥＤのトランスロケーション、およびそれに続く細胞表面へのＢＤの結合を
引き起こす。トランスロケーションはエンドサイトーシス経路によるものであり、それに
より、ＴＤは後期エンドソームの酸性化の際にそのコンホメーションを変化させ、細胞質
内へのＥＤの進入を可能にする孔を形成すると考えられている。ＢＤは、クロストリジウ
ム反復性オリゴペプチド（ＣＲＯＰ）から構成される多価反復性受容体結合ドメインであ
る。ＣＲＯＰＳは表面炭水化物（例えば、ルイスＸおよびルイスＹ）に結合し、毒素の結
合およびエンドサイトーシスを引き起こす。これらの反復は高度に免疫原性であり、クロ
ストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対するワクチンの標的となっ
ている。
ＬＣＴファミリーは、現在、以下の５つのメンバーを含む：ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ（クロ
ストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、Ｔｃ
ｎＡ（クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ））、ＴｃｓＬ
（クロストリジウム・ソルデリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ））お
よびＴｐｅＬ（クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅ
ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））。これらの毒素は類似した有機体、基質（ＲｈｏＡ ＧＴＰアー
ゼ）、補基質（ＵＰＤ−グルコース、ＵＤＰ−ＮＡｃグルコサミン）および補因子（Ｍｎ
ＩＩ）を共有する。それらの相互配列同一性は２９〜７６％の範囲であるが、触媒残基お
よび酵素ドメインの活性部位に沿って並ぶ残基は、ほぼ１００％保存され（図２を参照さ
れたい）、機械学的に統一体である。ＴｃｓＬ、ＴｃｎＡおよびＴｃｄＢの酵素ドメイン
は結晶化されており（Ｒｅｉｎｅｒｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５１：９７３−８１
（２００）；Ｚｉｅｇｌｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７：１３４６−５６（２０
０７））、それらの構造はほぼ同一である。また、ＴｃｄＡの酵素ドメインの結晶構造が
最近公開された（Ｐｒｕｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：８０１３−８０２
０（２０１２））。ＴｃｄＡは、他のＬＣＴファミリーメンバーに類似した構造を実際に
有することが示された。特に、毒素のコアの構造（ＵＤＰ結合および触媒活性）はＴｃｄ
Ａに比べて保存されているが、表面は多岐にわたる。
一般に、毒素の突然変異誘発は既に記載されている。特に、幾つかの研究は、１０２位
のトリプトファン残基（Ｗ１０２）、およびＬＣＴが含まれるグリコシルトランスフェラ
ーゼＡファミリーのシグネチャーモチーフである三つ組触媒基モチーフＤＸＤに関連した
研究を記載している。Ｗ１０２Ａ突然変異の最初の記載はＢｕｓｃｈら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３２２８−２３４（２０００））によるものであり、これ
はＴｃｓＬ触媒ドメインに焦点を合わせていた。その研究において、野生型断片と比較し
てＷ１０２Ａはグリコシル化活性を約１，０００倍低減し、Ｗ１０２Ｙは活性を１００倍
低減することが観察され、このことは、ウラシル環の芳香性スタッキングがこの残基の考
えられうる機能であることを示唆している。Ｂｕｓｃｈらは、クロストリジウム・ディフ
ィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ｒＴｃｄＢ Ｗ１０２Ａ断片が
グリコシル化アッセイにおいて野生型断片より遥かに低い活性を有することが判明した、
と簡潔に記載している。該著者は、酵素活性におけるこの低減が補基質に対する結合アフ
ィニティの低減によるものだと結論づけている。Ｔｅｉｃｈｅｒｔら（Ｉｎｆｅｃｔ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎ．７４：６００６−６０１０（２００６））は、組換え完全長ＴｃｄＡ
におけるＷ１０１Ａ突然変異がインビトロ系（ＲｈｏＡ−グルコシル化；後記を参照され
たい）においてグルコシルトランスフェラーゼ活性を３８０倍低減し、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ
３繊維芽細胞上で細胞変性活性を５０倍低減することを開示している。突然変異毒素の濃
度の５０倍の増加は完全な細胞毒性を回復させた。最後に、Ｇｅｒｈａｒｄら（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７，７６５−７７０（２
００８））は完全長Ｗ１０１Ａ ＴｃｄＡ突然変異体のアポトーシス作用を調べた。野生
型ＴｃｄＡは１ｎＭの濃度でアポトーシスを誘導しうるが、Ｗ１０１Ａ突然変異体で処理
された細胞はアポトーシスの最小限度の徴候を示すに過ぎない。しかし、ＴｃｄＡ Ｗ１
０１Ａ突然変異体の濃度を５０倍増加させると、細胞は野生型に類似したレベルのアポト
ーシスを示した。毒素Ｂの突然変異誘発はＪａｎｋら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２
（４８）：３５２２２−３５２３１（２００７））およびＢａｒｒｏｓｏら（Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：２９７−３０３（１９９４））によっても
記載されている。また、特定の突然変異毒素がＳｉｄｈｕらにより記載されている（米国
特許出願公開第２０１２／０２６９８４１号）。
ＤＸＤモチーフは、ＭｎＩＩ、ＵＤＰおよびグルコースの結合、配向および分極に関与
するため、酵素活性に必須である。Ｄ２８８残基は、ＭｎＩＩに直接結合する。Ｄ２８６
は、一般塩基（例えば、補基質を加水分解する水分子）、ＵＤＰおよびグルコースと相互
作用する。Ｂｕｓｃｈらは、ＴｃｓＬの触媒ドメイン断片内のこの部位に対する突然変異
を記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２７３：１８５６６−１９５７２（１９９８））。２８６または２８８位のアスパラギン
酸をアラニンまたはアスパラギンで置換すると、グルコシル化活性がインビトロアッセイ
において約５，０００倍低減することが判明した（Ｂｕｓｃｈら，１９９８，前掲）。Ｄ
２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ二重突然変異体では酵素活性は観察されなかった。ＤＸＤモチーフ
内のアスパラギン酸残基がアラニンに変化された場合、クロストリジウム・ディフィシレ
（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ断片に関する類似した抑制が観察された。また、高
濃度のＭｎＩＩの存在下、ＴｃｓＬ Ｄ２８８Ａ酵素の活性が約２０倍増加して、活性に
おける数百倍の低減を尚ももたらしたことが開示された（Ｂｕｓｃｈら，１９９８，前掲
）。高いＭｎＩＩ濃度は二重突然変異体の活性をモジュレーションしなかった。Ｔｅｉｃ
ｈｅｒｔら（２００６）は、完全長Ｄ２８５／２８７Ｎ二重突然変異体で、野生型Ｔｃｄ
Ａと比較して、インビトロ活性における比較しうる６，９００倍の増加を観察した。最後
に、Ｇｅｒｈａｒｄらは、ＴｃｄＡ Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ二重突然変異体がアポトー
シスを誘導し得ないことを示した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ５７：７６５−７７０（２００８））。
理論により束縛されることを望むものではないが、ＬＣＴの活性部位の精査に基づいて
、本発明者らは、１０２位における大きな芳香環の除去（Ｗ１０２Ａ）が、（芳香的スタ
ッキングによる）補基質のＵＤＰ環に関する結合エネルギーの正味の喪失をもたらし、よ
り低い触媒ターンオーバーを有する酵素を与えると仮定した。これは、アラニンをその位
置でチロシンに置換することによっては部分的にしか回復しない。なぜなら、チロシンの
フェノール環はトリプトファンのインドール二重環より遥かに小さく、したがって、より
低い結合エネルギーを与えるからである。ＤＸＤモチーフ内のアスパラギン酸残基の一方
または両方の突然変異はＬＣＴの酵素活性に顕著な効果を及ぼした。なぜなら、活性部位
は、ＭｎＩＩ補因子の結合および分極、そして最終的にはＵＤＰ−グルコース内のＯ−グ
リコシド結合の加水分解に関与する決定的に重要な残基を欠いているからである。したが
って、Ｗ１０２／１０１ポケットおよびＤＸＤモチーフ内の突然変異を組み合わせること
により、補基質に結合しそれを分極させるそれらの能力が著しく損なわれるため、野生型
の活性の一部しか示さない酵素が得られると推論された。
完全長の遺伝的に不活性なＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ、ならびにバシラス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）におけるそれらの発現は、ＷＯ ２０１１
／０６８９５３に記載されている。特に、ＷＯ ２０１１／０６８９５３は、突然変異Ｗ
１０１Ａ、Ｄ２８７ＮおよびＷ５１９Ａを含む突然変異ＴｃｄＡ、ならびに突然変異Ｗ１
０２ＡおよびＤ２８８Ｎを含む突然変異ＴｃｄＢを記載している。これらの毒素はマウス
において評価されたが、ワクチン接種後の有害事象に関して動物が評価されたかどうかは
不明である。
本発明者らは、３つの突然変異（３ｍＴｃｄＡ；Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ
）および（３ｍＴｃｄＢ；Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ）をそれぞれが含有する
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢからなるワクチンは、このワクチンがホルムアルデヒドで更に不
活化されなければハムスターおよびサルにおいて許容できない毒性（局所炎症および腫脹
）を引き起こすことを見出した。毒性を更に低下させるために、本明細書に記載され図３
Ａおよび３Ｂに示されているとおり、３つの追加的突然変異を株ＶＰＩ１０４６３からの
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの触媒ドメイン内に別々に導入した。特に、Ｅ５１４／５１５（
ＴｃｄＡ／ＴｃｄＢ）の部位ＭｎＩＩへの立体的等価結合に対する突然変異、ならびにＯ
−グリコシド結合の分極に影響を及ぼすＳ５１７／５１８位およびＷ５１９／５２０位（
ＴｃｄＡ／ＴｃｄＢ）における突然変異を試験した。また、単一アミノ酸欠失突然変異体
も構築し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。
本出願における図５および実施例２に示されているとおり、４ｍＴｃｄＢに関しては、
ＲｈｏＡ グルコシル化アッセイを用いて分析された場合、残留酵素活性がないことは明
らかであった。この第４突然変異の付加にもかかわらず、動物の免疫化の後、残留毒素が
尚も観察された。したがって、トランスロケーションドメインからの触媒ドメインの切断
をもたらして細胞質内へのその遊離を可能にするシステインプロテアーゼの鍵残基である
第５突然変異Ｃ７００Ａ／６９８Ａを導入した。この突然変異の導入はＴｃｄＢの毒性に
おける更に１０倍の低減を招く。
突然変異ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢトキソイド
前記のとおり、本明細書に記載されている実験は、３、４または５個の突然変異を含む
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素が種々のレベ
ルでタンパク質の毒性の低減を示すことを示している。その目的のために、本発明は、部
分的には、タンパク質の毒性を排除するように意図された少なくとも３つの突然変異を含
む単離および／または精製された組換えＴｃｄＡタンパク質に関する。本発明は更に、タ
ンパク質の毒性を排除するように意図された少なくとも３つの突然変異を含む単離および
／または精製された組換えＴｃｄＢタンパク質に関する。本発明の好ましい実施形態にお
いては、本発明の組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質は、毒性を排除するように意
図された少なくとも４つの突然変異または少なくとも５つの突然変異を含む。少なくとも
３つの突然変異を含むＴｃｄタンパク質は更に、化学的手段、例えばホルムアルデヒド不
活化により解毒されうる。
本発明の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡ突然変異体は、Ｗ１０１、Ｄ２８７、
Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９およびＣ７００からなる群から選択されるアミ
ノ酸残基における少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの突然変異を含む
又はそれらからなるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ
タンパク質（ＴｃｄＡ）を含む。追加的な実施形態において、ＴｃｄＡ突然変異体は、Ｗ
１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７０
０Ａ置換ならびにＷ１０１欠失からなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４
つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなる。
突然変異の導入のための基礎となる天然クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）またはＶＰＩ
１０４６３に由来するものでありうる。本発明の好ましい実施形態においては、該Ｔｃｄ
Ａ突然変異体は、ＶＰＩ １０４６３株から得られたアミノ酸配列を含む。本発明におけ
るＴｃｄＡ突然変異体配列のバックボーンを形成しうる典型的なＴｃｄＡアミノ酸配列（
すなわち、本明細書において特定されている突然変異は、特定されている位置において参
照「バックボーン」配列に対して施されうる）には、配列番号９４（ＶＰＩ１０４６３株
、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６３５６４）、配列番号９５（株６３０（毒
型（ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｅ）０、リボタイプ０１２））、配列番号９６（ＳＥ８４４（毒
型ＩＩＩａ、リボタイプ０８０））、配列番号９７（Ｒ１２０８７（ＮＡＰ１））、配列
番号９８（Ｋ１４（毒型０、リボタイプ０５３））、配列番号９９（ＢＩ６（ＮＡＰ１）
）、配列番号１００（ＢＩ１７（ＮＡＰ１））、配列番号１０１（ＣＨ６２３０（毒素Ｉ
ＩＩｃ））および配列番号１０２（ＳＥ８８１（毒型Ｖ、リボタイプ０６６））に記載さ
れているアミノ酸配列が含まれる。また、突然変異参照配列の突然変異を保有する突然変
異ＴｃｄＡタンパク質の誘導体が、本発明の範囲内に含まれる。例えば、Ｗ１０１Ａ置換
を含む又はそれからなるＶＰＩ参考株から誘導された突然変異ＴｃｄＡタンパク質の誘導
体はＷ１０１Ａ置換を維持するが、他の位置におけるＶＰＩアミノ酸参照配列に対する改
変／修飾を含みうる。
本発明の特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑを含
む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質を提供する。もう１つの実施形態は、アミノ酸
置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａを含む又はそれらからなるＴ
ｃｄＡタンパク質を含む。本発明のもう１つの特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１
Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む又はそれらからなるＴ
ｃｄＡタンパク質である。
本明細書に記載されている本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は突
然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａを含む又はそれらからなる
。もう１つの別の実施形態は、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５
１７Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＡタンパク質を提供する。これらの別の実施形態
のいずれか又は本明細書に記載されているいずれかの他の実施形態においては、もう１つ
の突然変異、例えばＣ７００Ａ突然変異がＴｃｄＡタンパク質に付加されうる。本発明の
追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個までの更なる突然変異が、本明細書
に記載されているＴｃｄＡ実施形態のいずれかに付加されうる。
本発明の特定の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、配列番号７、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５また
は配列番号３５に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる、またはそれらか
ら実質的になる。
本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、本明細書に記載されている
いずれかのアミノ酸残基位置（すなわち、Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ
５１７、Ｗ５１９およびＣ７００）に突然変異を含む、それらからなるまたはそれらから
実質的になり、ここで、特定されたアミノ酸残基は、天然配列内に存在しないいずれかの
他のアミノ酸残基で置換され、例えば、１０１位のトリプトファンはトリプトファン以外
のいずれかの残基で置換され、２８７位のアスパラギン酸はアスパラギン酸以外のいずれ
かのアミノ酸残基で置換される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｗ１０１、Ｄ２８７
、Ｅ５１４、Ｗ５１９およびＣ７００位に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号２
６（５ｍＴｃｄＡ：Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａ、Ｃ７００Ａ）に
より定められるＴｃｄＡ配列の変異体を含み、ここで、配列番号７０に記載されていると
おり、Ｗ１０１はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｄ２８７はアス
パラギン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ５１４はグルタミン酸以外のいずれ
かのアミノ酸で置換され、Ｗ５１９はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換さ
れ、Ｃ７００はシステイン以外のいずれかのアミノ酸で置換される。
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ
５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９およびＣ７００）は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、
Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａにより定められる突
然変異と同じクラス内の又は構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。例え
ば、好ましい実施形態においては、１０１位のトリプトファンは、アラニンと類似した構
造を有する又は同じクラス内のアミノ酸で置換される。
本発明の追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、以下に示すアミ
ノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから実質的になる。
Figure 2017141226
追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、本明細書に記載されてい
るＴｃｄＡタンパク質の誘導体、例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３５また
は配列番号７０に記載されているアミノ酸配列を含むＴｃｄＡタンパク質の誘導体である
。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３
５または配列番号７０）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配
列を含む。更なる実施形態においては、本発明は、配列番号７、配列番号８、配列番号９
、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号
３５または配列番号７０に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１
０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下
の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミ
ノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例
えば、置換）を含むＴｃｄＡタンパク質誘導体を含む。
本発明はまた、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０および
Ｃ６９８からなる群から選択されるアミノ酸残基における少なくとも３つ、少なくとも４
つ又は少なくとも５つの突然変異を含む又はそれらからなるクロストリジウム・ディフィ
シレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂタンパク質を含むＴｃｄＢ突然変異体に関する。
本発明の実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ
、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａ置換ならびにＷ１
０２欠失からなる群から選択される少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つ
の突然変異を含む又はそれらからなる。
突然変異の導入のための基礎となる天然クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）またはＶＰＩ
１０４６３に由来するものでありうる。本発明におけるＴｃｄＢ突然変異体配列のバック
ボーンを形成しうる典型的なＴｃｄＢアミノ酸配列（すなわち、本明細書において特定さ
れている突然変異は、特定されている位置において参照「バックボーン」配列に対して施
されうる）には、配列番号８６（ＱＣＤ−６３ｑ４２（リボタイプ００１，ＮＡＰ２）、
ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０５３２８７４４．１０）；配列番号８７（ＮＡＰ８，ＮＣＢ
Ｉ参照配列：ＺＰ ０６８９１２２８．１）、配列番号８８（ＱＣＤ−２３ｍ６３（リボ
タイプ０７８、毒型Ｖ）、ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ ０５４００１１３．１）、配列番号
８９（ＣＤ１９６（ＮＡＰ１，０２７，毒型ＩＩＩ）、ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ ００３
２１３６３９．１）；配列番号９０（１４７０（リボタイプ０１７、毒型ＶＩＩＩ）、Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＡＡ８０８１５．１）、配列番号９１（８８６４（
リボタイプ０３６、毒型Ｘ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＡＣ１９８９１．
１）、配列番号９２（５３４０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＧ１８０１１
．１）および配列番号９３（ＶＰＩ１０４６３（リボタイプ０８７、毒型０）、ＮＣＢＩ
参照配列：ＺＰ ０５３４９８２４．１）に記載されている配列が含まれる。当業者は、
いずれかのクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株において、特
定された位置に所望の突然変異を導入しうるであろう。
本発明の１つの実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、ＮＡＰ１株から
得られるアミノ酸配列（例えば、配列番号２８に記載されているアミノ酸配列を含む、そ
れらからなる又はそれらから実質的になるＴｃｄＢ突然変異タンパク質５ｍＴｃｄＢ）を
含む。別の実施形態においては、ＴｃｄＢ突然変異タンパク質は、ＶＰＩ株から得られる
アミノ酸配列（例えば、配列番号５８に記載されているアミノ酸配列を含む、それらから
なる又はそれらから実質的になるＴｃｄＢ突然変異タンパク質５ｍＴｃｄＢ）を含む。ま
た、突然変異参照配列の突然変異を保有する突然変異ＴｃｄＢタンパク質の誘導体も本発
明の範囲内に含まれる。例えば、Ｗ１０２Ａ置換を含む又はそれらからなるＮＡＰ１参考
株から誘導された突然変異ＴｃｄＢタンパク質の誘導体はＷ１０２Ａ置換を維持するが、
他の位置におけるＮＡＰ１アミノ酸参照配列に対する改変／修飾を含みうる。
本発明の特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑを
含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質を提供する。もう１つの実施形態は、アミノ
酸置換Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａを含む又はそれらからなる
ＴｃｄＢタンパク質を提供する。本発明のもう１つの特定の実施形態は、アミノ酸置換Ｗ
１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含む又はそれらから
なるＴｃｄＢタンパク質である。
本明細書に記載されている本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、
突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａを含む又はそれらからな
る。もう１つの別の実施形態は、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ
５１８Ａを含む又はそれらからなるＴｃｄＢタンパク質を提供する。これらの別の実施形
態のいずれか又は本明細書に記載されているＴｃｄＢいずれかの他の実施形態においては
、もう１つの突然変異、例えばＣ６９８Ａ突然変異がＴｃｄＢタンパク質に付加されうる
。本発明の追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個までの更なる突然変異が
、本明細書に記載されているＴｃｄＢ実施形態のいずれかに付加されうる。
本発明の特定の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、配列番号１９、
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２
７、配列番号２８または配列番号５８に記載されているアミノ酸配列を含む、それらから
なるまたはそれらから実質的になる。
本発明の追加的実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、以下に示すアミ
ノ酸配列を含む、それからなるまたはそれから実質的になる。
Figure 2017141226
本発明の別の実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、本明細書に記載されている
いずれかのアミノ酸残基位置（すなわち、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ
５１８、Ｗ５２０およびＣ６９８）に突然変異を含む、それらからなるまたはそれらから
実質的になり、ここで、特定されたアミノ酸残基は、天然配列内に存在しないいずれかの
他のアミノ酸残基で置換され、例えば、１０２位のトリプトファンはトリプトファン以外
のいずれかの残基で置換され、２８８位のアスパラギン酸はアスパラギン酸以外のいずれ
かのアミノ酸残基で置換される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｗ１０２、Ｄ２８８
、Ｅ５１５、Ｗ５２０およびＣ６９８位に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号２
８（５ｍＴｃｄＢ：Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０Ａ、Ｃ６９８Ａ）に
より定められるＴｃｄＢ配列の変異体を含み、ここで、配列番号７１に記載されていると
おり、Ｗ１０２はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｄ２８８はアス
パラギン酸以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ５１５はグルタミン酸以外のいずれ
かのアミノ酸で置換され、Ｗ５２０はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸で置換さ
れ、Ｃ６９８はシステイン以外のいずれかのアミノ酸で置換される。
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ
５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０およびＣ６９８）は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、
Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａにより定められる突
然変異と同じクラス内の又は構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。例え
ば、Ｗ１０２突然変異を含む好ましい実施形態においては、１０２位のトリプトファンは
、アラニンと類似した構造を有する又は同じクラス内のアミノ酸で置換される。
追加の実施形態においては、突然変異ＴｃｄＢタンパク質は、本明細書に記載されてい
るＴｃｄＢタンパク質の誘導体、例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、
配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５
８、配列番号７１に記載されているアミノ酸配列を含むＴｃｄＢタンパク質の誘導体であ
る。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番
号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配
列番号５８または配列番号７１）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なく
とも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
異なる実施形態においては、本発明は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配
列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号５８
および配列番号７１に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０ア
ミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残
基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸
以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば
、置換）を含むＴｃｄＡタンパク質誘導体を含む。
本明細書に記載されているＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異毒素の任意の組合せが、後
記により完全に記載されているとおり、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅ）感染またはＣＤＡＤの予防および／または治療のための免疫原性組成物およ
びワクチンにおいて有用であり、本発明に含まれる。
本発明はまた、本明細書に記載されているＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体をコード
するヌクレオチド配列に関する。該ヌクレオチド配列は、所望の突然変異を含むタンパク
質をコードするように、または所望の発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバシ
ラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の高発現遺伝子のコド
ン使用頻度により厳密に合致したコドンを利用することを意図したコドン最適化ヌクレオ
チド配列をコードするように天然ヌクレオチド配列に施された変化を伴う天然配列であり
うる。また、発現または安定性を増強するために、コード化タンパク質を改変することな
く、ヌクレオチド配列に他の変化を施すことが可能であり、例えば、ヌクレオチド配列の
ＧＣ含量を修飾することが可能であり、クローニング目的、精製タグ（例えば、Ｈｉｓタ
グまたはＧＳＴタグ）の付加、制限部位の付加などのために追加的ヌクレオチドを付加す
ることが可能である。また、組換えを低減するためにＣＲＯＰ領域の反復性を低減するた
めに、ヌクレオチド配列に変化が施されうる。
したがって、本発明は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質をコードする単離
されたヌクレオチド配列に関する。ＴｃｄＡをコードする本発明の典型的なヌクレオチド
配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、
配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１に記載されているヌクレオチド配列を含
む、それらからなる又はそれらから実質的になる。ＴｃｄＢをコードする典型的なヌクレ
オチド配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１
７、配列番号１８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号５７に記
載されているヌクレオチド配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本
発明の追加の実施形態は、本明細書に開示されているヌクレオチド配列の誘導体、例えば
、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番
号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配
列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４
および配列番号５７に記載されているヌクレオチド配列を含む又はそれらからなる核酸分
子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、本発明の核酸および誘導体のいずれかを含むベクター、ならびに本発明
のベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。
二成分毒素からのＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質
本明細書に記載されている実験は、大クロストリジウム毒素ＴｃｄＡおよびＴｃｄｂと
二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）との両方を含有するワクチンでのハムスターの免
疫化が、流行性ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ株でのチャレンジに対してＴｃｄＡおよびＴｃｄ
Ｂのみを含むワクチンより有意に高いレベルの防御を誘導することを実証している。その
目的において、本発明は、前記の突然変異ＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢタンパク質を
ＣＤＴａおよび／またはＣＤＴｂと組み合わせて含むワクチンおよび免疫原性組成物に関
する。好ましい実施形態においては、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、Ｔｃｄ
Ａ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質を含む。
二成分毒素が活性毒素であるので、ワクチンまたは免疫原性組成物において使用するた
めに、毒素タンパク質の遺伝的に不活性化（不活化）された形態を作製することが望まし
かった。したがって、毒素ＣＤＴａの酵素成分を遺伝的不活性化の標的とした。ＣＤＴａ
を遺伝的に不活性化するために、以下の６つのＣＤＴａ三重突然変異体および２つのＣＤ
Ｔａ四重突然変異体を設計した：３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８５Ａ，Ｅ３８７Ｄ
）；３ｍＣＤＴａ２（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）；４ｍＣＤＴａ３（Ｒ
３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）；３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６２Ａ，Ｙ６９
Ａ，Ｒ２５５Ａ）；３ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６２Ａ，Ｑ３０７Ｅ）；３ｍＣＤＴ
ａ６（Ｙ２５８Ａ，Ｆ３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）；３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３
Ａ，Ｙ３８２Ａ）；および４ｍＣＤＴａ８（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ，Ｃ２
Ａ）。
３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８５Ａ，Ｅ３８７Ｄ）の場合、突然変異は、ＣＤＴ
ａ、およびＣＤＴａに対して〜８４．３％の配列同一性を有するＩｏｔａ毒素（Ｉａ）に
ついて行われている、公開された突然変異誘発／毒性研究に基づいて選択された。ＩｏＴ
ａ毒素（Ｉａ）の触媒活性に必須である活性部位残基は、ＣＤＴａにおいて高度に保存さ
れている（Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂ
ｉｎａｒｙ ｔｏｘｉｎ ａｃｔｉｎ −ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＣＤ １
９６．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５（４）：１４０２−１４０
７（１９９７）；およびＳｕｎｄｒｉｙａｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆ
ｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏ
ｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏｘｉｎ
ＣＤＴａ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８４（４２）２８７１３−２８
７１９（２００９）；Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ Ａｒｇ−２９５
，Ｇｌｕ−３７８ ａｎｄ Ｇｌｕ−３８０ ａｒｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｒｅｓ
ｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉ
ｖｉｔｙ ｏｆ ｉｏｔａ ｔｏｘｉｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９５：１９１−
１９４．（１９９６）；Ｎａｇａｈａｍａら，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｉｏｔａ ｔｏｘｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ １８２（８）２０９６−２１０３（２０００），およびＴｓｕｇｅら，Ｃ
ｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｒｏｍ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｉｏｔａ ｔｏｘｉｎ Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ ３２５：４７１−４８３．（２００３））。したがって、本発明者らの仮定
は、ＣＤＴａ内の等価残基も触媒活性に必須であるはずだというものであった。
３ｍＣＤＴａ２の場合、突然変異（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）は、Ｃ
ＤＴａの突然変異誘発を記載している報告（Ｎａｇａｈａｍａら；Ｔｓｕｇｅら；Ｐｅｒ
ｅｌｌｅら；前掲；Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏｘｉｎ Ｃ
ＤＴａ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８４（４２）：２８７１３−２８７
１９（２００９）；およびＧｕｌｋｅら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ
ｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏｘｉｎ ＣＤＴａ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９（１０）
：６００４−６０１１（２００１））に基づいて選択された。また、Ｓｕｎｄｒｉｙａｌ
らはＣＤＴａの結晶構造を記載しており、突然変異Ｓ３４５Ｆが立体障害により基質結合
を妨げると予測した。Ｓ３３８Ａ（Ｓ３４５のＩａ等価体）では活性における〜２０倍の
低減が観察されたが、Ｓ３３８Ｆ突然変異体では活性は全く観察されなかった（Ｎａｇａ
ｈａｍａら）。Ｇｕｌｋｅらは、Ｉａでの観察と同様に、ＣＤＴａにおけるＳ３４５Ａか
らは活性の僅かな低減しか生じないことを報告した。
４ｍＣＤＴａ３（Ｒ３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）は、３ｍＣＤＴ
ａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異を組み合わせるように設計された。Ｅ３８５
ＡおよびＥ３８７Ｄに対して突然変異Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑが選択されたのは、こ
れらの置換残基が、グルタミン酸により類似しているからである。
３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６７Ａ，Ｙ６９Ａ，Ｒ２５５Ａ）の場合、クロストリジウム・パー
フリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のｉｏｔａ毒素に
おけるアクチン認識およびＡＤＰ−リボシル化残基の突然変異が細胞毒性および酵素活性
の低減を引き起こすことを示した過去の報告（Ｔｓｕｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：７３９９−７４０４．（２００８））に基づいて、アク
チン結合に関与する残基に突然変異が施された。
３ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６７Ａ，Ｑ３０７Ｅ）の場合、Ｙ６７Ａ突然変異は、
ＮＡＤと相互作用する２つの残基（Ｒ３５９およびＳ３０７）に対する突然変異と組み合
わされた。ＣＤＴａにおけるＲ３５９の等価残基である、ｉｏｔａ毒素におけるＲ３５２
は、ＮＡＤアーゼ活性に必須であることが示された（Ｔｓｕｇｅら，（２００３），前掲
）。また、ＣＤＴａの結晶構造に基づいて、ＮＡＤはＲ３５９およびＱ３０７と相互作用
すると予測された（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９））。３ｍＣＤＴａ６（Ｙ２５８
Ａ，Ｆ３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）の場合、ＡＲＴアーゼおよびＮＡＤアーゼ活性に影響を及
ぼす等価ｉｏｔａ毒素残基の能力に基づいて（Ｔｓｕｇｅら，（２００３））、またはＣ
ＤＴａ結晶構造に基づいて（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９））、追加的突然変異が
選択された。
３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３Ａ，Ｙ３８２Ａ）の場合、Ｉｏｔａ毒素におけ
るリガンド結合、ＮＡＤアーゼ活性および／またはＡＲＴアーゼ活性に関与すると考えら
れる残基に突然変異が施された（Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら，（２００９）；Ｔｓｕｇｅら，
（２００３））。また、Ｙ３８２が選択されたのは、それが、アクチン特異的ＡＤＰ−リ
ボシル化毒素に重要であることが公知の保存された決定的に重要な芳香族残基だからであ
る。
４ｍＣＤＴａ８の場合、野生型組換えＣＤＴａおよび組換え突然変異ＣＤＴａが二量体
化する傾向を有していたという本発明者らの観察に基づいて、突然変異Ｃ２Ａが３ｍＣＤ
Ｔａ２突然変異体における突然変異に加えられた。ＣＤＴａの配列を調べることにより、
本発明者らは単一のシステイン残基を見出し、ＣＤＴａの二量体化を低減または排除する
ことを試みるためにシステイン残基を変異させた。分析的解析は、このシステインの変異
が突然変異ＣＤＴａのオリゴマー化を劇的に低減することを示した。実施例１３および図
２０Ｃを参照されたい。
