SK16112003A3 - A novel engineered superantigen for human therapy - Google Patents

Description

SUPERANTIGÉN PRE HUMÁNNU TERAPIU

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka oblasti imunológie a proliferatívnych ochorení, ako sú nádory. Presnejšie sa týka prostriedkov a ich použitia, kde uvedené prostriedky obsahujú superantigény, ktoré boli modifikované tak, aby mali redukovanú séroreaktivitu.

Doterajší stav techniky

Superantigény (SAg) sú tvorené skupinou bakteriálnych a vírusových proteínov, ktoré sú extrémne aktívne v aktivácii veľkej frakcie populácie Tlymfocytov. Superantigény sa priamo viažu na hlavný histokompatibilný komplex (MHC) bez toho, aby boli spracované. V skutočnosti sa superantigény viažu nezpracované mimo antigén-väzbovú drážku na MHC molekulách triedy II, čo eliminuje väčšinu polymorfizmu v konvenčných väzbových miestach pre peptid. Mechanizmus väzby závisí od väzby superantigénu na T-lymfocytárny receptor (TCR) na νβ reťazci, miesto väzby na hypervariabilné slučky Tlymfocytárneho receptora (TCR).

Stafylokokové enterotoxíny (SE) sú homológnou skupinou superantigénov, ako z hľadiska štruktúry, tak z hľadiska funkcie (Papageorgiou et al., 2000). Sú známe ako hlavná príčina otráv z potravy a syndrómu toxického šoku u človeka.

Nový terapeutický postup pri liečbe nádorov na báze Sag sa vyvinul pre adjuvantnú liečbu solidných nádorov. Využíva obe hlavné ramená imunitného systému tým, že používa Fab časť tumor-špecifickej monoklonálnej protilátky a SAg aktivujúce T-lymfocyty v jednom rekombinantnom fúznom proteíne. FabSAg proteíny naviazané na nádorové bunky môžu aktivovať SAg-aktivované cytotoxické T-lymfocyty k zabíjaniu nádorových buniek priamo mechanizmom

249/B bunkovej cytotoxicity sprostredkovanej protilátkou k superantigénu, SADCC. Okrem toho aktivované T-lymfocyty produkujú tumoricidne a protizápalové cytokíny, čo rieši problémy spojené s heterogenitou nádoru a vychytávaním makromolekúl, v príslušnom poradí.

Protinádorové lieky na báze superantigénov majú určitú úspešnosť, avšak jedným klinickým problémom, ktorý musí byť vyriešený, je systémová aktivácia imunitného systému. Fúzne proteíny s prirodzeným SA boli skúmané v klinických štúdiách na kolorektálnom karcinóme a na karcinóme pankreasu (Alpaugh et al., 1998). Boli síce pozorované povzbudivé výsledky, ale tiež určité obmedzenia. Za prvé, prípravky boli veľmi toxické. Za druhé, vopred vytvorené protilátky k superantigénom u pacienta spôsobovali problémy pri dávkovaní. Okrem toho boli prípravky imunogénne. Preto bolo opakovanie cyklov terapie možné iba u obmedzeného počtu pacientov.

Do predkladaného vynálezu bola terapia na báze SAg obmedzená z hľadiska dávky. V predkladanom vynáleze je po prvý krát modifikovaný superantigénom, čo vedie k zníženiu séroreaktivity so zachovaním aktivity superantigénu; z tohto dôvodu je predkladaný vynález nový.

Podstata vynálezu

Teraz budú opísané všeobecnejšie rysy a technické výhody predkladaného vynálezu, aby bol následný podrobný opis vynálezu lepšie pochopiteľný. Ďalšie rysy a výhody predkladaného vynálezu budú opísané ďalej v pripojených patentových nárokoch. Je treba si uvedomiť, že koncepcia a špecifické uskutočnenia opísané v predkladanom vynáleze môžu byť použité ako základ pre modifikovanie alebo návrh ďalších štruktúr pre uskutočňovanie spôsobov podľa predkladaného vynálezu. Je tiež potrebné si uvedomiť, že takéto ekvivalentné uskutočnenia spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu, ako je definovaný pripojenými patentovými nárokmi. Nové rysy, o ktorých sa predpokladá, že sú charakteristické pre predkladaný vynález, ako z hľadiska organizácie, tak z hľadiska uskutočnenia, spoločne s ďalšími predmetmi a

249/B výhodami vynálezu, budú pochopiteľnejšie z nasledujúceho podrobného opisu a pripojených výkresov. Musí byť však jednoznačne jasné, že každý z výkresov je uvedený iba na ilustráciu a opis a nijako neobmedzuje rozsah predkladaného vynálezu.

Predkladaný vynález poskytuje konjugát tvorený bakteriálnym superantigénom a protilátkovou skupinou, kde superantigén je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a DNA sekvencia kódujúca superantigén je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne A je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. Príklady superantigénov sú, napríklad, stafylokokový enterotoxín (SE), exotoxín Streptococcus pyogenes (SPE), toxín syndrómu toxického šoku Staphylococcus aureus (TSST-1), streptokokový mitogénny exotoxín (SME) a streptokokový superantigén (SSA). V špecifických uskutočneniach je stafylokokovým enterotoxínom stafylokokový enterotoxín A (SEA) alebo stafylokokový enterotoxín B (SEE).

V konkrétnych uskutočneniach sú aminokyselinovými zvyškami nahradenými v regióne A zvyšky vybrané zo skupiny zahrňujúcej 20, 21, 24, 27, 173 a 204. Tiež sa predpokladá, že región C môže obsahovať substitúcie v nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškoch. Tieto substitúcie sa môžu vyskytovať v aminokyselinových zvyškoch 79, 81, 83 a 84. Tiež región E môže obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov, kde tieto substitúcie sa môžu vyskytovať v aminokyselinových zvyškoch v pozícii 227.

V inom uskutočnení predkladaný vynález poskytuje konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízkotitrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a

249/B aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne B je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. Konkrétne, pozície aminokyselinových zvyškov nahradených v regióne B môžu byť vybrané zo skupiny zahrňujúcej zvyšky 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 a 49.

V inom uskutočnení predkladaný vynález poskytuje konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízkotitrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne C je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. V konkrétnom uskutočnení je nádor vybraný zo skupiny zahrňujúcej karcinómy pľúc, prsníka, hrubého čreva, obličiek, pankreasu, vaječníkov, žalúdka, krčka maternice a prostaty. Pozície aminokyselinových zvyškov nahradených v regióne C môžu byť vybrané zo skupiny zahrňujúcej zvyšky 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84.

Príklady superantigénov sú, napríklad, stafylokokový enterotoxín (SE), exotoxín Streptococcus pyogenes (SPE), toxín syndrómu toxického šoku Staphylococcus aureus (TSST-1), streptokokový mitogénny exotoxín (SME) a streptokokový superantigén (SSA). V špecifických uskutočneniach je stafylokokovým enterotoxínom stafylokokový enterotoxín A (SEA) alebo stafylokokový enterotoxín B (SEE).

249/B

V konkrétnych uskutočneniach môže konjugát ďalej obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne A. Substitúcie v regióne A sa môžu vyskytovať v aminokyselinových zvyškoch v pozíciách 20, 21, 24, 27, 173 alebo 204. Ďalej môže konjugát obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne B. Presnejšie, substitúcie v regióne B sa môžu vyskytovať v aminokyselinovom zvyšku v pozícii 227.

V ďalšom špecifickom uskutočnení môže konjugát obsahovať SEE aminokyselinové sekvencie obsahujúce substitúcie R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S a D227S alebo SEE aminokyselinové sekvencie obsahujúce substitúcie R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, KS4S a D227A. Ešte ďalej môže konjugát obsahovať aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2.

V ďalších uskutočneniach môže konjugát obsahovať protilátkovú skupinu, napríklad Fab fragment. Špecifickými Fab fragmentmi môžu byť C215fab alebo 5T4Fab.

Ďalej môže konjugát obsahovať cytokín, ako je interleukín. V konkrétnych uskutočneniach je interleukínom IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL2. Iným uskutočnením je konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne D je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. Aminokyselinová pozícia v regióne D, ktorá má byť nahradená, je vybraná zo skupiny zahrňujúcej pozície 187, 188, 189 a 190.

249/B

V inom uskutočnení je poskytnutý konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne E je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. V konkrétnych uskutočneniach je stafylokokovým enterotoxínom stafylokokový enterotoxín A (SEA) alebo stafylokokový enterotoxín B (SEE). Aminokyselinové pozície v regióne E, ktoré majú byť nahradené, sú vybrané zo skupiny zahrňujúcej 217, 220, 222, 223, 225 a 227.

V konkrétnom uskutočnení konjugát ďalej obsahuje substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne A. Konkrétne, substitúcie v regióne A sa môžu vyskytovať v pozíciách aminokyselinových zvyškov 20, 21, 24, 27, 173 a 204.

V inom konkrétnom uskutočnení konjugát ďalej obsahuje substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne B. Konkrétne, substitúcie regiónu B sa môžu vyskytovať v pozíciách aminokyselinových zvyškov 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 a 49.

V inom konkrétnom uskutočnení konjugát ďalej obsahuje substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne C. Konkrétne, substitúcie regiónu C sa môžu vyskytovať v pozíciách aminokyselinových zvyškov 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84. Ďalej môže konjugát obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne D. Konkrétne, substitúcie v regióne D sa môžu vyskytovať v pozíciách aminokyselinových zvyškov 187, 188, 189 a 190.

V inom konkrétnom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický prostriedok obsahujúci terapeuticky účinné množstvo konjugátu, kde uvedený konjugát obsahuje bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde

249,'B superantigénom je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne C je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. Aminokyselinové pozície v regióne C, ktoré majú byť nahradené, sú vybrané zo skupiny zahrňujúcej 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84.

V ďalších uskutočneniach môže farmaceutický prostriedok obsahovať konjugát obsahujúci substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne A, kde substitúcie v regióne A sa vyskytujú v aminokyselinových pozíciách 20, 21, 24, 27, 173 a 204. Ešte ďalej môže farmaceutický prostriedok tiež obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne B. Presnejšie, substitúcie v regióne B môžu byť v aminokyselinových pozíciách 227.

V konkrétnych uskutočneniach môže farmaceutický prostriedok obsahovať konjugát obsahujúci SEE aminokyselinové sekvencie (SEQ ID NO: 7), rovnako ako ďalšie substitúcie R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K838, K84S a D227S.

V inom špecifickom uskutočnení môže farmaceutický prostriedok obsahovať SEE aminokyselinové sekvencie (SEQ ID NO: ID NO:7), rovnako ako ďalšie substitúcie R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, KB3S, K84S a D227A. Ešte ďalej môže farmaceutický prostriedok obsahovať konjugát, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1.

V ďalších špecifických uskutočneniach farmaceutický prostriedok obsahuje protilátkovú skupinu, napríklad Fab fragment. Konkrétne je Fab fragmentom C215Fab alebo 5T4Fab. Farmaceutický prostriedok môže ďalej obsahovať cytokín, ako je interleukín. Interleukínom môže byť IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu, ako prirodzený IL2.

24 9/B

Ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu zahrňuje spôsob liečby nádorov u cicavcov pomocou aktivácie imunitného systému uvedeného cicavca, pri ktorom je uvedenému cicavcovi podané terapeuticky účinné množstvo konjugátu, kde uvedený konjugát obsahuje bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne C je nahradených inými aminokyselinami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky. Príklady nádorov sú, napríklad, ale bez obmedzenia, karcinóm pľúc, prsníka, hrubého čreva, obličiek, pankreasu, vaječníkov, žalúdka, krčka maternice a prostaty. Pozície aminokyselinových zvyškov, ktoré sú nahradené, sú pozície vybrané zo skupiny zahrňujúcej pozície 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84.

V ďalších uskutočneniach môže región A tiež obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselín zvyškov, kde tieto substitúcie sa môžu vyskytovať v aminokyselinových pozíciách 20, 21, 24, 27, 173 a 204. Tiež región E môže dalej obsahovať substitúcie nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov. Konkrétne môžu byť substitúcie v regióne B v aminokyselinových zvyškoch v pozícii 227. Konjugát môže obsahovať SEE aminokyselinové sekvencie (SEQ ID NO; 7), rovnako ako ďalšie substitúcie R20G, N21T, S24G, P27K, K79E, KB1E, K83S, K84S a D227S alebo substitúcie R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S a D227A. Ďalej môže mať konjugát aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Nasledujúce výkresy tvoria súčasť predkladaného vynálezu a sú zahrnuté na ďalšiu ilustráciu niektorých aspektov predkladaného vynálezu.

249/B

Vynález je lepšie zrozumiteľný pomocou odkazov na nasledujúce výkresy a pomocou podrobného opisu uvedených špecifických uskutočnení.

Obr. 1 ukazuje peptidové fragmenty rozpoznávané ľudskými anti-SEA, ktoré boli identifikované z pepsínového trávenia SEA/E-18 eluovaného z anti-SEA kolóny. Fragmenty sa identifikovali pred a po prečistení za použitia HPLC s reverznou fázou spriahnuté s hmotnostným spektrometrom (MS). Fragmenty zistené v trávenom prípravku pri rovnakom retenčnom čase pred a po afinitnom prečistení sa považovali za pozitívne.

Obr. 2 ukazuje sedem rôznych identifikovaných peptidov, ktoré sú uvedené ako čiary pod aminokyselinovou sekvenciou pre SEA/E-120. Svetlošedé znaky ukazujú, ktoré zvyšky boli alterované v SEA/E-120 v porovnaní s SEA/E-18.

Obr. 3 je štrukturálne porovnanie sekvencie SEA, SED a SEH použitých ako templáty na prípravu komparatívneho počítačového modulu SEA/E-18. Štrukturálne konzervované regióny sú v čiernych rámčekoch.

Obr. 4 je porovnanie sekvencii SEA, SEE, SEA/E-18 a SEA/E-120. Ako čiary nad porovnaním je označených päť rôznych regiónov A-E, v ktorých sú uskutočňované všetky substitúcie v SEA/E-120.

Obr. 5 je SEA/E-18 model (čierne) zložený zo SEA (1SXT, šedé).

Obr. 6 sú regióny SEA/E-18, ktoré korešpondujú s identifikovanými séroreaktívnymi peptidmi.

Obr. 7 je test blízkosti scintilácie (SPA), ktorý meria špecifickú väzbu ¹²⁵l ľudskej anti-SEA naviazanej na C215FabSEA, C215FabSEA/E-18, -65, -97, 109, -110, -113 alebo -120 na anti-myší F(ab)₂ konjugovaný s biotínom na streptavidínových PVT korálkach.

Obr. 8A a obr. 8B ilustruje schopnosť sprostredkovať cytotoxicitu namierenú voči nádoru. Obr. 8A ilustruje cytotoxicitu, ako je meraná v teste bunkovej cytotoxicity závislej od protilátky proti superantigénu, SADCC. Obr. 8B ukazuje účinnosť superantigénov v sprostredkovaní zabíjania buniek exprimujúcich MHC antigény triedy II T-lymfocytmi, čo môže spôsobovať vedľajšie efekty v teste bunkovej cytotoxicity závislej od superantigénu, SDCC. Všetky nové

249/B chiméry znižovali ich efekt v SDCC o aspoň jeden log a o takmer 3 log pre C215FabSEA/E-120.

Obr. 9 je stĺpcový diagram SEA/E-120 modelu. Vedľajšie reťazce zvyškov G20, T21, G24 a K27 sú znázornené svetlošedo, vedľajšie reťazce zvyškov S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 a S84 sú znázornené šedo, vedľajšie reťazce zvyškov T217, S220, T222, 8223, S225 sú znázornené čierno a vedľajšie reťazce zvyškov S227 sú svetlošedé.

Obr. 10 je aminokyselinová sekvencia 5T4FabSEA/E-120 (SEQ ID NO: 1) s variabilnými časťami z myšej 5T4 protilátky a konštantnými časťami z myšej C242 protilátky. Pozície 1-458 je reťazec A a pozícia 459-672 je reťazec B.

