CN111549157A

CN111549157A - 一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

Info

Publication number: CN111549157A
Application number: CN202010424356.3A
Authority: CN
Inventors: 张亮; 杨宏军; 朱曼玲; 杨美; 楚会萌; 张云飞
Original assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Current assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2020-05-19
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-05-19
Also published as: CN111549157B

Abstract

本发明具体涉及一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。牛支原体是一种严重威胁牛养殖业的病原体，目前尚没有有效的治疗药物及疫苗，提供高效精确的检测方法对于牛支原体的防治具有重要意义。本发明研究表明P59蛋白编码基因序列在牛支原体种内高度保守且与其他物种相似度低，是一种良好的检测标志物。具体的，本发明还提供一种基于P59蛋白的SYBR Green I荧光定量PCR的检测方法，经验证，具有良好的检测特异性及灵敏度。该方法的建立为牛支原体病的快速、准确、高精度检测提供了新的诊断方法，为牛支原体的防控提供了一定保障。

Description

一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于支原体检测技术领域，具体涉及一种牛支原体检测方法、试剂盒及牛支原体P59蛋白作为检测标志物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牛支原体(Mycoplasma bovis)易引起牛的局部炎症，如肺、乳房、生殖道、关节发炎、各类呼吸系统疾病，甚至引起母牛不孕，是一种严重威胁牛养殖业的病原体。上个世纪八十年代以来，牛支原体相关疾病快速蔓延到多个国家及地区的牛群，严重制约了畜牧业和经济的快速增长。据报道，欧洲每年25.1％～33.8％的犊牛感染牛支原体肺炎，损失高达1.43亿～1.93亿欧元。英国每年有190万头左右的牛感染牛支原体肺炎。据报道，美国牛场的感染率达到了71％，因牛支原体引起的疾病如牛呼吸系统疾病、肺炎等产生的损失高达1.40亿美元。继2008年之后，我国的多个地区也相继爆发了由牛支原体引起的传染病，主要症状有发热、咳嗽、流鼻涕等。由于目前没有效果理想的治疗药物及疫苗，并且支原体具有高度的传染性，对于牛支原体进行快速、精准的鉴别有助于早期发现及提供及时的治疗。

目前，牛支原体的诊断方法还没有国际化的标准，我国对牛支原体的诊断方法主要是从病原分离培养后鉴定，血清学诊断和分子生物学三个大方向对该病原进行检测、鉴定。牛支原体的分离培养主要是将感染牛支原体的患病牛肺脏等组织研磨后，将研磨均匀悬液通过0.45μm滤膜接种于液体培养基中进行培养，该方法主要用于分离单独菌株，但是分离培养需要时间较多，不能够作为一种常规快速的诊断方法。血清学诊断牛支原体病原的方法主要包括酶联免疫相关技术(如ELISA、免疫酶技术等)、间接血凝抑制实验、化学发光分析等，血清学检测诊断虽然具有一定的灵敏性，但是容易出现假阳性的情况。常规PCR检测方法的灵敏度不够，有时肉眼观察具有明显临床病理变化的样品组织，却检测不出阳性条带。基因诊断技术中，所述PCR方法为鉴别支原体的主要技术，但由于牛无乳支原体和牛支原体的16SRNA具有极高的同源性，故利用PCR扩增16SRNA无法区分上述两种病原体。

发明内容

针对背景技术中的记载，本发明的技术目的在于提供一种精确、高效的牛支原体检测方法。本发明通过生物信息学方法对牛支原体P59蛋白编码基因MBOVPG45_0018分析发现，该基因序列具有高度保守性且与其他物种相似度低，作为检测靶点具有良好的特异性。本发明进一步的针对P59蛋白进行引物设计，建立了一种牛支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，经验证具有良好的检测特异性和灵敏度。

基于以上技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。

本发明中所述P59蛋白，在NCBI中登记号为ADR25304.1或WP_013456518.1。经验证，所述P59蛋白基因序列在牛支原体种内高度保守且与其他物种相似度均低于50％，这启示牛支原体蛋白P59具有一定的特异性，作为牛支原体检测标志物有望提高检测精确度，降低假阳性结果出现概率。