したがって、本発明は、Ｃ２、Ｙ６７、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５５、Ｙ２５８、Ｒ３
０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８２、Ｅ３８５、Ｅ３
８５、Ｅ３８７およびＥ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも２つ
の突然変異を含む、それらからからなる又はそれらから実質的になる組換え二成分毒素タ
ンパク質Ａ（ＣＤＴａ）に関する。本発明の特定の実施形態においては、ＣＤＴａタンパ
ク質は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２
Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３
８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄからなる群から選択される２個まで、
３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで
、１１個まで、１２個まで、１３個まで、１４個まで、１５個まで、１６個まで、または
１７個までの突然変異を含む又はそれらからなる。幾つかの実施形態においては、ＣＤＴ
ａ突然変異は、Ｃ２Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｑ
およびＥ３８７Ｄから選択される。本発明の幾つかの実施形態においては、組換えＣＤＴ
ａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｂ）Ｒ３０２Ａ、
Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（
ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ
およびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；（ｇ）Ｙ２５８Ａ、
Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａから
なる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれらからなる。本発明の好ましい実施
形態においては、ＣＤＴａタンパク質はシグナルペプチドを欠いている（すなわち、天然
ＣＤＴのシグナルペプチドが欠失している）。
本発明の追加の実施形態においては、本明細書に記載されているＣＤＴａ突然変異タン
パク質は、天然配列に対する１つの更なる突然変異を含む（例えば、突然変異Ｃ２Ａ、Ｓ
３４５Ｆ、Ｅ３８５ｑおよびＥ３８７ＱからなるＣＤＴａタンパク質に対して、１つの追
加的突然変異を加える）。本発明の追加的実施形態においては、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個
までの更なる突然変異が本明細書におけるいずれかの実施形態に記載されているＣＤＴａ
タンパク質のいずれかに付加されうる。
本発明の典型的実施形態においては、前記のＣＤＴａタンパク質は、配列番号４０、配
列番号４２または配列番号６７に記載されているアミノ酸配列を含む、それらからなる又
はそれらから実質的になる。本発明の追加の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は
、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７を含
む、それらからなる又はそれらから実質的になる。
本発明の別の実施形態においては、ＣＤＴａ突然変異タンパク質は、本明細書に記載さ
れているいずれかのアミノ酸残基（すなわち、Ｃ２、Ｙ６７、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５
５、Ｙ２５８、Ｒ３０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８
２、Ｅ３８５、Ｅ３８５、Ｅ３８７およびＥ３８７）に突然変異を含む、それらからなる
又はそれらから実質的になり、ここで、特定されているアミノ酸残基は、天然配列内に存
在しないいずれかの他のアミノ酸残基で置換され、例えば、２位のシステインはシステイ
ン以外のいずれかの残基で置換され、６７位のＹはチロシン以外のいずれかの残基で置換
される。例えば、本発明の別の実施形態は、Ｃ２、Ｓ３４５、Ｅ３８５およびＥ３８７位
に突然変異を含む又はそれらからなる配列番号６７に記載されているＣＤＴａ配列の変異
体（４ｍＣｄｔＡ８：Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）を含み、ここ
で、配列番号７２に記載されているとおり、Ｃ２はシステイン以外のいずれかのアミノ酸
で置換され、Ｓ３４５はセリン以外のいずれかのアミノ酸で置換され、Ｅ３８５はグルタ
ミン酸以外のいずれかのアミノ酸残基で置換され、Ｅ３８７はグルタミン酸以外のいずれ
かのアミノ酸で置換される。
好ましい実施形態においては、記載されているアミノ酸残基（すなわち、Ｃ２、Ｙ６７
、Ｙ６９、Ｙ２５３、Ｒ２５５、Ｙ２５８、Ｒ３０２、Ｑ３０７、Ｎ３４２、Ｓ３４５、
Ｆ３５６、Ｒ３５９、Ｙ３８２、Ｅ３８５、Ｅ３８５、Ｅ３８７およびＥ３８７）は、Ｃ
２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０
７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ
３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄにより定められる突然変異と同じクラス内の又は
構造において類似しているアミノ酸残基で置換される。
別の実施形態においては、本発明は、前記の突然変異のいずれか又はそれらの組合せを
含む突然変異ＣＤＴａタンパク質を提供する。突然変異の導入のための基礎となる天然Ｃ
ＤＴａタンパク質配列は、任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉ
ｌｅ）株、例えばＮＡＰ１／０２７／ＢＩ（「ＮＡＰ」）株またはＶＰＩ １０４６３株
に由来するものでありうる（すなわち、前記突然変異は、いずれかのＣＤＴａ参照配列、
例えば、配列番号３８に示されているＣＤＴａ配列、または異なる株からのＣＤＴａ配列
内に組込まれうる）。本発明におけるＣＤＴａ突然変異体配列のバックボーンを形成しう
る追加的な典型的ＣＤＴａアミノ酸配列（すなわち、本明細書において特定されている突
然変異は、特定されている位置において参照「バックボーン」配列に対して施されうる）
には、配列番号７３（株ＡＭ４７８（毒素型ＩＶ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
ＡＥＣ１１５７５．１）、配列番号７４（株ＣＤ９８（リボタイプ０７８、ＮＡＰ７、毒
素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６９．１）、配列番号７５（
株ＡＥ１６（リボタイプ０２７、ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号ＡＥＣ１１５６０．１）、配列番号７６（株ＣＤ１９６（ＮＡＰ１、毒素型ＩＩ
Ｉ、０２７）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ６７３０４．２）、および配列
番号７７（株Ａ７６５（毒素型ＩＸ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ
ＥＣ１１５７８．１）が含まれる。本発明の追加の実施形態においては、本発明の組換え
ＣＤＴａタンパク質のいずれかは実質的に精製されている。
追加の実施形態においては、突然変異ＣＤＴａタンパク質は、本明細書に記載されてい
るＣＤＴａタンパク質の誘導体、例えば、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７ま
たは配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含むＣＤＴａタンパク質の誘導体であ
る。そのような誘導体は、元の参照配列（例えば、配列番号４０、配列番号４２、配列番
号６７または配列番号７２）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも
９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。更な
る実施形態においては、本発明は、配列番号４０、配列番号４２、配列番号６７または配
列番号７２に対して１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基、１０アミノ酸以
下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸以下の残基、６ア
ミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３アミノ酸以下の残
基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変（例えば置換）を
含むＣＤＴａタンパク質誘導体を含む。本発明の追加の実施形態は、追加的なＮ末端メチ
オニンを伴う本明細書に記載されているＣＤＴａタンパク質（例えば、配列番号４０、配
列番号４２、配列番号６７または配列番号７２）のいずれかの誘導体を含む。
また、本発明は、単離および／または精製された組換え二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤ
Ｔｂ）を提供し、ここで、ＣＤＴｂタンパク質はシグナルペプチドを欠いている（本明細
書においては「プロＣＤＴｂ」と称される）。本発明の単離されたプロＣＤＴｂタンパク
質は、二成分毒素を発現する任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）株に由来しうる。本明細書に記載されている組成物およびワクチンにおいて使用
されうる典型的なＣＤＴｂ配列には、配列番号７８（株ＣＤ９８（リボタイプ０７８、Ｎ
ＡＰ７、毒素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７０．１）、配列
番号７９（株Ｋ７４４（リボタイプ０７８、ＮＡＰ８、毒素型Ｖ）、ＧｅｎＢａｎｋアク
セッション番号ＡＥＣ１１５８５．１）、配列番号８０（株ＡＭ４７８（毒素型ＩＶ）、
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７６．１）、配列番号８１（株ＡＤ６６
７（毒素型ＩＩＩ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５５８．
１）、配列番号８２（株Ｃ４２１（毒素型ＩＸ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ
ＥＣ１１５６４．１）、配列番号８３（株Ａ７６５（毒素型ＩＸ、ＮＡＰ１）、ＧｅｎＢ
ａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５７９．１）、配列番号８４（株ＣＤ１９６（ＮＡ
Ｐ１、毒素型ＩＩＩ、０２７）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ６７３０５．
１）、および配列番号８５（株ＡＥ１６（リボタイプ０２７、ＮＡＰ１、毒素型ＩＩＩ）
、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥＣ１１５６０．１）に記載されているアミノ酸
配列が含まれる。
米国および欧州におけるＣＤＩの確定臨床例に関して株型決定が行われた大規模多国臨
床試験および／または疫学的研究においては、主要な二成分毒素を発現するリボタイプは
０２７および０７８であった。これらの研究においては、０２７および０７８の有病率は
１１％〜４０％の範囲であった（Ｂａｕｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ３７７（９７５９）：６
３−７３（２０１１）；Ｇｅｒｄｉｎｇら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．８（２）：６７−８（２０１１））。本発明のこの態様の幾つかの
実施形態においては、プロＣＤＴｂアミノ酸配列はＮＡＰ１株に由来する。
特定の実施形態においては、プロＣＤＴｂタンパク質は、以下に示すアミノ酸配列を含
む、それらからなる又はそれらから実質的になる。
Figure 2017141226
本発明の追加の実施形態においては、単離された組換えＣＤＴｂタンパク質は更に欠失
している（すなわち、シグナルペプチドの欠失を含有し、ＣＤＴｂのＮ末端活性化ドメイ
ンの更なる欠失を含有する（Ｂａｒｔｈら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒ
ｅｖ．６８（３）：３７３−４０２（２００４）を参照されたい））。本発明のＣＤＴｂ
タンパク質は、二成分毒素を含む任意のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅ）株に由来しうる。本発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＣＤＴ
ｂタンパク質配列はＮＡＰ１株に由来する。特定の典型的な実施形態においては、ＣＤＴ
ｂタンパク質は、配列番号４６に記載されているアミノ酸配列からなる、実質的になるま
たはそれを含む。追加の実施形態においては、ＣＤＴｂタンパク質は、配列番号４６に記
載されているＣＤＴｂタンパク質の誘導体、例えば、配列番号４６に対して少なくとも８
５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％
同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＴｂタンパク質である。もう１つの実施形態において
は、本発明は、配列番号４６に対する１２アミノ酸以下の残基、１１アミノ酸以下の残基
、１０アミノ酸以下の残基、９アミノ酸以下の残基、８アミノ酸以下の残基、７アミノ酸
以下の残基、６アミノ酸以下の残基、５アミノ酸以下の残基、４アミノ酸以下の残基、３
アミノ酸以下の残基、２アミノ酸以下の残基または１アミノ酸の残基に対する修飾／改変
（例えば置換）を含むＣＤＴｂタンパク質誘導体を含む。
本発明はまた、本明細書に記載されているＣＤＴａおよびＣＤＴｂ突然変異体をコード
するヌクレオチド配列に関する。該ヌクレオチド配列は、所望の突然変異を含むタンパク
質をコードするように、または所望の発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス
・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）または昆虫細胞の高発現遺
伝子のコドン使用頻度により厳密に合致したコドンを利用することを意図したコドン最適
化ヌクレオチド配列をコードするように、天然ヌクレオチド配列に施された変化を伴う天
然配列でありうる。また、発現または安定性を増強するために、コード化タンパク質を改
変することなく、ヌクレオチド配列に他の変化を施すことが可能であり、例えば、ヌクレ
オチド配列のＧＣ含量を修飾することが可能であり、クローニング目的、精製タグ（例え
ば、ＨｉｓタグまたはＧＳＴタグ）の付加、制限部位の付加などのために追加的ヌクレオ
チドを付加することが可能である。
したがって、本発明は、本発明のＣＤＴａ突然変異タンパク質をコードする単離された
核酸に関する。突然変異ＣＤＴａタンパク質をコードする典型的なヌクレオチド配列は、
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５
２、配列番号６７および配列番号６８に記載されているヌクレオチド配列を含む、それら
からなる又はそれらから実質的になる。本発明の幾つかの実施形態においては、核酸は実
質的に精製されている。本発明の追加的実施形態は、本明細書に開示されているＣＤＴａ
ヌクレオチド配列の誘導体であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号４７、配列番号４
８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号６７および配
列番号６８に記載されているヌクレオチド配列を含む又はそれらからなる核酸分子に高い
ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、前記のＣＤＴｂおよびプロＣＤＴｂタンパク質をコードする単離された
ヌクレオチド配列に関する。ＣＤＴｂをコードする典型的なヌクレオチド配列は、配列番
号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６に記載されているヌクレオチド
配列を含む、それらからなる又はそれらから実質的になる。本発明の幾つかの実施形態に
おいては、該核酸は実質的に精製されている。本発明の追加の実施形態は、本明細書に開
示されているＣＤＴａヌクレオチド配列の誘導体であるヌクレオチド配列、例えば、配列
番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６に記載されているヌクレオチ
ド配列を含む又はそれらからなる核酸分子に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、本発明の核酸のいずれかを含むベクター、および本発明のベクターのい
ずれかを含む宿主細胞に関する。
使用方法
本発明の実施形態はまた、（ａ）療法（例えば、人体）、（ｂ）医薬、（ｃ）クロスト
リジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の複製の抑制、（ｄ）クロストリジ
ウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染の治療または予防、（ｅ）ク
ロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の予防、（ｆ）ク
ロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した病的症状の進
行、開始もしくは重症度の低減、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性の低減、あるいは（ｇ）下痢、大腸炎および偽膜性大
腸炎（これらに限定されるものではない）を含むクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療、予防、または該関連疾患の開始、重症化もしくは
進行の遅延における；（ｉ）使用のための、（ｉｉ）医薬または組成物としての使用のた
めの、あるいは（ｉｉｉ）医薬の製造における使用のための、突然変異ＴｃｄＡ、突然変
異ＴｃｄＢ、突然変異ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ毒素の１以上、又は本明細書に記載されて
いる毒素を含む組成物、または突然変異毒素もしくは組成物を含む若しくはそれらからな
るワクチンを含む。これらの使用においては、突然変異毒素、その組成物、および／また
は突然変異毒素もしくは組成物を含むもしくはそれらからなるワクチンは、場合により１
以上の抗細菌剤（例えば、後記の抗細菌化合物、モノクローナル抗体または組合せワクチ
ン）と組み合わせて使用されうる。
したがって、本発明は、本発明の毒素の１以上、または本発明の毒素の１以上を含む免
疫原性組成物もしくはワクチンを、治療を要する患者に投与することを含む、クロストリ
ジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染またはクロストリジウム・ディフ
ィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の予防的および／または治療的治療のための
方法を提供する。本発明のこの態様の幾つかの好ましい実施形態においては、患者には、
ＴｃｄＡタンパク質、ＴｃｄＢタンパク質、ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂ毒素タン
パク質、またはＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂを含むワクチンもしくは免
疫原性組成物が投与される。
「患者」（あるいは本明細書においては「対象」と称される）は、クロストリジウム・
ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染している哺乳動物を意味する。好ましい
実施形態においては、患者はヒトである。患者は予防的または治療的に処置されうる。予
防的処置は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染またはそ
の効果（すなわち、ＣＤＡＤ）の可能性または重症度を低減するのに十分な防御免疫をも
たらす。治療的処置は、重症度を低減するために、またはクロストリジウム・ディフィシ
レ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染もしくはＣＤＡＤの再発を予防するために行われうる
。
予防的処置は、本明細書に記載されている突然変異または単離毒素の１以上を含有する
医薬組成物を使用して行われうる。医薬組成物は、集団全体に、またはクロストリジウム
・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染のリスクの増大を示す個体に投与されう
る。
本発明の組成物は、追加的物質を含む治療計画の一部として患者に投与されうる。例え
ば、本発明は、ＣＤＡＤの治療またはＣＤＡＤの重症度もしくは進行の低減に有効である
抗生物質［例えば、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、バンコマイシン
（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）およびフィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｙｃｉｎ）］と組
み合わされた免疫原性組成物の使用を想定している。また、本発明においては、本明細書
に記載されている免疫原性組成物が、ＣＤＡＤの治療またはＣＤＡＤの重症度もしくは進
行の低減に有効である他の医薬または物質［例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、毒素Ａまたは毒素Ｂを標的化するモノクローナル抗体、例え
ば、米国特許第７，６２５，５５９号にＡｍｂｒｏｓｉｎｏにより記載されているモノク
ローナル抗体］での治療を受けている患者に投与される治療計画も提供される。そのよう
な場合、本明細書に記載されているワクチンおよび組成物は、クロストリジウム・ディフ
ィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の予防に有用である可能性があり、あるい
は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に既に感染している又
はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染する高いリスクを
有する患者において、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染
の重症度またはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の発現
または進行またはその効果（例えば、ＣＤＡＤ）を低減しうる。
「治療を要する」者は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）
感染を既に有する者、および感染を有する傾向にある者、または感染の可能性の低減が望
まれる任意の者を含む。クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感