Podrobný opis vynálezu

Odborníkom v odbore bude jasné, že existujú rôzne uskutočnenia a variácie predkladaného vynálezu, ktoré spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Termín protilátka” ako je tu použitý, označuje imunoglobulínovú molekulu, ktorá je schopná sa špecificky viazať na špecifický epitop na antigéne. Ako je tu použitý, označuje termín protilátka akékoľvek imunologické väzbové činidlo, ako je IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. Protilátky môžu byť intaktné imunoglobulíny získané z prirodzených zdrojov a alebo z rekombinantných zdrojov, alebo môže ísť o imunoaktívne časti intaktných imunoglobulinov. Protilátky podľa predkladaného vynálezu môžu existovať v rôznych formách, napríklad ako polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky, Fv, Fab a F(ab)₂, rovnako ako jednoreťazcové protilátky a humanizované protilátky (Harlow et al., 1988; Bird et al., 1988).

Termín antigén, ako je tu použitý, je definovaný ako molekula, ktorá provokuje imunitnú reakciu. Táto imunitná reakcia môže zahrňovať produkciu protilátok, aktiváciu špecifických imunologický kompetentných buniek alebo

249/B oboje. Antigén môže byť získaný z mikroorganizmov, podjednotiek proteínov/antigénov, usmrtených alebo inaktivovaných celých buniek alebo lyzátov. Tak odborník v odbore vie, že akákoľvek makromolekula, vrátane v podstate všetkých proteínov, môže slúžiť ako antigén. Ďalej môžu byť antigény získané z rekombinantnej DNA.

Termín nádor” ako je tu použitý, je definovaný ako proliferatívne ochorenie alebo malígna neoplazma (nádor). Príkladom môže byť, bez obmedzenia, karcinóm prsníka, karcinóm prostaty, karcinóm vaječníkov, karcinóm krčka maternice, karcinóm kože, karcinóm pankreasu, kolorektálny karcinóm a karcinóm pľúc.

Termín ”konjugát”, ako je tu použitý, je definovaný ako fúzny protein superantigénu alebo variantu superantigénu fúzovaného alebo konjugovaného na protilátku alebo fragment protilátky.

Termín imunogénny alebo imunogenicita”, ako je tu použitý, je definovaný ako substancia alebo molekula, ktorá vyvoláva imunitnú reakciu.

Termín hlavný histokompatibilný komplex” alebo ”MHC”, ako je tu použitý, je definovaný ako špecifické zoskupenie génov, z ktorých mnohé kódujú evolučné príbuzné povrchové bunkové proteíny podieľajúce sa na prezentácii antigénu, ktoré patria medzi najdôležitejšie determinanty histokompatibility. Trieda I MHC, alebo MHC-I, sa podieľa hlavne na prezentácii antigénu CD8 T lymfocytom. Trieda II MHC, alebo MHC-II, sa podieľa hlavne na prezentácii antigénu CD4 T lymfocytom.

Termín séroreaktívny”, séroreakcia” alebo séroreaktivita”, ako je tu použitý, je definovaný ako reakcia alebo akcia prebiehajúca v dôsledku séra. Odborníkom v odbore bude jasné, že sérum od pacientov alebo zvierat obsahuje neutralizačné protilátky alebo predvytvorené protilátky alebo endogénne protilátky k rôznym antigénom alebo molekulám. Preto séroreaktivita súvisí s reakciou neutralizačných protilátok v sére.

Termín superantigén”, ako je tu použitý, je definovaný ako trieda molekúl, ktorá stimuluje podstatu T-lymfocytov väzbou na MHC molekuly triedy

249/B

II a νβ domény T-lymfocytárnych receptorov, čo stimuluje aktiváciu Tlymfocytov exprimujúcich konkrétne \/β V génové segmenty.

Termín ”T-lymfocytárny receptor”, ako je tu použitý, je definovaný ako receptor, ktorý obsahuje disulfidovo viazaný heterodimér vysoko variabilných a alebo β reťazcov exprimovaných na bunkovej membráne vo forme komplexu s nevariabilnými CD3 reťazcami. T-lymfocyty nesúce tento typ receptora sú často označované ako α:β T-lymfocyty. Alternatívny receptor tvorený variabilnými γ a δ reťazcami je exprimovaný CD3 na podskupine T-lymfocytov.

Termín terapeuticky účinný”, ako je tu použitý, je definovaný ako množstvo farmaceutického prostriedku, ktoré je účinné pre liečbu ochorení alebo chorôb.

Termín variant” alebo varianty”, ako je tu použitý, označuje proteíny alebo peptidy, ktoré sa líšia od referenčného proteínu alebo peptidu, v príslušnom poradí. Varianty v tomto zmysle sú podrobne opísané ďalej. Napríklad môžu byť zmeny v sekvencií nukleovej kyseliny variantu silentné, t.j. nealterujú aminokyseliny kódované sekvenciou nukleovej kyseliny. Keď sú alterácie obmedzené na silentné zmeny tohto typu, tak variant kóduje peptid s rovnakou aminokyselinovou sekvenciou, ako má referenčný peptid. Zmeny v sekvencií nukleovej kyseliny variantu môžu meniť aminokyselinovú sekvenciu peptidu kódovaného referenčnou sekvenciou nukleovej kyseliny. Takéto zmeny nukleovej kyseliny môžu ústiť v aminokyselinové substitúcie, adície, delécie, fúzie a skrátenia v peptide kódovanom referenčnou sekvenciou, ako je opísané ďalej. Všeobecne, odlišnosti v aminokyselinových sekvenciách sú obmedzené tak, aby referenčné sekvencie a varianty boli celkovo podobné a - v mnohých regiónoch - identické. Variant a referenčný peptid sa môžu líšiť v aminokyselinovej sekvencií jednou alebo viacerými substitúciami, adíciami, deléciami, fúziami a skráteniami, ktoré môžu byť prítomné v akejkoľvek kombinácii. Variantom môže byť tiež fragment podľa predkladaného vynálezu, ktorý sa líši od sekvencie referenčného peptidu tým, že je kratší ako referenčné sekvencie, napríklad v dôsledku koncovej alebo internej delécie. Iný variant peptidu podľa predkladaného vynálezu tiež zahrňuje peptid, ktorý si zachováva

249/B v podstate rovnaké funkcie alebo aktivity takéhoto peptidu. Variant môže byť tiež (i) taký, kde je jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov substituovaných konzervovaným alebo nekonzervovaným aminokyselinovým zvyškom a takýto substituovaný aminokyselinový zvyšok môže a nemusí byť zvyšok kódovaný genetickým kódom, alebo (ii) taký, kde jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov obsahuje substituentovú skupinu, alebo (iii) taký, kde je zrelý peptid fúzovaný s inou zlúčeninou, ako je zlúčenina zvyšujúca polčas peptidu (napríklad polyetylénglykol), alebo (iv) taký, kde sú ďalšie aminokyseliny fúzované na zrelý peptid, ako je vedúca alebo sekrečná sekvencia alebo sekvencia, ktorá je použitá na prečistenie zrelého peptidu. Varianty môžu byť pripravené technikami mutagenézy, vrátane techník aplikovaných na nukleové kyseliny, aminokyseliny, bunky alebo organizmy, alebo za použitia rekombinantných techník. Všetky takéto varianty definované vyššie sú známe v odbore.

Termín biologická aktivita”, ako je tu použitý, označuje vlastnosť špecifickej molekuly, napríklad aktiváciu určitých buniek alebo väzbu na určité receptory. Definícia, ako je tu použitá, je primárne kvalitatívna a nie kvantitatívna.

I. Modifikácia superantigénov

Predkladaný vynález je určený na modifikáciu superantigénov, ktorá znižuje ich imunogenicitu tým, že je redukovaná ich séroreaktivita. Odborníkom v odbore bude jasné, že séroreaktivita označuje reakciu molekúl alebo antigénov s neutralizačnými protilátkami v sére. Konkrétne sa predkladaný vynález týka konjugátu obsahujúceho bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde uvedený konjugát obsahuje bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde superantigénom je nízko-titrový superantigén obsahujúci regióny A až E, kde región A je TCR väzbové miesto a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekulu triedy II; a aminokyselinová sekvencia superantigénu je substituovaná tak, že nie viac ako 15 aminokyselinových zvyškov v regióne A až E je nahradených inými aminokyselinami tak, že

249/B substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, z ktorého je odvodený; a kde protilátková skupina je kompletná protilátka alebo akýkoľvek fragment protilátky viažuci molekulu, ktorý je namierený proti štruktúre asociovanej s povrchom nádorovej bunky.

A. Superantigény

Medzi bakteriálne superantigény, ktoré sú zamýšľané na použitie v predkladanom vynáleze, patria, napríklad, stafylokokový enterotoxín (SE), a Streptococcus pyogenes exotoxín (SPE), toxín asociovaný so syndrómom toxického šoku Staphylococcus aureus (TSST-1), streptokokový mitogénny exotoxín (SME) a streptokokový superantigén (SsA). Odborníkom v odbore bude známe, že trojrozmerná štruktúra vyššie uvedených superantigénov môže byť získaná z Protein Data Banky (PDB, www.rcsb.org). Ďalej môžu odborníci v odbore získať sekvencie nukleovej kyseliny a aminokyselinové sekvencie vyššie uvedených superantigénov z GenBank (http//www. nebi. nim. nih.gov/Genbank/GenbankseaSearch.html).

V konkrétnych uskutočneniach je superantigénom nízko-titrový superantigén. Odborníkom v odbore je známe, že ľudské sérum za normálnych okolností obsahuje vysoké titry protilátok proti superantigénom. Napríklad, pre stafylokokové superantigény sú relatívne titry TSST-1 > SEE > SEC-1 > SEC-2 > SEA > SED > SEE. Odborník v odbore vie, že tieto relatívne titry ukazujú na problémy s imunogenicitou a problémy so séroreaktivitou alebo problémy s neutralizačnými protilátkami. Preto predkladaný vynález predpokladá použitie nízko-titrových superantigénov, ako je SEA alebo SEE, aby sa zabránilo séroreaktivite parenterálne aplikovaných superantigénov.

Ďalej je známe, že proteínové sekvencie a imunologická skrížená reaktivita superantigénov alebo stafylokokových enterotoxínov sa delí do dvoch príbuzných skupín. Do jednej skupiny patria SEA, SEE, SED a SEE. Do druhej skupiny patria SPEA, SEC, SEB a SSA. Tak predkladaný vynález tiež predpokladá použitie nízko-titrových superantigénov na zníženie alebo

249/B elimináciu skríženej reaktivity superantigénov podľa predkladaného vynálezu s endogénnymi protilátkami proti stafylokokovým enterotoxínom.

B. Varianty superantigénov

Varianty aminokyselinovej sekvencie superantigénnych proteínov môžu byť substitučné, inzerčné alebo delečné varianty. Tieto varianty môžu byť prečistené za použitia bežných techník, ako je zrážanie (napríklad síranom amónnym), HPLC, iónomeničová chromatografia, afinitná chromatograf i a (vrátane imunoafinitnej chromatografie) alebo rôznych techník separácie podľa veľkosti (sedimentácia, gélová elektroforéza, gélová filtrácia).

Substitučné varianty alebo varianty s náhradou sú obvykle pripravené výmenou jednej aminokyseliny za inú v jednom alebo viacerých miestach proteínu. Substitúcie môžu byť konzervatívne, čo znamená, že jedna aminokyselina je nahradená aminokyselinou podobného tvaru a náboja. Konzervatívne substitúcie sú dobre známe v odbore a patria medzi ne, napríklad, zámena: alanínu za serín; arginínu za lyzín; asparagínu za glutamín alebo histidín; aspartátu za glutamát; cysteínu za serín; glutamínu za asparagín; glutamátu za aspartát; glycínu za prolín; histidínu za asparagín alebo glutamín; izoleucínu za leucín alebo valín; leucínu za valín alebo izoleucín; lyzínu za arginín; metionínu za leucín alebo izoleucín; fenylalanínu za tyrozín, leucín alebo metionín; serínu za treonín; treonínu za serín; tryptofánu za tyrozín; tyrozínu za tryptofán alebo fenylalanín; a valínu za izoleucín alebo leucín.

Predkladatelia vynálezu predpokladajú, že v DNA sekvencií génov môžu byť uskutočnené rôzne zmeny bez toho, že by došlo k významnejšej strate biologickej aktivity alebo použiteľnosti proteínov, ako je opísané ďalej. Aktivitou sa mieni indukcia T-lymfocytárnej reakcie vedúca k cytotoxicite pre nádorové bunky. Ďalej sa zníži afinita superantigénu alebo molekuly MHC triedy II za minimálneho ovplyvnenia cytotoxity superantigénu.

249/B

Pri uskutočňovaní takýchto zmien musí byť braný do úvahy hydropatický index aminokyselín. Význam hydropatického indexu spočíva v tom, že ovplyvňuje interaktívne biologické funkcie proteínu, ako je v odbore všeobecne známe (Kyte a Doolittle, 1982). Predpokladá sa, že relatívny hydropatický charakter aminokyselín ovplyvňuje sekundárnu štruktúru výsledného proteínu, ktorá potom definuje interakciu proteínu s ďalšími molekulami, napríklad s enzýmami, substrátmi, receptormi, DNA, protilátkami, antigénmi, a podobne.

Každej aminokyseline môže byť priradený hydropatický index na základe jej hydrofobicity a náboja (Kyte a Doolittle, 1982), a tieto indexy sú: izoleucín (+4,5); valín (+4,2); leucín (+3,8); fenylalanín (+2,8); cysteín/cystín (+2,5); metionín (+1,9); alanín (+1,8); glycín (-0,4); treonín (-0,7); serín (-0,8); tryptofán (-0,9); tyrozín (-1,3); prolín (-1,6); histidín (-3,2); glutamát (-3,5); glutamín (-3,5); aspartát (-3,5); asparagín (-3,5); lyzín (-3,9); a arginín (-4,5).

V odbore je známe, že niektoré aminokyseliny môžu byť substituované inými aminokyselinami majúcimi podobný hydropatický index alebo skóre za získania proteínu s podobnou biologickou aktivitou, t.j. za získania biologicky funkčne ekvivalentného proteínu. Pri uskutočňovaní takýchto zmien sú výhodné substitúcie aminokyselín, ktorých hydropatické indexy sú ±2, hlavne ±1 a najlepšie ±0,5.

Tiež je v odbore dobre známe, že substitúcia podobných aminokyselín môže byť uskutočnená na základe hydrofilnosti. U.S. Patent 4,544,101, ktorý je tu uvedený ako odkaz, uvádza, že najväčšia lokálna priemerná hydrofilnosť proteínu, ktorá je určená susednými aminokyselinami, koreluje s biologickými charakteristikami proteínu. Ako je podrobne uvedené v US patente 4,554,101, sú aminokyselinovým zvyškom priradené nasledujúce hodnoty hydrofilnosti: arginín (+3,0); lyzín (+3,0); aspartát (+3,0 ± 1); glutamát (+3,0 ± 1); serín (+0,3); asparagín (+0,2); glutamín (+0,2); glycín (0); treonín (-0,4); prolín (-0,5 ± 1); alanín (-0,5); histidín (-0,5); cysteín (-1,0); metionín (-1,3); valín (-1,5); leucín (1,8); izoleucín (-1,8); tyrozín (-2,3); fenylalanín (-2,5); tryptofán (-3,4).

249/B

Je potrebné si uvedomiť, že aminokyselina môže byť substituovaná za inú aminokyselinu majúcu podobnú hydrofilnosť za získania biologicky a imunologický ekvivalentného proteínu. Pri takýchto zámenách sú preferované substitúcie aminokyselín, ktorých hodnoty hydrofilnosti sú ±2, lepšie ±1 a najlepšie ±0,5.

C. Fúzne proteíny

Špeciálnym typom inzerčného variantu je fúzny proteín. Táto molekula obvykle obsahuje všetky alebo významné časti pôvodnej molekuly, ktoré sú naviazané na N- alebo C-koniec, na celý alebo na časť pôvodného polypeptidu. Napríklad, fúzny proteín podľa predkladaného vynálezu obsahuje pridanú imunologický aktívnu doménu, ako je protilátkový fragment, pre zacielenie nádorových buniek.

