CN110483626A - 牛支原体膜蛋白p59作为抗原蛋白的应用 - Google Patents

牛支原体膜蛋白p59作为抗原蛋白的应用 Download PDF

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Abstract

本公开属于牛支原体疫苗技术领域，具体涉及一种牛支原体膜蛋白p59作为牛支原体抗原蛋白的应用。牛支原体是一种威胁牛场将抗养殖的重要病原，尚缺乏行之有效的商品化疫苗。本公开通过研究发现牛支原体表面膜蛋白p59具有抗原性，其抗体对牛支原体生长具有抑制作用，还能够降低牛支原体对MDBK细胞的抑制作用。另外，该膜蛋白与牛阳性血清抗体具有特异性结合作用，可用于牛支原体定位及检测。本公开通过基因工程表达纯化该膜蛋白p59得到相应的重组蛋白p59，提供了一种可工业化生产获得该蛋白的方法，其制备的重组蛋白p59可作为疫苗进行推广。

Description

牛支原体膜蛋白p59作为抗原蛋白的应用
技术领域
本公开属于牛支原体疫苗技术领域，具体涉及一种牛支原体膜蛋白p59作为牛支原体抗原蛋白的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在世界范围内，牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)已经成为威胁牛场健康养殖的重要病原。它可以引起黄牛和奶牛等动物的肺炎、乳房炎、关节炎、结膜炎及生殖系统障碍等一系列临床疾病。1983年，陈嘉棣等从上海奶牛乳汁中分离并鉴定出牛支原体，证明我国牛群中存在牛支原体的感染,该病发病率高达50％～100％，病死率约为10％～50％，且已在我国广泛分布。牛支原体可在宿主体内长期存在，造成慢性感染，对肉制品及奶制品危害严重。
由于牛支原体不具有细胞壁结构，目前使用的许多强力抗生素由于作用于细胞壁部位因此对牛支原体束手无策。随着牛支原体的耐药性的逐步增强，迫切的需要有效的疫苗来预防控制牛支原体。
牛支原体引起的危害让其越来越受到重视，与牛支原体相关的研究也越来越多，比如致病力较强的表面脂蛋白。近年来，对牛支原体脂蛋白的研究较多的有P48蛋白、pMB67蛋白、P26蛋白等。这些蛋白的生物功能已经进一步得到了证实：简莹娜等优化并合成牛支原体P48基因，获得可溶性重组P48蛋白，并将p48蛋白与靴酸处理过的绵羊红细胞进行试验，建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验；Behrens等于PG45中鉴定了一种新膜蛋白-pMB67，是牛支原体感染的主要抗原。pMB67位于菌体表面，是特异性单克隆抗体的特定抗原表位，与Vsp结合后能独立表达,提高了合成能力，并能保持原有的结构性、抗原性和表面功能；p26抗原开发的一种单克隆抗体已建立一种抗原捕获ELISA方法，能检测出牛乳样中的支原体；在胚胎牛肺细胞中，p26蛋白对牛支原体的黏附力起重要作用。
发明内容
基于上述研究背景，本公开对牛支原体表面膜蛋白进行了研究，筛选可作为牛支原体疫苗进行应用的抗原蛋白。本公开经研究，从牛支原体PG45标准基因全序列中筛选到膜蛋白p59编码序列，经分析为一种牛支原体外膜蛋白。本公开以膜蛋白p59序列为模板，通过基因工程手段表达纯化得到重组蛋白p59。经验证，该重组蛋白p59具有抗原性，可作为牛支原体抗原蛋白，具有抑制牛支原体繁殖及粘附作用的效果，有望成一种牛支原体疫苗加以推广。另外，p59蛋白作为牛支原体膜蛋白，可作为靶位点用于牛支原体的免疫荧光观察和检测。
为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供膜蛋白p59作为牛支原体抗原蛋白的应用。
本公开第二方面，提供膜蛋白p59抗体作为牛支原体抑制剂的应用。
本公开第三方面，提供一种重组p59蛋白，所述重组p59蛋白具有NCBI蛋白数据库中编号ADR25304.1所对应的氨基酸序列。
本公开第四方面，提供一种重组p59蛋白的外源性表达方法，所述表达方法包括以下步骤：构建含有p59的重组质粒，将重组质粒整合至大肠杆菌DH5α感受态细胞获取阳性重组质粒，将阳性重组质粒导入大肠杆菌BL21表达菌中获取重组p59蛋白。
优选的，所述重组质粒采用pET-30a(+)质粒。
