NO333676B1 - Nytt konstruert superantigen for human terapi - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetninger og fremgangsmåter for anvendelse, hvori sammensetningen omfatter et konjugat av et bakterielt superantigen og en antistoffenhet. Nærmere bestemt har det bakterielle superantigenet blitt modifisert for å redusere seroreaktiviteten med beholdt superantigenaktivitet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fagfeltene for immunologi og vekstsykdommer slik som kreft. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen konjugater av superantigener og antistoffer som angitt i krav 1, samt sammensetninger og anvendelser derav, hvori sammensetningene omfatter superantigener som har blitt modifisert for å redusere seroreaktivitet.

Beslektet teknikk

Superantigener (SAg'er) består av en gruppe bakterielle og virale proteiner som er svært effektive i aktivering av en stor andel av T-cellepopulasjonen. Superantigener binder direkte til hovedhistokompatibilitetskomplekset (MHC) uten å ha vært bearbeidet. Superantigenene binder faktisk ubearbeidet utenom antigenbindingsfuren på MHC klasse II molekyler, derved unngås det meste av polymorfismen i det vanlige peptidbindingssetet. Bindingsmekanismen avhenger av superantigenbindingen til T-cellereseptoren (TCR) i Vf$-kjeden, istedenfor binding til hypervariabelbøylene av T-cellereseptoren (TCR).

Stafylokokk enterotoksiner (SEer)er en homolog gruppe superantigener med hensyn til både struktur og funksjon (Papageorgiou et al., 2000). De er kjent for å være hoved-årsak til matforgiftning og toksisk sjokksyndrom hos mennesker .

En ny SAg-basert tumorterapeutisk adjuvantterapi for faste tumorer er blitt utviklet. Den benytter begge hovedgrenene av immunsystemet ved å inkorporere Fab-delen av et tumorspesifikt, monoklonalt antistoff og et T-celleaktive-rende SAg i et enkelt, rekombinant fusjonsprotein. Fab-SAg-proteiner bundet til tumorceller kan utløse SAg-aktivert cytotoksiske T-celler for direkte dreping av tumorcellene gjennom superantigen antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet, SADCC. I tillegg produserer aktiverte T-celler tumordrepende og proinflammatoriske cytokiner som henholdsvis motvirker problemene av tumorheterogenitet og makromolekylært opptak.

Superantigenbaserte tumorterapier har hatt noe suksess. Et klinisk problem som må rettes er aktiveringen av det systemiske immunsystemet. Fusjonsproteiner med villtype SEA har vært undersøkt i kliniske undersøkelser av kolorektal-og bukspyttkjertelkreft (Alpaugh et al., 1998). Selv om oppmuntrende resultater ble erholdt, ble begrensninger observert. Først var produktet svært toksisk. For det andre var dosering komplekst på grunn av forhåndsdannede antistoffer mot superantigenene i pasientene. I tillegg var produktet immunogent. Derfor var repeterte terapisykluser kun mulig i et begrenset antall pasienter.

Inntil foreliggende oppfinnelse var SAg-baserte terapier dosebegrensende. Foreliggende oppfinnelse er den første som modifiserer superantigen med resultat i senket seroreaktivitet med beholdt superantigenaktivitet.

Kort sammendrag av oppfinnelsen

Ovenfor står trekkene og de tekniske fordelene ved foreliggende oppfinnelse beskrevet nokså bredt slik at den detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen som følger kan forstås bedre. Ytterligere trekk og fordeler ifølge oppfinnelsen, vil bli beskrevet nedenfor. De nye trekkene som menes å være karakteristiske for oppfinnelsen, både med hensyn til dels oppbygning og fremgangsmåten for utførelse, sammen med videre hensikter og fordeler, vil lettere kunne forstås fra følgende beskrivelse når disse betraktes i sammenheng med de vedlagte figurene.

I foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er en variant av statylokokk enterotoksin E (SEE), SEQ ID No: 7, hvor aminosyresekvensen av superantigenet omfatter områdene A til E hvor område A er et TCR-bindingssete og områdene B til E bestemmer bindingen til MHC klasse II molekyler og hvor konjugatet skiller seg fra statylokokk enterotoksin E ved de trekk som er angitt i krav 1; slik at det substituerte superantigenet oppviser redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigen som den er derivatisert fra; og hvori antistoffenheten er et hellengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoffaktivt fragment, som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. Eksempler på superantigener inkluderer stafylokokk enterotoksin (SE), et Streptococcus pyogenes exotoxin (SPE), et Staphylococcus aureus toksisk sjokksyndromtoksin (TSST-1), et streptokokk mitogen eksotoksin (SME) og et streptokokk superantigen (SSA). I bestemte utførelser er stafylokokk enterotoksinet stafylokokk enterotoksin A (SEA) eller stafylokokk enterotoksin E (SEE).

I bestemte utførelser er aminosyreresiduposisjonene som skal erstattes i område A valgt fra gruppen bestående av 20, 21, 24, 27, 173 og 204 som angitt i krav 1. Det er også forestilt at område C kan omfatte substitusjoner i ikke flere enn 15 aminosyreresiduer som angitt i krav 1. Disse substitusjonene kan også forekomme ved aminosyreresiduposisjonene 79, 81, 83 og 84. Videre kan område E omfatte substitusjoner av ikke mer enn 15 aminosyreresiduer som angitt i krav 1, hvori en substitusjon kan forekomme ved aminosyreresiduposisjon 227.

I en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet, hvori superantigenet er et lavtiter superantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindingssete og områdene B til E bestemmer bindingen til MHC klasse II molekyler; og aminosyresekvenser av superantigenet er substituert slik at ikke mer enn 15 aminosyreresiduer i område B erstattes med forskjellige aminosyrer, slik at det substituerte superantigenet har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigenet som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er en fullengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. Nærmere bestemt kan aminosyreresiduposisjonene i område B som skal erstattes, velges fra gruppen bestående av 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 og 49.

En annen utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er et lavtiter superantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindende sete, og områdene B til E bestemmer binding til MHC klasse II molekyler; og aminosyresekvenser av superantigen er substituert slik at ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område C blir erstattet med forskjellige aminosyrer som angitt i krav 1, slik at det substituerte superantigenet har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigenet som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff og ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment, som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. I bestemte utførelser er canceren valgt fra gruppen bestående av lunge-, bryst-, kolon-, nyre-, bukspyttkjertel-, eggstokk-, mage-, cerviks- og prostatakreft.

I en bestemt utførelse kan konjugatet omfatte SEE aminosyresekvensen inkludert substitusjonene R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227S eller SEE aminosyresekvens inkludert substitusjonene av R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227A. Enda videre kan konjugatet omfatte aminosyresekvensen av sekvens ID nr. 2.

I videre utførelser kan konjugatet omfatte en antistoffenhet, for eksempel Fab-fragmentet. Spesifikke Fab-fragmenter kan inkludere C215Fab eller 5T4Fab.

Enda videre kan konjugatet også omfatte et cytokin, slik som et interleukin. I bestemte utførelser er interleukinet

IL2 eller et derivat derav som har vesentlig den samme biologiske aktiviteten av naturlig IL2.

En videre utførelse omfatter et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet, hvori superantigenet er et lavtiter-superantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindingssete og områdene B til E bestemmer binding til MHC klasse II molerkyler; og aminosyresekvensen av superantigenet er substituert slik at ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område D blir erstattet med forskjellige aminosyrer slik at det substituerte superantigen har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigen som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. Aminosyreresiduposisjonene i område D som kan erstattes, er valgt fra gruppen bestående av 187, 188, 189 og 190.

I en annen utførelse er det tilveiebrakt et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er et lavtiter superantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindingssete og områdene B til E bestemmer bindingen til MHC klasse II molekyler; og aminosyresekvensen til superantigenet er substituert slik at ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område E blir erstattet med forskjellige aminosyrer som angitt i krav 1, slik at det substituerte superantigenet har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigen som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. I bestemte utførelser er stafylokokk enterotoksin stafylokokk enterotoksin E (SEE). Videre er aminosyreresiduposisjonene i område E som skal erstattes, valgt fra gruppen bestående av 217, 220, 222, 223, 225 og 227.

I en bestemt utførelse omfatter konjugatet videre substitusjoner av ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område A som angitt i krav 1. Nærmere bestemt kan substitusjonene i område A forekomme ved

aminosyreresiduposisjonene 20, 21, 24, 27, 173 og 204.

I en annen bestemt utførelse omfatter konjugatet videre substitusjoner av ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område B hvor substitusjonene kan forekomme ved aminosyreresiduposisjonene 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 og 49.

Enda videre kan konjugatet omfatte substitusjoner på ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område C. Nærmere bestemt, substitusjonene i område C forekommer ved aminosyreresiduposisjonene 74, 75, 78, 79, 81, 83 og 84. Konjugatet kan videre omfatte substitusjoner på ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område D hvor substitusjonene kan forekomme ved aminosyreresiduposisjonene 187, 188, 189 og 190.

I en annen bestemt utførelse er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat, hvori konjugatet omfatter et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er et lavtiter superantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindingssete og områdene B til E bestemmer bindingen til MHC klasse II molekyler; og aminosyresekvensen av superantigenet er substituert slik at ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område C er erstattet med forskjellige aminosyrer, slik at det substituerte superantigenet har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigen som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment, som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur. Nærmere bestemt kan aminosyreresiduposisjonene som skal erstattes velges fra gruppen bestende av 74, 75, 78, 79, 81, 83 og 84.

I videre utførelser kan den farmasøytiske sammensetningen omfatte et konjugat omfattende substitusjoner på ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område A, hvor substitusjonene i område A forekommer ved aminosyreresiduposisjonene 20, 21, 24, 27, 173 og 204. Enda videre kan den farmasøytiske sammensetningen også omfatte substitusjoner på ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område E. Nærmere bestemt er substitusjon av område E ved aminosyreresiduposisjon 227, hvor asparaginsyre er erstattet med serin, alanin eller er konservert variant derav.

I bestemte utførelser kan den farmasøytiske sammensetningen omfatte et konjugat omfattende SEE aminosyresekvensen (sekvens ID nr. 7) så vel som ytterligere substitusjoner bestående av R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227S.

I en annen bestemt utførelse kan den farmasøytiske sammensetningen omfatte SEE aminosyresekvensen (sekvens ID nr. 7) så vel som ytterligere substitusjoner bestående av R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227A. Enda videre kan den farmasøytiske sammensetningen omfatte et konjugat som har en aminosyresekvens av sekvens ID nr. 1.

I ytterligere bestemte utførelser omfatter den farma-søytiske sammensetningen en antistoffenhet, for eksempel et Fab-fragment. Nærmere bestemt er Fab-fragmentet C215Fab eller 5T4Fab. Den farmasøytiske sammensetningen kan videre omfatte et cytokin slik som et interleukin. Interleukinet kan være IL2 eller et derivat derav som har vesentlig den samme biologiske effekten av naturlig IL2.

I videre utførelser kan område A også omfatte substitusjoner av ikke flere enn 15 aminosyreresiduer hvor sub stitusjonene forekommer ved aminosyreresiduposisjonene 20, 21, 24, 27, 173 og 204. Videre kan område E omfatte substitusjoner av ikke flere enn 15 aminosyreresiduer. Nærmere bestemt kan substitusjon av område E være ved ami-nosyreresiduposis jon 227. Konjugatet kan omfatte SEE aminosyresekvensen (sekvens ID nr. 7) så vel som de ytterligere substitusjonene R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227S eller substitusjonene R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S og D227A. Enda videre har konjugatet aminosyresekvensen sekvens ID nr. 1.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Følgende tegninger danner en del av foreliggende beskrivelse og er inkludert for videre å demonstrere bestemte trekk ved foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen kan bedre forstås ved henvisning til en eller flere av tegningene i kombinasjon med den detaljerte beskrivelsen av bestemte utførelser presentert heri. Figur 1 viser peptidfragmenter gjenkjent av human anti-SEA som ble identifisert fra pepsinfordøying av SEA/E-18 eluert fra en anti-SEA søyle. Fragmentene ble identifisert både før og etter rensing ved revers fase HPLC koblet til et massespektrometer (MS). Fragmentene funnet i fordøyingen ved samme retensjonstid både før og etter affinitetsrensing ble ansett som positive. Figur 2 er de syv forskjellige peptidene identifisert, gjengitt som linjer over aminosyresekvensen for SEA/E-120. Tegn i lys grå betegner hvilke residuer som har blitt endret i SEA/E-120 sammenlignet med SEA/E-18. Figur 3 er en strukturell sekvenssamstilling av SEA, SED og SEH benyttet som templater for å konstruere sammen-ligningsdatamodellen SEA/E-18. Strukturelt konserverte områder er avmerket med svarte bokser. Figur 4 er en flersekvenssamstilling av SEA, SEE, SEA/E-18 og SEA/E-120. De fem forskjellige områdene A-E som inneholder alle substitusjonene i SEA/E-120 er gjengitt som linjer over samstillingen. Figur 5 er en SEA/E-18 modell (i svart) lagt over SEA (1SXT, i grått). Figur 6 er områdene av SEA/E-18 som tilsvarer de identifiserte seroreaktivitetspeptidene. Figur 7 er et scintillasjonsnærhetsassay ("Scintillation Proximity Assay; SPA") som måler spesifikk binding av<1>25I human anti-SEA bundet til C215FabSEA, C215FabSEA/E-18, -65, -97, -109, -110, -113 eller -120 på biotin konjugert anti-musF(ab)2på streptavidin PVT-kuler. Figur 8A og figur 8B illustrerer evnen til å mediere tumorrettet cytotoksisitet. Figur 8A illustrerer cytotok-sisiteten som målt i et superantigen antistoffavhengig cellulært cytotoksisitetsassay, SADCC. Figur 8B viser effektiviteten av superantigener til å mediere T-celle-dreping av MHC klasse II-uttrykkende celler som resulterer i systemisk cytotoksisitet som kunne forårsake bivirkninger målt i et superantigenavhengig cellulært cytotoksisitetsassay, SDCC. Alle nye kimera senket sine effekter i SDCC med minst 1 log og med så mye som 3 log for C215FabSEA/E-120. Figur 9 viser kveilingen av SEA/E-120-modellen. Sidekjedene av residuene G20, T21, G24 og K27 er merket i mørk grått, sidekjedene av residuene S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 og S84 er markert i grått, sidekjedene av residuene T217, S220, T222, S223, S225 er markert i svart og sidekjedene av residu S227 er markert i lys grå. Figur 10 er en aminosyresekvens av 5T4FabSEA/E-120 (sekvens ID nr. 1) med variable deler fra musefamilie 5T4 antistoff og konstantdelene fra musefamilie C242 antistoff. Posisjonene 1-458 i kjede A og posisjonene 459-672 er kjede

B.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som benyttet heri i beskrivelsen kan "en" eller "et" bety flere enn en eller et. Som benyttet heri i kravet eller kravene kan ordene "et" eller "en" bety en eller flere når benyttet sammen med ordet "omfattende", som benyttet heri kan uttrykket "en annen" bety minst en annen eller flere.