Ďalej, použitie miesta na štiepenie v mieste alebo blízko miesta spojenia fúznych častí uľahčí odstránenie cudzieho polypeptidu po prečistení. Ďalšími výhodnými fúziami je naviazanie funkčných domén, ako sú aktívne miesta pre enzýmy, glykozylačné domény alebo iné bunkové zameriavacie signály alebo transmembránové regióny.

D. Prešmyk domén

Zaujímavá séria variantov môže byť vytvorená substituovaním homológnych regiónov rôznych proteínov. Toto je známe - v určitom kontexte ako prešmyk domén”.

Prešmyk domén zahrňuje tvorbu chimérickej molekuly za použitia odlišných, ale - v tomto prípade - príbuzných polypeptidov. Porovnaním rôznych SAg proteínov je možné uskutočniť odhad toho, ako sú tieto regióny molekuly funkčne významné. Potom je možné vymeniť príbuzné domény molekúl a určiť vplyv týchto domén na funkcie SAg. Takéto chiméry” sú ďalej výhodné v tom, že môžu byť odlíšené od prirodzených molekúl a zároveň majú rovnakú funkciu.

249/B

E. Prečistenie proteínov

Je žiadúee prečistiť SAg alebo jeho varianty. Techniky na prečistenie proteínov sú dobre známe odborníkom v odbore. Tieto techniky zahrňujú, na jednej strane, surovú frakcionáciu bunkovej hmoty na peptidové a nepeptidové frakcie. Po separácii proteínu od ďalších proteínov môže byť vybraný protein dalej prečistený za použitia chromatografických a elektroforetických techník, za dosiahnutia čiastočného alebo kompletného prečistenia (alebo prečistenia do homogenity). Analytickými metódami obzvlášť vhodnými na prípravu čistého peptidu sú iónomeničová chromatografia, vylučovacia chromatografia, elektroforéza na polyakrylamidovom géle; izoelektrické fokusovanie. Obzvlášť účinnou metódou na prečistenie peptidov je rýchla kvapalinová chromatografia pre proteíny alebo HPLC.

Niektoré aspekty predkladaného vynálezu sa týkajú prečistenia, a v niektorých aspektoch významného prečistenia, kódovaného proteínu alebo peptidu. Termín prečistený protein alebo peptid”, ako je tu použitý, označuje prípravok, izolovaný od iných zložiek, v ktorom je protein alebo peptid prečistený na akýkoľvek stupeň v porovnaní s akýmkoľvek stavom, v ktorom je možno ich získať z prirodzeného materiálu. Prečistený protein alebo peptid je preto tiež protein alebo peptid, ktorý je izolovaný z prostredia, v ktorom sa obvykle vyskytuje.

Termín prečistený” označuje proteínový alebo peptidový prípravok, ktorý bol spracovaný frakcionáciou na odstránenie rôznych ďalších zložiek, kde si tento prípravok v podstate zachováva svoju biologickú aktivitu. Keď je použitý termín významne prečistený”, tak tento termín označuje prípravok, v ktorom protein alebo peptid tvoria hlavnú zložku prípravku, napríklad tvoria približne 50 %, približne 60 %, približne 70 %, približne 80 %, približne 90 %, približne 95 % alebo viac proteínov v prípravku.

V odbore sú známe rôzne metódy na kvantifikovanie stupňa prečistenia proteínu alebo peptidu. Medzi takéto metódy patrí, napríklad, stanovenie

249/B špecifickej aktivity aktívnej frakcie alebo hodnotenie množstva polypeptidov vo frakcii SDS/PAGE analýzou. Výhodnou metódou na hodnotenie čistoty frakcie je vypočítanie špecifickej aktivity frakcie a porovnanie tejto aktivity so špecifickou aktivitou pôvodného extraktu a podlá tohto porovnania sa môže určiť stupeň čistoty, ktorý je hodnotený ako násobok prečistenia”. Skutočné jednotky použité na vyjadrenie aktivity budú samozrejme závislé od vybranej testovacej metódy a od toho, či exprimovaný proteín alebo peptid vykazuje detegovateľnú aktivitu.

Odborníkom v odbore budú známe rôzne techniky na prečistenie proteínov. Medzi takéto techniky patria, napríklad, zrážanie síranom amónnym, PEG, protilátkami a podobne alebo tepelnou denaturáciou, po ktorej nasleduje odstredenie; chromatografické stupne, ako je iónová výmena, gélová filtrácia, reverzné fázy, hydroxyapatitová a afinitná chromatografia; izoelektrické fokusovanie; gélová elektroforéza; a kombinácie takýchto a dálších techník. V odbore je známe, že poradie jednotlivých stupňov prečisťovania sa môže meniť, alebo že niektoré kroky môžu byť vynechané, a stále sa jedná o metódu vhodnú na prípravu významne prečisteného proteínu alebo peptidu.

Je známe, že migrácia polypeptidu môže byť rôzna, niekedy značne, pri použití rôznych podmienok SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Preto je jasné, že za rôznych elektroforetických podmienok môžu byť zreteľné molekulové hmotnosti prečistených alebo čiastočne prečistených produktov expresie rôzne.

Vysoko účinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je charakterizovaná veľmi rýchlou separáciou s mimoriadnym rozlíšením píkov. Tohto je dosiahnuté pomocou použitia veľmi jemných častíc a vysokého tlaku na udržanie adekvátneho prietoku. Separácia môže byť uskutočnená rádovo v minútach alebo maximálne niekoľko hodín. Okrem toto sú potrebné vzorky veľmi malého objemu, pretože častice sú tak malé a tesne pri sebe, že objem pórov je veľmi malou frakciou objemu lôžka. Tiež koncentrácia vzorky nemusí byť príliš veľká, pretože prúžky sú tak úzke, že je potrebné veľmi malé riedenie vzorky.

Gélová chromatografia, alebo chromatografia s molekulovými sitami, je špecifickým typom rozdeľovacej chromatografie, ktorá je založená na

249/B molekulovej veľkosti. Teoretickým základom gélovej chromatografie je to, že kolóna, ktorá je pripravená s jemnými časticami inertnej substancie, ktoré obsahujú malé póry, separuje väčšie molekuly od menších molekúl pri ich prechodoch pórmi, kde rýchlosť tohto prechodu závisí od veľkosti molekúl. Pretože materiál, z ktorého sú častice pripravené, neabsorbuje molekuly, je jediným faktorom ovplyvňujúcim rýchlosť prechodu veľkosť molekúl. Preto sú molekuly eluované z kolóny s klesajúcou veľkosťou, pretože ich tvar je relatívne konštantný. Gélová chromatografia je neprekonateľná pre separovanie molekúl rôznych veľkostí, pretože separácia je nezávislá od iných faktorov, ako je pH, iónová sila, teplota atď. Pri tejto metóde sa tiež prakticky nevyskytuje žiadna absorpcia, je prítomné menšie rozšírenie zón a elučný objem je v priamom vzťahu s molekulovou hmotnosťou.

Afinitná chromatografia je chromatografickou metódou, ktorá spočíva v špecifickej afinite medzi substanciou, ktorá má byť izolovaná, a molekulou, ktorá sa na ňu môže špecificky viazať. Ide o interakciu typu receptor-ligand. Materiál v kolóne je pripravený pomocou kovalentného naviazania jedného z väzbových partnerov na nerozpustnú matricu. Materiál kolóny je potom schopný špecificky absorbovať substanciu z roztoku. Elúcia prebieha zmenou podmienok na také, pri ktorých k väzbe nedochádza (zmena pH, iónovej sily, teploty atď.).

F. Mutagenéza variantov

Predkladaný vynález predpokladá, že modifikácia afinity superantigénu pre molekuly MHC triedy II môže znížiť toxicitu superantigénu. Zníženie afinity pre molekuly MHC triedy II môže viesť k zníženiu séroreaktivity alebo k zníženiu reakcie s neutralizačnými protilátkami alebo endogénnymi alebo skôr vytvorenými protilátkami.

V konkrétnych uskutočneniach je mutagenéza použitá na modifikáciu regiónu superantigénu, ktorý určuje väzbu na molekulu MHC triedy II. Mutagenéza sa môže uskutočniť za použitia niektorej zo štandardných techník

249/B mutagenézy. Mutácia je proces, pri ktorom dochádza k zmene v kvantite alebo štruktúre organizmu. Mutáciou môže byť modifikácia nukleotidovej sekvencie jediného génu, blokovanie génu alebo celých chromozómov. Zmeny v jednotlivých génoch môžu byť následkom bodových mutácií, pri ktorých dochádza k odstráneniu, pridaniu alebo substitúcii jedinej nukleotidovej bázy v DNA sekvencii, alebo môžu byť následkom zmien ako je inzercia alebo delécia väčšieho počtu nukleotidov.

Jednou obzvlášť výhodnou technikou mutagenézy je alanínová skenovacia mutagenéza, pri ktorej je určitý počet zvyškov substituovaný jednotlivo aminokyselinou alanínom tak, že môžu byť určené vplyvy interakcií odstránených vedľajších reťazcov za minimalizácie rizika väčších zmien v konformácii proteínu (Cunningham et al., 2989).

V posledných rokoch boli vyvinuté techniky na hodnotenie rovnovážnej konštanty pre väzbu ligandu za použitia malých množstiev proteínu (U.S. Patenty 5,221,605 a 5,238,808). Schopnosť uskutočňovať funkčné testy za použitia malých množstiev materiálu môže byť využitá pre účinné in vitro techniky saturačnej mutagenézy protilátok. Predkladatelia vynálezu obišli kroky klonovania kombináciou PCR mutagenézy a in vitro transkripcie/translácie na prípravu mutantných proteínov s vysokým výťažkom. Tu sú produkty PCR použité priamo ako templáty pre in vitro transkripciu/transláciu mutantnej jednoreťazcovej protilátky. V dôsledku vysokej účinnosti, s ktorou môže byť teraz pripravených a analyzovaných všetkých 19 aminokyselinových substitúcií je teraz možné uskutočniť saturačnú mutagenézu mnohých zvyškov a tento proces sa označuje ako in vitro saturačná skenovacia mutagenézy (Burks et al., 1997).

In vitro skenovacia saturačná mutagenéza je rýchlou metódou na získanie veľkého množstva informácií o štruktúre-funkcii, vrátane: (i) identifikácie zvyškov, ktoré modulujú špecificitu väzby ligandu; (ii) lepšie pochopenie väzby ligandu podľa identifikácie tých aminokyselín, ktoré zachovávajú aktivitu a tých, ktoré rušia aktivity v danej lokalizácii; (iii) hodnotenie celkovej plasticity aktívneho miesta alebo proteínovej subdomény;

249/B (iv) identifikácie aminokyselinových substitúcií, ktoré vedú k zvýšenej väzbe.

Štrukturálne riadená miestne cielená mutagenéza predstavuje účinný nástroj na zistenie a upravovanie interakcií proteín-ligand (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). Technika umožňuje prípravu a testovanie variantov sekvencie pomocou vkladania jednej alebo viacerých zmien nukleotidovej sekvencie do vybranej DNA.

Miestne špecifická mutagenéza využíva špecifické oligonukleotidové sekvencie, ktoré kódujú DNA sekvencie s požadovanou mutáciou, rovnako ako dostatočný počet susedných, nemodifikovaných nukleotidov. Týmto spôsobom je poskytnutá primérová sekvencia dostatočne dlhá a komplexná nato, aby vytvárala stabilnú dvojzávitnicu na oboch stranách delécie, ktorá má byť spojená. Výhodné sú priméry dĺžky približne 17 až 25 nukleotidov, s približne 5 až 10 zvyškami na oboch stranách sekvencie, ktorá je zmenená.

Technika obvykle využíva bakteriofágový vektor, ktorý existuje ako v jednoreťazcovej, tak v dvojreťazcovej forme. Vektory použiteľné v miestne cielenej mutagenéze sú vektory ako je M13 fág. Tieto fágové vektory sú komerčne dostupné a sú známe odborníkom v odbore. Dvojreťazcové plazmidy sa tiež bežne používajú v miestne cielenej mutagenéze. Čo eliminuje krok prenosu vybraného génu z fág do plazmidu.

Všeobecne, najskôr sa pripraví jednoreťazcový vektor, alebo sa rozvoľnia dva reťazce dvojreťazcové h o vektora, ktorý obsahuje vo svojej sekvencii DNA kódujúcu požadovaný protein alebo genetický element. Oligonukleotidový primér nesúci požadovanú mutovanú sekvenciu, pripravený synteticky, sa potom tepelne spracuje s prípravkom jednoreťazcovej DNA, pričom sa berú do úvahy počty chýb, ktoré sú dané výberom podmienok hybridizácie. Hybridizovaný produkt sa potom spracuje DNA polymerizujúcimi enzýmami, ako je E. coli polymeráza I (Klenow fragment) na dokončenie syntézy reťazca nesúceho mutáciu. Takto vznikne heteroduplex, v ktorom jeden reťazec kóduje pôvodnú nemutovanú sekvenciu a druhý duplex nesie požadovanú mutáciu. Tento heteroduplexný vektor sa potom použije na transformáciu vhodných hostiteľských buniek, ako sú E. coli bunky, a vyberú sa

249. B klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory nesúce mutovanú sekvenciu.

Dôkladná informácia o funkčnom význame a informačnom obsahu daného zvyšku sa získa najlepšie saturačnou mutagenézou, pri ktorej sa hodnotí všetkých 19 aminokyselinových substitúcií. Nevýhodou tejto techniky je to, že logistika multizvyškovej saturačnej mutagenézy je zvierajúca (Warren et al., 1996, Brown et al., 1996, Zeng et al., 1996; Burton a Barbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). Musia sa testovať stovky a niekedy i tisíce miestne špecifických mutantov. Avšak, lepšie techniky umožňujú rýchlejší a ľahší skríning mutantov. Pozri tiež U.S. patenty 5,796,208 a 5,830,650, kde je opísaná walkthrough” mutagenéza.

Ďalšie metódy miestne cielenej mutagenézy sú opísané v U.S. Patentoch 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377 a 5,789,66.

Okrem biologicky funkčných ekvivalentov, ktoré sú produkované za použitia techník mutagenézy opísaných vyššie, predkladatelia vynálezu tiež predpokladajú, že môžu byť pripravené štrukturálne podobné zlúčeniny, ktoré napodobňujú kľúčové časti superantigénu alebo konjugátu podľa predkladaného vynálezu. Takéto zlúčeniny, ktoré môžu byť označované ako peptidomimetiká, môžu byť použité rovnakým spôsobom ako konjugáty podľa predkladaného vynálezu a tiež sú teda funkčnými ekvivalentmi.

Niektoré mimetiká, ktoré napodobňujú niektoré rysy sekundárnej a terciárnej štruktúry proteínu, sú opísané v Johnson et al. (1993). Podkladom na použitie peptidových mimetík je to, že peptidový skelet proteínu existuje preto, aby orientoval aminokyselinové vedľajšie reťazce tak, aby boli uľahčené molekulové interakcie, ako sú interakcie protilátky a/alebo antigénu. Peptidové mimetikum je preto navrhnuté tak, aby umožnilo molekulové interakcie podobné interakciám pôvodnej molekuly.

Niektoré úspešné aplikácie konceptu peptidomimetík sa zamerali na napodobnenie β-slučiek v proteínoch, o ktorých je známe, že sú vysoko

249/B antigénne. Pravdepodobná β-štruktúra v polypeptide môže byť predpovedaná počítačovým algoritmom, ako je tu opísané. Akonáhle sú určené aminokyselinové zložky slučky, môžu byť pripravené mimetiká majúce podobnú priestorovú orientáciu základných elementov aminokyselinových vedľajších reťazcov.

Iné prístupy sa zamerali na použitie malých proteínov obsahujúcich veľa disulfidových väzieb ako atraktívnych štrukturálnych templátov na produkciu biologicky aktívnej konformácie, ktorá napodobňuje väzbové miesto väčšieho proteínu (Vitá et al., 1998). Štrukturálny motív, ktorý sa zdá byť evolučné konzervovaný v niektorých toxínoch, je malý (30-40 aminokyselín), stabilný a vysoko permisívny pre mutácie. Tento motív sa skladá z beta listu a alfa závitnice, ktorá je premostená vo vnútornom jadre tromi disulfidovými väzbami.