本发明第二方面，提供一组序列，所述序列组如下：

SEQ ID NO:1 ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，

SEQ ID NO:2 GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，

SEQ ID NO:3 TTACGCAAGAGAATGCTTCA，

SEQ ID NO:4 TAGGAAAGCACCCTATTGAT。

本发明第三方面，提供一种牛支原体的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括P59蛋白检测试剂。

本发明第四方面，提供一种牛支原体的检测方法，所述检测方法通过检测P59蛋白的实现牛支原体的检测。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明研究建立了牛支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度是常规PCR方法的100倍，不与多种病原菌发生交叉反应，变异系数小于3％，对牛鼻拭子和牛奶样品的阳性检出率均高于普通PCR。该方法极大地缩短了检测时效，敏感性较血清学方法更高和且特异性更高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中牛支原体p59蛋白编码基因进化树分析图；

图2为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR检测方法标准曲线图；

图3为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR检测方法溶解曲线；

图4为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR特异性试验结果；

图5为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用以及牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。

优选的，所述P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用包括通过免疫学方法及基因诊断方法通过检测P59蛋白的含量对牛支原体进行检测。

在一些实施方式中，所述免疫学方法包括采用免疫印迹、酶联免疫吸附测定方法或免疫组化方法对待测个体的血清、组织或分泌物进行检测。

在一些实施方式中，所述基因诊断检测方法包括采用核酸扩增方法检测待测个体血清、组织或分泌物中的P59。

本发明第二方面，提供一组序列，所述序列组如下：

SEQ ID NO:1 ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，

SEQ ID NO:2 GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，

SEQ ID NO:3 TTACGCAAGAGAATGCTTCA，

SEQ ID NO:4 TAGGAAAGCACCCTATTGAT。

优选的，所述P59蛋白检测试剂包括基于抗原-抗体识别作用对P59蛋白进行识别的蛋白类试剂。

优选的，所述P59蛋白检测试剂包括用于核酸扩增的核苷酸引物序列。

进一步优选的，所述P59蛋白检测试剂包括第二方面所述序列。

优选的，所述检测方法为一种SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。

在一些具体的实施方式中，所述荧光定量PCR最适反应体系：20μL反应体系中，P59-F/R的终浓度均为10pmol/L，核酸样品加样量为2.4μL。

在一些具体的实施方式中，所述荧光定量PCR最适反应条件为：95℃30s；95℃5s、56℃30s，40个循环，融解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃，1个循环。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一、p59基因的进化树分析

将MBOVPG45_0018基因序列(CP002188.1)提交BLAST数据库分别进行核酸序列和氨基酸序列的比对分析，从比对结果中选取Query Cover>30％且序列相似度高于70％的序列，采用Neighbor Joining方法建立进化树(图1)。核酸序列比对发现，牛支原体PG45中MBOVPG45_0018基因序列在牛支原体种内相似度高于99.94％，与无乳支原体p59编码序列的相似度为85.06％(Query Cover>99％)，低于UvrC基因和OppD/F序列的相似度。数据表明，牛支原体p59具有种内保守性和种间特异性，较UvrC基因和OppD/F序列有更高的区分度，更适于筛选特异性PCR检测引物。

二、荧光定量PCR检测方法

1材料与方法

1.1病毒株和样品来源

牛支原体16M株、牛鼻支原体、溶血性葡萄球菌、约氏不动杆菌、棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳酸乳球菌、产酸克雷伯式菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶血曼海姆菌、奇异变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌均为牛呼吸道临床分离菌；牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛流性热(BEFV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)均为牛呼吸道临床分离病毒。上述临床分离病原均保存于山东省农业科学院奶牛研究中心牛病研究室，病毒cDNA保存于-80℃冰箱。17份鼻拭子和52份牛奶样品采集于山东省5个规模化牧场。

1.2主要实验试剂盒

SYBR R Premix Ex Taq TM II荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，牛支原体基因组提取试剂盒和细菌基因组提取试剂盒均购自BIOMIGA公司。