优选的，外源表达方法还包括p59基因扩增，通过上、下游引物组合通过PCR扩增目的基因。进一步的，所述上游引物A1：5’-CGCGGATCCATGGAACACAATTATG-3’(横线处为BamH I酶切位点)，所述下游引物A2：5′-ACGCTCGAGTTCATCGCCTTCT-3′(横线处为Xho I酶切位点)。
优选的，所述将阳性重组质粒导入大肠杆菌BL21表达菌中经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导表达。
进一步优选的，所述IPTG终浓度0.4～0.6mmol/L时，35～39℃诱导2.5～4.5h。
在一些具体的实施例中，当IPTG终浓度0.5mmol/L时，37℃诱导4h时，p59重组蛋白表达量最高。
优选的，所述表达方法还包括蛋白纯化步骤，所述蛋白纯化采用80～120mmol/L咪唑洗脱。
本公开第五方面，提供第三方面所述重组蛋白p59在制备牛支原体疫苗中的应用。
本公开第六方面，提供一种牛支原体疫苗，所述疫苗包括第三方面所述重组p59蛋白及免疫佐剂。
优选的，所述免疫佐剂为完全弗氏佐剂。
本公开第七方面，提供一种牛支原体检测方法，所述检测方法采用牛阳性血清抗体作为捕捉抗体。
优选的，所述检测方法采用显色基团标记的牛阳性血清与p59蛋白的特异性结合对牛支原体蛋白进行检测。
本公开第八方面，提供一种牛支原体检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括显色基团标记的牛阳性血清或牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的牛阳性血清抗体。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.牛支原体对畜牧业、肉制品及奶制品具有较为严重的危害，本公开经筛选得到了一种牛支原体膜蛋白p59。本公开通过基因工程表达并纯化该膜蛋白得到重组蛋白p59。经验证，该重组蛋白具有抗原性，该重组蛋白免疫得到的多抗对牛支原体具有良好的抑制作用，另外该，还能够降低牛支原体对MDBK细胞的粘附作用，有望成一种牛支原体疫苗加以推广。
2.本公开通过构建重组质粒pET-30a(+)-p59在大肠杆菌体系中表达出p59重组蛋白，经筛选，本公开还提供了一种可大量表达重组p59蛋白及纯化的方法，为工业扩大生产该重组蛋白及相关疫苗的制备提供了高效可行的制备方法。
3.本公开研究还提供了该膜蛋白与牛阳性血清抗体的特异性结合作用，该特异性结合可用于牛支原体的检测，为牛支原体的定位研究和定量检测提供了良好的靶位点。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中牛支原体p56蛋白定位及信号肽预测分析图；
其中，图1A为p59蛋白定位预测图；
图1B为信号肽分析图。
图2为实施例1中p59基因的PCR扩增及表达载体pET-30a(+)-p59构建的条带图；
其中，图2A为p59基因的PCR扩增条带图；M：DL2000 DNA Marker，1,2：p59 gene；
图2B为重组质粒pET-30a(+)-p59的双酶切鉴定条带图；M:DL5000 DNA分子质量标准；1:pET-30a(+)-p59的双酶切产物。
图3为实施例1中p59重组蛋白的诱导表达、纯化与Western-blot鉴定条带图；
其中，图3A为p59重组蛋白的诱导表达、纯化条带图；M:蛋白质分子量标准；1-4:10mm/25mM/50mM/100mM咪唑洗脱液；
图3B为p59重组蛋白Western-blot鉴定；M:蛋白质分子量标准；1:pET30a(+)空载；2:p59重组蛋白。
图4为p59重组蛋白抗原性鉴定及亚细胞定位鉴定结果图；
其中，图4A为抗原性鉴定条带图；M:蛋白质分子量标准；1：牛支原体胞浆蛋白；2:牛支原体膜蛋白；3：p59重组蛋白；
图4B为p59亚定位ELISA柱形图。
图5为实施例1p59蛋白对MDBK细胞粘附抑制作用荧光图；
其中，图5A为兔阴性血清组；
图5B为兔阳性血清组；