Beta II slučky boli úspešné napodobnené za použitia cyklických Lpentapeptidov a D-aminokyselín (Weisshoff et al., 1999). Tiež Johannesson et al. (1999) opísal bicyklické tripeptidy s vlastnosťami indukujúcimi reverznú slučku.

V odbore sú opísané spôsoby pre generovanie špecifických štruktúr. Napríklad, alfa-helix mimetiká sú opísané v U.S. Patentoch 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833 a 5,859,184. Tieto štruktúry činia peptid alebo proteín viac termálne stabilným a zvyšujú rezistenciu k proteolytickej degradácii. Sú opísané šesť-, sedem-, jedenásť-, dvanásť-, trinásť- a štrnásť-členné kruhové štruktúry.

Sú opísané spôsoby prípravy konformačne restrihovaných beta slučiek a beta výčlenkov, napríklad, v U.S. Patentoch 5,440,013; 5,618,914 a 5,670,155. Beta-slučky umožňujú zmenu vedľajších substituentov bez zodpovedajúcej zmeny skeletu a majú vhodné konce pre inkorporáciu do peptidov pomocou štandardných syntetických procesov. Medzi ďalšie typy mimetík patria reverzné a gamma slučky. Mimetiká reverznej slučky sú opísané U.S. Patentoch 5,475,085 a 5,929,237, a mimetiká gama slučky sú opísané v U.S. Patentoch 5,672,681 a 5,674,976.

249/B

G. Expresia superantigénov

Predkladaný vynález tiež zahrňuje použitie expresných vektorov a hostiteľskej bunky. Tieto expresné vektory, ktoré boli geneticky upravené tak, aby obsahovali sekvencie nukleovej kyseliny konjugátov, sú vložené alebo transformované do hostiteľskej bunky tak, aby došlo k produkcii konjugátov podľa predkladaného vynálezu.

Hostiteľské bunky môžu byť geneticky upravené tak, aby inkorporovali sekvencie nukleovej kyseliny a exprimovali peptidy podľa predkladaného vynálezu. Vloženie sekvencii nukleovej kyseliny do hostiteľskej bunky môže byť uskutočnené transfekciou fosforečnanom vápenatým, DEAE-dextránom sprostredkovanou transfekciou, transvekciou, mikroinjekciou, transfekciou sprostredkovanou katiónovými lipidmi, elektroporáciou, transdukciou, vnesením pomocou nástroja, balistickým vnesením, infekciou alebo inou technikou. Takéto techniky sú opísané v mnohých štandardných laboratórnych manuáloch, ako je Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) a Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2^nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).

Reprezentatívnymi príkladmi vhodných hostiteľských buniek sú bakteriálne bunky, ako sú streptokoky, stafylokoky, E. coli, streptomyces a Bacillus subtilis·, huby, ako sú kvasinky a aspergilly; hmyzie bunky, ako sú Drosophila S2 a Spodoptera Sf9 bunky; živočíšne bunky, ako sú CRC, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 a Bowes melanómové bunky.

II. Protinádorová liečba

V predkladanom vynáleze je superantigén konjugovaný na protilátku alebo fragment protilátky pre zacielenie a deštrukciu nádorových buniek. Príklady nádorov sú nádory pľúc, prsníka, hrubého čreva, obličiek, pankreasu, vaječníkov, žalúdka a krčka maternice a prostaty.

249/B

V jednom aspekte predkladaného vynálezu musia nádorové bunky niesť nejaký marker, ktorý je vhodný pre zameranie, nie je prítomný na väčšine ďalších buniek. Existuje veľa nádorových markerov a akýkoľvek z nich môže byť vhodný pre zameranie v kontexte predkladaného vynálezu. Špecifickými cieľmi podľa predkladaného vynálezu sú protilátky. Protilátky, ktoré sú brané do úvahy v predkladanom vynáleze, sú napríklad Fab fragmenty. Príklady Fab fragmentov sú C215Fab alebo ST4Fab. Okrem Fab patria medzi ďalšie obvyklé nádorové markery karcinoembryonálny antigén, prostatický špecifický antigén, antigén asociovaný s nádormi močového traktu, fetálny antigén, tyrozináza (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialyl Lewis antigén, MucA, MucB, PLAP, estrogénový receptor, laminínový receptor, erb B a P155.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je použitie imunostimulačnej molekuly ako činidla, alebo lepšie v konjunkcii s iným činidlom, ako je napríklad cytokín, ako je napríklad IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, tumor nekrosis faktor; interferóny alfa, beta a gama; P43K a iné analógy cytokínov; chemokín, ako je napríklad MIP-1, MIP-1beta, MCP-1, RANTES, IL-8; alebo rastový faktor, ako je napríklad FLT3 ligand. Stimulačná molekula môže byť konjugovaná na konjugát podľa predkladaného vynálezu alebo môže byť podaná ako adjuvans v kombinácii s konjugátom podľa predkladaného vynálezu.

Jedným konkrétnym cytokínom predpokladaným na použitie v predkladanom vynáleze je IL-2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL-2. lnterleukín-2 (IL-2), pôvodne označovaný ako T-lymfocytárny rastový faktor, je vysoko účinný induktor proliferácie T-lymfocytov a ide o rastový faktor pre všetky subpopulácie Tlymfocytov. IL-2 je antigén-independentný profilačný faktor, ktorý indukuje progresiu bunkového cyklu a tak umožňuje klonálnu expanzii aktivovaných Tlymfocytov. Keďže čerstvo izolované leukemické bunky tiež secernujú IL-2 a reagujú naň, môže IL-2 účinkovať ako autokrínny rastový modulátor pre tie bunky, ktoré môžu zhoršovať ATL. IL-2 tiež podporuje proliferáciu aktivovaných B-lymfocytov, aj keď tento účinok vyžaduje prítomnosť ďalších faktorov, napríklad IL-4. In vitro IL-2 tiež stimuluje rast oligodendrogliových buniek.

249/B

Vzhľadom k svojim účinkom na T-lymfocyty a B-lymfocyty je IL-2 centrálnym regulátorom imunitných reakcií. Tiež má svoju úlohu v protizápalových reakciách, v hematopoéze a v dohľade nad nádormi. IL-2 stimuluje syntézu IFN-γ v periférnych leukocytoch a tiež indukuje sekréciu IL-1, TNF-α a TNF-β. Indukcia sekrécie tumoricídnych cytokínov je, okrem aktivity v expanzii LAK buniek (lymfokíny aktivovaných zabíjačov), hlavným faktorom zodpovedným za protinádorovú aktivitu IL-2.

Predpokladá sa, že prípravky podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané pacientovi trpiacemu nádorovým alebo proliferatívnym ochorením. Dávkou podanou pacientovi je terapeuticky účinné množstvo alebo množstvo, ktoré vedie k liečbe nádoru alebo ochorenia. Podanie konjugátu môže byť parenterálnou alebo alimentárnou cestou. Príklady alimentárnych ciest sú napríklad, orálne, rektálne, sublinguálne a bukálne podanie. Príklady parenterálnych podaní sú intraperitoneálne, intravenózne, podkožné, intramuskulárne, intradermálne, intratumorálne a intravaskulárne podanie.

III. Farmaceutické prostriedky

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité samostatne aiebo spoločne s ďalšími zlúčeninami, ako sú terapeutické zlúčeniny.

Medzi farmaceutické formy vhodné na injekčné použitie patria sterilné vodné roztoky a/alebo disperzie; prostriedky obsahujúce sezamový olej, podzemnicový olej a/alebo vodný roztok propylénglykolu; a/alebo sterilné prášky pre okamžitú prípravu sterilných injekčných roztokov a/alebo disperzií. Vo všetkých prípadoch musí byť forma sterilná a/alebo musí byť dostatočne tekutá na to, aby ju bolo možné podať injekčnou striekačkou. Forma musí byť stabilná za podmienok výroby a/alebo skladovania a/alebo musí byť chránená pred kontaminujúcimi účinkami mikroorganizmov, ako sú baktérie a/alebo huby.

Roztoky aktívnej zlúčeniny vo forme voľnej bázy a/alebo farmakologicky prijateľnej soli môžu byť pripravené vo vodne vhodne zmiešanej so surfaktantom, ako je hydroxypropylcelulóza. Disperzie môžu byť pripravené v

249/B glycerole, kvapalnom polyetylénglykole, a/alebo ich zmesi a/alebo v oleji. Za bežných podmienok skladovania a/alebo použitia obsahujú tieto prípravky konzervačné činidlá na zabránenie rastu mikroorganizmov.

Konjugát podľa predkladaného vynálezu môže byť použitý v prostriedku v neutrálnej forme a/alebo vo forme soli. Medzi farmaceutický prijateľné soli patria adičné soli s kyselinami (tvorené s voľnými aminoskupinami proteínov) a/alebo soli tvorené s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková a/alebo fosforečná, a/alebo s organickými kyselinami, ako je kyselina octová, šťavelová, vínna, mandlová a podobne. Soli tvorené s voľnými karboxylovými skupinami môžu byť tiež odvodené od anorganických báz, ako je napríklad sodík, draslík, amoniak, vápnik a/alebo hydroxidy železa, a/alebo od organických báz, ako je izopropylamín, trimetylamín, histidín, prokaín a/alebo podobne. Pre použitie peptidových terapeutík ako aktívnych zložiek pozri technológiu opísanú v U.S. Patentoch 4,606,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 a/alebo 4,578,770, ktoré sú tu všetky uvedené ako odkaz.

Nosičom môže byť tiež rozpúšťadlo a/alebo disperzné médium obsahujúce, napríklad vodu, etanol, polyol (napríklad glycerol, propylénglykol, a/alebo kvapalný polyetylénglykol, a/alebo podobne), ich vhodné zmesi a/alebo rastlinné oleje. Správna tekutosť sa môže udržiavať napríklad použitím povlaku, ako je lecitín, dodržaním správnej veľkosti častíc v prípade disperzií a/alebo pomocou použitia surfaktantov. Prevencia rastu mikroorganizmov sa môže dosiahnuť pridaním rôznych antibakteriálnych a/alebo antimykotických činidiel, napríklad parabénov, chlórbutanolu, fenolu, kyseliny sorbovej, timerosalu a/alebo podobne. V mnohých prípadoch je vhodné pridať činidlo upravujúce izotonicitu, napríklad sacharidy a/alebo chlorid sodný. Predĺženú absorpciu injekčných prípravkov možno dosiahnuť použitím činidiel odďaľujúcich absorpciu, napríklad monostearátu hlinitého a/alebo želatíny.

Sterilné injekčné roztoky sa pripravia inkorporovaním požadovaného množstva aktívnej zlúčeniny do vhodného rozpúšťadla s rôznymi ďalšími prísadami uvedenými vyššie, a potom sa uskutoční sterilizácia. Všeobecne,

249/B disperzia sa pripraví inkorporovaním rôznych sterilizovaných aktívnych zložiek do sterilného vehikulá, ktoré obsahuje základné disperzné médium a/alebo vybrané ďalšie zložky zo zložiek uvedených vyššie. V prípade sterilných práškov na prípravu sterilných injekčných roztokov je výhodným spôsobom prípravy sušenie vo vákuu a/alebo lyofilizácia, ktoré vedú k získaniu prášku aktívnej zložky s akoukoľvek ďalšou prísadou z vopred sterilné prefiltrovaného roztoku týchto zložiek. Príprava viac, a/alebo vysoko koncentrovaných roztokov pre priamu injekciu je tiež možná a použije sa pri nej DMSO ako rozpúšťadlo, pretože sa tak dosiahne extrémne rýchla penetrácia, dodanie vysokých koncentrácií aktívnych zložiek do malej oblasti.

Po príprave prostriedku sa roztoky aplikujú spôsobom kompatibilným s formou prípravku a/alebo v takom množstve, ktoré je terapeuticky efektívne. Prostriedky môžu byť ľahko podané v rôznych dávkových formách, ako typy injekčných roztokov opísaných vyššie, ale môžu byť tiež použité kapsuly uvoľňujúce liečivo a podobné formy.

Na parenterálne podanie vo vodnom roztoku by roztok mal byť vhodne pufrovaný, pokiaľ je to nutné, a/alebo by mal byť nariedený salinickým roztokom a/alebo glukózou, aby bol vhodne izotonický. Uvedené vodné roztoky sú obzvlášť vhodné na intravenózne, intramuskulárne, podkožné a/alebo intraperitoneálne podanie. Sterilné vodné médiá, ktoré môžu byť použité na tento účel, sú známe odborníkom v odbore. Napríklad, jedna dávka môže byť rozpustená v 1 ml izotonického NaCI roztoku a/alebo môže byť pridaná do 1000 ml hypodermoklyzačnej tekutiny a/alebo môže byť injikovaná vo vybranom mieste infúzie (pozri napríklad Remintgon's Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, strany 1035-1038 a/alebo 1570-1580). V dávke sa budú vyskytovať určité variácie, v závislosti od stavu liečeného jedinca. Osoba zodpovedná za aplikáciu v každom prípade určí dávku vhodnú pre konkrétneho jedinca.

Aktívny konjugát a/alebo činidlá môžu byť formulované v terapeutickej zmesi tak, že prostriedok obsahuje približne 0,0001 až 1,0 mg, a/alebo približne 0,001 až 0,1 mg, a/alebo približne 0,1 až 1,0 a/alebo i približne 10 mg na dávku. Môže byť aplikovaných viac dávok.

249/B

Okrem zlúčenín formulovaných pre parenterálne podanie ako je intravenózna, intraartikulárna a/alebo intramuskulárna injekcia, patria medzi ďalšie farmaceutický prijateľné formy napríklad tablety a/alebo iné pevné prípravky na orálne podanie; lipozomálne prípravky; kapsuly s načasovaným uvoľňovaním; a/alebo akékoľvek ďalšie v súčasnosti používané formy, vrátane krémov.

V predkladanom vynáleze je tiež možné použiť nazálne roztoky a/alebo spreje, aerosóly a/alebo inhalačné prípravky. Nazálne roztoky sú obvykle vodné roztoky určené na podanie do nosných priechodov vo forme kvapiek a/alebo sprejov. Nazálne prípravky sú pripravené tak, že sú v mnohých ohľadoch podobné nazálnemu sekrétu, takže je zachovaná normálna funkcia riasinkového epitelu. Preto sú nazálne roztoky obvykle izotonické a/alebo mierne pufrované tak, aby mali pH 5,5 až 6,5. Okrem toho môžu nazálne prostriedky obsahovať antimikrobiálne konzervačné látky, podobné ako sú látky používané v oftalmologických prípravkoch. Sú známe rôzne komerčné nazálne prostriedky a patria medzi ne, napríklad, antibiotiká a/alebo antihistaminiká a/alebo liečivá na profylaxiu astmy.

Ďalšie prípravky, ktoré sú vhodné pre iné spôsoby podania, sú vaginálne čapíky a/alebo pesary. Tiež môžu byť použité rektálne čapíky a/alebo pesary. Čapíky sú pevné dávkové formy rôznej hmotnosti a/alebo tvaru, ktoré obvykle obsahujú medikáciu a ktoré sa zavádzajú do rekta, vagíny a/alebo uretry. Po zavedení čapík mäkne, topí sa a/alebo sa rozpúšťa v dutine. Pre čapíky môžu byť použité tradičné spojivá a/alebo nosiče, ako sú, napríklad polyalkylénglykoly a/alebo triglyceridy; takéto čapíky môžu byť pripravené zo zmesí obsahujúcich aktívnu zložku v množstve 0,5 % až 10 %, výhodne 1 % - 2 %.