染のリスクの増大を示す者は、抗生物質治療、例えば、あるクリンダマイシン、セファロ
スポリンおよびフルオロキノロンでの治療を受けている者、ならびに高齢（６５歳以上）
の者、免疫抑制患者、医療従事者である患者、および長期入院患者を含む。
前記のとおり、本発明の特徴は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）感染を有する又は該感染に感受性である患者を治療するための組成物、好ましく
は免疫原性組成物またはワクチンにおける、本明細書に記載されている突然変異または単
離毒素の１以上を、単独又は１以上の追加的抗原と組み合わされた使用である。適切には
、該組成物は、ＣＤＴｂタンパク質および医薬上許容される担体と共に、本明細書に記載
されている突然変異毒素タンパク質（ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよびＣＤＴａ）の１以上の有
効量を含む。前記の本発明の好ましい実施形態においては、医薬組成物はヒト患者におい
て使用される。別の実施形態においては、医薬組成物は非ヒト患者において使用される。
本発明の組成物は、アジュバント、例えばＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはアルミニウ
ムアジュバントを更に含みうる。アジュバントの含有は、長く続く防御免疫を誘導するた
めに、患者へのワクチン抗原（すなわち、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよび／または
ＣＤＴｂ）の投与により惹起される免疫応答を増強しうる。免疫応答を増強することに加
えて、所望の免疫応答を惹起するのに必要な抗原の量を減少させるために、あるいは持続
的な免疫応答を誘導し、疾患に対する防御を付与し、および／またはクロストリジウム・
ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染により引き起こされる疾患の退縮を誘導す
るための臨床計画において必要な注射の回数を減少させるために、アジュバントが使用さ
れうる。
本発明の突然変異および／または天然毒素タンパク質と共に使用されうるアジュバント
には、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含有するアジュバント、またはＴＬＲ４およびＴＬＲ
９のようなトール様受容体（総説としては、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（１）：４５−５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅ
ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３９（１）：１７８−１９６（２
０１１）；Ｈｅｄａｙａｔら，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ
３２（２）：２９４−３２５（２０１２）を参照されたい）に作用する他の分子、例え
ば、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡおよびアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフ
ァートが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物において有用な
追加的なアジュバントには、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例えば、Ｕ．Ｓ．
７，７１３，５３５およびＵ．Ｓ．７，４７０，６７４を参照されたい）；Ｔヘルパーエ
ピトープ、リピドＡおよびその誘導体または変異体、リポソーム、リン酸カルシウム、サ
イトカイン（例えば、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ
−２、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＩＬ−１２、熱シ
ョックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、ＣｏＶａｃｃ
ｉｎｅ ＨＴ、非イオン性ブロック共重合体、不完全フロイントアジュバント、ケモカイ
ン、コレラ毒素；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミ
ルジペプチド、ムラミルペプチド類似体、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激性複合体、生分解
性ミクロスフェア、ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチドが含まれる。
本明細書に記載されている組成物と共に使用される追加的なアジュバントとしては、サ
ポニン（例えば、ＱＳ２１）を単独で又はコレステロールおよびリン脂質をＩＳＣＯＭ（
「免疫刺激性複合体」；総説としては、ＢａｒｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７４：８−２５（１９９６）；ならびに
ＳｋｅｎｅおよびＳｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：５３−５９（２００６）を参照
されたい）の特徴的な形態において組み合わせて含むアジュバントが挙げられる。本発明
で提供される組成物および方法の特定の実施形態においては、突然変異毒素および／また
は毒素タンパク質は、ＩＳＣＯＭ型アジュバントまたは「ＩＳＣＯＭ」［これは、抗原の
非存在下で製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（本明細書においては「ＩＭＸ
」とも称される）のようなＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントである］（ＩＳＣＯ
Ｍ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）はＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐ
ａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）と組み合わされる。
また、アルミニウムに基づく化合物、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、
アルミニウムヒドロキシホスファート（ＡｌＰＯ４）、無定形アルミニウムヒドロキシホ
スファートスルファート（ＡＡＨＳ）、またはいわゆる「ミョウバン」（ＫＡｌ（ＳＯ４
）・１２Ｈ２Ｏ）（Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄ
ｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｂｙ Ａｌ ＭＡ
Ｓ ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照
されたい）が、本発明で提供される組成物と組み合わされうる。本発明で提供される本発
明の典型的実施形態においては、アルミニウムアジュバントはアルミニウムヒドロキシホ
スファートまたはＡＡＨＳ（あるいは「ＭＡＡ」と称される）である。
前記組成物は、治療用または予防用ワクチンとして使用されうる。したがって、本発明
は、本発明の突然変異もしくは単離毒素（「免疫原性物質」）またはそれらの誘導体の１
以上を有効成分として含有するワクチンの製造に拡張される。そのようなワクチンを製造
するためには、任意の適当な方法が想定される。典型的な方法は、例えば、Ｎｅｗ Ｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅら，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（これを参照
により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものを含む。
誘導体毒素を含む本発明の突然変異毒素、または該突然変異毒素もしくは誘導体もしく
は天然毒素、例えばＣＤＴｂを（単独で又は１以上の免疫原と共に）含む組成物もしくは
ワクチンは、当技術分野でよく知られた技術を用いて製剤化され、患者に投与されうる。
医薬投与の全般に関する指針は、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒ
ｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉ
ｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄ
ｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲ
ｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。
したがって、本発明は、本明細書に記載されているワクチンまたは医薬組成物のいずれ
かの免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ
．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に対する患者における防御免疫応答を誘導するための方法を
提供する。
また、本明細書に記載されているワクチンまたは医薬組成物のいずれかの免疫学的有効
量を患者に投与する工程を含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉ
ｌｅ）感染を治療するためのまたはクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）感染に関連したいずれかの病態を治療するための方法が本発明により提供される
。
ワクチンおよび／または組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口または皮内の
ような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば、無針またはジ
ェット式注射器を使用して行われうる。本発明の好ましい実施形態においては、ワクチン
および組成物は筋肉内注射により投与される。
本明細書に記載されている組成物は、剤形に適合した方法で、そしてクロストリジウム
・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療し、および／または感染の可能性
を低減するのに免疫学的に有効な量で投与されうる。本発明の場合における患者に投与さ
れる用量は、患者における有益な応答（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のレベルの低下）に経時的に影響を及ぼすのにまたはクロストリジ
ウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染の可能性を低減するのに十分
なものであるべきである。投与されるべき免疫原性物質の量は、治療されるべき対象（そ
の年齢、性別、体重および全身健康状態を含む）に依存しうる。これに関して、投与され
る必要のある免疫原性物質の厳密な量は実施者の判断によるであろう。クロストリジウム
・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に対する治療または予防において投与さ
れる免疫原性物質の有効量の決定の際には、医師が、循環血漿レベル、疾患の進行および
抗クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗体の産生を評価しうる
。いずれの場合にも、本発明の免疫原性物質の適当な投与量は当業者により容易に決定さ
れうる。そのような投与量は、本発明の免疫原性物質のナノグラムからミリグラムのオー
ダーでありうる。
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的症状；投与経路
；所望の効果；ならびに使用される個々の化合物を含む当技術分野で公知の要因を考慮し
て決定される。該ワクチン組成物は多用量形態で使用されうる。
投与の時期は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初期投与後、抗体価を維
持および／または増強するために、１以上の追加的な用量が投与されうる。
組合せワクチン接種の場合、突然変異毒素のそれぞれは、１つの組成物中で一緒にある
いは異なる組成物中で別々に投与されうる。本明細書に記載されている本発明の突然変異
または単離ＴｃｄまたはＣＤＴ毒素は、１以上の所望の追加的免疫原と共に投与されうる
。「共に」なる語は、複数の治療用物質が厳密に同時に投与されることには限定されず、
それは、本明細書に記載されている突然変異または単離ＴｃｄおよびＣＤＴ毒素とその他
の所望の免疫原とが、それらが一緒になってそれ以外の様態で投与される場合と比較して
大きな利益をもたらすように作用しうるような順序および時間間隔で対象に投与されるこ
とを意味する。例えば、各治療用物質は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で連続的
に投与されうるが、同時に投与されない場合には、それらは、所望の治療効果が得られる
ように時間的に十分に近くなるように投与されるべきである。各治療用物質は任意の適切
な形態および任意の適切な経路で別々に投与されうる。
前記の本発明の態様においては、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、
Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突
然変異を含む組換えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ
（ＴｃｄＡ）タンパク質及び医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。本
発明のこの態様の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、（ａ）Ｗ１０１
Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ；（ｂ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１
９Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；ならびに（ｄ）Ｗ
１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａからなる群から選択される一組の突
然変異を含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は更に、Ｃ７００Ａ
突然変異、例えば、以下の一組の突然変異（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、
Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む。追加的な実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質
は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ株またはＶＰＩ
１０４６３株から得られたアミノ酸配列を含む。更に詳細な実施形態においては、Ｔｃ
ｄＡタンパク質は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１
、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６および配列番号３５からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５
２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む組換
えクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タン
パク質及び医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。本発明のこの態様の
追加的実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａおよ
びＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ
１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＤ２８６Ａ；ならびに（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２
８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む。
更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は更に、Ｃ６９８Ａ突然変異、例え
ば、以下の一組の突然変異（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０Ａおよ
びＣ６９８Ａを含む。更に詳細な実施形態においては、ＴｃｄＢタンパク質は、クロスト
リジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＮＡＰ株またはＶＰＩ １０４６３
株から得られたアミノ酸配列を含む。本発明のこの態様の特定の実施形態においては、Ｔ
ｃｄＢタンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列
番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８および配列番号５８からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の追加的実施形態においては、前記の突然変異
ＴｃｄＢ毒素タンパク質はいずれも、本明細書の全体において開示されているいずれかの
他の突然変異毒素タンパク質、例えば、前記の突然変異ＴｃｄＡタンパク質と組み合わさ
れうる。
したがって、本発明の１つの実施形態は、突然変異ＴｃｄＡタンパク質、突然変異Ｔｃ
ｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物である。本発明のこの
態様の幾つかの実施形態においては、ＴｃｄＡタンパク質は、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、
Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからなる群から選択
される少なくとも３つの突然変異を含み、ＴｃｄＢタンパク質は、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８
Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる群から
選択される少なくとも３つの突然変異を含む。更に詳細な実施形態においては、本発明の
免疫原性組成物は、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、本明細書に記載されて
いる突然変異ＴｃｄＢタンパク質、突然変異ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂタンパク
質を含み、ここで、突然変異ＴｃｄＡタンパク質は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２
５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、
Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３
８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を含む。本発明のこの態様の幾つかの実
施形態においては、ＣＤＴａタンパク質およびＣＤＴｂタンパク質は、シグナルペプチド
を欠いている。追加の実施形態においては、本明細書に記載されている免疫原性組成物は
いずれも、アジュバントを更に含みうる。更に詳細な実施形態においては、アジュバント
はＩＳＣＯＭ型アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ，ＬＴｄ．）および
／またはアルミニウムアジュバント、例えばＭＡＡである。
本発明はまた、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、
Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２
Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２
つの突然変異を含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）、およびクロストリジウ
ム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ
）、および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物に関する。追加の実施形態におい
ては、免疫原性組成物は、Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２
５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、
Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄからなる群から選択
される２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個
まで、１０個まで、１１個まで、１２個まで、１３個まで、１４個まで、１５個まで、１
６個まで、または１７個までの突然変異からなるＣＤＴａタンパク質を含む。本発明の幾
つかの実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、（ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑおよ
びＥ３８７Ｑ；（ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７Ｄ；（ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ
、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；（ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３
８７Ｑ；（ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；（ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７Ａおよ
びＱ３０７Ｅ；（ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに（ｈ）Ｎ３４２Ａ
、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａからなる群から選択される一組の突然変異を含む又はそれ
らからなる。更に詳細な実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、配列番号４０また
は配列番号４２に記載されているアミノ酸配列を含む又はそれらからなる。
更に詳細な実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、以下に示す配列を含む又はそ
れからなる。