图5C为阴性对照(BSA)组。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，牛支原体是一种威胁牛场健康养殖的重要病原，可在宿主内长期存在，对肉制品及奶制品威胁严重。随着牛支原体耐药性增强，迫切的需要可商业化的疫苗进行防控。为了解决如上的技术问题，本公开研究发现牛支原体表面膜蛋白p59具有抗原性，其抗体对牛支原体生长具有抑制作用。本公开通过构建表达该重组膜蛋白p59，可作为疫苗对牛支原体的生长产生抑制作用，减少牛支原体对MDBK的粘附作用。另外该重组蛋白能够与牛阳性血清抗体进行特异性结合，有望作为牛支原体检测的靶蛋白。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
1材料与方法
1.1试验菌种
牛支原体PG45标准株、支原体阳性血清由山东省农科院奶牛研究中心牛病研究室保存和提供。pET-30a(+)质粒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21表达菌均购自上海佑隆生物科技有限公司。
1.2试验动物
新西兰大白兔购自山东大学实验动物中心。
1.3主要试剂
质粒快速小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、T4 DNA Ligase、限制性内切酶BamH I和Xho I购自购自TaKaRa生物技术有限公司；支原体基因组DNA提取试剂盒购自biomiga公司；膜蛋白提取试剂盒(BB-31515-50T)购自贝博生物；HRP标记的兔抗牛Ig G(IgG-HRP)和山羊抗鼠Ig G(IgG-HRP)购自Abcam公司。PPLO培养基购自Binder公司；SDS-Page凝胶、彩色预染蛋白质分子量标准、ECL发光液购自碧云天生物技术有限公司。
1.4 p59基因的生物信息学分析
参照GenBank数据库中牛支原体PG45标准株全基因组序列(CP002188.1)中MBOVPG45_0018基因序列(即p59蛋白的编码序列)，采用DNAstar进行密码子分析，以确定其编码基因内是否存在大肠杆菌表达系统的终止密码子TGA；通过Expasy ProtParam数据库(https://web.expasy.org/protparam/)分析该蛋白的理化性质；采用TMHMM2.0数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测p59蛋白的定位与跨膜区域；采用SignalP 4.1数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测分析该蛋白的信号肽。
1.5 p59基因的扩增
采用Primer 6设计引物，由青岛擎科生物股份有限公司合成，上游引物A1：5’-CGCGGATCCATGGAACACAATTATG-3’(横线处为BamHI酶切位点)和下游引物A2：5′-ACGCTCGAGTTCATCGCCTTCT-3′(横线处为XhoI酶切位点)。按支原体基因组DNA提取试剂盒说明书提取支原体p59基因组，采用上述引物通过PCR扩增目的基因，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，45℃30s，72℃105s，35个循环；72℃10min；将扩增出来的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。
1.6重组表达载体pET-30a(+)-p59的构建
使用BamH I内切酶和XhoⅠ内切酶对pET-30a(+)载体进行双酶切，取酶切后回收产物6μL、载体2μL、T4 DNA Ligase 1μL、10×T4DNA Buffer 1μL，吹打混匀后37℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，阳性重组质粒命名为pET-30a(+)-p59。并送华大基因科技服务有限公司测序。
1.7 pET-30a(+)-p59重组菌的诱导表达
将测序正确的pET-30a(+)-p59重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落过夜培养后按照1:100比例转接入300ml 2YT(Kan+)培养基中，37℃培养3h至菌液OD600nm＝0.4～0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃诱导4h后，菌体经超声裂解后收集上清，用His-Tag蛋白纯化试剂盒进行纯化。将5×上样缓冲液和纯化后的重组蛋白按1:5比例混匀后，于95℃金属浴变性10min后迅速置冰上冷却2min，然后12 000r/min离心1min，取10μL进行SDS-PAGE电泳，首先在电压80V下进行，待溴酚蓝跑至分离胶界面时将电压调至120V直至电泳结束。