Orálne prostriedky obsahujú bežne používané prísady, ako sú, napríklad manitol, laktóza, škrob, magnézium-stearát, nátrium-sacharin, celulóza, uhličitan horečnatý a podobne, všetko vo farmaceutickej čistote. Tieto prostriedky môžu mať formu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, prostriedkov so spomaleným uvoľňovaním a/alebo práškov. V niektorých definovaných uskutočneniach obsahuje orálny farmaceutický prostriedok

249/B inertné riedidlo a/alebo požívateľný nosič, alebo môžu byť prostriedky obalené v mäkkej alebo tuhej želatínovej kapsule, lisované do tabliet, a/alebo môžu byť priamo zapracované do potravy. Na orálne terapeutické podanie môžu byť aktívne zlúčeniny v zmesi s prísadami a/alebo môžu byť použité vo forme požívateľných tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, sirupov, oplátok a podobne. Takéto prostriedky a/alebo prípravky by mali obsahovať aspoň 0,1 % aktívnej zlúčeniny. Percentuálny obsah v prostriedku alebo v prípravku môže byť rôzny, ale obvykle je v rozmedzí od približne 2 do približne 75 % hmotnosti dávkovej jednotky, alebo medzi 25-60 %. Množstvo aktívnych zlúčenín v takýchto terapeuticky použiteľných prípravkoch sú také, aby sa mohla dosiahnuť vhodná dávka.

Tablety, pastilky, pilulky, kapsuly a podobne môžu tiež obsahovať nasledujúce zložky: spojivo, ako je tragant, arabská guma, kukuričný škrob a/alebo želatína; prísady, ako je fosforečnan vápenatý; činidlo podporujúce rozpadavosť, ako je kukuričný škrob, zemiakový škrob, kyselina algínová a podobne; klzné činidlo, ako je magnézium-stearát; a/alebo sladidlo, ako je sacharóza, laktóza a/alebo sacharín; a/alebo chuťové korigens, ako je pepermint, mätová silica a/alebo čerešňová príchuť. Keď je dávkovou jednotkou kapsula, tak môže obsahovať okrem materiálov uvedených vyššie, kvapalný nosič. Môžu byť použité rôzne ďalšie materiály, vo forme povlakov a/alebo ako materiály inak modifikujúce fyzikálnu formu dávkovej jednotky. Napríklad tablety, pilulky a/alebo kapsuly môžu byť potiahnuté šelakom, sacharidom alebo oboma. Sirup alebo elixír môže obsahovať okrem aktívnej zložky sacharózu ako sladidlo, metyl a/alebo propylparabény ako konzervačné činidlo, a farbivo a/alebo chuťové korigens, ako je čerešňová a/alebo pomarančová príchuť.

V niektorých uskutočneniach sa predpokladá použitie lipidových prípravkov a/alebo nanokapsúl na podanie konjugátu a/alebo činidiel a/alebo vektorov pre génovú terapiu, vrátane prirodzených a/alebo protizmyslových vektorov, do hostiteľskej bunky.

249/B

Nanokapsuly môžu všeobecne zachycovať zlúčeninu stabilným a/alebo reprodukovateľným spôsobom. Na elimináciu vedľajších účinkov spôsobených nadmerným intracelulárnym obsahom polyméru by mali byť použité ultrajemné častice (veľkosť okolo 0,1 gm) a mali by byť použité polyméry, ktoré môžu byť degradované In vivo. Biodegradovateľné polyalkylkyanakrylátové nanočastice spĺňajú tieto požiadavky a môžu byť použité v predkladanom vynáleze a/alebo môžu byť takéto častice ľahko vyrobené.

V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu môže byť konjugát asociovaný s lipidom. Konjugáty asociované s lipidmi môžu byť enkapsulované vo vodnom vnútri lipozómu, v lipidovej dvojvrstve lipozómu, môžu byť naviazané na lipozóm pomocou spojovacej molekuly, ktorá je asociovaná s lípozómom i oligonukleotidom, môžu byť zachytené v lipozóme, môžu byť v komplexe s lipozómom, môžu byť dispergované v roztoku obsahujúcom lipid, môžu byť v zmesi s lipidom, môžu byť obsiahnuté ako suspenzia v lipide, môžu byť obsiahnuté alebo v komplexe s lipidom alebo môžu byť inak asociované s lipidom. Lipidové alebo lipid/konjugát asociované prostriedky podľa predkladaného vynálezu nie sú obmedzené na akúkoľvek štruktúru v roztoku. Napríklad môžu byť vo forme dvojvrstvovej štruktúry, vo forme micely alebo vo forme kolabovanej štruktúry. Môžu byť tiež iba voľne uložené v roztoku, čo umožní tvorbu agregátov, ktoré nemajú uniformný tvar ani veľkosť.

Lipidy sú mastné substancie, a môžu byť syntetické alebo prirodzené. Lipidy sú napríklad mastné kvapky, ktoré sa v prirodzenom stave vyskytujú v cytoplazme, rovnako ako zlúčeniny, ktoré sú dobre známe odborníkom v odbore a ktorými sú alifatické uhľovodíky s dlhým reťazcom a ich deriváty, ako sú mastné kyseliny, alkoholy, aminy, aminoalkoholy a aldehydy.

Fosfolipidy sa môžu použiť na prípravu lipozómov podľa predkladaného vynálezu a môžu mať pozitívny, negatívny alebo neutrálny elektrický náboj. Diacetylfosfát môže byť použitý na dosiahnutie negatívneho náboja na lipozómoch a stearylamín môže byť použitý na dosiahnutie pozitívneho náboja na lipozómoch. Lipozómy môžu byť pripravené z jedného alebo viacerých

249/B fosfolipidov.

Neutrálne nabitým lípidom môže byť lipid bez náboja, lipid s malým nábojom alebo zmes lipidov s rovnakým počtom pozitívnych a negatívnych nábojov. Medzi fosfolipidy patria fosfatidylcholíny a ďalšie lipidy známe odborníkom v odbore.

Lipidy vhodné na použitie v predkladanom vynáleze môžu byť získané z komerčných zdrojov. Napríklad, dimyristyl-fosfatidylcholín (”DMPC’j môže byť získaný od Sigma Chemical Co., diacetylfosfát (”DCP’j môže byť získaný od K and K Laboratories (Plainview, NY); cholesterol (”Choľ) môže byť získaný od Calbiochem-Behring; dimyristyl-fosfatidylglycerol (DMPG’j a ďalšie lipidy môžu byť získané od Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Zásobné roztoky lipidov v chloroforme alebo chloroforme/metanole môžu byť skladované pri približne -20 °C. Výhodne sa ako jediné rozpúšťadlo použije chloroform, pretože je možné ho ľahšie odpariť než metanol.

Fosfolipidy z prirodzených zdrojov, ako sú vaječné alebo sójové fosfolipidy, mozgová kyselina fosfatidová, mozgový alebo rastlinný fosfatidylinozitol, srdcový kardiolipin a rastlinný alebo bakteriálny fosfatidyletanolamín, nie sú používané ako primárny fosfatid, t.j. netvoria 50 % alebo viacej celkových fosfatidov, pretože sú nestabilné a spôsobujú priepustnosť výsledných lipozómov.

Fosfolipidy môžu vytvárať rôzne štruktúry iné než lipozómy, keď sú dispergované vo vode, v závislosti od molárneho pomeru lipidu a vody. Pri nízkych pomeroch je lipozóm výhodnou štruktúrou. Fyzikálne charakteristiky lipozómov závisia od pH, iónovej sily a/alebo od prítomnosti divalentných katiónov. Lipozómy môžu vykazovať nízku permeabilitu pre iónové a/alebo polárne substancie, ale pri zvýšenej teplote u nich môže dochádzať k fázovému prechodu, ktorý značne zvyšuje ich permeabilitu. Fázovým prechodom je zmena z pevne zloženej, pravidelnej štruktúry, ktorá sa označuje ako gélový stav, na menej zbalenú, menej pravidelnú štruktúru, ktorá sa označuje ako kvapalný stav. K tomu dochádza pri charakteristickej teplote fázového prechodu A, pričom výsledkom je zvýšenie permeability pre ióny, sacharidy a/alebo

249/B liečivá.

Lipozómy interagujú s bunkami štyrmi rôznymi mechanizmami: endocytózou fagocytárnymi bunkami retikuloendotelového systému, ako sú makrofágy a/alebo neutrofily; adsorpciou na povrch buniek, sprostredkovanou buď nešpecifickými slabými hydrofóbnymi a/alebo elektrostatickými silami, alebo špecifickými interakciami so zložkami bunkového povrchu; fúziou s plazmatickou bunkovou membránou, ktorá prebieha prostredníctvom inzercie lipidovej dvojvrstvy lipozómu do plazmatickej membrány, za simultánneho uvoľnenia obsahu lipozómu do cytoplazmy; a/alebo prenosom lipozomálnych lipidov do bunkových a/alebo subcelulárnych membrán, a/alebo naopak, bez akejkoľvek asociácie obsahu lipozómu. Podľa zmeny zloženia lipozómu sa môže meniť mechanizmus interakcie, aj keď tieto mechanizmy môžu byť súbežné.

Lipozómami-sprostredkované podanie oligonukleotidov a expresia cudzorodej DNA in vitro boli veľmi úspešné. Wong et al., (1980) dokázali uskutočniteľnosť lipozómami-sprostredkovanej aplikácie a expresie cudzorodej DNA v kultivovaných kuracích embryách, HeLa a hepatómových bunkách. Nicolau et al., (1987) uskutočnili úspešný lipozómami sprostredkovaný génový prenos u krýs po intravenóznej injekcii.

V niektorých uskutočneniach predkladaného vynálezu môže byť lipid asociovaný s hemaglutinačným vírusom (HVJ). Bolo dokázané, že toto uľahčuje fúziu s bunkovou membránou a podporuje vstup DNA obalenej v lipozóme (Kaneda et al., 1989). V iných uskutočneniach môže byť lipid v komplexe alebo konjugovaný s non-histónovými chromozomálnymi proteínmi (HMG-1) (Kato et al., 1991). V ešte ďalších uskutočneniach môže byť lipid v komplexe alebo konjugovaný s HVJ i HMG-1. Takéto expresné vektory boli úspešne použité na prenos a expresiu oligonukleotidov in vitro a in vivo a sú teda použiteľné v predkladanom vynáleze. Keď je v DNA konštrukte použitý bakteriálny promótor, tak je tiež žiadúce, aby bola obsiahnutá v lipozóme vhodná bakteriálna polymeráza.

249/B

Lipozómy použité podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené rôznymi spôsobmi. Veľkosť lipozómov závisí od spôsobu ich syntézy. Lipozóm suspendovaný vo vodnom roztoku má obvykle sférický tvar a má jednu alebo viac koncentrických vrstiev molekúl lipidovej dvojvrstvy. Každá vrstva sa skladá zo zoskupenia molekúl reprezentovaných vzorcom XY, kde X je hydrofilná skupina a Y je hydrofóbna skupina. Vo vodnej suspenzii sú koncentrické vrstvy usporiadané tak, že hydrofilné skupiny majú tendenciu zostávať v kontakte s vodnou fázou a hydrofóbne regióny majú tendenciu k asociácii medzi sebou. Napríklad, keď sú vodné fázy prítomné vo vnútri a vonku lipozómu, tak môžu lipidové molekuly tvoriť dvojvrstvu, ktorá je označovaná ako lamela, usporiadaná XY-YX. Agregáty lipidov sa môžu tvoriť vtedy, ked sa hydrofilné a hydrofóbne časti viac než jednej lipidovej molekuly asociujú medzi sebou. Veľkosť a tvar týchto agregátov závisí od mnohých rôznych premenných, ako je charakter rozpúšťadla a prítomnosť ďalších zlúčenín v roztoku.

Lipozómy podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené za použitia dobre známych laboratórnych techník. V jednom výhodnom uskutočnení sú lipozómy pripravené zmiešaním lipozomálnych lipidov v rozpúšťadle v zásobnej nádobe, napríklad v sklenenej banke. Zásobník by mal mať objem 10-krát väčší než je predpokladaný objem suspenzie lipozómov. Pomocou rotačnej odparky sa odstráni rozpúšťadlo pri približne 41 °C za negatívneho tlaku. Rozpúšťadlo sa normálne odstráni počas približne 5 minút až 2 hodín, podľa požadovaného objemu lipozómov. Prípravok sa môže potom sušiť v sušičke vo vákuu. Vysušené lipidy sa môžu zlikvidovať po približne 1 týždni, pretože ich kvalita sa časom zhoršuje.

Sušené lipidy môžu byť hydratované pri približne 25-50 mM fosfolipidu v sterilnej, apyrogénnej vode tak, že sa uskutoční trepanie do tej doby, než je všetok lipidový film resuspendovaný. Vodný roztok lipozómov môže byť potom rozdelený do podielov, ktoré môžu byť umiestnené do flaštičiek, môže sa uskutočniť lyofilizácia a flaštičky sa môžu uzatvoriť vo vákuu.

Alternatívne môžu byť lipozómy pripravené za použitia štandardných laboratórnych metód: metódou podľa Benghatn et al., (1965), ktorá je tu

249/B uvedená ako odkaz; metódou podľa Gregoriadisa, ako je opísaná v DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICÍNE, G. Gregoriadis ed. (1979) str. 287341, ktorá je tu uvedená ako odkaz a metódou odparenia reverznej fázy, ako je opísaná v Szoka and Papahadjopoulos (1978). Vyššie uvedené metódy sa líšia v schopnosti zachytávať vodný materiál a v pomeroch voda-lipid.

Sušené lipidy alebo lyofilizované lipozómy pripravené spôsobmi opísanými vyššie môžu byť dehydratované a rekonštituované v roztoku vo vhodnej koncentrácii s vhodným rozpúšťadlom, napríklad s DPBS. Zmes sa potom dôkladne pretrepe vo vírivom miešacom zariadení. Nezachytená nukleová kyselina sa odstráni pri 29000xg a lipozomálne pelety sa premyjú. Premyté lipozómy sa resuspendujú pri vhodnej koncentrácii celkových fosfolipidov, napríklad pri koncentrácii približne 50-200 mM. Množstvo enkapsulovanej nukleovej kyseliny môže byť stanovené pomocou bežných metód. Po stanovení množstva nukleovej kyseliny zachytenej v lipozómoch môžu byť lipozómy nariedené na vhodné koncentrácie a uskladnené pri teplote 4 °C do použitia.

Farmaceutický prostriedok obsahujúci lipozómy bude obvykle obsahovať sterilné, farmaceutický prijateľné nosiče alebo riedidlá, ako je voda alebo salinický roztok.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady ukazujú výhodné uskutočnenia predkladaného vynálezu. Odborníkom v odbore bude jasné, že techniky opísané v nasledujúcich príkladoch predstavujú techniky, ktoré dobre fungujú pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu a tak môžu byť považované za výhodné spôsoby jeho uskutočnenia. Odborníkom v odbore však bude jasné, že môžu byť uskutočnené mnohé zmeny špecifických uskutočnení, ktoré spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

249/B

Príklad 1

In vitro mutagenéza

Rôzne varianty superantigénov boli pripravené metódami na báze polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

Stručne, PCR produkty obsahovali dve jedinečné reštrikčné miesta, každé na jednej strane. Pre subklonovanie sa použil pUC19 (GIBCO BRL Life Technologies, Middlesex, U.K.), pripravený za použitia QIAprep Spin Miniprep Kit Protokolu (QIAGEN, Hilden, Germany). Boli vložené bodové mutácie neovplyvňujúce aminokyselinovú sekvenciu, ktoré uľahčujú ďalšiu analýzu. PCR reakcia bola uskutočnená na Perkin Elmer Gene Amp PCP systéme 2400 s Tag DNA polymerázou a vhodným PCR pufrom obsahujúcim 15 mM MgCI₂ (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland). PCR produkty a vektory sa štiepili cez noc vhodnými reštrikčnými enzýmami. Potom sa uskutočnilo prečistenie za použitia elektroforézy v 1 % agarózovom géli (GIBCO BRL Life Technologies) obsahujúcom 0,5 pg/ml etídiumbromidu (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) v TAE pufri (Sigma-Aldrich). Fragment obsahujúci DNA sa excidoval z gélu a extrahoval sa za použitia CONSERT™ Rapid Gel Extraction Systému (GIBCO BRL Life Technologies). Vektor a inzert sa ligovali (T4 DNA ligáza, Roche Molecular Biochemicals) pri teplote miestnosti počas 34 hodín. Ligačná zmes sa potom transformovala do Escherichia coli kmeňa DH5a (GIBCO BRL Life Technologies) podľa návodu výrobcu. Pozitívne klony sa verifikovali za použitia DNA sekvencovania. Správne sekvencie sa štiepili Rsrll/Hindl11 pri teplote 37 °C cez noc a ligovali sa do expresného vektora (Dohlsten et. al., 1994). Variabilné časti Fab sa zmenili na C215, aby boli vhodné pre dostupné zvieracie modely. Konštrukt sa nakoniec inkorporoval do Escherichia coli K12 kmeňa UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, AompT).