1.3引物设计

参照GenBank中牛支原体(CP002188.1)MBOVPG45-0018的核酸序列，设计特异性扩增该基因的SYBR Green I荧光定量PCR引物(表1)，由上海生物工程技术有限公司合成。

表1引物信息表

1.4基因组提取与标准品制备

采用细菌基因组提取试剂盒分别提取溶血性葡萄球菌、约氏不动杆菌、棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳酸乳球菌、产酸克雷伯式菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶血曼海姆菌、奇异变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌等呼吸道临床分离菌的DNA，作为特异性检测核酸备用。分别取牛支原体和牛鼻支原体新鲜培养物10mL，12,000r/min离心10min收集菌体。采用支原体基因组提取试剂盒提取牛支原体和牛鼻支原体基因组DNA备用。牛支原体提取时，最后一步采用无菌ddH₂O溶解牛支原体核酸。将提取好的牛支原体核酸，通过核酸测定仪测定核酸浓度。定量后的核酸作为实验标准品，-20℃保存备用。

1.5牛支原体荧光定量PCR检测方法的建立

以定量后核酸为模板，采用方阵法分别对退火温度(50℃-62℃)和引物浓度(5pmol/L-20pmol/L)进行优化，选取荧光最高值、Cp最小值、融解曲线特异性明显的反应条件作为最适反应条件。确定最佳反应条件后10倍倍比稀释实验标准品至10^-7，每个稀释倍数设置3个重复，根据扩增效率选取5个最适曲线绘制标准曲线。

1.6特异性试验

分别以牛支原体16M株、牛鼻支原体、溶血性葡萄球菌、约氏不动杆菌、棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳酸乳球菌、产酸克雷伯式菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶血曼海姆菌、奇异变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、BEFV、IBRV、BVDV、BCoV和BPIV3为模板，将上述模板采用建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法扩增，设置无菌ddH₂O作为阴性对照，进行特异性检测。

1.7敏感性试验

采用最适反应条件，10倍倍比稀释实验标准品至10^-8，每个稀释倍数设置3个重复，分别进行扩增，对该方法进行敏感性检测。分别以上述稀释的标准品为模板，采用常规PCR检测方法进行扩增，对比两种检测方法的敏感性。

1.8重复性试验

批内重复性试验：取5份不同稀释度的实验标准品进行荧光定量PCR扩增，每个稀释倍数设3个重复，设置无菌ddH₂O作为阴性对照。扩增完成后，计算Cp值的标准差(S)和变异系数(CV)。

批间重复性试验：取5份不同稀释度的实验标准品进行荧光定量PCR扩增，每3d重复一次。重复3次实验后，计算Cp值的变异系(CV)。

1.9临床样品的检测

将17份鼻拭子加入2mL PBS缓冲液充分震荡后，吸取2mL至2mL离心管中，6,000r/min离心8min，取上清1mL备用。从52份牛奶样品中吸取2mL至2mL离心管中6,000r/min离心8min，取中间清液1mL备用。根据支原体基因组提取试剂盒说明书，提取核酸作为待检样品模板。分别采用已建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法和普通PCR检测方法进行扩增。

2.结果

2.1牛支原体核酸标准品的确定

根据核酸测定仪测定结果显示，提取的牛支原体山东分离株16M株DNA浓度为70.12ng/μL。根据以下公式计算牛支原体基因组的拷贝数：每微升拷贝数＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(基因组分子质量)。全基因组测序显示牛支原体16M株基因组大小为1019,748bp，基因组分子量为314,926,933.99g/mol。根据计算公式可知：制备的牛支原体核酸标准品中，每微升含有1.34×10⁸个基因组拷贝。

2.2牛支原体荧光定量PCR检测方法的建立

对牛支原体荧光定量PCR条件进行优化，获得了最适反应体系和相应参数。最适反应体系：20μL反应体系中，P59-F/R的终浓度均为10pmol/L，核酸样品加样量为2.4μL。最适反应条件为：95℃30s；95℃5s、56℃30s，40个循环。融解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃，1个循环。建立标准曲线斜率为-3.405，截距为38.10，扩增效率为0.966(图2)，标准曲线方程为y＝-3.405x+38.1,r²＝0.966。