Uttrykket "antistoff" som benyttet heri, viser til et immunglobulinmolekyl som er i stand til å spesifikt binde til et spesifikt epitop på et antigen. Som benyttet heri er et antistoff ment å henvise bredt til enhver immunologisk bindende agens slik som IgG, IgM, IgA, IgD og IgE. Antistoffer kan være intakte immunglobuliner avledet fra naturlige kilder eller fra rekombinante kilder og kan være immunaktive deler av intakte immunglobuliner. Antistoffene ved foreliggende oppfinnelse kan eksistere i forskjellige former inkludert for eksempel polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, Fv, Fab og F(ab) 2, så vel som enkeltkjede antistoffer og humaniserte antistoffer (Harlow et al., 1988; Bird et al., 1988).

Uttrykket "antigen" som benyttet heri, er definert som et molekyl som fremkaller en immunrespons. Immunresponsen kan innebære antistoffproduksjon, aktivering av spesifikke immunologisk kompetente celler, eller begge. Et antigen kan avledes fra organismer, subenheter av proteiner/antigener, drepte eller inaktiverte hele celler eller lysater. Derfor erkjenner en fagperson at ethvert makromolekyl inkludert vesentlig alle proteiner, kan tjene som antigener. Videre kan antigener avledes fra rekombinant DNA.

Uttrykket "kreft" som benyttet heri, er definert som en formerende sykdom eller et ondartet neoplasma (tumor). Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, brystkreft, prostatakreft, ovarialkreft, livmorhalskreft, hud-kreft, kreft i bukspyttkjertelen, kolorektal kreft og lungekreft.

Uttrykket "konjugat" som benyttet heri, er definert som et fusjonsprotein av et superantigen eller en variant av et superantigen fusjonert eller konjugert til et antistoff eller et fragment av et antistoff.

Uttrykket "immunogen" eller "immungenisitet" som benyttet heri, er definert som en substans eller et molekyl som vekker en immunrespons.

Uttrykket "hovedhistokompatibilitetkompleks", eller "MHC" som benyttet heri, er definert som et bestemt gencluster hvorav mange koder for evolusjonært beslektede celleoverflateproteiner involvert i antigenpresentasjon, som er blant de viktigst bestemmende faktorer for histo-kompatibilitet. Klasse I MHC eller MHC-I, fungerer primært i antigenpresentasjon til CD8 T lymfocytter. Klasse II MHC eller MHC-II, fungerer primært i antigenpresentasjon til CD4 T lymfocytter.

Uttrykket "seroreaktiv", "seroreaksjon" eller "seroreaktivitet" som benyttet heri, er definert som en reaksjon eller virkning som forekommer som et resultat av serum eller sera. En med innsikt i faget erkjenner at serum eller sera fra en pasient eller dyr inneholder nøytraliserende antistoffer eller forhåndsdannede antistoffer eller endogene antistoffer mot et mangfold av antigener eller molekyler. Således vedrører seroreaktivitet reaksjonen av nøytralisering av antistoffer i serum.

Uttrykket "superantigen" som benyttet heri, er definert som en molekylklasse som stimulerer en undergruppe av T-celler ved binding til MHC klasse II molekyler og vp domenene av T-cellereseptorer, gjennom stimulering av aktiveringen av T-celler som uttrykker bestemte vp V-gensegmenter.

Uttrykket "T-cellereseptor" som benyttet heri, er definert som en reseptor som består av en disulfidkoblet heterodimer av svært variable a- eller p-kjeder uttrykt ved cellemembran som et kompleks med invariante CD3-kjeder. T-celler som bærer denne type reseptor, er ofte kalt a:P T-celler. En alternativ reseptor laget av variabel y- og 5 - kjeder blir uttrykt med CD3 på en undergruppe av T-celler.

Uttrykket "terapeutisk effektiv" som benyttet heri, er definert som mengden farmasøytisk sammensetning som er effektiv for å behandle en sykdom eller en lidelse.

Uttrykket "variant" eller "varianter" som benyttet heri, viser til proteiner eller peptider som avviker fra henholdsvis henvisningsproteinet eller peptidet. Varianter i denne sammenheng er beskrevet nedenfor og ellers i foreliggende beskrivelse i nærmere detaljer. Endringer i nukleinsyresekvensen av varianten kan for eksempel være stille ("silent"), det vil si at de ikke endrer aminosyrene som koder for nukleinsyresekvensen. Hvor endringer er begrenset til stille endringer av denne typen, vil en variant kode for et peptid med samme aminosyresekvens som henvisningspeptiden. Endringer i nukleinsyresekvensen av varianten kan endre aminosyresekvensen av et peptid som er kodet for av referansenukleinsyresekvensen. Slike nuklein-syreendringer kan føre til aminosyresubstitusjoner, addisjoner, delesjoner, fusjoner og forkortelser i peptidet som er kodet av referansesekvensen, som diskutert nedenfor. Generelt vil forskjeller i aminosyresekvenser være begrenset slik at sekvensene av referansen og varianten er svært like i sin helhet og i mange områder, identiske. En variant og referansepeptid kan avvike i aminosyresekvenser ved en eller flere substitusjoner, addisjoner, delesjoner, fusjoner eller forkortelser, som kan være til stede i en hver kombinasjon. En variant kan også være et fragment av et peptid ifølge oppfinnelsen, som skiller seg fra refe-ransepeptidsekvensen gjennom å være kortere enn referansesekvensen slik som ved en terminal eller interndelesjon. En annen variant av et peptid, ifølge oppfinnelsen, inkluderer også et peptid som beholder vesentlig den samme funksjon eller aktiviteten som slike peptider. En variant kan også være (i) en hvor en eller flere av aminosyreresiduene er substituert med en konservert eller ikke konservert aminosyreresidu og et slikt substituert aminosyreresidu kan eller trenger ikke være en kodet for ved den genetiske koden, eller (ii) en hvor en eller flere av aminosyreresiduene inkluderer en substituentgruppe, eller (iii) en hvor det modne peptidet blir fusjonert med en annen forbindelse slik som en forbindelse for å øke halve-ringstiden av peptidet (for eksempel polyetylenglykol), eller (iv) en hvor ytterligere aminosyrer blir fusjonert til det modne peptidet, slik som en leder eller sekre-sjonssekvens eller en sekvens som er benyttet for rensing av det modne peptidet. Varianter kan lages gjennom mutage-neseutførelsesmåter inkludert de benyttet mot nukleinsyrer, aminosyrer, celler eller organismer, eller kan gjøres på rekombinante måter. Alle slike varianter definert ovenfor er ansett å være innenfor omfanget av de med innsikt i faget fra lærdommen heri, og på fagområder.

Uttrykket "biologisk aktivitet" som benyttet heri, viser til en indre egenskap av et bestemt molekyl, for eksempel aktivering av bestemte celler eller binding til bestemte reseptorer. Definisjonen som benyttet heri, er primært kvalitativt fremfor kvantitativt.

I. Modifikasjon av superantigener

Foreliggende oppfinnelse drar nytte av modifisering av superantigener ved å senke immungenisiteten ved å redusere seroreaktiviteten. En med innsikt i faget er kjent med at seroreaktivitet henviser til reaksjonen av molekyler eller antigener med nøytraliserende antistoffer i serum. Nærmere bestemt drar foreliggende oppfinnelse mot et konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er et lavtitersuperantigen omfattende områdene A til E, hvilket område A er et TCR-bindingssete, og områdene B til E bestemmer bindingen til MHC klasse II molekyler; og aminosyresekvensen av superantigen blir substituert slik at ikke flere enn 15 aminosyreresiduer i område A til E blir erstattet med forskjellige aminosyrer, slik at det substituerte superantigenet har redusert seroreaktivitet sammenlignet med superantigen som den er avledet fra; og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff eller ethvert annet molekylbindende antistoff aktivt fragment, som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur.

A. Superantigener

Bakterielle superantigener som er forestilt for bruk i foreliggende oppfinnelse inkluderer en stafylokokk enterotoksin (SE), et Streptococcus pyogenes exotoxin (SPE), et Staphylococcus aureus toksisk sjokkassosiert toksin (TSST-1), et streptokokkmitogen eksotoksin (SME) og et streptokokk superantigen (SSA). En med innsikt i faget vil vite at tredimensjonale strukturer av de overnevnte subantigenene kan fås fra Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org). Videre vil en med innsikt i faget kunne oppnå nukleinsyresekvenser og aminosyresekvenser av de overnevnte superantigenene og andre superantigener fra GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/Genbanksearch.html).

I bestemte utførelser er superantigenet lavtiter-superantigen. Det er kjent og forstått av de med innsikt i faget at sera fra mennesker inneholder normalt høye titere av antistoffer mot superantigener. For stafylokokk superantigener for eksempel, er de forholdsmessige titrene TSST-1 > SEB > SEC-1 > SEC2 > SEA > SED > SEE. En med innsikt i faget kjenner til at disse forholdsmessige titrene betegner problemer med immungenisitet og problemer med seroreaktivitet eller problemer med nøytraliserende antistoffer. Foreliggende oppfinnelse forestiller således anvendelse av lav titer superantigen, slik som SEA eller SEE for å unngå seroreaktivitet av parenteralt administrert superantigener.

Enda videre er det tydelig kjent og forstått at pro-teinsekvenser og immunologisk kryssreaktivitet av superantigener eller stafylokokk enterotoksiner er delt i to beslektede grupper. En gruppe består av SEA, SEE, SED og SEH. Den andre gruppen er SPEA, SEC, SEB og SSA. Foreliggende oppfinnelse forestiller også anvendelsen av lav titer superantigener for å redusere eller fjerne kryssreaktivitet av foreliggende oppfinnelse med høy titer eller endogene antistoffer mot stafylokokk enterotoksiner.

B. Superantigenvarianter

Aminosyresekvensvarianter av superantigenproteiner kan være av substitusjons- innsetnings- eller delesjons-varianttypene. Disse variantene kan renses ifølge kjente fremgangsmåter slik som utfelling (for eksempel ammoniumsulfat), HPLC, ionebyttekromatografi, affinitetskromatografi (inkludert immunaffinitetskromatografi) eller forskjellige størrelsessepareringer (sedimentering, gelelektroforese, gelfiltrering).

Substitusjonsvariantene eller erstatningsvariantene inneholder vanligvis en aminosyre som er byttet ut for en annen ved en eller flere seter i proteinet. Substitusjoner kan være konservative, det vil si at en aminosyre blir erstattet med en av tilsvarende form og ladning. Konservative substitusjoner er godt kjent i fagområdet og inkluderer for eksempel følgende endringer: alanin til serin; arginin til lysin; aspargin til glutamin eller histidin; aspartat til glutamat; cystein til serin; glutamin til aspargin; glutamat til aspartat; glycin til prolin; histi din til asparagin eller glutamin; isoleucin til leucin eller valin; leucin til valin eller isoleucin; lysin til arginin; metionin til leucin eller isoleucin; fenylalanin til tyrosin, leucin eller metionin; serin til treonin; treonin til serin; tryptofan til tyrosin; tyrosin til tryptofan eller fenylalanin; og valin til isoleucin eller leucin.

Det er således forestilt av oppfinnerne at forskjellige endringer kan gjennomføres i DNA-sekvensene av gener uten vesentlig tap av biologisk anvendbarhet eller pro-teinaktivitet, som omtalt nedenfor. Aktiviteten betyr her induksjon av T-celleresponser for å føre til cytotoksisitet av tumorceller. Enda videre er affiniteten av superantigen for MHC klasse II molekyler redusert med minimale effekter på cytotoksisitet av superantigen.

Ved å gjøre slike endringer kan den hydropatiske indeksen av aminosyrer tas i betraktning. Viktigheten av den hydropatiske aminosyreindeksen i å meddele interaktiv, biologisk funksjon på et protein er generelt forstått i fagområdet (Kyte and Doolittle, 1982) . Det er akseptert at den relative hydropatiske egenskapen av aminosyren meddeler den sekundære strukturen av det resulterende proteinet, som etter tur styrer interaksjonen av proteinet med andre molekyler som for eksempel enzymer, substrater, reseptorer, DNA, antistoffer, antigener og lignende.