Príklad 2

Identifikácia ľudských anti-SEA väzbových regiónov

249/B

Regióny rozpoznávané ľudskou anti-SEA protilátkou sa identifikovali z pepsínového trávenia SEA alebo chimérického variantu SEA a SEE, SEA/E-18, skôr označované ako SEE/A-A (Antonsson et al., 1997) so substitúciou D227A.

Každý superantigén sa inkuboval s 0,5 % pepsínom, 10 mM HCI, 150 mM NaCl (hmot./hmot.) počas 60 minút pri 37 °C. Peptidová zmes sa neutralizovala 2M Tris-HCl, pH 8,0 a aplikovala sa na 1 ml HiTrap kolónu (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) s imobilizovanou ľudskou anti-SEA. PBS, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, pH 7,3, sa použil ako premývací pufor a protilátkové väzbové fragmenty sa eluovali za použitia 0,1 M kyseliny octovej, pH 3,0. Fragmenty sa identifikovali pred a po prečistení za použitia HPLC spojenej s hmotnostným spektrometrom (MS) (obr. 1). Chromatografia sa uskutočnila na C18 kolóne (2x250 mm) (VYDAC™, Hesperia, California, USA) za použitia lineárneho gradientu od 10 do 60 % acetonitrilu v 0,1 % kyseline trifluóroctovej počas 30 minút pri 40 °C. Hmotnostné spektrum sa určilo za použitia elektrosprejovej MS (Finnigan LCQ, Thermoquest, San Jose, California, USA). Fragmenty objavené v trávenom produkte pri rovnakom retenčnom čase pred a po afinitnom prečistení sa považovali za pozitívne (obr. 2).

Príklad 3

Molekulové modelovanie

Chimérický superantigén SEA/E-18 je na báze SEE sekvencie okrem štyroch aminokyselinových zvyškov blízko N-konca, ktoré sú zo SEA a jednej substitúcie v C-koncovej časti D227A (obr. 3 a obr. 4) (Antonsson et al., 1997).

Stručne, trojrozmerné štruktúry superantigénov s oveľa vyššou identitou sekvencie zo SEE, ktoré boli dostupné z PBD, sa použili ako templáty pre konštrukciu homologického modelu SEAE-18, t.j. SEA (1ESF, Shard et al., 1SXT, Sundstrom et al., 1996 A), SED (Sundstrom et al., 1996 B) a SEH (1ENF) (Hakansson et al., 2000). SEA bol najpodobnejší SEE s identitou sekvencie 80 %. SED mal identitu sekvencie 60 % a SEH 50 % vzhľadom k

249/B

SEE.

Konštrukcia modelu sa uskutočnila za použitia HOMOLOGY modulu v INSIGHTII Software (MSI, San Diego). Štruktúry troch superantigénov, SEA, SED a SEH, sa porovnali a určili sa štrukturálne konzervované regióny (SCR) (obr. 3). Tieto regióny sa obvykle mapovali do pravidelných sekundárnych štruktúr molekuly. Hrubé sekvencie pre SEA/E-18 sa pripravili za použitia SCR zo štruktúry SEA (obr. 5). Použili sa 1SXT koordináty pre SEA, okrem prvých deviatich zvyškov na N-konci, kde sa použilo 1ESF. Regióny medzi SCR boli vo väčšine prípadov flexibilné slučky a boli pripravené zo SEA a SED. Väčšina slučiek bola pripravených zo SEA, okrem zvyškov Gln19, lle140, Asp141, Lys142, Ser189, Gly191, Asp200, Pro206, Asp207 a Leu 224, ktoré boli použité zo SED. Niektoré oblasti v SCR vykazovali väčšiu podobnosť sekvencie so SED a bolí preto pripravené podľa SED ako štrukturálneho templátu (Ile37, Glu49, Asn50, Thr5T, Leu52, Ser195 a Thr218) (obr. 3).

Pretože bol ako štrukturálny templát pre väčšinu zvyškov v SEA/E-18 použitý SEA, nevyskytli sa problémy s prekrývaním vedľajších reťazcov. Miesta zostrihu pred a za SCR sa opravili. Najskôr sa substituované vedľajšie reťazce relaxovali a potom sa pomocou minimalizácie energie a molekulárnej dynamiky relaxovali všetky vedľajšie reťazce v SCR za použitia HOMOLOGY. Slučky sa relaxovali raz za použitia prvých 1000 krokov minimalizácie energie a 1000 krokov molekulárnej dynamiky. Tieto jemné úpravy sa aplikovali najskôr na vedľajšie reťazce slučky a potom na všetky atómy v slučke. Pre všetky simulácie sa použilo CVFF silové pole so silovou konštantou 100 kcal/A2 za použitia krokov 2 fs.

Konečný model sa testoval na zlé regióny za použitia PROSTÁT modulu v INSIGHITII. Neboli detegované žiadne zlé regióny. Vnútro proteínu sa balilo dobre bez významných odlišností v porovnaní so SEA. Všetky zvyšky spadali do povolených regiónov ramachandranovho grafu. Superpozícia 1SXT s modelom viedla k zisku RMSD 0,4 A, keď boli porovnávané Ca atómy. Hlavný rozdiel medzi dvoma štruktúrami bol pozorovaný v β9-β10 slučke (zvyšky His187-Thr193) (obr. 5).

249/B

Nové modely nových variantov superantigénov boli konštruované za použitia SEA/B-18 modelu ako templátu. Špecifické aminokyselinové zvyšky sa zmenili priamo na tento model. Najvýhodnejšia konformácia vedľajšieho reťazca bola vybraná za použitia jednoduchých sterických obmedzení a krátkej minimalizácie energie.

Príklad 4

Kultivácia a prečistenie

C215FabSEA/E chiméry sa exprimovali ako fúzne proteíny v E. coli K12 kmeni UL635 za použitia plazmidu s IPTG indukovaným Lac UV-5 promótorom a génom pre kanamycínovú rezistenciu.

Stručne, baktérie zo zmrazeného (-70 °C) zásobného roztoku v 20 % glycerole sa inkubovali pri 25 °C počas 22-24 hodín v banke obsahujúcej (na liter) 2,5 g (NH₄)₂SO₄, 3 g KH₂PO₄, 2 g K₂HPO₄, 0,5 g nátrium-citrátu, 1 g MgSO₄«H₂O, 0,05 g kanamycínu, 12 g monohydrátu glukózy a 1 ml roztoku stopových prvkov, avšak bez Na₂MoO₄*2H₂O. Bunky sa kultivovali do Abs₆₂o 23 a 10 ml kultivačného média sa použilo pre naočkovanie 1 litrového fermentačného tanku (Belách Bioteknik, Sweden) s počiatočným objemom 800 ml. Fermentačné médium obsahovalo (na liter) 2,5 g (NH₄)SO₄, 9 g KH₂PO₄, 6 g K₂HPO₄, 0,5 g nátrium-citrátu, 1 g MgSO₄’7H₂O, 0,05 g kanamycínu, 23,1 g monohydrátu glukózy a 1 ml roztoku stopových prvkov, ako je uvedené vyššie. pH bolo udržiavané na 7,0 titráciou 25 % NH₃, aerácia 1 liter/minúta a teplota bola 25 °C. Počas vsádzkovej fázy sa percento rozpusteného O₂ udržiavalo na 30 % tým, že sa regulovala rýchlosť miesenia od 400 rpm do 2000 rpm a počas živnej fázy tým, že sa reguloval prívod glukózy (60 % hmot./obj.). Tvorba produktu sa indukovala vtedy, keď bola absorbancia pri 620 nm 45 tým, že sa pridal 0,1 mM izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid (IPTG). Po fermentácii sa bunky odstránili odstredením pri -20 °C a potom sa uskutočnilo prečistenie.

249/B

Proces prečistenia sa rozdelil do troch krokov. Najskôr sa DNA odstránila zo supernatantu kultúry pomocou 0,19 % polyetylénimínu (hmot./obj.) v 0,2 M NaCI, pH 7,4, za použitia peristaltickej pumpy s prietokom 12 ml/min. Po odstredení pri 7500 x g počas 30 minút sa odobral supernatant.

Supernatant sa aplikoval na 60 ml proteín-G Sepharose 4, kolónu s rýchlym prietokom (Amersham Pharmacia Biotech) s prietokom 14 ml/min. Kolóna sa premyla za použitia PBS a elúcia sa uskutočnila so 100 mM kyselinou octovou, 0,025 % Tween 20, pH 3,0. Eluovaný produkt sa odobral a pH sa upravilo na hodnotu o 1,5 jednotiek nižšiu než je teoretický izoelektrický bod s 1M NaOH, produkt sa prefiltroval (0,2 pm) a zriedil sa štyrikrát 0,025 % Tween 20. Degradované varianty sa odstránili za použitia iónomeničovej chromatografie. Iónová sila vzorky sa upravila na 2mS/cm a použitou kolónou bola SP-Sepharose-HP, Hiload 16/10 (Amersham Pharmacia Biotech). Elúcia sa uskutočnila s prietokom 4,0 ml/min počas 50 minút za použitia lineárneho gradientu od 0-55 % pufra B, 100 mM NaAc, 400 mM NaCI, 0,025 % Tween 20, pH 5,0 v pufri A, 10 mM NaAc, 0,025 % Tween 20, pH 5,0.

Príklad 5

Séroreaktivita

Reaktivita medzi variantmi superantigénu s ľudským anti-SEA sa merala v Scintillation Proximity Assay (SPA).

Na mikrotitračnej platni (OptiPlate, Packard Instruments) sa streptavidínom potiahnuté PVT korálky, 150 mg korálkov/jamka (Amersham Pharmacia Biotech) inkubovali počas 30 minút F(ab)₂ fragmentmi anti-myšieho IgG konjugovanými s biotínom, 3 pg/mg korálkov. Korálky sa preinkubovali s C215Fab konjugovanými superantigénmi sériou riedenia 1:2, kde najvyššie konečné koncentrácie v jamkách boli 40 nM. Nakoniec sa korálky inkubovali s 1 nM afinitne prečistenej ľudskej anti-SEA protilátky konjugovanej s ¹²⁵l a veľkosť scintilácie sa merala vTop-Counter (Packard Instruments).

249/B

Ľudská anti-SEA reaktivita pre varianty superantigénov sa merala v enzýmovom imunosorbentnom teste, ELISA (Cavallin et al., 2000). Výsledky boli podobné ako výsledky získané v SPA.

Príklad 6

Biologické funkcie

Schopnosť indukovať bunkovú cytotoxicitu závislú od protilátok k superantigénu, SADCC, a bunkovú cytotoxicitu závislú od superantigénu, SDCC, sa porovnávali v štandardnom 4 hodinovom teste uvoľňovania ⁵¹Cr.

Stručne, ciele, ktoré sa použili pre SDCC, boli ľudské Raji bunky Blymfómu, a ciele, ktoré sa použili pre SADCC, boli Colo205 bunky ľudského kolorektálneho karcinómu. Bunky sa označili ⁵¹Cr a zriedili sa na koncentráciu 50000 buniek/ml a aplikovali sa do mikrotitračných jamiek tvaru písmena V. Efektorové bunky, SEA-reaktívne T-lymfocytárne línie, sa použili v pomere efektorových a cieľových buniek 45:1 pre SADCC a 30:1 pre SDCC. Sag varianty sa pridali v koncentráciách od 10'⁹ do 10'¹⁶ M pre SADCC a od 10‘⁷ do 10'¹⁴ pre SDCC. Supernatanty sa odobrali a uvoľňovanie Cr sa meralo v TopCount (Packard Instruments). Percento špecifickej cytotoxicity sa vypočítalo ako 100 x [(cpm uvoľnenie v pokuse - cpm spontánne uvoľnenie)/(cpm celkové uvoľnenie - cpm spontánne uvoľnenie)].

Príklad 7

Identifikácia protilátkových epitopov

U pacientov komplikujú preexistujúce protilátky proti superantigénom ich klinické použitie a často je nutná úprava dávkovania (Alpaugh et al., 1998). Jedným spôsobom, ako obmedziť vplyv vopred vytvorených protilátok, je modifikácia regiónu superantigénu zodpovedného za väzbu na T-lymfocytárny receptor (Antonsson, et al., 1997). Predkladaný vynález však zlepšuje terapeutický potenciál superantigénov tým, že využíva génové inžinierstvo na

249/B odstránenie protilátkových epitopov superantigénu.

Bolo zistené, že SEE vykazuje silnú redukciu v protilátkovej reaktivite v porovnaní so SEA (Antonsson et al., 1997). Nanešťastie je s týmto znížením tiež spojené zníženie tumoricidných vlastností, keď je SEE fúzovaný na tumorreaktívny Fab (Antonsson et al., 1997). Preto boli skúmané chimérické konštrukty SEA a SEE. Pri vložení príslušných aminokyselín zo SEA do štyroch pozícii v TCR-väzbovom regióne SEE sa dosiahli požadované vlastnosti. Tieto substitúcie, ARg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly a Arg27Lys (región A) v SEE viedli k zisku chiméry SEA/E-18 (obr. 4) (Antonsson et al., 1997). Táto chiméra vykazuje viac ako 50 % zníženie v protilátkovej reaktivite, ako má SEE, za zachovania účinnej úrovne cytotoxicity, ako má SEA. Ďalej pre zníženie afinity medzi superantigénom a MHC triedy II, ktorá redukuje SDCC a tak zlepšuje terapeutické okno, obsahuje SESA/E-18 tiež substitúciu Asp227Ala (Abrahmsén et. al., 1995).

Pre ďalšie zníženie schopnosti ľudských anti-SEA rozpoznávať SEA/E18 sa určili protilátkové väzbové epitopy v superantigénoch. Peptidy/fragmenty z čiastočného peptidového trávenia buď SEAwt alebo SEA/E-18 sa zachytávali za použitia imobilizovanej anti-SEA protilátky. Po prečistení sa peptidové sekvencie identifikovali za použitia LC-MS (obr. 1). Tak sa potenciálne oblasti podieľajúce sa na rozpoznávaní protilátkou lokalizovali do aminokyselinovej sekvencie. Významné je to, že väčšina získaných peptidov bola umiestnená blízko regiónov, o ktorých je známe, že interagujú s MHC antigénmi triedy II (Abrahmsén et al., 1995) (obr. 2 a obr. 6). Trojrozmerná štruktúra SEA (Schad et al., 1995; Sundstrom et al., 1996) a počítačový model SEA/E-18 (obr. 5), založený na kryštalickej štruktúre SEA (Schad. et al., 1995; Sundstrom et al., 1996 A), sa použili na lokalizáciu zvyškov exponovaných na povrchu v identifikovaných peptidoch. Nasledujúce zvyšky boli identifikované ako zvyšky exponované na povrchu a ako potenciálni kandidáti v protilátkových väzbových epitopoch: Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Asp173, His187, Ser189, Glu190, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 a Asp227 (Tabuľka

249/B

2).

Tieto zvyšky sa potom substituovali pre redukciu ich väzby na protilátky. Kontinuálne sa uskutočňovali nové počítačové modely s vylepšenými Sag variantmi, aby sa potvrdili a porovnali výsledky pre nové varianty. Hlavne sa hodnotil význam vedľajšie h reťazcov na stabilitu proteínov.

Príklad 8

Modifikácia superantigénov pre zníženie séroreaktivity

Charakterizoval sa príspevok identifikovaných zvyškov k väzbe protilátky, najskôr za použitia dvoch simultánnych substitúcii v SEA/E-18. Tak sa získali SAg varianty SEA/E-62 (Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala) (región E), SEA/E-63 (Ser189Asp, Glu190Ala) (región D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (región B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (región C), SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45AIa, Glu49Thr) (región B) a SEA/E-75 (Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser) (región C) (Tabuľka 1, obr. 4).