Figure 2017141226
別の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配
列番号６７を含む又はそれからなる。追加の実施形態においては、ＣＤＴａタンパク質は
、追加的なＮ末端メチオニンを伴う配列番号４０または配列番号４２を含む又はそれから
なる。
追加の実施形態においては、免疫原性組成物は、本明細書に記載されている任意のＣＤ
Ｔａタンパク質、およびシグナルペプチドを欠く（すなわち、シグナルペプチドが欠失し
ている）ＣＤＴｂタンパク質を含む。更に詳細な実施形態においては、組成物は、本明細
書に記載されている任意のＣＤＴａタンパク質、ならびにシグナルペプチドおよび活性化
ドメインの両方を欠く（すなわち、シグナルペプチドおよび活性化ドメインが欠失してい
る）ＣＤＴｂタンパク質を含む。
また、本明細書に記載されている任意の組換え突然変異ＴｃｄＡタンパク質、本明細書
に記載されている任意の組換え突然変異ＴｃｄＢタンパク質、本明細書に記載されている
任意の組換え突然変異ＣＤＴａタンパク質、およびシグナルペプチドを欠くＣＤＴｂタン
パク質、ならびに医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物が本発明により提供される
。追加的実施形態においては、記載されている組成物はアジュバントを更に含む。更に詳
細な実施形態においては、アジュバントはアルミニウムアジュバントおよび／またはＩＳ
ＣＯＭ型アジュバントである。
本発明の組成物の別の実施形態においては、本明細書に記載されている突然変異Ｔｃｄ
Ａ、ＴｃｄＢおよび／またはＣＤＴａタンパク質は、天然ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／ま
たはＣＤＴａタンパク質（例えば、同じ株の天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢタンパク質に対
するいずれの突然変異をも含まないが、解毒されている、または化学的手段により例えば
ホルムアルデヒドの使用により毒性が実質的に低減しているトキソイドタンパク質）と組
み合わされうる。そのような組成物はＣＤＴｂをも含みうる。追加的な別の実施形態にお
いては、本明細書に記載されている突然変異ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび／または突然変異
ＣＤＴａタンパク質はまた、残留毒性を更に低減または排除するためにホルムアルデヒド
で処理されうる。
本発明はまた、（ａ）突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａを含む
若しくはそれらからなるＴｃｄＡタンパク質、突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４
ＱおよびＷ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＡタンパク質
；（ｂ）突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを
含む若しくはそれらからなるＴｃｄＢタンパク質、または突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８
Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａを含む若しくはそれらからなるＴｃｄＢタンパク質；（
ｃ）シグナルペプチドを欠き、突然変異Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５Ｑ、Ｅ３８７ＱおよびＣ２
Ａを含む又はそれらからなるＣＤＴａタンパク質；ならびに（ｄ）シグナルペプチドを欠
くＣＤＴｂタンパク質、を含む免疫原性組成物に関する。別の実施形態においては、ＣＤ
Ｔｂタンパク質はシグナルペプチドおよび活性化ドメインを欠く。更に詳細な実施形態に
おいては、組成物はアルミニウムアジュバントまたはＩＳＣＯＭ型アジュバント、例えば
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を更に含む。更に詳細な実施形態においては、本明細
書に記載されている組成物はアルミニウムアジュバントおよびＩＳＣＯＭ型アジュバント
を含む。
組換え毒素の発現
本発明の方法において使用される本明細書に記載されている毒素タンパク質またはその
誘導体は、組換え製造され、必要に応じて、例えばホルムアルデヒドで化学修飾される。
本発明の好ましい実施形態においては、組換え毒素は、選択された宿主細胞発現系におけ
る組換え発現の後は、化学的手段、例えばホルムアルデヒド不活化によりそれ以上は不活
性化されない。ポリペプチドの組換え発現は、関心のあるポリペプチド（すなわち、本明
細書に記載されているＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａもしくはＣＤＴｂポリペプチドまた
はそれらの誘導体）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要す
る。関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られたら、関心のあるポ
リペプチドの産生のためのベクターが当技術分野でよく知られた技術を用いる組換えＤＮ
Ａ技術により製造されうる。したがって、関心のあるポリペプチドコードするポリヌクレ
オチドを発現させることにより、ポリペプチドを製造するための方法が本明細書に記載さ
れている。
関心のあるポリペプチドのコード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含
有する発現ベクターを構築するためには、当業者によく知られた方法が用いられうる。こ
れらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝的組
換えを含む。したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された関心のあるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
発現ベクターを通常の技術により宿主細胞に導入し、ついでトランスフェクト化細胞を
、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、通常の技術により培養して関心のあるポ
リペプチドを産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結され
た関心のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。本
明細書中で定義される「宿主細胞」なる語は、トランスジェニックヒトの体、トランスジ
ェニックヒト胎児またはトランスジェニックヒト胚における宿主細胞を含むものとは意図
されない。
ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａ、ＣＤＴｂまたはそれらの突然変異体もしくは誘導体形
態をコードする組換えヌクレオチド配列の宿主細胞内での発現の後、毒素タンパク質を回
収して、本明細書に記載されている免疫原性ワクチンおよび組成物において使用される実
質的に精製されたタンパク質を得ることが可能である。幾つかのタンパク質精製方法が利
用可能であり、使用に適している。組換え毒素タンパク質は、塩分別、イオン交換クロマ
トグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラ
フィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合せ又は個々の適用により、
細胞ライセートおよび抽出物から精製されうる。また、組換えタンパク質は、毒素タンパ
ク質またはその誘導体もしくは断片に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体
を使用して作製された免疫アフィニティカラムを使用して、他の細胞タンパク質から分離
されうる。
関心のあるポリペプチドを発現させるためには、種々の宿主−発現ベクター系が使用さ
れうる。そのような宿主−発現系は、関心のあるコード配列が産生され、ついで精製され
うるビヒクルを表し、そして、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランス
フェクトされると関心のあるポリペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで発現する細胞をも表す。こ
れらには、関心のあるコード配列（すなわち、本明細書に記載されている突然変異Ｔｃｄ
Ａ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質をコードする配列）を含有するＤＮＡ
発現ベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバシラス・メガテリウム（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のような微生物、および関心のあるコード配
列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫
細胞系を含むが、これらに限定されるものではない。
商業的ワクチン製造のための十分な量のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆ
ｆｉｃｉｌｅ）毒素を得るためには、低い生産収率、および培養内で増殖したクロストリ
ジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌からの天然毒素の単離に伴う安全
性の問題を克服する、組換え発現系において組換えＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢを発
現させるための方法を開発することが有益であろう。クロストリジウム・ディフィシレ（
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は嫌気性胞子形成生物であるため、培養におけるＴｃｄ毒素の
製造は非常に少量しか得られず、したがって高い経費を要する。また、毒素の化学的不活
化は困難なことがあり、汚染を招く可能性があり、このため、商業的ワクチン製造の場合
には安全性の問題が生じる。その目的において、本発明の好ましい実施形態は、大量の毒
素Ａおよび毒素Ｂの両方を与える、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ）ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質（例えば、前記のＴｃ
ｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂタンパク質またはそれらの誘導体）を、後記の
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において組換え発現させるための方法に関する。
本明細書に記載されているとおり、組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現において遭遇
する難題を克服するために、幾つかの発現プラットフォームを評価した。大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）は、この系を使用しても３ｍＴｃｄＡが発現され得なかったため、最適な発現プ
ラットフォームではないことを結果は示した。また、３ｍＴｃｄＢは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）内で成功裏に発現されたが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系における発現から生じた発現
産物は、他の発現系において産生される組換え毒素より大量の分解物を含有していた。大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で４ｍＴｃｄＡ／Ｂが発現される能力をも評価した。３ｍＴｃｄ
Ａで得られた結果に合致して、４ｍＴｃｄＡはこの宿主系においては発現されなかったが
、４ｍＴｃｄＢは高レベル（〜１．６ｇ／Ｌ）で産生された。バシラス・メガテリウム（
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系も評価し、これは少量ないし中等度の量の５ｍＴｃｄ
Ａ（〜７５ｍｇ／Ｌ）および５ｍＴｃｄＢ（〜２００から７００ｍｇ／Ｌ）を成功裏に産
生した。
前記の最適に準じる結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の両方に関して一貫し
ていたわけではなく、したがって商業的発現プラットフォームのための良好な候補とはな
らなかったため、昆虫細胞／バキュロウイルス産生プラットフォームを評価した。昆虫細
胞／バキュロウイルス系の前に別の発現系を評価した。というのも、突然変異毒素が残留
活性を完全に欠いていなければ、これらの毒素の発現は、Ｒｈｏタンパク質に対する毒素
の作用により、昆虫細胞宿主に致死的となると考えられるからである。昆虫細胞を含む全
ての真核細胞はＲｈｏタンパク質を産生し、これは細胞増殖および遺伝子発現における役
割を有し、アクチン細胞骨格の体制を制御する。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方の作用方
式はＲｈｏ ＧＴＰアーゼを不活性化して細胞円形化および細胞死を招くものであるため
、いかなる残留毒性も細胞を死亡させうるであろう。したがって、毒素発現の成功の可能
性を増大させ、そして、この系を使用して無傷抗原の収量を増加させるために、本発明者
らは５ｍＴｃｄＡおよび５ｍＴｃｄＢを試験した。本明細書に記載されている結果は、５
ｍＴｃｄＡ／Ｂ毒素が共に、この系において成功裏に発現されることを示した。また、こ
の系において産生された解毒されたＴｃｄＡを使用して行った安定性試験は、培地内で２
７℃で６週間貯蔵された場合に、検出可能な分解を示さなかった。
したがって、本発明は、細胞培養内のバキュロウイルス発現系における、少なくとも４
個または少なくとも５個の突然変異を含むＴｃｄタンパク質をコードするヌクレオチド配
列の組換え発現による、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒
素ＡおよびＢの製造方法に関する。本発明の好ましい実施形態においては、宿主細胞は昆
虫細胞である。前記方法の好ましい実施形態においては、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７
Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを含むＴｃｄＡをバキュロウイルス発現系
において発現させる。追加的な好ましい実施形態においては、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２
８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含むＴｃｄＢタンパク質をバキュロ
ウイルス発現系において発現させる。
したがって、本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少
なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個の突然変異を含む本明細書に記載さ
れているＴｃｄＡ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形
質転換してＴｃｄＡタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシ
レ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る
実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクター
である。
本発明は更に、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも
３個、少なくとも４個または少なくとも５個の突然変異を含む本明細書に記載されている
ＴｃｄＢ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換し
て、ＴｃｄＢタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ
．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法を提供する。本発明の或る実施形
態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベクターである
。
本発明は更に、本明細書の全体にわたって記載されているＣＤＴａタンパク質またはＣ
ＤＴｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組換え発現による、クロストリジウム
・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素Ａおよび二成分Ｂの製造方
法に関する。
したがって、本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少
なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個の突然変異を含む本明細書に記載さ
れているＣＤＴａ突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形
質転換して、ＣＤＴａタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａタンパク質の製造方
法を提供する。本発明の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクター
はバキュロウイルスベクターである。
本発明は、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、少なくとも２個
、少なくとも３個または少なくとも４個の突然変異を含む本明細書に記載されているＣＤ
Ｔｂタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換して、ＣＤＴｂ
タンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴｂタンパク質の製造方法を提供する。本発明
の或る実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞であり、ベクターはバキュロウイルスベ
クターである。
本明細書に挙げられている全ての刊行物を、本発明に関して使用されうる方法および材
料を記載し開示する目的で参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書におけ
るいずれのものも、本発明が先行発明に基づいてそのような開示に先行する権利を有しな
いと自認するものと解釈されるべきではない。
添付図面の参照により本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されているが、本発
明はそれらそのとおりの実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲において定めら
れる本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および修飾が当業者によ
り施されうると理解されるべきである。
図１はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＡおよびＢ（ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ）からの大クロストリジウム毒素の構造を示す。 図２Ａは、種々のクロストリジウム属種からのＬＣＴの多重配列アライメントを示し、活性部位に沿って並ぶ高度に保存された残基が太字で示されている。 図２Ｂは、種々のクロストリジウム属種からのＬＣＴの多重配列アライメントを示し、活性部位に沿って並ぶ高度に保存された残基が太字で示されている。 図３Ａは、本明細書中の実施例に記載されている組換えＴｃｄＡ（図３Ａ）およびＴｃｄＢ（図３Ｂ）突然変異体（完全長および酵素ドメイン）の突然変異の種類を示す。 図３Ｂは、本明細書中の実施例に記載されている組換えＴｃｄＡ（図３Ａ）およびＴｃｄＢ（図３Ｂ）突然変異体（完全長および酵素ドメイン）の突然変異の種類を示す。 図４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴｃｄ突然変異酵素ドメイン（触媒ドメイン、ＴｃｄＢ突然変異体、上；ＴｃｄＡ突然変異体、下）の発現を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシーブルー染色による精製ヘキサヒスチジンタグ付き酵素ドメインの分析が示されている（左パネル）。該タンパク質の同一性および完全性は、抗Ｈｉｓ ＭＡｂを使用するウエスタンブロット分析（右パネル）により確認された。 図５は、実施例２に記載されている、ＴｃｄＢおよび突然変異体組換え酵素ドメインに関するＲｈｏＡグルコシル化アッセイからの結果を示す。データは、１００％活性を有するＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＢに対して標準化された。データは、天然完全長ＴｃｄＢ毒素（ＴｃｄＢ）、およびバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において発現された完全長３ｍＴｃｄＢ（ｍＴｃｄＢ）に関して示されている。また、以下の触媒ドメイン断片に関するデータも示されている：Ｗ１０２欠失（Ｄｅｌｔａ）、野生型ＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＢ（ＶＰＩ）、野生型ＴｃｄＢ（ＮＡＰ１）、三重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ（Ｔｒｉ）、四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｓ５１８Ａ（ＱｕａｄＳ）、四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８６Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ（ＱｕａｄＤ）ならびに四重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｗ５２０Ａ（Ｑｕａｄ Ｗ）。全ての突然変異体断片はＶＰＩ１−４６３株から誘導された。 図６は、細胞に基づくアッセイにおける、種々のＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ構築物に関連した残留毒性を示す。３、４または５個の突然変異を含有するＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方の種々の突然変異形態（毒素Ａ突然変異体：ｎａｐ ３ｍＴｃｄＡ ｂｍ、ｖｐｉ ４ｍＴｃｄＡ ｂｖ、ｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ ｂｖならびに毒素Ｂ突然変異体：ｎａｐ ３ｍＴｃｄＢ ｂｍ、ｎａｐ ４ｍＴｃｄＢ ｅｃおよびｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ）を、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ｖｐｉ ＴｃｄＡ ｃｄ、ｎａｐ ＴｃｄＡ ｃｄ、ｖｐｉ ＴｃｄＢ ｃｄおよびｎａｐ ＴｃｄＢ ｃｄ）から精製された天然毒素、またはホルムアルデヒド不活化天然毒素（ｖｐｉ ＴｏｘＡ ｃｄおよびｖｐｉ ＴｏｘＢ ｃｄ）、またはホルムアルデヒド不活化突然変異毒素（ｖｐｉ ５ｍＴｏｘＡ ｂｖおよびｎａｐ ５ｍＴｏｘＢ ｂｍ）と比較した。