Hver aminosyre har blitt tildelt en hydropatisk indeks på basis av hydrofobisiteten og ladningsegenskapene (Kyte and Doolittle, 1982), og disse er: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Det er kjent i fagområdet at bestemte aminosyrer kan substitueres med andre aminosyrer som har en lignende hydropatisk indeks eller score og enda resultere i et protein med lignende biologisk aktivitet, det vil si, fortsatt oppnå biologisk funksjonelt, ekvivalent protein. Ved å lage slike endringer er substitusjon av aminosyrer med hydropatiske indekser innenfor +2 foretrukket, de som er innenfor +1 er spesielt foretrukket, og de som er innenfor +0,5 er enda mer foretrukket.

Det er også forstått i fagområdet at substitusjon av tilsvarende aminosyrer kan gjøres effektivt på basis av hydrofilisitet. U.S. patent 4.554.101 inkorporert ved referanse heri, forteller at den største lokale gjennom-snitts hydrofilisitet av et protein som bestemt ved hydro-filisiteten av dets naboaminosyrer, tilsvarer en biologisk egenskap for proteiner. Som beskrevet i US patent 4.554.101 har de følgende hydrofilisitetsverdiene blitt tildelt aminosyreresiduer: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartat (+3,0 + 1); glutamat (+3,0 + 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 + 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4).

Det er forstått at en aminosyre kan substitueres for en annen som har en lignende hydrofilisitetsverdi og fortsatt oppnå en biologisk ekvivalent og immunologisk ekvivalent protein. Ved slike endringer er substitusjon av aminosyrer med hydrofilisitetsverdier som er innenfor +2 foretrukket, de som er innenfor +1 er spesielt foretrukket og de innenfor +0,5 er enda mer foretrukket.

C. Fusjonsproteiner

En spesialisert type innsetningsvariant er fusjons-proteinet. Dette molekylet har generelt hele eller en vesentlig del av det naturlige molekylet koblet ved N-eller C-terminus til hele eller en del av en annen poly peptid. Et fusjonsprotein inkluderer for eksempel tilføyelse av et immunologisk aktivt domene, slik som et antistoffragment, til målspesifikke tumorceller.

Enda videre vil inklusjon av et spaltningssete ved eller nær fusjonssammenføyningspunktet forenkle fjerning av uvesentlig polypeptid etter rensing. Andre nyttige fusjoner inkluderer å koble funksjonelle domener, slik som aktive seter fra enzymer, glykosyleringsdomener, øvrige cellulære målsettingssignaler eller transmembrane områder.

D. Domeneskifting

En interessant serie av varianter kan dannes ved å substituere homologe områder av forskjellige proteiner. Dette er kjent i visse sammenhenger som "domeneskifting".

Domeneskifting innebærer fremstillingen av kimeriske molekyler ved anvendelse av forskjellige, men i dette tilfellet beslektede polypeptider. Ved å sammenligne forskjellige SAg-proteiner kan en danne forutsigelser med hensyn til funksjonelt vesentlige områder av disse molekylene. Det er da mulig å skifte beslektede domener blant disse molekylene i et forsøk på å bestemme kritikaliteten av disse områdene for SAg-funksjon. Disse molekylene kan ha ytterligere verdi i at disse "kimerene" kan skille seg fra naturlige molekyler mens de har muligheten for å til-veiebringe den samme funksjonen.

E. Rensing av proteiner

Det vil være ønskelig å rense SAg eller varianter derav. Proteinrensemetoder er godt kjent for de med innsikt i faget. Disse utførelsesmåtene innebærer på et nivå rå fraksjonering av det cellulære miljøet til peptid- og ikke-peptid-fraksjoner. Etter å ha separert proteinet fra øvrige proteiner kan proteinet av interesse videre renses ved anvendelse av kromatografiske og elektroforetiske utførelsesmåter for å oppnå delvis eller fullstendig ren sing (eller rensing til homogenitet). Analytiske fremgangsmåter spesielt egnet for fremstilling av et rent peptid er ionebyttekromatografi, eksklusjonskromatografi; polyakrylamidgelelektroforese; isoelektrisk fokusering. En spesielt effektiv metode for å rense peptider er hurtig proteinvæskekromatografi eller til og med HPLC.

Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan renses via et kodet protein eller peptid. Uttrykket "renset protein eller peptid" som benyttet heri, er ment å henvise til en sammensetning isolert fra øvrige bestanddeler hvori proteinet eller peptidet er renset til enhver grad i forhold til dets naturlig erholdte tilstand. Et renset protein eller peptid henviser derfor også til et protein eller peptid som er fri for miljøet hvor den kan forekomme på naturlig måte.

Generelt vil "renset" vise til en protein- eller pep-tidsammensetning som har blitt utsatt for fraksjonering for å fjerne forskjellige øvrige bestanddeler, og hvilken sammensetning vesentlig behandler dets uttrykte biologiske aktivitet. Når uttrykket "vesentlig renset" er benyttet, skal denne betegnelsen vise til en sammensetning hvor proteinet eller peptidet danner hovedbestanddelen av sammensetningen slik som å bestå av ca. 50 %, ca. 60 %, ca. 70 %, ca. 80 %, ca. 90 %, ca. 95 % eller mer av proteinene i sammensetningen.

Forskjellige fremgangsmåter for å kvantifisere renhetsgraden for proteinet eller peptidet vil være kjent for de med innsikt i faget i lys av foreliggende beskrivelse. Disse inkluderer for eksempel å bestemme den spesifikke aktiviteten av en aktiv fraksjon, eller å vurdere enten polypeptider i en fraksjon ved SDS-PAGE-analyse. En foretrukket fremgangsmåte for å vurdere renheten ved en fraksjon er å beregne den spesifikke aktiviteten av en fraksjon, og sammenligne dem med den spesifikke aktiviteten av utgangspunktekstraktet, og således beregne renhetsgraden, heri vurdert som et "-ganger renhetstall". De faktiske enhetene benyttet for å representere aktivitetsgraden vil selvfølgelig være avhengig av den bestemte assaymetoden benyttet for å følge rensing og om det uttrykte proteinet eller peptidet oppviser en detekterbar aktivitet eller ikke.

Forskjellige utførelsesmåter egnet for bruk i pro-teinrensing vil være kjent for de med innsikt i faget. Disse inkluderer for eksempel utfelling med ammoniumsulfat, PEG, antistoffer og lignende eller gjennom varmedena-turering, etterfulgt av sentrifugering; kromatografitrinn slik som ionebytte-, gelfiltrering-, reversfase-, hydrok-sylapatitt- og affinitetskromatografi; isoelektrisk fokusering; gelelektroforese; og kombinasjoner av slike og andre utførelsesmåter. Det er generelt kjent i fagområdet og antatt at rekkefølgen for å utøve de forskjellige ren-setrinnene kan endres eller bestemte trinn kan utelates og resultatet vil fortsatt være en egnet metode for fremstilling av et vesentlig renset protein eller peptid.

Det er kjent at migrering av et polypeptid kan variere, i blant vesentlig, under forskjellige forhold for SDS-PAGE (Capaldi et al., 1977). Det vil derfor være kjent at under forskjellige elektroforesebetingelser vil de tilsynelatende molekylvektene for rensede eller delvis rensede ekspresjonsprodukter kunne variere.

Høyytelse væskekromatografi (HPLC) er særpreget ved en svært hurtig separering med fortreffelig oppløselighet av toppene. Dette oppnås gjennom bruken av svært små partikler og høyt trykk for å opprettholde en adekvat gjen-nomstrømningshastighet. Separering kan oppnås på minutter eller maks en time. Dessuten trengs kun svært små prøve-volumer siden partiklene er så små og tettpakket at volumet av kornmellomrommet er en svært liten andel av senge-volumet. Videre trenger ikke konsentrasjonen av prøven å være særlig høy siden båndene er smale og det forekommer lite fortynning av prøven.

Gelkromatografi eller molekylær siktkromatografi er en spesiell type separasjonskromatografi som er basert på molekylstørrelser. Teorien bak gelkromatografi er at søylen som er preparert med svært små partikler av en inert substans som inneholder små porer, separerer større molekyler fra mindre molekyler mens de passerer gjennom eller rundt porene avhengig av størrelsen. Så lenge par-tikkelmaterialet ikke adsorberer molekylene, vil den eneste faktoren som bestemmer gjennomstrømningshastigheten være størrelsen. Det følger at molekyler blir eluert fra søylen i synkende størrelse så lenge formen er relativt konstant. Gelkromatografi er uovertruffen for å separere molekyler av forskjellige størrelser siden separering er avhengig av alle andre faktorer slik som pH, ionestyrke, temperatur etc. Det forekommer også så godt som ingen adsorpsjon, mindre sonespredning og elueringsvolumet er beslektet på en enkel måte med molekylvekten.

Affinitetskromatografi er en kromatografisk prosedyre som er avhengig av den spesifikke affiniteten mellom en substans som skal isoleres og molekylet som den kan bindes spesifikt til. Dette er en reseptor-ligandtype interaksjon. Cellematerialet er syntetisert gjennom å koble en av bindingspartnerne kovalent til en uoppløselig matriks. Søylematerialet blir deretter i stand til spesifikt å ad-sorbere substansen fra løsningen. Eluering forekommer ved å endre forholdene til de hvor binding ikke vil forekomme (endre pH, ionisk styrke, temperatur, etc).

F. Mutagenese av varianter

Foreliggende oppfinnelse kontemplerer at modifisering av superantigenets affinitet for MHC klasse II molekyler kan redusere superantigenets toksisitet. Således resulterer den reduserte affinitet for MHC klasse II molekyler i redusert seroreaktivitet eller redusert reaksjon med nøytraliserende antistoffer eller med endogen eller forhåndsdannede antistoffer.

I bestemte utførelser vil mutagenese benyttes for å modifisere området av superantigenet som bestemmer binding til MHC klasse II molekyler. Mutagenese vil utføres gjennom et mangfold av standard mutagenese fremgangsmåter. Mutasjon er prosessen hvor endringer forekommer i mengden eller strukturen av organismen. Mutasjon kan innebære modifisering av nukleotidsekvensen av et enkelt gen, gen-blokker eller hele kromosomer. Endringer i enkelte gener kan være en konsekvens av punktmutasjoner, som involverer fjerning, tilføyelse eller substitusjon av en enkel nukleotidbase innenfor DNA-sekvensen, eller de kan være en konsekvens av endringer som involverer tilføyelse eller delesjon av et større antall nukleotider.

En spesielt nyttig mutageneseteknikk er alaninskan-ningsmutagenese der et antall residuer blir substituert hver for seg med aminosyren alanin slik at effektene av å miste sidekjedeinteraksjoner kan bestemmes, mens risikoen for å forstyrre proteinstrukturen i stor skala blir mini-malisert (Cunningham et al., 1989).

I senere år har utførelsesmåter for å beregne like-vekstkonstanten for ligandbinding ved anvendelse av svært små mengder protein blitt utviklet (U.S. patentnumrene 5.221.605 og 5.238.808). Evnen til å utføre funksjonelle undersøkelser med små mengder materiale kan utnyttes til å utvikle svært effektive in vitro metoder for mettet mutagenese av antistoffer. Oppfinnerne har forbigått klone-trinnene ved å kombinere PCR-mutagenese med koblet in vitro transkripsjon/translasjon for den høye gjennomgangs-fremstilling av proteinmutanter. Her blir PCR-produktene benyttet direkte som templat for in vitro transkrip-sjon/translasjon av mutante enkeltkjede antistoffer. På grunn av den høye effektiviteten hvor alle 19 aminosyre substitusjonene kan frembringes og analyseres på den overnevnte måten, er det nå mulig å utføre mettende mutagenese på forskjellige residuer av interesse, en prosess som kan bli beskrevet som in vitro skanning mettende mutagenese (Burks et al., 1997).

In vitro skanning mettende mutagenese tilveiebringer en hurtig fremgangsmåte for å oppnå en stor mengde struktur-funksjonsinformasjon inkludert: (i) identifisering av residuer som modulerer ligangbindingsspesifisitet, (ii) å bedre forstå ligangbinding basert på identifisering av de aminosyrene som beholder aktivitet og de som avskaffer aktivitet ved en bestemt lokalisering, (iii) en evaluering av den totale plastisiteten av et aktivt sete eller protein subdomene, (iv) identifisering av aminosyresubstitusjoner som fører til økt binding.

Strukturstyrt setespesifikk mutagenese står for et kraftfullt verktøy for dissekering og manipulering av protein-ligand interaksjoner (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). Utførelsesmåten tilveiebringer fremstillingen og testingen av sekvensvarianter ved å introdusere en eller flere nukleotidsekvensendringer inn i et valgt DNA.

Setespesifikk mutagenese benytter spesifikke oligo-nukleotidsekvenser som koder for DNA-sekvensen av ønsket mutasjon så vel som et tilstrekkelig antall umodifiserte nabonukleotider. En primersekvens blir på denne måten til-veiebragt med tilstrekkelig størrelse og kompleksitet for å danne et stabilt kompleks på begge sidene av delesjons-koblingen som blir tilbakelagt. En primer med en lengde på mellom 17 og 25 nukleotider er foretrukket, hvorav ca. 5 til 10 residuer er på hver side av knutepunktet av sekvensen som skal endres.

Utførelsesmåten benytter vanligvis en bakteriofagvektor som foreligger i både en enkeltkjedet og dobbeltkjedet form. Vektorer som er nyttige for seterettet mutagenese inkluderer vektorer slik som M13 fag. Disse fagvektorene er kommersielt tilgjengelige og benyttelsen er godt kjent i fagområdet. Dobbeltkjedete plasmider blir også benyttet rutinemessig i seterettet mutagenese, som fjerner behovet for å overføre genet av interesse fra en fag til et plasmid.