1.8 p59重组蛋白的多抗制备与Western-blot鉴定
纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体，首免剂量为1mL/只。将重组蛋白与等量弗氏完全佐剂1:1混匀，充分乳化后多点注射。两周后进行二免，剂量减为0.5mL/只，将重组蛋白与等量弗氏不完全佐剂1:1混匀，充分乳化后多点注射。此后间隔一周强化免疫一次，免疫剂量同第二次免疫。每次免疫后，采血并分离血清。
将p59重组蛋白湿转印至PVDF膜上，用5％的脱脂牛奶封闭1h后，加入兔抗M.bovisp59抗血清(1:2500)，4℃冰箱孵育过夜，用1×TBST洗4次洗去未结合一抗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:5000)，37℃摇床孵育2h后，用1×TBST洗4次洗去，使用ECL显色发光试剂显色2min，在Image Quant LAS 500超灵敏化学发光成像仪下曝光观察。
1.9 p59重组蛋白抗原性与定位分析
经Western-blot验证该重组蛋白在细胞中的定位及是否具有抗原性。将M.bovis按1:10接入支原体液体培养基中，待培养基由红色变为橙黄色时，将M.bovis菌体12000r/min离心10min，离心后PBS重悬洗3次，按膜蛋白试剂盒步骤提取牛支原体膜蛋白和胞浆蛋白，取一定量的上述蛋白和纯化后p59重组蛋白，以牛阳性血清为一抗(1:25)，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗(1:2000)，进行Western-blot验证。
1.10牛支原体生长抑制实验
分别设置兔多抗血清组(A组)、免疫前血清组(B组)和支原体空白对照组(C组)3个分组，将新鲜培养的牛支原体10倍梯度稀释至10-8CCU/ml，1.8ml每管；对应实验组依次分别加入0.2ml兔多抗血清、0.2ml免疫前兔血清及0.2ml PBS缓冲液，37℃孵育1h；每管取10ul涂布于固体培养基上，37℃、5％CO2条件下先正置培养过夜，然后倒置培养3-5天，显微镜下计数。生长抑制率(％)＝[(兔免疫前血清CFU-兔多抗血清CFU)/支原体空白对照组]X100％，CFU：菌落形成单位(个)。由于低稀释度，菌落会很密集，不易计数，故取浓度为10- 7CCU/ml生长的支原体计算生长抑制率。试验重复三次。
1.11 p59蛋白对MDBK细胞的粘附实验
将盖玻片放入六孔板中，加入MDBK细胞培养6h，待细胞长到60％密度时加入300ul(100ug/ml)的p59重组蛋白于六孔板，37℃孵育1h，用4％多聚甲醛固定40min，5％脱脂奶粉37℃封闭2h，1×PBST洗三遍。加入300ul兔血清(1:10)，并设置BSA蛋白(100ug/ml)作为阴性对照，37℃孵育1h；1×PBST洗三遍，加入FITC绿色荧光二抗，37℃孵育1h(之后的步骤需要避光)。1×PBST洗三遍，加入DiI膜红色染料，室温染色20min；1×PBST洗三遍，加入DAPI蓝色核染料，染色30min；1×PBST洗三遍，加适量淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察。
2结果
2.1 p59基因的生物信息学分析
2.1.1牛支原体p59蛋白性质的预测分析
采用DNAstar进行密码子分析发现，p59蛋白编码色氨酸的密码子中不存在大肠杆菌表达系统的终止密码子TGA，因此可通过常规PCR的方法获得能够直接用于大肠杆菌原核表达的目的基因。采用ProtParam分析显示，p59蛋白大小约为59.3ku，分子式为C2657H4279N717O797S9，理论等电点为7.79，不稳定系数为20.65，脂溶性指数为98.93，预测p59蛋白为稳定的脂溶性蛋白。通过TMHMM2.0数据库中革兰氏阴性菌类型分析预测p59蛋白定位于胞外(图1A)。采用Signal P 4.1数据库分析显示，该蛋白无信号肽(图1B)。综合分析结果显示，p59蛋白可能为一种锚定于牛支原体外膜的蛋白。
2.2牛支原体p59基因的PCR扩增及原核表达载体pET-30a(+)-p59的构建