Pre skúmanie toho, či ľudské IgG anti-SEA protilátky môžu rozpoznávať rôzne SAg varianty sa vyvinul test blízkosti scíntilácie” (SPA). Modifikované varianty boli všetky rozpoznávané menej než SEA/E-18 (Tabuľka 1). Najvýznamnejšia redukcia väzby bola spôsobená substitúciou uskutočnenou v SEA/E-65. V SPA analýze bola spozorovaná redukcia o viac ako 40 % (obr. 7). Avšak, mnohé nahradenia tiež generovali redukciu produkcie v E. coli a občas bola znížená tiež biologická aktivita. Skúmaním substitúcií sme identifikovali v každom variante zodpovedné zvyšky a tie zvyšky sme modifikovali či vylúčili, aby sa dosiahli lepšie vlastnosti. Všeobecne bola produkcia zlepšená hydrofilnými substitúciami v porovnaní s viac hydrofóbnymi substitúciami.

Redukcia väzby protilátky bola synergicky zvýšená vtedy, ked' boli varianty kombinované, ako je tomu v SEA/E-91 skladajúceho sa zo SEA/E-63, SEA/E-65 a modifikovaného SEA/E-74 (s prirodzeným Asp45) (Tabuľka 1). Variantom s najlepšími výsledkami v SPA analýze s redukciou väzby takmer o

249/B % v porovnaní so SEA/B-1B bol SEA/E-110, kombinácia SEA/E-63, SEA/E75 a modifikovaného SEA/E-62 (SEA/E-97), SEA/E-64 (SEA/B-108), SEA/E-65 (SEAPE-84) a SEA/E-74 (wt Asp45) (obr. 7, tabuľka 1). Modifikácie zodpovedné za väčšinu redukcie väzby protilátky boli v SEA/E-109 (Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Ľys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser) a kombinácia SEA/E-75 a modifikovaného SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) a SEA/E-74 (wt Asp45). Toto je preto, že varianty superantigénov obsahujúce tieto substitúcie majú všetky dobré zníženia v SPA analýze.

Tak spôsobujú zvyšky substituované v SEA/E-62, SEA/B64, SEA/E-65 a SEA/E-74 20 až 40 % zníženie reaktivity s protilátkou v porovnaní so SEA/E-18 (Tabuľka 1).

249/B

CD

CD

Ν'

Tabuľka 1

OO

-

tn o

T—

tD O

m o

o o

LD O“

-

-

-

tn o

χ- Ο'

-

>N

X- O“

LD O

I 0,04 I

o

δ o'

o-

1 0,05 I

I 004 I

I 004 I

o

i

m o'

-

CO

T~

m O

b- o

-

V“

-

LD O

-

•c-

V o

-

-

CO

-

δ o“

LD o‘

LD O“

-

CO

v—

T”

Séroreaktivita (Bmax)

χΡ

s? S!

cr· 8

£ 8

xp

s? a

-P fe

“p

sp §

•p

p CV S?

p

S? 8

xp ox 8

xp

xp fe

xp

g?

s =- Ή >

o £

o V“

O s?

o s

O fe

o fe

m

CM of

o LD

iD 8

o Qľ

o OJ T“

o Ώ

o LD

o CO

o í

o ä

LD O

o Csf

o <\T

o o

o fe

o r<

o CM t—

<

<

oo

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

CO

0)

<

<

co

oo

oo

oo

oo

oo

<

0)

0)

0)

00

czo

oo

oo

oo

oo

oo

§

<

0)

0)

0)

0)

oo

oo

oo

oo

oo

oo

E222

1-

1-

H

H

1-

1-

H

H

1-

(-

H

1

<

czo

oo

OO

oo

czo

OO

OO

oo

oo

OO

K217

H

l·-

H

1-

H

1-

1—

1-

H

1-

l·-

B

CC

QC

H

H-

E190

<

<

<

<

<

S189

Q

Q

Q

Q

Q

S188

H

1-

H

H

H

H

H

H

H

H

t—

H

t—

H

H

H

t-

1-

1-

t—

H187

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

oo

<

<

oo

Dl 73

<

<

<

<

<

1

LL

LU

OO

LL

LL

oo

OO

CO

oo

oo

OO

oo

oo

§

UJ

LL

OO

LL

LL

0)

oo

oo

oo

oo

oo

oo

oo

§

LL

LL

LL

LU

IU

LL

LU

LU

LU

LL

LU

LL

LL

§

UJ

LU

LL

LL

LU

LU

LL

LL

LL

LU

LU

LU

LU

oo

0)

CZO

CZO

OO

oo

oo

czo

OO

LD Ď

<

<

<

<

<

<

<

<

<

§

H

H

1-

1-

1-

H

h-

1-

1-

§

H

H

H

H

H

H

1-

H

H

1-

H

§

<

<

§

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

E42

30

34

34

34

34

34

34

3Í

34

34

34

2

LU

LU

LU

LU

LU

LU

LL

LU

LU

LU

LU

I

oo

w

oo

0)

czo

oo

OO

oo

oo

oo

oo

R LL

34

oo

oo

oo

oo

OO

oo

oo

oo

oo

S

LL

S LL

34

oo

oo

oo

oo

CZO

oo

oo

oo

oo

6

a á oo

$ LL Ž OO

LU š 0)

S? LL Ž OO

? LL Ž OO

8 LĹI OO

UJ á oo

S LU iä oo

? LU Ž oo

$ ω

ä oo

T— σ> LU š czo

LD a a czo

8 LL Ž OO

δ ώ š 0)

CO t— V“ ώ a 0)

8 £ Ž CO

o ώ a oo

LD ώ a oo

CO LÚ á oo

O) LĹJ OO

fe ώ Ž oo

δ v yj

fe 5 a oo

X

CO

E m

>, +^

S co

Φ v— o

o czo g

c

CD

4—‘

O c

T3

O

4Z

CD

CL

CO ·

O c

Ό

O τ

ó o

Q

W >

co

O

Q <

W >

O

CO

W «:

LU ω

JO

CO

Ll

ΙΩ

CN o

CD ιΟ.

_co >

o c

(0 w

CO czo

CO

J>

CO ‘CO g

en o

g co >C1) c

4—»

CO

4—* oo o

o

CO

O

T5 +4 o

CL

E

CO >N

CO >oo

E ‘>>

.c

OO

CD

O ω

cs o

CL >

•CD

C

CO ‘n o

c “O

O •D

CZ)

E ·>.

c >o

ZO

-CD

C

CD

D

CD >

ZS +-<

o c

D

O

I oo ώ

á w

jQ

CO

LL ifo

CN

O o

'CO ·♦—' CZ CD CD ίο

CL >

‘CO c:

Q) •σ co '>!

>

249/B

Príklad 9

Náhrady ovplyvňujúce úroveň produkcie

Ako bolo uvedené vyššie, niektoré substitúcie na povrchu superantigénov vedú k zníženiu produkcie E. coli. Veľa kombinácií takýchto substitúcií nebolo možné produkovať. Preto bolo rozhodnuté skúmať alternatívne modifikácie tých zvyškov, ktoré zjavne spôsobujú redukciu výťažku. Substitúcie, ktoré ovplyvňovali výťažok bez toho, aby znižovali väzbu na protilátku, neboli ďalej skúmané. Miesto nich boli použité prirodzené zvyšky.

V prvej sade variantov superantigénov zvyšok Lys35 v SEA/E-64; negatívne ovplyvňoval úroveň expresie. Pri použití prirodzeného zvyšku v pozícii 35 spoločne so serínovou substitúciou Glu34 a Glu39, čo vedie k zisku SEA/E-108, bolo pozorované zvýšenie výťažku z 23 mg/l na 30 mg/l. Zníženie reaktivity s protilátkou bolo tak zachované. Pri substituovaní kyseliny glutámovej za zvyšky Lys79, Lys81, Lys83 a Lys84 v SEA/E-65 bola úroveň produkcie iba 1,5 mg/l. Vzhľadom na skutočnosť, že reaktivita s protilátkou sa znížila o 43 % v porovnaní so SEA/E-18, bola snaha identifikovať lepšie náhrady. Najlepšou kombináciou, ako z hľadiska výťažku, tak reaktivity protilátky, bol SEA/E-84 so serínovými zvyškami v pozíciách 83 a 84 a so zachovanou kyselinou glutámovou v pozíciách 79 a 81 (Tabuľka 1). Úroveň produkcie sa zvýšila 10krát a reaktivita protilátky sa redukovala o 41 % v porovnaní s SEA/E-18 (Tabuľka 1). Úroveň produkcie sa tiež znížila viac ako 10-krát pri substitúciách Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala a Asp227Ala v SEA/E-62, na 1,0 mg/l. Avšak, pri nahradení alanínových substitúcií serínovými zvyškami, čo vedie k zisku SEA/E-97, sa dosiahla produkcia 48 mg/ml (Tabuľka DZaujímavé je to, že pri kombinovaní SEA/E-65 s viacerými variantmi, ako je SEA/E-63 a modifikovaný SEA/E-74, ako je tomu v SEA/E-91, sa zmenila nízka úroveň produkcie na 12 mg/l (Tabuľka 1). Na druhej strane sa dosiahla expresia variantmi superantigénu SEA/E-110 iba 0,5 mg/l a 14 mg/l, v príslušnom poradí. Úroveň produkcie SEA/E-110 bola zvýšená na 30 mg/l pri odstránení substitúcií Asp174Ala, His87Ala, Ser188Thr, Ser189Asp, Glu190Ala

249/B a Gln204Thr, čo viedlo k zisku SEA/E-120 (Tabuľka 1).

Vloženie veľkého počtu substitúcií do superantigénu môže viesť k problému s expresiou v E. coli. Existujú aspoň tri mechanizmy pre tento jav: zníženie termodynamiky, narušenie prirodzených dráh skladania proteínu alebo novo vzniknuté proteolytické miesta. Aj keď bolo cieľom tohto pokusu odstránenie antigénnych epitopov na povrchu, ktoré s najväčšou pravdepodobnosťou interferujú s hlavným štrukturálnym skeletom, existuje tiež možnosť, že stabilita nových štruktúr bola závislá od iných zvyškov než v prirodzenom konštrukte. Preto sa trvalo vytvárali nové počítačové modely pre predikciu alebo potvrdenie lokalizácie substituovaných zvyškov v novej štruktúre. Týmto spôsobom je vo variantoch superantigénu možno identifikovať zvyšky spôsobujúce problémy s úrovňou expresie a je možné navrhovať vylepšené varianty obsahujúce buď prirodzené zvyšky alebo lepšie substitúcie (Tabuľka 1).

Záverom, na dosiahnutie lepšej úrovne produkcie by mali byť zvyšky Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 a Asp227 substituované na serín a nie na alanín. Ďalej, na elimináciu zníženia expresie by zvyšky Lys35, Asp173, His187, Ser188, Ser189, Glu190 a Gln204 mali byť konzervované.

Príklad 10

Hodnotenie biologických funkcií v rôznych Sac variantoch.

Keďže superantigény boli primárne navrhnuté na protinádorovú terapiu (Dohlsten et al., 1994), je dôležité, aby substitúcie v nových variantoch superantigénov neznižovali cytotoxicitu namierenú proti nádoru. Schopnosť sprostredkovať túto cytotoxicitu namierenú proti nádoru bola preto meraná proti všetkým novým variantom superantigénu v SADCC teste (obr. 3). Ďalej bola v SDCC meraná účinnosť superantigénov v sprostredkovaní zabíjania buniek exprimujúcich MHC antigény triedy II T-lymfocytmi, kde tento mechanizmus môže viesť k nežiadúcim účinkom (obr. 3). Pre klinické použitie je najlepšie, aby SDCC bola čo najmenšia, pretože sa tým zväčšuje terapeutické okno.

249/B

Väčšina z iniciálnej sady SAg variantov mala rovnakú úroveň tumor špecifického cytotoxického potenciálu ako SEA/E-18 (Tabuľka 1). Výnimkou bol SEA/E-75 so substitúciami Lys74Thr, Asp75Ala a Asn78Ser, ktorý mal desaťkrát menší potenciál a SEA/E-64 so substitúciami Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu a Glu42Lys, ktorý mal päťkrát menší potenciál ako SEA/E-18 (Tabuľka 1). Zaujímavé je to, že znížená aktivita v SEA/E-75 bola pozorovaná iba v tomto variante, v kombinácii s ďalšími substitúciami, ako je napríklad v SEA/E-109, bola detegovaná plná aktivita (Tabuľka 1). Okrem toho bola SDCC aktivita nezmenená v SEA/E-75 v porovnaní so SEA/E-18. Substitúcie Lys74Thr, Asp75Ala a Asn78Ser preto pravdepodobne narušujú interakcie významné pre na protilátkach závislú cytotoxicitu.

Väčšina z tu opísaných variantov superantigénov vykazuje jasné zníženie v SDCC. Mierne zníženie v SDCC aktivite bolo pozorované pre prvotné varianty SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 a SEA/E-74, v porovnaní so SEA/E-18.

Všetky varianty superantigénov obsahovali substituovaný zvyšok Asp227Ala alebo Ser. Je známe, že táto substitúcia redukuje afinitu k MHC molekulám triedy II 10O-krát a tým redukuje SDCC aktivitu (Abrahmsén et al., 1995). Pretože však SAg variant SEA/E-109, s N-koncovými substitúciami, vykazuje väčšie zníženie v porovnaní so SEA/E-18 než SEA/E-13, s Ckoncovými substitúciami, tak sa predpokladá, že v SEA/E-109 boli zmenené ďalšie zvyšky, ktoré sú významné pre SDCC a s najväčšou pravdepodobnosťou sa podieľajú na väzbe na MHC antigény triedy II (obr. 8).

Tak boli zvyšky spôsobujúce najväčšiu redukciu Lys79Ser a Lys81Ser v SEA/E-83 a substitúcie Asp45Ala v SEA/E-74. Väčšina z týchto substitúcií je lokalizovaná okolo zvyškov, o ktorých bolo skôr známe, že interagujú s MHC antigénmi triedy II (Abrahmsén et al., 1995).

249/B

Príklad 11

Vývoj nových variantov superantigénov

Pre vývoj optimálnych variantov superantigénu sa všetky výhodné substitúcie kombinovali, čo viedlo k zisku lepšieho SEA/E-120 (obr. 4 a obr. 9).

Najskôr sa zostavili všetky výhodné modifikácie v C-konci, t.j. zvyšky Asp173Ala, Ser189Thr, Glu190Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, Glu222Thr, Asn223Ser, His225Ser a Asp227Ser, spolu s Gln204Thr, za získania SAg variantu SEA/E-113. Tento variant mal očakávané zníženie anti-SEA reaktivity a prijateľnú úroveň expresie, ale mal o niečo nižšiu biologickú aktivitu (Tabuľka 1, obr. 7 a obr. 8A a obr. 8B). Všetky výhodné substitúcie na N-konci, t.j. zvyšky Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49T, Lys74T, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser a Lys84Ser, sa pridali do SEA/E-109. Bolo pozorované značné zníženie anti-SEA reaktivity pre tento variant superantigénu spoločne s vysokou expresiou a lepším biologickým profilom (Tabuľka 1, obr. 7 a obr. 8A a obr. 8B). Avšak, pri vytváraní kombinácií týchto dvoch variantov SEA/E-113 a SEA/E-109 v SEA/E-110 bolo pozorované významné zníženie ako výťažku, tak biologickej funkcie (Tabuľka 1). Biologická účinnosť bola celkom obnovená, keď sa v SEA/E-115 použili prirodzené zvyšky Ser189, Glu190 a Gln204, ale úroveň produkcie bola stále ešte nízka. Molekulové modelovanie tohto variantu predpovedalo, že zvyšky Asp173, His187 a Ser188 môžu byť dôležité pre stabilizáciu skladania, čo nakoniec vedie k zvýšeniu výťažku.