Generelt oppnår en først en enkeltkjedet vektor eller en smelter to kjedeer av dobbeltkjedeig vektor som inkluderes i sekvensen av en DNA-sekvens som koder for det ønskelige proteinet eller genetisk element. En oligonukleotidprimer som bærer den ønskede muterte sekvens, syntetisk fremstilt, blir deretter "annealet" med den enkeltkjedete DNA-fremstillingen, tatt i betraktning feiltilpasningsgraden når hybridiseringsbetingelsene velges. Det hybridiserte produktet blir utsatt for DNA-polymeriseringsenzymer slik som E. coli polymerase I (Klenow-fragment) for å sluttføre syntesen av den mutasjonsbærende kjeden. Således blir en heterodupleks dannet hvori en kjede koder for den opprinnelige, ikke-muterte sekvens, og den andre kjeden bærer den ønskelige mutasjonen. Denne heterodupleksvektoren blir deretter benyttet for å transformere egnede vertsceller slik som E. coli- celler, og kloner blir valgt som inkluderer rekombinante vektorer som bærer den muterte sekvensfremstillingen.

Omfattende informasjon vedrørende funksjonell betydning og informasjonsinnhold for et gitt residu av et protein kan best oppnås ved mettende mutagenese hvor alle 19 aminosyresubstitusjonene blir undersøkt. Ulempene med denne tilnærmingsmåten er at logistikken av multiresidumettende mutagenese er avskrekkende (Warren et al., 1996, Brown et al., 1996; Zeng et al., 1996; Burton and Barbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). Hundrevis og kanskje til og med tusenvis, av setespesifikke mutanter må undersøkes. Imidlertid gjør forbedrede utførelsesmåter produksjon og hurtig screening av mutanter mye enklere. Se også U.S. patentene 5.798.208 og 5.830.650 for en beskrivelse av "walk-through" mutagenese.

Andre fremgangsmåter for seterettet mutagenese er beskrevet i U.S. patentene 5.220.007, 5.284.760, 5.354.670, 5.366.878, 5.389.514, 5.635.377 og 5.789.166.

Foreliggende oppfinnere kontemplerer også strukturelt beslektede forbindelser som kan formuleres for å mimikere nøkkeldeler av superantigenet eller konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse, i tillegg til de biologisk funksjonelle ekvivalentene som blir fremstilt gjennom mutage-neseutførelsesmåter diskutert over. Slike forbindelser som kan kalles peptidomimetiske forbindelser, kan også benyttes på samme måte som konjugatene ifølge oppfinnelsen, og er således også funksjonelle ekvivalenter.

Visse mimetiske forbindelser som etterligner bestanddeler av sekundær og tertiær struktur av proteiner som beskrevet i Johnson et al. (1993). Det underliggende prinsippet for anvendelse av peptidmimetiske forbindelser er at peptidstammen av proteiner eksisterer først og fremst for å orientere aminosyresidekjedene på en slik måte at molekylære interaksjoner forenkles, slik som de av antistoff og/eller antigen. En peptidmimetisk forbindelse er således utformet for å tillate molekylære interaksjoner på en tilsvarende måte som det naturlige molekyl.

Noen vellykkede anvendelser av peptidmimetikkprinsippet har fokusert på mimetikker av p-dreininger i proteiner, som er kjent å være svært antigene. Det er sannsynlig at P~dreiningsstrukturen innenfor et polypeptid kan forutsies ved databaserte algoritmer, som beskrevet heri. Når bestanddelen aminosyrer av dreiningen er bestemt, kan mimetikker konstrueres for å oppnå samme romanordning for de vesentlige bestanddelene av aminosyresidekjedene.

Øvrige tilnærmingsmåter har fokusert på anvendelsen av små proteiner som inneholder flere disulfidbindinger som attraktive, strukturelle templater for å fremstille biologisk aktive konformasjoner som etteraper bindings-setene av store proteiner. Vita et al. (1998). Et strukturelt motiv som ser ut til å være konservert gjennom evolu-sjon i bestemte toksiner er små (30-40 aminosyrer), stabile og svært mottakelige for mutasjon. Dette motiv består av en beta "sheet" og et alfa heliks sammenkoblet i den indre kjernen gjennom tre disulfider.

Beta II dreininger har vært vellykket etterapet ved anvendelser av sykliske L-pentapeptider og de med D-aminosyrer (Weisshoff et al. 1999]. Johannesson et al. (1999) har også rapportert bicykliske tripeptider med revers dreiningsinduserte egenskaper.

Fremgangsmåter for fremstilling av bestemte strukturer har vært beskrevet i fagområdet. Alfa-heliks-mimetiske forbindelser er for eksempel beskrevet i U.S. patentene 5.446.128, 5.710.245, 5.840.833 og 5.859.184. Disse strukturene tildeler peptidet eller proteinet mer termisk sta-bilitet og øker motstandsdyktigheten overfor proteolytisk degradering. Ringstrukturer er beskrevet med seks, syv, elleve, tolv, tretten og fjorten medlemmer.

Fremgangsmåter for fremstilling av konformasjonsrestrikte betadreininger og betabuler er beskrevet i for eksempel. U.S. patentene 5.440.013, 5.618.914 og 5.670.155. Betadreininger tillater endrede sidesubstituenter uten endringer i den tilsvarende stammekonformasjonen og har egnede termini for inkorporering inn i peptider gjennom standard synteseprosedyrer. Øvrige etterapende - dreiningstyper inkluderer revers og gammadreininger. Reversdreiningsmimetiske forbindelser er beskrevet i U.S. patentene 5.475.085 og 5.929.237 og gammedreiningsmimetikker er beskrevet i U.S. patentene 5.672.681 og 5.674.976.

6. Ekspresjon av superantigenene

Konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles via ekspresjonsvektorer og vertsceller. Disse ekspresjons-vektorene som har vært genetisk manipulert for å inneholde nukleinsyresekvensene av konjugatene, blir introdusert eller transformert inn i vertsceller for å fremstille konjugatene av foreliggende oppfinnelse.

Vertsceller kan genetisk manipuleres for å inkorporere nukleinsyresekvenser og utviklede aktuelle peptider. Introduksjon av nukleinsyresekvenser inn i vertsceller kan påvirkes av kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstranmediert transfeksjon, transveksjon, mikroinjeksjon, kationisk lipidmediert transfeksjon, elektroporering, transduksjon, skraplasting, ballastintroduksjon, infeksjon eller øvrige metoder. Slike metoder er beskrevet i mange standard laboratoriemanualer, slik som Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) og Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) .

Representative eksempler på egnede vertsceller inkluderer bakterielle celler, slik som streptokokker, stafylokokker, E. coli, Streptomyces Bacillus subtilis celler; soppceller, slik som gjærceller og Aspergillus celler; innsektsceller, slik som Drosophila S2 og Spodoptera Sf9 celler; dyreceller, slik som CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 og Bowes-melanomceller.

II. Kreftbehandling

I foreliggende oppfinnelse blir et superantigen konjugert til et antistoff eller fragment av et antistoff for å målsette og destruere kreftceller. Eksempler på kreft inkluderer, men er ikke begrenset til, lunge-, bryst-, kolon-, nyre-, bukspyttkjertel-, eggstokk-, mage-, cerviks-og prostatakreft.

I et aspekt må tumorcellen bære en markør som kan målsettes, det vil si, som ikke er til stede på hoveddelen av øvrige celler. Mange tumormarkører eksisterer og enhver av disse kan være egnet for målsetting i sammenheng med foreliggende oppfinnelse. Spesifikke mål for foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffer. Antistoffene som er forestilt i foreliggende oppfinnelse, inkluderer Fab-fragmentet. Eksempler på Fab-fragment inkluderer C215Fab eller 5T4Fab. I tillegg til Fab kan øvrige felles tumormarkører inkludere karcinoembryonisk antigen, prosta-taspesifikk antigen, urinveistumorassosiert antigen, føtalantigen, tyrosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialyl Lewis Antigen, MucA, MucB, PLAP, østrogenreseptor, lami-ninreseptor, erb B og pl55.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er å benytte et immunstimulerende molekyl som en agens eller mer foretrukket, sammen med en annen agens, slik som for eksempel cytokiner som for eksempel IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, tumornekrosefaktor; interferoner alfa, beta og gamma; F42K og øvrige cytokinanaloger; et cytokin slik som for eksempel MIP-1, MIP-lbeta, MCP-1, RANTES, IL-8; eller en vekstfaktor slik som for eksempel FLT3 ligand. Det stimu-lerende molekylet kan konjugeres til konjugatet av foreliggende oppfinnelse eller administreres som en adjuvans i kombinasjon med konjugatet av foreliggende oppfinnelse.

En bestemt cytokin som er tenkt for bruk er IL2 eller et derivat som har vesentlig den samme biologiske aktiviteten som naturlig IL2. Interleukin-2 (IL-2), først kalt T-celle vekstfaktor I, er en svært effektiv induserende faktor for T-celleformering og er en vekstfaktor for alle subpopulasjonene av T-lymfocytter. IL-2 er en antigenuavhengig formeringsfaktor som induserer fremgang i cellesyklusen i hvilende celler og således tillater klonal ekspansjon av aktiverte T-lymfocytter. Siden nylig isolerte leukemiceller også utskiller IL2 og svarer til det, kan IL2 fungere som en autokrin vekstmodulator for disse cellene i stand til å forverre ATL. IL2 fremmer også formering av aktiverte B-celler, mens dette imidlertid krever nærvær av ytterligere faktorer som for eksempel IL4. In vitro kan IL2 også stimulere vekst av oligodendroglialceller. På grunn av effektene på T-celler og B-celler er IL2 en sentral regulerende faktor for immunresponser. Det spiller også en rolle for antiinflammatoriske reaksjoner, i hematopoiesis og i tumorovervåkning. IL-2 stimulerer syntesen av IFN-y i perifere leukocytter og induserer også utskillelse av IL-1, TNF-a og TNF-p. Induksjon av sekresjon av tumordrepende cytokiner er sannsynligvis hovedfaktorene ansvarlig for antitumoraktivitet ved IL2, utenom aktiviteten i ekspansjon av LAK-celler (lymfokinaktiverte dreperceller).

Det er forestilt at konjugatene foreliggende oppfinnelse kan administreres til en pasient som lider av kreft eller en formeringssykdom. Mengden som skal administreres til pasienten er en terapeutisk effektiv mengde eller en mengde som resulterer i behandling av kreften eller sykdommen. Administrasjonen av konjugatet kan være gjennom et parenteralt eller fordøyelsesveiene. Eksempler på fordøyelses-veier inkluderer, men er ikke begrenset til, oralt, rektalt, sublingualt og bukkalt. Eksempler på parenterale veier inkluderer, men er ikke begrenset til, intraperitoneal, intravenøs, subkutan, intramuskulær, intradermal, intratumoral og intravaskulær.

III. Farmasøytiske sammensetninger

Konjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan benyttes alene eller i sammenheng med andre forbindelser, slik som terapeutiske forbindelser.

De farmasøytiske formene egnet for injeksjon inkluderer sterile, vandige løsninger og/eller dispersjoner; formuleringer som inkluderer sesamolje, peanøttolje og/eller vandig propylenglykol; og/eller sterile pulvere for improvisert fremstilling av sterile, injiserbare løs- ninger og/eller dispersjoner. For alle tilfellene må formen være steril og/eller må være flytende i tilstrekkelig grad til at den lett kan sprøytes. Den må være stabil under fremstillingsbetingelsene og/eller oppbevaring og/eller må være preservert mot virkningen av kontaminering med mikroorganismer slik som bakterier og/eller sopp.

Løsninger av aktive forbindelser som frie baser og/eller farmakologisk akseptable salter, kan fremstilles i vann som er passe blandet med en surfaktant, slik som hydroksypropylcellulose. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler, og/eller blandinger derav og/eller i oljer. Under vanlige betingelser av oppbevaring og/eller bruk, inneholder disse preparatene et konserveringsmiddel for å forhindre veksten av mikroorganismer .

Konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan formuleres i en sammensetning i en nøytral og/eller salt form. Farmasøytisk akseptable salter inkluderer syreaddi-sjonssalter (dannet med frie aminogrupper av protein) og/eller som er dannet fra uorganiske syrer, slik som for eksempel saltsyre og/eller fosforsyrer, og/eller slike organiske syrer som eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, mandel-syre og/eller lignende. Saltene dannet med frie karboksyl-grupper kan også være avledet fra uorganiske baser slik som natrium, kalium, ammonium, kalsium og/eller jernoksider, og/eller slike organiske baser som isopropylamin, trimetylamin, histidin, prokain og/eller lignende. Tekno-logien hva gjelder anvendelse av peptidterapeutiske agenser som aktive ingredienser kan benyttes som beskrevet i U.S. patentene 4.608.251, 4.601.903, 4.599.231, 4.599.230, 4.596.792 og/eller 4.578.770.

Bæreren kan også være et løsemiddel og/eller disper-sjonsmedium inneholdende for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glyserol, propylenglykol og/eller flytende polyetylenglykol og/eller lignende), egnede blandinger derav og/eller vegetabilske oljer. Korrekt fluiditet kan opprettholdes ved for eksempel anvendelse av et belegg slik som lecitin, gjennom opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen ved tilfellet av dispersjon og/eller ved anvendelse av surfaktanter. Forhindringen av virkningene av mikroorganismer kan tilveiebringes gjennom forskjellige antibakterielle og/eller antisoppagenser, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, time-rosal og/eller lignende. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotone agenser som for eksempel sukkere og/eller natriumklorid. Prolongert absorpsjon av de injiserbare sammensetningene kan tilveiebringes gjennom anvendelse av agenser som forsinker absorpsjon i sammensetningene, som for eksempel aluminiummonostearat og/eller gelatin.