ＴＣ５０の増加は毒素活性の減少を示す。下の破線は、提示されている安全性閾値を示す。 図７は、実施例６に記載されているとおり、ＴｃｄＡ ＶＰＩ ４Ｍバキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞の上清および全ブロスサンプルの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す。また、陰性対照として働いた、インサートを含有しないバキュロウイルス（Ｂａｃｍｉｎ）も示されている。 図８はハムスターチャレンジモデルにおける防御の分析を示す。種々の発現系において組換え製造された上部に一覧されている種々の突然変異ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ毒素がクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子での致死的チャレンジからハムスターを防御する能力の評価が示されている。実施例７に記載されているとおり、ＶＰＩ株でハムスターをチャレンジした。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の起源が示されている（ｖｐｉまたはｎａｐ）。各突然変異体に関して使用した発現系も示されている（ｃｄ（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、ｂｖ（バキュロウイルス）、ｂｍ（バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））およびｅｃ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）））。 図９は、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａを有するＶＰＩ ５ｍＴｃｄＡのアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。 図１０は、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを有するＮＡＰ ５ｍＴｃｄＢのアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。 図１１Ａは、実施例１１に記載されているハムスターチャレンジモデルにおいて行った研究に関する生存曲線（時間に対する生存率）を示す。ｎａｐ ４ｍＴｃｄＡとｎａｐ ４ｍＴｃｄＢとの組合せ（黒三角）、またはホルムアルデヒド不活化トキソイドＡとトキソイドＢとの組合せ（白丸）（共にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの存在下でＭＡＡ上で製剤化されたもの）のいずれかでハムスターをワクチン接種した。また、アジュバントのみの対照（黒丸）も示されている。２４１ ＣＦＵの原型株ＶＰＩ１０４６３（パネルＡ）または４５７ ＣＦＵの流行性株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７（パネルＢ）で動物をチャレンジした。 図１１Ｂは、実施例１１に記載されているハムスターチャレンジモデルにおいて行った研究に関する生存曲線（時間に対する生存率）を示す。ｎａｐ ４ｍＴｃｄＡとｎａｐ ４ｍＴｃｄＢとの組合せ（黒三角）、またはホルムアルデヒド不活化トキソイドＡとトキソイドＢとの組合せ（白丸）（共にＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの存在下でＭＡＡ上で製剤化されたもの）のいずれかでハムスターをワクチン接種した。また、アジュバントのみの対照（黒丸）も示されている。２４１ ＣＦＵの原型株ＶＰＩ１０４６３（パネルＡ）または４５７ ＣＦＵの流行性株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７（パネルＢ）で動物をチャレンジした。 図１２はハムスターチャレンジモデルにおけるＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株でのチャレンジの後のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの防御効力に対するＣＤＴａおよびＣＤＴｂの関連関与を示す。 図１３Ａは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。 図１３Ｂは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。 図１３Ｃは、前記に記載されている、天然ＣＤＴａタンパク質からのシグナルペプチドを伴わないＣＤＴａ（パネルＡ、配列番号３８）、３ｍＣＤＴａ１（パネルＢ、配列番号４０）および３ｍＣＤＴａ２（パネルＣ、配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２における突然変異残基が示されている。示されているＣＤＴａ配列はＮＡＰ１株Ｒ２０２９１からのものである。 図１４Ａは、天然ＣＤＴｂタンパク質からのＣＤＴｂシグナルペプチドを欠くｐｒｏＣＤＴｂ（パネルＡ、配列番号４４）、および天然ＣＤＴｂタンパク質からのシグナルペプチドと活性化ドメインとの両方を欠くＣＤＴｂ（パネルＢ、配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。示されているＣＤＴｂ配列はＮＡＰ株Ｒ２０２９１からのものである。 図１４Ｂは、天然ＣＤＴｂタンパク質からのＣＤＴｂシグナルペプチドを欠くｐｒｏＣＤＴｂ（パネルＡ、配列番号４４）、および天然ＣＤＴｂタンパク質からのシグナルペプチドと活性化ドメインとの両方を欠くＣＤＴｂ（パネルＢ、配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。示されているＣＤＴｂ配列はＮＡＰ株Ｒ２０２９１からのものである。 図１５はＲ２０２９１参考株からのＣＤＴａの天然アミノ酸配列（配列番号５９）を示す。天然ＣＤＴａのシグナルペプチドが下線で示されている。本明細書においてＣＤＴａ突然変異を番号づけするための残基番号１の位置が示されている。残基番号１はシグナルペプチドの後の最初のアミノ酸から始まる。 図１６はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３株からの天然ＴｃｄＡ（配列番号６０）および天然ＴｃｄＢ（配列番号６１）のＮ末端部分の残基１から残基７１９（ＴｃｄＡ）および７１７（ＴｃｄＢ）までのアライメントを示す。本明細書に開示されている突然変異の位置が下線で示されているが、示されている残基は天然配列からのものである。 図１７はアカゲザル「研究番号１１」（実施例１２を参照されたい）に関するプロトコールの概要を示す。示されている投与計画で各群にｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ ｂｖ、ｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ、３ｍ ＣｄｔＡ２ ｂｖおよびｐｒｏＣｄｔＢ ｂｖを筋肉内投与した。毒素ワクチン成分に加えて、示されている量のアジュバントまたはアジュバントの組合せ（ＩＭＯ＝ＩＭＯ２１７０、ＭＡＡ＝アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートおよびＩＭＸ＝ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．））を、示されている量でまたはアジュバント無しで、各群に投与した。示されているとおり、幾つかのワクチン組成物をホルムアルデヒドで処理した。 図１８Ａは、３用量計画（図１８Ａ）または４用量計画（図１８Ｂ）で、示されている種々のアジュバントと組み合わされた４つの成分のそれぞれを含むワクチン組成物を投与した種々のサル群（研究番号１１）に関するＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂに対するＩｇＧ価のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図１８Ｂは、３用量計画（図１８Ａ）または４用量計画（図１８Ｂ）で、示されている種々のアジュバントと組み合わされた４つの成分のそれぞれを含むワクチン組成物を投与した種々のサル群（研究番号１１）に関するＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、ＣＤＴａおよびＣＤＴｂに対するＩｇＧ価のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図１９Ａ〜Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。 図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。 図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢおよび二成分毒素に関する中和アッセイデータを示す。図ＡおよびＢでは、各用量に関して示されている棒線は、左から右へ、群１〜１１に対応する。天然ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによるＶｅｒｏ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を測定するために、Ｎａｂアッセイを用いた。研究１１における群では、第０日、第７／１０日、第３０日および第４５日における（図ＡおよびＢ）、そして二成分毒素に関しては第４５日における（図Ｃ）、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対する中和抗体価が示されている。 図２０Ａは還元および非還元条件下のＣＤＴａ（レーン１および２）および３ｍＣＤＴａ １（レーン３および４）のウエスタンブロット分析の結果を示す。また、サイズマーカー（レーン１の左）ならびにタンパク質単量体および二量体バンドの位置も示されている。 図２０Ｂは経時的な３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析の結果を示す。凝集物、二量体および単量体のピークが示されている。 図２０Ｃは４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ ＭＡＬＳ分析の結果を示す。記載されている結果は経時的なモル質量を示す。４ｍＣＤＴａ８では単一単量体ピークが視認可能である。 図２１は、３ｍＣＤＴａ２または４ｍＣＤＴａ８で免疫化されたＳｙｒｉａｎハムスターの防御の比較を示す。アジュバントのみの対照と比較された経時的な生存率が示されている。 図２２は、実施例９に記載されているとおり、天然ＣＤＴａと比較された場合の、Ｖｅｒｏ細胞に対するキモトリプシン活性化プロＣＤＴｂと混合されたＣＤＴａの種々の突然変異形態の細胞毒性アッセイの結果を示す。
実施例１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉ
ｌｅ）ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異体の発現
Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
を使用して、ＶＰＩ１０４６３株に由来するクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅ）天然毒素Ａおよび毒素Ｂをコードするヌクレオチド配列に対して突然変
異誘発を行った。種々の組合せの突然変異を有する幾つかの突然変異毒素を、図３に示さ
れているとおりに製造した。突然変異体を発現させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製し
た。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列
をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
，ＮＪ）から入手した。図３に示されている突然変異体のうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
コドン最適化三重突然変異ＴｃｄＢ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ）だけが完全
長形態で発現された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された酵素ドメインだけから
なる追加的構築物を試験した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における構築物の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。図
４に示されているとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴｃｄ突然変異酵素ドメイン
（触媒ドメイン）の発現の分析は、一般に、分解産物の可変性プロファイルを有する〜６
０ｋＤａの１つの主要組換え体バンドを示した。タンパク質の同一性および完全性を、抗
Ｈｉｓ ＭＡｂを使用するウエスタンブロット分析により確認した（図４）。
実施例２
ＲｈｏＡグルコシル化アッセイによるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ酵素活性の決定
ＲｈｏＡグルコシル化活性アッセイを用いて、組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ酵素ドメ
インの毒性をインビトロで比較した。簡潔に説明すると、タンパク質を、２つの異なる濃
度レベル（１および１０μｇ／ｍＬ）で、基質（組換えＲｈｏＡ−ＧＴＰアーゼ）、補因
子（ＭｎＩＩ）および放射能標識補基質（ＵＤＰ−１４Ｃ−グルコース）を含有する反応
バッファーと混合した。反応を３７℃で９０分間インキュベートし、タンパク質を、取り
込まれた１４Ｃと共に、氷冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿させた。沈殿物を濾過により回
収し、フィルターを液体シンチレーションカウンターで定量した。
ＴｃｄＢに関するアッセイの結果を図５に示す。三重突然変異体Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８
Ａ，Ｅ５１５Ｑ触媒ドメインは天然触媒ドメインのグルコシル化活性の約１０％を保有し
ているようであり、これはＷ１０２欠失突然変異体と匹敵しうる活性であった。Ｑｕａｄ
Ｓ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｓ５１８Ａ）、ＱｕａｄＷ（Ｗ１０２Ａ，Ｄ
２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，Ｗ５２０Ａ）およびデルタＷ１０２は、検出可能な酵素活性を示
さなかった。完全長毒素の場合、３ｍＴｃｄＢは完全長毒素の活性の〜０．５％を保有し
ていた。３ｍＴｃｄＢ触媒ドメイン断片と完全長３ｍＴｃｄＢとの間の毒性の相違はフォ
ールディングまたは純度の相違によるものでありうる。ＴｃｄＡに関して、類似した結果
が観察された。
このデータに基づいて、完全長突然変異毒素（Ｗ１０２Ａ，Ｄ２８８Ａ，Ｅ５１５Ｑ，
Ｗ５２０Ａ）内に第４の突然変異を導入した。昆虫細胞（バキュロウイルス発現系）およ
びバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において、４ｍＴｃｄＡおよび
４ｍＴｃｄＢ構築物を発現させた。この第４突然変異の付加にもかかわらず、動物の免疫
化後に残留毒性が尚も観察された。したがって、第５の突然変異であるＣ６９８Ａを導入
した。Ｃ６９８Ａは、トランスロケーションドメインから触媒ドメインを切断して細胞質
内へのその遊離を可能にするシステインプロテアーゼの鍵残基である。この突然変異の導
入はＴｃｄＢの毒性における更に１０倍の減少を引き起こした（図６）。
実施例３
バキュロウイルス発現系におけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現
組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現において遭遇する難題を克服するために、幾つか
の発現プラットフォームを評価した。まず、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を試験したが、この
系を使用して３ｍＴｃｄＡを発現させることはできなかった。３ｍＴｃｄＢは成功裏に発
現されたが、それは部分的に分解した。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における４ｍＴｃ
ｄＡ／Ｂの発現も評価したが、この場合もまた、４ｍＴｃｄＡはこの宿主系において成功
裏に産生されなかったが、４ｍＴｃｄＢは高レベル（〜１．６ｇ／Ｌ）で産生された。ま
た、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系も評価し、それは少量
ないし中等度の量の５ｍＴｃｄＡ（〜７５ｍｇ／Ｌ）および５ｍＴｃｄＢ（〜２００から
７００ｍｇ／Ｌ）を成功裏に産生した。
バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を、この生物に
おける完全長ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの発現の過去の例（Ｂｕｒｇｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７（３）：５８４−８（２００３）；
Ｙａｎｇら，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１９２（２００８））に基づいて、発現
宿主として評価した。この発現宿主は３ｍＴｃｄＡおよび３ｍＴｃｄＢの産生の増加を示
したが（起源配列ＮＡＰ１株）、これらの分子でのハムスターおよびサルの免疫化は、こ
れらの調製物が、ホルムアルデヒド不活化の非存在下では許容し得ないほどに高レベルの
残留毒性を含有することを示した。
つぎに、無傷抗原の収量を増加させるために、５ｍＴｃｄＡおよび５ｍＴｃｄＢについ
て昆虫細胞／バキュロウイルス産生プラットフォームの使用を評価した。昆虫細胞におけ
るバキュロウイルス媒介性発現のために、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１
９Ａ突然変異またはＷ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ
突然変異のいずれかで修飾されたクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉ
ｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡ配列（以下、それぞれ、ＴｃｄＡ ＶＰＩ ４
ＭまたはＴｃｄＡ ＶＰＩ ５Ｍと称する）を使用した。また、突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ
２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａで修飾されたクロストリジウム・デ
ィフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＮＡＰ１／０２７／ＢＩからのＴｃｄＢ配列（
以下、ＴｃｄＢ ＮＡＰ ５Ｍ）を使用した。
組換えバキュロウイルスは、ＴｃｄＡ変異体に関して後記でより詳細に記載されている
とおり、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
）を使用して作製した。ＤＮＡ配列を遺伝子合成により作製し、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標
）導入ベクター内のＮｏｔＩ／ＳｐｈＩ制限部位内にクローニングした。ＴｃｄＡ突然変
異体のクローニングのために、プラスミドＶＰＩＡ ＢＭ ｐＵＣ５７における、Ｔｃｄ
Ａコード配列の上流のＢｓｒＧＩ制限部位にＮｏｔＩ制限部位を導入した。構築物は、ｐ
ＵＣ５７内にクローニングされたバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）最適化クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉ
ｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ配列（ＴｃｄＡ ＢＭ）を含有していた。ＮｏｔＩの挿入のため
に使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった：ＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ Ｆ−５
’ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ ３’（配列番号３６）
およびＢｓｒＧＩ−ＮｏｔＩ Ｒ−５’ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ
Ａ Ｔ Ｇ ３’（配列番号３７）。得られたＶＰＩＡ ＢＭ ｐＵＣ５７ ＮｏｔＩ
をＮｏｔＩおよびＳｐｈＩで消化してＴｃｄＡ ＢＭ遺伝子を得、ついでこれは、Ｎｏｔ
Ｉ／ＳｐｈＩで消化されたｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター内にクローニングすることが可能
であった。これは導入プラスミドｐＦｂＴｃｄＡ ＢＭを与えた。
ついでｐＦａｓｔＢａｃ（商標）を、親バクミド（ｂａｃｍｉｄ）を含有するコンピテ
ントＤＨ１０Ｂａｃ（商標）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内に形質転換
し、ここで、それは組換えバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）を与えるように再結合した。Ｔｃｄ
Ａ突然変異体の場合、２つのタイプの細菌コンピテント細胞において形質転換を行った。
１つ目は、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系を備えた標準的なＤＨ１０Ｂａ
ｃ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、２つ目はＢａｃｄＣＣＤＨ１０細胞（Ｍ ｖａｎ Ｏｅｒｓ
博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ＮＬ， Ｓ．Ｋａｂａら，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２２（２００４）
１１３−１１８）であった。ＢａｃｄＣＣ細胞においてバクミドとしてクローニングされ
たバキュロウイルスゲノムは、クロラムフェニコール耐性遺伝子により置換されたｖ−カ
テプシンおよびキチナーゼ遺伝子の欠失を含有する。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系と共に
提供されたマニュアルに従い、形質転換を行った。ＢａｃｄＣＣ ＤＨ１０細胞との組換
え体の選択のために、２５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールをＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅ
ｒｔａｎｉ）寒天プレートに加えた。再ストリーク後に白色にとどまるコロニーから培養
を成長させ、バクミドＤＮＡを単離し、トランスフェクションに使用した。
ついで組換えバクミドを抽出し、使用して、Ｓｆ９およびＳｆ２１昆虫細胞をトランス
フェクトし、ここで、バキュロウイルスを作製し、１〜２回継代して、実験のための十分
な組換えバキュロウイルスを得た。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃマニュ
アルに従い、トランスフェクションを行った。ＴＣＩＤ５０アッセイまたは市販のバキュ
ロウイルス力価測定キット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ，Ｗｏｏｄ
ｌａｎｄ，ＣＡ）を使用して、バキュロウイルスを力価測定した。精製プロセス条件にお
ける若干の相違以外は、それらの２つのＴｃｄＡ変異体およびＴｃｄＢ変異体は同様に処
理された。
実施例４
昆虫細胞の増殖および誘導のための方法
ＳＦ９（ＡＴＣＣ）、ＳＦ２１細胞（Ｋｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）、ＳＦ２１ＣＢ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）およびＥｘｐｒｅｓＳＦ＋（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を、無血清Ｓｆ９００−ＩＩまたはＳｆ
９００−ＩＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、振
とうフラスコ（培養体積＝フラスコ体積の１／５〜１／２）内で２７℃で培養し、１−２
’’行程の振とう器を使用して５０〜１５０ＲＰＭで撹拌した。細胞を分割し、０．５×
１０６〜５×１０６ 生細胞／ｍｌで維持した。発現研究のために、１〜２×１０６ 細
胞／ｍｌの生細胞濃度の昆虫細胞を０．１単位／生細胞以上の感染多重度（ＭＯＩ）で感
染させた。感染後第２〜６日から、細胞ペレット、上清および全ブロスサンプルにおいて
産物レベルをモニターした。サンプルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［この場合、ＴｃｄＡ
（〜３００ｋＤａ）およびＴｃｄＢ（〜２７０ｋＤａ）はほとんどの他のタンパク質から
良く分離される］により分析した。精製のための回収を、典型的には感染後第４〜５日に
行った。
実施例５
昆虫細胞からのＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質の回収および精製
回収時の全ブロスサンプルにおけるＴｃｄＡレベルは、（実験的変動および昆虫細胞型
の相違により）１００〜２００ｍｇ／ｌで変動し、ＴｃｄＢレベルは２００〜５００ｍｇ
／ｌで変動した。初期の試みは、清澄化上清から産物を回収することを目的とした。しか
し、組換えタンパク質は上清および細胞ペレットの両方に存在し、流動物または合せた全
ブロスのいずれからも回収されうる。細胞内画分は昆虫細胞の型によって様々であった。
細胞ペレットまたは全ブロスからのタンパク質の効率的抽出は、細胞溶解の誘発に典型的
な濃度の非イオン界面活性剤（例えば、０．１〜１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
の使用を要した。精製では、硫酸アンモニウム沈殿、およびそれに続く、強アニオン交換
樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の組合せを用いて、完全長産物
ＴｃｄＡは、清澄化上清から、低収率で７０％を超える純度まで回収可能であった。Ｔｃ
ｄＡおよびＴｃｄＢは共に、強アニオン交換樹脂を使用するＩＥＸクロマトグラフィーお
よびそれに続くヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの組合せを用い、流動
物のいずれからも２０％を超える収率で９０％を超える純度まで回収可能であった。
実施例６
組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質の特徴づけ
ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢタンパク質産物（完全長であった産物関連バンドの画分）の完
全性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴｃｄＢの場合）およびバシラス・メガテリウム（Ｂ
．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）における細胞内発現と比較して、バキュロウイルス／昆虫細胞
系において最も良く維持された。また、宿主不純物に対する所望の産物の比率は（より低
いバイオマスおよび細胞当たりの良好な生産性ゆえに）バキュロウイルス／昆虫細胞系の
場合に最高であり、それにより、より容易な下流処理が可能となった。これを例示するた
めに、図７に示されているとおり、上清、およびＴｃｄＡ ＶＰＩ ４Ｍバキュロウイル
ス感染Ｓｆ９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）昆虫細胞培養の全ブロスサンプルを
、サンプルバッファーとしての４×ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）により分析
した。陰性対照として、インサート（Ｂａｃｍｉｎ）を含有しないバキュロウイルスを使
用した。細胞に０．１ ＴＣＩＤ５０ 単位／細胞のＭＯＩで感染させ、それを感染の５
日後に回収した。
結果は、バキュロウイルス系により産生された突然変異毒素物質が、その他の系におい
て産生されたタンパク質より高い質を有することを示した。それは遥かに低い分解を示し
、より容易に精製された。
実施例７
ハムスターチャレンジモデルにおけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ突然変異タンパク質の免疫
原性の評価
ハムスターモデルを以下のとおりに行った。ゴールデンハムスターを３週間間隔でワク
チンで筋肉内に４回免疫化した。ついで、１５日間の休息期間の後、動物にクリンダマイ
シン（クレオシン（Ｃｌｅｏｃｉｎ））を経口ガバージュにより投与した。この処理はコ
ロニー性微生物叢を破壊し、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
）による定着に対する感受性のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を与えることが判明した。ク
レオシン処理の５日後、動物を致死量のクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆ
ｉｃｉｌｅ）胞子でチャレンジした。動物を１日２回、１４日間にわたって評価した。種
々のＴｃｄＡおよびＴｃｄｂタンパク質での免疫化のこのモデルにおける防御の結果を図
８に示す。
組換え突然変異毒素（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍ）およびバキュロウイルス／昆虫細胞）は、天然毒素に対する血清ＩｇＧ
を測定するＥＬＩＳＡ及び細胞に基づく中和抗体アッセイにおいて、お互いに対しておよ
び天然毒素のホルムアルデヒド不活化により得られたトキソイドワクチンに対して、ハム
スター致死チャレンジモデルにおいて免疫学的に類似していることも示された（データ非
表示）。
実施例８
ＣＤＴａおよびＣＤＴｂの発現
全ての二成分毒素構築物は、鋳型としてＮＡＰ１／０２７／ＢＩ配列を使用して作製し
た。ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ配列は、これまで調べた全株にわたって＞９７％保存されて
いるため、ＮＡＰ１株に基づく選択された構築物は、全ての二成分毒素発現株に対して防
御するのに十分な抗体応答を生成するはずである。
ＣＤＴａをコードするヌクレオチド配列（シグナルペプチドとして作用する最初の４２
個のＮ末端アミノ酸をコードするコドンを欠く）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最
適発現のためにＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりコドン最適化され（配列番号４７）、フランキングＮｄｅＩ
およびＸｈｏＩクローニング部位を含有し、終止コドンを含有していなかった。配列は、
指示上の誤りのため、Ｎ末端に余分なメチオニンを含有していた。遺伝子を大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ３０ａ（ＥＭＤ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｇ
ｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングし、Ｃ末端の６×
ヒスチジンタグと共に発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）（
ＥＭＤ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して発現研究を行った。ＣＤＴａは高度に発
現され、可溶性であった。
最初に、ＣＤＴｂの成熟形態（シグナルペプチドおよび活性化ドメインを欠く）を大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で６×ヒスチジンタブを伴って発現させるための試みを行った。Ｃ
ＤＴｂは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現に関してコド
ン最適化され、フランキングＮｄｅＩ／ＸｈｏＩクローニング部位を含有し、終止コドン
を含有していなかった（配列番号５３）。遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター
ｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングし、Ｃ末端の６×ヒスチジンタ
グと共に発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用して発現
研究を行った。残念ながら、この構築物は不安定であり、不溶性であることが判明した。
ＣＤＴｂタンパク質の＞９０％は〜４０ｋＤの分解産物中で見出された。
ベクターｐＧＥＸ ６Ｐ−１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＧＳＴ融合タ
ンパク質としてのＣＤＴｂの安定発現は、Ｓｕｎｄｒｉｙａｌら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７４：４２−４８（２０１０）
）により既に記載されている。この研究に基づき、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにより最適化され
た前記ＣＤＴｂを、Ｎ末端クローニング部位をＮｄｅＩからＢａｍＨＩへと変化させ終止
コドンを導入するように設計されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ついで、Ｓｕ
ｎｄｒｉｙａｌにより記載されているとおり、ＣＤＴｂを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベ
クターｐＧＥＸ６Ｐ−１内にＮ末端ＧＳＴタグとインフレームでクローニングした（配列
番号５４）。ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用してＣＤＴｂを発現させた。融合タンパク質は安定
であり、高度に発現され、可溶性であった。しかし、ＧＳＴタグを除去するためのタンパ
ク質分解は、タンパク質の可溶性の著しい低下を引き起こした。
ＣＤＴｂの可溶性を増加させることを試みるために、ＣＤＴｂの第２形態を構築した。
プロＣＤＴｂと称されるこの構築物は、元のＣＤＴｂ構築物には含まれていない活性化ド
メインを含んでいたが、シグナルペプチドを尚も欠いていた。プロＣＤＴｂは、フランキ
ングＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩクローニング部位および終止コドンを伴うように、Ｇｅｎ
ｓｃｒｉｐｔにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現に関してコドン最適化された（配
列番号５６）。前記のとおりに、プロＣＤＴｂを発現ベクターｐＧＥＸ ６Ｐ−１内にク
ローニングした。発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）を使用して、発現研究を行った。融合タンパ
ク質は安定であり、高度に発現され、可溶性であった。この場合もまた、ＧＳＴタグを除
去するためのタンパク質分解は、タンパク質の可溶性の著しい低下を引き起こした。
二成分毒素成分の安全性を評価するために、ハムスター研究を行った。ハムスターを、
以下の形態のＣＤＴａの１つと組み合わされたＣＤＴｂで免疫化した：（１）ホルムアル
デヒド不活化組換え天然（非突然変異）ＣＤＴａ、（２）ホルムアルデヒド不活化３ｍＣ
ＤＴａ１／３ｍＣＤＴａ２、または（３）組換え３ｍＣＤＴａ１／３ｍＣＤＴａ２（ホル
ムアルデヒド未不活化体）。全身性の及び注射部位の両方の有害事象（ＡＥ）に関して、
免疫化後の数日間にわたって動物を観察した。１つの研究においては、ホルムアルデヒド
不活化野生型配列ＣＤＴａを含有する全ての腕において有意なＡＥが観察され、ホルムア
ルデヒド不活化３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣＤＴａ２を含有する腕においては、少数の軽
度なＡＥが観察された。第２の研究においては、ホルムアルデヒド不活化野生型配列ＣＤ
Ｔａの投与を受けた腕の半分（２／４）で有意なＡＥが観察され、この場合もまた、ホル
ムアルデヒド不活化３ｍＣＤＴａおよび３ｍＣＤＴａ２ならびに組換え３ｍＣＤＴａ１／
３ｍＣＤＴａ２（ホルムアルデヒド未不活化体）を含有する腕において少数の軽度なＡＥ
が観察された。研究の結果は、二成分毒素を完全に不活化するにはホルムアルデヒド不活
化法だけでは不十分であったことを示している。また、ＡＥは大部分がＣＤＴａ成分によ
るものであろう。なぜなら、それらの２つの成分の免疫化は僅かなＣＤＴｂ関連ＡＥを別
個に示したに過ぎないからである。
実施例９
遺伝的に不活化されたＣＤＴａタンパク質の発現
二成分毒素は活性毒素であるため、遺伝的に不活化（不活性化）された形態の毒素タン
パク質を作製することも望ましかった。したがって、毒素の酵素成分ＣＤＴａを遺伝的不
活化のための標的とした。まず、ＣＤＴａを遺伝的に不活化することを試みるために、Ｃ
ＤＴａの以下の２つの三重突然変異体を設計した：３ｍＣＤＴａ１（Ｒ３０２Ａ，Ｅ３８
５Ａ，Ｅ３８７Ｄ）および３ｍＣＤＴａ２（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ）
。この場合もまた、遺伝子は、余分のメチオニンを伴わないこと以外はＣＤＴａ（前記）
と同様にして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最適発現のためにＧｅｎｓｃｒｉｐｔに
よりコドン最適化された。また、ＣＤＴａに関して前記されているとおりに、３ｍＣＤＴ
ａ１および３ｍＣＤＴａ２をクローニングし、発現させた。３ｍＣＤＴａ１および３ｍＣ
ＤＴａ２は高度に発現され、可溶性であった。
ＣＤＴａを遺伝的に不活化するために、以下の３つの追加的なＣＤＴａ三重突然変異体
および２つのＣＤＴａ四重変異体を設計した：４ｍＣＤＴａ３（Ｒ３０２Ａ，Ｓ３４５Ｆ
，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ）；３ｍＣＤＴａ４（Ｙ６２Ａ，Ｙ６９Ａ，Ｒ２５５Ａ）；３
ｍＣＤＴａ５（Ｒ３５９Ａ，Ｙ６２Ａ，Ｑ３０７Ｅ）；３ｍＣＤＴａ６（Ｙ２５８Ａ，Ｆ
３５６Ａ，Ｓ３４５Ｆ）；３ｍＣＤＴａ７（Ｎ３４２Ａ，Ｙ２５３Ａ，Ｙ３８２Ａ）；お
よび４ｍＣＤＴａ８（Ｓ３４５Ｆ，Ｅ３８５Ｑ，Ｅ３８７Ｑ，Ｃ２Ａ）。突然変異体構築
物の毒性を天然抗原と比較するために、細胞毒性研究を行った。毒性力価測定アッセイに
おいて、ＣＤＴａ（天然体または突然変異体）および活性化ＣＤＴｂを、１：７のＣＤＴ
ａ：ＣＤＴｂ モル比で一緒にした。毒素混合物を完全ＭＥＭ培地内で系列希釈した。つ
いで、希釈された毒素を、３８４ウェルプレート内で増殖させたベロ（Ｖｅｒｏ）細胞に
適用し、加湿ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を固
定し、透過性亢進させ、Ａｌｅｘａ ４８８ファロイジンで染色し、走査サイトメータ（
ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｖｅｌｏｓ）を使用して単層のイメージを得た。ＧｒａｐｈＰ
ａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、力価測定曲線をグラフ化した。結果は、全て
の突然変異ＣＤＴａタンパク質において、天然ＣＤＴａより低い毒性が観察されたことを
示している（図２２を参照されたい）。
実施例１０
ＣＤＴａ／ＣＤＴｂの精製
動物研究において使用するための精製された二成分毒素タンパク質を得るために、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からアフィニティタグ付き抗原としてＣＤＴａおよびＣＤＴｂを精製
した。アフィニティカラムを使用する精製方法を、動物研究のための十分な収率および純
度を確保するように最適化した。表１は、各構築物の精製に使用したアフィニティタグ、
ならびに得られた収率および純度を示す。幾つかの場合には、更なる研究のための十分な
純度を得るためにアフィニティクロマトグラフィー以降の追加的な精製工程を用いた。
Figure 2017141226
また、タグ無し二成分毒素タンパク質を、バキュロウイルスベクターを使用して、昆虫
細胞においておよびバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）において発現させた。各系からの発現力価をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。３ｍＣ
ＤＴａの発現力価（全ライセート／培養ブロスから測定）はバシラス・メガテリウム（Ｂ
．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）に関しては＞１ｇ／Ｌであり、バキュロウイルス系に関しては
約０．３ｇ／Ｌであった。ＣＤＴｂの発現力価はバシラス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）に関しては０．０２ｇ／Ｌであり、バキュロウイルスに関しては０．２ｇ
／Ｌであった。プロＣＤＴｂの場合、発現力価はバキュロウイルスにおいて＞０．５ｇ／
Ｌであった。
実施例１１
ワクチン組成物の効力
二成分毒素を含むワクチン組成物の効力を、実施例７に記載されているハムスターモデ
ルにおいて評価した。１つの研究においては、（ａ）アルミニウムヒドロキシホスファー
トアジュバント（「メルクアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋ Ａｌｕｍｉｎｕｍ
Ａｄｊｕｖａｎｔ」または「ＭＡＡ」）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュ
バントと共に製剤化された組換えＴｃｄＡ［バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系を使用して産生されたＮａｐ ３ｍＴｃｄＡ］およびＴ
ｃｄＢ［バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現系を
使用して産生されたＮａｐ ３ｍＴｃｄＢ］、（ｂ）ＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ
（登録商標）と共に製剤化されたホルムアルデヒド不活化ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ（Ｌｉ
ｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ
，ＣＡ）、または（ｃ）アジュバントのみの対照を含むワクチンでハムスターを免疫化し
た。結果は、組換えワクチンが投与された動物が原型ＶＰＩ１０４６３株からの胞子（純
度９５％）の２４１ ＣＦＵ／用量の致死的チャレンジに対して完全に防御されたことを
示している（図１１、パネルＡ）。
しかし、これらの動物がＶＰＩ株でのチャレンジの後に生存したにもかかわらず、全て
の試験群の動物において、相当な体重減少、下痢および罹患が生じた。また、クロストリ
ジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌および毒素は、便および盲腸含有
物の両方において検出可能であった。更に、前記の同じ３つの試験群（（ａ）〜（ｃ））
でワクチン接種を比較する別の研究において、組換えＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢワクチンは、高
毒性ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株からの胞子（純度９５％）の４５７ ＣＦＵ用量の致
死的チャレンジでチャレンジされたハムスターの生存を実質的に増加させることができな
かった（図１１、パネルＢ）。
したがって、ワクチンの防御効力を増強し、疾患に関連した罹患率を低下させるために
、他の抗原が該ワクチンに加えられうるかどうかを決定するために、追加的なワクチン成
分を評価した。この目的のために、ワクチン中のＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ毒素に加えられ
うる９個の追加的抗原を特定するために、文献およびプロテオーム評価を行い、そのよう
な追加的抗原をＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わせてハムスターモデルにおいて評価し
た。この評価から、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを含有するワクチンへの二成分毒素（ＣＤＴ
ａおよびＣＤＴｂ）の添加は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩチャレンジ後のハムスターにおけ
るこのワクチンの防御効力を一貫して増強した。
本発明者らはまた、二成分毒素（ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ）の両成分が、この分子によ
りもたらされる防御に必要なのかどうかまたは一方のタンパク質で十分なのかどうかを、
ハムスターチャレンジ研究において調べた。この研究においては、（ａ）組換えＴｃｄＡ
（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＡ）、組換えＴｃｄＢ（バキ
ュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、およびＣＤＴａ；（ｂ）組換
えＴｃｄＡ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＡ）、組換えＴｃ
ｄＢ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、およびＣＤＴｂ；
または（ｃ）組換えＴｃｄＡ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄ
Ａ）、組換えＴｃｄＢ（バキュロウイルス発現系を使用して産生された５ｍＴｃｄＢ）、
ＣＤＴａおよびＣＤＴｂ、のいずれかでハムスターをワクチン接種した。（ａ）〜（ｃ）
の全群をＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント共に製剤化し、アジュバントの
みが投与された第４群（ｄ）と比較した。結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと組み合わさ
れたＣＤＴａまたはＣＤＴｂがＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株（４７０ ＣＦＵ／動物）
による致死的チャレンジに対する防御を誘導しうることを示唆しているが、この防御は不