Bolo pripravených niekoľko rôznych kombinácií pre hodnotenie týchto zvyškov, za získania SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 a SEA/E122 (Tabuľka 1). Najlepšia produkcia bola získaná pre SEA/E-120 s prirodzenými zvyškami vo všetkých troch pozíciách. Spoločne so skôr pripravenými SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 a SEA/E-109 išlo o jediné SAg varianty, ktoré dosiahli úroveň expresie vyššiu než 20 mg/l (Tabuľka 1). Medzi variantmi neboli pozorované žiadne významnejšie odlišnosti v

249/B biologickej aktivite alebo protilátkovej reaktivite.

Návrh nových konjugátov

SEA/E-120 bol geneticky fúzovaný na Fab skupinu tumor-reaktívnej protilátky, ktorou bola 5T4 (Dohlsten et. al., 1994) (obr. 10).

Antigén 5T4 je exprimovaný na rôznych nádoroch, ako je nemalobunkový karcinóm pľúc, karcinóm prsníka, renálny karcinóm, karcinóm pankreasu, karcinóm vaječníkov a karcinóm hrubého čreva. Substitúcie v prirodzenej sekvencii 5T4 boli uskutočnené s cieľom dosiahnutia vyššieho výťažku. V ťažkom reťazci išlo o substitúcie: His41Pro, Ser44Gly, lle69Thr a Valí 13Gly a v ľahkom reťazci išlo o substitúcie: PhelOSer, Thr45Lys, lle63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val a Leu83Ala.

Je treba si uvedomiť, že aj keď bol predkladaný vynález a jeho výhody opísaný podrobne, existujú rôzne varianty opísaných uskutočnení, ktoré spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu, ako je definovaný v pripojených patentových nárokoch. Rozsah predkladaného vynálezu nie je limitovaný konkrétnymi uskutočneniami, prístrojmi, postupmi, zložením, a krokmi uvedenými v opise. Odborníkom v odbore bude jasné, že pri použití iných postupov, prístrojov, materiálov, môže byť dosiahnutý ten istý výsledok. Preto pripojené patentové nároky definujú také spôsoby, prístroje, postupy výroby, materiály a kroky.

Odborníkom v odbore bude tiež jasné, že predkladaný vynález je dobre adaptovaný pre uskutočnenie predmetu a výhod vynálezu. Opísané prostriedky, spôsoby, postupy a techniky sú iba príklady výhodných uskutočnení a neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu. Vynález je definovaný iba pripojenými patentovými nárokmi.

Citované odkazy:

Všetky patenty a patentové prihlášky uvedené v predkladanom vynáleze

249/B sa týkajú odboru, ktorého sa týka predkladaný vynález. Všetky patenty a patentové prihlášky sú tu uvedené ako odkazy v rovnakom rozsahu, ako keby bola každá jednotlivá publikácia označená ako odkaz.

U.S. Patent 4,554,101

U.S. Patent 5,221,605

U.S. Patent 5,238,808

U.S. Patent 5,798,208

U.S. Patent 5,830,650

U.S. Patent 5,220,007

U.S. Patent 5,284,760

U.S. Patent 5,354,670

U.S. Patent 5,336,878

U.S. Patent 5,389,514

U.S. Patent 5,635,377

U.S. Patent 5,789,166

U.S. Patent 5,446,128

U.S. Patent 5,710,245

U.S. Patent 5,840,833

U.S. Patent 5,859,184

U.S. Patent 5,440,013

U.S. Patent 5,618,914

U.S. Patent 5,670,155

U.S. Patent 5,475,085

U.S. Patent 5,929,237

U.S. Patent 5,672,681

249/B

U.S. Patent 5,674,976

U.S. Patent 4,608,251

U.S. Patent 4,601,903

U.S. Patent 4,599,231

U.S. Patent 4,599,230

U.S. Patent 4,596,792

U.S. Patent 4,578,770

Abrahmsén L., etal. EMBO J. 14:2978-86, 1995.

Alpaugh, R. K., et al., Clôn. Cancer Res. 4:1903-14, 1998.

Antonsson P., etal. J. Immunol. 158:4245-51, 1997.

Bangham et al., J. Mol. Biol., 13:238-252, 1965.

Bird et al., Science, 242:423-6, 1988.

Braisted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(12):5688-92, 1996.

Burks et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94(2):412-7, 1997.

Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 76:425, 1977.

Cavallin A„ et al., J. Biol. Chem. 275:1665-72, 2000.

Cunningham et al., Science, 244(4908):1081-5, 1989.

Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986

Dohlsten M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8945-9, 1994.

DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICÍNE, G. Gregoriadis ed. (1979) str. 287-341.

Hakansson, M. et al., J. Mol. Biol. 302:527-37, 2000.

Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988.

Johannesson et al., J. Med. Chem. 42:601-608, 1999.

Kaneda et al., J. Biol. Chem., 264(21):12126-12129, 1989.

249/B

Kato et al., J. Biol. Chem., 266(6):3361-3364, 1991.

Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987.

Papageorgiou A. C. et al., Trends in Microbiology 8:369-375, 2000.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, kapitola 61, str. 1035 1038 a 1570-1580.

Sambrook et al., v: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989. Schad E. M., et al. EMBO J. 14:3292-3301, 1995.

Short et al., J. Biol. Chem. 270(48):28541-50, 1995.

Sundstram M., et al., EMBO J. 15:6832-40, 1996 A.

Sundstrom M., et al., J. Biol. Chem. 271:32212-16, 1996 B.

Szoka and Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:4194-4198, 1978.

Vitá et al., Biopolymers 47:93-100, 1998.

Warren et al., Biochemistry 35(27):8855-62, 1996.

Weisshoff et al., Eur. J. Biochem. 259:776-788, 1999.

Wells et al., Methods 10(1):126-34, 1996.

Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980.

Yelton et al., J. Immunol. 155(4):1994-2004, 1995.

Claims (55)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén divokého typu alebo modifikovaný bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu obsahuje regióny A až E, kde región A je vo väzbovom mieste TCR a určuje väzbu na TCR, a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekuly triedy II, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne C v iných superantigénoch je nahradený jedným alebo viacerými rôznymi aminokyselinovými zvyškami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, od ktorého bol odvodený; a kde protilátková skupina je protilátka s plnou dĺžkou alebo akýkoľvek iný fragment protilátky viažuci antigén, ktorý je namierený proti povrchovej štruktúre asociovanej s nádorovou bunkou.
2. 2. Konjugát podľa nároku 1, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že je nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej zo 79, 81, 83 a 84 v regióne C v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne C v iných superantigénoch.
3. 3. Konjugát podľa nároku 1 alebo 2, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v regióne A, B, C, R a/alebo E v superantigéne.

   32 249/B náhradná strana
4. 4. Konjugát podía akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 49, 188, 189, 190, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B, D a/alebo E v iných superantigénoch.
5. 5. Konjugát podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44 a 49 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B v iných superantigénoch.
6. 6. Konjugát podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde superantigénom je stafylokokový enterotoxín (SE), exotoxín Streptococcus pyogenes (SPE), toxín syndrómu toxického šoku Staphylococcus aureus (TSST-1), streptokokový mitogénny exotoxín (SME) alebo streptokokový superantigén (SSA).
7. 7. Konjugát podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde superantigénom je Stafylokokový enterotoxín A (SEA) alebo E (SEE).
8. 8. Konjugát podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde v ňom je nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 79, 81, 83 a 84 v regióne C SEE.
9. 9. Konjugát podľa nároku 8, kde v ňom bol ďalej nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 20, 21, 24, 27, 173 a 204 v regióne A a 227 v regióne E SEE.

   32 249/B náhradná strana
10. 10. Konjugát podľa nároku 9, kde v ňom bol ďalej nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 49 v regióne B SEE a/aiebo v pozícii 74, 75, 78 v regióne C SEE a/alebo v pozícii 187, 188, 189, 190 v regióne D SEE a/alebo v pozícii 217, 220, 222, 223, 225 v regióne E SEE.
11. 11. Konjugát podľa nároku 10, kde nasledujúce substitúcie aminokyselinových zvyškov boli vložené do SEE sekvencie: R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S a D227S (alebo A).
12. 12. Konjugát podľa nároku 10, kde superantigén má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2 (SEA/E-120).
13. 13. Konjugát podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde protilátkovou skupinou je Fab fragment.
14. 14. Konjugát podľa nároku 13, kde protilátkovou skupinou je C215Fab.
15. 15. Konjugát podľa nároku 13, kde protilátkovou skupinou je 5T4Fab.
16. 16. Konjugát podľa nároku 1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 1.
17. 17. Konjugát podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý ďalej obsahuje cytokín.

    32 249/B náhradná strana
18. 18. Konjugát podľa nároku 17, kde cytokínom je interleukín.
19. 19. Konjugát podľa nároku 18, kde interleukínom je IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL2.
20. 20. Konjugát podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie v liečbe rakoviny.
21. 21. Konjugát podľa nároku 20, kde rakovina je vybraná zo skupiny zahrňujúcej rakovinu pľúc, prsníka, hrubého čreva, obličiek, pankreasu, vaječníkov, žalúdka, krčka maternice a prostaty.
22. 22. Použitie konjugátu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 19 na výrobu liečiva pre liečenie rakoviny.
23. 23. Použitie podľa nároku 22, kde liečivo je určené na intravenózne podanie.
24. 24. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje, ako aktívnu zložku, terapeuticky účinné množstvo konjugátu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 19.
25. 25. Prostriedok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že aktívna zložka obsahuje cytokín.
26. 26. Prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že cytokín je súčasťou konjugátu.

    32 249/B náhradná strana
27. 27. Prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že cytokín je prítomný ako nekonjugovaná zložka v kombinovanom prostriedku na simultánne, separované alebo sekvenčné použitie v protirakovinovej terapii.
28. 28. Prostriedok podľa akéhokoľvek z nárokov 25 až 27, vyznačujúci sa tým, že superantigén má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, protilátkovou skupinou je C215Fab a cytokínom je IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL2.
29. 29. Prostriedok podľa akéhokoľvek z nárokov 25 až 27, vyznačujúci sa tým, že superantigén má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, protilátkovou skupinou je 5T4Fab a cytokínom je IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL2.
30. 30. Spôsob liečenia rakoviny u cicavca pomocou aktivácie imunitného systému uvedeného cicavca, vyznačujúci sa tým, že uvedenému cicavcovi sa podá terapeuticky účinné množstvo konjugátu obsahujúceho bakteriálny superantigén divokého typu alebo modifikovaný bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu obsahuje regióny A až E, kde región A je vo väzbovom mieste TCR a určuje väzbu na TCR, a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekuly triedy II, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 74, 75, 78, 79, 81, 83 a 84 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne C v iných superantigénoch je nahradený jedným alebo viacerými rôznymi aminokyselinovými zvyškami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, od ktorého bol

    32 249/B náhradná strana odvodený; a kde protilátková skupina je protilátka s plnou dĺžkou alebo akýkoľvek iný fragment protilátky viažuci antigén, ktorý je namierený proti povrchovej štruktúre asociovanej s nádorovou bunkou.
31. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že je nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 79, 81, 83 a 84 v regióne C v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne C v iných superantigénoch.
32. 32. Spôsob podľa nároku 30 alebo 31, vyznačujúci sa tým, že aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v regióne A, B, C, R a/alebo E v superantigéne.
33. 33. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 30 až 32, vyznačujúci sa tým, že aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41,42, 44, 49, 188, 189, 190, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B, D a/alebo E v iných superantigénoch.
34. 34. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 30 až 33, vyznačujúci sa tým, že aminokyselinová sekvencia superantigénu je ďalej substituovaná tak, že je tiež nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44 a 49 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B v iných superantigénoch.

    32 249/B náhradná strana
35. 35. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 30 až 34, vyznačujúci sa tým, že superantigénom je stafylokokový enterotoxín (SE), exotoxín Streptococcus pyogenes (SPE), toxín syndrómu toxického šoku Staphylococcus aureus (TSST-1), streptokokový mitogénny exotoxín (SME) alebo streptokokový superantigén (SSA).
36. 36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že superantigénom je Stafylokokový enterotoxín A (SEA) alebo E (SEE).
37. 37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že je nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 79, 81, 83 a 84 v regióne C SEE.
38. 38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že je ďalej nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 20, 21, 24, 27, 173 a 204 v regióne A a v pozícii 227 v regióne E SEE.
39. 39. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že je dalej nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozícii 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 49 v regióne B SEE a/alebo v pozícii 74, 75, 78 v regióne C SEE a/alebo v pozícii 187, 188, 189, 190 v regióne D SEE a/alebo v pozícii 217, 220, 222, 223, 225 v regióne E SEE.
40. 40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že nasledujúce substitúcie aminokyselinových zvyškov boli vložené do SEE sekvencie: R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81 E, K83S, K84S a D227S (alebo A).

    32 249/B náhradná strana
41. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že superantigén má aminokyselinová sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 2 (SEA/E-120).
42. 42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že protilátkovou skupinou je Fab fragment.
43. 43. Spôsob podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že protilátkovou skupinou je C215Fab.
44. 44. Spôsob podľa nároku 42, vyznačujúci sa tým, že protilátkovou skupinou je 5T4Fab.
45. 45. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že konjugát má aminokyselinová sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 1.
46. 46. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 30 až 45, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje cytokín.
47. 47. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že cytokínom je interleukin.
48. 48. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že interleukínom je IL2 alebo jeho derivát majúci v podstate rovnakú biologickú aktivitu ako prirodzený IL2.
49. 49. Spôsob podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že rakovina je vybraná zo skupiny zahrňujúcej rakovinu

    32 249/B náhradná strana pľúc, prsníka, hrubého čreva, obličiek, pankreasu, vaječníkov, žalúdka, krčka maternice a prostaty.
50. 50. Konjugát obsahujúci bakteriálny superantigén divokého typu alebo modifikovaný bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu obsahuje regióny A až E, kde región A je vo väzbovom mieste TCR a určuje väzbu na TCR, a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekuly triedy II, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41,42, 44, 49, 188, 189, 190, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B, D a/alebo E v iných superantigénoch je nahradený jedným alebo viacerými rôznymi aminokyselinovými zvyškami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, od ktorého bol odvodený; a kde protilátková skupina je protilátka s plnou dĺžkou alebo akýkoľvek iný fragment protilátky viažuci antigén, ktorý je namierený proti povrchovej štruktúre asociovanej s nádorovou bunkou.
51. 51. Konjugát podľa nároku 50, kde je nahradený prinajmenšom jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 49, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B a E v iných superantigénoch.
52. 52. Použitie konjugátu podľa nároku 50 alebo 51 na výrobu liečiva na liečenie rakoviny.

    32 249/B náhradná strana
53. 53. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku, terapeuticky účinné množstvo konjugátu podľa nároku 50 alebo 51.
54. 54. Spôsob liečbenia rakoviny u cicavca pomocou aktivácie imunitného systému uvedeného cicavca, vyznačujúci sa tým, že uvedenému cicavcovi sa podáva terapeuticky účinné množstvo konjugátu obsahujúceho bakteriálny superantigén divokého typu alebo modifikovaný bakteriálny superantigén a protilátkovú skupinu, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu obsahuje regióny A až E, kde región A je vo väzbovom mieste TCR a určuje väzbu na TCR, a regióny B až E určujú väzbu na MHC molekuly triedy II, kde aminokyselinová sekvencia superantigénu je prinajmenšom substituovaná tak, že jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 49, 188, 189, 190, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B, D a/alebo E v iných superantigénoch je nahradený jedným alebo viacerými rôznymi aminokyselinovými zvyškami tak, že substituovaný superantigén má redukovanú séroreaktivitu v porovnaní so superantigénom, od ktorého bol odvodený; a kde protilátková skupina je protilátka s plnou dĺžkou alebo akýkoľvek iný fragment protilátky viažuci antigén, ktorý je namierený proti povrchovej štruktúre asociovanej s nádorovou bunkou.
55. 55. Spôsob podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že je nahradený jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov v pozíciách zvolených zo skupiny pozostávajúcej z 34, 35, 39, 40, 41,42, 44, 49, 217, 220, 222 a 223 v SEA alebo SEE alebo v zodpovedajúcich pozíciách v regióne B a E v iných superantigénoch.