Sterile, injiserbare løsninger kan fremstilles ved inkorporering av aktive forbindelser i den nødvendige mengden i egnet løsemiddel med forskjellige øvrige ingredienser nevnt ovenfor, etter behov, etterfulgt av filtre-ringssterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt gjennom inkorporering av de forskjellige steriliserte, aktive ingrediensene i et sterilt vehikkel som inneholder basis dispersjonsmediumet og/eller nødvendige øvrige ingredienser blant de nevnt ovenfor. Ved tilfellet sterile pulvere for fremstilling av sterile, injiserbare løsninger, er foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørking og/eller frysetørkingsutførelsesmåter som gir et pulver av aktiv ingrediens pluss eventuelt enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere steril, filtrert løsning derav. Fremstillingen av mer og/eller høyt konsentrerte løsninger for direkte injeksjon er også forestilt hvor anvendelsen av DMSO som løsemiddel er forestilt å resultere i svært hurtig penetrering, således førende til avlevering av høye konsentrasjoner av aktiv ingrediens til et lite område.

Ved formulering vil løsninger administreres på en måte som er kompatibel med doseringsformuleringen og/eller i en slik mengde som er terapeutisk effektiv. Formuleringene kan enkelt administreres i et mangfold av doseringsformer slik som typen injiserbare løsninger beskrevet ovenfor, men stoffrigjørende kapsler og/eller lignende kan også benyttes.

For parenteral administrasjon i en vandig løsning bør løsningen for eksempel om nødvendig, være tilstrekkelig bufret og/eller det flytende fortynningsmiddelet bør først gjøres isotont med tilstrekkelig saltvann og/eller glukose. Disse bestemte vandige løsningene er spesielt egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan og/eller intraperitoneal administrasjon. I sammenheng med dette er sterile, vandige medier som kan benyttes kjent for de med innsikt i faget i lys av foreliggende beskrivelse. En dosering kan for eksempel være oppløst i en ml isoton nat-riumkloridløsning og/eller enten tilsatt til 1000 ml av en hypodermocyklisk væske og/eller injisert ved det foreslåtte infusjonssetet (se for eksempel "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. utgave, s. 1035-1038 og/eller 1570-1580). Noe variasjon i dosering vil nødvendigvis forekomme avhengig av tilstanden til pasienten som skal behandles. Personen som er ansvarlig for administrasjon vil uansett bestemme den egnede dosen for den individuelle pasienten.

Det aktive konjugatet og/eller agenser kan formuleres innenfor en terapeutisk blanding for å omfatte ca. 0,0001 til 1,0 milligram, og/eller ca. 0,001 til 0,1 milligram, og/eller ca. 0,1 til 1,0 og/eller til og med ca. 10 milligram per dose og/eller omkring dette. Flere doser kan også administreres.

I tillegg til forbindelsene formulert for parenteral administrasjon slik som intravenøs, intraartikulær og/eller intramuskulær injeksjon, inkluderer øvrige farmasøytisk akseptable former, for eksempel tabletter og/eller andre faste stoffer for oral administrasjon; liposomale formuleringer; tidsavhengig frigjøringskapsler; og/eller enhver annen form i bruk i dag, inkludert kremer.

En kan også benytte nasale løsninger og/eller sprayer, aerosoler og/eller inhalanter i de aktuelle medikamenter. Nasale løsninger er generelt vandige løsninger laget for å bli administrert til de nasale veiene i dråper og/eller sprayer. Nasale løsninger blir fremstilt slik at de på mange måter er like nasale sekresjoner, slik at en normal ciliaaktivitet blir opprettholdt. Således er vandige, nasale løsninger vanligvis isotone og/eller lett bufret for å beholde en pH på mellom 5,5 og 6,5. I tillegg kan antimikrobielle konserveringsmidler lik de benyttet i oftalmiske preparater, og/eller egnede stoffstabiliserende midler om nødvendig inkluderes i formuleringen. Forskjellige kommersielle, nasale preparater er kjent og/eller inkluderer for eksempel antibiotika og/eller antihistaminer og/eller blir benyttet for astmaprofylakse.

Ytterligere formuleringer som er egnet for andre administrasjonsmoder inkluderer vaginale stikkpiller og/eller pessarer. Et rektalt pessar og/eller stikkpille kan også benyttes. Stikkpiller er faste doseringsformer av forskjellige tyngder og/eller fasonger, vanligvis antisep-tiske for innføring i rektum, vagina og/eller uretra. Etter innlegg vil stikkpiller mykne, smelte og/eller løse seg opp i hulromsvæskene. Generelt for stikkpiller kan tradisjonelle bindestoffer og/eller bærestoffer inkluderes, for eksempel polyalkylenglykoler og/eller triglyserider; slike stikkpiller kan formuleres fra blandinger inneholdende aktiv ingrediens i området 0,5 til 10 %, foretrukket 1-2 %.

Orale formuleringer inkluderer eksipienser som vanligvis er benyttet, for eksempel farmasøytisk grad av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, cellulose, magnesiumkarbonat og/eller lignende. Disse sammensetningene tar form av løsninger, suspensjoner, tab letter, piller, kapsler, opprettholdte frigjøringsformule-ringer og/eller pulvere. I bestemte definerte utførelser vil orale, farmasøytiske sammensetninger omfatte et inert fortynningsmiddel og/eller assimilerbart spiselig bærestoff, og/eller de kan være inneholdt i hard og/eller myk skallgelatinkapsel, og/eller de kan komprimeres til tabletter og/eller de kan inkorporeres direkte med maten i dietten. For oral, terapeutisk administrasjon kan aktive forbindelser inkorporeres med eksipienser og/eller benyttes i form av spiselige tabletter, bukkale tabletter, trocheer, kapsler, eleksirer, suspensjoner, siruper, skiver og/eller lignende. Slike sammensetninger og/eller fremstillinger bør inneholde minst 0,1 % aktiv forbindelse. Prosentandelen av sammensetningene og/eller preparatene kan selvfølgelig varieres og/eller kan være beleilig mellom ca. 2 og ca. 75 % av vekten av enheten, og/eller foretrukket mellom 25-60 %. Mengden aktive forbindelser i slike terapeutisk nyttige sammensetninger er slik at en egnet dosering vil oppnås.

Tabletter, trocheer, piller, kapsler og/eller lignende kan også inneholde følgende: et bindemiddel som gummi tragant, akasie, maisstivelse og/eller gelatin; eksipienser slik som dikalsiumfosfat; en desintegreringsagens slik som maisstivelse, potetstivelse, algininsyre og/eller lignende, et glidemiddel slik som magnesiumstearat og/eller et søtningsstoff slik som sukrose, laktose og/eller sakkarin kan tilsettes og/eller et smakstilsettende stoff, slik som peppermynte, olje av vintergrønnolje og/eller kirsebærsmak. Når doseringsenhetsformen er en kapsel, kan den i tillegg til materialene nevnt ovenfor, inneholde et flytende bærestoff. Forskjellige øvrige materialer kan være til stede som belegg og/eller for ellers å modifisere fysiske former for doseringsenheten. For eksempel kan tabletter, piller og/eller kapsler belegges med skjellakk, sukker og/eller begge. En sirup av eliksir kan inneholde de aktive forbindelsene sukrose som søtningsagens, metyl og/eller propylparabener som konserveringsmidler, et farge- og/eller smaksstoff slik som kirsebær og/eller appelsinsmak.

I visse utførelser er anvendelse av lipidformuleringer og/eller nanokapsler forestilt for introduksjon av et konjugat/agenser og/eller genterapivektorer, inkludert begge villtype- og/eller antisensvektorer inn i vertsceller .

Nanokapsler kan generelt innfange forbindelser på en stabil og/eller reproduserbar måte. For å unngå bivirkninger på grunn av intracellulær polymer overladning bør slike ultrafine partikler (med størrelse på rundt 0,1 u.m) designes ved anvendelse av polymerer som kan nedbrytes in vivo. Bionedbrytbare polyalkyl-cyanoakrylat nanopartikler som tilfredsstiller disse behovene er forestilt for bruk ved foreliggende oppfinnelse og/eller slike partikler kan enkelt lages.

I en utførelse av foreliggende oppfinnelse kan konjugatet assosieres med et lipid. Konjugatene assosiert med lipid kan innkapsles i det vandige interiøret av et liposom, innflettet i lipiddobbeltlaget av en liposom, koblet til en liposom via en lenkemolekyl som er assosiert med både liposomen og oligonukleotid, innfanget i et liposom, kompleksert med en liposom, dispergert i en løsning som inneholder en lipid, blandet med en lipid, kombinert med en lipid, inneholdt som en suspensjon i en lipid, inneholdt eller kompleksert med en micelle, eller ellers assosiert med en lipid. Lipiden eller lipid/konjugatassosierte sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, er ikke begrenset til noen bestemt struktur i løsning. De kan for eksempel være til stede i en dobbeltlagstruktur som mi-celler, eller med en sammenfalt struktur. De kan også enkelt være blandet i en løsning, eventuelt dannende aggregater som ikke er jevne i enten størrelse eller form.

Lipider er fettaktige substanser som kan være naturlig forekommende eller syntetiske lipider. For eksempel inkluderer lipider de fettaktige dråpene som forekommer naturlig i cytoplasma, så vel som forbindelsesklassen som er godt kjent i fagområdet, som inneholder langkjede, ali-fatiske hydrokarboner og derivatene derav, slik som fett-syrer, alkoholer, aminer, aminoalkoholer og aldehyder.

Fosfolipider kan benyttes for fremstilling av liposomer, og kan bære et nett positive, negative eller nøytral ladning. Diacetylfosfat kan benyttes for å tildele en negativ ladning på liposomene og stearylamin kan benyttes for å tildele positiv ladning på liposomene. Liposomene kan være laget av en eller flere fosfolipider.

Et nøytralt ladet lipid kan omfatte et lipid uten ladning, et vesentlig uladet lipid eller en lipidblanding med et likt antall positive og negative ladninger. Egnede fosfolipider inkluderer fosfatidylkoliner og andre som er godt kjent for fagfolk på området.

Lipider egnet for bruk ifølge foreliggende oppfinnelse, kan skaffes fra kommersielle kilder. Dimyristylfosfatidylkolin ("DMPC") kan for eksempel skaffes fra Sigma Chemical Co., dicetylfosfat ("DCP") skaffes fra K&K Laboratories (Plainview, NY); kolesterol ("Chol") er skaffet fra Calbiochem-Behring; dimyristylfosfatidylglyserol ("DMPG") og øvrige lipider kan skaffes fra Avanti Polar Lipids, Inc.

(Birmingham, Ala.). Stamløsninger for lipider i kloroform eller kloroform/metanol kan lagres ved ca. -20 °C. Kloroform blir foretrukket benyttet som eneste løsemiddel siden det er lettere å fordampe enn metanol.

Fosfolipider fra naturlige kilder, slik som egg eller søyabønnefosfatidylkolin, hjernefosfatidinsyre, hjerne-eller plantefosfatidylinositol, hjertekardiolipin og plante- eller bakteriefosfatidyletanolamin er foretrukket ikke benyttet som den primære fosfatid, det vil si bestående av 50 % eller mer av den totale fosfatsammenset-ningen, på grunn av ustabilitet og utetthet for de resulterende liposomene.

Fosfolipider kan danne forskjellige strukturer enn liposomer når disse dispergeres i vann, avhengig av det molare forholdet av lipid mot vann. Ved lave forhold er liposomen den foretrukne struktur. De fysiske egenskapene av liposomer er avhengig av pH, ionestyrke og/eller nærvær av bivalente kationer. Liposomer kan vise lav permeabilitet til ionisk og/eller polare substanser, men ved økte temperaturer gjennomgås en faseovergang som endrer sin gjennomtrengelighet markant. Faseovergangen innebærer en endring fra en tettpakket, ordnet struktur kjent som gel-tilstanden, til en løst pakket, mindre ordnet struktur, kjent som den flytende tilstanden. Dette skjer ved en karakteristisk faseovergangstemperatur og/eller fører til en økning i gjennomtrengelighet for ioner, sukkere og/eller stoffer.

Liposomer interagerer med celler via fire forskjellige mekanismer: Endocytose ved fagocytiske celler av retikuloendotelialsystemet slik som makrofager og/eller neutrofiler; adsorpsjon til celleoverflaten enten gjennom ikke-spesifikke, svake hydrofobe og/eller elektrostatiske krefter, og/eller ved bestemte interaksjoner med celle-overf latebestanddeler; fusjon med plasma cellemembran ved innføyelse av lipid dobbeltlag av liposomet til plasma-membranen med samtidig frigjøring av liposominnholdet inn i cytoplasma; og/eller ved overføring av liposomale lipider til cellulær og/eller subcellulære membraner, og/eller vise versa, uten assosiering av liposominnholdet. Hvilken mekanisme som er operativ, kan endres ved å variere liposomformuleringen mens flere enn en kan ha virkning samtidig.

Liposommediert oligonukleotidavlevering og ekspresjon av fremmed DNA in vitro har vært svært vellykket. Wong et al.,

(1980) viste gjennomførbarheten av liposommediert avlevering og ekspresjon av fremmed DNA i dyrkede kyllingembryo, HeLa og hepatomceller. Nicolau et al.,

(1987) gjennomførte vellykkede liposommediert genoverføring i rotter etter intravenøs injeksjon.

I bestemte utførelser av oppfinnelsen kan lipidet assosieres med et hemagglutineringsvirus (HVJ). Dette har vist å hjelpe fusjon med cellemembranen og fremme inngang i cellen for liposominnkapslede DNA (Kaneda et al., 1989) . I andre utførelser kan lipidet være kompleksert eller benyttet sammen med nukleære ikke-histone kromosomproteiner (HMG-1) (Kato et al., 1991). I enda videre utførelser kan lipidet komplekseres eller benyttes i sammenheng med både HVJ og HMG-1. I og med at slike ekspresjonsvektorer har vært vellykket benyttet i overføring og ekspresjon av et oligonukleotid in vitro og in vivo er de anvendelige for foreliggende oppfinnelse. Når en bakteriell promoter er benyttet i DNA-konstruktet, vil det også være ønskelig å inkludere i liposomene en egnet bakteriell polymerase.