完全であった。これとは対照的に、両方の二成分毒素タンパク質（ＣＤＴａおよびＣＤＴ
ｂ）とＴｃｄＡおよびＴｃｄＢとの組合せは、この組合せを用いて過去の研究において観
察された防御を完全に復元した（図１２）。
実施例１２
非ヒト霊長類におけるワクチン組成物の免疫原性
４〜１０歳のアカゲザルの１１群（ｎ＝３／群）を、２０μｇのｖｐｉ ５ｍＴｃｄＡ
ｂｖ、２０μｇのｎａｐ ５ｍＴｃｄＢ ｂｖ、５μｇの３ｍ ＣｄｔＡ２ ｂｖおよ
び５μｇのプロＣｄｔＢ（「研究１１」）を含む種々のワクチン組成物で筋肉内に免疫化
した。１０群に投与した試験組成物は、図１７に示されているとおり、ＩＭＸ、ＭＡＡ、
ＩＭＯ２１７０またはこれらのアジュバントの組合せから選択されるアジュバントをも含
んでいた。ＩＭＯ２１７０は、Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から得られるトール様受容体アゴニストである。
研究の全体にわたって有害事象に関して動物をモニターした。覚醒中の動物に対して、
研究の全体にわたり並びに用量１の投与後（ＰＤ１）、ＰＤ２、ＰＤ３およびＰＤ４の４
時間の時点で、トランスポンダーにより体温を測定した。投与後４時間の時点で、および
少なくとも７日間にわたって毎日、注射部位を観察した。研究の全体にわたって、ほとん
どのサルに関して体温は正常範囲内であった。いずれの動物に関しても、いずれの時点で
も有害事象は観察されなかった。
示されている時点で動物から採血し、全４個の抗原に対する免疫応答を、ＥＬＩＳＡア
ッセイを用いて測定した。アカゲザルにおいてワクチン接種により誘導された血清抗毒素
ＩｇＧの濃度を各ワクチン成分に関して測定した。抗原を９６ウェルプレート上にコート
した（ＴｃｄＡは１μｇ／ｍｌ、ＴｃｄＢは０．５μｇ／ｍｌ、ＣＤＴａは５μｇ／ｍｌ
およびＣＤＴｂは５μｇ／ｍｌ）。洗浄およびブロッキング工程ならびにＨＲＰヤギ抗ヒ
トＩｇＧ Ｆｃｇ二次抗体および現像用基質を含む一般的なＥＬＩＳＡ法に従った。
ＴｃｄＡ ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、３用量計画の投与を受けた群ではＰＤ−１の
抗体価（抗体力価）は１：１００未満であったことを示している。ＰＤ−２およびＰＤ−
３の力価は、群１〜４および６〜７において非常に類似していた。４用量計画の投与を受
けた群では、抗体価は、用量２の投与後、ＩＭＸ−ＭＡＡにおけるワクチンが投与された
群（群１１、１：１８６３の力価）において観察されたに過ぎなかった。ＰＤ−３および
ＰＤ−４の力価は群９〜１０において類似していた。また、群１１のＰＤ−４に関して、
力価の低下が観察された。
３用量計画の投与を受けた群では、ＴｃｄＢ ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、ＰＤ−１
抗体価が１：１００未満であったことを示している。ＰＤ−２およびＰＤ−３の力価は、
群２、４および７において非常に類似していた。群１、３、５および６において、第３用
量の投与後に力価の上昇（＞５×）が観察された。４用量計画の投与を受けた群では、抗
体価は、ＰＤ−２において、ＩＭＸ−ＭＡＡにおけるワクチンが投与された群（群１１、
１：８１４４）において観察されたに過ぎなかった。ＰＤ−３およびＰＤ−４において、
力価は群９〜１０において類似していた。用量４の投与後、群１（〜８×）で力価の上昇
が観察され、群１１で力価の低下（２．５×）が観察された。
二成分毒素成分の場合、ＣＤＴｂでは、全体的にＣＤＴａの場合より高い力価が観察さ
れた。３用量計画の投与を受けた群では、ＣＤＴａに関するＰＤ−１抗体価は１：１００
未満であった。用量２の投与後、ＣＤＴａ力価は群５において観察されたに過ぎなかった
（１：１０８５０）。ＰＤ−３では全群で力価が観察され、群５（ＩＭＸ−ＭＡＡ−Ｎｏ
Ｆ）において１：２６，０００の最大力価が観察された。群６（ＩＭＯ−ＭＡＡ−Ｆ）お
よび群７（アジュバント無し）では、１：２０００未満の力価が観察された。４用量計画
の投与を受けた全群で、ＣＤＴａ力価は用量２の投与後までは検出不能であった。用量３
の投与後、群８〜１０においては力価の上昇が観察され、群１１においては力価の低下が
観察された。
ＣＤＴｂの場合、３用量計画の投与を受けた全群でＰＤ−１抗体価は１：１００未満で
あった。ＰＤ−２およびＰＤ−３における抗体価は、３用量計画の投与を受けた全群で高
かった。興味深いことに、アジュバントを伴わずにワクチンが投与された群（群７）にお
いて、力価の上昇（５×）が認められた。４用量計画の投与を受けた群では、ＰＤ−２に
おいて、３用量計画の群からのＰＤ−２力価と比較して低い抗体価が観察された。しかし
、ＰＤ−３およびＰＤ−４における力価は全群において非常に類似していた。最終的なＩ
ｇＧ ＥＬＩＳＡ力価（第４７日）を、３用量計画の投与を受けた群に関しては図１８Ａ
に、４用量計画の投与を受けた群に関しては図１８Ｂに示す。
また、Ｎａｂアッセイを用いて中和抗体を測定した。このアッセイにおいては、天然Ｔ
ｃｄＡまたはＴｃｄＢによるベロ細胞の殺細胞を抑制する抗血清の能力を評価した。毒素
のインキュベーションおよびベロ細胞での抗血清の希釈の後、細胞を固定し、Ｆ−アクチ
ンに特異的な蛍光プローブで染色した。染色されたＦ−アクチンの量およびそれに続いて
細胞面積を、細胞走査サイトメータを使用して決定した。結果は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄ
Ｂに対する中和抗体が、３０日後（ＰＤ−３）および４５日後（群に応じてＰＤ−３また
はＰＤ−４）、全群で観察されたことを示している。３用量計画の場合、第４５日に、群
４（ＩＭＸ／ＭＡＡ−Ｆ）はＴｃｄＡおよび二成分毒素の両方に対する最高の中和抗体価
を示し、群１（ＩＭＸ−Ｆ）はＴｃｄＢに対する最高の中和力価を示した。４用量計画か
らの第４５日の結果は、群８および１１（ＩＭＸ−ＦおよびＩＭＸ／ＭＡＡ−Ｆ）が、全
３個の中和アッセイにおいて、ＭＡＡアジュバント化体（群９および１０）より高い力価
を有することを示している。一般に、ＩＭＸまたはＩＭＸ／ＭＡＡでアジュバント化され
た４成分ワクチンで免疫化されたサルは最高の中和力価を示した。該Ｎａｂアッセイの結
果を図１９Ａ〜１９Ｃに示す。
実施例１３
ＣＤＴａ突然変異４ｍＣＤＴａ８の分析用および免疫原性分析
組換え突然変異体３ｍＣＤＴａ２および組換え野生型ＣＤＴａのウエスタンブロット分
析により、本発明者らは、これらのＣＤＴａタンパク質が二量体化する傾向を有すること
を観察した。８〜１６％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを５μｇまたは２μｇ／ウェルでロー
ディングし、還元および非還元条件下で泳動させた。図２０Ａを参照されたい。結果は、
還元条件下、ＣＤＴａおよび３ｍＣＤＴａ２タンパク質の両方の大部分が単量体（＞９７
％）として存在することを示した。しかし、非還元条件下では、ＣＤＴａの約３５〜３８
％および３ｍＣＤＴａ２の約６０〜６３％は二量体として存在した。
ＣＤＴａの配列を調べることにより、単一のシステイン残基（Ｃ２）を見出した。シス
テインはジスルフィド結合によりタンパク質をオリゴマー化させうるため、ＣＤＴａの二
量体化を低減または排除することを試み、システイン残基を突然変異させた。このように
して、３ｍＣＤＴａ２における突然変異に突然変異Ｃ２Ａを付加した４ｍＣＤＴａ８を作
製した。システイン突然変異が実際に二量体化を低減していたかどうかを確認するために
、ＳＥＣ分析を行った。３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析では、移動相は２５ｍＭ Ｎ
ａＰｉ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ｗ／ｖ アジ化ナトリウム（ｐＨ６．８）で
あり、分析は、０．２ｍｌ／分の流速でＴＳＫｇｅｌスーパーＳＷ３０００（Ｔｓｏｓｏ
ｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｌ ８６７５）を使用して行った。４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ−
ＭＡＬＳ分析では、サンプルを、ガードカラムを伴うＷｙａｔｔ ０１０Ｓ５分析装置上
に注入した。カラムを平衡化し、０．５ｍｌ／分でＰＢＳ中で作動させた。サンプルは、
配列推定単量体分子量より約１３％高い約５６．９ｋＤａの計算分子量を有する単一の十
分に明瞭なピークとして溶出した。
３ｍＣＤＴａ１のＳＥＣ−ＵＶ分析は、物質が、二量体／より高次の凝集物として、単
量体より高い比率で存在することを証明した（図２０Ｂを参照されたい）。これとは対照
的に、４ｍＣＤＴａ８のＳＥＣ−ＭＡＬｓ分析は、タンパク質物質のほぼ全てが単量体と
して存在することを示しており（図２０Ｃ）、このことは、システイン突然変異がＣＤＴ
ａのオリゴマー化を実際に劇的に低減したことを証明している。
Ｃ２Ａ突然変異がＣＤＴａタンパク質成分の免疫原性またはＮＡＰ１チャレンジ後の防
御能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、他のワクチン成分（突然変異ＴｃｄＡ
／Ｂ、プロＣＤＴｂ）と組み合わされた３ｍＣＤＴａ２および４ｍＣＤＴａ８の免疫原性
の比較を含むハムスター研究を行った。生存曲線は、両方の群において、ハムスターの８
０％がＮＡＰ１チャレンジを生き延びたことを示しており、このことは、システイン突然
変異の付加が３ｍＣＤＴａ２（両抗原は免疫学的に類似している）の免疫原性に悪影響を
及ぼさなかったことを示している。

Claims (44)

  1. Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９ＡおよびＣ
    ７００Ａからなる群から選択される少なくとも４つの突然変異を含む組換えクロストリジ
    ウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＴｃｄＡ）タンパク質。
  2. 該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＷ５１９Ａ；（ｂ
    ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａ；（ｃ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７
    Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａ；（ｄ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＡおよびＥ５１４Ｑ；な
    らびに（ｅ）Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａからな
    る群から選択される一組の突然変異を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
  3. 該タンパク質が、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９ＡおよびＣ７００Ａ
    突然変異を含む、請求項２記載のＴｃｄＡタンパク質。
  4. 該ＴｃｄＡタンパク質が、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
    ）ＮＡＰ１参考株またはＶＰＩ １０４６３参考株から誘導されたアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜３のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質。
  5. 該タンパク質が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１
    、配列番号１２、配列番号２５、配列番号２６および配列番号３５からなる群から選択さ
    れるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＴｃｄＡタンパク質。
  6. 該タンパク質が実質的に精製されている、請求項１〜５のいずれか１項記載のＴｃｄＡ
    タンパク質。
  7. Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０ＡおよびＣ
    ６９８Ａからなる群から選択される少なくとも３つの突然変異を含む単離された組換えク
    ロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）タンパク
    質。
  8. 該タンパク質が、（ａ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８ＡおよびＥ５１５Ｑ；（ｂ）Ｗ１０２、
    Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＷ５２０Ａ；（ｃ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ
    およびＤ２８６Ａ；（ｄ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５ＱおよびＳ５１８Ａ；なら
    びに（ｅ）Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａからなる
    群から選択される一組の突然変異を含む、請求項７記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質
    。
  9. 該タンパク質が、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａ
    突然変異を含む、請求項８記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
  10. 該ＴｃｄＢタンパク質が、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ
    ）ＮＡＰ１参考株またはＶＰＩ １０４６３参考株から誘導されたアミノ酸配列を含む、
    請求項７〜９のいずれか１項記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
  11. 該タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番
    号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８または配列番号５８からなる群から
    選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７記載の単離されたＴｃｄＢタンパク質。
  12. 該タンパク質が実質的に精製されている、請求項７〜１１のいずれか１項記載の単離さ
    れたＴｃｄＢタンパク質。
  13. 請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質および医薬上許容される担体を
    含む免疫原性組成物。
  14. 請求項７〜１２のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体
    を含む免疫原性組成物。
  15. 請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄＡタンパク質および請求項７〜１２のいずれ
    か１項記載のＴｃｄＢタンパク質および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
  16. アジュバントを更に含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
  17. 該アジュバントが、アルミニウムアジュバント、Ｉｓｃｏｍ型アジュバント、またはア
    ルミニウムアジュバントとＩｓｃｏｍ型アジュバントとの組合せである、請求項１６記載
    の免疫原性組成物。
  18. 昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項１〜５のいずれか１
    項記載のＴｃｄＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベク
    ターで形質転換してＴｃｄＡタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・デ
    ィフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡタンパク質の製造方法。
  19. 昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項７〜１１のいずれか
    １項記載のＴｃｄＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスベ
    クターで形質転換してＴｃｄＢタンパク質を産生させることを含む、クロストリジウム・
    ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢタンパク質の製造方法。
  20. Ｃ２Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ６９Ａ、Ｙ２５３Ａ、Ｒ２５５Ａ、Ｙ２５８Ａ、Ｒ３０２Ａ、Ｑ
    ３０７Ｅ、Ｎ３４２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｆ３５６Ａ、Ｒ３５９Ａ、Ｙ３８２Ａ、Ｅ３８５Ｑ
    、Ｅ３８５Ａ、Ｅ３８７ＱおよびＥ３８７Ｄから選択される少なくとも２つの突然変異を
    含む組換え二成分毒素タンパク質Ａ（ＣＤＴａ）。
  21. 該タンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項２０記載のＣＤＴａタンパク質
    。
  22. 該ＣＤＴａタンパク質が、
    （ａ）Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
    （ｂ）Ｒ３０２Ａ、Ｅ３８５ＡおよびＥ３８７Ｄ；
    （ｃ）Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
    （ｄ）Ｒ３０２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ；
    （ｅ）Ｙ６７Ａ、Ｙ６９ＡおよびＲ２５５Ａ；
    （ｆ）Ｒ３５９Ａ、Ｙ６７ＡおよびＱ３０７Ｅ；
    （ｇ）Ｙ２５８Ａ、Ｆ３５６Ａ、Ｓ３４５Ｆ；ならびに
    （ｈ）Ｎ３４２Ａ、Ｙ２５３ＡおよびＹ３８２Ａ
    からなる群から選択される一組の突然変異を含む、請求項２０または請求項２１記載のＣ
    ＤＴａタンパク質。
  23. 該タンパク質が、配列番号４０、配列番号４２または配列番号６７に記載されているア
    ミノ酸配列を含む、請求項２０または請求項２１記載のＣＤＴａタンパク質。
  24. 該タンパク質が、Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ突然変異を含む、
    請求項２２記載のＣＤＴａタンパク質。
  25. 該タンパク質が実質的に精製されている、請求項２０〜２４のいずれか１項記載のＣＤ
    Ｔａタンパク質。
  26. 請求項２０〜２５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質およびクロストリジウム・
    ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの二成分毒素タンパク質Ｂ（ＣＤＴｂ）お
    よび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
  27. 該ＣＤＴｂタンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項２６記載の免疫原性組
    成物。
  28. 該ＣＤＴｂタンパク質が活性化ドメインを欠いている、請求項２７記載の免疫原性組成
    物。
  29. アジュバントを更に含む、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の免疫原性組成物。
  30. 該アジュバントがアルミニウムアジュバントまたはＩＳＣＯＭ型アジュバントまたはそ
    れらの組合せである、請求項２９記載の免疫原性組成物。
  31. 請求項２０〜２４のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質をコードするヌクレオチド
    配列を含む核酸分子。
  32. 請求項３１記載の核酸分子を含むベクター。
  33. バキュロウイルスベクターである、請求項３２記載のベクター。
  34. 請求項３２または請求項３３記載のベクターを含む宿主細胞。
  35. 該細胞が昆虫細胞である、請求項３４記載の宿主細胞。
  36. 細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、請求項３２記載のベクターで形
    質転換してＣＤＴａタンパク質を産生させることを含む、ＣＤＴａタンパク質の製造方法
    。
  37. 昆虫細胞を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下、ＣＤＴｂタンパク質をコー
    ドする核酸を含むバキュロウイルスベクターで形質転換してＣＤＴｂタンパク質を産生さ
    せることを含む、ＣＤＴｂタンパク質の製造方法。
  38. 請求項１３〜１７、２６〜３０または４０〜４３のいずれか１項記載の免疫原性組成物
    の有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆ
    ｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療または予防方法。
  39. クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治
    療または予防用の医薬の製造における、（ａ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＴｃｄ
    Ａタンパク質、（ｂ）請求項７〜１２のいずれか１項記載のＴｃｄＢタンパク質、（ｃ）
    請求項２０〜２５のいずれか１項記載のＣＤＴａタンパク質、または（ａ）、（ｂ）およ
    び（ｃ）のいずれかの組合せの使用。
  40. 請求項１〜６のいずれか１項記載の組換えＴｃｄＡタンパク質および請求項７〜１２の
    いずれか１項記載の組換えＴｃｄＢタンパク質を更に含む、請求項２６〜２８のいずれか
    １項記載の免疫原性組成物。
  41. ＴｃｄＡタンパク質が突然変異Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａおよび
    Ｃ７００Ａを含み、ＴｃｄＢタンパク質が突然変異Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ
    、Ｗ５２０ＡおよびＣ６９８Ａを含み、ＣＤＴａタンパク質がシグナルペプチドを欠いて
    おり、ＣＤＴａタンパク質が突然変異Ｃ２Ａ、Ｓ３４５Ｆ、Ｅ３８５ＱおよびＥ３８７Ｑ
    を含み、そして、ＣＤＴｂタンパク質がシグナルペプチドを欠いている、請求項４０記載
    の免疫原性組成物。
  42. 該組成物がアルミニウムアジュバントを更に含む、請求項４１記載の免疫原性組成物。
  43. 該組成物がＩＳＣＯＭ型アジュバントを更に含む、請求項４０〜４２のいずれか１項記
    載の免疫原性組成物。
  44. クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に関連した疾患の治
    療または予防のための、請求項１３〜１７、２６〜３０または４０〜４３のいずれか１項
    記載の免疫原性組成物の使用。
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