2.3特异性试验结果

采用优化后的的牛支原体荧光定量PCR检测方法对牛支原体16M株、牛鼻支原体、溶血性葡萄球菌、约氏不动杆菌、棒状杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳酸乳球菌、产酸克雷伯式菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶血曼海姆菌、奇异变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、IBRV、BVDV、BCoV和BPIV3检测后，按照Cp值小于30的判定条件，结果显示只有牛支原体核酸检测结果判定为阳性，其它核酸样品及阴性对照组均判定为阴性(图4)。实验结果表明建立的牛支原体荧光定量PCR方法具有较好的特异性。

2.4敏感性试验结果

将牛支原体核酸实验标准品10倍倍比稀释至1.34×10⁶拷贝/μL-1.34×10⁰拷贝/μL，分别采用牛支原体荧光定量PCR检测方法和常规PCR检测方法进行扩增。结果显示，本实验建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法对牛支原体核酸标准品的检测下限为1.34×10¹拷贝/μL，而常规PCR方法对相应质粒标准品的检测下限为1.34×10³拷贝/μL(图5)，表明本研究建立的方法敏感性较高。

2.5重复性试验结果

结果显示(表2)，本实验建立的牛支原体荧光定量方法的批内变异系数为0.22％-1.18％，批间变异系数为0.53％-0.98％，均小于3％，该方法方法具有良好的重复性。

表2批内与批间重复性试验结果

2.6临床检测

采用建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法和普通PCR检测方法对来自5个规模化奶牛场的17份鼻拭子和52份奶样进行检测，以Cp值小于30为阳性且阴阳性对照成立进行结果判定。结果显示：建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法中鼻拭子阳性检出率为35.29％(6/17)，奶样阳性检出率为15.38％(8/52)；而普通PCR检测方法中鼻拭子阳性检出率为29.41％(5/17)，奶样阳性检出率为7.69％(4/52)。对比结果表明建立的牛支原体荧光定量PCR检测方法在临床样品检测中较常规PCR检测方法有更高的检出率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心

<120> 一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actttaaatt ggttgctgcc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttcctaaag agtgttgata tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttacgcaaga gaatgcttca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taggaaagca ccctattgat 20

Claims

1.牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。

2.如权利要求1所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用包括通过免疫学方法及基因诊断方法通过检测P59蛋白的含量对牛支原体进行检测。

3.如权利要求2所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述免疫学方法包括采用免疫印迹、酶联免疫吸附测定方法或免疫组化方法对待测个体的血清、组织或分泌物进行检测。

4.如权利要求2所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述基因诊断检测方法包括采用核酸扩增方法检测待测个体血清、组织或分泌物中的P59。

5.一组序列，其特征在于，所述序列组如下：

SEQ ID NO:1ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，

SEQ ID NO:2GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，

SEQ ID NO:3TTACGCAAGAGAATGCTTCA，

SEQ ID NO:4TAGGAAAGCACCCTATTGAT。

6.一种牛支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括P59蛋白检测试剂。

7.如权利要求6所述牛支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述P59蛋白检测试剂包括基于抗原-抗体识别作用对P59蛋白进行识别的蛋白类试剂。

8.如权利要求6所述牛支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述P59蛋白检测试剂包括用于核酸扩增的核苷酸引物序列；优选的，所述P59蛋白检测试剂包括权利要求5所述序列。

9.一种牛支原体的检测方法，其特征在于，所述检测方法通过检测P59蛋白的实现牛支原体的检测。

10.如权利要求9所述牛支原体的检测方法，其特征在于，所述检测方法为一种SYBRGreen I荧光定量PCR检测方法；

优选的，所述荧光定量PCR最适反应体系：20μL反应体系中，P59-F/R的终浓度均为10pmol/L，核酸样品加样量为2.4μL；

优选的，所述荧光定量PCR最适反应条件为：95℃30s；95℃5s、56℃30s，40个循环，融解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃，1个循环。