Liposomer benyttet med konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse, kan lages på forskjellige metoder. Størrelsen på liposomene varieres avhengig av fremgangsmåten for syntese. En liposom suspendert i en vandig løsning er generelt i form av en sfærisk vesikkel som har en eller flere konsentriske lag av lipid dobbeltlag molekyler. Hvert lag består av et parallell array av molekyler representert ved formelen XY, hvori X er en hydrofil enhet og Y er en hydrofob enhet. I vandig suspensjon er de konsentriske lagene anordnet slik at de hydrofile enhetene tenderer til å være i kontakt med den vandige fasen og de hydrofobe områdene tenderer til å assosiere med seg selv. For eksempel når vandige faser er til stede både i og utenfor liposomen, kan liposommolekyler danne et dobbeltlag kjent som et lamella av arrangementet XY-YX. Lipidaggregater kan dannes når hydrofile og hydrofobe deler av mer enn et lipidmolekyl blir assosiert med hverandre. Størrelsen og fasongen på disse aggregatene vil være avhengig av mange forskjellige variabler slik som beskaffenheten av løsemiddelet og nærvær av øvrige forbindelser i løsningen.

Liposomer benyttet med konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ifølge

laboratorieutførelsesmåter som er godt kjent. I en foretrukket utførelse blir liposomer fremstilt gjennom å blande liposomale lipider i et løsemiddel i en beholder, for eksempel et glass, pæreformet flaske. Beholderen bør ha et volum som er ti ganger større enn volumet på den forventede suspensjonen av liposomer. Ved anvendelse av en roterende fordampningsinnretning blir løsemiddelet fjernet ved ca. 40 °C under negativt trykk. Løsemiddelet blir vanligvis fjernet i mellom 5 minutter og 2 timer, avhengig av det ønskede volum av liposomer. Sammensetningen kan videre tørkes i et tørkeapparat under vakuum. De tørkede lipidene blir generelt kastet etter ca. 1 uke på grunn av tendensen til å nedbryte over tid.

Tørkede lipider kan hydreres ved ca. 25-50 mM fosfolipid i sterilt, pyrogenfritt vann ved risting til alt av lipidfilmen er resuspendert. De vandige liposomene kan deretter separeres i alikvoter som plasseres i et hette-glass, blir lyofilisert og forseglet under vakuum.

I alternativet kan liposomer fremstilles i samsvar med øvrige kjente laboratoriefremgangsmåter: fremgangsmåten ifølge Bangham et al., (1965), fremgangsmåten ifølge Gregoriadis, som beskrevet i DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis red. (1979) s. 287-341, og reversfase fordampningsmetoden som beskrevet av Szoka og Papahadjopoulos (1978). Overnevnte fremgangsmåter avviker i sine henholdsvise evner til å fange vandig materiale og sine henholdsvise vandige plass-mot-lipidforholdene.

De tørkede lipidene eller lyofiliserte liposomene fremstilt som beskrevet ovenfor, kan dehydreres og rekonstitueres i løsning av hemmende peptid og fortynnes til en egnet konsentrasjon med et egnet løsemiddel, for eksempel DPBS. Blandingen blir deretter ristet hardt i en vortex-blander. Ikke-innkapslet nukleinsyre blir deretter fjernet ved sentrifugering ved 29.000 x g og liposomale pelletter blir vasket. De vaskede liposomene blir resuspendert ved en total fosfolipidkonsentrasjon, for eksempel ca. 50-200 mM. Mengden nukleinsyre innkapslet kan bestemmes i samsvar med standard utførelsesmåter. Etter bestemmelse av mengden nukleinsyre innkapslet i liposompreparater kan liposomene fortynnes til egnede konsentrasjoner og lagres ved 4 °C inntil bruk.

En farmasøytisk sammensetning omfattende liposomene vil vanligvis inkludere sterilt, farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller fortynningsmiddel, slik som vann eller saltvannløsninger.

IV. Eksempler

Følgende eksempler er inkludert for å vise foretrukne utførelser av oppfinnelsen. Det bør erkjennes av de med innsikt i faget at utførelsesmåtene beskrevet i eksemplene som følger, representerer utførelsesmåter funnet opp av oppfinneren for å fungere godt i sammenheng med oppfinnelsen og således kan ansees å utgjøre foretrukne utførelsesmåter

Eksempel 1

In vitro mutagenese

De forskjellige superantigenvariantene ble laget ved anvendelse av en polymerase kjedereaksjon (PCR)-basert metode.

Kort sagt inneholdt PCR-produktene to unike restrik-sjonsenzymseter, en på hver ende. For subkloningsprosedyren ble pUC19 (GIBCO BRL Life Technologies, Middlesex, U.K.) benyttet, preparert ifølge QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol (QIAGEN, Hilden, Tyskland). Punktmutasjoner som ikke påvirker aminosyresekvensen ble inkludert for å forenkle videre analyse. PCR-reaksjonen ble utført på et Perkin Eimer GeneAmp PCR-system 2400 med Taq DNA polymerase og egnet PCR-buffer inneholdende 15mM MgCl2(Roche Molecular Biochemicals, Basel, Sveits). PCR-produktene og vektorene ble spaltet med egnede restriksjonsenzymer over natten. De ble renset ved anvendelse av elektroforese i en 1 % agarosegel (GIBCO BRL Life Technologies) inneholdende 0,5 u.g/ml etidiumbromid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) i TAE-buffer (Sigma-Aldrich). Det DNA-inneholdende fragmentet ble skåret ut fra gelen og ekstrahert ved anvendelse av CONSERT™ Rapid Gel Extraction System (GIBCO BRL Life Technologies). Vektor og innleggsdel ble legert (T4 DNA-ligase, Roche Molecular Biochemicals) ved romtemperatur i 3-4 timer. Legeringsblandingen ble transformert inn i Escherchia coli bakteriestammen DH5a (GIBCO BRL Life Technologies) ifølge bruksanvisningen som fulgte med cellene. Positive kloner ble verifisert ved anvendelse av DNA-sekvensering. De riktige sekvensene ble spaltet ut med Rsrll/Hindlll ved 37 °C over natten og legert i ekspre-sjonsvektoren (Dohlsten et al., 1994). De variable delene av Fab ble endret for C215 for å tilpasse husets dyremo-deller. Til slutt ble konstruktet elektroporert inn i Escherchia coli K12-stammen UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, AompT).

Eksempel 2

Identifisering av humane anti-SEA-bindende områder

Områder gjenkjent av human anti-SEA ble identifisert fra en pepsinfordøyning av SEA eller en kimerisk variant av SEA og SEE, SEA/E-18, tidligere beskrevet som SEE/A-A (Antonsson et al., 1997) med substitusjonen D227A.

Hvert superantigen ble inkubert med 0,5 % pepsin, lOmM HC1, 150mM NaCl (vektprosent) i 60 minutter ved 37 °C. Peptidblandingen ble nøytralisert med 2M Tris-HCl pH 8,0 og satt på en 1 ml HiTrap søyle (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige) med immobilisert human anti-SEA. PBS, 8,lmM Na2HP04, l,5mM KH2P04, 137mM NaCl, 2,7mM KC1, pH 7,3 ble benyttet som vaskebuffer og antistoffbindende fragmenter ble eluert ved anvendelse av 0,1M eddiksyre, pH 3,0. Fragmentene ble identifisert både før og etter rensing med HPLC koblet til et massespektrometer (MS) (Figur 1). Kromatografien ble utført på en C18 søyle (2x250mm)

(VYDAC™, Hesperia, California, USA) ved anvendelse av en lineær stigning fra 10 til 60 % acetonitril i 0,1 % trifluoreddiksyre over 30 minutter ved 40 °C. Bestemmelse av massen ble utført ved anvendelse av elektrospray MS (Finnigan LCQ, Thermoquest, San Jose, California, USA). Fragmentene funnet i fordøyningen ved samme retensjonstid både før og etter affinitetsrensing ble ansett som posi-tiver (Figur 2).

Eksempel 3

Molekylmodellering

Det kimeriske superantigenet SEA/E-18 ble basert på SEE-sekvensen bortsett fra fire aminosyreresiduer nær N-terminus som var fra SEA og en substitusjon i C-terminus-delen D227A (figur 3 og figur 4) (Antonsson et al., 1997).

Kort sagt ble de tredimensjonale strukturene av superantigener med mye høyere sekvenslikhet med SEE enn det som var tilgjengelig fra PBD-databasen benyttet som templater for å konstruere en homologimodell av SEAE-18, det vil si SEA (1ESF, Shard et al, 1SXT, Sundstrom et al 1996 A), SED (Sundstrom et al., 1996 B) og SEH (1ENF)

(Håkansson et al., 2000). SEA var mest lik SEE med en sekvenslikhet på 80 %. SED hadde en sekvensidentitet på 60 % og SEH 50 % mot SEE.

Modellkonstruksjonen ble utført ved anvendelse av HOMOLOGY-modulen i INSIGHTII-programvaren (MSI, San Diego). Strukturene for de tre superantigenene SEA, SED og SEH ble samstilt og strukturert bevarte områder ("structural conserved regions") (SCRer) ble bestemt (figur 3). Disse områdene ble vanligvis kartlagt til vanlige, sekundære strukturer i molekylene. Råsekvensen for SEA/E-18 ble lastet inn og kjedet over SCRene fra SEA-strukturen (figur 5). lSXT-koordinatene for SEA ble benyttet, bortsett fra for de første ni residuene i N-terminus hvor 1ESF ble benyttet. Områdene mellom SCRene var i de fleste tilfellene fleksible bøyleområder og var bygget fra SEA og SED. De fleste av bøylene ble bygget fra SEA, bortsett fra residueneGlnl9, Ilel40, Aspl41, Lysl42, Serl89, Glyl91, Asp200, Pro206 Asp207 og Leu224, som ble bygget fra SED. Noen områder innenfor SCRene viste større sekvenslikhet med SED og ble derfor bygget ved anvendelse av SED som strukturelt templat (Ile37, Glu49, Asn50, Thr51, Leu52, Serl95 og Thr218) (figur 3).

På grunn av det faktum at SEA ble benyttet som strukturelt templat for de fleste residuene i SEA/E-18 forekom ingen problemer med overlapping av sidekjeder. Sammenskjøtningspunkter før og etter SCRene ble reparert. Først ble de substituerte sidekjedene løsnet og deretter ble energiminimalisering og molekylær dynamikksimuleringer løsnet på for alle sidekjedene innenfor SCRene ved anvendelse av standard utførelsesmåter i HOMOLOGY. Bøyleområder ble løsnet på en om gangen ved anvendelse av de første 1000 trinn av energiminimalisering etterfulgt av 1000 trinn molekylær dynamikk. Denne forbedringsmetoden ble benyttet først på bøylesidekjedene og deretter på alle atomene i bøylen. For alle simuleringene ble CVFF kraftfeltet med en kraftkonstant på 100 kcal/Å2 benyttet ved anvendelse av et tidstrinn på 2 fs.

Den endelige modellen ble testet for dårlige områder ved anvendelse av PROSTAT-modulen i INSIGHTII. Ingen dårlige områder ble detektert. Det indre av proteinet pakket godt med ingen signifikant forskjell sammenlignet med SEA. Alle residuene endte opp i tillatte områder i et ramachandran plot. Superiorposisjon av 1SXT med denne modellen ga et RMSD på 0,4Å når Ca atomer ble sammenlignet. Hoved-forskjellen mellom de to strukturene kan sees i P9-pi0-bøy-len (residuene Hisl87-Thrl93) (figur 5).

Nye modeller av nye superantigenvarianter ble konstruert ved anvendelse av SEA/E-18-modellen som et templat. De spesifikke aminosyreresiduene ble endret direkte på modellen. Den mest fordelaktige sidekjedekonformasjonen ble valgt ved anvendelse av et enkelt sterisk hindersøk etterfulgt av en kort energiminimalisering.

Eksempel 4

Dyrking og rensing

C215FabSEA/E kimerer ble uttrykt som fusjonsproteiner i E. coli K12-stammen UL635 ved anvendelse av plasmid med en IPTG-indusert Lac UV-5 promoter og et kanamycinresistent gen.

Kort sagt ble bakterier fra frossen (-70 °C) stamløsning i 20 % glyserol inkubert ved 25 °C i 22-24 timer i risteflasker som inneholdt (per liter) 2,5 g (NH4)2S04, 3 g KH2P04, 2 g K2HP04, 0,5 g natriumsitrat, 1 g MgS04'H20, 0,05 g kanamycin, 12 g glukosemonohydrat og 1 ml sporelement-løsning, imidlertid uten Na2Mo04'2H20. Cellene ble dyrket til et Abs62opå 2-3 og 10 ml av dyrkemediet ble benyttet for å inokulere en 1 liters fermenteringsanordning (Belach Bioteknikk, Sverige) med utgangsvolum på 800 ml. Fermente-ringsanordningsmediet inneholdt (per liter) 2,5 g (NH4)2S04, 9 g K2HP04, 6 g K2HP04, 0,5 g natriumsitrat, 1 g MgS04-7H20, 0,05 g kanamycin, 23,1 g glukosemonohydrat og 1 ml spor-elementløsning som over. pH ble holdt konstant ved 7,0 ved titrering av 25 % NH3, lufting var ved 1 liter/minutt og temperaturen var 25 °C. Under batchfasen var oppløst oksy-gen holdt ved 30 % gjennom regulering av agitasjonen fra 400 rpm til 2000 rpm og under forebatchen gjennom regulering av glukoseforet (60 % vekt/volum). Produktdannelsen ble indusert når absorbansen ved 620 nm var 45 ved tilføy-else av 0,1 mM isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Etter fermentering ble cellene fjernet gjennom sentrifugering ved -20 °C før opprensing.