以M.bovis DNA为模板，以A1和A2为特异性引物扩增出1600bp左右大小的单一条带，与预期相符(图3A)。将所得的目的片段与该基因的测序结果显示，该基因与p59编码序列一致。
经Bam HⅠ和Xho I双酶切鉴定，在1600bp和5500bp左右处有被切下的两个片段，表明p59基因已被成功连入pET-30a(+)质粒中(图3B)。将阳性质粒进行测序，与GenBank中的标准序列进行比对，同源性为100％，且插入位置完全正确，这表明pET-30a(+)-p59原核表达载体构建成功。
2.3 p59重组蛋白的诱导表达、纯化与Western-blot鉴定
将pET-30a(+)-P59重组质粒转化到大肠杆菌表达菌BL21中，经IPTG诱导表达后，重组菌可大量表达目的蛋白。100mmol/L咪唑洗脱时，蛋白含量最高(图4A)。纯化后p59重组蛋白经Western-blot鉴定，p59重组蛋白在70ku附近处出现特异性条带(图4B)。
2.4 p59重组蛋白抗原性鉴定及亚细胞定位鉴定
经Western-blot鉴定，在66ku处出现特异性条带，表明p59主要以膜蛋白形式存在于牛支原体中。该蛋白能与牛阳性血清抗体进行特异性结合，可以作一种抗原蛋白(图5A)。间接ELISA结果进一步证明p59蛋白在牛支原体细胞膜表面所占比例远大于胞浆蛋白，胞浆内含量极少(图5B)。
2.5牛支原体生长抑制实验
取牛支原体稀释浓度为10-7CCU/ml开始计数，兔阴性血清的固体培养基组3次实验平均生长个数为252个，兔多抗血清组3次实验平均生长个数为28个，支原体空白对照组3次实验平均生长个数为492个；生长抑制率(％)＝45.53％(表1)。
表1牛支原体生长抑制实验
Table 1 Growth inhibition experiment of mycoplasma bovis
2.6 p59蛋白对MDBK细胞粘附实验
激光共聚焦显微镜下观察结果显示，蓝色MDBK细胞核周围分布有明亮的绿色荧光，用红色染料标记的细胞膜和绿色染料标记的p59蛋白，二者颜色轮廓相吻合。p59兔多抗血清作为一抗时，红色细胞膜表面出现绿色荧光多于兔阴性血清做一抗时细胞膜表面出现的绿色荧光(图5A、B)，阴性对照组细胞膜表面无绿色荧光出现(图5C)，表明p59对MDBK细胞具有一定的粘附作用。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.膜蛋白p59作为牛支原体抗原蛋白的应用。
2.膜蛋白p59抗体作为牛支原体抑制剂的应用。
3.一种重组p59蛋白，其特征在于，所述重组p59蛋白具有NCBI蛋白数据库中编号为ADR25304.1所对应的氨基酸序列。
4.一种重组p59蛋白的外源性表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：构建含有p59的重组质粒，将重组质粒整合至大肠杆菌DH5α感受态细胞获取阳性重组质粒，将阳性重组质粒导入大肠杆菌BL21表达菌中获取重组p59蛋白。
5.如权利要求4所述重组p59蛋白的外源性表达方法，其特征在于，外源表达方法还包括p59基因扩增，通过上、下游引物组合通过PCR扩增目的基因；优选的，所述上游引物A1：
5’-CGCGGATCCATGGAACACAATTATG-3’，所述下游引物A2：
5′-ACGCTCGAGTTCATCGCCTTCT-3′。
6.如权利要求4所述重组p59蛋白的外源性表达方法，其特征在于，所述将阳性重组质粒导入大肠杆菌BL21表达菌中经IPTG诱导表达；优选的，所述IPTG终浓度0.4～0.6mmol/L时，35～39℃诱导2.5～4.5h
7.权利要求3所述重组蛋白p59在制备牛支原体疫苗中的应用。
8.一种牛支原体疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求3所述重组p59蛋白及免疫佐剂。
9.一种牛支原体检测方法，其特征在于，所述检测方法采用牛阳性血清抗体作为捕捉抗体；优选的，所述检测方法采用显色基团标记的牛阳性血清与p59蛋白的特异性结合对牛支原体蛋白进行检测。
10.一种牛支原体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括显色基团标记的牛阳性血清或牛阳性血清及辣根过氧化物酶标记的牛阳性血清抗体。
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