Renseprosedyren ble delt i tre trinn. Først ble DNA fjernet fra dyrkesupernatanten gjennom 0,19 % polyetylenimin (vekt/volum) i 0,2M NaCl, pH 7,4, ved anvendelse av en peristaltisk pumpe med gjennomstrømningshastighet på 12 ml/min. Etter sentrifugering ved 7500 x g i 30 minutter ble supernatanten samlet inn.

Det ble satt på et 60 ml protein-G Sepharose 4, fast gjennomstrømningssøyle (Amersham Pharmacia Biotech) med en gjennomstrømningshastighet på 14 ml/min. Søylen ble vasket med PBS og elueringen ble utført med lOOmM eddiksyre, 0,025 % Tween-20, pH 3,0. Elueringsproduktet ble samlet og pH ble justert til 1,5 enheter under det teoretiske isoelektriske punkt med IM NaOH, filtrert (0,2 um) og fortynnet fire ganger med 0,025 % Tween-20. Nedbrutte varianter ble fjernet ved anvendelse av ionebyttekromatografi. Ionestyrken på prøven ble justert til 2mS/cm og søylen benyttet var et SP-Sepharose-HP, Hiload 16/10 (Amersham Pharmacia Biotech). Elueringen ble utført med en gjennom-strømningshastighet på 4,0 ml/min i 50 minutter ved anvendelse av en lineær stigning fra 0-55 % buffer B, lOOmM NaAc, 400mM NaCl, 0,025 % Tween-20, pH 5,0 i buffer A, lOmM NaAc, 0,025 % Tween-20, pH 5,0.

Eksempel 5

Seroaktivitet

Reaktiviteten mellom superantigenvarianter og human anti-SEA ble målt i et scintillasjonsproksimitetsassay (SPA).

Streptavidinbelagte PVT-kuler, 150 u.g kuler/brønn (Amersham Pharmacia Biotech) ble inkubert i en mikrotiterplate (OptiPlate, Packard Instruments) i 30 minutter ved romtemperatur med biotinkonjugert F (ab) 2-fragmenter av anti-mus IgG, 3 u.g/mg kuler. Kulene ble forhåndsinkubert med C215Fab konjugert superantigener i en 1:2 fortynnings-serie, hvor den høyeste sluttkonsentrasjonen i brønnene var 40 nM. Til slutt ble de inkubert med 1 nM 125i konjugert affinitetsrenset human anti-SEA antistoffer og mengden p- scintillasjon ble målt i en Top-Counter (Packard Instruments).

Human anti-SEA-reaktivitet for superantigenvariantene ble også målt i et enzymlenket immunosorbent assay, ELISA (Cavallin et al., 2000). Resultatene lignet de erholdt i

SPA.

Eksempel 6

Biologisk funksjon

Evnen til å indusere superantigenantistoffavhengig, cellulær cytotoksisitet, SADCC og superantigenavhengig cellulær cytotoksisitet, SDCC ble sammenlignet i et standard 4 timers51Cr-frigjøringsassay.

Kort sagt var målene benyttet for SDCC humane B-celle lymfom Raji-celler og målene for SADCC var humane kolorektale karcinoma colo205-celler. Cellene ble merket med<51>Cr og fortynnet til en konsentrasjon på 50000 celler/ml i mikrotiterbrønner med V-fasong. Som effektor-celler ble en SEA-reaktiv, human T-cellelinje benyttet som effektor mot målforholdet på 45:1 for SADCC og 30:1 for SDCC. Sag-varianter ble tilsatt ved konsentrasjoner på mellom 10-<9->10<-16>M for SADCC og mellom 10<-7->10<-14>M for SDCC. Supernatantene ble hentet og frigjøringen av<51>Cr ble målt

i et TopCount (Packard Instruments). Prosentandel spesifikk cytotoksisitet ble beregnet som 100 x [[cpm eksperimentell frigjøring - cpm bakgrunnsfrigjøring)/(cpm total frigjøring

- cpm bakgrunnsfrigjøring)].

Eksempel 7

Identifisering av antistoffepitoper

Forhåndseksisterende antistoffer mot superantigener har komplisert klinisk anvendelse av det samme i pasienter, noe som har krevd justering av doseringen i terapi (Alpaugh et al., 1998). En annen tilnærmingsmåte for å begrense virkningen av forhåndsdannede antistoffer var å modifisere området av superantigenet ansvarlig for T-cellereseptorbinding (Antonsson, et al., 1997). Imidlertid har foreliggende oppfinnelse videre forbedret det terapeutiske potensialet for superantigener ved anvendelse av genetiske manipuleringsteknikker for å fjerne antistoffepitoper på superantigenet.

Det ble funnet at SEE oppviste en kraftig reduksjon i antistoffreaktivitet sammenlignet med SEA (Antonsson et al., 1997). Det fulgte dessverre med denne reduksjonen en påfallende forringelse av de tumordrepende egenskapene når fusjonert til et tumorreaktivt Fab (Antonsson et al., 1997). Kimeriske konstrukter av SEA og SEE ble derfor undersøkt. Ved introduksjon av tilsvarende aminosyrer fra SEA ved fire posisjoner i TCR-bindingsområdet for SEE ble de ønskede egenskapene oppnådd. Disse substitusjoner; Arg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly og Arg27Lys (område A) i SEE førte til kimeraen SEA/E-18 (figur 4) (Antonsson et al., 1997). Denne kimera oppviste mer enn 50 % reduksjon i antistoffreaktivitet som i SEE, mens den beholdt det effektive cytotoksisitetsnivået som i SEA. I tillegg inne-holer SEA/E-18 også substitusjonen Asp227Ala for å redusere affiniteten mellom superantigenet og MHC klasse II, som reduserer SDCC og derved forbedrer det terapeutiske vinduet (Abrahmsén et al., 1995).

For å videre redusere evnen til human anti-SEA til å gjenkjenne SEA/E-18 ble antistoffbindingsepitopene i superantigenene bestemt. Peptid/fragmenter fra en ufull-stendig pepsinfordøyning av enten SEAwt eller SEA/E-18 ble angitt ved anvendelse av immobilisert anti-SEA-antistoffer. Etter rensing ble peptidsekvensene identifisert ved anvendelse av LC-MS (figur 1). Mulige områder involvert i antistoffgjenkjennelse ble derved lokalisert i aminosyresekvensen. Det er påfallende at mesteparten av de hentede peptidene var lokalisert rundt områdene kjent å interagere med MHC klasse II (Abrahmsén et al., 1995) (figur 2 og figur 6). Den tredimensjonale strukturen for SEA (Schad et al., 1995; Sundstrom et al., 1996) og en datamodell av SEA/E-18 (figur 5), basert på krystallstrukturen av SEA (Schad et al., 1995; Sundstrom et al., 1996 A) ble benyttet for å lokalisere overflateeksponerte residuer innenfor de identifiserte peptidene. Følgende residuer ble identifisert som eksponert og mulige kandidater i antistoffbin-dingsepitoper: Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Aspl73, Hisl87, Serl89, Glul90, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 og Asp227 (tabell 1) •

Disse residuene ble vesentlig substituert for å redusere binding til antistoffer. Nye datamodeller med videre forbedret SAg-varianter ble laget omgående for å bekrefte og sammenligne resultatene erholdt fra sistnevnte. Nærmere bestemt ble innflytelsen av sidekjedene undersøkt og endringer som påvirket stabiliteten av proteinet ble identifisert.

Eksempel 8

Modifisering av superantigen for å redusere seroreaktivitet Antistoffbindingsnivåene for de identifiserte residuene blekarakteriserti utgangspunktet ved to til seks simultane substitusjoner i SEA/E-18. Derved ble følgende SAg-varianter erholdt (tabell 1, figur 4): SEA/E-62 (Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala) (område E), SEA/E-63 (Serl89Asp, Glul90Ala) (område D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (område B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (område C), SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45Ala, Glu49Thr) (område B) og SEA/E-75 (Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser) (område C).

Et scintillasjonsproksimitetsassay (SPA) ble utviklet for å undersøke om anti-SEA-antistoffer fra en human IgG-pool kunne gjenkjenne forskjellige SAg-varianter. Alle de modifiserte variantene ble gjenkjent i mindre grad sam menlignet med SEA/E-18 (tabell 1). Den mest vesentlige reduksjon i binding ble forårsaket av substitusjonene gjort i SEA/E-65. I SPA-analyse ble reduksjon i mer enn 40 % observert (figur 7). Imidlertid frembrakte mange erstatninger også en reduksjon i produksjonsnivået fra E. coli og i tillegg var den biologiske aktiviteten også redusert i blant. Gjennom å granske erstatningene kunne vi identifisere residuene ansvarlig i hver variant og ekskludere eller modifisere dem for å oppnå bedre egenskaper. Generelt var produksjonsnivået økt ved hydrofile erstatninger sammenlignet med hydrofobe erstatninger.

Reduksjonen i antistoffbinding var synergistisk økt når variantene ble kombinert, som i SEA/E-91 bestående av SEA/E-63, SEA/E-65 og en modifisert SEA/E-74 (med villtype Asp45) (tabell 1). Varianten med det mest overordenlige resultat i SPA-analysen som viste en bindingsreduksjon på nesten 70 % sammenlignet med SEA/E-18 var SEA/E-110, en kombinasjon av SEA/E-63, SEA/E-75 og modifisert SEA/E-62 (SEA/E-97), SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) og SEA/E-74 (wt Asp45) (figur 7, tabell 1). Modifiseringene som står for det meste av reduksjonen i antistoffbinding var i SEA/E-109 (Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser) en kombinasjon av SEA/E-75 og modifisert SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) og SEA/E-74 (wt Asp45). Dette er på grunn av at superantigenvariantene som inneholder disse substitusjonene alle viser en god reduksjon i SPA-analysen.

Således resulterte residuene substituert i SEA/E-62, SEA/E-64, SEA/E-65 og SEA/E-74 mellom 20 og 40 % reduksjon i antistoffreaktivitet sammenlignet med SEA/E-18 (tabell 1).

Eksempel 9

Erstatninger som påvirker produksjonsnivåene

Som antydet ovenfor førte noen av substitusjonene på superantigenoverflaten i reduserte produksjonsnivåer i E. coli. Det var ikke mulig å produsere mange av kombina-sjonene. Det ble derfor besluttet å undersøke alternative modifiseringer av de residuene som så ut til å forårsake en reduksjon i utbytte. Substitusjoner som påvirket utbyttet uten å redusere bindingen av antistoffer, ble ikke videre undersøkt. Istedenfor ble villtyperesiduer benyttet.

I det innledende settet av superantigenvarianter påvirket residu Lys35 i SEA/E-64 ekspresjonsnivået negativt. Når villtyperesiduet ble benyttet i posisjon 35 sammen med serinsubstitusjonene av Glu34 og Glu39, noe som ga SAg-varianten SEA/E-108, ble utbyttet økt fra 23 mg/l til 30 mg/l. Reduksjonen i antistoffreaktivitet var imidlertid beholdt. Ved introduksjon av glutaminsyresubstitusjoner for residuene Lys79, Lys81, Lys83 og Lys84 i SEA/E-65 førte dette til et produksjonsnivå på kun 1,5 mg/l. Det ble satset på å identifisere bedre erstatninger på grunn av det faktum at effekten i antistoffreaktivitet ble redusert med 43 % sammenlignet med SEA/E-18. Den beste kombinasjonen hva gjelder både utbytte og redusert antistoffreaktivitet ble funnet å være SEA/E-84 med serinresiduer i posisjonene 83 og 84 og konservert glutaminsyre ved posisjonene 79 og 81 (tabell 1). Produksjonsnivået ble økt ti ganger og antistoffreaktiviteten ble redusert med 41 % sammenlignet med SEA/E-18 (tabell 1). Produksjonsnivået ble økt 10 ganger og antistoffreaktiviteten ble redusert med 41 % sammenlignet med SEA/E-18 (tabell 1). Produksjonsnivået var også redusert mer enn ti ganger med erstatningene Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala og Asp227Ala i SEA/E-62, til 1,0 mg/l. Produksjonsutbyttet på 48 mg/ml ble imidlertid oppnådd ved å erstatte alaninsubstitusjonene for serinresiduer, resulterende i SEA/E-97 (tabell 1).

Det er interessant å merke seg at ved å kombinere SEA/E-65 med flere varianter, slik som SEA/E-63 og modifisert SEA/E-74 som i SEA/E-91, ble lave produksjonsnivåer snudd om til 12 mg/l (tabell 1). På den annen side var det kun ekspresjonsnivå av superantigenvarianten SEA/E-110 på henholdsvis 0,5 mg/l og 14 mg/l. Produksjonsnivået for SEA/E-110 ble imidlertid øket til 30 mg/l når substitusjonene Aspl74Ala, His87Ala, Serl88Thr, Serl89Asp, Glul90Ala og Gln204TAhr ble fjernet, således dannende SEA/E-120 (tabell 1).

Introduksjon av et stort antall substitusjoner inn i superantigenet kan føre til problemer med E. coli ekspresjon. Det foreligger minst tre forskjellige mekanismer for dette: redusert termodynamikk, destruert naturlig foldevei og nylig introduserte proteolytiske seter. Til tross for at hensikten med foreliggende studie er å fjerne antigen-epitoper fra overflaten, som mest sannsynlig ikke ville forstyrre noen hovedstrukturene ryggmarger, var det alltid en mulighet for at de nye strukturene var avhengig av andre residuer enn villtypekonstruksjonen for å opprettholde stabiliteten. Derfor ble nye datamodeller kontinuerlig laget for å forutsi eller bekrefte lokaliseringen av de substituerte residuene innenfor den nye strukturen. På denne måten kunne vi identifisere residuene ansvarlig for problemer med for eksempel ekspresjonsnivåene i tidlige superantigenvarianter og oppnå forbedrede varianter med enten villtyperesiduer eller bedre substitusjoner (tabell 1) .

I konklusjon bør følgende residuer substitueres til serin og ikke alanin for å oppnå bedre produksjonsnivå: Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 og Asp227. I tillegg bør residuene Lys35, Aspl73, hisl87, Serl88, Serl89, Glul90 og Gln204 være konservert for å unngå en reduksjon i ekspresj onsnivåene.

Eksempel 10

Evaluering av biologisk funksjon blant de forskjellige SAg-variantene

På grunn av at superantigenene ble primært designet for tumorterapi (Dohlsten et al., 1994) var det viktig å unngå erstatninger som reduserte tumorrettet cytotoksisitet innenfor de nye superantigenvariantene. Denne evnen til å mediere tumorrettet cytotoksisitet ble derfor målt for alle nye superantigenvarianter i et SADCC-assay (figur 3). Effektiviteten av superantigener til å mediere T-cel-ledreping av MHC klasse II uttrykkende celler resulterer i tillegg i systemisk cytotoksisitet som kunne forårsake bivirkninger målt i et SDCC-assay (figur 3). For klinisk bruk bør SDCC mest sannsynlig være lav for å øke det terapeutiske vinduet.

De fleste av det innledende settet SAg-varianter hadde samme nivå tumorspesifikk cytotoksisitetvirkeevne som SEA/E-18 (tabell 1). Unntakene var SEA/E-75 med erstatningene Lys74Thr, Asp75Ala og Asn78Ser som ble redusert ti ganger og SEA/E-64 med erstatningene Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu og Glu42Lys, som ble redusert fem ganger sammenlignet med SEA/E-18 (tabell 1). Det er interessant å bemerke at den reduserte aktiviteten i SEA/E-75 kun ble observert i denne varianten i kombinasjon med videre substitusjoner, for eksempel i SEA/E-109 ble full aktivitet detektert (tabell 1). I tillegg var SDCC-aktivitet uendret i SEA/E-75 sammenlignet med SEA/E-18. Det var derfor sannsynlig at substitusjonene Lys74Thr, Asp75Ala og Asn78Ser alene derfor ville være sannsynlig å forstyrre interaksjonene som var viktig for antistoffavhengig cytotoksisitet.

Hovedvekten av superantigenvariantene beskrevet heri viste ikke en tydelig reduksjon i SDCC. En liten reduksjon i SDCC-aktivitet ble observert for utgangspunktvariantene SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 og SEA/E-74 sammenlignet med SEA/E-18.

Alle superantigenvariantene inneholdt det substituerte residuet Asp227Ala eller Ser. Denne substitusjonen var kjent for å redusere affiniteten for MHC klasse II 100 ganger og derved SDCC-aktivitet (Abrahmsén et al., 1995). Imidlertid, siden SAg-varianten SEA/E-109 med N-terminalsubstitusjonene viste en større reduksjon sammenlignet med SEA/E-18 enn SEA/E-113 med C-terminalsubstitusjonene viste dette at innenfor SEA/E-109 hadde ytterligere residuer blitt endret som var viktige for SDCC og mest sannsynlig for binding til MHC klasse II (figur 8).

Således var residuene som forårsaket størst reduksjon Lys79Ser og Lys81Ser i SEA/E-83 og substitusjonen Asp45Ala i SEA/E-74. De fleste av disse substitusjonene er lokalisert rundt residuene som tidigere har vist å interagere med MHC klasse II (Abrahmsén et al., 1995).

Eksempel 11

Design av ny superantigenvariant

For å designe en optimal superantigenvariant ble alle de fordelaktige substitusjonene kombinert, noe som førte til den overlegne SEA/E-120 (figur 4 og figur 9).

Først ble alle de fordelaktige modifikasjonene i C-terminal, det vil si residuene Aspl73Ala, Serl89Thr, Glul90Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, Glu222Thr, Asn223Ser, His225Ser og Asp227Ser sammen med Gln204Thr montert for å danne SAg-varianten SEA/E-113. Denne varianten oppviser den forventede reduksjon i anti-SEA-reaktivitet og akseptable ekspresjonsnivåer, men med en noe redusert biologisk aktivitet (tabell 1, figur 7 og figur 8A og figur 8B). Alle de fordelaktige substitusjonene i N-terminal, det vil si residuene Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49T, Lys74T, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser og Lys84Ser ble montert inn i SEA/E-109. En bemerkelsesverdig reduksjon i anti-SEA-reaktivitet ble observert for denne superantigenvarianten sammen med et høyt ekspresjonsnivå og til og med en forbedret biologisk profil (tabell 1, figur 7 og figur 8A og figur 8B). Imidlertid, når kombinasjonen av disse to variantene, SEA/E-113 og SEA/E-109, ble laget i SEA/E-110, ble det et dramatisk tap i både utbytte og biologisk funksjon (tabell 1). Den biologiske virkeevnen ble hentet helt inn når villtyperesiduene Serl89, Glul90 og Gln204 ble benyttet igjen i SEA/E-15 (tabell 1), men produksjonsnivåene var fortsatt på et lavt nivå. Molekylær modellering av denne varianten antydet at residuene Aspl73, Hisl87 og Serl88 kunne være viktige for stabiliseringen av brettingen og følgelig resultere i høyere utbytter.

Flere forskjellige kombinasjoner ble laget for å evaluere disse residuene, resulterende i SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 og SEA/E-122 (tabell 1). Den beste produksjonen ble oppnådd med SEA/E-120 med villtyperesiduer i alle tre posisjoner. Sammen med de tidligere lagde SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 og SEA/E-109, var disse de eneste SAg-variantene som oppnådde ekspresjonsnivåer på mer enn 20 mg/l (tabell 1). Ingen signifikante forskjeller med hensyn til biologisk aktivitet eller

antistoffreaktivitet ble observert mellom variantene.

Design av et nytt konjugat

SEA/E-120 ble genetisk fusjonert til Fab-enheten av tumorreaktivitetsantistoffet som er 5T4 (Dohlsten et al., 1994) (figur 10) .

Antigenet av 5T4 er uttrykt på et mangfold av forskjellige tumorer, slik som ikke-små celle lungekarcinom, brystkreft, nyrecellekreft, bukspyttkjertelkreft, eggstokkreft og koloncancer. Substitusjoner i villtypesekvensen av 5T4 ble også gjort for å oppnå høyere utbytte. I tungkjeden: His41Pro, Ser44Gly, Ile69Thr og Valll3Gly og i lettkjeden: PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val og Leu83Ala.

Omfanget ved foreliggende oppfinnelse er ikke ment å være begrenset til de bestemte utførelsene ifølge fremgangsmåten, instrumentene, fremstillingen, sammensetningen av stoff, måter, metoder og trinn beskrevet i beskrivelsen. Prosesser, maskiner, fremstilling, sammensetninger av stoff, måter, metoder eller trinn som allerede eksisterer eller som senere vil bli utviklet som utfører vesentlig den samme funksjonen eller oppnår vesentlig det samme resultatet som tilsvarende utførelser beskrevet heri, vil kunne anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, noe som en person med vanlig innsikt i faget enkelt vil kunne erkjenne fra beskrivelsen ved foreliggende oppfinnelse.

En med innsikt i faget vil lett erkjenne at foreliggende oppfinnelse er godt tilpasset for å utøve hensikten og oppnå hensiktene og fordelene nevnt ovenfor, så vel som de som er iboende deri. Sammensetninger, fremgangsmåter, prosedyrer og utførelsesmåter beskrevet heri, er nå representative for de foretrukne utførelsene og er ment å fungere som eksempler og er ikke ment å begrense omfanget.

REFERANSELISTE

Abrahmsén L., et al. EMBO J. 14:2978-86, 1995.

Alpaugh R.K.,et al. Clin Cancer Res. 4:1903-14, 1998. Antonsson P.,et al. J .Immunol 158:4245-51, 1997. Bangham et al., J. Mol. Biol., 13:238-252, 1965.

Bird et al., Science. 242:423-6,1988.

Braisted et al, Proe Nati Acad Sei USA. 93 (12) :5688-92, 1996.

Burks et al., Proe Nati Acad Sei USA. 94(2):412-7, 1997 .

Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977 .

Cavallin A., et al. J Biol Chem. 275:1665-72, 2000. Cunningham et al., Science. 244(4908): 1081-5, 1989. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986 Dohlsten M.,et al. Proe Nati Acad Sei U.S.A. 91:8945-9, 1994 .

DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed.

(1979) pp. 287-341.

Håkansson, M. et al. J Mol Biol. 302:527-37, 2000. Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988. Johannesson et al., J. Med. Chem. 42:601-608, 1999. Kaneda et al., J Biol Chem., 264(21): 12126-12129, 1989. Kato et al., J Biol Chem., 266(6): 3361-3364, 1991. Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987. Papageorgiou A. C. et al. Trends in Microbiology 8: 369-375, 2000.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Chapter 61, pages 1035-1038 and 1570-1580.

Sambrook et. al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed.,1989.

Schad E. M., et al. EMBO J. 14:3292-3301, 1995.

Short et al., J Biol Chem. 270 (48) : 28541-50, 1995. Sundstrom M, et al. EMBO J. 15:6832-40, 1996 A. Sundstrom M., et al. J Biol Chem 271:32212-16, 1996 B. Szoka and Papahadjopoulos, Proe. Nati. Acad. Sei., 75:4194-4198, 1978.

Vita et al., Biopolymers 47:93-100, 1998.

Warren et al., Biochemistry 35 (27): 8855-62, 1996.

Weisshoff et al., Eur. J. Biochem. 259: 776-788, 1999. Wells et al., Methods. 10(1): 126-34, 1996.

Wong et al., Gene, 10: 87-94, 1980.

Yelton et al., J Immunol. 155(4): 1994-2004, 1995.

Claims (14)

1. Konjugat omfattende et bakterielt superantigen og en antistoffenhet hvori superantigenet er en variant av stafylokokk enterotoksin E (SEE), sekvens ID nr. 7, hvor aminosyresekvensen av superantigenet omfatter regioner A til E, hvilken region A ligger innenfor det TCR-bindende sete og bestemmer bindignen til TCR, og regioner B til E bestemmer bindingen til MHC Klasse II-molekyler og og skiller seg fra stafylokokk enterotoksin E ved at det omfatter de følgende aminosyresubstitusjonene, hvori posisjonene til aminosyresubstitusjonene er relative til aminosyreposisjonene i referansesekvens ID nr.7: (i) lysinet i posisjon 79 i region C har blitt erstattet med glutaminsyre eller en konservert variant derav, lysinet i posisjon 81 i region C har blitt erstattet med glutaminsyre eller en konservert variant derav, lysinet i posisjon 83 i region C har blitt erstattet med serin eller en konservert variant derav og lysinet i posisjon 84 i region C har blitt erstattet med serin eller en konservert variant derav, (ii) argininet i posisjon 20 i region A har blitt erstattet med glysin eller en konservert variant derav, asparaginet i posison 21 i region A har blitt erstattet med treonin eller en konservert variant derav, serin i posisjon 24 i region A har blitt erstattet med glysin eller en konservert variant drav, arginin i posisjon 27 i region A har blitt erstattet med lysin eller en konservert variant derav, og valgfritt har også aminosyrene ved posisjon 173 og/eller posisjon 204 i region A blitt erstattet, og (iii) asparaginsyren i posisjon 227 i region E har blitt erstattet med serin, alanin eller en konservert variant derav; og (iv) en eller flere aminosyreresidu(er) ved posisjoner 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 og 49 i region B og/eller ved posisjoner 74, 75, 78 i region C og/eller ved posisjoner 187, 188, 189, 190 i region D og/eller ved posisjon 217, 220, 222, 223, 225 i region E har blitt erstattet slik at det substituerte superantigen har redusert seroreaktivitet i forhold til seroreaktiviteten av Stafyllokokkisk enterotoksin som har aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 7, og hvori antistoffenheten er et fullengde antistoff eller ethvert annet antigenbindende antistoffaktivt fragment som er rettet mot en kreftassosiert celleoverflatestruktur.

2. Konjugat ifølge krav 1, hvori superantigenet har aminosyresekvensen gjengitt i sekvens ID nr. 2 (SEA/E-120).

3. Konjugat ifølge krav 1, hvori substitusjonen ved aminosyreposisjon 227 er alanin.

4. Konjugat ifølge krav 1, hvori substitusjonen ved aminosyreposisjon 227 er serin.

5. Konjugat ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori antistoffenheten er et Fab-fragment.

6. Konjugat ifølge krav 5, hvori antistoffenheten er C215Fab.

7. Konjugat ifølge krav 5, hvori antistoffenheten er 5T4Fab.

8. Konjugat ifølge krav 1, som har aminosyresekvensen gjengitt i SEQ ID NO. 1.

9. Konjugat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, for bruk i behandling av kreft.

10. Konjugat ifølge krav 9, hvori krefttypen er valgt fra gruppen bestående av lunge-, bryst-, kolon-, nyre-, bukspyttkjertel-, ovarian-, mage-, livmorhals- og prostatakreft.

11. Konjugat som krevd i krav 9 eller 10, hvori krefttypen er lungekreft.

12. Anvendelse av et konjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvori medikamentet er for intravenøs administrasjon.

14. Farmasøytisk sammensetning omfattende, som aktiv bestanddel en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, og videre omfattende ett eller flere farmasøytisk akseptable bærestoffer.